( PDF ) Avaliação da absorção intestinal de d-xilose no modelo experimental de inflamação intestinal crônica antígeno-específica em ratos

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Universidade Federal Fluminense

Centro de Ciências Médicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas

DANIELLE MOTA FONTES ANTUNES

AVALIAÇÃO DA ABSORÇÃO INTESTINAL DE D-XILOSE NO MODELO

EXPERIMENTAL DE INFLAMAÇÃO INTESTINAL CRÔNICA

ANTÍGENO-ESPECÍFICA EM RATOS.

NITERÓI

2007

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DANIELLE MOTA FONTES ANTUNES

AVALIAÇÃO DA ABSORÇÃO INTESTINAL DE D-XILOSE NO MODELO

EXPERIMENTAL DE INFLAMAÇÃO INTESTINAL CRÔNICA ANTÍGENO-

ESPECÍFICA EM RATOS.

Dissertação submetida à apreciação da

banca do Programa de Pós-Graduação

stricto sensu em Ciências Médicas da

Universidade Federal Fluminense, como

requisito parcial para obtenção do Grau de

Mestre em Ciências Médicas.

Orientadores: Profº Dr. Gilberto Perez Cardoso

Profª Drª. Gerlinde Agate Platais Brasil Teixeira

Niterói

2007

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iii

Antunes, Danielle Mota Fontes

Avaliação da absorção intestinal de D-

xilose no modelo

experimental de inflamação intestinal crônica antígeno-

específica em ratos. / Danielle Mota Fontes Antunes. –

Niterói : [s. n.], 2007.

150f., 30 cm.

Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) -

Universidade Federal Fluminense, 2007.

Bibliografia: f. 99-113.

1. Inflamação intestinal crônica. 2. Amendoim. 3.

Ratos. 4. D-xilose. I. Título.

DANIELLE MOTA FONTES ANTUNES

AVALIAÇÃO DA ABSORÇÃO INTESTINAL DE D-XILOSE NO MODELO

EXPERIMENTAL DE INFLAMAÇÃO INTESTINAL CRÔNICA ANTÍGENO-

ESPECÍFICA EM RATOS.

Dissertação submetida à apreciação da banca

do Programa de Pós-Graduação stricto sensu

em Ciências Médicas da Universidade Federal

Fluminense, como requisito parcial para

obtenção do Grau de Mestre em Ciências

Médicas.

Aprovada em ___ / ___ / 2007.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura

Prof. Dr. Mauricio Afonso Vericimo

Prof. Dr. José Galvão Alves

Niterói

2007

À minha família, pelo apoio

presente em todos os momentos e pelo

exemplo de amor e fé.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me abençoado, proporcionando a realização de mais uma conquista.

Aos meus pais e à minha irmã, pelo amor incondicional e apoio presente em todos

os momentos.

Ao Romulo, por sempre ter sido um companheiro exemplar, me apoiando com muito

amor, compreensão e amizade.

Ao prof. Gilberto, pela confiança, orientação e amizade.

À prof., amiga e orientadora Gerlinde, por ter me recebido de braços abertos no GIG,

acreditando e confiando em meu trabalho, sendo responsável pelo meu crescimento

pessoal e profissional.

Aos amigos do GIG – Patrícia, Munique, Priscila, Valéria, Monique, Mônica, Andrea

e Adriana – pela ajuda, respeito, carinho e aprendizado, assim também aos amigos

que já passaram por lá e deixaram uma marca especial, como Janilda, Vinícius,

Cecília e Archimedes. À Sylvia, pelo carinho e ajuda na revisão do texto.

Aos amigos do Mestrado, em especial a minha turma, pelo carinho, apoio e os

momentos maravilhosos de descontração.

Aos profs do Departamento de Imunobiologia, pelo apoio presente sempre que

necessário, em especial ao Prof. Mauricio Verícimo.

Aos profs do CCM, pelo ensino e respeito. Aos Profs Solange Artimos e Jocemir

Lugon, pelas reflexões críticas que foram tão construtivas; aos Profs Salim Kanaan e

Silvana Moreno, pela ajuda incontestável.

vii

"Jamais considere seus estudos como uma obrigação, mas

como uma oportunidade invejável para aprender a conhecer a

influência libertadora da beleza do reino do espírito, para seu

próprio prazer pessoal e para proveito da comunidade à qual

seu futuro trabalho pertencer".

Albert Einstein

viii

RESUMO

A alergia alimentar consiste em uma reação adversa que ocorre em pessoas

susceptíveis quando ingerem alimentos sensibilizantes, sendo uma das causas de

inflamação intestinal crônica. O estudo de modelos animais de inflamação da

mucosa, na tentativa de desvendar a patogênese das doenças inflamatórias

intestinais, tem sido estendido por quase meio século. A resposta imune

inapropriada aos alimentos, como ao amendoim, glúten e leite pode estar

relacionada à patogênese das doenças celíaca e de Crohn, as quais cursam com

má-absorção intestinal. Recentemente, vários estudos têm utilizado a absorção

intestinal de D-xilose como ferramenta investigativa na avaliação de problemas de

absorção de nutrientes em doenças intestinais. O objetivo do presente estudo

experimental consiste em avaliar a absorção intestinal de D-xilose no modelo em

ratos de inflamação intestinal crônica antígeno-especifica. Para isto, os animais do

grupo experimental foram inoculados com extrato protéico de amendoim antes de

serem expostos à dieta desafio, composta exclusivamente de sementes de

amendoim in natura, para a indução da reação inflamatória intestinal através da

alergia ao amendoim. Nossos resultados mostraram que a inoculação com extrato

protéico de amendoim levou a uma produção de maiores títulos de IgG específicos

do que no grupo controle (p<0,0001) e estes títulos se correlacionaram

positivamente com a alteração inflamatória da morfologia intestinal. Os animais

pertencentes ao grupo experimental mostraram uma absorção intestinal de D-xilose

menor do que os pertencentes ao grupo controle (p<0,0001). Assim, o uso do teste

sérico da D-xilose foi útil para identificar a presença de má-absorção intestinal em

nosso modelo de inflamação intestinal crônica em ratos.

Palavras-chave: inflamação intestinal crônica, amendoim, ratos, D-xilose.

ABSTRACT

Food allergy is an adverse reaction that occurs in susceptible people when

they eat sensitizing foods and is one of the causes of Inflammatory Bowel Disease

(IBD). The study of animal models of mucosal inflammation as a means to probe the

pathogenesis of Inflammatory Bowel Disease (IBD) extends for almost a half century.

The inappropriate immune response to foods, such as peanut, wheat, milk may be

implicated in the pathogenesis of celiac and Crohn’s diseases, which present small

intestinal malabsorption. A number of recent studies have utilized D-xylose

absorption as an investigative tool to study small intestinal function in a variety of

clinical settings, including in IBDs. Thus, the aim of the present experimental study

was to evaluate the intestinal absorption of D-xylose in an antigen specific gut

inflammatory reaction rat model. Animals of the experimental group were immunized

with peanut protein extract before their exposure to a challenge diet containing

exclusively peanut seeds to induce the gut inflammatory reaction due to peanut

allergy. Our results show that systemic immunization with peanut protein extracts

renders antibody IgG titers higher than control group (p<0.0001) and that the

antibody titers correlate positively to an inflammatory alteration of the gut

morphology. Animals pertaining to the experimental group showed an intestinal

absorption of D-xylose lower than control rats (p<0.0001). In conclusion, the use of

serum D-xylose test was useful to identify the presence of small intestinal

malabsorption in our antigen specific gut inflammatory reaction rat model.

Key-words: chronic gut inflammation, peanuts, rats, D-xylose.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. A) Eletromicrografia da seção transversal do intestino delgado, demonstrando as

vilosidades e a parede intestinal. B) Histologia do intestino normal, demonstrando

as camadas: serosa, muscular externa e interna, submucosa e mucosa, esta

composta pela lamina propria, vilosidades e glândulas. Fonte: Mowat, 2003. .... 23

Figura 2. Processamento e apresentação de antígenos nas vilosidades intestinais. Esquema

modificado de Weiner, 1997. .............................................................................. 25

Figura 3. Um modelo para o transporte de açúcar pelo enterócito. Os açúcares são

transportados pela célula e não pelas junções comunicantes. Na borda em

escova, a glicose e a galactose são transportadas para dentro da célula por um

sódio co-transportador de glicose, denominado primariamente de SGLT1. A

frutose é transportada passivamente pela borda em escova pela SGLT5. Alguns

autores sugerem que há um segundo transportador de glicose de baixa afinidade

na borda em escova: uns dizem que é o GLUT2, enquanto outros dizem que

pode ser um segundo SGLT. A glicose, a galactose e a frutose são transportadas

passivamente para o exterior do enterócito pela membrana basolateral, indo para

o sangue. Para os análogos de açúcar que não são metabolizados, como o

3OMDG (3-O-metil-D-glicopiranosideo), o principal caminho é através do GLUT2.

A frutose e a glicose podem passar também pela GLUT2, mas há uma grande

evidência de que a frutose também passa pela GLUT5 e que a glicose deixe a

célula por um mecanismo tipo a exocitose. Fonte: Wright et al., 2003................ 32

Figura 4 Vias de absorção de aminoácidos e peptídios. Fonte: Frenhani & Burini, 1999. .... 34

Figura 5. Fluxograma da classificação da EAACI de 1995 para reações adversas aos

alimentos baseada nos mecanismos patogenéticos. Fonte: Ortolani & Pastorello,

2006 (modificado)............................................................................................... 47

Figura 6. Possíveis mecanismos que levam ao desenvolvimento da DII. No intestino normal

(a), um estímulo antigênico intraluminal é tratado pela ação combinada das

respostas imunológicas antígeno- específicas e reações inflamatórias, reguladas

de modo negativo após a eliminação do estímulo; na DII (b), o estímulo persiste

(infecção crônica) ou ocorre a perda da regulação das respostas imunológicas e

inflamatórias. Em ambos os casos, o resultado consiste numa resposta

imunológica persistentemente intensificada, que provoca a lesão tecidual. Fonte:

Peakman & Vergani,1999................................................................................... 50

Figura 7. Desenho esquemático das principais alterações observadas em diferentes

estágios da inflamação intestinal crônica. Adaptação de Marsh, 1995. .............. 52

Quadro 1. Protocolo experimental I...................................................................................... 59

Quadro 2. Protocolo experimental II..................................................................................... 61

Figura 8. Consumo de ração e amendoim expresso em mg/gpc, durante o período de dieta

desafio. Os grupos Normal Ração (NR) e Imune Ração (IR) receberam somente

ração no cocho de suas gaiolas, enquanto que os grupos Normal Amendoim (NA)

e Imune Amendoim (IA) receberam somente semente de amendoim in natura. (A)

Representação do consumo diário ao longo da semana. (B) Representação da

média do consumo semanal. (C) Média de consumo diário ao longo do período

de dieta desafio. A diferença no consumo entre os grupos que foram alimentados

com ração e os que foram alimentados com amendoim foi significativa (p<

0,0001). Também foi observada a mesma significância quando comparado o

grupo NA com o grupo IA. .................................................................................. 72

Figura 9. Média de calorias ingeridas entre os grupos do experimento durante o período de

dieta desafio. Os grupos que consumiram ração apresentaram uma ingestão

significativamente (p>0,05) maior de calorias do que os grupos que consumiram

amendoim. Quando comparamos os grupos que consumiram amendoim, o grupo

NA apresentou uma ingestão significativamente maior do que o grupo IA

(p<0,01).............................................................................................................. 73

Figura 10. Média da diferença de peso, em gramas, dos animais dos grupos Normal Ração

(NR), Normal Amendoim (NA), Imune Ração (IR) e Imune Amendoim (IA), antes

e durante as quatro semanas de dieta desafio. Os animais dos grupos controles

(NR e IR) apresentaram ganho de peso, enquanto os animais do grupo NA não

apresentaram diferença de peso. Já os animais do grupo experimental (IA)

apresentaram uma perda de peso significativa (p<0,001) a partir do primeiro dia

de introdução da dieta desafio............................................................................ 75

Figura 11. Média dos níveis de IgG total anti-proteína de amendoim dos grupos durante as

semanas de dieta desafio. Os animais dos grupos IA e IR apresentaram altos

títulos de anticorpos, enquanto os animais dos grupos controles NR e NA

apresentaram baixos títulos (p<0,001). .............................................................. 76

Figura 12. Títulos de anticorpos IgG total antiamendoim nos grupos experimental e controle.

P<0,0001............................................................................................................ 77

Figura 13. Diferenças histológicas entre os ratos do grupo controle e experimental. (A)

Aspectos da vilosidade de um rato do grupo controle, apresentando um tecido

preservado, sem edema e poucos leucócitos. (B) Aspectos da vilosidade de um

rato do grupo experimental, apresentando hiperemia e grande infiltrado

leucocitário (coloração HE, aumento de 200x). .................................................. 78

xii

Figura 14. Análise histomorfométrica dos segmentos intestinais do grupo experimental e

controle. Representação gráfica da razão altura/largura da vilosidade (A), onde

somente o duodeno dos ratos experimentais apresentou diferença significativa

(p<0,05) quando comparado ao dos ratos controle, enquanto na representação

da razão altura da célula epitelial/largura da lamina propria (B), somente o jejuno

apresentou diferença significativa (p<0,05). ....................................................... 79

Figura 15. Análise histomorfométrica dos segmentos intestinais dos grupos experimental e

controle. Representação gráfica da razão altura da vilosidade/altura da cripta (A),

onde observamos diferença significativa (p<0,05) somente no duodeno dos ratos

experimentais quando comparado ao dos ratos controle. Na representação da

razão células epiteliais intestinais (CEI) / leucócitos intraepiteliais (LIE) (B),

ambos os segmentos duodeno e jejuno apresentaram diferença significativa

(p<0,05).............................................................................................................. 80

Figura 16. Determinação da curva de absorção e excreção de D-xilose em animais normais.

A) valores individuais do tempo zero (jejum) e da 1ª a 4ª hora pós-gavagem com

1,23g de D-xilose. B) Média dos valores dos animais, mostrando uma diferença

significativa (p< 0,0001) entre o período de jejum e após a gavagem; entre a 1ª e

3ª hora não há diferença significativa, passando a apresentar um clearance a

partir da 4ª hora (p>0,05 na comparação entre a 3ª e 4ª horas)......................... 81

Figura 17. Média de D-xilose sérica (mg/ml) nos ratos do grupo experimental e controle. A

diferença de absorção entre os grupos foi estatisticamente significativa

(p<0,0001).......................................................................................................... 82

Figura 18. Representação da correlação linear entre D-xilose sérica (mg/ml) e a razão

altura/largura da vilosidade no duodeno (p<0,0001)........................................... 83

Figura 19. Representação da correlação linear entre D-xilose sérica (mg/ml) e a razão altura

da célula epitelial/largura da lamina propria no jejuno (p<0,0001). ..................... 83

Figura 20. Representação da correlação linear entre D-xilose sérica (mg/ml) e a razão altura

da vilosidade/altura da cripta no duodeno (p<0,0001). ....................................... 84

Figura 21. Representação da correlação linear entre D-xilose sérica (mg/ml) e a razão

células epiteliais intestinais/leucócitos intraepiteliais no duodeno (p<0,0001)..... 85

Figura 22. Representação da correlação linear entre D-xilose sérica (mg/ml) e a sorologia

(p<0,0001).......................................................................................................... 85

Figura 23. Representação da correlação linear entre a sorologia e a razão células epiteliais

intestinais/leucócitos intraepiteliais no duodeno (p<0,0001). .............................. 86

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Exemplos de modelos animais de DII. ............................................................... 533

Tabela 2. Distribuição dos macronutrientes. ...................................................................... 622

Tabela 3. Distribuição de vitaminas e aminoácidos............................................................ 633

Tabela 4. Comparação da significância entre grupos quanto ao consumo calórico médio

durante o período de dieta desafio ................................................................... 744

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS

α/α

Alfa/alfa

α/β

Alfa/Beta

γδ

Gama - Delta

AA Aminoácidos

Ac Anticorpo

APC Célula Apresentadora de Antígeno

Ara h 1-8 Fração da proteína do amendoim (Arachis hypogaea)

BALB/c Linhagem isogênica de camundongos

BSA Albumina de soro bovino

CCR6 Receptor de quimiocina

CD Cluster of differentiation

CEI Células epiteliais intestinais

c-kit CD117 – receptor do fator de célula tronco

C57BL/6J Linhagem isogênica de camundongos

CP Placas da Cripta

DC Doença de Crohn

DII Doença Inflamatória Intestinal

DSS Dextrana de Sulfato de Sódio

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético (Ethylene Diamine TetrAcetic acid).

ELISA Ensaio Imunoenzimático

GLUT (1-5) Transportadores de membrana de glicose

HCl Ácido clorídrico

IA Grupo Imune Amendoim

ICE Enzima conversora de interleucina

IFN-γ Interferon-γ

Ig Imunoglobulina

IL Interleucinas

IR Grupo Imune Ração

Potássio

LIE Linfócitos intra-epiteliais

Lou-M Linhagem isogênica de ratos

LPS Lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas

MALT Tecido Linfóide associado às mucosas

MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade

Sódio

NA Grupo Normal Amendoim

NR Grupo Normal Ração

OPD Ortofenilenodiamina

3OMDG Análogo de glicose: 3-O-metil-D-glicopiranosideo

OVA Ovalbumina

PBS Tampão Salino Fosfato

PPs Placas de Peyer

RAG Proteína de recombinação gênica de linfócitos

rpm Rotações por minuto

RU Retocolite Ulcerativa

Sc Subcutâneo

SGLT (1,5) Co-transporte de molécula de glicose.

TCR Receptor da célula T

TGF Fator de crescimento tumoral

Th1 Células T helper 1

Th2 Células T helper 2

Th3 Células T helper 3

Thy-1 CD90 – marcador para linfócito T

TNF Fator de Necrose tumoral

xvi

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................19

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...............................................................................22

2.1 O tubo digestório ............................................................................................22

2.2 Arquitetura e organização morfofuncional da mucosa intestinal.....................23

2.3 Mecanismos extrínsecos de proteção ............................................................25

2.3.1 Proteólise.............................................................................................25

2.3.2 O peristaltismo.....................................................................................26

2.3.3 O muco ................................................................................................26

2.4 Epitélio de absorção intestinal ........................................................................27

2.4.1 Enterócitos...........................................................................................27

2.4.2 Células caliciformes.............................................................................28

2.4.3 Células de Paneth................................................................................28

2.4.4 Células enteroendócrinas ....................................................................29

2.4.5 Células M.............................................................................................29

2.4.6 Células indiferenciadas da cripta .........................................................29

2.4.7 Linfócitos intra-epiteliais (LIE)..............................................................30

2.5 Mecanismos de absorção de nutrientes .........................................................31

2.5.1 Absorção do açúcar.............................................................................31

2.5.2 Absorção de proteínas.........................................................................33

2.5.3 Absorção de lipídios.............................................................................34

2.6 Tecido Linfóide Associado às Mucosas (MALT).............................................36

2.6.1 Placas da cripta (Cryptopatches-CP)...................................................37

2.6.2 Placas de Peyer (PP)...........................................................................37

2.7 Padrão de resposta imune aos antígenos presentes no lúmen intestinal.......39

2.8 Tolerância Oral ...............................................................................................42

2.8.1 Características do desenvolvimento e manutenção da tolerância oral 43

2.8.2 Regulação antígeno-específica............................................................45

2.9 Alergia alimentar.............................................................................................46

2.9.1 Proteínas .............................................................................................48

2.10 Inflamação Intestinal: O Problema..................................................................49

xvii

2.11 Modelos animais.............................................................................................53

2.12 Inflamação intestinal crônica e a má-absorção de nutrientes.........................55

2.12.1 Avaliação da absorção de glicídios através do teste da D-xilose ........55

3 OBJETIVOS.......................................................................................................57

3.1 Geral...............................................................................................................57

3.2 Específicos .....................................................................................................57

4 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................58

4.1 Animais...........................................................................................................58

4.2 Protocolos Experimentais...............................................................................58

4.2.1 Protocolo experimental I – Experimento piloto para indução da

inflamação..........................................................................................................58

4.2.2 Protocolo experimental II – Indução da inflamação intestinal crônica e

estudo do metabolismo de açúcares..................................................................60

4.3 Dietas .............................................................................................................62

4.3.1 Ração comercial ..................................................................................62

4.3.2 Amendoim............................................................................................62

4.3.3 Comparação da distribuição de macronutrientes da ração e do

amendoim ..........................................................................................................62

4.4 Extração de proteínas do amendoim..............................................................63

4.4.1 Procedimento de extração ...................................................................63

4.4.2 Dosagem de proteína obtida nos extratos de amendoim.....................64

4.5 Inoculações: extrato bruto de amendoim e salina ..........................................64

4.6 Sangrias .........................................................................................................65

4.7 Determinação do consumo diário de alimento................................................65

4.8 Peso dos animais ...........................................................................................65

4.9 Avaliação dos níveis de IgG anti-proteínas do Amendoim .............................66

4.10 Teste de absorção de carboidratos – Dosagem da D-xilose sérica................66

4.10.1 Padronização da técnica de absorção de D-xilose em ratos normais e

determinação da curva-padrão ..........................................................................66

4.10.2 Uso da técnica de D-xilose para avaliação dos animais do experimento

4.11 Coleta de segmentos do intestino dos ratos...................................................68

xviii

4.12 Estatística .......................................................................................................70

5 RESULTADOS...................................................................................................71

5.1 Protocolo Experimental – I..............................................................................71

5.1.1 Avaliação do consumo de ração e de semente de amendoim.............71

5.1.2 Peso dos animais.................................................................................74

5.1.3 Sorologia – dosagem de IgG total anti-proteína de amendoim............75

5.2 Protocolo Experimental II................................................................................76

5.2.1 Desenvolvimento do Modelo de Inflamação Intestinal Crônica em Ratos

5.2.2 Avaliação sorológica ............................................................................77

5.2.3 Avaliação Histológica...........................................................................77

5.2.4 Padronização do teste da D-xilose sérica............................................80

5.2.5 Correlação entre o teste de absorção de D-xilose e os achados

sorológicos e histológicos e entre a sorologia e um parâmetro histomorfométrico.

6 DISCUSSÃO......................................................................................................87

7 CONCLUSÕES ..................................................................................................98

8 BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................99

ANEXOS .................................................................................................................114

APÊNDICES.............................................................................................................117

1 INTRODUÇÃO

Contrariamente ao que pensamos, a maior área de contato do corpo não é a

pele, mas sim a superfície mucosa, que é bombardeada imediatamente após o

nascimento por uma ampla variedade de microrganismos e proteínas antigênicas

decorrentes do ambiente (Brandtzaeg, 2002). Em humanos, estima-se que a mucosa

do intestino delgado apresente 300m

de superfície e esta se encontra constantemente

exposta ao contato com antígenos. Aproximadamente 30 kg de proteínas alimentares

chegam a este órgão durante um ano, dos quais 130-190g destas proteínas são

absorvidas de forma imunogênica (Brandtzaeg, 1998). Isto significa que a principal

fonte de perturbação da atividade imunológica ocorre via mucosa, uma vez que uma

grande quantidade de células do sistema imunitário encontra-se neste local. Devido às

interações do sistema imunitário de mucosas com o sistêmico, os eventos iniciados no

trato gastrintestinal possuem importante reflexão sistêmica (Weiner, 2001).

Apesar deste fato, na maioria das vezes em que os antígenos penetram o

organismo através do intestino, a resposta imunológica resultante não é a resposta

clássica Th1 ou Th2 (Weiner, 2001). Esta rede imunológica da mucosa apresenta um

aspecto único – a habilidade em manter uma responsividade não inflamatória

(tolerância) a uma gama enorme de antígenos derivados de fontes alimentares e

bactérias comensais. A resposta imunitária inflamatória aos agentes potencialmente

perigosos (bactéria, vírus entre outros) deve, no entanto, ser preservada para manter a

integridade do intestino e permitir a absorção do nutriente (Hyun et al., 2006).

Recentemente, alguns autores têm relatado um aumento na incidência de

reações adversas aos alimentos ingeridos, fato que pode ser decorrente de uma falha

da indução da tolerância oral ou de uma quebra em sua manutenção. Dentre os

alimentos causadores de reações adversas, um dos mais comuns é o amendoim. A

prevalência da alergia a esta semente que contém proteínas potencialmente

alergênicas, tem aumentado em crianças e adultos principalmente nos EUA e Reino

Unido (Strid et al., 2004).

A doença de Crohn e a retocolite ulcerativa são denominadas doenças

inflamatórias intestinais (DII), porém apresentam características imunorregulatórias e

manifestações clínicas distintas, sendo uma das principais causas de morbidade em

países ocidentais (Weber & Turner, 2007). A literatura médica enfatiza a relação

existente entre as DII e os processos relacionados à má absorção e perda de peso

corporal. Vários problemas metabólicos podem complicar estas doenças, e isso

geralmente ocorre em pacientes com formas severas (Allan, 1998).

O estudo de inflamação de mucosa em modelos animais para desvendar a

patogênese das doenças inflamatórias do intestino se estende ao longo de quase meio

século (Strober et al., 2002). Diferentes modelos estão disponíveis para o uso na

pesquisa destas doenças, podendo ser usados para avaliar a patogênese, as

alterações extraintestinais e moléculas farmacológicas ou agentes que podem levar a

uma possível cura. Em geral, um modelo apropriado ou ótimo deve apresentar

características similares ou idênticas ao curso da respectiva doença em humanos, tais

como fisiopatologia, sinais e sintomas, inflamação e alterações morfológicas (Jurjus et

al., 2004).

Estudos recentes têm utilizado a absorção da D-xilose como ferramenta

investigativa da função duodenal em diferentes manifestações clínicas humanas, sendo

um método simples e barato (Ehrenpreis et al., 2001). A D-xilose é uma pentose

encontrada naturalmente nas plantas e sua metabolização incompleta permite seu uso

como teste absortivo (Craig & Ehrenpreis, 1999). Na literatura, não há descrição quanto

ao uso do teste de D-xilose em modelos experimentais de DII.

Em um trabalho anterior do nosso grupo, Teixeira (2003) desenvolveu em

camundongos C57BL/6J, um modelo de alergia ao amendoim que cursa com

inflamação intestinal crônica, caracterizado por atrofia das vilosidades, hiperplasia da

cripta, aumento do infiltrado de leucócitos mononucleares e edema na lamina propria

(Teixeira, 2003). Estes achados são típicos da doença celíaca humana (enteropatia

causada pelo glúten), podendo também ser observado em outras enteropatias

induzidas por alimentos (Marsh, 1995).

Assim, estabelecer o modelo de inflamação intestinal crônica antígeno-

específico em ratos, avaliar a absorção intestinal de D-xilose e testar se há uma

correlação positiva entre os achados laboratoriais e clínicos - histológicos permitirá uma

melhor compreensão dos prejuízos nos processos inflamatórios intestinais com

respeito à absorção e ao metabolismo de nutrientes.

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 O tubo digestório

O tubo digestório compreende a boca, a faringe, o esôfago, o estômago, o

intestino delgado, o intestino grosso e o ânus. Os alimentos são triturados na boca

durante a mastigação, onde os amidos sofrem a primeira clivagem enzimática; ao

chegar no estômago, inicia-se a digestão protéica. O pH muito baixo e a ação de

enzimas propiciam o início da quebra das proteínas. No duodeno, o homogeneizado de

macromoléculas de origem protéica, lipídica e de carboidrato encontrará uma série de

enzimas que reduzirão a imensa maioria destas moléculas às suas unidades básicas

desprovidas de significado imunológico (Teixeira, 2003).

O muco, os movimentos peristálticos e mecanismos imunológicos agem como

barreiras físico-químicas, que dificultam a penetração de macromoléculas. Apesar de

todos estes mecanismos para garantir um contato restrito do organismo com

macromoléculas e microrganismos do meio ambiente, este contato acaba ocorrendo.

Embora insignificante do ponto de vista nutricional, ele é de grande importância do

ponto de vista imunológico, pois é responsável pela ativação constante do sistema

como um todo, principalmente das células do sistema imune de mucosas (Swarbrick et

al, 1979; Mayer, 2005).

A absorção dos nutrientes ocorre sob a ação de mecanismos ativos e passivos,

através da superfície de milhões de pequenas dobras. Após a entrada de

macromoléculas nas placas de Peyer ou na lamina propria, elas podem alcançar os

vasos linfáticos que as conduzirão aos linfonodos mesentéricos de drenagem regional.

Nessas estruturas, há uma vasta coleção de células apresentadoras de antígenos

(APC), além de linfócitos T e B. O enorme repertório de macromoléculas provenientes

do intestino pode também alcançar a circulação do sistema porta e estimular

componentes do sistema imunológico presentes no fígado. De fato, já foi atribuído ao

fígado um papel importante na indução da tolerância oral. As macromoléculas e

microrganismos podem ainda alcançar a circulação sistêmica e se redistribuírem por

todo o organismo (Cantor & Dumont, 1967; Qian et al, 1985).

2.2 Arquitetura e organização morfofuncional da mucosa intestinal

A organização morfológica da parede do tubo digestório é muito parecida em

toda sua extensão. Assim, vista de dentro para a luz intestinal, a parede é constituída

por quatro camadas: a serosa, a muscular, a submucosa e a mais complexa das

quatro, a mucosa. A organização da mucosa e da submucosa, com pregas circulares,

vilosidades e bordas em escova das células epiteliais, gera um aumento da área de

contato de até 150 vezes a área da pele (Figura 1) (Camerini et al, 1993).

A B

Vilosidade com

epitélio colunar

Lamina propria

Submucosa

Camadas

Musculares

Serosa

Figura 1. A) Eletromicrografia da seção transversal do intestino delgado, demonstrando as vilosidades e

a parede intestinal. B) Histologia do intestino normal, demonstrando as camadas: serosa, muscular

externa e interna, submucosa e mucosa, esta composta pela lamina propria, vilosidades e glândulas.

Fonte:

Mowat, 2003.

A camada mais externa das quatro, em relação à luz intestinal, recebe o nome

de serosa ou adventícia, de acordo com o trecho considerado. Da faringe ao hiato

diafragmático, o tubo digestório é recoberto por um tecido conjuntivo frouxo que se

funde com os tecidos adjacentes, recebendo a denominação de adventícia.

Atravessando o hiato diafragmático e entrando na cavidade peritoneal, é recoberta pela

serosa, que como a adventícia, é composta por tecido conjuntivo frouxo. Esta camada

é recoberta pelo mesotélio que, por sua vez, continua com o peritônio parietal,

permitindo, deste modo, que o estômago e as alças intestinais não fiquem soltos na

cavidade abdominal (Camerini et al,1993).

A mucosa, camada mais complexa das quatro, é formada por glândulas, pela

lamina propria e por uma camada de células epiteliais colunares que, revestindo as

vilosidades e as criptas, mantém contato com o meio ambiente (Camerini et al,1993). É

na camada mucosa que ocorre a maioria das interações entre o meio ambiente e o

organismo (Johnson & Kudsk, 1999).

A lamina propria, que tem a largura aproximada da altura das células epiteliais, é

composta por um tecido conjuntivo reticular e fibroelástico que dá sustentação aos

vasos sangüíneos e linfáticos e às terminações nervosas. Nesta região encontramos

também uma quantidade importante de linfócitos, plasmócitos, macrófagos, mastócitos

e eosinófilos (Camerini et al, 1993).

As células epiteliais intestinais (CEI) ou enterócitos são distintas de acordo com

a região do tubo digestório em que se encontram. Elas permitem uma absorção

seletiva do material da luz, além de secretarem seus produtos de modo diferenciado

(Johnson & Kudsk, 1999).

Disperso entre as CEI, observamos um grande número de linfócitos intra-

epiteliais (LIE). Estes linfócitos estão mais concentrados no duodeno e no jejuno

proximal numa relação aproximada de 10/1 CEI/LIE. Estas células participam de modo

decisivo na regulação das interações que ocorrem entre o meio ambiente e o sistema

imunológico, sendo que estas interações produzem efeitos locais e sistêmicos (Guy-

Grand et al, 1978).

2.3 Mecanismos extrínsecos de proteção

A função primária do intestino é a absorção de nutrientes. No entanto, tendo em

vista sua função e a sua grande superfície de contato com o meio, o mesmo fica

exposto a uma grande variedade de antígenos derivados não só dos alimentos, como

também das bactérias que compõem a microflora e/ou de possíveis microrganismos

patogênicos. Do ponto de vista fisiológico, o intestino é limitado por uma barreira

seletiva que permite a absorção de produtos essenciais e, ao mesmo tempo, impede a

entrada de substâncias agressoras (Johnson & Kudsk, 1999).

Figura 2. Processamento e apresentação de antígenos nas vilosidades intestinais. Esquema modificado

de Weiner, 1997.

2.3.1 Proteólise

O primeiro mecanismo a ser considerado é a atividade proteolítica das

secreções gastrintestinais. A absorção do nitrogênio dietético sofre influência das

condições gerais e locais de digestão, tais como: capacidade proteolítica, modo de

ingestão, composição química da dieta, absorção e motilidade intestinal (Waitzberg &

Mester, 1998). Qualquer alteração nestes fatores pode ter influência sobre o sistema

imunológico. Assim, ao se alterar a capacidade proteolítica das secreções, a

capacidade de absorção antigênica é modificada, podendo levar a repercussões

imunológicas importantes. Um exemplo disto é a dificuldade de indução de tolerância

oral concomitante a uma administração de inibidores de proteólise (Bruce & Ferguson,

1986). Este modelo experimental é traduzido na clínica, por exemplo, nos pacientes

com fibrose cística que apresentam uma secreção pancreática diminuída e, por

conseguinte, uma alta incidência de alergia alimentar (Walker & Isselbacher, 1974).

Outras proteínas secretadas pelas glândulas exócrinas, como o muco, também

apresentam um papel importante que limita o contato do organismo com antígenos,

principalmente de microrganismos patogênicos. Dentre estes fatores, que dificultam,

mas não impedem completamente a penetração dos microrganismos na parede

intestinal, destaca-se a lactoferrina. Esta proteína – ligante de ferro - é secretada pelo

pâncreas e dificulta a reprodução das bactérias dependentes deste íon (Johnson &

Kudsk, 1999).

2.3.2 O peristaltismo

O peristaltismo intestinal não constitui uma barreira propriamente dita, mas

regula a velocidade do trânsito intestinal e conseqüentemente, o tempo de contato do

conteúdo luminal com as barreiras físico-químicas estabelecidas pelo muco e pelo

glicocálix (Teixeira, 2003).

2.3.3 O muco

O muco, outra barreira importante para a proteção, é um meio semi-sólido que

recobre a mucosa sob a forma de uma película aderente. Esta película pode ser

dividida em três camadas principais, de dentro para fora: o glicocálix, o muco

propriamente dito e a camada lipídica (Teixeira, 2003).

A camada lipídica é a mais externa e a primeira, entre as três, a fazer contato

com o material da luz intestinal. Composta predominantemente por fosfatidilcolina, esta

camada contribui de forma significativa na seletividade dos produtos que entrarão no

muco propriamente dito. Os lipídios que compõem a camada mais externa, bem como

aqueles que se localizam no interior do muco, agem como seqüestradores de radicais

livres secretados pelos microrganismos (Lamont, 1992).

O muco propriamente dito é composto por uma família heterogênea de

glicoproteínas altamente viscosas, as mucinas, que não só diferem nas suas

proporções ao longo do trato digestório, como também ao longo da ontogenia do

indivíduo (Shub et al, 1983).

Por ser um meio semi-sólido, o muco age como uma membrana seletiva que

permite a difusão de substâncias de baixo peso molecular, dificultando ou impedindo a

passagem de macromoléculas e de microrganismos que permanecem em suspensão

no meio. Assim, ao permanecerem em suspensão no muco, os mesmos são

eliminados pelo peristaltismo. Os grupamentos de carboidratos que compõem estas

glicoproteínas são análogos aos existentes nas células epiteliais ou enterócitos

(Johnson & Kudsk, 1999). Desta forma, postula-se então que o muco compete pela

ligação de proteínas e microrganismos da luz intestinal que, de outra forma, se ligariam

aos enterócitos (Matsuo et al, 1997).

O glicocálix, que se encontra na interface entre o muco secretado e as

microvilosidades, é a camada mais densa das três. É composto por glicoproteínas que

revestem as microvilosidades da superfície apical dos enterócitos (Johnson & Kudsk,

1999; Mayer, 2000).

Deste modo, somente quando vencidas as barreiras físicas o conteúdo luminal

pode entrar em contato direto com o tecido epitelial da mucosa intestinal (Johnson &

Kudsk, 1999).

2.4 Epitélio de absorção intestinal

O tecido epitelial é constituído por uma monocamada de células epiteliais, os

enterócitos. Além deste constituinte principal e mais abundante, este tecido também é

composto pelas células caliciformes, células de Paneth, células enteroendócrinas,

células M, células indiferenciadas da cripta e os linfócitos intra-epiteliais (LIE) (Neutra &

Kraehenbuhl, 1992; Johnson & Kudsk, 1999; Mayer, 2000).

2.4.1 Enterócitos

Os enterócitos são células colunares, responsáveis pela absorção seletiva dos

nutrientes. Estão organizados de modo a regular e controlar a passagem de

macromoléculas do lúmen para a região intersticial. Encontram-se conectados uns aos

outros na região apical pelas junções bloqueadoras (tight junctions), que controlam a

passagem de moléculas hidrossolúveis, principalmente das macromoléculas. Estas

junções são refeitas e mantidas de forma eficiente durante a renovação epitelial e

durante a migração de LIE do tecido epitelial para o lúmen (Johnson & Kudsk, 1999).

Outra função importante das células epiteliais é sua capacidade de apresentar

antígenos para os linfócitos encontrados na lamina propria (Kaiselien et al, 1989). Para

tanto, estas células expressam constitutivamente baixos níveis de moléculas de

histocompatibilidade de classe II na superfície basolateral, aumentando assim de forma

significativa na presença de citocinas pró-inflamatórias (Teixeira, 2003).

Desta forma, os enterócitos apresentam, fisiologicamente, peptídeos absorvidos

do lúmen intestinal por endocitose (a partir das microvilosidades da região apical

celular) que, após o processamento, são expressos associados a moléculas de MHC

de classe II (Ramachandran et al, 2000; Neutra et al, 2001).

A apresentação de antígenos feita pelos enterócitos é diferente das APC. Os

enterócitos estimulam, preferencialmente, um padrão supressor dos linfócitos T CD8

Contudo, o aumento de IFN-γ no meio pode alterar este padrão de resposta celular,

potencializando a apresentação para linfócitos T CD4

(Mayer, 2000; Mayer, 2003).

2.4.2 Células caliciformes

As células caliciformes encontram-se distribuídas, tanto nas vilosidades como

nas criptas, por todo o intestino delgado e grosso. São responsáveis pela secreção e

liberação de muco (Kato & Owen, 1999).

2.4.3 Células de Paneth

As células de Paneth encontram-se geralmente localizadas nas criptas do

intestino delgado. Seu citoplasma é constituído, entre outros componentes, por vários

grânulos secretores contendo lisozima e fator de necrose tumoral (TNF). Atuam no

controle da proliferação de microrganismos na cripta (Kato & Owen, 1999).

2.4.4 Células enteroendócrinas

As células enteroendócrinas encontram-se distribuídas por todo o trato

gastrintestinal, tendo como principal função a liberação de hormônios nos capilares dos

tecidos conectivos em resposta às mudanças no meio externo (Kato & Owen, 1999).

2.4.5 Células M

Além dos enterócitos, a mucosa intestinal possui outro tipo de célula epitelial

recobrindo as placas de Peyer - as células M. Estas células apresentam sua superfície

apical polarizada e une-se às células vizinhas por junções tight. Sua face basolateral

apresenta grandes invaginações, formando bolsas intra-epiteliais que aumentam a

superfície de contato com o tecido linfóide subjacente organizado. Estas bolsas

constituem locais específicos para as interações entre as células M e as

subpopulações de LIE, uma vez que as primeiras são conhecidas por absorverem

antígenos da luz intestinal por transcitose (Neutra et al, 2001).

2.4.6 Células indiferenciadas da cripta

O epitélio intestinal caracteriza-se por uma população celular dinâmica. Assim,

as células epiteliais encontradas na cripta, são imaturas e se tornam, cada vez mais,

diferenciadas à medida que se desloca no sentido apical da vilosidade. Deste modo,

existem células epiteliais em diferentes estágios de maturação nas paredes

ascendentes das criptas. A partir da transição cripta-vilosidade, até o topo da

vilosidade, encontram-se apenas células maduras e diferenciadas (Baggi et al, 1999).

Embora a renovação celular ocorra de forma constante, sem risco à integridade da

barreira mucosa, esta requer uma regulação precisa, tanto da proliferação quanto da

diferenciação celular. Para tal, torna-se necessário a presença de fatores de

crescimento, componentes da matriz extracelular, substratos metabólicos,

prostaglandinas e estímulos imunológicos (Podolsky, 2000).

Dos fatores de crescimento, destacam-se o TGF-α e o TGF-β que regulam a

renovação das células epiteliais a partir da cripta para a vilosidade, através do controle

da proliferação e da diferenciação celular. Deste modo, o TGF-α estimula a proliferação

das células epiteliais indiferenciadas da cripta que migram no sentido da vilosidade e

neste caminho iniciam sua diferenciação estimulada e controlada pelo TGF-

. A

expressão de TGF-α nas células da vilosidade e, do mesmo modo, a expressão de

TGF-β encontrada nas células da cripta, sugere uma necessidade constitutiva de

restrição na proliferação (Podolsky, 2000).

Como exemplos da influência do substrato metabólico, destacam-se a glutamina

e os ácidos graxos de cadeia curta. No intestino delgado, principalmente na mucosa

intestinal, a glutamina funciona como principal substrato energético para os enterócitos

e linfócitos. Já no cólon, os principais substratos energéticos para os colonócitos são os

ácidos graxos de cadeia curta – acetato, propionato e butirato – formados a partir da

ação fermentativa das bactérias residentes desta região sobre as fibras alimentares

(Gu et al, 2001).

2.4.7 Linfócitos intra-epiteliais (LIE)

Os LIE estão localizados acima da lamina propria, principalmente no duodeno e

no jejuno proximal, e participam de modo decisivo na regulação das interações que

ocorrem entre o meio ambiente e o sistema imunológico, tanto local quanto sistêmico.

Estes linfócitos são, predominantemente, (98%) linfócitos T γδ CD8

CD45RO+ (células

de memória) (Mayer, 2005).

Contudo, também estão presentes linfócitos T com TCR

αβ

. Embora não exista

unanimidade quanto às funções desempenhadas por estes linfócitos, Mayer sugere

que a função citotóxica e/ou supressora seja a principal (Mayer, 2000). Outra

característica importante é a expressão da integrina seletiva

7, que se liga a E-

caderina nas células epiteliais cuja expressão é induzida pelo TGF-

(James & Kiyono,

1999).

Tanto os LIE que expressam o TCR αβ quanto os que expressam γδ,

apresentam uma diversidade limitada de receptores de antígenos. Esses achados

apóiam a teoria de que a variação da especificidade destes linfócitos é limitada (Mayer,

2005).

Imerso na lamina propria, encontramos também uma quantidade importante de

linfócitos, plasmócitos, macrófagos, mastócitos e eosinófilos. Os linfócitos da lamina

propria constituem uma mistura heterogênea de subpopulações linfocitárias - linfócitos

T, linfócitos B e plasmócitos secretores de imunoglobulinas, principalmente IgA.

Similarmente aos LIE, os linfócitos da lamina propria são T CD8

CD45RO+, embora

também expressem a integrina seletiva α4β7 (James & Kiyono, 1999; Mayer, 2000;

Nagler-Anderson, 2000).

As populações celulares descritas acima constituem o tecido epitelial e o tecido

linfóide difuso que revestem a superfície mucosa, onde cada elemento tem seu papel

em uma rede de interações complexas. Além deste tecido linfóide difuso, a mucosa

intestinal possui um tecido linfóide organizado, representado pelas placas de Peyer

(Teixeira, 2003).

2.5 Mecanismos de absorção de nutrientes

2.5.1 Absorção do açúcar

Os açúcares são a principal fonte de caloria em todos os estágios da vida. As

fontes dietéticas de açúcar variam da lactose no leite a carboidratos complexos. Estes

carboidratos são digeridos em monossacarídeos, na maioria glicose, galactose e

frutose, antes da absorção no intestino delgado. A digestão ocorre através de uma

série de reações complexas mediadas por amilases salivares e pancreáticas e por

dissacaridases ancoradas na superfície da borda em escova dos enterócitos que

cobrem a superfície do intestino delgado. Os enterócitos maduros no topo das

vilosidades intestinais são os responsáveis por completarem a absorção de açúcares

no corpo. Uma vez que absorvidas, a galactose e a frutose na maioria das vezes são

convertidas em glicose para o metabolismo ou estocagem (Wright et al., 2003;

Drozdowski & Thomson, 2006).

Como resultado da ação das amilases salivares e pancreáticas e das

dissacaridases da borda em escova, os carboidratos presentes na dieta são

convertidos em suas unidades monoméricas (hexose - as mais freqüentes) antes da

absorção. Estes são apresentados ao epitélio intestinal na forma de glicose, galactose

e frutose. Os açúcares são absorvidos no início e no meio do intestino delgado pelos

enterócitos maduros, na parte superior da vilosidade (Wright et al., 1994; Wright et al.,

2003; Drozdowski & Thomson, 2006; Raybould et al., 2006).

A glicose e a galactose são transportadas ativamente pela membrana borda em

escova através do co-transportador (symport) Na

/açúcar e são acumuladas dentro da

célula. Enquanto algumas destas glicoses fluem no metabolismo celular, uma grande

fração sai da célula pela membrana basolateral por difusão (uniport). No caso de

análogos de glicose que são transportados pela SGLT1, mas não são metabolizados,

como por exemplo, a alfa-metil-D-glicopiranosídeo, o meio intracelular pode alcançar

uma concentração 500-vezes maior do que aquela no lúmen intestinal. A energia para

este transporte ativo vem do gradiente de sódio que passa pela membrana borda em

escova. Este gradiente de sódio é mantido pela Na

-ATPase basolateral, que

impulsiona os íons sódio co-transportados para fora pela membrana basolateral (Figura

3) (Wright et al., 2003).

Figura 3. Um modelo para o transporte de açúcar pelo enterócito. Os açúcares são transportados pela

célula e não pelas junções comunicantes. Na borda em escova, a glicose e a galactose são

transportadas para dentro da célula por um sódio co-transportador de glicose, denominado

primariamente de SGLT1. A frutose é transportada passivamente pela borda em escova pela SGLT5.

Alguns autores sugerem que há um segundo transportador de glicose de baixa afinidade na borda em

escova: uns dizem que é o GLUT2, enquanto outros dizem que pode ser um segundo SGLT. A glicose, a

galactose e a frutose são transportadas passivamente para o exterior do enterócito pela membrana

basolateral, indo para o sangue. Para os análogos de açúcar que não são metabolizados, como o

3OMDG (3-O-metil-D-glicopiranosideo), o principal caminho é através do GLUT2. A frutose e a glicose

podem passar também pela GLUT2, mas há uma grande evidência de que a frutose também passa pela

GLUT5 e que a glicose deixe a célula por um mecanismo tipo a exocitose. Fonte: Wright et al., 2003.

Para cada molécula de glicose que é transportada pela borda em escova, dois

íons sódio (e dois ânions) também são transportados pelo epitélio. Isto atrai

aproximadamente 1.100 moléculas de água pelo epitélio para manter a isosmolaridade

do absorvido, lembrando que a absorção de íon e do nutriente pelo intestino não

aumenta a osmolaridade do fluido que continua no lúmen intestinal. O conjunto de

absorção glicose, sal e água justificam o fato de que a absorção de água que ocorre na

porção inicial e no meio do intestino é glicose-dependente, e é a explicação para a

terapia de reidratação oral, usada tão eficazmente para tratar pacientes com diarréia

secretora (Hirschhorn & Greenough, 1991; Wright et al., 2003).

2.5.2 Absorção de proteínas

As proteínas ingeridas não sofrem na boca, modificações químicas, sendo

apenas reduzidas a partículas menores. No estômago, as proteínas e polipeptídios são

desnaturados por ação do HCl e hidrolisadas pela pepsina. A digestão no estômago

representa apenas 10-20% da digestão total protéica. A maior parte desta digestão

ocorre no lúmen do duodeno e jejuno, sob a influência do suco pancreático,

processando-se, quase completamente no íleo terminal (Frenhani & Burini, 1999;

Teixeira, 2003).

No intestino delgado, a enteropeptidase, em pH neutro, ativa o tripsinogênio a

tripsina que, por sua vez, promove a ativação das outras propeptidases do suco

pancreático. Ocorre, então, a hidrólise luminal de proteínas e polipeptídios, produzindo

aminoácidos (AA) livres e pequenos peptídios (2-6 AA). Os AA e pequenos peptídios,

produtos da hidrólise luminal, são então hidrolisados pelas peptidases da borda em

escova em AA, di e tripeptídios que são absorvidos, principalmente, no jejuno proximal

(Frenhani & Burini, 1999). É importante ressaltar que uma parte dos peptídeos é

absorvida intacta por difusão. Depois de absorvidos, estes podem ser hidrolisados em

aminoácidos por peptidases celulares e passar para a circulação (Waitzberg & Mester,

1998), alcançar os linfonodos regionais e serem apresentados ao sistema imunológico

local (Mayer, 2005).

A absorção dos produtos da digestão protéica, AA, di e tripeptídios, ocorrem por

processos complementares, e podem ser transportados por três mecanismos simples:

transferência passiva por difusão, transferência passiva por difusão facilitada e

transferência ativa por co-transporte (Figura 4). A transferência passiva pode ser por

vias celulares ou paracelulares, enquanto a transferência ativa, por vias celulares

(Frenhani & Burini, 1999).

Figura 4

Vias de absorção de aminoácidos e peptídios. Fonte: Frenhani & Burini, 1999.

A atividade dos transportadores de AA e peptídios na borda em escova é

regulada pelos respectivos níveis de substratos, sendo que as variações que ocorrem

nessa atividade, dependem do custo da síntese dos transportadores e da

disponibilidade de nutriente no lúmen, cuja presença causa estimulação da atividade do

transportador. Portanto, a absorção não parece ser diretamente regulada por

mecanismos neurais ou endócrinos, como os processos digestivos, dependendo

apenas da presença dos produtos a serem absorvidos em contato com a superfície da

mucosa (Frenhani & Burini, 1999).

2.5.3 Absorção de lipídios

O intestino delgado é o sítio inicial de absorção dos ácidos graxos da dieta.

Devido a sua lipossolubilidade acreditava-se que estes eram absorvidos por difusão.

Porém, Wilson e colaboradores demonstraram a existência de uma camada

estacionária de água junto à borda em escova dos enterócitos, na qual a solubilização

é muito baixa. Desta forma esta camada estacionária atua como barreira, impedindo a

migração das moléculas de ácidos graxos até a borda em escova. A solubilização

micelar é muito importante para garantir a absorção dos produtos da digestão lipídica

no lúmen intestinal. Quando a concentração luminal de sais biliares excede a

concentração micelar crítica, formam-se micelas mistas de sais biliares e fosfolipídios.

As moléculas difundem-se facilmente por entre a camada estacionária de água,

possibilitando um aumento significativo da concentração aquosa de ácidos graxos e

monoacilgliceróis (Curi et al., 2002). O fluxo de ácidos graxos pela membrana apical é

muito grande, favorecido por alguns fatores como: alta concentração luminal de ácidos

graxos, presença de mecanismos apicais de transporte mediados por carreadores e a

solubilização micelar dos ácidos graxos no lúmen intestinal (Berk et al., 1996; Trotter et

al., 1996). O tamanho da cadeia carbônica também interfere no processo de absorção.

Os ácidos graxos de cadeia curta são em sua maioria produzidos no intestino a partir

da fermentação bacteriana das fibras, principalmente as solúveis, sendo pouco

adquiridos da dieta (leite e derivados são fontes de ácido butírico). A absorção destes

ácidos graxos é diretamente proporcional à sua concentração na solução de perfusão

(Liao et al., 1984) e geralmente ocorre por difusão. A digestão enzimática dos

triglicerídios ocorre de forma mais intensa no duodeno pela ação da lipase e colipase

pancreáticas, além de íons cálcio. No duodeno, a lipase pancreática atua na região

hidrofóbica da interface óleo-água para separar os dois ácidos graxos da posição alfa.

A colipase facilita a ação da lipase pelo deslocamento do sal biliar do substrato, já que

estes tendem a inibir a ação da lipase. Os produtos primários da ação da lipase sobre

as gorduras (ácidos graxos de cadeia longa e monoglicerídios) combinam-se com os

sais biliares formando micelas. As demais gorduras têm digestão diferenciada. Assim,

os ésteres de colesterol e fosfolipídios são rompidos por esterases em ácidos graxos,

colesterol e lisofosfatídeos. As vitaminas lipossolúveis podem ser incluídas no interior

das micelas, que se rompem ao entrar em contato com a borda em escova da

membrana intestinal. Os sais biliares permanecem no lúmem para formarem outras

micelas no jejuno-íleo e posteriormente sofrerem absorção (Armand, 2007).

Os monoacilgliceróis e os ácidos graxos de cadeia longa são absorvidos na borda

em escova dos enterócitos e migram para o retículo endoplasmático liso destes, no

qual ocorre a ressíntese dos triacilgliceróis, que formarão as lipoproteínas que atingem

a circulação via sistema linfático. Ockner e Manning isolaram e caracterizaram uma

família de pequenas proteínas (aproximadamente 15 kDa) denominadas de proteínas

ligantes de ácidos graxos (FABP) responsáveis pelo transporte citosólico dos ácidos

graxos de cadeia longa (Ockner & Manning, 1976). Além de transporte, elas atuam

como co-fatores de várias enzimas que participam do metabolismo lipídico (como a

acetilcoenzima A sintetase), participam do estoque de ácidos graxos de cadeia longa

não esterificado e protege a membrana celular contra o potencial ação detergente de

concentrações elevadas de ácidos graxos livres. Modulam ainda sinais intracelulares

mediados por lipídios, o crescimento e a diferenciação celular (Stremmel, 1988; Prieto

et al., 1996). Prieto e colaboradores (1996) demonstraram a existência de FABPs

associadas à borda em escova dos enterócitos e uma possível participação destas

proteínas na absorção de ácidos graxos. Bass e colaboradores (1985) investigaram a

cinética do influxo de ácido oléico marcado no jejuno e no íleo de ratos, utilizando

vesículas de membranas da borda em escova dos enterócitos (Bass et al., 1985).

2.6 Tecido Linfóide Associado às Mucosas (MALT)

O conceito de tecido linfóide associado às mucosas foi introduzido por

McDermont e Bienenstock (1978), que mostraram que os linfoblastos B de origem

intestinal migram preferencialmente para outras mucosas ou outros sítios do próprio

intestino (Mcdermott & Bienenstock, 1978; Mcdermott et al, 1980). Guy-Grand e

colaboradores (1978) mostraram, no camundongo, que o mesmo ocorre com

linfoblastos T. A idéia de um “sistema imunitário comum das mucosas” se baseia nas

características desta comunidade linfocitária que se estabelece nas mucosas e pela

circulação recursiva das mesmas (Guy-Grand et al, 1978).

O campo da imunologia de mucosa cresceu muito nas últimas duas décadas.

Hoje o fenômeno da tolerância oral e da população envolvida neste sistema são focos

importantes de estudo onde os modelos animais de inflamação intestinal se destacam

para o melhor entendimento deste complexo sistema (Mayer, 2005).

2.6.1 Placas da cripta (Cryptopatches-CP)

Em 1996, Kanamori e colaboradores identificaram um novo tipo de tecido linfóide

na mucosa intestinal de murinos, as placas da cripta (CP), por estarem localizadas na

lamina propria das criptas. Podem ser detectadas a partir de duas ou três semanas

após o nascimento, e uma fração dos linfócitos das CP expressam c-kit, IL-7R e Thy-1

(Kanamori et al, 1996).

As CP são compostas por pequenos grupos de células linfóides com fenótipos

de linfócitos imaturos e células dendríticas. Suas células precursoras expressam

CCR6, e a deleção deste receptor inibe o desenvolvimento dos folículos linfóides

isolados (Lügering & Kucharzik, 2006). A função das CP ainda é controversa. Quando

foram identificadas pela primeira vez acreditava-se que fosse um sítio extratímico de

desenvolvimento de linfócitos T intra-epiteliais através de observações feitas em

camundongos atímicos. Estudos mais recentes mostraram que as células das CP têm

um fenótipo consistente com as células tronco de origem linfopoiéticas. Novas

evidências mostram que a formação dos LIE não depende das CP. Estudos

subseqüentes demonstraram que há presença destes linfócitos mesmo em

camundongos deficientes de linfócitos T (Mayer, 2005).

2.6.2 Placas de Peyer (PP)

Para muitos autores, são nos agregados linfóides das placas de Peyer que

ocorre a maior parte da reatividade às macromoléculas que penetram na mucosa

intestinal. Sendo um órgão linfóide reconhecidamente importante do intestino, foi

descrito em 1677 por Joseph Hans Conrad Peyer como um agregado linfóide

macroscópico (Mayer, 2005).

As PP estão situadas abaixo de um tecido epitelial especializado, denominado

de células M. Estas são mais permeáveis a macromoléculas que as células epiteliais,

que recobrem as vilosidades e as criptas adjacentes (Owen, 1977; Pappo et al, 1988).

Este aumento na permeabilidade está diretamente relacionado às suas características

morfológicas, destacando-se uma camada de glicocálix e de muco mais delgada do

que aquela que recobre o restante do intestino delgado. Diferentemente das células

epiteliais, as células M não apresentam uma borda em escova (microvilosidades) bem

desenvolvida (Mayer, 2005).

O aumento de permeabilidade, em relação ao restante do epitélio, associado à

expressão constitutiva de proteínas de classe II do MHC, sugere um papel importante

destas células na regulação das interações do sistema imunológico com o meio

ambiente (Allan et al, 1993).

As células M, diferentemente dos enterócitos, utilizam a endocitose como

principal via de transporte transepitelial. Assim, pouco ou nada do material endocitado

é direcionado aos lisossomos. Embora este compartimento endossomial seja

acidificado e contenha proteases, pouco se sabe sobre a participação destas células no

processamento e apresentação de antígenos. A proximidade das bolsas encontradas

na superfície basolateral com a superfície apical diminui efetivamente a distância de

transporte da vesícula de transcitose através da barreira de células M (Neutra et al,

2001). Recentemente, Verbrugghe e colaboradores (2006) demonstraram a expressão

de Anexina V nas células M. Esta molécula é importante no processo de endocitose e

de suporte da membrana plasmática sugerindo, assim, que Anexina V tem um papel

importante no transporte de antígenos mediados pelas células M (Verbrugghe et al.,

2006)

Uma vez que macromoléculas tenham atravessado as células M, elas entram

em contato com as subpopulações de linfócitos localizadas nas bolsas da superfície

basolateral. Estas subpopulações são constituídas basicamente por linfócitos T, B e

células dendríticas. Os dois últimos tipos celulares funcionam como APC’s nas placas

de Peyer, processando estas moléculas e apresentando seus produtos aos linfócitos T

adjacentes, os quais, por sua vez, estimulam os linfócitos B que ali se encontram.

Estes linfócitos T diferem dos intra-epiteliais e são predominantemente CD4

(Neutra et

al, 2001).

Foi demonstrado que as interações entre as células envolvidas na resposta aos

antígenos oriundos das células M induzem, seletivamente, linfócitos B a secretarem

IgA. Deste modo, em estados fisiológicos, ocorre uma resposta do tipo Th2, com

secreção das interleucinas (ILs) IL-4, 5, 6, 10, 13 e TGF-

e níveis mínimos de IFN-

(McIntyre & Strober, 1999; Mayer, 2000; Nagler-Anderson, 2000).

É importante ressaltar que os linfócitos B ativados e diferenciados, antes de se

tornarem plasmócitos secretores de IgA, deixam as PP, através dos vasos linfáticos

aferentes, em direção aos linfonodos da região mesentérica, onde iniciam seu processo

de maturação. Após esta etapa, estes linfócitos B ganham a circulação sistêmica,

através do ducto torácico, entrando em contato com as outras estruturas linfóides da

periferia. Finalmente, eles retornam para a lamina propria na mucosa intestinal onde,

finalmente, se diferenciam em plasmócitos (Johnson & Kudsk, 1999).

A maioria dos estudos sobre as PP é realizada em modelos murinos. Existem

poucos estudos em humanos, indicando diferenças na estrutura e função deste órgão

linfóide entre as diferentes espécies. Primeiro, sua maior concentração está na região

do íleo, enquanto que nos camundongos encontramos um número maior na região do

duodeno. Segundo, seu desenvolvimento é pré-natal, enquanto que nos murinos o

término do desenvolvimento se dá na fase pós-natal, a partir do contato com antígenos

no lúmen. Essas diferenças parecem ajudar a explicar as dificuldades encontradas nas

tentativas de indução de tolerância oral em humanos (Mayer, 2005).

2.7 Padrão de resposta imune aos antígenos presentes no lúmen

intestinal

O intestino possui um tecido linfóide capaz de iniciar e efetuar uma grande

variedade de respostas imunológicas. Estas reações afetam não só o trato

gastrintestinal, mas o organismo como um todo, de forma sistêmica. Para se ter

verdadeira dimensão da importância do trato digestório como um órgão imunológico,

basta compararmos as superfícies externas da pele, do pulmão e do trato digestório.

Assim, no homem adulto, enquanto a extensão da pele é de apenas 2m

o pulmão

possui cerca de 80m

e o trato digestório pode alcançar até 300m

(Brandtzaeg, 2002).

Além desta diferença em extensão, o intestino é um local privilegiado para contatos do

organismo com o mundo antigênico, incluindo bactérias, parasitas, enzimas, toxinas e

uma ampla variedade de proteínas alimentares e seus produtos metabólicos (Teixeira,

2003).

A barreira essencial a este constante contato antigênico é a mucosa e, portanto,

sua integridade é fundamental dependendo da replicação, maturação e metabolismo de

seus constituintes. Funções adicionais para a manutenção da homeostase dependem

do muco, das lisozimas secretadas pelo pâncreas, fagócitos e de fatores humorais

envolvidos no processo inflamatório e na resposta imunológica (Brandtzaeg, 2002).

Estes fatores são produzidos, na sua maioria, localmente e o somatório destes

mecanismos celulares e moleculares constitui a barreira da mucosa. No entanto, esta

barreira não é absoluta, ao contrário, ocorre uma absorção contínua de antígenos pelas

células epiteliais. As estruturas especializadas das PP, dos folículos linfóides, do

apêndice vermiforme e de seus epitélios especializados permitem uma captação

antigênica contínua (Mayer, 2003).

Por causa deste aporte antigênico intenso e constante, o intestino pode ser

descrito como o principal órgão imunológico de contato fisiológico com o meio

ambiente. As respostas imunes advindas deste contato podem ser diametralmente

opostas levando, por um lado, a resposta imune clássica, com a proliferação

linfocitária, produção de altas concentrações de anticorpos (Ac) e citocinas ou, por

outro, uma hiporreatividade sistêmica conhecida como tolerância oral (Gebbers &

Laissue, 1989).

Embora a maioria dos trabalhos publicados em imunologia dê uma grande

ênfase à atividade dos linfócitos e seus produtos nos linfonodos, baço e outras

estruturas internas, não são nestes locais que se encontra a maior parte do sistema

linfóide. Na verdade, é na mucosa do intestino delgado que se localiza o maior número

de linfócitos secretores de imunoglobulinas (Ig) do corpo (Van der Heijden et al, 1995).

A observação de um grande número de células do sistema imunológico (linfócitos B e

T, macrófagos, polimorfonucleares, etc.) no intestino levou vários autores a

descreverem a mucosa e a submucosa do trato digestório como cronicamente

inflamada ou fisiologicamente inflamada (Newby et al, 1980; Newby & Stokes, 1984).

Quando os animais são mantidos em condições artificiais, isentos de germes,

ocorre uma redução importante do número de células linfóides na mucosa intestinal. No

entanto, a redução é ainda mais drástica quando é oferecido a estes animais uma dieta

livre de macromoléculas – animais livres de antígenos (Hooijkaas et al, 1984). Portanto,

esse tecido linfóide associado às mucosas está envolvido na reatividade a alimentos e

outros materiais provenientes do tubo intestinal. Além disso, os eventos imunológicos

ali iniciados têm evidentes repercussões sistêmicas e não são restritos às mucosas.

Assim, as mucosas em geral e a mucosa digestiva em particular, podem ser vistas

como vias naturais e efetivas de acesso ao sistema imunológico (Menezes et al, 2003).

Assim, o que se achava que eram múltiplos mecanismos para garantir um

contato restrito do organismo com macromoléculas e microrganismos do meio

ambiente, na verdade, são mecanismos que permitem o contato de forma constante e

adequado. A absorção de macromoléculas é de grande importância do ponto de vista

das reatividades imunológicas e da manutenção da estrutura morfológica da mucosa

uma vez que sem estímulos antigênicos não há secreção de fatores tróficos para a

manutenção da fisiologia local (Teixeira, 2003).

Uma das funções das subpopulações de linfócitos T CD4+, CD8+ e linfócitos B é

a regulação da proliferação e manutenção da estrutura epitelial, preservando a

integridade da mucosa intestinal. Desse modo, a presença dos nutrientes na luz

intestinal e seu contato direto com a mucosa intestinal são responsáveis pelos

estímulos antigênicos e, conseqüentemente, pela manutenção da estrutura íntegra da

mucosa intestinal (Mayer, 2005).

A ausência de estímulos antigênicos derivados de uma desnutrição protéico-

calórica ou de uma alimentação peptídica leva à diminuição das subpopulações

linfocitárias e seus produtos – as citocinas. Isto pode levar a um aumento do tempo de

migração celular da cripta para a vilosidade, o que leva à diminuição na renovação

celular, uma das causas da atrofia das vilosidades e, conseqüente, alterações na

permeabilidade e perda da função de barreira (King et al, 1997).

Independente da forma como entram as macromoléculas, através das células M

ou via enterócitos, a resposta fisiológica observada na mucosa intestinal mostra a

ausência de processo inflamatório. Nagler-Anderson e Shi (2001) relatam que após a

administração oral de uma proteína ocorre expansão clonal de linfócitos T,

independente se o padrão de resposta local é tolerogênica ou imunogênica (Nagler-

Anderson & Shi, 2001).

Deste modo, no processo da tolerância oral não ocorre, necessariamente, a

deleção dos clones reativos ao tolerógeno, existindo ao contrário, uma complexa rede

de interações celulares e moleculares na sua indução e manutenção. A tolerância

também é importante para a prevenção de reações de hipersensibilidade aos alimentos

e aos componentes da microflora não patogênica (Nagler-Anderson & Shi, 2001;

Neutra et al., 2001).

A importância fisiológica da tolerância oral, que muitas vezes foi negligenciada,

está sendo cada vez mais estabelecida. Assim, nos últimos anos, têm sido propostos

vários mecanismos para explicar tal fenômeno.

2.8 Tolerância Oral

Embora não reconhecida como tal, a tolerância oral foi o primeiro fenômeno com

bases imunológicas a aparecer na literatura após o relato de Jenner, em 1798, sobre a

vacinação anti-variólica (Mowat, 1987).

Em 1829, Dakin relata como os índios norte-americanos evitavam as dermatites

de contato causadas por uma planta sensibilizante do gênero Rhus (poison ivy). Eles

davam de beber às suas crianças uma infusão da planta. A partir de 1909, surge uma

nova série de artigos descrevendo a indução da tolerância oral a diversas proteínas

derivadas do leite (Beresdka, 1909), do milho e do ovo (Wells, 1911).

Após um novo hiato de três décadas, surge o trabalho de Chase, em 1946,

mostrando que a ingestão prévia de cloreto de picrila (dinitroclorobenzeno) evita a

dermatite de contato pelo pincelamento da pele com este composto (Chase, 1946;

Kraus et al, 2004).

No entanto, foi a partir do final da década de 70 que surgiu uma grande massa

de trabalhos envolvendo a tolerância oral, desta vez utilizando vários antígenos e

modelos animais como o cão (Cantor & Dumont, 1967), o porco (Bourne et al, 1975), a

cobaia (Heppell & Kilshaw, 1982), o rato (Bazin & Plateau, 1976; Bazin & Plateau,

1977); e o camundongo (Hanson et al, 1977; Vaz et al, 1981; Guerra, 1991; Slavin et al,

2001).

É verdade que os alimentos são digeridos na sua maior parte às unidades

estruturais de cada grupo (aminoácidos, ácidos graxos e monossacarídeos). No

entanto, uma parcela biologicamente ativa das macromoléculas ingeridas é absorvida

in natura pela mucosa, entrando em contato direto com os LIE e com as PP (Pappo et

al, 1988). Encontram-se vários relatos na literatura mostrando que ocorre a absorção

de macromoléculas minutos ou até segundos após a sua ingestão, inclusive através da

passagem para o feto ou para o lactente (Bruce & Ferguson, 1986; Bruce et al, 1987).

A rápida absorção de macromoléculas intactas para a circulação pode ser

evidenciada clinicamente nas alergias alimentares, que podem se manifestar por

sintomas generalizados, como urticárias, segundos após a ingestão do alimento

alergênico. No laboratório, ela também pode ser facilmente comprovada por

radioimunoensaio e outros métodos de detecção da presença de antígenos na

circulação (Teixeira, 2003).

Outras formas de hipersensibilidade, que não apenas a hipersensibilidade

imediata, também estão envolvidas nas alergias alimentares como na doença celíaca e

alergia ao leite, por exemplo. Nestas, a característica predominante é o infiltrado de

linfócito T, levando a alterações de inflamação crônica com a secreção de citocinas e

produção de IgG (Teixeira, 2003).

2.8.1 Características do desenvolvimento e manutenção da tolerância oral

A tolerância induzida por via oral não é um fenômeno subtrativo; ou seja, não

exige, necessariamente, a deleção dos clones reativos ao tolerógeno. Isto pode ser

afirmado diante das seguintes observações:

1. A transferência adotiva da tolerância oral pode ser obtida pela transferência

de linfócitos (Bruce et al, 1987);

2. Alguns dias após a indução de tolerância à OVA, por via oral, aparecem no

baço precursores de células secretoras de imunoglobulinas anti-OVA, que

alcançam níveis idênticos aos de animais inoculados (Titus & Chiller, 1981).

No entanto, estas células não se expandem em clones secretores de

anticorpos. Esta é uma situação semelhante à da existência fisiológica de

clones auto-reativos (precursores de células formadoras de auto-anticorpos),

hoje amplamente reconhecidos (Klinman et al, 1988; Coutinho et al, 1992;

Avrameas & Ternync, 1995);

3. Tanto a tolerância quanto a inoculação podem advir da introdução do

antígeno por via digestiva, na dependência do status imunológico, da dose,

freqüência e intervalo entre as exposições antigênicas (Peng et al, 1989;

Faria et al, 1993);

4. Na tolerância oral, a supressão da formação de anticorpos parece ser isotipo

específica (Suzuki et al, 1986; Kitamura et al, 1988), com uma redução da

síntese de anticorpos dos isotipos IgG e IgE. A síntese de IgA pode ser

afetada de forma diametralmente oposta. Às vezes, é induzida e outras vezes

é inibida (Challacombe & Tomasi, 1983);

5. A digestão do antígeno e seu posterior processamento pelas células

acessórias parece ter importância, uma vez que a indução da tolerância é

dificultada pela administração de inibidores de enzimas proteolíticas (Bruce &

Ferguson, 1986);

6. A transferência de soro de animais normais recém alimentados com OVA, é

capaz de transferir a tolerância oral (Bruce & Ferguson, 1986);

7. A transferência adotiva de linfócitos γδ intra-epiteliais de animais imunes para

animais tolerantes é capaz de reverter a tolerância oral ( Fujihashi et al, 1992;

Fujihashi et al, 1996).

8. A exposição a antígenos orais induz, preferencialmente, um padrão de

resposta Th2(IL-4/IL-10) ou Th3 (TGF-β) com propriedades supressoras

sobre a resposta Th1 e outras células imunitárias. As células tipo Th3,

aparentemente, são distintas das células Th2, uma vez que células CD4(+)

secretoras de TGF-β com propriedades supressivas no trato gastrintestinal

têm sido geradas em animais deficientes em IL-4 (Inobe et al, 1998; Baggi et

al, 1999; Slavin et al, 2001).

Estes dados indicam, portanto, a operação de uma complexa rede de interações

linfocitárias na indução e manutenção da tolerância oral. Estão incluídos nestas

interações tanto células T com receptores αβ, como γδ (Fujihashi et al, 1989; Fujihashi

et al, 1990).

2.8.2 Regulação antígeno-específica

Embora os mecanismos que resultem na indução de hiporresponsividade

sistêmica, após a introdução de um antígeno por via oral, ainda não estejam

completamente esclarecidos, sabe-se que a dose do antígeno tem grande importância

neste fenômeno (Friedman & Weiner, 1994). Por exemplo, doses baixas e repetitivas

induzem uma supressão ativa caracterizada pela presença de células T regulatórias

que incluem as células Th3 secretoras de TGF-

e as células Th1 secretoras de IL-10

(Groux, 2001; Carrier et al, 2007), enquanto que, uma dose única alta com freqüência

leva a hiporresponsividade sistêmica e local tanto da resposta humoral como celular

por deleção clonal ou anergia dos clones específicos (Kraus et al, 2004).

Assim, a via fisiológica de contato com antígenos dietéticos, ao contrário das

formas artificiais como tem sido estudada a tolerância oral, induzem respostas ativas

com proliferação celular, baixa secreção de anticorpos antígeno específicos, além da

regulação do micro ambiente local mediado através de citocinas, sem ativar os circuitos

inflamatórios das respostas imunitárias clássicas. Esta conclusão pode ser inferida pela

observação de que as principais citocinas envolvidas neste mecanismo são a TGFβ e

IL-10 (Teixeira, 2003).

Dada a multiplicidade das interações inter-linfocitárias, através de interações de

grupo, idiotípicas ou idiopeptídicas, cada clone pode, em princípio, ser afetado por uma

alteração funcional ou quantitativa de outro clone, alteração esta que se propagaria no

sistema imunológico. Embora não se conheça o impacto e extensão de tais interações,

estas devem contribuir de forma substancial para a seleção do repertório T e B, ou

seja, determinar quais especificidades de regiões variáveis, e quantas de cada tipo

estão presentes em um dado momento da vida do indivíduo. A topologia desta rede -

qual linfócito interage com qual, e de que forma e qual seu fenótipo efetor (Th1, Th2,

Th3, imunoregulador, etc.) - determinaria os estados de tolerância ou imunidade, em

relação a antígenos, sejam estes próprios e/ou estranhos (Mayer & Shao, 2004).

É interessante notar que nas doenças auto-imunes observa-se uma perturbação

do repertório T e B que é muito mais ampla do que se esperaria no caso de uma

atividade restrita a um pequeno conjunto de clones auto-agressivos. Isto sugere que a

quebra da tolerância e o conseqüente estabelecimento da auto-imunidade envolvem

uma extensa modificação da homeostase do sistema imunológico, alterações estas que

não dizem respeito somente aos clones diretamente auto-reativos, mas a circuitos

regulatórios pouco conhecidos. Seria, portanto, desejável que o desequilíbrio desta

homeostase pudesse ser estudado através de uma análise global do repertório T e B, e

com isso, fosse correlacionado o perfil do repertório com o estado funcional do sistema

imunológico (tolerância, auto-agressão, resposta imune) (Mayer & Shao, 2004).

2.9 Alergia alimentar

Aproximadamente 20% da população altera a dieta em função de reações

adversas a algum tipo de alimento. Estas podem ser desencadeadas pela variabilidade

de antígenos aos quais as pessoas entram em contato diariamente, pela diversidade

das respostas imunes a estes antígenos, por desordens metabólicas do indivíduo ou

até mesmo toxicidade do alimento em questão (Sicherer & Sampson, 2006).

Em um encontro de especialistas (alergistas, dermatologistas, pediatras, clínicos

gerais, pneumologistas e nutricionistas), ocorrido em Ultrecht, em 1990, buscava-se o

estabelecimento de um consenso sobre as hipersensibilidades alimentares,

particularmente no que concerne aos mecanismos da doença, métodos diagnósticos e

tratamento. Neste encontro não se chegou a uma conclusão em relação à

nomenclatura que diz respeito a todos os mecanismos envolvidos na hipersensibilidade

alimentar como, por exemplo, as manifestações extra-entéricas (de Monchy, 1991). No

entanto, um ponto importante deste encontro, foi o estabelecimento do uso de termos

como alergia e intolerância alimentar. Estas definições e/ou distinções estão

enunciadas a seguir:

♦ Alergia alimentar

“Definida como manifestações adversas ao alimento, mediadas por

mecanismos imunológicos”.

♦

Intolerância alimentar

“Definida como mecanismos não imunológicos das reações adversas ao

alimento como, por exemplo, a ausência da síntese de lactase na intolerância

ao leite”.

Tendo em vista a necessidade de se identificar os fatores desencadeadores das

reações adversas, a Academia Européia de Alergologia e Imunologia Clínica (EAACI)

estabeleceu, em 1995, uma classificação simples para as reações adversas aos

alimentos, baseada nos seus mecanismos patogênicos (Figura 5) (Johansson, 2004).

Figura 5.

Fluxograma da classificação da EAACI de 1995 para reações adversas aos alimentos baseada

nos mecanismos patogenéticos. Fonte: Ortolani & Pastorello, 2006 (modificado).

A primeira distinção feita com relação à toxicidade dos alimentos resulta em um

efeito nocivo observável em qualquer indivíduo (tóxico). Dois exemplos de efeitos

tóxicos agudos são: contaminação bacteriana (a própria bactéria ou suas toxinas) e

organofosforados. Como um exemplo de efeito tóxico crônico, podemos citar a

contaminação alimentar com metais pesados - chumbo ou mercúrio. Do lado das

reações não tóxicas, distinguem-se aquelas de ordem não imunológica (intolerância) ou

imunológica (alergia alimentar) (Ortolani & Pastorello, 2006).

As reações adversas não imunológicas podem ser classificadas em:

a) Enzimáticas - que na maioria dos casos é hereditária, como por exemplo,

a intolerância a lactose (ausência da enzima específica);

Reação adversa aos alimentos

Tóxica

Não-tóxica

Imuno Mediada (alergia

alimentar)

Não imuno mediada

(intolerância alimentar)

Enzimática

Farmacológica

Indefinida

IgE

Não-IgE

b) Farmacológicas - alguns indivíduos apresentam um limiar mais baixo ao

contato com substâncias tais como a histamina, presentes em alguns

alimentos (morango, vinho tinto);

c) Indefinidas - aquelas intolerâncias que não se encaixam nas duas formas

anteriores (Ortolani & Pastorello, 2006).

As reações adversas de ordem imunológica são, de um modo geral, respostas a

proteínas e são classificadas em:

a) Mediada por imunoglobulinas da classe IgE – a forma de alergia

alimentar mais comum e mais estudada que pode apresentar desde

sinais e sintomas dos mais leves (edema transitório), até reações graves

que envolvem problemas na pele, nos tratos respiratório e gastrintestinal

e no sistema cardiovascular (Ortolani & Pastorello, 2006);

b) Não mediadas pela IgE - que consiste em mecanismos que envolvem

outras classes de imunoglobulinas (IgG, IgM e IgA), imunocomplexos ou

células (Sicherer & Sampson, 2006).

2.9.1 Proteínas

As respostas alérgicas induzidas por certas proteínas em indivíduos suscetíveis

já estão bem estudadas e estabelecidas. No entanto, a interação das proteínas com o

sistema imune é bastante complexa e por isso torna difícil o entendimento de todos os

seus mecanismos. É sugerido que algumas proteínas sejam mais alergênicas do que

outras, porém ainda é um desafio para a ciência identificar as características que

conferem às proteínas esse potencial alergênico (Huby et al, 2000). Entre as proteínas

consideradas muito alergênicas estão aquelas derivadas do amendoim, oleaginosas de

árvores (tree nuts), clara de ovo, leite, peixes, crustáceos, entre outras (Teixeira, 2003).

A sensibilização induzida pelo amendoim afeta uma parcela significativa da

população, principalmente nos Estados Unidos, onde o consumo de amendoim é muito

grande (Palmer & Burks, 2006). Por outro lado, para outras oleaginosas, como a

castanha do Pará e a castanha de caju, poucos são os relatos de alergenicidade na

literatura internacional. Em um levantamento bibliográfico, consultando o banco de

dados do Pubmed, no período de 1935 a 2007, foram encontradas as seguintes

referências:

• Cashew nut AND allergy - 56 relatos envolvendo alergia a castanha de caju;

• Brazil nut AND allergy - 41 relatos envolvendo alergia a castanha do Pará;

•

Peanut AND allergy – 873 relatos envolvendo a alergia ao amendoim;

• Egg white AND allergy – 1335 relatos envolvendo a alergia a clara do ovo.

Para o melhor entendimento da resposta imune aos antígenos protéicos, tais

como o amendoim e a clara de ovo, é importante conhecer seus componentes

alergênicos. Hoje já estão identificados oito alérgenos principais dentre a fração

protéica do amendoim (Arachis hypogaea) (Ara h1 a Ara h8). Algumas pesquisas

recentes na população americana mostram uma maior alergenicidade de Ara h1 e Ara

h2 (Palmer & Burks, 2006), enquanto que um estudo desenvolvido na Itália mostrou

que Ara h3 é o antígeno principal na indução de alergias na população estudada

(Restani et al, 2005).

2.10 Inflamação Intestinal: O Problema

A etiologia para a maioria das doenças inflamatórias intestinais (DII) é

multifatorial, envolvendo fatores genéticos, estímulos da microflora, fatores ambientais

e possíveis anormalidades na imunidade sistêmica e da mucosa (Elson et al, 1998).

Assim, um único agente ou um mecanismo isolado não parece ser suficiente para

produzir ou desencadear a inflamação intestinal. Ainda que não existam evidências

diretas, a quebra da tolerância oral pode contribuir de modo importante para o

desenvolvimento e perpetuação das DII crônicas que iniciaram, muitas vezes, meses

ou anos antes de seu diagnóstico (Mowat & Weiner, 1999).

As questões relativas à patogenia da DII foram exemplificadas na seguinte

proposição: a atividade inflamatória recorrente e crônica da doença reflete uma

resposta apropriada a um estímulo persistentemente anormal (por exemplo, alteração

estrutural do intestino ou agente causal no meio ambiente) ou uma resposta

anormalmente prolongada a um estímulo normal (Figura 6) (Peakman & Vergani,1999).

Figura 6. Possíveis mecanismos que levam ao desenvolvimento da DII. No intestino normal (a), um

estímulo antigênico intraluminal é tratado pela ação combinada das respostas imunológicas antígeno-

específicas e reações inflamatórias, reguladas de modo negativo após a eliminação do estímulo; na DII

(b), o estímulo persiste (infecção crônica) ou ocorre a perda da regulação das respostas imunológicas e

inflamatórias. Em ambos os casos, o resultado consiste numa resposta imunológica persistentemente

intensificada, que provoca a lesão tecidual. Fonte: Peakman & Vergani,1999.

As inflamações intestinais crônicas podem ser classificadas em um sentido

amplo como: retocolite ulcerativa (RU), doença de Crohn (DC), enteropatias com perda

protéica (protein losing enteropathies), doença celíaca, alergias alimentares e outras

enteropatias mediadas imunologicamente (Teixeira, 2003). Uma outra classificação,

mais restrita, ressalta apenas duas doenças: a DC e a RU. Ambas resultam em

sintomas constantes ou recorrentes incluindo diarréia, dor, diminuição do apetite, perda

de peso e retardo de crescimento. Estas doenças manifestam-se durante a infância ou

adolescência em 20-25% dos pacientes. A incidência destas DII varia mundialmente,

apresentando uma baixa incidência nos países asiáticos e mediterrâneos e uma alta

incidência, abrangendo de 0,3% a 0,8% da população no nordeste da Europa,

Escandinávia, Nova Zelândia e Estados Unidos (Nicholas et al., 2007).

Tendo em vista que as DC e RU são multifatoriais, mediadas imunologicamente,

e, além do mais, podem ser classificadas em várias entidades, utilizamos neste

trabalho, a classificação mais ampla das inflamações intestinais crônicas.

Além das alterações no padrão de resposta local dos linfócitos T e B da mucosa

intestinal, ou até em função destas, observa-se também uma mudança na população

de macrófagos que são importantes na resposta inflamatória imune e de reparo do

tecido. Na mucosa intestinal normal, principalmente na lamina propria e nas PP, existe

uma grande população de macrófagos. Estes representam a principal população de

APC capazes de determinar o tipo de resposta celular mediada pelas células T para os

antígenos luminais (Allison et al, 1988).

Não é fácil induzir uma resposta inflamatória em macrófagos intestinais normais

residentes da mucosa, pois estes não liberam a IL-1 madura, mas sim uma forma

inativa desta (Allison et al, 1988). Esta incapacidade se deve ao fato destes

macrófagos expressar apenas a forma inativa da enzima conversora da interleucina

(ICE – Interleukin Converting Enzyme), mesmo quando estimulados por LPS - um

potente ativador destas células. Ao contrário, no processo ativo da inflamação intestinal

crônica, a população de macrófagos presentes na mucosa é, na sua maioria, derivada

do sangue periférico que, quando estimulados pelo LPS, expressam tanto o precursor

quanto a forma ativa da enzima conversora (ICE) e, portanto da IL-1. Isto sugere que a

indução do processo inflamatório intestinal depende diretamente de macrófagos

derivados de monócitos circulantes e não das populações de macrófagos residentes

(Mahida, 2000).

Além disso, os macrófagos recrutados do sangue periférico são fenotipicamente

diferentes da população residente da mucosa. Em pacientes com DC e RU, estes

macrófagos são capazes de secretar, além da IL-1, muitas outras interleucinas pró-

inflamatórias (IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF-α), além de metabólitos reativos do oxigênio

e do nitrogênio, que degradam a matriz extracelular. Por outro lado, os macrófagos

também são importantes no processo de cicatrização e reparo que ocorrem durante a

fase de remissão da doença (Mahida, 2000).

Além dos macrófagos, os neutrófilos, mastócitos e eosinófilos também podem ter

um papel importante na patogenia da inflamação intestinal. Entretanto, o papel dessas

células ainda não foi completamente elucidado (Madara et al, 1991; Kucharzik et al,

2001).

O número aumentado de mastócitos e eosinófilos na mucosa inflamada está

correlacionado à manutenção da resposta inflamatória local, uma vez que liberam

mediadores pró-inflamatórios como a histamina, metabólitos do ácido araquidônico e

enzimas proteolíticas (Resnick et al, 1993). Araki e colaboradores (2000) mostraram

que animais deficientes de mastócitos apresentam uma forma muito mais branda da

colite induzida por uma Dextrana de Sulfato de Sódio - DSS (dextran sulphate sodium)

(Araki et al, 2000).

As prostaglandinas e os leucotrienos, mediadores lipídicos do processo

inflamatório, são sintetizados a partir do ácido araquidônico. Seus efeitos metabólicos

incluem a vasodilatação, o aumento da permeabilidade vascular e a quimiotaxia para

neutrófilos (Newberry et al, 1999).

A síntese de mediadores pró-inflamatórios a partir do ácido araquidônico e a

importância de determinados substratos metabólicos no restabelecimento dos danos

teciduais da mucosa, causados pela inflamação intestinal crônica, indicam a utilização

de nutrientes específicos como uma possível terapia exclusiva, ou adjuvante, na

resolução da inflamação intestinal crônica (Newberry et al, 1999).

A inflamação intestinal crônica provoca destruição das vilosidades, hiperplasia

das criptas e infiltrado inflamatório na lamina propria. Optamos por mostrar,

esquematicamente (figura 7), uma classificação para as alterações da mucosa

intestinal, proposta por Marsh (Marsh, 1995).

Normal Estágio I Estágio II Estágio III Estágio IV

Estágio I ou infiltrativo - infiltrado de leucócitos com predomínio de linfócitos.

Estágio II ou hipertrófico - infiltração leucocitária e uma hiperplasia da mucosa.

Estágio III ou destrutivo - além do infiltrado, inicia-se a destruição da mucosa.

Estágio IV ou hipoplásico - hipoplasia da mucosa.

Figura 7. Desenho esquemático das principais alterações observadas em diferentes estágios da

inflamação intestinal crônica. Adaptação de Marsh, 1995.

2.11 Modelos animais

Vários modelos têm sido desenvolvidos para o estudo dos mecanismos

envolvidos nas DII buscando o entendimento destas entidades em humanos e animais

domésticos. Embora nenhuns dos modelos animais atuais tenham reproduzido

completamente a DII humana, os modelos animais de inflamação intestinal têm

providenciado conhecimentos úteis em relação à patogênese da resposta inflamatória

intestinal. Esses modelos animais têm se referido à ocorrência espontânea ou induzida

da doença. Modelos induzidos de DII incluem (i) animais que foram tratados com

agentes que promovem inflamação intestinal, (ii) roedores que foram manipulados

geneticamente por marcadores de genes ou pela introdução de transgenes, e (iii)

animais imunodeficientes em que as populações celulares que medeiam a inflamação

intestinal foram transferidas (Hendrickson et al., 2002). A tabela 1 cita alguns exemplos

de modelos animais de DII descritos.

Tabela 1.

Exemplos de modelos animais de DII.

Ocorrência espontânea

Linhagem de camundongo C3H/HeJBir

Linhagem de camundongo SAMP1/Yit

Tratamento com agentes que provocam injúria na mucosa

Enemas de ácido sulfônico trinitrobenzeno (TNBS)

Administração de dextrana de sulfato de sódio (DSS)

Alteração da função das citocinas

Camundongo knockout IL-10

Camundongo knockout IL-2

Camundongo TNF ∆ARE

Camundongo transgênico STAT-4

Alteração da função da célula T

Camundongo knockout com receptor α para célula T

Camundongo knockout com receptor β para célula T

Rato transgênico HLA-B27

Transferência de células de camundongo CD4

CD45RB

para SCID ou Rag

-/-

Desregulaçao da função da barreira epitelial

Camundongo mutante com gene multi-drogas resistente

Camundongo knockout com fator trefoil intestinal

Fonte: Hendrickson et al., 2002.

Nos últimos anos, a geração de animais manipulados geneticamente através da

deleção, inserção e/ou alteração de genes específicos levou à geração inesperada de

linhagens de roedores que desenvolvem a inflamação intestinal crônica espontânea.

Embora nenhuma destas linhagens geneticamente modificadas reproduza fielmente

todas as alterações histopatológicas e clínicas associadas às formas humana das DII

crônicas, muitas exibem aspectos fundamentais que compõem o desenvolvimento

espontâneo destas enfermidades (Hendrickson et al., 2002).

Os modelos experimentais são promissores, uma vez que permitem dissecar os

vários constituintes do epitélio intestinal e da resposta imune da mucosa, necessária

tanto para a manutenção da homeostasia como para a sua quebra e, conseqüente,

inflamação intestinal crônica.

Também têm surgido muitos modelos animais para o estudo da alergia

alimentar, entendida classicamente como reação mediada pela IgE. Nos modelos

animais descritos na literatura, os aspectos histológicos do trato gastrintestinal não são

o foco de atenção principal, como revisto por Helm (2002). Os principais animais

utilizados nestes modelos são cobaias, camundongos, ratos, cães atópicos e porcos

recém-natos. Geralmente, têm se procurado nestes modelos a produção de IgE,

resposta clínica à re-exposição antigênica e a classificação por ranqueamento da

alergenicidade dos alimentos, incluindo fontes protéicas não dietéticas (Helm, 2002).

O modelo murino de inflamação intestinal crônica desenvolvido por Teixeira

(2003) avalia os processos inflamatórios crônicos desencadeados por proteínas

dietéticas oferecidas de forma fisiológica (via oral). Neles, não se observa uma

resposta Th2 típica como descrito para a maioria dos modelos de alergia alimentar,

mas uma resposta que sugere o padrão Th1 (Teixeira, 2003). A proteína alergênica

utilizada neste modelo é o amendoim (Arachis hypogea), que pode ser consumido por

roedores em condições naturais, não faz parte da composição da ração utilizada para a

manutenção dos camundongos utilizados, é uma semente de baixo custo e de fácil

obtenção (Teixeira, 1995; Teixeira et al., 2007). Além disso, o amendoim é uma

semente considerada como um dos alimentos que mais freqüentemente levam a

respostas alérgicas em humanos

(Burks et al., 1995). Em nossa revisão não

encontramos modelos experimentais de alergia alimentar com respostas tipicamente

Th1. Em humanos, algumas formas de intolerância ao glúten, à caseína e outras

proteínas alimentares são mediadas por respostas tipo Th1, reforçando desta forma a

importância deste modelo experimental.

2.12 Inflamação intestinal crônica e a má-absorção de nutrientes

A literatura médica enfatiza a relação existente entre as DII e os processos

relacionados à má absorção e perda de peso corporal, em que o comprometimento

intestinal provoca alterações de absorção de nutrientes (glicídios, lipídios e proteínas)

em diferentes graus. A má absorção entérica pode estar presente em uma variedade

de condições clínicas, podendo ser resultante da competição bacteriana ou da flora

intestinal alterada, de alterações funcionais da mucosa do intestino delgado, da

obstrução do fluxo linfático ou de doenças que afetam a mucosa do intestino delgado,

como os diferentes tipos de inflamação que a atingem (Kao et al., 1999).

Clinicamente se sabe que a permanência prolongada de tais alterações se

reflete, posteriormente, em prejuízos para o organismo. O prejuízo na absorção de

aminoácidos influi num mesmo teor de proteínas orgânicas com reflexos gerais, tais

como, hipoproteinemia, hipoalbuminemia, anemia e baixo título de anticorpos

plasmáticos.

A má-absorção de açúcares pode ocorrer sob diversas circunstâncias,

decorrente de mudanças adaptativas na função do intestino delgado, como as que

ocorrem nas DII, como nos casos de DC e RU (Thomson & Wild, 1997).

Indiretamente, a má-absorção pode ser causada pela redução na área de

digestão da superfície intestinal, por exemplo, na síndrome do intestino curto ou

doenças de inclusão em microvilos, num aumento da motilidade intestinal, ou em

defeitos nos processos digestivos, como por exemplo, na insuficiência pancreática ou

hipolactasia (Wright et al., 2003).

2.12.1 Avaliação da absorção de glicídios através do teste da D-xilose

Danos nos enterócitos, causados pela ativação de células T e liberação de

citocinas, podem levar à má-absorção de monossacarídios e ao aumento da

permeabilidade duodenal. Enquanto a má-absorção pode contribuir para a perda de

peso e desnutrição, o aumento da permeabilidade intestinal pode provocar uma

enteropatia inflamatória (Sharpstone et al., 1999). Dentro dos quadros de inflamação

intestinal observamos alterações importantes na absorção de açúcares. Assim,

investigações não-invasivas da função intestinal são úteis para monitorar as

modificações sofridas pelos pacientes.

Há diversos testes que podem ser realizados para avaliar a alteração de

absorção de carboidratos, tais como o 51 Cr EDTA, lactose, rhamnose e manitol

(Howden et al., 1991; Barboza Jr et al., 1999; Tibble & Bjarnason, 2001), porém estes

testes são complexos.

O teste da D-xilose é atualmente a mais confiável medida quantitativa da função

absortiva intestinal, sendo um teste simples e barato, usado há quase 60 anos (Roe &

Rice, 1948; Eberts et al., 1979). Vários estudos recentes têm utilizado a absorção da D-

xilose como ferramenta investigativa da função duodenal em diferentes cursos clínicos,

como na infecção pelo HIV (Perin et al., 2001) e DII.

A D-xilose é uma pentose encontrada naturalmente nas plantas e sua

metabolização incompleta permite o uso como teste absortivo (Craig & Ehrenpreis,

1999), sendo um método simples e barato (Ehrenpreis et al., 2001). É absorvida no

duodeno e no jejuno; sua absorção é semelhante à de glicídios, já que é estimulado

pelo transporte de íons sódio. Ela pode ser dosada na urina ou soro, porém a maioria

dos estudos parece ser mais favoráveis ao teste sérico do que ao de excreção urinária

para triagem de pacientes adultos e pediátricos para má-absorção intestinal, pois pode

sofrer interferências como hidratação inadequada, alteração do clearance renal, tempo

de coleta, dentre outras (Craig & Atkinson, 1988). Em humanos, há também o teste de

D-xilose avaliado através de níveis de H

expelidos na respiração após sua ingestão,

sendo um teste útil no diagnóstico da má-absorção intestinal tanto em adultos quanto

em crianças. O princípio deste teste consiste no fato de que, quando a integridade da

mucosa duodenal apresenta um distúrbio, quantidades elevadas de D-xilose

administradas oralmente irão alcançar o cólon e serão fermentadas pela flora local,

produzindo taxas excessivas de excreção de H

pela respiração (Casellas et al., 2000;

Rana et al., 2007).

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Avaliar a absorção intestinal de D-xilose no modelo experimental de inflamação

intestinal crônica antígeno-específica.

3.2 Específicos

• Reproduzir o modelo murino de inflamação intestinal crônica antígeno-

específica, desenvolvido para camundongos, em ratos;

• Padronizar a técnica da D-xilose sérica, adaptada para camundongo, no modelo

de alergia alimentar em ratos;

• Avaliar a inflamação intestinal crônica através de parâmetros, como:

A evolução do peso corporal;

o A titulação de anticorpos IgG total anti-proteína de amendoim;

Os aspectos histológicos da mucosa intestinal;

Absorção intestinal da D-xilose.

• Correlacionar os achados referentes à absorção intestinal da D-xilose com os

achados sorológicos e histológicos.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Animais

Ratos isogênicos adultos, machos, da linhagem Lou-M, criados e mantidos no

Núcleo de Animais de Laboratório – Instituto de Biologia da Universidade Federal

Fluminense. Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno com tampas de

aço inox e sobre cama (maravalha) esterilizada pelo calor. A temperatura ficou em

torno de 25ºC, controlada por exaustores, assim como a purificação do ar.

Inicialmente, os animais foram divididos em três grupos controle - Normal Ração

(NR), Normal Amendoim (NA), Imune Ração (IR) e um grupo experimental - Imune

Amendoim (IA). A constituição de cada grupo será detalhada na seção abaixo.

4.2 Protocolos Experimentais

4.2.1 Protocolo experimental I – Experimento piloto para indução da inflamação

4.2.1.1 Objetivo

Reproduzir o modelo murino de inflamação intestinal crônica antígeno-específica

em ratos, além de avaliar e comparar o consumo, o peso corporal e a sorologia entre

os grupos do experimento.

Quadro 1. Protocolo experimental I

Grupos

Imunização

Primária

(sc)

Imunização

Secundária

(sc)

Dieta

Desafio

Imune

Ração

(IR)

Ração

ad libitum

Imune

Amendoim

(IA)

Extrato protéico de amendoim

+ Al(OH)

Extrato protéico de amendoim

Amendoim

in natura ad

libitum

Normal

Ração

(NR)

Ração

ad libitum

Normal

Amendoim

(NA)

SANGRIA ZERO – plexo retrorbital - 1ml

Salina+ Al(OH)

SANGRIA PÓS – PRIMÁRIA - plexo retrorbital - 1ml

Salina

SANGRIA PÓS – SECUNDÁRIA - plexo retrorbital - 1ml

Amendoim

in natura

ad libitum

SANGRIA PÓS – 1ª SEMANA DE DIETA, AV. DO CONSUMO E

PESO CORPORAL

SANGRIA PÓS – 2ª SEMANA DE DIETA, AV. DO CONSUMO E

PESO CORPORAL

SANGRIA PÓS – 3ª SEMANA DE DIETA, AV. DO CONSUMO E

PESO CORPORAL

SANGRIA PÓS – 4ª SEMANA DE DIETA, AV. DO CONSUMO E

PESO CORPORAL

4.2.1.2 Descrição do Protocolo

Ratos Lou-M machos adultos (8-12 semanas) foram divididos em 4 grupos

(n=40), denominados de acordo com o protocolo de inoculação e com a dieta que

receberam no período de exposição à dieta desafio:

•

Imune Ração (IR): animais submetidos à inoculação (sc) contendo extrato

protéico de amendoim e que receberam ração comercial ad libitum no cocho

de suas gaiolas durante o período de dieta desafio (por 4 semanas); este

grupo foi criado como controle do grupo Imune Amendoim, para verificar se o

fato destes ratos terem recebido a inoculação com amendoim e não terem se

alimentado com a mesma proteína, iriam desenvolver alergia e

conseqüentemente inflamação intestinal.

• Imune Amendoim (IA): animais submetidos à inoculação (sc) contendo

extrato protéico de amendoim e que receberam semente de amendoim in

natura ad libitum no cocho de suas gaiolas durante o período de dieta desafio

(4 semanas); consiste no grupo experimental que foi criado para desenvolver

alergia à proteína de amendoim e conseqüentemente, inflamação intestinal

crônica.

• Normal Ração (NR): animais submetidos à inoculação (sc) contendo solução

salina e que receberam ração comercial ad libitum no cocho de suas gaiolas

durante o período de dieta desafio (4 semanas); consiste no grupo controle

normal do experimento.

• Normal Amendoim (NA): animais submetidos à inoculação (sc) contendo

solução salina e que receberam semente de amendoim in natura ad libitum

no cocho de suas gaiolas durante o período de dieta desafio (4 semanas);

este grupo foi criado para verificar se o fato destes ratos terem recebido a

inoculação com salina e terem se alimentado com a semente de amendoim,

iriam desenvolver alergia e conseqüentemente, inflamação intestinal.

Durante o período de quatro semanas após a inoculação secundária, avaliamos

o consumo de ração e de semente de amendoim diariamente dos grupos e,

semanalmente, todos os ratos foram pesados e sangrados, para avaliação clínica e

sorológica respectivamente.

4.2.2 Protocolo experimental II – Indução da inflamação intestinal crônica e

estudo do metabolismo de açúcares

4.2.2.1 Objetivo

Indução da inflamação intestinal crônica dos ratos para avaliar os aspectos

histológicos da mucosa intestinal e padronizar a técnica da D-xilose sérica para avaliar

o metabolismo de carboidratos dos animais controle (NR) e experimental (IA).

Correlacionar os parâmetros utilizados para diagnóstico da inflamação intestinal crônica

com o teste de absorção da D-xilose.

Quadro 2. Protocolo experimental II

Grupos

Imunização

Primária

(sc)

Imunização

Secundária

(sc)

Dieta

Desafio

Experimental

(IA)

Extrato

protéico de

amendoim +

Al(OH)

Extrato

protéico de

amendoim

Amendoim

in natura

ad libitum

Controle

(NR)

SANGRIA ZERO – plexo retrorbital - 1ml

Salina+

Al(OH)

SANGRIA PÓS – PRIMÁRIA - plexo retrorbital - 1ml

Salina

SANGRIA PÓS – SECUNDÁRIA - plexo retrorbital - 1ml

Ração

ad libitum

SANGRIA PÓS – 1ª SEMANA DE DIETA E PESO CORPORAL

SANGRIA PÓS – 2ª SEMANA DE DIETA E PESO CORPORAL

SANGRIA PÓS – 3ª SEMANA DE DIETA E PESO CORPORAL

SANGRIA PÓS – 4ª SEMANA DE DIETA E PESO CORPORAL

GAVAGEM DA SOLUÇÃO DE D-XILOSE E SANGRIA

DOSAGEM DA D-XILOSE

MORTE – Retirada dos segmentos para a histologia

4.2.2.2 Descrição do protocolo

Ratos Lou-M machos adultos (8-12 semanas) foram divididos em 2 grupos:

Grupo Controle, equivalente ao Normal Ração (NR) e o Grupo Experimental,

equivalente ao grupo Imune Amendoim (IA). Depois de terem sido submetidos aos

respectivos procedimentos do protocolo anterior até a etapa de exposição à dieta

desafio, cada animal foi submetido a uma gavagem intragástrica contendo solução de

D-xilose. Em seguida, foram sangrados para a determinação da absorção de D-xilose,

através da quantificação deste açúcar no soro. Foi realizada a eutanásia de todos os

ratos para o procedimento de retirada de segmentos intestinais e a realização da

técnica de histologia.

4.3 Dietas

4.3.1 Ração comercial

Foi fornecida uma ração balanceada (NUVILAB-NUVITAL®) ad libitum a todos

os animais antes do período de dieta desafio e durante este período, foi fornecida

somente aos grupos NR e IR. Esta ração é composta de: carbonato de cálcio, farelo de

milho, farelo de soja, farelo de trigo, fosfato bicálcico, cloreto de sódio, premix mineral

vitamínico e aminoácidos.

4.3.2 Amendoim

Utilizamos como dieta desafio para a indução da alergia alimentar, e

conseqüentemente, para indução da inflamação intestinal, sementes de amendoim in

natura, oferecido no coxo da gaiola de forma exclusiva. Esta dieta foi imposta aos

animais dos grupos NA e IA por um período de 30 dias após a segunda inoculação.

4.3.3 Comparação da distribuição de macronutrientes da ração e do amendoim

A distribuição de macronutrientes, assim como a distribuição de vitaminas e

aminoácidos da ração e do amendoim, encontra-se descrita nas tabelas abaixo.

Tabela 2.

Distribuição dos macronutrientes.

Ração Comercial Amendoim

Componente % Componentes %

Umidade 12,5

Umidade

11,00

Proteína bruta 22,0

Proteína bruta

29,31

Carboidratos 43,5

Carboidratos

5,94

Extrato etéreo 4,0

Extrato etéreo

48,75

Material mineral 10,0

Material mineral

2,40

Matéria fibrosa 8,0

Matéria fibrosa

2,60

Calorias 298 Kcal Calorias 579,7 Kcal

Fonte: FRANCO, 1982.

Tabela 3. Distribuição de vitaminas e aminoácidos.

Ração Amendoim

Componente Concentração Componente Concentração

Vit A 12.000 UI Vit A 3,0 mcg

Vit. D3 1.800 UI Vit. D3 Nd

Vit K 3,00 mg Vit K Nd

Vit B1 5,00 mg Vit B1 910,0 mcg

Vit B12 20,00 mg Vit B12 0,1 mcg

Niacina 60,00 mg Niacina 17,6mg

Ac. pantotênico 20mg Ac. pantotênico Nd

Biotina 0,05 mg Biotina 0,039ng

Colina 60,00 mg Colina Nd

DL - metionina 300mg DL - metionina 0,43

Lisina 100mg Lisina 1,56

Ferro 50,00 mg Ferro

4 mg

Zinco 60,00 mg Zinco

6 mg

Cobre 10,00 mg Cobre

0,90 mg

Iodo 2,00 mg Iodo

Manganês 60,00 mg Manganês

Selênio 0,05 mg Selênio

Cobalto 1,50 mg Cobalto

Fonte: FRANCO, 1982.

4.4 Extração de proteínas do amendoim

4.4.1 Procedimento de extração

A obtenção de extratos de amendoim foi realizada pela metodologia

desenvolvida para extração de proteínas do milho na Embrapa - Sete Lagoas, M.G,

modificação da técnica descrita por Landry (Teixeira, 2003).

De forma sintética, as sementes foram descascadas e moídas em moedor

elétrico, tipo de café. O material resultante foi colocado em tubo de 15mL e suspenso

em tampão de extração alcalino na proporção de uma parte do material para dez de

tampão. O tubo foi agitado delicadamente por inversão durante 30 minutos, à

temperatura ambiente. A seguir, o material foi centrifugado por 30 minutos, a 5

C, 3000

rpm, e o sobrenadante recolhido. Foram realizadas, além desta extração, outras duas

com a utilização de um tampão ácido e outro neutro. A concentração de proteínas foi

determinada pela técnica de Lowry (Lowry et al, 1951).

4.4.2 Dosagem de proteína obtida nos extratos de amendoim

Resumidamente, a partir da amostra titulada de BSA (1mg/mL) foram feitas 4

diluições de cada amostra de extrato protéico de amendoim. Uma vez que as amostras

foram diluídas, acrescentamos o reativo 1 aos tubos e esperamos a reação por 10

minutos. O reativo de Folin-Ciocalteau foi diluído e acrescentado às amostras após os

10 minutos da reação anterior. Após esta última etapa, esperamos por mais 50 minutos

para que as amostras obtivessem coloração proporcional ao seu conteúdo de proteína.

Após os 50 minutos de reação, foi realizada a leitura em espectrofotômetro, em

comprimento de onda de 500nm. Cada amostra foi lida duas vezes e foi retirada a

média das leituras de cada tubo. Estabelecemos a equação da reta e o valor de R

, a

partir do qual foi calculada a concentração de proteína das amostras.

Os procedimentos de preparo de reagentes e diluição dos extratos e amostras

encontram-se em anexo.

4.5 Inoculações: extrato bruto de amendoim e salina

As inoculações foram realizadas por via subcutânea (sc). Na inoculação

primária, cada animal dos grupos Imune Amendoim e Ração recebeu 200µg de extrato

protéico de amendoim, mais 5mg de hidróxido de alumínio (Al(OH)

3 -

adjuvante) em

solução salina q.s.p no volume final de 1mL, enquanto que cada animal dos grupos

Normal Ração e Normal Amendoim recebeu uma inoculação composta somente por

solução salina mais 5mg de adjuvante, num volume final de 1mL.

Após um intervalo de 28 dias, os animais dos grupos Imunes Amendoim e

Ração receberam a inoculação secundária (sc) com 200µg de extrato protéico de

amendoim em solução salina q.s.p no volume final de 1mL, sem adjuvante, enquanto

que os animais dos grupos Normais Ração e Amendoim receberam novamente uma

inoculação com salina num mesmo volume final, sem adjuvante.

4.6 Sangrias

Foram retirados 1mL de sangue do plexo retro-orbitário de todos os animais

antes de qualquer manipulação e após qualquer exposição aos antígenos, quer por via

oral ou por via parenteral. Após a retração dos coágulos, as amostras de sangue foram

centrifugadas, os soros recolhidos e, em seguida, guardados a –20ºC até serem

analisados.

4.7 Determinação do consumo diário de alimento

Os componentes da dieta (amendoim ou ração) foram pesados e colocados nos

cochos das gaiolas a cada manhã. Após 24h de consumo ad libitum, o alimento

restante de cada gaiola foi separado e pesado. O consumo foi avaliado dividindo-se a

diferença entre o peso oferecido e o recolhido pelo peso corporal total dos animais do

grupo e expresso como miligrama de alimento por grama de peso corporal (mg/gpc).

CONSUMO (mg) = peso oferecido (g) – peso recolhido em 24h(g) X 1.000

Peso corporal total do grupo (g)

O consumo diário foi expresso em (mg) no sentido de melhorar a visualização

dos resultados.

A partir da avaliação do consumo diário de alimento, avaliamos o consumo diário

de calorias por grama de peso corporal de cada grupo. O cálculo de calorias ingeridas

foi realizado através da multiplicação do valor do consumo em gramas do alimento pela

quantidade de calorias contidas neste mesmo alimento.

4.8 Peso dos animais

Os animais foram pesados antes e durante ao período de dieta desafio,

semanalmente, em balança digital com duas casas decimais da marca Plenna

4.9 Avaliação dos níveis de IgG anti-proteínas do Amendoim

Para a quantificação dos níveis de anticorpos (Ac) IgG total anti-proteínas da

semente do amendoim, foi utilizada a técnica de ELISA. Placas de microtitulação foram

cobertas com 10µg de extrato protéico de amendoim em 100µL de tampão PBS por

poço e incubadas durante 12 - 18 horas, a 4

C. Em seguida, foram lavadas duas vezes

com uma solução de PBS-Tween 0,05% e cobertas com PBS-gelatina durante 1 hora,

à temperatura ambiente.

Após este período, as placas foram esgotadas e incubadas por 1h com os soros

a serem testados. Para isto, foram adicionados 20

L de soro diluído a 1:10 em 180

de PBS-gelatina na primeira fileira e, em seguida, feita a diluição seriada obtendo-se

uma diluição final de 1:12000.

Terminado o período de incubação, cada placa foi lavada seis vezes com PBS-

Tween, e em seguida, foi adicionado o Ac IgG de cabra anticadeia

de rato,

conjugado com peroxidase. Após novo período de incubação de 1h, a 37

C, as placas

foram lavadas como na etapa anterior e, em seguida, foi adicionado 100µL da solução

do substrato (OPD - 4mg, H

- 4µL, em 10mL de tampão citrato fosfato).

A reação foi interrompida após 20 minutos com uma solução 0,1M de ácido

sulfúrico (H

A medida das densidades ópticas foi realizada em um leitor de

ELISA (Anthos-2010), utilizando um comprimento de onda de 492nm.

A análise dos resultados foi realizada pela comparação do somatório das

densidades ópticas de cada soro, denominado de ELISA*. A sorologia foi avaliada pelo

método do ELISA a partir dos soros recolhidos das sangrias feitas nas diversas etapas

dos experimentos.

4.10 Teste de absorção de carboidratos – Dosagem da D-xilose sérica

4.10.1 Padronização da técnica de absorção de D-xilose em ratos normais e

determinação da curva-padrão

Para a dosagem da D-xilose, utilizamos o reagente floroglucinol (VETEC), Ácido

acético glacial (Merck), ácido clorídrico fumegante (Merck) e a D-xilose (VETEC).

Utilizamos a técnica descrita por Eberts e cols. (1979), padronizando-a para ratos.

Assim, submetemos cinco animais normais, sem manipulação anterior, a um

jejum por 12h. Após este período, todos os animais foram sangrados para obter um

controle.

A técnica, em resumo consistiu em:

1. Preparo do reagente indicador:

• Foi pesado 0,5g de fluoroglucinol, acrescentado a 10ml de ácido clorídrico

fumante (HCl) e completado para 100ml com ácido acético.

2. Preparo da solução de D-xilose (padrão):

 Foram diluídos 18,5g de D-xilose em 30ml de água destilada.

 Para a confecção da curva padrão, realizamos diluições seriadas 1:2 da

solução padrão de D-xilose 62% (ou seja, foi retirado 100µl e adicionado a

100µl de água destilada) por 9 diluições, atingindo uma diluição final de

0,0027mg de D-xilose. Estabelecemos 60µl para 2ml de solução indicadora

de cor, logo, a solução padrão no primeiro tubo, possuiu, 2mg de D-xilose.

3. Após o preparo das soluções, os ratos foram sangrados para a coleta do soro

pós-jejum e depois, foi realizada a gavagem da solução: cada animal recebeu

uma gavagem estomacal de 2ml contendo uma solução de D-xilose a 62%, o

equivalente à ingestão de 1,23g D-xilose. A seguir, realizamos as sangrias pelo

plexo retrorbital na 1ª, 2ª, 3ª e 4ª horas pós-gavagem.

4. Após a coleta do soro dos animais, os tubos para análise por espectrofotômetro

foram preparados:

• Tubo Branco:

- Consistiu na mistura de 60µl de água destilada em 2ml do reagente de cor.

• Tubos para curva-padrão:

- Consistiu na mistura de 60µl da solução padrão no primeiro tubo em 2ml do

reagente de cor – a seguir, foi realizado uma diluição seriada em 9 tubos,

como descrito no segundo item.

• Tubos contendo os soros a serem testados:

- Consistiu em 60µl de soro de cada amostra em tubos com 2ml de indicador.

5. Todos os tubos foram aquecidos em banho-maria até atingir 100ºC, por 4

minutos. Depois, esfriados à temperatura ambiente.

6. Os tubos foram lidos em espectrofotômetro (Pelkin Elmer), num comprimento de

onda de 554nm.

4.10.2 Uso da técnica de D-xilose para avaliação dos animais do experimento

Após a padronização desta técnica em animais normais, repetimos o mesmo

procedimento descrito acima nos animais pertencentes ao experimento, de acordo com

o protocolo, que será descrito mais adiante, no item 4.13.2.

Em resumo, os procedimentos realizados nestes animais:

• Jejum dos animais por 12h;

•

Sangria pós-jejum dos animais;

• Gavagem estomacal da solução de D-xilose a 62%;

• Sangrias na 1ª e 3ª hora pós-gavagem;

• Soro centrifugado, recolhido e armazenado a -20ºC até a análise;

•

Preparo dos tubos para análise;

• Aquecimento de todos os tubos até atingir 100ºC por 4 minutos;

• Leitura de todos os tubos em espectrofotômetro, em 554nm.

4.11 Coleta de segmentos do intestino dos ratos

A coleta de segmentos do intestino foi realizada pela técnica descrita por

Teixeira (Teixeira, 2003). Submete-se o animal à anestesia, utilizando inicialmente

Atropina, em dose de 0,05 mg/kg via subcutânea. Dez minutos após a injeção de

Atropina, foi aplicado 0,03mL via intramuscular de solução mãe (1mL ketamina (50mg)

+ 1mL de xilazina (20mg). Após a parada cardiorespiratória, o peritônio foi aberto e a

alça intestinal liberada do mesentério.

A avaliação macroscópica foi feita com a observação da textura e coloração do

intestino.

Os segmentos de interesse, duodeno e jejuno, foram dissecados, retirando-se

3cm de cada segmento. Estes segmentos foram colocados sobre um pedaço de papel

de filtro e abertos longitudinalmente com auxílio de uma pinça de relojoeiro e tesoura

reta oftalmológica. O processo de abertura do segmento de alça é um processo

delicado, sendo necessário muito cuidado para não danificar a camada mucosa.

Imediatamente após a abertura da alça, pinga-se formol tamponado para a fixação do

tecido. Em seguida, este tecido foi colocado em um recipiente contendo solução de

formol tamponado até a inclusão em parafina.

A carcaça e as vísceras foram embaladas e preparadas para incineração.

O conjunto dos segmentos intestinais ficou imerso em solução formol-salina

10%, por um período de 24-48 horas;

Após a lavagem das peças em água corrente por 4 horas, seguimos com as

etapas de imersão em: 1) álcool a 70%; 2) álcool a 95%, 3) álcool absoluto I, II e III a

100%; 4) xilol I e II, para clarear. O conjunto dos segmentos intestinais ficou imerso

durante 50 minutos em cada etapa.

A técnica foi prosseguida com o banho de parafina I e II em estufa, durante 50

minutos cada, e a inclusão dos segmentos em parafina. Foram feitos os cortes

histológicos, com espessura de 5µm, utilizando micrótomo manual (American optical

coorporation-820). Os cortes foram deixados em banho-maria para distenderem e,

então, foram colocados em lâminas, previamente albuminizadas;

Após desparafinização e hidratação, foi realizada a coloração das lâminas em

hematoxilina, por 20 minutos e eosina floxina, por 2 minutos. Após a montagem e

secagem, as lâminas foram analisadas em microscopia óptica.

Os parâmetros histomorfométricos utilizados, para avaliação da inflamação

intestinal, foram: número total de vilosidades por campo; número de leucócitos

mononucleares e número de enterócitos. As análises foram feitas por animal em cada

grupo, onde para a área do intestino delgado foram analisadas altura e largura de 10

vilosidades. A contagem dos enterócitos e dos leucócitos mononucleares intra-epiteliais

foi avaliada com a utilização de objetiva reticulada, com unidade de microscopia no

aumento de 60x, onde um campo equivale a 0,2 mm de tecido. As fotomicrografias

foram feitas com câmera Olympus acoplada ao microscópio óptico Olympos BX41

usando filme Kodak asa 100.

4.12 Estatística

De acordo com os protocolos experimentais consideramos o n mínimo de 10

para cada grupo. Os dados foram organizados a partir de seus valores originais e

representados graficamente.

Foram utilizados os testes T de Student, a Análise de Variância ANOVA com o

pós-teste de Tukey para a determinação da diferença mínima significativa e o

coeficiente de Pearson (r) (correlação linear).

O grau de significância utilizado será representado nos gráficos referente aos

resultados, de forma simbólica, como se segue:

•

P<0,05 será representado por *

•

P<0,01 será representado por **

• P<0,001 será representado por ***

Todos os testes estatísticos foram feitos com auxílio do software

GraphPadInstat





versão 4.10 for Windows 98, GraphPad Software, San Diego –

5 RESULTADOS

5.1 Protocolo Experimental – I

5.1.1 Avaliação do consumo de ração e de semente de amendoim

5.1.1.1 Objetivo

Analisar se há diferença significativa entre os grupos, em relação ao consumo

diário de ração e semente de amendoim e de calorias ingeridas durante o período de

exposição à dieta desafio.

5.1.1.2 Consumo diário da dieta e ingestão de calorias durante o período de dieta

desafio

Avaliamos o consumo de dieta de três formas distintas: o consumo médio diário

(Figura 8A), o consumo médio semanal (Figura 8B) e consumo médio total (Figura 8C).

O consumo de ração pelo grupo Imune Ração (IR) e pelo grupo Normal Ração (NR)

não apresentou diferença significativa na avaliação diária. Ambos os grupos

apresentam uma flutuação no consumo diário dentro de uma faixa de normalidade. Os

animais que foram alimentados com semente de amendoim apresentaram um consumo

diário menor, quando comparado aos grupos anteriores. Embora haja uma

variabilidade diária de consumo, os animais do grupo Normal Amendoim (NA)

consumiram sempre quantidades iguais ou maiores do que o grupo Imune Amendoim

(IA). Esta diferença se estabelece claramente a partir da segunda semana com um

grau de significância de p<0,0001.

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

1ª

sem

2ª

sem

3ª

sem

4ª

sem

mg/gpc

Gpo NR Gpo NA Gpo IR Gpo IA

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

1a sem 2a sem 3a sem 4a sem

mg/gpc

Gpo NR Gpo NA Gpo IR Gpo IA

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

Ração Amendoim

mg/gpc

Imune

Normal

Figura 8.

Consumo de ração e amendoim expresso em mg/gpc, durante o período de dieta desafio. Os

grupos Normal Ração (NR) e Imune Ração (IR) receberam somente ração no cocho de suas gaiolas,

enquanto que os grupos Normal Amendoim (NA) e Imune Amendoim (IA) receberam somente semente

de amendoim in natura. (A) Representação do consumo diário ao longo da semana. (B) Representação

da média do consumo semanal. (C) Média de consumo diário ao longo do período de dieta desafio. A

diferença no consumo entre os grupos que foram alimentados com ração e os que foram alimentados

***

com amendoim foi significativa (p< 0,0001). Também foi observada a mesma significância quando

comparado o grupo NA com o grupo IA.

Quando apresentamos as médias do consumo semanal, estes padrões de

comportamento se tornaram mais evidentes. Na avaliação média do consumo durante

as quatro semanas de exposição à dieta desafio, mostramos que os animais que foram

alimentados com ração (NR e IR) apresentaram consumo diário significativamente

maior do que os dois grupos que consumiram amendoim (NA e IA) (p<0,0001). Embora

o consumo médio do grupo IR (92,61±9,30mg/gpc) seja maior do que o grupo NR

(88,76±3,43mg/gpc) não há diferença entre estes grupos. Por outro lado, existe uma

diferença significativa quando comparamos o consumo do grupo NA

(38,47±2,31mg/gpc) com o consumo do grupo IA (27,60± 3,88mg/gpc) (p<0,0001).

Uma outra maneira de avaliar o consumo do alimento é através da quantificação

das calorias totais. Optamos por apresentar graficamente apenas a média do consumo

calórico diário por semana (figura 9), uma vez que este nos apresenta a melhor

visualização.

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

350,00

1a sem 2a sem 3a sem 4a sem

Gpo NR Gpo NA Gpo IR Gpo IA

Figura 9.

Média de calorias

ingeridas entre os grupos do experimento durante o período de dieta

desafio. Os grupos que consumiram ração apresentaram uma ingestão significativamente (p>0,05) maior

de calorias do que os grupos que consumiram amendoim. Quando comparamos os grupos que

consumiram amendoim, o grupo NA apresentou uma ingestão significativamente maior do que o grupo

IA (p<0,01).

Podemos visualizar na figura acima que o único grupo que se destaca quanto ao

valor calórico consumido foi o grupo inoculado com extrato protéico de amendoim e

alimentado com a respectiva proteína durante o período de dieta desafio (IA) com

diferentes graus de significância para cada um dos três grupos restantes. Entre estes,

aqueles alimentados com ração (NR e IR) e o grupo alimentado com amendoim e que

não foi inoculado com o extrato protéico de amendoim (NA), não há diferença

significativa (p>0,05) (tabela 4).

Tabela 4.

Comparação da significância entre grupos quanto ao consumo calórico médio durante o

período de dieta desafio

Comparação entre grupos Diferença média q Significância p valor

Gpo NR vs Gpo NA 34,263 2,564 ns P>0,05

Gpo NR vs Gpo IR -11,172 0,8362 ns P>0,05

Gpo NR vs Gpo IA 97,305 7,282 ** P<0,01

Gpo NA vs Gpo IR -45,435 3,400 ns P>0,05

Gpo NA vs Gpo IA 63,043 4,718 * P<0,05

Gpo IR vs Gpo IA 108,48 8,119 *** P<0,001

Ao final do período de exposição à dieta, o grupo NR ingeriu em média

257,41±9,96kcal, enquanto o grupo IR ingeriu 268,58±26,98kcal sem apresentar

diferença significativa (p>0,05). O grupo NA apresentou uma ingestão média de

223,15±13,43kcal, enquanto o grupo IA ingeriu significativamente menos calorias

160,10 ± 22,51kcal (p<0,05).

5.1.2 Peso dos animais

5.1.2.1 Objetivo

Verificar se a dieta desafio altera, de forma significativa, o ganho de peso em

animais inoculados com a respectiva proteína comparados com os animais inoculados

com salina, bem como comparar o ganho de peso em animais inoculados com a

proteína do amendoim ou salina que continuam comendo ração (grupos NR e IR).

5.1.2.2 Evolução do peso corporal médio dos animais entre os grupos

Antes do início do período de dieta desafio, os ratos de todos os grupos

apresentaram um peso médio de 242,03 ± 9,60g.

Os animais dos grupos alimentados com ração, independente do protocolo de

inoculação (proteína do amendoim (IR) ou salina (NR)), apresentaram um ganho de

peso contínuo durante o experimento sem diferença significativa (p>0,05) entre os

grupos.

Os animais dos grupos alimentados com amendoim (IA e NA), não só não

ganharam peso, como os que foram inoculados com a respectiva proteína (IA)

apresentaram uma perda significativa de peso (p<0,001), chamando a atenção para a

perda de peso do grupo IA desde a primeira semana de exposição à dieta desafio

(Figura 10).

-50

-40

-30

-20

-10

0 semana 1ª sem 2ª sem 3ª sem 4ª sem

gramas

Gpo NR Gpo NA Gpo IR Gpo IA

Figura 10.

Média da diferença de peso, em gramas, dos animais dos grupos Normal Ração (NR),

Normal Amendoim (NA), Imune Ração (IR) e Imune Amendoim (IA), antes e durante as quatro semanas

de dieta desafio. Os animais dos grupos controles (NR e IR) apresentaram ganho de peso, enquanto os

animais do grupo NA não apresentaram diferença de peso. Já os animais do grupo experimental (IA)

apresentaram uma perda de peso significativa (p<0,001) a partir do primeiro dia de introdução da dieta

desafio.

5.1.3 Sorologia – dosagem de IgG total anti-proteína de amendoim

5.1.3.1 Objetivo

Determinar, através da análise sorológica, se existe diferença quanto aos títulos

de IgG total entre os grupos inoculados com extrato protéico de amendoim e salina.

5.1.3.2 Titulação de anticorpos IgG de cada grupo do experimento

A inoculação sistêmica com extrato de amendoim (grupos IR e IA), proporcionou

um aumento significativo dos títulos de anticorpos (Ac) específicos anti-amendoim

(p<0,001), quando comparado aos grupos inoculados com salina mesmo durante as

quatro semanas de dieta desafio. Não houve diferença significativa (p>0,05) nos títulos

de anticorpos entre os grupos inoculados com salina (NR e NA) nem entre os aqueles

inoculados com extrato protéico de amendoim (IR e IA) (Figura 11).

-1

sg pós-sec 1 sem 2 sem 3 sem 4 sem

NR NA IR IA

Figura 11.

Média dos níveis de IgG total anti-proteína de amendoim dos grupos durante as semanas de

dieta desafio. Os animais dos grupos IA e IR apresentaram altos títulos de anticorpos, enquanto os

animais dos grupos controles NR e NA apresentaram baixos títulos (p<0,001).

5.2 Protocolo Experimental II

5.2.1 Desenvolvimento do Modelo de Inflamação Intestinal Crônica em Ratos

A partir das análises observadas no experimento piloto (I), pode-se observar que

o modelo foi desenvolvido com sucesso, pois os dados sorológicos e de peso foram

similares aos achados prévios em camundongos (Teixeira, 2003).

Devido à observação de que os grupos controles NA, NR e IR, apresentaram

comportamentos de consumo e peso similares, foi desenvolvido um novo protocolo

experimental (II), constando somente dos dois grupos extremos: IA (inoculados com

extrato protéico de amendoim e alimentados com a respectiva proteína) e NR

(inoculados com salina e alimentados exclusivamente com ração). A partir de agora,

denominados de grupo experimental e grupo controle, respectivamente. Este segundo

protocolo teve como objetivo avaliar a interferência do processo inflamatório crônico na

sua capacidade de absorção de glicídios e para confirmar o estado fisiopatológico e

imunológico (sorologia) dos animais destes grupos, também foi realizada a avaliação

histológica do intestino e a titulação de anticorpos anti-amendoim.

5.2.2 Avaliação sorológica

5.2.2.1 Objetivo

Confirmar através da análise sorológica, a resposta imunitária à inoculação com

extrato protéico de amendoim.

5.2.2.2 Titulação de anticorpos IgG anti-proteína de amendoim dos grupos

Confirmando resultados prévios, os ratos do grupo experimental (submetidos à

inoculação sistêmica com extrato bruto de amendoim) apresentaram títulos de

anticorpos IgG significativamente maiores (5,085±0,126) do que os ratos do grupo

controle, inoculados com solução salina (0,905±0,053). A diferença entre os títulos

nestes grupos foi significativa (p<0,0001) (Figura 12).

1 sem 2 sem 3 sem 4 sem

semanas de exposição

Unidades arbitrárias de ELISA*

Grupo Experimental

Grupo Controle

Figura 12.

Títulos de anticorpos IgG total antiamendoim nos grupos experimental e controle. P<0,0001.

5.2.3 Avaliação Histológica

5.2.3.1 Objetivo

Comparar as alterações histomorfométricas entre os grupos controle e

experimental.

5.2.3.2 Análise macroscópica e microscópica

Na análise macroscópica, os animais do grupo controle apresentaram tecido

intestinal de consistência normal, sem sinais de inflamação. Os animais pertencentes

ao grupo experimental apresentaram um tecido intestinal friável e foi observada

secreção purulenta em alguns animais (quatro entre os dez animais deste grupo).

A análise microscópica condiz com a macroscopia, onde foi observada uma

estrutura intestinal preservada nos animais do grupo controle, enquanto foi observado

nos animais do grupo experimental, vilosidades com edema, hiperemia e um grande

infiltrado leucocitário, tanto no duodeno quanto no jejuno (Figura 13A e B).

Figura 13.

Diferenças histológicas entre os ratos do grupo controle e experimental. (A) Aspectos da

vilosidade de um rato do grupo controle, apresentando um tecido preservado, sem edema e poucos

leucócitos. (B) Aspectos da vilosidade de um rato do grupo experimental, apresentando hiperemia e

grande infiltrado leucocitário (coloração HE, aumento de 200x).

Ao realizar a avaliação histomorfométrica do duodeno de animais do grupo

experimental, observamos um aumento significativo da largura das vilosidades com

uma conseqüente diminuição da razão altura/largura (3,54±1,10) quando comparamos

com o grupo controle (4,55±0,74) (p<0,05). A diminuição desta razão também ocorreu

no jejuno, mas não foi significativa quando comparamos os grupos citados (Figura

14A).

Figura 14.

Análise histomorfométrica dos segmentos intestinais do grupo experimental e controle.

Representação gráfica da razão altura/largura da vilosidade (A), onde somente o duodeno dos ratos

experimentais apresentou diferença significativa (p<0,05) quando comparado ao dos ratos controle,

enquanto na representação da razão altura da célula epitelial/largura da lamina propria (B), somente o

jejuno apresentou diferença significativa (p<0,05).

Foi observada uma diferença significativa (p<0,05) no jejuno, mas não no

duodeno, quando avaliada a razão altura da célula epitelial/largura da lamina propria.

Nesta avaliação, os animais experimentais apresentaram uma razão menor (0,62±0,08)

do que os animais controles (0,83±0,38) (Figura 14B).

O terceiro critério avaliado foi a razão altura da vilosidade/altura da cripta. Esta

razão foi maior em animais controle (1,97±0,11), quando comparado aos animais

experimentais (1,80±0,07). Após a avaliação dos dois segmentos intestinais,

observamos uma diferença significativa (p<0,05) somente no duodeno (Figura 15A).

Figura 15.

Análise histomorfométrica dos segmentos intestinais dos grupos experimental e controle.

Representação gráfica da razão altura da vilosidade/altura da cripta (A), onde observamos diferença

significativa (p<0,05) somente no duodeno dos ratos experimentais quando comparado ao dos ratos

controle. Na representação da razão células epiteliais intestinais (CEI) / leucócitos intraepiteliais (LIE)

(B), ambos os segmentos duodeno e jejuno apresentaram diferença significativa (p<0,05).

O quarto critério usado foi a comparação do número de células epiteliais

intestinais (CEI) com o número de leucócitos intraepiteliais (LIE) e o estabelecimento

da razão CEI/LIE. Para este critério, observamos diferenças significativas (p<0,05) em

ambos os segmentos intestinais quando comparamos os animais experimentais com os

animais controle. No duodeno, a razão CEI/LIE foi 9,09±1,43 no grupo experimental e

22,95±2,93 no grupo controle, enquanto no jejuno a razão foi 8,52±2,43 no grupo

experimental e 13,22±0,80 no grupo controle. Os animais do grupo controle

apresentaram uma relação maior do que dos animais experimentais (Figura 15B).

5.2.4 Padronização do teste da D-xilose sérica

5.2.4.1 Objetivo

Padronizar a técnica de D-xilose para avaliar e comparar a absorção intestinal

de carboidratos entre os grupos controle e experimental.

5.2.4.2 Experimento piloto – animais sem manipulação

Após a gavagem, todos os animais foram sangrados a cada hora durante as

quatro primeiras horas para determinar a curva de absorção e excreção de D-xilose.

Analisando a curva de absorção individual até a terceira hora pós-gavagem,

observamos que não houve diferença estatística nos níveis séricos de D-xilose, mesmo

quando foi feita a comparação entre os animais. Assim, passamos a utilizar a sangria

da primeira e terceira hora. Analisando as médias dos animais, observamos uma

diferença significativa na concentração de D-xilose no sangue entre o período de jejum

e após a gavagem, mas não durante as três horas pós-gavagem. A partir da quarta

hora inicia-se o clearance da D-xilose com uma diferença significativa na concentração

deste açúcar, quando comparado com a terceira hora (p>0,05) (Figura 16).

Jejum 1ª hora 2ª hora 3ª hora 4ª hora

Concentração de D-xilose sérica (mg/ml)

jejum 1ª hora 2ª hora 3ª hora 4ª hora

Concentração de D-xilose sérica (mg/ml)

Figura 16.

Determinação da curva de absorção e excreção de D-xilose em animais normais. A) valores

individuais do tempo zero (jejum) e da 1ª a 4ª hora pós-gavagem com 1,23g de D-xilose. B) Média dos

valores dos animais, mostrando uma diferença significativa (p< 0,0001) entre o período de jejum e após

a gavagem; entre a 1ª e 3ª hora não há diferença significativa, passando a apresentar um clearance a

partir da 4ª hora (p>0,05 na comparação entre a 3ª e 4ª horas).

5.2.4.3 Teste de absorção nos animais do experimento

Baseado na curva de absorção observada acima, nós determinamos que cada

animal do grupo experimental e do grupo controle deveria ser sangrado na primeira e

terceira hora após a gavagem. Os valores de absorção foram expressos como média

de ambas as sangrias.

Como mostrado na figura 17, os animais pertencentes ao grupo experimental

apresentaram uma absorção intestinal de D-xilose (9,66±1,79mg) significativamente

menor do que os animais do grupo controle (19,63 ± 2,89 mg (p<0,0001)).

***

Grupo Experimental Grupo Controle

D-xilose sérica (mg/ml)

Figura 17.

Média de D-xilose sérica (mg/ml) nos ratos do grupo experimental e controle. A diferença de

absorção entre os grupos foi estatisticamente significativa (p<0,0001).

5.2.5 Correlação entre o teste de absorção de D-xilose e os achados sorológicos

e histológicos e entre a sorologia e um parâmetro histomorfométrico.

5.2.5.1 Objetivo

Verificar se o teste de absorção de D-xilose, utilizado para avaliação da

absorção intestinal, apresenta correlação significativa com os outros parâmetros

utilizados para avaliar a inflamação intestinal crônica (razões histomorfométricas e os

títulos de IgG específicos).

5.2.5.2 Correlação entre o teste sérico de D-xilose e razão altura/largura da vilosidade

O coeficiente de correlação (r) entre a razão altura/largura da vilosidade, a

absorção intestinal de D-xilose foi igual a 0,7645, indicando que, quanto maior esta

razão (proximidade com o padrão de normalidade histomorfométrica) maior a absorção

intestinal deste açúcar. Portanto, como observado na figura 18, esta correlação foi

positiva e significativa (p<0,0001).

***

0 1 2 3 4 5 6 7

Razão altura/largura vilosidade

D-xilose (mg/ml)

Figura 18.

Representação da correlação linear entre D-xilose sérica (mg/ml) e a razão altura/largura da

vilosidade no duodeno (p<0,0001).

5.2.5.3 Correlação entre o teste sérico de D-xilose e razão altura da célula

epitelial/largura da lamina propria

O coeficiente de correlação (r) entre a razão altura da célula epitelial/largura da

lamina propria (que é um dos indicativos de alteração da lamina proporia como, por

exemplo, edema e infiltrado celular) e a absorção intestinal de D-xilose foi igual a

0,9001, indicando que quanto menor esta razão (lamina propria mais larga ou

achatamento de célula epitelial - padrão de inflamação intestinal crônica), menor é a

absorção de D-xilose. À medida que esta razão aumenta (proximidade com a

normalidade), observamos também um aumento na absorção intestinal deste açúcar.

Como observado na figura 19, esta correlação foi positiva e significativa (p<0,001).

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Razão Epitélio/Lamina propria

D-xilose (mg/ml)

Figura 19.

Representação da correlação linear entre D-xilose sérica (mg/ml) e a razão altura da célula

epitelial/largura da lamina propria no jejuno (p<0,0001).

5.2.5.4 Correlação entre o teste sérico de D-xilose e razão altura da vilosidade/altura da

cripta

O coeficiente de correlação (r) entre a razão altura da vilosidade/altura da cripta

e absorção de D-xilose foi igual a 0,9763, indicando que, quanto mais próximo da

normalidade, maior a absorção intestinal de D-xilose. À medida que esta razão diminui

(típico de um processo inflamatório crônico), a absorção intestinal deste açúcar

também diminui. Como observado na figura 20, esta correlação foi positiva e

significativa (p<0,0001).

1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4

Razão vilosidade/cripta

D-xilose (mg/ml)

Figura 20.

Representação da correlação linear entre D-xilose sérica (mg/ml) e a razão altura da

vilosidade/altura da cripta no duodeno (p<0,0001).

5.2.5.5 Correlação entre o teste sérico de D-xilose e razão células epiteliais

intestinais/leucócitos intraepiteliais

O coeficiente de correlação (r) entre o teste sérico de D-xilose e a razão células

epiteliais intestinais/leucócitos intraepiteliais foi igual a 0,8628, indicando que, quanto

maior o infiltrado celular e portanto, menor a razão células epiteliais

intestinais/leucócitos intraepiteliais, menor a absorção intestinal de D-xilose. À medida

que esta razão aumenta, observamos também um aumento na absorção intestinal

deste açúcar. Como mostra a figura 21, esta correlação foi positiva e significativa

(p<0,0001).

0 5 10 15 20 25 30

Razão CEI/LIE

D-xilose (mg/ml)

Figura 21.

Representação da correlação linear entre D-xilose sérica (mg/ml) e a razão células epiteliais

intestinais/leucócitos intraepiteliais no duodeno (p<0,0001).

5.2.5.6 Correlação entre o teste sérico de D-xilose e Sorologia

O coeficiente de correlação (r) entre o teste sérico de D-xilose e a sorologia foi

igual a -0,7773, indicando que, quanto maior a titulação de IgG anti-amendoim do

animal, menor é a sua absorção intestinal de D-xilose. Como observado na figura 22,

esta correlação foi negativa e significativa (p<0,0001). Temos que lembrar que neste

caso, os títulos de anticorpos anti-amendoim estão sendo mantidos elevados pela

estimulação constante com a proteína presente na dieta desafio.

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Sorologia (D.O.)

D-xilose (mg/ml)

Figura 22. Representação da correlação linear entre D-xilose sérica (mg/ml) e a sorologia (p<0,0001).

5.2.5.7 Correlação entre a Sorologia e a razão células epiteliais intestinais/leucócitos

intraepiteliais

Confirmando os dados da figura 23 quando se estabelece, neste modelo, o

coeficiente de correlação (r) entre a sorologia e a razão células epiteliais

intestinais/leucócitos intraepiteliais, o valor encontrado foi igual a -0.7885, indicando

que, quanto maior a titulação de IgG anti-amendoim do animal, menor é a razão células

epiteliais intestinais/leucócitos intraepiteliais, mostrando que a inoculação sistêmica

com a presença das respectivas proteínas na dieta interferem na arquitetura histológica

do intestino. A figura abaixo mostra que esta correlação foi negativa e significativa

(p<0,0001).

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500

Sorologia (D.O.)

Razão CEI/LIE

Figura 23.

Representação da correlação linear entre a sorologia e a razão células epiteliais

intestinais/leucócitos intraepiteliais no duodeno (p<0,0001).

6 DISCUSSÃO

O intestino não é simplesmente um tubo onde os alimentos entram e o que é

soluto é absorvido e o sólido, eliminado – consiste na nossa mais profunda vinculação

com o meio ambiente. Dessa intimidade decorre nossa própria sobrevivência: é graças

a ela que processamos, registramos e neutralizamos as proteínas estranhas que desde

o primeiro dia de vida ingerimos (Madi et al., 2001). Podemos ter um outro olhar para a

função do trato digestório a de permitir o acoplamento estrutural com o meio ambiente,

ou seja, interagimos com ele, nos integramos de forma mais harmônica possível

permitindo a absorção de proteínas estranhas sem que elas nos causem problemas –

nos tornamos tolerantes a elas sem a necessidade de neutralizá-las (Teixeira, 2003).

Assim, embora as mucosas entrem em contato diariamente com uma infinidade

de antígenos, sua morfofisiologia lhe garante o estado de homeostasia. A quebra desta

homeostasia, por diversos fatores, pode levar à ocorrências fisiopatológicas de

importância clínica variada, indo desde gastrenterites de resolução rápida até

processos mais complexos, como as alergias alimentares e as doenças inflamatórias

intestinais crônicas (Mayer, 2000; Nagler-Anderson & Shi, 2001).

As alergias alimentares estão emergindo como um importante problema de

saúde devido à severidade da inflamação intestinal resultante destas e do aumento

crescente no número de casos nas últimas décadas (Knippels et al., 2004). O aumento

na incidência destas alergias pode ser decorrente de uma falha na indução da

tolerância oral ou de uma quebra em sua manutenção. O amendoim consiste em uma

potente fonte de proteínas alergênicas e a prevalência da alergia a esta semente vem

aumentando tanto em crianças quanto em adultos, principalmente nos EUA e Reino

Unido (Strid et al., 2004). É também conhecida por persistir durante toda a vida.

Somente de 10-20% dos pacientes alérgicos ao amendoim perdem sua sensibilidade a

esta semente (Skolnick et al., 2001), comparado com 85% dos alérgicos ao ovo e ao

leite de vaca (Dannaeus & Inganas, 1981; Host et al., 2002). Várias proteínas do

amendoim têm sido identificadas como alergênicas, como por exemplo, a Ara h1, Ara

h2, Ara h3 (Burks et al., 1998).

A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença debilitante que abrange tanto

a doença de Crohn (DC) e retocolite ulcerativa (RU) quanto as inflamações não-

infecciosas do intestino e têm sido um enigma tanto para os gastroenterologistas como

imunologistas desde suas primeiras descrições, no inicio do século XX (Strober, 2007).

Recentemente, estima-se que as DII afetam aproximadamente um milhão de pessoas

somente na América do Norte (Bamias et al., 2005). A resposta imunitária inapropriada

aos alimentos e às bactérias comensais, que pode ser uma causa da doença celíaca e

da DC, decorrem da desregulação de processos cruciais de controle do intestino

(Mowat, 2003).

A tolerância imunológica é reconhecida como o estado de reatividade normal do

sistema imunitário do trato gastrintestinal frente ao contato com antígenos da

alimentação e da flora microbiana. Existe uma ampla variedade de tipos celulares que

participam de forma regulada para manter, não só a tolerância imunológica como a

integridade da mucosa intestinal (Sands, 2007). Os produtos da orquestração destas

células (em particular as citocinas), em um contexto de homeostasia, são fatores

tróficos para o crescimento das vilosidades um dos fatores que ajudam na manutenção

da relação adequada da altura da vilosidade e da cripta (Ohtsuka & Sanderson, 2000).

Estas interações do sistema imunitário das mucosas permitem, ao mesmo tempo, a

capacidade de construir uma resposta não inflamatória às proteínas alimentares e uma

resposta inflamatória aos microorganismos patogênicos.

Devido à impossibilidade ética de se realizar experimentos em humanos, os

cientistas vêm estabelecendo modelos animais para o estudo dos mecanismos

subjacentes ao desenvolvimento da alergia alimentar, com o objetivo de identificar

novas estratégias terapêuticas. Nas últimas duas décadas, o número de modelos

experimentais que apresentam diferentes manifestações clínicas semelhantes àquelas

observadas nos humanos tem aumentado (Jurjus et al., 2004). Estes modelos

contribuem imensamente para avanços importantes no nosso entendimento dos

mecanismos fundamentais da inflamação e da patogênese da doença. Em geral, um

modelo apropriado ou ótimo deve apresentar características similares ou idênticas ao

curso das doenças humanas e em particular, no nosso caso, às doenças inflamatórias

intestinais tais como: fisiopatologia, sinais e sintomas, bem como inflamação e

alterações morfológicas no intestino (Jurjus et al., 2004). Para isso, a maioria dos

modelos disponíveis induz à inflamação intestinal através da irritação da superfície

mucosa pela sua exposição a produtos e reagentes químicos, como ácido acético,

éster forbol e vários polissacarídeos sulfatados (carragenina, sulfato de amilopectina e

DSS) ou usam animais geneticamente modificados (Strober et al., 2002).

Neste sentido, Teixeira estabeleceu, em 2003, um modelo de alergia alimentar e,

portanto, de inflamação intestinal crônica, em camundongos da linhagem isogênica

C57Bl/6J que possui um padrão típico de resposta Th1, reproduzindo o padrão

histológico encontrado na doença celíaca em humanos. É importante ressaltar que a

doença celíaca é uma reação ao glúten presente no trigo, porém no modelo

desenvolvido por Teixeira (2003), o antígeno utilizado foi o amendoim, que é

reconhecidamente alergênico (Teixeira, 2003). Embora, a maioria das alergias ao

amendoim, tanto em humanos quanto em modelos animais, são mediadas por uma

resposta do tipo Th2 e, portanto, dependentes da produção de IgE (Sampson, 1994),

no modelo desenvolvido no nosso laboratório este padrão não foi observado, talvez

porque utilizamos como via de sensibilização a via subcutânea com altas doses do

antígeno (dados ainda não publicados).

A reprodutibilidade deste modelo de alergia ao amendoim desenvolvido em

camundongos C57BL/6J, foi demonstrada em camundongos BALB/c (Castro Junior,

2006; Antunes et al., 2007) e no presente trabalho, em ratos Lou-M (Antunes et al.,

2007). As características principais deste modelo de inflamação intestinal são atrofia

das vilosidades, hiperplasia da cripta, aumento do infiltrado de leucócitos

mononucleares, tanto na lamina propria como intraepitelial, e edema na lamina propria.

Estes são sinais típicos da doença celíaca no humano, podendo também ser

observado em outras enteropatias induzidas por alimentos (Marsh, 1995).

Teixeira (2003) demonstrou que os camundongos C57Bl/6J inoculados e

expostos a uma dieta exclusiva com o antígeno sensibilizante durante quatro semanas,

perdem peso corporal sem, no entanto, apresentar sinais como prostração ou

caquexia. Embora tenham apresentado fezes amolecidas, estes não apresentaram

diarréia franca. Estas características também foram observadas nos camundongos

BALB/c (Castro Junior, 2006) e em nossos ratos do grupo experimental (grupo IA).

Em nossos resultados mostramos que os animais que consumiram ração

durante o período da dieta desafio (grupos NR e IR) apresentaram um ganho de peso

constante e significativo, fato que pode ser justificado pela quantidade de calorias

ingeridas e por estarmos trabalhando com animais jovens (dois meses no início do

protocolo experimental). Após a introdução da semente de amendoim como dieta

exclusiva neste mesmo período (dieta desafio), observamos que os animais do grupo

NA, apesar de apresentarem uma oscilação no peso durante essas semanas, não

apresentaram alteração no peso no final deste período. Essa estabilidade de peso em

animais jovens pode ser explicada pelo fato do amendoim conter uma alta

concentração de gordura, o que tende a levar a uma saciedade maior e um

esvaziamento gástrico mais lento, justificando o consumo discretamente calórico menor

do que dos animais que foram alimentados com ração. Este fato não foi observado em

camundongos por Teixeira (2003). Os animais do grupo experimental (IA)

apresentaram uma perda de peso significativa a partir da primeira semana de

introdução da semente de amendoim como dieta desafio, quando comparados aos

demais animais. Mas como podemos justificar a perda de peso se não ocorre diarréia

nestes animais? Uma justificativa pode ser a presença da inflamação intestinal, o que

induz a um desconforto abdominal e tende a levar a uma aversão ao alimento e,

portanto, a redução da ingestão, como descrito por Garcia (1974). Outra justificativa

pode ser a absorção deficiente dos alimentos como pôde ser comprovado pela

absorção de D-xilose neste trabalho.

Teixeira (2003) ainda observou que, logo após a retirada da dieta desafio

(amendoim) e retorno para a dieta convencional (ração), todos os animais voltam a

ganhar peso, chegando a patamares de normalidade em quatro semanas de

recuperação. Por outro lado, observou que se a dieta desafio for composta por ração,

além do amendoim, não há perda de peso, uma vez que o processo inflamatório da

mucosa intestinal não se estabeleceu de forma tão intensa. A nossa hipótese que ainda

não foi testada é de que este comportamento se deve provavelmente pela proteção

oferecida pela tolerância oral às proteínas da ração.

O oferecimento de sementes de amendoim ad libitum aos animais sensibilizados

sistemicamente através da inoculação da respectiva proteína com objetivo de induzir a

inflamação intestinal (condição freqüente nas alergias alimentares humanas) é mais

próximo a história natural da doença intestinal inflamatória do que sua indução através

da utilização de irritantes da mucosa intestinal. Este é o diferencial do nosso modelo.

Existem outros trabalhos, onde os autores têm usado desafio intragástrico com

as proteínas alimentares para induzir uma reação alérgica, no entanto estes protocolos

utilizam como irritante a toxina colérica, molécula esta que provoca uma grande

irritação na mucosa intestinal (Morafo et al., 2003; Adel-Patient et al., 2005). Optamos

por uma inoculação subcutânea para simular a fase de sensibilização sistêmica, pois

podemos controlar a quantidade de proteína que o animal será exposto. Este protocolo

pode não estar tão longe das reais condições de sensibilização primária como

demonstrado recentemente por Strid e cols (2005), onde a exposição epicutânea a

proteínas de amendoim leva a uma sensibilização alérgica e previne a tolerância oral,

sugerindo que a sensibilização epidérmica pode ser uma das formas de se

desencadear uma condição alérgica alimentar. Mowat (2003) descreveu que a

desregulação da tolerância alimentar em humanos pode provocar a inflamação

intestinal crônica, como a doença celíaca ou de Crohn.

Nossos resultados confirmam que a inoculação sistêmica a uma proteína

alimentar pode levar a uma doença semelhante a DII no modelo animal. No modelo

desenvolvido por Teixeira (2003) nos camundongos C57BL/6J e no que foi reproduzido

por Castro Junior (2006) em camundongos BALB/c, foi observado presença de títulos

elevados e similares de IgG1, um isotipo de IgG derivado do padrão de resposta Th2.

Embora não tenhamos avaliado os subtipos de IgG nos ratos, os resultados obtidos

para IgG total específica foram similares aos achados em ambas linhagens de

camundongos.

Em contraste ao atual pensamento de que a alergia ao amendoim é

primariamente um processo de origem Th2, há vários dados na literatura indicando que

a alergia a esta semente é um resultado de uma mistura da resposta imune Th1-Th2.

Van Wijk e cols (2004) demonstraram essa mistura de respostas que contém citocinas

e anticorpos poli-isotípicos num modelo murino de alergia ao amendoim, específicos

aos principais alérgenos desta semente – as proteínas Ara h1, Ara h2, Ara h3 e Ara h6.

Também encontraram produção de IL-4 e IFN-γ (citocinas com efeitos antagônicos

Th2/Th1 respectivamente), produção de IgE, IgG1 e IgG2a na fase inicial da resposta

ao amendoim. O mesmo grupo também examinou o papel do CTLA-4, um regulador

negativo da ativação da célula T, na sensibilização com amendoim e relataram que o

uso de anticorpos contra CTLA-4 num modelo murino de alergia ao amendoim impediu

a resposta alérgica específica (van Wijk et al., 2005).

Embora Teixeira (2003) e Castro Junior (2006) tenham encontrado anticorpo de

isotipo derivado de resposta Th2 (IgG1) nos camundongos, o infiltrado celular do

epitélio intestinal não é típico de um perfil anafilático. A ausência de reações sistêmicas

anafiláticas no nosso modelo corrobora com a idéia de uma modulação de alergia ao

amendoim de perfil misto Th1-Th2. Finalmente, a verificação de uma resposta

inflamatória similar no intestino de camundongos com diferentes perfis genéticos e em

ratos, valida nosso modelo de alergia ao amendoim, providenciando assim um caminho

interessante para o estudo destas respostas imunes mistas às proteínas do amendoim.

Como foi descrito por Teixeira (2003) em camundongos, no presente estudo

também observamos que a inoculação com extrato protéico de amendoim induz títulos

de anticorpos significativamente maiores (observado no grupo experimental - IA) do

que nos ratos que receberam a inoculação com solução salina (grupos NA e NR). Os

animais do grupo experimental (IA) que foram alimentados com a dieta desafio

contendo amendoim por 30 dias após a inoculação, mantiveram estes altos níveis de

anticorpos ao longo de todo o período e apresentaram uma alteração correspondente

na morfologia intestinal, típica de reações inflamatórias crônicas intestinais.

Quando comparamos somente os grupos que foram alimentados com o

amendoim durante o período de exposição oral, observamos que a ingestão desta

semente após a inoculação com a mesma proteína mantém altos títulos de Ac,

enquanto a ingestão desta semente após a inoculação com solução salina (grupo NA)

não induz à sensibilização sistêmica. Os animais do grupo experimental (IA) que foram

alimentados com a dieta desafio contendo amendoim por 30 dias apresentaram uma

perda de peso significativa, o que pode ser justificado por um quadro de má absorção

em função da inflamação intestinal. Por outro lado, aqueles animais que foram

inoculados com extrato de amendoim e receberam como dieta desafio a ração (grupo

IR) mantiveram altos títulos de Ac, porém apresentaram um ganho de peso durante o

mesmo período, indicando que a presença de títulos elevados de anticorpos não é

indicativo de alterações gastrintestinais a não ser que haja a presença do estímulo

antigênico. A partir da observação destes fatos podemos concluir que a inoculação

sistêmica com a proteína de amendoim por si só não induz a alterações clínicas que

caracterizam um quadro de inflamação intestinal – para que o animal desenvolva este

quadro, é necessário que ele se alimente da mesma proteína a qual foi sensibilizado.

Em nosso modelo desenvolvido em ratos, os achados histológicos foram

similares aos descritos em experimentos anteriores do nosso grupo (Teixeira, 2003),

nos quais se verificou que animais experimentais (inflamados) apresentam, por

exemplo, uma relação CEI/LIE menor (3:1) do que a relação dos animais normais

(10:1). Esta alteração é devido ao aumento do número de leucócitos infiltrando a

camada epitelial dos animais experimentais. De acordo com a literatura, os parâmetros

histomorfométricos utilizados em nosso experimento, tais como razão altura

vilosidade/cripta, enterócito/lamina propria e enterócito/leucócito intraepitelial, são

parâmetros de avaliação das alterações intestinais em humanos com inflamação

intestinal crônica (Madi et al., 2001). Em nosso experimento, observamos que os ratos

do grupo experimental apresentaram razões menores do que os ratos do grupo

controle. Essas modificações morfológicas presentes nos animais experimentais são

semelhantes àquelas encontradas na doença celíaca, onde o infiltrado leucocitário no

epitélio intestinal é um sinal característico da doença (Madi et al., 2001). Baseado na

correlação linear de Pearson significativa, concluímos que a sorologia correlaciona-se

negativamente com um dos principais achados histomorfométricos; quanto maior a

titulação de IgG anti-amendoim do animal, menor é a razão de CEI/LIE. Assim, a partir

da análise sorológica e associando às alterações histológicas observadas, nossos

resultados indicam que os ratos do grupo experimental estão realmente apresentando

uma resposta alérgica ao amendoim. Da mesma forma que para a evolução dos pesos,

os animais inoculados com extrato de amendoim e que receberam a dieta desafio

contendo apenas ração não apresentaram as mesmas alterações, ou seja, não foi

possível estabelecer uma correlação entre títulos de IgG e alterações

histomorfométricas neste grupo (dados preliminares não apresentados neste trabalho).

Em qualquer estágio das DII, pode-se observar a ocorrência de uma doença

relacionada à má nutrição, perda de peso e condição nutricional subótima. As causas

de má nutrição nestas enfermidades são múltiplas e incluem a baixa ingestão dietética

e os prejuízos relacionados à digestão e absorção dos nutrientes (O’sullivan &

O’morain, 2006).

Em quadros de inflamação intestinal crônica, os danos aos enterócitos,

causados pela ativação de células T e a liberação de citocinas, podem levar a má-

absorção de monossacarídeos e ao aumento da permeabilidade duodenal (Sharpstone

et al., 1999). Na presença de quadros de inflamação intestinal, observamos alterações

importantes na absorção de açúcares e por isso, as investigações não-invasivas da

função intestinal são úteis para monitorar as modificações sofridas pelos pacientes.

Para avaliação da absorção de carboidratos são utilizados diversos tipos de testes que

são poucos invasivos, não só para o diagnóstico como também como

acompanhamento em doenças crônicas, como as DII e a Aids (Perin et al. 2001;

Thomas et al., 2003).

O teste da D-xilose é um dos testes quantitativos mais confiáveis da função

absortiva intestinal, podendo ser utilizado para a avaliação da má-absorção do intestino

delgado em diversas circunstâncias clínicas (Craig & Cebra 1971; Haeney et al., 1978;

Craig & Atkinson, 1988; Rolston & Mathan, 1989; Thomas et al., 2003). A D-xilose é

uma pentose encontrada naturalmente nas plantas, e sua metabolização incompleta

permite seu uso como teste absortivo (Craig & Ehrenpreis, 1999), sendo um teste

simples e barato (Ehrenpreis et al., 2001). A maioria dos estudos é favorável a

utilização do teste sérico do que ao teste de excreção urinária para triagem de

pacientes adultos e pediátricos em casos de má-absorção intestinal (Craig & Atkinson,

1988) devido à presença relativamente freqüente de falso-positivos (Ehrenpreis et al.,

2001).

O objetivo principal deste trabalho foi comparar a absorção intestinal dos ratos

com ou sem reação inflamatória intestinal antígeno-específico, usando o teste de

absorção da D-xilose sérica. Em pacientes pediátricos, principalmente em bebês e

crianças mais novas, o uso do teste sérico ao invés do urinário é mais favorável devido

a dificuldades em obter as coletas urinárias no tempo correto (Craig & Atkinson, 1999),

problema que também iríamos encontrar na aplicação deste teste em ratos. Ehrenpreis

e cols (2001) recomendam o uso das determinações séricas após a primeira e a

terceira hora da ingestão da D-xilose para a triagem de pacientes com sintomas de má-

absorção.

Na literatura, há poucos estudos referentes ao uso do teste de D-xilose em ratos,

e eles estão relacionados a outros modelos de doenças diferentes das DII, como

trauma hemorrágico, sepse (Singh et al., 1991), e anemia por deficiência de ferro

(Wayhs et al., 2004). No estudo de Singh, os autores mensuraram a capacidade

absortiva intestinal (CAI) usando o teste de absorção de D-xilose após a primeira hora

de administração da solução e encontraram achados significativos no soro destes

animais (Singh et al., 1991). Por outro lado, no estudo que envolve anemia (Wayhs et

al., 2004), os autores utilizaram o teste de excreção urinária para avaliar a absorção

intestinal de D-xilose nos ratos e não encontraram nenhuma diferença entre os grupos

com anemia e o controle. Estes resultados confirmam achados anteriores descritos por

Sharma e cols (1973) em ratos. Podemos argumentar que as diferenças observadas

nestes estudos podem ser derivadas de erros em procedimentos técnicos ou das

doenças em questão.

Em relação a estudos utilizando D-xilose em outros roedores, como em

camundongos, podemos citar o que foi realizado em nosso grupo por Costa (2005), no

nosso laboratório. Esta autora avaliou não só a absorção intestinal de glicídios, como

também a absorção de outros nutrientes, como lipídios e proteínas, no modelo de

inflamação intestinal crônica em camundongos C57Bl/6J (Costa, 2005).

No presente estudo, foi necessário determinar os melhores tempos de sangria

após a gavagem da solução de D-xilose. Baseado na literatura, os animais foram

sangrados durante quatro horas, com intervalos de uma hora. Nossos resultados

mostraram que durante as primeiras três horas não há diferenças significativas, o que

está de acordo com os relatos de Ehrenpreis e cols (2001), que sugerem que os

pacientes deveriam ser testados na primeira e na terceira hora após a administração da

D-xilose. Nossos achados também concordam com os achados em camundongos que

foram descritos por Costa (2005).

De acordo com estudos humanos e baseando-se no tempo de eliminação da D-

xilose no sangue, nós definimos como padrão sangrar os animais na primeira e na

terceira hora após a gavagem. Assim, observamos que os animais que apresentavam

perda de peso e presença de altos títulos de IgG específico ao amendoim (ratos do

grupo experimental), apresentaram uma absorção da solução de D-xilose

significativamente inferior à absorção observada nos ratos do grupo controle. Estes

resultados sugerem que o teste de absorção de D-xilose em animais expostos a

antígenos alimentares após inoculação sistêmica (modelo de inflamação intestinal

crônica antígeno-específico desenvolvido pelo nosso grupo) é sensível como teste

diagnóstico da atividade absortiva do intestino em condições fisiopatológicas distintas.

Este achado também foi observado por Costa (2005), porém tal estudo se limitou a

somente descrever este fato, sem realizar nenhum tipo de correlação entre este e os

achados sorológicos e histomorfométricos. Utilizando o teste de correlação de Pearson

neste estudo, em ratos, observamos uma correlação negativa entre a absorção de D-

xilose e os achados sorológicos, confirmando o fato de que, quanto maiores os títulos

de anticorpos anti-amendoim em ratos submetidos à dieta desafio com a respectiva

semente, menor a absorção da D-xilose, o que caracteriza a ocorrência de uma má-

absorção intestinal. Por outro lado, os animais sensibilizados que não foram

submetidos à dieta desafio não apresentaram a mesma correlação significativa (dados

não mostrados), indicando que a ingestão da dieta desafio por um período de 30 dias,

que induz o processo inflamatório, é essencial para a má absorção e é capaz de

manter altos títulos de Ac. Além disso, altos títulos específicos de Ac anti-alimento

indicam alergia alimentar, mas não necessariamente inflamação intestinal, sugerindo

que tal alimento específico seja um constituinte da dieta do indivíduo que deve ser

evitado.

Demonstramos também que a absorção de D-xilose revelou correlação positiva

com os parâmetros histomorfométricos estabelecidos, os quais são utilizados para

avaliar alterações intestinais na inflamação intestinal crônica em humanos (Madi et al.,

2001). Confirmando nossa hipótese, quanto menor as razões histomorfométricas

(indicativo de um processo inflamatório crônico, que foram observadas nos ratos do

grupo experimental), menor é a absorção de D-xilose, indicando que a inflamação

intestinal reduz ou impede a absorção de D-xilose.

Assim, de acordo com os resultados encontrados, podemos confirmar os

achados humanos e concluir que o teste da D-xilose sérica é uma ferramenta útil para

avaliar a má-absorção intestinal, apresentando uma boa correlação com outros

métodos de diagnóstico de doença inflamatória intestinal. Logo, na clínica quando

temos altos títulos de anticorpos e um quadro de má-absorção intestinal, podemos

inferir que também há um quadro de inflamação intestinal. Os resultados obtidos neste

estudo permitem uma redução na quantidade de animais que serão utilizados em

experimentos mais longos para buscar o entendimento dos processos inflamatórios

crônicos do intestino, permitindo a realização de um diagnóstico não-invasivo destes

animais, sem a necessidade de eutanásia durante o período experimental.

Como perspectivas de trabalho, iremos dar continuidade aos estudos

metabólicos neste modelo de inflamação intestinal crônica em ratos, onde pretendemos

avaliar os marcadores de leucocitose fecal, como a calprotectina. Estes marcadores

possuem grande valor diagnóstico nas DII humanas, pois estão diretamente

associados ao processo inflamatório, não são invasivos e são fáceis de serem

mensurados.

7 CONCLUSÕES

• O modelo murino de inflamação crônica intestinal antígeno-específico foi

desenvolvido com sucesso em ratos;

• Os ratos apresentaram um padrão de alterações similares aos observados nos

camundongos, na avaliação do peso corporal, no consumo da dieta desafio, na

avaliação de anticorpos específicos e nos aspectos histológicos;

• A inoculação sistêmica dos antígenos alimentares deixa os animais suscetíveis à

dieta desafio, provocando alergia;

• O teste sérico de absorção da D-xilose foi padronizado com sucesso;

• Os animais experimentais (inflamados) apresentaram uma absorção da D-xilose

significativamente menor do que os animais controle;

• O teste da D-xilose sérica após a 1ª e 3ª hora de gavagem foi útil para identificar

a presença de má absorção no nosso modelo em ratos, permitindo análise

clínica sem a eutanásia destes animais;

• Foi observada uma correlação positiva entre a presença da má-absorção e a

presença de inflamação intestinal, sendo condizente aos estudos em humanos;

• Demonstramos que no quadro de alergia ao amendoim, os animais apresentam

má-absorção intestinal, concluído pela correlação negativa entre absorção de D-

xilose e os altos títulos de IgG anti-proteína de amendoim;

• Nosso modelo consiste em uma ferramenta eficiente para estudar a evolução

das alterações metabólicas no processo crônico antígeno-específico.

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114

ANEXOS

1. Extração de proteínas do amendoim

Preparo dos reagentes

a) Tampão borato 0,1M pH 10:

• Adicionar 38,12g de borato a 900 mL de água (H

O) destilada;

• Acertar o pH com hidróxido de sódio (NaOH) para 10;

• Adicionar água qsp 1000mL;

•

Foi utilizado o pHmetro QUIMIS



, modelo Q.400.A.

Borato de sódio =

.10H

38,12g

O destilada qsp 1000mL

b) Salina fisiológica, pH 7.2:

•

Adicionar o NaCl à 900 mL de água destilada;

• Ajustar o pH entre 7.0 e 7.2;

• Foi utilizado o pHmetro QUIMIS, modelo Q.400.

Cloreto de sódio (NaCl) 8,5g

O destilada qsp 1000mL

2. Dosagem de proteína obtida nos extratos de amendoim

a) Preparo dos reagentes

Reativo 1

Sulfato de cobre (CuSO

) 1% 0,5 mL

Tartarato de sódio (C

. H

O) 2% 0,5 mL

Carbonato de sódio (NaCO

) 2%. 50 mL

115

Reativo de Folin -Diluição

Reativo de Folin

400

O destilada

6000µL

b) Elaboração da curva-padrão

 Diluição dos extratos salino e borato.

Tipo de extrato Diluição

Extrato amendoim salino Diluição 1:5

Extrato amendoim borato Diluição 1:10

 Diluição das amostras e fases da dosagem de proteína.

Tubos

Volume

(mL)

O destilada

(mL)

Reativo 1

(mL)

Reativo de Folin

(mL)

Amd borato 1 0,05 0,55 4 0,4

Amd borato 2 0,10 0,50 4 0,4

Amd borato 3 0,20 0,40 4 0,4

Amd salino 1 0,05 0,55 4 0,4

Amd salino 2 0,10 0,50 4 0,4

Amd salino 3 0,20 0,40 4

Esperar 10 minutos

0,4

Esperar 50 minutos

4. Preparo dos reagentes – ELISA

 Solução PBS 1X pH 7.2 para coating

Cloreto de sódio (NaCl) 8g

Cloreto de potássio (KCl) 0,2g

Fosfato de sódio dibásico (Na

HPO

) 1,15g

116

Dihidrogenofosfato de potássio (KH

) 0,2g

Água (H

O) 1000mL

 PBS-gelatina

Gelatina em pó 10g

PBS 1000mL

 Tampão Citrato Fosfato pH 5.0

Ácido cítrico anidro 9,6g

Fosfato de sódio dibásico (Na

HPO

) 17,04

O qsp 1000mL

 Ácido Sulfúrico (H

) 2N

Peso molecular

Normalidade =

Nº de hidrogênios

N = 98/2 → N =

49N/litro

Ni x Vi = Nf x Vf

2N = 4 mols 98 x Vi = 4 x 1

Vi = 0,04 x 1000

Vi = 41 mL de H

Ácido sulfúrico 41 mL

O destilada qsp 1000mL

117

APÊNDICES

1. Artigo intitulado “Induction of an Antigen Specific Gut Inflammatory Reaction in

Mice and Rats: A Model for Human Inflammatory Bowel Disease”.

Submetido à

revista Brazilian Archives of Biology and Technology.

Status do envio:

118

Induction of an Antigen Specific Gut Inflammatory Reaction in Mice and Rats: A

Model for Human Inflammatory Bowel Disease.

Danielle Mota Fontes Antunes*

1,2

, Archimedes Barbosa de Castro Júnior

2,3

, Sylvia Maria Nicolau

Campos

, Monique de Morais Bitetti Pedruzzi

, Patrícia Olaya Paschoal

2,3

, Janilda Pacheco da Costa

1,2

Vinicius da Silva Araújo

, Luis Antônio B. Andrade

, Silvana Ramos Farias Moreno

, Luiz Querino de

Araújo Caldas

, Gilberto Perez Cardoso

, Gerlinde Agate Platais Brasil Teixeira

2,3

, Alberto Felix Antonio

da Nobrega

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Centro de Ciências Médicas, Universidade Federal

Fluminense, 24033-900, Niterói, RJ, Brasil;

Departamento de Imunobiologia, Laboratório do Grupo de

Imunologia Gastrintestinal, Instituto de Biologia, Universidade Federal Fluminense, 24020-150, Niterói,

RJ, Brasil;

Programa de Pós-Graduação em Patologia,

Universidade Federal Fluminense, 24033-900,

Niterói, RJ, Brasil.

Departamento de Imunologia, Instituto de Microbiologia e Imunologia, Universidade

Federal do Rio de Janeiro, 21944-970, Ilha do Fundão, RJ.

ABSTRACT

Food allergy is an adverse reaction that occurs in susceptible people when they eat sensitizing

foods and is one of the causes of Inflammatory Bowel Disease (IBD). The effort to understand

the induction process of these diseases is important once IBD is increasing worldwide, including

in Brazil. Our aim was to develop an experimental antigen specific inflammatory process of the

gut of mice and rats. For this, we used peanut seeds. Animals were immunized with peanut

protein extract before their exposure to the in natura peanut seeds. Our results show that

systemic immunization with peanut protein extracts renders significantly higher antibody titers

than control groups and that immunized animals submitted to a challenge diet containing

peanuts present time dependent alterations of the gut similar to celiac disease. In conclusion,

results suggest that this experimental model is a convenient tool to study the evolution of

alterations in chronic antigen specific gut inflammatory process.

Key words: food allergy, peanuts, inflammatory bowel disease, rats, mice.

INTRODUCTION

Contrary to what is commonly thought, the

largest contact area of the body is not the

skin, but the mucosal surface, which is

bombarded immediately after birth by a large

variety of microorganisms and protein

antigens from the environment. The gut itself

presents an area approximately 300 to 600

fold that of the skin (Brandtzaeg, 2002; Moog,

1981). In humans the mucosa of the small

intestine, is estimated to be 300 m

and it is

constantly exposed to antigenic contacts.

Approximately 30 kg of food proteins reaches

119

this organ during a year and 130–190g of

these proteins is absorbed daily in the gut

(Brandtzaeg, 1998). This means that the

principal source of perturbation of

immunological activity occurs via the mucosa

and events initiated at this site have important

systemic reflections due to its large number of

immune cells. Despite of this fact, in most of

the times that antigens penetrate the system

through the gut, the resulting immunological

response is not the classical Th1 or Th2

response (Weiner, 2001). This mucosal

immune network has a unique aspect - the

ability to maintain relative unresponsiveness

(tolerance) to an enormous array of antigens

(Ags) derived from dietary sources and

commensal bacteria (Hyun et al., 2006).

Immune responsiveness to these harmless

agents must be prevented to maintain the

integrity of the gut and allow nutrient

absorption (Hyun et al., 2006). Therefore,

immunologic nonresponsiveness to luminal

Ags is more common than mucosal

responsiveness.

Another way of viewing this is that oral

tolerance allows the mucosal immune system

to focus on Ags or pathogens that pose a

threat to the host (Faria and Weiner, 2005).

The expresion oral tolerance is used when a

reduction in the systemic immunological

response is observed after parentally

challenging the animal with the same antigen

that it has eaten (Weiner, 2001). The

immunological consequence of the oral

administration of an antigen normally depends

on where and how the antigen is taken up and

presented to T cells. The intestinal immune

system is characterized by a distinct profile of

cytokines (Signore et al., 2002), adhesion

molecules, chemokines and cells (Mowat,

2003). The idea that the immunological

environment of the gut seems to make great

efforts to ensure that tolerance is the default

response to antigen is often challenged on the

basis that this would be a dangerous strategy

for host survival in the face of continuous

exposure to pathogens. The inappropriate

immune response to foods and commensal

bacteria that are responsible for celiac

disease and Crohn’s disease are due to

deregulation of these crucial processes

(Mowat, 2003). Thus, an increasing incidence

of adverse reactions to ingested foods is

being reported, which may reflect a failure of

oral tolerance induction or a breakdown of its

maintenance. Peanuts appear to consist of

particular potent allergenic proteins and the

prevalence of peanut allergy is rising in both

children and adults, mainly in USA and UK

(Strid et al., 2004), and it is also known for its

persistence through life as just 10-20% of

peanut allergic patient lose their sensitivity to

peanut (Skolnick et al., 2001) compared with

85% for egg and cow’s milk allergy

(Dannaeus and Inganas, 1981; Host et al.,

2002). Peanut (Arachis hypogaea) belongs to

the family of Leguminosae and consists of

albumins and storage proteins that comprise

87% of the total protein contents (Fries,

1982). Several peanut proteins have been

120

identified as allergens, such as Ara h1, Ara

h2, Ara h3 (Burks, Sampson and Bannon,

1998). However, recent work shows that the

food matrix is important in the immune

response to peanut and purified peanut

allergens may have little intrinsic stimulatory

capacity (van Wijk et al., 2005).

The gut-associated lymphoid tissue (GALT)

which is responsible for the induction phase of

the immune response can be divided into

effector sites which consist of lymphocytes

scattered throughout the epithelium and

lamina propria of the mucosa, and as

organized tissues such as the Peyer’s

patches (isolated small lymphoid follicles

distributed throughout the wall of the small

and large intestines) and mesenteric lymph

nodes (MLNs) (Hamada et al., 2002). Many

investigators believe that the lymphoid

aggregates of T and B cells of the Peyer

patches are the central players in the

induction of the immune response after oral

contact with macromolecules derived from the

diet or flora (Bruce and Ferguson, 1986). In

the gut, special sets of T and B cells co-exist,

which suggests the existence of a special

immunologic reactivity, prepared for constant

contacts of the immune system and the

environment. On the contrary, Inflammatory

Bowel Disease (IBD) is associated with

classical Th1 and Th2 responses, which are

characterized by the breakdown of the

immunoregulatory mechanisms that maintain

oral tolerance (Andrade et al., 2003). Crohn’s

disease and Ulcerative colitis both are IBD’s

with distinct immunoregulatory characteristics

and clinical manifestations. They are given a

common name because sometimes one

resembles the other so closely that even a

pathologist cannot distinguish between them

(Karlinger et al., 2000). Many potential

metabolic problems may complicate IBD, and

this usually occurs in patients with severe

forms of the disease (Allan, 1998). The study

of animal models of mucosal inflammation as

a means to probe the pathogenesis of IBD

extends for almost a half century (Strober et

al., 2002). Several animal models are

available for use in IBD research which

evaluates pharmacological molecules or

agents that could lead to a possible cure for

this devastating disease entity. Over the past

two decades, a steadily increasing number of

more than 20 experimental models with a

variable range of clinical manifestations

similar to those observed in human IBD have

been developed (Jurjus et al., 2004). These

models contributed greatly to important

advances in our current understanding of the

underlying mechanisms of inflammation and

disease pathogenesis as well as treatment. In

general, an appropriate or an optimal animal

model should display certain key

characteristics similar or identical to the

human IBD course: pathophysiology,

symptoms and signs. The gut of this model

should also exhibit inflammation and

morphological alterations (Jurjus et al., 2004).

For this, most of the available models induce

gut inflammation through irritation of the

121

mucosal surface by their exposure to

chemical reagents and products, such as,

acetic acid, phorbol ester and various sulfated

polysaccharides (carageenan, amylopectin

sulfate and dextran sulfate sodium) or use

genetically modified animals (Strober et al.,

2002).

We chose peanuts seeds (Arachis hypogea)

as our source of antigen once peanuts are

considered to be one of the most potent food

allergens causing severe diseases. Although

in humans most of the clinical symptoms are

Th2 related and show acute anaphylactic

symptoms, we here present a model with a

chronic profile.

The aim of this study was to develop an

animal model of the antigen specific gut

inflammation in rats and mice to analyze the

serum, the gut histology and some clinical

parameters (as weight measure and presence

of diarrhea), comparing control with

immunologically manipulated (immune)

animals.

MATERIALS AND METHODS

Animals

In this study we used 30 male adult Lou-M

rats (8-12 weeks) and 30 female (6–8 weeks)

BALB/c and C57BL/6J mice, bred and

maintained at the Animal Facility of the

Immunobiology Department of Fluminense

Federal University (Rio de Janeiro, Brazil).

The animals of each strain were randomly

divided into 2 groups: control group and

experimental group. They were individually

numbered enabling paired statistical analysis.

The Ethics Committee of the Medicine School

of Fluminense Federal University approved

this research (protocol 167/05).

Peanut protein extracts (PPE)

Peanut seeds were minced in an electrical

coffee grinder sieved and defatted with ether

(Teixeira, 1995). To the defatted seed

preparation, extraction buffer (Sodium borate,

0,0125M, SDS 1%, Mercaptoetanol 1% - pH

10) was added, maintaining a 1:10 w/v ratio.

This mixture was then placed on a rocker for

30 min at room temperature, centrifuged at

600g, for 30 minutes. The supernatant was

collected and kept frozen at -20

C until use.

The protein concentration was determined

using a technique developed by Lowry (Lowry

et al., 1951).

Immunization protocol for rats

The rats were immunized twice with 200

PPE subcutaneously (sc). Primary

immunization was done with 5mg Al(OH)

and

booster immunization without adjuvant after a

21-28 day interval. Control animals were

sham immunized with physiologic saline plus

5mg Al(OH)

and booster immunization

without adjuvant.

Immunization protocol for mice

122

The mice were immunized twice with 100µg

PPE sc. Primary immunization was done with

1mg Al(OH)

and booster immunization

without adjuvant after a 21-28 day interval.

Control animals were sham immunized with

physiologic saline plus 1mg Al(OH)

and

booster immunization without adjuvant.

Challenge diet

A challenge diet composed exclusively of

peanut seeds in natura offered ad libitum for a

30-day period was introduced one week after

secondary immunization.

Bleeding

All the animals were bled from the retrorbital

plexus prior to manipulation, and 10 days

after each immunization withdrawing 1ml and

200µl from rats and mice respectively. The

serum was collected and stored at -20º C until

analyses.

Clinical Evaluation

Weekly clinical evaluation included: weight

measure (Plenna digital balance 0.1g

resolution), presence of diarrhea and fur

characteristics.

ELISA

The serum samples were evaluated by ELISA

method to quantify specific anti-peanut protein

antibody titers. For antigen-specific IgG and

IgG1 antibodies, 96-well plates were coated

with PPE at 10µg/well in Phosphate Buffered

Saline (PBS) at 4°C overnight. Plates were

washed with 0,05% Tween-20 in PBS and

then blocked with 100µl of a 1% PBS/gelatin

solution for 1h at room temperature. Serum

samples were plated in 1:100 dilution

(100

l/well) and incubated for 3h at room

temperature. Plates were then washed and

received peroxidase-labeled rabbit anti-

mouse IgG (SIGMA-Aldrich - Germany), goat

anti-mouse IgG1 (Southern Biothechnology –

USA) or goat anti rat IgG (Southern

Biothechnology – USA) and incubated for 3h

at room temperature. Reactions were

developed with 100µl of solution containing

and o-phenylene-diamine (OPD)

(SIGMA-Aldrich - Germany). Plates were read

at 492nm on an automated ELISA reader

(Anthos 2010, Germany). The results are

reported as arbitrary units of ELISA

corresponding to the area under the dilution

curve of each serum.

Collection of the Intestine Segments and

Histological Parameters

After the diet exposure period, all animals

were euthanazed to collect 1-3cm segments

of gastro-duodenum junction and jejunum.

These segments were fixed with 10%

buffered formaldehyde and stained with

123

Hematoxilin-Eosin (HE). The histological

parameters evaluated from both duodenum

and jejunum were the general description of

the slide (integrity of the intestinal structure,

number of villi per field, edema, congestion

and leukocyte infiltrate). The villi height/width

ratio; epithelial-cell-height/lamina-propriety-

width ratio, villi-height/cript-height ratio and

Intestinal Epithelial Cells/Intraepithelial

Leukocytes (IEC/IEL) ratio were obtained

from the previous parameters.

Statistical Analysis

Statistical analysis were performed by using

Fisher’s test, ANOVA and Tukey´s post test to

determine the minimum significance

difference (MSD) using GraphPad InStat

program by GraphPad Software Inc.

RESULTS

Weight analysis

The weight of all rats and mice was analyzed

during the peanut feeding period (challenge

diet). In rats, at the beginning of the challenge

diet, animals of both groups (control and

experimental) presented an average weight of

250.75±12.10g and 258.80±16.21g

respectively. After the 4

week of the

challenge diet, it was observed that control

animals presented a significant difference of

weight compared with experimental rats

(p<0.05). Control rats gained 19.55±0.24g

while experimental animals lost an average of

5.62±2.82g. Animals of the control group

gained weight during the first week of the

challenge diet while experimental animals

began to lose weight at the second week (Fig.

1A).

At the beginning of the challenge diet, mice,

of both groups (control and experimental)

presented an average weight of 23.81g ±

1.47g. Mice of both strains presented a similar

behavior. Experimental group began to lose

weight at the first week of the challenge diet

with an average loss of 1.42±0.45g, while the

control group began to gain weight at the

second week and presented an average of

1.48±0.37g. The weight difference between

groups was significant (p<0.05). (Fig. 1B).

The systemic immunization with crude peanut

extract renders significantly higher antibody

titers.

Experimental rats (submitted to systemic

immunization with crude peanut extract)

render significantly higher total IgG antibody

titers (4.651±0.180 units) than control rats

(sham immunized) (0.879

0.087 units)

(p<0.05); eating peanuts over a 30-day

period, after immunization, maintains the high

antibody levels of experimental animals (Fig.

2A).

124

-10,00

-5,00

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

0 1 2 3 4

weight in grams

Control rats Experimental rats

weeks

-2,50

-2,00

-1,50

-1,00

-0,50

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0 1 2 3 4 5

weeks

weight in grams

Control mice Experimental mice

Figure 1. Evolution of the average weight of experimental and control animals during challenge diet (A)

rats and (B) C57BL/6J mice.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

2 weeks 3 weeks 4 weeks

booster feeding peanuts

Arbitrary units of ELISA*

Experimental rats Control rats

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

2 weeks 3 weeks 4 weeks

booster feeding peanuts

Arbitrary units of ELISA*

C57BL/6J experimental C57BL/6J control

Balb/c experimental Balb/c control

Figure 2.

Total antipeanut IgG antibody titers

in experimental and control rats (A) and in experimental

and control mice of both strains (B).

Similar to rats, mice of both strains, submitted

to the systemic immunization with crude

peanut extract, presented higher titers of IgG

and IgG1 when compared to control

counterparts. There were no differences

between experimental BALB/c and C57BL/6J

IgG1 antibodies titers, although total specific

IgG titers of experimental BALB/c mice were

significantly higher than of C57BL/6J mice

(C57BL/6J: 5.084±0.376 units; BALB/c:

7.673±3.360 units; p<0.05) (Fig. 2B). As seen

with the rats, eating peanuts over a 30-day

period, after immunization, maintains the high

antibody levels of experimental mice. In

contrast to control animals that does not

present the observed increase in antibody

titers. The difference of both strains IgG and

IgG1antibody titers between control and

experimental mice was significant (p<0.05).

Morphological Analysis of the Intestine

The macroscopic analysis of rats and mice

revealed a frail consistency of the intestinal

tissue pertaining to animals of the

125

experimental group in contrast to the intestinal

tissue of the control group.

The microscopic analysis, agrees with the

macroscopy, in which a preserved intestinal

structure in control animals was seen while in

the experimental animals their villi presented

edema, congestion and a high leukocyte

infiltration in both duodenum and jejunum

(Fig. 3 e 4).

In rats (Fig. 3), the villi from duodenum but not

jejunum of experimental animals presented

significant alterations (p<0.05) in the

height/width ratio (3.54±1.10) when compared

to control animals (4.55±0.74). A significant

difference (p<0.05) in jejunum but not

duodenum was observed in experimental

animals when evaluated the epithelial-cell-

height/lamina-propria-width ratio (0.62±0.08),

in wich the control animals presented a higher

ratio (0.83

0.38). The third criteria analyzed,

villi-height/crypt-height ratio, also showed

significant difference (p<0.05) in only one of

the intestinal segments, duodenum but not

jejunum, in which this ratio was higher in

control animals (1.97

0.11) when compared

to experimental animals (1.80

0.07). The

fourth criteria used to determine the

inflammatory process was to compare the

number of Intestinal Epithelial Cells (IEC) and

Intraepithelial Leukocytes (IEL) and establish

the IEC/IEL ratio. For this criterion, both

segments analyzed presented significant

differences when compared to control animals

(experimental duodenum: 9.09±1.43 vs.

control duodenum: 22.95±2.93 - p<0.05 and

experimental jejunum: 8.52±2.43 vs. control

jejunum: 13.22

0.80; p<0.05), in which control

animals presented a higher ratio than

experimental animals. We correlated the sera

Ab titers and the IEC/IEL ratio of control and

experimental animals, and according to

Fisher’s test, the row/column association was

statistically significant and the two-sided p

value was 0.0236.

Figure 3.

Histological differences between control

and experimental rats.

(A) Villi aspects of an

experimental rat, with presence of congestion and

increased leukocyte infiltration. (B) Villi aspects of

a control rat, with a preserved tissue, no edema

and few leukocytes. Tissue was stained with

Hematoxilin-Eosin.

Histological evaluation of mice (Fig. 4)

showed that experimental BALB/c mice

developed signs of gut inflammation on the

second week of peanut challenge, whereas in

experimental C57BL/6J mice only presented

significant inflammatory signs on the third

week of challenge. It was observed the

presence of edema in lamina propria and loss

126

of vilous integrity in duodenum. Control

animals submitted to peanut diet presented

IEC/IEL ratio (9.80±0.97) similar to that

observed in chow fed animals either

(11.00±1.55). BALB/c experimental mice

presented a significant increase (p<0.05) in

intraepithelial leukocytes number in duodenal

villus, represented by the decrease of IEC/IEL

ratio (5.60±1.14), and lamina propria edema

in the second week after receiving the

challenge diet (peanut). The IEC/IEL ratio, in

these animals, persists until the fourth week

of peanut challenge (5.72±1.11).

Experimental C57BL/6J animals only

presented a similar decrease in IEC/IEL ration

on the the third week of peanut challenge

(4.46

1.07). As observed with BALB/c mice,

the IEC/IEL ratio in duodenum of C57BL/6J

animals did not change after its initial

reduction (4.73

0.64). The peanut diet

caused gut morphological alterations (p<0.05)

in experimental mice of both strains tested

and was characterized by vilous atrophy and

lamina propria edema, especially after the

fourth week of challenge. Finally, control

animals, which underwent peanut

consumption, presented normal histological

appearance of gut as seen in chow fed

animals.

Figure 4.

Histological differences between control

and experimental mice.

(A) Villi of an experimental

BALB/c mouse. (B) Villi of an experimental

C57BL/6J mouse. (C) A normal villi of a control

C57BL/6J mouse. X200. Tissue was stained with

Hematoxilin-Eosin.

DISCUSSION

In the present work it was demonstrated the

reproducibility of a peanut allergy model,

originally developed in C57BL/6J mice by

Teireixa (2003), in BALB/c mice and Lou-M

rats. The features of this model of gut

inflammation are vilous atrophy, crypt

hiperplasia, prominent mononuclear leukocyte

infiltrate and lamina propria edema. These

signs are typical of human celiac disease

(gluten enteropathy), which is also observed

in other food induced enteropathies (Marsh,

1995). Teixeira (2003) demonstrated that

experimental C57BL/6J mice presented a mild

127

weight loss but no visible diarrhea. It was

observed weight loss in rats and BALB/c mice

in the experimental group with a gain in

weight in all control animals suggesting that

eating a foodstuff rich in calories in normal

situations induces fatting while in the

presence of an enteropathy this same food

will induce weight loss.

Offering peanut seeds ad libitum to animals in

order to induce gut inflammation is more

proximal to real conditions of human food

allergies and is distinctive of our model. In

other works, authors have been using

intragastric challenge to achieve an allergic

reaction (Morafo et al., 2003; Adel-Patient et

al., 2005). Nevertheless, our subcutaneous

mode of immunization may not be so far from

real conditions of primary sensitization.

Recently, Strid et al. (2005) have

demonstrated that epicutaneous exposure to

peanut proteins lead to allergic sensitization

and prevented oral tolerance, suggesting that

epidermal sensitization may be realistic to

provide a food allergy condition.

The presence of high and similar titers of

IgG1 a Th2 derived IgG isotype, in both

C57BL/6J and BALB/c mice in our model of

peanut allergy deserves more attention as

well as the fact that no major difference

between the gut inflammatory pattern were

found into these two mouse strains. Although

we did not measure IgG subtypes in rats the

results obtained for total specific IgG is similar

to that of the mice.

In contrast to the current thought that peanut

allergy is primarily a Th2-driven process,

there are accumulating data from the

literature indicating that peanut allergy is a

result of a mixed Th1-Th2 immune response.

Van Wijk and colleagues (2004)

demonstrated a mixed citokine response and

polyisotypic humoral response in murine

model of peanut allergy, specifically to major

peanut allergens Ara h1, Ara h2, Ara h3 and

Ara h6. Both IL-4 and IFN-γ production as well

as IgE, IgG1 and IgG2a were found at the

very early phase of the response to peanuts.

The same group also examined the role of

cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4

(CTLA-4), a negative regulator of T cell

activation, on peanut sensitization (Van Wijk

et al., 2005b). The use of an antibody against

CTLA-4 in a murine model of peanut allergy

failed to elicit an allergen-specific response.

Despite the induction of Th2 cytokines,

activation of antigen presenting cell (APC)

and an elevation in total serum IgE levels,

anti-CTLA-4 treatment did not induce peanut-

specific IgE antibodies or mast cell

degranulation. These data challenge the

pivotal role of a Th2 cytokine environment in

the induction phase of peanut allergy.

In our work, although we found Th2 derived

antibody isotype (IgG1) in mice, the cellular

infiltrate of the gut epithelium is not typical of

an anaphylactic profile. In addition, the

absence of anaphylactic systemic reactions in

our model corroborate the idea of a mixed

Th1-Th2 modulation of peanut allergy. Finally,

128

the verification of similar inflammatory

response in the gut of rats and mice with

different genetic backgrounds validates our

model of peanut allergy and provides an

interesting way for the study of this mixed

immune response to peanut proteins. Our

group has been interested in the study of

natural products derived from local plants as

possible alternatives for anti-inflammatory

drugs (Moreno et al., 2005). We are now

conducting new experiments in which this

animal model shall be used.

In conclusion, our results confirm that

systemic immunization to food antigens

makes animals susceptible to challenge diets,

leading to an antigen specific inflammatory

bowel disease, what makes this a convenient

tool to study the evolution of alterations in

chronic antigen specific gut inflammatory

process. As our findings are similar for more

than one species we may argue that we have

a robust model for food allergy.

ACKNOWLEDGEMENTS

Research supported by CAPES and UFF. We

would also like to thank Ms. Maira Platais for

her significant contribution in the revision of

the language.

RESUMO

A alergia alimentar consiste em uma reação

adversa que ocorre em pessoas susceptíveis

quando ingerem alimentos sensibilizantes,

sendo uma das causas das Doenças

Inflamatórias Intestinais (IBD). O objetivo

deste estudo foi desenvolver um protocolo

experimental de indução de um processo

inflamatório intestinal antígeno-específico em

camundongos e ratos. Foi escolhida para a

indução deste processo a semente de

amendoim. Os animais foram imunizados

com o extrato protéico previamente à

exposição com a semente in natura. Nossos

resultados mostram que a imunização

sistêmica com extratos protéicos de

amendoim ocasiona títulos significativamente

maiores de anticorpos quando comparado ao

grupo controle e que os animais imunizados

submetidos ao desafio com a dieta contendo

exclusivamente amendoim apresentam

alterações intestinais tempo-dependente

similares àquelas observadas na doença

celíaca. Os resultados obtidos sugerem que

este modelo experimental constitui uma

ferramenta conveniente para avaliar as

alterações no processo inflamatório intestinal

crônico antígeno-específico.

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131

2. Artigo intitulado

“Small intestinal malabsorption of D-xylose in rats with antigen

specific gut inflammatory reaction”.

Submetido à revista Nutrition Research.

Status do envio:

De Nutrition Research <nr@purdue.edu>

Para danimfantunes@gmail.com

Data 30/07/2007 12:17

assunto: Your submission

Nutrition Research

Title: Small intestinal malabsorption of D-xylose in rats with antigen specific gut

inflammatory reaction

Dear Dr. Antunes:

We have made an editorial office review of your manuscript and request that you

address the issues that came up during this review. Please include a detailed letter

indicating changes made in the revision (we will not resume the review process without

this letter). After we have your revised manuscript we can continue with the peer review

process. The peer review process will end if we do not hear from you and do not

receive a revised manuscript.

Your manuscript is important to our editorial office and we appreciate the opportunity to

evaluate your work for publication in Nutrition Research. We look forward to receipt of

your revised manuscript in 12 calendar days to continue the peer review process (EES

for electronic submission of manuscripts supported by Elsevier

http://ees.elsevier.com/nr/).

Regards,

Yong Li

Assistant Editor

132

Small intestinal malabsorption of D-xylose in rats with antigen specific gut

inflammatory reaction.

Danielle MF Antunes

*1,2

, Janilda P da Costa

1,2

, Sylvia MN Campos

, Patrícia O Paschoal

2,3

Valéria Garrido

, Munique Siqueira

, Silvana RF Moreno

, Gilberto P Cardoso

, Gerlinde APB

Teixeira

2,3

Graduation Program in Medical Sciences, Medical Sciences Centre, Fluminense Federal

University;

Immunobiology Department, Gastrintestinal Immunology Group, Biology Institute,

Fluminense Federal University;

Graduation Program in Pathology, Fluminense Federal

University, Niteroi, RJ, Brazil.

Abbreviations list

Ab - Antibody

Al(OH)

- aluminium hydroxide

BALB/c - isogenic mice mice strain

57BL/6J – isogenic mice strain

– Carbon dioxide

ELISA - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

GAC - Gut Absorptive Capacity

– Hydrogen peroxide

HE – Hematoxilin-Eosin stain

IBD - Inflammatory Bowel Disease

IEC - Intestinal Epithelial Cells

IEL - Intraepithelial Leukocytes

Ig – Immunoglobulin

Lou-M - isogenic rats strain

OPD - o-phenylene-diamine

PBS - Phosphate Buffered Saline

PPE - peanut protein extract

sc - subcutaneous rout

Abstract

The study of animal models of mucosal inflammation as a means to probe the pathogenesis of

Inflammatory Bowel Disease (IBD) extends for almost a half century. The inappropriate immune

133

response to foods, such as peanut, wheat and milk may be implicated in the pathogenesis of

celiac and Crohn’s diseases, which present small intestinal malabsorption. A number of recent

studies have utilized D-xylose absorption as an investigative tool to study small intestinal

function in a variety of clinical settings. Thus, the aim of the present experimental study was to

evaluate the intestinal absorption of D-xylose in an antigen specific gut inflammatory reaction rat

model. Animals of the experimental group were immunized with peanut protein extract before

their exposure to a challenge diet containing exclusively peanut seeds to induce the gut

inflammatory reaction due to peanut allergy. Our results show that systemic inoculation with

peanut protein extracts renders antibody titers higher than control group (p<0.0001) and that the

antibody titers correlate positively to an inflammatory alteration of the gut morphology. Animals

pertaining to the experimental group showed an intestinal absorption of D-xylose lower than

control rats (p<0.0001). In conclusion, the use of serum D-xylose test was useful to identify the

presence of small intestinal malabsorption in our antigen specific gut inflammatory reaction rat

model.

Key Words: xylose, rats, peanut allergy, malabsorption and gut inflammation.

Introduction

Ulcerative colitis and Crohn’s disease, collectively known as Inflammatory Bowel Disease (IBD),

are major causes of lifetime morbidity and each disease clearly involves an abnormal mucosal

inflammatory response [1]. The idea that the immunological environment of the gut seems to

make great efforts to ensure that tolerance is the default response to antigen is often challenged

on the basis that this would be a dangerous strategy for host survival in the face of continuous

exposure to pathogens. The inappropriate immune response to foods and commensal bacteria

responsible for celiac and Crohn’s disease are due to deregulation of crucial control processes

of the gut [2]. The use of animal models of mucosal inflammation as a means to probe the

pathogenesis of IBD extends for almost a half century [3] and several animal models are

available. These models have been used to evaluate pharmacological molecules or agents and

have contributed greatly to important advances in our current understanding of the underlying

mechanisms of inflammation and disease pathogenesis as well as treatment [4].

A number of recent studies have utilized D-xylose absorption as an investigative tool to study

small intestinal function in a variety of clinical settings. D-xylose is a pentose found naturally in

plants, and its incomplete metabolization allows it to be used as an absorptive test [5]. The

majority of studies appear to favor of the serum D-xylose measurements over urinary D-xylose

134

excretion to screen adult and pediatric patients for small intestinal malabsorption [6] which is a

simple and low-cost method [7].

In a prior study we demonstrated the reproducibility of a peanut allergy model, originally

developed in C57BL/6J mice by Teixeira [8,9], in BALB/c mice and Lou-M rats [10]. Peanuts

seeds (Arachis hypogea) were chosen as source of antigen as peanuts are considered to be

one of the most potent food allergens causing severe diseases [11-13]. The main features of

this model of gut inflammation are villous atrophy, crypt hiperplasia, prominent mononuclear

leukocyte infiltrate and lamina propria edema. These signs are similar to food induced

enteropathies in humans such as celiac disease, a gluten enteropathy. The aim of this study

was to evaluate the intestinal absorption of the D-xylose in an antigen specific gut inflammatory

reaction rat model. Unlike for diagnosis in humans, we are unaware of any reports in the

literature, in which D-xylose is utilized to evaluate the intestinal absorption in rat models of IBD.

Materials and methods

The Ethics Committee of the Medicine School of Fluminense Federal University approved this

research (protocol 167/05).

Animals

In this study 35 male adult Lou-M rats (8-12 weeks and 250-300g body weight) bred and

maintained at the Animal Facility of the Fluminense Federal University (Niteroi, Brazil) were

used. The healthy animals were randomly divided into 2 groups: control group and experimental

group. They were individually numbered to enable paired statistical analysis.

Induction of the antigen-specific gut inflammation

The induction of the antigen-specific gut inflammation was realized following the protocol

described before [10]. To develop the antigen-specific gut inflammation, all rats of the

experimental group (n=15) were inoculated twice with 200µg peanut protein extract through the

subcutaneous rout (sc). The primary inoculation with 5mg of adjuvant [Al(OH)

] and after an

interval of 21 days, each animal received a booster inoculation without adjuvant. After this

second inoculation, all rats were submitted to a challenge diet composed exclusively of peanuts

in natura ad libitum over a 30-day period. The control animals (n=15) were inoculated with

135

physiologic saline plus 5mg Al (OH)3, and after the same interval of 21 days, they received a

second inoculation with physiologic saline. After this second inoculation, all control animals

continued to receive commercial rodent chow (Nuvilab,NUVITAL, Brazil). The chow and peanut

macronutrients distribution are described in table 1.

Table 1.

Macronutrients distribution of the rats diet.

All animals were bled from the retrorbital plexus, prior to manipulation and 10 days after each

inoculation, withdrawing 1ml. The serum was collected and stored at -20ºC until analyses.

ELISA

The serum samples were evaluated by ELISA to quantify specific anti-peanut protein antibody

titers. For antigen-specific IgG antibody, 96-well plates were coated with peanut protein extract

(PPE) at 10ug/well in Phosphate Buffered Saline (PBS) at 4°C overnight. Unbound extract were

discarded, plates were washed with 0.05% Tween-20 in PBS and then blocked with 100ul of a

1% PBS/gelatin solution for 1h at room temperature. Serum samples were placed in the first

well at a 1% dilution (100ul/well) followed by a three fold serial dilution (obtaining a final dilution

of 1:218700) and incubated for 3h at room temperature. Plates were then washed and received

peroxidase-labeled goat anti-rat IgG (Southern Biothechnology – USA) and incubated for 3h at

room temperature. Reactions were developed with 100ul of solution containing H

and o-

phenylene-diamine (OPD) (SIGMA-Aldrich - Germany). Plates were read at 492nm on an

automated ELISA reader (Anthos 2010, Germany). The results are reported as arbitrary units of

ELISA corresponding to the area under the dilution curve of each serum.

Anesthesia

Rats received the equivalent of 100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine body weight

through intraperitoneal.

136

Determination of D-xylose absorption curve in normal animals

Anesthetized normal rats received an aqueous solution of 2ml containing 1.23g of D-xylose into

the stomach by gavage (n=5). All animals were bled from the retrorbital plexus - withdrawing

1ml – immediately prior to the gavage and at one-hour intervals after the D-xylose

administration, until the third hour. The serum was collected and stored at -20º C until analysis.

The amount of D-xylose in serum was determined as described by Eberts [14].

D-xylose absorption test in experimental and control animals

To determine if inflammation interferes in D-xylose absorption, the test was performed at the

end of the 30-day period of challenge diet in the same fashion as described above using the 1

and 3

hour post gavage.

Necropsy

All animals were euthanazed with CO

to collect a 3cm segment of the gastro-duodenum

junction, after the D-xylose test. This segment was fixed with 10% buffered formalin and stained

with Hematoxilin-Eosin (HE).

Statistical analysis

The statistical analysis performed was ANOVA with Tukey´s or Fisher post test to determine the

minimum significance difference (MSD), using GraphPad InStat Program by GraphPad

Software Inc



. P<0.05 was considered as statistically significant.

Results

The systemic inoculation with crude peanut extract renders high antibody titers

Confirming previous results in mice [8], experimental rats (submitted to systemic inoculation with

crude peanut extract) presented significantly higher (p<0.0001) IgG antibody titers (5.085 ±

0.126 units) than control rats (inoculated with saline) (0.905 ± 0.053 units) (Fig. 1).

137

Figure 1. Total antipeanut IgG antibody titers in experimental and control rats. Experimental rats

presented significantly higher (p<0.0001) IgG antibody titers than control rats.

Intestinal absorption of D-xylose

After gavage all animals were bled at hour intervals for the first three hours to determine the

absorption and excretion curve of D-xylose. Evaluating the individual absorption curves of the

first three hours after gavage of D-xylose we found that as of the first and until the third hour

there are no statistical differences in blood levels of D-xylose neither between animals nor time.

Evaluating the mean values of the five animals there is a statistical difference between before

and after gavage but not during the three hours following gavage (Fig. 2).

Figure 2.

Determination of the absorption curve of D-xylose in normal animals. Mean values of the five

animals showing a statistical difference (P< 0.0001) between before and after gavage, but not during the

three hours following gavage.

138

Based on the absorption curve we determined that each experimental and control animal should

be bled on the first and third hour after gavage. Absorption values are expressed as the mean

of both bleedings. As shown in figure 3, experimental animals showed an intestinal absorption

of xylose (9.66 ±1.79mg) significantly lower (p<0.0001) than control rats (19.63 ± 2.89 mg).

Figure 3.

Mean absorption of D-xylose (mg/ml) in experimental and control rats. Experimental animals

showed an intestinal absorption of xylose significantly lower (p<0.0001) than control rats.

Intestinal analysis

Animals of the experimental group presented a frail consistency of the intestinal tissue observed

in the macroscopic analysis in contrast to the intestinal tissue of the control group.

The microscopic analysis agrees with the macroscopy in which a preserved intestinal structure

in control animals was seen while in the experimental animals, villi presented edema,

congestion and a high leukocyte infiltration in duodenum (Fig. 4).

139

Figure 4.

Diferences in duodenum analysis between experimental and control animals (200x – HE). (A)

Villi from an experimental rat presenting alteration of the normal morphology (edema, congestion and a

high leukocyte infiltration). (B) Villi from a control rat presenting normal aspects.

Other criteria that used to determine the inflammatory process was to compare the number of

Intestinal Epithelial Cells (IEC) and Intraepithelial Leukocytes (IEL) and established the IEC/IEL

ratio. For this criteria, the duodenum segment analyzed presented significant differences

(p<0.05), where control animals presented a higher ratio than experimental animals.

We correlated the sera Ab titers and the IEC/IEL ratio of control and experimental animals, and

according to Fisher’s test, the row/column association was statistically significant (p=0.0236).

Discussion

The objective of the present study was to evaluate the intestinal absorption of rats with an

antigen specific gut inflammatory reaction, using the serum D-xylose absorption test, which

consists in a standard method of diagnosing small intestinal bowel malabsorption [7]. We chose

the serum D-xylose test rather than urine test because in some human studies a reduced

specificity of the urine test was observed due to false-positives. In pediatric patients, especially

in very young children and infants, the use of serum rather than urinary D-xylose testing is

favored due to difficulties in obtaining accurately timed urine collections [5]. Ehrenpreis et al

recommend the use of both 1 and 3 hour serum D-xylose determination to screen patients with

symptoms of malabsorption [7]. In literature, there are few studies on the use of D-xylose in rats,

and they are related to disease models other than IBD, such as trauma hemorrhage, sepsis [15]

and iron-deficiency anemia [16]. In the first study, authors measured the gut absorptive capacity

140

(GAC) using the 1-h D-xylose absorption test and found significative findings in portal blood

[15]. On the other hand in the study involving anemia [16], authors based the intestinal

absorption of D-xylose on urinary excretion and did not find any difference between the anemic

and control groups. These results confirm prior findings carried out by Sharma et al in rats [17].

We may argue that the differences observed in these studies may be due to the technical

procedures or to the underlying diseases. Due to the difficulties involved in adequate urine

collection in the rat we established to use serum determination of D-xylose absorption.

In the present study, it was necessary to determine the best bleeding times after D-xylose

gavage. Based on literature animals were bled during three hours with hourly intervals. Our

results are in accordance with data presented by Ehrenpreis et al who specified that patients

should be tested at the first and third hour after D-xylose administration [7]. Our results

demonstrate that during the first 3 hours there are no statistical differences. Thus, in accordance

to human studies and based on the timing of D-xylose elimination from the blood we defined as

a rule to use the 1

and 3

hour after gavage to bleed the animals. As observed by Teixeira in

mice [8,9], in the present study we also have observed that the systemic inoculation with crude

peanut extract (experimental mice) renders antibody titers significantly higher than saline

inoculated rats. Experimental animals that eat the challenge diet containing peanuts over a 30-

day period, after inoculation, maintain the high antibodylevels throughout the period, and

present a corresponding alteration of the gut morphology typical of chronic inflammatory gut

reactions demonstrating that this group presented peanut allergy. As shown by Mowat, that

deregulation of food tolerance in humans can provoke IBD like celiac or Chron´s disease [2],

our results confirm that systemic inoculation to a food protein can lead to an IBD-like disease in

the animal model.

In our previous work [8-10] we demonstrated that systemic inoculation without a challenge diet

does not induce inflammatory gut reactions but prior inoculation is absolutely fundamental for its

induction. On the other hand, eating the allergenic foodstuff prior to systemic inoculation

protects the animal form this form of IBD when submitted to the challenge diet. We found in our

peanut allergy/IBD rat model a positive association between higher IgG anti-peanut antibody

titers, presence of intestinal inflammation and the presence of small intestine malabsorption,

demonstrated by the D-xylose test. These results are in accordance to human findings [7].

In conclusion, the 1 and 3 hour serum D-xylose test was useful to identify the presence of small

intestinal malabsorption in our antigen specific gut inflammatory reaction rat model which

permits a clinical evaluation without having to euthanize the animals during the experimental

period.

141

Acknowledgments

The present work was carried out with support of the CAPES, Institution of the Brazil

Government for development of human resources. We are also indebted to UFF.

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143

3. Artigo intitulado

“Correlation between D-xylose absorption and sorological and

histological events in a Rat Model of Chronic Gut Inflammation”

. Submetido à

revista Brazilian Archives of Biology and Technology.

Status

do envio:

De Claudineia Nunes Pereira <clau@tecpar.br>

Para Danielle Antunes <danimfantune[email protected]>

Data 01/08/2007 15:12

Assunto Re: Fw: Envio de artigo - favor acusar recebimento

enviado por tecpar.br

Danielle,

Recebemos seu artigo: "Correlation of D-xylose absorption with serological and

histological events in an Animal Model of Chronic Gut Inflammation" no dia 30/07/07. O

número de referencia é BD-2062.

Atenciosamente

Claudinéia

Claudinéia Nunes Pereira

TECPAR - Instituto de Tecnologia do PR

Divisão de Extensão Tecnológica - DEXT

Brazilian Archives of Biology and Technology - BABT

Rua Prof. Algacyr Munhoz Mader, 3775 - CIC

81.350-010 - Curitiba - PR

Fone: (41) 3316-3012

144

Correlation of D-xylose absorption with serological and histological events in an

Animal Model of Chronic Gut Inflammation.

Danielle Mota Fontes Antunes*

1,2

, Janilda Pacheco da Costa

1,2

, Gilberto Perez Cardoso

Gerlinde Agate Platais Brasil Teixeira

2,3

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Centro de Ciências Médicas, Universidade Federal

Fluminense, 24033-900, Niterói, RJ, Brasil;

Departamento de Imunobiologia, Laboratório do Grupo de

Imunologia Gastrintestinal, Instituto de Biologia, Universidade Federal Fluminense, 24020-150, Niterói,

RJ, Brasil;

Programa de Pós-Graduação em Patologia,

Universidade Federal Fluminense, 24033-900,

Niterói, RJ, Brasil.

ABSTRACT

Inflamatory Bowel Disease (IBD) is a debilitating disease that can be provoked by inappropriate

immune response to foods. Recently, the D-xylose absorption test has been used as an

investigative tool to study small intestinal function in human IBD. Our aim is to analyse the

relationship between absorption of D-xylose with serological and histological events in a animal

model of peanut allergy/IBD. Animals immunized with peanut protein extract and exposed to a

peanut containing challenge diet (inflammatory induction period), received a D-xylose gavage

and were bled after the first and third hour to determine serum clearance of this sugar.

Duodenum segments were collected to determine degree of gut inflammation. We show that D-

xylose absorption correlates negatively with IgG titers and positively with morphometric

parameters. In conclusion, our results indicate that the D-xylose test is a useful tool to evaluate

intestinal malabsorption and presents a good correlation with other diagnostic methods of IBD.

Key words: inflammatory bowel disease, animal model, D-xylose, peanuts.

INTRODUCTION

IBD mainly by ulcerative colitis and Crohn

disease but also including noninfectious

inflammation of the gut, have posed an

enigma to gastroenterologists and

immunologists alike since their first

modern descriptions some 75–100 years

ago (Strober, 2007). Recently, it has been

estimated that IBD affects approximately

one million people in North America alone

(Bamias et al., 2005). The inappropriate

immune response to foods and

commensal bacteria responsible for celiac

and Crohn’s disease are due to

deregulation of crucial control processes

of the gut (Mowat, 2003). It is recognized

that immune tolerance is the normal state

of the intestinal immune system and it is

apparent that a wide variety of cell types

are orchestrated in a tightly regulated

fashion to maintain immunologic tolerance.

At the same time, the capacity to build an

immune and inflammatory response within

the mucosa is maintained. So, both the

innate and adaptive immune responses

play integrated roles in the homeostasis of

the intestinal mucosal immune response

(Sands, 2007). Disease related

malnutrition (undernutrition), weight loss

and sub-optimal nutritional status may be

present at any stage of IBD. The causes of

malnutrition in IBD are multiple and

include poor dietary intake, impaired

nutrient digestion and absorption

(O’Sullivan and O’Morain, 2006).

Several animal models of mucosal

inflammation are avaialble and these have

provided useful insights into the

pathogenesis of the intestinal inflammatory

response (Hendrikson et al., 2002).

Many recent studies have utilized D-xylose

absorption as an investigative tool to study

small intestinal function in a variety of

clinical settings in humans and animals

models (Singh et al., 1991; Wayhs et al.,

2004). D-xylose is a pentose found

naturally in plants, its incomplete

metabolization allows it to be used as a

tracer and therefore as an absorptive test

(Craig and Ehrenpreis, 1999).

In prior studies, we demonstrated the

reproducibility of a peanut allergy model,

in BALB/c mice and in Lou-M rats which

was originally developed in C57BL/6J

mice (Antunes et al., 2007a). In another

study we standardized in normal rats the

use of serum D-xylose as a tool to identify

small intestinal sugar absorption and

presented preliminary result of sugar

absorption in our rat model of IBD (Costa,

2005; Antunes et al., 2007b).

The aim of this study was to analyse the

relationship between D-xylose absorption

and serological and histological events

which were found in our animal model of

peanut allergy/IBD.

MATERIALS AND METHODS

The Ethics Committee of the Medicine

School of Fluminense Federal University

approved this research (protocol 167/05).

We used 30 male adult Lou-M rats (8-12

weeks and 250-300g body weight) and 30

male adult C57Bl/6J mice (6–8 weeks and

20-25g body weight) bred and maintained

at the Animal Facility of the Fluminense

Federal University (Niteroi, Brazil). The

healthy animals were randomly divided

into 2 groups: control and experimental.

Induction of the gut inflammation

To develop the induction of the antigen

specific gut inflamation, all rats and mice

were immunized twice as described before

(Antunes et al., 2007a) – the control group

received a sham immunization with saline

while the experimental group received an

immunization with a peanut protein

extract. The experimental group was

submitted to a challenge diet composed

exclusively of peanuts in natura ad libitum

over a 30-day period while control animals

continued to receive commercial rodent

chow.

Serum Analysis

All animals were bled from the retrorbital

plexus prior to manipulation, and 10 days

after each immunization, withdrawing 1ml.

The serum was collected and stored at -

20º C until ELISA analyses.

Evaluation of the gut absorption

To determine if inflammation interferes in

D-xylose absorption, the test was

performed at the end of the 30-day period

of challenge diet, as described in rats by

Antunes et al. (2007b) and in mice by

Costa (2005).

All rats and mice were anesthetized

through intraperitoneal. After this, rats

received an aqueous solution of 2ml

containing 1.23g of D-xylose into the

stomach by gavage while mice received

an aqueous solution of 100µl containing

0,01g of D-xylose. All animals were bled

from the retrorbital plexus - withdrawing

1ml of rats and 200µl of mice - at the first

and third hour after the D-xylose

administration. The serum was collected

and stored at -20º C until analysis.

The amount of D-xylose in serum was

determined as described by Eberts (1979).

In short, 60µl of serum was added to the

2ml of chromogen (phloroglucinol,

chloridric acid and acetic acid) and

reacted in a boiling water bath at 100

C for

4 minutes. After cooling at room

temperature, optical density was

measured using Pelkin Elmer

spectrophotometer at 554 nm.

Gut segments collection

After the D-xylose test, all animals were

euthanazed with CO

to collect a 3cm

segment of the gastro-duodenum junction

to establish histological parameters: villi

height/width ratio, villi-height/crypt-height

ratio and Intestinal Epithelial Cells

(IEC)/Intraepithelial Leukocytes (IEL) ratio.

The intestinal segments were fixed with

10% buffered formalin and stained with

Hematoxilin-Eosin (HE).

Statistical Analyses

Statistical analyses were performed by

using GraphPad InStat program by

GraphPad Software Inc. Interaction

between variables was studied using

Pearson correlation. P<0.05 was

considered as statistically significant.

RESULTS

Serological analyses, showed that

experimental animals (submitted to

systemic immunization with crude peanut

extract) presented significantly higher total

IgG antipeanut titers (rats: 5.95±0.19 units;

mice: 5.04±0.26 units) than control

animals (sham immunized) (rats:

0.96±0.05 units; mice: 0.85±0.02 units)

(p<0.001).

After the 30 day challenge diet and D-

xylose gavage, serum of experimental

animals showed an intestinal absorption of

xylose (rats: 9.73±1.65mg; mice:

2,09±1,42mg) significantly lower (p<0.001)

when compared to absorption titers of

control animals (rats: 20.61± 2.99 mg;

mice: 30,21± 12,87).

As shown previously, all histological

parameters here analysed were significant

when comparing experimental and control

groups (p<0.05). The villi height/width, villi-

height/crypt-height and IEC/IEL ratio was

significantly lower in experimental

duodenum than control animals (table 1).

Table 1. Histological parameters analysed in

mice and rats.

Lou-M rats

C57Bl6/J mice

Histological

Parameters

Control Exper. Control Exper.

Villi height/

width ratio

5.05±0.82 3.91±1.07 4.84±1.85 2.60±1.04

Villi-height/

crypt-

height ratio

2.09±0.18 1.90±0.10 1.98±0.23 1.70±0.15

IEC/IEL

ratio

21.89

2.7

9.48

1.37 18.87

3.9

10.90

2.46

Correlating D-xylose absorption with IgG

antibody titers of animals exposed to

challenge diet, we found a negative

correlation (r= -0.7773), (Fig. 1).

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

IgG titers (O.D.)

D-xylose (mg/ml)

Figure 1.

Correlation between antibody (Ab)

titers and D-xylose. (r= -0.7773; p<0.0001).

On the other hand, correlating D-xylose

absorption with villi height/width ratio

(r=0.7645), villi-height/crypt-height ratio (r=

0.9763) and IEC/IEL ratio (r=0.8628 –

Fig.2), a positive correlation was found.

5 7 9 11 13 15 17 19

IEC/IEL Ratio

D-xylose(mg/ml)

Figure 2. Correlation between IEC/IEL ratio

and D-xylose. (r=0.8628; p<0.001).

DISCUSSION

In the present study, the observed events

are similar to those described in prior

reports (Antunes et al., 2007a; Antunes et

al., 2007b).

The objective of this study was to correlate

the intestinal absorption of D-xylose and

the serological and histological findings in

an animal model of an antigen specific gut

inflammatory reaction (IBD model).

The serum D-xylose absorption test

consists in a standard method of

diagnosing small intestinal bowel

malabsorption in humans (Ehrenpreis et

al., 2001). In the literature, there are few

studies describing the use of D-xylose in

rats and mice, and they are related to

disease models other than IBD, such as

trauma hemorrhage, sepsis (Singh et al.,

1991) and iron-deficiency anemia (Wayhs

et al., 2004).

As observed in a prior study (Antunes et

al., 2007a), our results confirm that

systemic immunization to food antigens

make animals susceptible to the antigen

specific challenge diet, leading to specific

inflammatory bowel disease. As shown

before, this is a convenient tool to study

the evolution of alterations in a chronic

setting. Thus, having at hand an animal

model which mimics chronic human

disease, we decided to evaluate gut

absorption of nutrients, which is a serious

problem in the human IBD setting.

In preliminary reports (Costa, 2005;

Antunes et al., 2007b), we observed that

rats and mice with chronic inflammation of

the gut presented lower D-xylose

absorption than control animals.

Morphometric parameters, which are used

to evaluate gut alterations in chronic gut

inflammation in humans, have been

applied to our animal models (mouse and

rat) demonstrating to be very similar

(Antunes et al., 2007a). Thus, the

following ratios: villi-height/crypt-height,

villi height/width and IEC/IEL have shown

to be good parameters in determining the

intensity of gut inflammation. All three

parameters decrease as the inflammatory

process aggravates (Madi, 2001).

Confirming our hypothesis, as the

histomorphometric ratios observed in

experimental animals decrease (indicative

of a chronic inflammatory process), D-

xylose absorption also decreases, which

implies that inflammation reduces or

impedes D-xylose absorption. Correlating

D-xylose absorption with serological

events, a negative correlation was

observed in animals submitted to the

challenge diet. On the other hand,

sensitized animals that have not yet been

submitted to the challenge diet did not

present the same correlation P>0.05 (data

not shown) indicating that the challenge

diet, which induces the inflammatory

process, is essential for the malabsortion

and is capable of maintaining high

antibody titers over a 30 day period. Thus,

high specific anti-food antibody titers

indicate food allergy, but not necessarily

inflammation of the gut and suggests that

the specific foodstuff should not be a

constituent of the diet of that individual.

In conclusion, our results confirm the

human findings that the D-xylose test is a

useful tool to evaluate intestinal

malabsorption and presents a good

correlation with other diagnostic methods

of IBD. This permits that fewer animals be

used in long experiments in the

understanding of chronic inflammatory

processes of the gut, given that the

animals may be evaluated without having

to euthanize them throughout the

experiments.

ACKNOWLEDGEMENTS

Research supported by CAPES and UFF.

RESUMO

A doença inflamatória intestinal (DII) é

uma doença debilitante e pode ser

provocada por uma resposta imune

inapropriada a alimentos. Recentemente,

o teste de absorção de D-xilose tem sido

usado como ferramenta investigativa para

avaliar a função duodenal em humanos

com DII. Nosso objetivo é analisar a

relação entre o teste de absorção de D-

xilose e achados sorológicos e

histológicos no modelo animal de alergia

ao amendoim/DII. Animais imunizados

com extrato protéico de amendoim e

expostos à dieta desafio contendo

sementes de amendoim (período de

indução da inflamação), receberam uma

gavagem de D-xilose e foram sangrados

após a primeira e a terceira hora para

determinar a concentração deste açúcar.

Segmentos duodenais foram coletados

para determinar o grau de inflamação

intestinal. Nós mostramos que a absorção

de D-xilose correlaciona negativamente

com os títulos de IgG, e positivamente

com os parâmetros morfométricos.

Concluindo, nossos resultados confirmam

que o teste da D-xilose é uma ferramenta

útil para avaliar a má-absorção intestinal e

correlaciona-se bem a outros métodos de

diagnósticos de DII.

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