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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
AVALIAÇÃO DE UM MODELO EXPERIMENTAL DE
DIÁLISE PERITONIAL EM RATOS E EFEITO DA
CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE E DA TEMPERATURA
NO PERITÔNIO.
PRISCILA CADIMA VICENTE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zooctenia – Unesp – Botucatu para obtenção do
título de Mestre em Clínica Veterinária.
BOTUCATU – SP
Novembro 2007
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
AVALIAÇÃO DE UM MODELO EXPERIMENTAL DE
DIÁLISE PERITONIAL EM RATOS E EFEITO DA
CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE E DA TEMPERATURA
NO PERITÔNIO.
PRISCILA CADIMA VICENTE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zooctenia – Unesp – Botucatu para obtenção do
título de Mestre em Clínica Veterinária.
Profa. Dra. Sônia Regina Verde da Silva Franco
Orientadora
Profa. Dra. Jacqueline Costa Teixeira Caramori
Co-orientadora
BOTUCATU – SP
Novembro 2007
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Vicente, Priscila Cadima.
Avaliação de um modelo experimental de diálise peritonial em ratos e efeito
da concentração de glicose e da temperatura no peritônio / Priscila Cadima
Vicente. – Botucatu : [s.n.], 2007
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2007.
Orientador: Sonia Regina Verde da Silva Franco
Assunto CAPES: 50501020
1. Hemodiálise 2. Diálise peritoneal 3. Urologia veterinária
CDD 616.61089
Palavras-chave: Diálise peritoneal; Glicose; Rato; Temperatura
PRISCILA CADIMA VICENTE
COMPOSIÇÃO DA BANCA EXAMINADORA:
1. PRESIDENTE E ORIENTADORA:
Profa. Dra. Sônia Regina Verde da Silva Franco
2. EXAMINADOR:
Prof. Dr. Flávio Quaresma Moutinho
3. EXAMINADOR:
Prof. Dr. André Luis Balbi
BOTUCATU, 30 DE NOVEMBRO DE 2007.
Ao meu marido: Eduardo José Danza Vicente
Todo dia eu agradeço a Deus por ter você ao meu lado
Por ter o seu amor por inteiro
Por me mostrar o que é amar e ser amada
Deus, me deu um anjo e após todo este tempo você ainda me
surpreende com seu carinho, sua sinceridade e acima de tudo com
seu conhecimento
Eu posso não saber muito, mas tudo que sei são verdades que você
me mostrou ou me ensinou a ver
Eu não tenho palavras para agradecer tudo o que você fez e faz por
mim
Hoje meu Mundo é um lugar melhor por sua causa
Te amo muito: ontem, hoje, amanhã e sempre.
Obrigado por toda a paciência do mundo e por não me deixar desistir.
Sei que você esperava mais de mim, mas no meio de tantas
mudanças nas nossas vidas tentei fazer o melhor. Você é um exemplo
de luta e superação. Sinto-me honrada por você ter me escolhido
como companheira e por fazer parte de algumas das suas grandes
conquistas.
Ao nosso bebezinho: Eduardo Danza Cadima
Vicente
Desculpe se a mamãe ficou um pouco nervosa e a sua casinha ficou
um pouco agitada. Saiba que estamos ansiosos te esperando. Você é
um presente de Deus para a mamãe e para o papai.
As nossas filhas caninas: Meg (Cavalinho) e Lana
(Docinho)
Obrigado toda a fidelidade e carinho mesmo quando a mamãe não tem
muita paciência e tempo para as suas brincadeiras. Vocês são nossos
anjinhos peludos.
A minha orientadora: Profa. Sônia R.V. da S.
Franco e minha co-orientadora Profa. Jacqueline
C. T. Caramori
Ao mestre com carinho
Mestre
... é aquele que caminha com o tempo, propondo paz, fazendo
comunhão,
despertando sabedoria.
Mestre é aquele que estende a mão,
inicia o diálogo e encaminha para a aventura da vida.
Não é o que ensina fórmulas, regras, raciocínios,
mas o que questiona e desperta para a realidade.
Não é aquele que dá o seu saber,
mas aquele que faz germinar o saber do discípulo.
Mestres são vocês minhas professoras amigas, que me
compreendem, me estimulam e me enriquecem
com seu saber e ternura.
Eu serei sempre uma discípula na escola da vida.
Obrigada, professoras!
Aos meus pais: Florentino e Maria Cristina
Meus Pais
Meus pais são como porto seguro, são abrigos que me protegem de
todas as dificuldades que encontrei durante minha vida.
Estão sempre dispostos a dar suas mãos, são fortes, seguros, são
proteção.
Meus pais são heróis, dentre todos, são eles que mais se destacam no
meio da multidão. Heróis que trabalham durante a vida inteira,
pensando num futuro melhor para nós (filhos).
São como estrelas que me trazem luz nos momentos difíceis de minha
vida.
Meus pais são: chegada, partida, beijos, abraços e despedidas.
Obrigado por todo apoio e carinho.
Amo muito vocês.
Ao meu irmão: Alexandre Cadima
Agradeço sua amizade que gentilmente me permitiu desfrutar.
Agradeço sua energia que, positivamente, muitas batalhas você me
ajudou a ganhar. Agradeço sua força que bravamente, você conseguiu
me emprestar. Agradeço ao seu coração e a todo o carinho que pôde
me dar.
Você é o melhor irmão do mundo.
Aos meus sogros: José Tasso e Wanice; André e
Alexandre
Amigos muitos especiais
Amigo é alguém muito especial!
Ele nos faz sorrir e nos encoraja
Para sermos bem-sucedidos.
Ele empresta um ouvido quando precisamos,
Ele compartilha uma palavra de elogio
E sempre tem o coração aberto para nós.
Ele divide com a gente aquilo que tem
E se sentem felizes com o que podem receber.
Amigos ...... São assim .....
Como vocês!
Obrigado.
AGRADECIMENTOS
- Primeiramente aos animais deste experimento que precisaram morrer para
que este trabalho fosse realizado, a eles só o agradecimento é pouco, espero
que um dia eles me perdoem;
- À Coordenação e a Secretaria de Pós-Graduação do Curso de Pós-
Graduação da Faculdade de Medicina Veterinária, Área de Concentração
Clínica Veterinária, FMVZ/UNESP – Botucatu, especialmente a Denise, Maria e
Regina.
- Ao Laboratório Experimental do Departamento de Clínica da Faculdade de
Medicina UNESP – Botucatu e principalmente aos funcionários José Carlos
Georgete e Mário, pois sem a ajuda deles este trabalho não teria sido
realizado;
- Ao Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina UNESP – Botucatu
e principalmente a Profa. Dra. Maria Aparecida Marchesan Rodrigues
Kobayasi, pela paciência e compreensão devido as minhas dificuldades de
clínica e ao Toxican (Paulo e Mara) por terem me ajuda a processar todo o
material para a morfologia;
- À Profa. Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha do Departamento de
Microbiologia do IB/UNESP – Botucatu pela ajuda e por ter permitido que eu
realizá-se toda a parte microbiológica do trabalho no seu laboratório.
- Ao Departamento de Anatomia – IB/UNESP – Botucatu e principalmente ao
Prof. Adjunto Dr. Francisco Eduardo Martinez, por terem me deixado utilizar o
analisador de imagens para realização da morfometria;
- À Profa. Ass. Dra. Patrícia F. F. Pinheiro do Departamento de Anatomia –
IB/UNESP – Botucatu pelas idéias e pilotos realizados;
- Ao Departamento de Bioestatística – UFJF e em especial ao Prof. José
Jonas;
- Ao CAPES pela concessão de bolsa de auxílio à pesquisa;
- A todos os professores e colegas da Pós-Graduação;
- Aos professores da banca examinadora da qualificação: Profa. Mitchiko
Sakate e Prof. Flávio Quaresma;
- A aluna da Medicina: Gabriela Carmona por ter me ajudado com a parte
experimental e estar disposta a aprender um pouco mais;
- A Clínica Veterinária Arca dos Bichos: principalmente aos meus
companheiros de trabalhos e chefes Edney e Kátia pelo apoio e porque
permitiram que eu escrevesse esta dissertação durante o expediente de
trabalho, e as secretárias: Fabiana, Carol e Mariana e a Funcionária Elisângela
pela paciência comigo;
- A minha amiga Karina (Catota) pela amizade e carinho;
- A funcionária da biblioteca Selma por ter me ajudado a fazer a ficha
catalográfica;
- À todos aqueles que de uma forma ou de outra participaram de minha
formação, aqui omitidos mas não esquecidos
Muito Obrigado
LISTA DE ABREVIATURAS
DP Diálise Peritoneal
DPAC Diálise Peritoneal Ambulatorial Crônica
UF Ultrafiltração
GPDs Produtos de Degradação da Glicose
SDP Solução de Diálise Peritoneal
CSB Células Sanguíneas Brancas
GSC Grupo Solução Concentrada
GSCA Grupo Solução Concentrada Aquecida
GSF Grupo Solução Fisiológica
GSFA Grupo Solução Fisiológica Aquecida
GC Grupo Controle
IP Injeção Intraperitoneal
IRC Insuficiência Renal Crônica
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema da diálise peritoneal em humanos com 5
o líquido de diálise na cor azul dentro da cavidade
abdominal
Figura 2 Anatomia simplificada da cavidade peritoneal humana 8
Figura 3 Membrana peritoneal esquematizada 9
Figura 4 Montagem das bolsas 21
Figura 5 Caixa térmica de isopor 21
Figura 6 Procedimento de diálise 22
Figura 7 Procedimento de diálise 22
Figura 8 Introdução da solução salina no rato anestesiado 23
Figura 9 Colheita do lavado peritoneal 23
Figura 10 Procedimento de colheita do peritônio parietal na região 24
abdominal direita
Figura 11 Procedimento de colheita do peritônio parietal na região 24
abdominal direita
Figura 12 Procedimento de colheita do baço com o peritônio visceral 25
Figura 13 Procedimento de colheita do intestino com o omento 25
Figura 14 Montagem do mesentério no isopor 26
Figura 15 Gráfico com a média de mastócitos em todos os grupos 32
Figura 16 Lâmina de mesentério corada com azul de toluidina 33
com vários mastócitos (setas)
Figura 17 Peritônio visceral do baço com epitélio pavimentoso 33
simples no GC. Veja as células mesoteliais planas (setas)
Figura 18 Peritônio visceral do baço do GSC com transformação 34
cúbica das células mesoteliais grave (+++) (setas)
Figura 19 Peritônio visceral do baço no GSCA com transformação 35
cúbica das células mesoteliais grau moderado (++) (setas)
Figura 20 Peritônio visceral do baço no GSF com transformação 35
cúbica das células mesoteliais de grau leve (+) (setas)
Figura 21 Peritônio visceral do baço no GSFA com células 36
mesoteliais planas normais (setas)
Figura 22 Peritônio parietal normal com epitélio pavimentoso 37
simples sem evidência da camada submesotelial
no GC (setas)
Figura 23 Peritônio parietal do GSC com espessamento grave 37
(+++) (setas)
Figura 24 Peritônio parietal do GSCA com espessamento grave 38
(+++) (setas finas) e reação inflamatória
(ponta das setas largas)
Figura 25 Peritônio parietal do GSF com espessamento grave 39
(+++) (setas)
Figura 26 Peritônio parietal do GSCA com espessamento grave 39
(+++) e reação inflamatória difusa (++) (setas)
Figura 27 Peritônio visceral do intestino e omento no GC 40
normal (setas)
Figura 28 Peritônio visceral do baço do GSC com reação 41
inflamatória local moderada (++) (setas)
Figura 29 Peritônio visceral do baço no GSC com fibrose 41
difusa (setas)
Figura 30 Peritônio visceral do baço do GSCA com reação 42
inflamatória difusa (+) (setas) e fibrose focal
(setas largas)
Figura 31 Peritônio visceral do intestino e omento do GSCA com 42
fibrose focal (setas)
Figura 32 Peritônio visceral do GSCA do intestino e omento com 43
fibrose difusa (setas)
Figura 33 Peritônio visceral do intestino e omento do GSF com 43
fibrose focal (setas)
Figura 34 Peritônio visceral do baço do GSFA com fibrose 44
difusa (++) (setas)
Figura 35 Gráfico com o resumo dos achados histomorfológicos 44
em todos os grupos
Figura 36 Porcentagem de animais normais na análise 45
histomorfológica pelos pontos
Figura 37 Porcentagem de animais com peritonite nos grupos 47
LISTA DE TABELAS E ANEXOS
Tabela 1 Observação da temperatura das bolsas de diálise 21
e do isopor antes da infusão abdominal
Tabela 2 Avaliação histomorfológica do peritônio e pontuação 28
de acordo com as alterações
Tabela 3 Análise de variância (ANOVA) das variáveis: peso inicial e 31
final, contagem dos mastócitos e análise dos pontos da
histomorfologia
Tabela 4 Comparações múltiplas das médias dos mastócitos 32
em todos os grupos
Tabela 5 Comparações múltiplas das médias dos pontos da 46
análise histomorfológica em todos os grupos
Tabela 6 Resultado do exame microbiológico do lavabo peritoneal 47
de todos os animais
Anexo 1 Peso inicial e final dos animais em todos os grupos 67
Anexo 2 Contagem de mastócitos em 10 campos aleatórios 68
de cada animal e a média
Anexo 3 Análise do peritônio visceral do baço e peritônio parietal 69
no GC
Anexo 4 Análise do peritônio visceral do baço e peritônio parietal 70
no GSC
Anexo 5 Análise do peritônio visceral do baço e peritônio parietal 71
no GSCA
Anexo 6 Análise do peritônio visceral do baço e peritônio parietal 72
no GSF
Anexo 7 Análise do peritônio visceral do baço e peritônio parietal 73
no GSFA
Anexo 8 Análise da reação inflamatória e fibrose no GC 74
Anexo 9 Análise da reação inflamatória e fibrose no GSC 75
Anexo 10 Análise da reação inflamatória e fibrose no GSCA 76
Anexo 11 Análise da reação inflamatória e fibrose no GSF 77
Anexo 12 Análise da reação inflamatória e fibrose no GSFA 78
Anexo 13 Total dos pontos da análise histomorfológica em 79
todos os animais estudados
Anexo 14 Documento do Comitê de Ética e Pesquisa Animal 80
SUMÁRIO
Página
RESUMO............................................................................................... 1
ABSTRACT ..........................................................................................2
1. INTRODUÇÃO................................................................................. 3
2. REVISÃO DA LITERATURA..........................................................7
2.1. Anatomia e histologia do peritônio.............................................. 8
2.2. Os efeitos da diálise na membrana peritoneal..............................9
2.3. Considerações sobre a diálise peritoneal experimental...............14
3. OBJETIVOS......................................................................................17
4. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................. 19
4.1. Animais e grupos experimentais................................................. 20
4.2. Procedimento de diálise.............................................................. 22
4.3. Colheita do lavado peritoneal .....................................................23
4.4. Técnica de colheita da membrana peritoneal.............................. 24
4.5. Processamento histopatológico................................................... 26
4.5.1 Análise histomorfológica e morfométrica do peritônio.......... 26
4.6. Análise estatística........................................................................27
5. RESULTADOS.................................................................................29
5.1. Análise do peso inicial e final dos ratos......................................30
5.2. Contagem de mastócitos..............................................................31
5.3. Análise histomorfológica do peritônio........................................33
5.3.1. Análise do peritônio visceral do baço................................. 33
5.3.2. Análise do peritônio parietal................................................36
5.3.3. Análise da reação Inflamatória e fibrose............................. 40
5.4. Resultado dos pontos da análise histomorfológica..................... 45
5.5. Resultado do exame microbiológico do lavado
peritoneal.....................................................................................46
6. DISCUSSÃO.....................................................................................48
6.1. Discussão de métodos................................................................. 49
6.2. Discussão de resultados...............................................................52
7. CONCLUSÃO.................................................................................. 56
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................58
9. ANEXOS...........................................................................................66
VICENTE, P.C. Avaliação de um modelo experimental de diálise peritonial
em ratos e efeito da concentração de glicose e da temperatura no
peritônio. Botucatu, 2007. 80p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual
Paulista.
Resumo
O procedimento de diálise peritoneal é um método de tratamento renal
substitutivo muito utilizado na medicina humana. Os trabalhos experimentais
em ratos ajudam a compreender as alterações que ocorrem no peritônio, testar
novas soluções e aumentar o entendimento sobre os efeitos da diálise na
membrana peritoneal. O objetivo deste trabalho foi introduzir o rato como
modelo experimental de diálise peritoneal nesta instituição e estudar o efeito da
concentração de glicose e da temperatura no peritônio. Foram utilizados ratos
Wistar machos. Os ratos receberam injeção intraperitoneal diária por 30 dias
com 10ml de fluidos de DP (GSC, glicose 4,25% temperatura ambiente; GSCA,
glicose 4,25% aquecida; GSF, solução fisiológica temperatura ambiente;
GSFA, solução fisiológica aquecida) e o grupo controle que não recebeu
nenhum fluido. No final do experimento foi realizado lavado peritoneal para
exame microbiológico e o sacrifício dos animais para colheita de amostras do
peritônio para a histomorfologia e a contagem de mastócitos. Na contagem de
mastócitos pode-se observar que os animais dos grupos GSC e GSFA
apresentavam uma diferença significativa em relação aos animais do grupo
controle. Na análise histomorfológica pode-se observar uma alteração
significativa do peritônio entre os grupos GSC, GSCA e GSFA quando
comparados com o grupo controle. Concluie-se neste estudo que o rato pode
ser utilizado como modelo experimental de diálise peritoneal e que a
concentração de glicose e a temperatura alteraram a histomorfologia e a
contagem de mastócitos do peritônio.
Palavras-chave: Rato, Diálise Peritoneal, Glicose, Temperatura.
VICENTE, P.C. Evaluation of an experimental model the peritoneal dialysis
in rats and effect of the glucose concentration and temperature in the
peritoneum. Botucatu, 2007. 80p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual
Paulista.
Abstract
The procedure of the peritoneal dialysis is a method of substitutive renal
treatment very used in human medicine. The experimental works in rat help to
understand the alterations that happen in the peritoneum, to test new solutions
and to increase the comprehension on the effects of the dialysis in the
membrane peritoneal. The purpose of this work was to introduce the rat as an
experimental model of peritoneal dialysis in this institution and to study the
effect of the glucose concentration and temperature in the peritoneum. Male
Wistar rats were used. The rats received daily intraperitoneal injection for 30
days with 10 ml of fluids the PD (GSC, glucose 4.25 % room temperature;
GSCA, glucose 4.25 % heated up; GSF, physiological saline room temperature;
GSFA, heated up physiological saline) and the group control that didn't receive
any fluid. In the end of the experiment washed peritoneal was accomplished for
microbiologic exam and the sacrifice of the animals for crop of samples of the
peritoneum for the histomorphology and the mast cells counting. In the mast
cells counting it can be observed that the animals of the groups GSC and GSFA
presented a significant difference in relation to the animals of the group
controls. In the histomorphologic analysis a significant alteration of the
peritoneum can be observed among the groups GSC, GSCA and GSFA
comparing with the group control. It follows that the rat can be used as
experimental model of dialysis peritoneal and the glucose concentration and
temperature altered the histomorphology and the mast cells counting in
peritoneum.
Key words: Rat, Peritoneal Dialysis, Glucose, Temperature.
1. INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO
Diálise Peritoneal (DP) é um processo terapêutico que remove solutos
tóxicos dos fluidos corporais e normaliza os solutos endógenos que estão em
concentrações alteradas interferindo na fisiologia normal. De modo geral este
processo consiste na infusão de uma solução eletrolítica dentro da cavidade
abdominal onde em equilíbrio com o plasma por osmose e difusão, atravessam
a membrana peritoneal. A solução é então drenada da cavidade abdominal
removendo o excesso de solutos e água. Este sistema é repetido o tanto
quanto for necessário até: a resolução dos sintomas urêmicos, normalização da
hidratação, equilíbrio eletrolítico e ácido-básico ou remoção das toxinas da
circulação. Em humanos a DP é indicada para: manejar os dois tipos de
insuficiência renal a crônica e aguda, bem como para remover toxinas
dializáveis (etilenoglicol, etanol, barbitúricos), para reduzir severos distúrbios
metabólicos (hipercalcemia, hipercalemia, encefalopatia hepática), para tratar
peritonites, pancreatite, uroabdômen, hipotermia, hipertermia e sobrecarga de
fluidos secundária a insuficiência cardíaca (Dzyban et al. 2000).
A DP envolve o transporte de solutos e água através de uma “membrana”
que separa dois compartimentos que contêm líquidos. Estes dois
compartimentos são: (a) o sangue no capilar peritoneal o qual na insuficiência
renal contêm um excesso de uréia, creatinina, potássio e outros; e (b) a
solução de DP, que tipicamente contém sódio, cloreto e lactato que é
convertida em hiperosmolar pela inclusão de uma alta concentração de glicose
(Daugirdas et al. 2003) (Figura 1).
O processo físico de transferência de solutos através de uma membrana
semipermeável foi descrito e chamado de diálise pela primeira vez por Thomas
Graham em 1861. Ele demonstrou que a uréia poderia atravessar uma
membrana de pergaminho e especulou que a técnica poderia ter uma aplicação
médica (Coles 1994).
A utilização do peritônio como uma membrana para trocas em seres vivos
foi descrita primeiramente por Wegner, investigador alemão, que em 1877
publicou os resultados de estudos experimentais em coelhos perfundindo a
cavidade peritoneal com solução salina fria e soluções hipertônicas contendo
açúcar ou glicerol, que resultaram em redução da temperatura corporal dos
animais e aumentaram o volume do efluente peritoneal respectivamente (apud
Caramori 1999).
Figura 1. Esquema da diálise peritoneal em humanos com o líquido de
diálise na cor azul dentro da cavidade abdominal
Putnam em 1923 foi o primeiro pesquisador a caracterizar o peritônio
como uma membrana de diálise em animais. Este trabalho esclareceu a
evidência de que a membrana peritoneal era permeável em duas direções, ou
seja, ele estabeleceu o princípio do transporte de solutos e a ultrafiltração (UF)
que são verdades úteis hoje em dia (Lameire et al. 1998).
Em 1923, Georg Ganter publicou um novo método de remoção de toxinas
do sangue através da diálise tornando-se o pioneiro neste tipo de terapia de
tratamento renal (Teschner et al. 2004). No mesmo ano ele realizou o primeiro
uso clínico da diálise em humanos (apud Caramori 1999).
Apesar da terapia pela diálise peritoneal ter sido introduzida antes da
hemodiálise, ela entrou em desuso durante a década de 1960 por causa das
desvantagens como a necessidade de um furo abdominal todo dia, o risco de
peritonite e perfuração do intestino (Oreopoulos 1978b).
Em 1965, Weston & Roberts desenvolveram um cateter temporário e
Bigelow et al. (1973) desenvolveram a prótese de Dean, com isso algumas das
desvantagens da DP diminuíram; mas foi o cateter peritoneal permanente
projetado por Palmer e modificado por Tenckhoff que estabeleceu a diálise
peritoneal crônica como um procedimento seguro, simples e indolor
(Oreopoulos 1978a; Oreopoulos 1978b).
Segundo Oreopoulos (1978b), os principais fatores responsáveis pelo
retorno da diálise peritoneal crônica como método de diálise foram: um cateter
peritoneal permanente; os nefrologistas aceitarem para diálise peritoneal
crônica pacientes com mais de 55 anos e aqueles com doenças sistêmicas,
que toleram melhor a diálise peritoneal do que a hemodiálise e a diálise
peritoneal em casa (Oreopoulos, 1978b).
Desde sua introdução na medicina humana em 1976, a Diálise Peritoneal
Ambulatorial Crônica (DPAC), utilizando soluções de diálise processadas em
sacos plásticos, ocuparam um importante lugar no controle de pacientes no
estágio terminal de doença renal e tem sido considerada uma valiosa
alternativa de tratamento em muitos casos (Thornhill & Riviere 1983).
Em paralelo, com o desenvolvimento dos programas clínicos de DPAC na
década de 1980, houve um crescente interesse sobre as características de
transporte e permeabilidade da membrana peritoneal estimulando os estudos
da fisiologia peritoneal em animais (Lameire et al. 1998).
O programa de DPAC foi iniciado no Hospital das Clínicas da Faculdade
de Medicina da Unesp de Botucatu em março de 1990. Diversas pesquisas
estão em desenvolvimento neste serviço, com destaque para os estudos das
complicações infecciosas e aquelas que avaliam a eficácia da diálise na
remoção de solutos, particularmente em situações de injúria renal aguda.
Entretanto, os estudos clínicos falham em acompanhar adequadamente as
agressões à membrana peritoneal. Diante disto e para aumentar o
entendimento da DP, propomos este modelo experimental para avaliar a
estrutura peritoneal e padronizar o método de pesquisa.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Anatomia e histologia do peritônio
O peritônio é uma membrana serosa que reveste a cavidade peritoneal
(Figura 2) e é dividido em duas porções: peritônio visceral que reveste o
intestino e outras vísceras e peritônio parietal que reveste as paredes da
cavidade abdominal. O peritônio visceral responde por aproximadamente 80%
da área de superfície peritoneal total e recebe suprimento sanguíneo da artéria
mesentérica superior, enquanto a sua drenagem venosa se faz pelo sistema
porta. Ao contrário, o peritônio parietal recebe sangue das artérias lombares,
intercostais e epigástricas e drena para a veia cava inferior (Daugirdas et al.
2003). As duas mais importantes funções do peritônio consistem em diminuir o
atrito e opor resistência às infecções. Uma função menos importante é o
armazenamento de gordura, especialmente no omento maior. O omento maior
é uma prega peritoneal proeminente que tem origem no estômago,
anteriormente ao cólon transverso, ao qual se prende. Quando é tracionado
para cima, as alças do intestino delgado podem ser examinadas e o mesentério
acompanhado até sua raiz (Gardner et al. 1988).
Figura 2. Anatomia simplificada da cavidade peritoneal humana
Histologicamente, a membrana peritoneal consiste de uma monocamada
de células mesoteliais com um estroma contendo capilares, fibroblastos
dispersos e um número indeterminado de macrófagos teciduais (Williams 1995)
(Figura 3).
Figura 3. Membrana peritoneal esquematizada
2.2 Os efeitos da diálise na membrana peritoneal
Segundo Dobbie et al. (1994), a DP tem sido empregada como um
tratamento de suporte para os pacientes renais nos últimos 40 anos, mas
somente nos últimos 28 anos ela tem sido usada continuamente e o peritônio é
exposto ao efeito do dialisante diariamente, todo dia, por anos a fio. Diante
disto, desde o princípio da DPAC no final dos anos 70, existia uma persistente
ansiedade sobre as possíveis lesões que surgiriam na delicada membrana pela
natureza contínua da terapia e dos episódios de peritonite freqüentes.
A viabilidade da membrana peritoneal durante longos períodos de DP e a
capacidade da membrana de filtrar os líquidos e remover os solutos em
pacientes anúricos são as duas maiores complicações nos pacientes em DP
(Peng et al. 2000). As soluções de diálise peritoneal (SDP) são consideradas
não-fisiológicas ou bioincompatíveis e por causa disto foram observados
durante DP crônica um aumento progressivo no transporte de pequenos
solutos com o tempo de tratamento, falha na UF e fibrose peritoneal (Musi et al.
2004).
As alterações peritoneais começam com as modificações mesoteliais e
mais tarde envolvem alterações submesoteliais, fibrose e vasculopatias. Após
meses ou anos de DP em humanos, fibrose é praticamente um achado
constante. Consiste de um tecido esclerótico que raramente se estende para
todo o peritônio, mas é limitado em áreas de peritônio parietal e visceral. As
características de fibrose podem ser reproduzidas em ratos após DP sem a
necessidade de ação de nenhum outro agente no peritônio (Garosi & Di Paolo,
2000).
Durante DPAC várias alterações morfológicas ocorrem no peritônio,
incluindo: denudação mesotelial, fibrose intersticial, neovascularização e
alterações vasculares como duplicação da membrana basal, fibrose,
hialinização da parede vascular. Entre as causas sugeridas para estas
alterações histológicas e funcionais são: a resposta de natureza não-fisiológica
das SDP em particular, a alta concentração de glicose, a hipertonicidade, o
lactato, baixo pH, as peritonites recorrentes, a liberação de plásticos dos
materiais utilizados e os avançados produtos finais da glicosilação (Zareie et al.
2003 e Duman et al. 2004).
Em estudos clínicos, as alterações morfológicas vistas no peritônio
também podem ser causadas pela ocorrência de peritonite. Peritonites
freqüentes podem alterar a morfologia do peritônio e o aumento do transporte
da membrana peritoneal (Jonasson & Braide 1998).
Segundo George Wu (1982), o agente osmótico ideal para a DPAC
deveria ter as seguintes propriedades: não ser tóxico e bem tolerável; não
absorvível assim exerceria um efeito osmótico contínuo e manteria a UF mais
prolongada (isto também evitaria a síndrome hiperosmolar secundária à
absorção excessiva de partículas osmoticamente ativas), ser facilmente
metabolizado como uma fonte de energia; o agente osmótico não deveria ter
qualquer efeito prejudicial nas propriedades físicas ou fisiológicas da
membrana peritoneal; não deveria causar nenhuma alteração bioquímica ou
metabólica e deveria ser barato e facilmente fabricado.
Os estudos in vitro da biocompatibilidade do fluido de DP datam de 1981
quando Duwe, Vas e Weatherhead relataram que ambos: baixo pH e
hiperosmolalidade dos fluidos de DP comerciais tamponados com lactato
inibiam as funções dos leucócitos como: a fagocitose, a atividade bactericida e
quimiluminescência. Desde então, rapidamente cresceram o número de
estudos in vitro com os fluidos de DP que estão sendo publicados e todos
sugerem que a combinação do lactato e pH ácido adversamente afetam a
função de ambos: leucócitos e células mesoteliais peritoneais (Jorres et al.
1998).
A glicose é conhecida por ser um fator importante de bioincompatibilidade
dos fluidos de DP comercialmente viáveis. Pelo menos dois mecanismos estão
envolvidos no impacto negativo da glicose na função e estrutura peritoneal: o
efeito metabólico direto da alta concentração de glicose (hiperosmolalidade) e a
presença dos produtos de degradação da glicose (GPDs) durante a
esterilização e armazenamento dos fluidos de diálise peritoneal que podem
intensificar os efeitos deletérios da glicose nas soluções de diálise (Styszynski
et al. 2003).
A esterilização das soluções de diálise ocorre pela adição de energia na
forma de radiação ou de calor. É conhecido que este processo leva a
degradação e alteração das moléculas de glicose (Phillips et al. 1958; Feather
& Harris 1973) levando a formação dos GPDs (Schalkwijk et al. 1999). O grau
de degradação depende de vários fatores diferentes como: modo de
esterilização, tempo de armazenamento, pH, luz, concentração de glicose,
substâncias catalisadas e temperatura. Relatos antigos mostram que os GPDs
são tóxicos a diferentes tipos de células. Um dos primeiros relatos de interesse
foi publicado a mais de 100 anos atrás com o artigo de Roux (1887)
demonstrando a morte de esporos devido à exposição média da uma fração de
carboidratos a luz solar. Em 1935 foi demonstrado por Blank & Arnold que 20
carboidratos diferentes (inclusive a glicose) foram expostos à radiação
ultravioleta e inibiram o crescimento de bactérias. Por muitos anos o interesse
na degradação da glicose foi focado principalmente na produção de alimentos
mais seguros, meios de cultura celular e fluido para injeção intravenosa
(Wieslander et al. 1995).
Com o uso por longos períodos SDP convencional altera a função e a
morfologia da membrana peritoneal. Um dos efeitos mais desfavoráveis das
SDP convencionais é a presença de GPDs. A glicose é facilmente degradada
em GPDs quando aquecida bem como durante o armazenamento de fluidos
esterilizados. Os GPDs compreendem um grande número de substâncias
como: os acetaldeídos, formaldeídos, metilglioxal, 3-deoxiglicosona e 3,4-
dideoxiglicosona-3-n com uma média de peso molecular de aproximadamente
100, mas muitos outros GPDs já estão sendo identificados (Kim et al. 2007).
Outra complicação da DP são as peritonites que frequentemente resultam
em uma condição clínica que compromete a evolução do organismo, em adição
associam-se as alterações funcionais e estruturais da membrana peritoneal
com aumento no transporte de solutos, diminuição da UF, aumento da
densidade vascular e fibrose. Na urgência de peritonite, são freqüentes: as
obstruções do cateter de diálise peritoneal e seus efeitos podem comprometer
severamente a interpretação dos resultados experimentais (Mortier et al. 2005).
Na medicina humana a peritonite ainda responde pela principal causa de
falência do método com retirada temporária ou definitiva da DP (apud Caramori
1999).
Peritonite em modelos experimentais pode ser diagnosticada pela cultura
do dialisato e/ou contagem de células sanguíneas brancas (CSB). Suzuki et al.
(1995) encontraram um valor de referência na contagem de CSB em um
modelo de DP em ratos ao redor de 1000-1700 células/mm
3
. Em outro estudo,
Mortier et al. (2003) encontraram um valor na contagem de CBS em animais
com cultura do efluente negativa de 853 células/mm
3
. Mortier et al. (2005)
definiram peritonite como a combinação da cultura positiva e a contagem de
CBS do dialisato maior do que 1000 células/mm
3
.
Os patógenos mais comuns são os organismos gram-positivos, com os
Staphylococci coagulase-negativos sendo responsáveis por 30 a 40% dos
episódios de peritonite em humanos. Entretanto a relativa contribuição dos
organismos gram-negativos na DP tem aumentado consideravelmente nos
últimos anos (Gokal 2000).
A alta incidência de infecção intraperitoneal continua sendo um problema
importante nos modelos animais de exposição crônica ao dialisante.
Administração profilática de antibióticos pode ser usada para resolver este
problema, mas os efeitos isolados dos antibióticos na função e estrutura da
membrana peritoneal são desconhecidos. Mortier et al. (2003) concluíram que
a administração profilática de oxacilina e gentamicina adequadamente preveniu
a infecção peritoneal em um modelo animal de exposição crônica ao dialisante.
Outro achado interessante da DP é o papel dos mastócitos no peritônio.
Ele é uma célula inflamatória fundamental, originário da medula óssea e que
mostra uma distribuição tecidual peculiar. O peritônio bem como outras
superfícies serosas, é um dos poucos tecidos dos quais os mastócitos são
comuns. Recentemente, novas funções estão sendo descritas para os
mastócitos; já é bem conhecido o papel deles nas doenças alérgicas e na
resposta imune contra parasitas, mas eles parecem participar ativamente de
funções mais complexas da imunidade adquirida ou inata contra bactérias e
vírus. Mais recentemente, vários trabalhos descreveram um papel importante
na defesa do peritônio contra infecção. Entre as funções não-imunológicas
existem evidências consideráveis dos mastócitos no tecido de remodelação,
fibrogênese e angiogênese. Um aumento quantitativo nos mastócitos tem sido
descrito em vários modelos de fibrose, incluindo o peritônio. Esta é uma
questão não resolvida e o exato papel dos mastócitos precisa ser estabelecido
(Jiménez- Heffernan et al. 2006).
Em um modelo de DP no rato, demonstrou-se que a instilação diária de
SDP por cinco semanas causou alterações celulares na membrana peritoneal,
bem como o aumento do número de mastócitos no omento (Zareie et al. 2005).
Wieczorowska-Tobis et al. (2001) encontraram uma quantidade relativamente
grande de mastócitos, principalmente no compartimento interno do tecido
conjuntivo submesotelial de ratos dialisados com SDP com 3,86% de glicose
durante quatro semanas.
Apesar de comum na membrana peritoneal poucos trabalhos tem avaliado
os mastócitos durante o tratamento da DP (Jiménez- Heffernan et al. 2006).
Hekking et al. (2001) observaram uma diminuição significante no número de
mastócitos da cavidade peritoneal de ratos tratados com DP quando
comparados com o controle.
2.3 Considerações sobre a diálise peritoneal experimental
Os modelos animais são utilizados para mimetizar o processo de DP nos
humanos. Um modelo in vivo tem o potencial de fornecer informações como: 1)
biocompatibilidade de novos agentes osmóticos, 2) as modificações sofridas
pelos fluidos bem como o tempo de procedimento, 3) a interação que ocorre
entre os diferentes tipos de células na membrana, 4) a troca de eletrólitos e
líquido que ocorre na microcirculação peritoneal, 5) estudar a fisiologia de
transporte da membrana peritoneal, 6) manipulação dos efeitos farmacológicos,
7) estudo dos mecanismos de defesas peritoneais locais contra infecções, 8)
alterações morfológicas do peritônio e 9) modelos de uremia para investigar a
patofisiologia do estado urêmico (Rubin et al. 1983; Lameire et al. 1998 e
Mortier et al. 2005).
Vários grupos de pesquisa trabalham com modelos animais que se
diferenciam substancialmente de acordo com a espécie e linhagem dos
animais experimentais, método de acesso peritoneal, duração do estudo,
valores de transporte dos solutos de UF e diferentes locais de colheita das
amostras para a histologia (Mortier et al. 2005).
A estrutura peritoneal é similar em todos os mamíferos, por esta razão, é
importante reproduzir as alterações causadas pela DP o mais próximo possível
da DP em humanos (Garosi & Di Paolo, 2001). Para isso vários modelos de
diálise crônica têm sido usados nos últimos anos. A maioria dos investigadores
tem utilizado o rato ou coelho como modelos de DP. Ambos os animais têm
suas vantagens e desvantagens. O rato é fácil de alojar, econômico e modelo
estável de insuficiência renal crônica (IRC) por isso é o mais usado (Lameire et
al. 1998).
Uma desvantagem do uso dos ratos para testar soluções é que a
icodextrina (por exemplo) não pode ser avaliada por causa dos altos níveis de
amilase intraperitoneais que causam degradação local da icodextrina em
associação com aumento da osmolalidade do dialisante. Níveis séricos altos de
amilase não são únicos nos ratos, ocorrem também em outros roedores como
os camundongos e porquinhos da guinea (Waart et al. 2001 e Mortier et al.
2005).
Embora os modelos com coelhos permitam que a DP seja realizada por
um longo período de tempo e mimetizam certos aspectos da situação humana
(como a proporção da área de superfície peritoneal e o volume de trocas em
coelhos que são similares aos humanos), coelhos são animais mais difíceis de
alojar e sensíveis (Garosi & Di Paolo 2001).
Os métodos de instilação dos fluidos de DP são amplamente variáveis
(Mortier et al. 2005). Em um estudo comparando três modelos de diálise
crônica em ratos, Peng et al. (2000) observaram que o modelo de injeção
intraperitoneal (IP) pode ser o método de escolha para testar novas SDP, mas
deve-se tomar cuidado para não puncionar o intestino ou injetar o fluido dentro
da parede abdominal.
O volume instilado nos ratos também tem sido uma questão de debate
entre os grupos de pesquisa. A infusão de grandes volumes causa angústia
respiratória. A quantidade de líquido instilada nos modelos de DP varia de 10ml
a 20ml chegando até a 25ml. A freqüência de instilação também varia
amplamente entre os diferentes grupos de pesquisa, variando de uma a duas
vezes, ou até três vezes por dia (Mortier et al. 2005).
Outra dificuldade dos pesquisadores é sobre a colheita de amostras de
tecido para avaliação do peritônio. Muitos pesquisadores usam principalmente
o peritônio visceral enquanto outros exclusivamente o peritônio parietal (Mortier
et al. 2005). Análises pareadas de biópsias de peritônio parietal e visceral nos
humanos sugerem que as alterações na membrana visceral são menos
pronunciadas do que as da membrana parietal (Williams et al., 2003). O inverso
foi observado em alguns estudos em animais (De Vriese et al. 2002 e Martin-
Martinez et al. 2004). Outro grupo de pesquisa demonstrou que diferentes
tecidos peritoneais (peritônio visceral, peritônio parietal, omento) podem
responder diferentemente à exposição de fluidos de DP (Hekking et al. 2001 e
Zareie et al. 2001). Deste modo erros podem ser introduzidos quando amostras
são tiradas de lugares diferentes do peritônio e embora não exista um
consenso de um lugar representativo onde as amostras de peritônio devem ser
obtidas, está claro que uma retirada sistemática das amostras é essencial
(Mortier et al. 2005).
Independente do modelo animal escolhido, o principal problema para
estudar a estrutura da membrana peritoneal é a colheita. O mesotélio seca
rapidamente quando exposto ao ar. Para prevenir danos devido a artefatos, o
material normalmente é lavado e fixado tão logo a cavidade peritoneal seja
aberta (Garosi & Di Paolo 2001). Na experiência de Di Paolo et al. (1995) a
fixação em in vivo é o melhor caminho para proteger a amostra de artefatos.
3. OBJETIVOS
3. OBJETIVOS
1) Introduzir um modelo experimental de diálise peritoneal nas
pesquisas da instituição.
2) Avaliar o impacto da concentração de glicose e da temperatura
através da análise histomorfológica e contagem de mastócitos na
membrana peritoneal.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais e grupos experimentais
Foram utilizados (Rattus norvegiccus) da linhagem Wistar, adultos,
machos, com massa inicial variando de 170 – 305 g, média de 256,4 g (± 28,9
g), provenientes do Biotério Central da UNICAMP – Campinas/SP. Os animais
foram divididos em cinco grupos assim constituídos:
1. Grupo Solução Concentrada (GSC) - Neste grupo os ratos receberam
10 ml de fluido de diálise com 4,25% de glicose armazenada em temperatura
ambiente, através de injeção intraperitoneal (IP) diária, durante quatro
semanas. Este grupo foi constituído por 12 animais.
2. Grupo Solução Concentrada Aquecida (GSCA) - Neste grupo os ratos
receberam 10 ml de fluido de diálise com 4,25% de glicose, através de IP
diária, aquecida durante quatro semanas. Este grupo foi constituído por 12
animais.
3. Grupo Solução Fisiológica NaCl 0,9% (GSF) - Neste grupo os ratos
receberam 10 ml de solução fisiológica NaCl 0,9%, armazenada em
temperatura ambiente, através de IP diária, durante quatro semanas. Este
grupo foi constituído por 12 animais.
4. Grupo Solução Fisiológica NaCl 0,9% Aquecida (GSFA) - Neste grupo
os ratos receberam 10 ml de solução fisiológica NaCl 0,9%, através de IP
diária, aquecida durante quatro semanas. Este grupo foi constituído por 12
animais.
5. Grupo Controle (GC) – Neste grupo os animais não receberam
nenhuma IP e foram mantidos no laboratório por quatro semanas. Este grupo
foi constituído por nove animais.
Quatro horas antes da realização do procedimento de diálise, foram
colocadas panelas no fogão com água para ferver. Após 15 a 20 minutos a
água quente era colocada em quatro bolsas térmicas com capacidade de dois
litros (tanto a bolsa de diálise como a bolsa de solução fisiológica foram
encaixadas entre as duas bolsas térmicas). A caixa térmica de isopor era
montada da seguinte forma: bolsa de água quente no fundo, bolsa de diálise e
Aquecimento das
Bolsas de Diálise
Bolsa
Térmica
bolsa de água quente por cima, uma toalha, novamente uma bolsa de água
quente, a bolsa de solução fisiológica e a última bolsa de água quente e o
isopor era fechado. Este procedimento de aquecimento foi feito desta forma
para repetir as mesmas condições que os pacientes da DP fazem em suas
casas para aquecer a bolsa antes da infusão (Figura 4 e Figura 5) (Tabela 1).
Figura 4. Montagem das bolsas Figura 5. Caixa térmica de isopor
Tabela 1. Observação da temperatura das bolsas de diálise e do isopor
antes da infusão abdominal.
Data
Glicose
Ambiente
NaCl 0,9%
Ambiente
Glicose
Aquecida
NaCl 0,9%
Aquecida
Temperatura do
Isopor após 3,5
horas de
aquecimento
20/05
24,2 °C 24,2°C 43,2°C 45,2°C 49,8 °C
23/05
21,2°C 21,7°C 40,4°C 43,2°C 45,2°C
24/05
22,1°C 22,1°C 46,6°C 50,6°C 47,0°C
25/05
22,3°C 22,3°C 46,2°C 45,1°C 45,3°C
30/05
22,2°C 22,2°C 45,5°C 47,4°C 43,2°C
31/05
22,4°C 22,4°C 47,4°C 47,4°C 47,0°C
01/06
22,4°C 22,4°C 45,6°C 45,3°C 46,8°C
02/06
22,2°C 22,2°C 46,8°C 48,3°C 46,3°C
06/06
22,3°C 22,3°C 48,2°C 48,2°C 43,0°C
07/06
21,5°C 21,5°C 45,8°C 44,6°C 47,4°C
08/06
22,0°C 22,0°C 49,3°C 48,0°C 49,7°C
09/06
22,7°C 22,7°C 52,2°C 48,3°C 46,4°C
13/06
- -
48,2°C 49,5°C 43,5°C
O procedimento de diálise foi realizado uma vez por dia, durante 30 dias,
no período da manhã, entre 8:00 e 11:00 horas. Os animais foram pesados
duas vezes por semana e no primeiro e último dia de experimento.
Todos os animais foram deixados em observação para adaptação durante
três semanas antes do experimento. Os animais foram mantidos sob condições
convencionais de laboratório e tinham livre acesso à comida e água.
Os animais que viessem a óbito durante o experimento seriam submetidos
a exames post mortem. Após quatro semanas todos os animais foram
sacrificados e submetidos a exames da cavidade abdominal e colheita de
amostras do peritônio.
Todos os procedimentos realizados com os animais obedeceram aos
princípios éticos estabelecidos pelo Comitê de Ética desta Universidade para a
experimentação animal, protocolo número 62/2006-CEEA (Anexo 14).
4.2 Procedimento de diálise
Os animais foram posicionados em decúbito dorsal e o abdômen foi
desinfetado com iodo-povidine. Foi injetado intraperitonealmente com uma
seringa de 10 ml e uma agulha Nº 22 do lado abdominal esquerdo: 10 ml de
solução de diálise com 4,25% de glicose em temperatura ambiente no grupo
GSC, 10 ml de: solução de diálise com 4,25% de glicose aquecida no grupo
GSCA, 10 ml de solução fisiológica NaCl 0,9% em temperatura ambiente no
grupo GSF e 10 ml de solução fisiológica NaCl 0,9% aquecida no grupo GSFA
(Figura 6 e 7).
Figura 6 e 7. Procedimento de diálise
6
7
4.3 Colheita do lavado peritoneal
Após quatro semanas foi feita a indução com anestesia geral com
pentobarbital de sódio intramuscular na dose de 1 ml/Kg, assepsia com iodo-
povidine no abdômen, abertura de uma pequena janela na pele na região
abdominal ventral esquerda para introdução no peritônio de 40 ml de solução
salina isotônica para colheita do lavado peritoneal (Figura 8 e 9). Para estudar
a presença de peritonite foram preparados no Laboratório de Microbiologia da
Unesp – Botucatu, dois frascos com meios enriquecidos próprios para o
crescimento bacteriano: o TSB (caldo tripticasi soji) para bactérias aeróbias e o
Tioglicolato para bactérias anaeróbias, e placas para semeadura: uma
contendo ágar sangue (meio de cultura columbia ágar base acrescido de 5%
de sangue de carneiro desfibrinado) e a outra com meio de cultura ágar
MacConkey.
Figura 8. Introdução da solução Figura 9. Colheita do lavado
salina no rato anestesiado peritoneal
Logo em seguida foi feita uma massagem abdominal leve. Foram colhidos
assepticamente 10 ml de lavado peritoneal (Figura 14) e introduzidos 5 ml em
cada um dos frascos com caldos enriquecidos (TSB e Tioglicolato). Ao mesmo
tempo foi feita a primeira semeadura nas duas placas. Essas placas foram
incubadas a 37º C por 24 horas para avaliar se existia crescimento bacteriano.
Os frascos com caldos enriquecidos também foram levados para
incubação a 37º C e observados para a presença de turvação diariamente
durante cinco dias. Se fosse detectado qualquer sinal de turvação nesses
caldos, eles eram passados pelo procedimento de semeadura nas duas placas
com meios de cultura, com observação das placas em 24 horas. As placas que
apresentavam crescimento bacteriano eram separadas para realização de
testes bioquímicos para detectar o tipo de bactéria.
Ao final de cinco dias todos os caldos foram semeados nas duas placas
com meios de cultura para confirmar se estas amostras realmente estavam
negativas.
4.4 Técnica de colheita da membrana peritoneal
Após a colheita do lavado, 10 ml de Formol a 10% foi introduzido na
cavidade abdominal para fixação antes da laparotomia. Vinte minutos após a
introdução do fixador, o abdômen foi aberto e amostras do peritônio foram
colhidas. Essas amostras foram colhidas da parede abdominal ventral
(peritônio parietal) direito (do lado contrário de onde foram feitas a IP) (Figura
10 e 11), do baço com peritônio visceral (Figura 12), do intestino com o omento
(Figura 13) e do mesentério inteiro (Figura 14); e foram colocados em frascos
com formol a 10% por 24 horas. Após isso todas as amostras, exceto a do
mesentério inteiro, foram transferidas para frascos com álcool 70% (Figura 21).
Figura 10 e 11. Procedimento de colheita do peritônio parietal na região
abdominal direita
10 11
Figura 12. Procedimento de colheita do baço com o peritônio visceral
Figura 13. Procedimento de colheita do intestino com o omento
Figura 14. Montagem do mesentério no isopor
4.5 Processamento histopatológico
As amostras foram processadas após 24 horas dentro do álcool 70% pelo
procedimento padrão do Laboratório de Patologia – Faculdade de Medicina-
Unesp – Botucatu, e coradas como corante de Tricrômio de Masson e
examinadas em microscópio óptico. O mesentério após a fixação no formol foi
cortado, colocado em uma lâmina de vidro e corado com o Azul de Toluidina
1% para visualização dos mastócitos da análise morfométrica.
4.5.1 Análise histomorfológica e morfométrica do peritônio
A análise histomorfológica foi feita com base nos achados dos três cortes
histológicos corados com Masson. Para uma comparação objetiva foi criada
uma tabela de avaliação com as principais alterações. Usando o grupo controle
como base, quando existiam alterações, elas foram quantificadas utilizando-se
cruzes (+,++,++) sendo: uma cruz grau leve, duas cruzes grau moderado e três
cruzes grau grave; e para cada alteração foi dado um valor numérico de
pontuação levando-se em conta que quanto maior o número mais grave a
alteração. Foram observados: 1) presença ou ausência de transformação
cúbica das células mesoteliais ao redor do baço e o grau, 2) presença ou
ausência de espessamento do peritônio parietal e o grau, 3) presença ou
ausência de reação inflamatória e quando presente se esta reação era
localizada ou difusa e o grau e 4) presença ou ausência de fibrose e se era
localizada ou difusa. No final da avaliação os pontos de cada animal foram
somados (Tabela 2).
O tecido foi considerado com fibrose quando apresentava uma reação
inflamatória organizada com a presença de neovascularização, espessamento
submesotelial e atividade fibroblástica.
A análise morfométrica foi feita no microscópio modelo Axiophot 2 da
marca Zeiss® usando a câmera digital para captura de imagens Axiocam HRc.
O software para análise dos dados utilizado foi o Axiovision 4.1. Para esta
análise contamos os mastócitos em 10 campos diferentes de cada lâmina no
aumento de 10X, fechando antecipadamente as lâminas com códigos para que
a contagem fosse imparcial.
4.6 Análise estatística
A análise estatística foi feita utilizando-se a ANOVA (análise da variância)
para as variáveis: peso inicial e final, contagem do número de mastócitos e
análise dos pontos da avaliação histomorfológica do peritônio. Quando a
análise da variância apresentou diferença estatística significante, o teste de
Tukey para comparações múltiplas foi utilizado. Foi considerado altamente
significativo estatisticamente quando p< 0,01 e significativo quando p<0,05.
Tabela 2. Avaliação histomorfológica do peritônio e pontuação de acordo
com as alterações.
Morfologia do peritônio
Pontuação
Espessamento do peritônio
parietal
Ausente (epitélio pavimentoso
simples)
0
Espessado
Leve (+) 1
Moderado (++) 2
Grave (+++) 3
Transformação das células
mesoteliais do peritônio ao redor
de baço
Normal (células mesoteliais planas) 0
Cúbicas
Leve (+) 1
Moderado (++) 2
Grave (+++) 3
Reação inflamatória
Ausente 0
Presente
Local Leve (+) 1
Local Moderada (++) 2
Local grave (+++) 3
Difusa Leve (+) 2
Difusa Moderada (++) 4
Fibrose
Ausente 0
Presente
Focal 3
Difusa 4
5. RESULTADOS
5. RESULTADOS
5.1 Análise do peso inicial e final dos ratos
Os animais do GSC estavam com peso inicial variando de 253 - 299 g,
média de 272,4 g (± 15,8 g); os animais do GSCA estavam com peso inicial
variando de 226 - 295 g, média de 261,6 g (± 20,1 g); os animais do GSF
estavam com peso inicial variando de 234 – 291 g, média de 259,9 g (± 19,8 g);
os animais do GSFA estavam com peso inicial variando de 231 - 305 g, média
de 258,8 g (± 24,4 g) e finalmente os animais do GC estavam com peso inicial
variando de 170 - 303 g, média de 220,4 g (± 40,9 g) (Anexo1).
Quando se comparou a média dos pesos iniciais dos animais em todos os
grupos pode-se observar diferença altamente significativa (p=0,0003). (Tabela
3). Utilizando-se o teste para comparações múltiplas do peso inicial, pode-se
observar que a média do peso inicial do grupo GC apresentava diferença
significativa em relação aos demais grupos (GSC, GSCA, GSF e GSFA).
Os animais do GSC estavam com peso final variando de 341-452 g,
média de 399,9 g (± 31,7 g); os animais do GSCA estavam com peso final
variando de 337- 445 g com média de 389,9 g (± 36,8 g); os animais do GSF
estavam com peso final variando de 348 - 473 g, média de 398,8 g (± 42,4 g);
os animais do GSFA estavam com peso final variando de 344 - 452 g, média
de 393,3 g (± 29,8 g) e finalmente nos animais do GC estavam com peso final
variando de 268 - 448 g, média de 343,7 g (± 59,3 g) (Anexo1).
Quando se comparou a média dos pesos finais dos animais em todos os
grupos pode-se observar diferença estatística significativa (p=0,0182) (Tabela
3). Utilizando-se o teste para comparações múltiplas do peso final, pode-se
observar que a média do peso final do grupo GC apresentava diferença
significativa em relação aos grupos GSC e GSF.
Durante a colheita de material dos animais do GC o animal número 3 foi
descartado da análise histomorfológica porque apresentava neoplasia
abdominal.
Tabela 3. Análise de Variância (ANOVA) das variáveis: peso inicial, peso final,
contagem dos mastócitos e análise dos pontos da histomorfologia
FV
Soma dos
Quadrados
Grau de
Liberdade
Quadrados
Médios
F P
Peso inicial
15265,751 4 3816,438 6,28** 0,0003
Peso final
21072,944 4 5268,236 3,27* 0,0182
Contagem
dos
Mastócitos
1,18E-6 4 2,96E-7 3,68** 0,0103
Análise dos
Pontos da
Morfologia
140,065 4 35,016 4,21** 0,0051
* - Significativo ao nível de 5% de probabilidade
** - Significativo ao nível de 1% de probabilidade
5.2 Contagem de mastócitos
Os animais do grupo GSC apresentaram o número de mastócitos
variando de 881 a 1655, média de 1249,2 (± 257,4), os animais do grupo
GSCA apresentaram o número de mastócitos variando de 723 a 1502, média
de 1067,6 (± 280,6), os animais do grupo GSF apresentaram o número de
mastócitos variando de 682 a 2414, média de 1189,4 (± 502,5), os animais do
grupo GSFA apresentaram o número de mastócitos variando de 846 a 3009,
média de 1281,2 (± 613,5) e finalmente os animais do grupo GC apresentaram
o número de mastócitos variando de 497 a 1467, média de 851,9 (± 278,4)
(Figura 15 e 16) (Anexo 2).
Comparando-se a média da contagem de mastócitos de todos os animais
em todos os grupos pode-se observar diferença altamente significativa
(p=0,0103) (Tabela 2) com o grupo GC apresentando a menor média, 851,9
mastócitos e o grupo GSFA a maior média, 1281,2 (Anexo 2). Utilizando-se o
teste para comparações múltiplas pode-se observar que o grupo GC
apresentava diferença significativa quando comparado com os grupos GSFA e
GSC (Tabela 4).
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Média do número de
mastócitos
GSC GSCA GSF GSFA GC
Grupos
Tabela 4. Comparações múltiplas das médias dos mastócitos em todos os
grupos
Grupo (I) comparado com todos os outros Grupos (J)
* Houve diferença significativa.
Figura 15. Gráfico com a média de mastócitos em todos os grupos
(I) Grupo (J) Grupos Diferença de Média (I-J)
GC GSC
GSCA
GSF
GSFA
0,00044452*
0,00028360
0,00032157
0,00039757*
GSC GC
GSCA
GSF
GSFA
-0,00044452*
-0,00016092
-0,00012296
-0,0004695
GSCA GC
GSC
GSF
GSFA
-0,00028360
0,00016092
0,00003797
0,00011397
GSF GC
GSC
GSCA
GSFA
-0,00032157
0,00012296
-0,00003797
0,00007600
GSFA GC
GSC
GSCA
GSF
-0,00039757*
0,00004695
-0,00011397
-0,00007600
Figura 16. Lâmina de mesentério corada com azul de toluidina com vários
mastócitos (setas)
5.3 Análise histomorfológica do peritônio
5.3.1 Análise do peritônio visceral do baço
Estudando-se a reação do peritônio visceral do baço nos animais do
grupo GC pode-se observar que todos os animais apresentaram um epitélio
pavimentoso simples (Figura 17 e 35) (Anexo 3).
Figura 17. Peritônio visceral do baço com epitélio pavimentoso simples no
GC. Veja as células mesoteliais planas (setas)
Nos animais do grupo GSC pode-se observar que cinco dos 12 animais
apresentaram um epitélio pavimentoso simples; que é o tipo de epitélio
normalmente encontrado em um peritônio que não sofreu nenhum tipo de
agressão. Os outros sete animais apresentaram alterações epiteliais sendo
que: quatro animais apresentaram uma leve (+) transformação cúbica das
células mesoteliais, um animal apresentou uma grave (+++) transformação
cúbica das células mesoteliais e dois animais apresentaram características
moderadas (++) de transformação cúbica das células mesoteliais (Figura 18 e
35) (Anexo 4).
Figura 18. Peritônio visceral do baço do GSC com transformação cúbica
das células mesoteliais grave (+++) (setas)
Nos animais do grupo GSCA pode-se observar que dez dos 12 animais
pertencentes a este grupo apresentaram um epitélio pavimentoso simples. Um
animal apresentou leve (+) transformação cúbica das células mesoteliais e um
animal apresentou moderada (++) transformação cúbica das células
mesoteliais (Figura 19 e 35) (Anexo 5).
Figura 19. Peritônio visceral do baço no GSCA com transformação cúbica
das células mesoteliais grau moderado (++) (setas)
Nos animais do grupo GSF pode-se observar que nove dos 12 animais
pertencentes a este grupo apresentaram um epitélio pavimentoso simples.
Três animais deste grupo apresentaram transformação cúbica das células
mesoteliais num grau leve (+) (Figura 20 e 35) (Anexo 6).
Figura 20. Peritônio visceral do baço no GSF com transformação cúbica
das células mesoteliais de grau leve (+) (setas)
Nos animais do grupo GSFA pode-se observar que nove dos 12 animais
pertencentes a este grupo apresentaram um epitélio pavimentoso simples
(Figura 21). Dois animais deste grupo apresentaram transformação cúbica das
células mesoteliais num grau moderado (++) e um animal apresentou
transformação cúbica num grau leve (+) (Figura 35) (Anexo 7).
Figura 21. Peritônio visceral do baço no GSFA com células mesoteliais
planas normais (setas)
5.3.2 Análise do peritônio parietal
Estudando-se a reação do peritônio parietal do GC, pode-se observar que
todos os animais apresentavam um epitélio pavimentoso simples e a camada
submesotelial sem edema ou espessamento (Figura 22 e 35) (Anexo 3).
Figura 22. Peritônio parietal normal com epitélio pavimentoso simples
sem evidência da camada submesotelial no GC (setas)
No GSC, pode-se observar que dois dos 12 animais estavam normais
sem sinais de espessamento. Dos 10 animais com alteração na camada
submesotelial do peritônio parietal, três animais apresentaram um
espessamento grave (+++), três animais apresentaram um espessamento
moderado (++) e quatro animais apresentaram um espessamento leve (+)
(Figura 23 e 35) (Anexo 4).
Figura 23. Peritônio parietal do GSC com espessamento grave (+++)
(setas)
No GSCA, pode-se observar que um dos 12 animais estava normal, sem
sinais de espessamento. Dos 11 animais com alteração na camada
submesotelial do peritônio parietal, um animal apresentou um espessamento
grave (+++), cinco animais apresentaram um espessamento moderado (++) e
cinco animais apresentaram um espessamento leve (+) (Figura 24 e 35)
(Anexo 5).
Figura 24. Peritônio parietal do GSCA com espessamento grave (+++)
(setas finas) e reação inflamatória (ponta das setas largas)
No GSF pode-se observar que um dos 12 animais estava normal. Dos 11
animais com alteração na camada submesotelial do peritônio parietal, um
animal apresentou um espessamento grave (+++), três animais apresentaram
um espessamento moderado (++) e sete animais apresentaram um
espessamento leve (+) (Figura 25 e 35) (Anexo 6).
Figura 25. Peritônio parietal do GSF com espessamento grave (+++)
(setas)
No GSFA, pode-se observar que nenhum animal estava normal. Dos 12
animais com alteração na camada submesotelial do peritônio parietal, quatro
animais apresentaram um espessamento grave (+++), dois animais
apresentaram um espessamento moderado (++) e seis animais apresentaram
um espessamento leve (+) (Figura 26 e 35) (Anexo 7).
Figura 26. Peritônio parietal do GSCA com espessamento grave (+++) e
reação inflamatória difusa (++) (setas)
5.3.3 Análise da reação inflamatória e fibrose
Estudando-se à reação inflamatória do peritônio no GC podemos observar
que em três dos oito animais não foram visualizadas células inflamatórias. Esta
reação inflamatória foi local com grau leve (+) em quatro animais e foi difusa
com grau leve (+) em um animal. Como descrito na revisão da literatura uma
das funções mais importantes do peritônio é de opor resistência às infecções,
então, é de se esperar que uma pequena quantidade de células de defesa
esteja presente neste tecido, por isso uma leve reação inflamatória é normal.
Quando presente a reação inflamatória foi observada no peritônio visceral do
baço em cinco animais. A presença de fibrose foi avaliada em todas as
lâminas. No grupo GC nenhum animal apresentou fibrose (Figura 27 e 35)
(Anexo 8).
Figura 27. Peritônio visceral do intestino e omento no GC normal (setas)
No GSC pode-se observar que somente três dos 12 animais não
apresentaram reação inflamatória. Esta reação inflamatória foi focal em seis e
difusa em três; sendo que dos seis animais com reação focal, cinco
apresentaram um grau leve (+) um com grau moderado (++), dos três animais
com reação difusa, dois apresentaram de forma leve (+) e um animal de forma
moderada (++). A reação inflamatória quando presente foi visualizada no
peritônio visceral do baço (Figura 28). Na análise da fibrose três animais
apresentaram características de fibrose sendo dois animais com fibrose focal e
um animal com fibrose difusa (Figura 29 e 35) (Anexo 9).
Figura 28. Peritônio visceral do baço do GSC com reação inflamatória
local moderada (++) (setas)
Figura 29. Peritônio visceral do baço no GSC com fibrose difusa (setas)
No GSCA, pode-se observar que somente três dos 12 animais não
apresentaram reação inflamatória. Esta reação inflamatória foi focal em sete e
difusa em dois; sendo que dos sete animais com reação focal, cinco
apresentaram um grau leve (+) e dois com grau moderado (++), dos dois
animais com reação difusa, um apresentou uma forma leve (+) e um animal
apresentou a forma moderada (++). A reação inflamatória quando presente foi
visualizada no peritônio visceral do baço, no intestino e no omento. Sete
animais apresentaram características de fibrose sendo seis animais com
fibrose focal e um animal com fibrose difusa (Figuras 30, 31, 32 e 35) (Anexo
10).
Figura 30. Peritônio visceral do baço do GSCA com reação inflamatória
difusa (+) (setas) e fibrose focal (setas largas)
Figura 31. Peritônio visceral do intestino e omento do GSCA com fibrose
focal (setas)
Figura 32. Peritônio visceral do GSCA do intestino e omento com fibrose
difusa (setas)
No GSF, pode-se observar que quatro dos 12 animais não apresentaram
reação inflamatória. Esta reação inflamatória foi focal em todos os oito animais.
A reação inflamatória foi visualizada no peritônio visceral do baço e no peritônio
visceral intestino e omento. Cinco animais apresentaram características de
fibrose sendo todos os animais com fibrose focal (Figura 33 e 35) (Anexo 11).
Figura 33. Peritônio visceral do intestino e omento do GSF com fibrose
focal (setas)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
GC GSC GSCA GSF GSFA
Grupos
Transformação cúbica
do P.V.
Espessamento do P.P.
Reação Inflamatória
Característica de
Fibrose
No GSFA, pode-se observar que somente um dos 12 animais não
apresentou reação inflamatória. Esta reação inflamatória foi focal com grau leve
(+) em oito animais e difusa com grau moderado (++) em três animais. A
reação inflamatória foi visualizada no peritônio visceral baço, no peritônio
visceral do intestino e omento. Oito animais apresentaram características de
fibrose sendo seis animais com fibrose focal e dois com fibrose difusa (Figura
34 e 35) (Anexo 12).
Figura 34. Peritônio visceral do baço do GSFA com fibrose difusa (++)
(setas)
Figura 35. Gráfico com o resumo dos achados histomorfológicos em
todos os grupos
5.4 Resultado dos pontos da análise histomorfológica
Utilizando a Tabela 1 do material e métodos para quantificar os achados
da análise histomorfológica pode-se observar que os animais do GC
apresentaram uma variação de zero a dois pontos na soma das análises
(espessamento do peritônio parietal, transformação epitélio peritoneal do baço,
reação inflamatória e fibrose) sendo considerados normais. Na soma das
análises dos animais do GSC observamos uma variação de um a 14 pontos,
sendo que cinco dos 12 animais apresentaram de um a dois pontos no total,
considerados desta forma normais. No GSCA observamos uma variação de um
a dez pontos, sendo que dois dos 12 animais apresentaram um ponto no total.
No GSF observamos uma variação de um a oito pontos, sendo que cinco dos
12 animais apresentaram uma variação de um a dois pontos no total. No GSFA
observamos uma variação de dois a 13 pontos, sendo que três dos 12 animais
apresentaram dois pontos no total (Anexo 13).
Figura 36. Porcentagem de animais normais na análise histomorfológica
pelos pontos
Comparando-se os pontos da análise histomorfológica dos grupos
estudados pode-se observar diferença altamente significativa (p=0,0051)
(Tabela 2). Aplicando-se o teste para comparações múltiplas pode-se observar
diferença significativa entre os animais do grupo GC com os animais dos
grupos GSC, GSCA e GSFA (Tabela 5).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Porcentagem de animais
normais
1 2 3 4 5
Grupos
GSCA
GSF
GSFA
GC
GSC
Tabela 5. Comparações múltiplas das médias dos pontos da análise
histomorfológica em todos os grupos
Grupo (I) comparado com todos os outros Grupos (J)
* Houve diferença significativa.
5.5 Resultado do exame microbiológico do lavado peritoneal
Dos 56 animais utilizados neste estudo apenas 10 animais (17,85%)
apresentaram peritonite. Dos 10 animais que apresentaram peritonite, em nove
animais (90%) foi causada por organismos Gram-negativos e em apenas um
animal (10%) foi por organismo Gram-positivo (Figura 37) (Tabela 6).
(I) Grupo (J) Grupos Diferença de Média (I-J)
GC GSC
GSCA
GSF
GSFA
-3,83*
-4,17*
-3,08
-5,17*
GSC GC
GSCA
GSF
GSFA
3,83*
-0,33
0,75
-1,33
GSCA GC
GSC
GSF
GSFA
4,17*
0,33
1,08
-1,00
GSF GC
GSC
GSCA
GSFA
3,08
-0,75
-1,08
-2,08
GSFA GC
GSC
GSCA
GSF
5,17*
1,33
1,00
2,08
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
45%
50%
GSC GSCA GSF GSFA GC
PORCENTAGEM DE PERITONITE
Tabela 6. Resultado do exame microbiológico do lavado peritoneal de todos os
animais
Animal GSC GSCA GSF GSFA GC
1
Escherichi
a coli
Negativo Klebsiella sp. Negativo Negativo
2 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
3
Escherichi
a coli
Escherichia
coli +
Klebsiella sp
Staphylococcu
s coagulase-
negativo
Klebsiella sp
+
Enterobacte
r sp
*
4 Negativo Negativo
Escherichia
coli +
Enterobacter
sp.
Escherichia
coli +
Enterobacte
r sp
Negativo
5
Escherichi
a coli
Enterobacte
r sp.
Negativo Negativo Negativo
6 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
7 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
8 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
9 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
10 Negativo Negativo Negativo Negativo -
11 Negativo Negativo Negativo Negativo -
12 Negativo Negativo Negativo Negativo -
* Animal descartado
Figura 37. Porcentagem de animais com peritonite nos grupos
6. DISCUSSÃO
6. DISCUSSÃO
6.1 Discussão de métodos
A maioria dos pesquisadores tem usado ou o rato ou o coelho como
modelos experimentais de DP, nós escolhemos os ratos, pois são: fáceis de
manter em laboratório, econômicos, modelos estáveis de IRC (insuficiência
renal crônica) (Zareie et al. 2004), são dóceis, brigam menos que os outros
animais experimentais como os camundongos e podem ser mantidos em
grupos do mesmo sexo. Uma desvantagem dos ratos é que eles são pequenos
tornando a drenagem do dialisato difícil de recuperar (Lameiere et al. 1998). As
linhagens de ratos mais utilizadas são o Wistar albino e o Sprague-Dawley
albino, mas existem outras linhagens de ratos como o SHR (Spontaneously
Hipertensive Rat), Lewis albino e o F344 albino; nós optamos trabalhar com a
linhagem Wistar albino macho, pois é a linhagem de escolha do nosso
laboratório para as pesquisas e os machos porque eles não sofrem alterações
hormonais como as fêmeas.
Para realizar o procedimento de diálise o método de escolha foi a infusão
de líquido intraperitoneal por punção diária sem anestesia. Segundo Peng et al.
(2000), o método de IP pode ser o método de escolha tomando-se cuidado
para não injetar o fluido no intestino ou dentro da parede abdominal. Segundo
Musi et al. (2004) repetidas injeções com pequenos volumes IP diariamente em
ratos, parecem representar uma boa técnica de investigação não-invasiva da
biocompatibilidade dos fluidos de DP. A diferença mais importante entre
modelo experimental e a diálise clínica são: ausência de uremia e o fato do
volume instilado não ser drenado. No nosso trabalho esta desvantagem não se
torna importante visto que não faremos nenhum acompanhamento da
drenagem do líquido peritoneal nem das alterações causadas pela uremia.
Não existe um consenso sobre um período de exposição ótimo. Segundo
Mortier et al. (2005) o tratamento de 12 semanas ou mais é necessário para
obter alterações significantes sob as soluções testadas. Segundo Jonasson &
Braide (1998) que compararam dois fluidos de DP [Gambrosol (2,5% de
glicose e pH 5,3) e o PD-BIO (2,5% de glicose e pH 6,3)] com um grupo
controle em durações de DP e freqüências de instilação diferentes, concluíram
que infusões de fluidos de DP mais freqüentes numa curta duração (instilação
de três vezes por dia durante quatro a cinco dias) parecem ter causado mais
alterações peritoneais do que após uma exposição mais longa e numa
freqüência menor (instilação uma vez por dia durante quatro semanas). No
nosso trabalho a freqüência de instilação (uma vez ao dia) e o tempo de diálise
(quatro semanas) foram iguais em todos os grupos.
Já existem várias soluções de diálise peritoneal no mercado e outras
sendo testadas experimentalmente. Os trabalhos experimentais que estudam a
solução de diálise com glicose normalmente utilizam a solução de DP com
3,86% (Peng et al. 2000, Wieczowoska-Tobis et al. 2001, Mortier et al. 2004,
Zareie et al., 2004, 2004b) ou 4,25% (Suzuki et al. 1995, Margetts et al. 2001,
Wang et al. 2001, Kim et al. 2007) de glicose. Nós escolhemos a solução de
DP Dianel PD2 da Baxter Hospitalar com 4,25% de glicose por ser mais
concentrada.
Além da solução de diálise com glicose a 4,25% nós utilizamos como
base o grupo controle que não recebeu nenhum líquido peritoneal e a solução
de NaCl 0,9% chamada de solução “salina fisiológica”, que é amplamente
utilizada em vários procedimentos médicos como: lavagem de cavidades
corpóreas, limpeza de feridas externas (Breborowicz & Oreopoulus 2005) e em
outros trabalhos experimentais de DP em ratos (Hekking et al. 1998, Duman et
al. 2000, Styszynski et al. 2002, Zhuo et al. 2005).
Não existe um consenso sobre qual porção do peritônio (parietal ou
visceral) deveria ser usado em estudos sobre a morfologia. Análises de
biópsias pareadas em humanos de peritônio parietal e visceral sugerem que as
alterações na membrana visceral são menos pronunciadas que as do peritônio
parietal (Williams et al. 2003). O inverso foi observado em alguns estudos
animais (De Vriese et al. 2002, Martin-Martinez et al. 2004). Outros grupos
demonstraram que diferentes tecidos peritoneais (peritônio visceral, peritônio
parietal e omento) podem responder diferentemente a exposição dos fluidos de
DP (Hekking et al. 2001, Zareie et al. 2003). Erros podem ser introduzidos
quando as amostras são colhidas de lugares diferentes do peritônio (Mortier et
al. 2005). Diante destas dúvidas nós decidimos trabalhar tanto com o peritônio
parietal quanto com o visceral e tomamos muito cuidado para colher as
amostras sempre dos mesmos lugares em todos os animais. A diferença que
nós percebemos quando trabalhamos com tecidos peritoneais diferentes é que
a avaliação do peritônio deve ser diferenciada. Nas amostras de peritônio
visceral do baço a transformação cúbica das células mesoteliais fica mais
evidente do que nas amostras do peritônio parietal, da mesma forma que a
avaliação de espessamento do peritônio no peritônio parietal é mais evidente
que nas outras amostras. Já o peritônio visceral do intestino e omento quase
não ajudaram muito na avaliação histomorfológica.
Independente da escolha do modelo animal um dos problemas para
estudar a estrutura da membrana peritoneal é a colheita da amostra. O tecido
peritoneal seca rapidamente quando exposto ao ar. Para prevenir as alterações
devido a artefatos, a amostra peritoneal normalmente é fixada tão logo a
cavidade peritoneal é aberta. Na experiência de Garosi & Di Paolo (2001) a
fixação in vivo é a melhor maneira de proteger as amostras colhidas. Quando o
coelho era sacrificado para a colheita de material, solução de glutaraldeído
tamponada a 2% com 0,2 M de cacodilato sódico era infundida
simultaneamente na veia periférica (normalmente 20 ml por coelho) e dentro da
cavidade abdominal via cateter peritoneal (30 ml/Kg por coelho). O animal
morre imediatamente e a cavidade peritoneal toda e os tecidos adjacentes são
fixados antes da dissecação cirúrgica e a exposição ao ar. No nosso trabalho,
nós modificamos a técnica porque não trabalhamos com coelho e também não
iríamos realizar análise na microscopia eletrônica, deste modo, substituímos a
solução fixadora proposta por Di Paolo & Garosi por formol tamponado. Os
ratos anestesiados morreram imediatamente após a infusão do formol, que foi
deixado agir na cavidade peritoneal por mais ou menos 20 minutos, para que,
ao abrir a cavidade peritoneal para realizar a colheita das amostras, o peritônio
já estivesse em processo de fixação não sofrendo alterações pela exposição ao
ar.
A ausência de profilaxia para infecções permitiu a avaliação de peritonites
neste modelo de diálise. Não existe um consenso sobre como deve ser feito o
exame para avaliação de peritonite nos trabalhos experimentais com ratos e
quase não há estudos que pesquisam o agente microbiológico causador da
peritonite em ratos como há em humanos. Wieczorowska-Tobis et al. (2004)
em um modelo experimental utilizando ratos e inserindo o cateter peritoneal
para realizar a diálise, diagnosticava peritonite analisando a turbidez do
efluente peritoneal e a contagem total de células do dialisato ≥ 4500 células/μL
e com uma fração de neutrófilos >35%. De Vriese et al. (2002) e Mortier et al.
(2004), também em trabalhos experimentais com ratos, colhiam amostras de
dialisato pelo cateter de diálise para cultura e contagem de CSB. Nestes
trabalhos a infecção era arbitrariamente definida pela cultura positiva bem
como a contagem das CSB ser maior que 1000/mm
3
.
6.2 Discussão de resultados
Quando avaliamos o peso final não imaginávamos que ocorreria diferença
estatística entre os grupos e nenhum trabalho pesquisado comenta nada sobre
alteração do peso entre grupos dialisados e grupos controle. No trabalho de
Zareie et al. (2003) comparando grupos de ratos em diálise com tampão de
lactato, solução de diálise esterilizada aquecida, solução de diálise esterilizada
por filtração e ratos não tratados, eles não encontraram diferença estatística
entre a média de pesos.
No nosso trabalho, observamos uma diferença significante entre a média
do número de mastócitos do mesentério entre os grupos. Quando comparamos
os grupos entre si, observamos uma diferença significativa entre o GC com os
animais do grupo GSC e GSFA, nos outros dois grupos (GSCA e GSF) não
chegaram a mostrar diferença estatística para o grupo controle, mas a média
de mastócitos foi numericamente maior. Em trabalhos utilizando pacientes
humanos, Jiménez-Heffernan et al. (2006) quantificaram a quantidade de
mastócitos no peritônio parietal de quatro grupos de pacientes humanos:
normais, pacientes urêmicos que nunca fizeram DP, pacientes em DP e
pacientes não-renais com hérnia inguinal. Eles observaram que os mastócitos
estavam significativamente diminuídos no peritônio dos pacientes em DP
quando comparados com os outros grupos. Já Zareie et al. (2001) trabalhando
com fluido de DP com 3,86% de glicose em ratos, observaram um dramático
acúmulo de mastócitos no omento de ratos que receberam DP comparados
com os animais do grupo controle que não foram tratados. Em um outro
trabalho mais recente Zareie et al. (2005) comparando fluido padrão de DP
com 3,86% de glicose (Dianel PD4) com fluido de DP com aminoácidos
(Nutrineal PD4) e um grupo controle em ratos, observaram que o número de
mastócitos do omento estava significativamente aumentado nos grupos
tratados com diálise quando comparados com o grupo controle. Quando os
grupos tratados com diálise foram comparados entre si, não apresentaram
diferença significante. Os achados dos trabalhos de Zareie et al. (2001 e 2006)
são semelhantes aos nossos, apesar das amostras de peritônio utilizadas e
soluções de DP serem diferentes, eles também observaram aumento do
número de mastócitos dos ratos expostos a DP. Já no trabalho com pacientes
humanos, parece que os mastócitos atuam de forma diferente, pois
observaram o inverso, houve diminuição do número de mastócitos no peritônio
dos pacientes de DP.
Fazendo uma análise subjetiva dos dados do exame morfológico
podemos observar que: no GSC o peritônio visceral do baço estava com
transformação cúbica das células mesoteliais mais evidentes do que os outros
grupos; o espessamento do peritônio parietal encontrava-se alterado em todos
os grupos quando comparado com o controle, sugerindo que o peritônio
parietal seja um tecido mais sensível sendo altamente responsivo a ambas as
soluções adicionadas na cavidade peritoneal; a reação inflamatória não
apresentou muita diferença entre o controle e os outros grupos, exceto no
grupo GSFA e a presença de fibrose estava presente em um maior número de
animais nos grupos GSCA e GSFA sugerindo que a infusão abdominal de
soluções aquecidas predispôs às alterações mais graves no peritônio. Diante
disto podemos perceber que o peritônio reage de forma diferente a uma
agressão dependendo da sua localização, o que torna sua avaliação muito
difícil, principalmente para comparação de dados, como mencionado na
discussão de métodos. Este dado também foi observado no trabalho de Musi et
al. (2004) trabalhando com amostras do peritônio diafragmático, intestinal e
fígado; com várias soluções de diálise em ratos. Também neste trabalho eles
observaram que a fração de células mesoteliais com transformação cúbica no
peritônio diafragmático estava aumentada no grupo que recebeu solução de
diálise comercial com 4% de glicose (Gambrosol) quando comparado com os
outros grupos.
Outro dado que merece a atenção neste trabalho é a comprovação de que
a solução de NaCl 0,9% foi tão agressiva ao peritônio quanto à solução de
diálise com glicose. Realizando um revisão mais profunda encontramos
trabalhos questionando o papel da solução de NaCl 0,9% em outros
procedimentos médicos como a diálise. Phillips & Dudley (1984) em
experimento com lavagem da cavidade abdominal em modelos animais com
NaCl 0,9% em temperatura ambiente, observaram mais adesões quando
comparados com aqueles animais em que não foi feita nenhuma lavagem. Mais
tarde, Kappas et al. (1988), perceberam que a lavagem abdominal com solução
salina em temperatura normal (que é mais baixa que a corporal) em ratos não
aumentou a formação de adesões peritoneais, só que, esta mesma solução
aquecida (ao redor dos 40°C) o número e a intensidade de adesões peritoneais
foram maiores, esta relação do aquecimento foi percebida durante a avaliação
morfológica da presença de fibrose como visto no parágrafo anterior.
Styszynski et al. (2002), demonstraram que a solução de NaCl 0,9% causou
uma reação inflamatória severa quando administrada IP, duas vezes ao dia
durante quatro semanas. Os ratos que receberam só a solução de NaCl 0,9% a
contagem de células do dialisante, a permeabilidade às proteínas e a
concentração de óxido nítrico permaneceram altas durante as quatro semanas
do experimento enquanto que o outro grupo que recebeu a solução salina
suplementada com glicose apresentou uma baixa concentração dos fatores
mencionados anteriormente. No nosso experimento podemos perceber que a
solução salina fisiológica aquecida (GSFA) alterou o peritônio tanto quanto a
solução de glicose aquecida (GSCA) quanto a glicose (GSC) em temperatura
ambiente. A solução salina fisiológica em temperatura ambiente também
alterou o peritônio só que estatisticamente não foi percebido. Segundo Wang et
al. (1999) e Breborowicz et al. (2005), a solução salina fisiológica não é
biocompatível como solução de diálise peritoneal e não deveria ser usada
como solução controle ou lavagem de cavidades.
Nesta pesquisa a maioria dos patógenos causadores de peritonite foram
organismos Gram-negativos como: E. coli, Klebsiella sp, Enterobacter sp, e em
apenas um animal encontramos os Staphylococcus coagulase-negativo.
Segundo Choi et al. (2006) o patógeno Brevundimonas vesicularis foi o
microorganismo mais freqüente de infecção em DP em ratos. Outros patógenos
que causaram infecções incluem os Staphylococcus coagulase-negativo, S.
aureus, Stenotrophomonas maltophilia, Proteus mirabilis,
Enterococcus/Staphylococcus e Pseudomonas spinosa. Já no trabalho de
Mortier et al. (2003) os agentes causadores de infecção em ratos foram os
Staphylococcus coagulase–negativo, S. aureus, Enterobacter cloacae, E. coli e
Streptococcus viridans. A técnica de diálise usada com punção intraperitoneal
poderia explicar a distribuição microbiológica com predominância de Gram-
negativos no efluente peritoneal estudado. Todavia, a ocorrência de peritonite
sem ter sido realizada a antibioticoterapia profilática não é uma ocorrência que
inviabiliza a técnica, desde que realizada com cuidado.
7. CONCLUSÃO
7. CONCLUSÃO
Um modelo experimental de diálise peritoneal utilizando o rato foi
introduzido nas pesquisas desta instituição.
A concentração de glicose e a temperatura alteraram a histomorfologia do
peritônio. Na contagem dos mastócitos os grupos GSC e GSFA apresentaram
diferença estatística com o GC, ou seja, a concentração de glicose e a
temperatura alteraram a contagem de mastócitos só que não ao mesmo tempo
como aconteceu na análise histomorfológica.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9. ANEXOS
Anexo 1. Peso inicial e final dos animais em todos os grupos
Peso Inicial GRUPOS
Animal GSC GSCA GSF GSFA GC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
296
259
260
254
299
290
253
269
280
273
272
264
278
275
255
255
251
245
226
295
272
281
237
270
266
259
234
278
262
291
234
282
237
252
245
279
242
264
265
264
234
254
305
232
243
296
231
276
189
230
217
170
217
176
250
303
232
-
-
-
Média 272,4 261,6 259,9 258,8 220,4
Peso Final GRUPOS
Animal GSC GSCA GSF GSFA GC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
452
391
407
391
420
416
341
432
407
399
346
397
407
430
383
358
337
350
342
445
404
405
386
432
473
383
354
423
413
465
394
429
348
354
364
386
367
403
393
379
417
384
452
344
398
409
356
418
300
368
292
268
343
297
395
448
383
-
-
-
Média 399,9 389,9 398,8 393,3 343,7
Anexo 2. Contagem de mastócitos em 10 campos aleatórios de cada animal e
a média
GRUPOS
Animal GSC GSCA GSF GSFA GC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1462
1655
909
1403
1531
1325
881
1309
1223
1080
1312
900
1101
1197
738
1502
900
997
793
1036
723
1462
915
1447
1424
933
1149
1096
892
821
1597
901
726
2414
1638
682
3009
1045
1159
880
1119
1232
1153
1006
1934
885
846
1106
497
836
586
905
677
872
956
1467
871
-
-
-
Média 1249,2 1067,6 1189,4 1281,2 851,9
Anexo 3. Análise do peritônio visceral do baço e peritônio parietal no GC
Reação das células mesoteliais do
baço
Peritônio Parietal -
camada submesotelial
Animal Pavimentoso Cúbico Normal Espessada
GC1 Sim Não Sim Não
GC2 Sim Não Sim Não
GC4 Sim Não Sim Não
GC5 Sim Não Sim Não
GC6 Sim Não Sim Não
GC7 Sim Não Sim Não
GC8 Sim Não Sim Não
GC9 Sim Não Sim Não
Legenda: Cúbico: + (leve), ++ (moderado) e +++ (grave)
Espessamento: + (leve), ++ (moderado) e +++ (grave)
Anexo 4. Análise do peritônio visceral do baço e peritônio parietal no GSC
Reação das células mesoteliais
do baço
Peritônio Parietal -
camada submesotelial
Animal Pavimentoso Cúbico Normal Espessada
GSC 1 Não +++ Não +++
GSC 2 Não ++ Não +++
GSC 3 Não ++ Não +++
GSC 4 Não + Não ++
GSC 5 Sim Não Sim Não
GSC 6 Não + Não +
GSC 7 Não + Não +
GSC 8 Sim Não Não ++
GSC 9 Sim Não Não +
GSC 10 Não + Não +
GSC 11 Sim Não Sim Não
GSC 12 Sim Não Não ++
Legenda: Cúbico: + (leve), ++ (moderado) e +++ (grave)
Espessamento: + (leve), ++ (moderado) e +++ (grave)
Anexo 5. Análise do peritônio visceral do baço e peritônio parietal no GSCA
Reação das células mesoteliais
do baço
Peritônio Parietal -
camada submesotelial
Animal Pavimentoso Cúbico Normal Espessada
GSCA 1 Sim Não Sim -
GSCA 2 Sim Não Não +
GSCA 3 Sim Não Não ++
GSCA 4 Sim Não Não ++
GSCA 5 Sim Não Não ++
GSCA 6 Sim Não Não +
GSCA 7 Sim Não Não ++
GSCA 8 Sim Não Não +
GSCA 9 Não + Não +
GSCA 10 Não ++ Não +++
GSCA 11 Sim Não Não ++
GSCA 12 Sim Não Não +
Legenda: Cúbico: + (leve), ++ (moderado) e +++ (grave)
Espessamento: + (leve), ++ (moderado) e +++ (grave)
Anexo 6. Análise do peritônio visceral do baço e peritônio parietal no GSF
Reação das células mesoteliais
do baço
Peritônio Parietal -
camada submesotelial
Animal Pavimentoso Cúbico Normal Espessada
GSF 1 Não + Não +
GSF 2 Não + Não ++
GSF 3 Sim Não Não +
GSF 4 Sim Não Sim Não
GSF 5 Sim Não Não +
GSF 6 Não + Não +
GSF 7 Sim Não Não +
GSF 8 Sim Não Não ++
GSF 9 Sim Não Não +
GSF 10 Sim Não Não +
GSF 11 Sim Não Não ++
GSF 12 Sim Não Não +++
Legenda: Cúbico: + (leve), ++ (moderado) e +++ (grave)
Espessamento: + (leve), ++ (moderado) e +++ (grave)
Anexo 7. Análise do peritônio visceral do baço e peritônio parietal no GSFA
Reação das células
mesoteliais do baço
Peritônio Parietal -
camada submesotelial
Animal Pavimentoso Cúbico Normal Espessada
GSFA 1 Não ++ Não +++
GSFA 2 Não ++ Não +
GSFA 3 Sim Não Não +++
GSFA 4 Sim Não Não +
GSFA 5 Sim Não Não +++
GSFA 6 Sim Não Não ++
GSFA 7 Sim Não Não +
GSFA 8 Sim Não Não +++
GSFA 9 Sim Não Não +
GSFA 10 Sim Não Não +
GSFA 11 Não + Não +
GSFA 12 Sim Não Não ++
Legenda: Cúbico: + (leve), ++ (moderado) e +++ (grave)
Espessamento: + (leve), ++ (moderado) e +++ (grave)
Anexo 8. Análise da reação inflamatória e fibrose no GC
Avaliação da reação inflamatória Localização da
reação
inflamatória
Animal Negativa Presente Local Difusa P.V.
Baço
Omento
e
Intestino
Presença
de fibrose
GC1 Não Sim + Não Sim Não Não
GC2 Sim Não Não Não Não Não Não
GC4 Não Sim + Não Sim Não Não
GC5 Sim Não Não Não Não Não Não
GC6 Não Sim + Não Sim Não Não
GC7 Não Sim + Não Sim Não Não
GC8 Sim Não Não Não Não Não Não
GC9 Não Sim Não + Sim Não Não
Legenda: Local: + ou ++, Difusa: + ou ++ e Fibrose: Focal ou Difusa
Anexo 9. Análise da reação inflamatória e fibrose no GSC
Avaliação da reação inflamatória Localização da
reação
inflamatória
Animal Negativa Presente Local Difusa P.V.
Baço
Omento
e
Intestino
Presença
de
fibrose
GSC 1 Não Sim Não ++ Sim Não Difusa
GSC 2 Não Sim + Não Sim Não Não
GSC 3 Não Sim ++ Não Sim Não Não
GSC 4 Não Sim + Não Sim Não Não
GSC 5 Não Sim Não + Sim Não Não
GSC 6 Não Sim + Não Sim Não Focal
GSC 7 Não Sim Não + Sim Não Focal
GSC 8 Não Sim + Não Sim Não Não
GSC 9 Sim Não Não Não Não Não Não
GSC 10 Sim Não Não Não Não Não Não
GSC 11 Não Sim + Não Sim Não Não
GSC 12 Sim Não Não Não Não Não Não
Legenda: Local: + ou ++, Difusa: + ou ++ e Fibrose: Focal ou Difusa
Anexo 10. Análise da reação inflamatória e fibrose no GSCA
Avaliação da reação inflamatória Localização da
reação
inflamatória
Animal Negativa Presente Local Difusa P.V.
Baço
Omento
e
Intestino
Presença
de
fibrose
GSCA 1 Não Sim Não ++ Sim Sim Difusa
GSCA 2 Não Sim + Não Sim Não Focal
GSCA 3 Não Sim + Não Sim Não Focal
GSCA 4 Não Sim + Não Não Não Focal
GSCA 5 Não Sim + Não Não Não Não
GSCA 6 Sim Não Não Não Não Não Não
GSCA 7 Sim Não Não Não Sim Não Focal
GSCA 8 Sim Não Não Não Não Não Não
GSCA 9 Não Sim + Não Não Não Não
GSCA 10 Não Sim Não + Sim Não Focal
GSCA 11 Não Sim ++ Não Sim Não Não
GSCA 12 Não Sim ++ Não Sim Sim Focal
Legenda: Local: + ou ++, Difusa: + ou ++ e Fibrose: Focal ou Difusa
Anexo 11. Análise da reação inflamatória e fibrose no GSF
Avaliação da reação inflamatória Localização da
reação
inflamatória
Animal Negativa Presente Local Difusa P.V.
Baço
Omento
e
Intestino
Presença
de
fibrose
GSF 1 Sim Não Não Não Não Não Não
GSF 2 Não Sim ++ Não Sim Sim Focal
GSF 3 Sim Não Não Não Não Não Não
GSF 4 Não Sim + Não Sim Sim Focal
GSF 5 Sim Não Não Não Não Não Não
GSF 6 Sim Não Não Não Não Não Não
GSF 7 Não Sim + Não Sim Sim Não
GSF 8 Não Sim ++ Não Sim Não Focal
GSF 9 Não Sim ++ Não Sim Não Focal
GSF 10 Não Sim + Não Sim Não Focal
GSF 11 Não Sim + Não Sim Não Não
GSF 12 Não Sim ++ Não Sim Não Não
Legenda: Local: + ou ++, Difusa: + ou ++ e Fibrose: Focal ou Difusa
Anexo 12. Análise da reação inflamatória e fibrose no GSFA
Avaliação da reação inflamatória Localização da
reação
inflamatória
Animal Negativa Presente Focal Difusa P.V.
Baço
Omento
e
Intestino
Presença
de
fibrose
GSFA 1 Não Sim Não ++ Sim Sim Difusa
GSFA 2 Não Sim + Não Sim Sim Não
GSFA 3 Não Sim + Não Não Não Focal
GSFA 4 Não Sim + Não Sim Não Focal
GSFA 5 Não Sim Não ++ Sim Não Focal
GSFA 6 Sim Não Não Não Não Não Não
GSFA 7 Não Sim + Não Não Não Não
GSFA 8 Não Sim Não ++ Sim Não Focal
GSFA 9 Não Sim + Não Não Não Não
GSFA 10 Não Sim + Não Sim Sim Focal
GSFA 11 Não Sim + Não Sim Não Focal
GSFA 12 Não Sim + Não Sim Sim Difusa
Legenda: Local: + ou ++, Difusa: + ou ++ e Fibrose: Focal ou Difusa
Anexo 13. Total dos pontos da análise histomorfológica em todos os animais
estudados
ANIMAL GSC GSCA GSF GSFA GC
1 14 8 2 13 1
2 6 5 8 4 0
3 7 6 1 7 *
4 4 6 4 5 1
5 2 3 1 10 0
6 6 1 2 2 1
7 7 5 2 2 1
8 3 1 7 8 0
9 1 3 6 2 2
10 2 10 5 5 -
11 1 4 3 6 -
12 2 7 5 7 -
* Animal descartado.
Anexo 14. Documento do Comitê de Ética e Pesquisa Animal
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