( PDF ) Alterações nos depósitos de glicogênio e conteúdo de glicose na hemolinfa de Achatina fulica bowdich, 1822 (mollusca, gastropoda), hospedeiro intermediário de Angiostrongylus, exposta ao látex

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE VETERINÁRIA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

DISSERTAÇÃO

ALTERAÇÕES NOS DEPÓSITOS DE GLICOGÊNIO E CONTEÚDO DE GLICOSE NA

HEMOLINFA DE ACHATINA FULICA BOWDICH, 1822 (MOLLUSCA,

GASTROPODA), HOSPEDEIRO INTERMEDIÁRIO DE ANGIOSTRONGYLUS,

EXPOSTA AO LÁTEX DE COROA DE CRISTO EUPHORBIA SPLENDENS VAR.

HISLOPII

Camila Silva de Oliveira

2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE VETERINÁRIA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

ALTERAÇÕES NOS DEPÓSITOS DE GLICOGÊNIO E CONTEÚDO DE

GLICOSE NA HEMOLINFA DE ACHATINA FULICA BOWDICH, 1822

(MOLLUSCA, GASTROPODA), HOSPEDEIRO INTERMEDIÁRIO DE

ANGIOSTRONGYLUS, EXPOSTA AO LÁTEX DE COROA DE CRISTO

EUPHORBIA SPLENDENS VAR. HISLOPII

CAMILA SILVA DE OLIVEIRA

Sob a orientação do Professor

Jairo Pinheiro da Silva

E Co-orientação do Professor

Maurício Carvalho de Vasconcellos

Dissertação submetida como

requisito parcial para obtenção do

grau de Mestre em Ciências, no

curso de Pós-Graduação em

Ciências Veterinárias, Área de

Concentração em Parasitologia

Animal

Seropédica, RJ

Fevereiro de 2007

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636.089696

O48a

Oliveira, Camila Silva de, 1983

Alterações nos depósitos de glicogênio e conteúdo

de glicose na hemolinfa de Achatina fulica

bowdich,1822

(mollusca, gastropoda), hospedeiro

intermediário de Angiostrongylus, e

xposta ao látex

de coroa de cristo Euphorbia splendens var. hislopii

/ Camila Silva de Oliveira – 2007.

46 f. : il.

Orientador: Jairo Pinheiro da

Silva.

Dissertação (mestrado) –

Universidade Federal Rural do Rio

de Janeiro, Instituto de

Veterinária.

Bibliografia: f. 35-46.

1. Parasitologia veterinária -

Teses. 2. Molusco – Teses. 3.

Glicogênio – Teses. 4. Eufórbia –

Fisiologia – Teses. I. Silva,

Jairo Pinheiro da, 1969. II.

Universidade Federal Rural do Rio

de Janeiro. Instituto de

Veterinária. III. Título.

AGRADECIMENTOS

A DEUS, primeiramente, que me deu forças para sempre lutar pelos meus objetivos

fazendo-me perseverar mesmo diante das maiores dificuldades.

A minha mãe, VANDA, e a meu pai, IVAN, sem os quais não existiria. Agradeço

por toda a luta e carinho que sempre tiveram para que eu pudesse chegar até aqui. Vocês

sempre serão o meu alicerce onde encontrarei em qualquer momento uma palavra de

incentivo e carinho, seja de um jeito mais estimulador, sempre acreditando que serei capaz

de tudo como faz a minha mãe, ou seja, de um jeito mais introspectivo e não menos

encorajador como o meu pai, quando vejo seus olhos brilhando com as minhas conquistas.

PAI e MÃE, amo muito vocês, obrigada.

A meu grande amigo e orientador, JAIRO PINHEIRO, por ter acreditado no meu

potencial desde o início, quando éramos simples colegas de laboratório. Muito obrigada por

todas as conversas onde você sempre me orientou para que eu pudesse seguir um bom

caminho e nunca desistir. Saiba que você sempre foi o meu exemplo, sua dedicação à

pesquisa, seu jeito de sempre tirar uma boa lição das peças que a vida nos prega, seu

carisma e principalmente o seu jeito prático de ser sempre me inspiraram para lutar e quem

sabe um dia poder ser uma profissio nal tão competente como você é. Poderia escrever um

número sem fim de páginas de agradecimento para você, e nem assim conseguiria

demonstrar como sou grata por tudo. Muito Obrigada.

A meu co-orientador, MAURÍCIO VASCONCELLOS, que me acolheu em seu

laboratório e muito contribuiu com seus conhecimentos para a elaboração dessa dissertação.

Obrigada.

A minha irmã que sempre acreditou em mim e apostou no meu futuro, saiba que

você é meu exemplo de determinação. Beijos.

A meu cunhado, que foi quem me despertou a vontade de fazer uma faculdade

pública e seguir na pós-graduação.

Em especial, a minha prima Adriana que comemorou todas as minhas vitórias

fossem elas acadêmicas ou não. Dri, você para mim é um exemplo de força, garra,

determinação e profissionalismo. Obrigada pelas palavras de carinho e incentivo.

A todos os parentes, que mais ou menos presentes sempre torciam para que tudo

desse certo.

Aos colegas de curso e aos amigos de curso. Renata você foi minha companheira,

Bióloga como eu, sempre que possível estávamos juntas conversando sobre os mais

diversos assuntos, adorei ter a sua companhia nessa jornada. A todos os outros colegas,

Vanessa, Isabele, Marcos, Raquel e Rodney, vocês só vieram a somar na minha formação.

Foi muito bom conhecer vocês.

A todos os funcionários do Departamento de Ciências Fisiológicas da UFRRJ e do

Departamento de Parasitologia da UFRRJ, que sempre incentivaram e apoiaram na

realização das pesquisas.

Em especial, para uma pessoa que mesmo longe durante essa etapa nunca deixou de

estar perto de mim em todos os momentos. MAURO, hoje você está aqui mesmo que seja

só para aplaudir o último ato do espetáculo. TE AMO!

E a mim, que estudei e batalhei para cumprir todos os créditos necessários, me

dividindo entre a Rural e a FIOCRUZ para realizar os experimentos da dissertação. Acho

que fiz bem feito!

RESUMO

OLIVEIRA, Camila Silva. Alterações nos depósitos de glicogênio e conteúdo de glicose na

hemolinfa de Achatina fulica bowdich, 1822 (mollusca, gastropoda), hospedeiro

intermediário de Angiostrongylus, exposta ao látex de coroa de cristo Euphorbia splendens

var. hislopii. 2007. 46p Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias, Parasitologia

Animal). Instituto de Veterinária, Departamento de Parasitologia Animal, Universidade

Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2006.

Os moluscos são invertebrados de grande importância para a medicina humana e

veterinária, pois servem como hospedeiros intermediários de vários parasitos, podem

acometer animais ou o homem. O molusco Achatina fulica em especial, é hospedeiro

intermediário de nematóides do gênero Angiostrongylus spp. Estes moluscos,foram

introduzidos no Brasil como uma tentativa de substituir o tradicional escargot, porém as

grandes criações não proporcionaram o lucro esperado e os criadouros foram abandonados.

A Euphorbia splendens var. hislopii é uma planta originária do continente africano e é

muito utilizada como planta ornamental, devido ao seu fácil cultivo. Esta planta, porém, é

classificada como tóxica pelo SINITOX – Sistema Nacional de Informações Tóxico-

Farmacológicas. Assim sendo, o presente estudo pretendeu avaliar as conseqüências do uso

do látex de Euphorbia splendens var hislopii sobre o metabolismo de carboidratos de

Achatina fulica. Para a determinação da dose subletal grupos com trinta animais foram

expostos ao látex nas concentrações de 1%, 2.5%, 5%, 7.5%, 12.5%, 15%, 20%, 25%, 50%,

75% e 100%, sendo a concentração letal

(CL

) 11,2% . Os valores observados para a

concentração de glicogênio na glândula digestiva e na massa cefalopodal demonstraram

que houve diferença significativa apenas no primeiro dia após a exposição a CL

50.

A análise

de regressão polinomial demonstrou haver uma forte relação positiva (r

=0,95) entre a

concentração de glicogênio na massa cefalopodal de moluscos expostos a CL

e moluscos

do grupo controle ao longo do tempo após a exposição ao látex. Ao comparar os níveis de

glicose na hemolinfa de moluscos expostos a CL

e de moluscos controles em função do

tempo após a exposição em dias, a regressão polinomial evidenciou que esses níveis

aumentam conforme o prosseguimento dos dias. A exposição de A. fulica à CL

do látex de

E. splendens var. hislopii provocou a redução nos depósitos de glicogênio na glândula

digestiva, e um efeito tardio sobre os depósitos de glicogênio da massa cefalopodal, e não

apresentou variações significativas no conteúdo de glicose na hemolinfa de A. fulica

exposta ao látex. Embora nos primeiros dias de dissecação tenha sido encontrado um maior

nível de glicose livre circulante na hemolinfa. A exposição ao látex de E. splendens var.

hislopii provocou uma significativa redução na concentração de galactogênio na glândula

de albúmen de A. fulica.

Palavras Chave: Achatina fulica, Euphorbia splendens, alterações fisiológicas

ABSTRACT

OLIVEIRA, Camila Silva. Alterations in the glycogen deposits and glucose content in

hemolinfa of Achatina fulica Bowdich, 1822 (Mollusca, Gastropoda), intermediate

host of Angiostrongylus, displayed to the latex of Crown of Christ Euphorbia splendens

var. hislopii. 2007. 46p Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias, Parasitologia

Animal). Instituto de Veterinária, Departamento de Parasitologia Animal, Universidade

Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, Rio de Janeiro, 2007.

Snails are invertebrate of great importance for the human and veterinary medicine,

therefore they serve as intermediate host of some parasites, being able to acometer animal

or human people. The snail Achatina Fulica is an intermediate host of nematodes like

Angiostrongylus spp. These snails had been introduced in Brazil as an attempt to substitute

traditional escargot, however the great creations had not provided the waited profit and the

criation had been abandoned. The Euphorbia splendens var. hislopii is an originary plant of

the African continent and is largely used as ornamental plant. This plant, however, is

classified as toxic by the SINITOX – Sistema Nacional de Informações Tóxico-

Farmacológicas. So the present study intended to evaluate the consequences of the use of

the latex of Euphorbia splendens var hislopii on the metabolism of carbohydrates of

Achatina fulica. For the determination of the subletal Dose groups with thirty animals had

been displayed to the latex in the concentrations of 1%, 2,5%, 5%, 7,5%, 12,5%, 15%,

20%, 25%, 50%, 75% and 100%, being Concentration Dose 50 (CL50) 11,2%. The values

observed for the concentration of glycogen in the digestive gland and the cefalopodal mass

had demonstrated that the exposition after had extremely significant difference only in the

first day after displayed. The analysis of polynomial regression demonstrated to have one

strong positive relation (r2=0,95) enters the glycogen concentration in the cefalopodal mass

of snail displayed to the CL50 and snails of control group after to long of the time the

exposition to the latex. When comparing the glucose levels in hemolinfa of displayed snails

to CL50 and snails of control group in function of the time after the exposition in days, the

polynomial regression evidenced that these levels increase as the continuation of the days.

The exposition of the A. fulica to the CL50 of the latex of Euphorbia splendens var. hislopii

make a reduction in the deposits of glycogen in digestive gland of the clam, presented in a

delayed effect on the deposits of glycogen of the cefalopodal mass of the snails, did not

have significant variations in the glucose content in hemolinfa of A. fulica displayed to the

latex. Although in the first dissection day has been found a bigger concentration of free

glucose level in hemolinfa. The exposition to the latex of E. splendens var. hislopii make a

significant reduction in the concentration of galactogen in albumen gland of the snail.

Key Words: Achatina fulica, Euphorbia splendens, physiological alterations

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ..............................................................................................................1

REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................2

1) Achatina fulica ..........................................................................................................2

1.1) Biologia Geral ...............................................................................................2

1.2) Distribuição Geográfica ...............................................................................2

1.3) Aspectos Parasitológicos ..............................................................................4

2) Euphorbia splendens var. hislopii ............................................................................6

2.1) ação moluscicida das plantas .......................................................................8

2.2) Euphorbia splendens var hislopii e sua ação moluscicida ..........................9

2.2.1) Toxicologia ........................................................................................10

2.3) Principais resultados relacionados a Euphorbia splendens var hislopi ..11

3) Carboidratos ...........................................................................................................12

3.1) Glicogênio ....................................................................................................12

3.1.1) Síntese do Glicogênio .......................................................................13

3.1.2) Degradação do Glicogênio ............................................................. .14

3.2) Galactogênio ................................................................................................14

3.2.1) Síntese do galactogênio ....................................................................15

3.2.2) Degradação do galactogênio ............................................................16

4) Alterações fisiológicas em Condições de Estresse ...............................................16

OBJETIVOS....................................................................................................................20

MATERIAL E MÉTODO..............................................................................................21

RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................24

CONCLUSÕES...............................................................................................................34

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA...............................................................................35

ANEXO A.........................................................................................................................42

1 INTRODUÇÃO

Os moluscos são organismos invertebrados de grande importância para a medicina

humana e veterinária, pois servem como hospedeiros intermediários de vários parasitos

principalmente dos trematódeos digenéticos. Muitos desses helmintos acometem animais e

ou o homem causando respectivamente, perdas econômicas principalmente em rebanhos de

corte e problemas de saúde pública.

O molusco Achatina fulica em especial, é hospedeiro intermediário de nematóides

do gênero Angiostrongylus. Estes moluscos, no entanto foram introduzidos no Brasil como

uma tentativa de substituir o tradicional escargot, porém como esse tipo de iguaria

gastronômica não faz parte dos hábitos alimentares dos brasileiros, as grandes criações não

proporcionaram o lucro esperado e os criadouros foram abandonados. Atualmente, esses

moluscos constituem uma praga espalhada por todo o Brasil, o seu apetite voraz provoca a

destruição de lavouras e a elevada taxa reprodutiva traz como conseqüência grande

aumento populacional.

Tendo em vista todos os fatores acima apontados e as recomendações da

Orgnanização Mundial de Saúde (OMS), que propõem um controle integrado das

parasitoses, cresce cada dia mais o número de trabalhos relacionados a diferentes formas de

se controlar as populações de moluscos. Uma das principais correntes avalia o uso de

plantas tóxicas e sua possível ação moluscicida, havendo várias espécies que já tiveram sua

ação moluscicida avaliada. Assim, a Família Euphorbiaceae, que é reconhecidamente

tóxica, já teve várias substâncias ativas isoladas e diversos estudos com espécies diferentes

de moluscos foram realizados, apresentando doses letais abaixo do que as recomendadas

pela OMS.

Os resultados promissores obtidos até então só fazem aumentar o interesse da

comunidade acadêmica para essa linha de estudo, fazendo crescer a cada dia o número de

trabalhos e o número de espécies de plantas estudadas.

Essas substâncias apontadas como biopesticidas têm apresentado baixa toxidez e

rápida degradação quando testadas no ambiente.

Assim sendo, o presente estudo avaliou as conseqüências do uso do látex de

Euphorbia splendens var hislopii sobre o metabolismo de carboidratos de Achatina fulica.

2 REVISÃO DE LITERATURA

1) Achatina fulica

O molusco Achatina fulica é classificado zoologicamente como, segundo Simone,

1999:

Filo Mollusca

Classe Gastropoda

Subclasse Pulmonata

Ordem Stylommatophora

Subordem Sigmurethra

Superfamília Achatinoidea

Família Achatinidae

Espécie Achatina fulica Bowdich, 1822

1.1) Biologia geral

O “Caramujo Gigante Africano”, Achatina fulica Bowdich, 1822, é um molusco

pulmonado originário do Leste da África. Essa espécie de molusco alcança dimensões

consideráveis, em torno de 20 cm de comprimento de concha.

Com relação o seu comportamento, apresenta maior atividade no período noturno e

durante o dia vivem enterrados, escondidos ou abrigados em frestas de rochas, muros,

montes de lixo, telhas, entulho, árvores, jardins, terrenos baldios ou qualquer outro lugar

protegido da exposição direta aos raios solares. Além disso, alimentam-se vorazmente de

vegetais e detritos orgânicos, destruindo hortas e plantações.

Já em relação a sua biologia reprodutiva, são hermafroditas e podem viver até seis

anos, alcançando a maturidade sexual após o primeiro ano de vida. Cada A. fulica pode

colocar de 50 a 400 ovos por postura chegando até a 500 por ano, com período de um a 15

dias de incubação.

Em 1992, Sen Mandal & Chowdhury purificaram da hemolinfa de A. fulica uma

substância denominada AchatininH, uma lectina presa ao ácido siálico, responsável pela

regulação endócrina do sistema reprodutor. Para evidenciar o sítio de produção desta

substância os autores incubaram vários tecidos do molusco in vitro com metionina, um

aminoácido precursor, a 25°C por 5 horas, demonstrando que o sítio de produção é a

glândula de albúmem que tem a função de secretar o fluido perivitelino dos ovos.

Pouco se sabe sobre a regulação endócrina dos moluscos. Os poucos trabalhos

existentes na maioria das vezes discorrem sobre regulação endócrina de sistema reprodutor,

visando entender os mecanismos biológicos para controlar a espécie de uma maneira eficaz.

Fujisawa et al. 2000 avaliaram o efeito da fulicina, um neuropeptídeo contendo D-

aminoácido, em A. fulica que controla o comportamento copulador masculino no molusco.

Em seu estudo, os autores demonstraram que a vagina e o oviduto de A. fulica são

densamente inervados com fibras neuronais imunoreativas para fulicinas.

Nesse mesmo trabalho, os autores afirmam também que a fulicina demonstrou um

efeito excitatório profundo na contração da vagina e do oviduto sugerindo assim possível

controle sobre o comportamento de oviposição.

1.2) Distribuição geográfica

Além das informações biológicas vistas acima, outro aspecto importante a ser

abordado no estudo dessa espécie é sua dispersão geográfica. Tendo em vista que esta já

está presente em diversas regiões da África, Ásia, Ilhas do Pacífico e, recentemente, foi

registrada sua ocorrência isolada no continente americano (WILSON, 1991).

Esses moluscos foram introduzidos no Brasil para a substituição do tradicional

“escargot” Helix aspersa Müller, 1774, provavelmente, na década de 30. O grande “boom”

de Achatina no Brasil foi por volta do final da década 80, no Estado do Paraná, após a

exposição desse caramujo em uma feira, onde foi apresentado como uma possibilidade para

a substituição do tradicional escargot visto que o seu grande porte e fácil reprodução

gerariam maior rentabilidade aos criadores.

Alguns fatos, portanto, são apontados como motivos para o abandono das criações

desses moluscos como a não aceitação desta espécie pela população brasileira, já que sua

carne não apresenta uma boa palatabilidade e o fato dos brasileiros não terem hábito de

consumir escargot extensivamente. Então, o que era uma promessa de enriquecimento

rápido e fácil, tornou-se uma grande frustração e motivo de perdas econômicas para muitos.

Segundo Teles et al. (1822), os moluscos escaparam dos criadouros e se dispersaram na

cidade de Itariri, no estado de São Paulo, onde foi registrada sua primeira ocorrência.

Já no Estado do Rio de Janeiro, o seu primeiro relato ocorreu no Vale do Paraíba, no

município de Resende por Vasconcellos & Pile (2001). Atualmente, estes animais estão

alastrados por todo o Brasil, principalmente no litoral, estabelecendo populações de vida

livre e tornando-se verdadeiras pragas agrícolas, por apresentar vantagens no tempo de

crescimento individual e populacional, número de proles e resistência às condições

ambientais (Fig. 1).

Figura 1- Distribuição dos moluscos Achatina fulica e Helix aspersa no Brasil

É de grande destaque a importância do “escargot” na alimentação de civilizações

antigas. No Brasil, encontramos, entre outras, a espécie H. aspersa que foi introduzida

pelos portugueses. Contudo, produtores brasileiros de “escargot” importaram A. fulica sem

a mínima preocupação de possíveis danos à agricultura, às florestas, a competição com as

espécies nativas e à saúde pública que caramujos escapados ou abandonados de suas

criações pudessem causar.

1.3) Aspectos parasitológicos

Segundo Graczyk & Fried (2001), o parasitismo, como uma interação entre dois

organismos, hospedeiro e parasito, é exclusivamente dependente do grau de integração

fisiológica entre estes organismos e a sincronia fisiológica de seus ciclos biológicos. Assim,

segundo a definição de Olsen (1977), o parasitismo é aquela relação na qual o parasito é

fisiologicamente dependente do hospedeiro.

Moluscos são organismos de grande importância médica humana e veterinária, pois

servem como hospedeiros intermediários de uma ampla faixa de parasitos,

predominantemente do grupo dos trematódeos digenéticos, como o Schistosoma mansoni

Sambon, 1907 , Fasciola hepatica Linnaeus, 1758 e outros; também há nematóides de

grande interesse médico em nosso país que têm a participação de moluscos em seus ciclos

biológicos, como o Angiostrongylus costaricensis Morera & Céspedes, 1971.

Além disso, um grande número de parasitos, que não afetam a saúde humana ou de

animais de criação, hospedam-se em moluscos e participam da complexidade de ciclos e

interações que resultam na contínua evolução das espécies.

Os moluscos da espécie A. fulica são incriminados como possíveis hospedeiros

intermediários do nematóide Angiostrongylus cantonensis (=Parastrongylus cantonensis),

causador da angiostrongilíase meningoencefálica humana (ou angiostrongilose

meningoencefálica ou meningite eosinofílica) (TELES & FONTES, 1998). A manutenção

dessa zoonose tem potencial importância na medicina veterinária por apresentar também

roedores urbanos e silvestres como hospedeiros definitivos.

A infecção por A. cantonensis ocorre após o hospedeiro definitivo ingerir as larvas

de terceiro estádio (L

), as quais emergem do hospedeiro junto com o muco que é

eliminado pelo molusco para reduzir o atrito entre a massa cefalopodal e o substrato por

onde se desloca. No homem, pode apresentar os seguintes sintomas: febre alta, vômito,

irritabilidade, rachadura na pele, ausência de reflexos nos tendões, retenção urinária,

incontinência anal e meningite, podendo levar crianças à morte. A eosinofilia pode ser

constatada no sangue periférico e no líqüor pela citologia. Assim como algumas infecções

secundárias bacterianas também podem ser observadas

Esses moluscos podem também hospedar o verme A. costaricensis, causador da

angiostrongilíase abdominal (ou angiostrongilose abdominal), doença grave com centenas

de casos já reportados no Brasil, embora nenhum desses casos haja correlação com o

molusco A. fulica como hospedeiro intermediário. Essa doença pode resultar em óbito por

perfuração intestinal, peritonite e hemorragia abdominal.

São vários os trabalhos que existem na literatura tentando elucidar a rota de

migração dos estágios larvais de A. cantonensis em A. fulica, hospedeiro intermediário

(BROCKELMEN et al. 1976; SAUERLANDER & ECKERT, 1974). Carvalho et al.

(2003), infectaram experimentalmente alguns exemplares de A. fulica com larvas de A.

costaricensis, demonstrando a susceptibilidade do molusco ao parasito. Concluindo que A.

fulica pode ser um risco para a urbanização da angiostrongilíase abdominal devido a sua

alta proliferação, dispersão contínua e extraordinária adaptação nas cidades brasileiras.

Embora ainda não tenham sido registrados casos de A. fulica parasitadas por A.

costaricensis na natureza.

Com finalidade clara, esses trabalhos se fazem muito importantes para

reconhecimento da biologia do hospedeiro quando infectado, visto que para se definir

medidas de controle é necessário antes saber como o ciclo e as infecções se processam ao

longo deste para se fazer um controle mais eficaz.

Em 1976, Sauerlander infectou experimentalmente moluscos com seis meses de

idade. Um grupo recebeu 5000 larvas em primeiro estágio de desenvolvimento (L

) e outro

recebeu 2000 larvas também de primeiro estágio de desenvolvimento (L

) de

respectivamente, Angiostrongylus vasorum Baillet, 1866 e A. cantonensis, por exposição à

suspensão larval.

Os moluscos foram histologicamente examinados após vários períodos de tempo

pós-infecção. Uma hora pós-infecção as larvas foram encontradas na massa cefalopodal dos

moluscos, duas horas pós-infecção as larvas também foram encontradas no trato

gastrointestinal, doze horas pós-infecção pela primeira vez as larvas foram encontradas no

pulmão, para onde estas são levadas através da hemolinfa. Vinte e quatro horas após, de 80

a 90% do total da população de larvas estava concentrada na massa cefalopodal e no

pulmão. O autor também relata ter detectado larvas em vários outros órgãos como manto,

glândula digestiva e trato gastrointestinal, porém as larvas dispunham-se sempre próximas

aos vasos condutores de hemolinfa. Somente após doze dias de infecção o autor detectou a

ativação dos mecanismos de defesa que consiste em envolver o parasita por um grande

número de hemócitos.

Bessa et al.(2000) avaliou o desenvolvimento biológico de A. vasorum em Subulina

octona Bruguiere, (1789), para tal foram realizadas infecções dos moluscos por diferentes

vias como alface, terra, fezes e suspensão aquosa, todos contendo o estágio L

do parasito.

Após vinte e um dias a autora verificou que todos os quatro meios de infecção testados

foram viáveis.

Ainda em seu trabalho Bessa verificou a evolução larval demonstrando que até o 6º

dia pós-infecção só havia larvas no estágio L

, no 7º dia foi encontrada a primeira larva em

estágio L

e a partir do 13º dia a primeira em estágio L

. A sobrevivência das larvas de

estágio L

foi testada em diferentes temperaturas, e a maior sobrevivência, 23 dias, ocorreu

em temperaturas baixas cerca de 19,33°C.

Apesar de sempre relacionados a situações de aspecto negativo e da busca

incessante por medidas de controle cada vez mais eficazes, existem trabalhos, como o de

Tella (1979), no qual o autor investiga os possíveis efeitos farmacológicos do fluido

corpóreo e de extratos feitos com o tecido do pé de A. fulica, demonstrando que nas duas

fontes pesquisadas pode haver um agente anti-hipotensivo como os encontrados em

moluscos aquáticos.

Medidas de controle para os moluscos, principalmente A. fulica no Brasil, são de

extrema urgência por vários motivos. Seja por que o molusco foi introduzido

indevidamente no país e devido à ausência de predadores naturais se tornou uma verdadeira

praga, com reprodução intensa, destruindo lavouras e pequenas plantações. Seja pelo fato

do molusco atuar como hospedeiro intermediário de determinados parasitos com sucesso de

infecções experimentais já relatadas, ou até mesmo por problemas de saúde pública e

controle de epidemias visto que devido ao seu grande porte a concha dos moluscos depois

de mortos se não destruídas podem acumular água funcionado perfeitamente como

criadouro de larvas de vários insetos como o mosquito Aedes aegypti Linnaeu, 1758 vetor

do vírus da dengue, epidemia de difícil controle no estado do Rio de Janeiro (TRIPS 1973).

Em seu estudo, Ments & Graeff-Teixeira (2005) mantiveram quinze duplas

(macho/fêmea) de A. costaricensis in vitro, em meio de Waymouth durante 3 dias, para

observação da quantidade e duração da oviposição. Médias de 321, 24 e 4 ovos em 10

microlitros foram registradas em 24, 48 e 72 horas, respectivamente. A maioria dos ovos

foi eliminada nas primeiras 24 horas, sugerindo terem sido expulsos em condições não

fisiológicas. Estes resultados indicam que as condições in vitro não são adequadas para

testes de drogas inibidoras da oviposição, para tratamento da angiostrongilíase abdominal.

Graeff-Teixeira et al. (2006) fizeram um estudo longitudinal clínico-sorológico de

pacientes parasitados com A. costaricensis. Durante os estudos que durou cinco anos os

autores avaliaram e acompanharam 179 indivíduos residentes na zona rural do Sul do Brasil

com transmissão ativa. Após as coletas de dados os autores evidenciaram resultados que

indicam casos de re-infecção, em 32 indivíduos o teste de ELISA acusou reatividade para

IgG por pelo menos um ano, ambos os sexos masculino e feminino foram mais afetados na

faixa etária dos 30 aos 49 anos. Em algumas residências os autores encontraram moluscos

naturalmente infectados com estágio L

, apresentando uma prevalência de 16% e baixas

cargas parasitárias. Os autores concluem então que a angiostrongilíase abdominal no sul do

Brasil pode ser uma infecção freqüente, porém com baixa morbidade e reatividade

sorológica de gradual declínio.

2) Euphorbia splendens var. hislopii (Euphorbiaceae)

A Euphorbia splendens var. hislopii N.E.B. (Sin. Euphorbia milii Des Moulins var.

splendens (Hook) Ursch & Leandri ) (Carter, 1994) pertence a família Euphorbiaceae.

(Fig.2)

Figura 2- Euphorbia slendens var hislopii (coroa-de-cristo) – FIOCRUZ, RJ.

É uma planta originária do continente africano, na Região de Ilseberge, localizada

no Planalto Central da Ilha de Madagascar. Tem distribuição cosmopolita e é muito

utilizada como planta ornamental, devido ao seu fácil cultivo.

Esta planta, porém, apesar de sua extensa utilização ornamental é classificada como

tóxica pelo SINITOX – Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas.

Diferentes espécies da família Euphorbiaceae são conhecidas pela sua atividade

moluscicida. No entanto, até pouco tempo essas plantas não se mostravam muito atraentes

para estudos devido aos vários problemas relacionados à sua toxidez. Muitas espécies da

família Euphorbiaceae contêm componentes que promovem irritações locais por contato e

forbol ésteres, freqüentemente encontrados em muitos gêneros dessa família, como por

exemplo, os gêneros Croton e Euphorbia (FARNSWORTH et al. 1987). Este último

componente toma grande importância por ser reconhecido como potente indutor de

crescimento de tumores in vivo e aumentar a transformação de células sadias em células

malignas em situações in vitro (WILLIAMS & WEISBURGER, 1986).

Sendo assim, desde que se observou uma ação letal do látex para várias espécies de

moluscos do gênero Biomphalaria em concentrações menores que 0,5 ppm em condições

laboratoriais (VASCONCELOS & SCHALL, 1986), a coroa de cristo - E. splendens var.

hislopii, tornou-se especialmente interessante para os estudos.

O interesse em estudar a planta e sua ação moluscicida começou na década de 90

quando em 1991, Zani e colaboradores identificaram a presença de miliaminas no látex da

“coroa de cristo”. O fracionamento fitoquímico do látex revelou a presença de oito

substâncias derivadas da fração ativa, uma delas, porém, a miliamina L, apresentou uma

dose letal 90 (DL

) para os moluscos do gênero Biomphalaria de 0.01 ppm (ZANI et al.

1989). Número este que é cem vezes mais potente que a niclosamida, o componente

utilizado em larga escala na década de 90. A miliamina L teve sua ação letal demonstrada

para várias espécies de moluscos, como por exemplo, Biomphalaria glabrata Say, 1818,

Biomphalaria tenagophila Orbigny, 1835, Biomphalaria straminea Dunker, 1848,

Biomphalaria pfeifferi Pfeiffer 1839 e Bulinus sp, com doses letais variando entre 0.13 e

4.0 ppm dependendo da espécie testada (VASCONCELLOS & SCHALL, 1986; SCHALL

et al. 1998).

Essa substância, porém, foi avaliada em vários estudos juntamente com outras

miliaminas não revelando efeitos tóxicos nas concentrações usadas como moluscicidas.

(FREITAS et al. 1991; SCHALL et al. 1991; SOUZA et al. 1997; CRUZ et al. 1996;

OLIVEIRA-FILHO & PAUMGARTTEN, 1997).

Contudo, o fato mais representativo para justificar o número sem fim de estudos

com E. splendes var hislopii atualmente, é o fato das doses letais encontradas até hoje para

várias espécies de moluscos serem muito menores do que a recomendada pela OMS para

plantas utilizadas como moluscicida.

Segundo recomendações da Organização Mundial de Saúde (OMS), o controle das

parasitoses deve ser integrado. O controle dos moluscos é de extrema importância desde

que associados ao tratamento das pessoas doentes, junto com o controle do ambiente e

desenvolvimento sócio-econômico e com a participação da comunidade na educação para

promoção da saúde.

Entretanto, moluscicidas químicos são muito usados no controle dos caramujos. E

na maioria dos casos têm ocorrido rápida recolonização dos sítios de transmissão pelos

hospedeiros intermediários (PIERI et al. 1995). No Brasil, o uso da niclosamida é

freqüente, assim como a recolonização, pelos moluscos, dos sítios de aplicação. Além do

problema citado anteriormente de recolonização, há dados na literatura que inferem sobre

outros efeitos da ação letal das niclosamidas em seres vivos não alvos, como anfíbios,

peixes e plantas aquáticas. (ANDREWS et al. 1983).

Por essas razões, são realizados muitos estudos para desenvolver medidas

preventivas para o controle de caramujos. A maioria destes é baseado na possibilidade de

usar plantas ou derivados de plantas como moluscicida efetivo e com baixa toxicidade Por

que você usa toxicidade para o ambiente e outros animais.

Estudos alternativos que avaliam as propriedades moluscicidas de extratos de

plantas têm demonstrado que além de não afetar o ambiente, os extratos são de baixo custo.

De acordo com Guia Norte Americano, derivados de plantas moluscicidas são considerados

biopesticidas, o que os difere dos produtos sintéticos padronizados para espécies

específicas, pois não são tóxicos e devido a sua ocorrência natural causam menos danos ao

meio ambiente (KOEMAN, 1987).

2.1) Ação moluscicida das plantas

O uso de moluscicidas vem sendo estudado desde 1930 com a perspectiva de que se

torne o mais adequado e efetivo método de controle para caramujos que atuam como

hospedeiro intermediário de várias parasitoses. As investigações sobre as propriedades

moluscicidas das plantas, vêm crescendo ultimamente, com mais de 1.400 espécies já

estudadas (KLOOS & Mc COLLOUGH, 1987; JURBERG et al. 1989).

Extratos de plantas são investigados como potenciais moluscicidas, o que seria uma

estratégia auxiliar no controle principalmente da esquistossomose que é considerada um

problema de saúde pública.

Existem vários levantamentos sobre plantas moluscicidas, que fornecem inúmeras

informações sobre as plantas testadas, bem como sobre condições de testes realizados.

Esses estudos se fazem importantes porque quanto maior for o número de plantas

assinaladas, maior será o número de gêneros e conseqüentemente de espécies promissoras.

Em 1982, Kloos & Mccullough publicaram um levantamento com 61 espécies de

plantas. Nesse trabalho existe uma revisão bibliográfica sobre listagens de plantas testadas

como moluscicidas nos trabalhos de Amorim & Pessoa (1962), Barbosa & Mello (1969),

Silva, Souza & Rouquayrol (1971), Sousa E Rouquayrol (1974), Rouquayrol, Sousa &

Silva (1972), Rouquayrol, Sousa & Matos (1973) e Rouquayrol Et Al. (1980), que

identificaram várias plantas Brasileiras com atividade moluscicida em potencial.

Posteriormente, em 1987, novamente Kloos & Mccullough baseados no Banco de

Dados do NAPRALERT, listaram 571 plantas estudadas quanto as suas propriedades

moluscicidas. Estes mesmos dados foram utilizados no trabalho de Farnsworth et al.

(1987), em que os autores correlacionam as plantas que apresentam atividades moluscicidas

com seus princípios ativos, quando já testados, e sua distribuição geográfica, tornando

assim o levantamento mais completo.

Jurberg et al (1989) realizaram um levantamento no qual foram analisadas 73

famílias somando um total de 344 espécies. Dentre estas, 26 espécies em 19 famílias com

214 exemplares, apresentaram mortalidade em concentrações inferiores a 100 ppm. As

famílias das Euphorbiaceas e Sapindaceas, com duas e uma espécies, respectivamente,

apresentaram 100% de mortalidade a concentrações inferiores a 10 ppm. O resumo dos

resultados encontrados por esses autores está apresentado na Tabela 1.

Tabela 1- Famílias de plantas que apresentaram melhor atividade moluscicida com doses

letais menores que 100 ppm e 10 ppm.

Família

Total de

espécies

Nº de espécies que

matam em dose em

inferior a 100 ppm

Nº de espécies que matam

100% em dose inferior a 10ppm

Anacardiaceae 6 1 *

Apocynaceae 6 2 *

Bignoniaceae 2 1 *

Celastraceae 1 1 *

Compositae 92 4 *

Euphorbiaceae 23 5 2

Graminaceae 2 1 *

Lauraceae 6 1 *

Magnoliaceae 1 1 *

Melastomaceae 1 1 *

Rhamnaceae 3 1 *

Rubiaceae 5 1 *

Rutaceae 10 1 *

Sapindaceae 6 1 1

Vochysiaceae 4 1 *

L. Caesalpinoideae 15 1 *

L. Mimosoideae 15 1 *

L. Papilionoideae 14 1 *

2.2) Euphorbia splendens var hislopii e sua ação como moluscicida

A E. splendens var hislopii é uma planta bem adaptada ao clima do Brasil,

amplamente distribuída pelo país e de fácil crescimento. Além disso, a preparação do

moluscicida é simples, basta diluir o látex na água.

Resultados prévios demonstraram baixa toxidez do látex da E. splendens para pele e

olhos de cachorros e ratos e para pele de humanos (RIZZO & PORIFIRO, 1971), para pele

e os olhos de coelhos (FREITAS et al. 1991) e apresentando letalidade para o molusco

hospedeiro intermediário da esquistossomose, fatos estes que ampliam a margem

satisfatória para o uso do produto no campo.

Então em 1987, Koeman argumentou que se o produto é baseado num extrato

aquoso de planta, os constituintes tóxicos são menos acumulativos através das cadeias

alimentares.

O látex mostrou apenas uma pequena variação na potencialidade pelas estações e

área geográfica de coletas (SCHALL et al. 1992), onde os autores encontraram doses letais

(DL

) de 1.14 ppm na primavera, 1.02 ppm no outono, 1.09 ppm no inverno, e 1.07 ppm

no verão contra B. tenagophila no campo. Tais resultados talvez possam ser explicados pela

fisiologia da planta que tem todo seu metabolismo alterado, inclusive a produção de látex,

em função de aspectos abióticos como temperatura, intensidade luminosa, quantidade de

água disponível e outros fatores climáticos que no Brasil sofrem alterações consideráveis ao

longo do ano.

Ensaios com látex coletados em Belo Horizonte e Recife produziram valores

similares para DL

90,

com os obtidos de látex coletado no Rio de Janeiro, demonstrando

estabilidade geográfica para o efeito moluscicida dentro de uma mesma estação do ano.

Outros testes demonstraram que a atividade moluscicida do látex natural permanece

inalterada se este for armazenado por até 124 dias em temperatura ambiente e por 736 dias

em garrafa fechada (látex liofilizado) em refrigerador com temperatura de 10-12°C

(SCHALL et al. 1992).

Vasconcellos & Amorim (2003a) demonstraram a ação moluscicida do látex da

“coroa-de-cristo” – E. splendens var. hislopii – contra o molusco Lymnaea columella Say,

1817, hospedeiro intermediário de F. hepatica em condições de laboratório. Para realização

dos testes, os moluscos foram coletados nos tanques da piscicultura da Universidade

Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ. O objetivo dos autores era avaliar a ação

do látex ao longo das quatro estações do ano, e obtiveram os seguintes resultados

observando 100% de mortalidade no verão a uma concentração de 0.6mg/L; 100% de

mortalidade no inverno e outono a uma concentração de 1mg/L, enquanto na primavera

100% de mortalidade só foi conseguido a uma concentração de 2mg/L. Evidenciando dessa

maneira os fatos acima citados, referentes a pouca estabilidade moluscicida ao longo do

ano.

2.2.1) Toxicologia

Com a descoberta da ação moluscicida presente na E. splendens var hislopii, os

resultados promissores apontados pelas baixas doses letais encontradas, e as promessas de

controle de doenças endêmicas como a esquistossomose e a fasciolose, fizeram crescer

também o número de estudos sobre os possíveis efeitos toxicológicos presentes na planta

antes de iniciar o seu uso em larga escala.

Em 1986, Cruz e colaboradores avaliaram o efeito da planta na promoção de

crescimento de tumores devido à presença de forbol éster nas plantas da família

Euphorbiaceae.

Do ponto de vista da toxicologia ambiental, o látex mostra-se como um moluscicida

interessante por ser biodegradável e por ser menos perigoso para os organismos não alvo

quando comparado a Niclosamida®, que é o componente moluscicida mais utilizado

atualmente (OLIVEIRA-FILHO et al.1995).

Apesar dessas vantagens, é necessário ter cuidado compreender e avaliar todas as

questões toxicológicas relacionadas ao látex antes de iniciar o uso do mesmo em programas

de controle de moluscos.

São muitos os estudos que mostram a eficiência do látex da “coroa-de-cristo”,como

é vulgarmente conhecida, como moluscicida, entretanto, uma avaliação toxicológica ampla

do látex se faz necessária antes de cogitar a possibilidade de usar o produto em larga escala,

devido à presença de compostos cancerígenos na sua composição.

Visando demonstrar possíveis efeitos, Cruz et al. (1996) procuraram determinar se o

látex de Euphorbia milii, sinonímia de E. splendens var., hislopii, continha alguma

atividade promotora no crescimento de tumores em ensaios de curto período in vitro.

Amostras do látex liofilizado foram testadas em uma escala de concentração não citotóxica

de um, 10, 50 e 100µg/mL em três experimentos independentes. Em todos os três ensaios, o

látex de E. milii inibiu consideravelmente a cooperação metabólica entre as células V79 em

concentrações menores ou iguais a 10µg/mL. Quando analisados conjuntamente os

resultados dos três ensaios independentes mostraram que o látex de E. milii inibe a

cooperação entre mediadores metabólicos da junção GAP das células V79. Indicando

assim, que o látex de E. milii contém substâncias que promovem o crescimento de tumores,

sugerindo que o uso in natura do látex como moluscicida pode ser carcinogênico para as

pessoas que ficarem expostas continuamente ao produto.

Outros testes toxicológicos foram realizados, incluindo estudos de irritabilidade

(através de filtragem de TA98 e TA100 de Salmonella typhimuriium e citotoxicidade

(através de ensaios com células ovarianas de hamster chinês) (SCHALL et al. 1991 e

ZAMITH et al.1996), embriofetotoxicidade (usando camundongos Wistar tratado com

solução do látex durante o segundo estádio do período embriogênico, do sexto ao 15° dia

de gravidez) (SOUZA et al. 1997), ecotoxicologia (usando espécies de plâncton, peixes,

moluscos e larvas de insetos) (OLIVEIRA-FILHO & PAUMGARTTEN, 1997) e

toxicologia sub-crônica (administrando doses subletais a ratos por 90 dias), todos os

estudos não revelaram efeitos tóxicos nas concentrações usadas como moluscicida.

Contudo, outros ensaios demonstraram que E. splendens var. hislopii também

possui efeitos medicinais, como citado por Rao & Sussela (1982), quando estes realizaram

um estudo químico da planta e isolaram alguns poucos esteróides, e um deles (citrotadienol

– Ia) que reconhecidamente possui ação anti-inflamatória. Lee et. al (1982) citam o uso do

caule, raiz e do látex de E. splendens pelos Chineses na medicina popular como remédio

natural para hepatite e edema abdominal. Estudos com o extrato clorofórmico do caule e

das folhas dessa planta identificaram uma substância, que possui propriedades

anticancerígenas, inibindo, por exemplo, o crescimento de linfócitos leucêmicos. Não há

referências de efeitos negativos de E. splendens var hislopii feitos no sistema

NAPRALERT (FARNSWORTH et al. 1981).

Testes toxicológicos indicaram que a dose de campo recomendada não é prejudicial

a outros organismos que não sejam o alvo (SCHALL et al. 1998).

2.3) Principais resultados relacionados à Euphorbia splendens var hislopii

Estudos de campo com látex natural em ambientes lênticos e lóticos mataram 100%

das B. glabrata e B. tenagophila nas concentrações de 5 e 12 ppm, respectivamente.

(BAPTISTA et al. 1992, 1994; MENDES et al. 1992,1997).

Vários estudos já foram realizados para se observar à ação moluscicida de algumas

substâncias com várias espécies de moluscos, hospedeiros intermediários, para vários

parasitos. Madsen (1990) atesta em seu trabalho que com o advento de novas drogas e

técnicas de diagnóstico, a ênfase no controle da esquistossomose mudou do controle do

caramujo para a quimioterapia dos indivíduos infectados. Entretanto, essa medida não

previne novas infecções permanecendo a necessidade de reduzir a densidade de caramujos

nas águas fornecidas aos homens. Já que no passado os tratamentos com moluscicidas eram

ineficientes, caros e causavam sérios problemas ambientais.

Paniragrahi & Raut (1993) utilizaram o item alimentar preferido das lesmas

Laevicolis alte Férussac, 1822 e do caramujo A. fulica para preparar iscas tóxicas injetando

os pesticidas Rogor® e Nuvan® para matar moluscos. As iscas tóxicas preparadas com

Trichosantes dioica e Lycopersicum esculentum foram aceitas por todos os indivíduos das

duas espécies, independentemente do pesticida utilizado. Em todos os casos, as lesmas e

caramujos morreram dentro de um tempo considerável após consumir a isca. A importância

do uso de iscas tóxicas não está relacionada somente com a certeza do sucesso na morte dos

organismos, mas também com o uso seguro de material tóxico a fim de evitar riscos

ambientais.

Giovanelli et al. 2001 testaram o látex de E. splendens var. hislopii em Melanoides

tuberculata Müller, 1774, usado no controle biológico de planorbídeos que são hospedeiros

intermediários de Schistossoma mansoni Sambon, 1907, na região de Sumidouro no Estado

de Rio de Janeiro, Brasil. Como o molusco M. tuberculata, encontrado no local, reduz

naturalmente por competição exclusiva a população de B. glabrata, o uso do látex pode

afetar as duas espécies trazendo conseqüências negativas para o controle biológico. Desse

modo, o uso do látex só se torna interessante e vantajoso se o M. tuberculata for mais

resistente à toxina. Após os experimentos, os resultados demonstraram que a DL

para M.

tuberculata é 13,8 vezes maior do que a mesma dose para B. glabrata, então o uso do

moluscicida na presença do M. tuberculata possui um efeito sinérgico na redução da

população de Biomphalaria, podendo atuar de forma seletiva na eliminação de moluscos

hospedeiros de S. mansoni, sem, contudo, eliminar outros moluscos presentes no ambiente.

Vascocellos & Amorim (2003b), após estudos laboratoriais preliminares, utilizaram

o látex da E. splendens var. hislopii em ambientes simulados de campo, testando a

aplicação de solução aquosa do látex na concentração de 5mg/L em tanques da piscicultura

da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Os resultados demonstraram que 24 horas

após a aplicação houve uma redução de 97,4% no número de L. columella presente nos

tanques. Além desse resultado, 100% dos moluscos colocados em gaiolas, usados como

sentinelas em três pontos eqüidistantes do sítio de aplicação, morreram.

Contudo, o látex de E. splendens var. hislopii é uma substância promissora no uso

como moluscicida, visto que ele satisfaz muito dos critérios apontados por Mott (1987)

como os recomendados pela OMS para este tipo de utilização, por exemplo, as doses letais

encontradas para os moluscos vetores da esquistossomose são muito menores do que as

recomendadas pela OMS, pela fácil preparação do extrato que pode ser diretamente

manipulado pela população de áreas endêmicas que quase sempre está envolvida em

atividades agrícolas.

Assim sendo, devido à grande importância dos moluscos como hospedeiro

intermediário de vários parasitos, torna-se fundamental o uso de métodos de controle para o

hospedeiro intermediário. Uma vez que na ausência desse hospedeiro o ciclo biológico do

parasito não se completa, reduzindo assim a incidência das parasitoses nas quais esses

moluscos façam parte do ciclo.

3) Carboidratos

3.1) Glicogênio

O glicogênio é um polímero de D-glicose com cadeias lineares apresentando

ligações α(1,4) e grande número de ramificações formadas através de ligações α(1,6),

apresentando uma grande capa de solvatação. Esta macromolécula pode ser composta

apenas por resíduos de glicose ou pode apresentar outros componentes, notadamente,

açúcares derivados, como os aminoaçúcares, sendo, então, denominados homopolímeros ou

heteropolímeros, respectivamente.

A função básica da molécula de glicogênio é o armazenamento de glicose, o

substrato mais prontamente utilizável no processo de obtenção de energia pelos animais.

Assim, em momentos de alta demanda energética ou em condições fisiológicas de estresse

o metabolismo é acelerado e o glicogênio pode ser degradado por enzimas específicas, para

originar glicose livre, da qual é extraída a energia necessária para a manutenção de seus

processos vitais, seja por via aeróbia (respiração celular) ou anaeróbia (fermentação).

O glicogênio nos moluscos é encontrado em células especiais que o armazenam na

região anterior do manto e entre os ácinos da glândula digestiva e a gônada (MUELEMAN,

1972). Além dos sítios de localização citados acima, o tecido muscular, como aquele

presente na massa cefalopodal, também pode estocar quantidades consideráveis de

glicogênio, porém estes depósitos são direcionados (PINHEIRO & AMATO, 1994).

As duas enzimas reguladoras do metabolismo do glicogênio em mamíferos, a

glicogênio sintase e a glicogênio fosforilase, tiveram suas propriedades bioquímicas e

biofísicas bem caracterizadas e existem nas formas ativa (a) e inativa (b) sendo

diferenciadas pela presença ou ausência do ligante covalente fosfatado, respectivamente

(FISHER et al., 1970; STALMAN & HERS, 1973).

Trabalhos, tais como os realizados por More & Gosselin, 1962; Wang & Scheer,

1963, citam que as enzimas glicogênio fosforilase e glicogênio sintase estão presentes em

várias espécies de moluscos.

3.1.1) Síntese do glicogênio

Em 1957, Luiz Leloir e colaboradores demonstraram que o glicogênio é sintetizado

por um caminho diferente nos moluscos. O doador de glicosila é a uridina difosfato glicose

(UDP-glicose) e não a glicose-1-fosfato. A UDP-glicose, forma ativada da glicose é

sintetizada a partir da glicose-1-fosfato e uridina trifosfato (UTP) em uma reação catalisada

pela UDP-glicose pirofosforilase (Fig. 3).

Figura 3 - Esquema representando a transformação da Glicose-1-fosfato em UDP-glicose

pela UTP.

Durante o processo de formação, novas unidades glicosídicas são adicionadas aos

resíduos terminais não redutores do glicogênio. A unidade glicosídica ativada da UDP-

glicose é transferida para a hidroxila em C-4 de uma extremidade de glicogênio para formar

uma ligação a(1,4)-glicosídica. Esta reação é catalisada pela enzima glicogênio sintetase.

As ramificações, porém, são formadas pela adição de radicais glicosídicos na

posição a(1,6) através da enzima de ramificação, e estas aumentam tanto a solubilidade do

glicogênio bem como a sua velocidade de síntese e degradação.

Nos moluscos, a enzima glicogênio sintase b, que contém fosfato ligado

covalentemente é inativa in vitro a não ser na presença de glicose-6-fosfato (G6P).

Entretanto, a fosforilase b é inativa na ausência de adenosina monofosfato cíclico (AMP) e

não contém fosfato. Além disso, in vivo, a forma ativa dessas duas enzimas, sintetase a e

fosforilase b, possuem ligações covalentes de fosfato, não requerendo, nessas condições,

presença de moduladores. É importante ressaltar também que alguns moluscos como B.

glabrata, possuem ambas as enzimas na região cefalopodal (CHIANG, 1977),

corroborando os resultados encontrados por Pinheiro & Amato (1994).

Apesar da via preferencial de metabolismo dos polissacarídeos ser aeróbia, como

visto acima, Von Brand et al. (1950) demonstraram o consumo de carboidratos por moluscos

aquáticos em condições anaeróbias e a conseqüente produção de dióxido de carbono e

ácido lático.

Assim, de acordo com o trabalho realizado por Menakshi & Scheer (1968), no qual

os autores, após terem injetado glicose e maltose marcadas com

C, observaram a

formação de polissacarídeos marcados na glândula digestiva, no pé e na glândula de

albúmen de moluscos terrestres e como o visto por outros autores que obtiveram em

experimentos semelhantes à formação de fosfatases, lactato e intermediários do ciclo de

Krebs, também, marcados com

C, pode-se concluir a existência dos diferentes sítios de

reserva dos polissacarídeos e a presença de duas vias metabólicas para utilização do

glicogênio.

3.1.2) Degradação do glicogênio

O processo de degradação do glicogênio foi elucidado graças aos estudos que

mostraram que o glicogênio é cindido pelo ortofosfato para dar origem a uma nova ose

fosforilada, que identificaram como glicose-1-fosfato, através do isolamento e cristalização

da glicogênio fosforilase, enzima que catalisa esta reação. Portanto, fica claro que a reação

de degradação não é reversa da reação de síntese.

A fosforilase catalisa a remoção sequencial de resíduos glicosídios da extremidade

não redutora da molécula do glicogênio. A ligação glicosídica entre o C-1 de um resíduo

terminal e o C-4 do resíduo adjacente é cindida pelo ortofosfato. Especialmente, a ligação

entre o átomo de carbono C-4 e o átomo de oxigênio é cindida pelo ortofosfato e a

configuração a em C-1 é mantida.

A cisão fosforolítica do glicogênio é energeticamente vantajosa porque a ose

liberada é fosforilada. Ao contrário, uma cisão hidrolítica originaria uma glicose, que teria

que ser fosforilada às custas de ATP para entrar na via glicolítica.

O glicogênio é degradado até uma extensão limitada somente pela fosforilase. As

ligações a(1,6)-glicosídicas nos pontos de ramificação não são suscetíveis de serem

rompidas pela fosforilase. Quando a fosforilase atinge o quarto resíduo terminal a partir da

ramificação sua atividade cessa, então uma enzima de transferase migra o bloco de três

resíduos glicosídicos de um ramo extremo para outro, essa migração expõe o primeiro

resíduo a uma terceira enzima, chamada enzima de desramificação ou a(1,6)-glicosidase,

convertendo assim a estrutura ramificada do glicogênio em uma estrutura linear.

3.2) Galactogênio

Hammarstein (1885) registrou a presença de uma glicoproteína em extratos de

glândula de albúmem de Helix pomatia Linnaeus, 1758 e observou que a fração glicídica

desta apresentava características semelhantes às do glicogênio, porém possuía propriedades

levorrotatórias, ele a chamou de sinistrina. Em 1925, Levene, ao trabalhar com extratos

obtidos de H. pomatia e H. aspersa demonstrou que a substância chamada de sinistrina era,

na realidade, um polissacarídeo composto por galactose ou por derivados acetilados deste

monossacarídeo e que a fração protéica obtida por Hammarstein era, de fato, uma

impureza. Mas somente em 1931, May confirmou as observações de Levene e propôs o

nome galactogênio para este polissacarídeo. Desde então, o galactogênio, polímero de alto

peso molecular descrito como contendo tanto D como L-galactose em uma razão

aproximada de 6:1, tem sido citado em várias espécies de moluscos pulmonados. (MAY

1931; McMAHON et al., 1957)

Bioensaios com culturas orgânicas de glândula de albúmen de H. pomatia

demonstraram que a biosíntese de galactogênio é supostamente acelerada por um

neurohormônio secretado pelo molusco (GOUDSMIT, 1975; GOUDSMIT et al., 1984). No

entanto, os estudos ainda não foram capazes de provar se a ação deste neurohormônio tem

como alvo o processo de síntese de galactogênio ou a atividade das enzimas.

O galactogênio, no entanto, é encontrado exclusivamente na glândula de albúmen,

um órgão sexual secundário do sistema reprodutor feminino, e em ovos recém colocados. A

glândula de albúmen é uma glândula exócrina que contém somente dois tipos de células:

ciliadas e secretoras. Esta última sintetiza o polissacarídeo que posteriormente é

armazenado em vesículas membranosas destinadas ao complexo golgiense.

3.2.1) Síntese do galactogênio

Até o presente momento, vários estudos foram realizados na tentativa de elucidar os

processos que permeiam a síntese do galactogênio. Para tal, os autores utilizam-se de

métodos de marcação enzimática que permitem o estudo da síntese do polissacarídeo, em

tecido extraído durante as dissecações dos moluscos. Assim, não se pode afirmar que esses

resultados correspondam à verdade, pois não necessariamente as situações encontradas nos

testes in vitro são as mesmas que ocorrem nas situações in vivo.

Dessa forma, é possível supor que as enzimas biossintéticas se localizem no sistema

endomembranas. Talvez, a galactosiltranferase e a L-galactosidase estejam localizadas no

mesmo sub-compartimento do Golgi ou em vesículas ainda não descritas.

A atividade L-galactosidase descrita por Goudsmit et al. (1989) pode ser in vivo,

uma enzima lisossomal a L-fucosidase. Seu papel se houver, na biosíntese de galactogênio

requer conhecimentos de localização imunocitoquímica. Os estudos de Goudsmit et al.

(1989) sobre o aceptor específico, indicaram uma variedade de galactanas que são carentes

em L-galactose e podem atuar como aceptores para a 1,6-D-glactosiltransferase. Por outro

lado, estudos provam que o galactogênio é formado por ligações tipo ß- D-(1?3) e ß- D-

(1?6).

As moléculas de galactogênio nos moluscos terrestres são usualmente ricas em

terminações não redutoras. Aproximadamente, 40% do total de resíduos galactosil estão

nesse tipo de terminações, com 14% do total de galactose na forma de L-isômero.

Conjuntamente, a demonstração da presença de glicose-1-fosfato uridiltransferase

na glândula de albúmen de H. pomatia e a formação de galactogênio a partir da uridina

difosfato glicose (UDP-glicose), indicam que a síntese de galactose e do galactogênio são

supridas pela glicose fosfatase. Esses conhecimentos fizeram Sawicka & Chojnacki (1968)

testar a biossíntese do galactogênio a partir de glicose-1-fosfato (G-1-P) e glicose-6-fosfato

(G-6-P), demonstrando dessa maneira que a G-1-P fornece as unidades de galactose usadas

na síntese do galactogênio. O processo, porém, depende da presença de UTP e da formação

de UDP-glicose como um passo intermediário. De acordo com Goudsmit & Ashwell

(1965), a UDP-galactose atua melhor como precursor do galactogênio quando comparado a

UDP-glicose. Isso pode ocorrer devido à atividade da UDP-glicose 4-epimerase, presente

no estudo de Goudsmit & Ashwell (1965), sendo nesse caso o equilíbrio da reação: UDP-

glicose?UDP-galactose deslocado para a esquerda, e consequentemente toda UDP-

galactose formada é prontamente utilizada na síntese do galactogênio.

Estudos mais recentes, entretanto, como o realizado por Goudsmit et al. (1989)

permitiu identificar e obter, através de purificação, 2000 resíduos ativos da enzima presente

na glândula de albúmen capazes de transferir D-galactose da UDP-galactose e adicionar

monômeros de D-galactosil através de ligações α ou β? (1?6) ao aceptor de galactogênio

em H. pomatia. A enzima descrita pelos autores possui uma faixa de pH ótimo entre 6.8 e

7.5 e é ativada pela presença de Mg

Outras pesquisas demonstraram que apesar do galactogênio ser o melhor aceptor em

H. pomatia, a enzima também é capaz de utilizar galactanas de fígado de bovinos e

galactogênio de Lymnaea. stagnalis.

Joziasse et al., 1987 citam a atividade da UDP-D-galactose: galactosídeo ß-(1?3)-

galactosiltransferase em extratos de glândula de albúmen de L. stagnalis. Desde então

fragmentos não hidrolisados de galactogênio são ditos como bons aceptores, porém o papel

fisiológico da enzima na síntese de galactogênio in vivo permanece incerto. O pH ótimo da

enzima é 6.5 e a mesma é totalmente dependente de Mn

, diferenciando-se claramente da

1,6-galactosiltransferase descrita por Goudsmit et al. (1989).

3.2.2) Degradação do galactogênio

Nos gastrópodes pulmonados, os ovos, assim que fertilizados, descem pelo oviduto

e são envolvidos por uma camada de fluido perivitelino secretado pela glândula de

albúmen. O único carboidrato presente nesse fluido é o galactogênio. Esse polímero

representa 36% do peso seco da massa de ovos colocada por L. stagnalis (HORSTMANN,

1956).

Já em 1958, Raven havia descrito a distribuição do fluido perivitelino durante o

desenvolvimento de L. stagnalis. Segundo o autor, vacúolos contendo fluido perivitelino

aparecem no ectoderma durante a gastrulação. Mais tarde, células do estomodeu se tornam

ciliadas, e o fluido é conduzido até o meio de intestino, onde é englobado por células

ectodérmicas, formando numerosos pequenos vacúolos no seu interior. A depleção nos

depósitos de galactogênio tem início ainda no estágio de gástrula, continuando ao longo do

desenvolvimento. Valores entre 46 e 78% do galactogênio presente nos ovos são

consumidos durante o desenvolvimento embrionário, sendo o restante utilizado nos quatro

dias subseqüentes a eclosão.

McMahon et al. (1957) encontraram resultados semelhantes quando repetiram o

experimento de RAVEN. Comprovando também, a existência de um correspondente

aumento nos conteúdos de glicogênio nos tecidos durante o desenvolvimento. Horstmann

(1956) demonstrou alterações no conteúdo de lipídeo, havendo um aumento que variou

entre 0,15 e 3,85 µg por embrião durante 12 dias de desenvolvimento. Concluindo assim,

que lipídio e glicogênio são formados à custa do galactogênio.

4) Alterações fisiológicas sob condições de estresse

Nos gastrópodes pulmonados, o metabolismo energético é baseado em carboidratos,

os quais são armazenados na forma de polissacarídeos. Sendo o glicogênio e o

galactogênio, os polissacarídeos de maior importância para o metabolismo energético e à

reprodução, respectivamente, e mais abundantemente encontrados nos moluscos

(GERAERTS, 1992).

Segundo Dan & Bailey (1982), a densidade populacional pode exercer efeito

negativo sobre o crescimento e a reprodução de várias espécies de moluscos, resultando no

retardo do crescimento e na baixa fecundidade.

Em 2000, Sidel’nikov & Stepanov avaliaram o efeito da densidade populacional no

crescimento de A. fulica. Os autores verificaram que a taxa de crescimento estimada pelo

peso e tamanho do comprimento da concha decresceram quando os moluscos foram

submetidos a densidades que variaram de 10 até 60 moluscos/m

por um período de cinco

meses. De acordo com observações visuais feitas pelos autores, no grupo onde a densidade

populacional era maior os animais ingeriam menos comida já que a quantidade de alimento

que sobrava nesses terrários era maior quando comparada à quantidade dos terrários onde

os animais estavam em baixa densidade populacional. Ou seja, a densidade populacional

afeta diretamente o apetite dos moluscos.

Os ovos dos gastrópodes pulmonados são ricos em galactogênio e proteína,

substâncias essas que são utilizadas pelos embriões como fonte de energia e,

conseqüentemente, para a manutenção do metabolismo. A fim de determinar a estratégia

reprodutiva de Bulinus truncatus Audouin, 1872 em condições de jejum severo, Bayomy et

al. (1987) desenvolveram um estudo e observaram uma diminuição na postura de ovos, por

volta do sexto dia, entretanto, 24 horas após o restabelecimento da alimentação a postura de

ovos retornou ao normal. O mesmo foi observado por estes autores para a glândula de

albúmem, registrando redução proporcional do peso fresco da glândula com o período de

jejum.

Em situações de estresse, como jejum severo (PINHEIRO, 1996c), fotoperíodo,

elevadas densidades populacionais, baixa umidade relativa e parasitismo por trematódeos

larvais (PINHEIRO & AMATO 1994; AZEVEDO et al. 1996), o conteúdo destes

polissacarídeos sofre uma redução drástica e os moluscos passam a utilizar outros

substratos, como proteínas, para a obtenção de energia, o que pode causar no animal um

quadro de intoxicação devido a um aumento do conteúdo de produtos nitrogenados de

excreção.

Em 1978, Brockelman avaliou os efeitos do parasitismo por A. cantonensis na

concentração de proteínas da hemolinfa de A. fulica. Após infecções experimentais, os

moluscos não apresentaram nenhuma diferença nas concentrações de proteína na

hemolinfa. Quando os moluscos infectados foram submetidos à repetidas aspirações de

hemolinfa em seqüência, a concentração de proteínas mostrou uma redução significativa.

Moluscos infectados mantidos em jejum também foram capazes de manter constante a

concentração de proteína. Este mesmo tratamento, entretanto, associado a uma seqüência de

aspirações de hemolinfa causa segundo o autor um estresse tamanho ao animal que a sua

sobrevivência fica reduzida, pois o número de sobreviventes depende da freqüência de

aspirações e do nível de alimentação.

Ao estudar as alterações nas reservas de carboidratos de A. fulica quando

parasitadas por A. cantonensis e sob jejum severo os autores constataram que os níveis de

reservas glicídicas na hemolinfa e na glândula digestiva reduziram significativamente após

uma semana de infecção. Após um curto período de exposição, porém, os níveis de

glicídios em ambos os sítios de estudo voltaram para as concentrações normais, sugerindo

assim uma possível adaptação do molusco hospedeiro à condição de infectado. Em estudos

paralelos, os autores também constataram que os níveis de glicídios em condição de jejum

severo só se alteram significativamente quando os moluscos encontram-se infectados

(BROCKELMAN & SITHITHAVORN, 1980).

Registros de alterações no funcionamento da glândula de albúmem de moluscos

parasitados por larvas de trematódeos, têm sido encontrados com freqüência na literatura

(PINHEIRO, 2003; van ELK & JOOSSE, 1981).

Existem vários estudos na literatura que evidenciam as alterações fisiológicas

sofridas pelos moluscos que atuam como hospedeiros intermediários de vários parasitos,

boa parte desses estudos busca entender como se mobilizam as reservas de carboidratos em

moluscos infectados.

Estudos dessa natureza se fazem necessário, pois a utilização das reservas de

polissacarídeos pelos parasitos pode gerar várias conseqüências no organismo do

hospedeiro. Essas, no entanto, estão intimamente relacionadas a outros fatores como a

carga parasitária e a idade do hospedeiro, podendo acarretar problemas, como a castração

parasitária ou até mesmo a morte do hospedeiro, uma vez que o esgotamento das reservas

glicídicas leva a utilização de outras moléculas orgânicas, como as proteínas, que resultam

em metabólitos tóxicos para o animal em certas quantidades.

Infecções por larvas de trematódeos são sempre acompanhadas de intensas

alterações no metabolismo do molusco hospedeiro intermediário. Vários trabalhos

demonstram que a primeira reserva de energia para o desenvolvimento do esporocisto e,

conseqüentemente, das cercarias é a glicose, no entanto não é surpresa que haja redução na

concentração de glicose de moluscos infectados (CHENG & LEE, 1971; STANISLAWSKI

& BECKER, 1979; BECKER, 1980; SCHWART & CARTER, 1982).

A utilização de glicose pelos estágios larvais está diretamente relacionada com a

redução de glicose na hemolinfa e com a depleção nas reservas de glicogênio nos tecidos e

aumento da glicogenólise na região cefalopodal (SCHWART & CARTER, 1982).

Crews & Yoshino (1990) estudaram os mecanismos moleculares envolvidos na

alteração na função reprodutiva dos moluscos hospedeiros intermediários infectados pelas

larvas de S. mansoni durante o período pré-patente e demonstraram haver reduções na

atividade de síntese de carboidratos após um período de 28 dias de infecção.

É sabido que B. glabrata atua como hospedeiro intermediário de S. mansoni e que

após a penetração, na região cefalopodal do molusco, o miracídio se transforma em

esporocisto mãe, que, através de processos de poliembrionia, dão origem aos esporocistos

filhos que migrarão para a região da glândula digestiva, onde produzirão as cercárias. Em

seu trabalho de 1977, Chiang postulou que a maior disponibilidade de glicogênio na

glândula digestiva e no complexo do ovotestis pode explicar parcialmente a preferência dos

esporocistos filhos por essas regiões quando vão desenvolver as cercárias.

Em 1986, Thompson & Lee observaram que o conteúdo de glicose na hemolinfa de

moluscos é precisamente regulado em B. glabrata. Assumindo esta idéia como verdadeira,

Pinheiro & Amato (1994), em um estudo sobre o modelo Bradybaena similaris Férussac,

1821 infectada com larvas de Eurytrema coelomaticum Giard & Billet, 1892 (Looss, 1907),

propuseram que os esporocistos que ficam aderidos à superfície externa da glândula

digestiva do hospedeiro são banhados pela hemolinfa, de onde retiram os monômeros de

glicose necessários para a manutenção dos intensos processos plásticos que tem lugar no

desenvolvimento larval intramolusco. O desequilíbrio causado na composição glicídica da

hemolinfa, leva o molusco a dispor de suas reservas de carboidratos, o que causa a depleção

dos seus estoques de glicogênio.

Ishak et al. (1975) ao estudarem o metabolismo de carboidratos em Biomphalaria

alexandrina e B. tuncatus infectados e não infectados por trematódeos, comprovaram que

os animais infectados sofrem depleção de seus estoques de glicídios.

Em A. fulica os níveis de carboidratos totais e glicogênio no músculo da massa

corporal, pé e hemolinfa revelaram sua participação na derivação endógena de energia

durante o estresse. Os mesmos metabólitos na glândula digestiva revelaram sua importância

para a reprodução e desenvolvimento.

Como vários estudos comprovam que sob condições de estresse os depósitos de

carboidratos do molusco se alteram, o presente estudo visa observar a ocorrência de

alteração(ões) fisiológica(s), utilizando como parâmetro a dosagem dos carboidratos, nos

moluscos expostos à dose sub-letal do látex de “coroa-de-cristo” (Euphorbia splendens var

hislopii).

2 OBJETIVOS

1- Determinar a concentração sub-letal (CL

) do látex de E. splendens var

hislopii para A. fulica;

2- Determinar, quantitativamente, a concentração de galactogênio na

glândula de albúmem, e de glicogênio, na massa cefalopodal e glândula

digestiva em moluscos expostos a CL

do látex de E. splendens var

hislopii;

3- Realizar a análise bioquímica da hemolinfa de A. fulica, exposta a CL

do látex de E. splendens var hislopii, para determinação do conteúdo de

glicose livre.

3 MATERIAL E MÉTODOS

1) Coleta e manutenção das colônias de moluscos

Os moluscos foram coletados, no bairro Brito em Campo Grande, no Estado do Rio

de Janeiro (22º55’03”S; 43º33’40”W).

Os moluscos foram retirados manualmente da vegetação ou do solo e

acondicionados em vasilhames plásticos. Após a coleta, os moluscos foram levados para o

laboratório 3 da Área de Biofísica, Departamento de Ciências Fisiológicas (DCFis),

Instituto de Biologia (IB), UFRRJ, onde foram contados, lavados e transferidos para um

terrário, feito em caixa d’água de amianto com volume de 500L, com fundo coberto por

uma camada de terra vegetal de 3 cm de espessura, previamente umedecida com água da

torneira, através de um borrifador.

A alimentação dos moluscos foi feita com folhas de repolho (Brassica sp.) e alface

(Lactuca sativa L.) frescas, sendo as folhas lavadas em água de torneira antes de serem

oferecidas aos moluscos.

A manutenção do terrário foi realizada em dias alternados e durante o processo de

manutenção as folhas oferecidas aos animais foram renovadas, evitando sua fermentação no

interior dos terrários. O número de moluscos mortos, assim como a presença de posturas

também foram critérios observados.

Os terrários foram cobertos com tecido de nylon, permitindo uma boa aeração e

impedindo a saída dos moluscos, assim como, a entrada de insetos.

2) Coleta do látex de Euphorbia splendens var. hislopii

As amostras do látex de E. splendens var. hislopii foramcoletadas de exemplares

cultivados em canteiros situados próximos ao Departamento de Biologia na Fundação

Instituto Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, RJ (22º52’33”S; 43º14’46”W), em um

mesmo período do ano, durante os meses de maio e junho, correspondendo a uma mesma

estação do ano, o outono, evitando possíveis variações metabólicas que pudessem interferir

na concentração da substância ativa.

As coletas do látex foram realizadas nos mesmos dias dos testes, através de

seccionamento transversal, cerca de 10 cm abaixo do meristema apical de cada galho. O

látex bruto foi coletado em tubo de ensaio de vidro fechado com tampa rosqueável, para se

evitar a coagulação, e transportado ao laboratório imediatamente após a coleta, onde era

armazenado sob refrigeração (-10ºC) até seu uso para preparo da diluição.

Este método de coleta teve a vantagem de manter a integridade da planta da qual se

extraiu o látex mantendo-a viável e produtiva.

3) Determinação da concentração letal (CL

) e subletal (CL

)

Vários bioensaios foram inicialmente realizados a fim de verificar qual seria a

melhor forma de administração do látex para os moluscos, para isso foram usadas doses

previamente testadas e comprovadas pelo Núcleo de Biologia e Controle de Endo e

Ectoparasitas de Interesse Médico e Veterinário, Departamento de Biologia, Fundação

Instituto Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, RJ.

Foram testadas as seguintes formas de aplicação: a primeira consistia em solução de

látex oferecida em placas de Petri aos moluscos, a segunda consistia em aplicar o látex

liofilizado sobre a alface que era oferecida aos moluscos como alimento e a terceira forma

introduzida neste trabalho, por não ter sido anteriormente testada, foi a pulverização da

solução feita com o látex sobre os moluscos.

O experimento piloto foi realizado de acordo com a metodologia descrita para

moluscos aquáticos (OMS). Segundo estas, os moluscos sem formação de epifragma foram

expostos ao látex por um período de 24 horas, seguidos por mais 24 horas de recuperação.

Esse tempo, porém, teve que ser ajustado por causa da falta de parâmetros confiáveis, como

ausência de reflexos após estímulos na massa cefalopodal, ausência de movimento ou

consistência dos tecidos, para detectar a mortalidade dos moluscos e também pela pequena

quantidade e, às vezes, ausência de animais mortos. Então, o tempo foi reajustado para 48

horas de exposição seguidas por mais 48 horas de recuperação.

Ao término do experimento piloto, a avaliação dos resultados, expressos através do

número de animais mortos, demonstrou que a melhor forma de aplicação, ou seja, aquela

onde houve a maior taxa de mortalidade relacionava-se com o grupo de animais que foram

expostos ao látex através da pulverização, como demonstram os protocolos de dados

presentes no ANEXO 1.

Findada a etapa preliminar através da definição do melhor método de aplicação do

látex, teve início a bateria de testes para determinar a Concentração Letal.

a) Preparação das soluções aquosas e Período de exposição

Para a determinação das concentrações letal e subletal foi testada a aplicação do

látex da seguinte forma. A partir do látex in natura, eram obtidas as soluções de diferentes

concentrações a serem analisadas, que eram pulverizadas através de pulverizadores

plásticos sobre os moluscos.

Este procedimento de bioensaio está de acordo com a metodologia recomendada

pela OMS (WHO, 1983); Mott (1987) e já utilizada por Vasconcellos & Amorim (2003a,

b).

A aplicação foi feita em três repetições com grupos de dez moluscos cada, para cada

concentração testada: 1%, 2,5%, 5%, 7,5%, 12,5%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%. Outros 30

moluscos foram usados como grupo controle sobre os quais foi pulverizado somente água.

Os moluscos ficaram expostos ao látex por um período de 48 horas. Durante este período, a

temperatura e a umidade foram observadas antes e após a exposição ao látex.

b) Período de recuperação

Após o período de exposição, os moluscos foram retirados dos recipientes, lavados

com água destilada para remoção de resíduos da solução na concha e contados o número de

animais mortos. Após este procedimento, os moluscos foram transferidos para recipientes

contendo terra e alface fresca por mais 48 horas (período de recuperação).

Após 96 horas do início do teste, os animais mortos e sobreviventes foram

novamente contados. As mortes dos animais eram constatadas utilizando-se uma pinça de

relojoeiro para verificar a ausência de contração muscular, com o auxílio de microscópio

estereoscópico, caracterizando-se assim a morte do animal.

Ao final do período de recuperação, os moluscos sobreviventes eram sacrificados,

para dissecação anatômica.

Findados os experimentos que determinaram a concentração subletal, uma nova

bateria de exposição foi realizada a fim de avaliar aspectos bioquímicos da ação do látex

sobre os moluscos. Para tal, foram montados dez grupos com cinco animais cada dispostos

em vasilhames plásticos. Do total descrito acima, nove grupos foram expostos, através de

pulverização, a 10 mL da diluição do látex congelado a -10ºC na CL

determinada, o

outro grupo foi mantido como controle.

Um animal de cada grupo foi dissecado após 1 dia, 7, 14 e 21 dias da pulverização.

Os moluscos sobreviventes selecionados, após os períodos descritos acima, eram

sacrificados, para extração da hemolinfa e dissecação anatômica. Dos órgãos dissecados,

foram separadas glândula digestiva, massa cefalopodal e glândula de albúmem, para as

análises de glicogênio e galactogênio, respectivamente, sendo necessário o congelamento

das amostras em freezer (-10ºC), devidamente identificadas, para posterior processamento e

análise.

4) Extração e dosagem de glicogênio e galactogênio

A extração de glicogênio de glândula digestiva e massa cefalopodal e de

galactogênio da glândula de albúmem dos exemplares de A. fulica seguiu a técnica de

descrita por Pinheiro & Amato (1994) e a dosagem foi realizada segundo a técnica do 3,5

dinitro salicilato (DNS) (SUMNER, 1924).

5) Extração da hemolinfa para análise bioquímica

A hemolinfa foi coletada através da punção da cavidade cardíaca, utilizando-se

seringas B-D Becton Dickinson

e acondicionada em microtubos Eppendorf, mantidos

durante a coleta em banho de gelo. Os moluscos tiveram sua hemolinfa puncionada após a

quebra da concha que foi realizada sem anestesia prévia. A hemolinfa foi armazenada a –

10ºC até a sua utilização. A análise bioquímica foi realizada, posteriormente, através de kits

para diagnóstico laboratorial de glicose, Doles.

6) Análise Estatística

Os resultados obtidos nas determinações bioquímicas foram expressos como média

± desvio-padrão, submetidos ao teste de análise de variância (ANOVA), teste de Tukey-

Kramer para comparação das médias (α=5%) e o teste “t de Student” para dados não-

pareados. Os valores das médias e desvio padrão foram submetidos ao teste de regressão

polinomial de primeira ordem para verificar a significância da relação entre as alterações

observadas e a exposição ao látex de E. splendens var hislopii (GraphPad Prism



, versão

3.00, e GraphPad InStat



, versão 2,05ª, GraphPad Software, Inc.)

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

No presente estudo foram avaliados aspectos bioquímicos, de A. fulica exposta à

concentração letal 50 (CL

) de látex de E. splendes var hislopii, como os níveis glicídicos

em diferentes sítios de localização.

Os carboidratos como o glicogênio, a glicose e o galactogênio são encontrados,

respectivamente, na glândula digestiva e massa cefalopodal, na hemolinfa e na glândula de

albúmem. Esses carboidratos são de suma importância para manutenção do metabolismo do

animal.

Artigos na literatura demonstram que a glicemia nos moluscos é sensivelmente

regulada, sendo assim as menores alterações são prontamente corrigidas de forma rápida e

eficaz. Os depósitos de glicogênio, também de grande importância, sofrem várias alterações

quando os animais são submetidos a diversas condições de estresse, enquanto o conteúdo

de galactogênio se faz necessário durante o processo reprodutivo. Assim, estudos provam

que alterações nesses depósitos podem causar conseqüências metabólicas prejudiciais aos

moluscos na maior parte das vezes.

1) Determinação da Concentração Subletal (CL

)

A Concentração Subletal

(CL

) foi de 11,2% com P>0,05.

2) Dissecação dos animais experimentais

Durante as dissecações para a coleta das partes que seriam posteriormente dosadas

foram realizadas observações ao acaso. A Tab. 2 mostra que não foi possível a coleta da

hemolinfa de todos os moluscos dissecados, isso não foi possível porque alguns animais

apresentavam sua hemolinfa com aspecto aglutinado, impedindo assim que a mesma fosse

puncionada.

Tabela 2. Relação de material coletado durante as dissecações, por molusco, ao longo do

tempo de experimento. *Indica que o material foi coletado.

1 dia 7dias 14 dias 21 dias

MCP

HEM

MCP

HEM

MCP

HEM

MCP

HEM

Grupo 1 * * * * * * * *

Grupo 2 * * * * * * *

Grupo 3 * * * * * *

Grupo 4 * * * * *

Grupo 5 * * * * * * * * * * * * * *

Grupo 6 * * * * * * * * * * * *

Grupo 7 * * * * * *

Grupo 8 * * * * * * * * * *

Grupo 9 * * * * * *

Controle * * * * * * * * * * * * *

MCP: massa cefalopodal; GD: glândula digestiva; GA: glândula de albúmem; HEM: hemolinfa

3) Extração e dosagem de polissacarídeos da glândula digestiva e da massa cefalopodal de

Achatina fulica exposta à concentração subletal (CL

) do látex de Euphorbia splendens

var. hislopii

Os valores observados para a concentração de glicogênio na glândula digestiva e na

massa cefalopodal foram analisados estatisticamente pelo Teste t para dados não pareados.

As análises sempre realizadas entre as médias do grupo controle e do grupo exposto ao

látex de cada tempo após a exposição demonstrou que houve diferença extremamente

significativa apenas no primeiro dia após a exposição a CL

, nos intervalos de tempo

subseqüentes a comparação entre as média não houve diferença significativa. (Tab. 3)

Tabela 3. Variação na concentração de glicogênio (mg de glicose/g de tecido, peso fresco)

na glândula digestiva dos grupos de Achatina fulica expostos e não expostos ao látex de

Euphorbia splendens var hislopii em relação ao tempo após a exposição a DL

X±SD=média ± desvio-padrão.

Concentrações de glicogênio

(mg de glicose/g de tecido, peso fresco)

Controle Exposto

Tempo após exposição

(dias)

X ± SD X ± SD

1 6,81 ± 0,08

1,32 ± 0,67

7 1,18 ± 0,01

1,45 ± 1,19

14 1,09 ± 0,38

0,97 ± 0,16

21 0,72 ± 0,01

1,02 ± 0,15

a, b

- média seguidas de letras minúsculas diferentes são significativamente diferentes

A regressão polinomial demonstrou uma relação negativa entre o tempo após a

exposição e conteúdo de glicogênio neste sítio, para os moluscos expostos. Porém, a

relação, também negativa, observada entre estes parâmetros, para o grupo de moluscos

controle demonstrou ser menos significativa. Além disso, vale ressaltar que os níveis de

glicogênio na glândula digestiva dos moluscos do grupo exposto sofrem redução em função

do tempo após a exposição, enquanto o grupo controle apresentou pequena variação no

conteúdo de glicogênio presente na glândula digestiva (Fig 4).

Quando os valores do conteúdo de glicogênio na glândula digestiva observados para

os moluscos controle são somados e expressos através de uma média geral, o teste de

regressão polinomial revelou uma forte relação negativa entre o conteúdo de glicogênio e o

tempo de após a exposição (Fig 5).

Assim sendo, analisando os resultados expressos nas figuras 4 e 5, observamos que

logo após a pulverização do látex os moluscos sofrem alterações nos depósitos de

carboidratos, reduzindo as concentrações de glicogênio na glândula digestiva. Esse

armazenamento se faz de maneira menos intensa à medida que o tempo de exposição ao

látex vai passando, o que pode ser interpretado como um processo de recuperação dos

animais expostos ao látex com o passar do tempo. Esse comportamento metabólico se

mostra bastante diferente daquele apresentado pelos moluscos do grupo controle que

mantém quase que constante a taxa de glicogênio na glândula digestiva independentemente

do período de dissecação.

Mello-Silva et al. (2006) não constataram diferenças significativas quando valores

médios da concentração de glicogênio presente na glândula digestiva de moluscos

aquáticos da espécie B. glabrata expostos a diferentes concentrações do látex foram

comparados entre si. Ao submeter os resultados ao teste da regressão polinomial, estes

autores obtiveram como resultado uma correlação negativa entre a concentração de

glicogênio na glândula digestiva e as diferentes concentrações testadas. Esses resultados

são semelhantes aos encontrados neste trabalho para o mesmo parâmetro, concentração de

glicogênio na glândula digestiva.

Figura 4. Relação entre a concentração de glicogênio da glândula digestiva (mg de

glicose/g de tecido, peso fresco) de Achatina fulica expostos a CL

e controle em função

do tempo após a exposição a DL

, em dias. ? moluscos não expostos ao látex de

Euphorbia splendens var. hislopii, ¦ moluscos expostos ao látex

0 7 14 21

-2.5

0.0

2.5

5.0

7.5

y=5,31 - 0,27x

=0,88

y=1,37 - 0,02x

=0,98

Tempo após exposição (dias)

Concentração de glicogênio

(mg de glicose/g de tecido,

peso fresco)

Figura 5. Relação entre a concentração de glicogênio da glândula digestiva (mg de

glicose/g de tecido, peso fresco) em Achatina fulica expostos e não expostos a DL

ao longo do tempo após a exposição a CL

do látex de Euphorbia splendens var.

hislopii, em dias.

A comparação das médias dos resultados obtidos para a concentração de glicogênio

na massa cefalopodal, demonstrou não ter havido diferença significativa entre as médias

dos moluscos expostos e do controle para os tempos de 7, 14 e 21 dias após a pulverização.

Entretanto, após o primeiro dia de exposição a diferença entre as médias se mostrou muito

significativa (Tab 4).

Tabela 4. Variação na concentração de glicogênio (mg de glicose/g de tecido, peso

fresco) na massa cefalopodal de moluscos expostos e não expostos a CL

de E. splendens

var hislopii em função do tempo após a exposição em dias. X±SD=média ± desvio-padrão.

Concentrações de glicogênio

(mg de glicose/g de tecido, peso

fresco)

Tempo após Controle Exposto

exposição

(em dias)

X ± SD X ± SD

1 1,17 ± 0,04

0,34 ± 0,31

7 0,30 ± 0,12

0,35 ± 0,47

14 0,49 ± 0,10

0,33 ± 0,07

21 0,47 ± 0,04

0,47 ± 0,16

0 7 14 21

y=2,02 - 0,05x

=0,97

Tempo após exposição (dias)

Concentração de glicogênio

(mg de glicose/g de tecido,

peso fresco)

a,b

- médias seguidas de letras minúsculas diferentes diferem significativamente entre si.

A análise de regressão polinomial demonstrou haver uma forte relação positiva

=0,95) entre a concentração de glicogênio na massa cefalopodal de moluscos expostos a

e moluscos do grupo controle ao longo do tempo após a exposição ao látex. A análise

das retas de regressão mostra que as concentrações de glicogênio na massa cefalopodal do

grupo controle são menores até próximo ao 14º dia após a exposição, quando comparadas

as mesmas concentrações no grupo pulverizado com o látex. No entanto, após o 14º dia de

exposição a relação inverte e a concentração de glicogênio na massa cefalopodal dos

moluscos do grupo controle são maiores quando comparadas as do grupo de molusco

exposto no mesmo período (Fig 6).

Figura 6. Relação entre a concentração de glicogênio na massa cefalopodal (mg de

glicose/g de tecido, peso fresco) de Achatina fulica expostos e não expostos a CL

do látex de Euphorbia splendens var hislopii em função do tempo após a exposição

em dias. ¦ moluscos não expostos ao látex, ? moluscos expostos ao látex

Observações feitas ao longo do tempo e ao acaso mostram que os moluscos do

grupo controle mantiveram-se retraídos ao contrário do observado para os moluscos

expostos ao látex, que moviam-se intensamente tanto horizontalmente quanto

verticalmente, reforçando assim um possível mecanismo de escape.

Quando os resultados referentes ao grupo de moluscos expostos e não expostos são

somados e expressos através da média geral e analisados pela regressão polinomial

apresenta forte relação positiva entre os níveis de glicogênio presentes na massa

cefalopodal e o tempo de exposição em dias (Fig 7).

Contudo, se analisarmos o conteúdo de glicogênio de maneira geral podemos

ressaltar que após a pulverização, os moluscos expostos disponibilizam uma maior

quantidade de glicogênio para a região formadora da cabeça e do pé (Fig 6 e 7), enquanto

ocorre um decréscimo na mobilização desses mesmos compostos para a glândula digestiva

dos referidos moluscos (Fig 4 e 5). Esse fato pode estar correlacionado a uma tentativa de

0 7 14 21

0.00

0.25

0.50

0.75

y=0,018 + 0,016x

=0,95

y=0,30 + 0,007x

=0,95

Tempo após exposição (dias)

Concentração de glicogênio (mg

de gicose/g de tecido,

peso fresco)

fuga, ou seja, para se livrar o mais rapidamente possível da situação adversa, os moluscos

desviam uma maior quantidade de glicogênio para a massa cefalopodal que é responsável

pela locomoção do animal.

Figura 7. Relação entre a concentração de glicogênio presente na massa cefalopodal

(mg de glicose/g de tecido, peso fresco) de Achatina fulica expostos e não expostos

a CL

do látex de Euphorbia splendens var hislopii em função do tempo após

exposição em dias.

4) Análise bioquímica da hemolinfa

A análise bioquímica da hemolinfa foi realizada com o material proveniente das

dissecações, que estavam congelados e armazenados em Eppendorf a -10ºC. Durante as

dissecações que se procederam no dia seguinte e sete dias após a pulverização não foi

possível coletar a hemolinfa de todos os animais, como mostra a Tab. 2, visto que a mesma

apresentava-se com um aspecto aglutinado dificultando sua aspersão com a seringa.

As dosagens de glicose livre foram feitas através de método espectrofotométrico

enzimático (Doles

). A comparação das médias demonstrou só ter havido diferença

significativa entre as médias observadas para os moluscos que foram dissecados um dia e

vinte e um dias após a exposição (Tab. 5).

0 7 14 21

0.00

0.25

0.50

0.75

y=0,33 + 0,005x

=0,94

Tempo após a exposição (dias)

Concentração de glicogênio (mg

de glicose/g de tecido,

peso fresco)

Tabela 5. Concentração de glicose na hemolinfa (mg de glicose/dL de hemolinfa) de

Achatina fulica expostos e não expostos a CL

do látex de Euphorbia splendens var

hislopii ao longo do período de exposição em dias. X±SD= média±desvio-padrão .

Concentração de glicose

(mg/dL)

Controle Exposto

Tempo

após

exposição

(em dias) X±SD X±SD

1 dia 1,09 ± 0,10

0,53 ± 0,59

7 dias 0,10 ± 0,01

a.b

35,79 ± 51,54

a,b

14 dias 0,20 ± 0,01

a,b

31,08 ± 22,81

a,b

21 dias 58,88 ± 17,97

52,56 ± 14,32

a,b,c

=Médias seguidas de letras iguais não apresentam diferença significativa

A regressão polinomial demonstrou uma forte correlação positiva entre a concentração

de glicose ao longo do tempo após a exposição a CL

do látex de E. splendens var hislopii

em dias.

Ao comparar os níveis de glicose na hemolinfa de moluscos expostos a CL

e de

moluscos controles em função do tempo após a exposição em dias, a regressão polinomial

evidenciou que esses níveis aumentam conforme o prosseguimento dos dias, ou seja, após a

exposição os níveis de glicose livre na hemolinfa dos moluscos expostos são menores do

que as concentrações apresentadas ao final do experimento. Curiosamente, o mesmo

comportamento metabólico acontece com os moluscos do grupo controle que não foram

expostos ao látex. Entretanto, os níveis de glicose livre na hemolinfa dos animais expostos

são menores do que os encontrados nos moluscos não expostos apesar das diferenças não

serem significativas (Fig. 8).

Apesar desses resultados não corresponderem as expectativas, evidenciamos que a

aplicação do látex de E. splendens var hislopii provoca reações nos moluscos, alterando o

perfil glicídico da sua hemolinfa pelo menos por um curto período de tempo após a

aplicação, já que não foi possível coletar a hemolinfa de todos os espécimes de moluscos

um dia e sete dias após a pulverização.

A relação entre a concentração de glicose na hemolinfa (mg de glicose/dL de

hemolinfa) de moluscos expostos e não expostos a DL

apresentou forte relação positiva

=0,98) em função do tempo após a exposição em dias (Fig. 9).

Ao trabalhar com outro gênero de molusco, Biomphalaria, Mello-Silva et al. (2006)

observaram que não houve diferença significativa na quantidade de glicose livre na

hemolinfa em função das diferentes concentrações do látex utilizadas. Para esse trabalho,

onde o sistema foi montado com moluscos aquáticos, a regressão polinomial demonstrou

relação negativa entre a concentração de glicose e as diferentes concentrações do látex.

Figura 8. Relação entre a concentração de glicose na hemolinfa (mg de glicose/dL

de hemolinfa) de Achatina fulica expostos e não expostos a CL

do látex de

Euphorbia splendens var hislopii em função do tempo após a exposição, expresso

em dias. ¦ moluscos não expostos ao látex, ? moluscos expostos ao látex

Figura 9. Relação entre a concentração de glicose na hemolinfa (mg de glicose/dL

de hemolinfa) de Achatina fulica expostos e não expostos a CL

em função do

tempo após a exposição ao látex de Euphorbia splendens var. hislopii em dias.

0 7 14 21

-25

y=-13,3 + 2,64x

=0,87

y=2,30 + 2,38x

=0,99

Tempo após exposição (dias)

Concentração de glicose (mg/dl)

0 7 14 21

y=9,94 + 1,96x

=0,98

Tempo após exposição (dias)

Concentração de glicose (mg/dl)

5) Análise bioquímica da glândula de albúmem

A quantidade de galactogênio presente na glândula de albúmem dos moluscos

expostos foi analisada em função do tempo de exposição apenas, já que, apesar de utilizar

moluscos de tamanhos uniformes, somente durante as dissecações pudemos constatar a

maturidade sexual pelo desenvolvimento ou não da referida glândula. Evidenciando que os

tamanhos dos moluscos não possuem relação direta com a maturidade sexual.

Portanto, as análises da quantidade de galactogênio foram realizadas através do pool

das glândulas coletadas durante as dissecações, para que se pudesse obter a massa mínima

de 1g de tecido para as dosagens.

A maior e menor quantidade de galactogênio expressa em mg de galactose/g tecido,

peso fresco valor foram apresentados para os moluscos dissecados após o primeiro dia de

exposição ao látex (14,99) e o sétimo dia de exposição (0,18), respectivamente (Tab. 6)

Tabela 6. Concentração de galactogênio (mg de galactose/g de tecido, peso fresco) de

Achatina fulica expostos a CL

do látex de Euphorbia splendens var. hislopii ao longo do

tempo após a exposição ao látex, em dias. X±SD= média±desvio-padrão.

Concentração de

galactogênio

(mg de galactose/g de

tecido, peso fresco)

Tempo após Tratados

exposição

(dias) X±SD

1 14,99 ± 0,04

7 0,18 ± 0,03

14 9,08 ± 0,01

21 7,71 ± 0,03

A regressão polinomial por sua vez revelou uma relação negativa r

= 0.68

entre a concentração de galactogênio presente na glândula de albúmem dos moluscos

expostos a CL

em função do tempo após a exposição em dias. Ou seja, a quantidade de

galactogênio diminui com o passar dos dias, após a exposição de A. fulica ao látex de E.

splendens var. hislopii (Fig. 10).

Figura 10. Relação entre a concentração de galactogênio na glândula de albúmem

(mg de galactose/g de tecido, peso fresco) de Achatina fulica expostos a CL

látex de Euphorbia splendens var hislopii em função do tempo após a exposição, em

dias.

Vários estudos têm sido realizados nos últimos anos, comprovando a ação

moluscicida de algumas plantas ou de produtos extraídos destas. Rao & Singh (2003)

compararam o efeito de tratamentos simples e binários de derivados de plantas

moluscicidas sobre a atividade de diferentes enzimas: acetilcolinesterase, lactato

desidrogenase e fosfatases ácida e alcalina, no tecido nervoso de A. fulica. Em seus

experimentos, os moluscos foram expostos a doses sub-letais de óleo de Azadirachta

indica, Cedrus deodara, Allium sativum e Nerium indicum comprovando que algumas

combinações como, A. sativum + C. deodara e C. deodara + A. indica alteraram

significativamente a atividade das enzimas no tecido nervoso de A. fulica.

Contudo fica evidente que quando se pensa em controle de moluscos através do uso

de plantas com ação moluscicida, o habitat do molusco torna-se importante por que faz

diferir não só a forma de aplicação como também a concentração que deve ser aplicada.

Entretanto, fica evidente que A. fulica sofre alterações no metabolismo de

carboidratos após a exposição a CL

do látex de E. splendens var hislopii, fato este que

pode estar associado à mortalidade dos moluscos. No entanto, mais estudos se fazem

necessários, avaliando outros parâmetros metabólicos como lipídios, ácidos nucléicos e

compostos nitrogenados para que se possa afirmar com maior seguridade a respeito da

relação entre a aplicação do látex e a mortalidade dos moluscos.

0 7 14 21

y=9,89 - 0,16x

=0,68

Tempo após exposição (dias)

Conteúdo de galactogênio (mg de

galactose/g de tecido,

peso fresco)

5 CONCLUSÕES

Com base nos resultados obtidos no presente trabalho, podemos concluir quer:

1 - A Concentração Sub-Letal (CL

), ou seja, a concentração necessária para levar a

letalidade metade da população testada encontrada foi igual a 11,2%, para solução

pulverizada sobre A. fulica.

2 – A exposição de A. fulica à CL

do látex de E. splendens var. hislopii provocou uma

significativa redução na concentração de galactogênio na glândula de albúmen.

3 - A exposição de A. fulica à CL

de E. splendens var. hislopii apresentou em um efeito

tardio sobre os depósitos de glicogênio da massa cefalopodal do molusco, os quais

apresentaram-se significativamente reduzidos no 14º dia após a exposição.

4 – A exposição ao látex de E. splendens var. hislopii provocou uma redução nos depósitos

de glicogênio na glândula digestiva de A. fulica.

5 – Somente houve variação significativa no conteúdo de glicose na hemolinfa de A. fulica

exposta à CL

do látex de E. splendens var. hislopii, após 21 dias da exposição, quando

comparados ao grupo controle. Embora nos primeiros dias de dissecação tenha sido

encontrado um maior nível de glicose livre circulante na hemolinfa.

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2003a.

VASCONCELLOS, M. C. & AMORIM, A. Activity of Euphorbia splendens var. hislopii

N.E.B. (Euphorbiaceae) latex against Lymnaea columella (Say, 1817) (Pulmonata:

Lymnaeidae), Intermediate host of Fasciola hepatica, Linnaeus, 1758 (trematoda:

Fascolidae). 2: Limited Field-testing. Mem Inst Oswaldo Cruz. v.98. n.7. p.981-985.

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ANEXO A

PROTOCOLO DE TESTES COM MOLUSCICIDA

EXPERIMENTO 1: FORMA DE APLICAÇÃO DO LÁTEX

Responsável: Camila Silva de Oliveira

Data de início: 18/07/2005 Data do término: 22/07/2005

Produto testado: Látex de E. splendesn var hislopii Local de coleta: FIOCRUZ

Espécie testada: Achatina fulica Forma de aplicação: Diluição em placas

Biometria média 5,8cm Alimentação: Alface fresca

Amostra por concentração: 5 moluscos Amostra total: 55 moluscos

Exposição 48 horas Recuperação 48 horas

Concentração moluscos vivos

moluscos mortos

moluscos vivos moluscos mortos

1% (A) 5 0 5 0

1% (B) 5 0 5 0

12,5% (A) 5 0 5 0

12,5% (B) 5 0 5 0

25% (A) 5 0 5 0

25% (B) 5 0 5 0

50% (A) 4 1 4 0

50% (B) 5 0 5 0

75% (A) 5 0 5 0

75% (B) 5 0 5 0

Controle 5 0 5 0

PROTOCOLO DE TESTES COM MOLUSCICIDA

EXPERIMENTO 1: FORMA DE APLICAÇÃO DO LÁTEX

Responsável: Camila Silva de Oliveira

Data de início: 18/07/2005 Data do término: 22/07/2005

Produto testado: Látex de E. splendesn var hislopii Local de coleta: FIOCRUZ

Espécie testada: Achatina fulica Forma de aplicação: Pulverização

Biometria média 5,8cm Alimentação: Alface fresca

Amostra por concentração: 5 moluscos Amostra total: 55 moluscos

Exposição 48 horas Recuperação 48 horas

Concentração moluscos vivos

moluscos mortos

moluscos vivos moluscos mortos

1% (A) 4 1 4 0

1% (B) 5 0 5 0

12,5% (A) 4 1 4 0

12,5% (B) 4 0 5 0

25% (A) 4 0 3 1

25% (B) 4 0 5 0

50% (A) 3 1 4 0

50% (B) 3 0 4 1

75% (A) 1 2 2 1

75% (B) 4 0 5 0

Controle 5 0 5 0

PROTOCOLO DE TESTES COM MOLUSCICIDA

EXPERIMENTO 1: FORMA DE APLICAÇÃO DO LÁTEX

Responsável: Camila Silva de Oliveira

Data de início: 18/07/2005 Data do término: 22/07/2005

Produto testado: Látex de E. splendesn var hislopii Local de coleta: FIOCRUZ

Espécie testada: Achatina fulica Forma de aplicação: Liofilizado

Biometria média 5,8cm Alimentação: Alface fresca

Amostra por concentração: 5 moluscos Amostra total: 55 moluscos

Exposição 48 horas Recuperação 48 horas

Concentração moluscos vivos

moluscos mortos

moluscos vivos moluscos mortos

1% (A) 5 0 5 0

1% (B) 5 0 5 0

12,5% (A) 4 1 4 0

12,5% (B) 5 0 5 0

25% (A) 5 0 5 0

25% (B) 5 0 5 0

50% (A) 5 0 5 0

50% (B) 5 0 4 1

75% (A) 5 0 5 0

75% (B) 5 0 5 0

Controle 5 0 5 0

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