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Ivy Kiemle Trindade-Suedam
Estudo comparativo dos resultados de enxerto de vidro
bioativo e osso autógeno, associados ou não ao plasma
rico em plaquetas, em seio maxilar de coelho: análise
fractal, densitométrica e histomorfométrica.
Araraquara - SP
2007
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Faculdade de Odontologia de Araraquara
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Ivy Kiemle Trindade-Suedam
Estudo comparativo dos resultados de enxertos de vidro
bioativo e osso autógeno, associados ou não ao plasma
rico em plaquetas, em seio maxilar de coelho: análise
fractal, densitométrica e histomorfométrica.
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Periodontia, da Faculdade
de Odontologia de Araraquara, da
Universidade Estadual Paulista, para
obtenção do título de Doutor em
Periodontia.
Orientadora: Profa. Dra. Gulnara Scaf
Co-orientador: Prof. Dr. Elcio Marcantonio Jr
Araraquara
2007
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Trindade-Suedam, Ivy Kiemle
Estudo comparativo dos resultados de enxertos de vidro
bioativo e osso autógeno, associados ou não ao plasma rico em
plaquetas, em seio maxilar de coelho: análise fractal,
densitométrica e histomorfométrica / Ivy Kiemle Trindade-
Suedam. – Araraquara : [s.n.], 2007.
148 f. ; 30 cm.
Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Odontologia.
Orientador: Profa. Dra. Gulnara Scaf
Co-orientador: Prof. Dr. Elcio Marcantonio Junior
1. Seio maxilar 2. Transplante ósseo 3. Materiais
biocompatíveis 4. Densidade óssea 5. Radiografia
6. Histologia I. Título.
Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley Cristina Chiusoli Montagnoli CRB 8/5646
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP
Ivy Kiemle Trindade-Suedam
Estudo comparativo dos resultados de enxertos de vidro bioativo e osso
autógeno, associados ou não ao plasma rico em plaquetas, em seio
maxilar de coelho: análise fractal, densitométrica e histomorfométrica
COMISSÃO JULGADORA
Tese para obtenção do grau de Doutor
Presidente e Orientador: Profa. Dra. Gulnara Scaf
2º Examinador: Profa. Dra. Maria Lúcia Rubo de Rezende
3º Examinador: Prof. Dr. Eduardo Sant’Ana
4º Examinador: Prof. Dr. Eduardo Hochuli Vieira
5º Examinador: Prof. Dr. Joni Augusto Cirelli
Araraquara, 10 de outubro de 2007
4
DADOS CURRICULARES
Ivy Kiemle Trindade-Suedam
NASCIMENTO 27/01/1977 – Ribeirão Preto
FILIAÇÃO Alceu Sergio Trindade Junior
Inge Elly Kiemle Trindade
1996 – 1999 Curso de graduação
Faculdade de Odontologia de Bauru – USP.
2000 - 2002 Curso de aperfeiçoamento em Cirurgia Bucal
Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais,
Bauru – USP.
2002 - 2004 Curso de pós-graduação em Cirurgia e Traumatologia
Buco-Maxilo-Faciais, nível de Mestrado, pela
Faculdade de Odontologia, São Paulo, USP.
2004 - 2007 Curso de pós-graduação em Periodontia, nível de
Doutorado, pela Faculdade de Odontologia de
Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho”.
5
DEDICATÓRIA
Dedico sinceramente este trabalho...
...ao meu marido Valdey Suedam, que acompanhou de perto cada etapa
deste trabalho e que sempre me estimulou a seguir em frente, mesmo
tendo que abrir mão de minha presença constante por alguns anos.
Você desperta em mim o que tenho de melhor. Tenho certeza que ainda
alcançaremos muitos sonhos além daqueles que já concretizamos juntos.
...aos meus pais, Alceu e Inge, professores da Faculdade de Odontologia
de Bauru, que são para mim os maiores exemplos profissonais que
conheço. Obrigada por torcerem tão firmemente por mim em todas as
etapas de minha vida acadêmica e pessoal, como se cada vitória minha
fosse também de vocês.
...ao meu irmão Sergio Henrique, que com seu olhar atento e tão
carinhoso esteve presente, mesmo que de longe, vibrando,
em cada fase da minha vida.
...ao meu irmão Paulo Alceu, aluno de Odontologia, que aguçou em mim
a vontade do saber e me mostrou indiretamente a necessidade da
constante atualização, com suas perguntas e dúvidas intrigantes.
...à minha avó Joana, que sempre comemorou cada volta minha como se
não me visse há anos, mesmo que fizesse apenas alguns dias.
...à minha avó Hannelore, que nos deixou no decorrer deste curso e que
nunca mediu esforços pessoais para chegar aonde eu cheguei.
6
AGRADECIMENTOS ESPECIAS
À Profa. Gulnara Scaf, orientadora deste trabalho, agradeço
imensamente por ter me recebido nesta Faculdade, por ter conduzido
cada passo meu de forma tão competente e criteriosa e por ter apoiado
cada decisão, confiado e acreditado em mim, mostrando, dia a dia, que
eu era capaz de ir além.
Ao Prof. Elcio Marcantonio Jr, co-orientador deste trabalho, pessoa que
consegue reunir em si três características excepcionais: um excelente
professor, um pesquisador de alta qualidade e um primoroso cirurgião,
manifesto aqui toda a minha admiração e o meu reconhecimento.
7
Aos Professores Guilherme Tosoni, Carlos Benatti Neto, Amauri Leite
e Elza Leite, gostaria de manifestar todo o meu agradecimento pela
orientação precisa e ajuda imprescindível para a realização deste estudo.
À Profa. Mirian Aparecida Onofre, que além de professora desta casa, é
também minha prima. Agradeço da forma mais sincera possível, todo o
apoio que recebi, as hospedagens freqüentes e, enfim, o ombro amigo.
À minha querida amiga e companheira de trabalho Juliana Morais, que
fez parte do meu cotidiano em Araraquara, sou grata por dividir comigo
dias de tanto esforço e trabalho, dias tão especias que valeram a pena...
Aos queridos amigos Fábio Leite e Rafael Faeda que me mostraram que
a união de forças torna cada um mais forte.
8
AGRADECIMENTOS
À Profa. Adriana Marcantonio, diretora desta Faculdade, pelo exemplo
de liderança e competência.
À Profa. Marisa Gabrielli e Silvana Perez Orrico, pelas valiosas
sugestões a este trabalho.
Aos amigos Cacá e Patrícia, por me acolherem em sua casa nos passos
finais este trabalho.
Aos ex-alunos de iniciação científica, Mário Verzola e Talita Paquier,
pela precisoa ajuda durante a fase experimental deste trabalho.
Aos funcionários Claudinha, Zé Antônio, Edineide, Marcelo, Ronaldo,
Regina Lúcia, Zezé, Alexandre, Leila, Augusto, Wilson e Celso, que
participaram diretamente e que não mediram esforços para a realização
deste trabalho.
Aos funcionários da pós-graduação Mara, Rosângela, Alexandre e
Flávia, por estarem sempre dispostos a ajudar.
e
Aos professores, funcionários e colegas de pós-graduação do
departamento de Diagnóstico e Cirurgia.
9
“No fundo, a pesquisa é a busca da verdade;
sendo esta difícil de encontrar, como é secularmente conhecido,
não surpreende que poucos se disponham a buscá-la.
Portanto, do pesquisador exige-se que trabalhe pelo amor da verdade,
pela emoção da descoberta...”.
Protásio Lemos da Luz, 2002.
InCor, FMUSP.
10
SUMÁRIO
RESUMO...................................................................................................18
ABSTRACT...............................................................................................19
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................20
2 REVISÃO DA LITERATURA..................................................................23
3 PROPOSIÇÃO.......................................................................................41
4 MATERIAL E MÉTODO.........................................................................43
4.1 Amostra e cronograma de desenvolvimento............................44
4.2 Técnica cirúrgica.......................................................................47
4.3 Preparo do plasma rico em plaquetas......................................58
4.4 Obtenção e análise das imagens radiográficas........................65
4.5 Processamento e análise das peças anatômicas.....................72
4.6 Análise estatística.....................................................................76
5 RESULTADO..........................................................................................77
6 DISCUSSÃO........................................................................................101
7 CONCLUSÃO.......................................................................................120
8 REFERÊNCIAS....................................................................................122
9 ANEXOS...............................................................................................133
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Divisão de grupos.................................................................................46
Figura 2: Área de acesso ao seio maxilar e da área doadora do enxerto, após
tricotomia e antissepsia........................................................................................48
Figura 3: Seqüência cirúrgica de acesso ao seio maxilar....................................50
Figura 4 – Diagrama indicando o local de osteotomia para confecção da janela
óssea para acesso ao seio maxilar......................................................................51
Figura 5 – Diagrama indicando a loja enxertada do seio maxilar (“b” e “p”) e
outras lojas anatômicas do mesmo seio maxilar (“rs” e “sc”). “nc” corresponde à
cavidade nasal.....................................................................................................52
Figura 6: Esqueleto de coelho ilustrando o osso ilíaco........................................54
Figura 7: Procedimento cirúrgico para obtenção do osso autógeno: exposição
(A), remoção (B) e aspecto final (C) do osso ilíaco no momento da obtenção do
enxerto.................................................................................................................55
Figura 8: Osso autógeno proveniente do ilíaco no triturador ósseo.....................56
Figura 9: Perioglas
®
(Novabone products, llc, Alachua, Florida 32615): frascos
esterilizados de 0,5 cc cada (A) e material hidratado em solução salina
(B).........................................................................................................................57
Figura 10: Seqüência da coleta sangüínea: animal posicionado em dispositivo
para contenção (A), vacutainer
®
, escalpe e seringa para a coleta sangüínea (B);
punção da veia auricular (C); sangue coletado em tubo com acd-a,
homogenizado manualmente (D).........................................................................60
Figura 11: Seqüência laboratorial de preparo do plasma rico em plaquetas:
máquina Coulter t – 890 para contagem dos elementos figurados do sangue (A);
coleta de pequena amostra de sangue para contagem (B); centrífuga hermle (C);
vista interna da centrífuga (D)..............................................................................62
Figura 12: Seqüência laboratorial de obtenção do plasma rico em plaquetas:
separação entre plasma e glóbulos vermelhos após 1ª centrifigação (A);
pipetagem do plasma para nova centrifugação em tubo plástico (B); tubo
esquerdo: plasma após 2ª centrifugação e tubo direito: plasma pobre em
plaquetas (C); plasma rico em plaquetas (D); osso autógeno associado ao
plasma rico em plaquetas (E); vidro bioativo associado ao plasma rico em
plaquetas (F)........................................................................................................64
Figura 13: Seqüência de procedimentos para a tomada radiográfica: peça
anatômica contendo o seio maxilar posicionada sobre o filme (A); filme e peça
acondicionados no posicionador radiográfico (B); imagem radiográfica do seio
12
maxilar e da escala de alumínio, utilizada para a aferição da densidadde óssea
(C)........................................................................................................................66
Figura 14: Seqüência para obtenção das imagens para a análise radiográfica:
seleção da região de interesse (RI) em vermelho e região controle (RC) em
amarelo (A); RI (B) e RC (C) prontas para análise da densidade óssea
radiográfica...........................................................................................................68
Figura 15: Seqüência de manipulação da região de interesse (RI) para a
determinação da dimensão fractal: RI selecionada da imagem original (A);
imagem binária (IB) da RI (B); imagem esqueletizada (IE) da IB (C); imagem
invertida da IE (D)................................................................................................70
Figura 16: Seleção da região de interesse na lâmina histológica (em vermelho):
tábua óssea vestibular (1); processo alveolar (2); cortical palatina (3); membrana
sinusal (4).............................................................................................................75
Figura 17: Valores da densidade óssea radiográfica, expressos em milímetros
equivalentes de alumínio, na regiãos de interesse (enxertada) e região controle
(vazia), nos quatro tratamentos (OA, VB, OA+PRP e VB+PRP). Os traços
horizontais representam o valor mediano (Me), o 1º e 3º quartis (Q1 e Q3) e os
valores máximo (máx) e mínimo (mín) observados, desconsiderando os valores
discrepantes (pontos) identificados conforme critério estabelecido por Tukey
(1977)...................................................................................................................80
Figura 18: Valores da dimensão fractal, compreendidos entre 1 e 2, na região de
interesse (enxertada) e região controle (vazia), nos quatro tratamentos (OA, VB,
OA+PRP e VB+PRP). Os traços horizontais representam o valor mediano (Me),
o 1º e 3º quartis (Q1 e Q3) e os valores máximo (máx) e mínimo (mín)
observados, identificados conforme critério estabelecido por Tukey
(1977)...................................................................................................................83
Figura 19: Diferença média dos valores de densidade óssea radiográfica e
dimensão fractal entre a região enxertada e a região vazia, nos quatro
tratamentos (OA, VB, OA+PRPe VB+PRP). Os traços horizontais representam o
valor mediano (me), o 1º e 3º quartis (q1 e q3) e os valores máximo (máx) e
mínimo (mín) observados, desconsiderando os valores discrepantes (pontos)
identificados conforme critério estabelecido por Tukey (1977)............................85
Figura 20: Valores da histométrica, expressos em % de preenchimento ósseo,
nos quatro tratamentos (OA, VB, OA+PRP e VB+PRP). Os traços horizontais
representam o valor mediano (Me), o 1º e 3º quartis (Q1 e Q3) e os valores
máximo (máx) e mínimo (mín) observados, desconsiderando os valores
discrepantes (pontos) identificados conforme critério estabelecido por Tukey
(1977)...................................................................................................................87
Figura 21: Correlações estimadas entre as variáveis densidade óssea
radiográfica, dimensão fractal e histometria nos quatro tratamentos (OA, VB,
OA+PRP e VB+PRP)...........................................................................................88
13
Figura 22: Corte histológico de um seio maxilar de coelho enxertado com osso
autógeno, corado com Tricrômio de Masson.......................................................90
Figura 23: Corte histológico de um seio maxilar de coelho enxertado com osso
autógeno, corado com Tricrômio de Masson: vasos sangüíneos (1), osteócitos
(2), canais de Havers (3)......................................................................................91
Figura 24: Corte histológico de um seio maxilar de coelho enxertado com vidro
bioativo. Corado com Tricrômio de Masson.........................................................93
Figura 25: Corte histológico de um seio maxilar de coelho enxertado com vidro
bioativo. Corado com Tricrômio de Masson: partículas do vidro bioativo (1),
tecido conjuntivo fibroso (2), espaço medular amplo (3)......................................94
Figura 26: Corte histológico de um seio maxilar de coelho enxertado com uma
combinação de osso autógeno e prp, corado com Tricrômio de Masson............96
Figura 27: Corte histológico de um seio maxilar de coelho enxertado com uma
combinação de osso autógeno e prp, corado com Tricrômio de Masson: linha de
revrsão mostrando a divisão do osso pré-existente com o osso neoformado (1),
espículas ósseas (2), espaços medulares amplos (3), canais de Havers (4)......97
Figura 28: Corte histológico de um seio maxilar de coelho enxertado com uma
associação de vidro bioativo e prp, corado com Ticrômio de Masson.................99
Figura 29: Corte histológico de um seio maxilar de coelho enxertado com uma
associação de vidro bioativo e prp, corado com Tricrômio de Masson: trabécula
óssea fina e alongada (1), partícula do biomaterial (2), medular adiposa (3)....100
14
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Grupos experimentais..........................................................................45
Tabela 2: Protocolo desenvolvido para obtenção do PRP...................................63
Tabela 3: Valores individuais e médios (desvio padrão) do número de elementos
figurados no sangue venoso (SV) e no plasma rico em plaquetas (PRP) e
porcentagem de aumento (PA) de plaquetas no PRP relativamente ao SV, nos
animais tratados com a combinação de osso autógeno+PRP e vidro
bioativo+PRP.......................................................................................................78
Tabela 4: Valores individuais e médios de densidade óssea radiográfica, da
região de interesse (RI) e da região controle (RC), em milímetros equivalentes de
alumínio, nos quatro tratamentos: osso autógeno (OA), vidro bioativo (VB),
OA+PRP e VB+PRP............................................................................................79
Tabela 5: Comparação entre os valores médios (desvio padrão) de densidade
óssea radiográfica, expressos em milímetros equivalentes de alumínio, nas
regiões de interesse (RI) e regiões controle (RC), nos quatro tratamentos: osso
autógeno (OA), vidro bioativo (VB), OA+PRP e VB+PRP...................................81
Tabela 6: Valores individuais e médios de dimensão fractal, da região de
interesse (RI) e da região controle (RC), que podem variar de 1 a 2, nos quatro
tratamentos: osso autógeno (OA), vidro bioativo (VB), OA+PRP e VB+PRP......82
Tabela 7: Comparação entre os valores médios (desvio padrão) de dimensão
fractal, compreendidos entre 1 e 2, nas regiões de interesse (RI) e regiões
controle (RC), nos quatro tratamentos: osso autógeno (OA), vidro bioativo (VB),
OA+PRP e VB+PRP…………………………………………………………………..84
Tabela 8: Valores individuais da quantidade de osso aferida pela histometria,
expressa em porcentagem de osso presente. Cada valor representa a média das
medidas feitas em 3 cortes de cada seio maxilar, nos quatro tratamentos: osso
autógeno (OA), vidro bioativo (VB), OA+PRP e VB+PRP...................................86
Tabela 9: Comparação entre os valores médios (desvio padrão) da histometria,
expressos em porcentagem de preenchimento ósseo, nos quatro tratamentos:
osso autógeno (OA), vidro bioativo (VB), OA+PRP e VB+PRP...........................87
15
LISTA DE ABREVIATURAS
ACD-A - adenina citrato dextrose - Fórmula A
ACS – esponja de colágeno absorvível
BMP - proteína óssea morfogenética
.bmp - bitmap format
C - coelho
CaCl
2
- cloreto de cálcio
CaO – óxido de cálcio
cc – centímetros cúbicos
cm – centímetro
DF - dimensão fractal
DO – densidade óssea radiográfica
dp – desvio padrão
dpi – pontos por polegada
EDTA - ácido etilenodiaminotetracético
EGF – fator de crescimento endotelial
EqAl – equivalentes de alumínio
EVGF - fator de crescimento endotelial vascular
FGF – fator de crescimento fibroblástico
FOAr – Faculdade de Odontologia de Araraqauara
G - grupo
g – grama
HU – Hounsfield unit
IB – imagem binária
IE – imagem esqueletizada
IGF - fator de crescimento semelhante à insulina
IL - interleucina
IKTS - Ivy Kiemle Trindade-Suedam
JANDM - Juliana Aparecida Najarro Dearo de Morais
kg - kilograma
kVp - kilovoltagem
LD - lado direito
LE - lado esquerdo
16
mA – miliamper
Me – mediana
mg - miligramas
mL - mililitro
mm
3
– milímetros cúbicos
µL – microlitros
µm - micrômetros
Na
2
O - sódio
OA - osso autógeno
P
2
O
5
– pentóxido de fósforo
PA – porcentagem de aumento
PAF – fator de ativação plaquetária
PDGF - fator de crescimento derivado das plaquetas
PPP – plasma pobre em plaquetas
PRP - plasma rico em plaquetas
PVPI – polivinilpirrolidona iodo
Q - quartil
r - coeficiente de correlação
RC – região controle
rhBMP-2 - proteína óssea morfogenética recombinante humana
RI – região de interesse
rpm - rotação por minuto
SiO
2
- dióxido de sílica
SM - seio maxilar
SMD - seio maxilar direito
SME - seio maxilar esquerdo
SV – sangue venoso
TGF - fator de crescimento de transformação
TIFF - tagged image file format
VB - vidro bioativo
vs – versus
x - média
17
Apoio financeiro: CAPES
18
Trindade-Suedam IK. Estudo comparativo dos resultados de enxertos de
vidro bioativo e osso autógeno, associados ou não ao plasma rico em
plaquetas, em seio maxilar de coelho: análise fractal, densitométrica e
histomorfométrica [Tese de Doutorado]. Araraquara: Faculdade de
Odontologia da UNESP; 2007.
Resumo
O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da associação de osso
autógeno (OA) e de vidro bioativo (VB) ao plasma rico em plaquetas (PRP) como
substitutos ósseos no interior de seios maxilares (SM) de coelhos, por meio de
análise radiográfica da densidade óssea e da dimensão fractal e análise
histomorfométrica. Adicionalmente, pretendeu-se validar os métodos da
densidade óssea e dimensão fractal como indicadores da neoformação óssea.
Para tanto, 20 coelhos divididos em dois grupos (G1 e G2) foram submetidos à
cirurgia de levantamento de SM. No G1, 10 SM esquerdos foram enxertados
com OA e 10 SM direitos com VB. No G2, 10 SM esquerdos foram enxertados
com uma combinação de OA+PRP e 10 SM direitos com VB+PRP. Após 90 dias,
os animais foram sacrificados e radiografias padronizadas dos SMs foram
obtidas. Os valores médios (desvio padrão) da densidade óssea, expressa em
milímetros equivalentes de alumínio, para os tratamentos OA, VB, OA+PRP e
VB+PRP foram, respectivamente, 1,79(0,316), 2,04(0,398), 1,61(0,285) e
1,53(0,309), sendo que diferenças estatisticamente significantes (p<0,05) foram
encontradas entre os valores de VB e OA, e, VB+PRP e VB. Na dimensão
fractal, os valores encontrados, que podem variar de 1 a 2, foram 1,48(0,040),
1,35(0,084), 1,44(0,043) e 1,44(0,066), respectivamente. Diferenças significantes
(p<0,05) foram encontradas entre os valores de VB e OA, e, OA+PRP e VB. Na
histometria, expressa em porcentagem de preenchimento ósseo, os valores
obtidos foram 63,30±8,609, 52,65(10,415), 55,25(7,018) e 51,07(10,255),
respectivamente. Não foram encontradas diferenças estatísticas entre os
tratamentos. Não houve correlação estatisticamente significante entre as
variáveis densidade óssea, dimensão fractal e porcentagem de osso. Na análise
histológica dos SM tratados com OA observou-se tecido ósseo neoformado,
ricamente vascularizado e celularizado, preenchendo quase que a totalidade do
SM. Nos demais tratamentos, na maioria dos casos, foram observadas
trabéculas ósseas neoformadas que raramente se conectavam entre si, com
espaços medulares amplos. Não se observou a presença de células
inflamatórias na região. Nos grupos tratados com VB e VB+PRP, observou-se
fragmentos do biomaterial. Frente a estes achados, conclui-se que: 1) os
melhores resultados foram alcançados com o OA, nas análises
histomorfométrica e radiográfica, em relação ao VB ou à associação destes
materiais com o PRP, devendo, portanto, o OA ser considerado o material de
escolha para a enxertia do seio maxilar; 2) a densidade óssea radiográfica e a
dimensão fractal, em função das limitações observadas, devem ser utilizadas
como métodos complementares na análise dos resultados cirúrgicos.
Palavras-chave: Seio maxilar; transplante ósseo; densidade óssea; radiografia
19
Trindade-Suedam IK. Outcomes of bioactive glass and autogenous bone,
associated or not with platelet-rich plasma, in the augmentation of the
rabbit maxillary sinus: fractal, densitometric and histomorphometric
analysis. [Tese de Doutorado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da
UNESP; 2007.
Abstract
The objective of the present study was to evaluate the use of autogenous bone
(AB) and bioactive glass (BG) and the association of these materials with
platelet-rich plasma (PRP), as bone substitutes in the rabbit maxillary sinus (MS)
by means of radiographical bone density and fractal dimension and by
histomorphometrical analysis. In addition, the study aimed at validating the two
radiographic methods as indicators of bone formation. Twenty rabbits divided into
two groups (G1 and G2) were submitted to sinus lift surgery. In G1, 10 left MS
were grafted with AB and 10 right MS were grafted with BG. In G2, 10 left MS
were grafted with AB+PRP and 10 right MS were grafted with VB+PRP. Ninety
days after, the animals were sacrificed and standardized radiographs were taken.
Mean values (standard deviation) of bone density, expressed as aluminium
equivalent milimeters, in MS grafted with OA, VB, OA+PRP and VB+PRP were
1,79±0,316, 2,04±0,398, 1,61±0,285 and 1,53±0,309, respectively. Statistically
significant differences (p <0,05) were observed in bone density between BG and
AB, and between BG+PRP and BG. Mean values of fractal dimension, which can
vary from 1 to 2, were 1,48±0,040, 1,35±0,084, 1,44±0,043 and 1,44±0,066,
respectively. Significant differences were observed between BG and AB and
AB+PRP and BG. Mean values of percentage of bone inside MS, assessed by
histometrical analysis were, respectively, 63,30±8,609, 52,65±10,415,
55,25±7,018 and 51,07±10,255. Differences were not statistically significant. No
correlations were observed among bone density, fractal dimension and
percentage of bone. Histological analysis showed that MS treated with AB
presented newly formed and mature lamellar bone, with active bone formation
presenting several vessels and osteoblasts. The other groups showed minor
bone formation, with a diffuse marrow and thin network of newly formed
trabeculae. Inflammatory cells were not observed. In the MS grafted with BG,
fragments of the biomaterial were also observed. In conclusion, AB achieved
better results in relation to BG, AB+PRP and BG+PRP, as assessed by
radiographic and histomorphometrical analysis, and therefore should be
considered the gold-standard material for maxillary sinus augmentation. Due to
the limitations observed, bone density and fractal analysis should be used as
complementary methods for the assessment of surgical results.
Keywords: Maxillary sinus; bone transplantation; biomaterials; bone density;
radiography; histology.
20
1 Introdução
21
1 Introdução
Desde a descoberta do fenômeno biológico da osseointegração
por Per-Ingvar Brånemark
15
na década de 50 até os dias atuais, os
implantes osseointegráveis tornaram-se procedimento de rotina no
tratamento odontológico devido à sua alta previsibilidade. O sucesso
clínico dos implantes vem proporcionando um aumento do número de
pacientes desdentados reabilitados tanto em relação à estética como à
função mastigatória
1,32
.
Entretanto, alguns casos são considerados críticos para a
reabilitação como a região posterior da maxila edêntula que apresenta
freqüentemente uma acentuada diminuição da quantidade de osso em
decorrência da atrofia do processo alveolar e da pneumatização do seio
maxilar, impossibilitando a instalação de implantes
10,39,98
.
A cirurgia de levantamento da membrana do seio maxilar, com a
interposição de enxerto ósseo entre esta membrana e o assoalho do seio,
é um procedimento que foi introduzido por Boyne, James
13
(1980) e que
tem sido empregado rotineiramente para viabilizar a colocação dos
implantes osseointegráveis
54,86
. Seu objetivo primordial é corrigir a
deficiência em altura de tecido ósseo, permitindo assim a instalação de
implantes com comprimento adequado
11
.
Diversos biomateriais, de origem natural ou sintética, estão
disponíveis para enxerto tais como o osso bovino, o osso humano
22
homógeno, o plasma rico em plaquetas, a hidroxiapatita e o vidro bioativo;
porém, o osso autógeno é ainda considerado o material de escolha para o
preenchimento de seios maxilares
14,89
.
A avaliação radiográfica da região enxertada representa o mais
importante passo no controle pós–operatório das cirurgias de
levantamento de seio maxilar. Diversos métodos de avaliação vêm sendo
utilizados como a análise fractal, análise da densidade, da textura e a
subtração radiográfica digital, que permitem uma aferição objetiva do
processo de integração do enxerto, indicando o sucesso ou insucesso da
cirurgia realizada
8,14,28,69,76,91,101
.
Considerando que não foram encontrados estudos prospectivos
controlados que tenham investigado o uso do vidro bioativo e sua
associação ao plasma rico em plaquetas (PRP) no interior do seio maxilar,
e que tenham estabelecido parâmetros objetivos, como a dimensão fractal
ou a densidade, indicativos da neoformação óssea neste tipo de cirurgia,
foi nosso objetivo avaliar por meio de análise radiográfica e
histomorfométrica, o desempenho do vidro bioativo e do PRP em relação
ao osso autógeno, procurando consolidá-los ou não como uma nova
opção de tratamento para a reconstrução de rebordos maxilares
reabsorvidos e a futura reabilitação protética por meio de implantes
osseointegráveis.
23
2 Revisão da literatura
24
2 Revisão da literatura
2.1 Osso autógeno e biomateriais
Até o presente momento, o osso autógeno é considerado o
material de escolha para cirurgias de reconstrução do processo
alveolar
11,14,92,89
por apresentar propriedades biológicas tais como
osteoindução e osteocondução, além de trazer diretamente para a área
receptora, um aporte considerável de células osteogências.
Apesar dos excelentes índices de sucesso clínicos descritos na
literatura, confere-se ao osso autógeno algumas limitações clínicas, quais
sejam, disponibilidade de pouco volume em áreas doadoras intrabucais,
criação de um segundo sítio cirúrgico para obtenção do enxerto, aumento
do tempo cirúrgico e maiores desconforto e morbidade no trans e pós-
operatórios, principalmente em se tratando de áreas doadoras
extrabucais
9,21,14,58,59,62,68
.
Assim, em decorrência destas características indesejáveis
referentes ao osso autógeno, o desenvolvimento de novos materiais que
o substituam assume um papel de destaque na literatura. Neste sentido,
vários autores
11,26,35,44,50,53,95,104,109
vêm estudando a associação do osso
autógeno a diferentes tipos de biomateriais ou, até mesmo, o emprego
isolado destes enxertos tais como o osso homógeno, o osso heterógeno,
cerâmicas a base de fosfato de cálcio, as hidroxiapatitas e os vidros
25
bioativos em diferentes sítios cirúrgicos, com o objetivo de diminuir a
quantidade de osso necessária para a cirurgia. Estes estudos têm
demonstrado boa previsibilidade e bons resultados em longo prazo.
Outras vantagens dos biomateriais compreendem: o alto grau de
biocompatibilidade com o hospedeiro, a ausência de toxicidade, o fato de
não desencadearem reação inflamatória expressiva, de serem passíveis
de esterilização, o baixo ou o nulo índice de transmissão de doenças, a
radiopacidade, a facilidade de obtenção e o custo acessível
41
.
Dentre os biomateriais de origem sintética utilizados para enxertia
do seio maxilar, encontram-se as cerâmicas derivadas de fosfato de
cálcio, tais como as hidroxiapatitas, o β-fosfato tricálcio e o vidro bioativo.
2.2 Vidro Bioativo
O biovidro uma cerâmica sintética composta, em peso, por 45% de
SiO
2
, 24,5% de CaO, 24,5% de Na
2
O e 6% de P
2
O
5
26,37,42,78
. É um
material biocompatível
43
, atóxico
108
, reabsorvível
26
, radiopaco
83
, apresenta
propriedades osteocondutoras
26,48,78
, hemostáticas
42,78
e antimicrobiana
4,5
além de promover uma forte união química com o osso, sua principal
característica
78-80
.
É assim chamado, pois, ao entrar em contato com fluidos corporais,
sofre um processo de dissolução gradual, tendo como resultado uma
interação bioquímica com células e tecidos
38,52,78-80
. Com o processo
26
corrosivo, uma troca de íons com o meio se inicia e uma camada
superficial ricamente constituída por moléculas de cálcio e fósforo é
formada, assim como uma subcamada localizada no centro das
partículas, que é composta por alta concentração de sílica
78
.
Com a continuação do processo bioquímico, ocorre uma quebra da
estrutura externa de cálcio e fósforo e o interior da partícula, preenchida
por um gel de sílica torna-se exposta ao meio externo e é reabsorvida por
fagócitos presentes nos arredores da partícula. Em seguida, células
osteoprogenitoras reconhecem as paredes internas formadas por cálcio e
fósforo como um ambiente semelhante ao tecido ósseo, aderem-se à
essa estrutura e se diferenciam em osteoblastos, levando à formação de
ilhas de osso neoformado, que irá se conectar com o osso pré-existente
ao redor da partícula
52
. Esta conformação estrutural das partículas de
vidro que se ligam firmemente à apatita óssea
42
é denominada de dupla
camada ou dupla estrutura
78
.
Schepers et al.
78
(1991) demonstraram por meio de análise química,
que as partículas de vidro bioativo, quando implantadas em defeitos
ósseos em mandíbula de cães, apresentavam após 1 mês conexão do
centro com o meio externo por meio de pequenos túbulos que, na
presença de macrófagos, células mesenquimais indiferenciadas e
fibroblastos, levavam a uma gradual desintegração e escavação de seu
centro. Após 2 meses, os núcleos das partículas apresentaram-se
povoados por osteoblastos, podendo-se notar a presença de tecido
27
osteóide e tecido ósseo calcificado tanto no interior como ao redor das
partículas. Aos 3 meses, toda a massa de material encontrava-se
envolvida por osso neoformado e no centro das partículas já era possível
notar a presença de tecido ósseo maduro.
Em estudos in vitro
4,5,85
nos quais se investigou os possíveis efeitos
do biovidro sobre bactérias comumente encontradas na cavidade bucal,
foi observado que, tanto as bactérias supragengivais como as
subgengivais tais como Streptococcus sanguis, Streptococcus mutans,
Actinomyces viscosus, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium
nucleatum, Prevotella intermedia e Agregatibacter
actinomycetemcomitans tornaram-se inviáveis na presença de uma
solução de vidro bioativo, sugerindo o potencial antimicrobiano deste
material. De acordo com os autores, isto se deve ao fato de que, em um
ambiente aquoso, o vidro bioativo libera íons Ca
2+
, Na
+
, PO
4
(3-)
, e Si
4+
,
resultando em um aumento do pH e, conseqüentemente, alterando a
viabilidade destes microorganismos. Por este motivo, este biomaterial foi
considerado uma opção para enxertia de defeitos ósseos periodontais e
de seios maxilares, regiões anatômicas que freqüentemente são
colonizadas por alguns desses organismos.
Quanto ao uso do vidro bioativo em seios maxilares, Tadjoedin et
al.
87
(2000) avaliaram por meio de análise histomorfométrica o
comportamento de uma mistura de osso autógeno/biovidro (1:1) em
pacientes submetidos à cirurgia de levantamento bilateral do seio maxilar.
28
Seus resultados demonstraram que as biópsias obtidas do local de
instalação dos implantes eram compostas, aos 6 meses, por partículas de
vidro em processo ativo de reabsorção envoltas por tecido ósseo
trabecular neoformado, sem a presença de células inflamatórias. Aos 16
meses o que se pode notar foi, exclusivamente, a presença de tecido
ósseo maduro sem evidências de partículas do vidro bioativo no local.
Turunen et al.
96
(2004), estudando as propriedades do vidro
bioativo associado ao osso autógeno enxertado em seios maxilares de
humanos, observaram na análise histomorfométrica que, após 1 ano, as
biópsias eram compostas por osso trabecular maduro e por tecido
osteóide, além da presença de células hematopoiéticas, tanto no grupo de
vidro + osso autógeno como no grupo controle (osso apenas). Frente a
estes resultados favoráveis, o vidro bioativo tem sido objeto de intensa
investigação como substituto ósseo em cirurgias periodontais e em
cirurgias de reconstrução óssea
26,88,98
.
Neste contexto, Fetner et al.
31
(1994) desenvolveram um estudo
clínico para investigar o comportamento do vidro bioativo em defeitos
periodontias criados cirurgicamente em macacos e concluíram que o
material foi capaz de aderir firmemente ao osso, viabilizando o
restabelecimento do ligamento periodontal, impedindo a formação de
epitélio juncional longo e, portanto, favorecendo a reinserção das fibras do
ligamento periodontal em níveis normais.
29
Comparando o uso de uma membrana reabsorvível com o vidro
bioativo em defeitos ósseos periodontais de 1 a 3 paredes, de pacientes
com periodontite agressiva generalizada, Mengel et al.
65
(2003),
demonstrou que, após 12 meses, houve uma redução na profundidade de
sondagem e um ganho de inserção significativos em ambos os grupos,
demosntrando que tanto o vidro bioativo como o uso de membranas para
recobrimento dos defeitos constituem boas opções de tratamento para
regeneração periodontal.
Estudos desenvolvidos por pesquisadores deste
departamento
18,19,30
, investigaram o vidro bioativo em diferentes situações
clinicas. Cancian et al.
18
(2004) compararam o osso autógeno e o vidro
bioativo (FillerBone
e PerioGlas
) como materiais para preenchimento de
defeitos ósseos cirurgicamente criados em mandíbulas de macacos e
concluiu que o biovidro apresentou potencial de reparação similar ao osso
autógeno, com reabsorção quase que total do material após 180 dias e
substituição por tecido ósseo neoformado, comprovando por meio de
análise histológica sua atividade ostecondutora.
Já, Fernandes et al.
30
(2005), utilizando vidro bioativo e membrana
de colágeno em defeitos de furca grau III em cães, mostraram um
preenchimento parcial das furcas com regeneração óssea e cementária
limitadas à porção apical das mesmas. Por fim, Cardoso et al.
19
(2006)
estudaram o uso de duas formas de vidro bioativo (Biogran
®
e
PerioGlas
®
), com diferentes tamanhos de partículas, em defeitos críticos
30
em calvária de ratos. Por meio de analise histomorfométrica, os autores
puderam observar após um período de 60 dias, neoformação óssea
apenas nas margens do defeito e a presença de tecido conjuntivo fibroso
ao redor das partículas de ambos os materiais.
2.3 Plasma Rico em Plaquetas (PRP)
As plaquetas, células formadas na medula óssea a partir dos
megacariócitos, juntamente com os eritrócitos e leucócitos, fazem parte
do conjunto de células que compõem o sangue. Dentre suas funções,
duas se destacam: 1) início do processo de hemostasia, ao formarem um
tampão, viabilizando a formação do coágulo e 2) liberação de fatores de
crescimento, que auxiliam o processo de reparo dos tecidos
60, 63
.
O plasma rico em plaquetas, introduzido na comunidade científica
por Whitman et al.
108
(1997) é um concentrado de células, obtido pelo
processo de centrifugação do sangue autógeno, e que tem sido
amplamente utilizado nas diversas áreas da Medicina e da Odontologia
desde então
6,20,34,56,60,61,64,71,72,75,90,110
.
O uso do PRP é baseado na premissa de que um elevado número
de plaquetas libera quantidades significativas de fatores de crescimento,
que são proteínas responsáveis por regularem processos celulares tais
como mitose, quimiotaxia, diferenciação, metabolismo, produção de
31
colágeno e proliferação vascular, acelerando o processo de formação e
de maturação ósseas
24,56,57,108
.
Em contato com os fluidos corpóreos, as plaquetas sofrem o
processo de ativação ou degranulação, que consiste na liberação destes
fatores de crescimento presentes em grânulos secretórios especializados,
os grânulos α
77,103
. Entre eles podemos citar o fator de crescimento
derivado das plaquetas (PDGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF),
fator de crescimento epitelial (EGF), fator de crescimento semelhante à
insulina (IGF), fator de crescimento de transformação (TGF) beta 1 e beta
2, fator de crescimento endotelial vascular (EVGF), interleucinas-1 (IL-1),
e fator de ativação plaquetária-4 (PAF-4)
46,64
.
Dentre os principais benefícios clínicos do uso do PRP estão: maior
densidade óssea radiográfica e histológica
64
, instalação e ativação
precoces do implante bem como uma maior previsibilidade do
tratamento
63
. Por estas razões, tornou-se prática comum em pesquisas
clínicas a associação do PRP aos diferentes materiais para reconstrução
óssea com o intuito de se investigar os reais benefícios do concentrado
de plaquetas
6,7,20,34,36,56,60,61,63,71,72,74,75,77,82,90,110
.
Em se tratando da obtenção e emprego do PRP em coelhos, três
trabalhos constituíram o ponto de partida para a realização deste
estudo
2,17,29
. Cada qual descrevia diferentes metodologias para obtenção
do PRP que variavam quanto ao volume de sangue coletado, às
velocidades e quantidades de centrifugação, aos diferentes
32
anticoagulantes, às substâncias para geleificação do PRP, bem como os
diferentes resultados referentes às contagens celulares.
Ademais, nenhum dos estudos faz referência aos cuidados
necessários para a obtenção de um concentrado de plaquetas com
reduzida contaminação leucocitária a qual pode estimular o aumento do
número de células inflamatórias na ferida cirúrgica, e com a ativação
plaquetária precoce, viabilizando a ação dos fatores de crescimento
exclusivamente no leito cirúrgico. Por este motivo, foi objetivo deste
trabalho descrever um novo protocolo para obtenção de PRP em coelhos
com estes requisitos não considerados pelos protocolos descritos na
literatura.
Aghaloo et al.
2
(2002) coletaram 10mL de sangue venoso autógeno
em tubo contendo 1,1mL de anticoagulante ACD-A e submeteram esta
amostra a 2 centrifugações sendo que a 1ª foi realizada a 215g por 10
minutos e, após a separação do plasma, este foi novamente centrifugado
a 863g por 10 minutos. A metade superior formada no tubo foi
desprezada por ser considerada um plasma pobre em plaquetas (10.000
– 50.000/mm
3
)
e a metade inferior do tubo resultou no plasma rico em
plaquetas (625.000 – 1.495.000/mm
3
). Foi acrescentada ao PRP uma
solução de trombina bovina 5000 unidades e 5mL CaCl
2
a 10%, sendo
que a proporção de cloreto de cálcio com o volume total do plasma foi de
10 PRP:1 CaCl
2.
33
Por sua vez, Efeoglu et al.
29
(2004) descreveram dois protocolos
diferentes sendo que no primeiro os pesquisadores coletaram 9ml de
sangue venoso autógeno em tubo com EDTA. A 1ª centrifugação foi
realizada a 300g por 10 minutos e a camada de eritrócitos foi desprezada
mantendo-se no procedimento o conjunto plasma + “pink” plasma (plasma
com alguns eritrócitos). Na 2ª centrifugação, feita a 5000g por 5 minutos,
somente a metade inferior contida no tubo foi considerada como plasma
rico em plaquetas (1000x10
3
/µl). O segundo protocolo difere do primeiro
ao desprezar os 2/3 superiores do volume de plasma após a 2ª
centrifugação considerando como PRP apenas o terço inferior deste
volume (3134x10
3
/µl).
Butterfield et al.
17
(2005) prepararam o PRP por meio de duas
centrifugações utilizando 21cc de sangue autógeno. Na primeira
centrifugação, os autores submeteram o sangue total a uma velocidade
de 150g por 20 minutos e na segundo centrifugação o plasma foi
centrifugado a 400g por 10 minutos. Após este processo trombina e
cloreto de cálcio a 10% formam adicionados ao PRP. A contagem de
plaquetas alcançada no PRP foi 2061x10
3
/mm
3
.
Assim sendo, a substituição do osso autógeno por biomateriais é
justificada por tornar o procedimento cirúrgico mais simples e de menor
morbidade. No entanto, ainda não está definido qual é o melhor
biomaterial para ser empregado e nem mesmo a sua real eficácia.
Também, ainda há dúvidas em relação à eficácia do PRP, mesmo quando
34
associado ao enxerto ósseo autógeno, pois os trabalhos apresentados na
literatura são, na grande maioria das vezes, relatos de casos e/ou estudos
não controlados.
2.4 Análise radiográfica
De acordo com a Academia Americana de Radiologia Oral e
Maxilofacial, o sucesso no tratamento com implantes osseointegráveis
está relacionado, entre outros, com uma adequada avaliação das
estruturas ósseas onde se planeja instalar os implantes
97
. A análise
radiográfica pré-operatória viabiliza a determinação da presença de
lesões patológicas ou de estruturas anatômicas, a conformação do
processo alveolar e a aferição da qualidade e da quantidade de tecido
ósseo disponível, tornando o tratamento mais previsível e, portanto,
aumentando as chances de sucesso
33,45,97
.
Cortet et al.
27
(2004) afirmaram que a retirada de biópsias ósseas
para avaliação dos resultados pós-operatórios, em cirurgias de enxerto
ósseo prévio à instalação de implantes, constitui um método invasivo e,
portanto, inviável do ponto de vista ético na maioria dos casos. Assim,
métodos não invasivos para a avaliação e caracterização da
microarquitetura óssea se tornam necessários no campo da
Implantodontia.
35
Os recentes avanços da tecnologia na obtenção de imagens
radiográficas médicas e odontológicas, por meio do advento de sistemas
de aquisição digital de imagens radiográficas, fizeram aumentar a
demanda por métodos computacionais que aferissem de forma objetiva
(quantitativa) os fenômenos biológicos relacionados aos procedimentos
cirúrgicos, que antes eram avaliados apenas de forma subjetiva
(qualitativa)
28,45
. Da mesma forma, Tosoni et al.
91
(2005) afirmam que a
possibilidade de manipulação de imagens digitais compreende uma
importante ferramenta para análises objetivas como a densidade óssea e
sua microarquitetura, descrita pela dimensão fractal, métodos utilizados
neste estudo.
2.4.1 Densidade óssea radiográfica
Densidade radiográfica corresponde ao grau de escurecimento do
filme, que depende do poder de penetração dos raios-x nos diversos
tecidos do corpo humano. Assim, as imagens obtidas de um tecido que
têm a capacidade de absorver mais raios-x são mais radiopacas ou mais
densas do que outras partes que absorvem menos raios-x, classificadas
como menos densas ou mais radiolúcidas. Em se tratando de tecido
ósseo, a densidade indica, em última análise, o grau de mineralização ou
calcificação do tecido
14,81,89
.
36
Boyne et al.
14
(2005) desenvolveram um estudo clínico
multicêntrico controlado e randomizado, no qual 48 pacientes foram
submetidos à cirurgias de levantamento de seio maxilar, com enxerto de
diferentes concentrações de proteína óssea morfogenética recombinante
humana (rhBMP-2) ou enxerto ósseo autógeno (OA). Os resultados da
análise histológica descritiva evidenciaram que, 4 meses após a cirurgia,
havia a presença de tecido ósseo maduro nos três grupos, sem diferença
histológica entre eles. Já, a análise tomográfica detectou diferenças
estatisticamente significantes entre os grupos, mostrando que o OA
(350mg/cc) apresentou a maior densidade óssea, seguido do grupo com
1.50mg/mL de rhBMP-2/ACS (134mg/cc) e por fim o grupo com
0.75mg/mL de rhBMP-2/ACS (84mg/cc).
Ao avaliar o efeito do vido bioativo como material de
preenchimento em defeitos ósseos periodontais por meio dos parâmetros
clínicos e radiográficos como a densidade, Zamet et al.
112
(1997)
constataram que, após 12 meses, os valores mais elevados de densidade
foram encontrados nas bolsas enxertadas com Perioglas. Nas bolsas
tratadas apenas com raspagem e nas regiões controle (osso marginal ao
defeito periodontal), os valores de densidade foram menores, sendo estas
diferenças estatisticamente significantes.
Por sua vez, Schultze-Mosgau et al.
81
(2001) avaliaram as
alterações da densidade radiográfica do enxerto ósseo autógeno em
seios maxilares de seres humanos e correlacionaram estes dados com os
37
resultados da análise histomorfométrica de biópsias retiradas do local
onde se instalou implantes. Após 5 meses, os autores observaram que
houve um aumento de densidade da ordem de 76 Hounsfields units (HU)
para o osso enxertado no interior do seio maxilar. Ao mesmo tempo, a
histometria acusou um ganho de 45% de tecido ósseo em relação à
tomografia pós-operatória imediata. Entretanto, as alterações de
densidade mostraram um baixo coeficiente de correlação (0.16) com os
resultados da análise histométrica, indicando que a medida da densidade
radiográfica óssea possui um valor preditivo baixo, devendo ser
reconsiderado como instrumento de avaliação dos resultados pós-
cirúrgicos.
Outros trabalhos que correlacionassem os dados da densidade
com os da análise histomorfométrica, sendo esta última considerada a
metodologia padrão, não foram encontrados.
2.4.2 Dimensão fractal
O segundo método de análise radiográfica empregado neste
estudo, a análise fractal, também descrita como análise da dimensão
fractal, corresponde a um modelo matemático que procura descrever
formas complexas e não usuais da natureza, que não podem ser
mensuradas por fórmulas matemáticas simples ou tradicionais tais como a
38
área de um quadrado ou de um círculo
73,91
. O trabeculado ósseo é um
bom modelo de uma estrutura biológica não comumente mensurável.
Este método de avaliação de padrões estruturais complexos
utiliza uma fórmula matemática cujos resultados situam-se entre 1 e 2,
sendo que 1 corresponde ao valor de uma estrutura que preenche nada
ou praticamente nada de um espaço fixo pré-determinado. Já, quando a
dimensão fractal corresponde a 2, esta estrutura biológica ocupa todo o
espaço disponível de uma região com área pré-determinada
12,22,91,102,111
.
Valores elevados de dimensão fractal, próximos de 2, indicam estruturas
ósseas mais complexas; valores mais próximos de 1 representam
estruturas menos complexas. Entretanto, valores numéricos semelhantes
podem representar estruturas ósseas com padrões microestruturais não
necessariamente iguais
101
.
A análise fractal é um método que tem sido utilizado para o
diagnóstico radiográfico da osteoporose
84,91,101
, para aferir o padrão ósseo
em maxilas edêntulas
99
, para estudar o processo de reparo ósseo em
lesões periapicais após o tratamento endodôntico
23
, após cirurgias
ortognáticas
49
e após a movimentação ortodôntica
106
.
Tosoni et al.
91
(2006), avaliaram a capacidade da análise fractal
em detectar alterações ósseas em radiografias panorâmicas digitais de
mulheres com e sem osteoporose. Seus achados evidenciaram uma baixa
correlação entre os dados da dimensão fractal e a presença ou não da
doença, sugerindo que este método não foi eficaz em detectar as
39
alterações no padrão ósseo de pacientes com osteoporose, condição que
foi detectada pela análise da intensidade de píxel, no mesmo estudo.
Por outro lado, autores como Heo et al.
49
(2002) descreveram
resultados favoráveis na utilização da dimensão fractal em radiografias
panorâmicas digitalizadas para a caracterização do reparo ósseo em
mandíbulas após cirurgias ortognáticas. Seus achados demonstraram que
os valores da dimensão fractal diminuíram imediatamente após a cirurgia
e aumentaram gradativamente de acordo com o passar do tempo (1 e 6
meses). Após um período de 12 meses, os valores da dimensão fractal
foram compatíveis com os do início do experimento, no período pré-
operatório (p<0,05). Assim, os autores sugerem que a dimensão fractal é
um método confiável e efetivo para a avaliação quantitativa do reparo
ósseo em radiografias.
Nair et al.
66
(2001) avaliaram a formação óssea em defeitos
criados cirurgicamente em mandíbulas de coelhos, tratados isoladamente
com uma cultura de osteoblastos, com uma matriz polimérica ou com a
combinação de ambos. Os resultados desta investigação demonstraram
que os defeitos ósseos que exibiram valores altos de dimensão fractal
apresentaram, ao exame histomorfométrico, um padrão ósseo estrutural
complexo, estabelecendo uma alta correlação entre eles (r=0,79;
p<0,001), sugerindo que a análise fractal é um método efetivo para a
quantificação das alterações do padrão ósseo em cirurgias de enxerto
ósseo.
40
Em decorrência dos resultados divergentes quanto à real
capacidade de detecção de variações no padrão estrutural ósseo pela
dimensão fractal e pela densidade radiográfica, é também nosso objetivo
avaliar esta questão.
41
3 Proposição
42
3 Proposição
Objetivo geral:
O presente estudo teve por finalidade avaliar os resultados de
enxertos realizados no interior de seio maxilar de coelhos, utilizando osso
autógeno e vidro bioativo (PerioGlas
), associados ou não ao plasma rico
em plaquetas, por meio de análise histolmorfométrica e de análise
radiográfica da densidade óssea (DO) e da dimensão fractal (DF).
Objetivos específicos:
1- Comparar, por meio de análise histomorfométrica e de análise
radiográfica (DO e DF), os resultados das seguintes modalidades de
enxerto em cirurgias de levantamento do seio maxilar de coelhos:
a. Osso autógeno
x
vidro bioativo
b. Osso autógeno + PRP
x
vidro bioativo + PRP
c. Osso autógeno
x
osso autógeno + PRP
d. Vidro bioativo
x
vidro bioativo + PRP;
2- Validar os dois métodos de análise de imagens radiográficas, DF e
DO, como indicadores da neoformação óssea, por meio de análise
histomorfométrica.
43
4 Material e método
44
4 Material e método
4.1 Amostra e cronograma de desenvolvimento
Para a realização do experimento, foram utilizados 20 coelhos
machos (Nova Zelândia) adultos, com idade média de 28 semanas,
pesando aproximadamente 4kg, (Tabela 1A). A experimentação
animal foi conduzida de acordo com a aprovação pelo Comitê de
Ética em Experimentação Animal/FOAr (Figura 1A).
Os animais foram divididos aleatoriamente em 2 grupos (G1 e
G2), de 10 animais cada, sendo que cada grupo recebeu 2
tratamentos diferentes, um para cada seio maxila. No G1, os seios
maxilares esquerdos foram enxertados com osso autógeno (OA) e os
seios maxilares direitos foram enxertados com vidro bioativo (VB). No
G2, os seios maxilares esquerdos foram enxertados com uma
combinação de osso OA e PRP e os seios maxilares direitos foram
enxertados com uma combinação de VB e PRP (Tabela 1).
Os 10 seios maxilares tratados com OA foram considerados
controle e os demais tratamentos como grupos teste (Figura 1). Após
90 dias, os animais foram sacrificados para análise dos resultados.
45
Tabela 1 - Grupos experimentais
Tratamento
10 seios maxilares esquerdos OA
G1
10 coelhos
10 seios maxilares direitos
VB (PerioGlas
)
10 seios maxilares esquerdos OA + PRP
G2
10 coelhos
10 seios maxilares direitos
VB (PerioGlas
)+ PRP
*G: grupo
OA = osso autógeno
VB = vidro bioativo
PRP = plasma rico em plaquetas
46
FIGURA 1 - DIVISÃO DE GRUPOS.
47
4.2 Técnica cirúrgica
Em cada animal foi realizado o levantamento dos seios maxilares
direito e esquerdo em um único tempo cirúrgico, de acordo com o
protocolo descrito por Watanabe et al.
107
(1999). Para cada seio maxilar
foi designado um operador previamente treinado, totalizando dois
operadores (IKTS e JANDM).
Durante todo o período do experimento, os animais ficaram
alocados em um biotério próprio para coelhos e receberam água e comida
ad libitum, bem como cuidados especializados, quando necessário.
Para a realização das cirurgias, os coelhos receberam anestesia
geral com injeção intramuscular de quetamina a 10% (Ketamina Agener®
– Agener União, Brasil – uso veterinário) na proporção de 0,35ml/kg de
peso corporal, e também sedação e analgesia com injeção intramuscular
de cloridrato de xilasina (Calmium® – Agener União Saúde Animal, Brasil
– uso veterinário) na proporção de 0,25ml/kg de peso corporal (Tabela
2A). Repiques eventuais do anestésico geral e do sedativo foram
realizados com 1/3 da dose inicial (Tabela 3A), quando os animais
mostravam sinais de recuperação dos sentidos no decorrer do ato
cirúrgico. Após a anestesia, realizou-se a tricotomia na porção lateral da
maxila em ambos os lados e na região do osso ilíaco direito, bem como a
antissepsia do campo operatório com iodo – PVPI (Aster – Sorocaba – SP
– Brasil) (Figura2).
48
FIGURA 2 - ÁREA DE ACESSO AO SEIO MAXILAR (A) E DA ÁREA DOADORA
DO ENXERTO (B), APÓS TRICOTOMIA E ANTISSEPSIA.
A
B
49
Antes da incisão inicial, tanto na área de acesso ao seio maxilar
como na área doadora do enxerto ósseo, injetou-se aproximadamente
0,9mL de anestésico local mepivacaína 2% com epinefrina 1:100.000
(Mepiadre, DFL, Rio de Janeiro, RJ - Brasil), para promover uma
vasoconstricção local, facilitando a visualização da área operada.
O acesso cirúrgico ao seio maxilar foi obtido com o animal
posicionado em decúbito lateral, por meio de uma incisão cutânea
seguida de uma incisão muscular, poucos milímetros acima da borda
inferior do osso incisivo e da maxila, com aproximadamente 5 cm de
extensão (Figura 3A). Após a dissecção dos tecidos subcutâneo e
muscular, o periósteo foi incisado e elevado dorsalmente. Sob irrigação
salina constante, foi confeccionada uma janela óssea (Figura 3B) com
uma fresa esférica diamantada com diâmetro de 2mm, na porção lateral
da maxila, com 10mmx10mm, sendo que a osteotomia vertical distal
deveria estar localizada 2mm para mesial do 1º molar
105
, conforme ilustra
a Figura 4. Estas dimensões foram criteriosamente respeitadas para
garantir o acesso à loja mais inferior do seio maxilar, local padronizado
para receber o enxerto, uma vez que o seio maxilar do coelho é composto
por outras lojas
104
, conforme ilustra a Figura 5.
Após a remoção da janela óssea e exposição da membrana
sinusal, foi realizado o levantamento cuidadoso da membrana com
curetas de Lucas (Figuras 3C, 3D e 3E), sendo que a face romba ficou em
50
FIGURA 3 - SEQÜÊNCIA CIRÚRGICA DE ACESSO AO SEIO MAXILAR:
INCISÃO CUTÃNEA E SUBCUTÂNEA (A), CONFECÇÃO DA JANELA ÓSSEA
(B), REMOÇÃO DA JANELA ÓSSEA (C), MEMBRANA SINUSAL EXPOSTA (D),
MEMBRANA SINUSAL ELEVADA (E), ENXERTO POSICIONADO NA
CAVIDADE SINUSAL (F).
A B
C
D
E
F
51
FIGURA 4 – DIAGRAMA INDICANDO O LOCAL DE OSTEOTOMIA PARA
CONFECÇÃO DA JANELA ÓSSEA PARA ACESSO AO SEIO MAXILAR.
* Fonte: Watanabe et al.
107
(1999)
52
FIGURA 5 – DIAGRAMA INDICANDO A LOJA ENXERTADA DO SEIO
MAXILAR (“B” E “P”) E OUTRAS LOJAS ANATÔMICAS DO MESMO SEIO
MAXILAR (“RS” E “SC”). “NC” CORRESPONDE À CAVIDADE NASAL.
* Fonte: Wada et al.
105
(2001)
53
contato com a membrana e a face cortante em contato com a cavidade
óssea, evitando-se assim o rompimento da membrana (Figura 5).
Seguido do levantamento da membrana sinusal, deu-se inicio à
obtenção do osso autógeno sendo que a crista ilíaca direita foi
padronizada como área doadora, de acordo estudo prévio de Watanabe
et al.
107
(1999) (Figuras 6). Para tanto, foi realizada uma incisão cutânea
de aproximadamente 4cm, seguida da incisão muscular até se atingir o
osso ilíaco. Neste momento, procedeu-se o completo descolamento e
exposição da crista ilíaca e a remoção bicortical do enxerto com um
osteótomo (Figuras 7).
O volume de osso autógeno removido correspondeu ao volume
total necessário para um completo preenchimento da cavidade sinusal,
aferida no decorrer da cirurgia. Uma vez removido o enxerto, os
componentes cortical e medular do enxerto foram triturados em um
triturador ósseo rotatório (Neodent, Curitiba, PR - Brasil) (Figura 8) e
imediatamente enxertado no seio maxilar (Figura 3F).
Para os seios maxilares direitos de ambos os grupos, foram
utilizados frascos esterilizados de 0,5cc de PerioGlas
®
(NovaBone
Products, LLC, Alachua, Florida 32615) (Figura 9A) preparados de acordo
coma orientação do fabricante, ou seja, hidratação prévia em solução
salina (G1) (Figura 9B) ou associação ao plasma rico em plaquetas (G2).
A quantidade de biomaterial utilizada foi aquela suficiente para um
completo preenchimento do seio maxilar.
54
FIGURA 6 - ESQUELETO DE COELHO ILUSTRANDO O OSSO ILÍACO.
55
A
B
C
FIGURA 7 - PROCEDIMENTO CIRÚRGICO PARA OBTENÇÃO DO OSSO
AUTÓGENO: EXPOSIÇÃO (A), REMOÇÃO (B) E ASPECTO FINAL (C) DO
OSSO ILÍACO NO MOMENTO DA OBTENÇÃO DO ENXERTO.
56
FIGURA 8 - OSSO AUTÓGENO PROVENIENTE DO ILÍACO NO TRITURADOR
ÓSSEO.
57
A
B
FIGURA 9 - PERIOGLAS
®
(NOVABONE PRODUCTS, LLC, ALACHUA, FLORIDA
32615): FRASCOS ESTERILIZADOS DE 0,5cc CADA (A) E MATERIAL
HIDRATADO EM SOLUÇÃO SALINA (B).
.
58
Tanto a área doadora como o leito receptor foram suturados com
Vicryl 3.0 (Ethicon, Johnson & Johnson
®
) para o plano profundo, com
pontos simples. O plano superficial foi suturado com ponto contínuo de
seda 4.0 (Ethicon, Johnson & Johnson
®
). No pós-operatório imediato
administrou-se para cada animal injeção intramuscular de antibiótico
(Pentabiótico® veterinário – pequeno porte, Fort Dodge, Saúde animal
Ltda, Brasil) na proporção de 0,10mg/kg de peso corporal, uma vez por
dia, por 3 dias (Tabela 2A). Para o controle da dor, foi administrado logo
após a cirurgia paracetamol 100mg/mL (Tylenol Bebê® - JANSEN-CILAG
Farmacêutica, São José dos Campos - SP)., na proporção de 10mg/kg de
peso corporal.
Após 90 dias, os animais receberam uma dose letal de anestésico
geral hidrato de cloral a 40%. Toda a região maxilar foi dissecada e
acondicionada em vidro com solução de formol neutro tamponado a 10%,
pH 7,4 por 48 horas para fixação, em quantidade 30 vezes maior do que o
volume da peça.
4.3 Preparo do plasma rico em plaquetas (PRP)
O estabelecimento de um protocolo próprio para obtenção do
PRP foi realizado em duas etapas: 1) estudo piloto com 6 animais
utilizando diferentes metodologias para o preparo do PRP (Anexo 5) e, 2)
realização do experimento propriamente dito, com a metodologia já
59
estabelecida, nos 10 animais que compuseram a amostra deste estudo e
que receberam enxertos associados ao PRP.
Para se evitar a vasoconstricção periférica decorrente da
anestesia geral que dificultaria a coleta sangüínea, esta foi realizada com
o animal não anestesiado, alocado em uma caixa contensora (Figura
10A). Assim, procedeu-se a coleta de 8mL de sangue autógeno via
punção da veia auricular (Figura 10C) com um dispositivo para infusão
intravenosa (escaple 23G - BD Assepto– Juiz de Fora, MG - Brasil) e
seringa hipodérmica descartável de 10ml (INJEX, Ourinhos - SP - Brasil),
ilustrados na Figura 10B.
A coleta sangüínea foi realizada nos 20 coelhos,
independentemente destes pertencerem ou não ao grupo no qual se
utilizou o PRP, para inferir em todos os animais o mesmo viés.
Imediatamente após a coleta, o sangue venoso foi acondicionado em
tubos Vacutainer® contendo 1000µL de adenina citrato dextrose – fórmula
A (ACD-A) e homogeneizados manualmente, permitindo que o sangue
fosse completamente misturado ao anticoagulante, evitando-se a
coagulação sangüínea e preservando a integridade plaquetária (Figura
10D).
Em seguida, passou-se à fase laboratorial de preparo do PRP, no
Hemonúcleo da Faculdade de Farmácia e Bioquímica, UNESP –
Araraquara. Uma pequena amostra do sangue (0,2ml) foi utilizada para
60
A
B
C
D
FIGURA 10 - SEQÜÊNCIA DA COLETA SANGÜÍNEA: ANIMAL POSICIONADO
EM DISPOSITIVO PARA CONTENÇÃO (A), VACUTAINER
®
, ESCALPE E
SERINGA PARA A COLETA SANGÜÍNEA (B); PUNÇÃO DA VEIA AURICULAR
(C); SANGUE COLETADO EM TUBO COM ACD-A, HOMOGENIZADO
MANUALMENTE (D).
61
contagem computadorizada de células (COULTER t – 890, COULTER
Eletronics, Rio de Janeiro – RJ, Brasil), ilustrada nas Figuras 11A e B. O
sangue total foi submetido a 2 centrifugações em centrífuga Hermle Z380
(Figura 11C) com diâmetro de 16,5cm de o centro de uma caçapa à outra
(Figura 11D).
Na Tabela 2, está descrito o protocolo desenvolvido neste
experimento para a obtenção do PRP em coelhos. A primeira
centrifugação, feita em 302g por 10 minutos, promoveu a decantação dos
leucócitos e eritrócitos, levando estes elementos figurados do sangue
para o fundo do tubo de vidro e o plasma para a porção mais superior
(Figura 12A). O plasma foi coletado com o auxílio de pipetas (BOENCO,
Germany) (Figura 12B) e acondicionado em tubo plástico esterilizado
(Figura 12C). Assim, procedeu-se a segunda centrifugação do soro em
2862g por 5 minutos. Logo após esta etapa, os 2/3 superiores do soro,
designados plasma pobre em plaquetas, foram descartados restando no
tubo o terço inferior, ou plasma rico em plaquetas (Efeoglu et al.
29
, 2004)
(Figura 12D). O botão plaquetário aderido ao fundo do tubo foi suspenso
e homogenizado ao PRP.
Terminada a fase laboratorial, adicionou-se ao PRP o osso
autógeno (Figura 12E) ou ao vidro bioativo (Figura 12F) e uma solução de
cloreto de cálcio (CaCl
2
) a 10% na proporção de 10PRP:2CaCl
2
em
volume, para a geleificação da mistura.
62
A
B
C
D
FIGURA 11 - SEQÜÊNCIA LABORATORIAL DE PREPARO DO PLASMA RICO
EM PLAQUETAS: MÁQUINA COULTER T – 890 PARA CONTAGEM DOS
ELEMENTOS FIGURADOS DO SANGUE (A); COLETA DE PEQUENA
AMOSTRA DE SANGUE PARA CONTAGEM (B); CENTRÍFUGA HERMLE (C);
VISTA INTERNA DA CENTRÍFUGA (D).
63
Tabela 2 - Protocolo desenvolvido para obtenção do PRP
PROTOCOLO PARA OBTENÇÃO DO PRP EM COELHOS
PASSOS
PROCEDIMENTO
1
Coleta de 8mL de sangue venoso em tubo com 1000µL de ACD-A
2
Homogeneização do sangue
3
1ª centrifugação: 302g por 10 minutos
4
Separação do soro evitando glóbulos vermelhos e brancos
5
Colocação do soro em tubo plástico
6
2ª centrifugação: 2862g por 5 minutos
7
PRP = terço inferior (descarte do PPP: 2/3 superiores do tubo)
8
Contagem de células no PRP
9
Adição do CaCl
2
ao PRP (proporção 2:10)
10
Esperar 2 minutos para formação do gel
64
A
B
C
D
E
F
FIGURA 12 - SEQÜÊNCIA LABORATORIAL DE OBTENÇÃO DO PLASMA RICO EM
PLAQUETAS: SEPARAÇÃO ENTRE PLASMA E GLÓBULOS VERMELHOS APÓS
1ª CENTRIFIGAÇÃO (A); PIPETAGEM DO PLASMA PARA NOVA
CENTRIFUGAÇÃO EM TUBO PLÁSTICO (B); TUBO ESQUERDO: PLASMA APÓS
2ª CENTRIFUGAÇÃO E TUBO DIREITO: PLASMA POBRE EM PLAQUETAS (C);
PLASMA RICO EM PLAQUETAS (D); OSSO AUTÓGENO ASSOCIADO AO
PLASMA RICO EM PLAQUETAS (E); VIDRO BIOATIVO ASSOCIADO AO PLASMA
RICO EM PLAQUETAS (F).
65
A contagem de leucócitos, eritrócitos e plaquetas antes (SV) e
após a centrifugação (PRP) e o cálculo da porcentagem de aumento de
plaquetas
64
, foram realizados com o propósito de se confirmar a obtenção
de um concentrado com elevado número de plaquetas e reduzido número
de leucócitos.
4.4 Obtenção e análise das imagens radiográficas
Para que as imagens dos seios maxilares não contivessem
superposição de outras estruturas ósseas além daquelas de interesse
para a análise radiográfica, as cabeças foram cortadas na sua linha
mediana após o sacrifício, e foram divididas em duas metades iguais,
sendo que em cada uma delas estava contido cada um dos seios
maxilares enxertados. Novamente as peças foram reduzidas restando
apenas a loja enxertada do seio maxilar e tecido ósseo adjacente às estas
estruturas (Figura 13A).
Para a realização das tomadas radiográficas foi utilizado o
aparelho raios-x GE 1000. Os fatores de exposição foram pré-
estabelecidos em estudo piloto: 70kVp, 10mA e 15 impulsos. As
radiografias foram obtidas utilizando filme oclusal (Kodak Insight F)
posicionado de forma que o feixe de raios-x incidisse
perpendicularmente sobre o seio maxilar, com o auxílio de um
posicionador especialmente confeccionado para este fim
66
A
B
C
FIGURA 13 - SEQÜÊNCIA DE PROCEDIMENTOS PARA A TOMADA
RADIOGRÁFICA: PEÇA ANATÔMICA CONTENDO O SEIO MAXILAR
POSICIONADA SOBRE O FILME (A); FILME E PEÇA ACONDICIONADOS NO
POSICIONADOR RADIOGRÁFICO (B); IMAGEM RADIOGRÁFICA DO SEIO
MAXILAR E DA ESCALA DE ALUMÍNIO, UTILIZADA PARA A AFERIÇÃO DA
DENSIDADDE ÓSSEA (C).
67
(Figura 13B), mantendo a distância foco-filme padronizada em 53cm,
conforme previamente estabelecido em teste piloto.
Uma escala de alumínio, composta por dez degraus, com 1mm de
diferença na altura entre os degraus, foi posicionada ao lado da peça,
sobre o filme, para viabilizar a avaliação da densidade óssea
comparando-a com a densidade da escala (Figura 13C).
Após o processamento radiográfico automático dos filmes (DentX
9000), todas as radiografias foram digitalizadas em “scanner” com tampa
de transparência (AGFA, Snapscan 1236
S
) e as imagens obtidas foram
arquivadas em resolução máxima (2400dpi) no disco rígido do
computador, com o formato TIFF (Tagged Image File Format).
A seleção das imagens para o cálculo da densidade foi realizada
utilizando-se o programa ImageJ (version 1.36b / NIH software)
desenvolvido pelo National Institute of Health – USA
(http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Para fins de análise, selecionou-se
uma região de interesse (RI) nas imagens radiográficas digitalizadas,
ilustrada nas Figuras 14A e 14B, correspondente à área enxertada do
seio maxilar e uma regiao controle (RC) (Figuras 14A e 14C) para
garantirmos, após determinação e comparação dos valores da densidade
e da dimensão fractal, que a região designada como RI era, de fato, uma
área enxertada.
O tamanho da região de interesse foi determinado tomando como
base o menor seio maxilar observado na amostra. Dentro deste seio,
68
A
B
C
FIGURA 14 - SEQÜÊNCIA PARA OBTENÇÃO DAS IMAGENS PARA A
ANÁLISE RADIOGRÁFICA: SELEÇÃO DA REGIÃO DE INTERESSE (RI) EM
VERMELHO E REGIÃO CONTROLE (RC) EM AMARELO (A); RI (B) E RC (C)
PRONTAS PARA ANÁLISE DA DENSIDADE ÓSSEA RADIOGRÁFICA.
69
selecionou-se a maior área possível (312x192 pixels) e aplicou-se, então,
em todas as RIs a mesma janela para padronização das medidas.
Também foram selecionadas em cada radiografia outras 11 janelas
(100x100 pixels) correspondentes a cada degrau da escala de alumínio e
à região mais radiolúcida, localizada imediatamente acima do degrau de
menor espessura da escala, área esta correspondente à região do filme
totalmente exposta ao feixe de raios-x.
No cálculo da densidade, os níveis de cinza e a altura em
milímetros de cada degrau serviram como parâmetro para a
transformação dos níveis de cinza das RIs e RCs em milímetros
equivalentes de alumínio (EqAl). A conversão dos valores expressos em
níveis de cinza em EqAl permitiu uma comparação padronizada entre os
dados de densidade das diferentes radiografias, corrigindo variações de
exposição e processamento radiográfico.
A manipulação das imagens para a determinação matemática da
dimensão fractal (DF) foi realizada no programa ImageJ (version 1.36b /
NIH software), seguindo os seguintes passos, apresentados na Figura 15:
1) transformação da imagem original (Figura 15A) em imagem binária
(Figura 15B), ou seja, áreas onde havia tecido ósseo foram
automaticamente transformadas em branco e os espaços medulares em
preto; 2) transformação da imagem binária em imagem esqueletizada,
onde a área de tecido ósseo foi reduzida a uma única linha de pixels
(Figura 15C) e, 3) as imagens esqueletizadas foram invertidas (Figura 15D),
70
A
B
C
D
FIGURA 15 - SEQÜÊNCIA DE MANIPULAÇÃO DA REGIÃO DE INTERESSE (RI) PARA
A DETERMINAÇÃO DA DIMENSÃO FRACTAL: RI SELECIONADA DA IMAGEM
ORIGINAL (A); IMAGEM BINÁRIA (IB) DA RI (B); IMAGEM ESQUELETIZADA (IE) DA IB
(C); IMAGEM INVERTIDA DA IE (D).
71
ou seja, a região correspondente ao osso passa a ter uma tonalidade
branca e a reião medular agora assume a tonalidade preta. Neste último
passo, as imagens foram salvas no formato .bmp (bitmap) para a
determinação da DF pelo programa Benoit 1.3 (Trusoft International Inc,
St. Petersburg, FL). O cálculo da DF foi feito pelo método de “box-
counting”, com base nas linhas brancas que preenchem cada janela,
utilizando a seguinte fórmula:
Se: S = [Log (número de janelas ocupadas) x Log (tamanho das janelas)]
Então: DF = (1 - S)
Os valores de DF podem variar de 1 a 2, sendo que valores de 1
correspondem à regiões não preenchidas e valores de 2, ou mais
próximos dele, correspondem à regiões mais ocupadas por trabeculado
ósseo.
72
4.5 Processamento e análise histomorfométrica das peças
anatômicas
Após o sacrifício dos animais, os seios maxilares foram
dissecados, reduzidos, radiografados e imersos em solução de formol a
10% tamponado com pH 7,4 para fixação e conservação.
Aproximadamente um mês após, as peças foram acondicionadas
individualmente em cassetes plásticos identificados, lavadas em água
corrente por 24 horas para a completa remoção do formol impregnado, e
submersas em 1 litro de solução de Morse (50% de ácido fórmico a 50% e
50% de citrato de sódio a 20%) para descalcificação. Esta solução foi
trocada a cada 48 horas, por um período de 68 dias, quando as peças
apresentaram-se adequadamente descalcificadas.
Após este processo, as amostras foram seccionadas ao meio no
sentido vestíbulo-palatino, formando duas metades, uma mesial e outra
distal. Para fins de padronização, selecionou-se para análise a metade
mesial. Todas as peças foram lavadas em água corrente por 24 horas,
submersas em uma solução de sulfato de sódio a 5% por uma semana,
sendo esta trocada duas vezes neste período, com o objetivo de
neutralizar o ácido da solução anterior e lavadas, novamente, em água
corrente por 24 horas. Logo em seguida, as peças foram mantidas em
álcool 70º GL por 1 hora para dar início ao processo de desidratação.
73
Em seguida, os cassetes contendo as metades mesiais dos seios
maxilares foram colocados em uma máquina processadora automática
(Leica Jung Histokinette 2000 - LEICA Instruments GmbH, Heidelberg,
Germany) onde foram submetidos por aproximadamente 48 horas aos
processos sequenciais de desidratação em álcool 90º GL e em álcool
absoluto, diafanização, onde as peças foram purificadas e clarificadas em
xilol e, por fim, impregnação em parafina. Posteriormente, as peças foram
removidas da auto-processadora e incluídas em parafina na inclusora
automática (Histo Embedder Jung – LEICA Instruments GmbH,
Heidelberg, Germany).
A microtomia dos blocos de parafina contendo os seios maxilares
foi realizada em micrótomo automático (Jung Supercut 2065 - LEICA
Instruments GmbH, Heidelberg, Germany), obtendo cortes seriados com
5µm de espessura. Ao todo, foram obtidas as 20 primeiras lâminas do
bloco, com 4 cortes cada uma, sendo que a primeira estava localizada no
centro do seio maxilar e a última encontrava-se mais próxima à
extremidade mesial do mesmo. Foram analisadas ao todo 3 cortes por
seio maxilar (dois corados com Hematoxilina e Eosina e um com
Tricrômico de Masson). A porcentagem média de preenchimento ósseo
dos três cortes, aferida pela análise histométrica, foi considerada para a
análise dos dados. Considerou-se como área avaliada toda a extensão
óssea formada pela cortical vestibular, pelo rebordo alveolar, pela cortical
palatina ou pela cortical interna da cavidade nasal e pelo ponto mais
74
proeminente da membrana sinusal em relação ao rebordo, localizada
superiormente ao enxerto, conforme ilustra a Figura 16.
Na análise histológica descritiva foram avaliados o tipo e a
qualidade dos tecidos neoformados, as características das células
presentes e a presença ou não do vidro bioativo ou do enxerto ósseo,
utilizando um microscópio ótico com aumentos de 4x, 10x e 40x (Olympus
BX51). A análise histomorfométrica
16
foi realizada com o propósito de se
aferir a quantidade de formação óssea após os 90 dias. As mensurações
foram realizadas utilizando-se um microscópio óptico com objetiva para
aumento de 4 vezes (Olympus BX51). As imagens foram selecionadas e
transferidas para um microcomputador (Pentium 4 Intel) por meio de uma
câmera fotográfica (Olympus CAMEDIA C5060 / wide zoom) acoplada ao
microscópio óptico.
Com o auxilio de um "software" analisador de imagens (Image
Tool UTHSCSA version 3.0) a área total foi delimitada e quantificada
como 100%. Em seguida, as áreas estritamente ósseas foram
delimitadas, excluindo-se outras estruturas tais como espaços vazios,
células, vasos sangüíneos, feixes nervosos e partículas do biomaterial,
quando presentes. Assim, foi possível estabelecer uma porcentagem
referente à quantidade de osso presente naquela área pré-determinada.
Os valores foram expressos em porcentagem para permitir a comparação
estatística entre os grupos, uma vez que as regiões de interesse nas
lâminas histológicas possuíam tamanhos diferentes.
75
magnificação: 4x
FIGURA 16 - SELEÇÃO DA REGIÃO DE INTERESSE NA LÂMINA
HISTOLÓGICA (EM VERMELHO): TÁBUA ÓSSEA VESTIBULAR (1);
PROCESSO ALVEOLAR (2); CORTICAL PALATINA (3); MEMBRANA SINUSAL
(4).
76
4.6 Análise estatística
Para comparar os tratamentos realizados no mesmo animal (VB
com OA e VB+PRP com OA+PRP), comparar as RIs com as RCs e
comparar a contagem de leucócitos, eritrócitos, plaquetas e a
porcentagem de aumento de plaquetas, antes e após a centrifugação, foi
utilizado o teste t de Student pareado. Para as demais comparações
utilizou-se o teste t de Student para amostras independentes. Para manter
o nível de significância global em 5%, foi utilizada a correção de
Bonferroni, considerando um total de 6 comparações, na análise dos
tratamentos OA, VB, OA+PRP e VB+PRP
67
.
Para estudar associação entre a densidade e a dimensão fractal
com a histometria foi utilizado um modelo de regressão linear múltiplo
67
.
Para garantir a suposição de independência do modelo de regressão, a
análise foi dividida em duas partes: na primeira consideramos apenas os
dados do lado esquerdo dos coelhos (OA e OA+PRP) e na segunda
consideramos apenas os dados do lado direito (VB e VB+PRP).
Considerou-se como variável resposta a densidade e como variáveis
independentes a presença de PRP e a dimensão fractal.
77
5 Resultado
78
5 Resultado
5.1 Contagem de elementos figurados do sangue
As contagens de leucócitos, eritrócitos e plaquetas de cada animal,
no sangue venoso (SV) e após a centrifugação (PRP) estão apresentadas
na Tabela 3. As contagens médias de leucócitos e eritrócitos no PRP
diminuiram acentuadamente em relação ao SV (de 3,96±2,00 para
0,46±0,45 e de 5,64±0,44 para 0,02±0,01, respectivamente). Já, a
contagem média de plaquetas no PRP (1344,9±347,5) aumentou
significativamente em relação ao SV (317,7±39,9). O aumento médio de
plaquetas no PRP em relação ao SV foi de 327,4%±97,8. Todas as
diferenças foram estatisticamente significantes.
Tabela 3 - Valores individuais e médios (desvio padrão) do número de elementos
figurados no sangue venoso (SV) e no plasma rico em plaquetas (PRP) e
porcentagem de aumento (PA) de plaquetas no PRP relativamente ao SV, nos
animais tratados com a combinação de osso autógeno+PRP e vidro
bioativo+PRP
Leucócitos
(x10
3
/µl)
Eritrócitos
(x10
6
/µl)
Plaquetas
(x10
3
/µl)
Animal
SV PRP SV PRP SV PRP PA
11
6,6 0,7 5,38 0,02 286 1166 342
12
3,6 0,3 5,08 0,03 291 1629 459
13
4,0 0,3 6,66 0,01 357 988 176
14
7,5 - 5,69 0,02 349 1426 308
15
3,5 1,3 5,87 0,02 255 1031 304
16
- - 5,90 0,05 299 1602 435
17
3,8 0,6 5,78 0,02 288 909 215
18
3,7 1,1 5,36 0,04 365 1297 255
19
3,0 0,2 5,34 0,01 317 1361 329
20
3,9 0,1 5,35 0,01 370 2040 451
x±dp
3,96
±2,00
0,46
±0,45
5,64
±0,44
0,02
±0,01
317,7
±39,9
1344,9
±347,5
327,4
±97,8
79
5.2 Análises da densidade óssea, dimensão fractal e histometria
Os valores para cada animal e os valores médios de densidade
óssea radiográfica, das RIs e suas respectivas RCs, expressos em
milímetros equivalentes de alumínio (EqAl), bem como a comparação
entre os valores da DO dos quatro tipos de enxerto, estão descritos nas
Tabelas 4 e 5 e ilustrados na Figura 17. Os valores médios da DO, nas
RIs dos quatro tipos de enxerto, foram significativamente maiores do que
suas respectivas RCs.
Tabela 4 - Valores individuais e médios de densidade óssea radiográfica, da
região de interesse (RI) e da região controle (RC), em milímetros equivalentes de
alumínio, nos quatro tratamentos: osso autógeno (OA), vidro bioativo (VB),
OA+PRP e VB+PRP
DENSIDADE OSSEA RADIOGRAFICA
OA VB OA+PRP VB+PRP
Animal
RI RC RI RC RI RC RI RC
1
2,555 0,854 2,669 0,194 - - - -
2
1,799 0,795 1,938 0,547 - - - -
3
1,579 0,167 1,533 1,175 - - - -
4
1,507 0,543 1,457 0,577 - - - -
5
1,761 0,054 2,302 0,238 - - - -
6
1,981 1,441 2,288 1,422 - - - -
7
1,521 0,719 1,895 0,929 - - - -
8
1,674 1,031 1,857 0,457 - - - -
9
1,958 0,914 2,517 -0,073 - - - -
10
1,599 0,463 1,935 1,036 - - - -
11
- - - - 1,879 0,626 1,080 0,369
12
- - - - 1,878 0,359 1,565 0,691
13
- - - - 1,254 0,806 1,713 0,902
14
- - - - 1,233 0,056 1,475 0,250
15
- - - - 1,641 1,366 1,325 1,085
16
- - - - 1,971 0,367 1,363 0,316
17
- - - - 1,850 0,475 2,175 0,391
18
- - - - 1,575 0,547 1,455 0,678
19
- - - - 1,586 0,572 1,315 0,536
20
- - - - 1,254 0,114 1,816 0,839
x±dp
1,79±
0,316
0,70±
0,411
2,04±
0,398
0,65±
0,477
1,61±
0,285
0,53±
0,372
1,53±
0,309
0,61±
0,279
80
Vazia Enxertada
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
OA
Região
Densidade (EqAl)
Vazia Enxertada
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
VB
Região
Densidade (EqAl)
Vazia Enxertada
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
OA+PRP
Região
Densidade (EqAl)
Vazia Enxertada
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
VB+PRP
Região
Densidade (EqAl)
FIGURA 17 - VALORES DA DENSIDADE ÓSSEA RADIOGRÁFICA,
EXPRESSOS EM MILÍMETROS EQUIVALENTES DE ALUMÍNIO, NA REGIÃOS
DE INTERESSE (ENXERTADA) E REGIÃO CONTROLE (VAZIA), NOS
QUATRO TRATAMENTOS (OA, VB, OA+PRP E VB+PRP). OS TRAÇOS
HORIZONTAIS REPRESENTAM O VALOR MEDIANO (Me), O 1º E 3º
QUARTIS (Q1 E Q3) E OS VALORES MÁXIMO (Máx) E MÍNIMO (Min)
OBSERVADOS, DESCONSIDERANDO OS VALORES DISCREPANTES
(PONTOS) IDENTIFICADOS CONFORME CRITÉRIO ESTABELECIDO POR
TUKEY
94
(1977).
mí
n
Q1
Q1
mí
n
Q1
Q1
mí
n
Q1
Q3
mí
n
Q3
Q1
Q3
Me
Me
Me
má
x
mí
n
Q3
má
x
má
x
Q1
má
x
mí
n
Me
Me
má
x
mí
n
Q3
má
x
Me
Q3
má
x
Q3
má
x
mí
n
Q1
Q3
Me
Me
(RC) (RI) (RC) (RI)
(RC) (RI) (RC) (RI)
81
Valores significativamente mais elevados de DO foram
observados na comparação do enxerto de VB (2,04) em relação ao OA
(1,79) e na comparação entre VB (2,04) e VB+PRP (1,53). Nas
comparações entre os demais tipos de enxerto não foram observadas
diferenças significantes.
Tabela 5 - Comparação entre os valores médios (desvio padrão) de densidade
óssea radiográfica, expressos em milímetros equivalentes de alumínio, nas
regiões de interesse (RI) e regiões controle (RC), nos quatro tratamentos: osso
autógeno (OA), vidro bioativo (VB), OA+PRP e VB+PRP
DENSIDADE ÓSSEA RADIOGRAFICA
Tipo de enxerto Região N Média Desvio-padrão
RC 10 0.70 0.411
OA
RI 10 1.79
#
0.316
RC 10 0.65 0.477
VB
RI 10 2.04
# *
0.398
RC 10 0.53 0.372
OA+PRP
RI 10 1.61
#
0.285
RC 10 0.61 0.279
VB+PRP
RI 10 1.53
# †
0.309
#
p<0,05 diferença estatisticamente significante (RI vs RC)
* p<0,05 diferença estatisticamente significante (OA vs VB)
†
p<0,05 diferença estatisticamente significante (VB vs VB+PRP)
82
Na Tabela 6 e na Figura 18 estão apresentados os valores de DF
nas RIs e RCs dos quatro tipos de enxerto. Observou-se valores similares
de DF entre as RIs e RCs em todos os tipos de enxerto com exceção para
o VB, onde foi encontrado um valor médio significativamente menor de DF
na RI (1,35) em relação à sua RC (1,49).
Tabela 6 - Valores individuais e médios de dimensão fractal, da região de
interesse (RI) e da região controle (RC), que podem variar de 1 a 2, nos quatro
tratamentos: osso autógeno (OA), vidro bioativo (VB), OA+PRP e VB+PRP
DIMENSAO FRACTAL
OA VB OA+PRP VB+PRP
Animal
RI RC RI RC RI RC RI RC
1
- 1,453
- 1,416
- - - -
2
1,513
1,416
1,465
1,455
- - - -
3
1,436
1,556
1,390
1,547
- - - -
4
1,519
1,555
1,375
1,544
- - - -
5
1,433
1,425
1,266
1,510
- - - -
6
1,460
1,482
1,284
1,535
- - - -
7
1,519
1,472
1,323
1,487
- - - -
8
1,438
1,381
1,267
1,517
- - - -
9
1,486
1,463
1,311
1,489
- - - -
10
1,525
1,482
1,494
1,435
- - - -
11
- - - - 1,438 1,376 1,340 1,442
12
- - - - 1,475 1,430 1,384 1,481
13
- - - - 1,466 1,453 1,509 1,565
14
- - - - 1,408 1,532 1,479 1,481
15
- - - - 1,450 1,347 1,502 1,482
16
- - - - 1,416 1,547 1,339 1,439
17
- - - - 1,363 1,492 1,446 1,534
18
- - - - 1,437 1,430 1,470 1,426
19
- - - - 1,465 1,491 1,504 1,510
20
- - - - 1,519 1,499 1,411 1,408
X±dp
1,48±
0,040
1,47±
0,056
1,35±
0,084
1,49±
0,046
1,44±
0,043
1,46±
0,065
1,44±
0,066
1,48±
0,050
83
Vazia Enxertada
1.2 1.3 1.4 1.5 1.6
OA
Região
Dimensão fractal
Vazia Enxertada
1.2 1.3 1.4 1.5 1.6
VB
Região
Dimensão fractal
Vazia Enxertada
1.2 1.3 1.4 1.5 1.6
OA+PRP
Região
Dimensão fractal
Vazia Enxertada
1.2 1.3 1.4 1.5 1.6
VB+PRP
Região
Dimensão fractal
FIGURA 18 - VALORES DA DIMENSÃO FRACTAL, COMPREENDIDOS ENTRE
1 E 2, NA REGIÃO DE INTERESSE (ENXERTADA) E REGIÃO CONTROLE
(VAZIA), NOS QUATRO TRATAMENTOS (OA, VB, OA+PRP E VB+PRP). OS
TRAÇOS HORIZONTAIS REPRESENTAM O VALOR MEDIANO (Me), O 1º E 3º
QUARTIS (Q1 E Q3) E OS VALORES MÁXIMO (Máx) E MÍNIMO (Mín)
OBSERVADOS, IDENTIFICADOS CONFORME CRITÉRIO ESTABELECIDO
POR TUKEY
94
(1977).
má
x
mí
n
Me
Q1
má
x
Q1
Q3
mí
n
Q3
má
x
mí
n
Q1
Q3
mí
n
Q1
Q3
Me
má
x
Q1
Q3
má
x
mí
n
Q1
Q3
Me
má
x
mí
n
Q1
Q3
Me
má
x
mí
n
Q3
Me
mí
n
Me
má
x
Q1
Me
Me
(RC) (RI) (RC) (RI)
(RC) (RI) (RC) (RI)
84
Quando comparados os valores médios de DF entre as RIs dos
quatro tipos de enxerto (Tabela 7), observou-se valor médio
significativamente menor do VB (1,35) em relação ao OA (1,48) e valor
significativamente maior na RI do OA+PRP (1,44) em relação ao VB
(1,35). Não foram encontradas diferenças significativas nas demais
comparações.
Tabela 7 - Comparação entre os valores médios (desvio padrão) de dimensão
fractal, compreendidos entre 1 e 2, nas regiões de interesse (RI) e regiões
controle (RC), nos quatro tratamentos: osso autógeno (OA), vidro bioativo (VB),
OA+PRP e VB+PRP
DIMENSÃO FRACTAL
Tipo de enxerto Região N Média Desvio-padrão
RC 10 1.47 0.056
OA
RI 9 1.48 0.040
RC 10 1.49 0.046
VB
RI 9 1.35
# *
0.084
RC 10 1.46 0.065
OA+PRP
RI 10 1.44
†
0.043
RC 10 1.48 0.050
VB+PRP
RI 10 1.44 0.066
#
p<0,05 diferença estatisticamente significante (RI vs RC)
* p<0,05 diferença estatisticamente significante (VB vs OA)
†
p<0,05 diferença estatisticamente significante (OA+PRP vs VB)
85
A Figura 19 ilustra por meio de diagramas de caixa, ou boxplots,
as diferenças médias dos valores de DO e DF entre as RIs e RCs, nos
quatro tipos de enxertos. Nota-se que houve diferença significante nos
valores de DO em todos os tipos de enxerto. Na análise fractal, valor
significante foi encontrado apenas na diferença da RI com a RC do
enxerto de VB.
OA VB OA+PRP VB+PRP
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Densidade (EqAl)
OA VB OA+PRP VB+PRP
-0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2
Dimensão fractal
FIGURA 19 - DIFERENÇA MÉDIA DOS VALORES DE DENSIDADE ÓSSEA
RADIOGRÁFICA E DIMENSÃO FRACTAL ENTRE A REGIÃO ENXERTADA E A
REGIÃO VAZIA, NOS QUATRO TRATAMENTOS (OA, VB, OA+PRP E
VB+PRP). OS TRAÇOS HORIZONTAIS REPRESENTAM O VALOR MEDIANO
(Me), O 1º E 3º QUARTIS (Q1 E Q3) E OS VALORES MÁXIMO (Máx) E MÍNIMO
(Mín) OBSERVADOS, DESCONSIDERANDO OS VALORES DISCREPANTES
(PONTOS) IDENTIFICADOS CONFORME CRITÉRIO ESTABELECIDO POR
TUKEY
94
(1977).
Q1
mín
Q1
máx
mín
Q1
Q3
Me
máx
mín
Q3
Me
máx
Q3
Me
máx
mín
Q3
Me
Q3
Me
mín
Q3
Me
Q1
Q3
máx
mín
Q1
máx
Q1
Me
máx
mín
Q1
Q3
máx
mín
Me
86
As
Tabelas 8 e 9 apresentam os valores individuais e médios da
análise histométrica, expressa em porcentagem de preenchimento ósseo,
dos quatro tipos de enxerto bem como a comparação entre os valores
médios de cada enxerto. Observaram-se valores médios bastante
próximos entre os seios maxilares enxertados com OA (63,30%), VB
(52,65%), OA+PRP (55,25%) e VB+PRP (51,07%), sendo a diferença não
significante. A Figura 20 ilustra por meio de boxplots, os valores médios
de porcentagem de preenchimento ósseo, nos quatro tipos de enxertos.
Tabela 8 - Valores individuais da quantidade de osso aferida pela histometria,
expressa em porcentagem de osso presente. Cada valor representa a média das
medidas feitas em 3 cortes de cada seio maxilar, nos quatro tratamentos: osso
autógeno (OA), vidro bioativo (VB), OA+PRP e VB+PRP
PORCENTAGEM DE OSSO
Animal OA VB OA+PRP VB+PRP
1
65,94 61,63 - -
2
63,28 47,21 - -
3
67,67 52,14 - -
4
48,11 68,20 - -
5
65,45 43,29 - -
6
74,85 42,90 - -
7
69,38 60,54 - -
8
48,32 52,88 - -
9
66,59 35,62 - -
10
63,37 62,08 - -
11
- - 53,88 63,63
12
- - 57,96 36,84
13
- - 49,82 58,91
14
- - 64,24 54,87
15
- - 61,02 45,93
16
- - 48,90 42,37
17
- - 55,68 48,64
18
- - 42,15 65,98
19
- - 54,76 42,42
20
- - 64,09 -
X±dp
63,30±8,609 52,65±10,415 55,25±7,018 51,07±10,255
87
Tabela 9 - Comparação entre os valores médios (desvio padrão) da histometria,
expressos em porcentagem de preenchimento ósseo, nos quatro tratamentos:
osso autógeno (OA), vidro bioativo (VB), OA+PRP e VB+PRP
POCENTAGEM DE OSSO
Tipo de enxerto N Média Desvio-padrão
OA
10 63,30 8,609
VB
10 52,65 10,415
OA+PRP
10 55,25 7,018
VB+PRP
9 51,07 10,255
Sem diferença estatística entre os quarto tipos de enxerto
OA VB OA+PRP VB+PRP
30 40 50 60 70 80
Histometria (%)
FIGURA 20: VALORES DA ANÁLISE HISTOMÉTRICA, EXPRESSOS EM % DE
PREENCHIMENTO ÓSSEO, NOS QUATRO TRATAMENTOS (OA, VB,
OA+PRP E VB+PRP). OS TRAÇOS HORIZONTAIS REPRESENTAM O VALOR
MEDIANO (Me), O 1º E 3º QUARTIS (Q1 E Q3) E OS VALORES MÁXIMO (Máx)
E MÍNIMO (Mín) OBSERVADOS, DESCONSIDERANDO OS VALORES
DISCREPANTES (PONTOS) IDENTIFICADOS CONFORME CRITÉRIO
ESTABELECIDO POR TUKEY
94
(1977).
mí
n
má
x
mí
n
Q1
Q3
Me
má
x
Q3
Me
má
x
mí
n
Q3
Me
má
x
mí
n
Q3
Q1
Q1
Me
Q1
88
A Figura 21 ilustra os resultados da associação entre a
histometria e as variáveis densidade e dimensão fractal. Com base no
modelo de regressão linear múltiplo histometria vs densidade (Anexo 6) e
histometria vs dimensão fractal, observou-se que não houve correlação
entre a histometria, dimensão fractal e densidade.
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
30 40 50 60 70 80
OA
Densidade (EqAL)
Histometria (%)
OA
OA+PRP
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
30 40 50 60 70 80
VB
Densidade (EqAL)
Histometria (%)
VB
VB+PRP
1.2 1.3 1.4 1.5 1.6
30 40 50 60 70 80
OA
Dimensão fractal
Histometria (%)
OA
OA+PRP
1.2 1.3 1.4 1.5 1.6
30 40 50 60 70 80
VB
Dimensão fractal
Histometria (%)
VB
VB+PRP
FIGURA 21 - CORRELAÇÕES ESTIMADAS ENTRE AS VARIÁVEIS
DENSIDADE ÓSSEA RADIOGRÁFICA, DIMENSÃO FRACTAL E
HISTOMETRIA NOS QUATRO TRATAMENTOS (OA, VB, OA+PRP E VB+PRP).
R
2
= 0,23 R
2
= 0,12
R
2
= 0,08 R
2
= 0,21
89
5.3 Análise histológica descritiva
5.3.1 Grupo osso autógeno
A partir da tábua óssea correspondente ao processo alveolar e à
parede lateral da cavidade nasal, observou-se formação de osso novo,
com diferentes graus de maturação, em arranjo trabecular com disposição
nodular, envolvendo medular predominantemente adiposa, por vezes
caracterizada por estrutura fibro-adiposa, ricamente vascularizada (Figura
22). Este tecido ósseo neoformado ora se apresentou disposto
concentricamente formando canais de Havers, característica de osso
maduro, ora ricamente celularizado envolvendo osteócitos dispostos
aleatoriamente e com osteoblastos margeando o tecido em formação, em
disposição regular, entre osteoclastos (Figura 23). Estas condições
sugerem a continuidade do processo de formação e remodelação do
tecido pré-existente característica de tecido ósseo em plena atividade
Em poucos animais, observou-ser a presença de tecido ósseo,
em forma de espículas, dispersas e irregulares, com espaços medulares
amplos (medula adiposa) e sem vascularização expressiva, não
apresentando características de tecido em formação, denotando um
tecido ósseo, que sofreu estímulo inicial, mas que não teve continuidade,
ou seriam fragmentos do tecido implantado.
90
magnificação: 4x
FIGURA 22 - CORTE HISTOLÓGICO DE UM SEIO MAXILAR DE COELHO
ENXERTADO COM OSSO AUTÓGENO, CORADO COM TRICRÔMIO DE
MASSON.
91
FIGURA 23 - CORTE HISTOLÓGICO DE UM SEIO MAXILAR DE COELHO
ENXERTADO COM OSSO AUTÓGENO, CORADO COM TRICRÔMIO DE
MASSON: VASOS SANGÜÍNEOS (1), OSTEÓCITOS (2), CANAIS DE HAVERS
(3).
3
2
1
92
5.3.2 Grupo vidro bioativo
A partir da superfície interna da parede óssea do seio maxilar,
notou-se a presença de trabéculas ósseas neoformadas, com espaços
medulares amplos, preenchidos por tecido adiposo. Mais próximo à
membrana do seio maxilar, observou-se em todos os casos formações
vacuolares, com estrutura avermelhada em seu interior, sugestiva de
fragmentos remanescentes do vidro bioativo (Figura 24).
Em sua grande maioria, estas estruturas apresentavam-se
envoltas por tecido ósseo neoformado, em diferentes graus de maturação
habitual. Este conjunto, biomaterial-osso-matriz óssea, encontravam-se
em meio a um tecido conjuntivo fibroso em colagenização (Figura 25).
Não se observou a presença de células inflamatórias na região. Em um
caso, os fragmentos do biomaterial encontravam-se encapsulados por
tecido fibroso, sem formação óssea ao redor.
5.3.3 Grupo Osso Autógeno associado ao PRP
A partir da tábua óssea correspondente ao processo alveolar e à
parede lateral da cavidade nasal, foi possível observar a presença de
tecido ósseo novo, tendendo a formação de canais de Havers Em toda
extensão do seio maxilar trabéculas ósseas estavam presentes,
93
magnificação: 4x
FIGURA 24 - CORTE HISTOLÓGICO DE UM SEIO MAXILAR DE COELHO
ENXERTADO COM VIDRO BIOATIVO. CORADO COM TRICRÔMIO DE
MASSON.
94
FIGURA 25 - CORTE HISTOLÓGICO DE UM SEIO MAXILAR DE COELHO
ENXERTADO COM VIDRO BIOATIVO. CORADO COM TRICRÔMIO DE
MASSON: PARTÍCULAS DO VIDRO BIOATIVO (1), TECIDO CONJUNTIVO
FIBROSO (2), ESPAÇO MEDULAR AMPLO (3)
3
2
1
95
ora em forma de espículas, ora em forma ovaladas, que se apresentavam
distribuídas irregularmente. Entre essas trabéculas, espaços medulares
amplos foram visualizados, preenchidos por medula adiposa, bem como
inúmeros vasos sangüíneos (Figuras 26 e 27). O tecido ósseo presente,
apesar de ter aspecto de osso maduro, não apresentava caráter de
compactação ou solidez, nem características de continuidade de
formação ou evolução.
Em poucos animais, observaram-se trabéculas ósseas dispostas
de forma regular, preenchendo o seio maxilar. Nestes casos, notou-se
tecido ósseo maduro, circundado por tecido ósseo neoformado, envolto
em toda a sua extensão por osteoblastos, ou por matriz colagênica em
processo de calcificação.
5.3.4 Grupo Vidro Bioativo associado ao PRP
A partir da parede óssea do seio maxilar, observou-se a formação
de trabéculas ósseas finas e alongadas, dispostas de forma irregular. O
tecido calcificado presente possuía característica de tecido ósseo maduro,
sem a presença de osteoblastos ou matriz colagênica ao redor.
96
magnificação: 4x
FIGURA 26 - CORTE HISTOLÓGICO DE UM SEIO MAXILAR DE COELHO
ENXERTADO COM UMA COMBINAÇÃO DE OSSO AUTÓGENO E PRP,
CORADO COM TRICRÔMIO DE MASSON.
97
FIGURA 27 - CORTE HISTOLÓGICO DE UM SEIO MAXILAR DE COELHO
ENXERTADO COM UMA COMBINAÇÃO DE OSSO AUTÓGENO E PRP,
CORADO COM TRICRÔMIO DE MASSON: LINHA DE REVRSÃO
MOSTRANDO A DIVISÃO DO OSSO PRÉ-EXISTENTE COM O OSSO
NEOFORMADO (1), ESPÍCULAS ÓSSEAS (2), ESPAÇOS MEDULARES
AMPLOS (3), CANAIS DE HAVERS (4).
2
3
1
4
98
Entre estas trabéculas, havia espaços medulares amplos
preenchidos por medula adiposa (Figura 28). Na região mais central,
foram observadas formações vacuolares sugestivas da presença do vidro
bioativo, ora envoltas por tecido fibroso, ora tecido ósseo (Figura 29). Em
um caso, células gigantes foram observadas, reabsorvendo o tecido
ósseo neoformado.
99
magnificação: 4x
FIGURA 28 - CORTE HISTOLÓGICO DE UM SEIO MAXILAR DE COELHO
ENXERTADO COM UMA ASSOCIAÇÃO DE VIDRO BIOATIVO E PRP,
CORADO COM TRICRÔMIO DE MASSON.
100
FIGURA 29 - CORTE HISTOLÓGICO DE UM SEIO MAXILAR DE COELHO
ENXERTADO COM UMA ASSOCIAÇÃO DE VIDRO BIOATIVO E PRP,
CORADO COM TRICRÔMIO DE MASSON: TRABÉCULA ÓSSEA FINA E
ALONGADA (1), PARTÍCULA DO BIOMATERIAL (2), MEDULAR ADIPOSA (3).
2
3
1
101
6 Discussão
102
6 Discussão
Os resultados da análise histométrica, método que aferiu a
quantidade de osso presente no interior do seio maxilar, demonstraram
que quando se utilizou o osso autógeno, a porcentagem de
preenchimento ósseo foi maior do que os valores alcançados pelos
demais enxertos (VB, OA+PRP e VB+PRP), sendo o primeiro da ordem
de 63% e os demais 53%, 55% e 51%, respectivamente. Estas
diferenças, entretanto, não foram estatisticamente significantes.
Contudo, na análise histológica descritiva, método qualitativo, o
que se pôde observar para o enxerto de OA foi um resultado superior em
comparação aos demais tratamentos. Os 63% acusados pela histometria
eram referentes à presença de tecido ósseo neoformado com
características de osso maduro em plena atividade de neoformação e
remodelação. Os 37%, que não correspondiam ao osso neoformado,
eram, na grande maioria dos casos, espaços medulares, vasos
sangüíneos, fibras nervosas e células ósseas, ou seja, estruturas
comumente encontradas no tecido ósseo maduro, necessárias para a
futura osseointegração de implantes de titânio, que é o objetivo final da
cirurgia de levantamento de seio maxilar com enxerto ósseo.
Por outro lado, nos enxertos de VB, OA+PRP e VB+PRP
observou-se neoformação óssea pouco expressiva, sendo que as demais
porcentagens eram compostas, na maioria os cortes, por espaços
103
medulares amplos, poucos feixes vásculo-nervosos, espaços vazios, além
da presença de partículas do biomaterial ainda em fase de reabsorção,
nos grupos VB e VB+PRP.
O resultado da histometria é, de certa forma, contraditório em
relação ao resultado histológico descritivo, pois a histometria foi realizada
considerando-se apenas o parâmetro “tecido ósseo”, desconsiderando-se
outros parâmetros tais como a porcentagem de vasos sanguíneos, de
partículas do biomaterial, de medular óssea e principalmente de espaços
vazios. Assim, resultados mais favoráveis para o OA seriam
definitivamente encontrados. Também, é importante considerar no grupo
tratado com OA, a presença de “outliers”, resultados discrepantes que, se
fossem excluídos da amostra original (63±8,60%), teríamos uma média
mais elevada com um desvio padrão bem menor, da ordem de 67±3,74 de
preenchimento ósseo, em porcentagem.
Vale lembrar que as porcentagens descritas pela análise
histométrica compreendiam o tecido ósseo neoformado bem como a
cortical óssea pré-existente. Isto porque, na maioria dos cortes não era
possível visualizar o limite entre estas duas estruturas, ou seja, a linha de
reversão presente entre o osso neoformado e a cortical óssea antiga.
Acréscimos de osso antigo e exclusões de tecido ósseo neoformado
durante a análise histométrica implicariam em erros indesejáveis.
Assim, apesar das porcentagens apresentadas neste estudo não
indicarem com exatidão a quantidade de osso neoformado induzido pelos
104
quatro tipos de enxerto, o viés “osso pré-existente” foi introduzido em toda
a amostra, refletindo, portanto a neoformação óssea decorrente do
enxerto. Desta forma, sugerimos para um próximo estudo, o uso de
marcadores ósseos como fluorocromos que indicariam, no momento da
análise, o osso neoformado.
Apesar de o vidro bioativo ser descrito por alguns autores
18,26,78
como um biomaterial com características osteoindutoras e
osteocondutoras, capaz de induzir a ploriferação e migração de células
osteogênicas, Cardoso et al.
19
(2006) mostraram resultados desfavoráveis
para duas formas de vidro bioativo (Biogran
®
e PerioGlas
®
), com
diferentes tamanhos de partículas, quando comparado ao coágulo
sangüíneo, em defeitos críticos em calvária de ratos. Nos grupos em que
o biovidro foi utilizado, os autores observaram, após 60 dias, neoformação
óssea apenas nas margens do defeito e a presença de um tecido
conjuntivo fibroso ao redor das partículas do biomaterial,
descaracterizando o vidro bioativo como um material osteogênico.
Os resultados de Cardoso et al.
19
(2006) estão de acordo com os
do presente estudo, que observou uma maior concentração de tecido
ósseo neoformado em contato com as paredes internas dos seios
maxilares enxertados com vidro bioativo. Este fato também foi observado
por Fernandes et al.
30
(2005) que descreveu maior formação óssea ao
longo das paredes de defeitos periodontais, quando comparado ao centro
do defeito.
105
Observou-se também, no presente estudo, uma maior
concentração de partículas não reabsorvidas do biomaterial na região
central do seio maxilar, longe de suas paredes e próxima à membrana
sinusal. A ausência de partículas de vidro bioativo próximo as corticais
internas da cavidade sinusal, bem como a presença de tecido ósseo
neoformado devem-se provavelmente ao fato de haver uma maior
irrigação sangüínea nas margens ósseas do que no centro do seio
maxilar e a presença de células osteogênicas nas paredes das corticais
ósseas. Estes achados estão de acordo com estudos anteriores de
Boyne, James
13
(1980) e Hürzeler et al.
51
(1997) que afirmam que as
células osteprogenitoras que povoam os enxertos são provenientes das
tábuas ósseas maxilares e não da membrana sinusal que, sabidamente,
não possui potencial osteogênico.
Além disso, é de extrema importância considerar que o seio
maxilar representa um ambiente único no complexo maxilo-facial, com
particularidades anátomo-funcionais que viriam a influenciar os resultados
cirúrgicos tais como: 1) vascularização reduzida e, por conseguinte
oxigenação reduzida; 2) presença de uma membrana fina e delicada
susceptível à perfuração; 3) risco de infecções sinusais
17
e 4) presença de
pressão intra-sinusal desencadeada pela entrada e saída de ar durante a
respiração
54,47
.
Assim, o fato de os trabalhos realizados por esta equipe
18,19,30
terem demonstrado resultados díspares com relação ao desempenho do
106
vidro bioativo, despertou-nos o interesse de realizar este estudo, como
forma de somar conhecimentos a uma linha de pesquisa para a
investigação deste biomaterial.
A realização de estudos controlados em humanos que
investiguem a aplicação de biomateriais em seio maxilar e a avaliação
destes em toda a sua extensão é dificultada pela necessidade da
padronização de variáveis como gênero, peso corpóreo, hábitos
deletérios e doenças sistêmicas. A impossibilidade de controles
radiográficos freqüentes e da realização de biópsias desnecessárias
também são dificuldades encontradas em estudos em seres humanos.
Estes fatos fazem das pesquisas com animais uma alternativa bastante
oportuna para estudos clínicos in vivo.
Neste sentido, Watanabe et al.
107
(1999) foram os primeiros a
utilizar e validar o coelho como modelo animal para o estudo de cirurgias
de levantamento de seio maxilar. Estes autores demonstraram que 50
dias de pós-operatório constituem um período suficiente para que o osso
autógeno enxertado sofra o processo de remodelação e integração à
cavidade sinusal de coelhos. Albrektsson
3
(1980) afirmou, em seu estudo
clássico, que a revascularização de enxertos ósseos medulares em
coelhos se inicia no 5º dia após sua implantação no leito receptor e, aos
20 e 35 dias, a revascularização e a fase osteogênica de reabsorção e
deposição óssea estão completas, respectivamente.
107
No delineamento da metodologia deste estudo, ficou estabelecido
com base nas observações de Cardoso et al.
19
(2006) que o período mais
adequado para o sacrifício dos animais seria 90 dias haja visto que estes
autores observaram pouca formação óssea ao redor das partículas do
biovidro após 60 dias. Talvez, um período experimental mais prolongado,
de 90 dias, representaria maiores chances para o biovidro induzir a
neoformação óssea. Porém, após a conclusão deste experimento,
observou-se uma formação óssea menos expressiva nos seios maxilares
enxertados com vidro bioativo. Assim, frente a estes resultados, poderia-
se inferir que períodos experimentais maiores e menores aos de 90 dias
seriam necessários aos estudos futuros, com o objetivo de investigar o
comportamento do vidro bioativo em seios maxilares, ao longo do tempo.
Entretanto, descobriu-se que este argumento não é válido quando
se avaliou os resultados do grupo enxertado com osso autógeno onde é
possível visualizar uma expressiva formação óssea sugerindo que os 90
dias é, de fato, tempo suficiente para formação óssea no interior do seio
maxilar de coelhos e que, portanto, o biovidro não é capaz de formar osso
em quantidades comparáveis ao enxerto autógeno. Por fim, quando se
avalia as lâminas do grupo enxertado com vidro bioativo, pode-se
observar um tecido pouco celularizado, sem a presença de osteoblastos
em fase ativa de deposição de matriz óssea, carcaterizando aquele tecido
como um tecido que concluiu sua fase ativa de neoformação óssea.
108
A associação do vidro bioativo ao PRP foi fator decisivo no
delineamento inicial da pesquisa, isto porque o uso do PRP associado ao
osso autógeno ou a outros substitutos ósseos compreende uma nova
alternativa de tratamento em Periodontia, Implantodonia e Cirurgia Buco-
Maxilo-Facial. Alguns de seus benefícios incluem ausência de
antigenicidade ou transmissão de doenças infectocontagiosas, além da
presença de grandes quantidades de fatores de crescimento que seriam
capazes de promover a diferenciação de células mesenquimais
indiferenciadas em osteoblastos, acelerando os processos de formação
óssea e de reparação de outros tecidos
78
.
Apesar de muitos estudos utilizando o PRP terem sido
desenvolvidos e seus resultados profundamente
investigados
6,7,20,34,36,56,60,61,64,70-72,74,75,77,82,90,110
, muitos aspectos referentes ao seu
mecanismo de ação, aos efeitos colaterais e à metodologia de obtenção
ainda permanecem incertos. Ademais, existem poucos estudos
prospectivos controlados que elucidem os reais benefícios do PRP.
Butterfield et al.
17
(2005) afirmam que o coelho é um modelo
animal apropriado para o estudo do PRP, uma vez que possui um “status”
hematológico semelhante ao ser humano, no que se refere à quantidade
de fatores da coagulação e de plaquetas, além de oferecer volume
sangüíneo suficiente para a obtenção de um concentrado de plaquetas.
Em se tratando dos métodos para o preparo do PRP em coelhos,
diferentes protocolos são descritos na literatura. As variações principais
109
consistem no volume de sangue coletado, no número e velocidade das
centrifugações e no tipo de anticoagulante. Assim, frente às diferentes
metodologias empregadas, os trabalhos de Aghaloo et al.
2
(2002) e
Efeoglu et al.
29
(2004) foram o ponto de partida para o estabelecimento de
um protocolo próprio para a obtenção do PRP em coelhos.
Neste sentido, vários protocolos foram testados em estudo piloto
93
(Anexo 5) e modificações foram feitas de acordo com as dificuldades
encontradas, tais como, 1) escolha do anticoagulante ideal que poderia
ser infundido no animal; 2) quantidade ideal de sangue para se obter um
volume suficiente de PRP; 3) quantidade, velocidade e tempo das
centrifugações para se obter um concentrado de plaquetas livre de
eritrócitos e de leucócitos, com plaquetas íntegras; 4) volume do
centrifugado final que continha uma quantidade elevada de plaquetas
(PRP) e 5) decisão pelo uso ou não de ativadores plaquetários como a
trombina bovina.
Em relação ao item 1, apesar de Efeoglu et al.
29
(2004) ter
recomendado o uso do EDTA como anticoagulante no preparo do PRP
em coelhos, o anticoagulante utilizado neste protocolo foi o ACD-A
(adenina citrato dextrose). Isto porque, Landesberg et al.
57
(2000)
afirmaram que o EDTA é capaz de romper a parede das plaquetas mais
facilmente que os anticoagulantes compostos por citrato, ocorrendo a
liberação dos fatores de crescimento muito antes do momento desejado.
110
Ítem 2: De acordo com Efeoglu et al.
29
(2004), a quantidade de
sangue que pode ser coletada de um coelho adulto é de 15 mL, sem a
necessidade de repor a volemia com infusão de soro fisiológico. Nos
testes piloto deste estudo, ficou determinado que 8mL de sangue era um
volume adequado para obter 2mL de PRP, quantidade esta suficiente
para o uso no interior de seios maxilares de coelho.
Itens 3 e 4) Ficou estabelecido no estudo piloto que 2
centrifugações, sendo a primeira a 302g por 10 minutos e a segunda a
2862g por 5 minutos, promoveram a maior concentração de plaquetas.
Entretanto, questionou-se no estudo piloto se a centrifugação dupla, com
altas velocidades como a utilizada na segunda etapa, e um tempo de 10
minutos não romperiam a parede das plaquetas, inviabilizando o seu uso
ou as deixariam muito compactadas entre si ocorrendo um erro na
contagem. Assim, ao testar velocidades inferiores (Anexo 5), observou-se
que a contagem plaquetária no PRP era inferior aos resultados com
velocidades maiores e, ao se aferir a mesma contagem no plasma pobre
em plaquetas, uma alta concentração de plaquetas foi detectada,
mostrando que a centrifugação mais lenta foi insuficiente para decantar
todas as plaquetas
93
.
No estudo piloto
93
, a dificuldade em desagregar o botão
plaquetário formado no fundo do tubo de vidro após a 2ª centrifugação foi
considerada, pois contagens inferiores de plaquetas poderiam ser
observadas. Usando o tubo plástico, tornou-se mais fácil de dissociar as
111
plaquetas. Uma possível explicação para este fato é que o vidro pode
danificar a parede plaquetária, causando sua agregação e ativação.
De acordo com Efeoglu et al.
29
(2004), a contagem de plaquetas
no sangue venoso em coelhos New Zealand varia entre 250 e 750x10
3
/µl.
Os resultados do presente estudo, fazendo uso do novo protocolo
estabelecido, estão dentro destes limites, apontando uma contagem
média de 317,7x10
3
/µl ±39,9. Já, a contagem de plaquetas no PRP foi
significativamente maior, atingindo valores de 1344,9x10
3
/µl ±347,5,
enquanto esta contagem em outros estudos foi de 3134 x10
3
/µl
29
,
1050x10
3
/mm
3 2
e 2061 x10
3
/µl
17
.
A porcentagem de aumento de plaquetas no PRP em relação ao
sangue venoso foi de 327,4±97,8%, valor estatisticamente significante. No
estudo de Efeoglu et al.
29
(2004) este índice foi de 429%. Este é um dado
importante a ser considerado, pois leva em conta a contagem inicial de
plaquetas no sangue venoso, permitindo comparações entre valores de
diferentes animais. Marx
63
(2004), ao discutir a concentração ideal de
plaquetas capaz de promover uma maior formação óssea, afirma que uma
resposta celular decorrente do estímulo plaquetário e de seus fatores de
crescimento ocorre quando um aumento plaquetário da ordem de 4 a 5
vezes é alcançado.
No presente estudo, este aumento foi alcançado em 7 animais.
Nos animais 13, 17 e 18 o aumento foi da ordem de 3 vezes. É importante
ressaltar que estes animais apresentaram valores individuas de
112
densidade óssea, dimensão fractal e porcentagem de preenchimento
ósseo similares às médias do grupo ao qual pertenciam. Sendo assim, o
aumento de três vezes não influenciou negativamente os resultados.
Assim, a contagem de plaquetas no PRP alcançada em todos os
animais, bem como os valores obtidos na porcentagem de aumento
destas células sangüíneas no PRP em relação ao sangue venoso,
confirma que o protocolo desenvolvido neste estudo resulta em um
centrifugado com elevada contagem de plaquetas.
Outro fator de extrema relevância diz respeito à contaminação
indesejada do concentrado de plaquetas por leucócitos que viriam a
povoar o ambiente cirúrgico, atraindo por quimiotaxia um elevado aporte
de células inflamatórias ao leito receptor. No presente estudo, a contagem
média leucócitos no PRP foi significativamente menor (0,46±0,45x10
3
/µl)
do que no sangue venoso (3,96±2,00 x10
3
/µl). Este é um ponto forte do
presente estudo que se preocupou em confirmar a obtenção de um
concentrado livre de leucócitos, detalhe este pouco investigado por outros
estudos descritos na literatura.
Entretanto, de acordo com Zimmermann et al.
113
(2001), uma
lacuna metodológica encontrada no presente experimento diz respeito à
não quantificação dos fatores de crescimento presentes no PRP, detalhe
este que deve ser aferido em próximos estudos.
Ítem 5) A trombina bovina, substância comumento empregada
para geleificar o PRP, não foi utilizada com o propósito de se evitar
113
qualquer risco de contaminação por um material xenógeno como sugeriu
Christgau et al.
25
(2006), apesar de Marx
63
(2004) ter afirmado que este
composto é um iniciador seguro para a coagulação, sem risco de infecção
ou aumento da inflamação. Na verdade, a trombina bovina não foi
necessária, pois a adição de cloreto de cálcio a 10% foi suficiente para a
geleificação do PRP, que ocorreu em 2 minutos.
De acordo com a Associação Européia de Osseointegração
45
,
existe uma forte associação entre a falha na osseointegração de um
implante e a qualidade óssea onde este material está inserido. Assim,
torna-se clara a necessidade de se utilizar métodos objetivos de análise
dos resultados cirúrgicos, sendo que estes devem ser o menos invasivos
possível para o paciente. Neste sentido, métodos radiográficos de análise
vêm sendo constantemente desenvolvidos. Entre eles podemos citar a
densidade óssea radiográfica
14,40,69,81
, a análise fractal
66,91,101
, a análise da
textura e lacunaridade
28,101
e a subtração radiográfica digital
76
.
A aferição da densidade óssea radiográfica é um método
amplamente utilizado e consagrado em pesquisas clínicas em Radiologia.
Suas aplicações incluem a detecção precoce de doenças sistêmicas
como a diabetes
8
, a osteoporose
40,69,76
e a avaliação pós-operatória de
enxertos ósseos
89,97,100
.
A dimensão fractal, por sua vez, é uma metodologia que vem
sendo cada vez mais empregada, por seu baixo custo e caráter inovador.
Entretanto, as opiniões díspares dos autores
66,84,91,101
sobre a efetividade
114
e validade das informações que este método pode trazer têm sido motivo
de questionamento quanto aos seus reais benefícios clínicos e científicos.
Os resultados do presente estudo mostraram que quando
comparamos um seio maxilar enxertado, aqui denominado região de
interesse (RI) e um seio maxilar vazio, ou região controle (RC), o método
“densidade” foi capaz de diferenciar as RIs das RCs, independentemente
do tipo de enxerto presente (OA, VB, OA+PRP ou VB+PRP). Este é um
fato esperado e condizente com a realidade clínica haja visto que uma
cavidade preenchida por um determinado material deve ter uma
densidade radiográfica maior do que outra cavidade semelhante à
primeira, só que vazia.
A dimensão fractal, entretanto, não detectou diferenças
significantes entre as RIS e RCs dos grupos tratados com OA, OA+PRP e
VB+PRP, apenas entre as RIs e RCs tratadas com VB. Partindo-se da
premissa que a dimensão fractal afere o padrão radiográfico do
trabeculado ósseo e que o seio maxilar é uma cavidade margeada por
cortical óssea em toda a sua extensão, que estará superposta ao seio
maxilar não enxertado na imagem radiográfica, é de se esperar que os
valores das RIs sejam semelhantes aos das RCs. Na verdade, o ideal
seria que todas as RIs possuíssem valores de dimensão fractal
semelhantes às RCs, pois assim, presumiria-se que o material enxertado,
inclusive o vidro bioativo teria sido substituído por tecido ósseo. Contudo,
vale lembrar que, na análise fractal, valores numéricos semelhantes
115
podem representar estruturas ósseas com padrões microestruturais não
necessariamente iguais
101
.
Na análise da densidade óssea radiográfica dos diferentes tipos
de enxerto, os resultados mostram que os valores mais elevados foram
encontrados nos seios maxilares enxertados com VB, seguido daqueles
enxertados com OA. Entretanto, diferenças significantes foram
observadas apenas entre o VB e o OA e entre o VB e o VB+PRP, que
apresentou o menor valor de densidade. Da mesma forma, Zamet et al.
112
(1997), encontraram valores mais elevados de densidade radiográfica em
bolsas peridontais enxertadas com Perioglas após 12 meses, quando
compararam estes dados com os valores de densidade de regiões de
osso pré-existente ou de bolsas tratadas apenas com raspagem.
Na análise fractal, diferenças estatisticamente significantes foram
encontradas entre os enxertos de OA e VB e entre OA+PRP e VB. Ao
interpretar os dados gerados pela análise fractal, vemos que o enxerto de
OA apresentou valor médio bastante próximo ao valor médio das RCs,
sendo o primeiro 1,48 e o segundo 1,47, evidenciando a similaridade
estrutural, bem como a integração do enxerto autógeno com o osso
original pré-existente. Já, o VB (1,35) foi o tipo de enxerto que apresentou
um padrão estrutural mais distante da média do OA (1,48) ou da média
das RCs (1,47), sendo este resultados também esperado haja visto que
muitas partículas do biomaterial ainda estavam presentes aos 90 dias, o
116
que modificou a distribuição do trabeculado ósseo desta região em
relação ao osso autógeno.
A semelhança dos valores de dimensão fractal entre as RIs
tratadas com OA e as RCs no período pós-operatório tardio também foi
descrita por Heo et al.
49
(2002) que observaram valores similares de
dimensão fractal, nos períodos pré e pós-operatórios em radiografias
panorâmicas de mandíbulas submetidas à osteotomia em cirurgia
ortognática. Por outro lado, Tosoni et al.
90
(2006) demosntraram que a
análise fractal não foi capaz de diferenciar as alterações do trabeculado
ósseo de mulheres com e sem osteoporose, condição detectada pela
análise da intensidade de píxel no mesmo estudo.
Assim como afirmou Tosoni et al.
90
(2006) em relação à dimensão
fractal, acreditamos que a variabilidade de resultados apresentados na
literatura para ambos os métodos, análise fractal e da densidade, é
decorrente principalmente das diferenças no processo de obtenção das
radiografias e na técnica utilizada para a aferição dos mesmos.
Para a determinação da densidade e da dimensão fractal, o ideal
seria que radiografias digitais diretas fossem utilizadas ao invés de
radiografias digitais indiretas, pois as últimas sofrem interferências
decorrentes da tomada radiográfica, do processamento químico do filme
e, por fim, da digitalização da imagem. Desta forma, talvez valores mais
precisos fossem observados, pois imagens digitais diretas são mais
definidas e nítidas e os métodos não sofreriam interferências na
117
imagem
55,66
. O uso da escala de alumínio em cada radiografia, além de
permitir a comparação dos resultados nas diferentes radiografias, permitiu
que diferenças de exposição e de processamento fossem anuladas,
tornando os resultados mais confiáveis.
Do ponto de vista estatístico, diz-se que existe correlação ou
associação entre duas ou mais variáveis quando as alterações sofridas
por uma delas são acompanhadas por modificações nas outras
67
. Assim,
também foi objetivo deste estudo estimar a correlação entre as três
variáveis: densidade, dimensão fractal e histometria (% de preenchimento
ósseo). Assim sendo, no estudo da associação entre a histometria e a
densidade ou entre a histometria e a dimensão fractal, os resultados
mostraram que em todos os casos, não houve associação
estatisticamente significante entre as variáveis.
Estes dados estão de acordo com os de Schultze-Mosgau et al.
81
(2001) que estabeleceram um baixo coeficiente de correlação (r=0.16)
entre os dados da densidade e da análise histométrica de cirurgias de
enxerto “onlay” e “inlay” em maxilas atróficas, sugerindo que o método da
densidade possui um valor preditivo baixo, devendo ser reconsiderado
com instrumento de avaliação dos resultados pós-cirúrgicos. Já, Nair et
al.
66
(2001) observaram uma alta correlação dos resultados da análise
fractal com a análise histométrica (r=0.79) em cirurgias para
preenchimento de defeitos ósseos em mandíbulas de coelhos, sugerindo
118
que a análise fractal é um método efetivo para a quantificação das
alterações do padrão ósseo.
É importante ressaltar que ambos os métodos radiográficos,
densidade e dimensão fractal, detectaram diferenças importantes entre os
tratamentos com especial atenção para o OA e o VB e também entre as
RIs e RCs. Entretanto, estes métodos não foram capazes de detectar, em
alguns casos, diferenças onde de fato estavam presentes como na
comparação entre o OA e VB+PRP, comprovadas pela análise histológica
descritiva. Assim, conclui-se que os métodos apresentam limitações e que
devem ser complementares na análise dos resultados cirúrgicos.
Da mesma forma, a histometria não detectou diferenças entre os
tratamentos, uma vez que se aferiu unicamente a porcentagem de
preenchimento por tecido ósseo. Para os próximos estudos, fica clara a
necessidade de se quantificar outras estruturas não aferidas por este
experimento, que naturalmente fazem parte da anatomia histológica do
tecido ósseo, diferenciando-as de espaços meramente vazios. Assim,
resultados mais favoráveis serão detectados, principalmente nos grupos
tratados com osso autógeno. Por outro lado, como era de se esperar, a
análise histológica descritiva permitiu uma análise visual e direta dos
resultados, sendo considerada o padrão-ouro para a avaliação dos
resultados pós-operatórios.
Com relação aos tratamentos empregados como enxerto no
interior dos seios maxilares, conclui-se que os melhores resultados foram
119
encontrados no grupo tratado com osso autógeno. O vidro bioativo, por
sua vez, apresentou os piores resultados, tendo este um baixo potencial
osteocondutor e osteoindutor. Por fim, a associação do PRP ao osso
autógeno e ao vidro bioativo também não foi eficaz. Na verdade, o que se
pôde observar é que, além deste composto não ser capaz de acelerar a
neoformação óssea, como alguns trabalhos afirmam, ele alterou para
menos a quantidade óssea formada, como é possível observar nas
comparações entre o grupo tratado com osso autógeno exclusivamente e
o grupo tratado com a associação do osso autógeno e PRP.
Por fim, a extrapolação destes dados para seres humanos deve
ser cautelosa. Estudo prospectivo, randomizado, controlado que
investigue os aspectos clínicos e radiográficos de toda a extensão do seio
maxilar de seres humanos, bem como o comportamento dos enxertos
aqui testados em contato com a superfície de implantes é sobremaneira
necessário.
120
7 Conclusão
121
7 Conclusão
Com base nos achados do presente estudo, conclui-se, em relação aos
materiais utilizados como enxerto em cirurgias de levantamento de seio
maxilar de coelho, que:
•
O osso autógeno levou aos melhores resultados, comparativamente
ao vidro bioativo ou à associação destes materiais com o PRP,
devendo, portanto, ser considerado o material de escolha para a
reconstrução da região posterior da maxila.
•
O PRP reduziu a capacidade do osso autógeno em formar tecido
ósseo.
•
O vidro bioativo não induziu neoformação significativa de tecido ósseo
nas cavidades sinusais, tampouco quando associado ao PRP.
Com relação aos métodos radiográficos, conclui-se que:
•
A densidade óssea e a dimensão fractal apresentaram limitações na
aferição da neoformação óssea, comparativamente à
histomorfometria, devendo ser utilizados como métodos
complementares na análise dos resultados cirúrgicos.
122
8 Referências
123
8 Referências
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133
9 Anexos
134
9 Anexos
Tabela 1 A - Caracterização da amostra
ANIMAL GRUPO SEXO PESO – DATA* PESO – DATA**
1 1 M 3,900 - 07/12/05 3,900 - 30/01/06
2 1 M 4,250 - 05/12/05 4,250 - 30/01/06
3 1 M 3,700 - 05/12/05 4,200 - 30/01/06
4 1 M 3,950 - 09/12/05 4,050 - 30/01/06
5 1 M 4,000 - 07/12/05 4,250 - 30/01/06
6 1 M 4,400 - 08/12/05 4,250 - 30/01/06
7 1 M 4,700 - 08/12/05 4,150 - 30/01/06
8 1 M 3,800 - 08/12/05 3,900 - 30/01/06
9 1 M 3,650 - 09/12/05 4,200 - 30/01/06
10 1 M 4,350 - 08/12/05 4,150 - 30/01/06
11 2 M 4,600 - 05/12/05 4,450 - 30/01/06
12 2 M 3,950 - 05/12/05 3,750 - 30/01/06
13 2 M 4,250 - 07/12/05 3,900 - 30/01/06
14 2 M 4,250 - 06/12/05 4,350 - 30/01/06
15 2 M 3,700 - 06/12/05 4,300 - 30/01/06
16 2 M 4,350 - 06/12/05 3,900 - 30/01/06
17 2 M 3,550 - 06/12/05 3,650 - 30/01/06
18 2 M 4,050 - 06/12/05 4,050 - 30/01/06
19 2 M 4,150 - 07/12/05 4,150 - 30/01/06
20 2 M 3,650 - 08/12/05 4,000 - 30/01/06
* no momento da cirurgia de levantamento de seio maxilar
** aproximadamente 2 meses após a cirurgia de levantamento de seio maxilar
135
FIGURA 1A - PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM
EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL DA FACULDADE DE ODONTOLOGIA
DE ARARAQUARA – UNESP, AUTORIZANDO A REALIZAÇÃO DA
PESQUISA.
136
Tabela 2A - Doses do anestésico geral, sedativo, antibiótico e analgésico
para cada animal, de acordo com o peso no dia da cirurgia
ANIMAL
GRUPO
PESO
DOSE
KETAMINA
(0,35ml/kg)
DOSE
XILASINA
(0,25ml/kg)
DOSE
PENTABIÓTICO
(0,10ml/kg)
DOSE
PARACETAMOL
(0,10ml/kg)
1 1 3,900
1,30ml 1,0ml 0,39ml 0,39ml
2 1 4,250
1,48ml 1,0ml 0,42ml 0,42ml
3 1 3,700
1,29ml 1,0ml 0,37ml 0,37ml
4 1 3,950
1,38ml 1,0ml 0,39ml 0,39ml
5 1 4,000
1,40ml 1,0ml 0,40ml 0,40ml
6 1 4,400
1,54ml 1,1ml 0,44ml 0,44ml
7 1 4,700
1,64ml 1,2ml 0,47ml 0,47ml
8 1 3,800
1,33ml 1,0ml 0,38ml 0,38ml
9 1 3,650
1,27ml 0,9ml 0,36ml 0,36ml
10 1 4,350
1,52ml 1,0ml 0,43ml 0,43ml
11 2 4,600
1,61ml 1,2ml 0,46ml 0,46ml
12 2 3,950
1,38ml 1,0ml 0,39ml 0,39ml
13 2 4,250
1,48ml 1,0ml 0,42ml 0,42ml
14 2 4,250
1,48ml 1,0ml 0,42ml 0,42ml
15 2 3,700
1,29ml 0,9ml 0,37ml 0,37ml
16 2 4,350
1,52ml 1,1ml 0,43ml 0,43ml
17 2 3,550
1,24ml 0,9ml 0,35ml 0,35ml
18 2 4,050
1,41ml 1,0ml 0,40ml 0,40ml
19 2 4,150
1,45ml 1,0ml 0,41ml 0,41ml
20 2 3,650
1,27ml 0,9ml 0,36ml 0,36ml
137
Tabela 3A - Repiques do anestésico geral e do sedativo para cada
animal, de acordo com o peso no dia da cirurgia
ANIMAL
GRUPO
PESO
REPIQUE
KETAMINA
(1/3 da dose inicial)
REPIQUE
XILASINA
(1/3 da dose inicial)
1 1 3,900 0,7ml 0,5ml
2 1 4,250 0,7ml 0,5ml
3 1 3,700 0,6ml 0,5ml
4 1 3,950 0,7ml 0,5ml
5 1 4,000 0,7ml 0,5ml
6 1 4,400 0,8ml 0,5ml
7 1 4,700 0,8ml 0,6ml
8 1 3,800 0,6ml 0,5ml
9 1 3,650 0,6ml 0,4ml
10 1 4,350 0,7ml 0,5ml
11 2 4,600 0,8ml 0,6ml
12 2 3,950 0,7ml 0,5ml
13 2 4,250 0,7ml 0,5ml
14 2 4,250 0,7ml 0,5ml
15 2 3,700 0,6ml 0,5ml
16 2 4,350 0,8ml 0,5ml
17 2 3,550 0,6ml 0,4ml
18 2 4,050 0,7ml 0,5ml
19 2 4,150 0,7ml 0,5ml
20 2 3,650 0,6ml 0,4ml
138
Anexo 5: Artigo aceito para publicação no peródico internacional
Journal of Oral Implantology
139
140
141
142
143
144
145
Anexo 6 -Modelos de regressão linear múltiplo Histometria vs Densidade e
Presença de PRP
Tratamentos
Fatores Coeficiente
Erro-padrão
t p R
2
Intercepto 60,66 11,62 5,22
0,000
0,23
Densidade 1,47 6,32 0,23
0,819
OA e OA+PRP
Presença de PRP
-7,78 3,79 -2,05
0,056
Intercepto 72,18 14,20 5,08
0,000
0,12
Densidade -9,58 6,79 -1,41
0,177
VB e VB+PRP
Presença de PRP
-6,78 5,91 -1,15
0,268
*OA: osso autógeno
VB: vidro bioativo
PRP: plasma rico em plaquetas
RI: região de interesse
RC: região controle
146
Anexo 7 - Modelos de regressão linear múltiplo Histometria vs Dimensão fractal
e Presença de PRP
Tratamentos
Fatores Coeficiente
Erro-padrão
t p R
2
Intercepto 45,21 72,41 0,62
0,541
0,21
Dimensão fractal
12,01 48,85 0,25
0,809
OA e OA+PRP
Presença de PRP
-7,30 4,22 -1,73
0,103
Intercepto -0,34 45,25 -0,01
0,994
0,08
Dimensão fractal
38,43 33,35 1,15
0,267
VB e VB+PRP
Presença de PRP
-3,99 5,68 -0,70
0,493
*OA: osso autógeno
VB: vidro bioativo
PRP: plasma rico em plaquetas
RI: região de interesse
RC: região controle
147
Autorizo a reprodução deste trabalho.
(Direitos de publicação reservado ao autor)
Araraquara, 10 de outubro de 2007.
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