( PDF ) Aspectos morfológicos, morfométricos e ultra- estruturais do baço de ratos após o clampeamento total do pedículo hepático

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SILVIO HENRIQUE DE FREITAS

ASPECTOS MORFOLÓGICOS, MORFOMÉTRICOS E ULTRA-

ESTRUTURAIS DO BAÇO DE RATOS APÓS O CLAMPEAMENTO

TOTAL DO PEDÍCULO HEPÁTICO

Recife – PE

2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA VETERINÁRIA

SILVIO HENRIQUE DE FREITAS

ASPECTOS MORFOLÓGICOS, MORFOMÉTRICOS E ULTRA-

ESTRUTURAIS DO BAÇO DE RATOS APÓS O CLAMPEAMENTO

TOTAL DO PEDÍCULO HEPÁTICO

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciência Veterinária da

Universidade Federal Rural de Pernambuco

como requisito parcial para obtenção de grau

de Doutor em Ciência Veterinária.

Orientador

Prof. Dr. Joaquim Evêncio Neto

Recife – PE

2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA VETERINÁRIA

ASPECTOS MORFOLÓGICOS, MORFOMÉTRICOS E ULTRA-

ESTRUTURAIS DO BAÇO DE RATOS APÓS O CLAMPEAMENTO

TOTAL DO PEDÍCULO HEPÁTICO

Tese de doutorado elaborada por

SILVIO HENRIQUE DE FREITAS

Aprovada em....../.........../...........

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Joaquim Evêncio Neto

Orientador – Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal – UFRPE

Prof. Dr. Manuel de Jesus Simões

Departamento de Morfologia da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP

Prof. Dr. Alessandro César Jacinto da Silva

Departamento de Morfologia e Fisiologia animal – UFRPE

Prof. Dr. Lázaro Manoel de Camargo

Departamento de Clínica Médica da Fauldade de Medicina Veterinária da Universidade de

Cuiabá – UNIC

Profa. Dra. Liriane Baratella Evêncio

Departamento de Histologia e Embriologia da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE

DEDICATÓRIA

À minha família, orientador e aos amigos que direta ou indiretamente participaram desse

trabalho e, em determinada situação, mostraram caminhos que até então não eram vistos por

mim.

AGRADECIMENTO

Ao Orientador Dr. Joaquim Evêncio Neto, Professor Adjunto da Disciplina de Histologia do

Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal da Universidade Federal Rural de

Pernambuco-URFPE, pelo empenho, atenção e confiança depositada em mim e em toda

equipe empenhada nesse trabalho. Obrigado pelo apoio e, principalmente, pelo tempo cedido

em prol da nossa luta voltada para a conclusão desse trabalho;

Ao Dr. Manuel de Jesus Simões, Professor Adjunto do Departamento de Morfologia da

Disciplina de Histologia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP-EPM e Faculdade

de Medicina de Cuiabá-UNIC, pela humildade, atenção e dedicação voltada para pesquisa.

Obrigado pela colaboração e dedicação, não só durante o doutorado, mas por todo tempo que

estivemos juntos trabalhando.

Ao Dr. Lázaro Manoel de Camargo, Professor e Diretor da Faculdade de Medicina

Veterinária da Universidade de Cuiabá - UNIC, pela amizade, dedicação e confiança

depositada em meu trabalho e, principalmente, pelo apoio oferecido em todo meu trabalho.

Obrigado pela credibilidade;

À Professora Renata Gebara Sampaio Dória, pela paciência, dedicação e companherismo

durante o desenvolvimento desta tese;

Ao Dr. Carlo Ralph De Musis, Professor, Coordenador de Departamento de Lesgislação e

Dados Institucionais/Avaliação – DLDI e Coordenador de Pesquisa – CPQ, pela dedicação

direcionada à pesquisa e contribuição dada à minha tese. Obrigado pelo apóio nesse trabalho.

À secretária Edna Shérias do Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária da

Universidade Federal Rural de Pernambuco – UFRPE, pelo apoio e dedicação voltada aos

alunos, funcionários e, principalmente, aos professores dessa instituição.

ASPECTOS MORFOLÓGICOS, MORFOMÉTRICOS E ULTRA- ESTRUTURAIS

DO BAÇO DE RATOS APÓS O CLAMPEAMENTO TOTAL DO PEDÍCULO

HEPÁTICO

RESUMO - Uma das complicações do clampeamento total do pedículo hepático é a

congestão esplâncnica e, consequentemente, a congestão esplênica. Este trabalho teve como

objetivo avaliar as alterações morfológicas, morfométricas e ultra-estruturais que ocorreram

no baço frente à isquemia produzida pelo clampeamento total do pedículo hepático. Para tanto

foram utilizados 40 ratos machos, divididos em quatro grupos de 10 animais. O grupo

controle (C) não foi submetido à isquemia, já os grupos experimentais (E

, E

e E

) foram

submetidos ao clampeamento por 10, 20 e 30 minutos, respectivamente. Após esses períodos,

fragmentos do baço foram retirados e analisados histologicamente pela técnica de

Hematoxilina-Eosina, Ferrocianeto-Férrico e microscopia eletrônica de transmissão. Os

resultados mostraram alterações microscópicas nos grupos E

, E

e E

que permitem concluir

que 10 minutos de clampeamento do pedículo hepático são suficiente para apresentar sinais de

congestão esplênica e 20 e 30 minutos promovem intensa digestão de hemácias pelos

macrófagos, com presença de grânulos de ferro (hemossiderina) no parênquima esplênico.

Palavras chave: Congestão, Hemossiderina, Baço, Rato, Ultra-estrutura.

ASPECTOS MORFOLÓGICOS, MORFOMÉTRICOS E ULTRA- ESTRUTURAIS

DO BAÇO DE RATOS APÓS O CLAMPEAMENTO TOTAL DO PEDÍCULO

HEPÁTICO

MORPHOLOGIC, MORPHOMETRIC AND ULTRASTRUCTURAL ASPECTS OF

THE SPLEEN OF RATS AFTER TOTAL CLAMPING OF THE HEPATIC PEDICLE

ABSTRACT - One of the complications of hepatic pedicle total clamping is the splanchnic

congestion and consequently a splenic congestion. The aim of this study was to evaluate the

macro and microscopic alterations that occurred in the spleen during an ischemia produced by

the hepatic pedicle total clamping. Fourthy male rats were divided in four groups of ten

animals each. The control group (C) was not submitted to ischemia and the experimental

groups (E

, E

and E

) were submitted to the clamping during 10, 20 and 30 minutes,

respectively. After these periods, spleen fragments were collected and histological analyzed

by the eosin-hematoxilin and ferric ferrocyanide staining technique. Based on the results it is

possible to conclude that 10 minutes of hepatic pedicle total clamping is sufficient to show

signs of splenic congestion and 20 and 30 minutes promote intense red bood cels digestion by

the macrophages with the presence of iron granules (hemosiderin) at the splenic parenchyma.

Keyword: Congestion, Hemossiderin, Spleen, Rat, Ultrastructure.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 11

2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................ 13

3 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 17

4 MATERIAL E MÉTODO................................................................................................. 18

4.1. Amostras............................................................................................................. 18

4.2. Procedimento...................................................................................................... 19

4.3. Estudo morfológico ao microscópio de luz....................................................... 25

4.4. Estudo morfométrico......................................................................................... 26

4.5. Estudo ultra-estrutural...................................................................................... 27

4.6. Análise estatística............................................................................................... 28

5 RESULTADOS ................................................................................................................. 29

5.1. Macroscopia....................................................................................................... 29

5.2. Microscopia de luz............................................................................................. 29

5.3. Estudo Morfométrico........................................................................................ 32

5.4. Microscopia eletrônica de transmissão........................................................... 34

6 DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 35

7 CONCLUSÃO .................................................................................................................. 40

8 REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 41

ANEXOS................................................................................................................................ 47

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Aplicação da associação anestésica pela via intramuscular na região

posterior da coxa direita.......................................................................

Figura 2. Animal sendo submetido à tosquia da região abdominal com

máquina tosquiadeira……………........................................................

Figura 3. Anti-sepsia da região abdominal do animal com iodo

povidona...............................................................................................

Figura 4. Panos de campo colocados sobre o animal e fixos com pinças

Backhaus..............................................................................................

Figura 5.

Incisão mediana pré-retro umbilical com bisturi…………..................

Figura 6.

Ampliação da incisão da cavidade abdominal com tesoura

Metzenbaum.........................................................................................

Figura 7.

Apresentação do hilo hepático (sistema porta hepático)......................

Figura 8. Clampeamento do pedículo hepático com pinça vascular………

Figura 9. Coleta do baço após o clampeamento utilizando tesoura

Metzenbaum.........................................................................................

Figura 10.

Fotomicrografias mostrando cortes histológicos de baços de ratos

pertencentes aos vários grupos de estudo. Notar em C (Grupo

Controle) polpa vermelha com poucos grânulos de hemossiderina,

no entanto, estão aumentados (setas) nos grupos E1 (10 minutos) E2

(20 minutos) e E3 (30 minutos). H.E 10X

....................................................

Figura 11.

Fotomicrografias mostrando cortes histológicos de baços de ratos

pertencentes aos vários grupos de estudo. Notar em C (Grupo

Controle) pouca reatividade, que se acha aumentada, de forma

acentuada e progressiva (setas), nos grupos E1 (10 minutos) E2 (20

minutos) e E3 (30 minutos). Reação de Perls (Ferrocianeto-férrico)

10X…………………………………………………………………...

Figura 12.

Eletromicrografias mostrando macrófagos presentes nos cordões de

Billrroth de ratos pertencentes aos vários grupos de estudo. Notar

em C (Grupo Controle) poucos grânulos eletrondensos (seta), que

aumentam em números (setas) com o decorrer do tempo de

clampeamento hepático (E

, E

e E

). 8200X......................................

LISTA DE TABELA

Tabela 1. Porcentagem (%) da área ocupada pelos grânulos de hemossiderina

na polpa vermelha dos baços pertencentes aos vários grupos de

estudo (C, E

, E

e E

) após o clampeamento total do pedículo

hepático................................................................................................

Tabela 2. Porcentagem (%) de pigmento de hemossiderina (média ± desvio

padrão) obtida na polpa vermelha dos ratos pertencentes aos vários

grupos de estudo (C, E

, E

e E

)

após o clampeamento total do

pedículo hepático..................................................................................

LISTA DE GRÁFICO

Gráfico 1. Porcentagem de pigmento de hemossiderina (média ± desvio

padrão) obtida na polpa vermelha dos baços de ratos pertencentes

aos vários grupos de estudo (C, E

, E

e E

)após o clampeamento do

pedículo hepático..................................................................................

1. INTRODUÇÃO

As hemorragias hepáticas que ocorrem com freqüência após traumas, principalmente

nas ressecções e transplantes hepáticos, devem ser controladas; para tanto, modelos

experimentais de isquemia hepática têm sido muito difundidos. Inicialmente, Pringle (1908)

utilizou o clampeamento total do hilo hepático para conter os casos de hemorragias hepáticas.

Entretanto, Sébe (1999) trabalhando com clampeamento total do pedículo hepático em ratos,

observou que a privação de sangue neste órgão, por mais de vinte minutos, leva a lesões nas

organelas dos hepatócitos e, também, à congestão esplâncnica.

O baço é um órgão constituído por uma cápsula fibroelástica, de onde partem

trabéculas que servem para conduzir vasos e nervos e por um estroma representado por uma

rede de fibras e células reticulares que sustentam o parênquima ou polpa esplênica (polpas

branca e vermelha) (EICHNER, 1979; BLUE e WEISS, 1981; DELLMANN e BROWN,

1982; STITES et al., 1997). A polpa branca é formada por um conjunto de nódulos linfáticos

apresentando um centro germinativo e inúmeras células linfóides que se localizam ao longo

das arteríolas esplênicas. Já a polpa vermelha representa a maior parte do baço, onde são

observados inúmeros sinusóides sangüíneos que se entrelaçam e se anastomosam em várias

direções, separados por cordões celulares esplênicos, representados por fibroblastos,

leucócitos, eritrócitos e macrófagos (DOASSAN et al., 1984; ATRES, 1991; BANKS, 1992;

ROITT, 1992; POPE e ROCHAT, 1996). A reserva de hemácias no baço pode, quando

solicitado e sobre ação das catecolaminas, elevar o hematócrito em até 10% do seu valor

normal (LIPOWITZ e BLUE, 1998). O baço possui função hematopoiética nos recém

nascidos, podendo, também, desempenhar essa função nos adultos (LIPOWITZ e BLUE,

1998). A estrutura do baço, semelhante a uma peneira, torna-o eficiente no monitoramento de

células sangüíneas viáveis, facilitando, com isso, a fagocitose destas pelos macrófagos. Estes

acumulam pigmentos de hemossiderina, uma massa rica em ferro, oriunda da degradação da

hemoglobina (SWENSON e REECE, 1996; COUTO e HAMMER, 1997; CARLTON e

McGAVIN, 1998). Este órgão está, também, envolvido com os mecanismos de defesa do

organismo, através da produção de linfócitos e anticorpos (LIPOWITZ e BLUE, 1998;

RICHARD e SHERIND, 1998; SLATTER, 1998, MARQUES et al., 2004).

A importância desta pesquisa está em aproximar os modelos experimentais da

situação real em que tal procedimento é utilizado na prática médica diária. No presente estudo

procurou-se utilizar o modelo de isquemia hepática total, através do clampeamento total do

pedículo hepático sem derivação vascular, para pesquisar, em diferentes tempos, as alterações

histológicas que ocorrem no baço em diferentes tempos.

2. REVISÃO DE LITERATURA

O baço é um órgão linfóide que exerce funções complexas e variadas. Apesar de ter

sido bastante estudado, muitas destas funções ainda permanecem inexploradas ou

inexplicadas (POPE e ROCHAT, 1996).

Anatomicamente, o baço está localizado na cavidade abdominal, no quadrante cranial

esquerdo, em uma orientação dorsoventral, entre a curvatura maior do estômago, peritônio

parietal da parede abdominal lateral esquerda e o fígado. Ele está fixado ao omento maior na

região do hilo, na superfície visceral. Através do hilo, várias artérias e nervos simpáticos

penetram o baço e vasos venosos e linfáticos deixam o mesmo (EVANS e LAHUNTA, 1994;

LIPOWITZ e BLUE, 1998; GARTNER e HIATT, 1999). Ao corte, ele apresenta uma

superfície de coloração vermelho-escuro, conhecida como polpa vermelha, com áreas

acinzentadas, que constituem a polpa branca e estrias denominadas trabéculas (POPE e

ROCHAT, 1996; LIPOWITZ e BLUE, 1998).

Microscopicamente, o baço é constituído por uma espessa cápsula fibroelástica,

composta por tecido conjuntivo denso, fibras elásticas e musculares lisas, de onde partem

trabéculas que se ramificam e anastomosam repetidas vezes formando uma complexa trama

que sustenta o parênquima esplênico (polpas branca e vermelha) e serve para conduzir os

vasos e nervos (EICHNER, 1979; BLUE e WEISS, 1981; DELLMANN e BROWN, 1982;

GEORGE et al., 1998; BIER et al., 1989; STITES et al., 1997; ZHANG, 2001).

Histologicamente, o baço apresenta uma rede tridimensional de fibras e células

reticulares que se interligam entre a cápsula e as trabéculas, formando o parênquima esplênico

(EICHNER, 1979; BLUE e WEISS, 1981; DELLMANN e BROWN, 1982; BIER et al.,

1989; STITES et al., 1997, GARTNER e HIATT, 1999).

A polpa branca é constituída por uma massa linfóide esplênica composta por linfócitos

T e B, que corresponde aproximadamente a 5 a 20% da massa total do baço. Estas células

compreendem a bainha linfática periarterial que está intimamente associada com a arteríola

central (BURKITT et al., 1994; GARTNER e HIATT, 1999). Os linfócitos T estão

localizados ao redor da arteríola central, enquanto os linfócitos B constituem os nódulos

linfáticos ovóides, que podem apresentar centros germinativos com atividade antigênica

(GEORGE et al., 1998; GARTNER e HIATT, 1999). Esta polpa está envolvida por uma zona

marginal constituída por plasmócitos, linfócitos T e B, macrófagos e células dendríticas

apresentadoras de antígenos (GARTNER e HIATT, 1999). Entre as polpas branca e vermelha

há uma região denominada de zona marginal que recebe sangue de várias artérias terminais e

é densamente habitada por macrófagos (LIPOWITZ e BLUE, 1998).

A polpa vermelha, maior porção do baço, é constituída de sinusóides sangüíneos e

cordões esplênicos (cordões de Billroth) que se entrelaçam e se anastomosam em várias

direções. Nela ainda estão presentes várias células como fibroblastos, leucócitos, eritrócitos e

macrófagos (DOASSANS et al., 1984; TIZARD, 1985; ATRES, 1991; BANKS, 1992;

ROITT, 1992; POPE e ROCHAT, 1996; GARTNER e HIATT, 1999). É bastante semelhante

a uma esponja, onde as lacunas representam os sinusóides e as estruturas que as interligam

representam os cordões esplênicos, também denominados de parênquima (GARTNER e

HIATT, 1999). Os sinusóides esplênicos possuem um endotélio revestido por células

fusiformes e uma lâmina basal descontínua, sobre as quais estão presentes fibras reticulares

distribuídas transversalmente (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1999). Entre as células

endoteliais há espaços por onde migram hemácias dos cordões esplênicos para os sinusóides.

As hemácias velhas ou parasitadas, por perderem a sua flexibilidade e por não conseguirem

penetrar nos sinusóides, são fagocitadas e destruídas pelos macrófagos (hemocaterese).

Esses macrófagos, que são células muito ativas, possuem à microscopia eletrônica

uma superfície irregular, com inúmeras saliências e reentrâncias e um citoplasma contendo

vários lisossomos que depositam suas enzimas nos vacúolos que contém material fagocitado,

formando os fagossomos, onde vai ser realizada a digestão do material fagocitado (GEORGE

et al., 1998; GARTNER e HIATT, 1999; JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1999). A

hemoglobina resultante da digestão de hemácias se desdobra em porções heme e globina. A

fração globina é quebrada em seus constituintes de aminoácidos que vão para circulação

sanguínea e as moléculas de ferro, da fração heme, no interior dos macrófagos, se agrupam

formando um pigmento denominado de hemossiderina que são levados à medula óssea pela

transferrina, onde são utilizadas para formação de novas hemácias (SWENSON e REECE,

1996; COUTO e HAMMER, 1997; CARLTON e MCGAVIN, 1998; GEORGE et al., 1998;

GARTNER e HIATT, 1999, ALENCAR et al., 2002).

A irrigação esplênica é realizada pela artéria esplênica que vai se ramificando à

medida que penetra a cápsula através do hilo do baço. Vasos menores, como as artérias

trabeculares, vão surgindo e sendo transportados para o interior do parênquima esplênico por

trabéculas cada vez menores (KOLB, et al., 1984; GARTNER e HIATT, 1999). Estes vasos

esplênicos, ao atingirem diâmetros de 0,2mm, abandonam as trabéculas e vão sendo

envolvidos por uma bainha de linfócitos denominada bainha linfática periarterial, rica em

linfócitos T. Por estar localizado no centro da bainha, o vaso sanguíneo passa a ser chamado

de artéria central (KOLB et al., 1987; BURKITT, 1994; GARTNER e HIATT, 1999).

A artéria central, na sua extremidade, perde a bainha e se subdivide em vários ramos

curtos e paralelos, denominados de arteríolas penicilares, que penetram a polpa vermelha.

Estas arteríolas possuem três regiões denominadas de arteríola pulpar, arteríola encapsulada e

capilares arteriais terminais (GUYTON, 1992; BURKITT et al., 1994; GARTNER e HIATT,

1999). É sabido que estes últimos vasos despejam sangue nos seios esplênicos, porém, o

mecanismo da circulação ainda não está completamente elucidado, provocando a formulação

de três teorias: circulação fechada, circulação aberta e mista. Na primeira, o endotélio dos

capilares arteriais terminais tem continuidade com o endotélio dos sinusóides. Na segunda,

acreditam que o endotélio dos capilares arteriais terminais não está interligado com o

endotélio dos sinusóides, onde o sangue percorre a polpa vermelha até os seios esplênicos. Na

última, o endotélio dos capilares terminais pode ou não estar ligado ao endotélio dos

sinusóides, caracterizando uma circulação mista. O sangue dos sinusóides esplênicos é

drenado por pequenas veias da polpa vermelha que vão aumentando de calibre até formar a

veia esplênica que é uma tributária da veia porta hepática (GARTNER e HIATT, 1999).

O baço dos animais tem uma grande importância como reservatório sangüíneo,

podendo, quando solicitado e sobre ação das catecolaminas, elevar o hematócrito em até 10%

do seu valor normal (KOLB et al., 1987; LIPOWITZ e BLUE, 1998). Além disso, está

envolvido na produção de linfócitos T e B e de anticorpos (LIPOWITZ e BLUE, 1998;

RICHARD e SHERIND, 1998; LIPOWITZ e BLUE, 1998). Nos recém nascidos, o baço tem

função hematopoiética e, quando necessário, também pode produzir hemácias nos adultos

(LIPOWITZ e BLUE, 1998).

A estrutura do baço, devido a sua malha tridimensional, realiza o monitoramento de

células sangüíneas viáveis, favorecendo a fagocitose dos leucócitos, plaquetas e eritrócitos

senis pelos macrófagos (ZHANG, 2001). O material, quando processado pela Hematoxilina e

Eosina (H&E), apresenta grumos marrons de hemossiderina, uma massa rica em ferro,

oriunda da hemoglobina (SWENSON e REECE, 1996; COUTO e HAMMER, 1997;

CARLTON e MCGAVIN, 1998).

Nas lesões sangrantes do fígado, o bloqueio dos vasos torna-se necessário para

facilitar as manobras cirúrgicas (SILVA JR. et al., 2002, ARAÚJO JR. et al 2005). Em 1908,

Pringle já utilizava do clampeamento total do hilo hepático para conter hemorragias. O

clampeamento total do pedículo hepático utilizado para conter a hemorragia nos

procedimentos cirúrgicos do fígado resulta na congestão esplâncnica e, consequentemente,

perfusão sanguínea deficiente de órgãos como estômago, intestino delgado e parte anterior do

intestino grosso, baço e pâncreas (SEBE, 1999a; FREITAS, 2000; CAMARGO; 2003). Esse

procedimento resulta em hipóxia celular, aumento do metabolismo anaeróbico e formação de

substâncias lesivas às células como prostaglandinas e radicais livres (superóxidos - O

peróxido de hidrogênio - H

e hidroxil - OH

) (FORYTH e GUILFORD, 1995).

As células necessitam de oxigênio para oxidar substratos energéticos por meio das

enzimas citocromo oxidase. Para que essa reação ocorra, o oxigênio tem que receber quatro

elétrons para ser reduzido em água. Caso ocorra redução do oxigênio por um elétron, será

formado o radical superóxido (O

). Já a redução de dois elétrons, resulta em peróxido de

hidrogênio (H

) e a redução por três elétrons resulta no radical hidroxil (OH

)

(FLAHERTY e WEISFELDT, 1988). Esta redução do oxigênio por até três elétrons dá

origem a produtos conhecidos como radicais livres do oxigênio. Tanto o radical superóxido

quanto o hidroxil são altamente instáveis, podendo reagir com macromoléculas biológicas,

alterando sua conformação e provocando danos celulares. O radical hidroxil é considerado o

mais reativo, podendo reagir com moléculas de DNA. Embora o peróxido de hidrogênio seja

considerado o menos potente, na presença de íons de metais como o ferro, o peróxido de

hidrogênio pode ser convertido em radical hidroxi, tornando-se reativol (FLAHERTY e

WEISFELDT, 1988).

Para melhorar estas condições, Barbarino et al.(1978) trabalharam em seus

experimentos utilizando apenas o clampeamento isolado da veia porta. Essa técnica teve como

finalidade diminuir o afluxo de sangue para o fígado e a congestão esplâncnica. Mesmo assim

observaram esplenomegalia, com aumento da polpa vermelha, diminuição do número de

folículos de Malpighi que se apresentaram aumentados de tamanho.

SEBE (1999), FREITAS (2000) e CAMARGO (2003) observaram que o

clampeamento total do pedículo hepático, em ratos, por mais de vinte minutos, leva a

congestão esplâncnica. A partir deste fato, propôs-se com este trabalho, avaliar as alterações

morfológicas, morfométricas e ultra-estruturais do baço durante o clampeamento total do

pedículo hepático (manobra de PRINGLE modificada).

3. OBJETIVOS

Avaliar os aspectos morfológicos, morfométricos e ultra-estruturais do baço de ratos

após o clampeamento total do pedículo hepático em diferentes tempos.

4. MATERIAL E MÉTODO

4.1. Amostra

Foram utilizados 40 ratos (Rattus norvegicus albinus), da linhagem OUTB EPM-1,

Wistar, machos, de três meses de idade e peso entre 232 e 359 gramas. Os animais foram

fornecidos pelo Biotério da Universidade de Cuiabá (UNIC) e ficaram alojados em gaiolas de

poliuretano com grade de aço, de 41 x 34 x 17 cm, em número de dois por gaiola, sendo a

higienização destas realizada diariamente.

A temperatura foi mantida por ar condicionado em 22

C, a umidade em 65% e a

luminosidade foi controlada artificialmente com lâmpadas fluorescentes (luz do dia - Phillips

– 40 Watts) com 12 horas de luz e 12 horas sem luz.

Utilizou-se ração Labina

(Purina), própria para ratos e os animais foram mantidos em

jejum alimentar de duas horas anteriores à cirurgia.

Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de 10 animais,

denominados grupo controle (C) e grupos experimentais (E

e E

). Os procedimentos

realizados em cada grupo de animais foram os seguintes:

Grupo C – animal anestesiado + celiotomia + retirada do baço após 30 minutos;

Grupo E

– animal anestesiado + celiotomia + clampeamento do pedículo hepático do 20

minuto + retirada do baço;

Grupo E

– animal anestesiado + celiotomia + clampeamento do pedículo hepático do 10

minuto + retirada do baço;

Grupo E

– animal anestesiado + celiotomia + clampeamento do pedículo hepático por 30

minutos + retirada do baço.

4.2. Procedimento

Os ratos foram trazidos ao Laboratório de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental

da UNIC, instantes antes do início do experimento e mantidos isolados em uma sala separada.

Após serem sorteados aleatoriamente, foram enquadrados em um dos quatro grupos,

sendo etiquetados com um número de 1 a 10 e acrescida da letra de um dos quatro grupos

(C, E

, E

ou E

Após o sorteio e identificação, os animais foram pesados e submetidos à anestesia

dissociativa com 25 mg/Kg de xilazina

e 50 mg/Kg de cetamina

. A via de administração foi

intramuscular, na região posterior da coxa direita (Fig. 1).

Figura 1. Aplicação da associação anestésica pela via intramuscular

na região posterior da coxa direita.

Virbaxil 2% - Virbac do Brasil Indústria e Comércia Ltda, São Paulo, SP.

Vetanarcol – Koning do Brasil Ltda, Florianópolis, SC.

Em seguida foram realizadas tosquias da regiões abdominais dos animais com

máquina tosquiadeira (Fig. 2).

Figura 2. Animal sendo submetido à tosquia da região abdominal

com máquina tosquiadeira.

Na sequência, os animais foram posicionados na mesa cirúrgica em decúbito dorsal,

onde se procedeu anti-sepsia com iodo povidona

(Fig. 3) e foram colocados campos

operatórios (Fig. 4).

Figura 3. Anti-sepsia da região abdominal do animal com iodo

povidona.

Riodeine tópico – Indústria Farmacêutica Rioquímca Ltda, São Paulo, SP.

Figura 4. Panos de campo colocados sobre o animal e fixados com

pinças Backhaus.

Foi realizada uma incisão mediana pré-retro umbilical com lâmina de bisturi n

11,

partindo da cartilagem xifóide, se estendendo aproximadamente 4 cm caudal à cicatriz

umbilical (Fig. 5). Após incisão da pele e divulsão do subcutâneo, realizou-se a abertura da

parede abdominal com bisturi, ampliando a incisão com tesoura Metzenbaum (Fig. 6). Após a

abertura da cavidade abdominal localizou-se o pedículo hepático (Fig. 7).

Figura 5. Incisão mediana pré-retro umbilical com bisturi.

Figura 6. Ampliação da incisão da cavidade abdominal com tesoura

Metzenbaum.

Figura 7. Apresentação do hilo hepático (sistema porta hepático).

A artéria hepática, a veia porta e o colédoco foram clampeados utilizando-se pinça de

clampeamento vascular de 3 cm (Fig. 8).

Figura 8. Clampeamento do pedículo hepático com pinça vascular.

Em seguida as incisões foram cobertas com gazes embebidas em solução fisiológica a

0,9%

aquecida para evitar a hipotermia e desidratação.

Os animais do grupo C foram anestesiados, e as celiotomia foram realizadas na

sequência, porém não tiveram os pedículos hepáticos clampeados. Após 30 minutos seus

baços foram coletados.

Os demais animais, em seus respectivos grupos, tiveram seus pedículos hepáticos

clampeados por 10, 20 ou 30 minutos. Após cada tempo estipulado, oss baço foram coletados,

utilizando-se tesoura Metzenbaum. Foram seccionados todos os componentes do pedículo

esplênico (Fig. 9).

Solução fisiológica – JP Indústria Famacêutica SA, Ribeirão Preto, SP.

Figura 9 Coleta do baço após o clampeamento utilizando uma

tesoura Metzenbaum.

Após remoções dos baços, fragmentos foram coletados e imediatamente mergulhados

em solução de formaldeído a 10% ou em solução de glutaraldeido a 4%, tampão cacodilato.

Em seguida, os animais foram submetidos a eutanásia por aprofundamento anestésico

e cloreto de potássio a 10%

4.3. Estudo Morfológico ao microscópio de luz

Fragmentos do terço médio dos baços que permaneceram durante 24 horas

mergulhados em formol 10%, para fixação, foram submetidos às técnicas rotineiras para

inclusão em parafina. Após fixação, o material foi desidratado em concentrações crescentes

de álcool etílico (desde 70 GL até o absoluto ou 100

GL). Em seguida, foram submetidos à

diafanização pelo xilol e impregnação em parafina líquida a 59 ºC. Os fragmentos foram

incluídos em blocos de parafina de tal maneira que fosse possível observar, nas lâminas,

cortes perpendiculares ao maior eixo dos fragmentos. Dos blocos foram realizados cortes de

5µm de espessura, com o auxílio de micrótomo rotativo MR2125 Leica, coletados em lâminas

e corados pela Hematoxilina-Eosina (H.E). Alguns cortes de cada aminal foram submetidos à

metodologia citoquímica para identificação dos íons de ferro, pelo método de Perls

(Ferrocianeto-Férrico), para estudo morfométrico. Neste método, o ferro da hemossiderina,

em meio ácido, é liberado e vai combinar com ferrocianeto de potássio, formando o

ferrocianeto férrico de coloração azul da prússia. As lâminas coradas pelo H.E foram

analisadas em microscopia de luz (Axiolab 2.0 da Carl Zeiss) com objetivas que variavam de

4 a 100 X e ocular de 10X. O material foi fotografado em fotomicroscópio Olympus.

Cloreto de potásio 10% – Aster Produtos Médicos Ltda, Sorocaba, SP

4.4. Estudo Morfométrico

A análise morfométrica foi realizada nas lâminas submetidas à reação de Perls.

Imagens foram inicialmente capturadas com o auxilio de um sistema de captura de imagens,

que consiste em câmara digital de alta resolução (Axio Vision – Carl Zeiss) acoplada em

microscópio de luz (Axiolab 2.0 - Carl Zeiss) sob objetiva de 40X. A imagem obtida foi

transferida para computador Pentium 4.0 em ambiente Windows, contendo programa de

captura de imagens (Rel 4.0 da Carl Zeiss). Em seguida, com o auxílio de um sistema

computacional de análise de imagens (softwares IMAGELAB 2000), o material foi lido com

intuíto de analisar a porcentagem de área no corte que continha ferrocianeto férrico (resultado

da reação de Perls). Para tanto, foram capturados 10 campos do baço em cada animal, na

região imediatamente ao redor da polpa branca, ou seja, na região da polpa vermelha. Em

cada campo foi obtido um valor (percentual) sendo, ao final, obtido um valor médio para cada

animal.

4.5. Estudo ultra-estrutural

Para o estudo ultra-estrutural foram coletados fragmentos do terço médio do baço,

que foram transformados em peças de aproximadamente 1mm

, imediatamente imersas em

solução de glutaraldeído a 4,0% (0,32 osmolar), em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, em pH

7,2, à temperatura de 4 °C, por quatro horas. Em seguida, foram lavadas três vezes em

solução salina a 0,9%, 0,32 osmolar e imersas em acetato de uranila a 0,5%, 0,32 osmolar,

durante 12 horas, à 4°C. Logo após, as peças foram lavadas três vezes em água bidestilada e

desidratadas pelo etanol em concentrações crescentes, seguida de duas passagens de 10

minutos cada uma, pelo óxido de propileno. Em seguida, foi feita infiltração, onde as peças

ficaram em movimento giratório por uma hora, à temperatura ambiente, em mistura de óxido

de propileno e meio de inclusão (araldite) 1:1. O material foi, então, transferido para o meio

de inclusão, onde permaneceu girando por uma hora em estufa à 37°C. A inclusão das peças

foi realizada em araldite e mantida em estufa à 60 °C, por 72 horas, para a polimerização da

resina e preparo dos blocos, onde através de um ultramicrótomo Porter Blum MT - 1, foram

conseguidos cortes semifinos de espessuras de 0,5 µm. As lâminas foram preparadas e

coradas em mistura de partes iguais de Azur II a 1%, em água destilada e azul de metileno a

1%, em bórax a 1%, à quente. Em seguida, foram enxaguadas e examinadas ao microscópio

de luz para selecionar os blocos que continham a polpa vermelha. Após estes procedimentos,

os blocos foram selecionados e levados ao ultramicrótomo para obtenção de cortes ultrafinos,

com espessura variando de 40 a 80 nm. Para obtenção dos cortes ultrafinos foram usadas

facas de vidro e telas de cobre de 200 malhas. A análise dos cortes ultrafinos e de suas

eletromicrografias foram realizadas em microscópio de marca Carl Zeiss, modelo EM 900 a

80kV.

Nas eletromicrografias foram observadas a morfologia geral da polpa vermelha, em

especial dos macrófagos.

4.6. Análise estatística

Os dados da percentagem dos pigmentos férricos de hemossiderina foram

submetidos inicialmente à análise de variância, complementados pelos testes de Kolmogorov-

Smirnov, Levene e Welch e Brown-Forsythe (sofware - SPSS 15.0). O nível de significância

máximo adotado foi P < 0,05.

5. RESULTADOS

5.1. Macroscopia

Após o período de clampeamento do hilo hepático observou-se que os baços de todos

os grupos esperimentais (E

, E

e E

) mostraram coloração vermelho escuro a azulada,

semelhantes aos grupo controle.

5.2. Microscopia de luz

No Grupo Controle foi observado baço circundado por uma cápsula de tecido

fibromuscular que emite septos para o seu interior (trabéculas). No interior do órgão notou-se,

no parênquima, a presença de acúmulos de linfócitos (polpa branca) que formam cordões ao

redor de vasos sangüíneos ou nódulos com arteríola central. Ao redor dos nódulos linfáticos

notaram-se inúmeros capilares contendo hemácias no seu interior (polpa vermelha), sendo os

capilares rodeados por inúmeros macrófagos (cordões de Billrrot). Alguns macrófagos

apresentaram pequena quantidade de grânulos alaranjados (hemossiderina) no seu interior e,

após a reação ao ferrocianeto de potássio (Reação de Perls), se observou pequena quantidade

pigmentos férricos de coloração azulada (Fig. 10C e 11C, Tab. 2 e Graf. 1).

O Grupo E

(10 minutos de clampeamento) apresentou uma arquitetura do baço

muito semelhante ao Grupo Controle. Entretanto, observou-se ligeira vasodilatação nos

capilares presentes na polpa vermelha e maior quantidade de grânulos azulados de

hemossiderina que no Crupo C (Fig. 10E

e 11E

, Tab. 2 e Graf. 1 ).

No Grupo E

(20 minutos de clampeamento) notou-se que o baço também

apresentava a mesma arquitetura histológica daquela observada no grupo Controle. No

entanto, percebeu-se nítida diminuição da polpa branca, tanto da porção cordonal quanto da

nodular. A polpa vermelha mostrou-se bem evidente, com intensa dilatação dos capilares

sinusóides e concentração acentuada de grânulos de hemossiderina

(Fig. 10E

e 11E

, Tab. 2 e

Graf. 1).

No Grupo E

(30 minutos de clampeamento) foi observado acentuado aumento da

polpa vermelha. A polpa branca encontra-se praticamente tomada pela polpa vermelha devido

a acentuada dilatação dos vasos sangüíneos presentes nesta região e elevada concentração de

grânulos de hemossiderina (Fig. 10E

e 11E

, Tab. 2 e Graf. 1).

Figura 10. Fotomicrografias mostrando cortes histológicos de baços de ratos pertencentes aos vários

grupos de estudo. Notar em C (Grupo Controle) polpa vermelha com poucos grânulos de

hemossiderina, que no entanto, estão aumentados (setas) nos grupos E

(10 minutos), E

(20 minutos) e

(30 minutos). H.E 10X.

Figura 11. Fotomicrografias mostrando cortes histológicos de baços de ratos pertencentes aos vários grupos de

estudo. Notar em C (grupo controle) pouca reatividade, que se acha aumentada, de forma acentuada e

progressiva (setas), nos grupos E

(10 minutos), E

(20 minutos) e E

(30 minutos). Reação de Perls

(Ferrocianeto-férrico) 10X.

5.3. Estudo morfométrico

Os dados relativos à análise morfométrica dos grânulos de hemossiderina encontram-

se expressos na tabela 1 e 2 e gráfico 1.

Tabela 1. Porcentagem (%) da área ocupada pelos grânulos de hemossiderina na polpa

vermelha dos baços pertencentes aos vários grupos (C, E

, E

e E

) de estudo após o

clampeamento total do pedículo hepático.

GRUPOS

C (%)

1,2

2,2

1,3

1,4

1,5

1,4

1,3

1,5

1,4

(%)

2,2

1,3

2,1

1,1

2,1

2,5

2,3

2,0

1,8

(%)

5,4

7,5

5,7

4,5

3,2

5,6

4,5

5,4

3,2

4,2

(%)

12,5

15,4

17,8

16,5

18,9

15,7

16,7

18,5

18,9

19,6

Tabela 2. Porcentagem (%) de pigmento de hemossiderina (média ± desvio padrão) obtida na

polpa vermelha dos baços dos ratos pertencentes aos vários grupos (C, E

, E

e E

) após o

clampeamento total do pedículo hepático.

Grupos

Controle (%) E1 (%) E2 (%) E3 (%)

Médias

1,45

1,95

4,92

17,05

Desvio Padrão

0,28 0,44 1,29 2,15

Médias seguidas de letras diferentes diferem entre si (p<0,05).

Média ± desvio padrão de E3 > E2 > E1 > Grupo Controle.

Grupos

Controle E1 E2 E3

% de pigmento

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

Gráfico 1. Porcentagem de pigmento de hemossiderina (média ± desvio padrão)

obtida na polpa vermelha dos baços dos ratos pertencentes aos vários grupos

(C,

, E

e E

) após o clampeamento total do pedículo hepático.

5.4. Microscopia eletrônica de transmissão

No Grupo Controle foram observados inúmeros macrófagos em contato com

eritrócitos, sendo que alguns deles apresentavam no seu citoplasma alguns grânulos

eletrondensos (Fig. 12C).

Nos Grupos E

, E

e E

notou-se intensa vasodilatação que se acentua com o decorrer

do tempo de clampeamento e maior concentração de macrófagos contendo no seu interior

inúmeros grânulos eletondensos (Fg. 12 E

, E

e E

). Em alguns macrófagos notou-se que os

grânulos eletrondensos estavam constituídos por restos de hemácias ou de células (Fig.

12E

e E

Figura 12. Eletromicrografias mostrando macrófagos presentes nos cordões de Billrroth dos ratos

pertencentes aos vários grupos

(C, E

, E

e E

). Notar em C (Grupo Controle) poucos grânulos

eletrondensos (seta), que aumentam em números (setas) com o decorrer do tempo de clampeamento hepático

, E

e E

). 8200X.

6. DISCUSSÃO

O rato foi o animal escolhido para a realização deste trabalho por ser de fácil

aquisição, apresentar uma linhagem bem definida para se conseguir amostras de maior

homogeneidade e por ser amplamente utilizado nesse tipo de experimento (SHIBAYAMA et

al., 1991; HARDY et al., 1995; SEBE, 1999; CAMARGO et al, 2003).

Várias associações de tranquilizantes e anestésicos como midazolan e cetamina,

medetomidina e cetamina, xilazina e cetamina, podem ser utilizadas para anestesiar animais

de laboratório (HENS e BROSNAN, 1970; HORIUCHI et al., 1995 (SPINOSA et al., 1999;

FREITAS et al., 2000; SEBE et al., 2000; CAMARGO, 2003; ISOZAKI et al., 1992). Neste

experimento os barbitúricos foram evitados, uma vez que atuam na musculutara lisa da

cápsula esplênica, causando relaxamento da mesma, aumentando, com isso, o reserva

sanguínea esplênica, o que poderia interferir nos resultados durante o clampeamento do

pedículo hepático, elevando a pressão sangüínea intra-esplênica e aumentando a fagocitose

das hemácias pelos macrófagos (ETTINGER, 1996; CARLTON e MCGAVIN, 1998;

FRASER, 1991). Sendo assim, foi empregada a associação de xilazina e cetamina, na mesma

seringa, por via intramuscular, por ser de fácil aplicação, produzir analgesia, relaxamento

muscular e anestesia nos animais durante o procedimento cirúrgico, sem que promovesse

alterações hepáticas (WEISBROTH e FUDENS, 1972).

Vale lembrar que o ambiente onde os animais de laboratório são acomodados no

período pré-operatório é um fator a ser considerado, pois existe interfência da resposta aos

fármacos anestésicos frente a estímulos excitatórios externos (MASSONE, 2003). Diante do

exposto, optou-se, neste estudo, por um período de adaptação dos animais em uma sala

isolada, com ventilação e sem ruidos, de forma a obter uma anestesia satisfatória e livre de

intercorrências durante todo experimento.

O acesso à cavidade abdominal mais comumente utilizado na literatura é pela linha

mediana, partindo da cartilagem xifóide e estendendo-se em direção à cicatriz umbilical

(FREDERIKS et al., 1982; ASAKAVA et al., 1989; ISOZAKI et al., 1995, GONCE et al.,

1995; HARDY et al., 1995; MARUYAMA et al., 1995, SEBE et al., 2000). Esse tipo de

incisão foi utilizada nos animais do experimento, possibilitando a visualização do hilo

hepático, fígado e baço, facilitando o clampeamento do hilo hepático e avaliação direta do

baço.

A torção esplênica primária ou secundária, decorrente da dilatação e vólvulo-

gástrico, em pequenos animais, inicialmente promove a oclusão das veias de paredes

delgadas, mas não das artérias correspondentes, resultando em congestão, isquemia e,

posteriormente, necrose do parênquima esplênico. A patogênese da torção ainda não está bem

esclarecida, porém o grau de lesão esplênica irá depender do comprometimento dos vasos e

do tempo de privação sanguínea para esse órgão (POPE e ROCHAT, 1996). Da mesma

forma, neste estudo, a congestão esplênica observada após clampeamento total do pedículo

hepático, não promoveu necrose, pois a obstrução vascular comprometeu apenas a circulação

venosa, mantendo-se intacta a circulação arterial. Provavelmente, o tempo de clampeamento

não foi suficiente para causar necrose deste órgão, embora tenha promovido congestão

esplâncnica.

Silva Jr e Beer (1998), em seus modelos experimentais de isquemia hepática,

utilizaram a manobra de Pringle, de maneira modificada, clampeando o tronco vascular e

ducto biliar de determinado lobo hepático, não provocando, dessa forma, congestão

esplâncnica. Já Gonçalez et al. (1979) e Frederiks et al. (1982) realizaram o clampeamento da

artéria hepática esquerda, veia porta esquerda e ducto biliar esquerdo, causando isquemia no

lobo mediano e lobo lateral esquerdo do fígado de ratos, mantendo-se, dessa maneira, uma

parte do fígado funcional e evitando-se, então, a congestão esplâncnica. Derry e Slapak

(1973) utilizando o clampeamento hepático seletivo, baseado na segmentação do fígado de

ratos, propuseram um novo modelo de falência hepática aguda e, assim, conseguiram

isquemiar 70% do órgão e manter 30% com circulação normal, não sendo necessário

promover a descompressão vascular para impedir a congestão esplâncnica. Também,

Omokava et al. (1991) em seu experimento, trabalharam com isquemia hepática, promovendo

o desvio porto-sistêmico. O baço foi colocado na parede abdominal, sua cápsula foi

escarificada e ele foi sepultado numa bolsa de tecido subcutâneo, produzindo assim a

anastomose porto-sistêmica, com a finalidade de evitar a congestão esplâncnica.

Por outro lado, neste experimento foi utilizada a manobra de Pringle (1908)

modificada, uma técnica que consiste no clampeamento do pedículo hepático (artéria

hepática, veia porta e colédoco). Com essa técnica observou-se congestão esplâncnica, que

resultou na congestão esplênica. Barbarino et al. (1978) já haviam utilizado apenas a ligação

da veia porta e, observaram, em relação ao baço, esplenomegalia, aumento do diâmetro da

polpa vermelha, diminuição do número de folículos de Malpighi, como pôde, também, ser

observado neste trabalho. Da mesma forma, Sebe et al. (2000) e Camargo et al. (2003), em

seus experimentos, observaram congestão esplâncnica, com mudança de coloração dos órgãos

drenados pelo sistema porta.

De acordo com a literatura consultada, os períodos experimentais de tempo de

isquemia hepática variam desde 30 minutos até 100 minutos (ASAKAVA et al., 1989;

ISOZAKI et al., 1995), sendo os maiores períodos de tempo relacionados com trabalhos que

envolvem isquemia hepática parcial ou total com derivações vasculares e os menores

períodos de tempo relacionados com trabalhos que envolvem isquemia total, sem derivações

vasculares, como descrito por Sébe (1999) e reproduzido neste estudo.

No modelo experimental realizado por Sébe (1999), Freitas et al. (2000) e Camargo et

al. (2003), utilizando a manobra de Pringle modificada por 10, 20 e 30 minutos, notou-se

isquemia hepática, intestinal e congestão esplênica, decorrentes da congestão esplâncnica. A

isquemia hepática total em diferentes tempos, acarreta congestão esplâncnica e,

consequentemente, congestão esplênica, que é caracterizada pela diminuição da polpa branca

(nódulos linfáticos) e pelo aumento da polpa vermelha, sendo essa mais intensa aos trinta

minutos, conforme relatada por Freitas et al. (2006) e confirmada através deste estudo.

A hemocaterese fisiológica de eritrócitos envelhecidos, lesionados ou enfermo, pelos

macrófagos, libera grandes concentrações de ferro reutilizável, que é armazenado pelo baço e

parte é direcionado à medula óssea para ser utilizado na produção de novas hemácias (POPE e

ROCHAT, 1996; ALENCAR et al., 2002). Inicialmente, neste estudo, foi notado a presença

de pigmentos férricos no parênquima esplênico que caracteriza a hemocaterese fisiológica,

porém, com o aumento de tempo de clampeamento essa concentração aumentava.

O clampeamento do hilo hepático pode reduzir a concentração de energia e intensificar

a acidose láctica esplênica, que poderá causar danos às membranas dos eritrócitos e alteração

de sua elasticidade, aumentando a fagocitose das hemácias danificadas pelos macrófagos,

resultando numa maior produção de pigmentos férricos de hemossiderina. Estas alterações

ocorrem devido ao fato da concentração de glicose e colesterol nos seios venosos esplênicos

ser menor se comparado ao restante do sistema circulatório, que juntamente com a produção

de ácido láctico através do metabolismo das hemácias, resulta num ambiente tolerado apenas

por hemácias jovens e saudáveis, levando ao descarte das hemácias velhas ou enfermas

(POPE e ROCHAT, 1996). A presença de granulos de hemossiderina no parênquima

esplênico caracterisa destruição de hemácias (FREITAS 2000), evento também notada nesse

estudo, porém não se sabe se os pigmentos férricos são oriundos de hemácias jovens ou

velhas e se realmente os tempos de clampeamentos foram suficientes para alterar,

bioquimicamente, o baço

Também, o aumento da pressão sangüínea e da temperatura esplênica podem lesionar

os eritrócitos e intensificar a eritrofagocitose pelos macrófagos (FRASER, 1986, POPE e

ROCHAT, 1996, CARLTON e McGAVIN, 1998). Desse forma, notou-se nesse experimento,

que durante o clampeamento do pedículo hepático, a drenagem venosa esplênica, realizada

pelo sistema porta, ficou comprometida, caracterizada pela congestão esplênica, que

possivelmente, acarreta um aumento da pressão sanguínea intraesplênica. O acúmulo

progressivo de pigmentos férricos de hemossiderina observado no interior dos macrófagos,

caracteriza a eritrofagocitose decorrente do aumento da pressão sanguínea no parênquima e

seios venosos esplênicos.

Embora a reação de Perls ou azul da Prússia seja muito antiga, esta técnica ainda é

muito utilizada nos dias atuais para identificação do ferro celular na forma de ferritina ou

hemossiderina em várias patologias. A reação se processa na interação de íons ferrocianeto

com íons férricos no interior da célula, resultando em um produto de cor azul-esverdeado

denominado ferrocianeto férrico. Essa técnica é utilizada para detectar ferro no interior do

eritroblasto (sideroblasto), de macrófagos e nas hemácias (ASANO et al., 2006; FREITAS et

al., 2006; MEGURO et al., 2007). Por ser o baço um órgão que possui uma população muito

grande de macrófagos que atuam na destruição das hemácias, principalmente as velhas ou

danificadas, optou-se neste experimento, por utilizar essa técnica para detectar pigmentos

férrricos orindos de eritrócitos no interior dos macrófagos.

A mensuração e a quantificação dos tecidos podem ser realizadas pela morfometria

manual ou digital (HALASZ et al., 1993, VEIAGA et at, 2007). A quantificação

morfométrica digital (Softwares IMAGELAB 2000), por ser um método prático e confiável,

foi utilizada neste experimento, onde foi possível mensurar em porcentagem os pigmentos

férricos de hemossiderina presentes nos macrófagos esplênicos em diferentes tempos.

Com relação à análise estatítisca da porcentagem de pigmentos férricos na polpa

vermelha, o modelo adotado foi uma análise de variância de um fator. Entretanto, embora não

rejeitada a hipótese de aderência à distribuição Normal pelo teste de Kolmogorov-Smirnov

(α=0.365), detectou-se heterogeneidade de variâncias pelo teste de Levene (α=0.000), o que

levou a optarmos por um procedimento não sensível a esta heterocedasticidade, no caso os

testes de Welch e Brown-Forsythe (SOKAL e ROHLF, 1995). Após esta análise estatística

foram obesevadas diferenças estatísticas entre todos os grupos.

Os oxirradicais livres (ânions hiperóxidos, radicais hidroxila e peróxido de hidrogênio)

são moléculas altamente reativas e capazes de causar lesões celulares e no DNA. O peróxido

de hidrogênio não é um radical livre, porém, com a produção acelerada e em presença de

catalizadores metálicos como o ferro, através da reação de Haber-Weiss, formam radicais

hidroxila reativos (OH

) (FLAHERTY e WEISFELDT, 1988; AMBRÓSIO et al., 2000;

ALENCAR, et al.,2002, VALCARENGHI, 2006). Neste experimento, notou-se um aumento

considerado de pigmentos férricos de hemossiderina, proporcionalmente ao tempo de

clampeamento. Provavelmente, os pigmentos férricos contidos nos macrófagos, após o

desclampeamento do hilo hepático possam adentrar a circulação e aumentar a produção de

radicais livres, causando lesões às membranas celulares e, dependendo do grau destas lesões,

levar a óbito o paciente no pós-operatório.

Conforme nota-se nas literaturas consultadas, é de interesse estudar as possíveis

alterações que, eventualmente, possam ocorrer nos órgãos afetados pelo clampeamento do

hilo hepático durante procedimentos cirúrgicos realizados no fígado. Baseado nos trabalhos

de SEBE et al.(1999b) e CAMARGO (2004) que observaram alterações estruturais, por meio

de microscopias de luz e eletrônica de transmissão, em nível das vilosidades intestinais e,

também, congestão esplâncnica após clampeamento total do pedículo hepático, foi possível

demonstrar, com este estudo, inúmeras alterações esplênicas, que salientam a necessidade de

pesquisas complementares nesta área, principalmente no que tange sua proximidade à clínica

médica-cirúrgica.

7. CONCLUSÃO

Os dados obtidos permitem concluir que 10 minutos de clampeamento total do pedículo

hepático são suficientes para apresentar sinais de congestão esplênica e 20 e 30 minutos,

promovem diminuição da polpa branca, dilatação dos capilares sinusóides, intensa digestão de

hemácias pelos macrófagos, com presença de grânulos de ferro (hemossiderina) no

parênquima esplênico.

8. REFERÊNCIAS

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ANEXOS

(Trabalhos enviados)

ASPECTOS MACROSCÓPICOS, MORFOLÓGICOS E MORFOMÉTRICOS DO

BAÇO DE RATOS APÓS O CLAMPEAMENTO TOTAL DO PEDÍCULO

HEPÁTICO

MACROSCOPIC, MORPHOLOGIC AND MORPHOMETRIC ASPECTS OF THE

SPLEEN OF RATS AFTER TOTAL CLAMPING OF THE HEPATIC PEDICLE

Silvio Henrique de Freitas

; Joaquim Evêncio Neto

; Renata Gebara Sampaio Dória

; Fábio

de Souza Mendonça

; Manuel de Jesus Simões

; Lázaro Manoel de Camargo

; Abrão Antônio

Sébe

___________________________________________________________________________

1. Professor do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina Veterinária da

Universidade de Cuiabá – UNIC.

2. Professor Adjunto do Departamento de Morfologia e Fisiologia da Universidade

Federal Rural de Pernambuco - UFRPE.

3. Professor do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária da

Universidade de Cuiabá - UNIC.

4. Professor Livre Docente do Departamento de Morfologia da Universidade de Federal de

São Paulo - ENIFESP-EPM.

5. Professor do Departamento de Clínica da Faculdade de Medicina Veterinária da

Universidade de Cuiabá - UNIC.

6. Professor da Faculdade de Medicina da Universidade de Cuiabá – UNIC.

Silvio Henrique de Freitas. Av. Antártica, n

788, casa 26, Residencial Villas Boas,

Ribeirão da Ponte, CEP 78040-500, Cuiabá – MT, Brasil, E-mail:

[email protected], Telefone: (65) 36151222

RESUMO

Uma das complicações do clampeamento total do pedículo hepático é a congestão esplâncnica

e, consequentemente, a congestão esplênica. Este trabalho teve como objetivo observar as

alterações macroscópicas, morfológicas e morfométricas que ocorreram no baço frente à

isquemia produzida pelo clampeamento do pedículo hepático. Para tanto foram utilizados 40

ratos machos, divididos em quatro grupos de 10 animais. O grupo controle (C) não foi

submetido à isquemia, já os grupos experimentais (E

, E

e E

) foram submetidos ao

clampeamento total por 10, 20 e 30 minutos, respectivamente. Após esses períodos,

fragmentos do baço foram retirados e analisados histologicamente pela técnica de

Hematoxilina-eosina e Ferrocianeto-férrico. Os resultados mostraram alterações

microscópicas nos grupos E

, E

e E

, que permitem concluir que o clampeamento total do

pedículo hepático promove intensa congestão vascular, aumento de grânulos de

hemossiderina, diminuição da polpa branca e aumento da polpa vermelha, sendo essas

alterações mais intensas aos 30 minutos.

Palavras chave: Congestão, Hemossiderina, Baço, Rato.

ABSTRACT

One of the complications of hepatic pedicle total clamping is the splanchnic congestion and

consequently a splenic congestion. The aim of this study was to observe the macro and

microscopic alterations that occurred in the spleen during an ischemia produced by the hepatic

pedicle clamping. Fourth male rats were divided in four groups of nine animals each. The

control group (C) was not submitted to ischemia and the experimental groups (E

, E

and E

)

were submitted to the total clamping during 10, 20 and 30 minutes, respectively. After these

periods, spleen fragments were collected and histological analyzed by the eosin-hematoxilin

and ferric ferrocyanide staining technique. The results showed microscopic alterations at the

, E

and E

groups that permitted to conclude that the total clamping of the hepatic pedicle

promote intense vascular congestion, increase of the hemosiderin granules, decrease of the

white pulp and increase of the red pulp, being these alterations more pronounced at the 30

minutes.

Keywords: Congestion, hemossiderina, spleen, rats.

INTRODUÇÃO