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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
LUCIANA BOCACCIO SPERB DE FREITAS
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ULTRA-SOM NA CICATRIZAÇÃO
MUSCULAR ATRAVÉS DE PARÂMETROS DE ESTRESSE
OXIDATIVO EM MODELO ANIMAL DE LESÃO MUSCULAR
CRICIÚMA, SETEMBRO DE 2007
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LUCIANA BOCACCIO SPERB DE FREITAS
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ULTRA-SOM NA CICATRIZAÇÃO
MUSCULAR ATRAVÉS DE PARÂMETROS DE ESTRESSE
OXIDATIVO EM MODELO ANIMAL DE LESÃO MUSCULAR
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós Graduação em Ciências da
Saúde pra obtenção do Titulo de Mestre em
Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Emilio Luiz Streck
Co-orientador: Prof. Dr. Ricardo Aurino Pinho
CRICIÚMA, SETEMBRO DE 2007
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Dedico este trabalho a toda minha
família que me incentivou e me
auxiliou em todos os momentos.
Em especial ao Tiago, meu marido
e ao Gabriel, meu filho, o maior
motivo para vencer este desafio.
4
AGRADECIMENTO
Ao final do trabalho proposto pode-se sentir a importância das contribuições
de pessoas que ao ajudarem, mesmo supondo ser contribuições simples ou
obrigações, muitas vezes não avaliam o peso de suas atitudes para quem as
recebeu. Minha profunda gratidão a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram
para a elaboração deste trabalho em especial:
Prof. Dr. Emilio Streck, pela amizade, dedicação e disponibilidade, pelos
ensinamentos, pela paciência e por acreditar neste trabalho, e principalmente pela
confiança e oportunidade de trabalhar sob sua orientação.
Prof. Dr. Ricardo Pinho, pela amizade, apoio e confiança durante a
realização deste trabalho.
Tiago, meu marido, por ter me apoiado em meus sonhos, me incentivando
sempre e pela ajuda na formulação deste trabalho.
Gabriel, meu filho, que por algumas vezes não teve a atenção necessária,
mas que eu amo muito!
Aos meus pais, Decio e Maria Helena, que sempre me apoiaram e
estiveram ao meu lado me incentivando. Todo meu carinho.
A minha irmã, Cândice, por todo apoio, ajuda e incentivo.
Paulo e Luis Gustavo, pela ajuda, dedicação e paciência na realização deste
trabalho, que por muitas vezes deixaram a vida acadêmica para me auxiliar.
Aos colegas do Laboratório de Fisiopatologia Experimental e Laboratório
de Fisiologia e Bioquímica do Exercício pela ajuda nos experimentos e ótima
convivência.
5
RESUMO
Contusão muscular é a forma de lesão mais comum que afeta a função muscular,
entre atletas e não atletas. Tratamentos para aumentar o processo normal de
reparo e regeneração são importantes para a ampla variedade de pacientes. O
ultra-som terapêutico tem sido utilizado para promover o reparo tecidual,
especialmente para aumentar a proliferação de células e a síntese protéica. O
presente estudo aponta para a investigação do efeito do ultra-som pulsado
terapêutico nos parâmetros de estresse oxidativo, tais como as substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), conteúdo de carbonilação de proteínas e
a atividade das enzimas antioxidantes catalase e superóxido desmutase (SOD),
em músculo esquelético após lesão. Ratos Wistar foram submetidos a modelo
animal de lesão muscular (gastrocnêmio) e o ultra-som pulsado terapêutico foi
usado uma vez ao dia. No primeiro, terceiro e quinto dia após a lesão, os animais
foram mortos por decapitação e os parâmetros de estresse oxidativo foram
avaliados. Os níveis de creatina quinase sérica foram utilizados para comprovar a
lesão muscular esquelética; esses níveis aumentaram nos animais com lesão
muscular, indicando que o modelo animal de lesão foi eficaz. Além disso, o
TBARS não foi alterado após a lesão muscular, quando comparado ao grupo
sham. A carbonilação de proteínas aumentou após a lesão muscular. As
atividades de catalase e SOD diminuíram no primeiro dia após a lesão e não
estavam alteraradas no terceiro e quinto dias. O ultra-som pulsado terapêutico
diminuiu os níveis de TBARS após a lesão muscular, quando comparado ao
grupo com lesão muscular sem tratamento. A avaliação do conteúdo de
carbonilação de proteínas apresentou resultados similares. Especula-se que o
ultra-som pulsado terapêutico parece proteger o tecido da lesão oxidativa. Além
disso, o ultra-som pulsado terapêutico diminuiu as atividades de catalase e SOD,
especialmente no primeiro dia seguinte a lesão.
Palavras chave: ultra-som pulsado terapêutico; lesão muscular; estresse oxidativo
6
ABSTRACT
Contusion muscle are a very common form of both athletic and non-athletic injury,
that affect muscle function. Treatments to augment the normal repair and
regeneration processes are important to a wide variety of patients. Therapeutic
ultrasound has been claimed to promote tissue repair, especially by enhancing cell
proliferation and protein synthesis. The present study aimed to investigate the effect
of therapeutic pulsed ultrasound on parameters of oxidative stress, named
thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), protein carbonyl content and the
activities of antioxidant enzymes catalase and superoxide dismutase (SOD), in
skeletal muscle after injury. Wistar rats were submitted to an animal model of muscle
(gastrocnemius) laceration. Therapeutic pulsed ultrasound was used once a day.
One, three or five days after muscle laceration, the animals were killed by
decapitation and oxidative stress parameters were evaluated. Serum CK levels were
increased in muscle-injured animals, indicating that the laceration animal model was
successful. Besides, TBARS were not altered after muscle injury, when compared to
sham group. Protein carbonyl content was increased after muscle laceration.
Catalase and SOD activities were increased one day after muscle injury and not
altered at days 3 and 5. Therapeutic pulsed ultrasound decreased TBARS levels
after muscle laceration when compared to injured muscle-animals without treatment.
Protein carbonyl content evaluation presented similar results. It is tempting to
speculate that therapeutic pulsed ultrasound seems to protect the tissue from
oxidative injury. Moreover, therapeutic pulsed ultrasound diminished catalase and
SOD activities, especially at the first day following muscle laceration.
Keywords: therapeutic pulsed ultrasound; muscle injury; oxidative stress
.
7
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Representação esquemática das três fases da cicatrização 13
Figura 2. Estresse Oxidativo 25
8
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATP – adenosina trifosfato
CAT – catalase
CK – creatina quinase
DNA – ácido desoxirribonucléico
ERN – espécies reativas de nitrogênio
ERO – espécies reativas de oxigênio
LPO – lipoperoxidação
MHz – Mega Hertz
NADPH – nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
PDGF – fator de crescimento derivado das plaquetas
SOD –superóxido dismutase
TBARS – espécies reativas de ácido tiobarbitúrico
TNF-α – fator de necrose tumoral α
UNESC – Universidade do Extremo Sul Catarinense
US – ultra-som
9
SUMÁRIO
I INTRODUÇÂO 10
1 Lesão Muscular Esquelética 10
1.1 Tecido Muscular 10
1.2 Lesão e cicatrização muscular 12
2 Ultra-som 18
2.1 Histórico 18
2.2 Efeitos biológicos do Ultra-som 18
3 Terapia Ultra-sônica e a lesão muscular 22
4 Espécies reativas de oxigênio 24
4.1 Definição 24
4.2 Estresse oxidativo 26
II OBJETIVOS 28
1 Objetivo Geral 28
2 Objetivos Específicos 28
III RESULTADOS 29
1. Artigo: Effect of therapeutic pulsed ultrasound on parameters of
oxidative stress in skeletal muscle after injury. Cell Biology International
31 (2007) 482-488.
29
IV DISCUSSÃO 30
1 Discussão 30
2 Conclusões 36
3 Perspectivas 37
REFERÊNCIAS 38
10
I INTRODUÇÃO
1. Lesão Muscular Esquelética
1.1 Tecido Muscular
Os tecidos musculares dividem-se em três tipos: esquelético, cardíaco e liso.
Os cardíacos e esqueléticos possuem morfologia estriada e constituem os blocos
contráteis do corpo. O músculo esquelético representa a grande massa tecidual do
corpo, constituindo 40% a 45% do peso corporal total. Sua estrutura é composta
por células musculares, organizadas em redes de nervos e vasos sangüíneos, e
pela matriz extracelular do tecido conjuntivo (Riegel, 1999; Huard et al., 2002). As
células que constituem os músculos esqueléticos são multinucleadas, chamadas
fibras, devido a seu aspecto alongado que atinge a massa muscular de uma
extremidade à outra. Sua membrana externa é chamada de sarcolema, seu
citoplasma é o sarcoplasma e o conteúdo sarcoplasmático é constituído por um
número variável de organelas incluindo: o complexo de golgi, mitocôndrias, retículo
sarcoplasmático, mioglobinas, além das miofibrilas, que são feixes alongados de
cadeias peptídicas. As miofibrilas estão divididas em módulos funcionais
denominados sarcômeros (Huard et al., 2002; Järvinen et al., 2005).
São considerados elementos estruturais básicos do músculo esquelético a
miofibrila e o tecido conjuntivo. A miofibrila, juntamente com seus nervos, é
responsável pela função contrátil da fibra, enquanto que o tecido conjuntivo provido
de sua estrutura une células musculares durante a contração muscular e abraça os
capilares e nervos dentro da estrutura muscular (Lopes et al., 1993; Järvinen et al.,
2005).
11
As miofibrilas são unidas entre si e envolvidas por tecido conjuntivo em três
níveis denominados endomisio, perimísio, epimisio. O endomisio é o tecido
conjuntivo que cerca as miofibrilas individualmente, enquanto que, o perimísio
circunda pacotes ou fascículos de miofibrilas. Por fim, o epimisio é o tecido
conjuntivo mais externo do músculo esquelético, consideravelmente forte e grosso
envolto a todos os fascículos (Lopes et al., 1993; Huard et al., 2002; Järvinen et al.,
2005).
Dependendo do teor de mioglobina deriva a denominação dos músculos em
brancos ou vermelhos, embora uma mesma massa muscular contenha fibras dos
dois tipos musculares, variando entre os diferentes músculos do corpo. Os
músculos vermelhos apresentam grande quantidade de mioglobina que pode
armazenar algum oxigênio, sendo, por isso, usados em esforços submáximos de
longa duração. Estruturalmente, são mais resistentes à tensão, devido ao maior
teor de colágeno nos espaços interfibrilares, e suas fibras são do tipo I - de
contração lenta e ricas em mitocôndrias. Os músculos brancos têm pouca
mioglobina, mas elevada capacidade ATPásica e alta atividade das enzimas
glicolíticas, menos mitocôndrias que os vermelhos, são especializados em realizar
glicólise anaeróbica, utilizados em trabalho máximo e supra-máximo. Suas fibras
são do tipo II, ou de contração rápida (Bassel-Duby & Olson, 2006). As fibras de
contração lenta além de ricas em mitocôndrias possuem muitos capilares
circundantes a cada fibra, exibem um metabolismo oxidativo, tem baixa velocidade
de encurtamento e alta resistência à fadiga (Järvinen et al., 2005; Bassel-Duby &
Olson, 2006).
As células satélites podem ser encontradas achatadas contra a fibra muscular,
ou ocupando depressões pouco profundas na sua superfície. Estas células
12
localizam-se entre o sarcolema e a lâmina basal da fibra muscular, logo são
revestidas pela mesma capa envolvente de glicoproteínas e fibras reticulares. O
número de células satélites encontradas em um determinado músculo esquelético é
inversamente proporcional à idade desse tecido. São mais numerosas nos
músculos oxidativos (ricos em fibras tipo I) e desempenham um papel importante
na regeneração e no crescimento muscular (Zammit et al., 2006).
1.2 Lesão e cicatrização muscular
A lesão muscular é a lesão mais comum que ocorre em esportes, com
incidência variando de 10% a 55% de todas as lesões. Estas lesões ocorrem por
diferentes mecanismos, incluindo trauma direto: laceração, contusão e tensão; e
trauma indireto: isquemia e disfunção neurológica e toxinas (Huard et al., 2002;
Chan et al, 2003; Järvinen et al., 2005; Tidball, 2005; Toumi & Best, 2006).
A laceração muscular é uma lesão incomum no esporte, enquanto que 90% de
todas as lesões esportivas relatadas estão entre contusão e tensão. A contusão
muscular ocorre quando o músculo é submetido à repentina força compressiva, tal
como um golpe direto. O trauma muscular por contusão atinge tipicamente o local
de contato no esporte. Ao considerarmos corrida e salto, temos atividades mais
comuns de lesão por tensão (Tidball, 2005; Toumi & Best, 2006).
Na tensão a força tênsil excessiva submetida sobre o músculo leva as
miofibrilas à tensão acima do possível e conseqüentemente à ruptura próximo à
junção musculotendínea. Quando o tipo de contusão for uma força externa
causando a lesão músculo esquelética, a ruptura ocorre no local de impacto ou
adjacente a ele. Ao considerarmos a tensão muscular, a lesão será localizada na
junção músculo tendínea. A tensão muscular concentra a preocupação em
13
músculos superficiais principalmente nos que passam por duas articulações, tais
como os músculos reto femoral, semitendinoso e gastrocnêmio (Huard et al., 2002;
Järvinen et al., 2005; Toumi et al., 2006).
A lesão muscular envolve uma série de processos no tecido, principalmente a
degeneração intrínseca da fibra muscular e destruição da lâmina basal, o que
caracteriza uma desorganização das miofibrilas nos sarcômeros, ruptura de
mitocôndrias e retículos sarcoplasmáticos, descontinuidade do sarcolema,
alterações dos níveis de cálcio, autodigestão e morte celular (Tidball, 1995; Huard
et al., 2002; Oliveira, 2004).
O que distingue a cicatrização músculo esquelética da cicatrização de lesão
óssea é que a cicatrização músculo esquelética se dá através do processo de
reparo, e a cura óssea pelo processo de regeneração. A maioria dos tecidos do
corpo, ao serem lesados apresentaram cicatriz, ou seja, o tecido resultante do
processo de cicatrização é diferente do anterior à lesão, ao considerarmos um osso
que quebra, o tecido cicatrizado é idêntico ao existente antes da lesão (Järvinen et
al., 2005).
A cicatrização da lesão músculo esquelética segue completamente um padrão
constante, sem relação à causa (contusão, tensão ou laceração) (Järvinen et al.,
2005). No processo cicatricial têm sido identificadas três fases: inflamatória, de
regeneração e fibrose, conforme demonstra a figura 1.
A primeira fase, inflamatória ou fase de destruição é caracterizada pela ruptura
e proteção à necrose das miofibrilas, pela formação de hematoma e pela reação
inflamatória. O inicio da reação inflamatória é amplificado pelas células satélites
que através da liberação de substâncias químicas para as partes necrosadas das
miofibrilas, aumentam o extravasamento de células inflamatórias. Após a lesão
14
muscular, com a ruptura de miofibras e vasos sanguíneos do tecido muscular as
células inflamatórias têm direto acesso ao local da lesão, rápida e seqüencialmente
ocorre a invasão do local, pois são os macrófagos e fibroblastos que quando
ativados produzem um sinal quimiotático adicional para células inflamatórias
circulantes. Assim, a inflamação aguda é considerada a proteção do corpo em
resposta ao tecido lesado. A população de células inflamatórias no local da lesão
pode persistir por dias ou semanas, enquanto ocorrer o reparo, a regeneração e o
crescimento muscular (Tidball, 1995; Järvinen et al., 2005; Toumi et al., 2006).
Figura 1: representação esquemática das três fases da cicatrização tecidual
(Adaptado de Huard et al., 2002)
A inflamação é caracterizada pela formação de coágulo e atividade de
substâncias biologicamente ativas como prostaglandinas, serotoninas e fator de
15
crescimento derivado das plaquetas (PDGF). Neste período a liberação de
histamina aumenta a permeabilidade dos capilares, ocasionando edema na região
lesada. Os neutrófilos têm a função de eliminar as partículas estranhas do local
lesado, os mastócitos fagocitam as bactérias e debris do tecido lesionado, além de
serem outra fonte de substâncias biologicamente ativas que auxiliarão o processo
de reparo (Kitchen & Bazin, 2001; Starkey, 2002; Low & Reed, 2003).
Os neutrófilos rapidamente invadem o tecido muscular lesado e promovem
várias funções importantes que contribuem para inflamação e cicatrização (Toumi
et al., 2006). O quadro geral que surge de estudos é que neutrófilos e macrófagos
dominam a base da resposta inflamatória em músculos, o que inicia após a lesão.
Dados experimentais demonstram que neutrófilos promovem dano muscular após a
lesão, mas evidências experimentais para a função de neutrófilos, no reparo
muscular, não têm sido atingidas. Macrófagos podem promover qualquer lesão
muscular ou proliferação in vitro, embora seu papel in vivo após lesão muscular
permaneça mal compreendido. Recentes resultados demonstram que o processo
inflamatório tem benefício global e um efeito prejudicial na função muscular, isso se
deve pelo fato de a resposta ser influenciada pela prévia história de lesão, e pela
provável interação entre músculo e invasão de células inflamatórias (Tidball, 1995;
Toumi et al., 2006).
Os neutrófilos representam a 1ª linha de defesa a agentes infecciosos após
uma lesão. Estudos relatam que os neutrófilos participam não somente na
fagocitose, como também participam na promoção de lesão (Toumi & Best, 2006).
No mecanismo da relação entre a resposta inflamatória à lesão e os danos
adicionais, o dano mecânico inicial é a infiltração de células inflamatórias nas
16
miofibrilas e sequencialmente os neutrófilos produzem a liberação de radicais livres
de oxigênio (Toumi & Best, 2006; Toumi et al., 2006).
A maioria dos tecidos contém fator de crescimento guardados em forma
inativa na matriz extracelular, usado quando intensamente necessita-se, por
exemplo, no reparo de lesão. Estes fatores de crescimento armazenados são
produzidos pelas células residentes normais e inativados por sua aderência aos
proteoglicans e outros constituintes da matriz extracelular. No evento de dano
tecidual o rompimento da integralidade normal do tecido resulta na ativação e
liberação desta ligação membrana extracelular - fator de crescimento, e assim,
direto ao processo de reparo (Järvinen et al., 2005).
A respeito do fator de crescimento das citocinas, há evidência direta de que
o fator-α de necrose tumoral (TNF-α) tem um papel fisiológico na regeneração da
lesão músculo esquelética. A inibição desta atividade durante a cicatrização resulta
em leve déficit na força de recuperação do músculo (Huard et al., 2002; Järvinen et
al., 2005).
Na fase aguda da lesão muscular, leucócitos polimorfonucleares são as
células mais abundantes no local da lesão, mas ainda no primeiro dia eles são
substituídos pelos monócitos. Conforme os princípios básicos da inflamação, estes
monócitos são transformados em macrófagos que ativamente fagocitam os debris
necróticos circundantes às células satélites, enquanto simultaneamente enviam
fatores solúveis para esta regeneração celular (Järvinen et al., 2005).
Embora as implicações clínicas não estejam definidas, é concebível que
limitar certo aspecto inflamatório representa uma nova estratégia de tratamento
(Toumi & Best, 2006).
17
Alguns dias após a lesão inicia-se a segunda fase ou de proliferação, onde
os fagócitos migram para a área lesada e formam um tecido de granulação, o que
determinará o acúmulo de substância basal e de colágeno na área lesada,
preparando a reconstrução dos tecidos danificados. Uma nova camada epidérmica
se forma e um movimento centrípeto da pele circunjacente provoca uma redução
do tamanho da ferida, processo chamado de contração da ferida (Menetrey et al.,
2000; Huard et al., 2002; Zammit et al., 2006).
A terceira e última fase é a de maturação ou remodelagem, na qual o tecido
de granulação é substituído pelo fibroso, quando o colágeno e os fibroblastos se
realinham, tentando adaptar-se à orientação e função do tecido original. Esta fase
pode continuar por meses ou até anos após a ocorrência da fase proliferativa do
reparo (Kitchen & Bazin, 2001; Starkey, 2002; Low & Reed, 2003; Zammit et al.,
2006).
18
2. Ultra-Som
2.1 Histórico
O Ultra-som (US) teve sua descoberta em 1880, quando o casal Pierre e
Marie Curie descobriu o efeito piezoelétrico através da aplicação de uma corrente
elétrica senoidal sobre um cristal de quartzo colocado entre duas placas metálicas;
estes cientistas constataram a geração de uma vibração de alta freqüência.
Langevin, Tournier e Howeck construíram pela primeira vez, em 1917, em Paris, um
aparelho piezoelétrico que, embora tivesse utilidade para a Marinha, apresentava
aplicações no campo da biologia, observando-se que sob a ação dos ultra-sons que
emitia, morriam pequenos peixes depois de grandes convulsões (Haar, 2007).
Na Fisioterapia a terapia ultra-sônica é definida pelas oscilações de ondas
cinéticas ou mecânicas produzidas pelo transdutor vibratório, que aplicado sobre a
pele atravessa e penetra no organismo em diferentes profundidades, dependendo
da freqüência, que varia de 0,75 a 3,0 MHz, sendo utilizado no tratamento de
pequenas lesões musculares, acelerando o processo de cicatrização muscular e
epitelial (Robertson & Ward, 1997; Haar, 2007).
Desde a sua descoberta, a utilização do US, provoca nos pesquisadores
estudos incessantes, tendo com finalidade a verificação da sua eficácia nos
processos de regeneração muscular.
2.2 Efeitos biológicos do Ultra-som
Os efeitos do US dependem de muitos fatores físicos e biológicos, tais como a
intensidade, tempo de exposição, estrutura espacial e temporal do campo ultra-
sônico e estado fisiológico do objeto. Este grande número de variáveis complica a
compreensão exata do mecanismo de ação do ultra-som na interação com os
19
tecidos biológicos (Sarvazyan et al., 1982; Richardson, 1989; Robertson, 2002;
Gann, 2003).
Independente do tipo de mecanismo de interação que está agindo no tecido
biológico estudado, o objetivo principal é estabelecer limiares para a intensidade
ultra-sônica, abaixo dos quais não provoca efeito lesivo. Experimentos realizados
com o US demonstram que a interação com os tecidos biológicos provocam
alterações fisiológicas que podem ser benéficas ou provocar danos (Ferrari, 1987;
Haar, 2007).
Os mecanismos físicos envolvidos na terapêutica do US que induzem respostas
clinicamente significantes sobre as células, tecidos, órgãos e organismo são
geralmente classificados em mecanismo térmico e não térmico (Dyson,1987).
Térmico
É decorrente da absorção das ondas ultra-sônicas pelo tecido que se
transforma em calor. A vibração celular e de suas partículas provoca um atrito entre
elas, produzindo assim o efeito térmico. A produção de calor é maior nas áreas
limítrofe músculo/osso (Dyson,1987).
No US com feixe contínuo, prevalece o efeito térmico, o que não ocorre com o
feixe ultra-sônico pulsátil ou intermitente, promovendo ação analgésica,
antiinflamatória ou antiespasmódica na zona tratada. Melhora a circulação do local e
região, promovendo uma leve hiperemia (Silva, 1987; Machado, 1991; Kitchen &
Bazin, 2001; Low & Reed, 2003).
O tecido ao ser estimulado pelo plexo terminal nervoso ocorre vasodilatação
em extremidades, e com isso, temos o efeito térmico provocando um aumento do
20
fluxo sanguíneo, o que produzirá reflexamente nos capilares e arteríolas uma
vasodilatação reflexa (Dyson,1987; Kitchen & Bazin, 2001; Low & Reed, 2003).
Não Térmico ou Mecânico
As ondas ultra-sônicas, ao penetrarem no tecido, provocam vibrações sobre
os mesmo em nível celular (micromassagem), acelerando a velocidade de difusão
de íons através da membrana celular e o intercâmbio de fluidos, favorecendo o
processo de difusão e melhorando o metabolismo celular. O potencial da membrana
é alterado, produzindo a sua despolarização. Além disso, regula o desequilíbrio,
auxilia a liberação de aderências, pela separação das fibras colágenas (Dyson,
1987; Silva, 1987; Machado, 1991).
Com o aumento das trocas e da vasodilatação, teremos mais anticorpos,
leucócitos e eletrólitos na área, o que concorrerá para uma maior defesa, além de
aumentar consideravelmente o retorno venoso e linfático, facilitando a absorção de
edemas (Machado, 1991).
O US age através dos fatores mecânicos e térmicos, que provocam uma série
de reações químicas que aceleram as reações e aumentam a condutibilidade das
ações, como a liberação de substâncias vasodilatadoras, facilitando a dispersão dos
líquidos e a desagregação de moléculas complexas (Silva, 1987; Machado, 1991).
As ondas ultra-sônicas sofrem reflexão de mais ou menos 99% ao incidir
ar/pele, parte daí a importância de se evitar gases e a necessidade de utilizar
substâncias de acoplamento (gel, óleo, água, almofada de gel) entre o emissor e a
pele do paciente (Machado, 1991; Low & Reed, 2003; Agne, 2004; Yang et al.,
2005).
21
O US pode provocar a formação de bolhas ou cavidades micrométricas nos
líquidos contendo gás, causada por pressões negativas no tecido durante a
rarefação. Esta formação de bolhas pode quebrar ligações moleculares entre o gás
e o tecido (cavitação transitória). O colapso das bolhas libera energia que pode
também quebrar ligações. Radicais livres produzidos durante a quebra de ligações
podem levar a reação de oxidação (Kitchen & Bazin, 2001; Agne, 2004).
Portanto, trata-se de um efeito destrutivo ou danoso, constituindo uma lesão
celular provocada por força excessiva de tração e compressão das ondas do ultra-
som (Kitchen & Bazin, 2001; Agne, 2004).
Se for evitado um campo de ondas estacionárias e se forem utilizadas baixas
intensidades durante a terapia, será improvável a ocorrência desta cavitação
temporária (Kitchen & Bazin, 2001; Agne, 2004).
22
3. Terapia Ultra-sônica e a lesão muscular
A terapia por US influencia a atividade das células, plaquetas, mastócitos,
macrófagos e neutrófilos envolvidos na fase inflamatória do processo de
regeneração tecidual, acelerando o processo de cicatrização. As ondas ultra-sônicas
produzem o aumento da permeabilidade da membrana e das plaquetas facilitando a
liberação de serotonina. Os mastócitos terão o rompimento de sua membrana celular
em resposta ao aumento dos níveis de cálcio intracelular, liberando histamina. A
capacidade de efetuar o transporte do cálcio através das membranas celulares,
segundo mensageiro, pode exercer efeito profundo na atividade celular, aumentando
a síntese e secreção dos fatores de lesão pelas células envolvidas no processo de
cicatrização (Sarvazyan, 1982; Kitchen & Bazin, 2001; Low & Reed, 2003).
Na fase de proliferação ou granulação, que inicia aproximadamente três dias
após a lesão, no período em que as células são expostas a níveis terapêuticos de
US a motilidade dos fibroblastos estará aumentada, não tendo comprovação na
literatura sobre a ação desta terapia no estímulo da atividade dos fibroblastos. Outro
efeito está relacionado ao aumento da velocidade de angiogênese e aumento na
secreção de colágeno presentes nesta fase. No artigo de revisão de Maxwell (1992)
foi observado que a utilização da terapia ultra-sônica pode gerar radicais livres que
prejudicam a fase de granulação, outros estudos afirmam que o US pode
potencializar ou inibir o processo infamatório (Maxwell, 1992; Maxwell et al., 1994;
Menetrey, 1999; Low & Reed, 2003).
O estágio de remodelamento pode durar meses ou anos, até que o novo
tecido esteja com a formação e estrutura próximas ao tecido outrora lesado. O
tratamento com US fornece melhor resistência tênsil e elasticidade do colágeno
maduro, quando o tratamento é realizado desde o processo inflamatório até a fase
23
de remodelagem no processo do período cicatricial (Kitchen & Bazin, 2001; Low &
Reed, 2003; Fisher et al., 2003).
No entanto, os mecanismos fisiológicos e bioquímicos responsáveis pelos
efeitos benéficos do US, são pouco conhecidos. Nesse contexto, esse trabalho visa
aprofundar conhecimentos sobre a ação fisiológica do US terapêutico no processo
de cicatrização do tecido muscular, através do estresse oxidativo em modelo animal
de lesão muscular.
24
4. Espécies reativas de oxigênio
4.1. Definição
Em 1954, Gerham e Gilbert propuseram que alguns efeitos tóxicos do
oxigênio poderiam ocorrer pela formação de radicais livres de oxigênio. Os radicais
livres são definidos como qualquer espécie química capaz de existir de forma
independente e que contenham em sua estrutura elétrons desemparelhados. Assim,
os radicais livres têm um grande potencial reativo, reagindo com moléculas como
lipídios, proteínas e ácidos nucléicos, o que por sua vez pode ocasionar a morte
celular. Dentre os radicais livres existem dois grupos: as espécies reativas de
oxigênio (ERO) e as espécies reativas de nitrogênio (ERN) (Halliwell & Gutteridge,
2007).
As espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas na cadeia
mitocondrial, onde 90-95% do oxigênio consumido é reduzido à água. As EROs
podem ser geradas nos processos inflamatórios, na metabolização de gordura pela
-oxidação, na degradação da xantina à ácido úrico e na auto-oxidação de
catecolaminas (Halliwell & Gutteridge, 2007).
Durante a respiração celular, na cadeia transportadora de elétrons, o oxigênio
é reduzido à água. A molécula de oxigênio pode aceitar um total de quatro elétrons
para a sua redução a duas moléculas de água, mas esta redução pode acontecer
com apenas um elétron por vez, ocasionando a produção de ERO, e por
conseqüência a produção de radicais livres de oxigênio. Dois a cinco por cento do
oxigênio é desviado formando os radicais livres (Matsuo & Kaneko, 2001).
Em adição a fagocitose, a invasão e ativação de neutrófilos no local da lesão
músculo esquelética pode conduzir a liberação de radicais livres de oxigênio e
proteases como potencial causa de lesão. Neutrófilos contêm mais de quarenta
25
enzimas hidrolíticas e moléculas tóxicas em seus grânulos e podem gerar vários
oxidantes, tais como, ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e ácido
hipoclorídrico (Toumi & Best, 2006).
Os radicais livres são produzidos em muitos processos fisiológicos e exercem
funções importantes no organismo, participando da fagocitose, processos de
sinalização celular e estão envolvidos na síntese e regulação de algumas proteínas,
em condições fisiológicas. O problema constitui-se quando a produção dos níveis
totais de ERO for maior que a capacidade de defesa, podendo ocasionar danos
celulares (Bondy & Le Bel, 1993).
A produção das espécies reativas de oxigênio ocorre em três fases; na
primeira fase ocorre a inicialização onde duas moléculas se fundem e formam um
radical, após temos a progressão, fase em que o radical se liga a outra molécula
qualquer, gerando um radical livre e finalmente o término quando a geração de
radical termina (Halliwell & Gutteridge, 2007).
Os radicais livres são gerados conforme as fases descritas acima, o ânion
superóxido é o primeiro radical livre formado. Na cadeia respiratória mitocondrial, 5%
do oxigênio utilizado não é completamente reduzido à água, e ocorre a formação de
ânion superóxido (Cadenas & Davies, 2000; Halliwell & Gutteridge, 2007).
O complexo NADPH oxidase localizado em neutrófilos ativados e macrófagos
podem iniciar uma “bomba respiratória” que conduz a produção de ânion
superóxido e que pode rapidamente ser convertido em peróxido de hidrogênio.
Além disso a mieloperoxidase (enzima presente em neutrófilos e macrófagos) pode
gerar ácido hipoclorídrico, um agente de oxidação altamente reativo. Estudos que
analisaram a relação entre lesão muscular e concentração de neutrófilos, sugerem
26
que a invasão de neutrófilos e macrófagos exarceba a lesão muscular (Toumi &
Best, 2006).
Em estudos, os níveis de radicais livres de oxigênio foram medidos no
músculo – após 24 horas da lesão – e os resultados sugerem que existe uma
relação entre infiltração de neutrófilos e o grau de dano muscular após estiramento
do músculo (Toumi & Best, 2006).
4.2. Estresse oxidativo
Os radicais livres são formados no metabolismo celular. As defesas
antioxidantes, enzimáticas e não-enzimáticas, atuam contra a toxicidade dessas
espécies e são responsáveis pela homeostase entre a eliminação e a produção de
radicais livres. Em condições extremas ocorre o aumento da produção de radicais
livres, que são responsáveis por ultrapassar a capacidade antioxidante normal
presente no organismo humano ou ocasionar um déficit das defesas antioxidantes
no organismo, favorecendo o aumento do estresse oxidativo (Bondy & Le Bel, 1993;
Cadenas & Davies, 2000).
Figura 2. Estresse oxidativo (Adaptado de Marks et al., 1996).
27
O estresse oxidativo pode provocar perda da função celular por causar
alterações no metabolismo das células. Estudos mensuraram os níveis de radicais
livres de oxigênio no músculo após a lesão muscular, constatando um aumento
destes níveis no local da lesão nas primeiras 24 horas. Conseqüentemente estes
estudos sugerem que existe uma relação entre infiltração de neutrófilos e o grau de
dano muscular (Toumi & Best, 2006).
Após iniciada a lesão, o estresse oxidativo pode aumentar pela presença de
neutrófilos e macrófagos no local de lesão. A produção de radicais livres causa
dano nas membranas lipídicas e produz necrose nas células (Toumi & Best, 2006;
Toumi et al., 2006).
28
II. OBJETIVOS:
1. Objetivo Geral
Estudar o efeito do ultra-som terapêutico na cicatrização músculo esquelética
induzida em ratos, bem como as alterações na geração de espécies reativas de
oxigênio.
2. Objetivos Específicos
Verificar o efeito do tratamento de ultra-som terapêutico sob lesões
musculares em gastrocnêmio de ratos com os seguintes parâmetros:
1) nível sérico de creatina quinase, para validar o modelo e comprovar a
lesão muscular;
2) medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), um
marcador de lipoperoxidação;
3) oxidação de proteínas;
4) em gastrocnêmio atividade das enzimas antioxidantes superóxido
dismutase e catalase.
29
III RESULTADOS
ARTIGO
Effect of therapeutic pulsed ultrasound on parameters of oxidative stress in
skeletal muscle after injury
Luciana S. Freitas, Tiago P. Freitas, Paulo C. Silveira,
Luís G. Rocha, Ricardo A. Pinho, Emilio L. Streck
Artigo publicado na revista Cell Biology International 31 (2007) 482-488
30
IV DISCUSSÃO
1. Discussão
A lesão muscular esquelética freqüentemente ocorre em esportes
profissionais ou em atividades diárias. A maioria das lesões por esforço é causada
por episódios de estiramento repentino e freqüentemente causam significante
morbidade. Mecanismos que causam a lesão provocam o rompimento do tecido
conjuntivo e componentes miocelulares incluindo sarcolema, miofibrilas e
citoesqueleto (Kasemkijwattana et al., 1998; Menetrey et al.,2000). O tratamento
realizado com o objetivo de diminuir a reação inflamatória e promover a cicatrização
tecidual é a imobilização do local e o uso de antiinflamatórios não-esteroidais,
levando a um tempo prolongado de afastamento de suas atividades laborais, nem
sempre com uma eficácia comprovada (Guozhen et al., 2005).
Nikolaou et al. (1987) admitem que após a lesão provocada por esforço, a
cicatrização da lesão muscular sete dias após apresentava inflamação reduzida e a
fibrose por colágeno mais avançada. Os achados desse estudo demonstram que a
recuperação funcional do músculo ocorre 48 horas após, a despeito da inflamação e
cicatrização ativas (Nikolaou et al., 1987).
Os efeitos do US dependem de muitos fatores físicos e biológicos
(Sarvazyan,1983; Richardson, 1989; Robertson, 2002; Gann, 2003). Experimentos
realizados com o ultra-som demonstram que a interação com os tecidos biológicos
provoca alterações fisiológicas que podem ser benéficas ou provocar danos (Ferrari,
1987; Haar, 2007). A terapia por US influencia a atividade das células, plaquetas,
mastócitos, macrófagos e neutrófilos envolvidas na fase inflamatória do processo de
regeneração tecidual, acelerando o processo de cicatrização. (Sarvazyan,1983;
Kitchen & Bazin, 2001; Low & Reed, 2003).
31
Duarte & Xavier (1983) afirmam que a energia ultra-sônica aplicada ao local
lesado se identifica com a necessidade orgânica de promover potencial elétrico para
disparar o mecanismo de reparo e acelerá-lo, restaurar o fluxo sanguíneo,
permitindo assim a continuidade da vida celular e possibilitando seu desempenho.
Logo, concluíram que a presença de cargas elétricas no osso é vital, não só para o
desenvolvimento ósseo, mas para o reparo tecidual (Duarte & Xavier,1983; Duarte,
1983).
Dyson (1987) observou a regeneração tecidual em feridas experimentais de
coelhos, demonstrando que o uso de US pulsado aumentou o processo de
regeneração em 30% quando comparado ao controle não estimulado. Em estudos
que investigaram a ação do ultra-som pulsado em úlceras varicosas, foi verificada
uma redução significativa das ulcerações quando comparadas ao controle o que
permitiu concluir que o US terapêutico pode estimular o processo de reparação
tecidual (Dyson, 1987).
Trabalhos experimentais de Duarte (1983) comprovaram que o tratamento
com parâmetros específicos de US de baixa intensidade estimula a neoformação
óssea em animais, acelerando não somente o processo de regeneração de tecidos
moles como também a consolidação de fraturas (Duarte & Xavier, 1983; Duarte,
1983).
Efeitos da utilização do US pulsado no tratamento de lesão muscular
experimental aguda por esmagamento do músculo reto femoral de coelhos, foram
investigados por Menezes e colaboradores (1999). Dentre os resultados encontrados
nas propriedades mecânicas foi evidenciado maior suporte de carga e deformação
para os músculos tratados, indicando uma ação benéfica do US sobre o processo de
reparação muscular (Menezes et al., 1999).
32
Outro estudo avaliou os efeitos precoce e tardio do US terapêutico sobre o
processo de cicatrização de tendões flexores de coelhos. Os resultados encontrados
evidenciaram um significativo abrandamento da reação inflamatória, com menor grau
de necrose, um aumento da proliferação de fibroblastos e aumento da deposição de
fibras colágenas na fase tardia da cicatrização do tendão, indicando uma ação
favorável da utilização do US no processo tardio da cicatrização (Leung et al., 2004).
Neste estudo foram mensurados parâmetros de estresse oxidativo no
primeiro, terceiro e quinto dias após lesão muscular.
A figura 1 do artigo demonstra que os níveis de creatina quinase aumentaram
por cinco dias após lesão muscular e que a mais alta atividade da enzima ocorre no
primeiro dia quando comparada ao grupo sham (animais sem lesão). Estes
resultados indicam que a laceração no modelo animal foi bem sucedida.
A figura 2A demonstra que o ácido tiobarbitúrico TBARS, um marcador de
lipoperoxidação, não foi alterado no primeiro, terceiro ou quinto dias após a lesão
muscular, quando comparados ao grupo sham. A figura 2B demonstra diferentes
resultados para o conteúdo de proteína carbonil. Foi verificado que no primeiro,
terceiro e quinto dias após lesão muscular os níveis de proteína carbonil foram
aumentados, quando comparados ao grupo sham. Estes resultados indicam que as
proteínas são provavelmente mais afetadas pela lesão muscular que os lipídios. A
figura 2C mostrou que a atividade de catalase é significantemente aumentada no
primeiro dia após a lesão muscular e não é alterada no terceiro e quinto dias. O
mesmo resultado foi obtido para a atividade da superóxido desmutase (SOD), o que
pode ser visualizado na figura 2D.
As figuras 3, 4 e 5 demonstram um efeito do ultra-som terapêutico nos níveis
de creatina quinase sérica, TBARS, conteúdo de proteína carbonil e atividade de
33
catalase e SOD. Estes resultados mostraram que o US terapêutico pulsado diminuiu
os níveis da atividade CK sérica nos músculos lesados dos animais após o primeiro
dia de lesão, quando comparados com os animais que não receberam a terapia
ultrasônica. Sobre o terceiro e quinto dias, a terapia por US demonstrou não ter
efeito sobre os níveis de CK sérica (figura 3).
Esta pesquisa também verificou que a terapia por US pulsado diminuiu os
níveis de TBARS no gastrocnêmico no primeiro, terceiro e quinto dia após lesão,
quando comparados com os animais que não receberam tratamento, especialmente
com a dose de 1,0 W/cm
2
(figura 4). Contudo, pode-se observar na figura 2A, os
níveis de TBARS não aumentaram na musculatura lesada do animal, quando
comparados ao grupo sham (animais sem lesão). Esses achados demonstram que a
lipoperoxidação provavelmente não está presente no processo de cicatrização
muscular. O figura 4B demonstra que a avaliação do conteúdo de proteínas carbonil
apresentou resultados similares. Verificou-se que a terapia por ultra-som diminuiu o
dano de proteínas. Juntos estes resultados levam a sugerir que a terapia ultrasônica
pode proteger o tecido lesado do dano oxidativo.
Os resultados deste estudo também demonstram que a terapia por US
diminui a atividade de catalase (figura 5A) e SOD (figura 5B) no primeiro dia seguido
à lesão muscular. Sobre o terceiro dia, nenhuma das enzimas foram alteradas.
Sobre o quinto dia, a atividade de catalase não foi alterada e a atividade da SOD
apresentou diminuição. Estes resultados mostram que a terapia por US reduziu a
atividade das enzimas antioxidantes, especialmente no primeiro dia após a lesão
muscular.
Muitos estudos apontam para novos achados de dados sobre os efeitos
biológicos da terapia por US, relativo ao uso no tratamento de lesão muscular. O
34
mecanismo exato sobre os efeitos do US no reparo de tecido é provavelmente
relatado nos efeitos mecânicos ao contrário dos efeitos térmicos (Dinno et al., 1989;
Karnes & Burton, 2002). Neste contexto, acredita-se que o estímulo mecânico que
provém de ondas ultra-sônicas pode ativar o caminho sinal-transdução envolvido na
cicatrização (Markert et al., 2005). Já tem sido demonstrado que o US altera a
atividade de plaquetas, neutrófilos e macrófagos envolvidos na fase inflamatória do
processo de cicatrização muscular, acelerando este processo. Outro efeito é o
aumento da velocidade de angiogênese (Rantanen et al., 1999).
O complexo NADPH oxidase localizado em neutrófilos ativados e macrófagos
podem iniciar uma “bomba respiratória” que conduz a produção de ânion
superóxido e que pode rapidamente ser convertido em peróxido de hidrogênio.
Além disso a mieloperoxidase (enzima presente em neutrófilos e macrófagos) pode
gerar ácido hipoclorídrico, um agente de oxidação altamente reativo. Estudos que
analisaram a relação entre lesão muscular e concentração de neutrófilos, sugerem
que a invasão de neutrófilos e macrófagos exarceba a lesão muscular (Toumi &
Best, 2006).
Em estudos, os níveis de radicais livres de oxigênio foram medidos no
músculo – após 24 horas da lesão – e os resultados sugerem que existe uma
relação entre infiltração de neutrófilos e o grau de dano muscular após estiramento
do músculo (Toumi & Best, 2006).
Resultados de estudos anteriores sobre a efetividade do US na cicatrização
tecidual são ainda contraditórios, alguns pesquisadores acharam efeitos na
regeneração de miofibras esqueléticas, fibroblastos ou úlcera e feridas. Os
diferentes resultados podem ser explicados pelos diferentes tipos de tecidos
35
examinados, modelos e modo das lesões, intensidade e freqüência do tratamento
ultra-sônico (Karnes & Burton, 2002).
Neste estudo, foi usado US terapêutico pulsado para o tratamento de lesão
muscular. Nesta terapia por US pulsado, o efeito térmico é mínimo. Nesta
modalidade, a emissão é interrompida periodicamente, intercalando pausas. Assim,
um calor mínimo é gerado durante o impulso (Fisher et al., 2003). Verificou-se que a
terapia por US pulsado apresenta um efeito protetor de lipídios e proteínas
marcadores de dano oxidativo. Esta terapia também inibiu as atividades de catalase
e SOD no primeiro dia após a lesão muscular. Os resultados deste estudo indicam
que a terapia por US pulsado apresenta efeitos benéficos no processo de
cicatrização muscular, especialmente na diminuição de TBARS e conteúdo de
proteínas carbonil. Estudos adicionais serão realizados em nosso laboratório para
melhor entendimento dos efeitos biológicos da terapia por US pulsado e contínuo na
lesão muscular.
36
2. Conclusões
Parâmetros de estresse oxidativo foram analisados no primeiro, terceiro e
quinto dias após lesão, com ou sem a terapia por US pulsado, e com diferentes
doses de US. Com esse trabalho, conclui-se que:
1. Os níveis de creatina quinase sérica aumentaram na lesão muscular animal,
indicando que o modelo animal de lesão foi eficaz.
2. TBARS não foram alterados após lesão muscular, quando comparados ao
grupo sham.
3. O conteúdo de carbonilação de proteínas aumentou após a lesão muscular.
4. As atividades de catalase e SOD aumentaram no primeiro dia após a lesão
muscular e não alteraram no terceiro e quinto dias.
5. A terapia por ultra-som pulsado diminuiu os níveis de TBARS após a lesão
muscular, quando comparados aos animais com lesão muscular e sem
tratamento.
6. A avaliação do conteúdo de carbonilação de proteínas apresentou resultados
similares ao TBARS.
7. A terapia por US pulsado também diminuiu as atividades da catalase e da
SOD, especialmente no primeiro dia seguinte à lesão muscular.
37
3. Perspectivas
A partir do presente trabalho pretende-se continuar as pesquisas realizando
estudos:
•
com o modelo ultra-sônico além da forma pulsada, a contínua;
•
realização do teste cometa, para analisar lesões em nível de DNA;
•
marcador de dano ao DNA;
•
atividade dos complexos I, II, III e IV da cadeia respiratória mitocondrial;
•
realização de histologia;
•
introdução de fármacos antiinflamatórios juntamente com a corrente ultra-
sônica, a fim de proporcionar um melhor processo de regeneração
muscular;
•
realização de ultra-som em tecido epitelial;
•
a utilização desta terapia como tratamento de pequenas fraturas ósseas.
38
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