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GILBERTO CARLOS TIANO
Estudo da expressão de MMP
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Estudo da expressão de MMP-
--
-2
22
2
e MMP
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--
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fibroblastos gengivais de camundongos
fibroblastos gengivais de camundongos fibroblastos gengivais de camundongos
fibroblastos gengivais de camundongos
estimulados por
estimulados por estimulados por
estimulados por NaF
NaFNaF
NaF
via NF
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--
-κ
κκ
κB, p44/42, p38 e PI3K
B, p44/42, p38 e PI3KB, p44/42, p38 e PI3K
B, p44/42, p38 e PI3K
Dissertação apresentada à Faculdade
de Odontologia, Campus de
Araçatuba, Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,
como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Mestre em
Odontopediatria.
Orientadora: Profa. Dra. Sandra Helena Penha de Oliveira
Araçatuba
2007
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Dedicatória
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Dedico este trabalho:
À minha MARAVILHOSA esposa, Ana Valéria,
quem eu amo muito, pelo incentivo nos momentos mais difíceis
que passei, pela valiosa ajuda em várias situações e pela
paciência que teve comigo em muitas ocasiões. O meu maior
desafio foi abdicar de nossa convivência diária, quando cada
minuto de ausência parecia uma eternidade.
Aos meus pais, Gilberto e Ana, exemplos do
que é um alicerce dentro da família, que tudo fizeram nesta vida
para que nunca não nos faltasse nada, com muito amor, respeito
e dignidade.
Agradecimentos
especiais
Agradeço especialmente,
À Deus, por estar presente em todos os momentos de minha
vida, ainda que às vezes tenha questionado algumas de Suas
escolhas. Hoje não tenho dúvidas que me guiou pelo melhor
caminho, me concedendo a benção de ser feliz.
À minha orientadora, Profª. Drª. Sandra Helena Penha de
Oliveira, pela confiança em mim depositada, pela eficiência,
firmeza, profissionalismo com que me conduziu na realização
deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Alberto Carlos Botazzo Delbem, responsável pelo
meu início na Odontopediatria, exemplo incontestável de
professor, orientador, pessoa iluminada, inteligente, sempre
pronto a ajudar a quem o procura, além é claro de ser um grande
amigo.
Aos meus irmãos, Marcos, Priscila e Leonardo, pelo apoio
constante, pelo carinho e incentivo.
Aos meus avôs José, Ana e Rosa por torcerem e acreditar em
mim.
À minha segunda família, Jorge
Jorge Jorge
Jorge e Ana
AnaAna
Ana
Neri
NeriNeri
Neri; Gerônimo e I
; Gerônimo e I; Gerônimo e I
; Gerônimo e Iara
araara
ara
pelo incentivo, força e orações pelo meu sucesso.
À Lourdes Prando, por quem eu tenho muito carinho e
respeito, pelos bons momentos compartilhados, apoio e incentivo
durante a realização deste trabalho.
Agradecimentos
Meus agradecimentos,
Ao Prof. Dr. Pedro Felicio Estrada Bernabé e à Profa. Dra. Ana
Maria Pires Soubhia, Diretor e Vice-diretora da Faculdade de
Odontologia da Universidade Estadual Paulista - UNESP, Campus
de Araçatuba.
Aos docentes da Disciplina de Odontopediatria da Faculdade
de Odontologia de Araçatuba – UNESP, Prof. Dr. Alberto Carlos
Botazzo Delbem, Prof. Dr. Célio Percinoto, Prof Dr. Robson
Frederico Cunha, Profa Dra. Sandra M. H. C. Ávila de Aguiar e
Profa Dra. Rosângela dos Santos Nery.
Aos professores e funcionários do Departamento de Ciências
Básicas da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP, pela
amizade e companheirismo durante a realização deste trabalho.
Aos funcionários da Biblioteca da UNESP – Araçatuba, pela
paciência e disposição.
À Marina, Valéria e Diogo da Seção de Pós-graduação da
Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP pela atenção e
paciência.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP) pelo apoio financeiro concedido durante a realização
deste trabalho (processo n
o
06/54098-8).
Ao Prof. Dr. Fernando de Queiroz Cunha, chefe do laboratório
de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP
por permitir a utilização do laboratório para realização dos
ensaios ELISA.
Aos funcionários da Disciplina de Odontopediatria, Maria dos
Santos Ferreira Fernandes, Mário Luís da Silva, Maria Bertolina
Mesquita de Oliveira e Cleide da Silva Oliveira, por estarem sempre
dispostos a ajudar.
Aos meus colegas da turma de Mestrado, Carolina, Adriana,
Vanessa e Renata, pela convivência e troca de experiências.
A todos os colegas do curso de Pós-graduação em
Odontopediatria pela convivência amiga e momentos de
descontração.
A todos, que de alguma forma participaram na realização
deste trabalho...
... meu muito obrigado.
Epígrafe
“Se queremos progredir, não
“Se queremos progredir, não “Se queremos progredir, não
“Se queremos progredir, não
devemos repetir a história, mas
devemos repetir a história, mas devemos repetir a história, mas
devemos repetir a história, mas
fazer uma nova história”
fazer uma nova história”fazer uma nova história”
fazer uma nova história”
Gandhi
GandhiGandhi
Gandhi
Tiano GC. Estudo da expressão de MMP-2 e MMP-9 por fibroblastos gengivais
de camundongos estimulados por NaF via NF-κB, p44/42, p38 e PI3K
[Dissertação]. Araçatuba: Unesp – Universidade Estadual Paulista; 2007.
RESUMO
O declínio mundial da cárie dentária é atribuído ao uso abrangente do flúor.
Embora esse elemento seja capaz de proteger os dentes, seu uso excessivo
pode levar a uma ação citotóxica causando a inibição do crescimento
celular, da síntese de proteínas e até mesmo a morte celular. O primeiro
objetivo deste estudo foi investigar a concentração ideal do NaF (NaF)
capaz de ativar os fibroblastos gengivais de camundongos sem induzir morte
celular. Observou-se que, nesses fibroblastos, a concentração de 40 µg F/mL
induziu morte celular de 62,6 %. Na concentração de 20 µg F/mL a morte
celular foi de apenas
22,1%. Com base nesses resultados, optou-se por utilizar
a concentração de 20 µg F/mL como dose máxima para investigar os
mecanismos envolvidos na ativação dos fibroblastos gengivais. Dessa forma,
avaliou-se a capacidade do NaF induzir a expressão de MMP-2 e MMP-9
pelos fibroblastos gengivais de camundongos na presença ou ausência de
LPS, assim como a produção da quimiocina CCL-3/MIP-1α e óxido nítrico.
Avaliou-se também a participação das vias de sinalização intracelular
p44/42, p38, PI3K e NF-кB envolvidas durante essa ativação, por meio da
utilização dos respectivos inibidores PD98059 (50 µM), SB202190 (10 µM),
LY294002 (30 µM) e dexametasona (10 µM). Observou-se que o NaF foi capaz
de estimular os fibroblastos gengivais a expressarem MMP-9, mas não MMP-2,
na concentração de 20 µg F/mL com pico máximo 6 horas após, retornando
aos níveis normais 24 horas após. A produção da quimiocina CCL3/MIP-1α
pelos fibroblastos estimulados pelo NaF também foi observada com a
concentração de 20 µg F/mL com pico máximo 6 horas após estímulo. Na
presença de LPS, observou-se uma potenciação da expressão de MMP-9 e
produção de CCL3/MIP-1α na concentração de 20 µg F/mL, 6 horas após. O
pré-tratamento com o inibidor PD98053 (p44/42) e com a dexametasona
(NF-кB) foi capaz de inibir a expressão de MMP-9 pelos fibroblastos gengivais
estimulados por NaF na presença e ausência de LPS. A produção de CCL3/
MIP-1α foi inibida nos fibroblastos gengivais tratados com os inibidores
PD98059 (p44/42), SB 202190 (p38), LY294002 (PI3K) e Dexametasona (NF-кB).
Em conclusão, o NaF foi capaz de promover tanto a expressão de MMP-9
como a produção de CCL3/MIP-1α pelos fibroblastos gengivais, sendo que a
ativação dessa metaloproteinase ocorreu via p44/42 e NF-кB. A produção de
CCL-3/MIP-1α foi ativada pelas vias p44/42, p38, PI3K e NF-кB.
Palavras-chave: NaF. Matriz Metaloproteinase. Quimiocinas.
Tiano GC. Study of the expression of MMP-2 and MMP-9 by gingival fibroblasts
of mice stimulated by sodium fluoride through NF-κB, p44/42, p38 and PI3K
[Dissertation]. Araçatuba: Unesp – São Paulo State University; 2007.
ABSTRACT
The worldwide decline of the dental caries is attributed to the widespread use
of fluoride. Although this element is capable of protecting the teeth, its
excessive use, can lead to a cytotoxic action, causing an inhibition of the cell
growth, of the protein synthesis and even the cellular death. Based on these
results, we have chosen to use a concentration of 20 µ g F/mL as maximum
concentration to investigate the mechanisms involved in the activation of the
gingival fibroblasts. It was observed that, on those fibroblasts, the
concentration of 40 µg F/mL has resulted in a death cellular index of 62.6%. In
the concentration of 20 µg F/mL the cellular death was of 22.1% only. Based
on these results, the concentration of 20 µg F/mL has been chosen as
maximum concentration to investigate the mechanisms involved in the
activation of the gingival fibroblasts. Later, the ability of NaF to induce the
expression of MMP-2 and MMP-9 in gingival fibroblasts of mice in the presence
or absence of LPS has been assessed, as well as the production of chemokine
CCL-3/MIP-1a and nitric oxide. It also evaluated the participation of
intracellular signaling pathways p44/42, p38, PI3K e NF-kB involved in this
activation, through inhibitors PD98059 (50 µM), SB202190 (10 µM), LY294002 (30
µM) e dexamethasone (10 µM). It was observed that the NaF was capable to
stimulate the gingival fibroblasts to express MMP-9, at the concentration of 20
µgF/mL with maximum peak 6 hours after, returning to normal levels 24 hours
after. The expression of MMP-2 was not observed. The production of
chemokine CCL3/MIP-1α was also observed with the concentration of 20
µgF/mL with maximum peak 6 hours after the stimulation. In the presence of
LPS, it was observed an intensification in the expression of MMP-9 and also in
the production of CCL3/MIP-1α at the concentration of 20 µgF/mL, 6 hours
later. The pre-treatment with the PD98053 inhibitor (p44/42) and with
dexamethasone (NF-кB) was capable to inhibit the expression of MMP-9 in
gingival fibroblasts stimulated by NaF in the presence and absence of LPS.
The production of CCL3/MIP-1α has been inhibited in fibroblasts treated with
the inhibitor PD98059 (p44/42), SB202190 (p38), LY294002 (PI3K) and
Dexamethasone (NF-kB). In conclusion, the NaF was able to promote the
expression of MMP-9 and also the production of CCL3/MIP-1α in gingival
fibroblasts and the activation of this metaloproteinase have been occurred
by means of p44/42 and NF-кB. The production of CCL-3/MIP-1α has been
activated through p44/42, p38, PI3K and NF-кB.
Key-words: Sodium fluoride. Matrix metalloproteinase. Chemokines.
Lista de Figuras
Figura 1 Efeito citotóxico do NaF nos fibroblastos gengivais
estimulados nas concentrações de 1, 5, 10, 20 e 40 µg
F/mL e grupo controle (C), estimulados 6, 24 e 48 horas.
47
Figuras 2A, B
e C
Expressão de RNAm para MMP-2 e MMP-9 em
fibroblastos gengivais estimulados pelo NaF nas
concentrações 1, 5, 10 e 20 µg F/mL e grupo controle.
49
Figura 3A, B
E C
Expressão de RNAm para CCL3/MIP-1α em fibroblastos
gengivais estimulados por NaF nas concentrações 1, 5, 10
e 20 µg F/mL e grupo controle.
51
Figuras 4 Produção de CCL3/MIP-1α nos sobrenadantes de
fibroblastos gengivais estimulados por NaF nas
concentrações de 1, 5, 10 e 20 µg F/mL e grupo controle
(c) após 1, 6 e 24 horas de estimulo.
53
Figura 5 Expressão de RNAm para MMP-2 e MMP-9 em fibroblastos
gengivais estimulados por 6 horas com NaF (20 µg F/mL) na
presença ou ausência de LPS (10 µg/mL).
55
Figura 6 Expressão de RNAm para CCL3/MIP-1α pelos fibroblastos
gengivais estimulados por NaF (20 µg/mL) na presença ou
ausência de LPS (10 µg/mL) no tempo de 6 horas.
57
Figura 7
Produção de CCL3/MIP-1α nos sobrenadantes de
fibroblastos gengivais estimulados por NaF (20 µg/mL) na
ausência ou presença de LPS (10 µg/mL) no tempo de 6
horas.
59
Figura 8 Expressão de RNAm para MMP-9 de fibroblastos
gengivais pré-tratados com inibidores e estimulados por
6 horas com NaF (20 µg F/ml) na presença ou ausência
de LPS (10 µg/ml).
61
Figura 9
Expressão de RNAm para CCL3/MIP-1α de fibroblastos
gengivais pré-tratados com inibidores e estimulados por 6
horas com NaF (20 µg F/ml) na presença ou ausência de
LPS (10 µg/ml).
63
Figura 10 Produção de CCL3/MIP-1α nos sobrenadantes de
fibroblastos gengivais pré-tratados com os inibidores e
estimulados por 6 horas com NaF (20 µg F/mL) na
presença ou ausência de LPS (10 µg/ml).
65
Lista de Tabelas
Tabela 1 Primers utilizados na PCR para os diferentes alvos e
tamanhos antecipados dos produtos de amplificação
40
Tabela 2 Pré-tratamento com diferentes inibidores
42
LISTA DE ABREVIATURAS
% = Por cento
® = Marca comercial registrada
CO
2 =
Gás carbônico
cDNA = Ácido desoxirribonucléico cromossomal
DMEM = “Dulbecco´s Modified Eagle´s Médium – Meio de Eagle modificado
por Dulbecco
ELISA = Ensaio imuno-enzimático
et al = e colaboradores
H
2
O = Água
IL = Interleucina
LPS = Lipopolissacarídeo
MAPK = Proteína quinase ativadora de mitógeno
mg = Miligramas
MIP-1α = Proteína inflamatória para macrófago
MMP = Metaloproteinase
mL = Mililitros
mM = Milimolar
MTT = 2,5- difenil brometo de tetrazolium
NaF = NaF
nm= Nanômetro
NO = Óxido nítrico
NOS = Óxido nítrico sintase
pb = Pares de base
PBS = Tampão fosfato-salina
pg/mL = Picogramas por mililitros
RNA = Ácido ribonucléico
RT-PCR = Transcriptase reversa seguida de reação em cadeia da polimerase
TGF-β = Fator de crescimento transformador
µg/mL = Microgramas por mililitros
µM = Micromolar
µg F/mL = microgramas de flúor por mililitros
SUMÁRIO
1 Introdução 22
2 Proposição 31
3 Material e Método 33
3.1 Animais 33
3.2 Procedimento Experimental 33
3.3 Análise estatística 45
4 Resultado 44
5 Discussão 67
6 Conclusão 79
7 Referências 81
Anexos 88
Introdução
22
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
1 INTRODUÇÃO
A Odontologia passou por grandes mudanças conceituais no século
XX, entre elas, o entendimento da cárie dentária como doença, com
alternativas para prevenção, controle e tratamento, principalmente por
meio da utilização de flúor (ADAIR, 1999), que é capaz de reduzir a
progressão das lesões cariosas (CURY, 2001).
O efeito cariostático primário do flúor se dá por sua presença na
cavidade bucal em contato direto com os dentes já irrompidos, inibindo a
desmineralização e favorecendo a remineralização do complexo esmalte-
dentina, por meio da exposição tópica freqüente e em baixas
concentrações. Porém, a ingestão excessiva durante o período de
formação do esmalte dentário pode provocar uma alteração denominada
fluorose dentária. (PAIVA, 1991; LEVY, 1994; FEJERSKOV et al., 1996).
O uso excessivo de flúor também pode provocar efeitos tóxicos nas
células como a inibição do crescimento celular e da síntese de proteínas.
Essa atividade citotóxica pode ocorrer em diferentes tipos celulares, no
entanto, o exato mecanismo ainda não foi completamente elucidado
(HELGELAND; LEIRSKAR, 1976; OGURO et al., 1982; SATO et al., 1987). A
síntese de proteína em fibroblastos da mucosa oral humana é inibida pelo
fluoreto de sódio (NaF) por meio da diminuição dos níveis de ATP de
maneira dose-dependente (JENG et al., 1998). O flúor também apresenta
23
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
um efeito citotóxico em células pulpares humanas, de maneira dose e
tempo-dependente. (CHANG; CHOU, 2001).
A ação do NaF no processo inflamatório tem sido observada
utilizando-se uma composição de células epiteliais da mucosa oral e
fibroblastos orais, nos quais dentifrícios fluoretados foram capazes de
potencializar a secreção de interleucina-1β (IL-1β) e estimular a produção
excessiva de metaloproteinase 9 (MMP-9), sugerindo um papel importante
na resposta inflamatória (MOSTEFAOUI et al., 2002).
A resposta inflamatória é caracterizada pela reação do tecido vivo
vascularizado a uma agressão local, quer seja de natureza física, química
ou biológica. Esse mecanismo de defesa inclui uma série de reações
bioquímicas que acontecem, basicamente na microcirculação, no tecido
conjuntivo e no sangue. Quando um tecido é traumatizado ou torna-se
localmente infectado, uma reação inflamatória é desencadeada (ALLEN
et al., 1998). A resposta inflamatória compreende três componentes
principais: aumento do fluxo sanguíneo, aumento da permeabilidade
capilar e aumento da migração celular. Durante essa reação, uma
variedade de fatores solúveis está envolvida no recrutamento de
leucócitos, por meio do aumento da expressão de moléculas de adesão
celular e de fatores quimiotáticos. Muitos desses fatores regulam a ativação
das células residentes (tais como fibroblastos, células endoteliais,
macrófagos teciduais e mastócitos) e também das células inflamatórias
24
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
recém recrutadas (monócitos, linfócitos, neutrófilos e eosinófilos) (COLLINS,
2000).
Os mediadores inflamatórios podem atuar em um ou alguns tipos
celulares, ter alvos difusos, ou até mesmo efeitos diferentes, de acordo com
os tipos de células e tecidos. Muitas variáveis podem modificar esse
processo básico, incluindo a natureza e a intensidade da lesão, o material
indutor da lesão, o local e o tecido afetado e a resposta do hospedeiro.
Dentre os mediadores inflamatórios mais importantes encontram-se fatores
ativadores plaquetários, citocinas, quimiocinas, além do óxido nítrico
(COLLINS, 2000).
O óxido nítrico (NO), um gás solúvel, é produzido não apenas por
células endoteliais, mas também por macrófagos e fibroblastos. Sua
participação no processo inflamatório é observada durante a
vasodilatação, redução da agregação e aderência plaquetária e
também como regulador do recrutamento de leucócitos. O NO é
sintetizado a partir da L-arginina pela enzima óxido nítrico-sintase (NOS).
(COLLINS, 2000). No entanto, sua inibição pode ocorrer em presença da
arginase que utiliza o mesmo substrato que a L-arginina (UGAR-ÇANKAL;
OZMERIC, 2006). Estudos recentes mostram a produção de NO no tecido
gengival é aumentada, isso ocorre porque o biofilme bacteriano é
responsável pela ativação da NOS (PAQUETTE; WILLIANS, 2000).
25
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
As quimiocinas são um grupo específico de citocinas que
compartilham a capacidade de estimular o movimento leucocitário
(quimiocinese) e o movimento dirigido (quimiotaxia), sendo particularmente
importantes na inflamação. Atualmente as quimiocinas são classificadas de
acordo com a posição dos resíduos de cisteína localizados na porção
amino-terminal da molécula. As quimiocinas atuam em células-alvo por
meio de receptores específicos ligados a proteínas G, caracterizados por
apresentarem sete domínios transmembrânicos. Após a ligação com o
receptor, a sinalização é realizada pela proteína G, que por meio de suas
subunidades desencadeia eventos bioquímicos que resultam nos efeitos
que as quimiocinas exercem sobre as células (MURDOCH; FINN, 2000).
A quimiocina CCL3/MIP-1α (proteína inflamatória derivada de
macrófago) é produzida no local da inflamação por vários tipos celulares,
como neutrófilos, eosinófilos, células epiteliais, monócitos e fibroblastos
(MILLER; KRANGEL, 1992; OPPENHEIM et al., 1991; KOCH et al., 1994). Sua
produção pode ser induzida por diversos agentes pró-inflamatórios, LPS,
infecções virais (MAURER; STEBUT, 2004). Esta quimiocina participa tanto da
fase aguda como crônica da inflamação por meio do recrutamento de
células pró-inflamatórias ao local do dano ou infecção (BONECCHI et
al.,1999), como na artrite reumatóide, asma e principalmente na doença
periodontal (JOHN; LUKACS, 2003).
Os fibroblastos, que são células residentes sentinelas, além de
produzirem citocinas, quimiocinas e inicializarem a resposta inflamatória via
26
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
recrutamento de leucócitos (SMITH et al.,1997), desempenham outra
importante função, que é o remodelamento da matriz extracelular (LEKIC
et al.,1997), envolvida na homeostasia tecidual e nas condições
patológicas (MATRISIAN, 1990). Essas células são capazes de fagocitar
partículas estranhas do organismo e produzir o colágeno, que tem um
papel crítico no processo de reparo tecidual (MURAKAMI; OKADA, 1998).
Essas funções também são realizadas pelos fibroblastos gengivais ativados
por lipopolissacarídeo (LPS) durante a inflamação periodontal (MURAKAMI;
OKADA, 1998).
O LPS encontrado na parede bacteriana é também um dos agentes
etiológicos da doença periodontal, sendo responsável pela ativação das
células nos eventos da resposta inflamatória. Sua participação na
destruição do tecido periodontal pode estar relacionada com a
capacidade de estimular a produção das metaloproteinases (MMPs)
(BODET et al., 2007).
As MMPs são um grupo de enzimas responsáveis pela degradação
das proteínas da matriz extracelular durante o crescimento ou renovação
tecidual, atuando inclusive na doença periodontal (UITTO et al., 2003). Essa
família de proteinases constitui uma classe estruturalmente ligada a enzimas
proteolíticas responsáveis pelo metabolismo de componentes
extracelulares, incluindo a fibronectina, laminina e proteoglicanas, assim
como colágeno da membrana basal (WOESSNER; NAGASE, 2000). Baseado
em seu substrato específico podem ser divididas em três subgrupos: a
27
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
colagenase intersticial, a estromelisina e as gelatinases. Duas gelatinases, a
metaloproteinase 2 (MMP-2) e a metaloproteinase 9 (MMP-9), são capazes
de degradar colagenases intersticiais (gelatinas), laminina, elastina,
fibronectina e colágeno tipo IV associado à membrana basal (WERB, 1989).
Essas proteinases estão envolvidas em um grande número de eventos
fisiológicos tais como desenvolvimento embrionário, involução do útero no
pós-parto, remodelamento tecidual, morfogênese da glândula salivar e na
erupção dentária. A produção excessiva de MMPs induz a degradação
acelerada da matriz extracelular que está associada a patologias como
artrite reumatóide, câncer, aterosclerose, osteoporose e periodontite
(WOESSNER JUNIOR, 1991). Recentemente, a gelatinase A (MMP-9) foi
encontrada aumentada em modelo experimental de mucosa oral humana
após estímulo com dentifrícios fluoretados (MOSTEFAOUI et al., 2002) e em
lesões periapicais in vivo (SHIN et al., 2002). Esses resultados sugerem que a
inibição da atividade das MMPs pode ser uma ferramenta útil na
terapêutica periodontal e endodôntica. O TGF-β e os inibidores da proteína
quinase C podem inibir a atividade da MMP-2 em células pulpares
humanas (CHANG; CHOU, 2001), células do ligamento periodontal (CHANG
et al., 2002) e células de câncer bucal (TSAI et al., 2003).
Durante o processo de inflamação, a produção das MMPs e de
muitas citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias são dependentes, em
grande parte, da ativação de quinases protéicas denominadas de MAPK
28
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
(proteína quinase ativadora de mitógeno). As MAPK são quinases
envolvidas na transdução de sinal intracelular a partir de um estímulo
agressor que culmina na ativação e migração de leucócitos para o tecido
lesado. A ativação da via das MAPK é um dos maiores sistemas utilizados
por células eucarióticas para traduzir sinal extracelular em respostas
intracelulares. Todas as MAPKs apresentam a seqüência de aminoácidos
Thr-Xxx-Tyr na qual X difere de acordo com a isoforma, podendo ser ácido
glutâmico (Glu) na MAPK tipo ERK (p44/42), prolina (Pro) na MAPK JNK e
glicina (Gly) na MAPK p38, formando assim os três maiores grupos de MAPK
conhecidos até o presente momento (HERLAAR; BROWN, 1999).
Sabe-se o PI3K é positivamente regulado em conseqüência da
ativação de receptores tirosino-quinases, de receptores de proteína G ou
integrinas (NICHOLSON; ANDERSON, 2002). Além disso, a ativação da PI3K
pode estar relacionada principalmente com a quimiotaxia celular (WEBER
et al., 1998; NOBES; HALL, 1999) e com a produção de citocinas e
quimiocinas, como por exemplo, CCL3/MIP-1α (FINE et al., 2001).
A via de sinalização intracelular NF-кB desempenha uma importante
função na resposta imune e inflamatória através da regulação de
citocinas, quimiocinas, fator de crescimento e enzimas da ciclooxigenase 2
(KARIN; BEN-NERIAH, 2000; VANE et al., 1994; TAK; FIRESTEIN, 2001;
YAMAMOTO; GAYNOR, 2001). Sua ativação ocorre principalmente por
receptores encontrados em patógenos conhecidos por causar a doença
periodontal cuja ligação é ocasionada por produtos sintetizados por esses
microorganismos. (MORI et al., 2003; KUSUMOTO et al., 2004; REN et al.,
2005).
Recentemente foi observado que a produção de MMP-2 por cultura
de células da polpa dental humana é regulada pela via da enzima
ciclooxigenase 2, NF-κB e tirosina quinase (HUANG et al., 2004).
No entanto, muito pouco se conhece a respeito da participação das
vias p44/42, p38, fosfatidilinositol 3 quinase (PI3K) e NF-кB na produção das
MMPs e da quimiocina CCL3/MIP-1α por fibroblastos gengivais estimulados
com por NaF, tão amplamente utilizado para prevenção da cárie dentária.
Proposição
31
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
2 PROPOSIÇÃO
O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito citotóxico do
fluoreto de sódio em fibroblastos gengivais de camundongos in vitro. Bem
como os mecanismos envolvidos na ativação intracelularmente desses
fibroblastos em expressarem MMP-2, MMP-9 e CCL3/MIP-1α e também a
produzirem alguns mediadores do processo inflamatório (CCL3/MIP-1α e
NO) após estímulo por NaF na presença ou ausência de LPS, Para isso,
foram avaliadas nos fibroblastos gengivais de camundongos em cultura:
• A concentração capaz de promover o efeito citotóxico do
NaF;
• A expressão de MMP-2 e MMP-9 após estímulo por NaF na
presença ou ausência de LPS;
• A produção e a expressão de CCL3/MIP-1α pós estímulo por
NaF na presença ou ausência de LPS;
• A produção de NO;
• A participação das vias de sinalização intracelular p44/42, p38,
NF-κB e PI3K na expressão de MMP-2 e MMP-9 e na produção e
expressão de CCL-3/ MIP-1α.
Material e método
33
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
3 MATERIAL E MÉTODO
Previamente à realização deste estudo, o projeto foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho” – Campus de Araçatuba - UNESP (Protocolo 51/06)
(Anexo A).
3.1 ANIMAIS
Camundongos normais Balb/c com peso variando entre 20 e 24 g,
provenientes do biotério central da Faculdade de Odontologia de
Araçatuba-UNESP, foram utilizados. Esses animais foram mantidos em uma
sala climatizada com temperatura variando entre 20 e 22
0
C, sistema de
exaustão e ciclo claro/escuro de 12 horas, com livre acesso à água e
ração.
3.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
3.2.1 Cultura de fibroblastos gengivais de camundongos
Os fibroblastos gengivais foram preparados a partir de fragmentos de
gengivas extraídos de aproximadamente 5-6 camundongos normais e
colocados em meio de cultura em placa de petri. Os fragmentos de
gengiva foram triturados e transferidos para garrafas de cultura com meio
34
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) contendo 15 % de soro fetal
bovino, 100 µg/mL de penicilina, 100 µg/mL de streptomicina, 50 µg/mL de
gentamicina e 300 ng/ml anfotericina B, durante o período da cultura. A
medida que atingiram confluência, os fibroblastos gengivais em cultura
foram repicados por 4 vezes e então, a partir do quarto repique, foram
distribuídos em placas de 24 poços. Após um período de 24 horas os
fibroblastos em confluências foram utilizados nos ensaios. As culturas foram
mantidas a 37
0
C com 5% de CO
2
.
3.2.2 Contagem global
Para a realização da contagem global, foram utilizadas alíquotas de
20 µL de fibroblastos suspensos em meio de cultura. A contagem global foi
efetuada utilizando a Câmara de Neubauer, com auxílio de microscópio
óptico em aumento de 40 vezes e contador manual. A partir dos resultados
obtidos nessa contagem, foi calculado o número total de células em cada
poço.
3.2.3 Estimulação in vitro dos fibroblastos gengivais por NaF e LPS
Fibroblastos (3 X 10
6
/ poço) foram estimulados com NaF (99,9% de
pureza de marca comercial Sigma
®
) nas concentrações de 1, 5, 10 e 20
µgF/mL nos tempos de 1, 6 e 24 horas na presença ou ausência de LPS (10
µg/mL) (Escherichia coli) a 37
0
C em incubadora com 5% de CO
2
. Ao final
da incubação nos respectivos tempos, os sobrenadantes e as células foram
35
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
recolhidos em ependorfs estéreis e congelados a -70
0
C para realização do
ELISA e RT-PCR, respectivamente.
3.2.4 Avaliação do efeito citotóxico do NaF nos fibroblastos gengivais
No intuito de descobrir qual seria a dose de NaF que apresentasse
um efeito tóxico aos fibroblastos gengivais, esses foram plaqueados em
placas com 24 poços e após atingirem confluência foram estimulados por
NaF nas concentrações de 1, 5, 10, 20 e 40 µgF/mL, sendo incubados a
37
0
C com 5% de CO
2 ,
por um período de 6, 24 e 48 horas. Ao final da
incubação nos respectivos tempos, os sobrenadantes foram descartados e
uma solução de MTT, foi adicionada às células.
A solução de MTT (5 mg de 2,5- difenil brometo de tetrazolium de
marca comercial Sigma
®
) foi dissolvida em 1 mL de PBS, filtrada e
esterilizada utilizando filtro Millipore 0,22 µm. A solução foi adicionada em
cada poço (10 µL de MTT por 90 µL de meio de cultura), contendo os
fibroblastos gengivais pós-estímulo onde permaneceram incubados por 4
horas a 37
0
C em 5% de CO
2
. Posteriormente, a solução de MTT foi retirada
dos poços e descartada. Álcool isopropílico (100 µL) foi adicionado às
células, deixadas em mesa agitadora à temperatura ambiente por 30
minutos para dissolver os cristais azuis que coraram as mitocôndrias. Após
essa etapa, a placa foi levada ao espectrofotômetro com comprimento de
36
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
onda ajustado para 570 nm, no qual a leitura de absorbância foi realizada
(MOSMANN, 1983).
3.2.5 Avaliação da expressão de MMP-2, MMP-9 e CCL3/MIP-1α nos
fibroblastos gengivais estimulados por NaF na presença e ausência de LPS
por meio da RT-PCR
3.2.5.1 Extração de RNA das células
Para extração do RNA total contido nas amostras de fibroblastos
gengivais estimulados com NaF, na presença ou ausência de LPS, foi
adicionado em cada poço da placa de 24 poços contendo as células 1
mL de TRIzol (Life Techonlogies) para promover lise celular. As amostras
foram armazenadas em ependorfs livres de DNAse e RNAse de 1500 µL e
congeladas a -70
o
C, até o momento da extração de RNA.
Para a extração do RNA, os ependorfs contendo as amostras dos
fibroblastos foram descongelados. Para cada uma das amostras foi
adicionado 200 µL de clorofórmio, realizada agitação vigorosa,
procedendo a uma centrifugação a 15.700 X g durante 15 minutos em
centrífuga refrigerada a 4º C, para separação das fases.
Após a centrifugação, obtiveram-se três fases no ependorf: fase
transparente, correspondendo ao RNA total; fase branca, correspondendo
ao DNA genômico e fase rosa, correspondendo ao TRIzol. Foram coletado
500 µL da fase transparente, os quais foram transferidos para um novo
37
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
ependorf estéril. Em seguida, adicionou-se 500 µL de álcool isopropílico,
sofrendo novamente agitação vigorosa, seguida pelo armazenamento a -
20
o
C, por pelo menos 4 horas para precipitação do RNA.
Após este período as amostras foram centrifugadas a 15.700 X g
durante 15 minutos em centrífuga refrigerada a 4ºC. Os ependorfs foram
mantidos em gelo e o sobrenadante foi descartado. Em seguida, foi
acrescentado 500 µL de álcool 75%, agitando-se vigorosamente e
centrifugando os ependorfs a 9.300 X g durante 15 minutos em centrífuga
refrigerada a 4ºC. O sobrenadante foi novamente descartado, os
ependorfs foram deixados abertos e invertidos sobre filtro de papel em
temperatura ambiente, por aproximadamente 1 hora para permitir a
secagem das amostras. Para dissolver o RNA total, os ependorfs receberam
20 µL de água livre de DNAse e RNAse. Então, as amostras de RNA foram
armazenadas a -70
o
C até o uso.
3.2.5.2 Obtenção de cDNA a partir da extração do RNA
A obtenção de cDNA foi realizada a partir do RNA total. Os tubos
contendo amostras de RNA foram descongelados, homogeneizados e
armazenados em gelo. A seguir 2 µg de RNA foram diluídos em 8 µL em
cada amostra, os quais foram transferidos para um novo ependorf. Em
seguida, foi adicionado 1 µL de Oligo DT (Invitrogen) (0,5 µg/µl). Os
ependorfs foram incubados a 70
o
C por 10 minutos e a 4
o
C por 5 minutos em
termociclador. Após esse período, foi preparada uma solução para ser
38
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
adicionada às amostras, sendo que para cada amostra foram necessários:
4 µL de DNTP (Invitrogen) (2,5 µM), 4 µL de 5 x tampão para PCR (Invitrogen)
(250 mM TRIS-HCl), 2 µL dTT (Invitrogen) (0,1M) e 1 µL de RT (Invitrogen) (200
U/µL). Em cada amostra foram adicionados 11 µL da solução; os ependorfs
foram centrifugados a 4
o
C por 30 segundos e colocados em termociclador
42
o
C por 1 hora e 90
o
C por 5 minutos.
As amostras de cDNA foram armazenadas a -20
o
C até o momento
do uso.
3.2.5.3 Transcriptase reversa- reação de polimerase em cadeia (RT-PCR)
RT-PCR combina síntese de cDNA vindo de molde de RNA com PCR
para fornecer um método rápido e sensível para verificar a expressão
gênica. RT-PCR é usado para quantificar a expressão de RNAm, vindo de
uma concentração pequena de RNA (SANTOS et al., 2004). Esse método foi
utilizado para verificar a expressão de MMP-2, MMP-9 e CCL3/MIP-1α nos
fibroblastos gengivais de camundongos estimulados por NaF na presença
ou ausência de LPS in vitro. Os ependorfs foram numerados, mantidos em
gelo e em cada ependorf foram colocados 1 µL de cDNA mais 4 µL de
água livre de DNAse e RNAse.
A seguir foi preparada uma solução, sendo que para cada amostra
foram necessários: 11,4 µL de água livre de DNAse e RNAse, 2,5 µL de 10 X
tampão para PCR (Invitrogen) (200 mM TRIS-HCl), 2 µL de DNTP (Invitrogen)
39
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
(2,5 µM), 1,5 µL de MgCl
2
(Invitrogen) (50 mM), 1 µL de primer (10 µM), 0,1 µL
de TAq DNA polimerase (Invitrogen) (5 U/µL). Então 20 µL da solução foram
adicionados a cada ependorf, resultando em um volume total de 25 µL. Os
ependorfs foram centrifugados a 4
o
C por 30 segundos e colocados em
termociclador de acordo com a temperatura de amplificação,
anelamento e extensão para cada primer.
O processo de ciclagem térmica para os genes de expressão
constitutiva de β-actina pelos fibroblastos foi constituído de desnaturação
inicial por 4 minutos a 94
0
C seguida por 30 ciclos de amplificação. Cada
ciclo foi constituído de desnaturação por 45 segundos a 94
0
C, anelamento
por 45 segundos a 56
0
C e extensão 45 segundo a 72
0
C. Após o término do
último ciclo, as amostras foram incubadas por um período adicional de 10
minutos a 72
0
C (extensão final).
O processo de ciclagem térmica para os genes de expressão
induzida de MMP-2 pelos fibroblastos foi constituído por desnaturação
inicial por 4 minutos a 94
0
C seguida por 35 ciclos de amplificação. Cada
ciclo foi constituído de desnaturação por 45 segundos a 94
0
C, anelamento
por 45 segundos a 59,5
0
C e extensão 45 segundos a 72
0
C. Após o término
do último ciclo, as amostras foram incubadas por um período adicional de
10 minutos a 72
0
C (extensão final). Para o alvo MMP-9 por fibroblastos
gengivais foi alterada somente a temperatura de anelamento para 57
0
C.
O processo de ciclagem térmica para os genes de expressão
induzida de CCL3/MIP-1α pelos fibroblastos, foi constituído de desnaturação
inicial por 4 minutos a 94
0
C seguida por 35 ciclos de amplificação. Cada
40
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
ciclo foi constituído de desnaturação por 45 segundos a 94
0
C, anelamento
por 45 segundos a 58
0
C e extensão 45 segundos a 72
0
C. Após o término do
último ciclo, as amostras foram incubadas por um período adicional de 10
minutos a 72
0
C (extensão final).
O tamanho dos pares de base e os primers utilizados na PCR são
apresentados na tabela 1.
Tabela 1 - Primers utilizados na PCR para os diferentes alvos e tamanhos
antecipados dos produtos de amplificação
Alvo
Tamanho
Antecipado
Sense
(5’-3’)
Anti-sense
(5’-3’)
β-actina*
345 pb taaaacgcagctcagtaagagtccg
tggaatcctgtggcatccatgaaac
MMP-2**
331 pb gaatgcgggctcctgactacacatcc actggccggctctttcgcttact
MMP-9
#
481 pb cgacagcacctcccactatg cccaacttatccagactcct
CCL3
Ψ
258 pb gcccttgctgttcttctctgt ggcattcagttccaggtcagt
* Graham et al., 1990, ** Zhang et al., 2006,
#
Li et al., 2002,
Ψ
Ishida et aL., 2007
Para detecção dos produtos amplificados de tamanhos
antecipados, uma alíquota de 13 µL de cada amostra foi analisada por
eletroforese em gel de agarose (1,8%) (196 mL de água livre de DNAse e
RNAse, 3,6g de agarose e 4 mL de tampão TAE 50 X) corado com 10 µL de
brometo de etídio (10 µg/mL) (Invitrogen). A eletroforese foi feita a 90 Volts,
por 150 minutos, em uma cuba de eletroforese horizontal, e o cDNA
visualizado sob luz ultra-violeta em um transiluminador. O peso molecular
41
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
dos produtos da PCR foi determinado pela comparação com um
marcador de peso molecular de tamanhos conhecidos (DNA ladder,
Invitrogen 100-1500 pb). A fotodocumentação dos géis de agarose foi
realizada com a utilização de máquina Polaróide.
3.2.6 Determinação da produção de CCL3/MIP-1α nos sobrenadantes dos
fibroblastos gengivais estimulados por NaF e LPS
A produção de CCL3/MIP-1α foi avaliada a partir do sobrenadante
dos fibroblastos gengivais coletado 1, 6 e 24 horas após estímulo por NaF
nas concentrações de 1, 5, 10 e 20 µg F/mL, na presença ou ausência de
LPS (10 µg/mL). A produção de CCL3/MIP-1α extracelular foi quantificada
utilizando-se o método de ensaio imunoenzimático (ELISA). Placas de 96
poços foram recobertas e incubadas durante 15-18 horas a 4
o
C, com
anticorpo anti-CCL3 (Anti-human CCL3 Antibody – AF – 270-NA – R&D
Systems), diluídos em tampão fosfato de cálcio. Após o tempo de
incubação, as placas foram lavadas com PBS, contendo 0,5% de Tween 20
e bloqueadores durante 1 hora, em temperatura ambiente, com PBS
contendo soroalbumina bovina 1%. As placas então, foram lavadas e
incubadas com os sobrenadantes das células e com CCL3/MIP-1α
recombinante durante 1 hora a 4
o
C. Após esse período, as placas foram
lavadas e incubadas com anticorpo biotinilado (Biotinylated Anti-human
CCL3/MIP-1α Antibody – BAF 270-NA – R&D Systems) por 30 minutos à 37
0
C.
As placas foram lavadas com PBS e o substrato (peróxido de hidrogênio e
42
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
tetrametilbenzidina na proporção de 1:1) adicionado conforme as
instruções do fabricante. Após 30 minutos, a solução de paralisação da
reação (ácido sulfúrico 2N) foi adicionada e a leitura foi realizada em
espectrofotômetro ajustado para o comprimento de onda de 490nm.
3.2.7 Avaliação do papel da dexametasona, PD98059, SB202190 e LY294002
sobre a expressão de MMP-9 e CCL3/MIP-1α pelos fibroblastos gengivais de
camundongos
Para identificar a via de sinalização intracelular envolvida na
ativação dos fibroblastos gengivais por NaF na ausência ou presença de
LPS, esses fibroblastos foram pré-tratados com os seguintes inibidores.
Tabela 2 – Pré-tratamento com inibidores
*Igarashi et al., 2004, **Adachi et al., 2000,
#
Amin et al., 2003
Os fibroblastos gengivais normais foram plaqueados em placas de 24
poços e após atingirem confluência foram pré-tratados com os respectivos
INIBIDOR FABRICANTE AÇÃO CONCENTRAÇÃO
DEXAMETASONA*
Sigma Chem
Glicocorticóide
10 µM
PD98059 ** Calbiochem
Inibidor da p44/42
50 µM
SB 202190 * Calbiochem
Inibidor da p38
10 µM
LY294002
#
Calbiochem
Inibidor da PI3K
30 µM
43
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
inibidores da tabela 2. Após 30 minutos, os fibroblastos foram estimulados
por NaF nas concentrações de 1, 5, 10 e 20 µg F/mL, na presença ou
ausência de LPS (10 µg/ml), por um período de 6 horas. As células foram
coletadas em Trizol para detecção da expressão do RNA mensageiro para
MMP-9 e CCL3/MIP-1α, por meio da técnica do RT-PCR, descrita
anteriormente.
3.2.8 Determinação da produção de CCL3/MIP-1α nos sobrenadantes dos
fibroblastos gengivais estimulados por NaF e LPS após pré-tratamento com
inibidores
A produção de CCL3/MIP-1α foi avaliada a partir dos sobrenadantes
dos fibroblastos gengivais pré-tratados 30 minutos antes do estímulo com
inibidores PD98059, SB202190, LY294002 e dexametasona e coletados 06
horas após estímulo por NaF (20 µg F/mL) na presença ou ausência de LPS
(10 µg/mL). A produção de CCL3/MIP-1α extracelular foi quantificada
utilizando-se o método do ensaio imuno-enzimático (ELISA) descrito
anteriormente.
3.2.9 Determinação da produção de óxido nítrico por fibroblastos gengivais
44
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
Os fibroblastos gengivais normais foram plaqueados em placas de 24
poços e após atingirem confluência foram estimulados por NaF (1, 5, 10 e
20 µg F/mL), na presença ou ausência de LPS (10 µg/ml) e 1400w (10 µM)
(inibidor da enzima óxido nítrico sintase induzida). Após 1, 6 e 24 horas os
sobrenadantes foram coletados para dosagem de óxido nítrico pelo
método de Griess (GREEN et al., 1982).
3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada utilizando o programa Graph Prism
3.0. As diferenças estatisticamente significativas foram determinadas por
meio da análise de variância (ANOVA) seguida do teste de correção de
Bonferroni. Valores de p<0, 05 e p<0, 001 foram considerados significativos.
Resultados
46
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
4 RESULTADOS
4.1 AVALIAÇÃO DO EFEITO CITOTÓXICO DO NaF POR FIBROBLASTOS
GENGIVAIS DE CAMUNDONGOS
Para verificar qual concentração de NaF (1, 5, 10, 20 e 40 µg F/mL)
teria efeito tóxico nos fibroblastos, a taxa de mortalidade celular foi
observada 6, 24 e 48 horas após o estímulo com NaF. O efeito citotóxico do
NaF sobre os fibroblastos gengivais ocorreu de maneira dose e tempo-
dependente (Fig.1). Observou-se que a concentração de 40 µg F/mL
apresentou diferença estatisticamente significante em relação ao grupo
controle, 6 horas (p<0,05), 24 e 48 após estímulo (p< 0, 001), com percentual
de morte celular de 62,4% para esses dois últimos tempos de estímulo. A
concentração de 20 µg F/mL foi estatisticamente significante 24 e 48 horas
após, apresentando um índice de morte celular de 22,1% e 28,2%
respectivamente.
47
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
0.0
0.5
1.0
1.5
C
5
1
10 20 40 C
51 10 20 40
C
5
1
10 20 40
06 horas 24 horas
48 horas
*
*
#
#
*
NaF (µ
µµ
µg F/mL)
NaF (µ
µµ
µg F/mL)NaF (µ
µµ
µg F/mL)
Sobrevida (O.D)
Figura 1 – Efeito citotóxico do NaF nos fibroblastos gengivais estimulados nas
concentrações de 1, 5, 10, 20 e 40 µg F/mL e grupo controle (C),
estimulados 6, 24 e 48 horas. *(p< 0,05) e
#
(p< 0, 001) comparados
com o grupo controle de cada tempo. Os resultados foram
expressos pela média ± EPM, (ANOVA, com correção de
Bonferroni).
48
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
4.2 EXPRESSÃO DE MMP-2 E MMP-9 POR FIBROBLASTOS GENGIVAIS
ESTIMULADOS POR NaF
Com base nos dados obtidos, observou-se que a concentração de
40 µg F/mL promoveu um alto índice de morte celular (62,4%), com isso
optou-se por utilizar para os experimentos de ativação celular,
concentrações que não induzissem morte celular ou no máximo um
pequeno índice dessa morte, como a observada na concentração de 20
µg F/mL (22,1%). Para tanto, utilizou-se as seguintes concentrações de NaF:
1, 5, 10 e 20 µg F/mL nos tempos de 1, 6 e 24 horas. A expressão de MMP-9
pelos fibroblastos gengivais estimulados por NaF foi observada somente 6 e
24 horas pós-estímulos (Fig. 2B e 2C), na concentração de 20 µg F/mL, o
pico máximo de expressão de MMP-9 ocorreu de 6 horas após o estímulo
(Fig. 2B). No entanto, não foi observada a expressão de MMP-2 em
nenhuma das concentrações e tempos propostos (Fig. 2A, 2B e 2C).
49
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
A B
1
0
β-Actina
MMP-9
MMP-2
1 hora
C
o
n
t
r
o
l
e
1
0
β-Actina
MMP-9
MMP-2
06 horas
C
C
o
n
t
r
o
l
e
1
5
1
0
24 horas
β- Actina
MMP-9
MMP-2
Figura 2 - Expressão de RNAm para MMP-2 e MMP-9 em fibroblastos
gengivais estimulados pelo NaF nas concentrações 1, 5, 10 e 20
µg F/mL e grupo controle. (A) Tempo de 1 hora, (B) tempo de
06 horas, (C) tempo de 24 horas. Foram extraídos 2 µg de RNA
total e sua expressão avaliada pela técnica RT-PCR utilizando
gel de garose (1,8%) com os produtos da PCR para detecção
de β-actina (345 pb), MMP-9 (481 pb) e MMP-2 (331 pb).
50
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
4.3 EXPRESSÃO DE CCL3/MIP-1α POR FIBROBLASTOS GENGIVAIS DE
CAMUNDONGOS ESTIMULADOS POR NaF
Observou-se também a expressão de CCL3/MIP-1α pelos fibroblastos
gengivais estimulados por NaF. Os resultados demonstram que CCL3/MIP-1α
foi expressa somente na concentração de 20 µg F/mL após 6 e 24 horas de
estímulo (Fig. 3B e 3C). O pico máximo de expressão dessa quimiocina pelos
fibroblastos gengivais foi observado com 20 µg F/mL, 6 horas após,
diminuindo 24 horas após (Fig. 3B).
51
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
A B
β- Actina
CCL3
1 hora
/MIP-1α
β- Actina
CCL3
06 horas
/MIP-1α
C
β-Actina
CCL3
24 horas
/MIP-1α
Figura 3 - Expressão de RNAm para CCL3/MIP-1α em fibroblastos gengivais
estimulados por NaF nas concentrações 1, 5, 10 e 20 µg F/mL e
grupo controle. (A) Tempo de 1 hora, (B) tempo de 6 horas, (C)
tempo de 24 horas. Foram extraídos 2 µg de RNA total e sua
expressão avaliada pela técnica RT-PCR utilizando gel de agarose
(1,8%) com os produtos da PCR para detecção de β-actina (345
pb) e CCL3/ MIP-1α (258 pb).
52
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
4.4 DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE CCL3/MIP-1α NOS SOBRENADANTES
DE FIBROBLASTOS GENGIVAIS DE CAMUNDONGOS ESTIMULADOS POR NaF
Com o intuito de confirmar a expressão da quimiocina CCL3/MIP-1α
pelos fibroblastos gengivais estimulados por NaF, realizou-se a
quantificação da produção dessa quimiocina por meio do método ELISA. A
produção de CCL3/MIP-1α foi observada somente nos grupos estimulados
com a concentração de 20 µg F/mL, 6 e 24 horas pós-estimulo (p<0, 001),
quando comparados ao grupo controle. O pico máximo de produção de
CCL3/MIP-1α nesses fibroblastos foi observado 6 horas após, diminuindo
após 24 horas (Fig. 4), semelhantemente ao observado pela técnica da RT-
PCR. Com base nos resultados obtidos, observou-se que o pico máximo de
expressão de MMP-9, expressão e produção de CCL3/MIP-1α ocorreu
somente 6 horas após estímulo na concentração de 20 µg F/mL. Desta
forma, optou-se em utilizar essa concentração e esse tempo de estímulo
para a avaliação da expressão de MMP-9, expressão e produção de
CCL3/MIP-1α pelos fibroblastos gengivais estimulados por NaF na presença
de LPS.
53
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
0
5
10
15
C
2010
5
1
20105 1
20105
1
1 hora
24 horas
6 horas
*
*
C
C
NaF (µ
µµ
µg F/mL)
NaF (µ
µµ
µg F/mL)
NaF (µ
µµ
µg F/mL)
CCL3 (pg/mL)
Figura 4 - Produção de CCL3/MIP-1α nos sobrenadantes de fibroblastos
gengivais estimulados por NaF nas concentrações de 1, 5, 10 e
20 µg F/mL e grupo controle (c) após 1, 6 e 24 horas de
estimulo. Os resultados foram expressos pela média ± EPM
(ANOVA, com correção de Bonferroni) * p<0, 001. Este ensaio é
representativo de um experimento realizado em triplicata.
54
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
4.5 EXPRESSÃO DE MMP-2 E MMP-9 POR FIBROBLASTOS GENGIVAIS
ESTIMULADOS POR NaF NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE LPS.
Avaliou-se a expressão de MMP-2 e MMP-9 nos fibroblastos gengivais
de camundongos estimulados por NaF (20 µg F/mL) na presença ou
ausência de LPS (10 µg/mL) (Fig. 5). Observou-se que tanto o LPS quanto o
NaF promoveram a expressão de MMP-9, mas não de MMP-2, nos
fibroblastos gengivais. Entretanto, esses fibroblastos estimulados apenas por
NaF apresentaram uma ligeira intensidade na expressão de MMP-9 em
relação aos fibroblastos estimulados apenas por LPS. Portanto, os dados
mostram uma potencialização na expressão de MMP-9 nesses fibroblastos
ativados por NaF na presença de LPS.
55
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
β-Actina
MMP-9
6 horas
MMP-2
Figura 5- Expressão de RNAm para MMP-2 e MMP-9 em fibroblastos
gengivais estimulados por 6 horas com NaF (20 µg F/mL) na
presença ou ausência de LPS (10 µg/mL). Foram extraídos 2 µg
de RNA total e sua expressão avaliada pela técnica RT-PCR
utilizando gel de agarose (1,8%) com os produtos da PCR para
detecção de β-actina (345 pb), MMP-9 (481 pb) e MMP-2 (331
pb) Este ensaio é representativo de um experimento realizado
em triplicata.
56
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
4.6 EXPRESSÃO DE CCL3/MIP-1α POR FIBROBLASTOS GENGIVAIS DE
CAMUNDONGOS ESTIMULADOS POR NaF NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE LPS.
Analisou-se também a expressão de RNAm para CCL3/MIP-1α nos
fibroblastos gengivais ativados por NaF na presença ou ausência de LPS
através da técnica RT-PCR (Fig. 6). Os resultados mostram a expressão de
CCL3/MIP-1α pelos fibroblastos gengivais estimulados tanto por NaF quanto
por LPS. No entanto, quando esses fibroblastos foram estimulados por NaF
na presença de LPS, observou-se uma potencialização na expressão de
CCL3/MIP-1α.
57
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
β-Actina
CCL3
6 horas
/MIP-1α
Figura 6 - Expressão de RNAm para CCL3/MIP-1α pelos fibroblastos
gengivais estimulados por NaF (20 µg/mL) na presença ou
ausência de LPS (10 µg/mL) no tempo de 6 horas. Foram
extraídos 2 µg de RNA total e sua expressão avaliada pela
técnica RT-PCR utilizando gel de agarose (1,8%) com os produtos
da PCR para detecção de β-actina (345 pb) e CCL3/MIP-1α
(258 pb). Este ensaio é representativo de um experimento
realizado em triplicata.
58
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
4.7 DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE CCL3/MIP-1α NOS SOBRENADANTES
DE FIBROBLASTOS GENGIVAIS DE CAMUNDONGOS ESTIMULADOS POR NaF
NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE LPS
No intuito de confirmar a expressão de CCL3/MIP-1α pelos
fibroblastos gengivais, avaliou-se a produção de CCL3/MIP-1α nos
sobrenadantes desses fibroblastos estimulados por NaF (20 µg F/mL) na
presença e ausência de LPS (10 µg/mL) por meio do método ELISA (Fig 7).
Observou-se a produção de CCL3/MIP-1α pelos fibroblastos gengivais
estimulados somente por NaF, por LPS e NaF na presença de LPS. No
entanto, observou-se uma potencialização na produção dessa quimiocina
para esses fibroblastos estimulados por NaF na presença de LPS (p<0, 001).
59
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
06 horas
C NaF LPS NaF+LPS
0
5
10
15
*
#
62
65
68
*
20 µg F/mL + 10 µg/mL (LPS)
10 µg/mL (LPS)
20 µg F/mL
Control
CCL3/MIP-1α
α
α
α
(pg/mL)
Figura 7 - Produção de CCL3/MIP-1α nos sobrenadantes de fibroblastos
gengivais estimulados por NaF (20 µg/mL) na ausência ou
presença de LPS (10 µg/mL) no tempo de 6 horas. Os resultados
foram expressos pela média ± EPM (ANOVA, com correção de
Bonferroni) * p<0, 05 e
#
p<0, 001. Este ensaio é representativo
de um experimento realizado em triplicata.
60
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
4.8 DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO POR FIBROBLASTOS
GENGIVAIS ESTIMULADOS POR NaF E LPS
Avaliou-se a produção de NO (óxido nítrico) pelos fibroblastos
gengivais de camundongos estimulados por NaF (1, 5, 10 e 20 µg F/mL) nos
tempos de 1, 6 e 24 horas. Observou-se que o NaF não foi capaz de induzir
a produção de NO nos fibroblastos gengivais.
4.9 AVALIAÇÃO DO PAPEL DOS INIBIDORES: PD98059, SB202190, LY294002 E
DEXAMETASONA SOBRE A EXPRESSÃO DE MMP-9 PELOS FIBROBLASTOS
GENGIVAIS DE CAMUNDONGOS ESTIMULADOS POR NaF NA PRESENÇA OU
AUSÊNCIA DE LPS
As culturas de fibroblastos gengivais foram pré-tratadas 30 minutos
antes do estímulo com os inibidores: PD98053 (inibidor da p44/42), SB202190
(inibidor da p38 MAPK), LY 294002 (inibidor da PI3K) e Dexametasona
(glicocorticóide - NF-кB) após isso, foram estimuladas por NaF na presença
ou ausência de LPS (Fig. 8). Observou-se que PD98053 e dexametasona
foram capazes de inibir a expressão de RNAm para MMP-9 nos fibroblastos
gengivais estimulados somente por NaF, somente por LPS e para os
fibroblastos estimulados por NaF na presença de LPS, no entanto, LY294002
e SB202190 não foram capazes de promover essa inibição.
61
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
β-actina
MMP-9
PD 98059 SB 202190
LY 294002
DEXA
Inibidores
CONTROLE
Figura 8 - Expressão de RNAm para MMP-9 de fibroblastos gengivais pré-
tratados com inibidores e estimulados por 6 horas com NaF (20
µg F/ml) na presença ou ausência de LPS (10 µg/mL). Os
fibroblastos foram pré-tratados com os inibidores PD98059 (50
µM), SB202190 (10 µM), LY294002 (30 µM) e Dexametasona (10
µM) 30 minutos antes do estímulo. O RNA total foi extraído e
avaliado a sua expressão pela técnica RT-PCR utilizando gel de
agarose (1,8%) com os produtos da PCR para detecção de β-
actina (345 pb) e MMP-9 (481 pb).
62
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
4.10 AVALIAÇÃO DO PAPEL DOS INIBIDORES: PD98059, SB202190, LY294002 E
DEXAMETASONA NA EXPRESSÃO DE CCL3/MIP-1α PELOS FIBROBLASTOS
GENGIVAIS DE CAMUNDONGOS ESTIMULADOS POR NaF E LPS
Com o objetivo de identificar qual via de sinalização estaria
envolvida na expressão de CCL3/MIP-1α nos fibroblastos gengivais
estimulados por NaF na presença ou ausência de LPS (10 µg/mL), os
fibroblastos foram pré-tratados com os inibidores: PD98059 (50 µM),
SB202190 (10 µM), LY294002 (30 µM) e Dexametasona (10 µM) (Fig. 9). Os
dados mostram que todos os inibidores utilizados no experimento foram
capazes de bloquear a expressão de CCL3/MIP-1α nesses fibroblastos
submetidos aos estímulos.
63
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
β-actina
CCL3
PD 98059
SB 202190 LY 294002 DEXA
Inibidores
CONTROLE
/MIP-1α
Figura 9 - Expressão de RNAm para CCL3/MIP-1α de fibroblastos gengivais pré-
tratados com inibidores e estimulados por 6 horas com NaF (20 µg
F/ml) na presença ou ausência de LPS (10 µg/ml). Os fibroblastos
foram pré-tratados com os inibidores PD98059 (50 µM), SB202190 (10
µM), LY294002 (30 µM) e Dexametasona (10 µM), 30 minutos antes
do estímulo. O RNA total foi extraído e sua expressão avaliada pela
técnica da RT-PCR utilizando gel de agarose (1,8%) com os
produtos da PCR para detecção de β-actina (345 pb) e CCL3 (258
pb).
64
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
4.11 AVALIAÇÃO DO PAPEL DOS INIBIDORES: PD98059, SB202190, LY294002 E
DEXAMETASONA NA PRODUÇÃO DE CCL3/MIP-1α NOS SOBRENADANTE DE
FIBROBLASTOS GENGIVAIS DE CAMUNDONGOS ESTIMULADOS POR NaF E LPS
No sentido de avaliar a presença de CCL3/MIP-1α nos sobrenadantes
dos fibroblastos gengivais pré-tratados com os inibidores: PD98053,
SB202190, LY294002 e Dexametasona estimulados por NaF na ausência ou
presença de LPS, a produção de CCL3/MIP-1α foi quantificada utilizando-
se o método ELISA (Fig. 10). Para o grupo que não foi pré-tratado com os
inibidores (grupo controle) foram observados resultados semelhantes aos
apresentados acima. Entretanto, quando esses fibroblastos foram pré-
tratados com esses inibidores observou-se uma completa inibição na
produção de CCL3/MIP-1α nos fibroblastos gengivais.
65
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
0
5
10
15
C
LPS
NaF+
LPS
NaF
PD98053
SB202190 LY294002
DEXA
#
*
*
LPS
NaF+
LPS
NaF
LPS
NaF+
LPS
NaF
LPS
NaF+
LPS
NaFLPS
NaF+
LPS
NaF
60.0
67.5
75.0
CCL3/MIP-1
α
α
α
α
(pg/mL)
Figura 10 - Produção de CCL3/MIP-1α nos sobrenadantes de
fibroblastos gengivais pré-tratados com os inibidores PD98059
(50 µM), SB202190 (10 µM), LY294002 (30 µM) e Dexametasona
(10 µM) e estimulados por 6 horas com NaF (20 µg F/mL) na
presença ou ausência de LPS (10 µg/ml). Os resultados foram
expressos pela média ± EPM, * p< 0, 05 e
#
p< 0, 001 (ANOVA
com correção de Bonferroni).
Discussão
67
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
5 DISCUSSÃO
Nas ultimas décadas o flúor vem sendo amplamente utilizado na
odontologia, tanto na forma tópica quanto na sistêmica, devido aos seus
benefícios na redução da cárie dentária. Diante disso, observa-se um
aumento indiscriminado na sua utilização e infelizmente um aumento
significativo na prevalência da fluorose dentária. Atualmente existem
muitos estudos direcionados aos efeitos nocivos desse íon nos tecidos
mineralizados, no entanto, sabe-se muito pouco sobre seus efeitos no meio
celular e os mecanismos envolvidos nesse processo. Desta forma, o objetivo
do presente estudo foi avaliar a expressão de MMP-2 e MMP-9 e a
produção de CCL3/MIP-1α desses fibroblastos gengivais estimulados por
NaF e investigar as vias de sinalização intracelular envolvidas na ativação
desses fibroblastos para produção das substâncias descritas acima.
Dados de literatura mostram que o flúor pode promover alterações
nas células da polpa humana em cultura a partir da concentração de 19
µg F/mL (CHANG e CHOU et al., 2001). Em fibroblastos orais humanos o NaF
pode apresentar um efeito citotóxico a partir da concentração de 40 µg
F/mL (JENG et al., 1998). Quando dentifrícios fluoretados contendo 1500 µg
F/mL são utilizados a longo prazo, os tecidos da mucosa bucal podem
apresentar até 19 µg F/mL. Utilizando soluções para bochecho contendo
0,2 % de NaF, os tecidos da mucosa bucal podem conter até 40 µg F/mL
(JACOBSON et al., 1992).
68
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
Com base nesses dados, primeiramente o presente estudo avaliou a
dose que poderia ser ideal para ativar os fibroblastos gengivais sem induzir
morte celular. Para tanto se realizou o ensaio de citotoxicidade. Observou-
se que a concentração de 40 µg F/mL após 24 horas resultou em um
percentual de morte celular de 62,6%. Já a concentração de 20 µg F/mL,
resultou em 22,1% de morte celular. Optou-se, então, por utilizar 20 µg F/mL
como concentração máxima para os ensaios de ativação celular, já que
40 µg F/mL resultou em alto índice de morte celular, o que tornaria
impossível a visualização da ativação dos fibroblastos nessa concentração.
A justificativa em estudar a ativação das metaloproteinases 2 e 9
deve-se principalmente ao fato de desempenharem uma importante
função na destruição do tecido periodontal durante a periodontite e
também por serem produzidas pelos fibroblastos (CHANG et al., 2002). Essas
metaloproteinases pertencem ao mesmo subgrupo (gelatinases), sendo
responsáveis por degradar elastina, fibronectina e colágeno (colágeno tipo
IV) encontrado principalmente no tecido gengival (NAGASE; WOESSNER,
1999). A expressão dessas metaloproteinases pode ser regulada por vários
estímulos incluindo o fator de crescimento, estímulos mitógenos e até por
citocinas inflamatórias como a interleucina-1β (SATO et al., 1993; YOKOO;
KITAMURA, 1996). Neste trabalho, determinou-se a capacidade do NaF
induzir a ativação dos fibroblastos gengivais para a expressão MMP-2 e
MMP-9.
No presente estudo, observou-se que o NaF foi capaz de induzir os
fibroblastos a expressarem MMP-9, somente na concentração de 20 µg
69
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
F/mL. No entanto, a expressão de MMP-2 não foi observada. Os dados do
presente estudo podem ser relevantes visto que corroboram o estudo de
Mostefaoui et al. (2002), no qual uma composição de células epiteliais da
mucosa e fibroblastos orais foi estimulada com dois dentifrícios fluoretados
(Crest
®
e Aquafresh
®
) observando-se somente a produção de MMP-9 e não
de MMP-2. De acordo com Schonbeck et al. (1998), a produção de MMP-9
em fibroblastos orais pode ser mediada pela interleucina-1β. Desta forma,
sugere-se que a produção de MMP-9 pelos fibroblastos estimulados por NaF
pode ser mediada pela presença de algumas citocinas liberadas durante
esse estímulo.
A produção de metaloproteinase-2 pelos fibroblastos orais durante a
periodontite pode ser inibida pela presença de TGF-β no local da
inflamação (CHANG et al., 2002). Desta forma, pode-se sugerir que o NaF
pode induzir a produção de TGF-β, causando a inibição da expressão
MMP-2, justificando de certa forma o resultado encontrado.
Sabendo que o NaF foi capaz de ativar os fibroblastos gengivais a
expressarem MMP-9, e que a concentração de 20 µg F/mL pode ser
observada no tecido da mucosa oral quando se faz uso contínuo de
dentifrícios fluoretados com concentrações de 1.500 µg F/mL (JACOBSON
et al., 1992) utilizados na prevenção da cárie, é sugerida a utilização de
produtos fluoretados com baixas concentrações de flúor, principalmente
quando esses produtos são destinados ao uso infantil, para evitar possíveis
danos ao tecido gengival e retardo na cicatrização durante a doença
periodontal.
70
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
Com base em dados de literatura, sabe-se que a quimiocina
CCL3/MIP-1α participa tanto da fase aguda como da crônica no processo
inflamatório desempenhando um importante papel na ativação e
recrutamento de células pró-inflamatórias, como leucócitos, eosinófilos e
neutrófilos (BONECCHI et al., 1999). Essa quimiocina também é encontrada
durante a inflamação do tecido gengival com doença periodontal (JOHN;
LUKACS, 2003). Desta forma, investigou-se a possibilidade do NaF induzir os
fibroblastos gengivais a produzirem essa quimiocina.
Os dados do presente estudo demonstram que o NaF induziu os
fibroblastos gengivais a produzirem CCL-3/MIP-1α somente na
concentração de 20 µg F/mL. Essa produção diminuiu após o tempo de 24
horas, provavelmente em razão do início da morte celular. Sabe-se que o
NaF é capaz de induzir a composição de células epiteliais da mucosa e de
fibroblastos orais a produzirem interleucina-6 e interleucina-8, citocinas essas
envolvidas no processo inflamatório no qual também são capazes de atrair
neutrófilos (MOSTEFAOUI et al., 2002). Até o presente, não há relatos sobre
os efeitos do NaF em relação à produção da quimiocina CCL3/MIP-1α e da
expressão de MMP-9 por fibroblastos gengivais. Desta forma, os dados
deste estudo sugerem que o NaF na concentração de 20 µg F/mL pode
induzir uma degradação no tecido gengival em função da produção
excessiva de MMP-9 e induzir também uma resposta inflamatória mediada
pela quimiocina CCL3/MIP-1α.
Durante a doença periodontal níveis elevados de óxido nítrico (NO)
são encontrados no tecido gengival em decorrência do biofilme
71
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
bacteriano (PAQUETTE; WILLIAMS, 2000). Sabe-se que o óxido nítrico (NO), é
um gás solúvel produzido por células endoteliais, macrófagos, neurônios
(COLLINS, 2000) e fibroblastos (UGAR-ÇANKAL; OZMERIC, 2006) que
desempenha uma importante função na regulação vascular, redução da
agregação e aderência plaquetária, servindo como regulador do
recrutamento de leucócitos durante o processo inflamatório (COLLINS,
2000). A síntese de NO ocorre a partir da L-arginina através da enzima óxido
nítrico-sintase (MACMICKING et al., 1997; FANG, 1997). Sua inibição pode
ocorrer na presença da arginase que compete com a L-arginina para
utilizar o mesmo substrato (UGAR-ÇANKAL; OZMERIC, 2006). Desta forma,
avaliou-se também a produção de óxido nítrico (NO) nos fibroblastos
gengivais estimulados com NaF. Observou-se que esse estímulo não foi
capaz de induzir a produção de NO pelos fibroblastos gengivais, sendo
assim, sugerindo que o NaF pode ser capaz de induzir nesses fibroblastos a
produção de arginase, com isso ocasionando o bloqueio da síntese de NO,
ou que o mecanismo de ativação desses fibroblastos, estimulados pelo
NaF, seja independente do NO.
Sabendo que NaF foi capaz de ativar os fibroblastos gengivais
normais a expressarem MMP-9 e produzirem CCL3/MIP-1α, avaliou-se a
capacidade desse sal em ativar os fibroblastos gengivais a expressarem
MMP-9 e produzirem CCL-3/MIP-1α na presença de LPS. Para tanto
utilizamos o LPS (lipopolissacarídeo) de Escherichia coli com o intuito de
mimetizar o processo inflamatório nos fibroblastos gengivais avaliando os
efeitos do NaF em um fibroblasto já ativado. Os dados demonstram que o
72
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
NaF foi capaz de induzir a expressão de MMP-9 nos fibroblastos com LPS, no
entanto, conforme observado anteriormente, a produção de MMP-2 não
foi visualizada. Observou-se que a expressão de MMP-9 nesses fibroblastos
foi mais intensa quando comparada à expressão dos fibroblastos
estimulados somente com NaF ou somente com LPS. Sugere-se que essa
intensa expressão de MMP-9 induzida por NaF pelos fibroblastos na
presença de LPS, pode estar relacionada com um possível sinergismo no
qual outras citocinas podem ser liberadas, potencializando o efeito final.
Dados de literatura mostram que o LPS é capaz de induzir fibroblastos orais
a produzirem MMP-9 (BODET et al., 2007), entretanto, atualmente não há
relato mostrando que o NaF pode potencializar a expressão de MMP-9 em
fibroblastos gengivais ativados pelo LPS. Semelhantemente ao observado
anteriormente, a expressão de MMP-2 não foi visualizada.
Com base nos resultados obtidos é sugerido que a presença de LPS
pode potencializar a expressão de MMP-9 no processo inflamatório em
tecido gengival. Desta forma, pode-se sugerir que um indivíduo que tenha
doença periodontal e que faz uso de produtos fluoretados cronicamente,
em altas concentrações, pode sofrer um aumento na destruição tecidual
com possível retardo no processo cicatricial.
Já que foi observado em nosso estudo que o NaF foi capaz de ativar
os fibroblastos gengivais de camundongos a produzirem CCL3/MIP-1α,
decidiu-se avaliar também a produção desta quimiocina em fibroblastos
gengivais ativados pelo LPS. Os dados mostraram que o NaF intensificou a
produção da quimiocina CCL-3/MIP-1α nesses fibroblastos ativados pelo
73
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
LPS. Conforme observado na expressão de MMP-9, sugerindo que nesse
caso também possa estar ocorrendo sinergismo durante a exacerbada
produção de CCL-3/MIP-1α, sugerindo também que durante a doença
periodontal o NaF pode promover um aumento na resposta inflamatória
justamente pela produção excessiva de CCL-3/MIP-1α, já que essa
quimiocina desempenha um importante papel na ativação e
recrutamento de leucócitos ao local da inflamação. No entanto, não
existem relatos na literatura que demonstrem essa intensificação da
produção dessa quimiocina em fibroblastos gengivais ativados LPS e
estimulados por NaF.
Visto que o NaF foi capaz de ativar os fibroblastos gengivais a
expressarem MMP-9 e a produzirem CCL3/MIP-1α tanto na ausência quanto
na presença de LPS, decidiu-se investigar qual via de sinalização estaria
envolvida durante a expressão e produção das respectivas substâncias.
A transdução de sinal das MAPK (p38 e p44/42) vendo sendo
estudada devido a sua participação em inúmeras funções celulares (LEWIS
et al., 1998). Sabe-se que a ERK1/2 (p44/42) está envolvido na ativação da
proliferação e diferenciação celular e o p38 MAPK envolvida na apoptose
e em respostas mediadas por estresse (HERLAAR; BROWN, 1999). O pré-
tratamento dos fibroblastos gengivais com inibidores específicos da MAPK –
proteína quinase ativadora de mitógeno- (ERK1/2 e p38) foi utilizado como
ferramenta farmacológica. Observou-se que o inibidor específico da
proteína quinase ativadora de mitógeno p44/42 (PD 98059) foi capaz de
inibir a expressão de MMP-9 em fibroblastos na presença ou ausência de
74
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
LPS quando estimulados com NaF. Esses dados sugerem que NaF sozinho ou
na presença de LPS foi capaz de ativar os fibroblastos gengivais a
expressarem MMP-9 via p44/42. Corroborando nossos dados, resultados
obtidos por outros autores mostram que a ativação da ERK 1/2 pode estar
envolvida na produção de MMP-9 (LAI et al., 2003), no entanto, não há
relatos na literatura sobre a ativação de fibroblastos gengivais para
expressarem MMP-9 na presença ou ausência de LPS estimulados por NaF,
o que nos leva a concluir que este trabalho seja o primeiro a realizar este
tipo de estudo.
Outra via de sinalização importante envolvida no processo
inflamatório é a p38 MAPK. Avaliou-se a participação dessa via de
sinalização também sobre a expressão de MMP-9 pelos fibroblastos
gengivais estimulados somente por NaF ou na presença de LPS. Observou-
se que a inibição da expressão MMP-9 nesses fibroblastos após a utilização
do inibidor específico da p38 MAPK (SB 202190) não ocorreu. Esses dados
sugerem que a expressão de MMP-9 pelos fibroblastos gengivais
estimulados pelo NaF não é ativada por essa via, possivelmente porque a
via de sinalização p38 MAPK é responsável principalmente pela produção
e ativação de algumas citocinas como a interleucina-4 (FOLTZ et al., 1997),
alguns mediadores inflamatórios como, por exemplo, aminas vaso-ativas e
metabólitos do ácido araquidônico (prostaglandinas e leucotrienos)
(BARNES et al., 1998), mas não na ativação de metaloproteinases (FOLTZ et
al., 1997).
75
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
Seguindo a investigação das vias de sinalização responsáveis pela
ativação de MMP-9 induzida por NaF, pré-tratamos os fibroblastos gengivais
com o inibidor da PI3K (LY 294002). Novamente não houve inibição da
produção de MMP-9. De acordo com dados de literatura, sabe-se o PI3K é
positivamente regulado em conseqüência da ativação de receptores
tirosino-quinases, de receptores de proteína G ou integrinas (NICHOLSON;
ANDERSON, 2002). Além disso, a ativação da PI3K pode estar relacionada
principalmente com a quimiotaxia celular (WEBER et al., 1998; NOBES; HALL,
1999) e com a produção de citocinas e quimiocinas, como por exemplo,
CCL3/MIP-1α (FINE et al., 2001). Assim como a via de sinalização p38,
sugere-se também que a via PI3K não seja responsável pela ativação da
MMP-9.
Quando os fibroblastos gengivais foram pré-tratados com
dexametasona (inibidor da NF-кB) e estimulados por NaF na ausência ou
presença de LPS, observa-se resultados semelhantes ao pré-tratamento
com o inibidor PD98053. É sabido que a via de sinalização intracelular NF-кB
é ativada principalmente por receptores encontrados em patógenos
conhecidos pela indução da doença periodontal cuja ligação é
ocasionada por produtos sintetizados por esses microorganismos como, por
exemplo, o LPS. Essa ativação é responsável por desencadear uma
resposta inflamatória induzindo a liberação de citocinas ou quimiocina e
enzimas destrutivas (MORI et al., 2003; KUSUMOTO et al., 2004; REN et al.,
2005).
76
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
Sabe-se que a ativação de MMP-9 é regulada pela via de
sinalização NF-кB. Assim a inibição dessa via provoca também a inibição
da produção de MMP-9 (EBERHARDT et al., 2002). Estudos recentes mostram
que a inibição da expressão de MMP-9 por meio da dexametasona ocorre
em vários tipos celulares incluindo células da mucosa oral (KYLMANIEMI et
al., 1996). De acordo com Eberhardt et al. (2002), reduzindo a IL-1β indutora
de MMP-9 com glicocorticóides pode haver inibição da expressão gênica
de MMP-9, isso porque a regulação dessa expressão ativada por IL-1β é
dependente da ativação de NF-кB. (YOKOO; KITAMURA, 1996; EBERHARDT
et al., 2000). Desta forma, pode-se sugerir que a ativação da MMP-9 é
dependente da via de sinalização NF-кB.
Quanto à produção de CCL3/MIP-1α pelos fibroblastos gengivais
estimulados por NaF na presença ou ausência de LPS, foi observada uma
inibição na produção dessa quimiocina por todos os inibidores utilizados no
presente estudo. Em estudos realizados por Fine et al. (2001) mostram que a
liberação de CCL3/MIP-1α em monócitos pode estar relacionada com a
via de sinalização da PI3K. A quimiocina CCL3/MIP-1α também é ativada
via p38 (WANG et al., 1999), via p44/42 (YEN et al., 1997) e via NF-кB (HELD
et al., 2001). Os resultados desses estudos corroboram a presente pesquisa.
Com base no presente estudo sugere-se que os inibidores: PD98053,
SB202190, LY294002 e dexametasona, promoveram a inibição da
quimiocina CCL-3/MIP-1α induzida por fibroblastos gengivais por NaF
indicando a dependência das vias p44/42, p38, PI3K e NF-кB na produção
de CCL3/MIP-1α.
77
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
Concluindo, nossos dados mostram que NaF foi capaz de ativar
fibroblastos gengivais a expressarem metaloproteinase-9 via p44/42 e via
NF-КB. Esse estímulo, também promoveu nos fibroblastos gengivais a
produção da quimiocina CCL3/MIP-1α ativada pelas vias de sinalização
p44/42, p38, PI3K e NF-кB. Com isso, pode-se sugerir que o bloqueio dessas
vias responsáveis pela ativação da metaloproteinase-9 e da quimiocina
CCL-3/MIP-1α pode ser utilizada como uma ferramenta terapêutica
durante uma possível resposta inflamatória ocasionada pelo uso crônico e
excessivo de NaF.
Tomados em conjunto, os resultados do presente estudo sugerem que
o emprego do NaF em altas concentrações, além de possibilitar o
desenvolvimento de fluorose dental, pode também causar alteração no
tecido gengival. Essa alteração pode ser mais intensa quando o indivíduo
apresenta inflamação gengival ocasionada pelo acúmulo de biofime.
Portanto, sugerimos a utilização de produtos fluoretados em baixas
concentrações é mais segura, possuindo eficácia comprovada, sem a
desvantagem de causar possíveis danos ao tecido gengival.
Conclusão
79
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
6 CONCLUSÃO
Ao investigar os mecanismos envolvidos na ativação intracelular para a
expressão de MMP-2 e MMP-9 e expressão e produção de CCL3/MIP-1α nos
fibroblastos gengivais estimulados por NaF na ausência ou presença de LPS,
concluímos que:
• O efeito citotóxico do NaF ocorre de maneira dose e tempo-
dependente nos fibroblastos gengivais em cultura na concentração
de 20 µg/mL;
• O NaF (20 µg/mL) foi capaz de ativar os fibroblastos gengivais em
cultura na presença ou ausência de LPS a expressarem MMP-9, mas
não MMP-2, via p44/42 e via NF-кB;
• O NaF (20 µg/mL) promoveu a ativação dos fibroblastos gengivais em
cultura na presença ou ausência de LPS a expressarem e produzirem
CCL3/MIP-1α; via p44/42, p38 MAPK, PI3K e NF-кB;
• Na presença de LPS, os fibroblastos gengivais em cultura estimulados
por NaF tiveram uma potencialização na expressão de MMP-9;
• Na presença de LPS, os fibroblastos gengivais em cultura estimulados
por NaF tiveram uma potencialização na expressão e produção de
CCL3/MIP-1α.
Referências
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E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
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Anexos
88
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
ANEXO A
89
E studo da expressão de M M P-2 e M M P -9 por N aF
G ilberto Carlos Tiano
ANEXO B
SOLUÇÕES
SOLUÇÕESSOLUÇÕES
SOLUÇÕES
1 TAMPÃO SALINA-FOSFATO (PBS)
Cloreto de sódio P.A. (MERCK)------------------------------------------8,0g
Cloreto de potássio P.A. (MERCK)--------------------------------------0,2g
Fosfato de sódio dibásico P.A. (MERCK)----------------------------1,15g
Fosfato de potássio monobásico P.A. (MERCK)--------------------0,2g
Água deionizada Mili-Q q.s.p-----------------------------------------------1 L
O pH foi ajustado para 7,2 com NaOH ou HCl e a solução autoclavada antes de ser
utilizada.
2 MEIO DE EAGLE MODIFICADO POR DULBECO (DMEM) Completo
Bicarbonato de sódio P.A. (Merck)--------------------------------------3,7 g
Água deionizada Mili-Q q.s.p------------------------------------------------1 L
Meio de Eagle Modificado por Dulbeco-----------------------------------
Soro fetal bovino (Sigma)-----------------------------------------------150 mL
Penicilina/Streptomicina (Sigma)---------------------------------------10 mL
Gentamicina-------------------------------------------------------------------1 mL
Fungisone--------------------------------------------------------------------0,3 mL
Glutamina--------------------------------------------------------------------20 mL
O pH foi ajustado para 7,2 o meio filtrado em milipore 0,22 µm e mantido a 4
0
C.
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