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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
PAULA HILÁRIO ZAPELINI
ALTERAÇÕES METABÓLICAS E ESTRESSE OXIDATIVO EM
FÍGADO DE RATOS SÉPTICOS TRATADOS COM
N-ACETILCISTEÍNA E DEFEROXAMINA
Criciúma, dezembro de 2007
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PAULA HILÁRIO ZAPELINI
ALTERAÇÕES METABÓLICAS E ESTRESSE OXIDATIVO EM
FÍGADO DE RATOS SÉPTICOS TRATADOS COM
N-ACETILCISTEÍNA E DEFEROXAMINA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências da Saúde da
Universidade do Extremo Sul Catarinense para
obtenção do Título de Mestre em Ciências da
Saúde
Orientador: Prof. Dr. Emilio Luiz Streck
Co-orientador: Prof. Dr. Felipe Dal Pizzol
Criciúma, dezembro de 2007
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Dedico este trabalho a minha mãe
Tina H. Zapelini, por seu amor
incondicional.
AGRADECIMENTOS
A minha mãe Tina, mãe maravilhosa que acreditou no meu sonho e não mediu
esforços para me ajudar nesta conquista;
Ao meu pai João Carlos, que no pouco tempo que convivemos mostrou-me a
importância do conhecimento, e a necessidade de sempre estudar e querer
aprender mais.
Minha irmã Claudia, que mesmo neste período estando longe, sempre me apoiou e
incentivou a nunca desistir;
Meu namorado Ibanez, que sempre esteve ao meu lado com muito amor e
entendimento;
Ao meu orientador e agora amigo Prof. Emílio, a quem admiro muito e agradeço por
acreditar em mim, pela excelente orientação, sua paciência, dedicação e
ensinamentos que levarei para o resto da vida;
Ao meu co-orientador, Prof. Felipe, pela objetividade e tranqüilidade transmitidas
durante o curso.
Aos bolsistas do laboratório e funcionários do Programa de Pós-graduação em
Ciências da Saúde da UNESC, que não mediram esforços para me ajudar sempre
que foi necessário;
Aos colegas de mestrado, pela troca de experiências e as amizades que fizemos;
Enfim, obrigado a todos os amigos que não mencionei aqui, mas que estão
presentes na minha vida e torceram muito por mim.
Agradeço a Deus.
“A grandeza não consiste em receber
honras, mas em merecê-las.”
(Aristóteles)
RESUMO
Dados da literatura sugerem que as espécies reativas de oxigênio (EROs) tem um
papel importante no desenvolvimento da disfunção múltipla de órgãos e do choque
séptico. Terapias antioxidantes incluem a N-acetilcisteina (NAC) e deferoxamina
(DFX). A disfunção mitocondrial tem sido implicada na patogênese da síndrome da
disfunção múltipla de órgãos e sistemas (MODS) e em uma ampla variedade de
doenças. A teoria da hipóxia tecidual postula que diminuição na fosforilação
oxidativa mitocondrial, reduz a produção de ATP e induz MODS. No presente
trabalho, nosso objetivo foi avaliar os efeitos de NAC e DFX em dano oxidativo e
parâmetros de metabolismo energético em fígado de ratos submetidos a CLP,
modelo de sepse. Foi demonstrado que a CLP induz uma seqüência de eventos que
culminam em morte de células do fígado; apoptose nas primeiras 24hs e necrose
após este período. Sugere-se que a inibição do complexo IV leva a estresse
oxidativo, que leva à disfunção e “swelling” mitocondrial. Consequentemente há
liberação do citocromo c da mitocôndria e indução de apoptose. Estes eventos
ocorrem precocemente no desenvolvimento da sepse, como reportado neste
trabalho. A necrose de células do fígado ocorre 24hs após CLP, mas todos os outros
eventos ocorrem mais cedo (6-12hs). O dano oxidativo induzido pela sepse pode ser
prevenido por intervenções terapêuticas à base de antioxidantes em modelo animal
de CLP. Também foi verificado que a administração da L-NAME não reverteu o
aumento da produção de ânion superóxido, formação de TBARS, carbonilação de
proteínas, “swelling” mitocondrial, aumento da AST ou inibição da atividade do
complexo IV após CLP. Considerando que a L-NAME inibe a óxido nítrico sintase e
que nenhum parâmetro foi revertido após sua administração, sugere-se que todos os
eventos analisados neste estudo não são mediados pelo óxido nítrico. Mesmo que
seja difícil extrapolar os nossos resultados para a sepse humana, acredita-se que o
tratamento com antioxidantes possa ser utilizado no futuro.
Palavras-chave: sepse; mitocôndria; estresse oxidativo; cadeia respiratória; N-
acetilcisteína; deferoxamina.
ABSTRACT
Evidence from the literature have demonstrated that reactive oxygen species (ROS)
play an important role in the development of multiple organ failure and septic shock.
Antioxidant therapeutic interventions include N-acetylcysteine (NAC) and
deferoxamine (DFX). Mitochondrial dysfunction has been implicated in the
pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome (MODS) and a wide variety of
disease states. The hypothesis of cytopathic hypoxia postulates that impairment in
mitochondrial oxidative phosphorylation reduces aerobic adenosine triphosphate
(ATP) production and potentially induces MODS. In this work, our aim was to
evaluate the effects of NAC plus DFX on oxidative damage and energy metabolism
parameters in liver of rats submitted to a cecal ligation puncture (CLP) model of
sepsis. We speculate that CLP induces a sequence of events that culminate with
liver cells death by apoptosis in the first 24 hours and by necrosis after that period.
We propose that the inhibition of complex IV is responsible for oxidative stress,
leading to mitochondrial dysfunction and swelling. Consequently, release of
cytochrome c from mitochondria occurs and apoptosis is activated. These events
occur in early sepsis development, as reported in the present work. Liver cells
necrosis only occurs from 24 hours after CLP, but all other events occur earlier (6-12
hours). Moreover, we showed that antioxidants may prevent oxidative damage and
mitochondrial dysfunction in liver of rats after CLP. In another set of experiments, we
verified that L-NAME administration did not reverse increase of superoxide anion
production, TBARS formation, protein carbonylation, mitochondrial swelling,
increased serum AST or inhibition on complex IV activity caused by CLP.
Considering that this drug inhibits nitric oxide synthase and that any parameter was
reversed by its administration, we suggest that all the events reported in this study
are not mediated by nitric oxide. In conclusion, although it is difficult to extrapolate
our findings to human sepsis, it is tempting to speculate that antioxidants may be
used in the future in the treatment of this disease.
Keywords: sepsis; mitochondria; oxidative stress; respiratory chain; N-acetylcysteine;
deferoxamine.
SUMÁRIO
1 Introdução
9
1.1 Sepse
9
1.2 Aspectos epidemiológicos
10
1.3 Fisiopatologia
16
1.4 Disfunção múltipla de órgãos
18
1.5 Disfunção mitocondrial na sepse
19
1.6 Antioxidantes no tratamento da sepse
24
2 Objetivos
26
2.1 Objetivo Geral
26
2.2 Objetivos Específicos 26
3 Métodos e Resultados 27
Artigo: “Antioxidant treatment reverses mitochondrial dysfunction in a
sepsis animal model”, submetido para publicação na revista
Mitochondrion.
28
4 Discussão
53
5 Referências
56
1 INTRODUÇÃO
1.1 Sepse
A Sepse pode ser definida como a resposta inflamatória sistêmica frente à
infecção, denotando um processo progressivo de dano tecidual, onde a disfunção
orgânica múltipla representa a sua expressão mais grave, conforme postulado por
Bone e colaboradores no Consenso de Sepse de 1992 (Bone et al., 1997). A
importância em se padronizar essas definições vinha de encontro ao crescente
interesse pelo entendimento da fisiopatologia dessa síndrome cada vez mais
incidente. Entretanto, a sepse é composta por sinais e sintomas heterogêneos, o
que dificulta, além da compreensão da patogênese, também o desenvolvimento de
novas alternativas terapêuticas.
Com o passar dos anos, houve a necessidade em se rever e atualizar as
definições de 1992. Assim, em 2001, em uma nova reunião (Levy et al., 2003), foram
atribuídos aspectos mais clínicos às definições anteriores, levando em consideração,
entre outros fatores, o fato de que muitos pacientes com sepse não têm foco
infeccioso documentado. Houve então uma atualização das definições para resposta
inflamatória sistêmica, sepse, sepse grave, choque séptico e disfunção múltipla de
órgãos, tendo sido mantida a idéia de estratificação e de continuidade da mesma
doença, e ampliados os critérios diagnósticos, descritas a seguir.
A síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) é definida com a
resposta inflamatória sistêmica desencadeada pelo organismo frente a qualquer
agressão infecciosa ou não-infecciosa, como grandes queimados e pancreatite, que
ocorre, não necessariamente, na presença de infecção. Há perspectivas de
futuramente utilizar-se apenas critérios bioquímicos e imunológicos e não mais
critérios clínicos para identificar a SIRS.
A infecção é um fenômeno microbiano caracterizado por uma resposta
inflamatória reacional à presença de microorganismos ou à invasão de tecidos
normalmente estéreis. Sepse é a síndrome da resposta inflamatória sistêmica
decorrente de infecção, mesmo que o foco infeccioso seja apenas suspeitado; inclui
a presença de dois ou mãos critérios clínicos para o diagnóstico.
A sepse pode, ainda, ser classificada em dois tipos: sepse grave e choque
séptico. Na sepse grave ocorre disfunção orgânica, hipoperfusão ou hipotensão. A
hipoperfusão e anormalidades da perfusão podem incluir acidose láctica, oligúria ou
alteração aguda do estado mental. A sepse grave é considerada atualmente a
doença com maior mortalidade em pacientes sem doença coronariana nos Estados
Unidos. O choque séptico é caracterizado por hipotensão definida como PA sistólica
< 90 mmHg ou redução de > 40 mmHg da linha de base, ou PAM <60mmHg, não
responsiva a adequada reposição volêmica, com necessidade de uso de fármacos
vasopressores, em um paciente séptico, na ausência de outras causas de
hipotensão.
1.2 Aspectos epidemiológicos
Desde o início da década de 1990, já se tinha comprovação de que a
incidência de sepse vinha aumentando nos Estados Unidos. Um estudo abrangente
conduzido pelo Centro de Controle de Doenças norte-americano mostrou que, em
1990, havia 450.000 casos de sepse por ano, com mais de 100 mil mortes. Talvez a
limitação desse estudo esteja no fato de que na época ainda não se havia postulado
a definições de sepse adotadas a partir de 1992.
Seguiram-se então estudos epidemiológicos norte-americanos de SIRS e
sepse utilizando as definições do ACCP/SCCM (do inglês American College of Chest
Physicians/Society of Critical Care Medicine), de 1992. Dois grandes estudos
merecem destaque. No primeiro deles, Rangel-Frausto e colaboradores (1995)
estudaram 3.708 pacientes admitidos em três Unidades de Terapia Intensiva (UTIs)
e três enfermarias. Sessenta e oito porcento dos pacientes (2.527) apresentaram
SIRS, sendo que entre estes, 26%, 18% e 4% desenvolveram, respectivamente,
sepse, sepse grave e choque séptico. Pacientes com choque séptico apresentaram
um maior número de órgãos com disfunções. A limitação desse estudo deve-se
principalmente ao fato de não ter sido considerada a incidência, mas sim a
ocorrência de sepse. O segundo estudo, conduzido por Sands et al (1997), incluiu
oito centros médicos acadêmicos. O estudo foi desenvolvido prospectivamente entre
os anos de 1993 e 1994. Foram incluídos pacientes internados em UTIs e todos os
pacientes de enfermaria e de pronto socorro que apresentaram hemocultura
positiva, perfazendo 12.759 pacientes. A taxa de ocorrência encontrada de sepse foi
de 2,0 ± 0,16 casos por 100 admissões ou 2,8 ± 0,17casos por 1000 pacientes/dia.
Existem vários estudos epidemiológicos de sepse também no continente
europeu datando esta mesma época, onde foram utilizados critérios semelhantes
àqueles utilizados pelos norte-americanos. No Italian Sepsis Study, de Salvo et al
(1995), foram considerados 1101 pacientes, sendo a SIRS o critério de inclusão no
momento da admissão dos pacientes. A taxa de mortalidade em pacientes com
SIRS foi de 26,5%, semelhante àquela encontrada em pacientes críticos sem SIRS
ou infecção. Entretanto, a mortalidade foi maior em pacientes com sepse, sepse
grave e choque séptico, sendo de 36%, 52% e 81,8%, respectivamente.
Um outro estudo conduzido por Brun-Buisson et al (1995) analisou
prospectivamente todos os pacientes admitidos em 170 UTIs francesas. Foram
registradas 11.828 admissões com taxa de mortalidade de 17%; foram incluídos no
estudo pacientes que apresentavam infecção com dois ou mais dos seguintes
critérios: taquicardia, taquipnéia, ventilação mecânica, febre ou hipotermia e
hipotensão arterial associada à disfunção orgânica. Nesse estudo, o choque séptico
foi definido como hipotensão arterial persistente por no mínimo 1 hora, apesar da
reposição volêmica. Durante um período de busca ativa de oito semanas, 1.064
episódios de sepse grave clinicamente suspeitos foram identificados em 1.052
pacientes (9% das internações); bacteremia ocorreu em 53% dos pacientes com
sepse grave documentada. Sepse grave suspeitada clinicamente foi de 9% e sepse
grave documentada, de 6,3%. A taxa de letalidade global dos pacientes com sepse
grave documentada ou com choque séptico foi de 56%. Os autores relataram ainda
que os fatores de risco para o desenvolvimento de sepse grave foram idade
avançada, admissões clínicas ou cirurgias de urgência, imunossupressão ou
insuficiência hepática crônica.
A análise desses estudos também mostrou que pacientes internados em UTI
desenvolvem cerca de um quarto das infecções nosocomiais, com prevalência
variando de 15 a 40%. Pneumonia e outras infecções do trato respiratório são os
principais focos encontrados em pacientes internados em UTI, respondendo por
metade das infecções; o trato urinário responde por 10 a 20%. Outros focos como
ferida operatória, infecções do trato digestivo e do sistema nervoso central,
correspondem a um quarto das infecções (Vincent et al., 1995).
Em nosso meio, estudos epidemiológicos também demonstram a alta
incidência de sepse. No estudo de Salomão et al (1993), os aspectos
epidemiológicos de pacientes que apresentaram bacteremia, em hospital
universitário entre 1985 e 1986, foram considerados. Nesse estudo foi encontrada
uma incidência de 21,7 hemoculturas positivas a cada 1000 admissões. Ressalta-se
que essa incidência alta esteve relacionada às características dos pacientes
admitidos, sendo ainda maior nos extremos de idade. O sítio de infecção
frequentemente encontrado foi o trato respiratório, seguindo-se infecções
gastrintestinais e urinárias. Publicaram que a mortalidade nesses pacientes foi de
33,4%, seis vezes maior que aquela encontrada em pacientes que não
apresentaram bacteremia. A idade acima de 40 anos, a presença de doença pré-
existente, infecções respiratórias, a presença de choque e o isolamento de
Pseudomonas sp., estiveram significativamente associados à mortalidade. Além
disso, a terapia antimicrobiana adequada reduziu a incidência de choque e melhorou
a sobrevida nos pacientes que apresentaram bacteremia.
Outro estudo brasileiro, avaliando todos os pacientes que apresentaram
hemocultura positiva admitidos no Hospital São Paulo entre 1992 e 1993, observou
letalidade de 33% entre os que apresentaram bacteremia, 36% na sepse, 72% na
sepse grave e 78% no choque séptico (Ujvari et al., 1996). Nesse mesmo período, a
literatura coloca que as taxas de letalidade variavam de 10 a 80%, dependendo do
tipo de UTI e da definição utilizada para o diagnóstico de sepse (Brun-Buisson et al.,
1996). Os fatores de risco para o desenvolvimento da sepse e do choque séptico
eram bem reconhecidos e eram, em parte, responsáveis pelo aumento da
prevalência. Os principais seriam aumento progressivo da sobrevida de pacientes
com doenças crônico-degenerativas e imunossupressoras, utilização de
procedimentos invasivos e os próprios avanços tecnológicos, que possibilitariam a
manutenção do suporte orgânico para vítimas de insultos agudos graves (Sheagren,
1992). Knaus et al (1992) publicaram um estudo prospectivo utilizando pacientes
sépticos admitidos em UTI, onde 18% desses pacientes não preenchiam critérios de
sepse no momento da admissão, porém o fizeram ainda na primeira semana na UTI.
Com isso pode-se entender que é possível que tenha havido uma subestimação da
real incidência de sepse até então.
Em 2002, Albert et al publicaram um estudo epidemiológico englobando 28
UTIs da Europa. Os autores avaliaram 14364 pacientes admitidos em um ano. O
principal achado desse estudo foi que a incidência de infecção nos pacientes que
permaneceram na UTI por mais de 24 horas foi de 18,9%, incluindo 45% dos
pacientes infectados já na admissão; 6,6% do total de pacientes preencheram os
critérios de sepse grave e 8,2% de choque séptico. A taxa de letalidade hospitalar
variou de 16,9% nos pacientes não-infectados a 53,6% naqueles com infecção
adquirida no hospital. A taxa de letalidade hospitalar dos pacientes com sepse ficou
entre 44,8 e 67,9% e dos pacientes com choque séptico entre 47,2% e 63,8%.
A crescente incidência de sepse e sua elevada letalidade foram subsídios
para a realização de estudos de base populacional. O estudo de Angus & Wax
(2001) baseou-se em uma análise retrospectiva de 6.621.559 admissões
hospitalares em sete estados americanos (aproximadamente 25% da população).
Os autores utilizaram a classificação do CID-9 para identificar pacientes com sepse
e disfunção orgânica, verificando se os mesmos pacientes preenchiam os critérios
da ACCP/SCCM de 1992. Nessa amostra populacional, os autores identificaram
192.980 casos de sepse grave durante o ano de 1995. Após ajustes para idade e
sexo, pode-se afirmar que a incidência anual de sepse grave naquele país é de 3,0
casos por 1000 habitantes ou 2,6 casos por 100 altas hospitalares. Outro dado
interessante desse estudo é que cerca de 55% dos pacientes com sepse grave
apresentavam alguma co-morbidade. Metade dos pacientes com sepse grave
identificados recebeu, em algum momento de sua hospitalização, cuidados
intensivos. A taxa de mortalidade global foi de 28,6%, o que resulta em mais de
175.000 mortes anuais. Assumindo um crescimento anual de casos por ano de
1,5%, a estimativa e de que naquele país haverá 934.000 novos casos em 2010 e
1.110.000 no ano de 2020.
No Brasil, apesar de ainda não existirem estimativas precisas, a elevada
freqüência de sepse pode ser observada em um estudo epidemiológico denominado
BASES (do inglês Brazilian Sepsis Epidemiological Study). Este estudo foi sendo
desenvolvido entre maio de 2001 e janeiro de 2002, trata-se de um estudo
prospectivo, de coorte que avalia todos os pacientes internados em UTIs,
independente de sua patologia. As incidências de sepse grave e choque séptico nos
centros considerados foram de 27% e 23%, respectivamente e a taxa de letalidade
global foi de 22% (Silva et al., 2004). Sendo de 47% para sepse grave e de 52%
para choque séptico.
Deste modo, podemos assumir que a incidência de sepse vem aumentando e
a sua epidemiologia mudando no decorrer dos anos. As razões para este aumento
são várias: aumento do uso de procedimentos invasivos, aumento na infecção por
organismos multiresistentes, aumento do número de pacientes internados em UTIs,
entre outros.
1.3 Fisiopatologia
A fisiopatologia da sepse está relacionada a uma interação complexa entre o
hospedeiro e o microorganismo infectante. São vários os processos envolvidos,
sendo o principal relacionado à ativação de células inflamatórias, tais como
leucócitos, macrófagos teciduais, células dendríticas e eosinófilos. A ativação de
células inflamatórias desencadeia a ativação do endotélio, do sistema imune, de
citocinas pró e antiinflamatórias e do sistema de coagulação (Hotchkiss & Karl, 2003;
Crouser, 2004).
O sistema imune inato é a primeira linha de defesa contra infecções e é
ativado quando um patógeno atravessa a barreira natural do hospedeiro. Utiliza-se
uma variedade receptores de reconhecimento que podem estar expressos na
superfície celular, nos compartimentos intracelulares ou em substâncias secretadas
na corrente sanguínea ou em fluidos teciduais). Dentre as células efetoras do
sistema imune inato, as mais importantes são os neutrófilos e macrófagos, capazes
de fagocitar os patógenos, secretar citocinas e quimiocinas e coordenar mecanismos
adicionais do hospedeiro (Hotchkiss & Karl, 2003; Crouser, 2004).
Apesar de a sepse ser uma das maiores causas de morte em UTI, em muitos
casos as infecções são resolvidas com sucesso, caracterizadas por uma resposta
inflamatória intensa. Em contraste, as infecções fatais são caracterizadas por uma
incapacidade de conter a resposta inflamatória; mediadores inflamatórios são
liberados na circulação, ativando células inflamatórias em locais remotos em uma
condição conhecida como SIRS (Hotchkiss & Karl, 2003; Crouser, 2004).
Atualmente o papel de diversos mediadores na patogênese da sepse tem sido
esclarecido (Reinhart & Karzai, 2001). Estes mediadores podem induzir alterações
profundas na fisiologia normal da vasculatura e órgãos-alvo. Apesar de alguns
mediadores serem mais importantes que outros, é provável que haja uma interação
de mediadores dos micro-organismos e do hospedeiro, e sua ação conjunta seja
responsável pela patogênese da sepse.
Dentre os mediadores envolvidos na gênese da sepse podemos destacar
(Das, 2000; Hotchkiss & Karl, 2003) as citocinas, selectinas, óxido nítrico (NO),
metabólitos do ácido araquidônico, espécies reativas de oxigênio (EROs) e proteínas
do grupo de alta mobilidade I (HMG-I). As citocinas são derivadas principalmente do
sistema monócito-macrófago, sendo as mais importantes as interleucinas (IL),
principalmente IL-1 e o fator de necrose tumoral (TNF). As selectinas são de
receptores de adesão expressos nas células endoteliais e aumentam a migração de
neutrófilos e a reação inflamatória associada. A modulação da expressão de NO
sintase leva a um aumento na produção de NO, que pode estar associado
parcialmente à hipotensão associada a sepse (Szabo, 1998). Os metabólitos do
ácido araquidônico estão envolvidos em vasodilatação, agregação plaquetária e
ativação neutrofílica durante a sepse. As EROs foram recentemente identificadas
como mediadoras de diversas fases de dano celular e ativação de células imunes
durante a sepse (Zhang et al, 2000). Finalmente, as HMG-I, antigamente conhecidas
como anfoterinas, foram recentemente identificadas como possíveis mediadoras
envolvidas na mortalidade induzida pela sepse (Wang et al., 1999).
A interação dos diversos mediadores leva a depressão miocárdica, alteração
da função vascular e dano em órgãos-alvo (principalmente fígado, rim, pulmão e
sistema nervoso central) e em alguns casos a morte por hipotensão refratária ou
falência de múltiplos órgãos (Crouser, 2004).
1.4 Disfunção múltipla de órgãos
A disfunção múltipla de órgãos (DMO) é o final comum a muitos pacientes
com sepse grave e com choque séptico. Os primeiros estudos a respeito dessa
síndrome datam de mais de 30 anos (Tilney et al., 1973). Como conceito, é uma
alteração da função orgânica na evolução da sepse, do choque séptico ou da SIRS,
cuja etiologia acredita-se estar relacionada ao desequilíbrio entre a resposta pró e
antiinflamatória (Bone et al., 1997). Estima-se que mais da metade dos óbitos em
UTI podem ser atribuídos à DMO (Tran et al., 1990). Os principais sistemas
envolvidos são o respiratório, cardiovascular, renal, hepático, gastrintestinal,
hematológico, endócrino e neurológico.
Para definir e quantificar a disfunção de um ou mais órgãos, existe uma
variedade de escores que utilizam marcadores fisiológicos e laboratoriais. Estes
escores podem ser generalizados como o APACHE II (do inglês Acute And Chronic
Health Evaluation) (Knaus et al., 1985) e o SAPS (do inglês Simplified Acquired
Physiological Score) (Le Gall et al., 1996) ou podem ser mais específicos, como o
MODS (do inglês Multiple Organ Dysfunction Score) (Marshall, 1999), SOFA (do
inglês Sepsis-related Organ Failure Assessment) (Vicent et al., 1998) e LODS (do
inglês Logistic Organ Dysfunction System) (Le Gall, et al., 1996), que classificam as
disfunções utilizando escalas ordinais, isto é, graduando cada uma delas. Dessa
forma são capazes de quantificar a gravidade em um ou mais órgãos isolada ou
conjuntamente, embora não possam sugerir se a disfunção é reversível ou não.
Entretanto podem auxiliar no seu seguimento e até mesmo sugerir mudanças no tipo
de tratamento adotado (Marshall, 1999).
1.5 Disfunção mitocondrial na sepse
Os seres vivos precisam de energia para realizar várias funções, como, por
exemplo, o transporte ativo de íons e moléculas, síntese de macromoléculas e
outras biomoléculas a partir de precursores simples. A energia necessária para
realizar essas funções é proveniente da oxidação de substâncias na respiração
celular. O ATP é o principal combustível da célula na maioria dos processos que
precisam de energia. A energia é liberada pela hidrólise de ATP e serve para
impulsionar uma série de reações. O processo de obtenção de energia ocorre
através de uma rede integrada de reações químicas, chamadas de metabolismo
(Nelson & Cox, 2000; Berg et al., 2004).
O metabolismo oxidativo é o resultado do consumo aeróbico de oxigênio
durante a oxidação de substratos para provisão de energia para a célula na forma de
adenosina trifosfato (ATP). Em 1937, Hans Krebs propôs uma série de reações do
metabolismo intermediário de carboidratos, hoje conhecidas como ciclo de Krebs.
Há aproximadamente meio século, Kennedy e Lehninger descobriram que as
mitocôndrias contêm as enzimas do ciclo de Krebs e as enzimas de oxidação dos
ácidos graxos, além dos complexos respiratórios. Alguns anos depois, Palade e
Sjöstrand, através da microscopia eletrônica, mostraram que a mitocôndria
apresenta duas membranas, uma externa e uma interna, muito dobrada. Em 1961,
Peter Mitchell propôs a teoria quimiosmótica, sugerindo que o transporte de elétrons
e a síntese de ATP estão acoplados a um gradiente de prótons na membrana
mitocondrial interna. Mitchell sugeriu que bombas de prótons criariam esse gradiente
de prótons, que seria a força motriz para a síntese de ATP (Berg et al., 2004).
A glicose é a principal fonte de energia utilizada pela maioria das células e
ocupa uma posição central no metabolismo. A glicose é transportada para dentro
das células por proteínas transportadoras específicas. Ao entrar na célula, a glicose
pode ser metabolizada em diferentes rotas metabólicas. A principal via de
degradação da glicose é a glicólise, uma rota que envolve uma seqüência de
reações que ocorre no citosol e forma como produto final o piruvato. Uma molécula
de glicose gera duas moléculas de piruvato e de ATP. Além disso, a glicose pode
participar do ciclo das pentoses, que tem como objetivo formar NADPH, um doador
de elétrons de fundamental importância em biossínteses redutoras, e ribose-5-
fosfato, precursor na biossíntese de nucleotídeos (Nelson & Cox, 2000; Berg et al.,
2004).
Em organismos superiores, o piruvato, formado na glicólise a partir de glicose,
pode seguir duas rotas metabólicas distintas. Quando há baixa quantidade de
oxigênio, como no trabalho muscular forçado ou na hipóxia, o piruvato pode ser
convertido em lactato pela enzima lactato desidrogenase, formando ATP e
consumindo NADH. No entanto, só uma pequena quantidade de energia da glicose
é liberada pela conversão de piruvato a lactato (Nelson & Cox, 2000; Berg et al.,
2004).
Em condições aeróbicas, o piruvato é transportado para dentro da mitocôndria
e sofre ação do complexo enzimático da piruvato desidrogenase, que forma acetil
coenzima A (acetil-CoA), dando início ao ciclo de Krebs. É importante salientar que a
acetil-CoA pode ser formada também pela oxidação de ácidos graxos e aminoácidos
(Nelson & Cox, 2000; Berg et al., 2004).
O ciclo de Krebs ocorre na matriz mitocondrial e consiste de uma seqüência
de reações onde, em cada volta do ciclo, são formadas três moléculas de NADH,
uma de FADH
2
, duas de CO
2
e uma de GTP. O NADH e FADH
2
produzidos no ciclo
de Krebs são carreadores de elétrons e são utilizados na cadeia respiratória para a
produção de ATP na fosforilação oxidativa (Nelson & Cox, 2000).
A cadeia respiratória e a fosforilação oxidativa, assim como o ciclo de Krebs,
ocorrem nas mitocôndrias. A cadeia respiratória é formada por uma série de
complexos protéicos, onde ocorre a transferência de elétrons doados por NADH e
FADH
2
. A transferência de elétrons pela cadeia respiratória leva ao bombeamento
de prótons da matriz para o lado citosólico da membrana mitocondrial interna. O
gradiente de prótons é usado para impulsionar a síntese de ATP (Heales et al.,
1999; Nelson & Cox, 2000).
A cadeia respiratória é composta de quatro complexos (I, II, III e IV) e da
ATPsintase. O complexo I também chamado de NADH: ubiquinona oxirredutase,
realiza a transferência de elétrons do NADH para a ubiquinona, formando ubiquinol.
Essa reação faz com que dois prótons sejam bombeados para o espaço
intermembrana. O complexo II também denominado de succinato: ubiquinona
oxirredutase, é formado pela enzima succinato desidrogenase (SDH) e três
subunidades hidrofóbicas. Esse complexo participa do ciclo de Krebs e transfere
elétrons do succinato para a ubiquinona e também forma ubiquinol. O complexo III,
ou citocromo c oxirredutase, transfere elétrons do ubiquinol para o citocromo c,
reação que serve para o bombeamento de mais quatro prótons. O complexo IV mais
conhecido como citocromo c oxidase, transfere elétrons do citocromo c para o
oxigênio e forma água. Nessa etapa os últimos dois prótons são bombeados (Berg
et al., 2004).
O gradiente eletroquímico formado pelo bombeamento de prótons durante a
cadeia respiratória mitocondrial é utilizado como força motriz para a ATP sintase
formar ATP, processo chamado de fosforilação oxidativa (Heales et al., 1999; Nelson
& Cox, 2000; Berg et al., 2004).
Sabe-se que deficiências no funcionamento normal da cadeia respiratória
mitocondrial levam a uma rápida queda na obtenção de energia, aumento da
produção de EROs e lesão e morte celular (Ankarcrona et al., 1995). Nesse sentido,
as EROs têm sido implicadas como importantes mediadores patológicos de muitas
doenças. Do ponto de vista químico, chama-se radical livre toda substância que
contenha um elétron não pareado na sua última camada, proporcionando a molécula
uma grande reatividade e possibilidade de produzir lesão. Os radicais livres de
oxigênio mais importantes são o radical superóxido, o peróxido de hidrogênio e o
radical hidroxila. Os efeitos dos radicais livres de oxigênio são decorrentes da
peroxidação lipídica produzindo uma reação em cadeia, que altera a estrutura das
membranas celulares e suas funções estabilizadoras, existe também a possibilidade
de interação com outras macromoléculas, como proteínas e DNA (Akamine et al.,
1994).
Na sepse, o metabolismo de oxigênio está comprometido; desta forma, a
reperfusão ou a reoxigenação causam aumento da produção de radicais livres e
estes estão associados ao dano tecidual. A sepse está associada com um
desequilíbrio adquirido entre a formação e a liberação EROs nas células dos órgãos
vitais, uma condição conhecida como estresse oxidativo (Salles et al., 1999; Singer
& Brealey, 1999; Crouser, 2004). Além disso, sabe-se que as defesas antioxidantes
estão diminuídas nesta patologia, pois o excesso de EROs leva à depleção de
glutationa reduzida (Brealey et al., 2002; Crouser, 2004). A maioria dos casos fatais
de sepse ocorre com a DMO, que muitas vezes está associada com metabolismo
anaeróbico acelerado, mesmo com suprimento adequado de oxigênio. A hipóxia
tecidual tem sido considerada como importante mecanismo responsável pela DMO
(Singer & Brealey, 1999; Crouser, 2004).
No entanto, mesmo com disponibilidade de oxigênio normal, evidências da
literatura indicam a disfunção mitocondrial como um dos principais mecanismos
fisiopatológicos da disfunção celular e orgânica. Nesse sentido, sugere-se que a
disfunção mitocondrial pode ocorrer por mecanismos distintos. Uma possível causa
de disfunção mitocondrial seria a abertura de um poro inespecífico na membrana
mitocondrial, chamado de poro de transição da permeabilidade mitocondrial. Sob
certas condições, como em períodos de isquemia e reperfusão ou exposição celular
a toxinas, os poros abrem e causam dissipação do gradiente protônico mitocondrial,
impedindo a síntese de ATP. Outra causa potencial de hipóxia citopática é a
ativação da enzima poli (ADP-ribose) polimerase (PARP). Essa enzima é ativada por
fragmentos de DNA nuclear, os quais podem ser induzidos por vários oxidantes,
como peroxinitrito e peróxido de hidrogênio. Além disso, o substrato natural para
PARP é o NAD
+
. A principal conseqüência da ativação da PARP é a diminuição de
NAD, levando a uma “crise energética” celular. Finalmente, sabe-se também que a
lesão celular secundária à isquemia pode levar à disfunção mitocondrial, mesmo
após a reoxigenação do tecido. Este fenômeno está presente desde a instalação do
quadro séptico e se repete a cada instabilidade hemodinâmica e seu posterior
tratamento (Singer & Brealey, 1999; Fink & Evans, 2002; Silva et al., 2003; Crouser,
2004).
1.6 Antioxidantes no tratamento da sepse
Apesar da importância da sepse na mortalidade global em UTIs, os
tratamentos atualmente empregados são meramente de suporte. O melhor
entendimento da fisiopatologia da sepse através de trabalhos experimentais pode
fornecer dados preliminares e novos protocolos experimentais de tratamento para
serem posteriormente validados em ensaios clínicos e empregados na prática
médica (Fink & Heard, 1990).
Tratamentos que reduzem a geração ou previnem efeitos das EROs exercem
efeitos benéficos em uma variedade de protocolos testados em modelos animais de
sepse (Powell et al., 1991., Peristeris et al., 1992; Redl et al., 1993; Villa & Ghezzi,
1995; Sprong et al., 1998; Fujimura et al., 2000; Kong et al., 2000; Vulcano et al.,
2000; Salvemini & Cuzzocrea, 2003; Thiemermann, 2003). As intervenções
terapêuticas antioxidantes incluem N-acetilcisteína (NAC) (Peristeris et al, 1992; Villa
& Ghezzi, 1995; Sprong et al, 1998; Kozlov et al., 2003) e deferoxamina (DFX)
(Vulcano et al., 2000).
A NAC tem sido utilizada largamente como antioxidante “in vivo” e “in vitro”
(Cetinkaya et al., 2005). Ela também é eficiente no tratamento de algumas situações
de overdose de alguns fármacos, como paracetamol (Prescott et al., 1979), e como
mucolitico (De Flora et al., 2001). Por ser um “scavenger” de peróxido de hidrogênio,
ácido hipoclórico e radical hidroxil, inibe a liberação de TNF, a ativação de citocinas
pró-inflamatórias e apoptose celular. A NAC é doadora de grupos tióis que atua
como um precursor da cisteína intracelular, aumentando a produção de glutationa
(GSH) (Pinho et al., 2005), quando a demanda de GSH está aumentada, como
durante excessivo estresse oxidativo ou durante certos processos patológicos
(Cetinkaya et al., 2005). A maioria dos efeitos benéficos da NAC é sugerida como
sendo um resultado de sua habilidade tanto de reduzir cistina extracelular em
cisteína ou ser uma fonte de grupos tióis. Como fonte de grupos tióis, a NAC
estimula a síntese de glutationa, aumenta a atividade da glutationa-S-transferase, e
atua nos radicais oxidantes reativos (De Vries & De Flora, 1993).
A DFX é empregada rotineiramente para o tratamento de várias doenças
hematológicas, com um bom perfil de segurança. É um potente quelante de ferro e
tem sido estudado em eventos cardiovasculares (Hurn et al., 1995) e na sepse
(Ritter et al., 2004). Existem evidências que a DFX, quando associada à NAC,
diminui o dano oxidativo e a mortalidade quando administrada após a indução da
sepse (Ritter et al., 2004). A DFX pode prevenir ou reverter os efeitos da produção
de radicais livres por impedir a geração de radical hidroxila através da reação de
Fenton (Vulcano et al.,2000).
Muitos estudos têm demonstrado a função antioxidante da NAC,
principalmente no tratamento de doenças inflamatórias, por inibir o estresse
oxidativo e a quimiotaxia de neutrófilos e monócitos, entre outros efeitos. No entanto,
também foi demonstrado que a administração isolada de NAC pode produzir efeitos
pró-oxidantes, e que a combinação de NAC com DFX parece ser um tratamento
mais efetivo para muitas doenças inflamatórias (Ritter et al., 2003; Ritter et al., 2004;
Pinho et al., 2005; Ritter et al., 2006).
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar os efeitos de NAC e DFX sobre parâmetros de estresse oxidativo e
metabolismo energético no fígado de ratos submetidos ao modelo animal de sepse
por ligação cecal e perfuração (CLP).
2.2 Objetivos específicos
Avaliar os seguintes parâmetros em fígado de ratos submetidos ao modelo
animal de sepse por CLP, tratados ou não com NAC e DFX:
- atividade sérica da enzima aspartato aminotransferase (AST), indicadora
de lesão hepatocelular;
- produção de anion superóxido;
- medida dos níveis de substâncias reativas ao acido tiobarbitúrico
(TBARS), indicador de lipoperoxidação;
- medida de carbonilação de proteínas, indicador de oxidação de proteínas;
- liberação do citocromo C pela mitocôndria;
- “swelling” mitocondrial, através da medida de transição de permeabilidade
mitocondrial;
- atividade dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial.
3 METODOS E RESULTADOS
Conforme resolução 01/2007 do PPGCS, apresentados na forma de artigo cientifico
submetido para publicação na revista Mitochondrion.
Antioxidant treatment reverses mitochondrial dysfunction in a sepsis animal
model
Paula H. Zapelini
1
, Cristiane Ritter
1
, Gislaine T. Rezin
1
, Mariane R. Cardoso
1
, Fábio
Klamt
2
, José C. F. Moreira
2
, Emilio L. Streck
1
, Felipe Dal-Pizzol
1
*
Antioxidant treatment reverses mitochondrial dysfunction
in a sepsis animal model
Paula H. Zapelini
1
, Cristiane Ritter
1
, Gislaine T. Rezin
1
, Mariane R. Cardoso
1
,
Fábio Klamt
2
, José C. F. Moreira
2
, Emilio L. Streck
1
, Felipe Dal-Pizzol
1
*
1
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-graduação em
Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, Criciúma, SC, Brazil.
2
Centro de Estudos em Estresse Oxidativo, Departamento de Bioquímica,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil.
*Corresponding author E-mail: [email protected]r
ABSTRACT
Evidence from the literature have demonstrated that reactive oxygen species (ROS)
play an important role in the development of multiple organ failure and septic shock.
Antioxidant therapeutic interventions include N-acetylcysteine (NAC) and
deferoxamine (DFX). Mitochondrial dysfunction has been implicated in the
pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome (MODS) and a wide variety of
disease states. The hypothesis of cytopathic hypoxia postulates that impairment in
mitochondrial oxidative phosphorylation reduces aerobic adenosine triphosphate
(ATP) production and potentially induces MODS. In this work, our aim was to
evaluate the effects of NAC plus DFX on oxidative damage and energy metabolism
parameters in liver of rats submitted to a cecal ligation puncture (CLP) model of
sepsis. We speculate that CLP induces a sequence of events that culminate with
liver cells death by apoptosis in the first 24 hours and by necrosis after that period.
We propose that the inhibition of complex IV is responsible for oxidative stress,
leading to mitochondrial dysfunction and swelling. Consequently, release of
cytochrome c from mitochondria occurs and apoptosis is activated. These events
occur in early sepsis development, as reported in the present work. Liver cells
necrosis only occurs from 24 hours after CLP, but all other events occur earlier (6-12
hours). Moreover, we showed that antioxidants may prevent oxidative damage and
mitochondrial dysfunction in liver of rats after CLP. In another set of experiments, we
verified that L-NAME administration did not reverse increase of superoxide anion
production, TBARS formation, protein carbonylation, mitochondrial swelling,
increased serum AST or inhibition on complex IV activity caused by CLP.
Considering that this drug inhibits nitric oxide synthase and that any parameter was
reversed by its administration, we suggest that all the events reported in this study
are not mediated by nitric oxide. In conclusion, although it is difficult to extrapolate
our findings to human sepsis, it is tempting to speculate that antioxidants may be
used in the future in the treatment of this disease.
Keywords: sepsis, mitochondria, oxidative stress, swelling, respiratory chain, N-
acetylcysteine, deferoxamine.
INTRODUCTION
Sepsis is a complex syndrome characterized by an imbalance between pro-
inflammatory and anti-inflammatory response to pathogen (Hotchkiss and Karl, 2003;
Vandijck et al., 2006), being a frequent cause of morbidity and mortality in intensive
care units (Sands et al., 1997). The systemic inflammatory response seems to be
initiated by the release of bacterial lipopolysaccharide (LPS) or other microbial
substances into the lymphatic and circulatory system. When the sepsis cascade is
triggered, an unregulated systemic response that can progress to multiple organ
failure occurs. Multiple organ failure induced by sepsis is associated with a high
mortality rate in humans and is characterized clinically by significant liver, pulmonary,
cardiovascular, renal and gastrointestinal dysfunction (Bone et al., 1997; Wheeler
and Bernard, 1999). Sepsis-like states may be initiated by a number of inflammatory
events, but the pathogenesis of the resultant cellular and end-organ injury is still not
well understood.
Evidence from the literature have demonstrated that reactive oxygen species
(ROS) play an important role in the development of multiple organ failure and septic
shock (Basu and Eriksson, 1998; Zhang et al., 2000; Kozlov et al., 2003; Ritter et al.,
2003). Treatments that reduce the generation or prevent or reverse the effects of
ROS exert beneficial effects in a variety of models of endotoxic and septic shock
(Powell et al, 1991; Peristeris et al., 1992; Redl et al., 1993; Villa and Ghezzi, 1995;
Sprong et al., 1998; Fujimura et al, 2000; Kong et al, 2000; Vulcano et al., 2000;
Salvemini and Cuzzocrea, 2003; Thiemermann, 2003). The antioxidant therapeutic
interventions include N-acetylcysteine (NAC) (Peristeris et al, 1992; Villa and Ghezzi,
1995; Sprong et al, 1998; Kozlov et al., 2003) and deferoxamine (DFX) (Vulcano et
al., 2000). However, the isolated use of NAC could have some limitations due to its
pro-oxidant effects, probably by its interaction with iron (Sprong et al., 1998). The
combination of drugs is more efficient than the use of either alone, probably because
of the decrease of NAC oxidation and Fenton chemistry by DFX. In this context, we
have recently demonstrated that the combination of NAC and DFX is an effective
treatment of severe sepsis in a rodent animal model (Ritter et al., 2004).
It is well described that mitochondrial dysfunction has been implicated in the
pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome (MODS) and a wide variety of
disease states (Brealey and Singer, 2003; Hotchkiss and Karl, 2003; Streck et al.,
2003; Wallace, 2005). The hypothesis of cytopathic hypoxia postulates that
impairment in mitochondrial oxidative phosphorylation reduces aerobic adenosine
triphosphate (ATP) production and potentially induces MODS (Fink, 2002). In this
context, some works report deficiencies within the electron transport chain in sepsis
(Forget et al, 2000; Fink, 2002; Chen et al., 2003; Singer and Brealey 1999). Crouser
et al described defects in the inner and outer mitochondrial membranes in liver
(Crouser et al., 2004) and intestine (Crouser et al., 1999) of rats during acute
endotoxemia induced by LPS. However the mechanisms associated to mitochondrial
dysfunction during sepsis development are not fully understood.
The present work aimed to evaluate the effects of NAC plus DFX in liver of
rats submitted to a model of sepsis by measuring thiobarbituric acid reactive
substances (TBARS), superoxide anion production and protein carbonyls in
submitochondrial particles (SMP), cytochrome c release from mitochondria,
mitochondrial permeability transition (MPT), mitochondrial swelling and mitochondrial
respiratory chain complexes activities.
MATERIAL AND METHODS
Animals: Adult and male Wistar rats were obtained from Central Animal House of
Universidade do Extremo Sul Catarinense. They were caged in group of five with free
access to food and water and were maintained on a 12-hours light-dark cycle (lights
on 7:00 am), at a room temperature of 22°C ± 1°C. All experimental procedures were
carried out in accordance with the National Institutes of Health Guide for Care and
Use of Laboratory Animals, with the approval of Ethics Committee from Universidade
do Extremo Sul Catarinense.
Cecal ligation puncture (CLP) model: Male Wistar rats 2-3 months old, subjected
to CLP as previously described (Wichterman et al., 1980; Hollenberg et al., 2001;
Ritter et al., 2004), were used in this study. Rats were anesthetized with a mixture of
ketamine (80 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg), given intraperitoneally. Under aseptic
conditions, a 3-cm midline laparotomy was performed to allow exposure of the cecum
with adjoining intestine. The cecum was tightly ligated with a 3.0 silk suture at its
base, below the ileocecal valve, and was perforated once with a 14-gauge needle.
The cecum was then gently squeezed to extrude a small amount of feces from the
perforation site. The cecum was then returned to the peritoneal cavity and the
laparotomy was closed with 4.0 silk sutures. All animals were returned to their cages
with free access to food and water. Septic rats in this model become bacteremic with
Gram-negative enteric organisms (Hollenberg et al., 2001; Ritter et al., 2003).
Experimental protocols: The animals were randomly divided into four groups: group
1, sham-operated; group 2, isotonic saline solution (50 mL/kg s.c.) immediately after
and 12 hours after CLP; group 3, same as group 2 with basic support (ceftriaxone 30
mg/kg and clindamycin 25 mg/kg every 6 hours); group 4, same as group 3 plus NAC
(20 mg/kg) 3, 6 and 12 hours after CLP and DFX (20 mg/kg) 3 hours after CLP with a
subcutaneous injection. The rats were killed by decapitation 1, 3, 6, 12, 24 and 48
hours after CLP; blood was collected (for serum aspartate aminotransferase (AST)
determination) and the liver obtained. The samples from the liver were assayed for
thiobarbituric acid reactive species (TBARS) levels, superoxide anion production and
protein carbonyls in submitochondrial particles (SMP). Cytochrome c release,
mitochondrial permeability transition (MPT) and the activities of respiratory chain
enzymes in liver homogenates were also measured, as detailed subsequently. In
another set of experiments, L-NAME (100mg/kg) was administered subcutaneously 3
hours after CLP and the rats were killed by decapitation 6, 12 and 24 hours after
induction of sepsis. After that, the same parameters were measured.
Aspartate aminotransferase (AST) activity: The activity of AST was determined in
serum of rats by commercially available kits (Labtest, Brazil), as an index of necrosis
of liver cells.
Isolation of mitochondria: The liver of rats were homogenized (1:10, w/v) in ice-
cold isolation buffer A (220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 5 mM HEPES, 1 mM
EGTA, 0.5 mg/mL fatty-acid free bovine serum albumin, pH 7.4) and centrifuged at
2,000 x g for 10 min at 4°C. Approximately three quarter of the supernatant was
further centrifuged at 10,000 x g for 10 min at 4°C in a new tube. The fluffy layer of
the pellet was removed by gently shaking with buffer A and the firmly packet
sediment was resuspended in the same buffer without EGTA and centrifuged at
10,000 x g for 10 min at 4°C. Mitochondria pellet was resuspended in buffer B (210
mM mannitol, 70 mM sucrose, 10 mM HEPES-KOH, 4.2 mM succinate, 0.5 mM
KH
2
PO
4
, 4 µg/mL rotenone, pH 7.4). This procedure yielded about 20 mg of
mitochondrial protein/g of liver. Mitochondria protein was determined by the Lowry et
al. (1951) method using bovine serum albumin as standard.
Mitochondrial lipoperoxidation and superoxide anion production: Lipid
peroxidation was measured by the formation of TBARS during an acid-heating
reaction, as previously described (Draper and Hadley, 1990). Briefly, the samples
were mixed with 1 mL of trichloroacetic acid 10% (TCA) and 1 mL of thiobarbituric
acid 0.67% (TBA), then heated in a boiling water bath for 15 min. Butanol (2:1 v/v)
was added and after centrifugation at 800 x g for 5 min, TBARS were determined by
the absorbance at 535 nm. Results are expressed as MDA (malondialdehyde)
equivalents (nmol/mg protein). Superoxide anion production was determined in
washed SMP using a spectrophotometric assay based on superoxide-dependent
oxidation of epinephrine to adrenochrome at 37°C (Arnaiz et al., 1999).
Measurement of protein carbonyls: The oxidative damage to proteins was
assessed by the determination of carbonyl groups based on the reaction with
dinitrophenylhydrazine, as previously described (Levine et al., 1990). Briefly, proteins
were precipitated by the addition of TCA 20% and redissolved in
dinitrophenylhydrazine and the absorbance read at 370 nm.
Cytochrome c release: Cytochrome c release from rat liver mitochondria was
assayed according to Borutaite et al. (1999). Mitochondria (1 mg/mL) were
centrifuged at 10,000 x g for 10 min. Supernatants were used for spectrophotometric
measurement of cytochrome c released from mitochondria by using the absorption
difference of the wavelengths pair 550/540 nm for ascorbate-reduced minus
ferricyanide-oxidized cytochrome c (Rigobello et al., 1999).
Mitochondrial permeability transition: The permeability transition pore (PTP)
opening was assayed essentially as described by Petronilli et al. (1993). Opening of
the PTP causes mitochondrial swelling that is conveniently assayed as a decrease in
the light scattering (and thus absorbance) of a mitochondria suspension.
Mitochondria (0.25 mg protein/mL) were suspended in cuvettes in buffer B
(previously described). After 2-min equilibration period, mitochondrial swelling was
followed spectrophotometrically by the decrease in absorbance at 540 nm at 25°C for
10 min. Mitochondrial swelling was triggered by the addition (at the arrow) of 10 µM
Ca
+2
. In some experiments, 6 µM cyclosporine (CsA) was also added to ascertain
that permeability transition was involved in mitochondrial swelling.
Activities of mitochondrial respiratory chain enzymes activities: Liver was
homogenized (1:10, w/v) in SETH buffer (250 mM sucrose, 2 mM EDTA, 10 mM
Trizma base, 50 IU/ml heparin, pH 7.4). The homogenates were centrifuged at 800 x
g for 10 min and the supernatants were used for determination of mitochondrial
respiratory chain enzyme activities (complexes I, II, II–III and IV). In the day of the
assays, the samples were freezed and thawed in hypotonic assay buffer three times
to fully expose the enzymes to substrates and achieve maximal activities. NADH
dehydrogenase (complex I) was evaluated according to the method described by
Cassina and Radi (1996) by the rate of NADH-dependent ferricyanide reduction at
420 nm. The activities of succinate: DCIP oxidoreductase (complex II) and succinate:
cytochrome c oxidoreductase (complex II–III) were determined according to the
method of Fischer et al. (1985). Complex II activity was measured by following the
decrease in absorbance due to the reduction of 2,6-DCIP) at 600 nm. Complex II-III
activity was measured by cytochrome c reduction from succinate. The activity of
cytochrome c oxidase (complex IV) was assayed according to the method described
by Rustin et al. (1994), measured by following the decrease in absorbance due to the
oxidation of previously reduced cytochrome c at 550 nm. The activities of the
mitochondrial respiratory chain complexes were expressed as nmol/min mg protein.
Statistical analysis: Data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA)
followed by the Tukey test when F was significant and are expressed as mean ±
standard deviation. All analyses were performed using the Statistical Package for the
Social Science (version 12.0) software.
RESULTS
We first verified (Figure 1) that serum AST was not altered at 1, 3, 6 and 12
hours after CLP in all groups, indicating that liver cells necrosis did not occur in this
period. AST was increased 24 and 48 hours after CLP in groups 2 and 3 (CLP and
CLP plus basic support). In group 4 (CLP plus basic support and antioxidants),
serum AST increased only 48 hours after CLP.
We also evaluated TBARS (Figure 2), protein carbonyls (Figure 3), and
superoxide production (Figure 4) in SMP of liver cells after CLP. First, we found that
TBARS were increased from 6 to 48 hours after CLP in groups 2 and 3, when
compared to group 1 (sham-operated). In addition, protein carbonyls presented the
same profile of TBARS, increasing in groups 2 and 3 from 6 hours after CLP.
Moreover, protein carbonyls were also increased in group 4 (CLP plus basic support
and antioxidants) from 12 to 48 hours after CLP. Superoxide production was also
altered in the same groups, but this was an earlier alteration, increasing from 3 hours
after CLP.
Figure 5 shows that cytochrome c release from mitochondria increased from 6
to 48 hours after CLP in groups 2 and 3. Moreover, basic support and antioxidants
treatment prevented such effect (group 4). In Figure 6, mitochondrial swelling was
triggered by the addition (at the arrow) of 10 µM Ca
+2
. The results show that groups 2
and 3 presented enhanced mitochondrial swelling from 6 hours after CLP. The group
treated with basic support and antioxidants presented the same mitochondrial
swelling profile than sham-operated (control). Mitochondrial swelling in all groups
was inhibited by CsA, suggesting the participation of permeability transition (data not
shown). Finally, we verified that mitochondrial respiratory chain complexes were not
affected by CLP with exception of complex IV. This enzyme was inhibited from 3 to
48 hours after CLP in groups 2, 3 and 4 (Figure 7).
In a second set of experiments, we aimed to test the effect of L-NAME (100
mg/kg) administration on superoxide anion production, mitochondrial swelling,
oxidative stress parameters, serum AST and complex IV activity. L-NAME was
administered subcutaneously 3 hours after CLP and the rats were killed by
decapitation 6, 12 and 24 hours after induction of sepsis. As previously described,
blood was collected and the liver obtained. We verified that L-NAME administration,
differently from antioxidant administration, did not reverse increase of superoxide
anion production, TBARS formation and protein carbonylation caused by CLP (data
not shown). Moreover, mitochondrial swelling, increased serum AST or inhibition on
complex IV activity were not reversed by L-NAME (data not shown).
DISCUSSION
In this work, we showed that clinical relevant necrosis of liver cells occurred
from 24 hours after sepsis induced by CLP. Several mitochondrial alterations occur
before evident liver necrosis, and the attenuation of these could ameliorate liver
necrosis. We demonstrated here that superoxide mitochondrial production and
complex IV activity seemed to be the earliest alterations in liver mitochondria after
sepsis. Differently from previous investigations, our experimental design using fluid
resuscitation and antibiotics administration more closely mimics the clinical setting,
avoiding hypotension, and controlling the infectious focus. In addition, antioxidants
and L-NAME were administered 3 hours after CLP, when animals presented signs of
active infection, thus we are able to determine which intervention is more effective in
a model that mimics the clinical picture.
Tissues with high-energy demands, such as the liver, contain a large number
of mitochondria, being more susceptible to reduction of aerobic energy metabolism.
Crouser et al (2004) demonstrated that the efficiency of mitochondrial oxidative
phosphorylation is compromised during sepsis in part secondary to mitochondrial
membrane damage and impaired cytochrome complex function. Consequently,
electrons that would normally flow through the electron transport chain are diverted to
the Q-cycle, generating superoxide. In this context, we have demonstrated that CLP-
mediated oxidation of lipids and proteins occured in mitochondria of liver cells, and
superoxide is probably involved in this process. We supposed that the early increase
in superoxide production could induce lipid and protein oxidative damage that was
participate in the late increase in plasma AST. Differently from previous studies
(Boczkowski et al., 1999) NOS blockade did not prevent these alterations. Thus it
seems that NO could be important in our model before 3 hours after CLP, and after
this the production of ROS perpetuate and propagate mitochondrial injury, leading to
mitochondrial swelling and diminution of cytochrome C in the mitochondria.
Diaphragm and heart mitochondrial superoxide and hydrogen peroxide production
were 2- to 3-fold increased during endotoxemia and superoxide dismutase activity
showed a 2-fold increase, whereas catalase activity was unchanged, (Alvarez and
Boveris 2004), as we also demonstrated previously (Andrades et al 2005), thus it is
rational to suppose that the use of NAC and DFX could prevent mitochondrial
oxidative damage and liver necrosis. In addition, Crouser et al (2000) demonstrated
that mitochondrial injury after LPS was, in part, independent of NO, reinforcing the
role of ROS.
The mechanism of complex IV inhibition induced by sepsis is not completely
elucidated, but some points must be raised. In a recent work, Levy and Deustchman
(2007) propose some possible mechanisms, such as failed transcription and
translation of key subunits of the enzyme or reduced substrate concentration. We
believe that complex IV inhibition was unrelated to oxidative damage, or, more
probably, was irreversible, once antioxidants attenuates all other analyzed
parameters. Since liver cell necrosis was substantially diminished after antioxidant
treatment we believe that complex IV inhibition was of minor importance in
determining liver necrosis.
ACKNOWLEDGEMENTS
This research was supported by grants from Universidade do Extremo Sul
Catarinense (UNESC) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq).
REFERENCES
Alvarez, S., Boveris, A., 2004. Mitochondrial nitric oxide metabolism in rat muscle
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Figure 1. Aspartate aminotransferase activity in serum of rats after CLP. Results are
expressed as mean ± S.D. for five independent experiments. For more details, see
Material and Methods.
Figure 2. Thiobarbituric acid-reactive substances in liver of rats after CLP. Results
are expressed as mean ± S.D. for five independent experiments. For more details,
see Material and Methods.
Figure 3. Mitochondrial protein carbonyl in liver of rats after CLP. Results are
expressed as mean ± S.D. for five independent experiments. For more details, see
Material and Methods.
Figure 4. Mitochondrial superoxide anion in liver of rats after CLP. Results are
expressed as mean ± S.D. for five independent experiments. For more details, see
Material and Methods.
Figure 5. Mitochondrial cytochrome c content after CLP. Results are expressed as
mean ± S.D. for five independent experiments. For more details, see Material and
Methods.
Figure 6. Mitochondrial permeability transition 3, 6, 12 and 24 hours after CLP.
Results are representative of five independent experiments. For more details, see
Material and Methods.
Figure 7. Mitochondrial respiratory chain enzymes activities 3, 6, 12 and 24 hours
after CLP. Results are expressed as mean ± S.D. for five independent experiments.
For more details, see Material and Methods.
4 DISCUSSÃO
Neste trabalho foi demonstrado que a necrose de células do fígado ocorreu a
partir de 24 horas após a sepse induzida por CLP. Verificou-se que várias alterações
ocorreram antes da necrose de células hepáticas, e que a atenuação dessas
alterações previne parcialmente a necrose (medida pela liberação de AST). Foi
demonstrado que a produção de superóxido mitocondrial e a inibição do complexo
IV parecem ser as primeiras alterações nas mitocôndrias hepáticas após a sepse.
Diferente de outros estudos, o presente desenho experimental, usando reposição
volêmica e administração de antibióticos, é mais parecido com a condição clínica
humana, pois previne a hipotensão e controla o foco infeccioso.
Tecidos com alta demanda energética, como o fígado, contém um número
expressivo de mitocôndrias, tornando-se mais suscetível a alterações que ocorrem
no metabolismo energético. Crouser et al (2004) demonstraram que a eficiência da
fosforilação oxidativa está comprometida na sepse por causa de dano na membrana
mitocondrial e diminuição da atividade da cadeia respiratória mitocondrial. Devido a
este fato, elétrons que deveriam fluir normalmente na cadeia de transporte de
elétrons, são desviados para o ciclo Q, gerando superóxido.
Também foi demonstrado que na sepse induzida por CLP ocorreu oxidação
de lipídios e proteínas, provavelmente por envolvimento de superóxido. Nesse
contexto, sugere-se que o aumento precoce na produção de superóxido pode causar
dano em lipídios em proteínas, que resultou em aumento posterior de AST no
sangue, devido à necrose de hepatócitos. Diferentemente de estudos anteriores
(Boczkowski et al., 1999), a inbição da óxido nítrico sintase não preveniu essas
alterações. Dessa forma, parece que o óxido nítrico pode ser importante nas três
primeiras horas após a CLP, e depois disso a produção de EROs aumenta e causa
dano mitocondrial, levando a “swelling” mitocondrial e liberação de citocromo c por
essa organela.
Considerando que estudos mostram aumento de superóxido e peróxido de
hidrogênio em mitocôndrias de diafragma e coração durante endotoxemia (Alvarez &
Boveris, 2004), é importante verificar se a NAC e DFX conseguem prevenir o dano
oxidativo mitocondrial e a necrose de hepatócitos. Além disso, Crouser et al (2000)
demonstraram que o dano mitocondrial na endotoxemia é parcialmente
independente de óxido nítrico, reforçando a hipótese da importância dos radicais
livres no processo de disfunção mitocondrial na sepse.
O mecanismo de inibição do complexo IV da cadeia respiratória na sepse
ainda não está completamente compreendido, mas alguns pontos devem ser
discutidos. Em um estudo recente, Levy e Deustchman (2007) propõem que a
inibição do complexo IV pode ocorrer por falha de transcrição ou redução na
concentração do substrato. Os resultados do presente trabalho sugerem que a
inibição do complexo IV não tem relação direta com o dano oxidativo. Da mesma
forma, parece que a inbição dessa enzima é irreversível, já que os antioxidantes
reduziram todas as outras alterações, menos essa. Como a necrose de hepatócitos
foi reduzida pelo tratamento com antioxidantes, acredita-se que a inibição do
complexo IV não desempenha um papel fundamental na determinação da necrose.
Sabe-se que EROs são mediadores importantes de dano celular, contribuindo
para o desenvolvimento da sepse. As propriedades pró-inflamatórias das EROs
incluem dano endotelial, formação de fatores quimiostáticos, recrutamento de
neutrófilos, peroxidação de lipídios, dano em DNA, liberação de citocinas e formação
de peroxinitrito (
Zimmermann, 1995). Nesse sentido, o uso de antioxidantes na
sepse ainda é controverso. Alguns trabalhos mostram que o tratamento com
antioxidantes na sepse foi efetivo na redução de danos causados pela doença, pois
aumentaram a sobrevivência após sua administração (Kunimoto et al., 1987; Powell
et al., 1991; Vulcano et al., 2000).
O presente estudo demonstrou que a CLP induz uma seqüência de eventos
que levam a morte de células do fígado; apoptose ocorre dentro de 24hs após este
período surge necrose (avaliada pelo aumento de AST sanguineo).
Conseqüentemente, ocorre a liberação do citocromo C da mitocôndria e
apoptose é induzida. A necrose das células do fígado ocorre somente 24 horas após
CLP, enquanto os outros eventos ocorrem mais cedo (6-12hs). Nossos achados
estão de acordo com um estudo feito por Messaris et al (2004), que demonstrou
apoptose precoce em cérebro de ratos (6-12hs), no desenvolvimento da sepse.
Acredita-se que a causa primaria de morte de células do fígado acontece pela
inibição do complexo IV, visto que o tratamento com antioxidantes preveniu todos os
parâmetros estudados com exceção do complexo IV. O dano oxidativo induzido pela
sepse pode ser prevenido por intervenções terapêuticas a base de antioxidantes em
modelo animal de CLP.
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