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MÁRCIO TEORO DO CARMO
ESTUDO DO FLUIDO FOLICULAR, TRANSPORTE,
RECUPERAÇÃO E MATURAÇÃO DE OÓCITOS EM ÉGUAS
SUPEROVULADAS COM O EXTRATO DE PITUITÁRIA
EQÜINA
BOTUCATU - SP
2007
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual
Paulista – UNESP, Campus de Botucatu para
obtenção do título de Doutor em Medicina
Veterinária área de Reprodução Animal
ORIENTADOR: PROF. DR . MARCO ANTONIO ALVARENGA
CO-ORIENTADORA: PROFA. DRA. FERNANDA DA CRUZ LANDIM E ALVARENGA
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Quem ler esta tese de Doutorado e a minha dissertação de Mestrado vai
observar uma real cronologia do tema superovulação em eqüinos. Tema
este árduo, porem fascinante a quem gosta e procura desafios. Desafios
que nos são necessários, empolgantes e regozijam a nossa simples e
humilde passagem por este mundo. Mundo este que é feito de sonhos e
realidades, expectativas e perseverança, alegrias e decepções, vitórias e
derrotas, mas que procuramos ser um de seus pilares para lhe sustentar.
Contudo dizer palavras que não expressem o que eu sinto por tantas
pessoas que contribuíram com a minha vida profissional e pessoal, seria
algo insensato, entretanto como uma réplica do mestrado agradeço e
dedico este momento a todos os pedreiros que me ajudaram a construir
mais um degrau desta vida.
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DEDICATÓRIA
A vida tem sons, que para a gente ouvir precisa aprender a começar de novo, é
como tocar o mesmo violão e nele compor uma nova canção.......... Dedico este
momento a Deus e a Nossa Senhora de Aparecida, por me conceder a satisfação de
transpor mais um obstáculo que nos é imposto durante a jornada da vida.
Dedico a meus pais Esmeraldo do Carmo e Maria Lúcia Teoro do Carmo por ter-
me ajudado a caminhar e escrever a minha história. Dedico também a meus
irmãos Cássio e Cristiane, a meu avô José Teoro, a meus sobrinhos Thiago e Felipe,
e a meus cunhados Ricardo e Ana Rita.
Dedico à saudade da ausência de minha avó Maria Aparecida, que mesmo não
estando mais no nosso convívio é e sempre será responsável por fazer parte de um
dos mais belos capítulos da minha vida.
Dedico aos meus tios, Laura, Antônio Celso, Maria Zélia, Maria Teoro, aos primos
e a todos que fazem parte de nossa família e a meus avós paternos (em memória),
que ao simples gesto de carinho nos faz um grande ser humano.
Dedico a meus padrinhos Fernando Junqueira Meireles e Maria Imaculada do
Carmo Junqueira Meireles por serem importantes protagonistas da minha
personalidade e pelo entusiasmo e incentivo em conviver e trabalhar com a
espécie eqüina.
A TODOS MEU MUITO OBRIGADO
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Doutor Marco Antonio Alvarenga, por ter-me confiado e dado a
oportunidade em realizar mais um desafio em que nos é imposto, pela sua
amizade, competência e conhecimentos a mim transposto durante todos estes anos
que foram de estrema importância no meu desenvolvimento.
A Professora Dra. Fernanda da Cruz Landim-Alvarenga, por sua co-orientação,
amizade e conhecimentos transmitidos, sendo peça fundamental no desenrolo
desta tese.
Aos Professores Dr. Luis Losinno e Dr. Javier Aguilar, por nos ter aberto diversas
portas fundamentais para a execução do presente trabalho, pela convivência e
troca de conhecimentos e costumes de um outro país (Argentina), formando uma
aliança fundamental para a equideocultura da América do Sul. Aos Amigos
Argentinos que foram fundamentais ao desenvolver parte do experimento,
Ludunhas, Catalina, Caronila, Orácio, Nicolas, Juam Paplo Salomone, Victor
Colombo, Turco, Marcelo e dentre outros.
A Mariana Thaís de Almeida pelo seu entusiasmo, sua alegria, sendo uma pessoa
muito especial e competente.
A Fabiana e a Mere pela grande ajuda no procedimento da eletroforese e na
dosagem de Óxido nítrico.
Ao Gustavo e a Carla pela grande amizade e companheirismo em ajudar
desenvolver esta tese.
Ao José Victor pelo grande parceiro que é, e pelo vinculo que nos é dado com o
posto de fomento de equideocultura de Colina-SP, e a todos os funcionários desta
fundação.
Aos Professores do Departamento de Reprodução Animal, Dr. Papa, Dr. João
Carlos, Dr. Nereu, Dr. Sony, Dr. Meira, Dra. Eunice Oba, Dra. Denise Lopes e a
todos os seus orientados.
Aos amigos de pós Graduação, Claudia, Antonio Silvio, José Dell’Aqua, Gabriel,
Daniel, Heder, Bruna, Ieda, Liane, Viviane, Giovana, Guta, Cássia, Ian, Guta
Alonso, Cely, João, Camila, Leandro, Lílian, Alexandre, Mosquito, Renato Vilem,
Ana, Duroque, Bruno, Daniela, Fernanda, Gustavo Gomes.
Ao grande amigo Paulo (Panqueca) pela cumplicidade e lealdade, Marcelo
Dell’Aqua, Manoela, Bruno, Lucas, Manoela, Chico Pupo, Chico Garcia e aos
funcionários do Centro de Reprodução Horses (Gilson, Sergio e Hérique) pelo
companheirismo e incentivo.
Aos eternos amigos Rogério Dibe, Digão, Mariani, Bolinha, Guto, Ricardo,
Gustavo, Leo Carrara, Leo Baiano, Santista e aos mestres Dr. José Carlos Andrade
Moura, Dr. Carlos Antonio C. Fernandes, Dr. Rubens Pais de Arruda.
A Dra. Janeth Roser, da Universidade da California – USA, pela disponibilidade
da dosagem hormonal.
Aos funcionários do Departamento de Reprodução Animal, Miguel, Marquinho,
Edílson, Márcio, Cristina, Dona Cida e Tico.
Aos Haras e Centro Hípico Agromen, pela oportunidade profissional, e aos
médicos veterinários Cássio Luiz Nogueira Trinque, Marcelo Mandrá, Carlos
Denipot e Alseu Bueno.
A FAPESP (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo) pela
concessão da bolsa de estudo (processo FAPESP número 03/05045-0) e ao
FRIGORÍFICO AIMAR (Argentina) pela disponibilidade no desenvolvimento do
projeto.
Aos Residentes da área de Reprodução da FMVZ/UNESP - Botucatu.
i
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPc – Adenosina monofosfato ciclíco
Arom – Aromatase
ASP – Aspiração
B – Banda
CCO – Complexo cumulus oócito
CL – Corpo lúteo
CLG – Célula lútea grande
CLP – Célula lútea pequena
Cont – Controle
DNA – Ácido desoxirribonucléico
DPBS – Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline
E2 – Estrógeno
eGC – Gonadotrofina corionica eqüina
EGF – Fator de crescimento epidermal
Ep – Espaço perivitelíneo
EPE – Extrato de Pituitária Eqüina
FIV – Fertlização in vitro
FOL – Folículo
FSH – Hormônio folículo estimulante
FSHe – Hormônio folículo estimulante eqüino
FSHp - Hormônio folículo estimulante suíno
G – Complexo Golgi
GC – Grânulo cortical
GIFT – Transferência intra-falopiana de gametas
GnRH – Hormônio liberador de gonadotrofina
hCG – Gonadotrofina corionica humana
ICS – Injeção intracitoplasmático de espermatozoide
IGF – Fator de crescimento semelhante a insulina
IGFBP – Proteína ligadora do fator de crescimento semelhante a insulina
IGF-I - Fator de crescimento semelhante a insulina I
INB – Inibina
IOD – Densidade óptica integrada
ii
jc – Junção comunicante
L – Gota Lipídica
LH – Hormônio luteinizante
m – Mitocôndria
MET – Microscopia eletrônica de transmissão
MI – Metáfase I
MII – Metáfase II
MPF – Fator promotor de maturação
mv – microvilosidade
ND – Não Definido
NIH-FSH-S1 – National Institut Health-FSH-S1
NO – Óxido nítrico
NO
2
– Nitrito
NO
3
– Nitrato
OD – Ovário direito
OE – Ovário esquerdo
OOC - Oócito
OPU – Aspiração folicular orientada por ultra-som
P4 – Progesterona
PGF
2α
- Prostaglandina F
2α
PMSG – Gonadotrofina do soro da égua prenhe
REL – Retículo endoplasmático liso
RIA – Radioimunoensaio
RNA – Ácido ribonucléico
SO – Superovulação
Star – Steroidogenia acure regulatory protein
T – Testosterona
TO – Transferência de oócito
Ve1 – Vesícula recoberta
Ve2 – Vesícula lisa
VG – Vesícula germinativa
ZP – Zona pelúcida
iii
LISTA DE TABELAS
Tabela 01
: Média e desvio padrão das diferentes variáveis estudadas no grupo
tratado com extrato de pituitária eqüina e controle...............................................
112
Tabela 02
: Número de ovulações por ovário e de oócitos recuperados do
oviduto de éguas do grupo controle......................................................................
113
Tabela 03
: Número de ovulações por ovário e de oócitos recuperados do
oviduto de éguas tratadas com extrato de pituitária eqüina..................................
113
Tabela 04
: Média e desvio padrão das diferentes variáveis avaliadas no
experimento II do grupo superovulado com extrato de pituitária eqüina e do
controle.................................................................................................................
127
Tabela 05
: Número de ovulações e de oócitos aspirados de folículos de éguas
do grupo controle..................................................................................................
128
Tabela 06
: Número de ovulações e de oócitos aspirados de folículos de éguas
do grupo superovulado com extrato de pituitária eqüina......................................
129
Tabela 07
: Média e erro padrão dos hormônios dosados no fluído folicular dos
animais dos grupos controle e superovulado com extrato de pituitária eqüina....
141
Tabela 08
: Média e erro padrão por indivíduo dos hormônios dosados no fluido
folicular dos animais do grupo superovulado com extrato de pituitária eqüina.....
141
Tabela 09
: Densidade óptica integrada (IOD) das bandas encontradas nos
diferentes folículos de éguas do grupo controle e superovulado com extrato de
pituitária eqüina.....................................................................................................
147
Tabela 10
: Percentual de bandas protéicas no líquido folicular de éguas do
grupo controle e superovulado..............................................................................
148
Tab
ela 11
: Número e percentual de oócitos recuperados do oviduto de éguas
do grupo controle e superovulado com extrato de pituitária eqüina.....................
170
Tabela 12
: Resposta superovulatória e número de oócitos recuperados de
folículos aspirados de éguas tratadas com extrato de pituitária eqüina...............
215
Tabela 13
: Número de oócitos recuperados de folículos aspirados de éguas do
grupo controle.......................................................................................................
216
Tabela 14
: Resposta superovulatória e número de oócitos recuperados do
oviduto de éguas tratadas com extrato de pituitária eqüina..................................
217
Tabela 15
: Número de oócitos recuperados do oviduto de éguas tratadas com
solução fisiológica (controle).................................................................................
218
Tabela 16
: Densidade óptica integrada (IOD) das bandas encontradas nos
diferentes folículos das éguas do Grupo Superovulado.......................................
219
Tabela 17
: Densidade óptica integrada (IOD) das bandas encontradas no
folículo das éguas do Grupo Controle...................................................................
220
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 01
: Procedimento em abatedouro de eqüino para extração da pituitária.
10
2
Figura 02
: Esquema do tratamento superovulatório com extrato de pituitária
eqüina...................................................................................................................
106
Figura 03
: Animais alojados no frigorífico, os quais foram utilizados no
experimento de transporte de oócito para o oviduto de éguas
superovuladas.......................................................................................................
107
Figura 04:
Éguas contidas para controle folicular nas dependências do
Frigorífico AIMAR..................................................................................................
108
Figura 05
: Útero, ovários e oviduto de éguas superovuladas..............................
109
Figura 06
: Dissecação, lavagem do oviduto e procura do oócito.........................
109
Figura 07
: Oócitos e células do cumulus recuperados do oviduto de éguas
superovuladas e controle......................................................................................
110
Figura 08
: Número total de ovulações e oócitos recuperados do oviduto de
éguas tratadas com extrato de pituitária eqüina e grupo controle........................
114
Figura 09
: Percentual de oócitos recuperados em relação ao número de
ovulações..............................................................................................................
114
Figura 10
: Resposta superovulatória de uma égua tratada com extrato de
pituitária eqüina (4 folículos/4 corpos lúteos)........................................................
115
Figura 11
: Dissecação do ovário de uma égua superovulada (4 ovulações)
com extrato de pituitária eqüina, demonstrando os corpos hemorrágicos............
115
Figura 12
: Presença de grande coágulo de sangue na fossa de ovulação de
uma égua do grupo superovulado a qual apresentou 6 ovulações sendo 3 por
ovário....................................................................................................................
116
Figura 13
: Presença de pequeno coágulo de sangue na fossa de ovulação de
uma égua do grupo superovulado a qual apresentou 2 ovulações sendo uma
em cada ovário......................................................................................................
116
Figura 14
: Presença de pequeno coágulo de sangue na fossa de ovulação em
duas éguas do grupo controle com diferente número de ovulações....................
117
Figura 15
: Transdutor e guia de aspiração utilizado no experimento..................
125
Figura 16
: Número total de folículos aspirados e de oócitos recuperados de
éguas tratadas com extrato de pituitária eqüina e solução fisiológica..................
130
Figura 17
: Valores médios da concentração de oxido nítrico (1), inibina (2),
testosterona (3), estrógeno (4) e progesterona (5) do líquido folicular dos
grupos controle (CONT) e superovulado (SO)......................................................
142
Figura 18
: Concentração de inibina, testosterona, estrógeno e progesterona
do líquido folicular por animal do grupo superovulado com extrato de pituitária
eqüina...................................................................................................................
143
Figura 19:
Eletroforese em poliacrilamida de proteínas do líquido folicular de
éguas superovuladas. Canaleta 1, Marcador de Peso (10 a 250kda); setas
largas indicam as bandas formadas pelo marcador de peso molecular.
Canaletas de 2 a 10 são amostras do líquido folicular de éguas
superovuladas.......................................................................................................
149
v
Figura 20
: Eletroforese em poliacrilamida de proteínas do liquido folicular de
éguas não superovulads. Canaleta 1, Marcador de Peso Molecular (10 a
250kda); setas largas indicam as bandas formadas pelo marcador de peso
molecular. Canaletas de 2 a 13 são amostras do liquido folicular de éguas não
superovuladas.......................................................................................................
150
Figura 21
: Oócitos recuperados do oviduto de éguas superovuladas com
Extrato de Pituitária
Eqüina.............................................................................................................. 160
Figura 22
: Aspecto geral do oócito de eqüino do grupo controle. Notar o
grande número das gotas lipídicas (l) e mitocôndrias (m) e a presença de
grânulos corticais (gc) distribuídos na região cortical...........................................
163
Figura 23
: Detalhe da região cortical de um oócito do grupo controle,
mostrando mitocôndrias (m) associadas a gotas de lipídeo (l) e ao retículo
endoplasmático liso (rel).......................................................................................
164
Figura 24
: Detalhe da região cortical de um oócito do grupo controle
mostrando a distribuição dos grânulos corticais (gc)............................................
165
Figura 25
: Aspecto geral de um oócito superovulado de eqüino.........................
166
Figura 26
: Detalhe da região cortical de oócitos de eqüino superovulado,
mostrando a presença de Golgi (G) bem desenvolvido e a metabolização de
lipídeos (l). Notar a presença de vesículas recobertas (ve1) na face cis e
vesículas lisas (ve2) na face trans do Golgi..........................................................
167
Figura 27
: Grânulos corticais (gc) associados a mitocôndrias, distribuídos pelo
citoplasma de oócitos superovulados de eqüinos.................................................
168
Figura 28
: Aspecto das junções celulares entre o oócito e as células da
granulosa presentes nos oócitos superovulados..................................................
169
Figura 29
: Número médio de oócitos recuperados em diferentes estágios de
maturação do grupo superovulado com extrato de pituitária eqüina....................
171
Figura 30
: Percentual de oócitos recuperados em diferentes estágios de
maturação grupo superovulado com extrato de pituitária eqüina........................
171
Figura 31
: Percentual de oócitos em estágio de metáfase e de não definido em
éguas superovuladas com extrato de pituitária eqüina.........................................
172
Figura 32
: Oócitos avaliados através da microscopia confocal, apresentando o
corpúsculo polar (1), placa metafásica I (2), placa metafásica II (3).................... 172
Figura 33
: Eletroforese em poliacrilamida (SDS-PAGE) a 13% de
concentração no gel separador, em sistema descontínuo alcalino de proteínas
do liquido folicular de éguas superovulada e controle. Canaleta P, Marcador de
Peso Molecular (Full molecular weight range, 10 a 250kDa, Amersham
Biosciences)..........................................................................................................
221
vi
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas
Lista de tabelas
Lista de figuras
Resumo
Abstract
1. Introdução
...................................................................................................
23
2. Objetivos
.....................................................................................................
26
3. Revisão de literatura
..................................................................................
28
3.1. Ovulações múltiplas espontâneas em éguas.........................................
29
3.2. Superovulação na espécie eqüina..........................................................
32
3.3. Superovulação em ruminantes...............................................................
52
3.4. Aspectos fisiológicos do ciclo estral em éguas.......................................
62
3.5. Controle endócrino do ciclo estral..........................................................
64
3.6. Mecanismo de ovulação.........................................................................
66
3.6.1. Maturação folicular...........................................................................
66
3.6.1.1. Foliculogênese.............................................................................
66
3.6.1.2. Composição do fluido folicular.....................................................
72
3.6.1.2.1. Oxido nítrico ..........................................................................
73
3.6.1.2.2. Proteína do líquido folicular...................................................
76
3.6.1.3.Parâmetros para aferir a viabilidade do folículo ovariano.............
77
3.6.1.4. Processo da ovulação.................................................................
78
3.6.1.5. Aquisição de receptores para LH...............................................
80
3.6.2. Maturação oocitária..........................................................................
82
3.6.2.1. Oogênese....................................................................................
86
3.6.2.2. Fatores que influenciam na maturação oocitária.........................
88
3.6.2.3. Competência oocitária.................................................................
90
3.7. Aspiração folicular..................................................................................
91
4. EXPERIMENTOS
....................................................................................
101
4.1 Preparação do extrato de pituitária eqüina............................................
101
4.2 EXPERIMENTO I
...................................................................................
104
“ESTUDO DO TRANPORTE DO OÓCITO PARA O OVIDUTO DE ÉGUAS
SUPEROVULADS COM EXTRATO DE PITUITÁRIA EQUINA”
4.2.1. Material e métodos................................................................................
104
4.2.1.1 Monitorização e tratamento das éguas superovuladas..................
104
4.2.1.2 Animais...........................................................................................
107
4.2.1.3 Monitorização das éguas................................................................
107
4.2.1.4 Análise estatística...........................................................................
110
4.2.2 Resultado..............................................................................................
111
4.2.3 Discussão.............................................................................................
118
4.3 EXPERIMENTO II
.......................................................................................
123
“EFEITO DA SUPEROVULAÇÃO NA RECUPERAÇÃO DE OÓCITOS
QUANDO DA ASPIRAÇÃO FOLICULAR GUIADA POR ULTRA-
SONOGRAFIA”
4.3.1 Material e métodos.................................................................................
124
vii
4.3.1.1 Monitorização e tratamento das éguas superovuladas..................
124
4.3.1.2 Animais...........................................................................................
124
4.3.1.3 Obtenção de oócitos.......................................................................
124
4.3.1.4 Análise estatística...........................................................................
125
4.3.2 Resultados............................................................................................
126
4.3.3 Discussão.............................................................................................
131
4.4 EXPERIMENTO III
......................................................................................
135
“AVALIAÇÃO DO AMBIENTE FOLICULAR DE ÉGUAS SUPEROVULADAS
COM EXTRATO DE PITUITÁRIA EQUINA”
4.4.1 Material e métodos.................................................................................
136
4.4.1.1 Monitorização e tratamento das éguas superovuladas..................
136
4.4.1.2 Animais...........................................................................................
136
4.4.1.3 Obtenção do fluido folicular............................................................
136
4.4.1.4 Avaliação do fluido folicular............................................................
137
4.4.1.4.1 Dosagens hormonais.................................................................
137
4.4.1.4.2 Concentração do oxido nítrico...................................................
138
4.4.1.4.3 Perfil eletroforético das proteínas do líquido folicular................
138
4.4.1.5 Análise estatística...........................................................................
139
4.4.2 Resultado..............................................................................................
140
4.4.2.1 Análise hormonal e de oxido nítrico intra-folicular..........................
140
4.4.2.2 Perfil eletroforético das proteínas do fluido folicular.......................
146
4.4.3 Discussão.............................................................................................
151
4.5 EXPERIMENTO IV
.....................................................................................
157
“ESTUDO DA MATURAÇÃO OOCITÁRIA DE ÉGUAS SUPEROVULADAS
COM EXTRATO DE PITUITÁRIA EQUINA”
4.5.1 Material e métodos.................................................................................
158
4.5.1.1 Monitorização e tratamento das éguas superovuladas..................
158
4.5.1.2 Avaliação dos oócitos recuperados de folículos aspirados............
158
4.5.1.2.1 Avaliação da maturação citoplasmática....................................
158
4.5.1.2.2 Avaliação da maturação nuclear...............................................
159
A) Avaliação dos oócitos recuperados do oviduto................................
159
4.5.1.3 Análise estatística...........................................................................
160
4.5.2 Resultado..............................................................................................
161
4.5.2.1 Avaliação ultraestrutural oocitária através da microscopia
eletrônica..................
161
4.5.2.2 Avaliação ultra-estrutural oocitária por meio da microscopia
confocal...........................................................................................................
170
4.5.3 Discussão.............................................................................................
17
3
4.5.3.1 Maturação citoplasmática...............................................................
17
3
4.5.3.2 Maturação nuclear..........................................................................
17
5
5. Conclusões
.................................................................................................
17
8
6. Considerações futuras
...............................................................................
180
7. Referências bibliográficas
.......................................................................
183
8. Apêndice
....................................................................................................
215
CARMO, M.T. Estudo do fluido folicular, transporte, recuperação e maturação de
oócitos em éguas superovuladas com extrato de pituitária eqüina. Botucatu -SP,
2007. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, campus de Botucatu - SP. Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho.”
RESUMO
A fêmea da espécie eqüina é considerada monovulatória sazonal, o que é
um fator limitante a produção de embriões ao longo do ano. Esta limitação poderia
ser minimizada se houvesse uma resposta superovulatória eficiente em melhorar a
produção de embriões. Protocolos mais recentes desenvolvidos em nosso
laboratório utilizando-se o Extrato de Pituitária Eqüina (EPE) têm permitido uma
boa resposta superovulatória. Contudo o número de embriões recuperados ainda
tem sido inferior ao das ovulações, em conseqüência de fatores ainda não
determinados. O presente estudo teve por objetivo: verificar se o tratamento com o
EPE, administrado duas vezes ao dia, altera a maturação nuclear e citoplasmática
do oócito, avaliar o ambiente folicular mensurando os níveis de 17β-estradiol,
testosterona, progesterona, inibina e óxido nítrico, bem como o perfil eletroforético
de proteínas no fluido folicular entre éguas superovuladas e não superovuladas.
Estudamos também o transporte do oócito para o oviduto. Este trabalho foi
dividido em quatro experimentos: Experimento I “Estudo do transporte dos oócitos
para o oviduto de éguas superovuladas com extrato de pituitária eqüina”;
Experimento II “Efeito da superovulação na recuperação de oócitos quando da
aspirações foliculares guiadas por ultra-sonografia”; Experimento III “Avaliação do
ambiente folicular de éguas superovuladas”; Experimento IV “Avaliação da
maturação oocitária de éguas superovuladas com extrato de pituitária equina”. O
“experimento I” foi desenvolvido na Universidade de Rio Cuarto (Argentina), foram
utilizadas 22 éguas de 3 – 12 anos, (09 éguas controles; 13 éguas tratadas
“EPE”). Estes animais foram monitorizados diariamente por ultra-sonografia até
detectar-se um ou mais folículos de 30 mm, quando então, passaram a ser
examinadas duas vezes ao dia. O protocolo superovulatório utilizado consistiu na
administração de 25mg, de EPE duas vezes ao dia intramuscular, tendo o seu
início no sétimo dia pós-ovulação. Este foi interrompido quando a maioria dos
folículos atingiram um diâmetro de 35mm, neste momento foi administrado
2.500UI de hCG endovenosa. Para o estudo do transporte do oócito para o
oviduto, as éguas foram abatidas 12 a 24h após a detecção da primeira ovulação.
Os ovidutos foram removidos dos ovários e útero, e posteriormente dissecados e
lavados internamente com DPBS. No “experimento II” seguindo o mesmo
protocolo superovulatório do “experimento I” foram aspiradas 24 éguas divididas
em dois grupos, superovulado (GI/n=12) e não superovulado (GII/=12) utilizando
uma probe guiada por ultra-som via vaginal 30h após a indução da ovulação que
foi realizada quando a maioria dos folículos apresentaram 35mm de diâmetro. No
“experimento III” seguimos o mesmo protocolo do “experimento II” tendo sido o
fluido folicular obtido de éguas superovuladas (GI/n=12) e não superovuladas
(GII/n=12). Neste experimento realizamos a dosagem das concentrações
intrafoliculares dos hormônios, inibina, estrógeno, progesterona e testosterona,
além da dosagem de oxido nítrico e o perfil eletroforético das proteinas. No
“experimento IV” foi avaliado a maturação citoplasmática através da microscopia
eletrônica e a maturação nuclear através da microscopia confocal de oócitos. Foi
utilizado para a comparação de proporções o teste Exato de Fisher, com nível de
significância de 5%, seguido do Teste t de Student. Para a comparação dos níveis
hormonais entre indivíduos de folículos aspirados foi utilizado Anova e Student
Newman Keuls test, para se evidenciar diferenças estatísticas (p<0,05). O número
médio de ovulações/égua (p<0,05) e o percentual de oócitos viáveis/ovulação
recuperados do oviduto (p=0,07) no experimento I foi de 1,22 e 90%
respectivamente para o grupo controle e 4,77 e 64% respectivamente para o
grupo superovulado. Foi observada uma taxa de recuperação de oócitos/ovulação
similar ao grupo controle nas éguas com um número menor de quatro ovulações.
Observamos neste experimento um grande coágulo de sangue na fossa de
ovulação de éguas superovuladas, o que não foi observado nas éguas controle.
No experimento II, o numero médio de folículos aspirados por égua foi de 1,0 e
4,75 e o percentual de oócitos recuperados por folículo aspirado foi de 66% e 25%
respectivamente para os grupos controle e superovulado (p<0.05). Não foi
observada diferença significativa na avaliação do perfil hormonal e dos níveis
intrafoliculares de oxido nítrico no experimento “III”, havendo contudo uma
diferença (p<0,05) nos níveis de estrógeno, testosterona e inibina entre indivíduos
do grupo superovulado. Neste experimento foram também encontradas no fluido
folicular, 30 bandas protéicas nas éguas superovuladas e 24 nas éguas controle,
sendo que seis bandas sempre estiveram ausentes no grupo controle. No
experimento “IV”, do total de 27 oócitos recuperados do oviduto de éguas
superovuladas 40% (11/27) estavam em Metáfase I, 15% (04/27) em Metáfase II e
44% (12/27) foram classificados como não definidos (configuração da cromatina
não compatível com o estágio meiótico ou não visualização da cromatina).
Observamos também alterações ultraestruturais na maturação citoplasmática de
oócitos de éguas superovuladas quando comparada com éguas não
superovuladas. Concluímos que um exacerbado número de ovulações em éguas
tratadas com EPE altera o mecanismo de transporte do oócito para o oviduto e
que a superovulação induz alterações no ambiente folicular e na maturação dos
oócitos.
Palavras Chave: superovulação em éguas, extrato de pituitária eqüina, maturação
oocitária, aspiração folicular, fluido folicular, transporte oocitário.
CARMO, M.T. Study of follicular fluid, transport, recovery and oocyte maturation
in mares superovulated with equine pituitary extract. Botucatu, 2007. These
(Doctor in Veterinary Medicine) Faculty of Veterinary Science – FMVZ/UNESP,
campus of Botucatu - SP.
ABSTRACT
The equine female is considered a seasonal mono-ovulatory specie, which
is a restrictive factor in respect to embryo production throughout the year. This
limitation could be minimized if an efficient superovulatory response and
consequent improvement of embryo production were possible. More recent
protocols developed in our lab using EPE (equine pituitary extract) have allowed a
good superovulatory response. However, the number of embryos recovered has
been inferior to the number of ovulations detected due to unknown factors. The
present study has the following objectives: Verify if the EPE treatment
administered twice daily would alter the oocyte cytoplasmic and nuclear
maturation; and to evaluate the follicular environment by measuring estradiol 17-β,
testosterone, progesterone, inhibin and nitric oxide. The electrophoresis pattern of
proteins in follicular fluid from superovulated and non- superovulated mares was
determined. In addition, the oocyte transport through the oviduct was investigated.
The present study was divided into four experiments. Experiment I: Study of
oocyte transport to the oviduct in superovulated mares using equine pituitary
extract. Experiment II: Effect of superovulation on oocyte recovery using
transvaginal ultrasound guided follicular aspiration. Experiment III: Evaluation of
follicular environment in superovulated mares. Experiment IV: Oocyte maturation
in superovulated in mares using equine pituitary extract. Experiment I was
performed at Rio Cuarto University, Argentina. In the related study, 22 mares
aging from 3 to 12 years were used (9 control mares, 13 EPE treated mares).
These mares were monitored daily by ultrasound until the presence of a follicle ≥
30mm in diameter, being then examined twice daily. The superovulation protocol
used consisted in 25mg of EPE twice a day, intramuscularly, starting at day 7
post- ovulation. The treatment was ended when the majority of follicles reached
35mm, administering hCG (2500 UI,iv). The oviduct transport study had mares
submitted to slaughter from 12 to 24 hours after detection of first ovulation. The
oviducts were then removed from the ovaries and uterus, being dissected and
flushed using PBS. On experiment II, using the same superovulation protocol from
experiment I, 24 mares were submitted to transvaginal ultrasound guided follicle
aspiration being divided into two groups, superovulated (G1/n=12), and non-
superovulated ( G2/n=12) at 30h post induction of ovulation, which was performed
when the majority of follicles reached 35mm in diameter. At experiment III, the
same protocol from experiment II was used, with follicular fluid obtained from
superovulated (G1/n=-12), and non- superovulated mares (G2/n=12). In this
experiment, intra-follicular hormone concentrations of inhibin, estrogen,
progesterone and testosterone were determined besides the nitric oxide
concentrations and protein electrophoresis pattern. At experiment IV, the
cytoplasmic and nuclear oocyte maturation was evaluated by electronic and focal
microscopy respectively. The Fisher exact test was used to compare the
proportions, with 5% of significance followed by the Student t test. Anova and
Student Newman Keuls test were used to compare hormonal concentrations
among mares submitted to follicle aspiration considering 5% of significance. The
mean number of ovulations/mare (p<0.05) and the percentage of viable oocytes/
ovulation recovered from the oviduct (p=0.07) at experiment I was 1.22 and 90%
for control group and 4.77 and 64% for superovulated group. The rate of oocyte
recovered/ ovulation was similar between treated and control groups in mares
presenting less than 4 ovulations. A large blood coagulum was observed at the
ovulation fossa in superovulated mare, which was not present in control mares. At
experiment II, the mean number of follicles aspirated per mare was 1.0 and 4.75,
and the percentage of oocyte recovered per aspirated follicle was 66% and 25%
respectively in control and superovulated mares (p>0.05) There was no statistic
difference on hormonal concentrations and intra-follicular nitric oxide
concentrations in experiment III. Although, a difference (p< 0.05) in estrogen,
testosterone and inhibin concentrations among mares from superovulation group
was detected. In the related experiment were also determined 30 protein bands in
follicular fluid from superovulated mares and 24 bands from control mares;
observing the constant absence of 6 bands in the control group. In experiment IV,
from a total of 27 recovered oocytes from superovulate mare´s oviducts,
40%(11/27) were in metaphase I, 15% in metaphase II(04/27) and 44% (12/27)
were classified as non- defined (chromatin configuration non compatible with
meiotic stage or non-visualization of chromatin). Ultra-structural alterations were
observed in oocyte cytoplasmic maturation from superovulated mares when
compared to control mares. In conclusion, an exacerbated number of ovulations in
EPE treated mares alter the mechanism of oocyte transport to the oviduct. In
addition, the superovulation treatment leads to modifications in the follicular
environment and in the oocyte maturation.
Key words: superovulation in mare, equine pituitary extract, oocyte maturation,
follicular aspiration, follicular fluid, oocyte transport.
Introdução 24
1. INTRODUÇÃO
A atual conjuntura da criação de cavalos tem nos surpreendido com uma
grande amplitude e diversificação das atividades eqüestres que esta espécie é
capaz de desenvolver, lapidando assim a indústria eqüina, que hoje possui um
importante papel sócio-economico. A Confederação Nacional da Agricultura estima
que a industria do cavalo nacional empregue diretamente mais de um milhão de
pessoas, pontuando o nosso país como o terceiro maior rebanho eqüino do mundo,
contendo mais de 6 milhões de animais. O interesse na aplicação de biotécnicas
voltadas à reprodução eqüina vem se fomentando cada vez mais como ferramenta
para acelerar o ganho genético e tornando nossos animais mais competitivos. Estas
biotécnicas têm-se focado em obter melhores taxas de concepção de indivíduos
portadores de subfertilidade de origem ou não hereditária, além de maximizar o
aproveitamento de animais férteis de alto potencial genético.
O tratamento superovulatório na espécie eqüina, assim como em bovinos que
também são monovulatórios, busca recrutar um maior número de folículos possíveis
de uma onda folicular, sustentando o estímulo do seu desenvolvimento até o
momento das ovulações (Meira & Buratini, 1998).
Vários estudos têm relatado que a égua é refratária a todas as drogas
rotineiramente utilizadas visando superovulação em outras espécies, como o FSH
suino e o eCG (McCue, 1996). O extrato de pituitária eqüina (EPE) e o FSH equino
são os únicos compostos que consistentemente induzem ovulações múltiplas em
éguas (Squires et al., 1999); contudo, a resposta superovulatória tem sido baixa (1-3
ovulações/égua) (McCue, 1996; Rosas, et al., 1998).
Estudos têm demonstrado uma melhora no percentual de ovulações múltiplas
em éguas superovuladas com a administração do EPE duas vezes ao dia (4-
7ovulações/égua), entretanto com baixa taxa de recuperação embrionária
(Alvarenga et al., 2001; Scoggin et al., 2002; Carmo et al., 2002a; Carmo, 2003).
Este fato pode estar relacionado a produção de oócitos de baixa qualidade,
anormalidade na maturação folicular e oocitária, a falha do folículo em liberar o
oócito e a captação do mesmo para o interior do oviduto, assim como alterações no
trânsito deste ou do embrião pelo oviduto (Palmer et al., 1993; Dippert et al., 1994).
Em estudo mais recente, foi observado um maior número de recuperação
embrionária (2 embriões/égua) com o uso da administração de doses decrescentes
Introdução 25
de extrato de pituitária eqüina, quando comparado com a administração em doses
constantes (1,2 embriões/égua) (Carmo, 2003). O mesmo foi observado em vacas
(Monniaux et al., 1983) e em Hamsters (Carmo et al., 2001, Carmo, 2003), sendo
sugerido pelos autores um estudo mais profundo da maturação folicular e oocitária
no processo de superovulação.
Contudo, as respostas para as várias questões levantadas a respeito das
baixas taxas das recuperações embrionárias em éguas superovuladas ainda
continuam obscuras, fazendo-se necessários mais estudos, iniciando-se pelo
gameta feminino e o ambiente em que este se desenvolve.
Objetivos 27
27
2. OBJETIVOS
O presente trabalho objetivou:
# Determinar as razões da baixa taxa de recuperação de embriões em éguas
superovuladas com extrato de pituitária eqüina.
# Avaliar o transporte dos oócitos para o oviduto correlacionando o número de
oócitos presentes no oviduto com o número de folículos ovulados em éguas
superovuladas e não superovuladas com extrato de pituitária eqüina.
# Avaliar o efeito da superovulação com extrato de pituitária eqüina na
recuperação de oócitos quando da aspiração folicular guiada por ultra-sonografia.
# Avaliar os níveis de 17β-estradiol, testosterona, progesterona, inibina e óxido
nítrico, bem como o perfil eletroforético de proteínas no fluido folicular entre éguas
superovuladas e não superovuladas com extrato de pituitária eqüina.
# Verificar se o tratamento superovulatório com o extrato de pituitária eqüina altera
a maturação nuclear e citoplasmática do oócito.
# Verificar a maturação nuclear e citoplasmática bem como integridade estrutural
dos oócitos recuperados de éguas superovuladas com extrato de pituitária eqüina.
Revisão de literatura
29
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Ovulações múltiplas espontâneas em éguas
O conhecimento das particularidades fisiológicas, quanto aos aspectos da
foliculogênese e incidência de múltiplas ovulações, torna-se necessário no intuito
da prevenção de gestações gemelares ou para otimização da eficiência
reprodutiva e econômica em um programa de transferência de embriões em
equinos (Carmo et al., 2002a).
Apesar da espécie eqüina ser considerada monovulatória, ou seja, apenas
um folículo dominante é selecionado durante cada onda folicular, particularidades
são descritas dentre algumas raças, como é o caso do Puro Sangue Inglês, Polo
Argentino, Quarto de Milha e Apaloosa, que apresentam incidência de múltiplas
ovulações na ordem de 15-30%; 38%; 9% e 8%, respectivamente, por ciclos
estrais (Sertich, 1989, Ginther, 1992; Losinno et al., 2000).
Pascoe et al. (1987), avaliaram 1.015 éguas de raças européias e PSI,
concluíram que 38,2% das ovulações múltiplas evoluíram para gestações
gemelares. Sertich (1989) relatou que a incidência de múltiplas ovulações em
éguas de raças européias tem uma maior prevalência (55,9%), quando comparado
com raças americanas (8% a 9%). Já na raça crioula, Pimentel et al. (1994),
observaram uma incidência de múltiplas ovulações de 7,1%, sendo que, 6,5% de
dupla ovulação, 0,5% de tripla ovulação e 0,1% de quadrupla ovulação.
Trinque et al. (1997), relataram na raça Brasileiro de Hipismo, um caso de
quádrupla ovulação, havendo a recuperação de dois blastocistos expandidos, um
blastocisto inicial e um oócito em uma única colheita de embrião, resultando em
três prenhes e três parições. Entretanto, há uma maior incidência de ovulações
duplas do que tripla ou quádrupla, segundo relato de Hughes et al. (1972), onde
foram observados 99% de ovulações duplas e 1% de ovulações triplas e
quádrupla.
Um total de 829 ciclos em éguas da raça Brasileiro de Hipismo (BH) foi
avaliado por Carmo et al. (2002a), tendo sido detectados 390 (47%), 360 (43%) e
Revisão de literatura
30
79 (10%) ciclos com ovulações simples, duplas e triplas, respectivamente, e um
total de 617 embriões recuperados, sendo 230, 306 e 81 embriões provenientes
de ovulações simples, duplas e triplas respectivamente. Carmo, et al. (2004)
relatam uma alta incidencia de ovulações múltiplas em éguas da raça BH (53%).
A freqüência de ovulações múltiplas unilaterais e bilaterais tem sido motivo
de estudo por alguns pesquisadores. Em um levantamento realizado por Ginther &
Pierson (1989), não notaram diferença significativa entre as incidências uni ou
bilateral, o mesmo sendo relatado por Squires et al., (1987a) com 49,7% e 50,3%
respectivamente e por Carmo et al. (2002b) com 53% ovulações unilaterais e 47%
ovulações bilaterais. Duarte (2003), relatou uma maior incidência significativa de
ovulações múltiplas unilaterais do que bilaterais.
Riera et al. (2006) avaliaram 1.300 ciclos com ovulaçõe duplas de éguas da
raça Polo Argentino, e observaram um percentual de ovulações unilaterais e
bilaterais de 54% e 66%, respectivamente e um percentual de recuperações de
dois embriões de 35% e 48%, respectivamente (p<0,001). Quanto à recuperação
de um embrião não houve diferença estatística (35 e 37%, respectivamente).
Estes autores relataram não haver diferença no percentual de prenhez de
embriões recuperados de ovulações unilaterais (63%) e ovulações bilaterais
(64%).
Quanto ao tempo de ocorrencia entre as ovulações múltiplas tem-se
observado que a maioria dessas ocorre sincronicamente, apresentando 75% das
ovulações entre as primeiras 24h; 15% entre 48h e 10% após ás 48h (Hughes et
al., 1972). Ginther (1987) relatou que 55% das ovulações múltiplas são
simultâneas, ou seja ocorrem ao mesmo tempo, 33% em 24h, 9% em 48h e 3%
em até 62h, o mesmo sendo observado por Duarte (2003), com 62% das
ovulações sincrônica e 53% não sincrônica. Em um estudo com éguas
superovuladas, Carmo (2003) observou um sincronismo de 24h entre as
ovulações.
Quanto ao sincronismo entre as ovulações duplas unilaterais e bilaterais,
Henry et al. (1982) relataram em um estudo envolvendo 209 ovulações duplas, um
maior sincronismo entre as ovulações bilaterais do que em unilaterais. Duarte
Revisão de literatura
31
(2003) observou que nas ovulações duplas bilaterais a porcentagem de gestações
gemelares foi superior (61,8%) às unilaterais (28,4%).
A incidência de ovulações múltiplas pode estar relacionada a fatores
genéticos (raça), hereditários, nutricional (dieta rica em energia) e relacionado com
a idade da égua (18% entre 6 a 10 anos, e 14% entre 2 a 5 anos) (Warszawsky et
al., 1972; Henry et al., 1982; Ginther, 1992). Ginther & Douglas (1982)
encontraram maior incidência de ovulações múltiplas espontâneas em éguas
solteiras do que em éguas paridas com potro, hipotetizando haver um efeito
estressante do potro no período da amamentação.
Não se sabe ao certo qual a base hormonal para a predisposição de
ovulações múltiplas espontâneas, onde estudos têm demonstrado que as
concentrações circulantes de LH e FSH são semelhantes entre éguas de
ovulações simples e múltiplas, sugerindo haver uma maior sensibilidade ovariana
a gonadotrofina em determinadas raças e indivíduos (Urwin & Allen, 1983).
Ginther (1992) comparou, entre as ovulações simples e duplas, o diâmetro
médio dos folículos pré-ovulatórios descrevendo o diâmetro de 44mm para a
ovulação simples, 35mm e 40mm para as ovulações duplas unilaterais e bilaterais,
respectivamente. Quando o mesmo autor correlacionou o diâmetro entre a
primeira e a segunda ovulação de dois folículos pré-ovulatórios unilateral as
mensurações foram de 39mm e 34mm de diâmetro, respectivamente.
Uma das possíveis causas para o menor diâmetro dos múltiplos folículos
ovulatórios, é o aumento do nível circulante de inibina, resultando na inibição da
liberação do FSH. Entretanto, a relação entre o diâmetro dos folículos pré-
ovulatórios e o menor sincronismo entre as múltiplas ovulações unilaterais, pode
ser conseqüência do menor suporte sangüíneo entre os folículos, levando a uma
diminuição dos níveis de LH nos folículos menores em relação aos folículos
maiores (Ginther, 1992).
Squires et al. (1987b) relatam um aumento na concentração de
progesterona circulante em ovulações duplas naturais ou induzidas, porém os
níveis são menores do que o dobro das ovulações simples. Não há alteração
Revisão de literatura
32
sobre a duração do estro, diestro e do ciclo estral em éguas com ovulações
múltiplas (Ginther & Pierson, 1989).
O aumento do número de ovulações é desejável para fins de programa de
transferência de embriões, elevando o percentual de embriões recuperados por
éguas. Contudo, é preocupante no que diz respeito ao manejo reprodutivo, pois
gestações gemelares são indesejáveis na espécie eqüina (Carmo et al., 2002a).
3.2. Superovulação na espécie eqüina
As técnicas para otimizar a fertilidade na espécie eqüina têm sido limitantes
em decorrência da maioria das éguas apresentar uma única ovulação por ciclo
estral (McCue, 1996). A incidência de ovulações múltiplas espontâneas em raças
européias, tem maximizado a eficiência da transferência de embriões (Pascoe et
al., 1987; Sertich, 1989; Carmo et al., 2002a).
A transferência de embriões, visa elevar potencialmente o nível genético da
progênie (Meira & Buratini, 1998), porém é uma biotécnica que requer
investimentos, principalmente no que diz respeito às éguas receptoras pelo fato
destas terem que esperar vários ciclos para receberem o embrião (Squires &
Seidel, 1995).
O tratamento superovulatório na espécie eqüina busca recrutar um maior
número de folículos possíveis de uma onda folicular, estimulando o seu
desenvolvimento até as ovulações (Meira & Buratini, 1998).
O principal objetivo da superovulação é elevar a eficiência reprodutiva e
econômica dos programas de transferência de embriões, visto que, com a
multiplicação do número de ovulações e consequentemente do número de oócitos
para a fertilização, tem-se um maior número de embriões por éguas doadoras a
serem recuperados em uma única colheita (Andrade, 1986).
O processo superovulatório, também pode aumentar a taxa de fertilidade de
garanhões subférteis (maior chance de fertilizar um oócito) e de éguas subférteis,
por propiciar um maior número de ovulações e consequentemente uma maior
expectativa para a fertilização (McCue, 1996).
Revisão de literatura
33
Outras aplicações favoráveis à estimulação de múltiplos folículos, são o fato
destas poderem aumentar a eficiência da colheita de oócitos para fins de
fertilização in vitro (FIV), transferência intrafalópio de gametas (GIFT) e injeção de
espermatozóide intracitoplasmática (ICSI) (McCue, 1996).
Vários estudos têm relatado que a égua é refratária a todas as drogas
rotineiramente utilizadas na tentativa superovulatória de outras espécies, como o
FSH e o eCG (McCue, 1996). O extrato de pituitária eqüina (EPE) é um preparado
parcial de gonadotrofina eqüina, e o único composto que consideravelmente induz
ovulações múltiplas em éguas (Squires et al., 1999). Contudo, a resposta
superovulatória é baixa (1-3 ovulações/égua) em relação a outras espécies
(McCue, 1996).
Para se ter idéia desta baixa resposta ovariana das éguas aos hormônios
gonadotróficos, Douglas (1979) induziu a superovulação em éguas com a
gonadotrofina eqüina (Pitropin
®
), resultando em uma taxa de 2,3 ovulações, porém
em um outro experimento, o mesmo preparado foi capaz de induzir,
aproximadamente, 30 ovulações em vacas (apud Andrade, 1986).
A otimização da dose do extrato de pituitária para induzir um maior número
de ovulações é um ponto importante a ser considerado (Woods & Ginther, 1983).
Vários pesquisadores têm estudado a dosagem e a freqüência do EPE que mais
se adaptam para a estimulação ovariana (Douglas, 1974 e 1979; Lapin & Ginther,
1977; Woods & Ginther, 1983; Alvarenga et al., 1999 e 2001).
A potência da dose é estimada por uma amostra de ovários de ratas
superestimuladas com EPE, que são pesados e expressados em Fevold rat unit
(Fevold, 1939), contudo, a padronização da dose a ser administrada é um fator
trabalhoso e limitante, em decorrência das constantes variações dos níveis de
FSH e LH presentes no preparado (Squires et al., 1999).
Tem-se relatado que uma maior dose diária do EPE em éguas
anovulatórias, resulta em uma maior taxa de ovulações (1125 Fevold unit/3,3
ovulações/égua e 750 Fevod unit/1,4ovulações/éguas), porém quando
administrada na estação ovulatória, não foram observadas diferenças nas taxas
Revisão de literatura
34
de ovulações (750, 1500 e 2250 Fevold unit/2,7 ovulações/éguas) (Woods &
Ginther, 1983).
Alguns estudos têm sido relevantes em avaliar o melhor momento para se
iniciar o tratamento superovulatório (Woods & Ginther, 1983). As éguas tratadas
na fase de anestro com o EPE têm demonstrado uma média de 3,3
ovulações/éguas (Woods & Ginther, 1982), já na fase estral utilizando o mesmo
produto superovulatório, tem sido comparado às éguas em fase do estro e do
diestro (Lapin & Ginther, 1977). Na fase do estro a média de ovulações tem sido
de 1,7/égua (Lapin & Ginther, 1977; Woods et al., 1982), porém na fase do diestro,
quando se iniciou o tratamento no 15
o
dia pós-ovulação, a média foi de 2,9
ovulações/égua (Wood & Ginther, 1983).
Preparado comercial à base de FSH (Foltropin, Pluset) tem sido utilizado
em éguas na tentativa de induzir as ovulações múltiplas (Squires et al., 1986;
Fortune & Kimmich, 1993). Contudo, a resposta superovulatória é baixa, obtendo
uma média de 1,6 ovulações por ciclo e um percentual de ovulações múltiplas de
65% das éguas tratadas (Sirois et al., 1992), o que limita a sua utilização em
decorrência do seu alto custo e da necessidade de ser utilizada em altas doses
(McCue, 1996; Squires et al., 1999). A dose de FSH-p administrada em éguas é
aproximadamente 70 vezes a dose usualmente utilizada em vacas para promover
a superovulação (Ginther et al., 1986 apud McCue, 1996).
A gonadotrofina coriônica eqüina (eCG) é usualmente utilizada na
superovulação de ruminantes, porém em éguas tem sido demonstrado não haver
efeito no desenvolvimento ou na ovulação de múltiplos folículos (Day, 1940; Allen,
1982; Ginther, 1992). Esta falha no desenvolvimento de múltiplos folículos com o
eCG em éguas tem sido atribuída a uma limitada ligação do eCG aos receptores
de FSH no folículo de éguas não gestantes (McCue, 1996).
O GnRH também tem sido estudado na tentativa de melhorar a resposta
superovulatória em éguas, obtendo um melhor resultado no período de anestro,
em decorrência da presença do pico de FSH em resposta a sua administração
(Mccue, 1996). Johnson & Becker (1988), relataram a indução de ovulações
múltiplas com o uso de GnRH em éguas no período de anestro, obtendo uma
Revisão de literatura
35
média de 1,3; 2,9 e 3,5 ovulações, utilizando uma dosagem farmacológica de 2, 20
e 100µg de GnRH/hora, respectivamente, através de uma “bomba de GnRH”, por
um período médio de 11,4 dias. Já em éguas cíclicas, não houve sucesso na
indução de ovulações múltiplas, devido ao efeito de feedback negativo para a
liberação de FSH, ou seja, a inibina secretada pelos folículos em desenvolvimento
impedem a liberação do FSH, que bloqueia o crescimento de pequenos folículos
da onda folicular (McCue, 1996).
Algumas tentativas supressoras de inibina têm sido estudadas, com o
intuito de impedir o seu efeito (Mckinnon et al., 1992), através da
imunoneutralização de inibina, que consiste na utilização de fragmentos sintéticos
ou recombinantes da subunidade α, o que promove o bloqueio do mecanismo de
feedback negativo da liberação de FSH, permitindo a elevação dos níveis de FSH
endógeno durante a fase folicular (McCue, 1996).
Um antagonista da inibina foi utilizado na tentativa de induzir as ovulações
múltiplas em éguas (McKinnon et al., 1992; McCue et al., 1993). Mckinnon et al.
(1992) relataram um aumento na taxa de ovulações duplas e triplas e na
recuperação de embriões com a utilização deste antagonista de inibina, porém o
seu uso tem sido limitado em decorrência a relatos de choque anafilático e
abcesso no sitio de administração, devido ao prolongado tempo de administração
da droga, o qual é realizado em torno de duas ou mais semanas (Squires et al.,
1999).
Como dito anteriormente, atualmente o EPE e o FSHe são os únicos
compostos que consistentemente induzem a superovulação em éguas. Alguns
estudos têm demonstrado um aumento na taxa de ovulações em éguas
superovuladas com a utilização deste composto, contudo, a taxa de recuperação
de embriões é baixa (Palmer et al., 1993; Squires & Seidel 1995; Alvarenga et al.,
1999; Carmo et al., 2002b). Dippert et al. (1992), relataram que apenas 43% das
ovulações em éguas superovuladas resultaram na recuperação de embriões por
lavado uterino, comparado com 74% do grupo controle não superovulado.
Douglas (1979) também relatou um baixo percentual de embriões
recuperados por ovulações em éguas tratadas com EPE (35%) quando
Revisão de literatura
36
comparado com as ovulações simples não tratadas (67%). Squires et al. (1987b)
entretanto, não observaram diferença no percentual de embriões recuperados
entre éguas superovuladas com EPE (54%) e éguas controle não superovuladas
(55%).
Ainda não está claro, se a baixa recuperação de embriões de éguas
superovuladas ocorre devido à deficiência no desenvolvimento folicular (Dippert et
al., 1994), na falha do folículo em liberar o oócito no momento da ovulação
(Palmer et al., 1993), na produção de oócitos de baixa qualidade ou na falha da
captação dos oócitos para o interior do oviduto (Palmer et al., 1993; Dippert et al.,
1994). Dippert et al. (1994) também sugerem que o tratamento superovulatório
pode alterar o tempo normal do trânsito dos embriões através do oviduto.
Embora nenhuma afirmativa concreta foi determinada quanto a retenção do
oócito na fímbria do infundíbulo, alguns pesquisadores (Onuma & Ohnami, 1975)
encontraram uma massa gelatinosa globular em 76% de 424 ovidutos estudados e
deduziram que esta massa pode ter um papel em reter o oócito não fertilizado no
oviduto. Dippert et al. (1994) descrevem esta massa, como sendo um filamento de
secreção de muco das células da granulosa próximo da ovulação.
Durante a ovulação, esta secreção adere a fímbria do oviduto, ou migra
para o interior do mesmo com o oócito, envolvendo o oócito sob uma grande
camada de massa gelatinosa de origem folicular (Liu et al., 1991). Onuma &
Ohnami, (1975) relataram que os oócitos são retidos mais freqüentemente ao
oviduto, quando há presença desta massa globular. Liu et al. (1991) teorizaram
que esta massa pode obstruir o lume do oviduto, interferindo no transporte do
embrião, bem como, na aderência do oócito na fímbria do infundíbulo, impedindo a
sua migração para o oviduto.
Tem sido sugerido, que embriões oriundos de animais submetidos ao
tratamento superovulatório são menos competentes ao desenvolvimento, que
embriões de animais não superovulados (Elsden et al.,1976; Woods & Ginther,
1984; Hyttel et al., 1991). Woods & Ginther (1984), relataram baixo sucesso na
taxa de prenhez, decorrente de embriões transferidos de éguas com ovulações
múltiplas (11/21) do que éguas com ovulações simples (7/8). Elsden et al. (1976)
Revisão de literatura
37
demonstraram que a taxa de prenhez foi ligeiramente superior para embriões de
vacas não superovuladas, do que as vacas superovuladas (89% e 70%,
respectivamente).
Contradizendo os autores anteriores, Squires et al. (1987b) relataram que a
viabilidade dos embriões coletados de éguas com ovulações simples, ovulações
múltiplas espontâneas e de ovulações múltiplas induzidas (superovuladas) são
iguais. Dippert et al. (1994) observaram similares taxas de fertilidade entre
embriões de éguas superovuladas e não superovuladas, entretanto, outros
pesquisadores contradizem estes relatos (Woods & Ginther, 1984).
A migração dos grânulos corticais da membrana plasmática é usada para
avaliar o estágio final da maturação oocitária em mamíferos (Gran, 1989), e os
componentes do fluido folicular variam durante o crescimento e maturação do
folículo (Kenney et al., 1979; Watson & Hinrichs, 1988). Moor et al. (1985) e Loos
et al. (1991) relataram que o tratamento hormonal exógeno resulta na maturação
heterogênea de folículos e oócitos em mamíferos. Nas éguas, a qualidade
heterogênea de folículos e oócitos produzidos após o tratamento superovulatório,
pode explicar o baixo sucesso da taxa de múltiplos embriões (Bézard et al., 1995).
Hyttel et al. (1991) relataram que 37% dos oócitos recuperados de vacas
superovuladas sofrem maturação anormal comparado com apenas 11% em vacas
não superovuladas. Trinque et al. (1997) relataram três prenhezes oriundas da
colheita de três embriões de uma quádrupla ovulação.
Em um outro estudo, foi realizada uma análise ultra-estrutural de embriões
de éguas superovuladas e não superovuladas, sendo observado 95% de células
viáveis para o grupo superovulado e 90% para o grupo não superovulado (Landim-
Alvarenga et al., 2004). Estes autores concluiram que embriões de éguas
superovuladas têm a mesma viabilidade de embriões de éguas não
superovuladas, já que o teste de fertilidade resultou em 66% de prenhez para
embriões transferidos de éguas superovuladas.
Quanto ao período de retorno do cio pós-superovulação (17,99 e 15,04 dias
para as éguas superovuladas e não superovuladas) e a duração do estro (5,9 e
7,5 dias para as éguas superovuladas e não superovuladas) não há influência
Revisão de literatura
38
sobre a variável superovulatória (Douglas, 1979). Rosa et al. (1998) relataram que
éguas superovuladas com EPE e com o EPE purificado permaneceram 6,6 e 7,0
dias em estro, respectivamente e éguas do grupo não tratado 7,0 dias do ciclo
estral em estro, sendo o mesmo observado por Carmo (2003).
A primeira tentativa de superovulação em éguas foi realizada por um
pesquisador inglês (Day, 1940) utilizando tanto o PMSG quanto o hCG ou uma
combinação entre eles, e o extrato de pituitária eqüina (EPE) na dose de 800mg
subdividido em uma administração ao dia por um período de 5 dias. Todas as
tentativas para estimulação de múltiplos folículos foram acompanhadas de
insucesso.
Em 1974 foi publicado primeiro relato de uma indução de superovulação
com sucesso em éguas, por Douglas et al. (1974). Os autores induziram a
superestimulação ovariana com EPE parcialmente purificado em duas
administrações ao dia, de doses constantes por 14 dias consecutivos, em 29
éguas pôneis em sazonalidade anovulatória. Os resultados mostraram, que 25
(86%) das éguas tratadas obtiveram resposta a ativação ovariana, ocorrendo uma
ou mais ovulações, e quatro (14%) éguas continuaram apresentando inatividade
ovariana. Das éguas pôneis que ovularam, 58% apresentaram duas ou mais
ovulações.
Lapin & Ginther (1977) relataram que a administração do EPE uma vez ao
dia por um período de 14 dias, também induziu a atividade ovariana/ovulação em
11 de 11 éguas pôneis em sazonalidade anovulatória. A dose total administrada
foi equivalente a 3.3U NIH-FSH-S1 por Kg PV. Seis de 11 éguas receberam
2.000UI de hCG após a última administração do EPE. O número médio de
ovulações por éguas foi de 1,6; 1,8 e 0 para as éguas que receberam apenas
EPE; EPE+hCG e o grupo controle não tratado, respectivamente.
A indução a atividade ovariana/ovulação (ovulações simples) em éguas
pôneis anovulatórias, também foi demonstrada com a administração do GnRH
intervalado a cada 8h por 14 dias, mantidas em um manejo de 16h luz e 8h de
escuridão (Bailey & Douglas, 1977).
Revisão de literatura
39
O primeiro relato de ovulaçõs múltiplas em éguas cíclicas, foi publicado por
Lapin & Ginther (1977). Foram utilizadas 21 éguas pôneis subdivididas em três
grupos (estro, diestro e controle), onde receberam o EPE (2U NIH-FSH-S1) uma
vez ao dia, por seis dias via subcutânea, durante o 11
o
e 16
o
dia pós-ovulação ou
durante os dias 1
o
e 6
o
do estro. Duas ou mais ovulações ocorreram em quatro
das sete éguas em diestro e três das sete éguas tratadas durante o estro. Não
houve ovulações múltiplas em sete éguas controle. O número médio de folículos
na fase de diestro e de estro foram de 2,8 e 1,7 por éguas, respectivamente.
Douglas (1979) tratou oito éguas cíclicas com EPE, administrando uma
dose diária de 750 Fevold-Hisaw rat-units, via subcutânea durante os dias 14 e 20
pós-ovulação. Foram utilizados 4.000UI de hCG via subcutânea no último dia do
tratamento superovulatório. A dose administrada e o dia em que se iniciou o
tratamento superovulatório, foram baseados em resultados preliminares, entre as
doses diárias de 475 Fevold-Hisaw rat-units durante os dias 6-12 pós-ovulação,
750 Fevold-Hisaw rat-units durante os dias 10-16 pós-ovulação, 475 Fevold-Hisaw
rat-units durante os dias 12-18 pós-ovulação e 750 Fevold-Hisaw rat-units durante
os dias 14-20 pós-ovulação.
Os resultados do experimento do Douglas (1979) demonstraram que o
número de ovulações (2,3±1,0 e 1,0±0) e o número de éguas com mais de uma
ovulação (6/8 e 0/6) foi maior (p>0,05) em éguas tratada com EPE+hCG do que
nas controle. Houve duas éguas que não apresentaram ovulações múltiplas no
grupo EPE+hCG, resultando em ovulações simples. A maioria das ovulações
ocorreu no mesmo dia, onde somente uma égua apresentou sincronismo inter-
ovulatório de um dia.
Alguns autores têm relatado a necessidade da administração da PGF
2∝
se o
tratamento superovulatório for iniciado no diestro, com a finalidade do estro e das
ovulações estarem sincrônicas, porém se o tratamento for iniciado no final do
diestro, não há necessidade da administração da PGF
2∝
(Douglas, 1979; Woods &
Ginther, 1983).
Revisão de literatura
40
No experimento de Lapin & Ginther (1977) houve folículos que não
ovularam e se luteinizaram em éguas cíclicas, já no experimento de Douglas
(1979) todas as éguas superovuladas resultaram em ovulações.
Woods & Ginther (1983) relataram que a administração ou não do hCG, não
tem influência nas taxas de ovulações, porém o assincronismo entre as ovulações
é significativamente reduzido com a administração do hCG (0,0±0,0 e 1,4±0,4 dia,
respectivamente), ou seja, as ovulações múltiplas ocorreram no mesmo dia em
10/10 éguas tratadas com hCG comparado com 3/12 éguas não tratadas. Dippert
et al. (1994), descrevem que em éguas superovuladas, o intervalo entre a 1
o
e a
última ovulação é menor quando tratadas com hCG antes da 1
o
ovulação (0,0 dia)
do que éguas tratadas após 1
o
ovulação (1,8 dias).
Em uma avaliação retrospectiva de quatro experimentos, Woods & Ginther
(1983) relataram que 70% das éguas tratadas com EPE em fase cíclica resultaram
em ovulações múltiplas, 28% em ovulações simples e 2% resultaram em
inatividade ovariana. A média de ovulações múltiplas foi de 3,0/égua e o
sincronismo entre as ovulações de 1,2 dias.
Squires et al. (1986) compararam o EPE (750 Fevold Rat unit/S.C. uma vez
ao dia) e o FSH-p (150 mg/I.M. duas vezes ao dia) para a indução de ovulações
múltiplas em éguas cíclicas. O tratamento iniciou-se quando houve a presença de
um ou mais folículos maiores de 20mm de diâmetro (± 12 dias pós-ovulação), e
receberam também uma dose de PGF
2α
no início do tratamento, e 3.300UI de
hCG quando a maioria dos folículos chegou a um diâmetro de 35mm. Neste
experimento, foi observado que a taxa de ovulações foi maior para o tratamento
com EPE (2,2) em 13 de 18 éguas, comparado com quatro de nove éguas para o
tratamento com o FSH-p (1,6). O grupo controle obteve uma taxa de 1,0
ovulação/égua.
Squires et al. (1987b) verificaram o efeito do extrato de pituitária na indução
das ovulações múltiplas e na recuperação de embriões em 28 éguas cíclicas. Foi
administrada uma dose diária de 750 Fevold Rat unit em uma única administração,
iniciando o tratamento no 12
o
dia do ciclo estral e terminando quando dois ou mais
folículos atingiram um diâmetro de 35mm. Após o término do tratamento, foram
Revisão de literatura
41
administradas 3.300UI de hCG via endovenosa e realizadas as inseminações
artificiais diariamente com 250x10
6
de espermatozóides móveis, até o
desencadear das ovulações. Os resultados apresentaram uma média de 3,8
ovulações/égua (26/28 éguas) e 2,0 embriões recuperados no grupo
superovulado, contra 1,2 ovulações/égua (5/40 éguas) e 0,65 embriões
recuperados para o grupo controle (não superovulado). Obteve um sincronismo
inter-ovulatório de “0” (zero) dias em 84% das éguas, e 1 a 2 dias em 16% das
éguas tratadas. O período médio da administração do EPE foi de 5,5 dias. Neste
mesmo experimento, foi relatado que quanto maior o número de corpos lúteos,
maior é o nível de progesterona, visto que, durante um período de sete dias pós-
ovulação foram coletadas amostras de sangue para a dosagem de P4, obtendo
uma média significativa para éguas com ovulações duplas (55,2 ± 10,2ng) em
relação às de ovulações simples (44,6±11,4ng).
O diâmetro médio dos embriões coletados desse trabalho foi similar entre
os grupos superovulados e controle quando as colheitas foram realizadas no 6
o
dia pós-ovulação (0,177 e 0,213mm, respectivamente), porém quando os
embriões foram coletados no 8
o
dia pós-ovulação os embriões das éguas
superovuladas apresentavam-se menores do que os das éguas do grupo controle
(0,567 e 0,903, respectivamente). Apesar das variações entre os diâmetros dos
embriões coletados em diferentes tratamentos e períodos, foi relatado que todos
foram viáveis a serem transferidos (Squires et al., 1987b).
A resposta superovulatória ao tratamento com o EPE, parece estar
relacionada com o tamanho do folículo no início do tratamento; as éguas em fase
de anestro (transicional) o melhor resultado se deu na presença de um folículo de
30 mm de diâmetro; já em éguas cíclicas, a melhor resposta foi quando a
população dos folículos apresentou uniformes e o maior destes foi de no máximo
25mm de diâmetro (McCue, 1996).
A supressão do desenvolvimento folicular antes do tratamento
superovulatório tem sido investigada, com o intuito de identificar o dia da seleção
do folículo ovulatório (Pierson & Ginther, 1990). Neste experimento, os autores
utilizaram 36 éguas em fase cíclica, subdivididas em quatro grupos, em relação ao
Revisão de literatura
42
diâmetro folicular (15mm; 20mm; 25mm; 30mm). As éguas foram avaliadas pela
ultra-sonografia transretal, onde ao ser observado um corpo lúteo, foi administrado
10mg de PGF
2α
e mantida com a administração diária de estrógeno (10mg) e
progesterona (150mg) por um período máximo de 10 dias. O término da
administração do estrógeno e da prostaglandina, e o início do tratamento
superovulatório com EPE, foram adequados em relação ao diâmetro dos folículos
presentes (15mm; 20mm; 25mm; 30mm). A dose diária administrada do EPE foi
de 750 Fevolt – Hishow rat units por via subcutânea, sendo previamente filtrada
com o auxílio de um microfiltro de 0,22µm. O tratamento superovulatório foi
encerrado quando a maioria dos folículos apresentou 35mm de diâmetro ou
quando ocorreu uma ovulação.
Os resultados deste experimento demonstraram que o tempo médio entre o
final do tratamento com estrógeno mais progesterona e o início da administração
do EPE em relação aos grupos (15mm; 20mm; 25mm e 30mm), foi de 1,3; 5,8; 7,7
e 11,0 dias, respectivamente; o período médio de tratamento com EPE foi de 8,7;
6,3; 3,2 e 1,7 dia, respectivamente, e o número médio de folículos >30mm foram
de 2,5; 2,2; 1,2 e 0,8 folículos, respectivamente. Os autores observaram em um
grupo de éguas com apenas a administração do estrógeno mais progesterona,
que o número médio de folículos >30mm, foram iguais aos das éguas
superovuladas do grupo 30mm (0,8 folículo). Ocorreram ovulações de folículos
apresentando um diâmetro menor que 30mm (uma égua no grupo 20mm; duas
éguas no grupo 25mm; e duas éguas no grupo 30mm) (Pierson & Ginther, 1990).
Uma melhor resposta superovulatória foi observada por Carmo (2003) em
éguas que apresentaram folículos entre 10 e 20mm no início do tratamento, sendo
semelhante ao observado por Pirson & Ginther (1990) que relataram quanto
maiores forem as diferenças entre o diâmetro dos dois maiores folículos no início
do tratamento superovulatório com EPE, menor vai ser a resposta superovulatória.
Um achado importante discutido por Carmo (2003), é pelo fato do
percentual de ovulações entre os folículos de 10 a 20mm ter sido maior para o
grupo tratado em dose decrescente (61%) que em dose constante (47%). Este
pode ter relação com o desenvolvimento e a maturação folicular, por haver a
Revisão de literatura
43
necessidade de um maior nível de FSH no início do tratamento superovulatório do
que no final do mesmo, como observado por Ginther et al. (1996) em vacas.
Monniaux et al. (1983) também relataram uma melhor resposta superovulatória em
vacas, quando foram realizadas as administrações em doses decrescentes de um
produto com altos níveis de LH em seu composto, atribuíndo-se ao propósito da
necessidade de um maior nível de FSH no início do tratamento superovulatório de
que no final do mesmo.
Quando os folículos maiores do que 20mm de diâmetro começam a
decrescer e o diâmetro do maior e do segundo maior folículo da onda começam a
divergir, é indicativo que a seleção fisiológica do folículo ovulatório ocorreu
(Pierson & Ginther, 1990). A seleção do folículo dominante é manifestada durante
o intervalo interovulatório, que é de aproximadamente seis dias antes da ovulação,
quando o maior folículo apresenta uma média de 29,4mm (Pierson & Ginther,
1990). Tem sido hipoteizado que o recrutamento do folículo a ser ovulado, ocorre
aproximadamente 12 dias antes da ovulação (Driancourt & Palmer, 1984).
Em um estudo mais recente, foi averiguado qual o melhor momento para se
iniciar o tratamento superovulatório com EPE em éguas cíclicas (Orlandi et al.,
2006). Estes autores aspiraram todos os folículos ≥8mm ao 10
o
dia pós-ovulação
e iniciaram o tratamento com EPE (12,5mg, IM a cada 12h) segundo os grupos: 1)
foliculos 13mm (EPE); 2) folículos 20mm (EPE); 3) folículos 23mm (EPE); 4)
folículos 26mm (EPE); 5) folículos 13mm (solução fisiológica). Doze horas após o
inicio do tratamento, foi administrado 7,5mg de PGF
2α
, e quando a maioria dos
folículos atingiu 32mm o tratamento foi interrompido e ao atingirem 35mm de
diâmetro foi induzida a ovulação com 2.500UI hCG. Os resultados obtidos neste
experimento para os grupos 1, 2, 3, 4 e 5 foram: número de folículos ≥30mm 1,6;
1,8; 2,1; 1,2; 1,1, respectivamente aos grupos; número de ovulações 1,6; 1,8; 2,1;
1,2; 1,1, respectivamente.
As proporções de éguas com ≥2 ovulações desse experimento foram:
50%; 60%; 71%; 16%; 14%, respectivamente; o número de dias de tratamento foi
5,5; 3,8; 2,7; 2,4; 5,5. Foi detectado que o melhor momento para se iniciar o
Revisão de literatura
44
tratamento superovulatório é quando os folículos estão com o diâmetro entre 20-
23mm, ou seja antes ou durante o momento esperado do desvio folicular.
Hofferer et al. (1991) usando um protocolo de superovulação com EPE,
associado ou não a somatotrofina suína, concluíram que a adição desta não altera
a taxa de ovulações. Bruck & Lehn-Jensen (1997) apresentaram a proposta de
utilizar a somatotrofina eqüina com o intuito de aumentar a produção do fator de
crescimento Insulina-Like (IGF-1) que tem a finalidade de estimular o
desenvolvimento folicular. Os autores observaram que o aumento de IGF-1 não
aumentou o diâmetro médio dos folículos, e que não houve alterações nos níveis
de estradiol, progesterona e LH durante ou imediatamente após o tratamento.
Dippert et al. (1994) estudaram a taxa de fertilidade em éguas
superovuladas e em éguas com ovulações simples e múltiplas espontâneas.
Foram utilizadas 28 éguas cíclicas de 3 a 15 anos de idade, subdivididas em dois
grupos (superovulados e não superovulados). O tratamento superovulatório
iniciou-se no 5
o
dia pós-ovulação, com a administração de 40mg de EPE via
intramuscular uma vez ao dia. A PGF
2α
, foi aplicada no 1
o
e 2
o
dia da
administração do EPE. O tratamento com EPE foi interrompido quando a maioria
dos folículos apresentou um diâmetro ≥35 mm ou uma ovulação, onde então
foram administrados 3.300UI hCG. As inseminações artificiais foram realizadas
diariamente após a administração do hCG, utilizando 1x10
9
de espermatozóide
com motilidade progressiva. Dois dias após a última ovulação, os ovários e os
ovidutos foram removidos, das éguas, via laparotomia com acesso ao flanco.
Os resultados destes autores demonstraram uma maior taxa de ovulações
para o grupo tratado com EPE (3,6) do que para o grupo controle não
superovulado (1,1). O intervalo entre a 1
o
e a última ovulação foi similar entre os
grupo tratado e não tratado (0,3 e 0,0 dias, respectivamente) e o período de
tratamento com EPE foi de seis dias. Um maior percentual de éguas teve
ovulações múltiplas quando tratadas com EPE do que no grupo controle (92,9%
“13/14” éguas e 21,4% 3/14 éguas, respectivamente). O percentual de corpo lúteo
(CL) resultante das ovulações foi similar entre os grupos tratados (92,7% “51/55”)
e não tratado (94,1% 16/17). Cinco CL foram formados pela luteinização
Revisão de literatura
45
espontânea de folículos sem ovulação (04 CL do grupo tratado e 01 CL do grupo
não tratado). Um maior número de embriões foi recuperado de éguas
superovuladas do que das éguas controle (2,0 e 0,7, respectivamente). Entretanto,
o percentual de ovulações, resultando em embriões foi similar entre os grupos
tratados e não tratado (57,1% 28/49 e 62,5% 10/16).
Estes mesmos autores relatam que não há diferença na taxa de
recuperação de oócitos não fertilizados do oviduto de éguas tratadas com EPE e o
grupo controle não tratado. Foram recuperados 46 oócitos não fertilizados, sendo
41 classificados como oócitos de ciclos anteriores (19 oócitos de éguas tratadas
com EPE e 22 oócitos de éguas controle) e cinco aparentando ser do presente
ciclo experimental (04 oócitos das éguas tratadas com EPE e 01 oócito do grupo
controle). Baseado no total de cinco oócitos não fertilizados e 28 embriões
recuperados do presente ciclo experimental foi observado um percentual de 87,5%
(28/32) e 90,9% (10/11) de oócitos fertilizados entre o grupo tratado com o EPE e
o grupo controle respectivamente. Dentre os 34 embriões recuperados, foram
observados dois dias após a última ovulação, diferentes números de blastômeros
entre o grupo superovulado (01 embrião com 02 células; 13 embriões com 04
células; 01 embrião com 06 células e 13 embriões com 08 células) e o grupo não
superovulado (01 embrião com 04 células e 05 embriões com 08 células).
Bezard et al. (1995) estudaram o número de oócitos recuperados entre
éguas pôneis superovuladas (tratamento longo e curto) e não superovuladas
(controle) em fase cíclica, com idade de quatro a 17 anos, e 230 a 370kg de peso
vivo. O grupo do tratamento longo iniciou o tratamento superovulatório no 8
o
dia
pós-ovulação e terminar com a presença de dois ou mais folículos ≥35mm de
diâmetro; já o grupo do tratamento curto, iniciou-se com a presença de folículos
com o diâmetro de no máximo 17mm, e terminou quando dois ou mais folículos
apresentaram 25mm de diâmetro. A dose administrada do EPE foi de 0,75mg uma
vez ao dia. A PGF
2∝
foi administrada no 7
o
e 8
o
dia pós-ovulação para ambos os
grupos, e a indução da ovulação foi de 25mg do EPE via intravenosa. A punção
folicular foi realizada entre 34 e 35h pós-indução das ovulações. Os autores
obtiveram uma média de 1,09 folículos no grupo controle, 2,29 para o tratamento
Revisão de literatura
46
longo e 2,8 para o tratamento curto. Quarenta e seis oócitos foram recuperados de
68 folículos pré-ovulatórios. A taxa de recuperação de oócito por folículo aspirado
não apresentou diferença significativa entre os grupos controle (79%) e os grupos
superovulados (61%), também não houve diferença entre os tratamentos longo e
curto (50% e 68%, respectivamente). Já o número de oócitos por ciclo, foi
significativamente menor no controle do que no superovulado (0,66 e 1,17 oócitos,
respectivamente), com uma tendência (p=0,06) para um maior número de oócitos
recuperados no tratamento curto (1,58 oócitos) em relação ao tratamento longo
(0,73 oócitos).
Rosas et al. (1998) compararam a eficiência de uma fração enriquecida de
FSH eqüino (60,8µg de FSH/mg e 11,5µg de LH/ng) com o EPE (68,3µg de
FSH/mg e 97,0µg de LH/ng) na indução de ovulações múltiplas e na taxa de
embriões recuperados em 10 éguas durante a estação ovulatória. A dose diária
administrada para ambos os grupos foi de 25mg via intramuscular, iniciando o
tratamento no 6
o
dia pós-ovulação, e encerrando o mesmo quando dois ou mais
folículos apresentaram um diâmetro ≥35mm, sendo em seguida administrados
25mg de EPE via intravenosa para induzir as ovulações. No 1
o
e no 2
o
dia de
tratamento foram administrados 250µg de cloprostenol. As inseminações artificiais
foram realizadas diariamente após a indução das ovulações com 500X10
6
de
espermatozóides. Neste experimento o número médio de administrações do
hormônio folículo estimulante eqüino (eFSH) e do EPE foram de 7,6 e 8,0 dias
respectivamente, e o intervalo do início do tratamento à 1
a
ovulação (p>0,05) foi
de 10,4 e 10,2 dias, respectivamente. Não houve diferença significativa entre a
proporção de éguas com duas ou mais ovulações em resposta ao tratamento com
eFSH (0,8) e EPE (0,8), porém a proporção de ambos os grupos tratados foi maior
do que no grupo controle (0,0). O número de ovulações por égua também foi
maior para os grupos eFSH (4,6) e EPE (3,6) (p>0,05), do que no grupo não
superovulado (1,0) (p<0,05).
Estes pesquisadores observaram, que o número de embriões recuperados
por égua superovulada foi similar entre os grupos eFSH e EPE (2,0 e 2,0,
respectivamente), sendo superiores ao grupo não tratado (0,4 embrião). O
Revisão de literatura
47
diâmetro do maior folículo pré-ovulatório foi de 38,0mm; 38,1mm e 36,4mm para
os grupos eFSH; EPE e controle não superovulado, respectivamente. As
ovulações ocorreram 48h após a administração de 25 mg de EPE via intravenosa.
Em um recente experimento, foi avaliado o uso do eFSH para induzir o
desenvolvimento folicular e a ovulação em éguas durante a fase de transição de
primavera. Vinte e oito éguas, de 3 a 15 anos, foram examinadas durante os
meses de agosto e setembro de 2003 com ultra-som por duas semanas antes do
início do experimento, para determinar se elas estavam em transição (nenhum
folículo maior que 25mm e nenhum corpo lúteo presente). Após este período,
conforme as éguas apresentam pelo menos um folículo maior ou igual a 25mm,
elas foram distribuídas alternadamente em um dos dois grupos: grupo controle
(não tratado) e grupo tratado com 12,5mg de eFSH, duas vezes ao dia, até que a
maioria dos folículos maiores que 30 mm alcançassem 35mm. A atividade folicular
de todas as éguas foi acompanhada (Peres, 2004).
Quando a maior parte dos folículos das éguas tratadas e o folículo das
éguas do grupo controle adquiriram um tamanho pré-ovulatório (35mm), foram
administradas 2.500UI de hCG, via intravenosa, para induzir a ovulação. A partir
deste momento as éguas foram inseminadas com sêmen fresco, em dias
alternados, até a ovulação. Os exames ultra-sonográficos continuaram até a
detecção das ovulações e a recuperação embrionária foi realizada sete a oito dias
após a ovulação. As éguas do grupo tratado apresentaram o primeiro folículo pré-
ovulatório e ovularam mais cedo do que as éguas não tratadas (6,57 vs 18 dias).
Entretanto, elas levaram mais tempo para a segunda ovulação (22,36 vs 10,92
dias) após a coleta de embrião e administração do luteolítico (Peres, 2004).
O período médio de tratamento foi de 4,79 ± 1,07 dias e 85,71% das éguas
tiveram múltiplas ovulações. O número de ovulações (5,57 vs 1,0) e de embriões
(2,0 vs 0,69) por égua foi superior para as éguas tratadas em comparação as
éguas controle. Porém, o número de embriões por ovulação, foi similar entre os
grupos (0,44 vs 0,69). O padrão de crescimento folicular também foi diferente
entre os dois grupos. Oitenta e nove por cento dos embriões oriundos das éguas
superovuladas mostraram-se viáveis após uma análise inicial, considerando-se
Revisão de literatura
48
que foram recuperados três embriões completamente degenerados. As éguas do
grupo tratado com múltiplas ovulações tiveram um aumento expressivo da
quantidade de progesterona, em relação às éguas com apenas uma ovulação.
Pode-se concluir que o tratamento com eFSH foi eficiente em antecipar a primeira
ovulação do ano e em promover múltiplas ovulações, além de permitir a
recuperação de embriões viáveis (Peres, 2004).
O perfil hormonal de éguas superovuladas com eFSH foi comparado por
Machado et al., (2005) com éguas não superovuladas (controle), sendo observado
que a concentração plasmática de estradiol ao longo do tratamento
superovulatório apresentou-se semelhante ao grupo controle, porém as
concentrações do grupo tratado foram superiores ao controle nos dias -4, 0, 1 e 2
(dia 0 = ovulação). As concentrações plasmáticas de progesterona não
apresentaram diferença estatística entre os dois grupos avaliados durante o
período de tratamento e ovulação, permanecendo baixas (menores a 1ng/mL).
A elevação das concentrações de estradiol observadas no grupo
superovulado desse trabalho corresponde ao aumento do número de folículos pré-
ovulatórios e demonstrando sua competência esteroidogênica. O aumento
significativo das concentrações de inibina do grupo tratado em relação ao controle,
observado a partir do dia -7 pode estar relacionada com o aumento da população
de folículos durante a onda, e o seu pico observado no dia da ovulação está
relacionada ao número de ovulações, já que este hormônio aumenta durante a
ovulação possivelmente em resposta ao extravasamento do fluido folicular para a
cavidade abdominal (Machado et al., 2005).
Baseado em prévios estudos onde o aumento da taxa superovulatória em
éguas foi obtido quando houve um aumento na dose diária de EPE (Woods &
Ginther, 1982), associado com o melhor resultado obtido em vacas quando foi
aumentada a freqüência da administração do FSH (Monniaux et al., 1983),
Alvarenga et al., (1999) propuseram o tratamento com EPE duas vezes ao dia,
relatando uma melhor resposta superovulatória em éguas utilizando o EPE em
duas administrações ao dia.
Revisão de literatura
49
Neste experimento, os autores visando aumentar a resposta
superovulatória em éguas cíclicas, compararam a administração do EPE em uma
e duas aplicações ao dia e relataram que 25mg do EPE administrados duas vezes
ao dia, iniciando o tratamento no mesmo dia da injeção da PGF
2α
(entre os dias
seis e oito do diestro) e encerrando quando a presença de folículos ≥35mm de
diâmetro, induz uma resposta superovulatória significativamente maior do que a
administração uma vez ao dia (6,1 e 2,0 folículos/ciclo respectivamente), contudo
o índice de recuperação dos embriões foi insatisfatório.
Em um experimento subseqüente, Alvarenga et al. (2001) utilizando o
mesmo protocolo, porém iniciando o tratamento superovulatório com folículos
≤20mm de diâmetro, constataram uma melhor resposta superovulatória e um
maior número de embriões recuperados. O número de ovulações foi de 1,2 para
os ciclos controle não tratados, 2,4 e 7,1 para os grupos tratados com a
administração do EPE uma e duas vezes ao dia, respectivamente. O número de
embriões recuperados por égua foi de 1,6 e 3,5 para os grupos tratados uma e
duas vezes ao dia, respectivamente. Os dias de tratamento e o intervalo do início
do mesmo à primeira ovulação foram em média de 6,6 e 8,3 dias,
respectivamente. Não havendo diferença entre o percentual de embriões
recuperados por ovulações entre os diferentes tratamentos (69% e 49% para os
grupos tratados uma e duas vezes ao dia, respectivamente).
Seguindo a mesma linha de pensamento, Scoggin et al. (2002) estudaram
em 58 ciclos de diferentes éguas, o efeito do aumento da freqüência ou da dose
do EPE. Foram administradas 25mg 1x/dia, 50mg 1x/dia, 12,5mg 2x/dia e 25mg
2x/dia por um período médio de 7,2; 6,1; 8,2 e 7,0, dias, respectivamente, sendo
que o início do tratamento ocorreu no quinto dia do diestro, e a administração da
PGF
2α
no sétimo dia do diestro. O número médio de ovulações por égua e o
percentual de éguas com maior ou igual a duas ovulações foram de 3,4 e 80%; 4,4
e 100%; 3,4 e 60%; 4,7 e 90%, respectivamente. O número médio de embriões
por égua e o percentual de embriões recuperadas por ovulações foi de 1,2 e
35,3%; 1,5 e 36,4%; 2,6 e 67,6%; 2,1 e 43,2%, respectivamente.
Revisão de literatura
50
Os mesmos autores também verificaram o efeito da administração do EPE
duas vezes ao dia em doses decrescentes. A dose do EPE foi iniciada com 35mg
por administração, decrescendo a mesma em 10mg ao dia, mantendo as ultimas
10mg de tratamento por um período médio de 6,7 dias. O número de folículos
≥35mm de diâmetro e o número de ovulações por égua foram de 4,0 e 3,3,
respectivamente. O percentual de éguas com ≥2 ovulações foi de 88,9%; o
número de embriões recuperados por égua foi de 2,3; o percentual de embriões
recuperados por ovulações e o percentual de éguas com ≥2 embriões
recuperados foram de 60% e 75%, respectivamente.
No primeiro estudo de Scoggin et al. (2002) o EPE apresentou em seu
composto um nível de 1,41mg eFSH/mL e 3,37mg eLH/mL; já no segundo estudo
estes níveis foram de 2,01mg eFSH/mL e 5,95mg eLH/mL. Carmo (2003) relata
que no EPE há 60% de LH e 40% de FSH.
Na tentativa de induzir ovulaçõe múltiplas em éguas com a administração
de baixas doses de EPE, Farinasso et al. (2005), compararam a administração
diária de 6mg (EPE), 8mg (EPE), e a administração duas vezes ao dia de 4mg
(EPE) iniciando-se o tratameto entre o 6 e 9 dia pós-ovulação, e interrompendo
quando a maioria dos folículos atingiram 35mm de diâmetro. O percentual de
éguas com ≥2 ovulações foi de 54%; 60% e 63%, respectivamente para os grupos
tratados com EPE 4mg/IM/2xdia; 6mg/IM/1xdia e 8mg/IM/1xdia; e o número médio
de embriões recuperados foi 0,94; 1 e 1, respectivamente aos grupos sitados
anteriormente.
O mesmo foi encontrado por Rocha Filho et al. (2005), quando avaliaram o
efeito da administração de baixas doses de EPE (4mg/IM/1xdia), eFSH
(5mg/IM/1xdia) e controle (solução fisiológica) nas taxas de ovulações e
recuperação de embriões em éguas. O tratamento foi iniciado no oitavo dia pós-
ovulação e interrompido quando a maioria dos folículos atingiu o diâmetro de
35mm, administrando então 2.500UI hCG. O número médio de ovulações foi de
1,36; 1,64 e 1,18, respectivamente, o número médio de embriões foi de 1,0; 1,0 e
0,63 respectivamente. A taxa de recuperação embrionária em função do número
Revisão de literatura
51
de ovulações entre os grupos EPE e eFSH foi de 87,5% e 60,8%; já o percentual
de embriões recuperados por lavado foi de 127,3% e 100%, respectivamente.
Na tentativa de compreender melhor a baixa taxa de recuperação
embrionária, Carmo (2003) procurou minimizar o efeito deletério do LH, através da
administração do EPE duas vezes ao dia em doses decrescentes, tendo como
grupo controle a administração do mesmo em doses constantes, assim como
relatado por Alvarenga et al. (1999 e 2001). Neste experimento, foi hipotetizado
que poderia haver uma melhor recuperação de embriões em conseqüência da
diminuição dos níveis circulantes de LH no processo final da superovulação,
baseado na observação de Monniaux et al. (1993) na espécie bovina, que
constataram uma melhora significativa na taxa de ovulações e de embriões
recuperados quando administraram um produto com altos níveis de LH em doses
decrescente.
Um outro trabalho seguindo a mesma linha de raciocínio foi relatado por
Alvin et al., (2000), onde observaram que o Pluset
, produto comercial com altas
concentrações de LH, apresenta uma menor taxa de embriões recuperados e de
embriões viáveis em bovinos (15,3 e 6,8, respectivamente) quando comparado
com um outro produto comercial, Foltropin
, que apresenta baixos níveis de LH
em seu composto (16,5 e 9,7, respectivamente).
Os valores encontrados por Carmo (2003) quando comparado os grupos
doses constantes e doses decrescentes, foram de 3,5 e 5,0 ovulações e 1,2 e 1,8
embriões recuperados, obtendo um percentual de embriões recuperados de
30,2% e 37,8%, respectivamente, não sendo observadas diferenças significativas.
Entretanto, as diferenças numéricas foram evidentes entre os tratamentos
superovulatórios; provavelmente o pequeno número de animais tenha interferido
nos resultados. Este mesmo autor, utilizando como modelo experimental
hamsters, demonstrou que doses constantes de EPE induzem a luteinização dos
folículos, inibindo a liberação do oócito.
Carmo (2003) observou uma melhor resposta superovulatória, contudo
baixos índices de recuperação embrionária quando as aplicações foram mais
freqüentes com o EPE. O mesmo foi observado por outros autores, onde
Revisão de literatura
52
relataram uma melhora no percentual de ovulações múltiplas em éguas
superovuladas com a administração do EPE duas vezes ao dia (4 a
7ovulações/égua), entretanto com baixa taxa de recuperação embrionária
(Alvarenga et al., 2001; Scoggin et al., 2002; Carmo et al., 2002b).
Baseando-se nos estudos com bovinos, foi demonstrado que alto nível de
LH presente no preparado superovulatório afeta adversamente a resposta
ovariana, a taxa de fertilidade e a qualidade dos embriões, fazendo-se necessária
a administração gradativa do FSH e LH em doses decrescentes ao invés de doses
constantes, na tentativa de minimizar os danos na maturação folicular e oocitária
(Monniaux et al., 1983).
Hyttel et al. (1989 e 1991), relataram uma assincronia entre a maturação
citoplasmática e nuclear nos oócitos de vacas superovuladas, supondo ser
conseqüência da assincronia intrafolicular causada pelo variável e baixo suporte
sangüíneo entre os folículos superestimulados.
Em um estudo mais recente, Carmo et al. (2006) ao coletar oócito do
oviduto de éguas superovuladas, encontraram uma grande quantidade de coágulo
sanguíneo na fossa de ovulação, e lançaram uma questão se este poderia estar
impedindo que o oócito migrasse para o oviduto, já que o mesmo não foi
observado em éguas controle com ovulações simples.
A superovulação na espécie eqüina açoita a entusiasmada cosmovisão
científica de alguns pesquisadores. Entretanto, é uma biotécnica que fascina o
intelecto de vários estudiosos (Day, 1940; Douglas et al, 1974/1979; Lapin &
Ginther, 1977; Woods & Ginther, 1983; Squires et al., 1987a; Palmer et al., 1993;
Dippert et al., 1994; McCue, 1996; Rosas et al., 1998; Alvarenga et al. 1999 e
2001; Scoggin et al., 2002; Carmo et al., 2006) que buscam desvendar uma das
mais empolgantes charadas da fisiologia da reprodução eqüina.
3.3. Superovulação em ruminantes
A superovulação é um elemento chave na biotecnologia da transferência de
embriões, sendo estudada desde 1940 na espécie bovina com o intuito de
Revisão de literatura
53
estimular, através da administração de hormônios gonadotróficos, o
desenvolvimento de um maior número de folículos antrais que normalmente
sofreriam atresia (Casida et al., 1940).
Um grande número de pesquisadores tem procurado desde o final da
década de 80 um melhor entendimento da dinâmica folicular (Savio et al., 1988;
Ginther et al., 1989) com o propósito de compreender alguns dos eventos que
ocorrem durante a superovulação. No entanto, ainda não existe um protocolo
satisfatório que permita eliminar, ou mesmo, reduzir de forma significativa as
variáveis que afetam a resposta superovulatória em bovinos (Gonsalves et al.,
2002).
Moor et al. (1984) relataram que o tratamento superovulatório em vacas
pode causar distúrbios que afetam a maturação folicular e oocitária, diminuindo o
número de oócitos normais ovulados e conseqüentemente o número de embriões
viáveis.
Em um estudo realizado por Adams et al. (1993), foram avaliadas 2.048
colheitas de embriões em diferentes vacas, chegando a uma média de 11,5
oócitos/embriões e 6,2 embriões transferíveis por vaca. Os mesmos autores
relataram que em média 24% das colheitas de embriões em vacas não resultam
em embriões, 64% das vacas doadoras produzem menos embriões viáveis
(transferíveis) que a média (4 – 6 embriões/vaca) e que 30% das colheitas
produzem um total de 70% de embriões transferíveis. Nogueira (2001) observou
em seu experimento que 43% das vacas Nelore superovuladas apresentaram uma
baixa taxa de embriões transferíveis ou nenhum embrião tranferível.
O número de corpos lúteos e o nível plasmático de progesterona podem
estar correlacionados (Monniaux et al., 1983), mas não o suficiente para afirmar
precisamente o número de estruturas lúteas (Saumande, 1981).
A baixa resposta superovulatória e a baixa recuperação de embriões viáveis
por colheita ainda podem estar relacionados a fatores individuais (raça, causas
genéticas ou fisiológicas, estado nutricional, estação do ano e repetições
sucessivas de tratamento superovulatório) e a fatores relacionados ao tratamento
superovulatório (momento de se iniciar o tratamento com relação ao ciclo estral,
Revisão de literatura
54
tipo de gonadotrofina utilizada, relação FSH e LH nos preparados, duração do
tratamento, dose de gonadotrofina e a via de administração) (Ginther et al., 1989;
Totey et al.,1989; Gonzales et al., 1990; Carbodevila & Torquatis, 1991; Adams et
al., 1992; Bo et al; 1993; Armstrong, 1993; Pérez, 1996).
Os fatores individuais relacionados à raça estão presentes entre os Bos
indicus e os Bos taurus, havendo uma maior predisposição a uma melhor resposta
superovulatória para as raças Bós taurus; porém, variações individuais podem
existir, como é o caso do Bós taurus por apresentarem uma maior dificuldade na
colheita dos embriões em conseqüência às características anatômicas do trato
genital (Carbodevila & Torquatis, 1991). Chupim et al. (1987), sugerem que em
vacas Holandesa requer um extrato mais purificado do que em vacas Charolês.
Os animais que não respondem aos estímulos superovulatórios ou o fazem
de forma débil, tendem a não responder aos tratamentos subsequentes. O inverso
ocorre em vacas com boa resposta superovulatória apresentando resultados
favoráveis aos próximos tratamentos superovulatórios (Kohram et al., 1995). Estes
fatores genéticos e fisiológicos também foram relatados por Armstrong (1993)
onde este observou uma grande variação entre as vacas e suas linhagens, porém
o número de folículos foi similar no início do tratamento para as vacas com alta ou
baixa resposta superovulatória.
O estado nutricional das vacas também pode influenciar na resposta
superovulatória, na taxa de ovulação e na fertilidade, sendo necessário um
metabolismo basal positivo como a ingestão de rações com alto valor energético,
resultando na estimulação dos centros hipotalâmicos e consequentemente na
ativação ovariana (Carbodevila & Torquiatis, 1991; Bó et al., 1994).
Quanto aos fatores individuais envolvidos na estação do ano, Chupin et al.
(1984 e 1987) observaram em vacas da raça Brahman que na época do verão
(fevereiro) a resposta superovulatória e o número de embriões viáveis são
significativamente maiores que no inverno (julho), apresentando uma média de
19,2/5,9 corpos lúteos e 9,6/1,6 embriões recuperados, respectivamente.
O momento do ciclo estral mais propício para se iniciar o tratamento
superovulatório, é baseado em dados obtidos de vários experimentos científicos
Revisão de literatura
55
assim como dados de técnicos a campo, sugerindo ser iniciado entre o 8
o
e 12
o
dia
pós-ovulação (Lindsell et al., 1986).
Os preparados utilizados nas tentativas superovulatórias em vacas são
baseados em três tipos de gonadotrofinas de origem natural: as gonadotrofinas do
extrato de pituitária de animais domésticos (suíno, ovino, eqüino, bovino),
gonadotrofina coriônica eqüina (eCG) ou gonadotrofina do soro da égua prenhe
(PMSG) e a gonadotrofina da menopausa humana (hMG) (Boland et al., 1978;
Carbodevila & Torquati., 1991; Wright & Malmo., 1992; Mantovani et al., 1994).
As gonadotrofinas do extrato de pituitária de origem animal, são
encontradas em produtos comerciais com diferentes nomes (Folltropin-V
®
;
Ovaset
®
; Pluset
®
, Ovagem
®
, Superov
®
) e apresentando em suas bases, diferentes
concentrações de LH em relação às concentrações de FSH (±15%LH, ±5%LH,
±50%LH, 0%LH, 0%LH respectivamente) (Bó et al., 2000).
O eCG/PMSG é apresentado comercialmente como Novormon
®
5000,
Folligon
®
, Intergonam
®
e Pregmagon
®
, onde são constituídos de atividades
variáveis de FSH e LH no preparado em conseqüência do estágio da gestação
quando o soro for colhido das éguas (Murphy et al., 1984).
A superovulação em vacas é usualmente induzida pelo extrato de pituitária
de origem animal (FSH) (Alfuraiji et al., 1993; Barros & Nogueira, 1997). A
gonadotrofina coriônica eqüina (eCG) ou a gonadotrofina do soro da égua prenhe
(PMSG) tem sido associada com um menor número de embriões transferíveis em
comparação às vacas tratadas com FSH (Elsden et al., 1978).
Monniaux et al. (1983) compararam a resposta superovulatória entre o
preparado de FSH/LH e o PMSG em vacas Charolais. Neste estudo foi observado
uma maior taxa de ovulações e embriões transferíveis em vacas oriundas do
tratamento superovulatório com o preparado do FSH/LH duas vezes ao dia por um
período de quatro dias (11,1 e 4,4, respectivamente) quando comparado com a
administração de PMSG em dose única (8,1 e 3,3, respectivamente).
Quanto à freqüência na administração do FSH, é sugerido ser administrado
duas vezes ao dia em oito aplicações, em conseqüência da vida média circulante
Revisão de literatura
56
deste hormônio ser curta (±5h) para a estimulação ovariana, mas ainda
permanecendo na circulação por ±12h (Laster, 1972).
Já o eCG/PMSG é um complexo glicoproteico com uma vida média
estimulatória ovariana prolongada (±40h), fazendo-se necessária apenas uma
administração para eliciar a resposta superovulatória em vacas (Bó et al., 1994).
Gonsalves et al. (2002) relatam que a vida média do eCG/PMSG varia de 8 a 14
dias.
Estudos que comparam a freqüência na administração de FSH uma ou
duas vezes ao dia, foram demonstrados por Boland & Roche (1992), havendo um
maior número de embriões recuperados em vacas quando foi administrado duas
vezes ao dia (8,8 embriões) em comparação a uma vez ao dia (5,0 embriões),
confirmando a curta vida média do FSH, fazendo-se necessária a administração a
cada 12h para que os níveis séricos desta gonadotrofina sejam mantidos,
permitindo a ação superovulatória desejada (Laster, 1972; Gonsalves et al., 2002).
O mesmo foi relatado por Monniaux et al. (1983), quando compararam a
freqüência da administração do FSH/LH em uma (T1), duas (T2) e três (T3) vezes
ao dia por quatro dias, divididas em doses iguais. Os resultados demonstraram
que a administração do FSH/LH duas e três vezes ao dia foram superiores a
administração de uma vez ao dia, obtendo uma média de ovulações, embriões
recuperados e embriões transferíveis de 10,2; 6,7 e 5,1, respectivamente para
(T2); 10,0; 6,9 e 4,1, respectivamente para (T3) e 7,4; 3,6 e 1,8, respectivamente
para (T1).
A prolongada vida média do eCG administrado, provoca alguns problemas
originários da permanente estimulação ovariana, como os folículos que não
ovulam e luteinizam, levando a perfis endócrinos anormais (altos níveis de
estrógeno) e embriões de baixa qualidade ou degenerados (Bó et al., 2000).
Para minimizar estes problemas, tem-se associado ao protocolo
superovulatório com eCG, um anti-soro anti-eCG/PMSG (Neutra-PMSG
®
) que é
um anticorpo monoclonal anti-eCG/PMSG, sendo administrado no momento da
primeira inseminação artificial, com o intuito de neutralizar a ação desta
Revisão de literatura
57
gonadotrofina na estimulação ovariana (Dieleman et al., 1987 e 1993; Alfuraiji et
al., 1993; Bó et al., 2000).
A dose recomendada do eCG, varia entre 1.500 a 3.000UI por
administração, sendo usualmente utilizado na dosagem de 1.500 a 2.500UI em
novilhas e vacas primíparas e 3.000UI para vacas multíparas via intramuscular
(Gonzales et al., 1994; Bó et al., 2000;). Já o Folltropin-V
®
e o Pluset
®
(FSHp) tem
sido recomendada a administração de 150-250mg/350-600 UI em vacas de corte
européias, 130-200mg/300-450 UI em vacas de corte zebuínas, 200-400mg/400-
800 UI em vacas de leite, respectivamente aos seus produtos (Lange &
Reichenback, 1997; Barros & Nogueira, 1997; Fernandes & Santos, 2000).
A grande variação nas dosagens hormonais de FSH e eCG/PMSG, é
decorrente das oscilantes respostas superovulatórias entre novilhas, vacas e entre
diferentes raças (Santos Filho & Oliveira, 1998; Barros et al., 2000; Matoba et al.,
2002).
Bó et al. (1994) compararam diferentes dosagens de FSH (Folltropin-V
®
),
200mg, 400mg, 600mg e 800mg por via subcutânea em vacas de corte,
demonstrando uma maior taxa no número de corpos lúteos, oócitos fertilizados e
embriões transferíveis quando utilizaram a dose de 400mg. A administração de
400mg do mesmo produto a base de FSH em dose única via subcutânea ou em
duas aplicações diárias por um período de quatro dias via intramuscular, não
houve diferenças significativas entre os tratamentos quanto ao número de corpos
lúteos (26,8/20,7), ao número total de oócitos/embriões (9,0/11,3), ao número de
oócitos fertilizados (3,6/6,3) e ao número de embriões transferíveis (2,5/4,8),
respectivamente (Bó et al., 1994).
O mesmo tem sido relatado por outros autores entre as vacas Bos taurus
taurus, Bos taurus indicus (Fernandes et al., 1993) e em búfalas (Kasiraj et al.,
1992), porém quando o FSH foi administrado em dose única via intramuscular, a
resposta superovulatória foi bem frustrante (Bó et al., 1991).
As diferentes concentrações de FSH e LH presentes nos mais variados
produtos superovulatórios têm sido motivo de preocupação e de estudo (Barros et
al., 2000), visto quehá um efeito negativo no aumento das concentrações de LH
Revisão de literatura
58
na produção e na qualidade dos embriões em vacas (Donaldson & Ward, 1986)
sugerindo que os níveis máximos do LH não devem ser superiores a 15% e 20%
(Mapletoft et al. (1992 e 1993).
Em contrapartida, uma quantidade mínima de LH no processo
superovulatório é essencial em decorrência de sua ação no final da maturação
folicular (Murphy et al., 1984; Chupin et al.,1987; Herrler et al., 1994). Contudo,
Donaldson & Ward (1986) relataram que o preparado de FSH altamente purificado
reduz significativamente a taxa de ovulação.
O primeiro folículo dominante em novilhas depende da troca de ligações do
FSH em LH para manter o seu desenvolvimento, havendo um aumento no número
de receptores de LH ligados na célula da granulosa desde o sexto dia do ciclo
estral (Ireland & Roche, 1987).
Em vacas não superovuladas o aumento nos níveis de LH é responsável
pelo reinício da meiose dos oócitos pré-ovulatórios, contudo, o aumento excessivo
ou a diminuição do LH contido no preparado gonadotrófico, demonstra alterar a
atividade da maturação oocitária durante o processo superovulatório (Moor et al.,
1984). Porém há necessidade da presença do LH exógeno no preparado
superovulatório, pois o LH endógeno não se faz suficientemente para a
estimulação final da maturação folicular e do desenvolvimento oocitário em
múltiplos folículos (10 a 20 folículos) em vacas superovuladas (Kelly et al., 1997).
Armstrong (1993) relata que os folículos de ovelhas superovuladas, são menores
que os de ovelhas não superovuladas.
Em decorrência destas variações, estudos têm demonstrado que os
preparados gonadotróficos estão diretamente relacionados com as variações dos
resultados nos tratamentos superovulatórios, visto que a alta concentração de LH
causa efeitos deletérios na resposta superovulatória (Murphy et al., 1984;
Donaldson & Ward, 1986; Gonzales et al.,1990) e na qualidade dos embriões (Kafi
& Mcgowan, 1997), em conseqüência da luteinização folicular e da maturação
prematura do oócito (Callesen et al., 1986). Dessa forma, o efeito negativo do
aumento dos níveis de LH na superestimulação ovariana, sugere a necessidade
Revisão de literatura
59
de diminuir o seu nível exógeno no processo final da superovulação (Donaldson &
Ward, 1986).
Monniaux et al. (1983), na tentativa de minimizar o efeito deletério do LH
exógeno, compararam a administração de um composto superovulatório (FSH/LH)
com altas concentrações de LH em doses decrescentes e doses contínuas. Neste
estudo os autores administraram uma dose total de 50 mg de FSH/LH duas vezes
ao dia por um período de quatro dias, obtendo uma média de ovulações, embriões
recuperados e de embriões transferíveis de 15,9 e 9,3; 12,2 e 5,8; 5,3 e 2,4
respectivamente aos protocolos superovulatórios em doses decrescentes e em
doses contínuas.
Alvin et al. (2000) compararam dois produtos comerciais para
superovulação em vacas, o Pluset
que é um produto com alta concentração de
LH (1:1), e o Folltropin
que é um produto com baixa concentração de LH (15%).
O número de estruturas coletadas e o número de estruturas viáveis foram de
15,32 e 6,89; 16,57 e 9,71, respectivamente ao Pluset
e ao Folltropin
.
O mesmo foi observado por Kelly et al. (1997), onde os tratamentos
superovulatórios com o Pluset
comparado com o Folltropin resultaram em um
maior número de folículos (10mm) e ovulações, porém com maior número de
embriões degenerados e não fertilizados em comparação ao Folltropin
.
Relataram, ainda que as novilhas superovuladas com Pluset
em apenas uma
administração ao dia por quatro dias apresentaram um maior nível de estrógeno
em relação ao mesmo tratamento com o Folltropin
. Entretanto, quando as
novilhas foram superovuladas com os mesmos produtos comerciais em duas
administrações ao dia em dose decrescente por um período de quatro dias, não
houve diferença significativa nos níveis de estrógeno.
Uma alternativa promissora para aumentar o recrutamento de folículos
antes da superovulação é a utilização da somatotrofina recombinante bovina
(rbsT), que é capaz de estimular a síntese de IGF-I em vários tecidos, inclusive no
ovário (Gong et al., 1996). Spicer & Geisert (1992) mostraram que folículos
pequenos contem menor quantidade de IGF-I do que folículos médios e grandes.
Kuehner et al. (1993) relataram que a rbsT influencia na resposta superovulatória,
Revisão de literatura
60
visto que, este pode estimular a síntese de IGF-I e esta por sua vez é capaz de
estimular as células da granulosa. Contudo, a rbsT ainda é motivo de discussão
entre os pesquisadores, sendo que, alguns deles têm relatado o aumento na
resposta superovulatória (Niemann, 1991; Herrler et al., 1994; Gong et al., 1996) e
outros não têm obtido o mesmo sucesso (Gray et al., 1993)
Alguns estudiosos têm observado a presença de um maior nível de
estrógeno em vacas superovuladas, em decorrência ao maior número de
ovulações que são expressas pelo número de corpos lúteos presentes no 6
o
e 7
o
dia pós-inseminação artificial (Callesen et al., 1990).
O elevado nível de LH presente nos compostos, associado ao aumento dos
níveis de estrógeno, pode explicar o maior número de folículos pré-ovulatórios
produzidos pelo Pluset
. Isto é decorrente da maior atividade estrogênica em
relação ao aumento na produção de andrógeno pelas células da teca (Kelly et al.,
1997). As células da teca produzem andrógenos em resposta ao LH e as células
da granulosa convertem andrógeno em estrógeno através da enzima aromatase
em resposta ao FSH (Bevers & Dieleman, 1987). Entretanto, as altas
concentrações de LH presentes no Pluset
, podem estimular o aumento das
concentrações de andrógenos nas células da teca que, conseqüentemente, eleva
a produção de estrógeno nas células da granulosa (Kelly et al., 1997). Porém na
administração do Pluset
em doses decrescentes, os níveis de LH exógeno foram
menores e houve, conseqüentemente, uma menor produção de andrógenos e
estrógeno.
Uma outra anormalidade superovulatória pode ser decorrente ao
desenvolvimento folicular acelerado culminando com a ovulação, antes que o
folículo tenha atingido o crescimento e o desenvolvimento adequado para
completar o processo de maturação oocitária e das células da granulosa
(Armstrong, 1993).
A redução do número de células da granulosa em vacas superovuladas
pode propiciar uma anormalidade oocitária (Armstrong, 1993). Uma vez que essas
células tem um papel essencial na nutrição do oócito presente no folículo em
desenvolvimento (Anderson & Albertini, 1976; Armstrong, 1993). O sítio de
Revisão de literatura
61
comunicação entre as células da granulosa, as células do cumulus e o oócito,
forma uma rede de comunicação entre estas células intercomunicadas que
provém de um sinal regulatório e nutricional do oócito (Anderson & Albertini,
1976).
A comunicação reduzida do sincício entre as células da granulosa e as
células do cumulus, simultaneamente com uma diminuição na duração da fase
folicular em animais superovulados, podem levar a uma inadequada nutrição do
oócito durante o período crítico do desenvolvimento pré-ovulatório, na qual a
maturação citoplasmática é completada. Isto poderá resultar em uma deficiência
biocinética e metabólica que comprometeria a capacidade de desenvolvimento
dos oócitos (Armstrong, 1993). Anormalidades também foram encontradas por
Moor et al. (1985) quanto à secreção de esteróides e aos padrões dos sítios
protéicos no oócito de ovelhas superovuladas com PMSG, oferecendo suporte a
hipótese de Armstrong (1993).
Vários autores têm relatado que repetições sucessivas do tratamento
superovulatório tendem a diminuir a resposta ovariana, assim como uma
irregularidade no ciclo estral, devido a produção de anticorpos ao hormônio
exógeno, fazendo necessário intervalar as superovulações entre 56 e 60 dias
(Pinheiro-Andrioli et al.,1995; Nogueira, 2001). Entretanto, em outros estudos não
foram observadas qualquer diminuição no número de embriões viáveis até seis (6)
repetições do tratamento superovulatório (Lamberson & Lamberth, 1986; Oikawa
et al., 1998; Manciaux et al., 2000).
Pinheiro-Andrioli et al. (1995) estudaram a resposta superovulatória em 30
cabras depois de repetidos tratamentos com gonadotrofina hipofisária de suíno
intervalados em 56 dias. Os autores constataram uma diminuição significativa na
ocorrência do estro em cabras na 2
o
e na 3
o
indução superovulatória em relação a
1
a
superovulação (36,5%, 41,1% e 83,3%, respectivamente). Em relação a taxa de
ovulação após repetidos tratamentos não houve diferença significativa (3,9; 3,4;
2,6, respectivamente a 1
o
, 2
o
e 3
o
indução superovulatória).
Pode-se concluir que a superovulação é uma técnica cosmopolita, todavia,
complexa e que requer ainda intensos estudos para solucionar as suas incógnitas
Revisão de literatura
62
que em parte vêm sendo eficientemente solucionados com a interação entre as
técnicas de punção folicular transvaginal e as biotécnicas da Fertilização in-vitro
(FIV) e Transferência Intrafalópio de Gametas (GIFT).
3.4. Aspectos fisiológicos do ciclo estral em éguas
O ciclo estral da espécie eqüina é uma combinação de eventos fisiológicos
que ocorrem entre duas fases, estro e diestro (Andrade, 1986), podendo também
denominá-las de fase folicular e fase luteal (Dieleman et al., 1986), que são
intervaladas entre dois períodos sucessivos de cio (Andrade, 1986).
A fase de estro ou fase folicular, em éguas, é caracterizada pela presença
de um folículo dominante de 30 mm de diâmetro (Ginther, 1992) no ovário, onde
são produzidos elevados níveis de estrógenos pelas células da granulosa.
As quantidades crescentes de estradiol secretadas pelos folículos ovarianos
induzem o comportamento de estro e a elevação dos níveis de LH e ativação dos
seus receptores na célula da granulosa, consequentemente a ovulação e a
formação do corpo lúteo através da retroalimentação positiva no sistema
hipotalámico e hipofisário ( Hafez, 1995).
A elevação dos níveis de estrógenos durante a fase estral é responsável
pela instalação do edema uterino; o qual tende a ser diminuído em dois dias que
antecedem a ovulação (Mckinnon & Carnevale, 1993; Buratini, 1997).
Já a fase de diestro ou luteal é caracterizada pelo término das
manifestações dos sinais do estro, que ocorrem entre 24h e 48h após a ovulação,
resultado da formação do corpo lúteo (Neely et al., 1989). Sirois et al. (1989),
consideram a ovulação como o início da fase luteal, e a fase final culminando com
a luteólise do corpo lúteo, apresentando níveis plasmáticos de progesterona
inferiores a 1ng/ml.
Na fase luteal, o corpo lúteo produz progesterona em quantidades
crescentes do segundo ao décimo dia pós-ovulação. Esta secreção se mantém
estável até o décimo segundo dia, quando ocorre uma queda acentuada nas
Revisão de literatura
63
concentrações plasmáticas de progesterona, ocasionando a luteólise entre o
décimo quarto e o décimo sexto dia do ciclo estral (Ginther, 1992).
As fêmeas eqüinas por apresentarem atividade sexual durante a fase de
maior luminosidade, são classificadas como monovulatórias poliéstricas
estacionais. Elas atingem a maturidade sexual quando alcançam a puberdade, o
que ocorre por volta dos dois anos de idade, podendo ser esta alterada pela
influência das condições corporais, peso, níveis de energia, ferormônio e a
estação do ano (McKinnon & Voss, 1993).
A duração do ciclo estral da égua tem sido considerado variável por alguns
autores. Esta variabilidade pode ser de origem racial, individual e principalmente
da natureza dos dados computados, como é o caso das aquisições dos dados de
diferentes técnicos, em diferentes ambientes e de diferentes métodos de avaliação
do estro além da dificuldade de predizer as fases exatas do estro e do diestro
(Ginther, 1992; McKinnon & Voss, 1993; Neely et al.,1989 , Hafez, 1995).
O período do ciclo estral, estro e diestro tem sido relatado por Ginther
(1992) como sendo em média de 21,7 (19,1 a 23,7), 6,5 (4,5 a 8,9); 14,9 (12,1 a
16,3) dias, respectivamente.
Com o uso da ultra-sonografia na reprodução equina na década de 80, uma
maior precisão da atividade ovariana, no que diz respeito ao recrutamento,
crescimento, divergência e atresia folicular, pôde ser estudada (Palmer &
Driancourt, 1980), tendo sido caracterizada a dinâmica folicular aos mecanismos
reguladores hormonais (Mapletoft et al., 1994; Fortune,1994).
As éguas podem apresentar uma ou duas ondas foliculares (Sirois et al.,
1989; Ginther, 1990), havendo uma maior predisposição a uma única onda. Há
trabalhos que indicam uma tendência a duas ondas foliculares na primeira metade
da estação reprodutiva (Pierson & Ginther, 1987; Ginther & Pierson, 1989; Ginther,
1990) e uma maior tendência a uma onda folicular na segunda metade da estação
reprodutiva (Ginther, 1990; Buratini, 1997).
O estudo comparativo da dinâmica folicular entre raças, tem indicado uma
maior predisposição a duas ondas foliculares para as raças PSI, Apallosa e Quarto
de Milha (Ginther & Bergfeld, 1993), quando comparadas com as raças Árabe e
Revisão de literatura
64
Pônei (Ginther, 1992; Dimmick et al., 1993) na primeira metade da estação
reprodutiva.
Em estudos realizados por Buratini (1997), a duração média do intervalo
interovulatório para ciclos que apresentaram uma ou duas ondas foliculares foram
de 19,4 e 23,3 dias, respectivamente.
O crescimento diário dos folículos recrutados pelas ondas foliculares, pode
variar de 2,5 a 3,0mm (Ginther, 1986). Porém quando se beneficiam da
estimulação ovariana através de preparados hormonais, o crescimento folicular
diário pode alcançar 3,0mm ou mais (Moura & Merkt, 1996). Palmer et al. (1993)
relataram um desenvolvimento folicular de 2,mm ao dia em éguas pôneis
superovuladas com o EPE.
A atividade ovariana também tem sido estudada entre éguas jovens,
adultas e idosas, apresentando uma maior queda desta atividade a partir dos 15
anos de idade, onde se pode notar um atraso na emergência das ondas
foliculares, no prolongamento do intervalo interovulatório e na redução da
população de folículos nas ondas foliculares (Ginther & Bergfelt, 1993; Carnevale
et al., 1995).
Estas alterações são provavelmente devido a um menor número de
folículos e disposição dos mesmos a serem recrutados, e uma menor resposta aos
estímulos gonadotróficos, já que os níveis de FSH liberados pela pituitária não são
alterados ao decorrer da idade (Ireland, 1987).
3.5. Controle endócrino do ciclo estral
A glândula hipófise (ou pituitária), está intimamente ligada ao hipotálamo. A
neurohipófise (ou hipófise posterior) apresenta ligação neural com o hipotálamo;
existem neurônios que possuem o corpo celular no hipotálamo e o final do axônio
na neurohipófise. Quando há estímulo no hipotálamo, os hormônios produzidos
por estes neurônios são liberados pela neurohipófise. Os hormônios liberados pela
neurohipófise são a ocitocina e o hormônio antidiurético (ADH ou vasopressina). A
adenohipófise (ou hipófise anterior) possui uma relação hormonal com o
Revisão de literatura
65
hipotálamiva. Para cada hormônio da adenohipófise, existe um hormônio de
liberação hipotalâmico, que é secretado no sistema porta-hipotalâmico-hipofisário
(Price & Smith, 1997). O GnRH secretado pelo hipotálamo, através do sistema
porta-hipotalâmico-hipofisário, atinge esta glândula e estimula a liberação das
gonadotrofinas, FSH e LH.
Existem dois locais de secreção e produção de GnRH no hipotálamo: os
centros controladores de secreção tônica, que secretam GnRH de uma forma
relativamente contínua e os centros controladores da onda pré-ovulatória que
secretam grandes quantidades de GnRH de uma só vez. As gonadotrofinas, além
de distribuírem no organismo via circulação sistêmica, atingem o hipotálamo, pelo
vaso de fluxo retrógado, onde causam um bloqueio parcial na liberação de GnRH
(mecanismo conhecido como “feedback” negativo) (Fernandes, 2000). Via
circulação, as gonadotrofinas chegam aos ovários, especificamente aos folículos,
onde o FSH estimula o desenvolvimento dos mesmos. Com isto, os folículos
iniciarão a produção de estrógeno, que via circulação sistêmica atingiram o
hipotálamo provocando um efeito negativo na secreção tônica e um efeito positivo,
estimulando os centros controladores da onda-ovulatória, além de um efeito
positivo na secreção de gonadotrofinas na hipófise.
Quando a quantidade de estrógeno na circulação chega em determinado
nível (devido a produção crescente pelos folículos em desenvolvimento) este
sensibiliza áreas superiores do sistema nervoso central, fazendo com que a fêmea
manifesta sinais de estro, ou seja sinais de aceitação do macho, e age também
nos centros controladores da onda pré-ovulatória de GnRH, fazendo com que uma
grande quantidade deste hormônio seja liberado na circulação (Mies Filho, 1982).
Na etapa final de seu desenvolvimento, os folículos secretam outro
hormônio, a inibina, que via sistêmica tem a função de bloquear seletivamente a
síntese de FSH na hipófise. Por este motivo, acompanhando o pico de liberação
de GnRH (onda pré-ovulatória) tem-se aumento de LH, já que a produção de FSH
encontra-se parcialmente bloqueada. Esta elevação de LH é responsável pela
ovulação dos folículos presentes nos ovários que tem desenvolvimento
compatível. As células remanescentes do folículo que ovulou sofreram uma
Revisão de literatura
66
transformação chamada luteinização, formando o corpo lúteo, que produz
progesterona. Estes eventos também são coodenados pelo LH (Hafez, 1995).
A produção de progesterona alcança seu limite por volta de 5 a 7 dias após
a formação do corpo lúteo, e enquanto permanecer em níveis elevados na
circulação é responsável por bloquear a liberação de GnRH e das gonadotrofinas
hipofisárias, ou seja, a égua não apresenta estro novamente enquanto estiver em
concentrações circulantes elevadas (Fernandes, 2000).
Considerando que a fêmea não tenha ficado gestante, por volta de 12 a 15
dias após a formação do corpo lúteo, a ocitocina produzida pelo hipotálamo e
armazenada na neurohipófise, é liberada via que no útero promove a contração
uterina e a liberação de PGF
2α
que será responsável pela regressão do corpo
luteo, processo conhecedo como luteólise. Com isso, a concentração plasmática
de progesterona diminui, possibilitando o aumento gradativo na secreção de
GnRH, FSH e LH, iniciando um novo ciclo. Se a égua ficou prenha, o corpo lúteo
não pode sofrer regressão, pois é a principal fonte de progesterona no início da
gestação (Mckinnon & Voss, 1993).
3.6. Mecanismos da ovulação
3.6.1. Maturação folicular
3.6.1.1. Foliculogênese
A origem das gônadas se dá através do néfrom, que é um órgão com uma
estrutura bilateral, alongado, formado a partir do mesoderma embrionário e
composto por três porções: o pronefro (origina os rins), o mesonefro (origina os
rins) e o metanefro (compõe a eminência genital que origina as gônadas) (Austin &
Short, 1982; Byskov, 1986).
Os dutos paramesonéfricos ou dutos de Muller e os dutos mesonéfricos ou
dutos de Wolff, estão presentes no embrião sexualmente indiferenciado. Os dutos
de Muller na diferenciação sexual desenvolvem–se em um sistema de duto-
gonadal, que se unem na sua porção caudal dando origem a toda a porção tubular
da fêmea (útero, cérvix e a porção anterior da vagina) (Byskov, 1986; Hafez,
1995).
Revisão de literatura
67
Os dutos de Wolff sofrem atrofia nas fêmeas e originam–se em uma
estrutura vestigial presente na vagina, denominada de duto de Gartner (Byskov,
1986).
Se não ocorrer o estímulo para a diferenciação sexual, as gônadas
primitivas (eminência genital) do embrião feminino (XX), transformam–se
espontaneamente em ovário, que ao contrário dos testículos, permanecem na
cavidade abdominal migrando para a região caudal aos rins, permanecendo
definitivamente por toda a vida do indivíduo (Ohno, 1985; Byskov, 1986).
Os ovários desempenham duas importantes funções, uma exócrina ou
gonadal (produção e liberação de oócito) e outra endócrina (produção e liberação
de hormônios) (Hafez, 1995, Youngquist, 1997). Essa dupla função é um
processo interdependente, complementar e necessário para o sucesso da
reprodução (Pineda, 1989), portanto a produção do gameta feminino é resultante
da interação de dois fenômenos que ocorrem no ovário, isto é, a oogênese e a
foliculogênese (Saumande, 1981).
A foliculogenênese é o processo de formação, crescimento e maturação
folicular, que se inicia com o desenvolvimento das oogônias e a formação do
folículo primordial, e culmina com a formação do folículo de Graaf, também
denominado de folículo pré-ovulatório ou de folículo maduro (Picton, 2001).
O folículo é a unidade funcional do ovário, que tem a finalidade de propiciar
um ambiente ideal para o crescimento e maturação do oócito e a produção de
hormônios esteróides (Gordon, 1994). Os mamíferos apresentam milhares de
folículos ao nascimento, constituindo uma grande reserva folicular (Downs, 1993;
Beckers et al. 1996), dos quais apenas 0,01% resultam em ovulação durante a
vida reprodutiva, ocorrendo a atresia dos demais no decorrer das fases de
crescimento e maturação (Carrol et al. 1990).
A população folicular presente nos ovários pode variar em relação ao
indivíduo, a espécie, a raça e a genética (Peters, 1976; Cahill et al.,1979; Gosden
& Telfer, 1987a, 1987b; Roy and Treacy, 1993, Smith et al.,1994). Estima–se que
a população folicular ovariana na espécie bovina e humana ao nascimento é de
235.000 e 2.000.000 respectivamente (Erickson, 1986; Betteridge et al., 1989),
Revisão de literatura
68
porem na espécie equina não há relatos. Os pesquisadores Driancout & Palmer
(1984) relataram a presença de aproximadamente 36.000 folículos primordiais e
100 folículos em desenvolvimento em éguas Pôneis com atividades cíclicas
normais, através do exame histológico ovariano.
Até bem pouco tempo acreditava-se que os folículos ovarianos não
atrésicos resultantes do estágio fetal, iniciavam o seu desenvolvimento
ininterruptamente de uma forma aleatória, independente das fases do ciclo estral
ou gestação (Ginther, 1992). Hoje em dia, este conceito se modificou e sabe-se
que os grupos de folículos iniciam o seu desenvolvimento sincronicamente em
determinados períodos do ciclo estral (Austin & Short, 1982; Ginther, 1992).
Os folículos ovarianos são preenchidos internamente por um fluido viscoso
denominado de líquido folicular que apresenta em sua composição líquida os
hormônios esteróides, principalmente o estradiol (em quantidades crescentes com
o desenvolvimento folicular) e a progesterona (presente em folículos em atresia e
próximos à ovulação) (Hafez, 1987).
Outros hormônios não esteróides fisiologicamente ativos também estão
presentes no líquido folicular, como o O.M.I (fator inibidor da maturação do oócito)
e a inibina (em quantidade crescente no final do desenvolvimento folicular). A
composição e a quantidade do fluido modifica-se com o desenvolvimento do antro
folicular (Hafez, 1987).
As principais funções do líquido folicular segundo Hafez (1995) são:
• Regulação das funções das células da granulosa, início do crescimento
folicular e esteroidogênese,
• Maturação do oócito, ovulação e transporte do oócito para a trompa,
• Preparação do folículo para a formação do subsequente corpo lúteo,
• Fatores estimulantes e inibidores no fluido que regulam o ciclo folicular.
Em relação à pressão do fluido folicular no processo da ovulação, Janson
(1975), demonstrou um aumento no volume folicular relacionado ao aumento no
fluxo sanguíneo e diminuição na resistência vascular induzido pelo LH.
Entretanto, antes da ruptura folicular, ocorre um aumento acentuado no volume do
fluido e um aumento na distensibilidade das células da granulosa na parede
Revisão de literatura
69
folicular, e o decréscimo na força elástica permitem que a ruptura folicular
(ovulação) ocorra sob pressão (Rondell, 1964).
O desenvolvimento folicular nas espécies monovulatória é subscrito em três
fases: a primeira inicia-se com a ativação do folículo primordial, a segunda, ocorre
o recrutamento e o crescimento folicular, e a terceira ocasionando a seleção de
um ou dois folículos dominantes e atresia dos folículos subordinados (Ginther &
Bergfelt 1993).
De acordo com o grau de evolução, os folículos podem ser subdivididos em
pré-antrais, que são constituídos pelos folículos primordiais, folículos primários e
folículos secundários; e antrais, que compreendem os folículos terciários e os
folículos de Graaf (Hafez, 1987; Fortune, 1994; Hulshof, 1995).
Os folículos pré-antrais, compõem a fase mais longa e são dependentes de
fatores ovarianos intrínsecos (regulado pelo próprio ovário, ou seja, substâncias e
mecanismos que atuam na própria célula) (Austin & Short, 1982). Já os folículos
antrais, são caracterizados pelo desenvolvimento do antro quando os folículos
atingem aproximadamente 300µm de diâmetro na espécie eqüina, e são regulados
pela hipófise, ou seja, é dependente do FSH e LH, além da ação do estrógeno
produzido pelo próprio folículo (Hafez, 1995).
Nessa fase, ocorre um aumento no tamanho do oócito e a formação de
duas sub-camadas de células da teca (interna e externa) que são formadas ao
redor das células da granulosa (Driancourt et al., 1991). As células da granulosa
organizam–se em múltiplas camadas ao redor do oócito, formando o cumulus
oóphorus (Kenney et al., 1979).
Alguns autores têm relatado uma forte evidência em mulheres, ovelhas,
vacas e porcas, que o gene que codifica o receptor para FSH, não é expresso
antes que o folículo atinja o grau do desenvolvimento da formação do antro
folicular (Tisdall et al., 1995; Xu et al., 1995; Yuan et al., 1996). Outros
pesquisadores contradizem estas evidências, relatando a presença de um
estímulo gonadotrófico para a ativação e para o crescimento dos folículos pré-
antrais (Hirshfield, 1991; Van Wezel & Rodgers, 1996).
Revisão de literatura
70
Os mecanismos reguladores do desenvolvimento do folículo pré-antral,
ainda não são completamente esclarecidos, acredita-se que o fator de
crescimento ß (TGF-ß) expressado pelo oócito, pode ser o mediador para o
crescimento do folículo pré-antral (Mcnatty et al., 1999; Elvin et al., 2000).
Os folículos primordiais são os primeiros a serem formados e os menores
folículos encontrados no ovário, representando um “pool” de folículos do qual
alguns serão selecionados até tornarem-se folículos dominantes, sendo então
considerados a unidade reprodutiva fundamental do ovário (Eppig & O’Brien,
1996). Esses folículos primordiais são constituídos de um oócito dictiano
centralizado e circundado por uma única camada de células da granulosa de
forma achatada ou pavimentosa, demarcada por uma membrana basal (Fortune,
1994; Eppig & O´Brien, 1996). Eles compreendem cerca de 90% a 95% de toda a
população folicular presente no ovário dos mamíferos (Erickson, 1986).
A ativação dos folículos primordiais se faz necessário para que haja a
passagem dos folículos quiescentes em uma reserva, para o pool de folículos em
crescimento (Russe, 1983). O primeiro sinal desta ativação é o retorno da
proliferação das células da granulosa, transformando o formato achatado da célula
para o formato cuboide, culminando com o aumento do tamanho do oócito,
ocorrendo a passagem do estágio de folículo primordial para o estágio de folículo
primário (Hirsfield, 1995).
Van Wezel & Rodgers (1996) sugerem que a ativação e o crescimento dos
folículos primordiais são dependentes de nutrientes ovarianos, fatores de
crescimento e pouco dependente da ação do hormônio gonadotrófico, o que
contradiz com Hafez (1987) que relata a total ausência da ação das
gonadotrofinas hipofisárias nesta fase. Alguns folículos primordiais iniciam seu
crescimento tão logo sejam formados, enquanto outros permanecem quiescentes
por vários meses ou anos (Hirshfield, 1992; Van Wezel & Rodgers, 1996).
Os folículos primários são caracterizados pela presença de um oócito
central circundado por uma camada de células da granulosa com formato cuboide,
representando o primeiro estágio do crescimento folicular (Hyttel et al., 1997). Este
estágio inicial do crescimento folicular é ininterrupto, inclusive por ocasião da
Revisão de literatura
71
gestação, lactação, bem como após a hipofisectomia (Hirshfield, 1991). O
crescimento do folículo primário é pouco dependente das gonadotrofinas
hipofisárias, fazendo-se necessário à ação dos fatores de crescimento (Hirshfield,
1985).
Os folículos secundários apresentam um oócito com as mesmas
características que os folículos primários, porém maior e circundado por duas ou
mais camadas de células da granulosa com o formato cúbico (Hyttel et al., 1997).
Nesta fase, ocorre a diferenciação das células da teca, que são formadas pela
organização em seguimentos paralelos das fibras de tecido conjuntivo (Hitshfield,
1991) e o espaçamento da zona pelúcida, a qual circunda o oócito (Figueiredo,
1995).
Eppig (1992) relatou que tanto o crescimento do oócito como a proliferação
das células da granulosa, são processos independentes de gonadotrofina em
folículos pré-antrais, o que contradiz o relato de Hirshfield (1985), portanto deduz-
se que tanto na fase de folículo primordial como nas fases de folículo primário e
folículo secundário, podem ou não sofrer a ação destes hormônios.
Estudos in vitro em folículos pré-antrais, têm demonstrado que os fatores de
crescimento como Epidermal Growth Factor (EGF), Basic Fibroblast Growth Factor
(bFGF) (Jewgenow, 1996), e o insulin–like Growth Factor (IGF-1 e IGF-2), bem
como o FSH (Nuttinck et al., 1996), estão envolvidos na proliferação e
diferenciação das células da granulosa e na esteroidogênese, que é de extrema
importância na estimulação de receptores para LH nas células da granulosa, tal
qual para o comportamento sexual do estro.
Os folículos terciários são caracterizados em sua fase inicial como folículos
antrais, constituídos por um oócito circundado por várias camadas de células da
granulosa que se organizam para a formação do cumulus oóphorus (Hyttel et al.,
1997). Nessa fase, surge o aparecimento de uma pequena cavidade contendo
líquido folicular denominada de antro, apresenta também uma membrana basal e
duas camadas de células tecais que são divididas em interna e externa
(Figueiredo, 1995).
Revisão de literatura
72
O desenvolvimento dos folículos terciários está diretamente relacionado
com a gonadotrofina hipofisária, assim como os fatores de crescimento e os
fatores extra-ovarianos como é o caso do hormônio do crescimento (GH)
(Hirshfield, 1991).
Na fase final do folículo terciário, ocorre um aumento da sensibilidade das
células da granulosa ao FSH, o aparecimento e ativação dos receptores de LH
nas células da granulosa e um aumento da atividade da aromatase nas células da
granulosa, resultando na formação do folículo de Graff (Monniaux et al., 1993).
3.6.1.2. Composição do fluido folicular
A viabilidade e o grau de capacitação atingidos por um folículo são, em
grande parte, refletidos pela composição bioquímica do fluido presente em sua
cavidade antral. Os produtos resultantes do metabolismo das células do cumulus
oophorus, da granulosa mural, e mesmo da teca, são difundidos pelo fluido
folicular, fornecendo um panorama da atividade esteroidogênica e da
biodisponibilidade de fatores de crescimento (como o fator semelhante a insulina
do tipo I, IGF-I; e a proteína ligadora do IGF-I como IGFBP-4 e IGFBP-3).
Estudos em folículos bovinos demonstraram que existe uma alta correlação
entre as concentrações de IGF-I livre, de IGFBP-4, de estradiol e de progesterona,
presentes no fluído e a capacidade desses folículos atingirem a dominância e a
capacitação final pré-ovulação (Beg et al., 2001; Crowe et al., 2001; Ginther et al.,
2001). Desse modo, uma alta concentração de 17β-estradiol aliado a baixos níveis
de progesterona (uma alta relação estradiol:progesterona) e uma baixa
concentração de IGFBP-4 (o que disponibilizaria grande quantidade de IGF-I para
ser utilizado como promotor de crescimento pelo folículo) seriam marcadores
bioquímicos fidedignos da viabilidade de um determinado folículo.
Melo et al. (2005) avaliaram a concentração de IGF-I em folículos aspirados
de vacas nelore com diâmetro ≥ 6,5mm (dominantes) e <6,5mm (subordinados), e
observaram uma maior concentração em folículos dominantes
(184,61±19,31ng/mL P=0,009) do que os folículos subordinados
(113,79±17,23ng/mL). Estes resultados indicam que depois do desvio folicular, o
Revisão de literatura
73
folículo dominante pode estar influenciando nos níveis de IGF-I dos demais
folículos. As menores concentrações de IGF-I e demais fatores de crescimento,
além de outras variações hormonais na fase de dominancia, podem induzir a
atresia e alterações na competência oocitária, consequentemente na quantidade e
qualidade de embriões produzidos in-vitro.
Outros estudos têm demonstrado que em cavalos o crescimento folicular
está associado com a diminuição nas concentrações de IGFBP-3 e aumento das
concentrações de IGF-I, e que as mudanças nas concentrações de IGFBP-3 pode
alterar os níveis de IGF-I que estimula a mitose e a esteroidogenese no
desenvolvimento folicular e éguas (Carneiro et al., 2002).
Os níveis hormonais presentes no fluido folicular são de grande importância
na muturação folicular e consequentemente na maturação oocitária. Assey et al.
(2005) relataram que o maior intrave na industria da transferência de embriões em
vacas é a grande variação na produção de embriões viáveis oriundos de animais
superovulados. Deste modo, investigaram os níveis da esteroidogenese no fluido
folicular e a sua influencia no desenvolvimento folicular e oocitário. Assim
observaram uma menor concentração de estrógeno e progesterona no fluido
folicular de folículos pré-ovulatórios de novilhas superovuladas que em novilhas
não superovuladas (83,7ng/mL – 208,1ng/mL, p>0,05 e 31,1ng/mL – 150,3ng/mL,
respectivamente; p<0,05), além dos folículos apresentarem um menor diâmetro. A
diminuição destes valores hormonais tem fortes indícios de estarem interferindo no
processo de maturação folicular e oocitária.
Os níveis de progesterona e andrógenos foram superiores em ratas
superovuladas com PMSG em relação ao grupo controle, entretanto os valores de
estrógeno não apresentaram variação entre os dois grupos (Yun et al., 2005).
3.6.1.2.1. Óxido Nítrico
O óxido nítrico (NO) é um gás formado, em meio aquoso, através da
conversão da arginina, na presença de oxigênio e diversos co-fatores, em citrulina
e NO pela ação do óxido nítrico-sintetase (ONS) (Knowles et al., 1989). Sua
molécula é lábil e de grande difusibilidade, sintetizada de forma regulada. O NO,
Revisão de literatura
74
um radical livre gasoso altamente reativo, tem sido identificado como um
importante mensageiro intra e intercelular que controla vários processos, como o
tônus vascular, a neurotransmissão, produção de hormônios, diferenciação
celular, expressão gênica, a ativação de células do sistema imune e na fisiologia
ovariana (Moira et al 1998). Estas ações dependem da produção local e da
disponibilidade da ONS, já que o NO é rapidamente consumido (Murad, 1999). A
enzima que controla a produção do NO foi encontrada sob três formas homólogas:
iONS (indutora), eONS (endotelial) e nONS (neuronal) (Nathan, 1992). A forma
nONS está contida em neurônios que são encontrados em várias localizações no
hipotálamo e, em particular, nos núcleos paraventricular e supra-óptico, cujos
axônios se projetam para a eminência mediana e se estendem até o lobo neural
da hipófise (McCann et al 1999). NO é sintetizado por uma reação oxidativa da L-
arginina catalisada pelas iso-enzimas óxido nítrico sintase. Diversos trabalhos
demonstraram a ação do NO na ovulação, atresia folicular e esteroidogênese das
células da granulosa. NO inibe a atividade aromatase e diminui a síntese do
RNAm desta enzima em mulheres e ratas (Rosselli et al., 1998).
Pinto et al. (2002) administraram em éguas um inibidor da síntese de oxido
nítrico (N
-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride), e observaram uma
diminuição acentuada no edema uterino 12h após a sua administração, o que não
foi observado em éguas controle e um atraso significativo na ovulação (84h) após
a administração do hCG, quando comparado com o grupo controle (42h) que
também recebeu hCG. Os autores atribuem esta diminuição do edema, ao fato de
que o óxido nítrico é um importante mediador do mecanismo celular e vascular
que ocorrem no útero e no ovário de éguas em estro e sugerem que oxido nítrico
tem um importante papel na fisiologia ovariana (crescimento folicular e ovulação)
em éguas. Avaliaram, ainda, os níveis de oxido nítrico, progesterona e estrogeno
no fluido folicular antes da administração do hCG (0h) e 36h após a administração
do hCG para indução de ovulação. Os resultados demonstraram que o nível de
oxido nítrico e de progesterona foram menores no momento “0h” em relação ao
momento “36h” (p<0,05), e os níveis de estrógeno foram maiores no momento ”0h”
do que no momento de “36h”.
Revisão de literatura
75
Caldas et al. (1999) verificaram a presença do NO no fluido folicular
ovariano de éguas e sua correlação com as concentrações de 17β-estradiol (E2) e
com o tamanho folicular. Neste experimento os folículos foram selecionados
levando-se em consideração a coloração, intensidade de vascularização das
células da teca após a dissecação dos mesmos e concentração de E2. Os
folículos foram divididos em três grupos de acordo com o volume do fluido
folicular: G1 (10 a 20mL); G2 (>20 a 30mL) e G3 (> 30mL). As concentrações de
E2 foram estimadas por radioimunoensaio e as concentrações de NO com a
utilização da reação colorimétrica de Griess após a redução do nitrato a nitrito. As
concentrações de nitrato no fluido folicular apresentaram uma correlação negativa
com o tamanho do folículo e com as concentrações de E2. Os autores concluíram
que o NO está presente no líquido folicular ovariano de equinos e sugerem que o
mesmo também pode estar envolvido no desenvolvimento folicular e/ou
esteroidogênese ovariana de éguas.
Flores et al. (2001) descrevem que quando a produção de NO no ovário é
inibida in vivo ou in vitro, retarda o processo da ovulação por impedir as trocas
vasculares. Este efeito pode ser revertido se for administrado simultaneamente um
promotor de NO como o nitroprusiato, sustentanto desta forma a importancia do
sistema NO/NOS na ruptura folicular.
As funções do NO no ovário são muito variadas, e vão desde controlar a
relação dos vasos a o volume sangüíneo circulante, até a exsudação do plasma
que acompanha na ruptura do folículo. O mecanismo pelo qual o NO exerce sua
função na vasodilatação é o seguinte: o NO uni-se ao ferro pelo grupo heme, pelo
sítio ativo da guanitil ciclase, ativando-a e resultando em GMPc. Este estimula as
proteinas quinases dependentes dele, resultando no relaxamento da musculatura
lisa dos vasos sanguineos. Além disso, o NO também contribue na liberação de
PGE
2
e de prostaciclinas ao ativar a ciclooxigenase que regula sua via de síntese
pelo mecanismo similar ao descrito para a guanitil ciclase, já que o sítio ativo das
ciclooxigenases também contém um grupo hemo (Salvemini, 1997).
Revisão de literatura
76
3.6.1.2.2. Proteína do líquido folicular
O fator de crescimento ligado a insulina (IGF) tem um importante papel na
função ovariana. Os perfis da proteína ligadora de insulina (IGFBPs) no fluido
folicular têm sido caracterizados em um grande número de mamíferos (ratos,
porcas, vacas, ovelhas, eqüinos e humanos) e são bons indicadores do estado
folicular. Estudos in vitro da célula da granulosa de várias espécies, têm
demonstrado que IGF-I estimula a diferenciação e a proliferação das células da
granulosa (Adashi et al., 1985). Mais recentemente, alguns estudos demonstraram
o efeito do IGF-I na maturação oocitária (Lorenzo et al., 1995).
Em eqüinos, Gérard & Monget (1998), estudaram os perfis de IGFBP do
soro e do fluido folicular. O fluido folicular foi recuperado através da aspiração
folicular guiada por ultrassom. No primeiro experimento, os folículos que estavam
se destacando como dominantes com diãmetro entre 22 a 25mm de 10 éguas
foram parcialmente aspirados (0,5 a 2,2mL). Quando os folículos atingiram um
diâmetro de 35mm a ovulação foi induzida com 2500UI de hCG, e 34h após foram
aspirados totalmente. Dentre os 10 folículos pré-ovulatórios aspirados das 10
éguas, cinco (5) foram classificados como normais, ou seja, bons, e os outros
cincos (5) foram considerados como hemorrágicos.
Em um segundo experimento, os folículos foram inicialmente aspirados ao
atingirem o diâmetro entre 33 a 35mm sendo posteriormente induzida a ovulação
com 2.500UI de hCG e aspirados 34h após. Em cada seção de aspiração foi
retirado o sangue para obtenção do soro. O fluido folicular e o soro sangüíneo
demonstraram que o IGFBP de 42 a 44Kda (IGFBP-3), 28 a 32Kda (IGFBP-5) e
35Kda identificado como IGFBP-2 por immunoblotting. O IGFBP-2 apresentou um
maior nível no soro do que nos folículos dominantes aspirados. No fluido folicular,
IGFBP-3 foi o maior arranjo de proteína, sendo quase sempre constante nos
diferentes estágios de desenvolvimento folicular estudado (Gérard & Monget,
1998).
O desenvolvimento do folículo dominante foi caracterizado pela diminuição
da concentração intra-folicular de IGFBP-3 e de IGFBP-5 antes da indução da
ovulação, e por um aumento de IGFBP-2 após a indução da ovulação. A
Revisão de literatura
77
regressão de grandes folículos, assim como dos subordinados, foi caracterizada
pelo baixo nível intra-folicular de 17β-estradiol associado ao aumento de IGFBP-2,
IGFBP-4 e da IGFBP-5. Estes resultados demonstraram uma alta correlação entre
os níveis de 17β-estradiol, IGFBP-2 e da IGFBP-5 intra-folicular. Portanto, o
crescimento e a regressão folicular em éguas pode estar associado a mudanças
específicas nos níveis de IGFBP, o qual pode ser de importância crucial no
desenvolvimento folicular, na ovulação e na atresia folicular (Gérard & Monget;
1998).
3.6.1.3. Parâmetros para aferir a viabilidade do folículo ovariano
O processo de desenvolvimento folicular ovariano e de maturação nuclear
do oócito é aferido sob o controle endócrino das gonadotrofinas hipofisária e dos
esteróides ovarianos, entretanto, recentes observações sugerem que as
gonadotrofinas são apenas parte de um complexo sistema de agentes autócrinos
e paracrinos, incluindo os fatores de crescimento (Tonetta & Dizerega, 1989).
A pituitária anterior é composta por uma população de células secretoras
em conjunto com células não secretoras. Nas espécies eqüina e ovina estas
células são observadas tanto na fase de desenvolvimento fetal quanto no
crescimento pós-natal enquanto em aves são observadas apenas após a eclosão
do ovo. As células secretoras são divididas de acordo com a sua produção
hormonal, sendo os corticotrofos [produtores o hormônio adenocorticotropico
(ACTH)], os gonadotrofos (produtores de LH e FSH), os lactotrofos (produtores de
prolactina), os somatotrofos [produtores do hormônio de crescimento (GH)] e os
tireotrofos [produtores de tireotrofina (TSH)]. Além de produzir, a pituitária é
responsável pelo armazenamento da ocitocina (OT) produzida pelo hipotálamo e,
transportada do corpo celular, no núcleo do hipotálamo, para os terminais
nervosos da pituitária posterior carreada por uma proteína (neurofisina II) atingindo
o peso molecular de 20.000, o dobro de seu peso inicial (Gaine et al., 1985).
O LH e o FSH são hormônios glicoprotéicos que consistem de duas
subunidades, α e β. A subunidade α é espécie específica e essencialmente
idêntica nestes hormônios, a β parece conferir a cada hormônio sua função
Revisão de literatura
78
biológica (Pierce & Parsons, 1981). Essas gonadotrofinas podem ser isoladas,
purificadas e seqüenciadas, possuindo cerca de 34.000 de peso molecular, como
demonstrado em trabalhos iniciais com sua extração da glândula pituitária de
eqüinos (Braselton & Mcshan, 1970).
3.6.1.4. Processo da ovulação
O processo da ovulação consiste na liberação do oócito do folículo
dominante selecionado a partir da emergência de uma onda folicular, na qual os
folículos pertencentes a mesma onda folicular que não sofreram a ovulação,
entram em atresia (Hafez, 1995).
Os folículos pré-ovulatórios passam por três modificações fundamentais
durante o processo ovulatório: a) maturação citoplasmática e nuclear do oócito; b)
diminuição da propriedade coesiva das células do cumulus entre as células da
granulosa; c) adelgaçamento e ruptura da parede folicular externa (Hafez, 1995).
Quando a onda ovulatória de gonadotrofina estimula um folículo pré-
ovulatório, a principal resposta celular é a luteinização das células da teca interna
e das células da granulosa que constituem a parede folicular pela ação do LH,
(Price & Smith, 1997). Embora o processo de luteinização não requeira a
ovulação, parece que o processo ovulatório é parte integral dos estágios iniciais
da luteinização. A ovulação e a luteinização, são dependentes de eventos da
célula da teca interna e da célula da granulosa, e a ruptura final do folículo
ovulatório pode ser dependente da ativação dos fibroblastos do tecido conectiva
tecal folicular (Price & Smith, 1997).
Pouco antes da ruptura folicular, as células do cumulus sofrem uma
dissociação parcial e acumulam em torno do oócito, formando a corona radiata,
devido a um aumento dos níveis de progesterona que estimula a síntese de
enzimas colagenases que dissociam a ligação entre as células da granulosa,
tornando a camada de células da granulosa menos espessa (Parr, 1975; Espey,
1978).
Por ação do hormônio luteinizante, ocorre a síntese de prostaglandina pelas
células da granulosa, que contribui para a ruptura dos lisossomos das células
Revisão de literatura
79
epiteliais no ápice folicular e provoca também a contração de fibras musculares do
estroma ovariano, aumentando a pressão no interior do folículo e favorecendo a
ruptura do mesmo após o adelgaçamento do ápice folicular (Brannstrom &
Hellberg, 1989). A inibição da síntese da prostaglandina pode impedir o processo
de ovulação (Hafez, 1995).
Dentre as prostaglandinas, as que atuam no processo da ovulação são, a
PGF
2∝
que participa da ruptura folicular através da ativação dos lisossomos, e a
PGE
2
que estimula a produção de plasminogênio ativador, aumentando a
atividade da plasmina que geralmente fica envolvido na migração celular dos
tecidos e provavelmente tem a função na remodelação das camadas de células
tecais e das células da granulosa durante a formação do corpo lúteo (Hafez,
1995).
Segundo Fritz & Speroff (1982), o mecanismo da ovulação pode ser
resumido em:
• O aumento do LH plasmático estimula o aumento do AMPc intracelular.
• O AMPc é o mediador da luteinização e da retomada da meiose,
superando a ação local do inibidor da luteinização e da maturação do
oócito.
• A síntese de progesterona aumenta e a parede folicular tem aumentada
sua distensibilidade.
• Aumentam os níveis de prostaglandina que junto com a plasmina e a
colagenase, digerem a parede do folículo ovariano.
• O aumento dos níveis de LH completa a divisão reducional e formação
do primeiro corpo polar.
• O pico do FSH estimula a expansão do cumulus e a produção do
ativador do plasminogênio.
• A continuidade da digestão enzimática resulta na ruptura da parede
folicular.
• Ocorre a expulsão do oócito.
• Vasos sangüíneos invadem a granulosa luteinizada.
Revisão de literatura
80
3.6.1.5. Aquisição de receptores para o LH
Em bovinos, está bem caracterizada a importância da expressão de
receptores de LH nas células da granulosa, como ponto chave para a transição da
dependência de FSH para LH (Xu et al., 1995; Beg et al., 2001). A aquisição de
receptores de LH, pelas células da granulosa, ocorre logo após o desvio na onda
de crescimento folicular, propiciando ao folículo manter a dominância adquirida
durante o nadir do pico presente de FSH e continuar o desenvolvimento a despeito
dos níveis basais de FSH presentes nesse momento. Além disso, a aquisição de
receptores de LH é fundamental para o papel desse hormônio na maturação final
do oócito (Hyttel et al., 1986 e 1997) e na própria ovulação do folículo.
O LH atua nas células-alvo foliculares ligando-se a receptores específicos,
que gera a ativação da proteína de membrana adenil ciclase, que aumenta a
produção intracelular de AMPc. É possível também ser translocado estimulando a
produção de glicose-6-fosfato, o que vai prover NADPH para a hidroxilação de
esteróides e outros propósitos biosintéticos, ainda é possível a atuação do LH
ativando diretamente a RNA polimerase (Alexander & Irvine, 1992).
Os receptores de LH estão presentes nas células da teca de folículos pré-
antrais e nos folículos com antro formado está presente nas células da teca bem
como nas células da granulosa, a expressão desses receptores é induzida pela
presença de FSH e estradiol (Ginther, 1992). A fase final da maturação folicular e
a ovulação necessitam do LH para ocorrerem, e, por esse motivo, a aplicação de
substâncias semelhantes ao LH, como a gonadotrofina coriônica humana (hCG),
em folículos com mais de 30 a 35mm de diâmetro antecipa a ovulação por
acelerar a maturação folicular. Mas, a ausência do pico de LH fisiológico não
impede totalmente a ocorrência de ovulações, evento considerado normal no
diestro da égua, quando as concentrações plasmáticas de LH estão baixas (Evans
et al., 1982; Montovan et al., 1990).
Ainda não é bem conhecido o papel do LH durante todo o processo de
desenvolvimento folicular, mas pontualmente se evidenciou seu envolvimento na
maturação folicular, ovulação, formação e manutenção do corpo lúteo e, mais
recentemente, no da luteólise.
Revisão de literatura
81
Em éguas, o aumento nas concentrações de LH e a diminuição das
concentrações plasmáticas de FSH durante a divergência folicular, foram
estudados para determinar o papel do LH na produção de estradiol e inibina
(Bergfelt et al., 2001). A redução das concentrações de LH a partir do dia -4 (dia 0
= divergência), no grupo tratado com progesterona exógena, retardou e limitou a
elevação das concentrações de inibina e estradiol a partir dos dias -3 e -1,
respectivamente. Concluiu-se que o aumento nas concentrações de LH que
precede a divergência exerce um papel funcional no maior folículo, no que diz
respeito à produção de estradiol e inibina.
O processo ovulatório é ativado pelo aumento nas concentrações
plasmáticas de LH que inicia dramáticas mudanças bioquímicas, físicas e de
expressão gênica no folículo, que culmina na ruptura folicular e liberação do oócito
(Ko et al., 2006). Com o LH sendo considerado um remodelador do folículo
ovariano em preparação para o processo ovulatório. Mudanças foliculares que
incluem a reprogramação das células da granulosa diferenciando-as para células
luteínicas grandes (CLG) e das células da teca em células luteínicas pequenas
(CLP), alteração das propriedades secretórias das células do cumulus e
maturação oocitária. Conti et al. (2006) em revisão, incluindo estudos em outras
espécies como a humana, aponta que a estimulação do folículo pré-ovulatório com
o LH envolve a ativação de uma rede de fatores de crescimento epidermal (EGF).
Essa ativação se dá via estimulação das células murais da granulosa via
sinalização com AMPc, isso gera a expressão de fatores semelhantes ao EGF.
Esses fatores de crescimento por sua vez ativam os receptores de EGF com
atuação autócrina/justácrina na camada mural ou difundida para atuar nas células
do cumulus. A ativação deste último receptor sinaliza para as células do cumulus,
em conjunto com o AMPc, provocando o início da maturação nuclear do oócito e a
aquisição de competência para desenvolver-se, bem como estimula a expansão
do cumulus.
Revisão de literatura
82
3.6.2. Maturação oocitária
O processo de maturação que resulta na aquisição da capacidade do oócito
ser fertilizado ocorre em duas fases. A primeira é conhecida como fase de
crescimento e confere ao oócito a capacidade de reiniciar a meiose (Cran & Moor,
1990). A segunda fase, caracterizada pelo reinício da meiose é normalmente
denominada de maturação final e ocorre após a puberdade no folículo pré-
ovulatório. Esta fase envolve modificações nucleares e citoplasmáticas que irão
resultar na formação de um gameta com capacidade de ser fertilizado (Cran et al.,
1980; Moor et al., 1981; Sathananthan, 1994).
A meiose, no oócito, tem início durante a vida pré-natal ou logo após o
nascimento, sendo interrompida no estágio de diplóteno da prófase I. O oócito
entra no estágio de núcleo dictiato quando se apresenta em vesícula germinativa,
permanecendo neste estágio até a puberdade quando a cada ciclo sexual, a
meiose é retomada culminado em ovulação ou atresia folicular (Ayalon et al.,
1972).
Prince & Smith (1997), relataram que a cada ciclo ovulatório, as centenas
de oócitos primários que foram recrutados para o “pool” de crescimento por meio
de estímulos de hormônios gonadotróficos, reassumem a divisão meiótica,
chegando até a metáfase da segunda divisão meiótica, sendo todos esses passos
compreendidos entre o final da prófase I e a metáfase II.
Este processo é genericamente conhecido por processo de maturação
meiótica e compreende sucessivamente a dissolução da membrana nuclear
oocitária ou quebra da vesícula germinativa, condensação da cromatina,
separação dos cromossomos homólogos, emissão do primeiro corpúsculo polar e
parada da divisão na metáfase II com os cromossomos alinhados no fuso mitótico
(Prince & Smith, 1997).
Na espécie eqüina, as relações entre as mudanças morfológicas e
endocrinológicas do fluido folicular do oócito em maturação são pobremente
descritas. Na maioria das espécies de mamíferos, a maturação nuclear in vivo
ocorre após o pico pré-ovulatório de LH (Dekel et al., 1988; Sirard & First, 1988;
Hyttel et al., 1989; Sun & Moor, 1991). Na égua não existe um pico pré-ovulatório
Revisão de literatura
83
de LH precedendo a ovulação; em lugar disso, as concentrações de LH aumentam
gradativamente durante o estro (Geschwind et al., 1975; Miller et al., 1980).
Em folículos imaturos e pré-ovulatórios de éguas menores que 37mm
(provavelmente antes da elevação de LH) o núcleo do oócito é esférico e
localizado central ou periférico ao ooplasma. O espaço perivitelino está ausente e
há uma forte união entre oócito e células do cumulus, através de numerosas
junções comunicantes com o oolema (Moor et al., 1981; Kruip et al., 1983; Hyttel
et al, 1987). As mitocôndrias estão concentradas na região cortical, e em íntimo
contato com o retículo endoplasmático formando pequenas unidade metabólicas
(Cran et al., 1980; Kruip et al., 1983; Vogelsang et al., 1987; Zamboni &
Mastroianni, 1996).
Grondahl et al. (1995) e Landim-Alvarenga (1999) descreveram os eventos
da maturação nuclear, onde se observa um achatamento do núcleo esférico do
oócito eqüino, seguido de um aumento da ondulação do envelope nuclear,
formação da placa metafásica da primeira divisão meiótica, a extrusão do primeiro
corpúsculo polar e subseqüentemente a formação da placa metafásica da
segunda divisão meiótica. O processo da maturação nuclear, termina uma hora
antes da ovulação (Hafez, 1995).
Segundo Landim-Alvarenga (1999) a maturação nuclear oocitária pode ser
classificada em quatro fases: a) vesícula germinativa (VG), quando o oócito
apresenta um núcleo esférico e localizado centralmente ou perifericamente no
ooplasma; b) quebra da vesícula germinativa, quando o núcleo do oócito
apresentar carioteca irregular ao redor da cromatina condensada e dispersa; c)
metáfase I (caracterizada pela presença dos cromossomos arranjados na placa
metafásica e localizados perifericamente ao ooplasma; d) metáfase II presença
dos cromossomos metafásicos na periferia do ooplasma e do corpúsculo polar no
espaço periférico.
A ocorrência da maturação meiótica do oócito em equinos, é acompanhada
e provavelmente regulada por mudanças no padrão de fosforilação de várias
proteínas celulares, na qual, um importante componente desta mudança é a
atividade do fator promotor de maturação (MPF), (Landim-Alvarenga, 1999). O
Revisão de literatura
84
fator promotor de maturação apresenta níveis oscilantes, onde inicialmente
aparece quando a vesícula germinal é rompida e atinge o nível máximo na fase de
metáfase I, desaparecendo transitoriamente quando o primeiro corpo polar é
emitido. O MPF, volta a reaparecer em metáfase II permanecendo em níveis
elevados até a fertilização (Hashimoto & Kishimoto, 1988).
Em conjunto a maturação nucelar deve estar ocorrendo a maturação
citoplasmática que é caracterizada por diversas mudanças no formato e
localização das organelas celulares (Landim-Alvarenga, 1999), nas fases de
metáfase I e II existem grandes mudanças nucleares e citoplasmáticas. Uma
migração maciça de mitocôndrias, vesículas e gotas lipídicas pra a região central,
resultam no aparecimento de um grande número de grânulos corticais e
complexos de Golghi livres na região periférica. Os grânulos corticais são
observados abaixo do oolema na metáfase II. Estas modificações morfológicas
são bastante similares às observadas por Enders et al. (1987), em oócitos em
metáfase II recém-ovulados, indicando que o oócito eqüino completa todo o
processo de maturação antes da ovulação.
Willis et al. (1994) trabalhando com oócito imaturos e maturos in vitro de
eqüinos por 15 horas, descreveram que, enquanto o oócito imaturo apresenta
poucos grânulos corticais e poucas microvilosidades, no oócito maturo os grânulos
corticais apresentam-se esféricos, com forma e tamanho homogêneos, densos e
migram até a membrana citoplasmática.
Os oócitos oriundos de novilhas superovuladas com FSHp apresentaram as
seguintes alterações, formação prematura do espaço perivitelineco, ausência de
vacuolização nucleolar, redução da quantidade de gotas de lipídio e ausência de
associação de lipídio-mitocondria, aumento do compartimento do retículo
endoplasmático rugoso, aumento da condensação da cromatina e expansão de
algumas células do cúmulus. Assey et al. (2005) relataram também a presença de
oócitos degenerados em novilhas superovuladas, além da redução intrafolicular
das concentrações de estrógeno e progesterona. Estas alterações podem
contribuir para a redução do desenvolvimento e maturação dos oócitos de animais
superovulados.
Revisão de literatura
85
Yun et al. (1987) avaliaram a maturação oocitária de ratas superovulads
com PMSG e relataram uma marcante alteração na resposta ovariana e
esteroidogenica sérica o que pode conduzido a uma grande quantidade de oócitos
degenerados. Em um subseqüente estudo, Yun et al. (2005) demonstraram haver
oócitos de ovulações de ratas superovuladas (PMSG) com prematuridade ou
asincronia na maturação nuclear, sendo observado uma grande variação de
oócitos entre Prófase I e Metáfase II, ao contrário de animais não superovulados
onde a maioria dos oócitos apresentam em Metáfase II. Assim como relatado por
Assey et al (2005), estes autores observaram uma diminuição nos níveis de
progesterona no fluido folicular e também uma diminuição nos níveis de
andrógenos. Os níveis de Estrógeno não variaram entre ratas superovuladas e
não superovuladas.
Segundo Carneiro et al. (2002), o estudo da migração dos grânulos corticais
em oócitos mamíferos é um importante critério para avaliar a maturação
citoplasmática. Os oócitos eqüinos em estágio de VG (imaturos) apresentam
grânulos corticais (GC) dispersos no citoplasma, com o decorrer da maturação (30
a 36 horas) ocorre uma progressiva migração centrípeta dos GC em direção ao
córtex oocitário, formando uma monolinha adjacente a membrana plasmática
(Landim-Alvarenga, 2004). Sendo que a migração cortical tem uma correlação
positiva com a maturação nuclear (Franz et al., 2002).
A principal característica dos oócitos eqüinos, independente do seu estado
de maturação nuclear, é a presença de uma grande quantidade de gotas de
lipídios em associação com mitocôndrias e retículo endoplasmático liso,
apresentando conteúdo amorfo de densidade eletrônica média, sugerindo a
formação de unidades metabólicas (Kruip et al., 1983; Landim-Alvarenga, 2002).
De fato a observação de algumas gotas sem o conteúdo amorfo e apresentando
restos de membrana indica a metabolização do material neles contido,
provavelmente colesterol. A aparência diferente do conteúdo presente nos oócitos
maturos, nos quais as gotas aparecem vazias e a associação menos consistente
com as mitocôndrias, pode indicar que o processo de maturação demanda a
metabolização do conteúdo destas gotas (Landim-Alvarenga, 2002).
Revisão de literatura
86
É conhecido que o retículo endoplasmático liso está envolvido no
metabolismo lipídico (Ginther, 1992). Esta observação morfológica pode indicar
que oócitos e/ou embriões de equinos tem a capacidade de sintetizar colesterol.
De fato embriões de equinos são capazes de produzir estrógeno durante os
estágios iniciais de seu desenvolvimento (Ginther, 1992).
Tanto nos oócitos maturos quanto imaturos foi observado a presença de
complexos de Golgi localizado na periferia próximo ao ovolema. Entretanto, nos
oócitos imaturos, fixados logo após a colheita, o complexo de Golgi apresentou-se
mais desenvolvido, constituído por inúmeras lamelas dilatadas associadas a
vesículas membranosas de eletro-densidade variável, tanto na face de cis como
trans. As da face de cis são vesículas recobertas e podem ser as vesículas
picnóticas vistas na superfície do oócito as quais estariam migrando em direção ao
Golgi. Neste caso as vesículas da face trans poderiam conter o material absorvido
já elaborado pelo Golgi. Como grânulos semelhantes aos grânulos corticais são
observados na proximidade desta organela é possível que esta tenha um papel na
sua produção. Nos oócitos maturos, o complexo de Golgi também está presente
na periferia do oócito, mas com tamanho reduzido indicando menos atividade, o
que poderia ser explicado por já ter concluído a produção de grânulos corticais
(Landim-Alvarenga, 2002).
Bezard et al. (1995) compararam a maturação nuclear e citoplasmática em
oócitos de éguas superovuladas com o EPE e não superovuladas, e constataram
que não há diferença na competência oocitária, porém a composição do líquido
folicular parece ser diferente entre os grupos superovulado e não superovulado.
3.6.2.1. Oogênese
A oogênese é considerada como o processo de formação, crescimento e
maturação do gameta feminino (Austin & Short, 1982; Ginther, 1992), iniciando-se
na fase embrionária, através da formação das células germinativas primordiais
originárias das células tronco embrionária, e termina na fase de puberdade por
ocasião da fecundação (Austin & Short, 1982).
Revisão de literatura
87
As células germinativas primordiais são oriundas do saco vitelíneo. Elas
inicialmente migram para o epitélio embrionário e posteriormente para o
mesênquima da crista genital, colonizando a gônada indiferenciada ainda na vida
fetal (Wassarman, 1988). Nesta fase as células germinativas primordiais sofrem o
processo de mitose, recebendo a denominação de oogônias ao redor dos 50 dias
de gestação na espécie eqüina (Deansly, 1978). O processo de mitose da célula,
é constituído de quatro fases: diplóteno-2n, síntese de DNA, 4n e a divisão
mitótica que é subdividida em prófase, pró-metáfase, metáfase e telófase (Gordon,
1994).
Na fase de telófase da subdivisão mitótica, a célula que apresentava 4n
cromossomos volta a apresentar 2n cromossomos, devido a divisão ou separação
das cromátides irmãs (Austin and Short, 1982), dando origem a uma linhagem de
células oogoniais e a uma outra célula que permanece em interfase que se divide
periodicamente, originando-se em nova célula germinativa que diferenciará em
oogônia (Russe, 1983).
Numa fase pré–meiótica da prófase I, denominada de preleptóteno, o
gameta com 2n cromossomo tem seu DNA duplicado pela síntese de DNA
(Sagata, 1996), dando início à meiose e transformando a oogônia em oócito
(Gordon, 1995).
O processo da meiose ocorre aproximadamente entre 75 e 160 dias de
gestação na égua (Ginther, 1992). É caracterizado pela presença do gameta 2n
cromossomo, que sofre a primeira divisão meiótica, passando pelas fases de
leptóteno, zigóteno e paquiteno da prófase I, dando origem a uma célula haplóide
(1n cromossomo) (Picton, 2001). Nesta fase de prófase I da meiose, forma–se o
oócito primário, que se apresenta recoberto por uma fina camada de células da
granulosa no folículo primordial, permanecendo quiescente no estágio de
diplóteno, conhecido como estágio de dictióteno ou de vesícula germinativa até a
puberdade, quando os folículos selecionados estarão aptos a ovularem (Picton,
2001).
Todos os oócitos que não forem incorporados aos folículos primordiais
serão degenerados, porém os folículos primordiais estabelecidos serão recrutados
Revisão de literatura
88
pelas ondas foliculares, pelo resto da vida dos animais, ou até o final da atividade
ovariana (Gosden & Telfer, 1987). Na fase pré-puberal, imediatamente antes da
ovulação, reinicia-se a divisão meiótica e a vesícula germinativa passa para o
estágio de diacinese, quando em seguida ocorre o rompimento da vesícula
germinativa, a condensação cromossômica e a organização dos cromossomos no
plano equatorial, correspondendo ao estágio da metáfase I (Gordon,1994). Em
seguida, ocorre a expulsão do primeiro corpúsculo polar e o oócito passa a ser
denominado de secundário, correspondendo às fases de anáfase I e prófase I
(Vanderwall, 1996). A partir desse momento, inicia a segunda divisão meiótica em
estágio de metáfase II, quando ocorre a segunda interrupção da meiose (Gordon,
1994).
Nesta fase, o oócito já possui maturação nuclear completa e está preparado
para a fecundação do espermatozóide, o qual se houver a fertilização do oócito,
inicia a segunda divisão da meiose, passando pelos estágios de anáfase II
(cromatides separadas), telófase II e zigoto ou oócito terciário, ocorrendo a
expulsão do segundo corpúsculo polar e originando o pró-núcleo feminino, dentro
do espaço perivitelíneo (Goudet et al., 1998). Em alguns casos, o oócito equino
imaturo em metáfase I da meiose pode ser encontrado no oviduto, onde será
maturado e concluído a metáfase II da meiose (Vanderwall, 1996).
3.6.2.2. Fatores que influenciam a maturação oocitária
Os fatores que influenciam a maturação oocitária incluem as condições
físicas como osmolaridade e composição iônica (Yamauchi et al., 1999),
temperatura, pH, tensão de CO
2
e O
2
assim como o volume de cultura, presença
de células do cumulus, adição de gonadotrofinas ao meio de maturação e o tempo
de cultivo dos oócitos. Foi comprovado em diversas espécies que a presença das
células da granulosa durante a maturação é benéfica (em humanos, Kennedy &
Donahue, 1969; coelhos e vacas, Robertson & Baker, 1969). Associação entre as
células germinativas e somáticas regula os níveis de síntese e o padrão de
fosforilação de proteínas específicas no oócito em crescimento, regulando,
portanto o metabolismo do mesmo.
Revisão de literatura
89
Fatores de crescimento, gonadotrofinas, soro específicos e diferentes
condições de cultivo revelaram influência nas taxas de produção e qualidade
embrionária, porém, ainda não se tem relato sobre uma resposta total dos oócitos
cultivados nestas condições (Sirard et al., 1998). Apesar de sabermos da
influência dos meios e condições de cultivo, são os próprios constituintes originais
do oócito que são os responsáveis por controlar a habilidade de responder as
condições mais adequadas de cultivo (Sirard, 2001).
Desse modo a maioria dos laboratórios ainda utiliza as condições
inicialmente propostas por Moor et al. (1984), onde o meio de cultivo celular TCM-
199 é suplementado com soro fetal bovino, estradiol e gonadotrofinas.
A maturação meiótica in vivo de oócitos mamíferos é conhecida por ser
regulada através de gonadotrofinas. Brackett et al. (1989) demonstraram que a
utilização de hormônio luteinizante (LH) bovino no meio de maturação in vitro
aumentou significativamente a qualidade embrionária. Sugere-se que FSH tenha
um efeito benéfico e que a presença de gonadotrofinas melhore a expansão das
células do cumulus e conseqüentemente leva a melhoras na capacitação
espermática e na fertilização (Eyestone & Boer, 1993).
Um outro componente importante é a atividade do fator promotor de
maturação (MPF), o qual acredita-se ser um regulador universal do ciclo celular,
tanto na mitose como meiose (Nurse, 1990). O MPF é uma proteína composta por
uma subunidade catalítica, a kinase 1 ciclina dependente (cdk1) e uma
subunidade reguladora, a ciclina B (Downs, 1993; Taieb et al., 1997). O MPF ativo
induz a condensação dos cromossomos, o desaparecimento do envelope nuclear
e reorganização do citoplasma para a entrada na fase M (divisão) tanto do ciclo
mitótico como meiótico (Murray & Kirschner, 1989).
Existem fatores de crescimento produzidos nos ovários que estão
envolvidos na regulação da maturação nuclear e na expansão do cumulus. Os
fatores de crescimento relacionados com a maturação oocitária são o Fator de
Crescimento Epidermal (EGF), Fator de Crescimento semelhante à Insulina I e II
(IGF-I e IGF-II) (Tsafari & Adashi, 1994).
Revisão de literatura
90
Em bovinos, Lorenzo et al. (1995) observaram que o EGF atua estimulando
a maturação do Complexo Cumulus Oócito (CCO), mas não atua, em oócitos
desnudados (sem células do cumulus).
Quanto ao IGF-I, receptores foram detectados tanto no oócito quanto nas
células do cumulus, e já foi demonstrado previamente que o IGF-I modula uma
variedade de funções das células foliculares somáticas como a proliferação,
diferenciação e esteroidogênese (Xia et al., 1994). Pesquisas mostraram que a
expansão das células do cumulus ocorre por influência deste fator de crescimento,
e que o IGF-I possa ser produzido endogenamente pelos CCOs (Singh &
Armstrong, 1997).
As razões para a falha dos oócitos eqüinos em completar a meiose durante
a maturação in vitro são desconhecidas, mas podem estar ligadas a uma alteração
da cascata bioquímica envolvida na meiose (Goudet et al., 1998).
3.6.2.3. Competência oocitária
A maturação de um folículo está diretamente relacionada à capacidade de
seu oócito suportar a fertilização e o posterior desenvolvimento embrionário.
Estudos têm demonstrado que o crescimento máximo do oócito no momento que
antecede a ovulação está relacionado diretamente com a sua competência (Hyttel
et al., 1997). Assim, em vacas superovulados, devido à população heterogênea de
folículos, podem ocorrer ovulações de oócitos ainda não completamente
capacitados para a fertilização e o desenvolvimento embrionário (Callesen et al.,
1987; Hyttel et al., 1991), sendo uma característica da espécie eqüina à retenção
destes no oviduto, impedindo-os de migrarem até o útero.
Muitos estudos correlacionados a morfologia oocitária à qualidade
embrionária e as taxas de fertilização, clivagem e gestação. A morfologia do oócito
inclui a avaliação da forma, tamanho do espaço perivitelínico, presença de
vacuolização, granulação ou inclusão citoplasmática e anormalidades da zona
pelúcida e do corpúsculo polar (De Sutter et al., 1996).
Xia (1997) sugere que a taxa de fertilização e a qualidade dos embriões
provenientes de oócitos com corpúsculos polares intáctos, espaço perivitelínico
Revisão de literatura
91
normal e sem inclusões citoplasmáticas são significativamente melhores em
comparação à taxa de fertilização e a qualidade embrionária obtidas com oócitos
morfologicamente alterados. Loutradis et al. (1999) relataram a formação de
embriões de pobre morfologia a partir de oócitos morfologicamentes anormais e
baixas taxas de gestação. Avaliaram também o valor prognóstico da morfologia do
primeiro corpúsculo polar e observaram taxa de fertilização, qualidade embrionária
e taxa de implantação melhores quando o corpúsculo polar apresentava-se
intácto.
3.7. Aspiração Folicular
Nos últimos anos, tem-se havido um crescente interesse nas biotecnologias
assistidas em reprodução eqüina em conseqüência do avanço socio/economico
apresentado na cosmovisão do criatório de cavalo. A biotécnica aspirativa folicular
em éguas apresenta-se como uma alternativa para suprir a necessidade
reprodutiva de éguas subférteis, que por qualquer problema reprodutivo, ou seja,
por patologias reprodutivas venha a ter dificuldades em gerar a prole ou serem
doadoras de embriões (Bogh, 2003).
Esta técnica tem como propósito a recuperação de oócitos com fins de ser
transferido para uma égua receptora. Este oócito pode ser fertilizado in vivo
através da técnica de transferência de oócito (TO), onde o oócito (maturado in-vivo
ou in-vitro) é transferido cirurgicamente para o oviduto de uma égua receptora pelo
acesso do flanco e procedendo a inseminação artificial via vagina/uterina
(Carnevale et al., 2001). Uma outra técnica é a transferencia intrafalopiana de
gametas (GIFT) que segue o mesmo protocolo da TO porem a inseminação
artificial é realizada no oviduto juntamente com o oócito (Carnevale, 2004).Entre
estas duas técnicas de inseminação, Carnevale et al. (2001) não observaram
diferença significativa (12/22 55% e 14,26 55% respectivamente para as
inseminações intra uterino e intra oviduto).
Quanto a fertilização do oócito em laboratório, há limitados sucessos no
desenvolvimento da técnica de fertilização in-vitro (FIV) em equinos, devido a dois
Revisão de literatura
92
principais fatores, a maturação do oócito e a capacitação espermática (Squires et
al., 2003). Os únicos potros produzidos in-vitro foi relatado através da técnica da
injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICS), onde se injeta um
espermatozoide no interior do oócito, sendo este clivado e desenvolvido até a fase
de blastocisto, onde será transferido para o útero da égua receptora (Carnevale &
Ginther, 1993).
Palmer et al. (1987) foram os primeiros a descreverem a técnica de OPU
com a égua em estação, cujo operador fixava o ovário com a mão pelo reto
guiando-o até a agulha de punção através do flanco até atingir o folículo.
McKinnon et al. (1987) relataram índices de recuperação de 71,4% utilizando um
trocáter e uma agulha de 9,8mm para aspirar folículos pré-ovulatórios de éguas
através do flanco.
Procedimento semelhante foi descrito por Hinrichs et al. (1990), com índices
de recuperação de 73,0%. Neste caso, foi adicionado à técnica de aspiração pelo
flanco, uma incisão na parede cranial da vagina, a qual permitia ao operador
introduzir sua mão na cavidade peritonial e fixar o ovário diretamente contra o
trocáter.
Vogelsang et al. (1988) comparou a coleta de oócitos via punção
transcutânea pelo flanco com a coleta via laparotomia e exposição do ovário. O
primeiro experimento, usando uma agulha de 13G e 15cm de comprimento
conectada a um tubo de látex e uma seringa estéril, obteve uma taxa recuperação
de 10%.Com a laparotomia, usando a mesma agulha, esta taxa subiu para 14% e
quando associada a um sistema de irrigação contínua a vácuo subiu para 60%.
Este mesmo sistema de irrigação proporcionou uma taxa de 38% quando usado
para punção transcutânea, indicando que a coleta de oócitos com o animal em
estação era possível, com sucesso moderado, sem danos ao oócito.
O primeiro relato de OPU transvaginal em éguas foi o relatado em 1992 por
Bruck et al. utilizando-se um transdutor setorial acoplado a uma guia transvaginal,
e conectado a um aparelho de ultra-som, direcionando-se a agulha de aspiração
por uma linha de biópcia presente na tela deste aparelho.
Revisão de literatura
93
Há uma dificuldade na recuperação de oocitos em éguas através da técnica
de aspiração folicular, em conseqüência da sua anatomia a parede do folículo. Na
égua. O folículo apresenta uma camada de células da teca, logo abaixo da junção
das células do cumulus oophorus com a parede folicular. Uma das características
anatômicas desta estrutura é a presença de processos celulares emitidos pelas
células da granulosa para o interior da camada de células tecais. Desta forma, os
processos das células da granulosa, bem como a posição da camada de células
tecais e a estrutura do componente polissacarídeo, funcionam como uma âncora
do complexo Cumulus-Oócito (CCO) à parede folicular (Hawley, 1995).
A técnica de aspiração folicular em éguas também têm sido utilizado com o
propósito de acelerar a formação do corpo lúteo, ou seja, no aumento dos níveis
de progesterona circulante. Alvarenga et al. (1999) observaram a formação de
corpo lúteo em 38% das éguas aspiradas em fase de transição com folículo acima
de 30mm, dando continuidade ao estro após ser administrado PGF
2α
sete dias
após este procedimento.
Uma tentativa foi realizada para aumentar o número de folículos pequenos
e médios, para a recuperação de oócitos através da aspiração do folículo
dominante antes do estabelecimento da dominância. Éguas cíclicas foram
aleatoriamente divididas em quatro grupos no dia da ovulação. Cada égua foi
avaliada diariamente pela ultra-sonografia transretal oito dias após a ovulação
para determinar o crescimento e a regressão de folículos maiores que 15mm de
diâmetro. Uma vez detectado o folículo dominante, as éguas do G1 foram
submetidas a aspiração deste folículo e três dias após todos os demais que
apresentaram diâmetro maiores que 15mm. No G2 foi identificado o folículo
dominante, porem não aspirando, sendo todos os folículos maiores que 15mm
aspirados três dias após a identificação do dominante. No G3 foi aspirado o
folículo dominante e seis dias após todos os demais que apresentaram o diâmetro
maior que 15mm. No G4 teve o mesmo procedimento do G2, porém a aspiração
foi realizada seis dias após a identificação do folículo dominante. O folículo maior
que 25mm de diâmetro por dois dias consecutivos após o oitavo dia da ovulação
foi considerado como dominante, sendo este identificado em média 15,1 dias após
Revisão de literatura
94
a ovulação. A média do número de folículos pequenos (3 a 17mm) e médios (18 a
27mm) não diferiu estatisticamente nos dias três e seis após a
identificação/aspiração do folículo dominante em todos os grupos tratados. As
éguas do grupo 2 tiveram um número significativamente maior (p<0,05) de
folículos grandes (≥28mm) três dias após a identificação do folículo dominante em
relação ao G1 (1,3 – 0,5 folículos, respectivamente), e as médias para os grupos 3
e 4 foram similares. No G4 a taxa de atresia foi maior para os folículos
subordinados em relação aos grupos aspirados no momento da identificação.
Houve um percentual maior de folículos que cresceram após a aspiração do
folículo dominante (47/137 ou 34,3%) quando comparado os não aspirados
(15/133 ou 11,3%). Estes autores concluíram, que a aspiração do folículo
dominante não aumenta o número de folículos pequenos ou médios três ou seis
dias após a ovulação, entretanto, uma pequena proporção de folículos entrou em
atresia após a aspiração do folículo dominante quando comparado com os que
manteve o dominância intacta. Contudo, minimizando o número de folículos
subordinados em processo de atresia pode-se ter um benefício na recuperação de
oócitos viáveis destes folículos (Dippert et al., 1995).
Para avaliar o efeito da aspiração in vivo do líquido folicular de folículos pré-
ovulatórios em éguas, Hinrichs et al. (1991) aspiraram folículos entre 30 e 34mm
(G1) e entre 35 e 49mm (G2) de diâmetro, e observaram que a ocorrência de
ovulações secundárias foi maior (54%) no o G1 do que no grupo G2 (18,2%). Foi
observado 11 ovulações de 32 ciclos entre o terceiro e o oitavo dia pós-aspiração,
sugerindo que o líquido folicular pode conter fatores que inibem o crescimento de
folículos secundários. Os autores também compararam os efeitos da aspiração e
da ovulação através dos níveis de progesterona, e observaram que a remoção do
líquido folicular não mimetiza completamente a ovulação, apesar da formação do
corpo lúteo.
Franco (2005) estudou o efeito da aspiração folicular na fertilidade do
subsequente ciclo estral de éguas. Foi observado que 73,3% das ovulações
ocorreram no mesmo ovário do ciclo anterior aspirado, e o número médio de dias
da aspiração a ovulação foi de 20 dias. A média de dias da aplicação da PGF
2α
Revisão de literatura
95
(administrada 8 dias após a aspiração) até a ovulação foi de 15,5 (folículos
aspirados entre 25 a 20mm), 13,0 (folículos aspirados 30 a 34mm) e 8,0 (folículos
aspirados acima de 35mm). Neste trabalho, nenhuma ovulação secundária foi
observada, ao contrário do trabalho descrito anteriormente por Hinrichs et al.
(1991). Nenhuma diferença foi encontrada na duração da liberação, no pico de
progesterona e no percentual de prenhes entre éguas aspiradas e não aspiradas.
Entretanto, pode-se concluir que a aspiração transvaginal de folículos de
diferentes tamanhos não interfere nos índices de prenhez do ciclo subsequente à
aspiração, sendo uma biotécnica segura em eqüinos.
Em um estudo mais recente, Scott et al. (2006) avaliaram a taxa de
recuperação de oócito de éguas em fase de transição, cíclica e prenha, através da
aspiração de folículo, guiado por ultra-som via transvaginal. A aspiração dos
folículos foi dividida em dois grupos em relação ao seu tamanho, grandes
(>20mm) e pequenos (10 a 20mm). As éguas em transição foram divididas em
dois grupos, o primeiro recebeu 12,5mg eFSH uma vez ao dia por quatro dias, e o
segundo não recebeu nada, ou seja o grupo controle. Para as éguas ciclantes,
estas também foram divididas em dois grupos, o primeiro recebeu 12,5mg eFSH
duas vezes ao dia por um período de três dias, e o segundo grupo como controle.
As éguas prenhas foram aspiradas com 25, 40 e 55 dais de gestação e não foram
tratadas com eFSH. O número de folículos pequenos e grandes por égua, o
número de oócitos recuperados de foliculos pequenos e grandes por égua e o
percentual e o percentual de recuperação de oócito por folículos pequenos e
grandes em éguas controle em fase de transição foi de 5,61; 1,64; 1,21; 0,11;
23,6; 10,0, respectivamente. Para as éguas tratadas com eFSH em fase de
transição foi de 6,14; 1,18; 0,96; 0,21; 19,0; 11,0, respectivamente. Nas éguas em
fase cíclica controle foi de 5,86; 2,25; 1,07; 0,14; 22,6; 5,8. Para as éguas em fase
cíclica tratada com eFSH foi de 6,25; 2,64; 1,39; 0,46; 21,2; 20,1, respectivamente.
Já para as éguas prenhas aos 25 dias de gestação foi de 9,27; 2,36; 2,91; 0,73;
27,7; 30,5, respectivamente. Aos 40 dias de gestação foi de 9,18; 0,82; 2,73; 0,45;
38,1; 23,0, respectivamente, e para o grupo das éguas aos 55 dias de gestação foi
de 6,73; 0,79; 1,47; 0,04; 27,0; 10,2, respectivamente.
Revisão de literatura
96
Carnevale (2005) obteve uma taxa de recuperação de oócitos em folículos
pré-ovulatórios de 77%, preconizando a aspiração desta categoria de folículos
como sendo o melhor momento para coleta em programas comerciais de
transferência de oócitos. Estes autores relatam também que a taxa de
recuperação de oócitos e maior quando se faz a indução da ovulação com a
associação do hCG com a deslorelina.
A influência da pressão de vácuo nas taxas de recuperação de oócitos foi
estudada por Kanitz & Berger (1995). Quatorze ovários de matadouro forneceram
37 complexos cumulus oócito (COC) de 134 folículos entre 5 e 46mm quando uma
pressão de 0,2 ou 0,4 bar (1mmHg = 1,333 x 10
-3
bars) era usada. Não houve
diferença na taxa de recuperação (28,8% x 26,4%) quando comparadas as duas
pressões de vácuo. Bruck & Greeve (1997) investigaram os efeitos da aspiração e
lavagem do folículo usando uma agulha de 18G e uma seringa de 60mL,
comparado à sucção e lavagem do folículo com bomba de elétrica. O uso da
bomba elétrica não aumentou as taxas de recuperação, e as aspirações efetuadas
a um intervalo de 6 dias resultaram em menores taxas de recuperação (18,5%)
que as efetuadas em intervalo de 23 dias (35,8%).
Cook et al. (1992), usando um transdutor curvilinear de 5mHz e uma bomba
de vácuo a 300mmHg de pressão ligada a uma agulha de 12G e lúmen simples,
determinaram que a lavagem do folículo aspirado é um fator essencial para a
coleta de oócitos, já que nenhum foi encontrado no fluido folicular enquanto
repetidas lavagens do mesmo folículo resultaram em taxas de recuperação de
52% para folículos pré-ovulatórios previamente tratados com hCG. Em 1993 este
mesmo grupo, trabalhando novamente com folículos pré-ovulatórios, comparou as
agulhas de lúmen simples e duplo, obtendo uma taxa de recuperação de 84% com
a agulha de lúmen duplo, pois esta permitia que o fluido penetrasse
continuamente no folículo enquanto a sucção estava sendo aplicada. A agulha de
12G com lumen simples foi considerada de eficiência intermediária, com 52% de
recuperação de oócitos.
Há dúvidas se as agulhas com lúmen simples ou duplo devem ser usadas
em folículos em diestro. Cook et al. (1993) não encontraram diferenças nas taxas
Revisão de literatura
97
de recuperação (22%), mas Bracher et al. (1993) relataram 12,3% de recuperação
de oócitos com agulhas de lúmen simples e 24% com agulhas de lúmen duplo
para esta categoria de folículos.
A turbulência criada pela lavagem do folículo após a aspiração facilita o
destacamento do oócito em folículos pré-ovulatórios, onde a conexão entre o
oócito e as células da parede folicular é mais fraca devida expansão do cumulus
pela deposição de hialuronidase mediada por gonadotrofinas (Hafez & Hafez,
2000; Brück et al., 1996). Entretanto, em folículos de diestro, só a lavagem do
folículo não é suficiente para a retirada do oócito, sugerindo-se a escarificação da
parede folicular com agulha para que seja liberado o oócito imaturo (Mari et al.,
2004). A curetagem da parede folicular e mais fácil de ser realizada quando o
folículo apresenta diâmetro pequeno, no entanto os oócitos oriundos de folículos
com menos de 10 mm de diâmetro apresentam baixa capacidade de sofrer
maturação in vitro (Goudet et al., 1997).
Cook et al. (1993) sugeriram que a recuperação de oócitos poderia
aumentar se múltiplos folículos grandes estivessem presentes no momento da
coleta o que poderia ser conseguido com o uso de protocolos de superovulação
para estimular o crescimento de muitos folículos de uma onda folicular, embora
esta manipulação ocasione algumas restrições na qualidade do oócito,
particularmente se estes estivessem designados para a atresia. Além disso,
ovários superestimulados possuem um tamanho exacerbado que dificulta a
manipulação manual para o posicionamento e aspiração dos folículos (Squires,
1996).
O trabalho em aspiração folicular descrito por Vogelsang et al. (1988)
incluiu EPE para estimular o desenvolvimento folicular. Uma taxa de recuperação
maior foi observada em éguas tratadas em comparação às não tratadas (45% x
16%). Ao contrário, Bruck & Greeve (1997) relataram que o tratamento, de quatro
dias, com FSH suíno (100 mg/dia) não melhorou a taxa de recuperação
comparando-se com as éguas não tratadas. Cook et al. (1993) relataram uma
baixa taxa de recuperação de oócitos de folículos pré-ovulatórios de éguas
tratadas com EPE: uma média de três folículos pré-ovulatórios se desenvolveu por
Revisão de literatura
98
égua em cada ciclo estral, com taxas de recuperação de 61% contra 84% em
folículos de ciclos normais das éguas não tratadas.
Uma das principais perguntas quanto à técnica de aspiração folicular é se
esta impõe alguma seqüela a fertilidade da égua em repetidas aspirações. Para
responder esta pergunta, Bruck et al. (1997) aspiraram folículos por cinco cíclos
consecutivos em dois diferentes intervalos, o primeiro a cada seis dias (A1, B1 e
C1) e o segundo com intervalo ≥23 dias (A2, B2 e C2). Neste estudo foram
aspirados todos os folículos ≥5mm em três grupos: A) aspiração e lavagem do
folículo usando uma seringa 60mL, B) aspiração e lavagem do folículo usando
uma bomba de vácuo, C) aspiração e lavagem do folículo usando uma bomba de
vácuo após quatro dias de tratamento com 100mg de FSHp, administrado uma
vez ao dia via intramuscular. Para o lavado dos folículos, foi utilizado DPBS com
100UI/ML de heparina. Os resultados estão ilustrados nas tabelas a baixo:
Intervalo das
aspirações
Técnica
Nº de
aspirações
Diâmetro dos folículos aspirados (mm)
5-10 11-20
21-30
31-40
Total
6 dias
A1
3 11 14 - 1 26
B1 5 10 18 3 - 31
C1 5 17 24 5 - 46
≥ 23 dias
A2 4 6 13 4 1 24
B2 5 23 21 2 1 47
C3 2 18 17 3 - 38
Total 24 85 107 17 3 212
Grupo
Estágio de desenvolvimento nuclear do oócito
VG
VGBD
MI
MII
Degenerado
Total
B1 8 2 1 2 - 13
B2 - 3 - - 2 5
C1 8 3 - - - 11
C2 2 3 - - 2 7
Total 18 11 1 2 4 36
Os resultados, das tabelas acima, mostraram que as aspirações repetidas a
cada seis dias teve uma menor taxa de recuperação dos oócitos em relação as
Revisão de literatura
99
aspirações a cada ≥ 23dias, entretanto as duas técnicas de aspiração folicular
(seringa e bomba de vácuo) não houveram diferença.
Em um outro trabalho mais recente, Mari et al. (2005) realizaram três a
quatro aspirações consecutivas de 20 éguas em fase de estro (folículo ≥ 35mm de
diâmetro) e diestro (folículo ≥ 20mm de diâmetro), perfazendo um total 76 cíclos
aspirados, 153 folículos aspirados e 31 oócitos recuperados. Foi comparado
também a taxa de recuperação de oócitos de folículos apenas aspirados e de
folículos aspirados/lavados, o que resultou em 46,4% e 12,5% de oócitos
recuperados respectivamente aos grupos anteriores em éguas em fase de estro,
para as éguas em fase de diestro a taxa de recuperação foi de 30,0% e 26,7%,
respectivamente. Das 20 éguas aspiradas, 10 foram inseminadas e sete (7)
ficaram prenhas. Contudo, aspirações foliculares não interferem na taxa de
prenhes, e que há uma melhor recuperação de oócitos em éguas com folículos
pré-ovulatórios através da aspiração/lavagem folicular.
A recuperação de oócitos de éguas prenhes parece ser mais alta
comparada a éguas controle. Goudet et al. (1998) relatam índices de recuperação
de oócitos de 54% em éguas prenhes vs 47% em éguas cíclicas. Meintjes et al.
(1995) obtiveram 75% de recuperação de oócitos em éguas prenhes contra 42,9%
no grupo controle de éguas com folículos pré-ovulatório. Onze aspirações foram
realizadas por éguas num período de 44 dias (entre os dias 22 a 66 de gestação)
com um máximo de sete (7) oócitos sendo recuperados por seção. Em um segundo
estudo, (Meintjes et al., 1997) as aspirações foliculares foram realizadas até os 150
dias de gestação. O número médio de aspirações por égua foi de 7,6 e o número
médio de oócitos obtidos 18,9 por égua. Os autores concluíram que cerca de 2,5
oócitos podem ser coletados a cada sete a 10 dias em éguas prenhes. Foi
estimado que 19 oócitos poderiam ser coletados de uma mesma égua durante os
dias 21 a 150 de gestação, comparado com 12 coletados durante 130 dias em
éguas ciclando, sem estimulo hormonal. Cochran et al. (1998) aspirou em média 13
folículos por seção com índices de recuperação de 66% em 20 aspirações
realizadas entre os dias 14 e 70 de gestação.
Experimentos 101
4. EXPERIMENTOS
4.1 Preparação do extrato de pituitária eqüina
O extrato de pituitária eqüina foi preparado segundo o método proposto por
Guillon & Combarnous (1983) no Departamento de Reprodução Animal da
Faculdade de Medicina Veterinária e zootecnia da Universidade Estadual Paulista
(FMVZ/UNESP), Campus de Botucatu - SP. As pituitárias foram adquiridas em
frigorífico de eqüino, localizado na cidade de Pelotas-RS, sendo congeladas (-20
O
C)
e conduzidas ao laboratório do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia
Veterinária (FMVZ/UNESP). Para a extração das pituitárias, foi realizado um corte
obliquo caudo/cranial na região caudal ao pavilhão auricular e mandíbular; após a
remoção do encéfalo a pituitária pode ser visualizada na célula túrsica, sendo
removida com o auxilio de uma espátula (figura 01). Ao serem processadas, estas
foram descongeladas e banhadas em água destilada/deionizada, trituradas em
liqüidificador doméstico com solução de 40% de etanol, álcool etílico P.A.
(Laboratório Dinamica
, São Paulo), e 6% de acetato de amônia (Laboratório
Synth
, São Paulo-SP). A fração ativa foi então precipitada aumentando-se a
concentração de etanol em 80%, tendo sido em seguida dializada, liofilizada e
conservada a uma temperatura de -20°C.
Ao ser utilizado, o EPE liofilizado foi diluído em solução fisiológica na
proporção de 10mg/mL, sendo conservado em refrigerador a 5°C no período
máximo de sete dias.
Os níveis de FSH e LH presente no EPE, foram avaliados na Universidade da
California, Davis – EUA através da técnica de radioimunoensaio (R.I.A), onde foram
detectados níveis de 480µg e 340µg para LH e FSH, respectivamente.
Experimentos 102
• A: Corte cranial ao pavilhão auricular
• B: Remoção de todo o cérebro
• C/D: Extração da pituitária
• E: Fossa da célula tursica
• E: Demonstração de quatro pituitárias
Figura 01: Procedimento em abatedouro de eqüino para extração da pituitária.
A
D
E
B
C
F
Experimento I 104
4.2 EXPERIMENTO I
“ESTUDO DO TRANSPORTE DOS OÓCITOS PARA O OVIDUTO DE ÉGUAS
SUPEROVULADAS COM EXTRATO DE PITUITÁRIA EQUINA”
4.2.1 MATERIAL E MÉTODOS
4.2.1.1 Monitorização e tratamento das éguas superovuladas
Foram monitorizados dois ciclos estrais de cada égua sendo o primeiro ciclo
usado para detecção do dia da ovulação (D0) e o segundo ciclo a ser superovulado.
A detecção do cio das éguas foi realizada diariamente e individualmente em
troncos de contenção, com o auxílio de um rufião. O tratamento superovulatório
(Extrato de Pituitária Eqüina) foi iniciado no 7
o
dia pós-ovulação, sendo estipulado
para ser iniciado o tratamento a presença de corpo lúteo e folículos não maiores que
20mm. A dose administrada do EPE foi de 25mg por via intramuscular em intervalos
regulares de 12h. A PGF
2α
(250µg/dia de cloprostenol) foi administrada no primeiro e
segundo dia do início do tratamento superovulatório. O tratamento foi interrompido
quando a maioria dos folículos atingiu 35mm de diâmetro; sendo neste momento
administrado 2500UI de hCG (gonadotrofina coriônica humana - Vetecor
Laboratorio Calier, São Paulo, SP) por via intravenosa, visando acelerar o processo
da maturação folicular e oocitária.
O esquema detalhado do tratamento superovulatório está descrito a seguir:
• Primeiro dia do tratamento (7
o
dia pós-ovulação): iniciou-se no período da manhã
(7:00 h) administrando-se 25mg/IM do EPE e após uma hora a PGF
2α
250µg/IM. No
período da tarde (18:00 h), aplicou-se 25mg/IM do EPE.
• Segundo dia do tratamento: pela manhã (7:00 h), administrou-se 25mg/IM do
EPE e uma hora mais tarde a PGF
2α
(250µg). No período da tarde (18:00 h) aplicou-
se 25mg/IM do EPE.
Experimento I 105
• Do terceiro dia a no máximo dez dias de tratamento: aplicou-se o EPE pela
manhã (7:00 h) e à tarde (18:00 h) sempre utilizando 25mg/IM.
• Quando a maioria dos folículos atingiu 35mm de diâmetro foi suspenso o
tratamento com EPE e administrado 2.500UI hCG (Vetecor) intravenosa.
A monitorização das éguas controle foi realizada assim como as
superovuladas, tendo sido utilizada solução fisiológica seguindo o mesmo protocolo
do grupo superovulado.
Experimento I 106
Experimento I 107
4.2.1.2 Animais
O experimento foi desenvolvido na Universidade de Rio Cuarto (Argentina)
utilizando-se 22 éguas mestiças divididas aleatoriamente em dois grupos: 1) Grupo
superovulatório (13 éguas) submetidas ao tratamento superovulatório com EPE
utilizando-se do mesmo protocolo descrito anteriormente; 2) Grupo controle (09
éguas), tratamento com solução fisiológica seguindo o mesmo protocolo
superovulatório. Os animais estavam em bom estado geral de saúde, com idade
variando entre quatro a 14 anos, massa corpórea de 400 a 600Kg e com histórico
reprodutivo normal. As éguas ficaram alojadas em um piquete do frigorífico de
equinos, localizado em Rio Cuarto, Argentina, próximo da Universidade de Rio
Cuarto (5Km), com livre acesso a água e feno de alfafa. Estes animais receberam
previamente ao experimento um manejo sanitário adequado (vermifugação, banho
com carrapaticida) Figura 03.
Figura 03: Animais alojados no frigorífico, os quais foram utilizados no experimento
de transporte de oócito para o oviduto de éguas superovuladas.
4.2.1.3 Monitorização das éguas
Foram utilizados dois ciclos estrais de cada égua sendo o primeiro para
monitorização da ovulação e o segundo a ser tratado (EPE ou solução fisiológica).
Após inicio do tratamento, os ovários e útero destas éguas foram monitorados
duas vezes ao dia através da palpação retal e da ultra-sonografia (ALOKA – 500),
Figura 04. Os tratamentos foram interrompidos quando a maioria dos folículos
Experimento I 108
atingiu um diâmetro médio de 35mm e então administrado o hCG. Os animais foram
abatidos entre 12 e 24h após a detecção da primeira ovulação, sendo removido todo
o aparelho reprodutivo interno (útero e ovários) e armazenados em uma caixa
térmica com uma solução de DPBS pré-aquecida (37
0
C), onde então foi conduzido
ao laboratório da universidade (tempo decorrente do abate a extração dos ovários e
ovidutos de 30min).
Figura 04: Éguas contidas para controle folicular nas dependências do Frigorífico
AIMAR.
Ao chegar no laboratório os ovários e ovidutos foram separados. Os ovários
foram avaliados macroscopicamente e os ovidutos dissecados e lavados com 20mL
de DPBS + 10% Soro Fetal (37
0
C) para recuperação dos oócitos (Figuras 05 e 06).
As características morfológicas dos oócitos (degenerado, compacto, desnudado e
expandindo – Losinno, 2006) foram realizadas imediatamente após a sua
localização, utilizando um estereomicroscópio (Figura 07). Após esta classificação,
os oócitos foram corados com o fluocromo MITO TRACKER DEEP RED 633
(M22462), para serem avaliados quanto ao grau de maturação nuclear (Losinno,
2006).
Experimento I 109
Figura 05: Útero, ovários e oviduto de éguas superovuladas.
Figura 06: Dissecação, lavagem do oviduto e procura do oócito.
Experimento I 110
Figura 07: Oócitos e células do cumulus recuperados do oviduto de éguas
superovuladas e controle.
4.2.1.4 Analise estatística
Para a comparação de proporções foi utilizado o teste Exato de Fisher. O
nível de significância foi de 5%.
Para avaliar o número médio de ovulações, de oócitos viáveis e degenerados
por égua, e o diâmetro máximo do folículo pré-ovulatório foi utilizado o Teste t de
Student.
Experimento I 111
4.2.2 RESULTADOS
Neste experimento foram avaliadas 22 éguas, sendo 09 (nove) destas
tratadas com solução fisiológica (grupo controle) e 13 tratadas com extrato de
pituitária eqüina (grupo superovulado), resultando um total de 73 ovulações (11 e 62
respectivamente).
O grupo controle apresentou 22% (2/9) dos animais com dupla ovulação e
88% (7/9) com simples, já no grupo tratado com EPE 8% (1/13) com ovulação
simples, 23% (3/13) com dupla ovulação e 69% (9/13) com ≥ 3 ovulações (p< 0,05).
Desta forma as éguas tratadas com EPE apresentaram um número
significativamente maior de ovulações (p<0,05), ou seja, o quadruplo (média = 4,77
ovulações) em relação às éguas controle (média = 1,22 ovulações), o que também
foi significativo (p<0,05) quando comparado o número médio de oócitos viáveis
recuperados/égua no grupo superovulado (3,08) em relação ao grupo controle
(1,11), havendo um total de 49 oócitos recuperados no grupo superovulado (40
oócitos viáveis/09 oócitos degenerados) e 13 oócitos no grupo controle (10 oócitos
viáveis/03 oócitos degenerados). Quanto ao percentual de oócitos viáveis
recuperados/ovulação houve tendência (p=0,07) para um menor número nas éguas
superovuladas (90% grupo controle e 64% grupo superovulado, Tabela 1).
Quando unidos os dois grupos (controle/superovulado) e avaliados o
percentual de oócitos recuperados por ovulações simples, dupla e tripla e múltiplas
(>3 ovulações) observou-se um maior percentual de recuperação (p<0,05) para as
ovulações simples (87%) e dupla/tripla (92%) em relação às ovulações múltiplas
(48%).
A média dos dias de tratamento com solução fisiológica (controle) e EPE
(superovulado) foi de 9,89 e 7,54, respectivamente, havendo uma tendência do
grupo superovulado apresentar um crescimento folicular mais rápido que o grupo
controle (p=0,059). Não foi observada diferença significativa (p>0,05) quando
comparado o tempo da administração do hCG à primeira ovulação e a ultima
ovulação entre o grupo controle (41,43±6,19h e 41,42±6,19) e superovulado
(33±16,97 e 42,33±11,14 – Tabela 1).
Experimento I 112
O diâmetro médio do folículo pré-ovulatório foi significativamente maior no
grupo controle (41,45±3,56 mm) quando comparado ao superovulado (37,27±4,02
mm).
Foi observado na região da fossa de ovulação na maioria das éguas
superovuladas a presença de uma grande quantidade de coagulo de sangue , já nas
éguas do grupo controle, este coágulo nem sempre estava presente e quando
presente apresentava-se bem menos evidente.
Tabela 01: Média e desvio padrão das diferentes variáveis estudadas no grupo
tratado com extrato de pituitária eqüina e controle
.
GRUPO
CONTROLE
(SOL. FISIOL.)
SUPEROVULADA
(EPE)
VALOR DE
P
N
0
de éguas 09 13 -
N
0
de éguas com ≥ 2 ovulações
02
b
12
a
P=0,03
N
0
de éguas com ≥ 3 ovulações
0
b
9
a
P<0,01
Total de ovulações 11
b
62
a
P<0,05
Total de oóc. viáveis recuperados 10
b
40
a
P<0,05
Total de oóc. degenerados recuperados 03
b
09
a
P<0,05
N
0
médio de ovulações/égua 1,22 ± 0,44
b
4,77 ± 3,06
a
P=0,003
N
0
médio de oóc viáveis recuperados/égua
1,11 ± 0,6
b
3,08 ± 2,22
a
P=0,018
N
0
médio de oóc degenerados
recuperados/égua
0,33 ± 0,5
a
0,85 ± 1,34
a
P=0,29
% oóc viáveis recuperados/ovulação 90
a
64
a
P=0,07
Intervalo médio entre ovulações (h) 0
b
6,46
a
P=0,025
Média dos dias de tratamento (dias) 9,89±3,69
a
7,54±1,76
a
P=0,059
Interva
lo médio da administração do hCG a
primeira ovulação (h.)
41,43±6,19
a
33±16,97
a
P=0,068
Intervalo médio da administração do hCG a
ultima ovulação (h.)
41,42±6,19
a
42,33±11,14
a
P=0,399
Diâmetro médio do fol pré ovulatório (mm) 41,45 ± 3,56
a
37,27 ± 4,02
b
P=0,002
Experimento I 113
Tabela 02: Número de ovulações por ovário e de oócitos recuperados do oviduto de
éguas do grupo controle.
GRUPO CONTROLE (SOL. FISIOL.)
ÉGUAS
NUMERO DE OVULACOES
NUMERO DE OOCITOS
OE OD OE OD
01 2 0 2 0
02 0 1 0 1
03 1 0 0 0
07 1 0 1 0
10 1 0 1 0
14 0 1 0 1
313 1 0 1 0
315 1 1 1 1
320 0 1 0 1
Sub.tota
l
6 5 5 5
TOTAL 11 10
Tabela 03: Número de ovulações por ovário e de oócitos recuperados do oviduto de
éguas tratadas com extrato de pituitária eqüina.
GRUPO SUPERO
VULAÇÃO (E.P.E.)
ÉGUAS
NUMERO DE OVULACOES
NUMERO DE OOCITOS
OE OD OE OD
05 3 3 0 1
08 2 4 2 2
11 0 1 0 1
12 1 1 1 1
13 1 1 1 1
15 0 2 0 1
309 4 5 2 2
307 2 2 2 0
311 2 1 2 1
312 3 1 3 1
314 2 2 2 0
318 4 4 1 4
319 7 4 7 2
Sub
total
31 31 23 17
TOTAL 62 40
•
OD = Ovário Direito / OE = Ovário Esquerdo
Experimento I 114
Figura 08: Percentual médio de ovulações e oócitos recuperados do oviduto de
éguas tratadas com extrato de pituitária eqüina e grupo controle.
Figura 09: Percentual de oócitos recuperados em relação ao número de ovulações.
0
20
40
60
80
Cont. SO
GRUPOS
NÚMERO DE
ESTRUTURAS
N. OV
N. OOC.
•
N OV= Número de ovulações
• N OOC= Número de oócitos recuperados
• Cont.= Grupo controle
• SO= Grupo superovulado
0
20
40
60
80
100
S
im
ples
T
r
ipl
a
M
ult
ipl
a
OVULAÇÕES
% OÓCITOS
RECUPERADOS
Simples
Tripla
Multipla
87%
92%
48%
Experimento I 115
Figura 10: Resposta superovulatória de uma égua tratada com extrato de pituitária
eqüina (4 folículos/4 corpos lúteos)
Figura 11: Dissecação do ovário de uma égua superovulada (4 ovulações) com
extrato de pituitária eqüina, demonstrando os corpos hemorrágicos
Experimento I 116
Figura 12: Presença de grande coágulo de sangue na fossa de ovulação de uma
égua do grupo superovulado, a qual apresentou seis (6) ovulações sendo três (3)
por ovário.
Figura 13: Presença de pequeno coágulo de sangue na fossa de ovulação de uma
égua do grupo superovulado, a qual apresentou duas (2) ovulações sendo uma (1)
em cada ovário.
OE: 3 ovulações/0 oócito
OD: 3 ovulações/1 oócito
OVÁRIO ESQUERDO
OVÁRIO DIREITO
OVÁRIO ESQUERDO OVÁRIO DIREITO
OE: 1 ovulações / 1 oócito
OD: 1 ovulações / 1 oócito
Experimento I 117
Figura 14: Presença de pequeno coágulo de sangue na fossa de ovulação em duas
éguas do grupo controle com diferentes números de ovulações.
OVÁRIO ESQUERDO OVÁRIO DIREITO
OE: 1 ovulação / 1 oócito
OD: 0 ovulação / 0 oócito
OE: 2 ovulação / 2 oócito
OD: 0 ovulação / 0 oócito
OVÁRIO ESQUERDO
OVÁRIO DIREITO
Experimento I 118
4.2.3 Discussão
A superovulação tem por objetivo induzir um maior numero de ovulações e
subseqüentemente aumentar a taxa de oócitos fertilizados. Há mais de duas décadas
vários esforços têm sido realizados com o intuito de investigar os fatores que
influenciam na resposta superovulatória em vaca e em éguas, identificando vários
fatores que possam interferir no desenvolvimento folicular e na ovulação.
Os fatores que afetam a resposta superovulatória, assim como a produção de
embriões, pode ser divididos em fatores intrínsecos (idade, raça, variações causadas
pela presença de um folículo dominante, dentre outros) e fatores extrínsecos
(estação do ano, ambiente, nutrição, variações nas drogas utilizadas na
superovulação e outros).
O esforço na elaboração deste experimento, desenrolo dos dados e
promoção de uma discussão dos nossos achados frente aos trabalhos científicos
anteriormente desenvolvidos, teve por finalidade contribuir conhecimentos sobre a
superovulação na espécie eqüina.
O extrato de pituitária eqüino utilizado neste experimento, consistentemente
induziu o crescimento de múltiplos folículos em éguas, assim como descrito por
Carmo (2003), o qual administrou 25mg desse produto duas vezes ao dia, obtendo
uma média de 4,0 ovulações/égua, número este similar aos nossos achados (4,7
ovulações/égua), empregando o mesmo protocolo. Nossos resultados foram
superiores aos obtidos por Wood & Ginther (1983), Rosa et al., (1988) e Bézard et al.,
(1995) com 2,9; 3,0 e 2,39 ovulações por égua, respectivamente, quando do uso de
EPE uma vez ao dia.
Já Alvarenga et al. (2001) obtiveram um maior número de ovulações (7,1) do
que os nossos achados. O número médio de embriões recuperados/égua por estes
autores foi de 3,5. Estes valores seriam extremamente animadores se não fosse o
fato de uma égua ter apresentado 18 ovulações com nove embriões recuperados.
A espécie eqüina é monovulatória, havendo contudo predisposição raciais e
individuais para ovulações duplas expontâneas. Todos os animais utilizados neste
experimento tiveram ciclos anteriores monitorizados não possuindo predisposição
para múltiplas ovulações espontâneas sendo observado um percentual de 92%
(12/13) de éguas com duas ou mais ovulações quando tratada com EPE e 22% (2/9)
para éguas controles tratadas com solução fisiológica. Estes dados são compatíveis
Experimento I 119
aos descritos por Douglas (1979), Woods & Guinther (1977), Squires et al. (1987ab),
Scoggin et al. (2002) e Carmo (2003) onde 86%, 70%, 92%, 84% e 90% de éguas
apresentaram múltiplas ovulações, respectivamente, após o tratamento
superovulatório com EPE.
O percentual de oócitos viáveis recuperados do oviduto de éguas
superovuladas e não superovuladas foi de 64 e 90% respectivamente, semelhantes
aos resultados de Carmo et al. (2006), os quais observaram uma diminuição no
percentual de oócitos recuperados do oviduto de éguas superovuladas com EPE,
sendo estes resultados também consistentes com a baixa taxa de recuperação de
embriões por ovulação relatada por Alvarenga et al. (2001) utilizando a mesma dose
de EPE de nosso experimento e por Peres et al. (2005) utilizando FSHe.
As causas da baixa taxa de recuperação embrionária em éguas
superovuladas é ainda uma incógnita, levando-nos a questionar se este problema
está relacionado à captação dos oócitos para o interior do oviduto, a maturação
oocitária ou por alteração folicular ou infundibular e a fertilização. Os altos níveis de
LH encontrados no extrato de pituitária eqüina é considerado um fator deletério à
maturação oocitária tanto em bovinos (Donaldson et al., 1986).
Contudo de todos estes fatores relacionados acima, em nosso experimento
observamos que as alterações no mecanismo de captação oocitária é um fator
decisivo, já que o número médio de oócitos viáveis recuperados por ovulação em
nosso experimento no grupo superovulado foi de 0,6 (oócitos), número este inferior
ao grupo controle com 0,9 (oócitos).
A esta questão, se impõem alguns mitos, como os levantados por Onuma &
Ohnami (1975) e Liu et al. (1991), onde foram pertinentes em propor uma falha na
captação dos oócitos pela fímbria do infundíbulo sendo em decorrência do líquido
folicular apresentar uma consistência “gelatinosa”, o que poderia reter o oócito,
impedindo-o de migrar para o interior do infundíbulo ou mesmo bloqueando o lúmen
do oviduto evitando a migração do embrião do oviduto para o útero. Já Palmer et al.
(1993) acreditam que a baixa taxa na recuperação de embriões é conseqüência da
não fertilização do oócito em função da falha da liberação deste pelo folículo,
observação esta difícil de ser suportada, pois desde que ocorram as ovulações os
oócitos serão liberados.
Já Dippert et al. (1994) afirmaram não haver diferença na recuperação de
oócitos de éguas tratadas com EPE e não tratadas, onde o percentual médio de
Experimento I 120
recuperação de estruturas (oócitos e/ou embriões) do oviduto de éguas
superovuladas foi de 62% (51 ovulações e 32 estruturas), e para o grupo não
superovulado de 68% (16 ovulações e 11 estruturas), obtendo uma média de 3,5 e
1,1 ovulações, respectivamente. Corroborando com nossos achados onde a
recuperação de ovócitos /ovulação se aproxima do normal quando temos menos de 3
ovulações por égua tratada com EPE.
Contudo, dos poucos estudos realizados até o presente momento, não houve
nenhuma citação quanto a diferença na massa de coágulo de sangue que se forma
na fossa de ovulação como demonstrado em nosso estudo. Observamos a formação
de um grande coagulo em éguas com múltiplas ovulações no mesmo ovário ao
contrário das éguas que apresentam ovulações simples, duplas e triplas. Acreditamos
que este fator possa ser um fator importante na queda observada da taxa de
recuperação de embriões em éguas que apresentam várias ovulações no mesmo
ovário. Alterações no mecanismo de coagulação ou mesmo um maior sangramento
de folículos de éguas superovuladas com resposta ovariana exacerbada podem estar
relacionadas a uma inadequada produção de fatores de coagulação (fibrinogênio e
antitrombina) bem como de agentes anticoagulantes . Kim et al., (2006) observaram
uma inadequada expressão de fatores de coagulação no líquido folicular de mulheres
com aborto espontâneo recorrente.
Fica claro perante aos nossos resultados que existe queda significativa do
número de oócitos/ovulações quando ocorrem ovulações de um número maior que
três (3) folículos.
Se observarmos na tabela 02 e 03 o percentual de oócitos recuperados por
ovário que apresentou duas ou três ovulações e resultou em 100% (recuperação total
de oócitos/ovulação) de recuperação foi de 63% (7/11) dos ovários. Já nos ovários
em que ocorreram quatro ou mais ovulações o percentual de 100% de recuperação
de oócito/ovulação foi de 14% (1/7) dos ovários.
Os nossos percentuais de oócitos recuperados por ovulações duplas e triplas
(92%) são similares aos de ovulações simples (87%), vindo a ser concordante com os
achados de Alvarenga et al. (2001) os quais observaram uma maior taxa de
recuperação de embriões (70%) por ovulação em éguas que apresentaram uma
menor média de ovulações (2,4 ovulações) quando comparados com éguas com
muitas ovulações (7,1 ovulações e 49% de embriões recuperados).
Experimento I 121
Este baixo percentual de recuperação de embriões relatados por estes
autores (49%) é similar ao percentual de 55% de oócitos recuperados por ovulações
demonstrados em nosso experimento quando observamos quatro ou mais ovulações.
Rocha Filho et al. (2005) e Farinasso et al. (2005), utilizando baixas doses de
EPE obtiveram em média o desenvolvimento de dois folículos um embrião por lavado,
por outro lado Carmo (2003) quando utilizou altas doses de EPE obteve uma média
de cinco folículos e 45% de embriões recuperados por ovulação. O mesmo já havia
sido relatado por Douglas (1979) onde o percentual de embriões recuperados por
ovulações no grupo tratado com EPE foi de 35% e no grupo não superovulado de
67%.
Um outro fator que indica ocorrer alterações no desenvolvimento folicular de
éguas superovuladas diz respeito as diferenças nos diâmetros dos folículos pré-
ovulatório. Em nosso trabalho o diâmetro médio do folículo pré-ovulatório observado
em éguas superovuladas foi menor que os das éguas controle (37,27mm / 41,45mm,
respectivamente), dados que são similares aos descritos por Ginther (1992), quando
comparou o diâmetro médio dos folículos pré-ovulatório de ovulações simples e
duplas, descrevendo o diâmetro de 44mm para ovulações simples e 35mm e 40mm
para ovulações duplas unilaterais e bilaterais, respectivamente. Em vacas
superovuladas os folículos pré-ovulatórios apresentam um diâmetro 20% a 30%
menor que as não superovuladas, apresentando também um crescimento folicular
mais acelerado (Driancourt et al., 1991). Já em ovelhas superovuladas tem-se
observado uma grande variação no tamanho dos folículos e no número de células da
granulosa por folículos (Driancourt & Fry, 1992).
Experimento II 124
4.3 EXPERIMENTO II
“EFEITO DA SUPEROVULAÇÃO NA RECUPERAÇÃO DE OÓCITOS QUANDO
DA ASPIRAÇÃO FOLICULAR GUIADA POR ULTRA-SONOGRAFIA”
4.3.1 MATERIAL E MÉTODOS
4.3.1.1 Monitorização e tratamento das éguas superovuladas
A monitorização e o tratamento das éguas do grupo superovulatório (Extrato
de Pituitária Eqüina) e controle foram realizados conforme descrito no experimento I.
As aspirações foliculares foram realizadas 30h após a administração do hCG.
4.3.1.2 Animais
Foram utilizadas 24 éguas divididas aleatoriamente em dois grupos G1 -
éguas superovuladas (n=12), e G2 - éguas controle (n=12), em bom estado geral de
saúde, com idade variando de quatro a 14 anos, massa corpórea entre 400 a 600Kg
e com bom histórico reprodutivo. Estes animais foram mantidos em piquete com livre
acesso a bebedouro coletivo, suplementação mineral em um consumo médio diário
de 70 g, ração fornecida uma vezes ao dia em um total de três quilos/égua, o feno
de coast-cross (Cynodon dactylon) sendo ofertado duas vezes ao dia, em um total
de 10 quilos/égua.
O experimento foi realizado no Posto de Monta da Fazenda Lajeado, UNESP
localizado no município de Botucatu, estado de São Paulo, e no Polo regional da
Alta Mogiana localizado na cidade de Colina, estado de São Paulo.
4.3.1.3 Obtenção do oócito
Após a higienização da região perivulvar, as éguas foram sedadas com a
associação de Xilazina 10% (0,5mg/kg, Sedazine
Fort Dodge) e Acepromazina 1%
(0,05mg/kg, Acepran
Univet), e administrado 0,14mg/kg de Brometo de Hoxima
(Buscopan
Boehringer Ingelheim do Brasil) via venosa, com a finalidade de
Experimento II 125
diminuir o peristaltismo para uma melhor manipulação ovariana pelo reto. Todos os
folículos maiores que 35mm foram aspirados, utilizando uma agulha de lume duplo
modelo Cook (12-GA-Cook Veterinary Products, Spencer, IN) acoplada a uma probe
de aspiração (Nutricell, Campinas-SP) transvaginal guiada por ultra-som, (Figura
15). Após a recuperação do fluido folicular, o antro do folículo puncionado foi lavado
com DPBS heparinizado (10%), visando a recuperação do oócito, conforme descrito
por Coutinho da Silva (2004). O fluido folicular e o lavado intra-folicular foram
individualmente inspecionados em um esteromicroscópio com aumento de 40x, para
identificação do oócito.
Figura 15: Transdutor e guia de aspiração utilizada no experimento.
4.3.1.4 Analise estatística
Para a comparação de proporções foi utilizado o teste Exato de Fisher. O
nível de significância foi de 5%.
Para avaliar o número médio de ovulações, de oócitos viáveis e degenerados
por égua, e o diâmetro máximo do folículo pré-ovulatório foi utilizado o Teste t.
Experimento II 126
4.3.2 RESULTADOS
Neste estudo foram utilizados 24 animais distribuídos aleatoriamente em
grupo controle (n=12) e superovulado (n=12), observamos que o número total de
folículos aspirados e o total de oócitos recuperados foram significativamente
superiores (p<0,05) no grupo superovulado (58 e 14, respectivamente) quando
comparado ao grupo controle (12 e 8, respectivamente). O número médio de
folículos aspirados/égua e o número médio de oócitos/égua também foi
significativamente maior no grupo superovulado (4,73 e 1,17) em relação ao grupo
controle (1,0 e 0,66). Entretanto o grupo controle apresentou um maior número
médio de oócitos/folículo aspirado do que o grupo superovulado (0,66 e 0,25,
respectivamente) , com p<0,05.
O percentual de oócitos recuperado/folículo aspirado foi maior no grupo
controle (66%) do que no grupo superovulado (25%), porém o percentual de oócitos
recuperados/égua foi significativamente maior (p<0,05) no grupo superovulado
quando comparado ao grupo controle (116,7 e 66%).
Todas éguas superovuladas apresentaram dois ou mais folículos pré-
ovulatórios, enquanto que no grupo controle, as éguas apresentaram apenas um
folículo pré-ovulatório (p<0,01).
O número médio de dias de tratamento foi maior no grupo controle (p<0,01)
do que no grupo superovulado (10,17 e 7,17, respectivamente), demonstrando que o
tratamento com EPE acelera o desenvolvimento folicular.
O diâmetro médio dos folículos aspirados 30 horas após a administração do
hCG foram de 40,75±2,01 e 39,25±2,49 nos grupos controle e superovulados,
respectivamente não havendo diferença estatística entre os dois grupos (p>0,05).
Os resultados relacionados à aspiração folicular estão sumarizados nas
tabelas 04, 05 e 06.
Experimento II 127
Tabela 04: Média e desvio padrão das diferentes variáveis avaliadas no experimento
II do grupo superovulado com extrato de pituitária eqüina e do controle.
GRUPO
CONTROLE SUPEROVULADAS
P
N
o
de éguas 12 12 -
N
o
de éguas com ≥ 2 fol. Pré-ov.
0
a
12
b
P<0,01
Total de Fol. Aspirados 12
b
58
a
P<0.01
N
o
médio de fol. asp./égua 1,0 ± 0,0
b
4,75 ± 2,7
a
P<0,001
Total de oócitos recuperado 8
b
14
a
P<0,05
N
o
médio de oóc/égua 0,66
b
1,17
a
P=0,013
N
o
medio de ooc/fol. aspirado 0,66
a
0,25
b
P<0,05
% oóc recuperado / égua 66
b
116,7
a
P<0,05
% oóc recuperados/fol. aspirado
66
a
25
b
P<0,05
Média dos dias de tratamento
(dias±DP)
10,17 ± 0,94
a
7,17 ± 0,89
b
P<0,01
Diâmetro médio dos folículos
aspiração (mm±DP)
40,75 ± 2,01
a
39,25 ± 2,49
a
P=0,506
Experimento II 128
Tabela 05: Número de ovulações e de oócitos aspirados de folículos de éguas do
grupo controle.
GRUPO CONTROLE (SOL. FISIOL.)
ÉGUAS NUMERO DE FOLÍCULOS
ASPIRADOS
NUMERO DE OOCITOS
RECUPERADOS
OE OD OE OD
10 0 1 0 0
29 0 1 0 1
30 1 0 1 0
35
A
1 0 1 0
35B 0 1 0 1
46 1 0 0 0
54 1 0 0 0
58 1 0 0 0
101 0 1 0 1
212 0 1 0 1
263 1 0 1 0
Esmeralda 0 1 0 1
Sub.Total 6 6 3 5
TOTAL 12 8
•
OD = Ovário Direito
•
OE = Ovário Esquerdo
Experimento II 129
Tabela 06: Número de ovulações e de oócitos aspirados de folículos de éguas do
grupo superovulado com extrato de pituitária eqüina.
GRUPO SUPEROVULAÇÃO (E.P.E.)
ÉGUAS NUMERO DE FOLICULOS
ASPIRADOS
NUMERO DE OOCITOS
RECUPERADOS
OE OD OE OD
16 1 3 1 0
29b 2 1 1 1
46 1 2 1 1
54 3 4 1 0
60 2 1 1 1
100 2 2 2 0
112 6 4 0 0
140 2 2 0 0
256b 1 2 0 0
387 1 2 0 2
Jady 1 2 1 1
Colina 5 5 0 0
Sub.Total 27 30 8 6
TOTAL 57 14
•
OD = Ovário Direito
•
OE = Ovário Esquerdo
Experimento II 130
Figura 16: Número total de folículos aspirados e de oócitos recuperados de éguas
tratadas com extrato de pituitária eqüina e solução fisiológica.
0
10
20
30
40
50
60
Cont. SO
GRUPOS
NÚMERO DE
ESTRUTURAS
N. Fol. Asp.
N. Oóc. Recup.
•
N FOL ASP. = Número de folículos aspirados
• N OÓC REC. = Número de oócitos recuperados
• Cont. = Grupo controle
• SO = Grupo superovulado
12
08
57
14
Experimento II 131
4.3.3 DISCUSSÃO
Observamos em nosso experimento a recuperação de um maior número de
oócitos por égua no grupo superovulado (1,17) quando comparado ao grupo controle
(0,66), estes resultados são idênticos aos reportados por Bézard et al. (1995).
Conforme esperado foram aspirados um maior número de folículos no grupo
superovulado (4,75) do que o não superovulado (1,0). Entretanto o percentual de
oócitos recuperados por folículo aspirado foi menor no grupo tratado com EPE (25%)
quando comparado ao grupo controle (66%), o que discorda dos achados de Bézard
et al. (1995) os quais obtiveram um percentual médio de oócitos recuperados de
folículos pré-ovulatório de éguas tratadas e não tratadas de 60% e 79%
respectivamente. Esta alta recuperação atribuída por estes autores pode estar
relacionadas ao baixo número de ovulações (2,39) obtidas quando da superovulação.
Acreditamos que o dobro da resposta superovulatória que obtivemos de éguas
superovuladas em relação aos autores anteriores citados tenha interferido na
recuperação dos oócitos.
Dentre as dificuldades que possam ter interferido na recuperação dos oócitos
de éguas superovuladas, ressaltamos a grande quantidade de folículos presentes no
ovário. Em função disto alguns destes foram perfurados acidentalmente e se
perderam por estarem muito próximos uns dos outros. Um outro aspecto importante
diz respeito a dificuldade de manipular o ovário após terem sido aspirados dois ou
três folículos, ficando o ovário com uma consistência gelatinosa o que dificultou a sua
manipulação.
Landim-Alvarenga (1999) relata uma série de fatores que possam interferir
nos índices de recuperação de oócitos aspirados. Alguns destes fatores são: o
sistema de punção, incluindo o uso de agulhas com lume simples ou duplo, a
lavagem contínua do folículo, a curetagem ou não da parede do folículo com a agulha
e o tamanho do folículo a ser aspirado. Além disso, outro fator é a experiência do
técnico. Ao decorrer do experimento observamos uma maior facilidade na
recuperação dos oócitos ao massagear o folículo contra a agulha e movimentando a
agulha dentro do folículo sobre o estroma.
Experimento II 132
A grande dificuldade encontrada na recuperação de oócitos de folículos
imaturos de éguas, é conseqüente de diferenças anatomias da relação entre o oócito
e o folículo. Uma das particularidades anatômicas desta estrutura em eqüinos é a
presença de processos celulares emitidos pelas células da granulosa para o interior
da camada de células teçais. Desta forma, os processos das células da granulosa,
bem como a posição da camada de células tecais e a estrutura do componente
polissacarídeo, funcionam como uma âncora do complexo Cumulus-oócito à parede
folicular, dificultando desta forma a recuperação do oócito de folículos imaturos. Em
éguas que estejam com folículos próximos a ovulação ocorre um afrouxamento desta
estrutura, o que facilita a recuperação dos oócitos, aumentando desta maneira a taxa
de recuperação (Hawley, 1995).
Palmer (1987) foi o primeiro a descrever uma técnica de aspiração com o animal
em estação, onde o operador manipulava o ovário pelo reto e guiava uma agulha
pelo flanco até os folículos. Os primeiros milímetros do fluido folicular eram
reinjetados para recuperar o oócito e então o folículo era lavado com 20mL de
solução Dulbecco com heparina. A taxa de recuperação obtida neste trabalho
pioneiro foi 63% para folículos maiores que 35mm em éguas previamente tratadas
com hCG, valores este semelhante aos nossos em éguas não superovuladas (66%)
utilizando a técnica de aspiração via vaginal guiada pelo ultra-som (Bruck et al.,
1992). Este mesmo percentual foi obtido por Vogelsang et al. (1988) ao coletar
oócitos via punção transcutânea pelo flanco , usando uma agulha de 13G e 15cm de
comprimento conectada a um tubo de látex e ligado a um sistema de irrigação
contínua (60%), entretanto os índices foram menores ao utilizar uma seringa para
aspiração (10%).Com a laparotomia, usando a mesma agulha, esta taxa também foi
baixa (14%). Outro procedimento foi descrito por Hinrichs et al. (1991) com taxas de
recuperação de 73% em folículos pré-ovulatórios de éguas tratadas com hCG, além
da incisão pelo flanco, outra era feita em fundo de vagina, permitindo que o operador
introduzisse sua mão na cavidade peritoneal e direcionasse o ovário diretamente
contra a cânula.
Entretanto, todas estas técnicas envolvendo procedimentos cirúrgicos
apresentam efeitos colaterais indesejáveis, como aderências que limitam o número
de vezes em que o procedimento pode ser repetido, infecções e complicações
anestésicas, entre outros fatores.
Experimento II 133
A aspiração transvaginal guiada por ultra-som é um método não invasivo,
relativamente simples punções repetidas de folículos imaturos e pré-ovulatórios em
éguas. Em nosso experimento o procedimento foi bem tolerado e nenhum efeito
colateral significativo foi notado, sendo que em todas as éguas ao final da aspiração
era visualizado com um especulo o fundo de vagina e nenhuma laceração foi
constatada, sendo observado apenas um pequeno ponto de coagulo de sangue,
contudo 36h após a aspiração o fundo de vagina estava integro, assim com descrito
por Bracher et al, (1993) que ao aspirarem éguas pelo fundo de vagina auxiliado por
uma guia conectada ao ultra-som, não observaram qualquer anormalidade pós-
aspiração.
A pressão de bomba de vácuo utilizada em nosso trabalho foi de 180 a
200mmHg, pressão esta satisfatória as nossa aspirações quanto a recuperação de
oócitos, visto que testamos em uma fase pré experimental uma menor pressão de
vácuo, não tendo sido verificado melhora dos resultados. Fato também observado
por Kanitz & Berger (1995), os quais ao utilizarem uma pressão de 0,2 ou 0,4 bar
(1mmHg = 1,333 x 10
-3
bars) não observaram diferença na taxa de recuperação
(28,8% x 26,4%) em éguas.
Os índices de recuperação de oócitos também podem ser variáveis na
depêndencia do calibre da agulha utilizada na aspiração folicular. Procuramos seguir
a mesma linha de autores que trabalharam rotineiramente na recuperação de oócitos
de éguas (Carnevale et al., 1993; Carnevale, 2005; Cook et al., 1993) utilizando
agulhas modelo CooK de duplo lumen com calibre de 12g. Ao comparar agulhas de
lúmen simples e duplo com calibre de 12g, CooK et al. (1993) observaram uma
melhor recuperação de oócitos em folículos pré-ovulatório com agulha de duplo
lúmen (84%) do que simples lume (52%). O que podemos observar é que a agulha
de duplo lume permite um fluxo contínuo de fluido no folículo ao mesmo tempo em
que é realizada a aspiração, facilitando assim o lavado e a escarificação interna do
folículo.
Nosso índice de recuperação de oócitos/folículo no grupo controle (66%) foi
similar aos obtidos por Mackinnon et al. (1987), Hinrichs et al. (1991) e Mari et al.
(2005) os quais obtiveram um percentual de recuperação de 71,4%, 73% e 46,4%
respectivamente, ao aspirarem folículos pré-ovulatórios de éguas previamente
tratadas com hCG. Carnevale (2005) obteve uma taxa de recuperação de oócitos um
pouco superiores aos nossos quando aspirados folículos pré-ovulatórios (77%),
Experimento II 134
entretanto as aspirações neste trabalho foram realizadas muito próximas as
ovulações, o que aumenta a taxa de recuperação de oócitos Estes autores relatam
também que a taxa de recuperação de oócitos foi maior quando se realizou a indução
da ovulação com a associação do hCG com a desorelina do que com apenas um
destes, como foi realizado por nós quando utilizamos apenas o hCG.
Cook et al. (1992) ao aspirarem folículos de éguas durante os dias sete (7) a
nove (9) do diestro com diâmetro entre 10 a 25m, obtiveram um percentual de 18,5%
de recuperação de oócitos, sustentando a hipótese de que o tamanho do folículo
influencia a taxa de recuperação de oócitos. Bezard et al. (1997) observaram um
maior percentual na recuperação de oócitos em folículos pequenos com 5 a 15mm
(52%) do que em folículos com 20 a 27mm (22%), relatando que a curetagem da
parede folicular é mais fácil de ser realizada quando o folículo apresenta diâmetro
pequeno, entretanto no folículo pré-ovulatório o índice de recuperação de oócitos foi
mais alto (78%). Em bovinos, a taxa de recuperação de oócitos por OPU chega a
72% para folículos maiores que 4mm de diâmetro e 50% para folículos menores que
4mm (Seneda et al., 2001)
A baixa taxa na recuperação de oócitos de éguas superovuladas encontradas
em nossos trabalhos pode também estar associada a não completa maturidade do
folículo superovulado, ou seja este poderia não estar responsivo ao estímulo do hCG
aplicado 30 horas antes da aspiração.
Experimento III 136
4.4 EXPERIMENTO III
“AVALIAÇÃO DO AMBIENTE FOLICULAR DE ÉGUAS SUPEROVULADAS”
4.4.1 MATERIAL E MÉTODOS
4.4.1.1 Monitorização e tratamento das éguas superovuladas
A monitorização e o tratamento das éguas do grupo superovulatório
(Extrato de Pituitária Eqüina) e controle foram realizados conforme descrito no
experimento II.
4.4.1.2 Animais
Foram utilizadas 24 éguas divididas aleatoriamente em dois grupos G1 -
éguas superovuladas (n=12), e G2 - éguas controle (n=12), em bom estado
geral de saúde, com idade variando de quatro a 14 anos, massa corpórea entre
400 a 600Kg e com bom histórico reprodutivo. Estes animais foram mantidos
em piquete com livre acesso a bebedouro coletivo, suplementação mineral em
um consumo médio diário de 70g, ração fornecida uma vezes ao dia em um
total de três quilos/égua, o feno de coast-cross (Cynodon dactylon) sendo
ofertado duas vezes ao dia, em um total de 10 quilos/égua.
O experimento foi realizado no Posto de Monta da Fazenda Lajeado,
UNESP localizado no município de Botucatu, estado de São Paulo, e no Polo
regional da Alta Mogiana localizado na cidade de Colina, estado de São Paulo.
4.4.1.3 Obtenção do fluido folicular
O fluido folicular foi recuperado através da aspiração folicular guiada por
ultrassonografia via vaginal conforme descrito no experimento II.
Experimento III 137
4.4.1.4 Avaliação do fluido folicular
Após a obtenção do fluido folicular, este foi centrifugado a uma força de
600g por 10 (dez) minutos com o intuito de separar o precipitado (células da
granulosa) do sobrenadante (fluido folicular). O precipitado foi transferido para
uma placa de petri com a finalidade de avaliar as características e a viabilidade
das células em expansão. O sobrenadante foi armazenado (-20
0
C).
4.4.1.4.1 Dosagens Hormonais
O líquido folicular foi encaminhado para Universidade da Califórnia,
Davis – EUA para dosagem de 17β-estradiol, testosterona, progesterona,
inibina por meio de radioimunoensaio (RIA).
A concentração de testosterona foi determinada por RIA, assim como
descrito por Rose & Hughes (1991). Foi utilizado o anti-T anticorpo ovino (S-
250; G. Niswender, Colorado State Univ., Fort Collins, CO). A sensibilização da
amostra foi de 0,15ng/mL.
A concentração de estrogeno foi determinada por RIA, assim como
descrito por Pinaud & Coworkers (1991). Foi utilizado o anticorpo de ovino,
anti-estradiol-17β-6-BSA (#244; G. Niswender, Colorado State Univ., Fort
Collins, CO). A sensibilização da amostra foi de 15,0pg/mL.
A concentração de imunorreação de inibina foi determinada por um
heterologo de RIA, assim como descrito por Roser et al. (1994). Foi utilizado o
anti-T anticorpo ovino (S-250; G. Niswender, Colorado State Univ., Fort Collins,
CO). A sensibilização da amostra foi de 0,33ng/mL.
A concentração de progesterona foi determinada, em duplicata por RIA,
assim como descrito por Rose et al. (1994). O limite determinado para as
amostras foi de 0,02ng/mL.
Experimento III 138
4.4.1.4.2 Concentração de Oxido Nítrico
Foi realizada no Laboratório Clinico da Universidade Estadual Paulista
(UNESP) Botucatu,SP utilizando-se o detector químico luminescente (Nitric
oxide Analyzer NOA
TM
, Model 280, Sievers Instruments, Inc., Boulder, CO).
O óxido nítrico decompõe-se em nitritos (NO
-
2
) e nitratos (NO
-
3
) em
cultura. Assim, a produção desse metabólito pode ser avaliada indiretamente
medindo-se a concentração de NO
-
2
acumulado, por meio de método
colorimétrico baseado na reação de diazotação com o reagente de Greiss
(NEED 0,1% e sulfanilamida 1%).
A concentração de nitrito no liquido folicular refletem a produção de
óxido nítrico celular, que foram determinados segundo a reação de Griess,
como descrito por Hawkins et al. (1998). Para tanto, volumes iguais de liquido
folicular (100µL) e reagente de Griess foram colocados em placas de 96
alvéolos a temperatura ambiente por 10min. e mensurados por leitura em leitor
de placas a 550nm. A concentração de nitrito foi determinada por referência a
uma curva padrão criada por diluição seriada de nitrito de sódio (200mM a
1,58mM).
4.4.1.4.3 Perfil eletroforético de proteína do líquido folicular
Foi realizado o perfil eletroforético de proteínas no Departamento de
Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da Universidade Estadual Paulista
(UNESP) Botucatu,SP, através da técnica de Eletroforese, onde as amostras
foram recentrifugadas (4200xg, por 1 hora, a 4ºC) e a dosagem de proteína
total em duplicata foi realizada pelo método do Bradford (Micropot Dolles),
utilizando o corante “cromassie azul” como reagente de cor.
A eletroforese foi realizada conforme descrito por Laemmli (1970) e
adaptado por Bollag et al. (1996), utilizando-se duas concentrações de
poliacrilamida (29,2% de Acrilamida e 0,8% de Bisacrilamida), de 13% e 22%,
nos géis de separação para cada amostra.
As corridas eletroforéticas foram realizadas em mini cubas verticais
(Hoefer MiniVE Vertical Eletrophoresis System - Amersham Biosciences). Após
Experimento III 139
a limpeza das placas de vidro com álcool etílico 96º, as mesmas foram
montadas sobre o suporte da cuba.
Posteriormente, as imagens dos géis foram digitalizadas (VDS,
Amersham Biosciences) e um “software” analisador de imagens (Image Master,
Amersham Biosciences), do Departamento de Física e Biofísica, Instituto de
Biociências, UNESP, Botucatu, SP, foi utilizado para determinar o peso
molecular e a densidade óptica integrada (IOD) para cada banda, de cada
amostra no gel.
Os géis foram montados entre papel celofane permeável com gelatina
incolor, sobre uma placa de vidro.
4.4.1.5 Analise estatística
Para detectar diferenças entre as médias (± erro padrão da média) dos
hormônios (estrógeno, progesterona, testosterona, inibina) e do oxido nítrico
dosados no fluído folicular aspirado dos animais dos grupos controle e
superovulado com extrato de pituitária eqüina, foi utilizado o Teste t, com nível
de significância de 5%.
Para as lacunas de dados da densidade óptica integrada, utilizou-se o
programa estatístico (SigmaStat
), que emprega um sofisticado sistema
baseado no cálculo do quadrados mínimos e na regressão dos dados, linear ou
não para substituir as células vazias por valores próximos aos médios reais,
mas, extrapolados por fórmulas matemáticas. Mostrando a ausência da banda
não como um valor nulo (p<0,05). Já para os percentuais de presença ou
ausência do padrão das bandas eletroforéticas do líquido folicular dos grupos
controle e superovulado foram realizado o teste exato de Fisher, com nível de
significância de 5%.
Para a avaliação dos níveis hormonais entre indivíduos de folículos
aspirados foi utilizado o teste de Anova e Student Newman Keuls, para se
evidenciar as diferenças estatísticas (p<0,05).
Experimento III 140
4.4.2 Resultados
4.4.2.1 Análise hormonal e de óxido nítrico intra-folicular
Não foi encontrada nenhuma variação significativa nas concentrações
médias dos hormônios e de oxido nítrico dosados entre os grupos controle e
superovulado, como demonstrado na tabela 07. Observação semelhante foi
encontrada quando avaliado os níveis hormonais entre folículos de um mesmo
animal dentro do grupo superovulado, apesar da grande variação de valores
detectada (Figura 19).
Contudo, houve diferenças quando comparados os valores hormonais
dos indivíduos do grupo superovulado (p<0,05), com exceção da progesterona
(p>0,05), conforme demonstrado na tabela 08. No grupo de éguas controle não
foi observado diferença significativa (p>0,05) nos valores hormonais entre os
indivíduos.
Experimento III 141
Tabela 07: Média e erro padrão dos hormônios dosados no fluído folicular dos
animais dos grupos controle e superovulado com extrato de pituitária eqüina.
Hormônios Controle EPE Valor de P
Inibina (
µ
g/mL)
1,59 ± 0,12 2,33 ± 0,25 P=0,106
Testosterona (ng/mL) 7,96 ± 0,76 8,89 ± 0,36 P=0,231
Estrógeno (
µ
g/mL)
1,60 ± 0,17 1,39 ± 0,09 P=0,265
Progesterona (ng/mL) 324,25 ± 93,1 241,92 ± 47,46
P=0,411
Oxido Nítrico (
µ
M/mL) 5,61
±
0,61 5,94
±
0,42
P= 0,688
Tabela 08: Média e erro padrão por indivíduo dos hormônios dosados no fluído
folicular dos animais do grupo superovulado com extrato de pituitária eqüina.
ÉGUAS
INIBINA
TESTOSTERONA
ESTROGENO
PROGESTERON
A
16 1,56 ± 0,012 C 8,8 0,44 AB 1,5 ± 0,05 B 67,0 ± 2,12 A
29 2,77 ± 0,191 C 7,03 ± 1,07 B 1,34 ± 0,13 B 94,33 ± 38,32 A
46 5,02 ± 0,55 B 9,9 ± 0,51 AB 1,87 ± 0,13 B 333,0 ± 6,66 A
54 1,232 ± 0,46 D 6,75 ± 0,08 B 0,64 ± 0,023 C 233,25 ± 72,25 A
60 2,5 ± 0,0 CD 8,9 ± 0,0 AB 1,05 ± 0,0 B 1232,0 ± 0,0 A
100 1,86 ± 0,26 C 10,3 ± 2,0 AB 1,66 ± 0,47 B 55,0 ± 11,0 A
112 1,47 ± 0,88 D 10,4 ± 1,07 AB 1,44 ± 0,14 B 225,25 ± 60,65 A
140 1,59 ± 0,86 C 12,17 ± 0,57 A 2,53 ± 0,09 A 197,25 ± 19,69 A
256 1,24 ± 0,025 D 9,23 ± 1,09 AB 0,89 ± 0,061 C 602,67 ± 432,4 A
387 2,2 ± 0,185 C 7,17 ± 0,38 B 1,0 ± 0,16 C 268,0 ± 40,5 A
Colina 1,815 ± 0,09 C 7,7 ± 0,38 B 1,45 ± 0,13 B 211,0 ± 112,33 A
Jady 6,04 ± 0,82 A 8,33 ± 2,18 AB 0,9 ± 0,05 C 74,0 ± 40,15 A
Letras maiúsculas diferentes na mesma coluna apresentam diferenças significativas
(p<0,01)
Experimento III 142
Figura 17: Valores médios da concentração de oxido nítrico (1), inibina (2),
testosterona (3), estrógeno (4) e progesterona (5) do líquido folicular
dos
grupos controle (CONT) e superovulado (SO).
5,4
5,5
5,6
5,7
5,8
5,9
6
CONT. SO
uM/ml
NO
1
0
50
100
150
200
250
300
350
CONT SO
ng/ml
P4
5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
CONT SO
ng/ml
T
3
0
0,5
1
1,5
2
CONT SO
ug/ml
E2
4
0
0,5
1
1,5
2
2,5
CONT SO
ug/ml
INIB
2
•
NO = Oxido Nitrico
• INIB = Inibina
• T = Testosterona
• E2 = Estrogeno
• P4 = Progesterona
Experimento III 143
Égua 100
0,00
1,00
2,00
3,00
F1 F2
Folículos
ug/mL
INB
E2
Égua 100
0,00
5,00
10,00
15,00
F1 F2
Folículos
ng/mL
T
Égua 100
0
50
100
F1 F2
Folículos
ng/mL
P4
Égua 112
0,00
1,00
2,00
F1 F2 F3 F4
Folículos
ug/ml
INB
E2
Égua 112
0,00
5,00
10,00
15,00
F1 F2 F3 F4
Folículos
ng/mL
T
Égua 112
0
200
400
600
F1 F2 F3 F4
Folículos
ng/mL
P4
Égua 140
0,00
1,00
2,00
3,00
F1 F2 F3 F4
Folículos
ug/ml
INB
E2
Égua 140
0,00
5,00
10,00
15,00
F1 F2 F3 F4
Folículos
ng/ml
T
Égua 140
0
200
400
F1 F2 F3 F4
Folículos
ng/ml
P4
Égua 256
0,00
1,00
2,00
F1 F2 F3
Folículos
ug/ml
INB
E2
Égua 256
0,00
5,00
10,00
15,00
F1 F2 F3
Folículos
ng/ml
T
Égua 256
0
500
1000
1500
F1 F2 F3
Folículos
ng/ml
P4
Experimento III 144
Égua 387
0
500
F1 F2 F3
Folículos
ng/ml
P4
Égua 387
0,00
1,00
2,00
3,00
F1 F2 F3
Folículos
ug/ml
INB
E2
Égua 387
0,00
5,00
10,00
F1 F2 F3
Folículos
ng/ml
T
Égua 29
0
100
200
F1 F2 F3
Folículos
ng/ml
P4
Égua 29
0,00
5,00
10,00
F1 F2 F3
Folículos
ng/ml
T
Égua 29
0,00
1,00
2,00
3,00
F1 F2 F3
Folículos
ug/ml
INB
E2
Égua 54
0,00
1,00
2,00
F1 F2 F3 F4
Folículos
ug/ml
INB
E2
Égua 54
0
500
F1 F2 F3 F4
Folículos
ng/ml
P4
Égua 54
0,00
5,00
10,00
F1 F2 F3 F4
Folículos
ng/ml
T
Égua 46
300
320
340
360
F1 F2 F3
Folículos
ng/ml
P4
Égua 46
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
F1 F2 F3
Folículos
ug/ml
INB
E2
Égua 46
0,00
5,00
10,00
15,00
F1 F2 F3
Folículos
ng/ml
T
Experimento III 145
Figura 18: Concentração de inibina, testosterona, estrógeno e progesterona
do líquido folicular por animal do grupo superovulado com extrato de pituitária
eqüina.
Égua 60
0
500
1000
F1
Folí culo
P4
Égua 60
0,00
1,00
2,00
3,00
F1
Folículo
ng/ml
INB
E2
Égua 60
0,00
5,00
10,00
F1
Folículo
ng/ml
T
Égua Colina
0,00
5,00
10,00
F1 F2 F3 F4
Folículos
T
Égua Colina
0
500
1000
F1 F2 F3 F4
Folículos
ng/ml
P4
Égua Colina
0,00
1,00
2,00
F1 F2 F3 F4
Folículos
ug/ml
INB
E2
Égua Jady
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
F1 F2 F3
Folículos
ug/ml
INB
E2
Égua Jady
0,00
5,00
10,00
15,00
F1 F2 F3
Folículos
ng/ml
T
Égua Jady
0
50
100
150
200
F1 F2 F3
Folículos
ng/ml
P4
Égua 16
0,00
1,00
2,00
F1 F2 F3 F4
Folículos
ug/ml
INB
E2
Égua 16
0,00
5,00
10,00
15,00
F1 F2 F3 F4
Folículos
ng/ml
T
Égua 16
50
60
70
80
F1 F2 F3 F4
Folículos
ng/ml
P4
•
INB = Inibina, T = Testosterona, E2 = Estrógeno, P4 = Progesterona, F = Folículo
Experimento III 146
4.4.2.2 Perfil eletroforético das proteínas do fluido folicular
Foram encontradas 30 bandas nas éguas superovuladas e 24 nas éguas
controle, sendo a B1, B2, B10, B14, B16 e B29 sempre ausentes no grupo
controle. No grupo superovulado apenas 09 bandas estavam presentes em
todas as amostras, sendo encontrado 17 bandas comuns a todas as éguas no
grupo controle.
A B5 estava ausente no folículo do animal 46A e a B30 estava ausente
no F2 da égua Jady do grupo superovulado. A B22, B27 e B28 estavam
ausentes na égua 212 do grupo controle. Já a B14 e B16 estavam presentes
apenas no F1 do animal 140 e no F1 da égua 387 do grupo superovulado.
Comparando-se a densidade óptica integrada (IOD) das bandas
protéicas encontradas nos diferentes grupos, observou-se uma maior
densidade na B7 (129,2Kda), no grupo superovulado do que no controle
(p=0,01), bem como nas B8, B9, B11, B12 e B13 (tabela 09).
Na faixa das bandas B17 a B23 (28,1 a 47Kda) encontraram-se
proteínas com pesos moleculares similares aos das Proteínas Ligadoras de
IGF (IGFBP) envolvidas no processo de maturação folicular, como a IGFBP – 3
(42 a 44Kda), IGFBP – 5 (28 a 32Kda) e IGFBP – 2 (35Kda), Gerard & Monget
(1998). Nessa faixa encontrou-se uma maior densidade na B17 (47Kda) no
grupo superovulado do que no controle (p= 0,04), também foi detectado uma
tendência estatística (0,05<P<0,1) na IOD das bandas B19 e B20 do grupo
superovulado.
Analisando-se as porcentagens da presença das bandas protéicas dos
grupos (tabela 10), observou-se uma menor freqüência da B8 (117Kda), B10
(100,4Kda), B14 (96Kda), B22 (31,2Kda), B23 (28,1Kda) e B28 (17,6Kda) no
grupo superovulado do que no controle (p<0,05). Ao passo que a B1
(352,8Kda), B2 (327,8Kda), B4 (255Kda) e B26 (22,3Kda) apresentaram uma
maior freqüência no grupo controle (p<0,05).
A B27 (20,2Kda) demonstrou uma tendência de maior freqüência no
grupo controle do que no superovulado (p=0,073). Nas faixas das proteínas
conhecidamente envolvidas no processo de maturação folicular (B17 a B23)
somente observou-se diferença na B22 e na B23 em possuir uma freqüência
menor no grupo superovulado, Gerard & Monget (1998).
Experimento III 147
Não foi realizada uma correlação entre o grau de maturação oocitária e
os resultados obtidos na eletroforese por folículo, pois a maturação foi avaliada
pela microscopia eletrônica, na qual foi necessária a utilização de um “pool” de
oócitos recuperados pela aspiração folicular no grupo controle e superovulado.
Tabela 09
: Densidade óptica integrada (IOD) das bandas encontradas nos
diferentes folículos de éguas do grupo controle e superovulado com extrato de
pituitária eqüina
.
Superovulado
Controle
Banda
n
lacunas
Média±SEM
n
lacunas
Média±SEM
P
B1
37
25 24,25 ± 1,88 12
12 — —
B2
37
25 26,43 ± 2,59 12
12 — —
B3
37
7 33,75 ± 2,38
a
12
0 39,69 ± 3,78
a
0,191
B4
37
32 37,04 ± 6,30
a
12
7 29,47 ± 3,42
a
0,126
B5
37
01 53,43 ± 2,71
a
12
0 61,34 ± 5,09
a
0,160
B6
37
7 53,86± 2,04
a
12
0 55,35 ± 3,98
a
0,719
B7
37
5 63,84 ± 3,42
a
12
0 48,07 ± 3,03
b
0,011
B8
37
13 61,57 ± 5,3
a
12
0 41,72 ± 2,03
b
0,014
B9
37
0 54,43 ± 3,24
b
12
0 71,68 ± 4,57
a
0,008
B10
37
31 38,78 ± 3,52
a
12
12 — —
B11
37
0 56,98 ± 4,21
a
12
0 40,36 ± 4,09
b
0,038
B12
37
0 165,24 ± 9,48
b
12
0 222,67 ± 14,29
a
0,003
B13
37
11 97,74 ± 7,22
b
12
5 134,67 ± 9,38
a
0,018
B14
37
36 107,93 12
12 — —
B15
37
0 778,25±36,69
a
12
0 801,59±77,37
a
0,766
B16
37
36 231,55 12
12 — —
B17
37
0 289,42 ± 9,53
a
12
0 249,87 ± 14,82
b
0,040
B18
37
0 74,87 ± 4,39
a
12
0 63,54 ± 2,08
a
0,156
B19
37
0 82,02 ± 3,04
a’
12
0 75,50 ± 4,31
a’
0,056
B20
37
0 70,73 ± 4,79
a’
12
0 55,86 ± 2,27
a’
0,089
B21
37
0 93,81 ± 10,27
a
12
0 69,31 ± 4,08
a
0,187
B22
37
20 89,20 ± 11,18
a
12
1 90,17 ± 8,44
a
0,951
B23
37
20 242,27±31,59
a
12
0 180,00 ± 19,45
a
0,142
B24
37
9 332,23 ± 19,6
a’
12
5 259,13 ± 7,76
a’
0,075
B25
37
0 111,27 ± 5,29
a
12
0 101,76 ± 6,93
a
0,352
B26
37
30 65,70 ± 7,85
a
12
5 58,95 ± 5,92
a
0,506
B27
37
15 54,63 ± 6,59
a
12
1 40,58 ± 4,80
a
0,169
B28
37
26 40,03 ± 5,17
a
12
1 34,46 ± 5,08
a
0,451
B29
37
33 49,74 ± 7,69 12
12 — —
B30
37
1 65,27 ± 4,48
a’
12
0 51,53 ± 3,41
a’
0,095
Letras minúsculas iguais na mesma linha não apresentam diferença estatística (Teste t,
p<0,05).
Experimento III 148
Tabela 10
: Percentual de bandas protéicas no liquido folicular de éguas do
grupo controle e superovulado.
Superovulado
Controle
Banda
n
Presença
%
n
Presença
%
P
B1
37
12 32,43
a
12
0
0
b
0,024
B2
37
12 32,43
a
12
0 0
b
0,024
B3
37
30 81,08
a
12
12 100
a
0,171
B4
37
32 86,48
a
12
5 41,66
b
0,004
B5
37
36 97,29
a
12
12 100
a
1,0
B6
37
30 81,08
a
12
12 100
a
0,171
B7
37
32 86,48
a
12
12 100
a
0,315
B8
37
24 64,86
b
12
12 100
a
0,021
B9
37
37 100
a
12
12 100
a
1,0
B10
37
6 16,21
b
12
12 100
a
<0,001
B11
37
37 100
a
12
12 100
a
1,0
B12
37
37 100
a
12
12 100
a
1,0
B13
37
26 70,27
a
12
7 58,33
a
0,492
B14
37
1 2,7
b
12
12 100
a
<0,001
B15
37
37 100
a
12
12 100
a
1,0
B16
37
1 2,7
a
12
0 0
a
1,0
B17
37
37 100
a
12
12 100
a
1,0
B18
37
37 100
a
12
12 100
a
1,0
B19
37
37 100
a
12
12 100
a
1,0
B20
37
37 100
a
12
12 100
a
1,0
B21
37
37 100
a
12
12 100
a
1,0
B22
37
17 45,94
b
12
11 91,66
a
0,007
B23
37
17 45,94
b
12
12 100
a
<0,001
B24
37
28 75,67
a
12
7 58,33
a
0,285
B
25
37
37 100
a
12
12 100
a
1,0
B26
37
7 18,91
b
12
7 58,33
a
0,023
B27
37
22 59,45
a’
12
11 91,66
a’
0,073
B28
37
11 29,72
b
12
11 91,66
a
<0,001
B29
37
4 10,81
a
12
0 0
a
0,561
B30
37
36 97,29
a
12
12 100
a
1,0
Letras minúsculas iguais na mesma linha não apresentam diferença estatística (Teste Exato de
Fisher, p<0,05).
Experimento III 149
Figura 19
: Eletroforese em poliacrilamida de proteínas do líquido folicular de
éguas superovuladas. Canaleta 1, Marcador de Peso (10 a 250Kda); setas
largas indicam as bandas formadas pelo marcador de peso molecular.
Canaletas de 2 a 10 são amostras do líquido folicular de éguas superovuladas.
250KDa
15KDa
25KDa
30KDa
35KDa
50KDa
75KDa
105KDa
160KDa
1
10
9
8
7
6
5
4
3
2
Experimento III 150
Figura 20
: Eletroforese em poliacrilamida de proteínas do liquido folicular de
éguas não superovuladas. Canaleta 1, Marcador de Peso Molecular (10 a
250kDa); setas largas indicam as bandas formadas pelo marcador de peso
molecular. Canaletas de 2 a 13 são amostras do liquido folicular de éguas não
superovuladas.
250KDa
15KDa
25KDa
30KDa
35KDa
50KDa
75KDa
105KDa
160KDa
1
10
9
8
7
6
5
4
3
2
11
12
13
Experimento III 151
4.4.3 DISCUSSÃO
O líquido folicular apresenta concentrações variáveis de hormônios de
acordo com a fase de desenvolvimento folicular, estando estas variações bem
estudadas na fêmea eqüina. Contudo, a literatura é falha em apresentar
trabalhos que comparem diferenças na composição do fluido folicular entre
éguas submetidas a estímulo hormonal visando superovulação e éguas não
estimuladas.
Não foram encontradas em nosso experimento diferenças significativas
(p>0,05) nas concentrações dos diferentes hormônios estudados
(progesterona, Testosterona, Estrógeno e Inibina) entre éguas tratadas ou não
com EPE. Contudo foi observado uma maior variação (p<0,05) nos níveis entre
indivíduos nas éguas superovuladas, o que não foi observado nas éguas
controle (p>0,05).
Quando avaliado os valores de cada hormônio, observamos que os
valores de testosterona obtidos em nosso trabalho não apresentaram
diferenças significativas entre o grupo controle e superovulado (7,96±0,76 e
8,89±0,36ng/mL, respectivamente). O mesmo foi observado por Alvarenga et
al. (2000) ao aspirar folículos de éguas de 10 a 20mm, 20 a 30mm e >30mmm,
sem indução da ovulação.
Altas concentrações de andrógenos intra-foliculares estão
correlacionadas com o processo de atresia, porem não se sabe se são
responsáveis ou conseqüências desta condição. Os andrógenos produzem um
aumento da atividade da P450scc promovendo uma maior captação de
lipoproteínas e maior conversão do colesterol em pregnenolona. Nas células da
teca de humanos, eles promovem um aumento da atividade da 3βHSD, e nas
células da granulosa uma diminuição da atividade desta enzima, diminuindo a
produção de progesterona. Também possuem uma ação conjunta com o FSH
no complexo P450aromatase das células da granulosa, promovendo maior
aromatização dos andrógenos.
Não observamos também diferença estatística entre os grupos em
relação aos níveis de progesterona (324,25±93,1 e 241±47,46ng/mL grupo
controle e superovulado, respectivamente) e estradiol (1,60±0,17 e
1,39±0,09µg/mL grupo controle e superovulado, respectivamente). Alvarenga
Experimento III 152
et al. (2000) ao aspirar folículos de éguas de 10 a 20mm, 20 a 30mm e
>30mmm, sem indução da ovulação, também não observaram diferença
significativa nos níveis de P4. Gérard et al. (2002) encontraram no fluido
folicular de folículos pré-ovulatórios de éguas não superovuladas uma
concentração 1094,3±170,9ng/mL de progesterona e 2,8±0,24µg/mL de
estradiol, valores bem superiores ao encontrado no grupo controle de nosso
experimento. Somente um animal do grupo controle apresentou nível de
estradiol superior a 2,3µg/mL e em dois animais do grupo superovulado foram
observados níveis de progesterona superiores a 1000ng/mL no fluido folicular.
Assey et al. (2005) relataram uma menor concentração de E2 e P4 no
fluido folicular de novilhas superovuladas, corroborando com os nossos
achados, pois mesmo não havendo diferença significativa, os valores desses
hormônios foram numericamente menores no grupo superovulado do que no
controle (1,39 e 241,92µg/mL; 1,60 e 324,25ng/mL, respectivamente). Em
contraste, Yun et al. (2005) relataram que os níveis de progesterona foram
superiores em ratas superovuladas com PMSG, entretanto os valores de
estrógeno não apresentaram variação entre os grupos (controle e tratado).
Esses resultados indicam uma evidencia direta de que essas ovulações
atípicas geraram oócitos com maturação nuclear assincrônica ou prematura e
demonstraram uma correlação direta entre esses oócitos com aberrações
meióticas e a esteroidogênese folicular anormal que se seguiu após o
tratamento com PMSG, em ratas. O’Callaghan et al. (2000) em ovelhas,
encontraram valores superiores no liquido folicular tanto de P4 quanto de E2 no
grupo superovulado quando comparado ao controle.
O EPE é um produto que apresenta maior concentração de LH do que o
FSH, podendo inclusive ser utilizado na indução da ovulação em éguas
(Medeiros et al., 2005; Melo et al., 2005) de forma tão eficaz quanto aos outros
indutores de ovulação utilizados nesta espécie (hCG e GnRH). Esses altos
níveis de LH administrado no grupo superovulado não resultaram em uma
maior secreção de P4 e de E2 em relação ao grupo controle, entretanto os
níveis de testosterona a despeito de não ter sido verificado diferença estatística
foram numericamente maiores nas éguas superovuladas do que as do grupo
controle (8,89 e 7,96ng/mL, respectivamente), porém não o suficiente para
Experimento III 153
promover uma maior estimulação na síntese de E2 nos folículos do grupo
superovulado. Estes achados concordam com outros autores (Watson and
Hinrichs 1988), os quais observaram um aumento dos níveis intrafolicular de
testosterona em éguas tratadas com hCG, Indicando que como demonstrado
por Tucker et al., (1986), as células da teca interna produza mais testosterona
quando estimulada com LH. Diferente do esperado, os níveis de P4 foram
numericamente mais baixo nas éguas superovuladas. Estas duas observações
indicam que os folículos das éguas superovulads não estão completamente
maturados, onde aparentemente as células da granulosa estão menos
responsívas ao estímulo exógeno de LH. Esperava-se que os níveis de P4
intrafolicular de éguas superovuladas fosse superior pois o EPE contem altos
níveis de LH o que deveria induzir uma maior luteinização folicular das células
da granulosa. Em bovinos é sabido que um dos fatores determinantes da baixa
taxa de recuperação de embriões utilizando eCG está relacionado com a alta
atividade de LH destes hormônios (Soumano & Price, 1997). Estes mesmos
autores demonstraram que folículos de vacas superestimuladas com eCG
apresentaram um aumento na produção da “Star” (steroidogenic acude
regulatory protein) proteína esta responsável pelo transporte de colesterol pela
membrana mitocondrial, sendo posteriormente convertido o colesterol em
pregnenolona pela enzima P450scc (colesterol side-chain cleavage).
O fato do LH/hCG não estimular a atividade da P450aromatase (arom) e
a testosterona apresentar efeito estimulador marcante na síntese de E2 sugere
que, pelo menos durante a fase folicular tardia, a disponibilidade de substrato
aromatizável seja limitante para que ocorra a síntese de E2 pelas células da
granulosa. Essa hipótese é sustentada por relatos que demonstraram que a
célula da granulosa de folículos pré-ovulatórios de ovinos (Evans et al., 1981) e
suínos (Tsang et al., 1985), cultivadas in vitro e coletadas durante diferentes
tempos após o tratamento com eCG, apresentam atividade da P450arom
constante (Caldas-Bussiere et al., 2005). Essa alteração na esteroidogênese
de folículos superovulados, tem sido relatada como um forte contribuinte na
redução do desenvolvimento e na maturação do oócito em ratas (Yun et al.,
2005), em vacas (Assey et al., 2005).
Bézard et al. (1995) observaram níveis mais baixos de androstenediona
e testosterona nas éguas superovuladas com EPE do que nas não
Experimento III 154
superovuladas, não havendo observado contudo, diferença nos níveis de
progesterona e estradiol .
Estes resultados contradizem nossos achados, pois não encontramos
diferença significativa nas concentrações intra-foliculares de P4, E2 e
testosterona entre as éguas superovuladas e não superovuladas. Os valores
médios de progesterona intra-folicular de nosso experimento (282,5ng/mL),
estão bem a baixos dos encontrados por Bézard et al. (1995) 861 ng/mL,
porém próximos aos descritos por Watson & Hinrichs (1988) para folículos pré-
ovulatório aspirados 28 a 32h após a administração do hCG (401,5ng/mL).
Já os níveis de testosterona (8,42ng/mL) obtidos em nosso trabalho
foram próximos aos descritos Watson & Hinrichs (1988) e por Bézard et al.
(1995) (12,1 e 10,6ng/mL, respectivamente) para folículos pré-ovulatório,
ocorrendo o mesmo quanto aos níveis de estrógeno, onde observamos
concentrações iguais aos de Bézard et al. (1995) 1,5ng/mL. Bézard et al.
(1995), também relatam uma correlação positiva entre os níveis de E2 e P4 e a
recuperação de embriões.
O oxido nítrico (NO) é caracterizado como um importante mensageiro
intra e intercelular que tem papel fundamental na fisiologia ovariana na espécie
eqüina, como no crescimento folicular e no processo ovulatório (Moira et al.,
1998; Pinto et al., 2002). Dentre as várias funções do NO uma das mais
importantes é a de controlar a relação dos vasos e volume sangüíneo
circulante folicular (Salvemine, 1987).
A ausência de diferença estatística nas concentrações médias de óxido
nítrico do fluido folicular do grupo superovulado e do controle (5,94±0,42 e
5,61±0,61µg/mL, respectivamente), neste experimento, é um bom indicador de
que este esteja presente em condições adequadas para funcionar como
mediador do mecanismo celular e vascular que ocorrem no ovário,
favorecendo, assim o desenvolvimento folicular e o processo ovulatório em
ambos os grupos. O fluido folicular contém proteínas que modulam a
diferenciação das células da granulosa induzidas pelo FSH, como inibina e
ativina ((Findlay et al., 1993), lipoproteínas (Veldhuis & Gwynne, 1989) e
proteínas ligadoras de IGF (Ui et al., 1989)
Em nosso trabalho foram encontradas bandas de peso molecular no
perfil eletroforético do líquido folicular semelhantes aos das IGFBP descritas
Experimento III 155
por Gérard & Monget (1998). De acordo com alguns pesquisadores existe uma
alta correlação entre as concentrações de IGFBPs, de estradiol e de
progesterona presentes no fluido folicular e a capacidade desses folículos
atingirem a dominância e maturação final pré-ovulação (Mihn et al., 2000;
Austin et al., 2001; Beg et al., 2001; Crowe et al., 2001; Ginther et al., 2001).
Na espécie eqüina o crescimento folicular juntamente com a maturação
oocitária estão associados com a diminuição nas concentrações intrafoliculares
de IGFBP-3, IGFBP-2 e de IGFBP-5 e um aumento de IGF-I livre (Gérard &
Monget 1998; Carneiro et al., 2002). Alvarenga et al. (2000) observaram que a
banda de 35Kda estava presente apenas em folículos maiores que 35mm,
afirmando ser essa banda um bom indicador de maturidade folicular, já em
folículos < 35mm esteve presente em maior a banda 23, a qual tem peso
molecular similar a IGFBP-5 encontrada em folículos imaturos.
Em nosso experimento observamos uma freqüência menor na presença
das bandas B22 e B23 (IGFBP-5) no grupo superovulado do que no controle,
não havendo diferença estatística entre as demais bandas. Por não possuirmos
os valores das concentrações dessas proteínas durante o desenvolvimento
folicular não podemos afirmar se esses valores diminuíram ou não no folículo
pré-ovulatório, contudo a ausência de diferença significativa entre o grupo
controle e superovulado, com exceção das bandas 17, 22 e 23, indicando que
provavelmente não houve influencia do tratamento superovulatório nas
concentrações da maioria das IGFBP intra-folicular e conseqüentemente no
desenvolvimento e maturação folicular. Este evento pode estar influenciado
pela administração do hCG (LH) em ambos os grupos promovendo desta forma
a maturação de todos os folículos aspirados, já que em folículos com diâmetro
entre 10 a 30mm tem-se demonstrado haver uma maior quantidade de
proteínas com peso molecular de 28-32Kda (IGFBP-5) indicando imaturidade
folicular, ao contrário de folículos pré-ovulatórios (folículos maturos) que há a
ausência destas e a presença de proteínas com peso molecular de 35Kda
(IGFBP-2) (Alvarenga et al., 2000).
Gérard & Monget (1998) observaram em éguas que há uma diminuição
na concentração intra-folicular de IGFBP-3 e de IGFBP-5 antes da indução da
ovulação, e um aumento de IGFBP-2 após a indução da ovulação. Portanto, o
crescimento e a regressão folicular em éguas está associado a mudanças
Experimento III 156
específicas nos níveis de IGFBP, o qual pode ser de importância crucial no
desenvolvimento folicular, na ovulação e na atresia folicular.
Experimento IV 158
4.5 EXPERIMENTO IV
“ESTUDO DA MATURAÇÃO OOCITÁRIA DE ÉGUAS SUPEROVULADAS COM
EXTRATO DE PITUITÁRIA EQUINA”
4.5.1 MATERIAL E MÉTODOS
4.5.1.1 Monitorização e tratamento das éguas superovuladas
A monitorização e o tratamento das éguas do grupo superovulatório
(Extrato de Pituitária Eqüina) foi realizados conforme descrito no experimento I e
II.
4.5.1.2 Avaliação dos oócitos recuperados de folículos aspirados
4.5.1.2.1 Avaliação ultraestrutural da maturação citoplasmática
A morfologia dos ovócitos foi analisada utilizando-se a microscopia
eletrônica de transmissão (MET). Foram utilizados neste experimento 10 ovócitos
obtidos após superovulação e 6 ovócitos obtidos de animais não superovulados
(controle). Os oócitos foram fixados em glutaraldeído a 2.5% em tampão fosfato a
0.1M (pH 7.4) e pós-fixados em tetróxido de osmio a 1% em mesmo tampão. Após
a desidratação em séries crescentes de acetona os ovócitos foram incluídos em
Epon. Os cortes ultra-finos foram obtidos com navalha de diamante, montados em
grades de cobre e corados com acetato de uranila e citrato de chumbo. As
amostras foram então examinadas em um microscópio eletrônico de transmissão
Philips CM100.
Experimento IV 159
4.5.1.2.2 Avaliação da maturação nuclear
A) Avaliação dos oócitos recuperados do oviduto
A classificação morfológica de 27 oócitos (degenerado, compacto,
desnudado e expandindo) foi realizada imediatamente após a sua localização
utilizando um estereomicroscópio (Figura 21).
Logo após a classificação dos oócitos, estes foram imersos durante 15
minutos em MitoTracker Red CMX Ros
(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)
250nM, sendo posteriormente fixados em paraformaldeido a 3.7% em PBS e
armazenados individualmente em criotubos a 4°C. Ao serem avaliados por
microscopia confocal, os oócitos foram permeabilizados com Tritón X (Sigma cat #
T8787) durante 5 minutos, incubados com Sytox Green
(Molecular Probes,
Eugene, OR, USA) 2.5µM e montados em porta objetos preparados com poly L-
Lysina. As amostras foram processadas com um microscopio confocal Laser
Scanning LSM 510
, (Inverted Axiovert 100, Carl Zeiss, Jena, Germany),
utilizando lasers de Helio / Neón e Argón, e obtendo-se séries de cortes confocais
de 2µm de cada oócito.
As avaliações dos oócitos seguiram as seguintes determinações:
a) Estágio nuclear (Losinno, 2006)
• Metáfase I (MI)
• Metáfase II (MII)
• Não Definido (ND): Configuração da cromatina não compatível com as
fases meióticas ou cromatina não visível.
Experimento IV 160
Figura 21: Oócitos recuperados do oviduto de éguas superovuladas com extrato
de pituitária eqüina.
4.5.1.3 Analise estatística
Para a comparação entre as proporções foi utilizado o teste Exato de
Fisher. O nível de significância utilizado foi de 5%.
Experimento IV 161
4.5.2 Resultados
4.5.2.1 Avaliação ultraestrutural oocitária através da microscopia eletrônica
Oócitos de éguas controle
Nos oócitos do grupo controle a característica principal foi a presença de
uma grande quantidade de gotas de lipídeos e mitocôndrias distribuídas de
maneira homogênea por todo o citoplasma (Figura 22). As mitocôndrias
apresentam formato arredondado ou em formato de alteres com poucas cristas,
não diferindo morfologicamente das observadas nos oócitos superovulados.
Complexos de Golgi pouco desenvolvidos aparecem na região cortical do
oócito. A quantidade de vesículas observada também foi pequena. Apesar disto,
o retículo endoplasmático liso se encontrava presente, principalmente na região
sub-cortical associado às mitocôndrias e às gotas de lipídeo (Figura 23).
O espaço perivitelínico apresentou-se estreito e em seu interior foram
observadas inúmeras microvilosidades (Figura 24). Nestes oócitos não foram
vistos pontos de contato entre as microvilosidades oocíticas e os prolongamentos
das células da granulosa circundantes. Logo abaixo da membrana vitelínica foi
detectada a presença de inúmeros grânulos corticais de tamanho e eletron-
densidade homogêneas (Figura 24).
Oócitos de éguas superovuladas
A principal característica dos oócitos obtidos após a superovulação também
foi a grande riqueza em mitocôndrias e a presença no citoplasma de uma grande
quantidade de grânulos de lipídeo (Figura 25). Estes grânulos com freqüência
apareceram associados às mitocôndrias (Figura 26). Em alguns dos casos foram
observados restos membranosos no interior de alguma das gotas ou grânulos
(Figura 25), as quais também se encontravam associadas às mitocôndrias.
As mitocôndrias apresentavam-se pequenas arredondadas ou em forma de
alteres com poucas cristas internas e distribuídas por todo o ovoplasma,
semelhante ao observado no oócitos do grupo controle.
O complexo de Golgi apresentou-se também na periferia do ovoplasma. No
entanto, enquanto no grupo controle este aparecia pouco desenvolvido, nos
Experimento IV 162
oócitos oriundos de folículos superovulados o complexo de Golgi apresentara-se
bem desenvolvido e constituído por várias cisternas sobrepostas e associado a
pequenas vesículas recobertas (Figura 26), semelhantes às vistas originando-se
por pinocitose na superfície do oócito. Nas proximidades do complexo de Golgi
foram observados alguns grânulos limitados por membranas, com conteúdo
elétron-densos, os quais foram caracterizados como grânulos corticais. Grânulos
semelhantes foram observados próximos a membrana plasmática, embora em
pequeno número (Figura 27) e dispersos pelo citoplasma, ou agrupados em
conjunto com as mitocôndrias. Retículo endoplasmático liso (REL) tubular
apareceu principalmente na região sub-cortical do oócito associados a
mitocôndrias (Figura 27).
O espaço vitelínico dos oócitos superovulados apresentou-se ligeiramente
dilatado e atravessado por microvilosidades (Figuras 27 e 28). Através da zona
pelúcida, constituída por material fibrilar, foram observados alguns
prolongamentos celulares originados das células da granulosa ainda presentes ao
redor dos oócitos. No interior do espaço perivitelínico estes prolongamentos fazem
contato com a membrana vitelínica do oócito ou com seus prolongamentos, sendo
que em alguns pontos foi observada a presença de complexos juncionais entre
eles (Figura 28).
Experimento IV 163
zp = zona pelúcida
Figura 22: Aspecto geral do oócito de eqüino do grupo controle. Notar o grande
número das gotas lipídicas (l) e mitocôndrias (m) e a presença de grânulos
corticais (gc) distribuídos na região cortical.
l
l
l
zp
m
m
m
gc
gc
(6500x)
Experimento IV 164
gc = grânulos corticais; ep = espaço perivitelínico
Figura 23: Detalhe da região cortical de uma oócito do grupo controle, mostrando
mitocôndrias (m) associadas a gotas de lipídeo (l) e ao retículo endoplasmático
liso (rel).
m
m
m
l
l
rel
gc
gc
ep
(13.000x)
Experimento IV 165
zp = zona pelúcida; mv = microvilosidades; m = mitocôndrias
Figura 24: Detalhe da região cortical de um oócito do grupo controle mostrando a
distribuição dos grânulos corticais (gc).
zp
m
mv
gc
(16.500x)
Experimento IV 166
m = mitocôndrias; l = lipídeo; zp = zona pelúcida
Figura 25: Aspecto geral de um oócito superovulado de eqüino.
zp
l
l
l
m
m
m
(3.600x)
Experimento IV 167
ep = espaço perivitelínico; mv = microvilosidades; m = mitocôndrias
Figura 26: Detalhe da região cortical de oócitos de eqüino superovulado,
mostrando a presença de Golgi (G) bem desenvolvido e a metabolização de
lipídeos (l). Notar a presença de vesículas recobertas (ve1) na face cis e vesículas
lisas (ve2) na face trans do Golgi.
ep
mv
l
l
l
G
G
m
m
ve1
ve1
ve2
Experimento IV 168
zp = zona pelúcida; m = mitocôndria; mv = microvilosidades; rel = retículo
endoplasmático liso.
Figura 27: Grânulos corticais (gc) associados a mitocôndrias, distribuídos pelo
citoplasma de oócitos superovulados de eqüinos.
gc
gc
zp
m
m
m
mv
rel rel
(13.000x)
Experimento IV 169
jc = junção comunicante; zo = sônula de oclusão; mv = microvilosidades
Figura 28: Aspecto das junções celulares entre o oócito e as células da granulosa
presentes nos oócitos superovulados.
jc
zo
mv
(23.000x)
Experimento IV 170
4.5.2.2 Avaliação oocitária por meio da microscopia confocal
Os resultados da avaliação oocitária através da microscopia confocal
demonstraram um maior número de oócitos em MI (40% - 11/27 oócitos) em
relação a MII (15% - 04/27 oócitos) em éguas superovuladas, a despeito de não
haver uma diferença estatística, o valor numérico em MI foi maior do que MII, o
que indica um problema na maturação oocitária. Quanto ao alto número de oócitos
não definidos (44% - 12/27 oócitos), podem ter ocorrido um problema na coloração
e/ou na leitura confocal, visto que na microscopia eletrônica não foi observado um
alto número de oócitos degenerados.
Tabela 11: Número e percentual de oócitos recuperados do oviduto de éguas do
grupo controle e superovulado com extrato de pituitária eqüina.
GRUPOS N
0
ÉGUAS
N
0
OÓCITOS
N
0
OÓC./MI
N
0
OÓC./MII
N
0
OÓC./ND.
SUPEROVULADO 13 27 11 (40%) 4 (15%) 12 (44%)
Experimento IV 171
Figura 29: Número médio de oócitos recuperados em diferentes estágios de
maturação do grupo superovulado com extrato de pituitária eqüina.
Figura 30: Percentual de oócitos recuperados em diferentes estágios de
maturação grupo superovulado com extrato de pituitária eqüina.
Superovulada
0
50
MI MII ND
Estágio de maturação
oocitária
% oócitos
Superovulada
MI = Metafase I, MII = Metafase II, ND = Não Definido
Superovulado
0
5
10
15
MI MII ND
Estágio de maturação
oocitária
Número de
oócito
Superovulado
MI = Metafase I MII =Metafase II
ND = Não Definido
Experimento IV 172
Figura 31: Percentual de oócitos em estágio de metafase e não definido em
éguas superovulado com extrato de pituitária eqüina.
Figura 32: Oócitos avaliados através da microscopia confocal, apresentando o
corpúsculo pola (1), placa metafásica I (2), placa metafásica II (3).
SO = Grupo Superovulado
SO
0
20
40
60
Metafase Não Definido
% OÓCITOS
SO
1
1 3
3
2
2
Experimento IV 173
4.5.3 DISCUSSÃO
4.5.3.1 Maturação citoplasmática
A principal característica dos oócitos de eqüinos estudados, independente
de seu estado de maturação foi a presença de uma grande quantidade de gotas
de lipídeo. Nos oócitos de ambos os grupos estas estruturas foram vistas em
associação com mitocôndrias e retículo endoplasmático liso, apresentando
conteúdo amorfo de densidade eletrônica média. De acordo com Flemming &
Saacke (1972) e Kruip et al. (1983) esta associação sugere a formação de
unidades metabólicas. A aparência do conteúdo presente nos oócitos do grupo
controle, nos quais as gotas parecem vazias e a associação menos consistente
com as mitocôndrias, parece indicar que o processo de maturação demanda a
metabolização do conteúdo destas gotas. No entanto, o fato de no grupo de
oócitos superovulados estas gotas apresentarem restos de membranas, indica a
metabolização do material nelas contido, ou seja, imaturidade, uma vez que nos
oócitos deste grupo a metabolização de lipídeos, provavelmente colesterol, ainda
está ocorrendo. Embora não existam relatos de produção de esteróides por
oócitos de eqüinos, é conhecida a capacidade do embrião de eqüino em produzir
estrógeno em seus estágios iniciais do desenvolvimento (Ginther, 1992). É
possível que o RNAm para as enzimas que controlam a produção de hormônios
esteróides seja armazenado no ovócito nos seus estágios finais de maturação.
Durante a fase de crescimento dos oócitos de mamíferos, ocorre
concomitantemente um aumento no número de mitocôndrias, bem como a
modificação de sua morfologia. Neste estudo, não foram observadas diferenças
com relação a morfologia das mitocôndrias dos oócitos analisados, mas a
associação destes com gotas lipídicas parece menos freqüentes nos oócitos do
grupo controle.
A presença de complexo de Golgi localizado na periferia dos ovócitos foi
observada em ambos os grupos estudados. Entretanto, nos oócitos do grupo
superovulado, o complexo de Golgi apresentou-se mais desenvolvido, constituído
Experimento IV 174
por inúmeras lamelas dilatadas associadas a vesículas membranosas de elétron-
densidade variável. Alem disso, grânulos semelhantes aos grânulos corticais
foram observados na proximidade desta organela. Nos oócitos do grupo controle,
o complexo de Golgi, também presente na periferia, apareceu com tamanho
reduzido indicando menor atividade, o que poderia ser explicado por já ter
concluído a produção dos grânulos corticais. Estes achados estão de acordo com
o observado por Hyttel et al. (1989) que observaram complexos de Golgi menos
desenvolvidos em oócitos bovinos maduros.
Em eqüinos, Landim-Alvarenga & Alvarenga (2006), trabalhando com
oócitos maturados in vivo e in vitro por 24 a 36 horas, descreveu que, enquanto o
oócito maturados in vivo apresentavam inúmeros grânulos corticais, com forma e
tamanho homogêneo, localizados próximo a membrana vitelínica, após 24 a 36
horas de maturação in vitro os grânulos corticais apresentavam-se com tamanho e
elétron-densidade variável e distribuídos aleatoriamente na região cortical do
oócito, mas sem alinhamento. Estes achados estão de acordo com o observado
neste experimento, em oócitos superovulados onde os grânulos corticais
apresentavam conteúdo de elétron-densidade variável, tamanho heterogêneo e se
encontravam dispostos na região cortical, mas não alinhados.
Nos oócitos obtidos de folículos superovulados foi observado um espaço
perivitelínico preenchido por microvilosidades, e algumas regiões onde as células
da granulosa se encontravam aderidas a membrana do ovócito através de
Junções comunicantes (Hyttel et al., 1989). Estes achados indicam mais uma vez
imaturidade citoplasmática incompleta. A conexão entre as células da granulosa e
o ovócito tem sido observada por diferentes pesquisadores há várias décadas,
estabelecendo-se a existência de uma íntima conexão e interação entre estes dois
tipos celulares (Browder, 1984).
De acordo com Odor (1960), no folículo pre-ovulatório, os processos das
células da granulosa começam a se retrair, e no momento da formação do 1
o
corpúsculo polar o espaço perivitelínico se encontra aumentado, não sendo mais
observadas junções celulares entre as células somáticas e o oócito. De fato, no
Experimento IV 175
grupo controle não foram observadas junções comunicantes entre as células da
granulosa e o oócitos. Em mamíferos, a dissociação progressiva das células do
cúmulus do oócito ocorre em resposta ao estímulo gonadotrófico durante o
período pré-ovulatório (Gilula et al., 1978). Aparentemente esta perda de contato é
importante para a finalização da maturação citoplasmática e preparação para a
fertilização Eppig & Downs (1987).
4.5.3.2 Maturação nuclear
A grande maioria dos trabalhos voltados ao estudo de agentes
estimulantes da função ovariana, concluem que os tratamentos hormonais visando
a superovulação leva a baixo número de embriões recuperados bem como um
aumento de estruturas inviáveis em conseqüência de distúrbios no mecanismo de
maturação oocitária (Monniax et al., 1983; Hyttel et al., 1991; Scoggin et al., 2002;
Carmo, 2003).
Em nosso experimento encontramos um elevado percentual de oócitos no
estágio de metáfase I, metáfase II e não definidos de 40% (11/27), 15% (04/27) e
44% (12/27) respectivamente. Estes valores são diferentes dos obtidos por Aguilar
et al. (2002) em éguas jovens (3 a 8 anos) não superovuladas, onde observaram
um percentual médio de oócitos recuperados do oviduto em MI de 19% (04/21),
MII 52,4% (11/21) e cuja maturação nuclear não pode ser definida (ND) de 28,4%
(06/21). Sendo também nossos resultados diferentes dos observados por Losinno
(2006) quando avaliou a maturação nuclear de oócitos do oviduto obtido de
folículos pós ovulados em 21 éguas jovens, onde o percentual foi de 19,0%;
52,3% e 28,7% respectivamente, para os estágios de MI e MII e de não definidos.
Aguilar et al. (2002) e Losinno (2006) relataram um maior número de
oócitos ND em éguas velhas (53,3 e 53,4) do que em éguas jovens (28,4 e 28,7).
Estes valores observados em éguas velhas são semelhante aos nossos achados
em éguas (jovens) superovuladas (44%), demonstrando haver um problema na
maturação oocitária, já que observamos também um maior percentual de oócitos
em MI (40%) do que em MII (15%). Na maioria dos mamíferos, a ovulação ocorre
Experimento IV 176
quando o oócito se encontra em MII e quando há formação do primeiro corpúsculo
polar (Baker, 1982), com algumas exceções como no caso de cães (Thibault,
1993). Vale destacar que utilizamos o mesmo laboratório e técnicas utilizadas por
Aguila et al. (2002) e Losinno (2006) para avaliação da microscopia confocal dos
oócitos.
Hamilton & Day em 1945, ao reportarem os primeiros estudos sobre o
estágio de maturação nuclear oocitária no oviduto de folículos pós ovulados em
eqüinos, relataram não observar corpúsculo polar e concluirão que a égua ovula
em Metáfase I (MI). Entretanto alguns anos depois este relato caiu em descrédito,
onde Niekerk (1966) observou a presença de corpúsculo polar descrevendo que a
éguas ovulam na maioria da vezes oócitos em estágio de Metáfase II (MII).
Posteriormente vários trabalhos demonstraram que 80% dos oócitos
aspirados de folículos pré-ovulatórios de éguas se encontram em prófase II da
meiose (Kirp et al., 1987; Palmer et al., 1991).
Hyttel et al. (1989 e 1991) relataram uma assincronia entre a maturação
citoplasmática e nuclear nos oócitos de vacas superovuladas, supondo ser este
distúrbio conseqüência da assincronia intrafolicular causada pelo variável e baixo
suporte sangüíneo entre os folículos superestimulados.
Carmo (2003) e Alvarenga et al. (2001) observaram grandes variações no
tamanho bem como no estágio de desenvolvimento entre embriões recuperados
de éguas superovuladas com EPE. Esta observação é um forte indicativo de que
esteja ocorrendo a ovulação de oócitos em diferentes estágios de maturação,
onde provavelmente os oócitos imaturos concluem a sua maturação no oviduto,
apresentando assim um atraso no seu desenvolvimento em relação aos demais.
Esta observação corroboram nossos achados, onde encontramos um elevado
percentual de oócitos em metáfase I, as quais provavelmente terminam a
maturação no oviduto após ocorrer a ovulação. O elevado percentual de estruturas
não definidas é um indicativo que muitos oócitos são ovulados degenerados ou se
degeneram durante o transito pelo oviduto.
Sabidamente em vacas quanto maior a resposta superovulatória pior a
qualidade dos embriões recuperados, da mesma forma uma resposta exacerbada
Experimento IV 177
ovariana reduz a proporção de folículos que ovularão. Provavelmente ambas as
observações sejam conseqüência de uma redução na resposta das células da
granulosa ao LH (Saumande & Chupin, 1986).
Um único trabalho foi encontrado na literatura onde se estudou através na
microscopia óptica a maturação nuclear de oócitos de éguas superovuladas
(Bézard et al., 1995). Neste trabalho as éguas foram tratadas com extrato de
pituitária eqüina contendo uma maior quantidade de FSH ao LH. Estes autores
não encontraram diferença entre éguas controle e tratadas com EPE no
percentual de oócitos que atingiram o estágio de metáfase II, tendo sido este
percentual de 87% e 81% para os grupos controle e tratado respectivamente.
Acreditamos que a maior taxa de recuperação de oócitos em metáfase II
observado neste experimento estejam relacionados a baixa resposta
superovulatória, onde estes autores obtiveram em média 2,3 ovulações por égua
tratada. Reforçando mais uma vez nossa hipótese de que quanto menor a
resposta ovariana à drogas que estimulem o crescimento de múltiplos folículos,
melhor será a maturação folicular e oocitária, com conseqüente melhoria nos
índices de recuperação de embriões.
Em função de não termos avaliado individualmente os oócitos por égua
aspirada, não nos foi possível comparar a maturação oocitária de acordo com a
resposta superovulatória.
Conclusões 179
5. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos neste estudo nos permite concluir que:
• A superovulação interfere no transporte oocitário em éguas com um número
maior de três ovulações, possivelmente pela dificuldade na migração do oócito
para o oviduto em decorrência da formação de grande coágulo de sangue na
fossa de ovulação.
• Há uma maior dificuldade na recuperação de oócitos de folículos aspirados em
éguas superovuladas devido a dificuldade na manipulação ovariana e/ou
imaturidade folicular e oocitária.
• Existe uma maior variação entre indivíduos nos níveis hormonais de estrogeno,
testosterona e inibina no fluido folicular de éguas superovuladas.
• O tratamento superovulatório interfere na maturação oocitária, tanto nuclear
como citoplasmática conforme indicado pelo baixo percentual de oócitos em
metáfase II, bem como pelas características ultra-estruturais observadas.
Considerações futuras 181
6. CONSIDERAÇÕES FUTURAS
Dentre os diferentes achados do presente trabalho o que mais nos
inquietou e diferiu de observações de estudos realizados em outras espécies, foi
a formação, nas primeiras 12 horas após ovulações, de um grande coágulo de
sangue na fossa de ovulação das éguas com melhor resposta superovulatória. O
entendimento dos fatores determinantes deste distúrbio é de suma importância
para que se determinem medidas para evita-lo ou mesmo minimiza-lo. Devendo
estes estudos, em nossa opinião, focar os fatores de coagulação intra-foliculares
e também a vascularização folicular.
Até que se defina a melhor estratégia de controle deste distúrbio estudos
voltados a determinação de protocolos que consistentemente induzam duplas e
triplas ovulações nos parece ser o melhor caminho a ser seguido de imediato, na
tentativa de recuperar um maior número de embriões de éguas doadoras ao longo
da estação reprodutiva.
A análise conjunta de todos os experimentos realizados demonstra
claramente que o tratamento com Extrato de Pituitária Eqüina visando
superestimulação ovariana levou a uma série de alterações nos mecanismos de
maturação folicular e oocitária, bem como na migração do óvulo para o oviduto.
Dentre estas foram mais expressivas as alterações no transporte de
oócitos para o oviduto, principalmente nas éguas que apresentaram mais de três
(3) ovulações. Observamos também nestas éguas com melhor resposta ovariana
um maior acúmulo de sangue na fossa de ovulação.
Permitindo-nos concluir que estas duas observações estão inter-
relacionadas, ou seja, o acúmulo de sangue coagulado provavelmente impede,
em um determinado momento, a migração de alguns oócitos para o oviduto.
Observamos que o ambiente folicular também sofreu alterações como
conseqüência do tratamento com EPE, tendo sido mais marcante a grande
variação na capacidade esteroidogênica entre indivíduos. Os oócitos também
mostraram alterações estruturais tanto na maturação citoplasmática como
nuclear.
A associação destes distúrbios certamente responde ou pelo menos melhor
elucida duvidas que existiam acerca das causas ou fatores determinantes da
Considerações futuras 182
baixa recuperação embrionária bem como da variação individual no que diz
respeito a produção de embriões quando da superovulação de éguas.
Referências bibliográficas 184
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Apêndice 215
Tabela 12: Resposta superovulatória e número de oócitos recuperados de folículos aspirados de éguas tratadas com extrato de pituitária eqüina.
TRATAMENTO SUPEROVULADO (ASPIRADO)
Éguas
16 (19) 29b 46 54 60 100 (233) 112 140 256b 387 Jady Colina
Dias de tratamento
7 6 7 8 6,5 6,5 7 7 8,5 7 9 6,5
Intervalo da administracao do
hCG á aspiração (h)
30 32 28 30 29 32 28 30 30 34 32 30
Numero, de
folículos no
início do trat.
05-10mm 4 5 3 3 5 6 5 6 4 3 4 3
11-15mm 4 3 3 4 3 6 6 4 4 5 4 6
16-20mm 3 5 5 5 5 5 6 3 4 2 4 6
21-25mm 1 0 1 2 0 4 5 3 0 2 1 5
Número de
fol.
≥
≥≥
≥
35mm
OE 1 2 3 5 4 4 7 3 3 1 2 6
OD 3 2 4 4 2 6 8 2 2 2 2 5
Diámetro do
fol. aspirado
(mm)
OE 42 2x42 2x40; 39
2X38;
2X40; 41
40;
2X42; 45
3X42; 44 3X38; 40;
3X43
40; 42;
54
2X38; 40
44 40; 44 2X40;
2X41;
43; 45
OD 40; 2x42 40; 42 2x38;
2x40
39; 2X40;
42
2X42 38; 2X42;
3X44;
38; 3X41;
2X42; 2X45
2X44 40; 42 2X40 2X44 3X38;
2X40;
Número de
Fol. aspirados
OE 1 2 1 3 2 2 6 2 1 1 1 5
OD 3 1 2 4 1 2 4 2 2 2 2 5
Número de
oócitos
recuperados
OE 1 1 1 1 1 2 0 0 0 0 1 0
OD 0 1 1 0 1 0 0 0 0 2 1 0
Classificação
das células da
granulosa (liq.
Fol.)
OE C E E E E C
38C; 3X41;
2X42; 2X45E
E C E C E
OD E C E F39;2x40-
C, 42E
E C E E C E E
2X38C;
1x38 E
2X40E
Classificação
das células do
cumulus e da
Corona radiata
do oócito
OE
2 3 3 3 3 2 - - - - 3 -
OD - 3 2 2 3 - - - - 2; 3 2 -
Classificação
morfológica e do
grau de
maturação
nuclear do
oócito
OE
MII GI Não
avaliado
MI GI Não
avaliado
Não
avaliado
Não
avaliado
- - - Não
avaliado
-
OD - Não
avaliado
Não
avaliado
Não
avaliado
- - - - MI /
MII
GI
Não
avaliado
-
1. Células do Cumulus Compacta + Corona Radiata Compacta (Imaturo), 2.Células do Cumulus Expandido + Corona Radiata Compacta(Início da maturação),
3. Células do Cumulus Expandida + Corona Radiata Expandida(maturo), E. Células da Granulosa Expandida, C. Células da Granulosa Compacta.
Apêndice 216
Tabela 13: Número de oócitos recuperados de folículos aspirados de éguas do grupo controle.
TRATAMENTO
CONTROLE (ASPIRADO)
Éguas
10 29 30 35
A
35B 46 54 58 101 212 263
Esmeralda
Dias de tratamento
11 10 10 11 12 10 9 9 10 9 11 10
Intervalo da administracao do hCG á
aspiração (h)
30 30 30 30 28 32 30 31 30 28 32 30
Numero, de
folículos no
início do trat.
05-10mm 3 5 2 5 5 3 5 6 8 6 4 9
11-15mm 4 4 5 5 4 5 3 6 7 4 4 5
16-20mm 4 3 3 5 4 2 6 5 6 5 5 4
21-25mm 0 1 3 0 2 2 3 1 1 3 1 0
Número de
fol.
≥
≥≥
≥
35mm
OE 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0
OD 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1
Diámetro do
fol. aspirado
(mm)
OE - - 42 40 - 39 38 39 - - 41 -
OD 39 41 - - 42 - - - 43 45 - 40
Número de
Fol. aspirados
OE 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 -
OD 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1
Número de
oócitos
recuperados
OE
0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0
OD 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1
Classificação
das células da
granulosa (liq.
Fol.)
OE
- - E E - - C C - - E C
OD C E E - E E - - E E - -
Classificação
das células do
cumulus e da
Corona radiata
do oócito
OE
- - 3 3 - - - - - - 3 -
OD - 3 - - 3 - - - 2 3 - 2
Classificação
morfológica e
do grau de
maturação
nuclear do
oócito
OE
- - Não
avaliado
MI GI - - - - - - Não
avaliado
-
OD - MII GII - - MI GI - - - Não
avaliado
MI GI - Não
avaliado
2. Células do Cumulus Compacta + Corona Radiata Compacta (Imaturo), 2.Células do Cumulus Expandido + Corona Radiata Compacta(Início da maturação),
3. Células do Cumulus Expandida + Corona Radiata Expandida(maturo), E. Células da Granulosa Expandida, C. Células da Granulosa Compacta.
Apêndice 217
Tabela 14: Resposta superovulatória e número de oócitos recuperados do oviduto de éguas tratadas com extrato de pituitária eqüina.
TRATAMENTO SUPEROVULAÇÃO (OÓCITOS RECUPERADOS DO OVIDUTO)
ÉGUAS
08 11 12 13 15 05 311 307 309 312 314 318 319
Dias de tratamento
9 5 5 10 8 6 7,5 9 7 9,5 6,5 9,5 6
Intervalo do início do tratamento á 1
ovulacao (dias)
9 7 5,5 10,5 8,5 8 9 10,5 9 10,5 7 11 8
Intervalo da administracao do hCG á 1
ovulacao (h)
36 48 n.hCG n.hCG n.hCG 24 24 Nao hCG
36 36 -12 24 36
Intervalo da 1 ovulacao a ultima (h)
12 0 0 0 0 12 12 0 0 0 24 12 12
Intervalo da 1 ovulacao ao sacrificio(h)
18 8 10 12 12 17 18 8 6 10 24 12 10
Numero, de
folículos no início
do trat.
05-10mm 1 2 2 6 0 5 2 8 5 6 9 6 6
11-15mm 5 0 4 0 5 2 2 3 4 4 7 2 2
16-20mm 1 1 0 0 0 0 2 0 4 0 0 0 0
21-25mm 0 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 0
Número de
fol.
≥
≥≥
≥
35mm
OE 2 1 0 0 0 3 2 2 5 4 2 4 7
OD 4 0 0 0 0 4 2 2 4 2 5 4 4
Diámetro do fol.
Ovulado (mm)
OE 2F35 40 28 33 - 41,42 35,35 36,36 35;2x36;
2x37
39,38,
35
35,32 3 x 40 3x45,3
x42,35
OD 3F33,3
6
- 25 33 32,30 2F40, 2F42
37 35,35 2x35;
2x38
35 35, 37 2x42,
40,38
2x38,4
0,42
Número de
ovulacoes
OE 2 0 1 1 0 3 2 2 4 3 2 4 7
OD 4 1 1 1 2 3 1 2 5 1 2 4 4
Número de oócitos
viáveis
recuperados do
ovid.
Oviduto esquerdo 2 0 1 1 0 0 2 2 2 3 2 1 7
Oviduto Direito 2 1 1 1 1 1 1 0 2 1 0 4 2
Número de oócitos
degenerados
recuperados do
ovid.
Oviduto esquerdo - - - - - - 0 0 2 1 0 0 3
Oviduto Direito - 1 - 2 - - 0 0 2 0 0 0 0
Número de
folículos nao
ovulados
≥
≥≥
≥
30mm
OE - 1 - - - 3 0 0 1 1 0 0 0
OD - - - - - 1 0 0 0 0
3 (1 fol.
Normal, 2
fol. Hemor.)
0 0
Número de oócitos recuperados de
folículos nao ovulados.
≥
≥≥
≥
30mm
- 1 - - - 2 0 0 0 0 0 0
1.Células do Cumulus Compacta + Corona Radiata Compacta (Imaturo), 2.Células do Cumulus Expandido + Corona Radiata Compacta(Início da maturação)
Células do Cumulus Expandida + Corona Radiata Expandida(maturo), E. Células da Granulosa Expandida, C. Células da Granulosa Compacta.
Apêndice 218
Tabela 15: Número de oócitos recuperados do oviduto de éguas tratadas com solução fisiológica (controle)
TRATAMENTO CONTROLE (OÓCITOS RECUPERADOS DO OVIDUTO)
ÉGUAS
01 02 03 07 10 14 313 315 320
Dias de tratamento
15 11 5 14 8 4 11 10 11
Intervalo do início do tratamento á 1
ovulacao (dias)
17 12,5 7 15 9 6 13 11,5 13
Intervalo da administracao do hCG á
1 ovulacao (h)
38 36 36 n.hCG n.hCG 48 48 36 48
Intervalo da 1 ovulacao a ultima (h)
0 0 0 0 0 0 0 0 0
Intervalo da 1 ovulacao ao
sacrificio(h)
6 7 8 12 12 8 6 6 7
Numero, de
folículos no
início do trat.
05-10mm 4 6 6 3 6 3 4 2 3
11-15mm 1 2 0 1 0 0 1 2 2
16-20mm 1 1 0 0 0 0 0 2 0
21-25mm 0 0 1 1 0 1 1 0 1
Número de
fol.
≥
≥≥
≥
35mm
OE 2 0 1 1 1 0 1 0 0
OD 0 1 0 0 0 1 0 2 1
Diámetro do
fol. Ovulado
(mm)
OE 37; 38 - 41 50 42 - 42 - -
OD - 42 - - - 40 - 38; 42 44
Número de
ovulacoes
OE 2 0 1 1 1 0 1 1 0
OD 0 1 0 0 0 1 0 1 1
Número de
oócitos viáveis
recuperados do
ovid.
Oviduto esquerdo 2 0 0 1 1 0 1 1 0
Oviduto Direito 0 1 0 0 0 1 0 1 1
Número de
oócitos
degenerados
recuperados do
ovid.
Oviduto esquerdo 0 0 0 0 0 0 1 0 0
Oviduto Direito 0 0 0 1 0 0 0 0 1
Número de
folículos nao
ovulados
≥
≥≥
≥
30mm
OE 0 0 0 0 0 0 0 0 0
OD 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Número de oócitos recuperados de
folículos nao ovulados.
≥
≥≥
≥
30mm
0 0 0 0 0 0 0 0 0
1.Células do Cumulus Compacta + Corona Radiata Compacta (Imaturo), 2.Células do Cumulus Expandido + Corona Radiata Compacta(Início da maturação)
3. Células do Cumulus Expandida + Corona Radiata Expandida(maturo), E. Células da Granulosa Expandida, C. Células da Granulosa Compacta.
Apêndice 219
Tabela 16: Densidade óptica integrada (IOD) das bandas encontradas nos diferentes folículos das éguas do Grupo Superovulado.
BANDAS (kDa)
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30
ÉGUA FOL 352,8 327,8 294,7 255,0 232,6 159,3 129,2 117,0 102,1 100,4 93,2 74,2 69,5 69,0 55,1 56,0 47,0 40,3 38,0 34,7 32,9 31,2 28,1 26,7 24,1 22,3 20,2 17,6 15,7 14,9
16 1 — 20,4 23,3 — 37,7 44,9 45,2 45,0 36,2 — 90,6 82,9 88,4 — 606,1 — 330,6 78,9 83,9 62,4 59,7 — — 309,2 65,7 — — — — 68,5
16 2 — 13,9 19,0 — 27,0 — 48,3 32,3 33,8 — 92,9 61,8 86,8 — 567,2 — 286,6 81,4 54,1 66,7 52,6 — — 217,1 65,6 — — — — 55,6
16 3 — 20,3 15,9 — 25,8 — 60,0 30,4 44,3 — 98,6 63,6 77,7 — 660,7 — 288,0 68,7 79,0 49,1 65,8 — — 304,3 87,6 — — — — 68,1
16 4 — 13,4 12,2 — 15,8 — 37,6 51,3 24,8 — 94,9 44,2 56,7 — 555,9 — 263,6 49,5 87,6 61,4 52,6 — — 270,7 68,1 — — — — 57,9
60 1 — 19,0 18,4 — 26,1 33,5 58,8 60,5 39,5 — 70,9 109,0 — — 756,5 — 192,6 65,6 67,2 65,0 82,4 — — 318,7 101,9 — — — — 66,4
256 B 1 — 20,3 24,0 — 35,3 — 60,0 49,7 38,4 — 105,8 106,8 — — 785,1 — 246,9 66,2 101,4 67,3 59,5 — — 311,0 111,4 — — — — 74,0
256 B 2 — 30,4 35,0 — 39,5 — 77,7 82,6 56,6 — 94,4 150,0 — — 912,4 — 250,2 101,0 70,2 67,9 91,9 — — 324,6 116,0 — — — — 84,1
256 B 3 — 27,6 33,0 — 49,8 — 76,3 59,8 62,5 — 114,5 121,9 — — 876,8 — 247,6 66,0 101,6 74,1 142,7 — — 382,2 109,6 — — — — 85,3
46A 1 — — — — — — 70,6 61,5 51,3 — 101,3 137,2 — — 632,6 — 334,8 147,0 99,9 89,2 247,2 — — 419,3 98,4 106,0 — — — 178,1
46A 2 — — — — 52,6 39,9 48,8 — 40,6 — 38,1 138,6 83,2 — 706,8 — 319,3 63,0 112,7 56,8 166,7 71,6 69,7 130,8 62,3 62,5 38,0 37,5 30,6 80,3
46A 3 — — — — 47,3 43,2 41,1 — 31,8 — 38,2 174,3 26,7 — 428,4 — 300,6 95,3 110,2 65,2 340,5 101,4 142,0 294,3 70,8 64,0 — 58,9 61,6 120,1
JADE 1 — — — 31,3 25,0 46,5 36,8 — 43,4 — 60,9 114,8 31,6 — 658,9 — 338,8 88,4 122,5 67,6 170,1 0,0 104,1 178,4 104,4 75,0 — 58,1 44,0 90,9
JADE 2 — — 28,5 — 73,3 51,3 78,8 — 95,6 — 72,4 117,5 125,0 — 783,0 — 413,5 171,2 98,9 198,3 133,1 150,7 234,1 117,3 37,6 62,2 63,3 56,1 62,7 —
JADE 3 35,4 36,2 — — 68,9 63,7 65,0 47,3 65,9 — 71,1 105,7 147,3 — 838,1 — 340,5 106,3 81,5 118,6 108,8 112,3 134,3 170,9 151,5 — — — — 55,9
387 1 — 41,1 — — 58,1 43,7 60,6 37,6 92,6 — 38,9 192,2 97,8 — 669,9 231,6 289,5 110,7 65,5 102,2 161,5 — — 467,1 162,6 — — — — 65,0
387 2 23,6 36,0 35,8 — 50,7 53,6 77,9 47,6 84,9 — 42,6 156,6 105,2 — 869,8 — 342,5 80,5 103,7 96,1 120,4 — — 465,7 149,0 — — — — 66,0
387 3 27,7 31,6 — — 62,6 45,0 39,6 50,2 46,7 — 45,8 171,9 91,7 — 836,0 — 341,2 90,2 112,0 95,9 115,5 — — 494,1 151,0 — — — — 76,1
140 1 — 25,9 34,1 — 46,8 67,3 47,8 48,2 72,9 — 53,1 150,3 47,7 107,9 682,4 — 314,6 100,9 76,9 104,2 117,3 75,6 107,1 346,5 122,8 — — — — 69,1
140 2 11,3 — 20,0 — 54,8 42,8 54,5 — 45,1 — 28,1 130,8 79,8 — 499,9 — 211,0 63,8 43,1 45,7 44,1 — — 332,2 105,8 — 14,8 — — 39,5
140 3 18,0 — 27,3 — 58,6 53,3 74,6 — 46,4 — 52,7 91,1 134,3 — 627,6 — 261,7 62,7 63,1 60,2 68,6 — — 438,2 125,3 — 35,3 — — 80,9
140 4 23,2 — 30,1 — 66,9 63,3 69,8 — 77,5 — 58,3 221,2 70,0 — 738,1 — 231,1 68,0 79,5 56,0 63,6 — — 455,1 93,0 — 53,5 — — 63,5
112 1 17,9 — 27,0 — 36,4 39,6 75,3 — 49,2 29,0 27,7 173,8 — — 666,4 — 198,0 60,3 66,0 39,9 59,0 — — 368,9 119,1 — 35,1 — — 48,0
112 2 28,3 — 36,7 — 65,3 58,5 88,9 — 51,3 40,3 39,1 217,3 — — 780,8 — 225,4 71,8 84,4 60,7 75,1 — — 440,3 121,8 — 67,3 32,3 — 56,4
112 3 24,5 — 24,5 — 59,2 48,0 87,6 — 29,5 42,6 30,4 193,3 — — 705,0 — 221,2 73,1 77,5 59,7 86,8 — — 392,3 105,0 — 83,3 — — 52,2
112 4 21,8 — 35,8 — 72,3 65,1 79,7 — 24,1 39,6 33,2 251,3 119,2 — 581,6 — 238,1 63,4 88,6 66,9 67,0 — — 381,3 89,8 — 96,5 — — 67,7
54 1 30,2 — 30,6 — 80,3 72,5 99,8 — 47,1 29,4 63,5 168,1 170,3 — 613,3 — 216,6 56,7 86,0 76,6 93,5 — — 373,9 122,3 — 124,9 — — 77,9
54 2 29,1 — 38,2 — 73,3 59,8 77,5 — 54,2 51,8 51,2 198,3 153,6 — 556,4 — 233,0 62,5 73,3 73,5 94,5 — — 388,6 88,5 — 109,8 — — 76,8
54 3 — — 25,4 — 60,9 59,1 27,5 36,7 81,8 — 38,7 182,6 146,5 — 571,6 — 209,5 58,8 74,0 49,4 56,7 75,7 84,9 236,2 85,3 47,1 21,8 7,4 — 54,0
54 4 — — 25,5 — 69,4 43,5 39,4 27,8 51,3 — 33,6 183,8 132,8 — 580,1 — 220,1 62,7 74,3 46,9 66,1 52,1 96,4 292,1 77,4 43,1 30,0 25,0 — 49,3
COLINA 1 — — 38,1 35,9 46,1 63,1 52,6 42,0 56,5 — 61,5 288,5 — — 1088,3 — 313,2 30,7 57,8 63,8 70,9 97,3 231,5 — 136,0 — 41,5 23,3 — 44,0
COLINA 2 — — 66,8 38,4 58,8 60,2 95,5 65,4 78,0 — 67,5 245,6 — — 1357,4 — 394,7 60,5 91,4 83,1 86,9 154,1 350,1 — 138,5 — 69,8 35,6 — 54,5
COLINA 3 — — 68,6 47,1 54,8 86,6 91,7 110,8 49,7 — 35,1 182,0 — — 1394,4 — 389,8 59,0 100,9 87,1 77,1 162,4 375,4 — 161,3 — 81,0 52,4 — 61,5
COLINA 4 — — 47,0 32,5 64,3 61,7 56,0 68,6 49,9 — 43,5 203,3 — — 1095,9 — 320,9 64,5 75,3 78,9 91,0 162,5 262,2 — 136,2 — 80,1 53,7 — 52,7
100 1 — — 34,6 — 87,4 53,4 — 82,8 54,4 — 34,5 211,0 81,5 — 948,4 — 337,4 58,9 55,8 60,0 36,1 58,3 432,3 — 141,6 — 30,3 — — 38,2
100 2 — — 31,1 — 42,6 42,4 — 87,1 62,2 — 33,5 223,9 101,1 — 945,9 — 248,8 49,3 58,1 34,6 28,5 48,9 340,8 — 97,3 — 23,5 — — 34,2
29B 1 — — 46,5 — 56,2 56,0 — 100,5 100,5 — 42,2 221,3 81,4 — 1048,7 — 313,0 57,7 75,0 40,3 40,1 71,8 383,5 — 133,2 — 22,6 — — 32,7
29B 2 — — 45,5 — 48,7 46,0 — 116,3 52,9 — 49,3 234,8 120,9 — 989,1 — 305,8 60,1 73,4 50,9 24,0 64,1 386,2 — 166,9 — 30,6 — — 31,5
29B 3 — — 52,4 — 51,2 41,9 — 96,1 30,0 — 30,5 201,8 84,1 — 936,3 — 370,7 60,6 75,5 39,7 35,4 57,8 384,1 — 138,3 — 48,7 — — 39,4
Apêndice 220
Tabela 17: Densidade óptica integrada (IOD) das bandas encontradas no folículo das éguas do Grupo Controle
.
BANDAS (kDa)
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30
ÉGUA FOL 352,8 327,8 294,7 255,0 232,6 159,3 129,2 117,0 102,1 100,4 93,2 74,2 69,5 69,0 55,1 56,0 47,0 40,3 38,0 34,7 32,9 31,2 28,1 26,7 24,1 22,3 20,2 17,6 15,7 14,9
46B 1 — — 25,5 — 43,0 35,1 27,9 32,2 60,2 — 23,3 150,9 136,8 — 501,1 — 199,2 52,3 63,2 50,9 46,0 38,5 88,4 255,6 58,1 37,3 25,2 26,5 — 64,4
263 1 — — 34,9 — 71,4 53,5 44,8 39,4 65,0 — 33,0 167,5 107,1 — 620,0 — 211,5 66,4 66,7 56,8 64,0 59,2 146,7 252,0 80,8 41,3 31,9 32,1 — 55,5
212 1 — — 25,3 — 55,6 41,7 30,7 34,0 64,8 — 30,0 157,0 117,6 — 515,7 — 200,3 56,0 61,8 52,4 55,9 — 174,3 230,4 87,8 56,7 — — — 44,3
ESMERALDA 1 — — 36,8 — 62,6 57,8 50,7 44,1 64,2 — 68,1 209,9 128,4 — 606,1 — 220,0 64,5 81,2 59,0 71,0 78,9 104,6 275,0 101,0 56,1 38,0 41,7 — 58,8
29 1 — — 46,2 — 76,3 61,9 53,4 47,9 97,6 — 40,0 216,2 172,0 — 587,6 — 184,2 73,6 67,5 50,6 84,7 76,8 107,8 284,6 104,0 70,2 45,6 46,3 — 62,4
35A 1 — — 63,4 — 82,9 65,0 45,6 50,2 59,5 — 65,5 227,4 116,6 — 675,0 — 230,3 75,2 75,4 63,0 82,5 75,6 134,5 277,4 115,5 73,8 54,1 56,8 — 64,2
30 1 — — 51,9 — 95,4 66,5 54,3 44,8 100,0 — 46,0 241,1 164,3 — 634,9 — 229,8 60,4 85,2 55,5 76,4 123,8 148,1 238,9 119,3 77,2 62,2 65,8 — 61,7
10 1 — — 59,4 38,1 61,3 86,5 66,9 47,5 51,2 — 45,0 319,5 — — 1222,4 — 330,2 64,1 106,3 77,1 97,1 121,9 274,5 — 157,8 — 71,6 36,8 — 57,5
58 1 — — 27,0 21,7 45,5 49,6 52,5 31,5 91,4 — 39,6 251,7 — — 1089,4 — 280,3 56,7 68,9 50,9 58,0 87,0 234,2 — 103,2 — 33,8 15,7 — 42,7
54 1 — — 41,5 34,9 58,8 56,8 54,6 40,2 69,8 — 27,5 280,9 — — 1103,5 — 306,3 71,5 49,1 53,4 66,8 97,6 237,5 — 106,1 — 25,7 18,5 — 35,9
35B 1 — — 29,0 31,4 36,0 43,6 47,9 51,6 71,6 — 29,2 213,1 — — 1018,8 — 291,3 62,6 60,2 47,8 60,9 124,1 259,7 — 91,3 — 24,3 15,2 — 35,5
101 1 — — 35,5 21,3 47,1 46,2 47,5 37,2 65,1 — 37,1 236,9 — — 1044,6 — 315,0 59,3 60,6 53,0 68,5 108,4 249,7 — 96,2 — 34,2 23,6 — 35,6
Apêndice 221
P 1 2 3 4 5 6 7
8 9
10 P 11 12 13 14 15 16 17 18
19 20 P 21 22 23 24 25 26 27
Apêndice 222
Figura 33: Eletroforese em poliacrilamida (SDS-PAGE) à 13% de concentração no gel separador, em sistema
descontínuo alcalino de proteínas do liquido folicular de éguas superovulada e controle. Canaleta P, Marcador de
Peso Molecular (Full molecular weight range, 10 a 250 kDa, Amersham Biosciences).
28 29 30 P 31 32 33 34 35 36
46 P
47 48 49 50
P 37 38 39 40 41 42 43 44 45
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