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WALCLÉCIO MORAIS LIRA
Avaliação do potencial mutagênico e antimutagênico de
extratos e compostos vegetais obtidos a partir dos gêneros
Byrsonima e Davilla
Araraquara – SP
2007
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WALCLÉCIO MORAIS LIRA
Avaliação do potencial mutagênico e
antimutagênico de extratos e compostos vegetais
obtidos a partir dos gêneros Byrsonima e Davilla
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Análises Clínicas da Faculdade
de Ciências Farmacêuticas de Araraquara,
como requisito parcial para a obtenção do
Título de Doutor.
Orientadora: Profª Drª Eliana Aparecida Varanda
Araraquara – SP
2007
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Banca Examinadora
Profa. Dra. Eliana Aparecida Varanda
Profa. Dra. Clarice Queico Fujimura Leite
Profa. Dra. Ilce Mara de Syllos Colus
Prof. Dr. Edson Luis Maistro
Profa. Dra. Soraya Duarte Varella
À minha esposa Janaína, pelo carinho, apoio e compreensão
em todos os momentos.
Aos meus filhos Gabriel e Igor, pela alegria e pela força que
trouxeram ao meu viver, dando a minha vida um objetivo.
Aos meus pais, José e Matildes, pelos ensinamentos, eterno
carinho e amor, e pelo grande incentivo aos meus sonhos.
Às minhas irmãs Leomara, Walcléia e Walclécia, pelo amor e
pela amizade sempre constante.
Ao meu sobrinho Bruno Aloísio Amâncio Lucena, por nossas
conversas, apoio, socorro quando precisava de ajuda,
sempre aí disposto a ajudar.
AGRADECIMENTOS
À DEUS, meu grande companheiro.
À Profª Drª Eliana Aparecida Varanda, pelas oportunidades,
confiança e imensa contribuição para o meu crescimento
científico.
À Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP, em especial
ao Departamento de Ciências Biológicas, onde foi realizada toda
parte experimental deste trabalho.
À amiga Profª Drª Denise Crispim Tavares Barbosa, que ao
longo dos anos tornou-se peça fundamental para o meu
desenvolvimento científico, moral e acadêmico.
À amiga Soraya Varella, pelos ensinamentos, apoio, disposição,
incentivo e paciência, sempre constantes. Pelo mais importante
de tudo isso, sua amizade. Nós sabemos que, com certeza, não
ocorreu por acaso, serei eternamente grato.
Ao meu amigo Fábio Vieira dos Santos, pelos ensinamentos,
constantes, ajuda e parcerias em congressos. Acima de tudo pela
sua amizade.
Aos amigos Adolfo Barreto, Ana Carolina Malaspina, que sempre
estiveram ao meu lado dando força e me ajudando se medir
esforços, contem sempre comigo.
Aos amigos Karina de Prince, Fernando Pavan, Faber Johanser
e José Rodrigo Pandolfi, que juntamente com o Adolfo e a Carol,
após a saída dos meus amigos e companheiros de laboratório, me
adotaram no dia-a-dia em seu laboratório. Nossos cafés,
almoços... saudades.
À Profª Drª Clarice Queico Fujimura Leite, pela atenção,
disponibilidade e contribuição para este trabalho.
Ao meu amigo Carlos Henrique Lopes Martins pelo apoio e
longas conversas sempre de muito proveito.
Às colegas de laboratório Fabiana, Ana Paula, Mari, Vanessa,
Cássia, Néia e Marisa.
À amiga Silvia, pelas conversas sempre proveitosas, pelo carinho
e amizade.
Às secretárias da seção de pós-graduação, Laura, Sônia e
Claudia pela paciência, atenção e ajuda.
Ao Prof. Dr. Wagner Villegas, á Miriam, Juliana e todos os
alunos de graduação e pós graduação do laboratório de química
orgânica do instituto de química da UNESP-Araraquara
À FAPESP e CNPq pelo apoio financeiro.
"Sei que meu trabalho é uma gota no oceano. Mas sem
ele, o oceano seria menor…"
Madre Teresa de Calcutá
RESUMO
A investigação das plantas baseada na medicina popular tem sido intensificada com o
objetivo de obter-se novas drogas capazes de promover a cura de algumas
enfermidades, ou até mesmo prevenir a ação de componentes tóxicos presentes em
medicamentos, alimentos e bebidas. Portanto, esta busca em sua grande maioria tem
como base a biodiversidade dos diferentes tipos de vegetações existentes no mundo.
Neste estudo foram avaliados extratos vegetais que têm sido utilizados na medicina
popular. Para tanto, foram realizados ensaios in vitro (teste de Ames) e in vivo
(micronúcleo), com a finalidade de avaliar o possível potencial antimutagênico de
algumas espécies pertencentes aos gêneros Byrsonima e Davilla. Foi verificado os
potenciais mutagênicos e antimutagênico dos extratos MeOH (metanólico) e CHCl
3
(clorofórmico)
de Byrsonima basiloba, CHCl
3
de
Byrsonima crassa e CHCl
3
de Davilla
ellyptica. A verificação do possível potencial antimutagênico através dos testes de Ames
e micronúcleo destes extratos mostrou que todos foram capazes de reduzir a atividade
mutagênica da Aflatoxina B
1
(AFB
1
), Benzo[a]pireno (B[a]P), Peróxido de Hidrogênio
(H
2
O
2
), 4-o-nitrofenilenodiamina (NPD), Azida Sódica (AZS) e Mitomicina (MC),
quando testados frente às linhagens TA97a, TA98, TA100, TA102. Os melhores índices
de redução no número de colônias revertentes foram obtidos na linhagem TA98 com os
extratos CHCl
3
de B. basiloba (95,29%) e CHCl
3
de D. ellyptica (94,9%) frente ao
potencial do B[a]P. Para o teste de micronúcleos o melhor resultado foi obtido com o
extrato CHCl
3
de B. basiloba (56%).Verificou-se também que quando utilizado a
técnica de micronúcleo a resposta foi positiva contra o potencial da ciclofosfamida na
concentração de 83,25mg/kg. Os testes realizados com as substâncias puras (Ác. gálico,
Quercetina-3-o-α-L-raminopiranosídeo, Quercetina, Miricetina-3-o-α- L-
raminopiranosídeo, Galato de metila, (+)catequina e Lupeol) demonstraram que apenas
a quercetina foi mutagênica.
ABSTRACT
The investigation of the plants based in the popular medicine has been
intensified with the aim to obtain new capable drugs to promote cures of some
illnesses, or even to prevent the action of present toxic components in medicines, foods
and beverages. So, this search in its big majority has as its basis the biodiversity of the
different kinds of existing vegetations in the world. In this study, some vegetables
extracts that have been used in the popular medicine were evaluated. For that, in vitro
(Ames test) and in vivo (micronucleus) tests were realized, with the purpose of
evaluating the possible mutagenic and antimutagenic potential of some species
belonging to the kinds Byrsonima and Davilla. The mutagenic and antimutagenic
potentials from extracts MeOH (metanolic) and CHCl3 (cloroformic) of Byrsonima
basiloba, CHCl3 of Byrsonima crass and CHCl
3
of Davilla ellyptica were verified. The
verification of the possible antimutagenic and mutagenic potentials through the Ames
test and micronucleus of these extracts, showed that all of them were capable of
reducing the mutagenic activity of the AflatoxinB1 (AFB1), Benzo[a]pyrene (B[a]P),
Peroxide of Hydrogen (H2O2), 4-the-nitrophenylenodiamin (NPD), Azid Sodic (AZS)
and Mitomicin (MC), when tested in face of the lineages TA97a, TA98, TA100,
TA102. The mutagenicity tests showed that none of the extracts presented mutagenic
activity. The best indexes of reduction in the number of revertents colonies were
obtained in the lineage TA98 with the extracts CHCl3 of B. crassa (95%) and CHCl3 of
D. ellyptica (95%) facing the potential of the B[a]P. For the micronucleus test the best
result was obtained with the extract CHCl3 of D. elliptica (51%). Also, it was verified
that when the technique of micronucleus was used the answer was positive against the
potential of the ciclophosfamide in the concentration of 83.25mg/kg. The tests realized
with the pure substances (Ác. Galic, Quercetin-3-o-α-L-haminopiranosid, Quercetin,
Miricetin-3-o-α- L-haminopiranosid, Galato de metila, (+)catequin e Lupeol) showed
that just the quercetin was mutagenic.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA
DESCRIÇÃO
PÁGINAS
FIGURA 1.
Mapa de Biomas do Brasil.....................................................................................
3
FIGURA 2.
Caule Byrsonima sp……………………………………………………………
11
FIGURA 3.
Florescência de Byrsonima sp………………………………………………….
11
FIGURA 4.
folhas de Davilla sp………………………………………………………………….....
13
FIGURA 5.
Frutos de Davilla sp…………………………………………………………………....
13
FIGURA 6.
Percentual de inibição do extrato MeOH de B. basiloba ......................................
47
FIGURA 7.
Percentual de inibição do extrato MeOH de B. basiloba ......................................
47
FIGURA 8.
Percentual de inibição do extrato MeOH de B. basiloba.....................................
48
FIGURA 9.
Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. basiloba ......................................
52
FIGURA 10.
Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. basiloba.......................................
52
FIGURA 11.
Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. basiloba.......................................
53
FIGURA 12.
Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. basiloba.......................................
53
FIGURA 13.
Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. crassa...........................................
58
FIGURA 14.
Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. crassa...........................................
58
FIGURA 15.
Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. crassa ..........................................
59
FIGURA 16.
Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. crassa...........................................
59
FIGURA 17.
Razões de mutagenicidade (RM)...........................................................................
62
FIGURA 18.
Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de D. elliptica.......................................
66
FIGURA 19.
Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de D. elliptica.......................................
66
FIGURA 20.
Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de D. elliptica.......................................
67
FIGURA 21.
Percentual de inibição do extrato CHCl3 de D. elliptica ......................................
67
FIGURA 22.
Médias do número de micronúcleo por grupo de tratamento. Extrato MeOH de
Byrsonima basiloba................................................................................................
74
FIGURA 23.
Médias do número de micronúcleo por grupo de tratamento. Extrato CHCl
3
de
Byrsonima basiloba................................................................................................
74
FIGURA 24.
Médias do número de micronúcleo por grupo de tratamento; Extrato CHCl
3
de
Byrsonima crassa...................................................................................................
75
FIGURA 25.
Médias do número de micronúcleo por grupo de tratamento – Extrato CHCl
3
de
Davilla elliptica .....................................................................................................
75
FIGURA 26.
Foto do gel do teste mutagênico das substâncias puras isoladas dos extratos. na
concentração de 0,9mg/mL....................................................................................
81
FIGURA 27.
Percentual de quebras. Controles positivos, negativos e tratamento associados
controle positivo + compostos (0,9mg/mL e 0,45mg/ml).....................................
82
FIGURA 28.
Gel do teste antimutagênico das substâncias puras isoladas dos extratos na
concentração de 0,9mg/mL....................................................................................
83
FIGURA 29
Gel do teste mutagênico das substâncias pura isoladas dos extratos na
concentração de 0,45mg/mL..................................................................................
84
LISTA DE TABELAS
TABELA
DESCRIÇÃO
PÁG.
TABELA 1.
Atividade antimutagênica do extrato MeOH de B. basiloba ..............................................................
45
TABELA 2.
Atividade antimutagênica do extrato MeOH de B. basiloba ..............................................................
46
TABELA 3.
Perfil fitoquímico do extrato MeOH de B. basiloba ..........................................................................
48
TABELA 4.
Atividade antimutagênica do extrato CHCl
3
de B. basiloba frente a compostos mutagênicos
diretos, utilizando. ..............................................................................................................................
50
TABELA 5.
Atividade antimutagênica do extrato CHCl
3
de B. basiloba frente a compostos mutagênicos
indiretos...............................................................................................................................................
51
TABELA 6.
Perfil fitoquímico do extrato clorofórmico de B basiloba..................................................................
54
TABELA 7
Atividade antimutagênica do extrato CHCl
3
B. crassa frente a compostos mutagênicos diretos.......
56
TABELA 8
Atividade antimutagênica do extrato CHCl
3
de B. crassa frente a compostos mutagênicos
indiretos, utilizando.............................................................................................................................
57
TABELA 9
Perfil fitoquímico do extrato clorofórmico de B. crassa.....................................................................
60
TABELA 10
Atividade mutagênica do extrato CHCL
3
da planta Davilla elliptica em ausência e presença de
ativação metabólica............................................................................................................................
61
TABELA 11
Atividade antimutagênica o do extrato CHCl
3
de Davilla eliyptica frente a compostos mutagênicos
diretos...................................................................................................................................................
64
TABELA 12
Atividade antimutagênica do extrato CHCl
3
de Davilla elliptica frente a compostos mutagênicos
indiretos................................................................................................................................................
65
TABELA 13
Perfil fitoquímico do extrato clorofórmico de D. elliptica..................................................................
68
TABELA 14
Número de células micronucleadas por animal...................................................................................
69
TABELA 15
Avaliação antimutagênica dos extratos através do teste de micronúcleo em células de sangue
periférico de camundongos tratados com ciclofosfamida....................................................................
72
TABELA 16
Índices de redução do número de micronúcleos obtidos com os extratos testados.............................
73
TABELA 17
Atividade mutagênica das substâncias isoladas dos extratos...............................................................
77
TABELA 18
Atividade antimutagênica dos compostos isolado frente à mutágenos diretos e indiretos, utilizando
a linhagem TA98 de S. typhimurium...................................................................................................
79
ABREVIAÇÕES UTILIZADAS
ºC
Graus Celsius
CE
Cloreto de Estanho
µg
Micrograma
µL
Microlitro
DNA
Ácido desoxirribonucléico
EDTA
Ácido etilenodiaminotetracético
SEM
Etilmetanossulfonato
LB
Meio Luria-Bertani
mL
Mililitro
mM
Milimolar
pH
Potencial de hidrogênio
TAE
Tris-acetato-EDTA
TE
Tris/EDTA
Tris
Tris (hydroxymethyl)aminomethane
+S9
Com Ativação Metabólica
-S9
Sem Ativação Metabólica
AMG
Agar Mínimo Glisosado
ANOVA
Análise de Variância
AO
Acridine Orange
Ctrol-
Controle Negativo
Ctrol+
Controle Positivo
MeOH
Metanólico
MN
Micronúcleo
MNRET
Reticulócito Micronucleado
p.c
Peso Corpóreo
RM
Razão de Mutagenicidade
RNA
Ácido Ribonucléico
UV
Ultra-Violeta
CHCl3
Clorofórmico
Capítulo I
SUMÁRIO
Capítulo I
PAG
.
1.INTRODUÇÃO..........................................................................................................................
1
1.1 Cerrado brasileiro........................................................................................................................
2
1.1.1 Cerrado.......................................................................................................................................
3
1.1.2 O cerrado e as plantas medicinais..............................................................................................
4
1.2 Plantas da família Malpighiaceae................................................................................................
9
1.2.1 Gênero Byrsonima.......................................................................................................................
10
1.3 Família Dilleniaceae.....................................................................................................................
11
1.3.1 Gênero Davilla............................................................................................................................
12
1.4 Mutagênese e antimutagênese.....................................................................................................
13
1.4.1 Sistemas-teste para Avaliação de Mutagenicidade/Antimutagenicidade....................................
17
1.4.1.1 Teste de Ames...........................................................................................................................
17
1.4.1.2 Micronúcleo............................................................................................................................
18
1.4.1.3 Danos no DNA Plasmidial.......................................................................................................
20
2. OBJETIVOS................................................................................................................................
23
2.1 Objetivos Gerais...........................................................................................................................
24
2.2 Objetivos Específicos....................................................................................................................
24
3. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................................
25
3.1 Material vegetal...........................................................................................................................
26
3.2 Obtenção de Extratos e substâncias...........................................................................................
27
3.2.1 Obtenção de substâncias puras................................................................................................
28
3.3 Concentrações utilizadas............................................................................................................
28
3.3.1 Extratos.....................................................................................................................................
28
3.3.2 Substâncias puras......................................................................................................................
29
3.4 Avaliação da antimutagenicidade e mutagenicidade................................................................
29
3.4.1 Teste de Ames............................................................................................................................
29
3.4.1.1 Linhagens utilizadas...............................................................................................................
29
3.4.1.2 Manutenção e estoque das cepas de Salmonella typhimurium............................................
30
3.4.1.3 Verificação das características genéticas das cepas de S. typhimurium.............................
30
3.4.1.4 Taxa de reversão espontânea...............................................................................................
31
3.4.1.5 Preparo do inóculo de S. typhimurium utilizados no ensaio...............................................
31
3.4.1.6 Controles.................................................................................................................................
31
3.4.1.7 Ensaios de mutagenicidade....................................................................................................
32
3.4.1.8 Ensaios de antimutagenicidade.............................................................................................
32
3.4.1.9 Teste de viabilidade................................................................................................................
33
3.5 Teste de micronúcleo....................................................................................................
34
3.5.1 Animais.......................................................................................................................................
34
3.5.2 Preparo das lâminas com Acridine Orange............................................................................
35
3.5.3 Obtenção do sangue e preparo das células..............................................................................
35
3.5.4 Ensaio de antimutagenicidade..................................................................................................
35
3.5.5 Ensaio de mutagenicidade........................................................................................................
37
3.5.6 Análise Estatística dos Resultados...........................................................................................
38
3.6 Teste do plasmídeo.................................................................................................................
38
3.6.1 Procedimento ............................................................................................................................
39
3.6.2 Isolamento do plasmídeo..........................................................................................................
39
3.6.3 Quantificação do DNA plasmidial extraído............................................................................
39
3.6.4 Tratamento do DNA plasmidial...............................................................................................
40
3.6.5 Análise dos resultados...............................................................................................................
40
4. RESULTADOS...........................................................................................................................
42
4.1 Teste de Ames.......................................................................................................................
43
4.1.1 Byrsonima basiloba............................................................................................................
43
4.1.2 Byrsonima crassa………………………………………………………………………………...
54
4.1.3 Davilla ellyptica..................................................................................................................
60
4.2 Teste do micronúcleo.............................................................................................................
69
4.2.1 Mutagenicidade..................................................................................................................
69
4.2.2 Antimutagenicidade..........................................................................................................
70
4.3 Substâncias Isoladas.............................................................................................................
76
4.3.1 Teste de Ames......................................................................................................................
77
4.3.2 Teste do Plasmídeo.............................................................................................................
80
5. DISCUSSÃO.......................................................................................................................
85
5.1- Extratos ...............................................................................................................................
86
5.2 Substâncias Isoladas.............................................................................................................
96
6 CONCLUSÕES.................................................................................................................
106
7 REFERÊNCIAS.................................................................................................................
114
Capítulo II
1. ARTIGO PUBLICADO..........................................................................................
136
1. INTRODUÇÃO
1.1 Cerrado brasileiro
É fato que o Brasil possui umas das maiores biodiversidades do mundo,
graças ao tamanho e localização do seu território, quinto maior do planeta. Ocupa uma
área de 8.511.965 Km
2
, distribuída desde aproximadamente 5°N a 34°S entre o equador
e o trópico de capricórnio. Por estar próximo ao equador, apresenta uma grande
variedade climática. Embora o clima predominante no Brasil seja o equatorial, também
se pode encontrar tropical úmido, tropical típico ou semi-úmido, semi-árido e
subtropical (JUNIOR, 2006).
Devido à sua extensão, o Brasil apresenta diferentes biomas,
precisamente seis, sendo que o bioma Amazônia é o maior, com aproximadamente
4.196.943km
2
, o que equivale a 49,9% da área total do território brasileiro; seguido pelo
bioma Cerrado com 2.036.448km
2
o que representa 23,92% da área total do Brasil. O
bioma Mata Atlântica com 1.110.182km
2
é o terceiro maior, sua área ocupada
representa 13,04% do território nacional. A Caatinga, com apenas 9,92% do território
brasileiro, ocupa 844.453km
2
e vem seguida pelo bioma Pampa com 176.496km2 que
representa 2,07% e Pantanal com 150.355km
2
correspondente a 1,76% que são os
menores do país (Figura 1- IBGE, 2004).
Figura 1: Mapa de Biomas do Brasil.
Fonte: IBGE, 2004.
O Brasil apresenta várias formações vegetais devido às diversidades no
clima e extensão territorial. Os principais tipos de vegetação encontrados no Brasil são:
Floresta Amazônica, Floresta Latifoliada Tropical, Mata de Araucárias ou Pinhais, Mata
dos Cocais, Caatinga, Cerrado, Complexo do Pantanal, Campos Naturais e Vegetação
Litorânea. Dentre essas destacamos o Cerrado.
1.1.1 Cerrado
O termo cerrado é comumente utilizado para designar o conjunto de
ecossistemas compostos por matas, savana campos e matas de galerias que ocorrem no
Brasil central (EITEN, 1977; RIBEIRO et al., 1981).
O cerrado brasileiro ocupava uma área de aproximadamente dois milhões
de km
2
há seis mil anos, tamanho esse que varia de acordo com a inclusão ou não de
áreas de transição presentes nas extremidades da área central deste bioma (MACHADO,
2004).
Cerca de 50% de toda área do cerrado já foi transformada pela ação do
homem em pastagem ou em áreas de culturas anuais como o cultivo da soja e
gramíneas, principalmente as de origem africana, que hoje ocupam uma área
equivalente à área territorial da Espanha (KLINK e MACHADO, 2005).
O cerrado apresenta cerca de 7.000 espécies vegetais entre plantas
herbáceas, arbustivas, arbóreas e cipós (MENDONÇA et al., 1998). Esta diversidade
está dividida em uma fito fisionomia, composta desde formas campestres abertas como
o campo limpo de cerrado até às formas densas como o cerradão.
1.1.2 O cerrado e as plantas medicinais
O uso de plantas medicinais é uma das mais antigas práticas realizadas
pelo homem, sendo, ainda hoje, muito difundida em todo o mundo. De acordo com a
Organização Mundial da Saúde, cerca de 80% da população mundial faz uso de
tratamentos ou medicamentos sugeridos pela chamada medicina popular (CRAGG et
al., 1995 apud BASSO et al., 2005).
Existe uma vasta fonte de informações, nas culturas antigas, acerca de
plantas com potencial farmacológico e estudos científicos estão sendo desenvolvidos,
para comprovação da eficiência e a eficácia dessas plantas e formulações. O cerrado,
por ser um bioma rico em espécies vegetais, vem sendo amplamente utilizado em várias
pesquisas, como fonte de material vegetal para o desenvolvimento de estudos de
comprovação do potencial farmacológico de vegetais utilizados pelas populações no
combate a enfermidades.
Em trabalho recente, Borba e Macedo (2006) avaliaram a utilização de
plantas do cerrado no combate a enfermidades bucais na comunidade de Santa Cruz,
Chapada dos Guimarães e Mato Grosso. Este trabalho foi realizado através de
entrevistas com a população local. Foram citadas 87 espécies pertencentes a 48 famílias
diferentes do bioma cerrado ou cultivado nos quintais dos entrevistados. Entre as
aplicações mais comuns, temos a utilização, para a erupção dentária, da camomila
(Matricaria chamomilla L.); para candidíases, estomatites, gengivites e afta, o açafrão
(Crocus sativus L.) e, para dor de dente, a arnica-da-serra (Brickelia brasiliensis
(Spreng.) Robinson). Pessoas idosas, líderes comunitários, parteiras e benzedeiras
entrevistadas apresentaram um maior conhecimento sobre o assunto.
No estudo realizado com 27 espécies pertencentes a oito famílias
diferentes de plantas, obtidas do cerrado brasileiro, verificou que, 32 dos 204 extratos
obtidos, cerca de 15,%, foram eficientes contra o crescimento do Plasmodium
falciparum que é o agente causador da malária (DE MESQUITA, 2007).
Austroplenckia populnea é uma planta encontrada no cerrado, conhecida
popularmente como marmelinho do campo, mangabeira-brava, mangabarana e vime,
muito utilizada pela população contra processos inflamatórios, anti-úlcera, analgésico
entre outras. Utilizando o extrato bruto, frações hexanica, clorofórmica e acetato de etila
desta planta, constatou-se que houve uma redução significativa dos processos
inflamatórios induzidos em diferentes grupos de tratamento e diferentes espécies
animais (ANDRADE, et al. 2007).
A biodiversidade vem a cada dia, sendo o foco de vários estudos
desenvolvidos pelos mais variados segmentos de pesquisas, pois, sabe-se que os
componentes encontrados na natureza podem e já estão fornecendo uma ampla
variedade de produtos de interesse médico e industrial.
É evidente que os produtos obtidos através de estudos científicos são
também de grande interesse econômico e, dentre eles, podemos destacar os fitoterápicos
e os fitofármacos.
Fitoterápicos são definidos como sendo os medicamentos originados
exclusivamente de plantas medicinais, como é o caso da sete-sangrias (Cuphea
carthagenensis), que apresenta propriedades laxativa, diurética, entre outras (DICKEL.,
et al 2007) e espinheira-santa (Maytenus ilicifolia) que é utilizada no combate a lesões
gástricas e como analgésico (TIBERT, et al. 2007).
Fitofármacos são as substâncias que foram extraídas de plantas com
atividade farmacológica que podem ser utilizadas em terapias. Como por exemplo,
temos o jaborandi (Pilocarpus spp), que fornece a pilocarpina extraída de sua folha e
que é utilizada no tratamento do glaucoma (GUERRA E NODARI in SIMÕES et al.,
2004).
Os vegetais fazem parte da vida humana desde os primórdios, sendo
utilizados na alimentação, habitação, vestuário, meios de transporte e na reabilitação da
saúde (SCHENKEL et al., in SIMÕES et al., 2004).
Os estudos com plantas medicinais tiveram uma reorientação com o início
do novo milênio principalmente devido ao surgimento de novos métodos analíticos de
alta tecnologia, os quais permitem isolar componentes presentes nas plantas mesmo que
em baixas quantidades. Além disso, favorecem o desenvolvimento de novos modelos
biológicos que permitem a triagem de compostos isolados, tanto através de testes in vivo
quanto in vitro, levando a elucidação de mecanismos de ação de extratos e compostos
isolados de vegetais (WAGNER in YUNES E FILHO, 2007).
O uso dos fitoterápicos não visa a substituição de medicamentos já
registrados e comercializados, mas tem como principal objetivo aumentar as opções
terapêuticas, e fornecendo uma terapia, mais barata e com espectro de atividade mais
direcionado que os já comercializados, ou até mesmo como medicação complementar a
medicamentos já utilizados (LAPA, et al., in SIMÕES et al., 2004).
A utilização de fitoterápicos era a terapia quase exclusiva até 1950, mas,
foram paulatinamente sendo substituídos por medicamentos contendo substâncias
extraídas dos vegetais. Outro aspecto não menos importante da utilização de
fitoterápicos é a valorização das tradições populares (LAPA, et al., in SIMÕES et al.,
2004).
Acredita-se que as plantas são tradicionalmente utilizadas no combate a
enfermidades e pragas em todos os continentes a milhares de anos e que o mercado de
fitofármacos e fitoterápicos gira em torno de U$ 9 a 11 bilhões/ano, com a utilização de
aproximadamente 13.000 plantas em todo o mundo como fármacos ou fonte de
fármacos. (TYLER, 1994).
Cerca de 40% dos medicamentos utilizados na terapia moderna tem origem
natural com aproximadamente 25% de origem vegetal, 13% de microrganismos e 3% de
origem animal. Em cinco anos nos Estados Unidos foram aprovados cerca de 200 novos
medicamentos de origem natural. Além disso, 50% dos medicamentos mais vendidos no
ano de 1998 já eram desenvolvidos a partir de produtos naturais. Quando se analisam as
drogas anticancerígenas e antimicrobianas, vemos que cerca de 70% são originados a
partir de produtos naturais (YUNE e CALIXTO, 2001).
No Brasil, o aumento na demanda de produção de plantas medicinais tem
levado a perda de qualidade. Acredita-se que aproximadamente 50% dos produtos
fitoterápicos disponíveis no mercado apresentam irregularidade que vão desde a
presença de matéria orgânica estranha até erro de identificação botânica (REIS in
SIMÕES et al., 2004).
De certa maneira a informação anterior de que 50% dos produtos
fitoterápicos vendidos no Brasil encontram-se ilegais é preocupante, pois, já é sabido
que a utilização de produtos fitoterápicos sem controle traz prejuízos a saúde do usuário.
Como exemplo, a utilização de Senna alexandrina, Aloe vera e Rhamnus
frangula como laxativos, estão relacionadas a dores abdominais e problemas cardíacos;
plantas como Areca catechu, Ephedra sinica e Paullinia cupana, utilizadas como
estimulantes estão sendo relacionadas com disfunções hepáticas, agitação, palpitações e
insônia. Além de casos de hepatotoxicidade que também são associados à utilização
destes vegetais (ELVIN-LEWIS, 2001). Além disso, a regulamentação da formulação
de medicamentos varia de acordo com a região, mas em grande parte dos países, ainda é
ineficaz. Na Europa os padrões regulatórios variam de país para país e assim não se
pode assegurar a composição exata, a eficiência ou a segurança de praticamente nenhum
medicamento derivado de plantas (ELVIN-LEWIS, 2001).
É comum encontrar entre os constituintes de extratos vegetais compostos
com ação citotóxica ou genotóxica que podem ser associados ao desenvolvimento de
tumores (AMES, 1983).
Devido a fatos como os citados acima, o desenvolvimento de novos
fármacos geralmente requer a colaboração multidisciplinar envolvendo disciplinas como
botânica, microbiologia, química, biologia molecular, genética, farmacologia,
toxicologia, entre outras (NEWMAN in YUNES E FILHO, 2007).
Por ser um processo que engloba várias disciplinas, a descoberta e
regularização de compostos envolvem várias etapas de aprovação, entre elas os testes de
citotoxicidade e genotoxicidade. Entre os vários ensaios utilizados para determinar a
mutagenicidade, temos o teste de Ames, micronúcleos que são alguns dos mais
utilizados.
No Brasil o órgão responsável pela regulamentação de novos fitoterápicos é
a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), que após consulta pública de n°.
94 realizada em 6 de novembro de 2003 estabeleceu a Resolução RDC n°. 48 em 16 de
março de 2004 que estabelece normas no controle de qualidade química, estudos de
citotoxicidade, eficácia e indicações terapêuticas dos fitoterápicos (CARDOSO in
YUNES E FILHO, 2007). A Resolução n°. 90 de 2004 estabelece que todo
medicamento fitoterápico deve ser avaliado quanto à sua toxicidade aguda ou por doses
repetidas, bem como quanto à genotoxicidade. Para a avaliação da genotoxicidade, caso
os fitoterápicos sejam utilizados em tratamentos de longa duração, a ANVISA preconiza
o uso dos testes de Ames e micronúcleo.
O teste de Ames é um dos ensaios de triagem mais utilizados para detectar o
potencial mutagênico de compostos (CARIELO E PIEGORSCH, 1996; UMBUZEIRO
E VARGAS in RIBEIRO, et al. 2003).
Da mesma maneira, o teste do micronúcleo é amplamente utilizado e aceito
por agências internacionais e governamentais como parte dos testes necessários para o
fornecimento de registro de novos produtos químicos e farmacológicos (CHOY 2001).
1.2 Plantas da família Malpighiaceae
A família Malpighiaceae é composta, aproximadamente, de 1250
espécies distribuídas em 71 gêneros, sendo que, deste total, cerca de 950 espécies
pertencem a 47 gêneros e encontram-se distribuídas pelo mundo. Basicamente, esta
família está distribuída ao longo dos trópicos e subtrópicos (MAKINO-WATANABE,
1988). A maioria das espécies (cerca de 70%) está na América tropical onde são
encontrados, geralmente, em locais abertos como florestas, cerrados, campos e matas
ciliares (ANDERSON, 1979).
No Brasil, encontram-se cerca de 300 espécies distribuídas por todas as
regiões e são classificadas como pertencentes a 32 gêneros de Malpighiaceae. Essa
família geralmente apresenta hábito trepador, mas também pode ser encontrada como
arbusto e ocasionalmente erva perene (JUDD, et al. 1999).
Segundo Judd, et al. (1999), a distribuição das espécies dentro dos
respectivos gêneros é a seguinte: Byrsonima (150 ssp), Heteropterys (120 ssp),
Banisteriopsis (92 ssp), Terapterys (90).
1.2.1 Gênero Byrsonima
O gênero Byrsonima, é nativo do cerrado brasileiro e utilizado pela
população desta região no tratamento de enfermidades, como infecções cutâneas e
disfunções gástricas (AMARQUAVE et al., 1994). A espécie Byrsonima crassa é
popularmente conhecida como murici-cascudo ou murici-vermelho e a literatura relata
os efeitos anti-micótico (CÁCERES et al., 1993) e bactericida (MARTINEZ-
VASQUES et al., 1999). Estudos fitoquímicos realizados com extratos desta espécie
demonstraram a presença de alguns compostos biologicamente ativos como quercetina-
3-O-β-galactopiranosideo, quercetina-3-O-α-1-arabinopiranosideo, amentoflavona, (+)-
catequina e (-)-epicatequina (SANNOMIYA et al., 2004; SANNOMIYA et al., 2005).
Em estudo realizado pelo mesmo grupo, foi possível verificar que os extratos
metanolico água (80% MeOH), metanólico (MeOH) e clorofórmico (CHCl
3
), quando
administrados por via oral em ratos na dosagem de 250, 500 e 1000 mg/kg, ocasionaram
uma redução no número de lesões gástricas promovidas pelo HCl/etanol.(
AMARQUAVE et al., 1994)
Figura 2:Caule Byrsonima sp Figura 3: Florescência de Byrsonima sp
Fonte: Manoel Cláudio da Silva Junior Fonte: Manoel Cláudio da Silva Junior
1.3 Família Dilleniaceae
A Família Dilleniaceae é composta por, aproximadamente, 18 gêneros e
cerca de 530 espécies de árvores, arbustos e lianas lenhosas, amplamente distribuídas no
Brasil. No Brasil, ocorrem cinco gêneros e 31 espécies, com centros de diversidade nas
regiões do nordeste, onde várias espécies estão adaptadas à caatinga nordestina, cerrado
e floresta amazônica. Nos Estados de Goiás e Tocantins ocorrem quatro gêneros e cerca
de oito espécies: Curatella americana L. popularmente conhecidas pelos nomes de
“lixeira” e “sambaíba”; Davilla rugosa Poir., D. elliptica St. Hil., D. nítida (Vahl) Kub.
e D. grandiflora St. Hil, possuem hábito arbustivo e são conhecidas pela população
local como “lixeirinhas”, sendo de ampla ocorrência nos cerrados; Doliocarpus dentatus
(Aubl.) Standl. e D. elegans Eichl. “cipó-de-fogo” e “cipó-d‟água” são lianas lenhosas e
estão associados às florestas úmidas e de galeria e cerradão; Tetracera willdenoviana
Steud., outra espécie de liana lenhosa, de ocorrência nas florestas regionais. Atualmente,
algumas novas espécies têm sido descritas em várias regiões neotropicais para mostrar a
necessidade de estudos regionais mais profundos, e gerar melhor conhecimento da
região do cerrado, tão ameaçado pelo avanço das atividades agropecuárias. (PEREIRA,
2005).
1.3.1 Gênero Davilla
Davilla elliptica é conhecida popularmente como ―lixinha‖, devido à
aspereza de suas folhas. Floresce de abril a junho e sua época de frutificação é de julho
a setembro. Apresenta porte médio de 1,50m, caracterizando-se como subarbustos. Na
medicina popular, o infuso das raízes é utilizado como adstringente tônico e laxativo,
possuindo forte efeito purgativo. Já o banho com folhas frescas é indicado em caso de
linfatismo, inchações e orquites (RODRIGUES & CARVALHO, 2001).
Coelho et al. (2005) relataram o emprego destas plantas como fármaco
de primeira escolha no tratamento de enfermidades, pela população da comunidade
Mumbuca, localizada na região Oeste do Estado do Tocantins. Esta espécie, conhecida
pelo nome de lixeirinha, é utilizada pelos locais na forma de infusão como analgésico.
Trabalhando com o gênero Davilla, Guaraldo et al. (2001), verificaram
que a utilização do extrato hidroalcoólico foi capaz de reduzir o número de lesões
gástricas produzidas por HCL/etanol (400mg/kg de peso corpóreo) em camundongos.
Figura 4: folhas de Davilla sp Figura 5: Frutos de Davilla sp
Fonte: Manoel Cláudio da Silva Junior Fonte: Manoel Cláudio da Silva Junior
1.4 Mutagênese e antimutagênese
O material genético da maioria dos organismos vivos, apesar de
encontrar-se no interior das células, imerso no citoplasma, protegido por membranas,
imerso no citoplasma e com uma maquinaria de reparo, não está livre de sofrer
constantes alterações, ou seja, mutações.
Essas alterações, as quais esta sujeita o material genético, podem ser
originadas através de erros ocorridos durante o processo de duplicação e divisão celular
e, embora a maioria das pessoas associe o evento mutacional com processos lesivos, as
mutações têm grande importância no processo evolutivo, portanto, são responsáveis
pelo surgimento de novos fenótipos (MARQUES apud RIBEIRO, et al., 2003).
As mutações podem ser classificadas em gênicas ou puntiformes quando
atingem poucos nucleotídeos ou aberrações cromossômicas, quando atingem
cromossomos inteiros ou pedaços de cromossomos. Basicamente as mutações gênicas
podem ser subdivididas em substituição de pares de bases e alteração na matriz de
leitura, ocorrendo por adição ou deleção de nucleotídeos. As cromossômicas podem ser
divididas em numéricas e estruturais, que por sua vez são subdivididas de acordo com o
tipo (GRIFFITHS et al., 2006).
Quando a alteração no material genético afeta células somáticas, os
efeitos são observados no próprio indivíduo, pois é possível observar diminuição ou
perda de função da célula atingida, podendo chegar ao desenvolvimento de neoplasias.
Entretanto, quando a alteração ocorre no material genético de células germinativas, os
efeitos destas alterações são observados na prole, que apresenta desde disfunções
orgânicas até a morte do indivíduo (GRIFFITHS et al., 2006).
Estas alterações, segundo Lewin (2001), podem ser decorrentes de
processos celulares normais (mutações espontâneas) ou devidas à exposição do
organismo a agentes químicos ou físicos (mutações induzidas).
Vale ressaltar que, diariamente, milhares de pessoas estão expostas a
agentes indutores de mutação nas suas atividades, como é caso dos agricultores que,
freqüentemente, utilizam agrotóxicos citotóxicos e genotóxicos para células humanas
(HOYOS et al., 1996; LIOI et al., 1998; MARQUEZ et al., 2005)
Sem dúvida, as mutações são de grande interesse para a sociedade de
modo geral, pois estão diretamente envolvidas em processos iniciadores de doenças
degenerativas tais como câncer e arteriosclerose (DE FLORA, 1998; SEO et al., 2000).
Sabendo que a mutação é um dos eventos iniciadores do câncer, o
combate ou a prevenção da ocorrência de eventos mutacionais seria o caminho a ser
desenvolvido na tentativa de prevenir essas mutações, ou seja, a utilização de
substâncias que funcionem como antimutagênicos. De acordo com Waters e McCuthan
(1990), o termo ―antimutagênico‖ foi primeiramente utilizado por Novick e Szilard em
1952 para descrever aqueles agentes que apresentam a propriedade de reduzir a taxa de
mutações espontâneas ou induzidas, independentemente dos mecanismos envolvidos.
Esses agentes antimutagênicos têm a capacidade de prevenir a intervenção de um
mutágeno com DNA, promovendo danos, ou modulação da reposta após a interação
mutágeno-DNA, amenizando os efeitos causados (FIORIO, 1994; NAMIKI, 1990).
A prevenção do desenvolvimento do câncer, através de substâncias
químicas que funcionem como agentes antimutagênicos e que tenham a capacidade de
interagir com compostos mutagênicos ou seus metabólitos a fim de reduzir os seus
efeitos, é uma alternativa promissora, chamada, a quimioprevenção (ROY et al., 2003).
Estudos recentes mostram que os extratos vegetais têm um grande
potencial para serem utilizados na medicina como substâncias capazes de prevenir
danos causados ao organismo humano, e que a introdução de medicamentos originados
de vegetais, provavelmente, não terá problema de aceitação por parte da população que
já utiliza produtos de origem natural no combate de algumas enfermidades (CORDELL,
1995). Por exemplo, a formação de radicais livres é amplamente investigada como fator
de iniciação do câncer (LAKSHMI et al., 2003) e, substâncias que tenham a capacidade
de impedir a formação destes radicais livres, são de interesse médico e industrial. As
fontes pesquisadas são as mais variadas possíveis: frutos, folhas, caules, raízes dos
vegetais, fungos como cogumelos que são utilizados na medicina popular.
São vários os trabalhos que demonstram a atividade antimutagênica de
extratos e de diferentes compostos naturais destes extrato, como por exemplo, Camellia
sinensis, Camellia assamica (TANEJA et al., 2003).
Utilizando o teste de Ames, Varella et al. (2001) avaliaram o potencial
mutagênico e antimutagênico de Mormodica charantia e constataram que o extrato
desta planta, utilizada na medicina popular, é capaz de atuar como antimutagênico,
quando testado frente a indutores de mutações como a azida sódica, 4-o-nitro-
fenilenodiamina (NPD), daunomicina, 2-antramina e 2-aminofluoreno.
Testes realizados com rabanete (Raphanus sativus), um vegetal
pertencente à família Cruciferaceae, comprovaram a atividade de redução aos danos
causados pelas aminas heterocíclicas. Esta verificação foi feita através do teste de Ames
com as linhagens TA98 e TA100 (SHISHU & KAUR, 2003).
Avaliação realizada com feijão preto (Phaseolus vulgaris L.), através do
teste de micronúcleo em medula óssea e sangue periférico de camundongos e teste do
cometa, demonstraram que animais, em dieta suplementada com feijão preto, tiveram
uma redução significativa nos danos causados ao DNA quando tratados com
ciclofosfamida (AZEVEDO, 2004).
Em trabalho realizado por Geetha et al. (2004), demonstraram que o
extrato do chá verde foi capaz de reduzir significativamente o número de colônias
revertentes para a linhagem TA102, quando testado frente a peróxido de hidrogênio que
é uma substância com potencial de causar danos oxidativos ao DNA.
Bukova et al. (2005) também verificaram o efeito antimutagênico do chá
verde. Utilizando o teste de Ames, constataram uma redução de até 74% quando os
ensaios foram realizados com ativação metabólica.
Em estudo recente, Resende et al. (2006), utilizando o teste do
micronúcleo demonstraram que os ácidos ursólico e oleanólico extraídos de Miconia
fallax são eficientes quando testados contra o efeito mutagênico da doxorrubicina. Os
grupos que foram tratados simultaneamente com esses ácidos e a doxorrubicina
chegaram a reduzir em até 78% o número de micronúcleos quando comparados com o
grupo controle.
Através do teste de Ames, utilizando as linhagens TA98 e TA100, as
substâncias atorvastatina e lovastatina apresentaram potencial antimutagênico contra a
atividade mutagênica do NPD e azida sódica (AJITH e SOJA, 2006).
O efeito antimutagênico do extrato das flores de Melampodium
divaricatum, avaliado através de ensaios de mutação gênica reversa com Salmonella
typhimurium, foi atribuído principalmente à presença de triterpenos (NOGUEIRA et al.
2006).
Em ensaios realizados com flores de S. pilosa e Stevia eupatoria para
avaliar o potencial antimutagênico destes vegetais, foi verificado, através do teste de
Ames, que Stevia pilosa reduziu em até 99% os efeitos mutagênicos de N-etil-N-nitro-
N-nitrosoguanidina na linhagem TA100 (CARIÑO-CORTÉS et al., 2007).
1.4.1 Sistemas-teste para Avaliação de Mutagenicidade/Antimutagenicidade
1.4.1.1 Teste de Ames
O teste de Ames tem sido amplamente utilizado para identificar
mutágenos entre substâncias puras, misturas complexas e amostras ambientais.
Caracteriza-se pela utilização de linhagens indicadoras de S. typhimurium sensíveis a
substâncias capazes de induzir diferentes tipos de mutação. Na presença de agentes
mutagênicos, estas linhagens revertem seu caráter de auxotrofia para a síntese de
histidina e passam a formar colônias em meio desprovido desse aminoácido. Desta
forma, através da contagem de colônias por placa, é possível estabelecer a ação
mutagênica e antimutagênica de um composto em função de sua concentração
(ZEIGER, 2001). Um considerável número de mutágenos, primeiramente identificados
pelo teste de Ames, mostrou-se carcinogênicos em ensaios com animais (MARON e
AMES, 1983). Isso faz com que esse teste seja um dos principais ensaios empregados
na determinação da mutagenicidade e antimutagenicidade de um grande número de
compostos químicos (UMBUZEIRO e VARGAS, 2003).
Existe uma variedade de linhagens bacterianas que podem ser
empregadas neste ensaio. Cada uma delas apresenta várias mutações específicas que
resultam, além da incapacidade de sintetizar histidina, em outras características
particulares, que as tornam mais hábeis para a identificação de diferentes classes de
agentes químicos mutagênicos (MARON e AMES, 1983).
As mutações no operon histidina também são diferentes de acordo com a
linhagem, e essas diferenças permitem identificar o mecanismo de ação de diferentes
agentes químicos, isto é, determinadas linhagens permitem a identificação de agentes
mutagênicos que causam substituição de pares de bases. Outras linhagens permitem a
identificação de agentes químicos que causam mutações do tipo frameshift (MARON e
AMES 1983; MORTELSMANS e ZEIGER, 2000). Entretanto, as linhagens bacterianas
não apresentam enzimas de metabolização, o que impossibilita sua capacidade para
identificação de agentes mutagênicos de ação indireta. Para superar essa dificuldade,
adiciona-se às culturas durante os ensaios a chamada fração S9, que contém enzimas
metabolizadoras de xenobióticos que é obtida a partir do fígado de ratos (MARON e
AMES 1983; MORTELSMANS e ZEIGER, 2000).
Todas essas características conferem ao teste de Ames uma grande
capacidade de identificação e caracterização de diferentes agentes mutagênicos e
antimutagênicos, com grande eficiência e sensibilidade.
1.4.1.2 Micronúcleo
Micronúcleos têm sido estudados há muitos anos e freqüentemente
usados para quantificar a exposição a agentes químicos ou à radiação e são, atualmente,
também empregados para estudos de agentes antimutagênicos.
Os micronúcleos foram primeiramente descritos por Howell em 1891
como inclusões citoplasmáticas em células vermelhas do sangue de gatos anêmicos.
Jolly observou essas mesmas estruturas em 1901 em seus estudos com eritrócitos de
embriões de ratos (SLESINSKI e GUZZIE, 1988)
Segundo Heddle et al. (1983), diferentes mecanismos podem estar
envolvidos na formação dos micronúcleos, incluindo quebras cromossômicas
(clastogênese) e rompimento das fibras do fuso mitótico (aneuploidiogênese). Esses
mecanismos levam a formação de um ―pequeno núcleo‖, envolto por membrana
(micronúcleo), isolado do núcleo principal, mas corado similarmente a este, devido ao
seu conteúdo de DNA (SLESINSKI e GUZZIE, 1988).
Embora os micronúcleos possam ser originados espontaneamente, a sua
indução é comumente usada para se detectar danos genotóxicos, resultantes de
exposição a agentes mutagênicos (HEDDLE et al., 1983; MAJER et al., 2001). O teste
do micronúcleo é uma alternativa à análise de aberrações cromossômicas, entretanto,
somente um, as quebras e perdas cromossômicas aparecem como micronúcleos
(GRAWÉ et al., 1998).
De acordo com Surrallés e Natarajan (1997), as principais vantagens da
análise de células micronucleadas são a velocidade e a facilidade com que este tipo de
estudo pode ser efetuado, especialmente quando são aplicados em roedores em estudos
in vivo, além de permitir a inferência de processos de aneugênese e clastogênese.
Hayashi et al. (1990) descreveram uma técnica para a análise de células
micronucleadas do sangue periférico de camundongos com a utilização de lâminas pré-
coradas com o corante fluorescente acridine orange, que proporciona coloração amarela
ao DNA e vermelha ao RNA. Essas propriedades permitem a identificação dos
reticulócitos, eritrócitos jovens ricos em RNA em nível de citoplasma, que se coram em
vermelho pela presença desse ácido nucléico. Os micronúcleos, por seu conteúdo de
DNA, coram-se em amarelo e se tornam muito evidentes nestas células.
Segundo Kishi et al. (1992), em estudos comparativos entre a técnica
convencional de coloração por Giemsa de células da medula óssea de camundongos e a
técnica de coloração descrita por HAYASHI et al. (1990), não houve divergência nos
resultados, sendo que, a última técnica utilizada mostrou-se tão sensível quanto a
primeira. Ainda segundo esses mesmos autores, esse método que utiliza lâminas pré-
coradas com acridine orange é de realização ainda mais fácil e rápida, por não ser
necessário processamento do material biológico antes do preparo das lâminas e nem a
fixação prévia à coloração. A facilidade para análise é também um ponto destacado por
KISHI et al. (1992).
As principais vantagens da utilização do sangue periférico para a análise
de micronúcleos foram apontadas por MACGREGOR et al. (1980) apud CSGMT
(1992) como sendo o fato de que um mesmo animal pode fornecer várias amostras de
material, sem a necessidade da eutanásia, a simplicidade da preparação das amostras e a
abundância e uniformidade da população. Com a mesma confiabilidade que é utilizada
para avaliar compostos mutagênicos, o teste de micronúcleo tem sido empregado para
avaliar o potencial antimutagênico de vários compostos.
1.4.1.3 Danos no DNA Plasmidial
Os plasmídeos, encontrados em algumas bactérias e algumas espécies de
eucariotos, são moléculas de DNA extras cromossômicas circulares ou lineares, com
dupla fita, variando o seu tamanho de 2 a 50kb em média, entretanto, podem atingir até
500kb (FARAH, 2000; TRABULSI, 2004).
Os plasmídeos possuem replicação independente, ou seja, a sua
duplicação não está ligada à duplicação do DNA cromossomal. Os genes que
desenvolvem funções essenciais não são encontrados no plasmídeo. Entretanto,
podemos encontrar genes com algumas funções importantes como, os de resistência a
antimicrobianos e metais pesados e a metabolização de alguns compostos importantes
que permitem aos microrganismos possuidores de plasmídeo a sobreviver em condições
adversas. Portanto, não é uma molécula indispensável ao microrganismo e sim, uma
vantagem seletiva adquirida pelo mesmo (TRABULSI, 2004).
Devido à possibilidade de introduzi-lo com facilidade em bactérias, os
plasmídeos são utilizados como vetores na engenharia genética por serem considerados
ideais para transporte de material genético. Um dos plasmídeos mais comuns na
engenharia genética é o pBR322, composto por 4.362pb, e dois genes de resistência aos
antimicrobianos ampicilina e tetraciclina. Geralmente os plasmídeos podem carregar
com sucesso moléculas de DNA de até 4.000pb (FARAH, 1997).
Por ser uma molécula de DNA relativamente pequena, o que facilita os
trabalhos, os plasmídeos vêm sendo utilizados com sucesso na detecção de agentes
genotóxicos.
Utilizando o plasmídeo PUC19, foi avaliada a capacidade protetora de
biflavonóides extraídos de Araucaria angustifólia em proteger o DNA plasmidial contra
danos oxidativos induzidos por NPDO
2
(1,4-nafitalenodipropionato) e radiação ultra-
violeta (YAMAGUCHI et al., 2005).
Thomas et al. (1995) avaliaram a ação protetora de flavonóides contra o
oxigênio molecular gerado por NPDO
2
no plasmídeo pBR322.Foi avaliado in vitro,
utilizando plasmídeo, o potencial mutagênico e antimutagênico da quitina-glucana
extraído do micélio do fungo Aspergillus niger contra a atividade mutagênica do H
2
O
2
.
O referido composto mostrou atividade antimutagênica protegendo-a da ação do
peróxido de hidrogênio (KOGAN et al., 2003).
Dantas et al. (1999) utilizaram o plasmídeo PUC 9.1 extraído de
Escherichia coli para avaliar o potencial genotóxico de diferentes concentrações de
cloreto de estanho frente ao DNA plasmidial. O cloreto de estanho promove quebras no
DNA plasmidial o que muda a sua conformação e padrão de migração quando analisado
no gel de agarose. Devido às quebras, o plasmídeo poderá apresentar as formas aberta e
circular saindo de sua conformação original superenovelada. Estas mudanças de
conformação são realizadas de acordo com o tipo de quebra que ocorreu, ou seja,
quando temos uma quebra em uma fita simples do plasmídeo podemos observar a
ocorrência da forma circular e quando ocorre dupla quebra pode-se observar que o
plasmídeo assume a forma aberta.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos Gerais
Avaliar a mutagenicidade e antimutagenicidade dos extratos metaólico (MeOH)
e clorofórmio (CHCl
3
) de Byrsonima basiolba, CHCl
3
de Byrsonima crassa e
CHCl
3
de Davilla elliptica e de sete substâncias isoladas destes extratos
2.2 Objetivos Específicos
• Avaliar para cada um dos extratos, a mutagenicidade e
antimutagênicidade in vitro através do teste de Ames empregando-se as linhagens
TA100, TA98, TA97a e TA102 de Salmonella typhimurium frente aos mutágenos o 4-
o-nitrofenilenodiamina (NPD), Azida Sódica (AZS), Mitomicina (MC), Peróxido de
Hidrogênio (H
2
O
2
), Benzo[a]pireno (B[a]P) e Aflatoxina B
1
(AFB
1
).
• Avaliar a atividade mutagênica e antimutagênica in vivo dos extratos, empregando o
teste do micronúcleo em células do sangue periférico de camundongos frente à
ciclofosfamida.
• Avaliar, através do teste de Ames e de danos induzidos em DNA plasmidial, a
mutagenicidade e antimutagenicidade das substâncias puras: Ácido gálico, Quercetina-
3-o-α-L-raminopiranosídeo, Quercetina, Miricetina-3-o-α- L-raminopiranosídeo, Galato
de metila, (+)catequina, Lupeol, obtidos dos diferentes extratos vegetais.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material vegetal
Todos os vegetais utilizados neste estudo tiveram como base principal os
estudos realizados pelo Laboratório de Microbiologia da Profa. Dra. Clarice Queico F.
Leite que desenvolveu estudos quanto ao potencial antimicobacteriano dos extratos
citados abaixo. Estes ensaios fazem parte do projeto temático Biota-Fapesp, que está
sendo desenvolvido de maneira conjunta por pesquisadores de diversas áreas de
pesquisa pertencentes à Universidade de Campinas (UNICAMP), Universidade
Estadual Paulista (UNESP) e a Universidade Estadual de Londrina (UEL), visando a
identificação de compostos com várias atividades biológicas como: anti-inflamatória,
antimicrobiana, antimicobacteriana, antioxidante e também quanto ao seu potencial
mutagênico e antimutagênico.
As espécies utilizadas foram são espécies utilizadas pela população no
combate a enfermidades. Portanto, neste trabalho utilizaram-se folhas das seguintes
espécies vegetais: Byrsonima basiloba, B. crassa e Davilla elliptica.
Byrsonima basiloba foi coletada por Luís Fernando R. de Almeida (IBB-
UNESP-Botucatu, SP) no município de Pratânia-SP., sendo identificada por Prof. Dr.
José Clemente Campos do IB-Botucatu. A exsicata de número 24163 encontra-se
depositada no herbário da UNESP- Botucatu.
Byrsonima crassa Niedenzu (IK) foi coletada por Eduardo Ribeiro dos
Santos em Porto Nacional, no estado do TO, sendo posteriormente realizada a
identificação pela Profª Solange de Fátima Lólis. As exsicatas foram depositadas no
Herbário da Fundação Universidade do Tocantins com os seguintes números de
voucher: Byrsonima crassa Niedenzu (IK), TO 3377.
Davilla elliptica A. St. -Hil foi coletada pela Profª Clélia A. Hiruma-
Lima em Palmas (TO). Posteriormente a identificação foi realizada pela Profª Solange
de Fátima Lólis. A exsicata foi depositada no Herbário da Fundação Universidade do
Tocantins com o seguinte número de voucher: D.elliptica St. Hil (Dilleniaceae)
TO4593.
3.2 Obtenção de Extratos e substâncias
Os extratos e substâncias testados neste trabalho foram obtidos através do
grupo do Prof. Dr. Wagner Vilegas do Instituto de Química (I.Q.) da UNESP Campus
de Araraquara-SP. Foram testados os extratos clorofórmico (CHCl
3
) apolares e
metanólico (MeOH) polares.
O material vegetal coletado, foi levado a estufa para passar pelo processo
de secagem a uma temperatura de aproximadamente 60
o
C; após o período de secagem
este material foi macerado em clorofórmio a fim de se obter o extrato clorofórmico, que
decorrido 7 dias após a maceração inicial, passou por um processo de evaporação com
temperatura de aproximadamente 40
o
C, obtendo-se assim o extrato apolar, ou seja,
extrato clorofórmico. Após o processo de evaporação e eluição do extrato clorofórmico,
a sobra (torta) passou por uma nova maceração com metanol, de onde, após sete dias
através do processo de evaporação a uma temperatura de aproximadamente 40
o
C com
pressão negativa, obteve-se o extrato polar, ou seja, extrato metanólico.
3.2.1 Obtenção de substâncias puras
Além dos extratos CHCl
3
e MeOH, foram testadas algumas substâncias
puras: Ácido gálico, Quercetina-3-o-α-L-raminopiranosídeo, Quercetina, Miricetina-3-
o-α- L-raminopiranosídeo, Galato de metila, (+)catequina e Lupeol que também foram
obtidas pelo grupo do Prof. Dr. Wagner Vilegas. Os procedimentos utilizados para
isolamento dessas substâncias estão descritos em Rodrigues, et al., (2007).
3.3 Concentrações utilizadas
3.3.1 Extratos
Para o desenvolvimento do ensaio de mutagenicidade e
antimutagenicidade in vitro (teste de Ames) foram utilizadas cinco concentrações
diferentes para cada extrato, que foram determinadas a partir do ponto máximo de
solubilidade, diluídos em DMSO.
Para o ensaio in vivo (teste de micronúcleos) de mutagenicidade e
antimutagenicidade, utilizaram-se três diferentes concentrações correspondendo a
100%, 75% e 50% da concentração máxima de solubilidade. Os extratos foram
solubilizados em óleo de soja da marca Soya e administrados aos animais via gavage
num volume máximo de 0,3mL/animal.
3.3.2.Substâncias puras
Para as substâncias isoladas as concentrações das soluções utilizadas no
teste da indução de danos no DNA plasmidial foram de 0,45 mg/mL e 0,9 mg/mL. No
teste de Ames foram avaliadas na concentração de 75μg/placa.
3.4 Avaliação da antimutagenicidade e mutagenicidade
Para realização do estudo de potencial mutagênico e antimutagênico in
vitro, dos extratos de B. crassa, B. basiloba e D. elliptica, foram empregados o teste de
Ames com Salmonella typhimurium linhagens TA100, TA102, TA98 e TA97a, com e
sem ativação metabólica .
Para avaliação do potencial mutagênico e antimutagênico in vivo foi
empregado o teste do micronúcleo em sangue periférico de camundongos.
3.4.1 Teste de Ames
O ensaio utilizado para detectar mutação gênica reversa foi o Teste de
Ames que se baseia no emprego de linhagens de Salmonella typhimurium auxotróficas
para o aminoácido histidina, as quais revertem à prototrofia pelo tratamento com
agentes mutagênicos (MARON e AMES,1983).
3.4.1.1 Linhagens utilizadas
Foram utilizadas as linhagens TA100, TA97a, TA98 e TA102 de
Salmonella typhimurium, gentilmente cedidas pelo Dr. Bruce Ames da Universidade de
Berkeley, Califórnia. A linhagem TA100 detecta mutágenos que causam substituição de
pares de bases no DNA, contém uma mutação no gene HisG (HisG46) que codifica para
a primeira enzima da biossíntese da histidina, tendo o par GC como ponto preferencial
para a reversão. Na linhagem TA97a pode ser detectada a mutação de deslocamento de
quadro de leitura onde o alvo das mutações são sítios de CG, esta linhagem apresenta a
mutação HisD6610. A cepa TA98 apresenta mutação no gene HisD (HisD3052) que
codifica para a histidinol desidrogenase, apresentando como ponto preferencial para a
reversão oito resíduos repetitivos de GC e detecta compostos mutagênicos que causam
deslocamento do quadro de leitura do DNA. A TA102 é capaz de detectar uma
variedade de mutágenos, principalmente agentes oxidantes, essa linhagem contém uma
mutação ocre-TAA no gene HisG.
3.4.1.2 Manutenção e estoque das cepas de Salmonella typhimurium
As cepas de S. typhimurium ficaram estocadas em tubos para
congelamento (1,5mL), e mantidas à -70 C para que se mantivessem inalteradas todas
as suas características genéticas. Para cada 0,9mL de cultura, foi adicionado 0,1mL de
dimetilsufóxido (DMSO) que é um crioprotetor.
3.4.1.3 Verificação das características genéticas das cepas de S. typhimurium
As características genéticas das cepas de S. typhimurium foram checadas
rotineiramente, antes do preparo dos estoques para congelamento. A dependência da
histidina, presença de mutação rfa, presença de deleção uvrB e a presença de plasmídios
de resistência também foram verificada.
3.4.1.4 Taxa de reversão espontânea
A reversão espontânea das cepas-teste para independência à histidina foi
medida rotineiramente sendo que a freqüência de reversão é característica para cada
cepa. As colônias revertentes prototróficas para a histidina, são facilmente visíveis em
placas de ágar mínimo glicosado com traços de histidina e biotina, em contraste com as
colônias auxotróficas, que formaram uma fina camada de crescimento bacteriano
(„background”).
3.4.1.5 Preparo do inoculo de S. typhimurium utilizados no ensaio
Semeou-se com auxílio de alça de inoculação, pequena quantidade do
crescimento da cultura em 30 mL de caldo nutriente (Oxoid n. 2). Incubou-se a 37 C
por 12-16 horas em banho-maria com agitação (160 rpm) de modo a obter uma
densidade de 1,2 x10
9
bactérias/mL. Após crescimento manteve-se a cultura sob
refrigeração durante o período que a mesma não estava sendo utilizada.
3.4.1.6 Controles
Os controles negativos foram feitos com o solvente dos extratos, ou seja,
com o DMSO. Além disso, foram utilizados mutágenos diretos e indiretos conhecidos
que atuaram como agentes indutores das mutações. Em ausência de metabolização,
utilizou-se para as linhagens TA98 e TA97a o 4-o-nitrofenilenodiamina (NPD), para a
TA100 a azida Sódica (AZS) e para a linhagem TA102 a mitomicina (MC) e o peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
). Para os ensaios com ativação metabólica foram utilizados o
benzo[a]pireno (B[a]P) e aflatoxina B
1
(AFB
1
) para as linhagens TA97a, TA98 e TA100
e para a TA 102 o peróxido de hidrogênio.
3.4.1.7 Ensaios de mutagenicidade
De acordo com a metodologia de pré-incubação, desenvolvida por
Maron e Ames (1983), diferentes concentrações dos extratos vegetais foram misturadas
a 0,5 mL de tampão fosfato 0,2M pH 7,4, 0,1 ml de cultura de bactérias e incubadas de
20-30 minutos a 37°C. Nos ensaios com ativação metabólica, foram adicionados, em
substituição ao tampão fosfato, 0,5 mL da mistura S9. Decorrido o tempo de incubação,
2 mL de ―top ágar‖ (agar de superfície), contendo traços de L-histidina e D-biotina,
foram adicionados a mistura presente nos tubos. O conteúdo de cada tubo, assim
composto, foi levemente homogeneizado em vórtex e vertido sobre a superfície de uma
placa contendo ágar mínimo glicosado. Após solidificação do ―top-ágar‖, as placas
foram incubadas por 48 horas, a 37°C. Ao término desse período, foi realizada a
contagem do número de colônias revertentes por placa. Os ensaios foram realizados em
triplicata.
3.4.1.8 Ensaios de antimutagenicidade
Foram utilizadas diferentes concentrações dos extratos: sendo: 0,46;
0,91; 1,83; 3,65; 7,3; 14,6 e 21,9 mg/placa para o extrato metanólico (MeOH) de B.
basiloba; 0,99; 1,99; 3,97; 7,95 e 15,9mg/placa do extrato clorofórmico (CHCl
3
) de B.
basiloba; 0,74; 1,48; 2,97; 5,95 e 8,95 mg/placa do extrato CHCl
3
de B. crassa.; 1,04;
2,08; 4,17; 8,35 e 12,525 mg/placa do extrato CHCl
3
de D. ellyptica.
Também foi empregada a metodologia de pré-incubação em placas,
desenvolvida por Maron e Ames (1983) sendo que, neste ensaio os extratos foram
misturados a 0,1mL de cultura de bactérias, um agente mutagênico (azida sódica, 4-o-
nitro-fenilenodiamina, mitomicina C, peróxido de hidrogênio, benzo[a]pireno ou
aflatoxina B
1
) e a fração S9 dependendo do mutágeno usado. Em seguida o conteúdo de
cada tubo assim composto foi levado a estufa a 37
o
C por um período de 20-30 minutos.
Decorrido este tempo, a essa mistura foram adicionados 2mL de ágar superfície (“top
agar”) suplementado com traços de histidina e biotina, depois foi levemente
homogeneizado e vertido sobre a superfície de uma placa contendo ágar mínimo
glicosado. Após solidificação do “top-agar”, as placas foram incubadas por 48 horas a
37 C. Após esse tempo procedeu-se a contagem do número de colônias revertentes por
placa. Todo o ensaio foi realizado em triplicata. O cálculo da porcentagem da inibição
da mutagenicidade foi realizado de acordo com Tachino et al. (1994) onde:
Inibição = 1- revertentes induzidos/placa (com inibidor) x100
revertentes induzidos/placa (sem inibidor)
3.4.1.9 Teste de viabilidade
O teste de viabilidade foi aplicado para todas as concentrações que
apresentaram índice de inibição da mutagenicidade acima de 40% (BUKOVA, 2005).
Para o desenvolvimento do teste de viabilidade procedeu-se da mesma maneira para o
método de pré-incubação em placas, ou seja, misturou-se num tubo de ensaio o
mutágeno, a bactéria, o tampão (ou S9) e a amostra a ser testada. Após homogeneizar
em vortex, o conteúdo de cada tubo foi adicionado em tubos com 9mL de solução
fisiológica estéril a fim de se obter uma diluição de 1:10 e em seguida homogeneizado e
1mL transferido para outro tubo com mesma quantidade de solução fisiológica e este
procedimento foi repetido até obter-se uma diluição de 10
-5
. Do tubo contendo a
diluição de 10
-5
retirou-se 0,1mL e semeou-se com alça de Drigalsky em placas com
ágar nutriente, em seguida encubou-se por 24h a 37
0
C. Decorrido este período, as
colônias foram contadas e calculadas as unidades formadoras de colônias/mL (UFC=
diluição X n
o
de colônias X 10). O percentual de viabilidade para cada tratamento foi
comparado com o número de colônias do controle negativo.
De acordo com Vargas et al. (1993) foram consideradas citotóxicas as
amostras que apresentaram um percentual de viabilidade menor que 60%.
3.5 TESTE DO MICRONÚCLEO
3.5.1 Animais
Foram utilizados camundongos da espécie Mus musculus (Swiss albino)
com aproximadamente 30g de peso corpóreo, provenientes do Biotério Central do
Centro de Ciências Biológicas da UNESP de Botucatu-SP. Os animais foram mantidos
em caixas individuais de polipropileno, com tampa-grade, durante o período de
tratamento, com água e alimento ad libitum, ciclo claro/escuro de 12 horas e
temperatura de 23 ± 2 ºC. O projeto de pesquisa para o desenvolvimento desse trabalho
foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Franca UNIFRAN-
Franca –SP, sendo toda a metodologia de experimentação com animais aprovada.
Para os tratamentos os animais foram divididos em grupos de 6, sendo 3
machos e 3 fêmeas. Cada um deles recebeu as diferentes doses dos extratos vegetais via
gavage, num volume máximo de 0,1 mL para cada 10g de peso corpóreo.
O protocolo adotado para a realização dos ensaios foi o descrito por
Hayashi et al. (1990), no qual se empregam lâminas pré-coradas por acridine orange.
3.5.2 Preparo das lâminas com Acridine Orange
As lâminas (bem limpas) foram aquecidas em uma placa aquecedora a
aproximadamente 70 ºC. Sobre as lâminas quentes, foram colocados 10μl de solução de
acridine orange (1mg/mL) e fazendo-se o espalhamento utilizando a extremidade de
outra lâmina bem limpa. As lâminas foram secas ao ar protegida da luz e em seguida
guardadas em caixa apropriada, a temperatura ambiente, em local escuro, por pelo
menos 24h.
3.5.3 Obtenção do sangue e preparo das células
Com o auxílio de uma agulha, a cauda dos animais foi perfurada,
coletando-se 5μL de sangue (uma gota) e depositando-os no centro da lâmina
previamente preparada com acridine orange, cobrindo-a com lamínula. As lâminas com
o material biológico foram mantidas a -20 ºC, no escuro, por no mínimo 24 horas antes
da análise citológica, propiciando uma melhor ação do corante.
A análise citológica das lâminas contendo o sangue periférico dos
animais foi efetuada o mais rápido possível, para evitar a deterioração do material. Esta
análise foi realizada em microscópio de fluorescência, combinando luz azul (488 nm) e
filtro amarelo. Foram contados 2000 reticulócitos por animal e anotadas as médias com
desvio padrão de células micronucleadas.
3.5.4 Ensaio de antimutagenicidade
Para avaliação da antimutagenicidade in vivo dos extratos obtidos das
plantas medicinais nativas do Bioma Cerrado, foram utilizadas três doses de cada um
dos extratos vegetais: CHCl
3
de B. crassa, CHCl
3
de D. ellyptica, CHCl
3
e MeOH de B.
basiloba que foram administradas aos animais via gavage.
Para diluição dos extratos utilizou-se óleo de soja da marca Soya como
solvente. (controle negativo). O agente mutagênico utilizado foi a ciclofosfamida
administrada intraperitonealmente na concentração de 50mg/kg p.c.
Foram estabelecidos os seguintes grupos experimentais:
1- Controle solvente: este grupo foi tratado com 0,3mL de óleo de soja
2- Controle positivo: todos os animais deste grupo foram tratados via
intraperitoneal com 0,3mL de ciclofosfamida na dosagem de 50 mg/kg p.c.
3- Controle positivo associado ao solvente: os animais deste grupo
receberam via gavage 0,3mL de óleo de soja e via intraperitoneal 0,3mL de
ciclofosfamida (50 mg/kg p.c.)
4- Tratamento com extrato MeOH de B. basiloba via gavage nas
dosagens: 166, 124,5 e 83mg/mL + ciclofosfamida (50 mg/kg p.c.)
5- Tratamento com extrato CHCl
3
de B. basiloba via gavage nas
concentrações: 100, 75 e 50mg/mL + ciclofosfamida (50 mg/kg p.c.).
6- Tratamento com extrato CHCl
3
de B. crassa administrado via gavage
nas concentrações de 125, 93,75 e 62,5mg/mL + ciclofosfamida (50 mg/kg p.c.).
7- Tratamento com extrato CHCl
3
de D. elliptica nas concentrações de
111, 93,7 e 62,5 mg/mL + ciclofosfamida (50 mg/kg p.c.).
8- Controle sem nenhum tratamento.
Foram coletadas amostras de sangue da cauda dos animais trinta horas
depois da administração dos compostos-testes.
3.5.5 Ensaio de mutagenicidade
O teste para verificar a mutagênicidade dos extratos foi utilizado apenas a
maior concentração utilizada pára os ensaios de antimutagenicidade.
Foram formados além dos grupos controles positivo e negativo, os
grupos com
1- Controle solvente: este grupo foi tratado com 0,3mL de óleo de soja
2- Controle positivo: todos os animais deste grupo foram tratados via
intraperitoneal com 0,3mL de ciclofosfamida na dosagem de 50 mg/kg p.c.
3- Controle positivo associado ao solvente: os animais deste grupo
receberam via gavage 0,3mL de óleo de soja e via intraperitoneal 0,3mL de
ciclofosfamida (50 mg/kg p.c.)
4- Tratamento com extrato MeOH de B. basiloba via gavage na
dosagem de 166 mg/mL.
5- Tratamento com extrato CHCl
3
de B. basiloba via gavage nas
concentrações de 100mg/mL.
6- Tratamento com extrato CHCl
3
de B. crassa administrado via gavage
nas concentrações de 125mg/mL.
7- Tratamento com extrato CHCl
3
de D. elliptica nas concentrações de
111mg/mL.
8- Controle sem nenhum tratamento.
Foram coletadas amostras de sangue da cauda dos animais trinta horas
depois da administração dos compostos-testes.
3.5.6 Análise Estatística dos Resultados
Após a análise citológica das lâminas contendo amostras do sangue
periférico dos camundongos, foram calculadas as freqüências médias de células
micronucleadas, bem como os desvios padrões para cada um dos grupos de tratamento.
A partir destes resultados foi aplicado o teste-t de Student, realizando-se comparações
entre os valores obtidos para os grupos tratados com os extratos vegetais + controle
positivo e aqueles obtidos a partir do grupo controle positivo. Os testes estatísticos
foram realizados com o software estatístico INSTAT (GraphPad).
O teste-t é utilizado quando se faz a comparação entre as médias obtidas
de duas amostras, com variâncias iguais. Nesse teste a hipótese nula (Ho) considera que
não existem diferenças estatísticas entre as amostras e a hipótese alternativa é que as
médias apresentam diferenças entre si.
3.6 Teste do plasmídeo
Para avaliação do potencial indutor ou protetor dos danos ao DNA
induzidos pelas substâncias puras encontradas nos extratos polares e apolares foi
utilizado o teste com plasmídeos isolados de Escherichia coli DH5SαFIQ. O plasmídeo
utilizado foi o pUC9.1 que confere resistência ao antimicrobianos ampicilina e
canamicina. Esta linhagem foi gentilmente cedida pelo laboratório do Dr. Adriano
Caldeira Araújo do Departamento de Biofísica, do Instituto de Biologia Roberto
Alcântra Gomes da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ).
3.6.1 Procedimento
Foi selecionada uma colônia bem isolada no meio de cultura Lauria-
Bertani (LB) sólido, em seguida repicada em LB líquido com antibióticos 50µg/mL de
canamicina e 10µg/mL de ampicilina e incubado overnight, sob agitação. Decorrido o
tempo de aproximadamente 12 horas, foi avaliado o crescimento da cultura utilizando-
se espectrofotômetro, com absorbância de 1,5 a 2,5 em 600nm o que indica bom
crescimento bacteriano e boa probabilidade de obter número elevado de cópias de DNA
plasmidial.
3.6.2 Isolamento do plasmídeo
Para isolar o DNA plasmidial foi utilizado o kit de extração Perfectprep
Plasmidi Mini da Ependorf.
3.6.3 Quantificação do DNA plasmidial extraído
Após a realização da extração conforme instruções do fabricante do kit
referido anteriormente o DNA plasmidial foi quantificado por espectrofotômetro com a
leitura sendo realizada em 260 nm de onda de absorção.
Para realizar esta quantificação foi adicionado a um microtubo 1,5μl da
amostra completando com água para um volume final de 500 μl, em seguida procedeu-
se a leitura.
A concentração de DNA é dada pela multiplicação da concentração
obtida na leitura vezes o volume. Ou seja,
Sendo que a concentração final de DNA na amostra é obtida utilizando a
formula [ ] μg/mL= Abs 260 X diluição X fator de correção (DNA = 50).
3.6.4 Tratamento do DNA plasmidial
Para o tratamento dos plasmídeos foram feitas alíquotas de
aproximadamente 200ng de DNA por tubo, em seguida foi realizado o tratamento
descrito a seguir.
Em um microtubo adicionou-se: 5 μL DNA + 45 μL água milli-Q;
mantendo sempre o volume final da reação em 50 μL. Incubou-se a temperatura
ambiente, por aproximadamente 40 minutos.
Controle positivo: 5 μL DNA + 45 da solução de cloreto de estanho (CE)
200 μg/mL (possibilita visualização das formas círculo aberto e linear).
Para avaliação das substâncias isoladas, foi adicionado em um microtubo
5 μL DNA + 45 μL da solução substância a ser testada (0,9mg/ml e 0,45mg/ml). Da
mesma maneira incubou-se por aproximadamente 40 minutos à temperatura ambiente,
realizando em seguida a avaliação através da eletroforese em gel de agarose.
C = m
v
Na avaliação do potencial protetor das substâncias contra os danos induzidos
pelo CE procedeu-se da mesma maneira descrita anteriormente para avaliação do
potencial indutor de danos, sendo que, no microtubo foram misturados o DNA , o CE e
a substância que se queria avaliar.
3.6.5 Análise dos resultados
Após o período de incubação, uma alíquota de aproximadamente 10µl de
cada microtubo com tratamentos diferenciados foi submetida a um gel de eletroforese
com concentração de 0,8% de agarose para verificar a estrutura do plasmídeo PUC 9.1
após o tratamento com o controle positivo (CE) e as substâncias avaliadas. Neste gel é
possível observar as três conformações apresentadas pelo plasmídeo, ou seja, circulo
aberto resultante de uma quebra simples, forma linear resultante de quebras dupla ou a
forma nativa superenoveloda quando não sofre quebras.
O gel foi analisado utilizando o Software de bioinformática Alphaimager
da empresa Alphainnotech. Que compara a intensidade das bandas pela quantidade em
pixels.
4.RESULTADOS
Para avaliar o potencial mutagênico e antimutagênico dos extratos CHCl
3
e
MeOH de B. basiloba, CHCl
3
de B. crassa e CHCl
3
de D. elliptica, foram utilizados: os
testes de Ames, de micronúcleo e do plasmídeo. Os resultados observados para os
diferentes extratos estão apresentados nas Tabelas e Figuras a seguir.
4.1 Teste de Ames
4.1.1 Byrsonima basiloba
Os extratos metanólico e clorofórmico de B. basiloba quando avaliados
através do teste de Ames nas linhagens TA97a, TA98, TA100 e TA102 de
S.typhimurium não apresentaram mutagenicidade (LIRA, et al. 2007 in press- anexo 1)
Extrato MeOH de B.basiloba
Antimutagenicidade
Os resultados obtidos na avaliação da atividade antimutagênica do extrato
MeOH de B. basiloba estão demonstrados nas Tabelas 1 e 2. e Figuras 6, 7, e 8.
Para a linhagem TA97a foi observada a redução do número de colônias
revertentes, porém, de acordo com os ensaios de viabilidade, essa redução foi devido ao
efeito tóxico dos agentes utilizados. Portanto, em nenhuma das condições testadas
(presença ou ausência de metabolização) o extrato MeOH de B. basiloba desenvolveu
efeito antimutagênico. para a
Quando o extrato MeOH de B.basiloba foi testado na linhagem TA98 contra
mutágenos diretos ou indiretos pode-se constatar redução em torno de 80% no número
de colônias revertentes como mostrado na Figura 6.
Na linhagem TA100 o extrato MeOH de B. basiloba não apresentou
redução no número de colônias revertentes frente a AZS. O mesmo extrato foi testado
contra mutágenos indiretos, e apresentou redução frente ao efeito da AFB
1
(Tabela 2,
Figura 7). Entretanto, foi citotóxico nas duas maiores concentrações testadas e quando
avaliado em relação ao B[a]P, também se verificou efeito citotóxico (Tabela 2).
Nos testes realizados sem ativação metabólica com a linhagem TA102
(Tabela 1 Figura 8), também foi possível observar uma redução significativa no número
de colônias revertentes nas duas maiores concentrações mostrando o efeito protetor do
extrato MeOH de B.basiloba, contra o efeito da MC (Figura 8). Frente ao H
2
O
2
sem
ativação metabólica, o extrato apresentou índice de redução significativo no número de
colônias revertentes, nas concentrações de 3,65 e 7,30mg/placa. Nas três maiores
concentrações observaram-se efeitos citotóxico (Tabela 2), mas, com +S9, a redução foi
observada apenas nas duas menores concentrações (Tabela 2).
Tabela 1. Atividade antimutagênica expressa pela média, desvio padrão do número de revertentes e percentual de
inibição (valor entre parênteses) do extrato MeOH de B. basiloba frente a compostos mutagênicos diretos, utilizando
as linhagens TA97a, TA98, TA100 e TA102 de S. typhimurium.
Linhagens
Mutágenos
Concentração do extrato (mg/placa)
Número de revertentes
(% inibição )
NPD
1,82
3,65
7,30
14,60
21,90
TA97a
810±30
318±80
(tox)
335±9
(tox)
94±30
(tox)
45±8
(tox)
22±3
(tox)
TA98
504±9
341±31
(32)
340±39
(32)
327±17
(35)
286±37
(43)*
96±20
(80)*
AZS
TA100
2373±90
1770±130
(25)
2016±194
(15)
2074±12
(12)
1366±145
(tox)
495±130
(tox)
MC
TA102
1737±77
1507±7
(13)
1558±85
(10)
1265±24
(27)
605±88
(65)*
620±167
(64)*
H
2
O
2
TA102
503±11
332±15
(34)
235±75
(53)*
242±52
(52)*
78±3
(tox)
67±2
(tox)
NPD (4-nitro-o-phenilenediamina – 10,0 g/placa); AZS= Azida Sódica (1,25 g/placa); MC = Mitomicina
C (0,5 g/placa); H
2
O
2
( Peróxido de hidrogênio - 0,034mg/placa); MeOH – Extrato Metanólico. Tox=
viabilidade < 60%; *=antimutagênico.
Tabela 2. Atividade antimutagênica expressa pela média, desvio padrão do número de revertentes e
percentual de inibição (valor entre parênteses) do extrato MeOH de B. basiloba frente a compostos
mutagênicos indiretos, utilizando as linhagens TA97a, TA98, TA100 e TA102 de S. typhimurium.
Linhagens
Mutágenos
Concentração do extrato (mg/placa)
Numero de revertentes M±SD
(% inibição)
AFB
1
0,46
0,91
1,83
3,65
7,30
TA97a
1182±45
276±12
(tox)
217±10
(tox)
245±12
(tox)
209±1.5
(tox)
199±25
(tox)
1,82
3,65
7,30
14,60
21,90
TA98
613±16
199±24
(68)*
164±14
(73)*
194±13
(68)*
145±16
(76)*
119±17
(81)*
TA100
1627±77
254±16
(84)*
228±12
(86)*
179±8
(89)*
128±16
(tox)
117±17
(tox)
B[a]P
0,46
0,91
1,83
3,65
7,30
TA97a
749±6
187±63
(tox)
210±13
(tox)
193±16
(tox)
191±15
(tox)
144±42
(tox)
1,82
3,65
7,30
14,60
2190
TA98
595±1
201±8
(66)*
169±12
(72)*
163±8
(73)*
163±10
(73)*
110±9
(82)*
TA100
710±22
95±3
(tox)
96±11
(tox)
86±7
(tox)
53±3
(tox)
13±2
(tox)
H
2
O
2
TA102
614±18
200±8
(68)*
222±11
(64)*
188±32
(tox)
133±32
(tox)
61±28
(tox)
H
2
O
2=
Peróxido de hidrogênio (0,034mg/placa); AFB
1
=Aflatoxina B
1
(0,5 g/placa), B[a]P =
Benzo[a]apireno (1 g/placa); MeOH – Extrato Metanólico. Tox= viability < 60%; *= antimutagênico.
32
32
35
43
80
68
73
68
76
81
66
72
73
73
82
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Percentual de inibição
Byrsonima basiloba MeOH TA98
NPD
Aflatoxina B1
Benzo[a]pireno
25
15
12
84
86
89
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Percentual de inibição
Byrsonima basiloba MEOH TA100
Azida sódica
Aflatoxina
Figura 6: Percentual de inibição do extrato MeOH de B. basiloba quando testado com a linhagem
TA98; NPD (4-nitro-o-phenilenediamina – 10,0 g/placa);Aflatoxina B1 (0,5 g/placa),
Benzo[a]pireno (1 g/placa); MeOH – Extrato Metanólico.
Figura 7: Percentual de inibição do extrato MeOH de B. basiloba quando testado com a linhagem
TA100.Aflatoxina B1 (0,5 g/placa), Azida Sódica (1,25 g/placa); MeOH – Extrato Metanólico.
1,8 3,6 7,3 14,6 21,9 1,8 3,6 7,3 14,6 21,9 1,8 3,6 7,3 14,6 21,9
Concentrações
1,8 3,6 7,3 1,8 3,6 7,3
Concentrações
13
10
27
65
64
39
53
52
67
64
0
10
20
30
40
50
60
70
Percentual de inibição
Byrsonima basiloba MeOH TA102
H2O2 s/S9
Mitomicina C
H2O2 c/S9
Figura 8: Percentual de inibição do extrato MeOH de B. basiloba quando testado com a linhagem
TA102. Mitomicina C (0,5 g/placa); Peróxido de Hidrogênio (0,034mg/placa); MeOH – Extrato
Metanólico.
Estudo fitoquímico do Extrato
De acordo com o estudo fitoquímico realizado foram encontradas as
substâncias apresentadas na Tabela 3.
Tabela 3. perfil fitoquímico do extrato MeOH de B. basiloba
Quercetina-3-O-α-L-raminopiranosil-(1→3)-O-[α-L-raminopiranosil-
(1→6)]-β-D-allopiranosídeo
Quercetina-3-O-α-L-raminopiranosideo
Amentoflavona
(+)-catequina
(-)-epicatequina
Galato de metila
Quercetina-3-O-β-D-Galactopiranosídeo
Lupeol
Ácido ursólico
Ácido olenólico
(+)-catequina,
Ácido gálico
Dados cedidos pela equipe do Dr. Wagner Vilegas.
1,8 3,6 7,3 14,6 21,9 1,8 3,6 7,3 1,8 3,6
Concentrações
Extrato CHCl
3
de Byrsonima basiloba
Antimutagenicidade
Os resultados do extrato CHCl
3
de B. basiloba estão demonstrados nas
Tabelas 4 e 5 e os índices de inibição da mutagenicidade nas Figuras de 9 a 12.
A avaliação dos dados da linhagem TA97a em relação ao extrato CHCl
3
de B.
basiloba sem ativação metabólica mostrou que houve uma redução significativa no
número de mutantes revertentes para todas as concentrações testadas (Tabela 4).
Quando avaliado com ativação metabólica na mesma linhagem também se mostrou
efetivo na redução no número de colônias revertentes frente ao B[a]P, sendo tóxico
quando testado em conjunto com a AFB
1
(Tabela 5). A Figura 9 ilustra os índices de
inibição obtidos para essa linhagem.
Da mesma forma, os dados da avaliação do extrato na linhagem TA98, também
mostraram que houve uma redução significativa para as duas maiores concentrações
testadas contra os mutágenos diretos (Tabela 4) e indiretos (Tabela 5). Na Figura 10
estão os índices de inibição.
Na linhagem TA100 o extrato CHCl
3
de B. basiloba apresentou redução de
maneira significativa no número de colônias revertentes nas duas maiores concentrações
testadas frente a AZS azida sódica (Tabela 5, Figura 11). Já para o teste com mutágenos
indiretos, o extrato CHCl
3
de B. basiloba não foi capaz de reduzir o número de colônias
revertentes induzidas pelo B[a]P e a AFB
1
para as concentrações testadas (Tabela 5).
Com a linhagem TA102 também foi possível observar uma redução
significativa no número de colônias revertentes em três concentrações, quando testado
frente a MC. Quando se utilizou peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), de forma direta, apenas
a maior concentração utilizada foi capaz de promover redução (Tabela 4, Figura 12). Já
quando testado contra o H
2
O
2
com metabolização o extrato promoveu redução em todas
as concentrações utilizadas (Tabela 5, Figura 12).
Tabela 4. Atividade antimutagênica expressa pela média, desvio padrão do número de revertentes e
percentual de inibição (valor entre parênteses) do extrato CHCl
3
de B. basiloba frente a compostos
mutagênicos –S9, utilizando as linhagens TA97a, TA98, TA100 e TA102 de S. typhimurium.
Linhagens
Mutágenos
Concentração do extrato (mg/placa)
Número de revertentes M±SD
(% inibição)
NPD
0,99
1,99
3,97
7,95
15,90
TA97a
810±30
203±46
(74)
197±20
(76)
178±17
(78)
179±16
(78)
193±10
(76)
TA98
504±9
341±31
(32)
340±39
(33)
327±17
(35)
286±37
(43)*
196±20
(61)*
AZS
TA100
2373±90
1770±130
(25)
2016±194
(15)
2074±12
(12)
1366±145
(44)*
495±130
(79)*
MC
TA102
1731±77
1724±182
(0,4)
1182±122
(32)
783±61
(55)*
578±16
(67)*
585±84
(66)*
H
2
O
2
0,99
1,99
3,97
7,95
15,9
TA102
503±11
418±29
(17)
493±56
(2)
418±26
(17)
392±13
(22)
270±28
(46)*
NPD (4-nitro-o-phenilenediamina – 10,0 g/placa); AZS= Azida Sódica (1,25 g/placa); MC=
Mitomicina C (0,5 g/placa); (H
2
O
2
) Peróxido de hidrogênio (0,034mg/placa); CHCl
3
– Extrato
Cloroformico. Tox= viabilidade < 60%; *= antimutagênico.
Tabela 5. Atividade antimutagênica expressa pela média, desvio padrão do número de revertentes e percentual de
inibição (valor entre parênteses) do extrato CHCl
3
de B. basiloba frente a compostos mutagênicos +S9, utilizando as
linhagens TA97a, TA98, TA100 de S. typhimurium.
Linhagens
Mutágenos
Concentração do extrato (mg/placa)
Número de revertentes M±SD
(% inibição)
B[a]P
0,99
1,99
3,97
7,95
15,90
TA97a
749±
676±10
(10)
289±14
(61)*
164±14
(78)*
178±9
(76)*
165±13
(78)*
TA98
595±1
259±11
(56)*
212±4
(64)*
208±13
(65)*
258±13
(56)*
197±9
(66)*
TA100
710±22
350±15
(tox)
253±16
(tox)
85±16
(tox)
74±11
(tox)
23±2.3
(tox)
AFB
1
TA97a
1128±45
276±12
(tox)
217±10
(tox)
245±12
(tox)
209±1.5
(tox)
199±2.5
(tox)
TA98
613±16
211±2
(65)*
183±18
(70)*
186±7
(69)*
179±4
(70)*
158±4
(74)*
TA100
1627±75
223±16
(tox)
169±16
(tox)
121±19
(tox)
194±84
(tox)
134±9
(tox)
H
2
O
2
TA102
614±18
254±18
(59)*
269±31
(56)*
267±6
(57)*
234±13
(62)*
261±24
(58)*
H
2
O
2
=Peróxido de hidrogênio (0,034mg/placa); AFB
1
=Aflatoxina B1 (0,5 g/placa), B[a]P= Benzo[a]pireno
(1 g/placa); CHCl
3
– Extrato Clorofórmico. Tox= viability < 60%; *= antimutagênico
Figura 9: Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. basiloba quando testado com a linhagem TA97a. NPD
(4-nitro-o-phenilenediamina – 10,0 g/placa); Benzo[a]pireno (1 g/placa); CHCl
3
– Extrato clorofórmico.
Figura 10: Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. basiloba quando testado com a linhagem TA98;
NPD (4-nitro-o-phenilenediamina – 10,0 g/placa);Aflatoxina B
1
(0,5 g/placa), Benzo[a]pireno (1 g/placa);
CHCl
3
– Extrato clorofórmico.
74
76
78
78
76
10
61
78
76
78
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Percentual de inibição
Byrsonima basiloba CHCl3 TA97a
NPD
Benzo[a]pireno
32
32
35
43
60
56
64
65
56
66
65
70
69
70
74
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Percentual de inibição
Byrsonima basiloba CHCl3 TA98
NPD
Benzo[a]pireno
Aflatoxina
0,99 1,99 3,97 7,95 15,90 0,99 1,99 3,97 7,95 15,90
Concentrações
0,99 1,99 3,97 7,95 15,9 0,99 1,99 3,97 7,95 15,9 0,99 1,99 3,97 7,95 15,9
Concentrações
25
15
12
42
79
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Percentual de inibição
Byrsonima basiloba TA100 CHCl
3
Azida Sódica
Figura 11: Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. basiloba quando testado com a linhagem
TA100; Azida Sódica (1,25 g/placa); CHCl
3
– Extrato Cloroformico.
Figura 12: Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. basiloba quando testado com a linhagem TA102;
Mitomicina C (0,5 g/placa); H
2
O
2
= Peróxido de hidrogênio (0,034mg/placa); CHCl
3
– Extrato Clorofórmico.
4
32
55
67
66
17
2
17
22
46
59
56
57
62
58
0
10
20
30
40
50
60
70
Percentual de inibição
Byrsonima basiloba CHCl
3
TA102
Mitomicina C
H2O2 s/S9
H2O2 c/S9
0,99 1,99 3,97 7,95 15,9 0,99 1,99 3,97 7,95 15,9 0,99 1,99 3,97 7,95 15,9
Concentrações
0,99 1,99 3,97 7,95 15,9
Concentrações
Estudo fitoquímico do extrato CHCl
3
de B. basiloba
As substâncias isoladas a partir do fracionamento do extrato CHCl
3
de B.
basiloba são apresentados na Tabela 6.
Tabela 6.perfil fitoquímico do
extrato clorofórmico de B
basiloba.
Triacontano
Dotriacontano
Lupeol
Acido ursólico
Acido oleanólico
Catequina
Quercetina-3-O-α-L-arabinopiranosídeo
Ácido gálico
Galato de metila
Proantocianidinas
Dados cedidos pela equipe do Dr. Wagner Vilegas.
4.1.2 Byrsonima crassa
Extrato CHCl
3
de Byrsonima crassa
Mutagenicidade
Foi realizada a avaliação do potencial mutagênico do extrato CHCl
3
e os
resultados não evidenciaram atividade mutagênica (CARDOSO et. al 2006).
Antimutagenicidade
As concentrações testadas do extrato CHCl
3
de
B. crassa na linhagem TA97a
não apresentaram redução no número de colônias revertentes frente ao agente
mutagênico direto (NPD) (Tabela 7; Figura 13). Entretanto, mostrou-se positivo na
redução no número de colônias revertentes, para as cinco concentrações testadas contra
mutágenos indiretos (AFB1, B[A]P) (Tabela 8; Figura 13).
As concentrações testadas do extrato CHCl
3
de B. crassa na linhagem
TA98, não mostraram uma redução no número de colônias revertentes frente a
ação do NPD (Tabela 7, Figura 14). Em presença de S9, o extrato mostrou uma
redução significativa no número de colônias revertentes por placa (Tabela 8).
Analisando-se o resultado obtido na linhagem TA98 frente ao NPD associado ao
extrato CHCl
3
de B. crassa, observa-se um aumento no número de revertentes,
que, provavelmente é resultado de uma interação mutágeno extrato, aumentando o
potencial mutagênico do NPD (Tabela 7).
A linhagem TA100 demonstra que foi possível reduzir o número de
colônias revertentes com o extrato CHCl
3
de B. crassa com valores em torno de 50%,
quando testada frente a mutágenos diretos (Tabela 7, Figura 15). Na presença de S9, a
redução no número de colônias revertentes pode ser observada quando testado contra o
potencial mutagênico do B[a]P. Porém, apresentou efeito citotóxico frente a AFB
1
(Tabela 8, Figura 15).
Nos testes realizados sem metabolização com a linhagem TA102 não foi
verificado redução significativa no número de colônias revertentes quando testado
frente a MC nas duas menores concentrações. Entretanto, quando testado frente ao
peróxido de hidrogênio sem ativação metabólica, o extrato apresentou índice de redução
significativo no número de colônias revertentes, em todas as concentrações testadas
(Tabela 7, Figura 16). Com ativação metabólica também demonstraram redução
significativa (Tabela 8, Figura 16).
Tabela 7. Atividade antimutagênica expressa pela média, desvio padrão do número de revertentes e percentual
de inibição (valor entre parênteses) do extrato CHCl
3
B. crassa frente a compostos mutagênicos –S9, utilizando
as linhagens TA97a, TA98, TA100 e TA102 de S. typhimurium.
Linhagens
Mutágenos
Concentração do extrato
(mg/placa) Número
derevertentes M±SD (%
inibição)
NPD
0,74
1,48
2,97
5,95
8,95
TA97a
810±30
711±35
(12)
826±72
(0)
823±40
(0)
729±55
(10)
724±32
(10)
TA98
504±9
1270±274
(0)
823±185
(0)
738±42
(0)
509±82
(0)
530±37
(0)
AZS
TA100
2373±90
1493±182
(37)
1330±112
(44)*
1167±125
(50)*
1122±98
(52)*
1074±141
(54)*
MC
TA102
1737±77
1062±147
(38)
1057±134
(39)
910±90
(47)*
900±83
(48)*
948±55
(45)*
H
2
O
2
TA102
614±18
325±15
(47)*
340±3
(44)*
268±15
(56)*
205±14
(66)*
162±2
(73)*
NPD (4-nitro-o-phenilenediamina – 10,0 g/placa); AZS = Azida Sódica (1,25 g/placa); MC = Mitomicina C
(0,5 g/placa); H
2
O
2
= Peróxido de hidrogênio (0,034mg/placa); MeOH – Extrato Metanólico. Tox= viabilidade
< 60%; *= antimutagênico.
Tabela 8. Atividade antimutagênica expressa pela média, desvio padrão do número de revertentes e percentual
de inibição (valor entre parênteses) do extrato CHCl
3
de B. crassa frente a compostos mutagênicos +S9,
utilizando as linhagens TA97a, TA98, TA100 e TA102 de S. typhimurium
Linhagens
Mutagenos
Concentração do extrato (mg/placa)
Número de revertentes M±SD
(% inibição)
AFB
1
0,74
1,48
2,97
5,95
8,95
TA97a
1182,66±45
232±14
(80)*
216±6
(82)*
182±7
(85)*
181±5
(85)*
178±9
(85)*
TA98
613±16
184±10
(70)*
205±17
(67)*
194±2
(68)*
183±9
(70)*
135±10
(78)*
TA100
1627±77
436±8.5
(tox)
338±9.2
(tox)
256±9.6
(tox)
131±9,5
(tox)
80±12
(tox)
B[a]P
TA97a
794±6
289±20
(63)*
286±46
(63)*
219±20
(72)*
246±8
(69)*
147±5
(81)*
TA98
595±1
53±9
(91)*
54±1
(91)*
40±2
(93)*
41±1
(93)*
28±5
(95)*
TA100
710±22
280±36
(61)*
219±4
(69)*
149±28
(79)*
143±46
(80)*
130±15
(82)*
H
2
O
2
TA102
614±18
235±16
(61)*
198±21
(67)*
135±19
(78)*
148±39
(76)*
107±21
(83)*
H
2
O
2
= Peróxido de hidrogênio (0,034mg/placa); AFB
1
=Aflatoxina (0,5 g/placa); B[a]P= Benzo(a)pireno
(1 g/placa); CHCl
3
– Extrato Cloroformico. Tox= viabilidade < 60%; *= antimutagênico
12
0
0
10
10
80
82
85
85
85
63
63
72
69
81
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Percentual de inibição
Byrsonima crassa CHCl3 TA97a
NDP
Aflatoxina
Benzo[a]pireno
Figura 13: Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. crassa quando testado com a linhagem TA97a. NPD
(4-nitro-o-phenilenediamina – 10,0 g/placa);Aflatoxina B
1
(0,5 g/placa), Benzo[a]pireno (1 g/placa); CHCl
3
–
Extrato Clorofórmico.
Figura 14: Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. crassa quando testado com a linhagem TA98.
NPD (4-nitro-o-phenilenediamina – 10,0 g/placa);Aflatoxina B
1
(0,5 g/placa), Benzo[a]pireno
(1 g/placa); CHCl
3
– Extrato Clorofórmico.
70
67
68
70
78
91
91
93
93
95
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Percentual de inibição
Byrsonima crassa CHCl
3
TA98
Benzo[a]pireno
Aflatoxina
0,74 1,48 2,97 5,95 8,95 0,74 1,48 2,97 5,95 8,95 0,74 1,48 2,97 5,95 8,95
Concentrações
0,74 1,48 2,97 5,95 8,95 0,74 1,48 2,97 5,95 8,95
Concentrações
0,74 1,48 2,97 5,95 8,95 0,74 1,48 2,97 5,95 8,95
Concentrações
38
39
47
48
45
47
44
56
66
73
61
67
78
76
83
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Percentual de inibição
Byrsonima crassa CHCl
3
TA102
Mitomicina C
H2O2 s/S9
H2O2 c/S9
Figura 15: Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de B. crassa quando testado com a linhagem TA100.
Azida Sódica (1,25 g/placa);Aflatoxina B
1
(0,5 g/placa), Benzo[a]pireno (1 g/placa); CHCl
3
– Extrato
Clorofórmico.
Figura 16: Percentual de inibição da mutagenicidade pelo do extrato CHCl
3
de B. crassa quando testado com
a linhagem TA102. Mitomicina C (0,5 g/placa); H
2
O
2=
Peróxido de hidrogênio (0,034mg/placa); CHCl
3
–
Extrato Clorofórmico.
37
43
50
52
54
61
69
79
80
87
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Percentual de inibição
Byrsonima crassa CHCl
3
TA100
Azida sódica
Benzo[a]pireno
0,74 1,48 2,97 5,95 8,95 0,74 1,48 2,97 5,95 8,95 0,74 1,48 2,97 5,95 8,95
Concentrações
0,74 1,48 2,97 5,95 8,95 0,74 1,48 2,97 5,95 8,95
Concentrações
Estudo fitoquímico do extrato CHCl
3
de B. crassa
As substâncias isoladas no estudo fitoquímico do extrato CHCl
3
de B.
crassa estão demonstradas na Tabela 9.
Tabela 9. Perfil fitoquímico do extrato clorofórmico de B. crassa.
Àcido Gálico
Galato de metila
Quercetina-3-O-β-D- Glucopiranosídeo
Quercetina-3-O-β-D-Galactopiranosídeo
Quercetina-3-O-α-L-Arabinopiranosídeo
Quercetina-3-O-α-L (2”-Galoil)-Arabinopiranosídeo
Quercetina-3-O-β-D-(2”-Galoil)-Galactopiranosídeo
Lupeol
α-Amirina
β-Amirina
α-Amirenona
Amentoflavona
(+)-Catequina
(-)-Epicatequina
Dados cedidos pela equipe do Dr. Wagner Vilegas.
4.1.3 Davilla elliptica
Extrato CHCl
3
de Davilla elliptica
Mutagenicidade
Os resultados do teste de mutagenicidade do extrato CHCl
3
de Davilla
elliptica, estão mostrados na Tabela 10 e na Figura 17. Fica evidente que o extrato
mostrou-se não mutagênico frente as linhagens TA100, TA102 e TA97a, quando testado
com e sem ativação metabólica. Entretanto, quando foi avaliado frente a linhagem TA98
com ativação metabólica o referido extrato apresentou-se mutagênico para as duas
menores concentrações.
Tabela 10: Atividade mutagênica do extrato CHCL
3
da planta Davilla elliptica nas linhagens TA98, TA97a,
TA100 e TA102 de Salmonella typhimurium, em ausência e presença de ativação metabólica.
Tratamento
(mg/placa)
Número de revertentes/placa em linhagens de S.typhimurium (M SD)
TA98
TA97a
TA100
TA102
-S9
+S9
-S9
+S9
-S9
+S9
-S9
+S9
CHCl
3
0,00
a
17 4
22 3
162 15
143 8
188 50
142 16
316 12
244 26
0,65
23 4
54 4
**
181 7
184 16
158 18
152 9
310 10
322 15
*
1,30
17 5
59 7
**
191 20
183 17
167 16
133 9
315 56
363 10
*
2,60
16 6
34 4
*
197 26
171 19
163 6
135 5
203 30
341 10
*
5,20
16 3
27 5
236 15
*
188 16
207 0
160 22
162 14
239 18
7,80
19 6
29 4
192 19
145 7
205 38
117 35
125 9
247 34
C+
b
463 59
381 40
1115 8
813 10
1118 3
779 59
908 61
1688 36
*
P<0.05 (ANOVA)
**
P<0.01 (ANOVA), M SD= média desvio padrão
a
Controle negativo: dimetilsulfóxido,
75µl/placa.
b
Controles positivos: 4-nitrofenilenodiamino, 10 g/placa (TA98 e TA97a); azida sódica, 2,5 g/placa
(TA100); mitomicina, 3 g/placa (TA102), em ausência de S9 e 2-antramino, 3 g/placa (TA98, TA97a,TA100); 2-
aminofluoreno, 10 g/placa (TA102).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0,65
1,3
2,6
5,2
7,8
RM
Concentrações
Razão de mutagenicidade
TA97a -S9
TA97a+S9
TA98 -S9
TA98 +S9
TA100 -S9
TA100 +S9
TA102 -S9
TA102 +S9
Figura 17. Razões de mutagenicidade (RM) observadas nas linhagens de Salmonella typhimurium expostas a
diferentes concentrações do extrato CHCL
3
da planta Davilla elliptica, na ausência e presença de ativação
metabólica (S9). Esses resultados foram cedidos pela pós-graduanda Fabiana I. Biso que desenvolve o trabalho de
mutagenicidade com essa espécie.
Antimutagenicidade
Os resultados mostraram que para linhagem TA97a houve uma redução
significativa do número de colônias revertentes quando utilizadas até a concentração
de 8,35mg/placa contra a ação do mutágeno direto NPD (Tabela 11, Figura 18).
Quando avaliado com ativação metabólica o extrato mostrou-se citotóxico para AFB
1
,
porém, foi efetivo contra a ação do B[a]P (Tabela 12, Figura 18 ).
Na TA98 o extrato CHCl
3
de D. elliptica, também apresentou uma diminuição
significativa do número de colônias revertentes em algumas das concentrações
utilizadas sem ativação metabólica (Tabela 11, Figura 19). Os testes de avaliação do
extrato com ativação metabólica (+S9) também mostraram que houve uma redução
significativa no número de colônias revertentes por placa. (Tabela 12, figura 19). Com
índices de redução de até 95%.
Verificou-se também a ocorrência de redução no número de colônias
revertentes quando testado em conjunto com a AZS na linhagem TA100 (Tabela 11). E
quando testado contra o potencial mutagênico da AFB
1
e do B[a]P, mostrou-se eficiente
frente a AFB
1
, porém, foi citotóxico para as duas maiores concentrações quando testado
em conjunto com B[a]P (Tabela 12, Figura 20).
Nos testes realizados sem metabolização com a linhagem TA102 frente
a MC foi possível observar uma redução significativa no número de colônias revertentes
apenas para a maiores concentrações. Utilizando o peróxido de hidrogênio com o agente
indutor sem ativação metabólica, o extrato apresentou índice de redução significativo no
número de colônias revertentes para maioria das concentrações avaliadas (Tabela 11,
Figura 21) Os testes realizados com ativação metabólica, também, demonstraram que
ocorreu redução significativa para as concentrações testadas (Tabelas 12, Figura 21).
Tabela 11. Atividade antimutagênica expressa pela média, desvio padrão do número de revertentes e percentual
de inibição (valor entre parênteses) do extrato CHCl
3
de Davilla elliptica frente a compostos mutagênicos
diretos, utilizando as linhagens TA97a, TA98, TA100 e TA102 de S. typhimurium.
Linhagens
Mutagenos
Concentração do extrato
(mg/placa)Número de revertentes M±SD
(% inibição)
NPD
1,04
2,08
4,17
8,35
12,52
TA97a
810±30
153±9
(81)
285±44
(64)
273±61
(66)
225±13
(72)
30±8
(tox)
TA98
504±9
320±22
(36)
319±22
(36)
293±30
(42)*
270±12
(46)*
237±41
(53)*
AZS
TA100
2373±90
2010±43
(15)
1751±209
(26)
1469±42
(38)
1288±319
(45)*
1131±42
(52)*
MC
TA102
1737±77
2116±210
(0)
1866±114
(0)
1562±267
(10)
1194±115
(31)
974±82
(43)
H
2
O
2
TA102
503±11
377±6
(25)
262±17
(48)*
212±1
(63)*
151±22
(70)*
103±2
(80)*
NPD (4-nitro-o-phenilenediamina – 10,0 g/placa); AZS =Azida Sódica (1,25 g/placa); MC = Mitomicina
C (0,5 g/placa); H
2
O
2
= Peróxido de hidrogênio (0,034mg/placa); MeOH – Extrato Metanólico; Tox=
viabilidade < 60%; *= antimutagênico.
Tabela 12. Atividade antimutagênica expressa pela média, desvio padrão do número de revertentes e percentual
de inibição (valor entre parênteses) do extrato CHCl
3
de Davilla elliptica frente a compostos mutagênicos
indiretos, utilizando as linhagens TA97a, TA98, TA100 e TA102 de S. typhimurium
Linhagens
Mutagenos
Concentração do extrato (mg/placa)
Número de revertentes M±SD
(% inibição)
AFB
1
1,04
2,08
4,17
8,35
12,52
TA97a
1182,66±45
231±16
(tox)
183±5
(tox)
206±10
(tox)
202±57
(tox)
159±11
(tox)
TA98
613±16
220±6
(64)*
187±17
(69)*
199±4
(67)*
161±18
(74)*
184±14
(70)*
TA100
1627±77
159±3
(91)*
151±16
(91)*
119±11
(93)*
127±10
(92)*
86±9
(95)*
B(a)P
TA97a
794±6
711±31
(10)
440±37
(44)*
397±89
(50)*
228±41
(71)*
178±16
(77)*
TA98
595±1
51±1
(91)*
38±6
(94)*
49±13
(91)*
30±11
(95)*
30±8
(95)*
TA100
710±22
268±36
(62)*
224±12
(68)*
160±34
(77)*
118±12
(tox)
120±29
(tox)
H
2
O
2
TA102
614±18
255±20
(58)*
340±18
(45)*
223±22
(64)*
209±13
(66)*
211±27
(66)*
(H
2
O
2
) Peróxido de hidrogênio (0,034mg/placa); AFB
1
=Aflatoxina B1 (0,5 g/placa), B(a)P = Benzo[a]apireno
(1 g/placa); CHCl
3
– Extrato Clorofórmico. Tox= viabilidade < 60%; *= antimutagênico.
Figura 18. Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de D. elliptica quando testado com a linhagem TA97a. NPD
(4-nitro-o-phenilenediamina – 10,0 g/placa); Benzo[a]apireno (1 g/placa); CHCl
3
– Extrato Clorofórmico.
1,04 2,08 4,17 8,35 1,04 2,08 4,17 8,35 12,5
Concentrações
Figura 19: Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de D. elliptica quando testado com a linhagem TA98; NPD (4-
nitro-o-phenilenediamina – 10,0 g/placa);Aflatoxina B1 (0,5 g/placa), Benzo[a]pireno (1 g/placa); CHCl
3
–
Extrato Clorofórmico
Figura 20: Percentual de inibição do extrato CHCl
3
de D. elliptica quando testado com a linhagem TA100.
Azida Sódica (1,25 g/placa);Aflatoxina B
1
(0,5 g/placa), Benzo[a]apireno (1 g/placa); CHCl
3
– Extrato
Clorofórmico.
1,04 2,08 4,17 8,35 12,5 1,04 2,08 4,17 8,35 12,5 1,04 2,08 4,17 8,35 12,5
Concentrações
1,04 2,08 4,17 8,3 12,5 1,04 2,08 4,17 8,3 12,5 1,04 2,08 4,17
Concentrações
Figura 21: Percentual de inibição do extrato CHCl3 de D. elliptica quando testado com a linhagem
TA102;Mitomicina C (0,5 g/placa); (H2O2) Peróxido de hidrogênio (0,034mg/placa); CHCl3 –
Extrato Clorofórmico.
Estudo fitoquímico do extrato CHCl3 de D. elliptica
Os dados do estudo fitoquímico realizado com o extrato CHCl3 de D.
elliptica estão apresentados na Tabela 13.
Tabela 13: Perfil fitoquímico do extrato clorofórmico de D. elliptica.
Àcido Gálico
Quercetina
Miricetina
Quercetina-3-O-β-D-Galactopiranosídeo
Quercetina-3-O-α-L-Raminopiranosídeo (Quercitrina)
Miricetina-3-O-α-L-Raminopiranosídeo (Miricitrina)
Quercetina-3-O-α-L-Raminopiranosil-(1→6)-β-D- Glucopiranosídeo- (Rutina)
Miricetina-3-O-α-L-(2”-Galoil)-Raminopiranosídeo
Miricetina-3-O-α-L-(3”-Galoil)-Raminopiranosídeo
Miricetina-3-O-β-D-Galactopiranosideo
Miricetina-3-O-β-D-Glucopiranosídeo
Miricetina-3-O-β-D-(2”-O-Galoil)-Galactopiranosíde
(-)-epicatequina
Vomifoliol
Dados cedidos pela equipe do Dr. Wagner Vilegas
4,17 8,3 12,5 1,04 2,08 4,17 8,3 12,5 1,04 2,08 4,17 8,3 12,5
Concentrações
4.2 Teste do micronúcleo
4.2.1 Mutagenicidade
Foi empregado o teste do micronúcleo em células do sangue periférico de
camundongos, submetidos a tratamento agudo, para avaliar o potencial mutagênico dos
extratos vegetais CHCl
3
e MeOH de B. basiloba, CHCl
3
de B.crassa e CHCl
3
de D.
elliptica.
Os resultados na Tabela 14 mostram que quando comparados os grupos
tratados com os extratos com o grupo controle negativo, não foram observadas
diferenças estatisticamente significativas. Todos os extratos foram avaliados na maior
concentração utilizada.
TABELA 14. Número de células micronucleadas por animal, média e desvio padrão
para camundongos tratados com os extratos de diferentes espécies vegetais, diluídos em
óleo de soja, via gavage e os respectivos controles.
Animais
Tratamento/concentração
F1
F2
F3
M4
M5
M6
Média±SD
Controle positivo
21
23
24
25
22
25
23,33± 1,6
Controle solvente
1
2
2
2
1
3
1,83± 0,75
Controle pos + solvente
15
27
12
18
17
15
17,33±5,16
B. basiloba MeOH/166mg/mL
2
1
3
2
1
1
1,66±0,81
B. basiloba CHCl3/100mg/mL
2
2
1
1
1
1
1,30±0,51
B.crassa CHCl3/125mg/mL
1
1
1
2
2
1
1,33±0,51
D. elliptica CHCl3/111mg/mL
2
2
1
1
3
1
1,66±0,81
Controle negativo= óleo de soja; Controle Positivo= Ciclofosfamida 50 mg/kg p.c.;
CHCl3= Extrato Clorofórmico, MeOH= extrato metanólico; SD= desvio padrão;P≤0,05.
4.2.2 Antimutagenicidade
A comparação das médias do número de reticulócitos micronucleados (MNRet)
obtidos nos tratamentos controle positivo (ciclofosfamida) e na associação
ciclofosfamida com o óleo, mostrou que não foi observada redução significativa no
número de células micronucleadas. Portanto, a redução no número de MNRet no
tratamento onde ocorreu a associação dos extratos com o agente indutor não foi devida
ao óleo. A Tabela 15 mostra os resultados da avaliação do potencial antimutagênico dos
extratos nas três diferentes concentrações utilizadas. Na tabela 16 estão os percentuais
de redução obtidos.
Extrato MeOH de B.basiloba
Pode-se observar que em ensaio realizado com o extrato MeOH de B.basiloba
associado a ciclofosfamida o número de células micronucleadas sofreu uma redução de
43,73% quando administrado na dosagem de 166mg/mL em relação ao número de
células micronucleadas do grupo tratado apenas com ciclofosfamida. Para concentração
de 124,5mg/mL a redução apresentada no número de células micronucleadas foi de
49,66%. Sendo que, quando a concentração foi reduzida para 83 mg/mL o índice de
redução observado caiu para 42,97%. As reduções no número de MNRet apresentadas
pelas concentrações utilizadas foram estatisticamente significativa P≤0,05(Tabela 16). A
Figura 22 representa as médias dos números de reticulócitos micronucleados obtidos em
cada tratamento.
Extrato CHCl
3
de B. basiloba
Quando foram comparadas as médias obtidas nos ensaios com o extrato CHCl
3
de B. basiloba associado com ciclofosfamida com as médias do grupo com a associação
de controle positivo (só ciclofosfamida) associado com óleo, observa-se que para a
concentração de 100mg/mL, a redução no número de micronúcleos é bem menor
(7,42%) do que as observadas com as contrações de 75mg/mL (40%) e de 50mg/mL
(40,75%). A redução observada para a concentração de 100mg/mL não foi
estatisticamente significante. Entretanto, a redução no número de reticulócitos
micronucleados das outras duas concentrações mostrou-se estatisticamente significativa
P≤0,05 (Figura 23).
Extrato CHCl
3
de B. crassa
Para o extrato CHCl
3
de B. crassa o resultado obtido para a concentração de
125mg/mL em conjunto com ciclofosfamida foi o único a reduzir significativamente o
número de células que apresentaram micronúcleos (48,17%). Para as concentrações de
93,75mg/mL e 62,5mg/mL não ocorreu redução no número de micronúcleos (Figura
24).
Extrato CHCl
3
de D. elliptica
O extrato CHCl
3
de D. elliptica apresentou resultados positivos para todas
concentrações testadas (111 mg/mL, 83,25 mg/mL e 55mg/ml) com índices de redução
de 41,56%, 51,86% e 42,9% respectivamente. Portanto, ocorreu redução no número de
micronúcleos para todas as concentrações (Figura 25).
Tabela 15: Avaliação antimutagênica dos extratos através do teste de micronúcleo em células de sangue
periférico de camundongos tratados com ciclofosfamida.
Animais
Machos Fêmeas
Tratamento
1
2
3
4
5
6
Média±SD
Controle -
2
3
4
3
3
4
3,16±0,75
Solvente
3
5
3
6
7
4
4,66±1,63
Controle +
21
23
24
25
22
25
23,33±1,63
Controle (+) + solvente
22
27
25
21
19
21
22,5±2,94
MeOH de B.basiloba
Ciclo+166mg/mL
11
11
13
11
17
13
12,66±2,33*
Ciclo+124,5mg/mL
11
8
18
12
9
9
11,16±3,65*
Ciclo+83mg/mL
8
19
14
11
12
13
12,83±3,65*
CHCl
3
de B. basiloba
Ciclo+100mg/mL
16
16
32
31
16
14
20,83±8,30
Ciclo+75mg/mL
12
9
9
17
22
12
13,5±5,08*
Ciclo+50mg/mL
11
12
13
19
9
16
13,33±,61*
CHCl
3
de B. crassa
Ciclo+125mg/mL
14
19
7
12
9
9
11,66±4,36*
Ciclo+93,75mg/mL
32
28
20
35
30
36
30,16±5,81
Ciclo+62,5mg/mL
29
27
28
19
23
18
24±4,73
CHCl
3
de D. elliptica
Ciclo+111mg/mL
8
16
14
11
14
16
13,16±3,12*
Ciclo+83,25mg/mL
15
11
9
9
11
10
10,83±2,22*
Ciclo+55,5mg/mL
8
19
14
11
12
13
12,83±3,65*
CHCl
3
= clorofórmico; MeOH= metanólico; SD= desvio padrão; Ciclo= Ciclofosfamida;
Solvente= óleo de soja; Controle + = Ciclofosfamida 50mg/kg p.c.; Controle - = água;
*= P≤0,05.
3
23,33
22,5
12,66
11,16
12,83
0
5
10
15
20
25
Número de Micronúcleos
Byrsonima basiloba MeOH
Água
Ciclo
Ciclo+óleo
Ciclo+ 166mg/ml
Ciclo+124,5mg/ml
Ciclo + 83mg/ml
Tabela 16: Índices de redução do número de micronúcleos obtidos com os extratos testados.
Extrato
Concentração mg/ml
Índice de redução
MeOH de B. basiloba
83
42,97%
124,5
49,66%
166
43,73%
CHCl
3
de B. basiloba
50
40,75%
75
40%
100
7,42%
CHCl
3
de B. crassa
62,5
0,00%
93,75
0,00%
125
48,17%
CHCl
3
de D.elliptica
55,5
42,97%
83,25
51,86%
111
41,56%
CHCl
3
– Extrato Clorofórmico; MeOH – Extrato
metanólico.
Figura 22: Médias do número de micronúcleo por grupo de tratamento; Ciclo – Ciclofosfamida (50mg/kg
peso corpóreo); MeOH – Extrato metanólico.
a
estatisticamente não significativo;
b
estatisticamente
significativo(P≤0,05).
b
b
b
a
3
23,33
22,5
11,16
30,16
24
0
5
10
15
20
25
30
35
Número de Micronúcleo
Byrsonima crassa CHCl
3
Água
Ciclo
Ciclo + óleo
Ciclo + 125mg/ml
Ciclo + 93,75mg/ml
Ciclo + 62,5mg/ml
Figura 23: Médias do número de micronúcleo por grupo de tratamento Ciclo – Ciclofosfamida (50mg/kg
peso corpóreo); CHCl
3
– Extrato Clorofórmico.
a
estatisticamente não significativo;
b
estatisticamente
significativo (P≤0,05).
Figura 24: Médias do número de micronúcleo por grupo de tratamento; Ciclo – Ciclofosfamida (50mg/kg
peso corpóreo); CHCl
3
– Extrato Clorofórmico.
a
estatisticamente não significativo;
b
estatisticamente
significativo(P≤0,05).
3
23,33
22,5
20,83
10,16
13
0
5
10
15
20
25
Números de micronúcleos
Byrsonima basiloba CHCl
3
Água
Ciclo
Ciclo + óleo
Ciclo + 100mg/ml
Ciclo + 75mg/ml
Ciclo + 50mg/ml
b
a
a
a
a
a
b
b
3
23,33
22,5
13,16
10,83
12,83
0
5
10
15
20
25
Número de micronúcleos
Davila elliptica CHCl
3
Água
Ciclo
Ciclo + óleo
Ciclo + 111mg/ml
Ciclo + 83,75mg/ml
Ciclo + 55,5mg/ml
Figura 25: Médias do número de micronúcleo por grupo de tratamento Ciclo – Ciclofosfamida (50mg/kg
peso corpóreo); CHCl
3
– Extrato Clorofórmico;
a
estatisticamente não significativo;
b
estatisticamente
significativo (P≤0,05).
4.3 Substâncias Isoladas
Diante dos resultados dos ensaios de antimutagenicidade apresentados
pelos extratos foi necessária a avaliação do potencial mutagênico e antimutagênico de
algumas das substâncias isoladas (Ácido gálico, Quercetina-3-o-α-L-raminopiranosídeo,
Quercetina, Miricetina-3-o-α- L-raminopiranosídeo, Galato de metila, (+)catequina,
Lupeol) a partir dos extratos na tentativa de identificar o possível agente responsável
pelas reduções da mutagenicidade induzida. As substâncias avaliadas foram
selecionadas pelo rendimento no processo de extração,ou seja, disponibilidade do
composto. Por essa razão, algumas das substâncias detectadas no estudo fitoquímico não
foram avaliadas.
a
a
b
b
Para avaliar o potencial mutagênico e antimutagênico destas substâncias,
foram realizados ensaios através do teste de Ames e do teste que envolve análise dos
danos de DNA plasmidial. Os resultados obtidos estão demonstrados nas Tabelas 17 e
18 e nas Figuras de 26-29. Ensaios in vivo não puderam ser realizados devido a
quantidade de substâncias isoladas não ter sido suficiente.
4.3.1 Teste de Ames
Para realização do teste de Ames com os compostos isolados foi
escolhida a linhagem TA98, por ter sido a linhagem que apresentou os
melhores resultados nos testes realizados com os extratos.
Mutagenicidade
Os resultados observados na Tabela 17 demonstram que a maioria dos
compostos isolados não induziu aumento da freqüência normal de revertentes quando
comparados à freqüência do controle negativo. Porém, a quercetina foi a única
substância que apresentou aumento significativo no número de revertentes.
Tabela 17: Atividade mutagênica expressa pela média, desvio padrão do número de revertentes na linhagem TA98 de S.
typhimurium tratadas com 75µg/placa das substâncias isoladas dos extratos.
Linhagem
Número de revertentes M±SD
ESP
DMSO
NPD
B[a]P
AG
GM
Q
QH
M
C
L
TA98 –
S9
48±
4
44±
4
236± 4,3
38± 4
38,25±
4
197,5±
14
41,75±
6,5
51,75±
4
46,25±
9,2
42,75±
9,4
TA98
+S9
46±
3,3
38±
4
196±
4,3
36±
4,5
37,5±
3,7
223±
28,9
33,75±
5,5
37,5±
3,2
45±
7,5
44,5±
4,5
ESP= Espontâneo, DMSO= controle negativo, AG= ácido gálico, GM= galato de metila, Q= quercetina, QH= Quercetina-3-o-α-L-
raminopiranosídeo, M= Miricetina-3-o-α- L-raminopiranosídeo, C= catequina, L= lupeol.
Antimutagenicidade
Foi realizada a avaliação do potencial antimutagênico dos
compostos isolados dos extratos através do teste de Ames utilizando-se a
linhagem TA98 de S. typhimurium. Como pode-se observar os melhores
resultados foram obtidos quando testado contra o agente indutor direto NPD,
sendo que, os melhores índices de redução foram obtidos com o Lupeol e
Catequina (53% e 52% respectivamente). O restante das substâncias com
exceção da quercetina mantiveram o índice de redução por volta de 40% como
mostrado na Tabela 18.
Quando testados contra mutágeno indireto os resultados mostram
que os índices de redução giram entorno de 30% que neste trabalho não foram
considerados efeitos protetores. Como já descrito anteriormente serão
consideradas com efeito protetor satisfatório apenas as substâncias que
apresentarem índices de redução acima de 40%.
Tabela 18. Atividade antimutagênica expressa pela média, desvio padrão do número de revertentes e
percentual de inibição (valor entre parênteses) dos compostos frente à mutágenos diretos e indiretos,
utilizando a linhagem TA98 de S. typhimurium.
Número de revertentes M±SD
(% inibição)
Linhagem
Tratamento
TA98 –S9
TA98 +S9
ESP
48±4
46±3,3
Controle -
44±4
46,3±1,2
Controle +
236±4,3
196±4,3
AG+ Controle +
133,25±13,6
(44)
137,25±12,6
(30)
GM+ Controle +
136,25±11,5
(42)
151,25±3,6
(23)
Q+ Controle +
405±29
(0)
215,7±7,76
(0)
QH+ Controle +
127,5±22,8
(46)
137,5±12,4
(30)
M+ Controle +
137±11,5
(42)
145,5±6,6
(26)
C+ Controle +
112,2±21
(52)
140,5±9
(28)
L+ Controle +
110,75±14,1
(53)
137±0,5
(30)
ESP.= Espontâneo; D=DMSO, AG= ácido gálico, GM= galato de metila, Q= quercetina, QH=
quercetina raminopiransídeo, M= Miricetina-3-o-α- L-raminopiranosídeo, C= catequina, L= lupeol.
Controle + (-S9)=NPD (4-nitro-o-phenilenediamina – 10,0 g/placa); Controle + (+S9)=
Benzo[a]pireno (1 g/placa). Para todos os extratos foi utilizada a concentração de 75µg/placa.
4.3.2 Teste do Plasmídeo
O teste do plasmídeo foi empregado para analisar o potencial genotóxico e
antigenotóxico de algumas substâncias puras obtidas a partir dos extratos MeOH e
CHCl
3
de B. basiloba, CHCl
3
de B. crassa e CHCl
3
de D.elliptica. As substâncias
utilizadas nesta avaliação foram, Ácido Gálico, Galato de metila, Quercetina-3-o-α-L-
raminopiranosídeo, Miricetina-3-o-α- L-raminopiranosídeo, Catequina e Lupeol.
Como mostra a Figura 26, as substâncias não apresentaram potencial genotóxico
quando testadas na concentração de 0,9 mg/mL, com exceção da quercetina que
promoveu a quebra nesta concentração.
Figura 26: Foto do gel do teste de genotoxicidade das substâncias puras isoladas dos extratos MeOH e
CHCl
3
de B. basiloba, CHCl
3
de B. crassa e CHCl
3
de D.elliptica. na concentração de 0,9mg/mL.(A=
água, D=DMSO, CE= cloreto de estanho, AG= ácido gálico, GM= galato de metila, Q= quercetina,
QH= Quercetina-3-o-α-L-raminopiranosídeo M= Miricetina-3-o-α- L-raminopiranosídeo, C= catequina,
L= lupeol. Seta vermelha = DNA plasmidial em forma circulo aberto; seta verde = DNA plasmidial em
forma superenovelada.
Para avaliar o potencial antigenotóxico das substâncias isoladas dos
extratos,os plasmídeos foram tratados com duas concentrações de cada substância em
combinação com cloreto de estanho na concentração de 200μL/mL.
Os testes realizados para verificar o potencial antigenotóxico das
substâncias isoladas dos extratos mostrram que ambas as concentrações utilizadas na
maioria dos casos foram capazes de reduzir os danos causados ao DNA pelo cloreto de
A D CE AG GM Q QH M C L
estanho. As fotos dos géis de agarose foram analisadas através do software
AlphaEaserFC que analisa as imagem obtidas na revelação do gel de eletroforese e que
permite fazer comparações pela intensidade do padrão de bandas. A Figura 27 mostra a
comparação do percentual de quebras observado nos tratamentos com as duas diferentes
concentrações utilizadas, ou seja, na concentração de 0,9 mg/mL e 0,45 mg/mL. Pode-se
verificar que o acido gálico e lupeol quando utilizados na concentração de 0,9mg/mL
reduziram de maneira significativa o número de quebras. Diferentemente dos resultados
observados com miricetina e catequina, onde houve uma inversão nos resultados
obtidos, pois, na concentração de 0,45 mg/mL a redução observada foi maior que a
obtida para a concentração de 0,9 mg/mL.
Figura 27. Percentual de quebras. Controles positivos, negativos e tratamento associados controle positivo +
compostos (0,9mg/mL e 0,45mg/ml). D=DMSO, CE= cloreto de estanho, AG= Ácido Gálico, GM= Galato de
Metila, Q= Quercetina, QH= Quercetina-3-o-α-L-raminopiranosídeo, M= Miricetina-3-o-α- L-raminopiranosídeo,
C= Catequina, L= Lupeol.
CN CE AG GM Q QH M C L
As figuras 28 e 29 mostram o géis do tratamento das substâncias 0,9
mg/mL e 0,45 mg/mL respectivamente em conjunto com CE 200μg/mL onde pode-se
observar as três conformações do plasmídeo quando tratado com CE. No restante dos
tratamentos onde houve a associação com as substâncias observa-se apenas as
conformações circular e superenovelada.
Figura 28. Gel do teste antimutagênico das substâncias puras isoladas dos extratos na concentração de
0,9mg/mL.(A= água, D=DMSO, CE= cloreto de estanho, AG= ácido gálico, GM= galato de metila, Q=
quercetina, QH= Quercetina-3-o-α-L-raminopiranosídeo, M= Miricetina-3-o-α- L-
raminopiranosídeo, C= catequina, L= lupeol. Seta vermelha = DNA plasmidial em forma circulo aberto;
seta azul = DNA plasmidial na forma linear; seta verde = DNA plasmidial em forma superenovelada.
AC QH Q M GM C L A CE D
Figura 29. Gel do teste mutagênico das substâncias pura isoladas dos extratos na concentração de
0,45mg/mL.(A= água, D=DMSO, CE= cloreto de estanho, AG= ácido gálico, GM= galato de metila,
Q= quercetina, QH= quercetina-3-O-a-L-arabinopiranosideo, M= Miricetina-3-o-α- L-
ramnopiranosídeo, C= catequina, L= lupeol. Seta vermelha = DNA plasmidial em forma circulo
aberto; seta azul = DNA plasmidial na forma linear; seta verde = DNA plasmidial em forma
superenovelada).
A CE D AG QM Q M GM C L
5. DISCUSSÃO
Com base nas informações da literatura e resoluções das agências
regulamentadoras de novos produtos químicos e farmacológicos, neste estudo foram
desenvolvidos o teste de Ames, micronúcleo e de danos no DNA plasmidial para avaliar
o potencial mutagênico e antimutagênico de três espécies vegetais, a partir de quatro
extratos: MeOH e CHCl
3
de B. basiloba, CHCl
3
de B. crassa e CHCl
3
de D. elliptica
além das substâncias isoladas destes extratos: ácido gálico, galato-de-metila,
quercetina-3-o-α-L-raminopiranosídeo, quercetina, miricetina-3-o-α- L-
raminopiranosídeo, lupeol e catequina.
5.1- Extratos
Para melhor entendimento, a discussão foi separada por extrato e logo
depois as substâncias puras apresentando os ensaios de mutagenicidade e em seguida os
de antimutagenicidade, de acordo com as espécies estudadas.
Extrato MeOH de B.basiloba
Foram realizados testes in vivo e in vitro para verificar o potencial
mutagênico do extrato MeOH de B. basiloba. De acordo com os resultados do teste in
vitro em nenhuma das concentrações e linhagens utilizadas, o extrato induziu ao
aumento do número de colônias revertentes de forma significativa (LIRA, et a. 2007 in
press). Os resultados do teste in vivo estão mostrados na Tabela 14, onde não foi
observado aumento no número de células micronucleadas quando se compara os grupos
controle negativo com os grupos tratados com o extrato MeOH de B. basiloba, na
concentração de 166mg/mL que é a concentração máxima de solubilidade do extrato no
solvente utilizado. Portanto, fica evidenciado que nos sistemas testes utilizados e nas
concentrações utilizadas o extrato não apresentou atividade mutagênica. Estes
resultados são relevantes, pois este estudo tem também como objetivo avaliar o
potencial antimutagênico.
O estudo fitoquímico desse extrato está apresentado na Tabela 3. Dentre as
substâncias encontradas temos a amentoflavona e a quercetina que na literatura são
citadas como sendo mutagênicas (CARDOSO et al. 2006; MAKENA e CHUNG, 2007).
As demais substâncias (compostos fenólicos e triterpenos) são citadas como não
mutagênicas (RESENDE, et al, 2006; MAKENA e CHUNG, 2007).
De acordo com Cardoso et al. (2006) o extrato MeOH de B. crassa apresentou
atividade mutagênica e a principal substância responsável por esse efeito foi a
amentoflavona. Porém, em B. intermedia esse biflavonol presente em menor quantidade
induziu apenas sinais de mutagenicidade (SANNOMIYA et al. 2007). Portanto, também
em nosso caso, a quantidade de amentoflavona e quercetina presente no extrato não foi
suficiente para induzir esse efeito e isso ficou confirmado através da quantificação
dessas substâncias no extrato (LIRA et al. 2007, in press).
O potencial antimutagênico do extrato MeOH de B. basiloba, tanto in vitro
quanto in vivo quando testado contra a ação de vários agentes indutores diretos e
indiretos são mostrados nas Tabelas 1, 2, 15 e 16 e nas Figuras 6,7,8 e 22. Pode-se
constatar que quando testado na linhagem TA97a em conjunto com os agentes
mutagênicos este extrato foi citotóxico. Entretanto, observou-se uma redução em torno
de 80% no número de colônias revertentes na linhagem TA98 frente à ação do NPD, e
82% quando testado em conjunto com B[a]P.
Através do estudo fitoquímico, nesse extrato foi detectada a presença de
flavonóides tais como: catequina, miricetina, quercetina, entre outros, que são
biologicamente ativos e abundantemente presente nos vegetais (DAS, 1990). Entre as
atividades biológicas apresentadas pelos flavonóides pode-se destacar capacidade de
seqüestrar radicais livres, anticonvulsivante, anticancerígeno, imunomodulador (DAS,
1990; PARK, et al., 2004) além de antiviral, antiinflamatório, antioxidante e atitumoral
(ZUANAZZI e MONTANH, 2002. apud SIMÕES et al., 2004).
Em estudo desenvolvido através do teste de Ames utilizando a linhagem
TA100 verificou-se que flavonóides isolados de Rhus verniciflua foram capazes de
inibir a ação mutagênica da aflatoxina B1(AFB1) e N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG) (PARK, et al., 2004). Os resultados obtidos em nosso trabalho de certa
maneira concordam com os resultados obtidos por estes autores. Pois, em ensaios
realizados com o extrato de B. basiloba frente a AFB1 também apresentaram redução
no número de colônias revertentes por placa. Portanto, pode-se inferir que os
flavonóides contribuíram para a redução no número de colônias revertentes.
Já é sabido que os flavonóides e outros compostos fenólicos como taninos,
ácido gálico entre outros, apresentam propriedades antioxidantes, sendo que, os
mecanismos de ação envolvidos neste processo são: neutralização de ânions
superóxidos(O
2
), radicais hidroxila ou radical peróxido atuando de forma sinérgica com
vitaminas como a C e E. Alguns têm a capacidade de se ligar a íons metálicos
impedindo a atuação deste íons como canalizadores na formação de radicais livres,
inibição das enzimas cicloxigenase, lipoxigenase, NADPH-oxidase, xantina-oxidase e
fosfolipase, além de desenvolverem papel de estimuladores de enzimas com ação
antioxidante como a catalase e a superóxido-dismutase. Deste modo, os flavonóides
desenvolvem papel importante interferindo na formação e propagação de radicais livres
(TRUEBA e SANCHEZ, 2001).
Alguns flavonóides como a quercetina e a miricetina apresentaram a
capacidade de inibir a peroxidação microssomal de lipídeos (HARAGUCHI, 2001 in
SIMÕES, et al., 2004).
Além dos flavonóides nesse extrato foram também encontrados triterpenos
como ácido ursólico, ácido oleanólico, taninos entre outros.
Existe pelo menos cerca de 4000 triterpenóides na natureza sendo a
maioria facilmente encontrada nos vegetais (KELLY et al., 2002; PATOCKA, 2003) e
são várias as propriedades atribuídas aos triterpenos como: antiinflamatória, protetor do
sistema vascular, antialérgica, analgésica. Entretanto, os triterpenos pentacíclicos são os
que apresentam maior atividade anticancerígena como é o caso do ácido ursólico (AU),
ácido oleanólico (AO) lupeol, ácido boswelico entre outros (LOPES, 2005).
Entre os vários compostos isolados, os ácidos ursólico e oleanólico são dois
compostos que nos últimos anos vêm merecendo destaque na literatura devido às
propriedades biológicas, como efeitos benéficos ao sistema cardiovascular apresentado
em estudo realizado por Somova et al. (2003) e efeito imunomodulatório (Cárdenas et
al. 2004). Além disso, foi relatada a capacidade de inibir a atividade da tirosina quinase,
expressão da lipoxigenase, ciclooxigenase-2 (SUH et al., 1998; SUBBARAMAIAH et
al., 2000; SHISHODIA et al., 2003).
Estudo realizado para avaliar o potencial antimutagênico do AO e AU
através do teste de micronúcleo in vivo, demonstrou que tanto na forma isolada quanto
em mistura, ambos foram capazes de reduzir o número de células micronucleadas,
desenvolvendo ação protetora contra a ação da doxirrubicina (REZENDE et al., 2006).
Em outro estudo realizado com os ácidos ursólico e oleanólico, Niikawa et
al. (1993), utilizando teste de Ames também obtiveram resultados positivos para
inibição do potencial mutagênico do B[a]P na linhagemTA98. Os resultados obtidos
neste estudo corroboram com os resultados obtidos pelo autores citados.
Além disso, em trabalho realizado com outros triterpenóides (α-amirina e β-
amirina), através do teste do micronúcleo em camundongos, não evidenciaram atividade
mutagênica (VILLASEÑOR et al., 2004). Pelo contrário, vários trabalhos revelam
atividades biológicas bastante promissoras para esses compostos como
antimutagenicidade (RESENDE et al., 2006) e atividade antitumoral (FUKUDA et al.,
2006). Ainda em relação aos triterpenoides, em estudo desenvolvido também com a
mistura (α-amirina e β-amirina), constatou-se efeitos hepatoprotetores (OLIVEIRA et
al., 2005).
Os resultados obtidos no teste do micronúcleo mostraram que o extrato
metanólico, também apresentou atividade antimutagênica contra a ação da
ciclofosfamida associada às duas menores concentrações (50 e 75 mg/mL) testadas, este
potencial antimutagênico observado nos teste in vivo também foi observado no teste in
vitro, visto que no teste de Ames, este extrato apresentou o mesmo comportamento
frente a vários agentes mutagênicos, mostrando a eficiência na proteção do DNA a
diferentes indutores de danos.
Extrato CHCl
3
de B. basiloba
Os testes com Salmonella para avaliação do potencial mutagênico deste
extrato não apresentaram resultados positivos em nenhuma das linhagens testadas com
ou sem ativação metabólica (LIRA et al.2007 in press) da mesma maneira, não foi
observada atividade mutagênica no teste de micronúcleo.
A avaliação do potencial antimutagênico deste extrato mostrou que frente
aos agentes mutagênicos NPD e AZS, ocorreu uma redução significativa no número de
colônias revertentes, sendo obtidos os melhores resultados nas linhagens TA97a onde
foram alcançados índices de redução de até 78%. Para a linhagem TA98 o maior índice
de redução foi de 61% para maior concentração utilizada quando testado em conjunto
com o NPD. Também foi eficiente quando testado na maior concentração nas linhagens
TA 100 frente a AZS e TA102 em teste conjunto com a MC obtendo-se índices de
redução de 79% e 66 % respectivamente.
Nos testes com mutágenos indiretos o extrato mostrou-se eficiente quando
testado frente às linhagens TA97a e TA98 em associação com B[a]P. Quando testado
em conjunto com a AFB1, ocorreu redução apenas na linhagem TA98. Para a
associação deste extrato com o H
2
O
2
, pode-se observar que o extrato foi capaz de
interagir com este composto reduzindo o seu potencial oxidativo.
No teste de micronúcleo este extrato não apresentou atividade mutagênica.
Porém, apresentou atividade protetora nas duas menores concentrações utilizadas
confirmado o potencial antimutagênico do extrato tanto in vivo quanto in vitro.
De acordo com os dados da Tabela 6, que mostra o perfil químico do extrato
CHCl
3
de B. basiloba, a maioria das substâncias encontradas são comuns ao extrato
MeOH (Lupeol, ác. ursólico, ác. oleanólico, catequina, ác. gálico e galato de metila) e
como descrito anteriormente possuem atividade antimutagênica.
Estudo realizado com extrato aquoso de Baccharis coridifolis verificou-se
atividade antioxidante atribuída à presença neste extrato de flavonóides e polifenois
(MONGELLI et al., 1997).
Foi atribuído aos triterpenos o potencial antimutagênico do extrato de
Melampodium divaricatum em testes realizado com as linhagens de S. tiphyimurium
TA97a, TA98, TA100 e TA102 frente ao B[a]P, AFB1 e Daunomicina (NOGUEIRA, et
al., 2006). Nossos resultados vêm reforçar as propriedades antimutagênicas dos
triterpenoides que também foram isolados deste extrato, facilitando o entendimento dos
resultados obtidos tanto nos testes de mutagenicidade para os quais mostrou-se
negativo, quanto para o teste de antimutagenicidade onde foram obtidos bons resultados
na inibição da ação mutagênica de B[a]P e da AFB1.
Quando avaliado através do teste de micronúcleos o extrato CHCl
3
de B.
basiloba, foi eficiente na proteção do DNA frente a ação da ciclofosfamida apenas nas
duas menores concentrações, sendo capaz de reduzir o número de células
micronucleadas. Entretanto, para a maior concentração utilizada não foi possível
observar redução no número de células micronucleadas.
Extrato CHCl
3
de B. crassa
O extrato CHCl
3
de B. crassa foi avaliado quanto ao seu potencial
mutagênico e antimutagênico através dos testes de Ames e micronúcleos e os resultados
mostram que no teste de Ames não foi observada atividade mutagênica (CARDOSO, et
al., 2006). No teste do micronúcleo nas condições experimentais utilizadas também
verificou-se ausência de efeito mutagênico.
De acordo com a composição química desse extrato, duas substâncias são
relevantes quanto a sua atividade mutagênica, a amentoflavona e a quercetina.
Cardoso et al. (2006) afirmam que em testes realizados com o extrato metanólico
de B. crassa foi observado mutagenicidade, e esse efeito foi atribuído ao biflavonol
amentoflavona. Entretanto, no extrato CHCL
3
a presença da amentoflavona não foi
suficiente para desenvolver atividade mutagênica, provavelmente pela quantidade que
deve ser maior no extrato metanólico.
Outro aspecto que deve ser considerado é que, apesar do extrato
clorofórmico de B. crassa apresentar quercetina, ela esta na sua forma glicosilada
(Tabela 9) e de acordo com Heim et al. (2002), a quercetina no estado glicosilado tem
sua reatividade reduzida o que pode justificar a ausência de mutagenicidade observada
para este extrato.
Em estudo desenvolvido por Ramos et al., (2001) foi avaliado o potencial
mutagênico do extrato de Parthenium hysterophorus L. através dos testes de Ames e
micronúcleo em células da medula óssea de ratos e verificaram através dos dois testes a
ausência de mutagenicidade. Esta ausência de mutagenicidade foi atribuída à presença
no extrato de flavonoides e triterpenos o que de certa maneira contribuem para
esclarecer a ausência de atividade mutagênica dos extratos avaliados neste.
Diante dos resultados negativos obtidos nos teste de mutagenicidade do
extrato CHCl
3
de B. crassa foram realizados testes para avaliar o seu potencial
antimutagênico. Os resultados obtidos através do teste de Ames estão apresentados nas
Tabelas 7 e 8 e Figuras de 13-16. De acordo com os dados observados, fica evidente que
este extrato apresentou um bom potencial antimutagênico principalmente quando
testado contra mutágenos indiretos, na linhagem TA98 com redução que chega a 95%
quando associado ao B[a]P.
No teste de micronúcleos em sangue periférico de camundongos os dados
mostram que só houve redução no número de células micronucleadas para a maior
concentração(125mg/mL).
No perfil fitoquímico do extrato CHCl
3
de B. crassa constatou-se a presença
de vários compostos como ácidos fenólicos, flavonóides, esteróides entre outros que,
como já foi discutido anteriormente, apresenta atividade antimutagênica. Além disso,
foi verificado a presença de ácido úrsólico, que é classificado como triterpenóide e nos
últimos anos vem crescendo o interesse por esta classe de compostos graças às suas
atividades terapêuticas como antiinflamatória (OVESNA et al., 2004; MICELI et al.,
2005), antimicrobiana (NGOUELA et al., 2005), hepatoprotetora (JEONG et al., 2005),
anti-alérgica (RYU et al., 2000; BANNO et al., 2004), anti-úlcera (OVESNA et al.,
2004) e atividade antimutagênica (RESENDE et al., 2006).
A atividade antimutagênica observada por Resende et al. (2006) através do
teste de micronúcleo embasam os dados obtidos na atividade antimutagênica obtidos
neste estudo. Além disso, a presença de outros triterpenoides e flavonóides favorece a
redução do potencial mutagênico de indutores de danos o que foi verificado na literatura
com discutido anteriormente.
Os dados da literatura indicam que os compostos fenólicos são capazes de
reduzir a atividade mutagênica de agentes indutores de mutação. Hour et al. (1999)
verificaram através do teste de Ames o potencial antimutagênico de alguns compostos
fenólicos isolados de vários tipos chás, entre eles, chá verde e chá preto e verificaram
que o ácido gálico e (-)epigalocatechina-3-galato foram capazes de reduzir o número de
colônias revertentes contra ação de vários agente indutores.
Extrato CHCl
3
de D. elliptica
O potencial mutagênico do extrato CHCl
3
de D. elliptica foi avaliado
através de testes in vitro e in vivo onde foi verificado que na maioria dos testes, este
extrato não demonstrou atividade mutagênica. Os resultados do teste de Ames estão
demonstrados na Tabela 10 e Figura 17, e pode-se verificar que este extrato não
apresentou mutagenicidade quando testado sem metabolização, da mesma maneira não
se apresentou como mutagênico para maioria das linhagens quando testado com
metabolização. Entretanto, quando se observa o resultado obtido para duas menores
concentrações na linhagem TA98 com S9, verifica-se um aumento no número de
colônias revertentes e neste caso, o aumento observado no número de colônias pode ser
classificado como mutagênico, pois, a razão de mutagenicidade é maior que dois.
Para o teste de micronúcleo em sangue periférico de camundongo este
extrato não apresentou potencial mutagênico (Tabela 14). Este resultado pode ser
explicado em parte, pela análise fitoquímica deste extrato, mostrada na Tabela 13.
Analisando os dados da tabela podemos verificar que, assim como os outros extratos
utilizados neste estudo, a composição química mostra substâncias que, segundo a
literatura, possuem propriedades protetoras contra danos causados ao DNA. Entretanto,
pode-se observar a presença de quercetina, que no teste do micronúcleo não se
comportou como agente mutagênico.
Segundo Borstel et al. (1998), alguns compostos que possuem atividade
antimutagênica podem também, dependendo das condições experimentais,
apresentarem-se como compostos mutagênicos. Esses compostos são conhecidos com
compostos Janus, e alguns dos flavonóides encontram-se classificados nesta categoria,
como é o caso da quercetina.
Os resultados dos testes de antimutagenicidade realizados através do teste
de Ames estão apresentados nas Tabelas 11 e 12, e nas Figuras de 18-21 onde, pode-se
verificar que na maioria dos casos este extrato apresentou atividade antimutagênica.
Trabalhos na literatura realizados com ácidos fenólicos, flavonóides e triterpenóides
indicam na maioria dos casos efeitos protetores para o DNA, desenvolvendo funções
como antioxidantes, moduladores da atividade protéica in vitro (SHIMIZU, et al. 2004).
Shimizu et al. (2004) verificaram que ácidos fenólicos provenientes da
própolis brasileira tem a capacidade de inibir danos oxidativos do DNA em hepátocitos
(HepG2) e em linhagens de células provenientes de adenocarcinoma de cólon em
humanos.
Em recente estudo com extrato Melampodium divaricatum realizado através
do teste de Ames, foi verificado o potencial antimutagênico frente aos mutágenos
AFB1, B[a]P e Daunomicina, demonstrando a atividade antimutagênica deste extrato. O
potencial antimutagênico deste extrato foi atribuído à presença de triterpenóides em sua
composição química (NOGUEIRA te al., 2006).
Soobrattee et al. (2005) em estudo com alguns compostos fenólicos
constataram que a catequina, miricetina, quercetina entre outros, possuem propriedade
antioxidativa e que essa atividade pode estar ligada à capacidade de modular a
expressão gênica, seqüestrar radicais livres ou quelar íons metálicos.
De um modo geral os resultados obtidos neste estudo mostraram através dos
testes de antimutagenicidade tanto in vivo quanto in vitro que os extratos aqui estudados
apresentaram ampla atividade protetora contra danos causados ao DNA por diversos
agentes químicos indutores. O estudo fitoquímico mostrou que a maioria das
substâncias presentes tem histórico de proteção e não de agressão ao DNA.
Portanto, na tentativa de relacionar o efeito antimutagênico observado com
alguma das substâncias presentes nos extratos, foram realizados ensaios através do teste
de Ames, direcionado para apenas uma das linhagens, a TA98. Além desse teste, foi
também realizado o ensaio que envolveu a avaliação do DNA plasmidial frente aos
diferentes tratamentos, já que experimentos in vivo não poderiam ser realizados devido
a quantidade dessas substâncias ser insuficiente.
5.2 Substâncias Isoladas
Basicamente o metabolismo vegetal encontra-se dividido em duas vias, uma
primária e a outra secundária. O metabolismo primário é direcionado para manutenção
da atividade vital, como produção de energia e biossíntese de substâncias necessárias à
sobrevivência (macromoléculas celulares) (SANTOS, in SIMÕES et al., 2004).
Os vegetais também apresentam a capacidade de produzir e armazenar
inúmeras substâncias que são classificadas pelos bioquímicos como sendo do
metabolismo secundário, cujo produto não é considerado essencial para o organismo
produtor, mas fornece-lhe vantagens que ajudam na perpetuação da espécie (WINK,
1990).
Ainda segundo Gottlibe et al. (1996), uma outra definição mais simplificada
para diferenciar os dois tipos de metabolismos apresentados pelos vegetais, seria que, o
vegetal utiliza o metabolismo primário para produção de matéria-prima e de energia e o
metabolismo secundário, é destinado a produção de metabólitos especial.
Durante muito tempo acreditou-se que estes compostos gerados a partir do
metabolismo secundário eram produtos de excreção. Entretanto, hoje se sabe que são
graças a estes compostos produzidos pelo metabolismo secundário que alguns vegetais
se adaptam ao seu meio, pois são atribuídas atividades como proteção contra raios UV,
defesa contra herbívoros entre outras (WINK 1990).
Os vegetais produzem uma grande diversidade de compostos tidos como
secundários, tanto em relação ao número de substâncias quanto à diversidade numa
mesma espécie (HARBONE 1998).
Um exemplo da capacidade de produção de compostos secundários pelos
vegetais é da Catharanthus roseue (L.) G.Don. (vinca), da família Apocynaceae, que
produz e acumula cerca de 90 compostos classificados como alcalóides (ROBBERS et
al., 1996).
Estes compostos secundários vêm sendo amplamente estudados
principalmente na área farmacêutica (SANTOS in SIMÕES et al.,2004).
As substâncias isoladas dos extratos utilizados neste estudo são
consideradas compostos secundários, pois os triterpenóides e esteróides são originados
através da via da biossíntese do acetato enquanto que os compostos fenólicos como é o
caso dos flavonóides e taninos são produzidos através da via da biossíntese do ácido
chiquímico (SANTOS in SIMÕES et al., 2004).
Após a realização do estudo fitoquímico dos extratos, algumas substâncias
foram submetidas à avaliação do potencial mutagênico e antimutagênico através do
teste de Ames e de danos no DNA plasmidial.
Para a avaliação no teste de Ames foi selecionada a linhagem TA98, já que
foi a linhagem que apresentou os melhores resultados de antimutagenicidade frente aos
agentes mutagênicos diretos e indiretos. As substâncias isoladas do extrato foram
escolhidas obedecendo apenas o critério de rendimento após o processo de extração. As
substâncias testadas e os extratos de onde foram isolados estão mostrados na Tabela 19.
Tabela 19. Substâncias puras avaliadas e os extratos de origem.
Substância isolada
Extrato
Ácido gálico
CHCL
3
deB. crassa, MeOH de B.
basiloba, CHCL
3
de B. basiloba,
CHCL
3
deD. elliptica
Galato de metila
CHCL deB. crassa, MeOH de B.
basiloba, CHCL
3
de B. basiloba.
Quercetina
CHCL
3
deD. elliptica
Quercetina-3-O-a-L-arabinopiranosideo
CHCL deB. Crassa, CHCL
3
de B.
basiloba.
Miricetina-3-o-α-L-raminopiranosídeo
CHCL
3
deD. elliptica
Catequina
CHCL
3
deB. crassa, MeOH de B.
basiloba, CHCL
3
de B. basiloba.
Lupeol
CHCL
3
de B. basiloba, CHCL
3
deB.
crassa, MeOH de B. basiloba.
Quercetina
Os resultados dos testes de Ames e do plasmídeo realizado com as
substâncias isoladas para verificar o potencial mutagênico dos compostos estão
apresentados na Tabela 17 e Figura 26. Pode-se observar que apenas a quercetina
apresenta-se como mutagênica, os demais compostos não apresentaram potencial
mutagênico.
Entretanto, em estudo realizado por Snijman et al. (2007), verificaram
através do teste de Ames, que alguns flavonóides entre eles a quercetina, foram capazes
de expressar atividade antimutagênica contra ação da AFB1 e 2-acetamido-fluoreno (2-
AAF) e ação mutagênica, estes resultados obtidos foram atribuídos entres outros
aspectos à concentração utilizada. Isto sugere que no caso deste estudo a
mutagenicidade também pode ser atribuída principalmente a quantidade.
Ainda em relação à atividade mutagênica destes compostos isolados, os
mecanismos foram avaliados através do teste do plasmídeo onde foi observado que
apenas a quercetina apresentou efeito lesivo, pois foi à única substância capaz de
promover a quebra do DNA plasmidial alterando a sua conformação de superenovelada
para circulo aberto, quando utilizada na concentração de 0,9mg/mL.
Os resultados deste estudo com substâncias isoladas de plantas estão de
acordo com os obtidos por Cardoso et al (2006), que também analisaram algumas
substâncias puras, mas apenas a quercetina na sua forma aglicona e a amentoflavona
apresentaram atividade mutagênica. Verificaram ainda que tanto derivados glicosilados
de quercetina quanto o galato de metila não apresentaram atividade mutagênica, o que
reforça os resultados obtidos no presente estudo.
Além disso, outros autores também relatam a atividade mutagênica da
quercetina. Segundo Macgragor (1983), a quercetina induz lesões do tipo frameshift e
substituição de pares de bases. Estudos revelam que a quercetina é um dos compostos
do vinho tinto e que tem a capacidade de induzir lesões oxidativas no DNA (GASPAR
et al. in SANTOS 2006).
Por se tratar de um flavonóide e como relatado acima, a quercetina também
apresenta resultados na literatura que mostram a sua atividade antimutagênica, sendo
capaz de reduzir os danos causados por compostos oxidativos como a bleomicina e o
peróxido de hidrogênio (STAGOS et al.,2006).
Porém, nas condições experimentais utilizadas neste trabalho a quercetina
não apresentou atividade antimutagênica.
Quercetina-3-o-α-L-hamnopiranosídeo
Como se pode observar através do teste de Ames a quercetina-3-o-α-L-
raminopiranosídeo, não foi capaz de induzir mutação, o que está de acordo com a
afirmação de Heim et al (2002), que a quercetina na sua forma glicosilada fica menos
reativa, perdendo assim, a capacidade de interação com o DNA e promover danos ao
material genético.
Neste trabalho a quercetina glicosilada apresentou atividade
antimutagênica ainda que moderada diante do NPD. Entretanto, esta atividade foi
perdida quando foi testada de forma indireta, ou seja, com a utilização de S9, o que está
de acordo com resultados obtidos por Tangvarasittichai et al. (2007), que observaram
em seus estudos que a quercetina e outros flavonóides na sua forma glicosilada foram
capazes de reduzir danos causados por AFB1 e B[a]P.
No teste de genotoxidade esta substância não promoveu interação com o
DNA plasmidial a ponto de promover danos. Quando testado em conjunto com o CE
apresentou redução de apenas aproximadamente (58%) no número de quebras como
mostrado na Figura 27.
Ainda em relação a atividade biológica da quercetina na sua forma
glicosilada, Dongmo et al., (2007), observaram em seus estudos que alguns flavonóides
entre eles a quercetina apresentou atividade antiinflamatória, inibindo as cicloxigenases
COX-1 e COX-2.
Ácido gálico
A literatura traz relatos que o ácido gálico é um agente antimutagênico,
Gichner et al. (1986, 1987) mostraram que o ácido gálico foi antimutagênico
combatendo os danos causados pelo N-metil-N´-nitro-N-nitroso-guanidina (MNNG).
Em testes com a linhagem TA100 foram obtidos bons resultados na avaliação contra o
potencial mutagênico do 3-(5-nitro-2-furil)ácido acrílico (5NFAA) e da azida sódica
(BIROŠOVÁ et al. 2005).
Em nosso estudo foram obtidos resultados que estão de acordo com a
literatura, pois, o ácido gálico apresentou redução de aproximadamente 78% no número
de quebras induzidas pelo CE e sendo uma das substâncias mais ativas.
Os compostos fenólicos vem há muito tempo sendo investigados quanto às
suas atividades terapêuticas, entre elas ação antioxidante, capacidade de seqüestrar
radicais livres, capacidade quelante de íons metálicos e modulação da expressão gênica
(SOOBATTREE et al., 2005).
Miricetina-3-o-α- L-raminopiranosídeo
Alguns dados da literatura relatam que a miricetina aglicona é capaz de
promover quebras ao DNA (YOSHINO et al., 1999). Entretanto, Santos (2006)
avaliou um derivado deste composto na sua forma glicosilada, ou seja, associado a um
açúcar e verificou-se a ausência de mutagenicidade, os dados obtidos neste trabalho
estão de acordo com obtidos por este autor. No teste de Ames aqui realizado, a sua ação
contra o agente indireto não foi tão eficaz, apresentando apenas uma baixa atividade
protetora reduzindo em apenas 42% atividade mutagênica do NPD e quando testado na
presença de S9 esta proteção caiu para 26%.
Observando os dados expostos nas Figuras 27, 28 e 29, vê-se que a
maioria das substâncias isoladas apresentaram atividade protetora contra a ação do
cloreto de estanho. Na Figura 27 onde são mostrados os percentuais de quebras, fica
claro que a concentração de 0,9mg/ml foi mais eficiente, pois apresentou melhores
resultados para cinco compostos e em apenas dois compostos miricetina-3-o-α- L-
raminopiranosídeo e catequina o efeito protetor foi melhor na menor concentração
testada.
No teste do plasmídeo esta substância também não apresentou atividade
genotóxica, portanto, não foi capaz de promover danos ao DNA. Quando testada contra
a ação genotóxica do CE, foi capaz de reduzir o número de quebras do DNA plasmidial
(em 35%).
Galato de Metila
Nos testes de avaliação do galato de metila não foi observada
atividade mutagênica. Este resultado está de acordo com Santos (2006) e com os
resultados obtidos por Martinez et al. (2000) que avaliaram o galato de metila
não verificando atividade mutagênica para esta substância.
O galato de metila faz parte dos compostos fenólicos e como já discutido
anteriormente possui várias propriedades biológicas principalmente a ação antioxidante
e, além disso, tem sido atribuído aos compostos fenólicos um papel importante na
prevenção de câncer e doenças cardíacas (MARIA et al., 2005).
Neste trabalho quando avaliado na ausência de S9 o galato de metila
apresentou atividade antimutagênica discreta (42%), esse percentual de redução caiu
quando esta substância foi avaliada na presença do S9.
No teste do plasmídio também não foi observado mutagenicidade. Mas, o
galato de metila foi capaz de reduzir os danos causado ao DNA pelo CE, reduzindo o
percentual de quebras (40,13%).
Lupeol
O interesse pelas atividades biológicas dos vários triterpenóides vem
aumentando a cada dia e entre as várias propriedades dos triterpenos estão incluídas
propriedades como imunoestimulador (PRESS et al. 2000, apud CONNOLLY e HILL,
2002); antiinflamatória (RIOS et al. 1998, apud Connolly e Hill, 2002) e atividade
antipromoção de tumores (KONOSHIMA e TAKASAKI, 2001 apud CONNOLLY e
HILL, 2002).
Lupeol é um triterpenóide muito comum em vários frutos, vegetais e
plantas medicinais, sendo encontrado em quantidades significantes principalmente em
azeitona, manga, morango e figo (SALEEM et al., 2004).
O lupeol tem sido empregado com sucesso na terapia de carcinoma de
cabeça e pescoço, sendo capaz de induzir células a apoptose. Acredita-se que o lupeol
tem ação na regulação de células NF-kappa β (LEE et al., 2007).
Em estudo realizado com extrato etanólico e algumas frações de
Plumeria acuminata Ait, foi verificado que, juntamente com os ácidos ursólico e
oleanólico, o lupeol promoveu redução no número de micronúcleos induzidos por
mitomicina C, sendo o lupeol responsável por uma redução de 57% no número de
células micronucleadas (GUEVARA et al., 1996). Este estudo é corroborado pelos
resultados obtidos nos teste realizado com lupeol para verificar o seu potencial
mutagênico e antimutagênico. Ficou constatado também que esse triterpeno não foi
capaz de promover danos ao material genético quando testado através do teste de Ames
e do plasmídeo. Os resultados da avaliação antimutagênica mostraram que o lupeol no
teste de Ames foi mais eficiente quando testado contra ação de agentes diretos como
mostra a Tabela 18, já na avaliação do teste do plasmídeo quando o lupeol foi utilizado
na menor concentração como mostrado na Figura 27, foi protetor frente contra lesões
induzidas pelo cloreto estanhoso.
Catequina
A catequina e seus derivados são classificados como taninos condensados
e assim como vários outros taninos da mesma classe são encontrados nos vegetais. Os
vegetais ricos em taninos são amplamente empregados na medicina popular no
tratamento de enfermidades como diarréia, hipertensão arterial, reumatismo,
hemorragia, feridas, queimaduras, problemas estomacais (azia, náusea, gastrite, e úlcera
gástrica) problemas renais, do sistema urinário e processos inflamatórios em geral
(HASLAM 1996: DE BRUYNE et al. 1999; DU FRESNE E FARNWORTH, 2001
apud SIMÕES et al., 2004).
Testes realizados com extratos ricos em taninos apresentaram in vitro
várias atividades biológicas como ação bactericida e fungicida (SCALBERT 1991;
CHUNG et al., 1998), antiviral (OKUDA et al., 1998); inibição da peroxidação de
lipídeos e seqüestrador de radicais livres (HAGERMAN et al., 1998; MOURE et al.,
2001) além de antitumoral (DUFRESNE e FARNWORTH 2001).
Segundo Santos e Mello, 2003 apud Simões (2004) o mecanismo
antioxidante dos taninos está diretamente ligado a capacidade de seqüestrar radicais
livres. Ainda de acordo com Moure et al. (2001) várias doenças de caráter degenerativo
como câncer, esclerose múltipla, aterosclerose são doenças que estão ligadas a altas
concentrações intercelulares de espécies oxigenadas reativas ou radicais livres. Vários
taninos atuam como capturadores de radicais livres e poderiam ser utilizados de forma
eficaz no tratamento destas enfermidades, interceptando o oxigênio ativo formando
radicais estáveis. Este processo poderia se dar ocorrer bloqueio da peroxidação de
lipídeos em mitocôndrias hepáticas ou no bloqueio da lipoxigenases em leucócitos.
Desta maneira, os taninos como a catequina teriam uma possível importância na
prevenção e tratamento de doenças originadas pela peroxidação de lipídeos.
Estes relatos vêm corroborar com os resultados obtidos nos teste de
mutagenicidade e antimutagênicidade desenvolvidos neste estudo onde foi constatado
que a catequina não apresentou atividade mutagência no teste de Ames e nem no teste
do plasmídeo. Quanto à avaliação do potencial antimutagênico desta substância foi
evidente a sua ação protetora tanto no teste de Ames quando testado de forma direta, ou
seja, sem ativação metabólica atingindo a uma redução de 52% no número de colônias
revertentes. Quando avaliada através do teste do plasmídeo nas duas concentrações
utilizadas este tanino apresentou atividade protetora contra ação do cloreto de estanho.
6. CONCLUSÕES
Diante dos resultados obtidos neste estudo as seguinte conclusões foram
obtidas.
Os extratos de maneira geral não apresentaram atividade mutagênica na maioria
das condições experimentais utilizadas tanto in vitro quanto in vivo.
A atividade antimutagênica do extrato MeOH de B. basiloba foi maior quando
testado na linhagem TA98, alcançando 82% de redução no número de colônias
revertentes contra a ação da Aflatoxina B1 que é um agente intercalante e pode
promover danos do tipo frameshit.
O Extrato CHCl
3
de B. basiloba também apresentou atividade antimutagênica, e
assim como para o extrato metanólico da mesma espécie, os melhores resultados
foram obtidos na TA97a com 78% de redução no número de colônias
revertentes frente ao NPD e ao B[a]P.
O extrato clorofórmico de B. crassa apresentou potencial antimutagênico e os
maiores índices de redução (≈90%) foram obtidos com a linhagem TA98 frente
ao B[a]P.
De todos os extratos avaliados na TA102, que detecta principalmente danos
oxidativos, o extrato CHCl
3
de B. crassa foi o mais efetivo agente antioxidante.
Nos testes realizados com extrato CHCl3 de D. elliptica, observou-se atividade
atimutagênica contra a ação do NPD na linhagem TA98 com redução de 95%
frente ao B[a]P
In vivo todos os extratos avaliados foram capazes de minimizar o efeito
mutagênico da ciclofosfamida, porém, os melhores resultados foram obtidos
com o extrato CHCl3 de D. elliptica (51,88%) e metanólico de B. basioloba.
(49,66).
As respostas quanto à antimutagenicidade de extratos e substâncias puras foram
diferentes, tendo sido mais pronunciadas para os extratos, o que sugere a
interação entre substâncias.
A avaliação das substâncias puras obtidas dos extratos mostrou que a quercetina
pode promover interação com DNA causando mutação as demais substâncias
isoladas não apresentam atividade genetóxica.
No teste com o plasmídeo, a maioria das substâncias apresentou potencial
antimutagênico, impedindo a iteração do CE com DNA, e diminuindo a
ocorrência de quebras, o que sugere atividade antioxidativa.
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Capítulo II
1. Artigo publicado
For Peer Review
Journal of Medicinal Food: http://mc.manuscriptcentral.com/medicinalfood
Modulatory effect of Byrsonima basiloba extracts on the mutagenicity of
certain direct and indirect-acting mutagens in Salmonella typhimurium
assays
Journal: Journal of Medicinal Food
Manuscript ID: JMF-2007-0553.R1
Manuscript Type: Original Article
Date Submitted by the
Author:
n/a
Complete List of Authors: Moraes, Walclecio; FCF-UNESP, Biological Sciences
Santos, Fábio; FCF-UNESP, Biological Sciences
Sannomiya, Miriam; IQ-UNESP, Organic Chemistry
Rodrigues, Clenilson; IQ-UNESP, Organic Chemistry
Vilegas, Wagner; IQ-UNESP, Organic Chemistry
Varanda, Eliana; FCF-UNESP, Biological Sciences
Keyword: cancer, chemoprevention, flavonoids, genotoxicity, tea
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For Peer Review
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Modulatory effect of Byrsonima basiloba extracts on the mutagenicity of certain direct
and indirect-acting mutagens in Salmonella typhimurium assays
Walclecio Lira de Moraes
1
, Fabio Vieira dos Santos
1
, Miriam Sannomiya
2
,Clenilson Martins
Rodrigues
2
, Wagner Vilegas
2
, Eliana Aparecida Varanda
1*
1
Department of Biological Sciences, Faculty of Pharmaceutical Sciences of
Araraquara,UNESP- São Paulo State University, Rodovia Araraquara-Jaú, Km 1, 14801-
902, SP, Brazil
2
Chemical Institute of Araraquara, UNESP- São Paulo State University, Rua Prof.Francisco
Degni s/n, 14801-970, Araraquara, SP, Brazil
Running title: Antimutagenic effect of Byrsonima basiloba
*Corresponding author. Tel.: +55–16-33016951; Fax: +55-16-3322-0073
E-mail address: varandae@fcfar.unesp.br
Abbreviations: HF: Hexane fraction; DF:Dichloromethane fraction; MF: Methanol fraction;
EtOAc: Ethyl acetate; CC: Column chromatography; CHCl
3
: Chloroform; MeOH: Methanol ;
MeOH:H
2
O: Methanol:water ratio; NMR: Nuclear Magnetic Resonance; NP/PEG:
Diphenylaminoborate (Natural products – Polyethylene glycol 4000); TMS:
Tetramethylsilane
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2
ABSTRACT
Byrsonima basiloba A. Juss. species is a native arboreal type from the Brazilian
“cerrado” (tropical American savanna) and the local population uses it to treat diseases, such
as diarrhea and gastric ulcer. It belongs to the Malpighiaceae family and it is commonly
known as “murici”. Considering the popular use of B. basiloba derivatives and the lack of
pharmacological potential studies regarding this vegetal species, the mutagenic and
antimutagenic effect of MeOH (methanol) and CHC1
3
(chloroform) extracts were evaluated
by the Ames test, using the strains TA97a, TA98, TA100 and TA102 of Salmonella
typhimurium. No mutagenic activity was observed in any of the extracts. To evaluate the
antimutagenic potential, direct and indirect mutagenic agents were used: 4 nitro-o-
phenylenediamine (NPD), sodium azide (SAZ), mitomycin C (MMC), aflatoxin B
1
(AFL),
benzo(a)pyrene (B(a)P) and hydrogen peroxide (H
2
O
2
). Both the extracts evaluated showed
antimutagenic activity, but the highest value of inhibition level (89%) was obtained with
MeOH extract, strain TA100 in presence of AFL. Phytochemical analysis of the extracts
revealed the presence of n-alkanes, lupeol, ursolic and oleanolic acid, (+)-catechin, quercetin-
3-O-G-L-arabinopyranoside, gallic acid, methyl gallate, amentoflavone, quercetin, quercetin-
3-O-(2”-O-galloyl)-H-D-galactopyranoside and quercetin-3-O-(2”-O-galloyl)-G-L-
arabinopyranoside.
Keywords: Ames test, Antimutagenic, Byrsonima, Mutagenic.
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INTRODUCTION
Compounds capable of promoting mutation are found in our daily diet, as well as in
air and water pollution, drinks, medications and solar radiation. It is known that mutations are
the main factor for the onset of cancer. Chemoprevention, i.e. prevention against cancer
development by chemical substances that act as antimutagenic agents and present the capacity
to interact with mutagenic compounds or their metabolites and reduce their effects, is one
possible alternative for fighting cancer.
1
Exposure to environmental mutagenic substances can influence not only the
development of cancer, but also cardiovascular and neurodegenerative diseases.
2,3,4
The Byrsonima basiloba A. Juss. species belongs to the Malpighiaceace family, is
commonly known as “murici”,
5
and the local population uses its derivative products for the
treatment of diseases, such as diarrhea and gastric ulcer. However, no effective biological
activity has been detected up to now, since only a few studies have been realized regarding
this species. Previously, our group reported the antidiarrhoeal activity of methanolic and
hydromethanolic extracts obtained from the leaves of B. cinera (now formally documented as
B. basiloba) determined by intestinal motility in Swiss mice. This assay showed a significant
reduction in gastrointestinal motility of both extracts evaluated. A chemical study of the
methanolic extract of this species revealed (+)-catechin and quercetin-3-O--L-
arabinopyranoside.
6
Other species of the Byrsonima genus are characterized by the presence of
sulfonoglycolipids, phytosterols, triterpenes, aromatic esters, amino acids, proanthocyanidin
and flavonoids.
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Considering the popular use of B. basiloba, as well as the limited number of
pharmacological potential studies regarding this vegetal species, the mutagenic and
antimutagenic effect of methanol and chloroform extracts were evaluated using different
mutagens with direct (sodium azide, mitomycin C, hydrogen peroxide, 4 nitro-o-
phenylenediamine) and indirect action (aflatoxin B
1
, benzo(a)pyrene, hydrogen peroxide).
This study was based on the Salmonella reversion assay, which is widely used for the
detection of antimutagenic agents, especially those present in plant extracts.
8,9,10,11
MATERIAL AND METHODS
Chemicals
Dimethylsulfoxide (DMSO), methanol, chloroform, nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate sodium salt, D-glucose-6-phosphate disodium salt, magnesium
chloride, L-histidine monohydrate, D-biotin, sodium azide (SAZ), 2-anthramine, 4-nitro-o-
phenylenediamine (NPD), mitomycin C (MMC) benzo(a)pyrene (B(a)P), and aflatoxin B
1
(AFL) were purchased from Sigma Chemical Co (St. Louis, USA). Oxoid Nutrient Broth No.
2 (Oxoid, England) and Difco Bacto Agar (Difco, USA) were used as bacterial media. D-
glucose, magnesium sulfate, citric acid monohydrate, anhydrous dibasic potassium phosphate,
sodium ammonium hydrogen phosphate, monobasic sodium phosphate, dibasic sodium
phosphate, sodium chloride and hydrogen peroxide (H
2
O
2
) were purchased from Merck
(Whitehouse Station, NJ).
Vegetal material
Leaves of Byrsonima basiloba A. Juss. were collected at Pratânia, São Paulo, Brazil
by Luiz Fernando R. de Almeida of the Botucatu Institute of Biosciences of São Paulo State
University, SP, Brazil (IBB-UNESP, Botucatu, SP, Brazil) and identified by Dr. Jose
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Clemente Campos, also of the IBB-UNESP. Exsiccates of number 24163 can be found in the
UNESP Herbarium, Botucatu.
Ames mutagenicity assay
The Salmonella mutagenicity assay was performed using the preincubation
method,
12
for 20–30 min with S. typhimurium strains TA100, TA98, TA97a and TA102, with
and without metabolic activation. The metabolic activation mixture (S9 mix) was freshly
prepared before each test using an Aroclor-1254-induced rat-liver fraction purchased
(lyophilized) from Moltox Molecular Toxicology Inc. The S. typhimurium strains were kindly
provided by Dr. B. Ames of the University of California, Berkeley, CA, USA.
Five different doses of the compounds extracted from the leaves of B. basiloba were
evaluated in this assay; all of them diluted in dimethylsulfoxide. The chloroform extract was
tested in the mutagenicity assay at doses of 1.99, 3.97, 7.95, 11.92 and 15.90 mg/plate and the
methanol extract at doses of 3.65, 7.30, 14.60, 21.90 and 29.20 mg/plate. For the
antimutagenicity assay the following concentrations were used: 0.99, 1.99, 3.97, 7.95 and
15.90 mg/plate for the chloroform extract and 0.46, 0.91, 1.82, 3.65, 7.30, 14.60 and 21.90
mg/plate for the methanol extract.
The concentrations used were based on the bacterial toxicity of each preparation,
estimated in a preliminary test. In all subsequent assays, the upper limit of the dose range
tested was either the highest nontoxic dose or the lowest toxic dose determined in this
preliminary assay. Toxicity was apparent either as a reduction in the number of his+
revertants or as an alteration in the auxotrophic background (i.e. background lawn).
Each concentration of the tested mixtures was added to 500 ML of buffer pH 7.4 or
500 ML of S9 mix (for test the influence of metabolic activation) and 100 ML of bacterial
culture and then incubated at 37 °C for 20–30 min. After this time 2 mL of top agar was
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added and the mixture was poured on to a plate containing minimal agar. The plates were
incubated at 37°C for 48h and the his+ revertant colonies were manually counted. All the
experiments were performed in triplicate.
The standard mutagens used as positive controls in experiments without S9 mix
were 4-nitro-o-phenylenediamine (10 Mg/plate) for TA98 and TA97a, sodium azide (1.25
Mg/plate) for TA100 and daunomycin (3 Mg/plate) for TA102. 2-Anthramine (0.125 Mg/plate)
was used in the experiments with metabolic activation for all strains. DMSO served as the
negative (solvent) control (100 ML/plate).
Statistical analysis was performed with the Salanal computer program, adopting the
Bernstein et al.
13
model. The mutagenic index (MI) was also calculated for each dose, as the
average number of revertants per plate divided by the average number of revertants per plate
of the negative (solvent) control. A sample was considered positive when MIO2 for at least
one of the tested doses and when the response was dose dependent.
14
Ames antimutagenicity assay
According to the methodology of preincubation in plates, developed by Maron and
Ames,
12
different concentrations of MeOH and CHC1
3
extracts of B. basiloba were mixed
with 0.1mL of bacterial culture and the mutagenic agent (sodium azide, 4 nitro-o-
phenylenediamine, mitomycin C, hydrogen peroxide, aflatoxin B
1
or benzo(a)pyrene) and
then incubated at 37ºC for 20-30 minutes. After incubation, 2mL of top agar were added and
supplemented with traces of histidine and biotin and the content of each tube was lightly
homogenized and poured on a plate with minimum glucose agar. After the solidification of
top agar, the plates were incubated for 48 hours at 37ºC and the number of revertant colonies
per plate was counted. The entire assay was performed in triplicate. The percentage of
mutagenicity inhibition was calculated according to Tachino et al.,
15
where:
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Revertants induced/plate (with inhibitor)
Revertants induced/plate (without inhibitor)
A non-antimutagenic effect was considered when a value lower than 25% was
obtained, a moderate effect when a value between 25% and 40% was obtained and strong
antimutagenicity at values greater than 40%.
16
Cell viability was also determined for each antimutagenesis experiment to evaluate the
potential bactericidal effect of the mutagens. The responses were considered cytotoxic when
the percentage of sample survival was less than 60% of the total observed for the negative
control.
17
Phytochemical analysis
The powdered leaves (800 g) were extracted exhaustively and successively with
chloroform and methanol at room temperature; 48 h for each solvent. The solvents were
evaporated at 60°C under reduced pressure providing the CHCl
3
(94.5 g)
and MeOH (79.3 g)
extracts, respectively. The yields (w/w) for the CHCl
3
and MeOH extracts from the dried
powders of B. basiloba leaves were 11.8 % and 9.9 %, respectively.
A portion of CHCl
3
extract (30.0 g) was filtrated in a silica column (15 cm x 5.0 i.d.)
to separate the compounds according to their polarity. This column initiated the elution with a
pure n-hexane solvent, then with dichloromethane and finally methanol. After evaporation of
the remaining solvent, the hexane (HF, 0.4 g), dichloromethane (DF, 12.0 g) and methanolic
(MF, 10.3 g) fractions were obtained, respectively. Part of the HF was chromatographed in a
chromatography column (Silica gel 60) with hexane (100%) that produced an n-alkane
mixture of C-30 to C-34 consisting almost exclusively of triacontane (C-30) and
dotriacontane (C-32). The MF was analogously fractionated by silica gel column
x100
Inhibition= 1-
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chromatography using chloroform as an eluent, gradually increasing the polarity with MeOH.
The fractions were guided to provide ursolic and oleanolic acids. The DF resulted in an
exclusive mixture of lupeol. These triterpenes were identified by comparison of their
spectroscopic data with those reported in the literature.
18
n- alkane identification; gas chromatography analyses
Gas chromatography (GC) analyses were performed using a Varian 3380 gas
chromatograph equipped with a fused silica CBP-5 capillary column (25 m x 0.33 mm i.d.;
film thickness 0.5 m) coupled to the a flame ionization detector (FID). Hydrogen was used as
the carrier gas (60 Kpa), and the injection split ratio was 1:30. The injection temperature was
250°C; the column temperature was maintained at 50°C for 1 min, and then increased to
300°C at 10°C/min, where this temperature was maintained for 10 min; the detector
temperature was 280°C. n-alkane standards and the fraction isolated from the HF of 1 µL
were manually injected using a 10 µL Hamilton syringe.
Phytochemical screening and compound isolation from the MeOH extract
The fresh methanol extract proved positive for steroids, flavonoids and
proanthocyanidins.
19
A portion (10.0 g) of the MeOH extract of B. basiloba was partitioned with a mixture
of EtOAc/H
2
O (1:1, v/v). The EtOAc fraction (4.0 g) was submitted to Gel Permeation
Chromatography (GPC) on a Sephadex LH-20 (Pharmacia) column (57 x 3 cm), eluted with
MeOH. Fractions (15 ml) were collected and checked by (Thin Layer Chromatography) TLC
on Si gel plates eluted with a mixture of CHCl
3
/MeOH/H
2
O (80:18:2, v/v) and revealed either
with NP/PEG reagent or with anisaldehyde/sulfuric acid solution.
20
Fractions 28-32 (60.0 mg)
were successively fractionated by CC on silica gel (Merck, 10.0 cm x 1.5 i.d.) eluted with
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CHCl
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/MeOH (90:10, v/v) providing gallic acid and methyl gallate (18.0 mg). Fractionation
was realized by cellulose column (12.0 x 1.5 i.d.) using MeOH/H
2
O (80:20) to yield the pure
biflavonoid amentoflavone (8.0 mg).
The NMR spectra in DMSO-d
6
were obtained using a Varian INOVA 500
spectrometer, operating at 500 MHz for
1
H and 150 MHz for
13
C. Chemical shifts are given as
(ppm) using TMS as an internal standard. TLC analyses were performed on silica gel Si
F254 (Merck) plates eluted with CHCl
3
/MeOH (80:20, v/v). The plates were visualized using
UV light (254 nm).
HPLC analysis
The HPLC quantitative analysis of the methanol extract was performed with a liquid
chromatograph equipped with a ProStar 210 dual solvent pump, a ProStar 330 photodiode
array detector (Varian, Walnut Creek, CA, USA) and a Rheodyne 7125 sample injector with a
20 ML sample loop (Rheodyne, Cotati, CA, USA). The analytical column was a Phenomenex
Luna C2 RP18 (250 x 4.6 mm I.D. x 5 M m, equipped with a Phenomenex security guard 4.0 x
2.0 mm, Torrance, CA, USA). The mobile phase compositions used were: water (eluent A)
and acetonitrile (eluent B), both containing 0.05% TFA (trifluoroacetic acid). The gradient
program was as follows: 27-34% B (3 min), 34-65% B (42 min) and 65-100% (5 min). Total
run time was 50 min. The flow rate of the mobile phase was 1.0 mL min
–1
. Star LC
Workstation software was used for both the operation of the detector and for data processing.
These experiments permitted the identification of the flavonoids: quercetin-3-O-(2”-O-
galloyl)-H-D-galactopyranoside, quercetin-3-O-(2”-O-galloyl)-G-L-arabinopyranoside and
quercetin. Compound identification was performed by comparison retention time, by spiking
with known standards and by comparison with previously isolated compounds under the same
conditions. Methods using external standards were used to quantify each compound. For
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calibration curves, appropriate volumes of the standard stock solutions in rutin (1.0 mg mL
–1
)
were diluted with 75% methanol. For quantitation, peak areas were compared with the
calibration curves. Flavonol glycosides and aglycones were calculated as rutin in the
concentration range of 10-500 Mg mL
–1
(y = -4.81 10
5
+ 1.91 10
5
x, R
2
= 0.9999, n = 7, =
360 nm). The HPLC quantitative data were expressed as milligrams of flavonoid derivative
per gram of solid extract (Table 6).
RESULTS
Mutagenic activity
After the mutagenicity evaluation of the methanol and chloroform extracts of the B.
basiloba species, no positive mutagenicity was verified (Table 1). The results obtained for the
chloroform extract presented an increase in the frequency of revertants in the strain TA100 (-
S9), but the ratio of mutagenicity was not higher than 2. In the same strain, the methanol
extract became cytotoxic after metabolic activation of the highest three doses tested. In strain
TA97a, cytotoxicity was also evident without metabolic activation.
Antimutagenic activity
The results obtained regarding verification of the antimutagenic potential of B.
basiloba extracts are presented in Tables 2- 5.
The MeOH extract was evaluated in strains TA97a, TA98, TA100 and TA102, using
direct, NPD, SAZ, MMC and H
2
O
2
and indirect mutagens, AFL, B(a)P and H
2
O
2
. When the
strain TA97a was used, this extract presented no reduction in the number of revertant
colonies. However, in strain TA98, levels of reduction were obtained when tested with NPD
(32-81% -Table 2), AFL (68-81%) and B(a)P (66-82%) (Table 3). For strain TA100, the
MeOH extract showed no protective effects against the action of SAZ (Table 2) but showed a
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strong protective effect when associated with AFL (84-89% - Table3). The protective action
of the extract against H
2
O
2
mutagenic effect was evaluated in strain TA102, and it was
concluded that the mutagenic potential was significantly reduced independent of the presence
or absence of metabolization. The levels observed vary from 34–52% (Table 2) when tested
in the absence of metabolic activation and around 60% when tested in the presence of
metabolization (Table 3). Besides H
2
O
2
, a significantly reduction on the number of revertant
colonies also occurred in the same strain when the mutagen used was MMC (13-65% - Table
2).
As for the CHC1
3
extract, a general reduction in the mutagenic potential of the
inductor agents was observed. The levels of reduction were from 75-78% for NPD (Table 4),
and 10-78% for B(a)P in the strain TA97a (Table 5). For strain TA98, the levels varied from
32-61% for NDP (Table 4), 56-66% for B(a)P and 66-74% for AFL (Table 5). In the case of
TA100, the levels of reduction obtained with SAZ were 25-79% (Table 4) whereas for B(a)P
and AFL, toxicity was observed at all concentrations (Table 5). For the strain TA102, when
H
2
O
2
was used without metabolization, the levels obtained varied from 2-46% (Table 4) and
in the presence of metabolization, the levels were around 60% (Table 5). When the inductor
agent was MMC, the levels of reduction were 0.4-67% (Table 4).
Phytochemical analysis
The HF of the CHCl
3
extract from B. basiloba was then analyzed by GC under the
same condition as the aforementioned hydrocarbon standard, in order to obtain
chromatograms and retention times. The results of hydrocarbon analyses showed the presence
of a mixture of n-alkanes (C
30
-C
34
). These consisted of only saturated straight chain
hydrocarbons with triacontane (C-30) and dotriacontane (C-32) as the major components.
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Fractionation of the DF resulted in the isolation of lupeol and the MF provided ursolic
and oleanolic acid.
The initial study of the MeOH extract of B. basiloba showed the presence of (+)-
catechin and quercetin-3-O-G-L-arabinopyranoside.
6
In this work, the isolation or
identification of gallic acid, methyl gallate, the biflavonoid amentoflavone, quercetin-3-O-
(2”-O-galloyl)-H-D-galactopyranoside, quercetin-3-O-(2”-O-galloyl)-G-L-arabinopyranoside
and quercetin is described (Table 6).
DISCUSSION
Scientific studies that involve medicinal plants are being developed each day. They are
important not only on an academic level, but are also economically and socially important.
People have been using alternative medicinal treatments and plants for centuries and the
pharmaceutical and cosmetics industries are looking for natural sources of raw materials and
active principles for their products.
Nevertheless, in many cases, people do not realize that treatments based on
medicinal plants can cause serious risks to their health. Diagnoses are often inaccurate and the
symptoms of numerous serious diseases could be hidden by these types of treatment.
21
Many plants present chemical compounds in their constitution, which can be cyto- or
genotoxic and could be related to the development of tumors.
22
Reid et al.
23
evaluated the
mutagenic effect of dichloromethane and 90% methanol extracts of 42 South African plants
and observed that methanol extracts from whole plants of Helichrysum simillimum, H.
herbaceum and H. rugulosum demonstrated mutagenicity. Thus, the realization of assays for
mutagenicity evaluation, as well as of other risks, is essential, given the consumption of
natural products by the population.
24
In this study, the mutagenicity and antimutagenicity of two different vegetal extracts
obtained from the leaves of B. basiloba were evaluated, since it is commonly used as a
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medicinal plant in Brazil. Using the Ames test, five different concentrations of a polar extract
(methanol) and an apolar extract (chloroform) were evaluated.
As shown in Table 1, the chloroform and methanol extracts presented no
mutagenicity in any of the strains used. The absence of a mutagenic response by plant extracts
against S. typhimurium bacterial strains in the Ames assay is a positive step forward in
determining the safe use of plants used in traditional medicine. Considering the popular use of
this plant, this result is relevant, and assays were then realized to evaluate the antimutagenic
activity against direct and indirect mutagens. B(a)P and AFL (indirect), SAZ, NPD, MMC
(direct) and H
2
O
2
(direct and indirect) were included among these mutagens.
The extracts showed positive results when tested against the mutagenic agents; i.e,
they presented antimutagenic potential for more than one strain and were efficient against
different mutational mechanisms (frameshift: TA98 and TA97a; base pairs substitution:
TA100 and TA102 and antioxidative action: TA102). The highest value of inhibition level
(89%) was obtained with MeOH extract, using the strain TA100 in presence of AFL
The phytochemical analysis of the CHCl
3
extrac in this work showed the presence of
a mixture of n-alkanes (C
30
-C
34
), of which triacontane (C-30) and dotriacontane (C-32) were
the major components, in addition to these, lupeol, ursolic acid and oleanolic acid were
isolated.
The mutagenic or antimutagenic effect of n-alkanes have not been described in the
literature, but lupeol, ursolic acid and oleanolic acid are known for their antimutagenic
activity.
25,26,27,28
Ursolic acid isolated from the ethanolic fraction of Eriobotrya japonica markedly
and significantly decrease the numbers of S.typhimurium TA100 revertants per plate, thus
showing antimutagenic activity.
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In addition the presence of lupeol, a triterpene that has had its pharmacological
properties approved. According to the literature, lupeol presents antiinflammatory, anti-
arthritis, antimutagenic, antioxidative, anticarcinogenic properties,
30
as well as
hepatoprotective properties against degenerative lesions caused by aflatoxin B
1
.
31
Phytochemical studies of the methanol extract demonstrated the presence of (+)-
catechin, quercetin-3-O-G-L-arabinopyranoside, quercetin, gallic acid, methyl gallate and the
amentoflavone. In previous studies by our group, using another species of Byrsonima, no
mutagenic activity was observed for (+)-catechin, quercetin-3-O-G-L-arabinopyranoside and
methyl gallate, however, mutagenic activity was positive for amentoflavone.
32
Despite the
fact that this biflavonoid presented mutagenic activity, the amount of this compound found in
the methanol extract of B. basiloba (1.79 mg/g of methanolic extract - Table 6) it is much
smaller than that found in B. crassa (17.04 mg/g of methanolic extract) and B.intermedia
extracts (13.70 mg/g of methanolic extract).
33
Another aspect that should be considered is that quercetin also presents mutagenic
activity,
34
however, in agreement with the present results the amount found in the methanol
extract is small (0.53 mg/g of methanol extract) in relation to its glucoside derivatives (Table
6). The literature states that the glucoside quercetin presents significantly diminished pro-
oxidant activity when compared to the pro-oxidant effect of quercetin aglycone.
35
Methyl gallate presents no mutagenic potential.
36
In addition, according to Dauer et
al.
37
catechin caused minimal damage to the genetic material of hepatocytes only at high
concentrations. Martínez et al.
36
also reported this data and showed that catechin was not
capable of causing oxidative damage in specific strains of E. coli. The same authors state that
gallic acid, also found in this vegetal extract, presented the capacity to cause oxidative
damage, but that after metabolic activation, this property was no longer present.
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Proanthocyanidins, condensed tannins, were isolated from the methanol extract of B.
basiloba and, according to Yamakoshi et al.,
38
an enriched fraction of these compounds
obtained from grape seeds showed no mutagenic effects in the Ames test, nor on chromosome
aberration in vitro or in the micronucleus of mice cells. Dauer et al.
37
reported that a fraction
of proanthocyanidins obtained from Hamamelis virginiana caused breaks in hepatocyte DNA,
which were detected using the comet assay; although, as stated in the same study, this tannin
fraction also presented antigentoxic activity in vitro.
Vegetal extracts are used as medicine for several types of illness and may be used as
chemopreventives in different parts of the world. Recently, Bunkova et al.,
39
demonstrated
that green tea contains certain antioxidant substances, such as epigallocatechin, epicatechin
and catechin, among others, which are capable of reducing the level of mutagenicity to 70%.
Using green tea extract, which is rich in polyphenols (catechin, epicatechin), Geetha et al.
40
showed antioxidative activity when it was tested against the oxidant potential of hydrogen
peroxide in Salmonella typhimurium TA102, in agreement with the results of this study.
Flavonoids present antimutagenic activity in addition to therapeutic properties.
Sannomiya et al.
7
showed that the flavonoids in B. crassa extract presented a significant
antiulcerogenic effect. Park et al.
41
analyzed flavonoids in Rhus verniciflus extract and
discovered efficiency in the antimutagenic test, with a considerable reduction in the level of
mutagenicity promoted by aflatoxin. In general, this study showed that extracts of Byrsonima
presented positive results for antimutagenicity and that this occurs in the presence of
flavonoids.
In the present study, both MeOH and CHCl3 B. basiloba extracts were efficient at
protecting genetic material against different types of damage caused by several mutagenic
agents. A number of these agents, like aflatoxin B
1
, benzo(a)pyrene and hydrogen peroxide,
are often found in human daily diet and the environment.
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All of these findings highlight that this plant extract could be useful for
chemoprevention against damage produced by a variety of mutagenic compounds.
The occurrence rate of cancer is increasing worldwide and the determination of
chemopreventive or chemoprophylaxis compounds is important regarding efforts to reduce
the risk of cancer.
42
Antimutagenicity determination of plant extracts is also important in the
discovery of new effective anticarcinogenic treatments. A plant extract indicating
antimutagenicity is not necessarily an anticarcinogen, however, it is a strong indication of
possible anticarcinogenic properties that should stimulate further investigation.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors would like to thank the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo (FAPESP) for providing funds from the Biota-Fapesp Program and to the Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico Tecnológico (CNPq) for grants conceded to W.V.,
E.A.V. and W.L.M.
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Table 1. Mutagenic activity expressed by the mean and standard deviation of the number of revertants and mutagenicity ratio (value in parenthesis) in strains TA98, TA100, TA97a and
TA102 of S. typhimurium exposed to several doses of chloroform and methanol extracts of B. basiloba, with (+S9) or without (-S9) metabolic evaluation.
DMSO: 100 µL/plate (negative control). Control + (positive control):
a
NPD (4-nitro-o-phenylenediamine – 10.0 µg/plate);
b
2-Anthramine (1.25 µg/plate);
c
Sodium Azide (1.25 µg/plate);
d
Daunomycin (3.0 µg/plate). CHCl
3
– Chloroform Extract; MeOH – Methanol Extract.
*
P < 0.05.
TA98 TA100 TA97a TA102
Treatment
(mg/plate)
- S9 + S9 - S9 + S9 - S9 + S9 - S9 + S9
CHCl
3
DMSO
37.0 ± 3.61 28.7 ± 4.5 106.3 ± 19.5 97.7 ± 4.7 112.5 ± 7.8 156.0 ± 11.5 291.3 ± 6.7 266.3 ± 31.6
1.99
43.7 ± 12.2 (1.2) 32.7 ± 3.5 (1.2) 119.3 ± 9.8 (1.1) 109.0 ± 10.5 (1.2) 120.0 ± 4.2 (1.1) 162.0 ± 8.9 (1.0) 248.0 ± 32.6 (0.8) 312.7 ± 10.4 (1.2)
3.97
36.3 ± 2.52 (1.0) 27.7 ± 3.5 (1.3) 123.3 ± 8.9 (1.2) 107.7 ± 16.6 (1.1) 133.0 ± 5.7 (1.2) 173.3 ± 10.7 (1.1) 274.3 ± 18.0 (0.9) 304.0 ± 21.0 (1.1)
7.95
41.0 ± 5.2 (1.1) 31.3 ± 7.5 (1.1) 130.0 ± 6.9 (1.2) 116.3 ± 24.6 (1.2) 126.5 ± 6.4 (1.1) 169.3 ± 20.0 (1.1) 201.7 ± 14.3 (0.7) 315.7 ± 18.5 (1.2)
11.92
34.7 ± 7.64 (0.9) 38.7 ± 2.5 (1.0) 126.3 ± 5.1 (1.2) 101.0 ± 13.1 (1.0) 138.0 ± 5.7 (1.2) 195.3 ± 24.7 (1.2) 232.0 ± 7.9 (0.8) 324.7 ± 22.2 (1.2)
15.90
36.7 ± 4.0 (1.0) 34.0 ± 3.6 (1.1) 126.7 ± 7.6 (1.2) 98.7 ± 4.2 (1.0) 154.0 ± 8.5 (1.4) 154.0 ± 10.5 (1.0) 214.0 ± 7.1 (0.7) 313.0 ± 13.5 (1.2)
MeOH
DMSO
37.0 ± 3.61 28.7 ± 4.5 106.3 ± 19.5 97.7 ± 4.7 112.5± 7.8 156.0 ± 11.5 291. 3 ± 6.7 266.3 ± 31.6
3.65
41.0 ± 5.2 (1.1) 32.7 ± 2.5 (1.1) 128.7 ± 7.6 (1.2) 92.3 ± 6.7 (0.9) 194.0 ± 1.4 (1.7)
*
217.3 ± 20.0 (1.4) 293.7 ± 10.3 (1.0) 285.0 ± 12.8 (1.1)
7.30
28.3 ± 2.89 (0.8) 29.7 ± 4.0 (1.0) 122.0 ± 6.2(1.5)
*
104.7 ± 5.9 (1.1) 167.0 ± 5.7 (1.5)
*
267.0 ± 10.9(1.7)
*
242.7 ± 11.1 (0.8) 293.0 ± 8.5 (1.1)
14.60
44.0 ± 19.2 (1.0) 30.7 ± 5.9 (1.1) 125.7 ± 12.9 (1.2)
Cytotoxic
100.5 ± 4.9 (0.9) 255.0 ± 6.0 (1.6)
*
233.7 ± 31.2 (0.8) 285.3 ± 39.3 (1.1)
21.90
39.0 ± 9.54 (1.0) 33.0 ± 3.6 (1.1) 177.0 ± 11.8(1.7)
*
Cytotoxic Cytotoxic
138.7 ± 6.5 (0.9) 219.0 ± 28.3 (0.7) 292.3 ± 13.6 (1.1)
29.20
48.3 ± 3.06 (1.3) 33.0 ± 5.6 (1.1) 191.3 ± 26.0(1.8)
*
Cytotoxic Cytotoxic
140.3 ± 8.6 (0.9) 224.3 ± 9.1 (0.8) 291.7 ± 21.6 (1.1)
Control +
766.3 ± 76.3
a
1314.3 ± 143.1
b
1213.9 ± 107.8
c
1534.9 ± 176.1
b
1456.7 ± 122.9
a
1316.7 ± 197.9
b
1857.6 ± 121.2
d
1973.3 ± 231.1
b
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23
Table 2. Antimutagenic activity expressed by the mean and standard deviation of the number of revertants and percentage of
inhibition (value in parenthesis) of MeOH extract of B. basiloba with direct mutagenic compounds, using strains TA97a,
TA98, TA100 and TA102 of S. typhimurium
.
NPD (4-nitro-o-phenylenediamine – 10.0 µg/plate); SAZ (Sodium Azide -1.25 µg/plate); MMC (Mitomycin C -
0.5µg/plate); H
2
O
2
(Hydrogen Peroxide – 0.034 mg/plate); Tox= viability < 60%
Strain Mutagen
Extract concentration (mg/plate)
Number of revertants (M±SD)
(% inhibition )
NPD
1
.82 3.65 7.30 14.60 21.90
TA97a
810±30 318±80
(tox)
335±9
(tox)
94±30
(tox)
45±8
(tox)
22±3
(tox)
TA98
504±9 341±31
(32)
340±39
(32)
327±17
(35)
286±37
(43)
96±20
(81)
SAZ
1.82 3.65 7.30 14.60 21.90
TA100
2373±90 1770±130
(25)
2016±194
(15)
2074±12
(12)
1366±145
(tox)
495±130
(tox)
MMC
1.82 3.65 7.30 14.60 21.90
TA102
1737±77 1507±7
(13)
1558±85
(10)
1265±24
(27)
605±88
(65)
620±167
(64)
H
2
O
2
1.82 3.65 7.30 14.60 21.90
TA102
503±11 332±15
(34)
235±75
(53)
242±52
(52)
78±3
(tox)
67±2
(tox)
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For Peer Review
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Table 3. Antimutagenic activity expressed by the mean and standard deviation of the number of revertants and
percentage of inhibition (value in parenthesis) of MeOH extract of B. basiloba with indirect mutagenic compounds,
using strains TA97a, TA98, TA100 and TA102 of S. typhimurium
H
2
O
2
(Hydrogen Peroxide- 0.034mg/plate); AFL (Aflatoxin - 0.5µg/plate); B(a)P (Benzo(a)pyrene- 1µg/plate);
Tox= viability < 60%
Strain Mutagen
Extract concentration (mg/plate)
Number of revertants (M±SD)
(% inhibition )
AFL
0.46 0.91 1.83 3.65 7.30
TA97a
1182±45
276±12
(tox)
217±10
(tox)
245±12
(tox)
209±1.5
(tox)
199±25
(tox)
1.82 3.65 7.30 14.60 21.90
TA98
613±16
199±24
(68)
164±14
(73)
194±13
(68)
145±16
(76)
119±17
(81)
1.82 3.65 7.30 14.60 21.90
TA100
1627±77
254±16
(84)
228±12
(86)
179±8
(89)
128±16
(tox)
117±17
(tox)
B(a)P
0.46 0.91 1.82 3.65 7.30
TA97a
749±6 187±63
(tox)
210±13
(tox)
193±16
(tox)
191±15
(tox)
144±42
(tox)
1.82 3.65 7.30 14.60 21.90
TA98
595±1
201±8
(66)
169±12
(72)
163±8
(73)
163±10
(73)
110±9
(82)
TA100
710±22
95±3
(tox)
96±11
(tox)
86±7
(tox)
53±3
(tox)
13±2
(tox)
H
2
O
2
TA102
614±18 200±8
(68)
222±11
(64)
188±32
(tox)
133±32
(tox)
61±28
(tox )
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Table 4. Antimutagenic activity expressed by the mean and standard deviation of the number of revertants and
p
ercentage of inhibition (value in parenthesis) of CHCl
3
e
xtract of B. basiloba with direct mutagenic compounds,
using strains TA97a, TA98, TA100 and TA102 of S. typhimurium.
NPD (4-nitro-o-phenylenediamine – 10.0 µg/plate); SA (Sodium Azide -1.25 µg/plate); MMC (Mitomycin C -
0.5µg/plate); H
2
O
2
(Hydrogen Peroxide – 0.034 mg/plate); Tox= viability < 60%
Strain Mutagen
Extract concentration (mg/plate)
Number of revertants (M±SD)
(% inhibition )
NPD
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA97a
810±30
203±46
(75)
197±20
(76)
178±17
(78)
179±16
(78)
193±10
(76)
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA98
504±9
341±31
(32)
340±39
(33)
327±17
(35)
286±37
(43)
196±20
(61)
SAZ
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA100
2373±90
1770±130
(25)
2016±194
(15)
2074±12
(13)
1366±145
(44)
495±130
(79)
MMC
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA102
1731±77 1724±182
(0.4)
1182±122
(32)
783±61
(55)
578±16
(67)
585±84
(66)
H
2
O
2
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA102
503±11
418±29
(17)
493±56
(2)
418±26
(17)
392±13
(22)
270±28
(46)
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For Peer Review
26
Table 5. Antimutagenic activity expressed by the mean and standard deviation of the number of revertants and
percentage of inhibition (value in parenthesis) of CHCl
3
extract of B. basiloba with indirect mutagenic compounds,
using strains TA97a, TA98, TA100 of S. typhimurium.
H
2
O
2
(Hydrogen Peroxide- 0.034 mg/plate); AFL (Aflatoxin - 0.5µg/plate); B(a)P (Benzo(a)pyrene- 1µg/plate);
Tox= viability < 60%
Strain Mutagen
Extract concentration (mg/plate)
Number of revertants (M±SD)
(% inhibition )
B(a)P
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA97a
749±
676±10
(10)
289±14
(61)
164±14
(78)
178±9
(76)
165±13
(78)
TA98
595±1
259±11
(56)
212±4
(64)
208±13
(65)
258±13
(56)
197±9
(66)
TA100
710±22
350±15
(tox)
253±16
(tox)
85±16
(tox)
74±11
(tox)
23±2.3
(tox)
AFL
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA97a
1128±45
276±12
(tox)
217±10
(tox)
245±12
(tox)
209±1.5
(tox)
199±2.5
(tox)
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA98
613±16
211±2
(66)
183±18
(70)
186±7
(70)
179±4
(70)
158±4
(74)
0.99 1.99 3.97 7.95 15.9
TA100
1627±75
223±16
(tox)
169±16
(tox)
121±19
(tox)
194±84
(tox)
134±9
(tox)
H
2
O
2
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA102
614±18 254±18
(59)
269±31
(56)
267±6
(57)
234±13
(62)
261±24
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Table 6. Content of the main flavonoids from Byrsonima basiloba.
Compounds Content (mg g
–1
of methanol
extract)*
NI 2.20
Q3OGal 3.82
NI 1.83
Q3O(2"Galoil)Gal 0.17
Q3OAra 2.97
Q 0.53
Amentoflavone 1.79
Total flavonoids
13.31
Q3OGal = quercetin-3-O-H-galactopyranoside; Q3OAra = quercetin-3-O-G-arabinopyranoside;
Q3O(2”Galloyl)Gal = quercetin-3-O-(2”-O-galloyl)-H-galactopyranoside; Q3O(2”Galloyl)Ara = quercetin-3-O-
(2”-O-galloyl)-G-arabinopyranoside; Q = quercetin. NI = not identified.
* Flavonoids contents determined by HPLC-UV-PDA.
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For Peer Review
Table 1. Mutagenic activity expressed by the mean and standard deviation of the number of revertants and mutagenicity ratio (value in parenthesis) in strains TA98, TA100, TA97a and
TA102 of S. typhimurium exposed to several doses of chloroform and methanol extracts of B. basiloba, with (+S9) or without (-S9) metabolic evaluation.
DMSO: 100 µL/plate (negative control). Control + (positive control):
a
NPD (4-nitro-o-phenylenediamine – 10.0 µg/plate);
b
2-Anthramine (1.25 µg/plate);
c
Sodium Azide (1.25 µg/plate);
d
Daunomycin (3.0 µg/plate). CHCl
3
– Chloroform Extract; MeOH – Methanol Extract.
*
P < 0.05.
TA98 TA100 TA97a TA102
Treatment
(mg/plate)
- S9 + S9 - S9 + S9 - S9 + S9 - S9 + S9
CHCl
3
DMSO
37.0 ± 3.61 28.7 ± 4.5 106.3 ± 19.5 97.7 ± 4.7 112.5 ± 7.8 156.0 ± 11.5 291.3 ± 6.7 266.3 ± 31.6
1.99
43.7 ± 12.2 (1.2) 32.7 ± 3.5 (1.2) 119.3 ± 9.8 (1.1) 109.0 ± 10.5 (1.2) 120.0 ± 4.2 (1.1) 162.0 ± 8.9 (1.0) 248.0 ± 32.6 (0.8) 312.7 ± 10.4 (1.2)
3.97
36.3 ± 2.52 (1.0) 27.7 ± 3.5 (1.3) 123.3 ± 8.9 (1.2) 107.7 ± 16.6 (1.1)
133.0 ± 5.7 (1.2) 173.3 ± 10.7 (1.1) 274.3 ± 18.0 (0.9) 304.0 ± 21.0 (1.1)
7.95
41.0 ± 5.2 (1.1) 31.3 ± 7.5 (1.1) 130.0 ± 6.9 (1.2) 116.3 ± 24.6 (1.2) 126.5 ± 6.4 (1.1) 169.3 ± 20.0 (1.1) 201.7 ± 14.3 (0.7) 315.7 ± 18.5 (1.2)
11.92
34.7 ± 7.64 (0.9) 38.7 ± 2.5 (1.0) 126.3 ± 5.1 (1.2) 101.0 ± 13.1 (1.0) 138.0 ± 5.7 (1.2) 195.3 ± 24.7 (1.2) 232.0 ± 7.9 (0.8) 324.7 ± 22.2 (1.2)
15.90
36.7 ± 4.0 (1.0) 34.0 ± 3.6 (1.1) 126.7 ± 7.6 (1.2) 98.7 ± 4.2 (1.0) 154.0 ± 8.5 (1.4) 154.0 ± 10.5 (1.0) 214.0 ± 7.1 (0.7) 313.0 ± 13.5 (1.2)
MeOH
DMSO
37.0 ± 3.61 28.7 ± 4.5 106.3 ± 19.5 97.7 ± 4.7 112.5± 7.8 156.0 ± 11.5 291. 3 ± 6.7 266.3 ± 31.6
3.65
41.0 ± 5.2 (1.1) 32.7 ± 2.5 (1.1) 128.7 ± 7.6 (1.2) 92.3 ± 6.7 (0.9) 194.0 ± 1.4 (1.7)
*
217.3 ± 20.0 (1.4) 293.7 ± 10.3 (1.0) 285.0 ± 12.8 (1.1)
7.30
28.3 ± 2.89 (0.8) 29.7 ± 4.0 (1.0) 122.0 ± 6.2(1.5)
*
104.7 ± 5.9 (1.1) 167.0 ± 5.7 (1.5)
*
267.0 ± 10.9(1.7)
*
242.7 ± 11.1 (0.8) 293.0 ± 8.5 (1.1)
14.60
44.0 ± 19.2 (1.0) 30.7 ± 5.9 (1.1) 125.7 ± 12.9 (1.2)
Cytotoxic
100.5 ± 4.9 (0.9) 255.0 ± 6.0 (1.6)
*
233.7 ± 31.2 (0.8) 285.3 ± 39.3 (1.1)
21.90
39.0 ± 9.54 (1.0) 33.0 ± 3.6 (1.1) 177.0 ± 11.8(1.7)
*
Cytotoxic Cytotoxic
138.7 ± 6.5 (0.9) 219.0 ± 28.3 (0.7) 292.3 ± 13.6 (1.1)
29.20
48.3 ± 3.06 (1.3) 33.0 ± 5.6 (1.1) 191.3 ± 26.0(1.8)
*
Cytotoxic Cytotoxic
140.3 ± 8.6 (0.9) 224.3 ± 9.1 (0.8) 291.7 ± 21.6 (1.1)
Control +
766.3 ± 76.3
a
1314.3 ± 143.1
b
1213.9 ± 107.8
c
1534.9 ± 176.1
b
1456.7 ± 122.9
a
1316.7 ± 197.9
b
1857.6 ± 121.2
d
1973.3 ± 231.1
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For Peer Review
Table 2. Antimutagenic activity expressed by the mean and standard deviation of the number of revertants and percentage of
inhibition (value in parenthesis) of MeOH extract of B. basiloba with direct mutagenic compounds, using strains TA97a,
TA98, TA100 and TA102 of S. typhimurium
.
NPD (4-nitro-o-phenylenediamine – 10.0
µ
g/plate); SAZ (Sodium Azide -1.25
µ
g/plate); MMC (Mitomycin C -
0.5
µ
g/plate); H
2
O
2
(Hydrogen Peroxide – 0.034 mg/plate); Tox= viability < 60%
Strain Mutagen Extract concentration (mg/plate)
Number of revertants (M±SD)
(% inhibition )
NPD
1.82 3.65 7.30 14.60 21.90
TA97a
810±30 318±80
(tox)
335±9
(tox)
94±30
(tox)
45±8
(tox)
22±3
(tox)
TA98
504±9 341±31
(32)
340±39
(32)
327±17
(35)
286±37
(43)
96±20
(81)
SAZ
1.82 3.65 7.30 14.60 21.90
TA100
2373±90 1770±130
(25)
2016±194
(15)
2074±12
(12)
1366±145
(tox)
495±130
(tox)
MMC
1.82 3.65 7.30 14.60 21.90
TA102
1737±77 1507±7
(13)
1558±85
(10)
1265±24
(27)
605±88
(65)
620±167
(64)
H
2
O
2
1.82 3.65 7.30 14.60 21.90
TA102
503±11 332±15
(34)
235±75
(53)
242±52
(52)
78±3
(tox)
67±2
(tox)
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For Peer Review
Table 3. Antimutagenic activity expressed by the mean and standard deviation of the number of revertants and
percentage of inhibition (value in parenthesis) of MeOH extract of B. basiloba with indirect mutagenic compounds,
using strains TA97a, TA98, TA100 and TA102 of S. typhimurium
H
2
O
2
(Hydrogen Peroxide- 0.034mg/plate); AFL (Aflatoxin - 0.5
µ
g/plate); B(a)P (Benzo(a)pyrene- 1
µ
g/plate);
Tox= viability < 60%
Strain Mutagen Extract concentration (mg/plate)
Number of revertants (M±SD)
(% inhibition )
AFL
0.46 0.91 1.83 3.65 7.30
TA97a
1182±45 276±12
(tox)
217±10
(tox)
245±12
(tox)
209±1.5
(tox)
199±25
(tox)
1.82 3.65 7.30 14.60 21.90
TA98
613±16 199±24
(68)
164±14
(73)
194±13
(68)
145±16
(76)
119±17
(81)
1.82 3.65 7.30 14.60 21.90
TA100
1627±77 254±16
(84)
228±12
(86)
179±8
(89)
128±16
(tox)
117±17
(tox)
B(a)P
0.46 0.91 1.82 3.65 7.30
TA97a
749±6 187±63
(tox)
210±13
(tox)
193±16
(tox)
191±15
(tox)
144±42
(tox)
1.82 3.65 7.30 14.60 21.90
TA98
595±1
201±8
(66)
169±12
(72)
163±8
(73)
163±10
(73)
110±9
(82)
TA100
710±22 95±3
(tox)
96±11
(tox)
86±7
(tox)
53±3
(tox)
13±2
(tox)
H
2
O
2
TA102
614±18 200±8
(68)
222±11
(64)
188±32
(tox)
133±32
(tox)
61±28
(tox )
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For Peer Review
Table 4. Antimutagenic activity expressed by the mean and standard deviation of the number of revertants and
percentage of inhibition (value in parenthesis) of CHCl
3
extract of B. basiloba with direct mutagenic compounds,
using strains TA97a, TA98, TA100 and TA102 of S. typhimurium.
NPD (4-nitro-o-phenylenediamine – 10.0
µ
g/plate); SA (Sodium Azide -1.25
µ
g/plate); MMC (Mitomycin C -
0.5
µ
g/plate); H
2
O
2
(Hydrogen Peroxide – 0.034 mg/plate); Tox= viability < 60%
Strain Mutagen Extract concentration (mg/plate)
Number of revertants (M±SD)
(% inhibition )
NPD
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA97a
810±30 203±46
(75)
197±20
(76)
178±17
(78)
179±16
(78)
193±10
(76)
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA98
504±9 341±31
(32)
340±39
(33)
327±17
(35)
286±37
(43)
196±20
(61)
SAZ
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA100
2373±90 1770±130
(25)
2016±194
(15)
2074±12
(13)
1366±145
(44)
495±130
(79)
MMC
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA102
1731±77 1724±182
(0.4)
1182±122
(32)
783±61
(55)
578±16
(67)
585±84
(66)
H
2
O
2
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA102
503±11 418±29
(17)
493±56
(2)
418±26
(17)
392±13
(22)
270±28
(46)
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For Peer Review
Table 5. Antimutagenic activity expressed by the mean and standard deviation of the number of revertants and
percentage of inhibition (value in parenthesis) of CHCl
3
extract of B. basiloba with indirect mutagenic compounds,
using strains TA97a, TA98, TA100 of S. typhimurium.
H
2
O
2
(Hydrogen Peroxide- 0.034 mg/plate); AFL (Aflatoxin - 0.5
µ
g/plate); B(a)P (Benzo(a)pyrene- 1
µ
g/plate);
Tox= viability < 60%
Strain Mutagen Extract concentration (mg/plate)
Number of revertants (M±SD)
(% inhibition )
B(a)P
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA97a
749± 676±10
(10)
289±14
(61)
164±14
(78)
178±9
(76)
165±13
(78)
TA98
595±1 259±11
(56)
212±4
(64)
208±13
(65)
258±13
(56)
197±9
(66)
TA100
710±22 350±15
(tox)
253±16
(tox)
85±16
(tox)
74±11
(tox)
23±2.3
(tox)
AFL
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA97a
1128±45 276±12
(tox)
217±10
(tox)
245±12
(tox)
209±1.5
(tox)
199±2.5
(tox)
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA98
613±16 211±2
(66)
183±18
(70)
186±7
(70)
179±4
(70)
158±4
(74)
0.99 1.99 3.97 7.95 15.9
TA100
1627±75 223±16
(tox)
169±16
(tox)
121±19
(tox)
194±84
(tox)
134±9
(tox)
H
2
O
2
0.99 1.99 3.97 7.95 15.90
TA102
614±18 254±18
(59)
269±31
(56)
267±6
(57)
234±13
(62)
261±24
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For Peer Review
Table 6. Content of the main flavonoids from Byrsonima basiloba.
Compounds Content (mg g
–1
of methanol
extract)*
NI 2.20
Q3OGal 3.82
NI 1.83
Q3O(2"Galoil)Gal 0.17
Q3OAra 2.97
Q 0.53
Amentoflavone 1.79
Total flavonoids
13.31
Q3OGal = quercetin-3-O-
-galactopyranoside; Q3OAra = quercetin-3-O-
-arabinopyranoside;
Q3O(2”Galloyl)Gal = quercetin-3-O-(2”-O-galloyl)-
-galactopyranoside; Q3O(2”Galloyl)Ara = quercetin-3-O-
(2”-O-galloyl)-
-arabinopyranoside; Q = quercetin. NI = not identified.
* Flavonoids contents determined by HPLC-UV-PDA.
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