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MARIA APARECIDA GALHARDO DE SOUZA
AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA TARDIA
DO FÍGADO E DO PULMÃO APÓS LESÃO DE ISQUEMIA E
REPERFUSÃO HEPÁTICA SELETIVA COM MODULAÇÃO
PELO PRECONDICIONAMENTO ISQUÊMICO OU
PELA N-ACETILCISTEÍNA
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo – Escola Paulista de Medicina,
para obtenção do Título de Doutor em
Ciências.
SÃO PAULO
2007
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MARIA APARECIDA GALHARDO DE SOUZA
AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA TARDIA
DO FÍGADO E DO PULMÃO APÓS LESÃO DE ISQUEMIA E
REPERFUSÃO HEPÁTICA SELETIVA COM MODULAÇÃO
PELO PRECONDICIONAMENTO ISQUÊMICO OU
PELA N-ACETILCISTEÍNA
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo – Escola Paulista de Medicina,
para obtenção do Título de Doutor em
Ciências.
ORIENTADOR: Profa. Dra. Edna Frasson de Souza Montero
SÃO PAULO
2007
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Galhardo, Maria Aparecida de Souza
Avaliação morfológica e imunohistoquímica tardia do fígado e do
pulmão após lesão de isquemia e reperfusão hepática seletiva com
modulação pelo precondicionamento isquêmico ou pela N-acetilcisteína
xx, 61f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação.
Late morphological and immunohistochemical evaluation of liver and lung
after selective ischemia and reperfusion injury modulated by ischemic
preconditioning or N-acetylcysteine
1. Traumatismo por reperfusão 2. Fígado 3. Pulmão 4. Acetilcisteína.
5. Precondicionamento isquêmico
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
UNIFESP-EPM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIRURGIA E EXPERIMENTAÇÃO
COORDENADOR: Prof. Dr. José Luiz Martins
TESE DE DOUTORADO
AUTOR: Maria Aparecida Galhardo de Souza
ORIENTADOR: Prof
a
. Dra. Edna Frasson de Souza Montero
TÍTULO: Avaliação morfológica e imunohistoquímica tardia do fígado e do pulmão após
lesão de isquemia e reperfusão hepática seletiva com modulação pelo precondicionamento
isquêmico ou pela N-acetilcisteína.
BANCA EXAMINADORA:
1- Presidente: Prof
a
Dra. Edna Frasson de Souza Montero
Professora Afiliada do Departamento de Cirurgia da Universidade Federal de São Paulo.
MEMBROS EFETIVOS:
2 – Prof. Dr. Tarcisio Triviño
Professor Adjunto do Departamento de Cirurgia da Universidade Federal de São Paulo.
3 – Prof. Dr. Manuel de Jesus Simões
Professor Associado do Departamento de Morfologia da Universidade Federal de São
Paulo.
4 - Prof
a
Dra. Susi Heliene Lauz Medeiros
Professora Adjunta do Departamento de Cirurgia da Universidade Federal do Rio Grande.
5 – Prof. Dr. Marcelo Augusto Fontenelle Ribeiro Jr
Professor Assistente do Departamento de Cirurgia da Universidade de São Paulo.
MEMBROS SUPLENTES:
1- Prof
a
Dra. Margareth Pauli Lallée
Professora Doutora do Departamento de Cirurgia da universidade de São Paulo.
2 - Prof. Dr. Ítalo Accetta
Professor Titular do Departamento de Cirurgia Geral e Especializada da Universidade
Federal Fluminense.
iii
"Se você quer transformar o mundo, experimente primeiro promover o seu
aperfeiçoamento pessoal e realizar inovações no seu próprio interior.
Estas atitudes se refletirão em mudanças positivas no seu ambiente
familiar. Deste ponto em diante, as mudanças se expandirão em
proporções cada vez maiores. Tudo o que fazemos produz
efeito, causa algum impacto."
Tenzin Gyatso, o Dalai Lama
(Líder espiritual Tibetano; Prêmio Nobel da Paz)
iv
DEDICATÓRIA
À minha família que tem sido o alicerce da minha vida, servindo de estimulo para
continuar; ensinando que tanto os bons quanto os não tão bons
momentos fazem parte de um aprendizado maior.
Obrigado por estarem do meu lado.
v
AGRADECIMENTO ESPECIAL
À Prof
a
. Dra. Edna Frasson de Souza Montero, Professora Afiliada do
Departamento de Cirurgia e Vice-Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em
Cirurgia e Experimentação da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista
de Medicina, orientadora deste trabalho, por me incentivar a vencer os desafios da
pesquisa, por demonstrar com seu exemplo o que é ser pesquisadora, pela sua
grande capacidade de trabalho e mérito pessoal .
vi
AGRADECIMENTOS
À UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO – ESCOLA PAULISTA DE
MEDICINA – UNIFESP-EPM, por ter me recebido como aluno do Programa de Pós-
Graduação em Cirurgia e Experimentação, possibilitando minha titulação.
Ao Prof. Dr. José Luiz Martins, Professor Associado, Livre-Docente da
Disciplina de Cirurgia Pediátrica e Coordenador do Programa de Pós-Graduação em
Cirurgia e Experimentação da UNIFESP-EPM, pelos ensinamentos e exemplo de
dignidade.
Ao Prof. Dr. Luiz Francisco Poli de Figueiredo, Professor Titular da
Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, pela
acolhida na Disciplina.
Ao Prof. Dr. Djalma José Fagundes, Professor Adjunto da Disciplina de
Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, pela acolhida,
incentivo e valiosos ensinamentos.
Ao Prof. Dr. Hélio Plapler, Professor Adjunto e Chefe da Disciplina de
Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, pelo conhecimento e
tranqüilidade transmitida aos alunos.
Ao Prof. Dr. Paulo de Oliveira Gomes, Professor Adjunto da Disciplina de
Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, pelas informações,
conhecimentos e grande delicadeza no trato com os alunos.
Ao Prof. Dr. Murched Omar Taha, Livre-Docente e Professor Afiliado ao
Departamento de Cirurgia da UNIFESP-EPM, pelos ensinamentos transmitidos com
serenidade.
vii
Ao Prof. Dr. Ivan Hong Jun Koh, Livre-Docente e Professor Adjunto da
Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, pela
capacidade demonstrada.
Ao Prof. Dr. Sérgio Tomaz Schettini, livre-Docente e Professor Adjunto da
Disciplina de Cirurgia Pediátrica da UNIFESP-EPM, pelo saber demonstrado.
Ao Prof. Dr. João Luiz Moreira Coutinho de Azevedo, Professor Adjunto
da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM,
pelos ensinamentos.
Ao Prof. Dr. Luiz Gonzaga de Freitas Filho, Professor do Departamento de
Cirurgia da UNIFESP-EPM, pela inteligência, capacidade técnica, gentileza e
simplicidade demonstrada ao longo deste período.
Ao Prof. Dr. Raimundo Manno Vieira, Diretor Acadêmico da Escola de
Medicina Souza Marques, pelo incentivo e pela ajuda para buscar nesta
Universidade a almejada Pós-Graduação.
À Profa. Stella Souza Marques, Presidente da Fundação Técnico-
Educacional Souza Marques, pelo carinho que ao longo dos anos demonstrou.
À Carla Cristina Maganhin de Souza, Mestre e Pós-graduanda de
Doutorado do Departamento de Morfologia da UNIFESP-EPM, sua disponibilidade,
carinho e ajuda fizeram que a fase final desse trabalho pudesse chegar ao fim. Muito
obrigado por tudo.
À Profa. Dra. Celina Tizuko Fujitama Oshima, Professora do Departamento
de Patologia da UNIFESP-EPM, pela realização das lâminas de imunohistoquímica,
pela forma carinhosa que me recebeu.
viii
À Adriana Aparecida Ferraz Carbonel, Pós-Graduanda de Mestrado em
Ciências da Saúde e Paulo Celso Franco, funcionário, do Departamento de
Morfologia da UNIFESP-EPM, pela disponibilidade e carinho.
À Mônica Cecília Bochetti Manna, colega de pós-graduação e amiga,
Mestre pelo Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação da
UNIFESP-EPM, que me acolheu calorosamente e me proporcionou o sentimento
necessário para que eu me sentisse em casa.
A Ricardo José Morello colega do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia
e Experimentação da UNIFESP-EPM, pela participação neste estudo e amizade.
A Carlos Eduardo Benetti Ramalho, pela ajuda na confecção dos blocos
para o estudo histológico e amizade.
A Paulo Sérgio Venerando da Silva Ferreira, colega de pós-graduação,
pela amizade e ajuda no trabalho.
À Elaine Maria Alves Bazzi Dantas e Valdelice Justiniano Soares,
secretárias do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação, pela
amizade e pelo apoio durante essa jornada, pela delicadeza e trato amigável, com
certeza fizeram ser melhor esse período e hoje são amigas queridas.
À Adriana Bazzi Pedreira, Benedita Salete Costa Lima Valverde e Rita de
Cássia Almeida Bonfim, funcionárias da Disciplina de Técnica Operatória e
Cirurgia Experimental da UNIFESP, pela alegria e amizade.
A Pedro Gabriel Riboli Navarro, acadêmico de Medicina da UNIFESP-EPM,
pela participação na fase inicial deste trabalho.
Aos colegas do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação
da UNIFESP, pela convivência, amizade e ajuda na formação do espírito crítico.
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fotomicrografias mostrando parte de fígados de ratos
pertencentes aos vários grupos de estudo. H.E. 400X ........
20
Figura 2 - Fotomicrografias mostrando parte de fígados de ratos
pertencentes aos vários grupos de estudo. Notar no grupo
IR hepatócitos com núcleos condensados (setas). H.E
.
400X......................................................................................
20
Figura 3 - Fotomicrografias mostrando fígado de ratos pertencentes
aos vários grupos de estudo. As setas indicam a
reatividade citoplasmática para a Caspase-3 clivada.
(400x)....................................................................................
22
Figura 4 - Fotomicrografias mostrando fígado de ratos pertencentes
aos vários grupos de estudo. As setas indicam a
reatividade nuclear ao PCNA. (400x) ...................................
24
Figura 5 - Fotomicrografias mostrando parte do pulmão de ratos
pertencentes aos vários grupos de estudo. Notar no grupo
IR região de alvéolos alterados. H.E.
100X......................................................................................
28
Figura 6 - Fotomicrografias mostrando parte do pulmão de ratos
pertencentes aos vários grupos de estudo. Notar no grupo
IR pulmão com septos espessados. H.E.
400X......................................................................................
28
Figura 7 - Fotomicrografias mostrando pulmões de ratos
pertencentes aos vários grupos de estudo. As setas
indicam a reatividade citoplasmática para a Caspase-3
x
clivada. (400x).......................................................................
30
Figura 8 - Fotomicrografias mostrando pulmões de ratos
pertencentes aos vários grupos de estudo. As setas
indicam a reatividade nuclear ao PCNA. (400x) ...................
32
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores da aspartato aminotransferase – AST em ratos do
grupo SHAM (controle) e em ratos submetidos à isquemia
por 40 minutos e 24 horas de reperfusão nos grupos IR
(isquemia e reperfusão), IPC (precondicionamento isquêmico)
e NAC (N-acetilcisteína) ...........................................................
14
Tabela 2 - Valores da alanina aminotransferase – ALT em ratos do
grupo SHAM (controle) e em ratos submetidos à isquemia
por 40 minutos e 24 horas de
reperfusão nos grupos IR
(isquemia e reperfusão), IPC (precondicionamento
isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína)........................................
15
Tabela 3 - Valores da esteatose microvesicular no fígado, observada na
microscopia óptica corada por hematoxilina-eosina, em ratos
do grupo SHAM (controle) e em ratos submetidos à isquemia
por 40 minutos e 24 horas de reperfusão nos grupos IR
(isquemia e reperfusão), IPC (precondicionamento isquêmico)
e NAC (N-acetilcísteina)................... ........................................
16
Tabela 4 - Valores do infiltrado inflamatório no fígado, observado na
microscopia óptica corada por hematoxilina–eosina, em ratos
do grupo SHAM (controle) e em ratos submetidos à
isquemia por 40 minutos e 24 horas de reperfusão nos grupos
IR (isquemia e reperfusão), IPC (precondicionamento
isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína).........................................
17
Tabela 5 - Valores de necrose no fígado, observada na microscopia
óptica corada por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo
SHAM (controle) e em ratos submetidos à isquemia por 40
xii
minutos e 24 horas de reperfusão nos grupos IR (isquemia e
reperfusão), IPC (precondicionamento isquêmico) e NAC (N-
acetilcisteína).............................................................................
18
Tabela 6 - Valores de apoptose no fígado, observada na microscopia
óptica corada por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo
SHAM (controle) e em ratos submetidos à isquemia por 40
minutos e 24 horas de reperfusão nos grupos IR (isquemia e
reperfusão), IPC (precondicionamento isquêmico) e NAC (N-
acetilcisteína).............................................................................
19
Tabela 7 - Valores de Caspase-3 no fígado, observada na microscopia
óptica corada por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo
SHAM (controle) e em ratos submetidos à isquemia por 40
minutos e 24 horas de reperfusão nos grupos IR (isquemia e
reperfusão), IPC (precondicionamento isquêmico) e NAC (N-
acetilcisteína).............................................................................
21
Tabela 8 - Valores de PCNA no fígado, observado na microscopia óptica
corada por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo SHAM
(controle) e em ratos submetidos à isquemia por 40 minutos
e 24 horas de reperfusão nos grupos IR (isquemia e
reperfusão), IPC (precondicionamento isquêmico) e NAC (N-
acetilcisteína).............................................................................
23
Tabela 9 - Valores do infiltrado inflamatório no pulmão, observado na
microscopia óptica corada por hematoxilina–eosina, em ratos
do grupo SHAM (controle) e em ratos submetidos à
isquemia por 40 minutos e 24 horas de reperfusão nos grupos
IR (isquemia e reperfusão), IPC (precondicionamento
isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína) ........................................
25
xiii
Tabela 10 -
Valores do espessamento do septo alveolar no pulmão,
observado na microscopia óptica corada por hematoxilina–
eosina, em ratos do grupo SHAM (controle) e em ratos
submetidos à isquemia por 40 minutos e 24 horas de
reperfusão nos grupos IR (isquemia e reperfusão), IPC
(precondicionamento isquêmico) e NAC (N-
acetilcisteína).............................................................................
26
Tabela 11 -
Valores da congestão no pulmão, observada na microscopia
óptica corada por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo
SHAM (controle) e em ratos submetidos à isquemia por 40
minutos e 24 horas de reperfusão nos grupos IR (isquemia e
reperfusão), IPC (precondicionamento isquêmico) e NAC (N-
acetilcisteína)............................................................................
27
Tabela 12 -
Valores de Caspase-3 no pulmão, observada na microscopia
óptica corada por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo
SHAM (controle) e em ratos submetidos à isquemia por 40
minutos e 24 horas de reperfusão nos grupos IR (isquemia e
reperfusão), IPC (precondicionamento isquêmico) e NAC (N-
acetilcisteína).............................................................................
29
Tabela 13 -
Valores de PCNA no fígado, observado na microscopia óptica
corada por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo SHAM
(controle) e em ratos submetidos à isquemia por 40 minutos
e 24 horas de reperfusão nos grupos IR (isquemia e
reperfusão), IPC (precondicionamento isquêmico) e NAC (N-
acetilcisteína).............................................................................
31
xiv
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Média dos valores séricos de aspartase aminotransferase
de cada grupo...............................................
14
Gráfico 2 - Média dos valores séricos de aspartase aminotransferase
de cada grupo...............................................
15
Gráfico 3 - Média dos valores atribuídos a microesteatose no fígado
de cada grupo.......................................................................
16
Gráfico 4 - Média dos valores atribuídos a infiltração inflamatória no
fígado de cada grupo............................................................
17
Gráfico 5 - Média dos valores atribuídos a necrose no fígado de cada
grupo....................................................................................
18
Gráfico 6 - Média dos valores atribuídos a microesteatose no fígado
de cada grupo.......................................................................
19
Gráfico 7 - Média dos valores da Caspase-3 no fígado de cada
grupo....................................................................................
21
Gráfico 8 - Média dos valores do PCNA no fígado de cada
grupo....................................................................................
23
Gráfico 9 - Média dos valores atribuídos ao infiltrado inflamatório no
pulmão de cada grupo..........................................................
25
Gráfico 10 - Média dos valores atribuídos ao espessamento do septo
alveolar de cada grupo.........................................................
26
xv
Gráfico 11 -
Média dos valores atribuídos a congestão no pulmão de
cada grupo............................................................................
27
Gráfico 12 -
Média dos valores da Caspase-3 no pulmão de cada
grupo....................................................................................
29
Gráfico 13 -
Média dos valores do PCNA no pulmão de cada
grupo....................................................................................
31
xvi
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ALT - alanina aminotransferase
AST- aspartato aminotransferase
ATP- adenosina tri-fosfato
Bcl-2- célula-B de linfoma 2
C - Celsius
CEDEME- Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e
Biologia
DNA - ácido desoxirribonucleico
DP - desvio padrão
EROs - espécies reativas de oxigênio
G - gramas
GSH- glutationa reduzida
GSSD - glutationa oxidada
H
2
O
2 -
peróxido de hidrogênio
HE: hematoxilina-eosina
IEGs - genes de ativação imediata
IL-6 - interleucina 6
IPC - precondicionamento isquemico
IR - isquemia e reperfusão
Kg - quilograma
L - litro
MIP-2 -proteína macrófago inflamatória
ML - mililitro
Mm - milímetro
NAC - N-acetilcisteína
NF-ΚΒ − fator nuclear kappa beta
ΝΟ − oxido nítrico
PCNA - antígeno nuclear de células proliferativas
SHAM - grupo controle
SOD - superóxido dismutase
STAT-3 - sinal transdutor e ativador da proteína de transcrição 3
TNF-α − fator de necrose tumoral alfa
xvii
TUNEL - marcação in situ das extremidades nicadas de DNA
UI - unidades internacionais
UNIFESP-EPM - Universidade Federal de São Paulo-Escola Paulista de Medicina
XOD - xantina oxidase
µm: micrômetro
xviii
RESUMO
Este estudo teve como objetivo avaliar o papel do precondicionamento isquêmico
(IPC) e da N-acetilcisteína (NAC) no fígado e no pulmão na fase tardia da lesão de
isquemia e reperfusão hepática. Foram usados 24 ratos Wistar EPM-1, distribuídos
por randomização em quatro grupos: (IR) Isquemia hepática por 40 minutos e
reperfusão por 24 horas; (IPC) precondicionamento isquêmico de 10 minutos de
isquemia e 10 minutos de reperfusão antes da isquemia prolongada; (NAC) Animais
receberam N-acetilcisteína 15 minutos antes da isquemia e 5 minutos antes da
reperfusão e (SHAM) Animais foram operados e tiveram o pedículo hepático
manipulado sem serem submetidos à isquemia. Na reoperação, após 24 horas de
reperfusão hepática, foi colhido sangue para dosagem de aspartato
aminotransferase (AST) e alanino aminotransferase (ALT) e retirados os lobos
isquêmicos do fígado e o pulmão esquerdo para estudo histológico e
imunohistoquímico com Caspase-3 e PCNA para avaliar a apoptose e a proliferação
celular, respectivamente. Foram usados o teste de Kruskal-Wallis e o teste de
variância com pós-teste de Tukey (p < 0,05). Os valores da AST foram similares
entre os grupos (p=0,45); para a ALT houve aumento comparado ao grupo SHAM
(p=0,036). Nos grupos IPC e NAC houve prevenção da necrose (p=0,027), apoptose
(p=0,003) e esteatose microvesicular (p=0,0007); porém somente no grupo NAC
houve redução do infiltrado inflamatório (p=0,004) no fígado. Os grupos IPC e NAC
reduziram a marcação citoplasmática de Caspase-3 (p=0,0001) e a marcação
nuclear do PCNA (p=0,0001) no fígado. No pulmão, o IPC reduziu o espessamento
da parede do alvéolo (p=0,014), porém tanto o IPC quanto a NAC reduziram a
Caspase-3 e o PCNA em relação ao grupo IR. Em conclusão, o precondicionamento
isquêmico e a N-acetilcisteína reduzem a lesão de isquemia e reperfusão hepática
no fígado e no pulmão na fase tardia.
xix
ABSTRACT
This study aimed to evaluate the effect of ischemic preconditioning (IPC) and N-
acetylcysteine (NAC) in hepatic and pulmonary damage in late phase after liver
ischemia-reperfusion injury. 24 male Wistar-EPM rats were randomized and
assigned into four groups: (IR) Hepatic ischemia-reperfusion; (IPC) IPC achieved
before hepatic ischemia; (NAC) Animals received NAC pre treatment; and (SHAM)
Sham operated group. After 24 hours of hepatic reperfusion, blood, ischemic liver
and pulmonary samples were collected. Aspartate aminotransferase (AST) and
alanine aminotransferase (ALT) activity were measured, histological and
immunohistochemical studies in liver and lung were also performed. Apoptosis was
evaluated by Caspase-3 while cell proliferation by proliferating cell nuclear antigen
(PCNA) in liver and pulmonary samples. Kruskal-Wallis and one-way ANOVA with
post-hoc Tukey's test for multiple comparisons were used (p ≤ 0.05). AST levels were
similar among experimental groups. ALT lower levels were observed in sham group
(p=0.04). IPC and NAC groups prevented from necrosis (p=0.027), apoptosis
(p=0.003) and microvesicular steatosis (p=0.0007), but just NAC group prevented
from neutrophil infiltration in liver tissue (p=0.004). SHAM, NAC and IPC groups
were lower than IR group in the caspase-3 activity (P=0,001) and quantitative
analysis showed that PCNA in IR group was higher than SHAM, NAC and IPC
groups (P=0,001). In lung tissue, just IPC treatment reduced alveolar septal edema
(p=0.014), but IPC and NAC groups didn’t prevent from neutrophil infiltration or
vascular congestion. The immunohistochemical study showed NAC and IPC groups
prevented apoptosis (P= 0,001) and cell proliferation (P=0,001). In conclusion, IPC
and NAC attenuated hepatic and pulmonary damage after hepatic ischemia-
reperfusion injury in late phase..
xx
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO...................................................................................... 01
2. OBJETIVOS...........................................................................................
07
3. MÉTODOS.............................................................................................
08
4. RESULTADOS.............................................................................……...
14
5. DISCUSSÃO..........................................................................................
33
6. CONCLUSÕES......................................................................................
48
7. REFERÊNCIAS......................................................................................
49
8. NORMAS ADOTADAS.......................................................................... 58
9. ANEXOS.............................................................................................. 59
1
1. INTRODUÇÃO
A lesão de isquemia e reperfusão tem sido um grande fator limitador na
prática clínica e implicada como um dos responsáveis pela falência hepática e lesão
de órgãos distantes
1-3
, causando um aumento da morbidade e mortalidade,
principalmente nas grandes ressecções e no transplante hepático
1-6
.
A fase inicial da lesão de isquemia e reperfusão hepática é caracterizada
principalmente pela produção de espécies reativas de oxigênio e pela ativação do
complemento e células de Kupffer, enquanto na fase tardia ocorre acúmulo de
neutrófilos, produção de proteases e espécies reativas de oxigênio
7-11
. A maioria
das lesões por IR manifestam-se nesta última fase
12
.
A isquemia hepática, em que ocorre ausência do suprimento de oxigênio e
nutrientes às células, de forma persistente pode causar lesão irreversível,
caracterizada morfologicamente por edema mitocondrial, dano das membranas
plasmáticas e edema dos lisossomos. A morte celular se manifesta por necrose, e
também ocorre apoptose, ativada provavelmente pela liberação de moléculas pró-
apoptóticas que extravasam da mitocôndria
7,8
.
Paradoxalmente, com a reperfusão algumas células submetidas à isquemia,
que não sofreram lesão irreversível, em vez de se recuperarem, evoluem para morte
por necrose ou apoptose
4
. Os mecanismos propostos incluem a formação de
espécies reativas de oxigênio (EROs), nas células parenquimatosas, endoteliais e
nos linfócitos que infiltram a lesão
13
, que produzidas durante a reperfusão causam
lesão celular diretamente por agredir uma variedade de moléculas celulares e
indiretamente pela promoção da síntese de mediadores pró-inflamatórios
14,15
.
A principal via biológica de formação das espécies reativas de oxigênio está
associada à transferência de elétrons com as membranas mitocondriais
16
.
Entretanto, as espécies reativas de oxigênio podem advir de fontes citoplasmáticas,
como na reação da hipoxantina com o oxigênio catalisada pela xantina oxidase, com
geração de radical superóxido
1,16
.
Durante o processo de IR, sistemas antioxidantes como a glutationa (GSH), a
superóxido dismutase (SOD) e a catalase podem sofrer depleção ou serem
inativadas, levando a um aumento da vulnerabilidade do fígado à lesão por IR
1,7,15
.
2
A SOD atua diretamente na dismutação do superóxido a peróxido de hidrogênio,
sendo que a SOD extracelular é abundante no tecido pulmonar
16
e hepático
7
. A
enzima catalase é considerada um importante componente da defesa antioxidante
primária, atuando na catálise da decomposição de H
2
O
2
em água, dividindo esta
função com a glutationa peroxidase. Na presença de baixos níveis de H
2
O
2
, os
peróxidos orgânicos são eliminados preferencialmente pela glutationa peroxidase,
enquanto que em altas concentrações de H
2
O
2
predomina a ação da catalase
16
. A
liberação de xantina e XOD do fígado na corrente sangüínea tem um papel
importante na patogênese das complicações da IR hepática, incluindo infiltração
neutrófila e estresse oxidativo para o pulmão
1,13
. Conseqüentemente, estratégias
com a capacidade de agir no sistema xantina/XOD, podem ser consideradas úteis
para atenuar os efeitos da lesão das EROs, observadas no fígado e pulmão como
conseqüência da IR hepática
1
.
A lesão de isquemia e reperfusão também está associada à inflamação pela
produção de citocinas e ao aumento da expressão das moléculas de adesão por
células endoteliais hipóxicas
17
, que recrutam leucócitos polimorfonucleares para o
tecido reperfundido
7,18
. A ativação da via do complemento pode contribuir para a
lesão de IR, anticorpos IgM se depositam em tecidos isquêmicos e quando o fluxo é
restabelecido as proteínas do complemento se ligam a esses anticorpos causando
lesão celular e inflamação
19
.
Na morte celular, após a lesão de isquemia e reperfusão, coexistem a necrose
e a apoptose. Na necrose, as membranas perdem sua integridade e o conteúdo
intracelular geralmente extravasa, causando inflamação no tecido adjacente.
Morfologicamente, as células necróticas apresentam um aumento da eosinofilia, o
citoplasma pode apresentar vacúolos após a digestão das organelas
citoplasmáticas; as alterações nucleares podem englobar a cariólise, cariorréxis e
picnose, sendo que a picnose também ocorre na apoptose
7
.
Na apoptose a membrana plasmática da célula permanece intacta e sua
estrutura é alterada sendo fagocitada rapidamente, sem extravasamento do seu
conteúdo e sem desencadeamento de reação inflamatória. As características
morfológicas são: redução do tamanho celular, condensação da cromatina na
periferia, formação de bolhas citoplasmáticas e corpos apoptóticos
7
. Dentre as
3
características bioquímicas mais especificas estão a degradação das proteínas,
envolvendo a ativação de cisteíno-proteases chamadas caspases e a decomposição
do DNA, em grandes pedaços e subseqüente clivagem internucleossomal por
endonucleases, em múltiplos de 180 a 200 pares de bases
20
.
A apoptose é induzida por uma cascata de eventos moleculares que são
iniciados por vários mecanismos e culminam na ativação das caspases
21
. O início da
apoptose ocorre por sinais de duas vias, extrínseca e intrínseca, que convergem
para ativar as caspases. A via extrínseca, deflagrada por estímulos externos, através
de receptores específicos na superfície celular, chamados de receptores de morte
celular, que têm entre os mais descritos, os da família de receptores do fator de
necrose tumoral e da proteína Fas (CD95). A via intrínseca, ou mitocondrial, é
ativada por estímulos internos de estresse intracelular, tais como, lesão do DNA,
perturbações no ciclo celular ou nas vias metabólicas. Nos hepatócitos a sinalização
de Fas pode ativar um fator pró-apoptótico, o Bid, que ativa a via mitocondrial,
fazendo uma justaposição das duas vias
7
.
Alguns pesquisadores têm relatado que após a lesão de isquemia e
reperfusão, em modelos experimentais, ocorre uma indução da proliferação celular
como parte do processo de reparo que se segue à lesão de isquemia e reperfusão.
Muitas das citocinas que têm sido implicadas no processo inflamatório por lesão de
IR hepática, também estão envolvidas no processo de reparo e regeneração
hepática
22-24
. Foi demonstrado em estudo experimental de hepatectomia parcial que
a resposta inicial da regeneração depende da ativação precoce de fatores de
transcrição responsivos a TNF-α e IL-6
25,26
. Em animais que receberam anticorpos
anti-TNF ocorreu redução da lesão de IR
27
, no entanto, o TNF e a IL-6 também
estão implicados na transição da fase G0/G1 pela ativação de genes de ativação
imediata/fatores de transcrição
28
.
Na lesão de isquemia e reperfusão, tal qual na regeneração hepática após
hepatectomia parcial, tem-se identificado os genes de ativação imediata (IEGs), que
compõem um grupo de proto-oncogenes relacionados à proliferação celular
29-31
,
incluindo o c-fos e c-jun, que têm sido considerados importantes no processo de
manutenção da modelagem hepática após apoptose
7,29
. Eles se dimerizam para
formar o fator de transcrição da AP-1, que por codificações de proteínas e
4
decodificação de outros fatores de transcrição, como o NF-ΚΒ e STAT-3, levam ao
avanço da célula pelo ciclo celular e, quando os hepatócitos estão no processo de
replicação, são marcados pelo anticorpo do PCNA. O padrão de dimerização de c-
fos e c-jun poderia levar a apoptose ou a regeneração
30
. Desta forma, a extensão da
proliferação celular, assim como da apoptose, refletiria a gravidade da lesão de
isquemia e reperfusão e influenciaria na mortalidade
29,30,32
.
As estratégias de proteção do parênquima hepático e de órgãos remotos
contra as lesões provocadas pela IR incluem táticas operatórias
1-3,33
, uso de agentes
farmacológicos
6,9,34
e terapia gênica
29,31
.
Dentre as técnicas operatórias, o precondicionamento isquêmico (IPC)
descrito por Murry et al.
35
, na isquemia miocárdica de cães, consiste da
realização de um ou mais períodos curtos de isquemia seguidos de reperfusão antes
da isquemia tecidual prolongada para promover tolerância à lesão de IR. Seu
mecanismo de ação não se encontra totalmente elucidado; o bloqueio da geração
de EROs tem sido considerado um dos mecanismos de ação envolvidos
36,37
. Alguns
mediadores de proteção tem sido propostos como a concentração extracelular de
adenosina, a ativação de receptores de adenosina A2 , a produção de óxido
nítrico
38,39
, a supressão do TNF-α
40
e desnaturação proteica
41
. Alguns trabalhos
experimentais têm demonstrado proteger o fígado, pela inibição da apoptose por
meio do bloqueio da atividade das caspases
41-43
. Enquanto, Rudiger et al
44
sugeriram que o IPC confere uma proteção através da indução de um estresse sub-
letal que levaria a uma adaptação do fígado, Teoh & Farrell
40
propõem que o IPC
pela liberação de pequenas quantidades de TNF, ative o NF-κΒ e pela IL-6 promova
a inclusão da célula no processo de reparo celular. Quanto à proteção ao pulmão,
após isquemia e reperfusão hepática, alguns autores
1-3
têm sugerido que o IPC
possa diminuir a lesão pulmonar na fase precoce da lesão de IR . Os mecanismos
de ação sugeridos ocorreriam pela inibição de xantina/ XOD
1
, atenuando a lesão
inflamatória no pulmão, assim como no fígado e pela diminuição da liberação de
TNF-α
2,45
.
Apesar das várias vias discutidas, os efeitos benéficos encontrados
incluem melhora na sobrevida, redução da extensão da necrose hepática,
diminuição da atividade das transaminases no plasma e estabilização do ATP após
5
IR
1-3,33,39,41
. Esses resultados têm estimulado estudos clínicos envolvendo o IPC;
Clavien et al
47,48
relataram, em dois estudos prospectivos, melhora dos parâmetros
avaliados em algumas situações clínicas específicas. Mais recentemente, Azoulay et
al
49
observaram que o IPC apresentou uma maior tolerância à lesão de isquemia, no
entanto, o grupo de pacientes receptores dos fígados, cujos doadores foram
submetidos ao IPC, apresentou uma piora da função hepática inicial.
No Laboratório de Microcirurgia da disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia
Experimental da UNIFESP, alguns trabalhos
50,51
foram realizados para avaliação do
precondicionamento isquêmico na lesão de reperfusão local. O IPC promoveu
melhora no fígado com redução de transaminases, esteatose microvesicular,
apoptose de células endoteliais e hepatócitos na fase precoce e intermediaria da
lesão. À parte dos benefícios identificados pelo IPC na lesão de IR, os mecanismos
pelo qual esta proteção é conferida precisam ser mais bem elucidados.
Como modulação química, a N-acetilcisteína (NAC) tem sido utilizada com
boa perspectiva , em alguns trabalhos para prevenir a lesão de IR
9,34,51,52,53,,54
. Tem
sido administrada rotineiramente em pacientes com falência aguda do fígado
secundária a hepatite por acetaminofen e distúrbios hemodinâmicos
9,51,55
. É um tiol
de baixo peso molecular, que interage e destrói as espécies reativas de oxigênio
por reações não enzimáticas
53,54
e é deacetilado para formar cisteína, a qual auxilia
a síntese de glutationa, um dos mais importantes antioxidantes intracelulares
44,56,57
,
mantém também um efeito sobre a microcirculação
56
.
Em estudos experimentais, ao se avaliar o resultado final de uso da NAC
observa-se algumas controvérsias
58,59
e parece que seu efeito depende da forma e
do momento de administração, ou seja, em bolus ou continua e antes da isquemia e
antes ou durante a reperfusão, respectivamente. Os efeitos da NAC na lesão de
isquemia e reperfusão se mostraram dose-dependente, demonstrando um melhor
resultado com a utilização de 150 mg/kg de peso corporal
52
.
Em estudo clínico de
transplante hepático, Thies et al
60
, em estudo com 60 pacientes, demonstraram com
a utilização de NAC, atenuação da lesão de reperfusão, com diminuição das
transaminases, melhora da microcirculação e prevenção da falência do fígado. Tauf
et al
61
, em outro estudo com pacientes, observaram que 1 hora após o início da
reperfusão no receptor, em transplante hepático, ocorreu uma diminuição na
6
liberação de P-selectina endotelial, sugerindo ser o fator responsável pela
diminuição da adesão neutrófila. No entanto, Steib et al
62
usando NAC em 60
pacientes , em estudo prospectivo randomizado, não conseguiram demonstrar efeito
benéfico na função do enxerto nos três primeiros dias pós-transplante. Essas
variações de resultado podem estar ligadas ao modelo de utilização da NAC, assim
como a diferenças nos pacientes.
Na avaliação da modulação pela NAC na lesão de isquemia e reperfusão,
alguns trabalhos foram desenvolvidos também no Laboratório de Microcirurgia.
Inicialmente, utilizou-se a NAC em estudo de isquemia total por 30 minutos, obtendo-
se redução das transaminases e melhora da lesão à observação do parênquima
hepático, no entanto, sem alteração da relação entre GSH e GSSG
54
. Esses dados
em relação a glutationa foram confirmados em estudos posteriores, em que também
não se observou alteração da glutationa pulmonar na fase tardia da reperfusão, nem
na lesão de isquemia e reperfusão hepática associada ao choque hemorrágico,
ainda que houvesse melhora da lesão de isquemia e reperfusão hepática
53,58
. Esses
trabalhos levaram à hipótese de que a NAC atuaria pelo mecanismo de ação direta
sobre as EROs e não pelo aumento da glutationa intracelular.
Considerando a importância de estratégias que melhorem ou mesmo
impeçam a lesão por isquemia e reperfusão hepática, no próprio órgão e à distancia,
elaborou-se esta pesquisa com a finalidade de se observar o papel do IPC e da NAC
na fase tardia da lesão de isquemia e reperfusão em animais de experimentação.
7
2. OBJETIVOS
Geral
Avaliar o efeito do precondicionamento isquêmico e da N-acetilcisteína no fígado
e no pulmão na fase tardia da lesão de isquemia e reperfusão hepática.
Específicos
1. Avaliar a lesão dos hepatócitos por meio das transaminases
2. Avaliar as alterações histológicas no fígado e pulmão por meio da microscopia
óptica
3. Avaliar a ocorrência de apoptose no fígado e pulmão por meio da
imunohistoquímica
4. Avaliar a ocorrência de proliferação celular no fígado e pulmão por meio da
imunohistoquímica
8
3. MÉTODOS
AMOSTRA
Foram utilizados 24 ratos (Rattus norvegicus albinus) EPM-1 Wistar, machos,
com idade entre 3 e 4 meses e peso médio de 350 gramas.
Os animais foram provenientes do CEDEME - Centro de Desenvolvimento de
Modelos Experimentais em Medicina e Biologia da Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina (UNIFESP - EPM) e operados no Laboratório de
Microcirurgia da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da
UNIFESP - EPM após serem submetidos a período de adaptação de quatro dias no
biotério setorial. Antes do experimento, os ratos foram alojados em gaiolas de
poliuretano com grade de aço inox, com tamanho de 41 x 34 x 17cm, ficando cada
animal em uma gaiola, sendo os animais alimentados com ração para ratos e oferta
livre de água potável. O ritmo circadiano dos animais foi respeitado e mantidas as
condições sanitárias adequadas. No período de seis horas, que antecedeu o
experimento, houve restrição de alimentos sólidos.
A amostra foi distribuída, aleatoriamente, em quatro grupos, cada um com
seis ratos, conforme descrito a seguir (Figura 1):
- Grupo SHAM (n=6): animais submetidos a laparotomia, dissecção do
pedículo hepático e observação sob anestesia durante 60 minutos, período
correspondente aos dos demais grupos;
- Grupo IR (n=6): animais foram submetidos a laparotomia, observados
por 20 minutos e, em seguida, submetidos ao clampeamento do pedículo dos lobos
lateral esquerdo e mediano do fígado pelo período de 40 minutos e reperfundidos
por 24 horas;
- Grupo IPC (n=6): animais foram submetidos a laparotomia e, imedia-
tamente após, submetidos a 10 minutos de isquemia seguidos por 10 minutos de
reperfusão nos lobos lateral esquerdo e mediano do fígado. Ao final da reperfusão,
os mesmos pedículos foram ocluídos por 40 minutos e reperfundidos por 24 horas;
9
- Grupo NAC (n=6): animais foram submetidos a laparotomia e, 5 minutos
após, receberam infusão venosa de N-acetilcisteína. Após observação por 15
minutos, foram submetidos ao clampeamento do pedículo dos lobos lateral
esquerdo e mediano do fígado pelo período de 40 minutos e reperfundidos por 24
horas.
PROCEDIMENTOS
Antes da realização do experimento, o projeto de pesquisa foi avaliado e
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP – EPM / Hospital São
Paulo, sob o protocolo 1336/06.
Após terem sido pesados, os animais foram anestesiados com uma
associação de xilazina (10 mg/Kg)
*
e cetamina (60 mg/Kg)
†
por via intramuscular, na
face lateral da pata traseira direita. O animal foi considerado anestesiado quando
ocorreu perda dos reflexos córneo-palpebrais e de retirada da pata traseira contra-
lateral, ao estímulo doloroso por preensão.
Em seguida, cada animal foi acomodado em bancada cirúrgica equipada com
colchão térmico, a 37
o
. C, durante todo o procedimento. Para a realização das
dissecções, foi utilizado microscópio cirúrgico
‡
nos aumentos de 6 a 16 vezes, assim
como, instrumental microcirúrgico adequado.
Foi realizada laparotomia mediana, a partir do apêndice xifóide em direção
caudal, com 6 cm de extensão. Feita administração de 100 UI de heparina na veia
cava abdominal com seringa de insulina, com volume de 0,1 mL por animal.
Todos os animais foram submetidos a dissecção do pedículo dos lobos lateral
esquerdo e mediano do fígado, englobando o ducto biliar, artéria hepática e veia
porta. Em seguida, foi feita randomização, por sorteio, para alocação nos grupos.
Para a realização da isquemia e reperfusão hepática seletiva, procedeu-se a
exposição do fígado com secção dos ligamentos falciforme e coronário esquerdo,
seguida da identificação e isolamento, dos ramos dos segmentos lateral esquerdo e
*
Anasedan
†
Ketamina Agener
‡
DF Vasconcelos M 900 - São Paulo
10
mediano do fígado. Após 20 minutos de observação, este pedículo foi ocluído com
clampe vascular microcirúrgico, durante 40 minutos, para a promoção da isquemia
sustentada, e reperfundidos por 24 horas. Este procedimento foi realizado nos
animais do grupo IR e, conforme descrito nos parágrafos subseqüentes, naqueles
dos grupos IPC e NAC.
A realização do precondicionamento isquêmico consistiu da oclusão
temporária do pedículo dos lobos lateral esquerdo e mediano do fígado, mediante
colocação de clampe vascular microcirúrgico, durante 10 minutos de isquemia
seguidos por 10 minutos de reperfusão, precedendo a isquemia sustentada por 40
minutos e reperfusão por 24 horas.
Para o protocolo da NAC, a N-acetilcisteína foi administrada lentamente na
veia cava abdominal, na dose de 150 mg/Kg de peso corporal, num volume de 0,6
mL, 15 minutos antes da isquemia sustentada por 40 minutos e 5 minutos antes de
iniciar a reperfusão por 24 horas.
O procedimento operatório simulado consistiu de anestesia, laparotomia,
exposição do fígado e dissecção do pedículo hepático de forma similar aos demais
grupos. Permaneceram anestesiados em observação, pelo período de 60 minutos,
tempo de duração de todos os procedimentos.
Todos os animais foram submetidos à síntese da parede abdominal em dois
planos, com fio de náilon 5-0. Os animais de todos os grupos foram hidratados com
solução salina 0,9% à temperatura de 37
o
C, com dose única de 3 ml/Kg de peso
corporal.
Ao final do procedimento operatório, após recuperação da anestesia, os ratos
foram mantidos em gaiolas individuais e receberam ração e água ad libitum.
Vinte e quatro horas depois, os animais foram novamente anestesiados,
conforme protocolo descrito, submetidos à punção da veia cava inferior supra-
hepática, para coleta de sangue, e remoção cirúrgica dos lobos isquêmicos do
fígado. A incisão abdominal foi estendida ao tórax para a ressecção do pulmão
esquerdo. A eutanásia foi obtida sob anestesia, pela ação combinada da
exsangüinação e do pneumotórax.
11
ESTUDO BIOQUIMICO
O sangue colhido foi imediatamente encaminhado ao Laboratório Central do
Hospital São Paulo / UNIFESP – EPM. As dosagens bioquímicas de aspartato
aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) mensuradas por métodos
cinéticos em aparelho auto-analisador
§
.
ESTUDO HISTOLOGICO
As amostras teciduais do fígado isquêmico e do pulmão foram identificadas,
fixadas em formol tamponado a 10% e mantidas por 3 dias em refrigeração. Foram,
então, incluídas em parafina e enviadas para processamento histológico e
imunohistoquímico.
Dos blocos foram realizados cortes de 5 µm e colocados em lâminas para
análise histológica. O preparo das lâminas e sua análise foram realizados na
Disciplina de Histologia e Biologia Estrutural do Departamento de Morfologia da
UNIFESP – EPM.
O estudo histológico foi realizado em lâminas coradas pela hematoxilina e
eosina (H.E) com o auxílio de microscópio de luz
**
pelo patologista.
Para cada órgão foram definidos parâmetros diferentes, devido a
peculiaridade de cada um. No fígado foi analisada a ocorrência de:
1 - esteatose microvesicular - definida como a presença de acúmulo lipídico
sob a forma de microvesículas citoplasmáticas com volume menor que o do núcleo;
2 – necrose - caracterizada pela condensação ou apagamento do núcleo,
intensa eosinofilia citoplasmática e destruição, perda da arquitetura dos cordões de
hepatócitos (destrabeculação hepatocelular);
3 – apoptose – caracterizada pelo aspecto nuclear, ou seja, a disposição da
cromatina no núcleo e pelo aspecto do citoplasma nuclear;
4 – infiltração leucocitária – presença de leucócitos, em especial neutrófilos
nas várias partes do lóbulo hepático.
§
Cobas Mira
**
axiocam 2.0 - Carl Zeiss
12
No pulmão foi analisada a ocorrência de:
1 - infiltração leucocitária – presença de leucócitos, em especial neutrófilos
nas varias partes do pulmão;
2 - congestão vascular – presença de vasos dilatados no estroma pulmonar;
3 – espessamento dos septos alveolares – aumento na espessura dos septos
Além disso foi utilizado um sistema de escore para graduar as lesões
presentes no fígado e no pulmão, baseado na presença e intensidade das
alterações.
No fígado e no pulmão foram observados 50 campos ao acaso, de cada
animal sob vários aumentos (objetivas de 4 a 400 x). As lesões foram graduadas em
cruzes variando de ausente (-) até ++++ dependendo da sua intensidade. Estes
valores foram transformados em números para aplicação de testes estatísticos, da
seguinte maneira: Ausência = 0; +/- = 0,5; + = 1; ++ = 2; +++ = 3 e, ++++ = 4.
ESTUDO IMUNOHISTOQUíMICO
Foram obtidos cortes, de 3 µm de espessura, aderidos em lâminas
silanizadas, desparafinizados em xilol e hidratados em concentrações decrescentes
de etanol até água. A recuperação antigênica foi realizada em tampão citrato pH 6,0
(em panela de vapor) por 20 minutos. Após resfriamento, o bloqueio da peroxidase
endógena foi realizado através da aplicação de peróxido de hidrogênio a 3%.
Os anticorpos utilizados foram: Polyclonal rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175)
Antibody
††
, diluição 1:200 e Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear
Antigen (PCNA), Clone PC10
‡‡
, diluição 1:200, para a marcação de Caspase 3 e do
PCNA, respectivamente.
A incubação com o anticorpo primário foi feita por 16 a 18 horas. Após esse
período incubou-se com o anticorpo secundário do Kit LSAB por 30 minutos e o
amplificador do mesmo Kit por mais 30 minutos. A reação foi revelada com
diaminobenzidina (DAB), contracorada com Hematoxilina de Harris e montada em
resina.
††
Cell Signaling
‡‡
Dakocytomation,
13
As células coradas pelo PCNA foram contadas e o índice de PCNA foi
calculado pela contagem de 1000 núcleos em cada lâmina usando a seguinte
formula: (número de células marcadas/número de células coradas e não coradas) x
100. Foi considerado como padrão de positividade o aparecimento de coloração
marrom acastanhada no núcleo para a reatividade ao PCNA, e na região da matriz
citoplasmática para a Caspase 3. O índice para a Caspase-3 foi feito usando o
mesmo procedimento do utilizado para o índice de PCNA.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Todos os dados foram expressos em médias ± DP (desvio padrão). Para a
análise dos resultados foram aplicados os testes segundo a natureza das variáveis.
Para a análise dos resultados foram aplicados os seguintes testes: Análise de
variância por Postos de Kruskal-Wallis para comparar as dosagens bioquímicas e
valores histopatológicos nos grupos IR, IPC, NAC e SHAM; ANOVA com um fator
de variância e posteriormente o Teste de Tukey para múltiplas comparações para
avaliação do PCNA e da caspase-3. Fixou-se o nível de rejeição da hipótese de
nulidade em 0,05 ou 5% (P< 0,05).
14
4. RESULTADOS
Tabela 1: Valores da aspartato aminotransferase – AST em ratos do grupo SHAM
(controle) e em ratos submetidos à isquemia por 40 minutos e 24
horas de reperfusão nos grupos IR (isquemia e reperfusão), IPC
(precondicionamento isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína).
Sham IR NAC IPC
1155 1560 2220 1790
1713 1310 751 998
1250 2072 653 2260
1168 1360 710 1143
782 350 1020 1868
500 440 1070 1120
MÉDIA
DP
1214
333
1330
626
1071
658
1612
528
Análise de Variância por postos de Kruskal – Wallis
( IR x PCI x NAC x S )
H crítico = 7,82 H calculado = 2,60
(p) Kruskal-Wallis = 0,45
AST
SHAM IR IPC NAC
0
1000
2000
Grupos
U/L
Gráfico 1 – Média dos valores séricos de aspartato aminotransferase de cada
grupo.
15
Tabela 2: Valores da alanina aminotransferase – ALT em ratos do grupo SHAM
(controle) e em ratos submetidos à isquemia por 40 minutos e 24
horas de reperfusão nos grupos IR (isquemia e reperfusão), IPC
(precondicionamento isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína).
Sham IR NAC IPC
259 1905 2290 1795
459 926 886 709
189 2005 431 2120
274 624 560 954
231 1330 1060 2273
295 661 1040 1120
MÉDIA
DP
285
93
1242
608
1045
740
1495
654
Análise de Variância por postos de Kruskal – Wallis
( IR x PCI x NAC x S )
H crítico = 7,82 H calculado = 13,54*
IR, IPC, NAC > SHAM
(p) Kruskal-Wallis = 0,0036
ALT
SHAM IR IPC NAC
0
1000
2000
Grupos
U/L
Gráfico 2 – Média dos valores séricos de aspartato aminotransferase de cada
grupo.
16
Tabela 3: Valores da esteatose microvesicular no fígado, observada na microscopia
óptica corada por hematoxilina-eosina , em ratos do grupo SHAM
(controle) e em ratos submetidos à isquemia por 40 mi
nutos e 24
horas de reperfusão nos grupos IR (isquemia e reperfusão), IPC
(precondicionamento isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína).
Sham IR IPC NAC
0,5 2,0 2,0 0
0,5 4,0 2,0 0
1,0 2,0 0 1,0
0,5 4,0 1,0 0
0 1,0 0 0
0 2,0 0 0
MÉDIA
DP
0,4
0,4
2,5
1,2
0,8
1,0
0,2
0,4
Análise de Variância por postos de Kruskal – Wallis
( IR x PCI x NAC x S )
H crítico = 7,82 H calculado = 11,26*
(p) Kruskal-Wallis = 0,01
IR > SHAM
IR > IPC e NAC
FÍGADO
SHAM IR IPC NAC
0
1
2
3
Grupos
Esteatose microvesicular
Gráfico 3 – Média dos valores atribuídos a esteatose microvesicular no fígado de
cada grupo.
17
Tabela 4: Valores do infiltrado inflamatório no fígado, observado na microscopia
óptica corada por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo SHAM
(controle) e em ratos submetidos à isquemia por 40 minutos e 24
horas de reperfusão nos grupos IR (isquemia e reperfusão), IPC
(precondicionamento isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína).
Sham IR IPC NAC
0 2,0 3,0 2,0
0,5 2,0 1,0 2,0
0 2,0 1,0 0
0,5 2,0 1,0 0
1 2,0 2,0 1,0
0 3,0 1,0 1,0
MÉDIA
DP
0,3
0,4
2,2
0,4
1,5
0,8
1,0
0,9
Análise de Variância por postos de Kruskal – Wallis
( IR x PCI x NAC x S )
H crítico = 7,82 H calculado = 13,02*
(p) Kruskal-Wallis = 0,004
IR e IPC > SHAM
NAC < IR
FÍGADO
SHAM IR IPC NAC
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Grupos
Infiltrado Inflamatório
Gráfico 4 – Média dos valores atribuídos ao infiltrado inflamatório no fígado de cada
grupo.
18
Tabela 5: Valores de necrose no fígado, observada na microscopia óptica corada
por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo SHAM (controle) e em
ratos submetidos à isquemia por 40 minutos e 24 horas de reperfusão
nos grupos IR (isquemia e reperfusão), IPC (precondicionamento
isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína).
Sham IR IPC NAC
0 1,0 3,0 2,0
0 1,0 0 0
0 2,0 0 0
0 1,0 0 0
0 2,0 0 0
0 4,0 0 0
MÉDIA
DP
0
0
1,8
1,2
0,5
1,2
0,3
0,8
Análise de Variância por postos de Kruskal – Wallis
( IR x PCI x NAC x S )
H crítico = 7,82 H calculado = 9,44*
(p) Kruskal-Wallis = 0,02
IR > SHAM
IPC e NAC < IR
FÍGADO
SHAM IR IPC NAC
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Grupos
Necrose
Gráfico 5 – Média dos valores atribuídos a necrose no fígado de cada grupo.
19
Tabela 6: Valores de apoptose no fígado, observada na microscopia óptica corada
por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo SHAM (controle) e em
ratos submetidos à isquemia por 40 minutos e 24 horas de reperfusão
nos grupos IR (isquemia e reperfusão), IPC (precondicionamento
isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína).
Sham IR IPC NAC
0 2,0 1,0 0
0 2,0 1,0 0
0 3,0 1,0 0
0 1,0 0 0
0 2,0 0 0
0 3,0 0 0
MÉDIA
DP
0
0
2,2
0,8
0,5
0,5
0
0
Análise de Variância por postos de Kruskal – Wallis
( IR x PCI x NAC x S )
H crítico = 7,82 H calculado = 14,14*
(p) Kruskal-Wallis = 0,002
IR > SHAM
IPC e NAC < IR
FÍGADO
SHAM IR IPC NAC
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Grupos
Apoptose
Gráfico 6 – Média dos valores atribuídos a apoptose no fígado de cada grupo.
20
IPC
IR
NAC
SHAM
Figura 1 – Fotomicrografias mostrando parte de fígados de ratos pertencentes
aos vários grupos de estudo. H.E. 100X
Figura 2 – Fotomicrografias mostrando parte de fígados de ratos pertencentes
aos vários grupos de estudo. Notar no grupo IR hepatócitos com núcleos
condensados (setas). H.E. 400X
IPC
SHAM
NAC
IR
21
Tabela 7: Valores de caspase-3 no fígado, observada na microscopia óptica corada
por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo SHAM (controle) e em
ratos submetidos à isquemia por 40 minutos e 24 horas de reperfusão
nos grupos IR (isquemia e reperfusão), IPC (precondicionamento
isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína).
Sham IR IPC NAC
10 60 48 36
12 62 38 35
9 58 42 34
10 52 40 40
11 55 43 42
9 55 40 38
MÉDIA
DP
10,1
1,07
57
3,37
41,83
3,18
37,4
3,07
Análise de Variância - ANOVA
( IR x PCI x NAC x S )
p < 0,0001
Teste de Tukey
SHAM x IR ( p < 0,001); IR x IPC ( p < 0,001); IR x NAC ( p < 0,001)
FÍGADO
SHAM IR IPC NAC
0
10
20
30
40
50
60
Grupos
% células marcadas Caspase-3
Gráfico 7 – Média dos valores da caspase-3 no fígado de cada grupo.
22
IR
IPC
NAC
SHAM
Figura 3 – Fotomicrografias mostrando fígado de ratos
pertencentes aos vários grupos de estudo. As setas indicam a
reatividade citoplasmática para a caspase- 3 clivada. (400X)
23
Tabela 8: Valores de PCNA no fígado, observado na microscopia óptica corada
por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo SHAM (controle) e em
ratos submetidos à isquemia por 40 minutos e 24 horas de reperfusão
nos grupos IR (isquemia e reperfusão), IPC (precondicionamento
isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína).
Sham IR IPC NAC
10 60 40 30
12 58 38 28
11 62 36 36
15 59 40 30
12 62 40 28
14 56 38 29
MÉDIA
DP
12,33
1,86
59,50
2,34
38,60
1,63
30,40
3,28
Análise de Variância - ANOVA
( IR x PCI x NAC x S )
p < 0,0001
Teste de Tukey
SHAM x IR ( p < 0,001); IR x IPC ( p < 0,001); IR x NAC ( p < 0,001)
FÍGADO
Sham IR IPC NAC
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Grupos
% células marcadas PCNA
Gráfico 8 – Média dos valores do PCNA no fígado de cada grupo.
24
Figura 4 – Fotomicrografias mostrando fígado de ratos
pertencentes aos vários grupos de estudo. As setas indicam a
reatividade nuclear ao PCNA. (400X)
SHAM
IPC
NAC
IR
25
Tabela 9: Valores do infiltrado inflamatório no pulmão, observado na microscopia
óptica corada por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo SHAM
(controle) e em ratos submetidos à isquemia por 40 minutos e 24
horas de reperfusão nos grupos IR (isquemia e reperfusão), IPC
(precondicionamento isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína).
Sham IR IPC NAC
0,5 1,0 0,5 1,0
1,0 0,5 2,0 0,5
0,5 2,0 2,0 1,0
0 2,0 1,0 1,0
0,5 3,0 0,5 2,0
1,0 4,0 1,0 1,0
MÉDIA
DP
0,6
0,4
2,1
1,3
1,2
0,7
1,1
0,5
Análise de Variância por postos de Kruskal – Wallis
( IR x PCI x NAC x S )
H crítico = 7,82 H calculado = 6,21
(p) Kruskal-Wallis = 0,10
PULMÃO
SHAM IR IPC NAC
0
1
2
3
Grupos
Infiltrado Inflamatório
Gráfico 9 – Média dos valores atribuídos ao infiltrado inflamatório no pulmão de cada
grupo.
26
Tabela 10: Valores do espessamento do septo alveolar no pulmão, observado na
microscopia óptica corada por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo
SHAM (controle) e em ratos submetidos à isquemia por 40 minutos
e 24 horas de reperfusão nos grupos IR (isquemia e reperfusão),
IPC (precondicionamento isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína).
Sham IR IPC NAC
0,5 2,0 0,5 1,0
2,0 1,0 2,0 1,0
0,5 2,0 2,0 1,0
0,5 3,0 0,5 0,5
0,0 3,0 0,0 2,0
0,0 4,0 1,0 1,1
MÉDIA
DP
0,6
0,7
2,5
1,0
1,0
0,8
1,1
0,5
Análise de Variância por postos de Kruskal – Wallis
( IR x PCI x NAC x S )
H crítico = 7,82 H calculado = 9,88*
(p) Kruskal-Wallis = 0,01
IR e IPC > SHAM
NAC < IR
PULMÃO
SHAM IR IPC NAC
0
1
2
3
Grupos
Espessamento do septo
Gráfico 10 – Média dos valores atribuídos ao espessamento do septo alveolar no
pulmão de cada grupo.
27
Tabela 11: Valores da congestão no pulmão, observada na microscopia óptica
corada por hematoxilina–
eosina, em ratos do grupo SHAM
(controle) e em ratos submetidos à isquemia por 40 minutos e 24
horas de reperfusão nos grupos IR (isquemia e reperfusão), IPC
(precondicionamento isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína).
Sham IR IPC NAC
0,0 2,0 0,5 2,0
1,0 0,5 2,0 0,5
1,0 2,0 2,0 1,0
1,0 2,0 0,5 0,5
0,0 3,0 0,0 2,0
0,0 4,0 1,0 1,2
MÉDIA
DP
0,5
0,5
2,3
1,2
1,0
0,8
1,2
0,7
Análise de Variância por postos de Kruskal – Wallis
( IR x PCI x NAC x S )
H crítico = 7,82 H calculado = 5,83
(p) Kruskal-Wallis = 0,11
PULMÃO
SHAM IR IPC NAC
0
1
2
3
Grupos
Congestão
Gráfico 11 – Média dos valores atribuídos a congestão no pulmão de cada grupo.
28
IR
NAC
SHAM
IPC
NAC
IR
SHAM
IPC
Figura 5 – Fotomicrografias mostrando parte do pulmão de ratos
pertencentes aos vários grupos de estudo. Notar no grupo IR
região de alvéolos alterados. H.E. 100X.
Figura 6 – Fotomicrografias mostrando parte do pulmão de ratos
pertencentes aos vários grupos de estudo. Notar no grupo IR
pulmão com septos espessados. H.E. 400X.
29
Tabela 12: Valores de caspase-3 no pulmão, observada na microscopia óptica
corada por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo SHAM (controle)
e em ratos submetidos à isquemia por 40 minutos e 24 horas
de reperfusão nos grupos IR (isquemia e reperfusão), IPC
(precondicionamento isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína).
Sham IR IPC NAC
0,01 12,0 7,0 4,0
0,04 13,0 8,0 4,0
0,02 12,0 6,0 5,0
0,01 11,0 7,0 3,0
0,01 14,0 8,0 5,0
0,03 12,0 8,0 6,0
MÉDIA
DP
0,02
0,01
12,33
1,03
7,33
0,81
4,50
1,04
Análise de Variância - ANOVA
( IR x PCI x NAC x S )
p < 0,0001
Teste de Tukey
SHAM x IR ( p < 0,001); IR x IPC ( p < 0,001); IR x NAC ( p < 0,001)
PULMÃO
SHAM IR IPC NAC
0
10
20
30
40
50
60
Grupos
% células marcadas Caspase-3
Gráfico 12 – Média dos valores da caspase-3 no pulmão de cada grupo.
30
IR
NAC
SHAM
IPC
Figura 7 – Fotomicrografias mostrando pulmões de ratos
pertencentes aos vários grupos de estudo. As setas indicam a
reatividade citoplasmática para a Caspase-3. (400X)
31
Tabela 13: Valores de PCNA no pulmão,observado na microscopia óptica corada
por hematoxilina–eosina, em ratos do grupo SHAM (controle) e em
ratos submetidos à isquemia por 40 minutos e 24 horas de reperfusão
nos grupos IR (isquemia e reperfusão), IPC (precondicionamento
isquêmico) e NAC (N-acetilcisteína).
Sham IR IPC NAC
0,01 6,3 2,8 1,4
0,01 6,2 2,7 1,3
0,01 6,2 2,7 1,4
0,01 6,1 2,7 1,4
0,01 6,2 2,6 1,4
0,02 6,1 2,8 1,5
MÉDIA
DP
0,01
0,00
6,18
0,07
2,71
0,07
1,40
0,06
Análise de Variância - ANOVA
( IR x PCI x NAC x S )
p < 0,0001
Teste de Tukey
SHAM x IR ( p < 0,001); IR x IPC ( p < 0,001); IR x NAC ( p < 0,001)
PULMÃO
Sham IR IPC NAC
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Grupos
% células marcadas PCNA
Gráfico 13 – Média dos valores do PCNA no pulmão de cada grupo.
32
SHAM
IPC
IR
NAC
Figura 8 – Fotomicrografias mostrando pulmões de ratos
pertencentes aos vários grupos de estudo. As setas indicam a
reatividade nuclear ao PCNA. (400X)
33
5. DISCUSSÃO
Os procedimentos cirúrgicos complexos sobre o fígado, tais como ressecções
extensas, transplante e trauma, incluem na maioria das vezes a oclusão temporária
do pedículo hepático. A hipóxia gerada desencadeia o processo lesivo de isquemia
que se intensifica com a reperfusão do fígado, comprometendo não somente o
fígado mas também outros órgãos à distância. Esta lesão de isquemia e reperfusão
vem sendo estudada para esclarecimentos da sua fisiopatologia e para o
desenvolvimento de estratégias moduladoras, com o intuito de minimizar a sua
repercussão local e sistêmica.
A escolha do modelo animal utilizado, o rato, deve-se à facilidade de
obtenção, ao amplo conhecimento da fisiologia, a resistência às infecções e baixa
mortalidade, ao baixo custo e a manutenção do mesmo modelo utilizado em outros
estudos da linha de pesquisa
50,51,53,54,58
.
Entretanto, este animal requer uma maior
habilidade cirúrgica, com o uso de técnica microcirúrgica, além de apresentar
algumas diferenças anatômicas em relação ao fígado humano, tais como ausência
da vesícula biliar e a multilobulação do órgão. Além disto, a lesão de isquemia e
reperfusão com clampeamento seletivo do pedículo hepático encontra-se bem
estabelecida em ratos, assim como o padrão bioquímico, histológico e
imunohistoquímico, com a existência de anticorpos disponíveis e de fácil acesso.
Na literatura existem vários protocolos anestésicos e, para este experimento,
optou-se por um modelo que vem sendo empregado nesta linha de pesquisa porque
proporciona um plano anestésico adequado ao procedimento, além de ser
administrado pela via intramuscular, que não compromete as vias respiratórias do
animal, fato particularmente importante nesta pesquisa posto que o pulmão foi
estudado
50,
.
A abordagem do fígado por laparotomia mediana permite uma adequada
exposição do hilo hepático e a abordagem da veia cava abdominal, promove menos
sangramento, além da facilidade da extensão da incisão para a retirada do pulmão.
Esse estudo utilizou o modelo de isquemia e reperfusão seletiva por
clampeamento do pedículo dos lobos lateral esquerdo e mediano, que tem sido
usado para avaliar a função hepática, alterações estruturais
44,45,56,57,64,65,75
e a
34
microcirculação hepática
56,63
diminuindo a congestão vascular esplâncnica e
conseqüente interferência de mediadores inflamatórios intestinais na fase da
reperfusão hepática
64
.
A escolha do tempo de duração da isquemia baseou-se na intensidade da
lesão induzida ao fígado e órgãos remotos
64
, mantendo o que vem sendo
empregado nos trabalhos anteriores desta mesma linha de pesquisa. A comparação
de tempos de isquemias, variando de 45 minutos até 120 minutos com a mesma
duração de reperfusão, mostrou um aumento progressivo nas transaminases,
indicando uma relação tempo-dependente da isquemia e gravidade da lesão
hepática
11
. Em 30 minutos de isquemia seletiva, as alterações promovidas estão
mais relacionadas à redução do ATP
47
e, em períodos de até 60 minutos, ainda
ocorrem lesões reversíveis no parênquima hepático
64
. Quando se analisa
hepatócitos o end point está acima de 90 minutos
64
. Nesse período de 40 minutos de
isquemia, obteve-se lesão hepática, que pode ser identificada pelo aumento da
transaminases, sem a ocorrência de mortalidade nos animais,.
Nessa linha de pesquisa, o IPC havia sido avaliado após isquemia de 40
minutos na fase precoce
50,51
e intermediária da reperfusão hepática
50
, não tendo
sido avaliado na fase tardia, no modelo de isquemia seletiva. Quanto à NAC, foi
avaliada em isquemia total e parcial do pedículo hepático na fase precoce
51,53,54,58
.
Na fase tardia, o experimento foi realizado com isquemia total
58
, em que se avaliou a
repercussão pulmonar com isquemia total e duração mais curta da oclusão do aporte
sangüíneo
58
.
Em relação às aminotransferases não se observou diferença na atividade da
AST entre os grupos e com referência à ALT somente ocorreu diferença estatística
em relação ao grupo controle. Esses resultados podem ser explicados pelo tempo de
reperfusão avaliado associado ao tamanho reduzido da amostra. Essas enzimas no
plasma encontram-se em baixas concentrações e seu aumento reflete uma
disfunção ou perda da integridade da membrana celular, sendo usadas
1,29,41,56,57,65
como indicadores da integridade dos hepatócitos, principalmente a ALT. Na
literatura
1,29,56,57
, tem-se observado um aumento dessas enzimas em animais
submetidos à isquemia e reperfusão na fase precoce ou inicial da fase tardia da
lesão. Nesses experimentos, verifica-se morte celular principalmente por necrose,
35
enquanto em experimentos de fase tardia predomina a apoptose, processo no qual
não ocorre lise da membrana celular. Em alguns desses estudos
1,29,56,57
, ocorreu
redução da AST e, principalmente, da ALT, com a modulação por IPC e NAC. Em
tempo de isquemia maior que 60 minutos foi observado em 24 horas de reperfusão,
um aumento da atividade da ALT em relação ao grupo sem isquemia, no entanto,
essa diferença foi menor que no período de duas horas de reperfusão do mesmo
experimento, que teve o pico de atividade em torno de seis horas de reperfusão
65
.
Peralta et al
2
, em 90 minutos de isquemia e 24 horas de reperfusão, obtiveram uma
diferença significante com o IPC, na dosagem da ALT e AST, mas também nesse
estudo foi verificada uma redução das transaminases quando comparadas ao tempo
de reperfusão de seis horas. Esses dados corroboram a hipótese de maior gravidade
da lesão hepática relacionada ao tempo de isquemia
11,64
, já que o aumento de
atividade das transaminases liberadas pelas células hepáticas está diretamente
ligado ao número de hepatócitos lesados. A dosagem da ALT usada em nosso
trabalho foi adequada para mostrar a existência de dano hepático no tempo de 40
minutos de isquemia hepática. No entanto, como observamos um maior tendência
no número de células apoptóticas em relação às células necróticas, isto pode estar
relacionado à meia vida das transaminases, ou seja, esse aumento deve ter ocorrido
na fase inicial da reperfusão, na qual a morte celular parece ser mais relacionada à
necrose
65
.
Neste trabalho optou-se por avaliar o papel do precondicionamento isquêmico
e da N-acetilcisteína por meio de estudo morfológico e imunohistoquímico, além do
bioquímico. Essa metodologia mostrou-se adequada para esta análise, já que se
conseguiu obter resultados com significância estatística com um número reduzido de
animais, conforme uma tendência dos grandes centros de pesquisa na
área
1,3,9,10,52,56
, para as avaliações teciduais.
A avaliação histológica pela microscopia óptica tem permitido a diferenciação
de lesões reversíveis e irreversíveis no tecido hepático e em outros órgãos
acometidos. Foram observadas a esteatose microvesicular, a infiltração leucocitária,
presença de células apoptóticas e necrose no fígado dos animais como parâmetros
de lesão parenquimatosa.
36
A esteatose microvesicular provém de um acúmulo de vacúolos de gordura na
célula, e é vista como pequenas gotículas de gordura, finamente dispersas no
citoplasma, sem deslocar o núcleo e resulta da lesão aguda promovida pela
isquemia e reperfusão
63
. Está freqüentemente associada com a diminuição da beta-
oxidação dos lipídeos e alterações inflamatórias
63
. A esteatose microvesicular tem
sido observada em outros estudos
50,51
, mas não se sabe ainda predizer seu valor na
lesão tecidual por IR. Recentemente observou-se, em estudo experimental, que
fígados com macroesteatose são mais susceptíveis que fígados com microesteatose
à lesão de isquemia e reperfusão
66
. No nosso trabalho, pode-se observar que tanto
o IPC quanto a NAC foram capazes de reduzir sua ocorrência.
O exato mecanismo da morte celular na lesão de IR não está totalmente
esclarecido. Recentemente, um estudo
65
demonstrou que, após isquemia seletiva do
fígado de 60 minutos, a morte celular na fase precoce da lesão ocorreu
principalmente por necrose, enquanto na fase tardia, com 24 horas de reperfusão,
houve um deslocamento para a morte celular por apoptose. Observou-se também,
um aumento tempo-dependente do número de células apoptóticas no fígado em
relação à isquemia
29,65,67
. Kohli et al
67
relataram que entre 40% e 60% dos
hepatócitos entram em processo de apoptose durante a reperfusão. Nossos
resultados são concordantes com esses estudos, já que no grupo submetido à
isquemia e reperfusão sem estratégia de modulação, a atividade da caspase-3
apresentou uma positividade de 57%, como observado em outros trabalhos
64,68
, que
foi significantemente reduzida com o IPC e a NAC. Isto sugere que a inibição da
apoptose tem um papel importante na redução da lesão de isquemia e reperfusão
hepática com ambas as estratégias de modulação.
Alguns experimentos usaram o TUNEL para avaliar a apoptose, no entanto, a
capacidade desse método para distinguir a apoptose da necrose tem sido
questionada
64,69
. A técnica de TUNEL, marca a porção terminal da hélice do DNA
fragmentado, pela utilização de deoxiuridina tri-fosfato e visualização por
imunohistoquímica. Porém, é possível a marcação de resíduos do núcleo de células
necróticas, que seriam erroneamente identificadas como corpúsculos
apoptóticos
64,69
. Outros trabalhos têm usado outra técnica imunohistoquímica, a
marcação de anticorpos anti-caspase-3 clivada
10,65,72
. As caspases, proteases que
37
existem como pró-enzimas ativas, sofrem uma clivagem para serem ativadas e
efetivar a apoptose. O processo pode ser dividido em uma fase de atividade
catalítica ativa das caspases e uma fase efetora, na qual as caspases atuam
promovendo a morte celular. Entre as caspases efetoras estão as caspases
3,6 e 7.
Em especial, a ativação da caspase-3 ativa a Dnase citoplasmática clivando um
inibidor da enzima e induzindo a clivagem internucleossomal do DNA
7
. Sua
importância tem sido demonstrada com inibidores da caspase no bloqueio da
apoptose
42,65
. Em virtude do exposto, utilizamos esta última técnica.
No entanto, existe discordância da primazia da morte por apoptose na lesão
de IR. Jaeschke
69
e Jaeschke & Lemasters
70
têm relatado que a principal forma de
morte celular na lesão por isquemia, fria ou normotérmica, é a necrose e não a
apoptose. Eles acreditam que haja um erro de interpretação pelos métodos
utilizados nos trabalhos
65,71,72
, fazem críticas à utilização do TUNEL e descrevem o
estudo histológico apurado como o método de escolha; entre os estudos
imunohistoquímicos, defendem a avaliação da atividade da caspase-3 como um
método complementar mais adequado para avaliar a apoptose. Relataram ainda que
o grande aumento das aminotransferases encontrado, também, na fase tardia
reforça a maior lesão hepática por necrose celular. Entretanto, deve ser levado em
consideração, que a meia vida das aminotransferases é bastante variável e longa,
podendo justificar os níveis de atividade na fase tardia da lesão
73
. Os autores
70
,
descreveram que a isquemia desencadeia um sinal de morte celular que pode levar
à apoptose ou à necrose até o momento em que se torna irreversível, dependendo
de fatores como a diminuição dos níveis de ATP, e denominaram este processo de
“necroapoptose”. Em nosso experimento na avaliação morfológica foi observada
uma tendência maior de apoptose sobre a necrose nos animais submetidos à IR e
pode-se verificar que o IPC e a NAC reduziram a apoptose, assim como, as áreas de
necrose.
Tradicionalmente, a morte por apoptose caracteriza-se pela ausência de
inflamação adjacente, enquanto, na morte celular por necrose é freqüente
7
. No
entanto, trabalhos recentes têm demonstrado que a apoptose, direta ou
indiretamente, promove resposta inflamatória, assim como, a subseqüente lesão por
isquemia e reperfusão
74,75
. Nesse estudo de isquemia e reperfusão renal, onde a
38
apoptose foi inibida, se observou prevenção do aumento da MIP-2 e da conseqüente
piora do infiltrado neutrófilo. Esse conceito de inflamação induzida pela apoptose
após IR oferece importantes novas oportunidades para efetivamente prevenir
manifestações clinicas de lesão por reperfusão, pelo bloqueio da apoptose.
A inflamação tem sido implicada, como importante causa da lesão tecidual
2
.
Em trabalho recente
2
, em modelo de isquemia e reperfusão hepática, obteve-se a
redução do infiltrado neutrófilo, estresse oxidativo, das alterações de permeabilidade
vascular e edema hepático com o bloqueio da MIP-2 através do aumento do Bcl-2 e
da utilização do IPC, isoladamente. No entanto, o bloqueio da lesão de IR somente
foi alcançado com a utilização conjunta das estratégias. Sugerindo que o mecanismo
de ação do IPC no fígado não interfere na produção de proteínas antiapoptóticas. No
fígado do nosso estudo, o infiltrado leucocitário apresentou-se aumentado com a
isquemia e reperfusão e se tornou acentuadamente minimizado com a NAC e houve
uma tendência à queda da infiltração leucocitária com o IPC. No entanto, esses
resultados podem advir da prevenção da necrose, também observada na avaliação
histológica.
Ainda, no experimento feito por Peralta et al
2
com o IPC houve a presença de
pequenas áreas focais de necrose de coagulação, enquanto com o Bcl-2, ocorreram
somente pequenas áreas focais de necrose incipiente. Afirmaram ainda, baseados
na análise de mieloperoxidase, usada como marcador de infiltração e ativação
neutrófila, que o bloqueio da MIP-2 parece ser melhor que o IPC contra a resposta
inflamatória, já que o IPC manteve uma diferença estatística com os animais
controle. Em nosso experimento não se utilizou outros métodos diagnósticos o que
impossibilita afirmar mais sobre essa persistência do infiltrado inflamatório. No
entanto, em outro estudo Peralta et al
45
também não obtiveram, com o uso de IPC,
redução do infiltrado inflamatório no fígado, apesar de obter redução da lesão de IR
por outros parâmetros. Neste trabalho os autores observaram ainda que o IPC não
reduz a P-selectina no fígado, enquanto em alguns órgãos distantes está reduzida,
produzindo uma diminuição do infiltrado inflamatório. Em estudo de isquemia e
reperfusão normotérmica, Yadav et al
41
relataram uma proteção do IPC pela inibição
de mecanismos pro-apoptóticos, incluindo a ativação das caspases, sem, no
entanto, aumentar a expressão de fatores anti-apoptóticos, como a Bcl-2. Esses
39
resultados proporcionaram uma melhora da lesão hepática, mas, não a preveniram
totalmente, tal qual nos experimentos realizados por Peralta et al
2,45
e em nosso
experimento.
Na lesão de isquemia e reperfusão tem sido mostrado que a apoptose e a
regeneração de hepatócitos co-existem e que a manutenção da massa hepática é
regulada pelos dois processos
31
. A proliferação celular induzida pela lesão de IR
seria parte do processo de reparo tecidual e os genes de ativação imediata (IEGs)
parecem ter um papel determinante
32
. Dentre esses genes destacam-se, o c-fos, c-
jun e c-myc, como relacionados à proliferação celular
7,31
e que estão ativados no
processo de apoptose
30,76
. Da mesma forma, outros trabalhos
31,32
também
demonstraram que a expressão de c-fos e c-jun está aumentada no fígado após
isquemia e reperfusão hepática e esse aumento foi associado com dano hepático,
seguido de regeneração. Sharma et al
77
suprimiram a ativação da caspase e o nível
de mRNA de c-fos para prevenir a apoptose com o uso de um antagonista da
angiotensina II, reconhecida como indutora de apoptose, em células vasculares no
infarto agudo do miocárdio. No fígado, Ishii et al
29
observaram com 24 horas de
reperfusão uma relação entre a lesão celular, a proliferação e obtiveram picos de c-
fos e c-jun em torno de uma hora após a reperfusão.
Entre os métodos usados para avaliar a proliferação hepatocelular, está o
antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), que é expresso na fase G1 tardia e
durante a fase S do ciclo celular
78
. A escolha do anticorpo monoclonal anti-PCNA
deveu-se à facilidade de se poder trabalhar com tecido fixado em parafina, ser
resistente a fixação em formol, apresentar uma meia vida longa de
aproximadamente vinte horas, indicando que o núcleo pode permanecer positivo
mesmo após o estímulo
78
. Desta maneira, pode-se avaliar o grau de lesão da
isquemia e reperfusão tanto pela monitorização da apoptose quanto pela
proliferação celular.
Pelos nossos resultados pode se sugerir que a reação de proliferação celular
acompanhou a apoptose dos hepatócitos na mesma proporção, como parte do
processo de reparo celular, estando refletida na marcação da caspase-3 e do PCNA.
Recentemente, os resultados de Yamada et al
79
mostraram-se concordantes com
os nossos. Eles compararam ratos com 40, 60, 90 e 120 minutos de isquemia, e
40
observaram que ocorreu uma relação tempo-dependente inversa entre o
aparecimento de áreas de necrose e proliferação celular, e que no tempo de 40
minutos de isquemia o pico máximo do PCNA aconteceu entre os dias 1 e 3 após a
reperfusão, verificando-se em 24 horas uma relação com a morte celular no figado.
Em nosso experimento, não se pode afirmar temporalmente quando acontece a
ativação no ciclo celular, já que foi avaliado um único momento da reperfusão.
Schlossberg et al
30
, avaliando progressivamente a reperfusão, encontraram uma
redução drástica entre 6 e 20 horas na atividade do PCNA por imunofluorescência.
Entretanto, analisaram somente dois animais em cada tempo de reperfusão, o que
não permitiu uma análise estatística. Em nosso estudo, foi encontrado em torno de
60% de hepatócitos marcados pelo PCNA nos animais submetidos somente à
isquemia e reperfusão, e tanto o IPC quanto a NAC reduziram a proliferação celular.
Este resultado permite afirmar que o estímulo para o reparo tecidual está presente
após 24 horas de reperfusão, corroborando os estudos de Yamada et al
79
. Tem sido
relatada também, a relação entre o grau da lesão hepática pós IR e a proliferação
celular, com influência sobre a mortalidade dos animais, relacionada aos genes de
ativação imediata
29,30,32
.
Estudos
25,26,80
em hepatectomia parcial mostraram que a iniciação da
resposta regenerativa depende da ativação precoce da IL-6, que exerce potente
ação antiinflamatória no processo de isquemia e reperfusão
80,81
e do TNF-α, que
também é liberado na fase aguda da isquemia
40,64
. Porém, os mecanismos de ação
da IL-6 na regeneração hepática seriam diferentes daqueles envolvidos na lesão de
reperfusão
81
. Na modulação da lesão de IR, o IL-6 estaria relacionado à redução do
TNF-α, enquanto na regeneração, atuaria por efeito direto nos hepatócitos,
induzindo a translocação do fator de transcrição STAT-3, do citoplasma para o
núcleo, causando assim, ativação de genes imediatos, síntese de DNA e mitose
28,82
.
Outros autores
22-26
também fazem referência a participação das citocinas envolvidas
no processo inflamatório da lesão de IR hepática e na remodelagem tissular do
fígado. No entanto, essa não deve ser a única forma de indução da proliferação
celular de hepatócitos, já que em camundongos knockout para TNF e IL-6, tratados
com mitógenos primários, ocorreu proliferação celular
82
.
41
Para avaliar o efeito do IPC e da NAC no pulmão, utilizamos o estudo
histológico e imunohistoquímico.
O índice de atividade da caspase-3 demonstrou a ocorrência de apoptose no
pulmão e uma redução com a modulação pelo IPC e a NAC. No entanto, não
pudemos associar esses resultados com o estudo histológico na NAC. Essa redução
da apoptose não impediu a presença de alterações, sugerindo que o mecanismo de
proteção do pulmão pela NAC na lesão de isquemia e reperfusão hepática, envolve
uma outra via além da apoptose.
Em estudo anterior dessa linha de pesquisa, com 30 minutos de isquemia
total do pedículo hepático, também com vinte e quatro horas de reperfusão não se
obteve melhora da lesão de IR no pulmão, avaliada somente por dados
morfológicos
58
, ainda que nos tempos mais precoces houvesse redução da lesão
pulmonar após reperfusão. Entretanto, ao se avaliar a eficácia da NAC no pulmão,
imediatamente após 30 minutos de isquemia, não se observou melhora da lesão em
relação aos animais submetidos somente à isquemia
83
. Em estudo ïn vitro,
Weibroum et al
84
demonstraram com o uso da NAC uma diminuição da atividade da
xantina oxidase e manutenção da GSH. Em outro experimento
52
demonstraram que
a reperfusão isolada do pulmão com NAC, por mais tempo que a perfusão conjunta
com o fígado, alcançou melhora dos parâmetros estudados no pulmão.
Recentemente, em estudo
85
com a NAC, utilizada somente antes da isquemia, em
uma e três horas de reperfusão, ocorreu melhora do edema pulmonar. Neste
experimento, foi identificada uma redução do TNF-α, com a NAC, nesses períodos
de observação. No entanto, não foi realizada avaliação histológica.
Nos trabalhos publicados em relação ao pulmão, pode-se observar o efeito da
NAC na fase inicial
58
e intermediária
58,,84
da lesão. Esse resultado tem independido
do período de utilização da NAC. Nosso experimento no pulmão pode identificar o
beneficio da NAC na fase tardia pela redução da caspase-3, apesar de não se
verificar repercussão histológica.
No pulmão, o precondicionamento isquêmico hepático reduziu o
espessamento da parede do alvéolo, mas não apresentou redução do infiltrado
inflamatório e da congestão, sendo que na avaliação imunohistoquímica, houve uma
redução significante da apoptose e da proliferação celular. Também, em relação ao
42
IPC, o mecanismo de ação da lesão remota no pulmão, está associado à apoptose,
mas outra via deve ser considerada. Peralta et al
45
sugerem o TNF-α como o
principal mediador que pode disparar a resposta inflamatória em órgãos remotos.
Em estudo onde utilizou o IPC, obteve-se o bloqueio do aumento de P-selectina
provavelmente pela inibição da liberação sistêmica do TNF-α pelas células de
Kupffer, já que com o uso de anti-TNF-α preveniu a resposta inflamatória no pulmão.
Este resultado difere do nosso, o que talvez possa ser explicado pelo maior tempo
de isquemia utilizado, 90 minutos, além de realizar isquemia somente do lobo direito
do fígado.
Dentre as estratégias de modulação da lesão de IR hepática, o IPC tem sido
alvo de vários estudos
1-3,10,33,44
, inclusive da linha de pesquisa, a qual este
experimento faz parte
50,51
.
Em modelos experimentais in vivo ou in vitro, o tempo aplicado no
precondicionamento isquêmico parece ser determinante para permitir a tolerância à
lesão de IR. Períodos de isquemia menores que 5 minutos ou maiores que 15
minutos têm falhado na indução da proteção ao fígado
41
. Na reperfusão períodos
menores que 5 minutos ou que excedam a 15 minutos também não têm logrado
êxito
41
. Outros estudos
39,50,51
, inclusive clínicos
46-48
que foram iniciados
recentemente, têm optado por utilizar 10 minutos de isquemia com 10 minutos de
reperfusão, nesses tempos ocorre um aumento de adenosina tecidual, sem acúmulo
simultâneo da xantina oxidase
40
. Esses níveis aumentados de adenosina tecidual na
fase isquêmica favoreceriam a síntese de óxido nítrico, promovendo proteção na
fase de reperfusão
39
ou ainda, o estresse oxidativo liberaria TNF-α em pequena
quantidade, o suficiente para indução de IL-6
40
.
Pode-se constatar neste estudo uma proteção do IPC ao fígado, pela
diminuição da apoptose e da necrose, entretanto, o IPC não foi capaz de impedir a
presença do infiltrado inflamatório, conforme a avaliação histológica. Este resultado
encontra-se em consonância com Peralta et al
45
que também verificaram a
manutenção do infiltrado inflamatório no fígado, sugerindo que o IPC atua sobre a
apoptose e a necrose, mas existe outro mecanismo presente na lesão de isquemia e
reperfusão capaz de manter a infiltração inflamatória. Outros trabalhos
2,45
que
43
analisaram o efeito do IPC na apoptose, também não obtiveram um bloqueio do
infiltrado inflamatório, e sim, redução.
Peralta et al
1
estudaram o efeito do IPC no fígado e pulmão, correlacionando-
o com os níveis circulantes de xantina e da conversão de xantina desidrogenase
para xantina oxidase. Nesse trabalho, o IPC conseguiu reduzir ambas, reduzindo a
lesão do fígado e também o espessamento da parede do alvéolo e o infiltrado
neutrófilo. No entanto, analisaram a fase precoce da lesão usando um tempo de
isquemia maior e uma área menor do fígado.
Selzner et al
82
, em experimento com hepatectomia parcial, observaram uma
redução da regeneração hepática com a isquemia fria e em animais pré-tratados
com IL-6 obtiveram índices de regeneração comparáveis ao dos animais submetidos
somente à hepatectomia. Correlacionaram essa piora da regeneração à redução do
TNF-α e da IL-6. Teoh et al
86
corroboraram essa hipótese em trabalho com isquemia
normotérmica e apresentaram a hipótese
87
de que com o IPC a entrada dos
hepatócitos no ciclo celular se daria duas horas após o processo de isquemia e
reperfusão e, por interferência na liberação de TNF-α, ativaria o fator de transcrição
NF-κΒ, o SAPK (p38) e o JNK-1, e este último também pela via da iNOS, liberando
NO. O NF-κΒ atuaria sobre IL-6 e os outros dois atuariam direto nas ciclinas do
grupo D. Tudo isto, ocorreria para favorecer a sobrevivência dos hepatócitos na
lesão de isquemia e reperfusão. Para os autores, os efeitos do TNF-α se
estenderiam da indução da morte à promoção de regeneração celular
40
. Reforçando
esse conceito, anticorpos anti-TNF-α em ratos reduziram a lesão hepática, pela
inibição da apoptose, assim como, o uso de pentoxifilina, que suprime a síntese de
TNF-α pelas células de Kupffer, diminuiu a apoptose e a conseqüente lesão de IR
88
.
O fator JNK também estaria implicado na ocorrência de apoptose ao mesmo tempo
em que induz a ciclina D1
40
. A participação de IEGs na mediação pelo IPC, na
proteção da lesão hepática, também foi relatada com a ocorrência de redução de c-
fos e c-jun em ratos submetidos a 40 minutos de isquemia e observados na fase
precoce e tardia da lesão
29
. Estas hipóteses sugerem que a origem da proliferação
celular no processo de IR esta ligada ao reparo celular para manutenção da massa
hepática, e que o IPC mantém essa óptica original do fígado. Esses mecanismos de
ação do IPC ainda não se encontram totalmente esclarecidos, assim como os
44
próprios mecanismos da lesão de IR. No pulmão, em nosso experimento, o IPC
diminuiu a apoptose induzindo uma proteção ao órgão, verificada pela diminuição do
espessamento da parede dos alvéolos.
Em nosso estudo pode-se traçar uma linha de relação entre a apoptose e a
proliferação celular contribuindo para a idéia de que o IPC por um estresse oxidativo
não deletério para o fígado, pode induzir a liberação de TNF-α e,
conseqüentemente, levar à apoptose pela ativação da caspase-3 e ao estímulo da
proliferação celular, pelo menos no tempo de isquemia usado.
Apesar da ampla literatura sobre o uso de N-acetilcisteína, os tempos e
formas de utilização são muito diversos, dificultando uma comparação de resultados.
A NAC apresentou uma proteção à lesão de isquemia e reperfusão no fígado,
demonstrada pelos parâmetros histológicos, assim como, pela imunohistoquímica.
Seu papel protetor tem sido descrito pelos seguintes mecanismos, aumento da
reserva citoplasmática de glutationa reduzida, ação como antioxidante direto, além
de efeito sobre a microcirculação
56
.
Em estudo anterior de isquemia e reperfusão hepática
53
, não foi identificado
aumento intracelular da glutationa reduzida, que é o mecanismo pelo qual a NAC
protege o fígado na hepatite pelo acetoaminofen. Também Lauz
54
encontrou a
concentração de glutationa total e reduzida inalterada, após o uso de N-
acetilcisteína, em modelo de isquemia total no fígado de ratos. A utilização de um
outro precursor da glutationa reduzida, também não obteve aumento da GSH
89
em
modelo de isquemia total do pedículo hepático. Ainda, em outro experimento
58
avaliando a glutationa hepática e pulmonar, em isquemia total do pedículo hepático
por trinta minutos e reperfusão de vinte e quatro horas, não foi identificada alteração
das concentrações de GSH e GSSG. Esses resultados sugerem que o mecanismo
de ação da NAC na lesão de isquemia e reperfusão hepática não ocorra pelo
aumento da glutationa. Recentemente
90
, a utilização de glutationa, reduziu a lesão
de IR, aumentando a quantidade de GSH e GSSG no plasma, mas não alterando
sua quantificação no tecido hepático. Os autores propõem que o mecanismo de
ação tenha ocorrido pela redução do estresse oxidativo vascular, produzido pela
ativação das células de Kupffer. Estes trabalhos sugerem que na lesão de isquemia,
o mecanismo de ação da N-acetilcisteína possa ocorrer pela reação direta com o
45
óxido nítrico. Este efeito parece ocorrer após a liberação das espécies reativas de
oxigênio, protegendo as células endoteliais e a subseqüente ativação das células de
Kupffer. Sua ação através dos grupos sulfidrila impediria a reação do óxido nítrico
com o radical superóxido, o peróxido de hidrogênio, e o radical hidroxila impedindo a
formação de peroxinitrito e suas conseqüências, como a peroxidação lipídica,
desnaturação proteica e dano ao DNA
56
.
Recentemente
56
, o uso de NAC no início da fase tardia da lesão de IR reduziu
a formação de S-nitrotiois (RSNOs), que podem ser formados a partir de reações do
NO. Estes são mais estáveis, e podem atuar com moléculas doadoras de NO
provocando alterações na microcirculação e agregação plaquetária. As alterações
vistas na microcirculação no grupo IR relacionaram-se negativamente com as
alterações de RSNOs
56
. Os autores sugeriram que a redução dessas alterações com
a NAC fossem uma conseqüência da inibição da expressão de iNOS e seqüestro de
peroxinitrito, que pode gerar RSNOs através de uma reação de NO com EROS. Em
modelo de isquemia e reperfusão seletiva, Hur et al
91
sugeriram que o NF-κΒ é
ativado pelo estresse oxidativo e, este fator de transcrição, seria responsável pela
indução do iNOS gene. Nesse trabalho, a administração de NAC antes da
reperfusão bloqueou a ativação da NF-κΒ e inibiu a expressão de iNOS mRNA.
O mecanismo acima proposto sugere, juntamente com nosso resultado da
expressão da atividade do PCNA, que o mecanismo de ação pelo qual acontece a
proliferação celular com a NAC, difere do possível mecanismo do IPC, através da IL-
6
44
, já que este dependeria da ativação do NF-κΒ. Outro experimento também
evidenciou a redução do NF-κΒ com o uso da NAC, Kin et al
92
verificaram em
cardiomiócitos uma redução da apoptose pela diminuição da atividade da caspase-3
e aumento de Bcl-2, assim como, redução do TNFα e da IL-6. Esse trabalho
corrobora com nossa hipótese sobre a via da proliferação celular pela NAC, já que
ela reduziu em nosso experimento a atividade da caspase-3 e do PCNA. Com
nossos resultados, pode-se verificar uma proteção da NAC ao fígado na fase tardia
da lesão de IR hepática, no entanto, no pulmão essa proteção não se refletiu na
macroestrutura, apesar da redução da apoptose.
46
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste estudo utilizou-se dois moduladores que têm seus mecanismos de
ação na proteção da lesão de IR ainda não totalmente esclarecidos e que nesta fase
da lesão também têm sido menos estudados.
Os resultados evidenciam uma proteção do fígado pela N-acetilcisteína e pelo
precondicionamento isquêmico e também uma proteção ao pulmão de ambos os
moduladores na fase tardia da lesão de isquemia e reperfusão hepática.
Esses achados nos permitem sugerir que tanto o IPC quanto a NAC atuam
sobre a cascata das caspases inibindo a apoptose. Com ambos os moduladores,
também se pode observar que o fígado e o pulmão conseguem manter a indução da
proliferação celular, permitindo o processo de manutenção do reparo celular após a
lesão de isquemia e reperfusão hepática neste modelo de IR.
A maior necessidade de órgãos para transplante, pelo aumento de doenças
crônicas, e o maior número de traumas hepáticos advindos da violência urbana,
fazem com estratégias de redução da lesão de isquemia hepática sejam
constantemente buscadas.
Estimulados pelos experimentos em animais, alguns grupos de pesquisadores
iniciaram recentemente a aplicação do IPC em estudos clínicos. Esses trabalhos têm
demonstrado que outros fatores ainda devem ser avaliados. Clavien et al
47
em um
estudo prospectivo com 100 pacientes onde o IPC foi efetivo em reduzir as lesões de
IR evidenciou algumas situações onde o IPC foi menos efetivo. Mais recentemente
Azoulay et al
49
relataram pela primeira vez o uso do IPC no transplante clinico
demonstrando uma maior tolerância à lesão de IR, mas identificaram uma piora da
função hepática inicial. A NAC também tem sido usada nos últimos anos em alguns
estudos clínicos de IR demonstrando que existe uma necessidade de ajuste no
tempo, modo e dose da aplicação. Apesar desses estudos nos últimos anos com o
IPC e a NAC, ainda restam muitas dúvidas a serem esclarecidas, tanto no que se
refere aos mecanismos de ação quanto aos critérios de utilização.
47
Este estudo desenvolvido em uma linha de pesquisa, que se propõe a estudar
o papel do IPC e da NAC na lesão de IR, contribui com a identificação da apoptose
como importante mecanismo de morte celular na fase tardia da lesão e com a
identificação da proliferação celular neste modelo de IR, além de verificar a proteção
do IPC e da NAC no fígado e no pulmão na fase tardia.
48
6. CONCLUSÕES
1. O precondicionamento isquêmico e a N-acetilcisteína protegem o fígado e o
pulmão na fase tardia da lesão de isquemia e reperfusão hepática, segundo a
ocorrência de apoptose e proliferação celular.
2. As alterações morfológicas do fígado foram minimizadas por ambas as
estratégias estudadas, exceto o infiltrado inflamatório que foi prevenido
principalmente pela N-acetilcisteína.
3. As alterações morfológicas do pulmão tenderam a diminuir com ambas as
estratégias, entretanto, somente o espessamento do septo alveolar foi
prevenido pelo precondicionamento isquêmico.
49
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9. ANEXOS
Tabela 1: Valores dos pesos dos ratos submetidos dos grupos IR, IPC, NAC
submetidos a isquemia de 40 minutos e reperfusão de 24 horas e dos
ratos do grupo SHAM.
Rato Sham IR NAC IPC
1
2
3
4
5
6
377
346
361
329
382
335
318
328
332
376
329
361
351
322
332
363
376
317
389
348
371
357
373
326
MÉDIA
DP
355
21
341
22
343
23
361
22
Análise de variância para postos de Kruskal-Wallis
H critico =7,82 H calculado = 4.66
(p) Kruskal-Wallis = 0.19
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