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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ASSOCIAÇÃO DA 3-O-METILQUERCETINA COM
β
ββ
β
-CICLODEXTRINA:
AVALIAÇÃO DA COMPLEXAÇÃO E PENETRAÇÃO CUTÂNEA
Dissertação de Mestrado
Liege Cassia Schwingel
Porto Alegre, 2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ASSOCIAÇÃO DA 3-O-METILQUERCETINA COM
β
ββ
β
-CICLODEXTRINA:
AVALIAÇÃO DA COMPLEXAÇÃO E PENETRAÇÃO CUTÂNEA
Dissertação apresentada por Liege
Cassia Schwingel para obtenção do
GRAU DE MESTRE em Ciências
Farmacêuticas
Orientador: Profª. Dr. Valquiria Linck Bassani
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, em nível de Mestrado da Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul e aprovada em 31.08.2007 pela Banca Examinadora
constituída por:
Profª. Dr. Elenara Lemos Senna
Universidade Federal de Santa Catarina
Prof. Dr. José Ângelo Zuanazzi
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Profª. Dr. Letícia Scherer Koester
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
FICHA CATALOGRÁFICA
Schwingel, Liege C.
Associação da 3-O-metilquercetina com
β
-ciclodextrina: avaliação da
complexação e penetração cutânea – Porto Alegre: UFRGS, 2007. –85p.:
il., graf., tab.
Dissertação (mestrado). UFRGS. Faculdade de Farmácia. Programa
de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
1. Tecnologia farmacêutica. 2. 3-O-metilquercetina. 3.
β
-ciclodextrina.
4. Hidroxipropilmetilcelulose. 5. Penetração cutânea I. Bassani, Valquiria
Linck. II. Título.
CDU: 615.4
Bibliotecária Responsável:
Margarida Maria C. F. Ferreira, CRB 10/480
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Desenvolvimento Galênico,
empregando, também, equipamentos da Central Analítica da Faculdade de
Farmácia, da Central Analítica do Instituto de Química da UFRGS e do Instituto de
Ciências Exatas da UFMG. Agradecimentos ao CNPq, órgão que financiou parte do
desenvolvimento do presente trabalho.
"A mente que se abre a uma nova idéia
jamais volta ao seu tamanho original."
Albert Einstein
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profª. Dr. Valquiria Linck Bassani, pelos ensinamentos,
confiança, apoio, responsabilidade, dedicação e constante incentivo dispensado na
realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Helder Teixeira, pela disponibilidade e constantes contribuições
durante a realização do trabalho.
Ao Prof. Dr. Rubén Sinisterra e à Dr. Ivana Lula, do Departamento de Química
da Universidade Federal de Minas Gerais pela realização dos espectros de RMN.
A todos os colegas do Laboratório de Desenvolvimento Galênico pela
assistência, amizade e apoio prestados.
Aos amigos Daniel, Camila, Roberta e Maribete, pelo companheirismo, pelos
momentos de descontração e risadas, e por compartilharem idéias e conhecimentos.
Aos colegas do laboratório de Fitoquímica pela amizade, assistência e
conhecimentos compartilhados.
A todos os professores e colegas deste programa de Pós-Graduação, pelo
convívio, auxílio e por compartilhar científico e pessoal.
Ao Marcelo, pelo companheirismo, amizade, apoio e incentivo.
Ao meu irmão Roger, pela amizade, incentivo e cumplicidade.
E principalmente aos meus pais, Geraldo e Licelote, pelo exemplo de ética e
humanismo, incentivo e apoio incondicional.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................
2 OBJETIVOS .......................................................................................................
2.1 Objetivo geral ..................................................................................................
2.2 Objetivos específicos ......................................................................................
3 REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................
3.1 Herpes Simples ..............................................................................................
3.2 3-O-metilquercetina .........................................................................................
3.3 Pele .................................................................................................................
3.4 Ciclodextrinas .................................................................................................
4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................
4.1 Matérias-primas ..............................................................................................
4.2 Aparelhos e equipamentos .............................................................................
4.3 Solventes e outros materiais ...........................................................................
4.4 Métodos ..........................................................................................................
4.4.1 Isolamento da 3-O-metilquercetina ..............................................................
4.4.2 Caracterização da 3-O-metilquercetina .......................................................
4.4.2.1 Espectroscopia no Infravermelho (IV) .......................................................
4.4.2.2 Ressonância Magnética Nuclear ..............................................................
4.4.2.3 Espectroscopia no Ultravioleta (UV) .........................................................
4.4.2.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) .....................................
4.4.3 Validação do método analítico para a quantificação de 3-OMQ ..................
4.4.4 Determinação do coeficiente de partição octanol/água ...............................
4.4.5 Estudo de solubilidade da associação 3-OMQ/
β
CD ....................................
4.4.6 Preparação do complexo 3-OMQ:
β
CD em meio líquido ..............................
4.4.7 Preparação da simples mistura entre 3-OMQ e
β
CD ..................................
4.4.8 Caracterização do complexo 3-OMQ:
β
CD ..................................................
4.4.8.1 Espectro no infravermelho (IV) .................................................................
4.4.8.2 Espectro de ressonância magnética nuclear (RMN de
1
H) .......................
4.4.8.3 Modelagem Molecular ...............................................................................
4.4.9 Incorporação da 3-OMQ e
β
CD associadas em gel hidrofílico ....................
4.4.10 Estudo de penetração cutânea ..................................................................
01
05
07
07
09
11
11
22
24
29
31
31
31
32
32
33
33
33
34
34
34
37
38
38
38
39
39
39
39
40
40
4.4.10.1 Preparação das membranas para difusão ..............................................
4.4.10.2 Cinética de permeação ...........................................................................
4.4.10.3 Quantificação da 3-OMQ remanescente na pele ....................................
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .........................................................................
5.1 Validação do método analítico ........................................................................
5.2 Associação da 3-O-metilquercetina com
β
-ciclodextrina ................................
5.2.1 Diagrama de solubilidade ............................................................................
5.2.2 Espectroscopia na região do infravermelho .................................................
5.2.3 Ressonância Magnética Nuclear e Modelagem Molecular ..........................
5.3 Determinação do coeficiente de partição octanol/água (log Kp) ....................
5.4 Avaliação dos perfis de penetração ................................................................
5.5 Determinação da quantidade de 3-O-metilquercetina acumulada ..................
6 CONCLUSÕES ..................................................................................................
7 REFERÊNCIAS ..................................................................................................
41
42
43
45
47
52
52
53
56
64
64
69
71
75
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química da 3-OMQ .................................................................
Figura 2. Diagrama de solubilidade de fases ........................................................
Figura 3. Etapas do procedimento de preparo das células de Franz para ensaio
de permeação .......................................................................................................
Figura 4. Espectro de absorção da 3-O-metilquercetina no ultravioleta e visível..
Figura 5. Perfil cromatográfico da 3-O-metilquercetina obtido por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) ...........................................................................
Figura 6. Curva padrão da 3-O-metilquercetina obtida por CLAE ........................
Figura 7. Cromatograma do extrato de pele suína na ausência de 3-OMQ .........
Figura 8. Diagrama de solubilidade da 3-OMQ associada à
β
CD ........................
Figura 9. Espectro no infravermelho da 3-OMQ ...................................................
Figura 10. Espectro no infravermelho da
β
CD ......................................................
12
25
42
47
48
49
51
53
54
54
Figura 11. Espectro no infravermelho da mistura 3-OMQ/
β
CD ............................
Figura 12. Espectro no infravermelho do complexo 3-OMQ:
β
CD .........................
Figura 13. Espectro de RMN de
1
H da 3-OMQ .....................................................
Figura 14. Espectro de RMN de
1
H da
β
CD ..........................................................
55
56
57
58
Figura 15. Espectro de RMN de
1
H do complexo 3-OMQ:
β
CD .............................
Figura 16. Mapa de contornos NOESY do complexo 3-OMQ:
β
CD ......................
Figura 17. Estrutura tridimensional da 3-OMQ por MM2 ......................................
Figura 18. Estrutura tridimensional da
β
CD por MM2 ...........................................
58
59
61
61
Figura 19. Simulação da complexação da 3-OMQ com
β
CD pela borda de OH
secundárias ...........................................................................................................
Figura 20. Simulação da complexação da 3-OMQ com
β
CD pela borda de OH
primárias ................................................................................................................
Figura 21. Comparação entre os perfis de penetração intrínseca ........................
Figura 22. Perfis de penetração a partir de HPMC ...............................................
62
63
66
67
Figura 23. Perfis de penetração da 3-OMQ e diferentes associações ..................
Figura 24. Quantidade total de 3-OMQ acumulada na pele de suíno após a
permeação de 8 horas ..........................................................................................
69
70
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Protocolo para ensaio de exatidão na determinação da 3-OMQ por
CLAE .....................................................................................................................
Tabela 2 - Protocolo para ensaio de exatidão em extrato de pele suína .............
Tabela 3 - Proporções molares empregadas de 3-OMQ e
β
CD ...........................
Tabela 4 - Composição do hidrogel contendo 3-O-metilquercetina ......................
Tabela 5 - Precisão inter-dia para a análise de 3-O-metilquercetina por CLAE ...
Tabela 6 - Repetibilidade para a análise de 3-O-metilquercetina por CLAE ........
Tabela 7 - Exatidão da análise de 3-O-metilquercetina por CLAE .......................
Tabela 8 - Exatidão da análise de 3-OMQ em extrato de pele suína por CLAE ...
Tabela 9 - Incrementos de solubilidade da 3-OMQ observados em função da
proporção molar de
β
CD .................................................................................................
36
36
38
40
50
50
50
51
53
Tabela 10 – Atribuições e deslocamentos químicos de RMN de
1
H da 3-OMQ e
da
β
CD ..................................................................................................................
Tabela 11 – Resultados de energia (kJ mol
-1
) da análise conformacional dos
complexos .............................................................................................................
Tabela 12 - Concentrações da 3-OMQ quantificadas nas fases aquosa e
octanólica ..............................................................................................................
Tabela 13 – Permeação de 3-O-metilquercetina em pele de orelha de suíno:
fluxo, tempo de latência e quantidade permeada, após 8 horas ..........................
57
63
64
64
RESUMO
No presente trabalho foi realizado o isolamento da 3-O-metilquercetina, a partir
de produto seco do extrato de inflorescências de Achyrocline satureioides, e sua
caracterização. Em etapa farmacotécnica, foi realizado o estudo da associação
deste flavonóide com
β
-ciclodextrina, bem como testes preliminares de permeação
cutânea das associações, incorporadas ou não em gel de hidroxipropilmetilcelulose.
As técnicas espectroscópicas, infravermelho e ressonância magnética de hidrogênio,
confirmaram a estrutura do flavonóide isolado. Para o doseamento da 3-O-
metilquercetina, realizou-se a validação de metodologia analítica por cromatografia
líquida de alta eficiência, obtendo-se linearidade, na faixa de concentração de 0,05 a
1,5 µg/mL, precisão e exatidão adequadas. A análise da associação da 3-O-
metilquercetina com
β
-ciclodextrina por infravermelho, ressonância magnética de
hidrogênio e a análise pelo método empírico de Mecânica Molecular (MM2) do
software Chem3D Ultra (Versão 9.0, CambridgeSoft) indicam possível inclusão do
anel B da 3-O-metilquercetina na cavidade da
β
-ciclodextrina, sendo a inserção do
flavonóide pela borda das hidroxilas secundárias mais favorável do que pela borda
das hidroxilas primárias. A
β
-ciclodextrina e o gel de hidroxipropilmetilcelulose
promoveram a permeação do flavonóide através da pele. A realização de ensaios in
vivo para a seleção da melhor formulação constitui-se na principal perspectiva de
continuidade de investigação científica do tema.
Palavras-chave: Tecnologia farmacêutica; 3-O-metilquercetina;
β
-ciclodextrina;
Hidroxipropilmetilcelulose; Penetração cutânea.
ABSTRACT
Schwingel, Liege Cassia. 3-O-METHYLQUERCETIN ASSOCIATION WITH
β
ββ
β
-
CYCLODEXTRIN: EVALUATION OF COMPLEXATION AND SKIN PERMEATION.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2007.
3-O-methylquercetin (3-OMQ) was isolated from spray dried powder of Achyrocline
satureioides and characterized by IR and
1
H NMR. The study of association of this
flavonoid with
β
-cyclodextrin (
β
CD) was performed, as well as preliminary skin
permeation tests of these associations, incorporated or not in hydroxypropyl
methylcellulose (HPMC) hydrogel. A LC method for 3-OMQ assay was validated in
the concentration range from 0.05 to 1.5 µg/mL, with suitable precision and accuracy.
The complexation of 3-OMQ with
β
CD was analyzed by IR,
1
H NMR and Molecular
Mechanics (Chem3D Ultra 9.0, CambridgeSoft) and the results indicated the possible
insertion of B ring of the flavonoid into the
β
CD cavity, being the insertion through the
secondary OH rim more favorable than through the primary OH rim.
β
CD and HPMC
promoted the permeation of the flavonoid through the skin. In vivo assay is required
to select the appropriate formulation.
Keywords: Pharmaceutical technology; 3-O-methylquercetin;
β
-cyclodextrin;
Hydroxypropyl methylcellulose; skin permeation.
1 INTRODUÇÃO
2
3
A 3-O-metilquercetina (3-OMQ) é um flavonóide presente em inflorescências de
Achyrocline satureioides (Lam.) DC. Asteraceae e em outros vegetais, sendo
conhecida, entre outras, por sua atividade anti-viral (VAN HOFF et al., 1984; KAUL
et al., 1985; CASTRILLO et al., 1986; SIMÕES, 1992; SEMPLE et al., 1998). A
síntese da 3-OMQ também tem sido relatada, sendo esta de baixo rendimento, com
formação de inúmeros subprodutos tóxicos e de difícil purificação
(KRISHNAMACHARI et al., 2004). Embora não haja relatos do seu uso popular em
afecções provocadas pelo vírus herpes simples tipo 1 (HSV-1), tal atividade foi
verificada em ensaios in vitro, revelando promissoras perspectivas para o tratamento
de infecções herpéticas do tipo I especialmente localizadas em lábios e mucosas
(BETTEGA, 2004). Estudos sobre o mecanismo de ação antiviral da 3-OMQ
mostraram que ela inibe uma etapa inicial da replicação do vírus (entre 1 a 1,5 horas
após a infecção) reduzindo a síntese do RNA viral e protéica (VLIETINCK et al.,
1986; VRIJSEN et al., 1987; VANDEN BERGHE et al., 1993).
As ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos com variável número de
unidades de glicose, possuindo relativa solubilidade em água. São moléculas
cristalinas de estrutura tronco-cônica com capacidade de auto-organização, sendo a
β
-ciclodextrina (
β
CD), com 7 unidades de glicose, a mais utilizada na indústria
farmacêutica (SALTÃO e VEIGA, 2001), por seu menor custo, por apresentar prazo
de vigência da patente já expirada e pela dimensão da cavidade que propicia
inclusão de um grande número de moléculas. Por possuírem uma cavidade
hidrofóbica, as ciclodextrinas tendem à formação de complexos de inclusão com
substâncias que possuam uma maior afinidade por elas do que pelo meio onde
estão inseridas, sendo em geral meio aquoso. Este sistema proporciona inúmeras
vantagens tecnológicas para as formulações, dentre as quais se destaca o
incremento da solubilidade dos fármacos e, freqüentemente, a melhora da sua
estabilidade (BACKENSFELD et al., 1991; LOFTSSON e BREWSTER, 1996;
TOROS DE ILARDUYA et al., 1998; OZDEMIR e ORDU, 1998; PERDOMO-LOPEZ
et al., 2002; TOMMASINI et al., 2004; ODA et al., 2004). As ciclodextrinas também
exercem efeito promotor da permeação cutânea de fármacos lipofílicos devido,
principalmente, à extração de lipídios e conseqüente desorganização do extrato
córneo (MATSUDA e ARIMA, 1999), mas também, por melhorar a disponibilidade
dos mesmos na superfície cutânea.
4
O potencial da 3-OMQ para o tratamento de infecções causadas pelo vírus
herpes simples tipo 1 motivou o presente trabalho, que propõe o estudo da
associação deste flavonóide com a
β
CD visando a preparação de formulação de uso
tópico sobre a pele. A complexação da 3-OMQ com ciclodextrina objetiva ao
aumento da sua disponibilidade na superfície cutânea, bem como a promoção de
sua penetração.
Neste contexto, o presente trabalho propõe o isolamento e caracterização da 3-
OMQ a partir de produto seco de Achyrocline satureioides e o estudo da associação
deste flavonóide com
β
CD, bem como a realização de testes preliminares de
permeação cutânea das associações, incorporadas ou não em gel de
hidroxipropilmetilcelulose (HPMC).
5
2
OBJETIVOS
6
7
2.1 Objetivo geral
Investigar a associação da 3-O-metilquercetina (3-OMQ) à
β
-ciclodextrina
(
β
CD) com subseqüente estudo da influência da associação sobre a penetração
cutânea do flavonóide, incorporadas ou não em hidrogel de
hidroxipropilmetilcelulose.
2.2 Objetivos específicos
• Isolar o flavonóide 3-OMQ a partir de produto seco de inflorescências de
Achyrocline satureioides (Lam.) DC. Asteraceae, caracterizando-o e analisando seu
grau de pureza;
• complexar a 3-OMQ com
β
CD, e caracterizar os complexos, comparando
com a simples mistura entre 3-OMQ e
β
CD;
• preparar hidrogel de hidroxipropilmetilcelulose e incorporar 3-OMQ na forma
livre, complexada ou em mistura com
β
CD;
• testar a penetração cutânea da 3-OMQ, intrínseca e a partir das
formulações desenvolvidas, em pele de orelha de suíno.
8
9
3 REFERENCIAL TEÓRICO
10
11
3.1 Herpes Simples
Os vírus herpéticos são altamente disseminados na natureza. As principais
infecções causadas pelo vírus herpético do tipo 1 (HSV-1) são as cutâneo-mucosas
(mais comumente o herpes labial), gengivomastites, faringotonsilites, querato-
conjuntivites, encefalites, infecções genitais (sendo 80 % dessas últimas causadas
pelo HSV-2, mas um percentual também têm sido atribuído ao HSV-1) e infecções
neonatais (McCORMAK et al., 1996).
Assim como outros membros da família Herpesviridae, o vírus herpes simples é
constituído por um filamento linear de DNA de dupla fita envolvida em um capsídio
protéico (McCORMAK et al., 1996). A terapia anti-herpética utilizada no caso das
infecções causadas pelos vírus herpéticos dos tipos 1 (HSV-1) e 2 (HSV-2), são
geralmente compostos a base de idoxuridina, trifluoridina, ibacitabina, vidarabina,
citarabina, além do aciclovir e seus derivados fanciclovir, pencivlovir, ganciclovir,
valaciclovir e foscarnet (CLERCQ, 1993; LIMA, 2004; TIERNEY JR et al., 2005).
A existência de cepas herpéticas resistentes ao aciclovir e aos análogos de
nucleosídeo revela o interesse em incrementar a quimioterapia antiviral buscando
substâncias alternativas efetivas contra infecções virais que apresentam, ao mesmo
tempo, a menor toxicidade possível às células hospedeiras. Os produtos naturais
contituem uma fonte inesgotável de compostos com promissora atividade antiviral,
não apenas pelo grande número de espécies com propriedades medicinais
inexploradas, mas principalmente pela variedade de metabólitos sintetizados
(HUDSON, 1990; CHE, 1991; ABAD et al., 1997).
3.2 3-O-metilquercetina (3-OMQ)
3-OMQ (5,7,3’,4’-tetrahidroxi-3-O-metilflavona ou 2-(3,4-dihidroxifenil)-5,7-
dihidroxi-3-metoxi-4H-cromen-4-ona) é um 3-metil flavonol natural com atividade
antiviral pronunciada e moderada atividade antiinflamatória e antioxidante
(MIDDLETON et al., 2000). 3-OMQ foi primeiramente isolada de extratos da planta
Euphorbia grantii Oliver (Euphorbiaceae) (VAN HOOF et al., 1984; DE MEYER et al.,
12
1991), mas também é quimicamente sintetizada (DE MEYER, 1989). Não há relatos
precisos a respeito de suas características físicas e físico-químicas.
Figura 1: Estrutura química da 3-OMQ (C
16
H
12
O
7
, 316 g/mol).
3-O-metil flavonóis não se acumulam frequentemente em plantas, pois são
intermediários na rota biossintética de flavonóides parcialmente/altamente metilados.
A 3-O-metilação da quercetina confere propriedades distintas a esta substância,
além de ser um agente antiinflamatório e antiviral (MIDDLETON e KANDASWAMI,
1993; MALHOTRA et al., 1996).
Sua distribuição é relativamente difusa, incluindo algumas espécies da famíla
Asteraceae, como por exemplo Pallenis spinosa Cass. (AHMED et al.,1992), gênero
Artemisia (VALANT-VETSCHERA et al., 2003), e Serratula tinctoria L. (HUANG et
al., 2004). Além disso, foi recentemente relatado o acúmulo da 3-OMQ em tricomas
das folhas de tabaco (Nicotiana tabacum), juntamente com outros flavonóides
metilados, em resposta a estresse e herbívoros (RODA et al., 2003).
A 3-OMQ também está presente em inflorescências de Achyrocline
satureioides (Lam.) DC.(Asteraceae), na forma livre. Juntamente com quercetina e
luteolina, são considerados os constituintes majoritários de soluções extrativas
hidroalcoólicas. As atividades antiviral (SIMÕES et al., 1999), antiinflamatória
(SIMÕES et al., 1988) e antioxidante (POLYDORO et al., 2004; MORQUIO et al.,
2005) apresentadas por estes extratos têm sido, pelo menos parcialmente,
relacionadas com a presença destes polifenóis.
13
Com o interesse em quantificar os flavonóides em preparações
fitofarmacêuticas ou fitocosméticas de Achyrocline satureioides, DE SOUZA e
colaboradores (2002) desenvolveram um sistema de cromatografia líquida para
separar quercetina, luteolina e 3-OMQ e quantificá-las em soluções extrativas das
inflorescências da planta. As concentrações de quercetina, luteolina e 3-OMQ na
solução extrativa aquosa foram as mais baixas, demonstrando que as agliconas
flavonoídicas foram melhor extraídas das inflorescências com solventes de menor
polaridade, como misturas de etanol:água 80:20 ou 40:60 (v/v). Este foi o primeiro
relato da separação entre luteolina e 3-OMQ e de sua quantificação por
cromatografia líquida de alta eficiência, aspecto de extrema relevância, face a sua
similaridade estrutural.
SAITO e colaboradores (2005) fizeram uso de cromatografia líquida a vácuo
em gel de sílica para isolar 3-OMQ a partir da fração aquosa de um extrato semi-
purificado de A. satureioides. O rendimento obtido de 3-OMQ por este método, em
relação à droga vegetal, foi de 1,21 %. Seu espectro de massas revelou [M+H]
+
m/z
317, sendo compatível com a fórmula molecular C
16
H
12
O
7
. A análise de RMN de
1
H
apresentou um singleto em
δ
3,78 ppm, característico de grupamento metoxila (O-
CH
3
). A presença de dois dubletos em
δ
6,19 e 6,38 ppm (
4
J = 2,4 e 2,4 Hz) é um
padrão característico dos hidrogênios H-6 e H-8 do anel A, respectivamente. Pelo
espectro de 2D-COSY (
1
H/
1
H) uma correlação entre os sinais em
δ
6,90, 7,53 e 7,62
ppm, típico de um sistema AMX; correspondendo aos hidrogênios H-5’ (J = 8,4 Hz),
H-6’ (J = 8,4 e 2,1 Hz) e H-2’ (J = 2,1 Hz), respectivamente. O isolamento da
substância 3-OMQ confirma a utilização da cromatografia líquida a vácuo como um
possível método analítico e quantitativo para o extrato de marcela (SAITO et al.,
2005).
ZIDORN e colaboradores (2005) isolaram 3-OMQ a partir do extrato metanólico
de Arnoseris minima, dissolvendo o extrato metanólico em uma mistura
água/metanol (1:1) com sucessiva extração com éter de petróleo e acetato de etila.
A camada de acetato de etila foi fracionada por cromatografia em coluna por sílica
gel, usando um sistema de eluição gradiente de diclorometano e metanol (iniciando
com diclorometano puro e terminando com metanol, usando misturas 99:1. 98:2,
14
95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 50:50, 25:75). As frações foram purificadas por repetidas
cromatografias em coluna Sephadex LH-20 usando metanol como eluente. A
estrutura química foi elucidada por meio de espectrometria de massas, RMN de
1
H,
RMN de
13
C, COSY, HSQC e HMBC, sendo os resultados obtidos comparados com
os dados da literatura para a 3-OMQ (BARBERA et al., 1986).
VERDI e colaboradores (2004) isolaram 3-OMQ a partir de flores de Baccharis
illinita DC (Asteraceae), conhecida como chá ventura ou erva milagrosa. 500 g da
planta foram extraídos com clorofórmio e depois com etanol, por 15 dias. Os
solventes foram removidos por evaporação a vácuo (< 55 ºC). O extrato etanólico
(5,0 g) foi suspenso numa mistura etanol:água (10:90, v/v) e a partição da fase
aquosa com acetato de etila resultou na fração acetato de etila (1,3 g), a qual foi
submetida à cromatografia em coluna com sílica gel, sendo eluída com misturas
hexano - acetato de etila – etanol. Entre os nove flavonóides isolados, incluiu-se a 3-
OMQ (3 mg).
3-OMQ e luteolina foram isoladas a partir de extrato metanólico (50 mg/mL) das
flores de Gnaphalium oxyphyllum var. oxyphyllum, e demonstraram inibição
significativa de Staphylococcus aureus e Bacillus cereus. Entretanto, não
apresentaram atividade contra Salmonella typhimurium e Escherichia coli
(VILLAGÓMEZ-IBARRA et al., 2001).
Em 2006, LALL e colaboradores isolaram 3-OMQ a partir de Helichrysum
melanacme (DC.) Harv. (Asteraceae), e testaram a sua atividade antiviral e anti-
tuberculose. Nas concentrações máximas testadas, a 3-OMQ não apresentou
atividade frente ao vírus Influenza A humano e à Mycobacterium tuberculosis (LALL
et al., 2006).
BOUKTAIB e colaboradores (2002) desenvolveram metodologia para a
hemisíntese dos cinco isômeros da O-monometilquercetina. A estratégia utilizada
baseia-se na diferença de reatividade dos diferentes sítios de ligação e na proteção
seletiva do grupamento catecol com diclorodifenilmetano. Para a 3-OMQ isolada,
foram relatados os seguintes resultados: 2-(3,4-Dihidroxifenil)-5,7-dihidroxi-3-
methoxi-cromen-4-one. P.E. 271–273 ºC. RMN de
1
H (DMSO-d
6
): 3,75 (s, 3H,
15
OCH
3
), 6,14 (s, 1H, H aromático), 6,32 (s, 1H, H aromático), 6,87 (d, J = 8,3 Hz, 1H,
H aromático), 7,48 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H aromático), 7,59 (s, 1H, H aromático). RMN
de
13
C (DMSO-d
6
): 60,5 (OCH
3
), 94,7; 99,8; 105,8; 116,4; 116,5; 122,4; 122,9; 139,5;
146,4; 149,9; 157,9; 158,3; 163,0; 165,8; 179,9 (C=O). MS m/z 316 (M
+
) 315, 301,
284, 270, 229, 228, 166, 141, 137, 110. HRMS (C
16
H
12
O
7
) calculado: 316,0583;
encontrado: 316,0587. C
16
H
12
O
7
, 1,5 H
2
O (343,29): calculado C 55,98, H 4,40;
encontrado C 56,12, H 4,12.
DOK-GO e colaboradores (2003) isolaram quercetina, (+)-dihidroquercetina e
3-OMQ de frações de acetato de elila de frutas e caules de Opuntia ficus-indica var.
saboten e, a partir destas substâncias, estudaram os efeitos protetores contra danos
neurais oxidativos induzidos em culturas primárias de células corticais de ratos e
suas atividades oxidantes utilizando três bioensaios celulares diferentes. A 3-OMQ
inibiu potente e dramaticamente os danos neurais induzidos por peróxido de
hidrogênio e xantina/xantina oxidase (X/XO), com valores de concentração inibitória
para 50 % das células (IC
50
) de 0,6 e 0,7 g/mL, respectivamente. Quercetina e 3-
OMQ inibiram a atividade de xantina oxidase in vitro, com IC
50
de 10,67 e 42,01
g/mL, respectivamente. A 3-OMQ parece ser o neuroprotetor mais potente dentre
os três flavonóides isolados desta planta.
Na inibição dos danos oxidativos neurais, ao contrário da quercetina, os
flavonóides (+)-dihidroquercetina e 3-OMQ apresentaram efeitos protetores
concentração-dependentes. Em experimentos adicionais, verificou-se que os efeitos
protetores da (+)-dihidroquercetina e da 3-OMQ foram mantidos nas concentrações
300 e 30 g/mL, respectivamente. 3-OMQ inibiu potentemente a peroxidação lipídica
iniciada por cloreto ferroso (FeCl
2
) em homogeneizados de cérebro de rato, com IC
50
de 0,74 g/mL. A concentração de 3-OMQ que teve 50 % do efeito scavenger dos
radicais livres gerados por 1,1-difenil-2-picrilhidrazila (DPPH) foi de 14,62 g/mL.
Quercetina e 3-OMQ inibiram a atividade da xantina oxidase (XO), medida in vitro
pela formação de ácido úrico de xantina, com respectivos IC
50
de 10,67 e 42,01
g/mL. A exposição de culturas de células corticais ao peróxido de hidrogênio ou
X/XO gera radicais livres, como os radicais superóxido e hidroxila. Estes radicais
participam ativamente da iniciação da peroxidação lipídica e eventualmente causam
a morte celular. A quercetina teve uma inibição da peroxidação lipídica e da xantina
16
oxidase mais potente, tendo maior atividade scavenger do que os outros dois
flavonóides. Entretanto, à medida em que as concentrações de quercetina são
aumentadas de 30 para 100 g/mL, esta não é mais protetora, implicando em sua
citotoxicidade ou atividade pró-oxidante a estas concentrações em culturas de
células corticais (DOK-GO et al., 2003). Este efeito pró-oxidante da quercetina
também tem sido referido por POLYDORO e colaboradores (2004). 3-OMQ manteve
os efeitos protetores a 30 g/mL, 30 vezes a concentração mais eficaz. Baseado
nisso, é referido como pouco provável que 3-OMQ seja citotóxica ou pró-oxidante
nestas concentrações, em culturas de células corticais de rato (DOK-GO et al.,
2003).
3-OMQ apresentou maior proteção das células neurais contra os danos
oxidativos em culturas corticais. Na verdade, a 3-OMQ foi de 6 a 9 vezes mais
potente que quercetina, e 13 a 25 vezes mais potente que (+)-dihidroquercetina em
termos de inibição de dano oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio ou X/XO.
Esta diferença tem sido atribuída à natureza mais hidrofóbica da 3-OMQ.
Concentrações relativamente altas de 3-OMQ são necessárias para a inibição da
xantina oxidase (IC
50
= 42,01 g/mL). Desta forma, a 3-OMQ parece inibir mais o
dano neural induzido por radicais, como o ânion superóxido gerado por X/XO, do
que inibir a geração de radicais durante a oxidação de xantina por xantina oxidase.
Além disso, 3-OMQ parece ser o neuroprotetor mais potente e promissor dentre os
três flavonóides isolados da Opuntia ficus-indica var. saboten. Os autores concluem
sobre o benefício neuroprotetor obtido pelo uso da planta ou de suas substâncias
ativas na prevenção e tratamento de distúrbios neurológicos induzidos por estresse
oxidativo (DOK-GO et al., 2003).
Com o objetivo de desenvolver agentes neuroprotetores para uso terapêutico,
YOO e colaboradores (2005) propuseram modificações do padrão de substituição de
grupamentos na estrutura da 3-OMQ, visando a melhorar as propriedades físico-
químicas ou a aumentar a atividade antioxidante. Uma série de 3-metoxiflavonas
foram sintetizadas a partir da 3-OMQ isolada de caules de Opuntia ficus-indica var.
saboten, e a atividade antioxidante dos derivados foi testada.
17
Os resultados dos testes de atividade antioxidante indicaram que pelo menos
dois grupamentos hidroxila são necessários no anel B das flavonas para que a
atividade antioxidante seja evidenciada. Com a metilação dos grupamentos hidroxila
de C-5 e/ou C-7 do anel A, a atividade antioxidante não foi muito afetada. Entretanto,
quando o grupamento hidroxila de C-7 foi removido da 3-OMQ, a atividade
scavenger de ânion superóxido foi reduzida em cinco vezes, enquanto que a
atividade scavenger do radical DPPH e de inibição da peroxidação lipídica foram
mantidas. Portanto, a substituição dos grupos funcionais das posições C-5 ou C-7
parece viável no desenvolvimento de novas 3-metoxiflavonas antioxidativas com
propriedades físico-químicas melhoradas (YOO et al., 2005).
O extrato de Achyrocline satureioides foi incorporado numa base cosmética e
aplicado na pele das costas de coelhos. A pele foi exposta a 1 hora de irradiação UV
de fonte conhecida (lâmpada UV Spectroline ENF-260C/FE; lâmpadas BLE-6T36S e
BLE-6254S; 6W, 9 – dose de 5.7 mJ/cm
2
; 254; 365 nm). A produção de radical
hidroxila foi medida na pele após exposição ao UV, por meio da medida do ácido
2,3-dihidroxibenzóico (2,3-DHBA), produzido pela hidroxilação do salicilato de sódio
previamente injetado intracutaneamente nas áreas irradiadas. O UV provocou um
forte aumento no 2,3-DHBA nos animais do grupo controle, que foi
significativamente diminuído pela preparação cosmética contendo Achyrocline
satureioides. Esta preparação cosmética foi capaz de scavenger à produção de
hidroxila na presença de altas concentrações de agliconas como quercetina,
luteolina e 3-OMQ (MORQUIO et al., 2005).
LINES e ONO (2006) analisaram FRS 1000 (bebida a base de plantas, que
contém flavonóides extraídos de casca de cebola) quanto a sua atividade inibidora
da fosfodiesterase 5A (PDE 5A), a qual é considerada importante para o tratamento
de disfunção erétil. Os resultados sugerem que a inibição da PDE 5A não está
diretamente relacionada à atividade scavenger de radicais livres dos flavonóides.
Sabe-se que a 3-OMQ inibe o AMPc total e GMPc-PDE da traquéia de cobaia (KO et
al., 2002). Recentemente, foi relatado que a 3-OMQ inibe seletivamente
fosfodiesterase subtipo 3 com um IC
50
de 1,9 M, entretanto inibe muito fracamente
os outros subtipos, como PDE 4 e 5A, com um IC
50
de 28,5 e 86,9 M,
respectivamente (KO et al., 2003). Mais recentemente, LINES e ONO (2006) referem
18
que o melhoramento da função sexual relatado dentre os pacientes pode ser
parcialmente explicado pela atividade inibidora específica de PDE 5A da quercetina,
um dos principais constituintes do FRS 1000.
KO e colaboradores (2004) relataram que 3-OMQ tem potencial para uso no
tratamento de asma, com efeitos antiinflamatório e broncodilatador, em dose que
não afeta a pressão sangüínea. Os autores referem que, nas doses utilizadas (3 a
30 mol/kg), a 3-OMQ suprimiu significativamente todas as células inflamatórias,
macrófagos, neutrófilos e eosinófilos. Além disso, os autores demonstraram que a 3-
OMQ atenuou, significativamente, a secreção do fator de necrose tumoral.
Para esclarecer os mecanismos do efeito antiinflamatório da 3-OMQ, JIANG e
colaboradores (2006) investigaram os mecanismos de supressão da produção de
óxido nítrico por 3-OMQ em células RAW 264.7, uma linhagem de células
macrofágicas de camundongo. A produção de óxido nítrico induzida por
lipopolisacarídeos por meio da expressão da óxido nítrico sintase indutível nas
células RAW 264.7, pode refletir o grau de inflamação e fornecer uma medida para
avaliar o efeito de fármacos no processo inflamatório. A 3-OMQ (0,3-10 M) de
forma concentração-dependente, inibiu 50 % da produção de óxido nítrico na
concentração de 4,23 M. Com base nestes resultados, os autores concluíram que a
3-OMQ pode exercer seu efeito antiinflamatório por meio da inibição da transcrição
do DNA da óxido nítrico sintase indutível. Também, tem sido relatado o efeito
inibitório da 3-OMQ sobre a formação de tromboxanos pela inibição da
ciclooxigenase em plaquetas de coelhos, embora com potência inferior à
indometacina (LAEKEMAN et al., 1986). Além disto, o efeito anti-plaquetário na
agregação induzida por ácido araquidônico e colágeno, tem sido relatado por LIN e
colaboradores (1995).
A atividade antipicornaviral da 3-OMQ isolada e sintetizada foi testada in vitro
em linhagens de células e in vivo em camundongos (VAN HOOF et al., 1984). Em
culturas de células de rim de macaco verde africano (células VERO), foi observada
uma inibição de 90 % do Poliovírus Tipo I e Coxsackie B4, em concentrações de
0,01 g/mL; o efeito permaneceu inalterado com o aumento da concentração da 3-
OMQ para 25 g/mL. Em concentração de 5 g/mL, a 3-OMQ também mostrou
19
atividade antiviral contra o vírus da estomatite vascular. A 3-OMQ foi bem tolerada
(in vitro) pelas células VERO e fibroblastos de pele humana por mais de 5 dias de
exposição, sendo a concentração citotóxica para 50 % (TC
50
), 40 g/mL (VAN HOOF
et al., 1984).
DENG (1998) relatou atividade anti-poliovírus da 3-OMQ quimicamente
sintetizada, em concentrações situadas na faixa de 0,5-10 g/mL e TC
50
na
concentração de 25 g/mL (DENG et al., 1997). Testes com 3-OMQ obtida por semi-
síntese a partir da rutina demonstraram atividade em faixas de concentração de 1,0-
12,5 g/mL contra o Poliovírus Tipo I, Coxsackie B2 e o Rinovírus Humano tipo 81
(DIMOVA et al., 2003).
Estudos sobre o mecanismo da ação antiviral da 3-OMQ têm mostrado que a
3-OMQ inibe uma etapa inicial da replicação viral (entre 1 e 1,5 h após a infecção),
reduzindo a síntese do RNA e das proteínas virais (VLIETINCK et al., 1986;
VRIJSEN et al., 1987; VANDEN BERGHE et al., 1993). 3-OMQ não tem
demonstrado efeito virucida extracelular contra Poliovírus e o vírus Coxsackie (VAN
HOOF et al., 1984). Este efeito inibitório da 3-OMQ é reversível no início da infecção
viral, uma vez que se observa que as células tratadas com 3-OMQ re-iniciam a
síntese de RNA e proteínas virais, se houver a remoção da mesma. A adição de 3-
OMQ no início da infecção do poliovírus evita o surgimento de proteínas virais,
embora o cancelamento da tradução de proteínas do hospedeiro ainda ocorra
(CASTRILLO et al., 1986). A adição tardia de 3-OMQ na infecção não inibe a síntese
protéica viral, enquanto que a síntese de RNA viral é inibida drasticamente,
sugerindo que a síntese do RNA é o alvo da ação da 3-OMQ (CASTRILLO et al.,
1986). A 3-OMQ não tem efeito na síntese do RNA em células não infectadas. Em
suma, esta substância bloqueia a síntese do filamento de RNA do poliovírus e seus
intermediários replicadores, havendo especificidade para as células infectadas
(CASTRILLO e CARRASCO, 1987a).
No que se refere à relação estrutura-atividade, estudos têm demonstrado que
os grupamentos 3-metoxila e 5-hidroxila da estrutura do flavonol são necessários
para atividade anti-rinovírus específica, enquanto que o grupamento 3-metoxila é
responsável pelo efeito anti-poliovírus (TSUCHIYA et al., 1985).
20
Devido a sua pronunciada atividade anti-picornavírus e moderada atividade
anti-inflamatória e antioxidante (PELZER et al., 1998; DE MEYER et al., 1991; COS
et al., 1998), a 3-OMQ tem sido apontada como uma substância com potencial anti-
rinovírus, para aplicação nasal. Neste sentido, DIMOVA e colaboradores (2003)
estudaram o efeito da 3-OMQ, com ou sem promotores de absorção como
hidróxipropil--ciclodextrina (HP--CD) ou polissorbato 80, sobre a freqüência dos
movimentos ciliares in vitro de células do epitélio nasal humano. Na menor
concentração testada, 3-OMQ mostrou um efeito cílio-estimulante in vitro em células
do epitélio nasal humano, após exposição de 15 minutos. A freqüência dos
movimentos ciliares aumentou, respectivamente, 18 e 14 % nas concentrações de 2
e 10 g/mL, permanecendo semelhante na concentração de 20 g/mL. Este efeito
foi reversível. A baixa solubilidade da 3-OMQ em água (S
0
= 21,7 g/mL) motivou a
sua associação com HP--CD, não sendo observado efeito ciliotóxico na ausência
ou presença de HP--CD 3 %, m/v. Estes resultados mostraram o potencial da 3-
OMQ, sozinha ou combinada com HP--CD, como um composto anti-rinovírus, para
aplicação nasal (DIMOVA et al., 2003).
Extratos e frações ricas em flavonóides de frutas e folhas de Vitex polygama
Cham. (Verbenaceae) foram testadas contra vírus herpes simples tipo 1, aciclovir-
resistente. Ambas inibiram a atividade antiviral de forma dose-dependente. O extrato
das folhas mostrou atividade antiviral intracelular, enquanto que o extrato das frutas
teve efeito virucida. Uma fração obtida com acetato de etila do extrato das folhas
inibiu a propagação do vírus bloqueando os receptores HEp-2 (linhagem de célula
humana do carcinoma de laringe) (GONÇALVES et al., 2001).
A fração contendo a mistura de 3-OMQ, quercetina e luteolina foi a mais
citotóxica, com uma concentração máxima não-tóxica de 6 g/mL. Esta não
apresentou inibição viral, provavelmente devido à baixa concentração utilizada. A
concentração máxima não-tóxica da quercetina e da rutina foram, respectivamente,
50 g/mL e 200 g/mL. O extrato das folhas apresentou uma atividade antiviral
melhor do que o extrato das frutas. A 25 g/mL, o extrato acetato de etila das folhas
foi o mais ativo, seguido do extrato acetato de etila das frutas. A esta concentração,
a rutina foi a menos ativa. A fração obtida por separação cromatográfica do extrato
acetato de etila das folhas teve uma ação antiviral maior do que a do extrato original,
21
provavelmente devido a sua baixa citotoxicidade. Estes resultados indicam que os
compostos antivirais podem estar concentrados nesta fração, os quais podem não
ser responsáveis pela citotoxicidade do extrato (GONÇALVES et al., 2001).
Em relação ao mecanismo de ação, o extrato das frutas teve efeito virucida
(73,1 % de inibição) e leve ação intracelular (43,8 % de inibição). O extrato das
folhas apresentou atividade inibidora de 73,7 % na concentração máxima não-tóxica,
por meio do bloqueio da ligação do HSV-1 aos repectores HEp-2, além de inibição
intracelular (60,2 %), não apresentando atividade virucida (GONÇALVES et al.,
2001). CÒRDOBA e colaboradores (1991) demonstraram que as substâncias com
atividade virucida se ligam às proteínas do vírus provocando uma desnaturação
irreversível que bloqueia a infectividade viral. O efeito virucida foi observado no
extrato das frutas, enquanto que o extrato das folhas apresentou principalmente
atividade intracelular (GONÇALVES et al., 2001).
A 3-OMQ não teve efeito na síntese do RNA nas células HeLa controle (não
infectadas), enquanto que 2 g de 3-OMQ por mL bloqueou cerca de 50 % da
síntese do RNA em células infectadas por poliovírus resistente à actinomicina D.
Estes resultados embasam a conclusão de que 3-OMQ é um inibidor potente e
seletivo da síntese de RNA em células infectadas pelo poliovírus. 3-OMQ não teve
efeito na síntese do RNA em células não infectadas. Entretanto, esta substância
bloqueou a síntese do filamento de RNA do poliovírus e dos intermediários da
replicação. Um pico de radioatividade foi claramente aparente na presença de 3-
OMQ na região correspondente às formas replicativas. Os resultados sugerem que a
3-OMQ permite algumas sínteses de RNA de fita dupla, talvez porque a síntese de
subunidades menores pode ocorrer na presença de 3-OMQ. O mecanismo de ação
da 3-OMQ no ciclo de replicação do poliovírus pode ser assim explicado: depois que
o RNA parental do poliovírus está no citoplasma, é traduzido, dando origem a várias
moléculas de código da replicase viral que podem ser usadas para fazer uma cópia
da subunidade menor do RNA. Esta não pode ser transcrita para gerar mais cópias
de polaridade positiva na presença da 3-OMQ, já que esse processo requer a
participação de proteínas adicionais. Uma dessas proteínas é o alvo da 3-OMQ.
Embora a ação da 3-OMQ possa ser considerada similar à da guanidina, a 3-OMQ
parece ser mais seletiva. Também é interessante que poliovírus mutantes
22
resistentes à 3-OMQ não são resistentes à guanidina (CASTRILLO e CARRASCO,
1987a).
A inibição da síntese protéica da célula hóspede após a infecção do poliovírus
é consequência da degradação proteolítica de um peptídeo p220 necessário para
traduzir o filamento de RNAm. 3-OMQ bloqueia eficientemente a síntese de RNA do
poliovírus sem afetar a cinética ou inibição da síntese protéica celular. A tradução do
adenovírus não é afetada pela 3-OMQ. Além disso, a síntese de várias proteínas
tardias do adenovírus continua após a infecção do poliovírus quando este inibidor é
adicionado em vários tempos, mesmo que a tradução celular diminua gradualmente
(CASTRILLO e CARRASCO, 1987b).
PARVEZ e colaboradores (2004) estudaram o efeito de flavonóides comuns
contra o crescimento de planta e fungo. As relações de estrutura-atividade da
quercetina e seus sete derivados foram investigadas utilizando um teste de
crescimento com mudas de Arabidopsis thaliana e teste de germinação de conídios
com Neurospora crassa. 3-OMQ inibiu completamente o crescimento de A. thaliana
a 100 ppm e também em concentração mais baixa (30 ppm). A germinação de
conídio também foi inibida. Estes resultados indicam que a presença de grupamento
metila no núcleo flavonoídico tem importância no efeito inibitório para A. thaliana e
N. crassa.
3.3 Pele
A pele é uma membrana heterogênea, sendo que a principal camada que
controla a absorção é a epiderme, em especial, o estrato córneo. Uma das funções
principais da pele é evitar que o corpo perca água e bloquear a entrada de agentes
exógenos. Portanto, a pele e, em particular, o estrato córneo, formam uma barreira
efetiva para a permeação cutânea. Este efeito de barreira do estrato córneo é
observado quando o mesmo é removido por stripping com fita adesiva, ocasionando
um aumento expressivo na permeação de água e outros compostos (SCHEUPLEIN
e BLANK, 1971; WEBBER, 2003; WICKETT e VISSCHER, 2006).
23
A permeação através do estrato córneo é uma etapa crítica para a absorção
percutânea de agentes terapêuticos, uma vez que outras camadas da pele,
epiderme e derme, não apresentam propriedades de barreira tão relevantes. As vias
de penetração através do estrato córneo podem ser classificadas em: via
intercelular, que ocorre entre os corneócitos; via intracelular, que ocorre através dos
corneócitos; e as vias anexas, que incluem os canais sudoríparos e folículos pilosos
(SHIM et al., 2004). O espaço intercelular é constituído de um complexo de lipídeos
estruturados em bicamadas, sendo os principais componentes os ácidos graxos de
cadeia longa, ceramidas e colesterol (PLESSIS et al., 2001). A mucosa de
revestimento dos lábios e bochecha é constituída de epitélio não queratinizado,
sendo mais permeável do que as regiões queratinizadas (GANEM-QUINTANAR et
al., 1997).
Os processos patológicos podem influenciar a composição de proteínas ou
lipídeos do estrato córneo através de mudanças em proteínas estruturais ou
enzimáticas, ou ainda, causar a formação imprópria do estrato córneo aumentando a
proliferação de queratinócitos (WILLAMS e ELIAS, 1993). A pele acometida por uma
infecção transiente ou por uma condição crônica é geralmente mais penetrável por
exposições ambientais, ocupacionais ou de produtos tópicos do que a pele normal
saudável. Os danos causados à integridade da pele variam dependendo da
severidade da infecção. Apesar de favorecer o tratamento tópico, deve-se lembrar
que a barreira é dinâmica e será restaurada a medida que a infecção melhorar e,
conseqüentemente, o fluxo de fármaco através do tecido será mais lento (BUCK,
2004).
Não foram encontrados na literatura relatos específicos sobre o nível de dano
causado à pele pelo vírus HSV-1. No entanto, a julgar pelo quadro, a gravidade e
profundidade que as lesões podem atingir, é provável que o dano não fique restrito à
epiderme.
Frequentemente, a permeação intrínseca de substâncias bioativas é
insuficiente, sendo necessário o uso de estratégias de formulação para alcançar o
aumento da penetração tópica na pele. Neste sentido, substâncias denominadas
promotores de permeação têm sido empregadas, entre as quais encontram-se as
24
ciclodextrinas. As ciclodextrinas têm sido aplicadas na melhoria da liberação cutânea
de fármacos visando ação local ou sistêmica.
3.4 Ciclodextrinas
Ciclodextrinas naturais são olígarossacarídeos que consistem de seis (
α
-
ciclodextrina), sete (
β
-ciclodextrina), oito (
γ
-ciclodextrina) ou mais unidades de
glicopiranose unidas por ligações
α
-(1,4). Elas são produzidas pela degradação do
amido, por meio da reação de transglicosilação intramolecular, catalisada pela
enzima ciclodextrina-glicosiltransferase (CGTase) (SZETJLI, 1998).
O principal interesse nas ciclodextrinas está relacionado à sua capacidade de
formar complexos de inclusão com vários tipos de moléculas (HEDGES, 1998;
DUCHÊNE e WOUESSIDJEWE, 1990; BAUDIN et al, 2000; FICARRA et al., 2002;
DEL VALLE, 2004), sendo que estes complexos apresentam propriedades físico-
químicas e biofarmacêuticas diferentes das moléculas inclusas, destacando-se o
aumento na solubilidade e biodisponibilidade. Para que haja a formação de
complexos de inclusão, é necessário que a molécula hóspede possua maior
afinidade pela cavidade hidrofóbica da ciclodextrina do que pelo meio, bem como
dimensões compatíveis com esta (ao menos parcialmente).
A inclusão na ciclodextrina é um fenômeno estequiométrico molecular, em que,
geralmente, uma molécula hóspede interage com uma cavidade da ciclodextrina.
Para moléculas de baixo peso molecular, pode ocorrer a inclusão de mais de uma
molécula na cavidade, assim como, para moléculas de alto peso molecular, pode
ocorrer a complexação com mais de uma molécula de ciclodextrina, dependendo da
afinidade dos grupamentos e da estereoquímica da molécula (DEL VALLE, 2004).
Os complexos são formados a partir de forças de Van der Waals, pontes de
hidrogênio, interações hidrofóbicas, entre outras, mas a principal força propulsora da
formação de complexos é a saída de moléculas de água de alta entalpia do interior
da cavidade, deslocadas pela molécula hóspede de menor polaridade presente na
solução, resultando num estado de menor energia, portanto, termodinamicamente
favorecido (SZETJLI, 1998).
25
Das ciclodextrinas citadas, a
β
CD apresenta a menor hidrossolubilidade (1,85
g/100mL), porém, esta pode ser suficiente para melhorar consideravelmente a
solubilidade e, conseqüentemente, a biodisponibilidade de fármacos muito pouco
solúveis (DUCHÊNE e WOUESSIDJEWE, 1990). Sua cavidade, com diâmetro de
6,0 a 6,5 Å, tende a complexar anéis aromáticos e heterocíclicos (DEL VALLE,
2004). No que se refere à solubilidade dos complexos formados e à influência da
concentração de ciclodextrina sobre a mesma, a Figura 2 apresenta as situações
classicamente relatadas.
Figura 2. Diagrama de solubilidade de fases: A
P
- aumento de solubilidade com
desvio positivo; A
L
- aumento de solubilidade linear; A
N
- aumento de
solubilidade com desvio negativo; B
S
– formação de complexo pouco
solúvel; B
I
- redução de solubilidade com complexo insolúvel. Fonte:
HIGUCHI e CONNORS, 1965.
26
A isoterma do tipo A indica que a solubilidade da molécula-hóspede aumenta
com as concentrações crescentes da ciclodextrina, enquanto que o diagrama tipo B
indica a formação de um complexo de solubilidade limitada. No tipo A, vários
comportamentos podem ser observados. O A
L
, que se caracteriza por um aumento
linear da solubilidade, indica que se formam complexos solúveis de composição
constante. O tipo A
P
com um desvio positivo de linearidade reflete a formação de
complexos de maior ordem molecular, significando que na medida em que aumenta
a concentração de ciclodextrina, mais do que uma molécula de ciclodextrina é
complexada com uma molécula-hóspede. O tipo A
N
é idêntico ao anterior, mas com
desvio negativo, que corresponde ao estabelecimento de interações soluto/soluto e
soluto/solvente. No tipo B pode-se observar dois tipos de comportamento: tipo B
S
e
tipo B
I
. No primeiro, onde inicialmente há um aumento da solubilidade do soluto,
seguido de um platô e posterior diminuição da solubilidade em altas concentrações
de ciclodextrina, geralmente é ocasionado por uma precipitação do complexo. No
tipo B
I
, o complexo de inclusão é praticamente insolúvel, o que justifica a ausência
da parte inicial da curva de solubilidade (SZETJTI, 1994).
A obtenção de complexos pode ser realizada por diversas técnicas,
destacando-se o método da co-precipitação. Neste método, a ciclodextrina é
dissolvida em água, sendo que a molécula hóspede é adicionada, sob agitação, à
solução de ciclodextrinas. A complexação da molécula hóspede com as
ciclodextrinas ocorre na medida em que a solução é resfriada. Há formação de um
precipitado, o qual pode ser coletado por decantação, centrifugação ou filtração.
Após, o precipitado é lavado com uma pequena quantidade de água ou outro
solvente miscível com água (etanol, metanol ou acetona, por exemplo). A grande
desvantagem deste método está relacionada com a transposição para escala
industrial, tendo em vista a solubilidade limitada das ciclodextrinas o que implica no
uso de grandes quantidades de água e energia (DEL VALLE, 2004).
Além do método de co-precipitação, outras técnicas de complexação podem
ser citadas, como a complexação rápida (slurry), que é semelhante à co-
precipitação; complexação em pasta (é uma variação do slurry, porém pequena
quantidade de água é utilizada); mistura úmida, onde utiliza-se pouca ou nenhuma
água e o sistema é aquecido a 100 ºC; extrusão (variação da mistura úmida com
27
utilização de extrusor); mistura seca, a qual é realizada sem a adição de água (DEL
VALLE, 2004). A escolha do método está relacionada com as propriedades da
substância a ser complexada, bem como com os objetivos propostos para a
formulação, rapidez e simplicidade do método.
Uma propriedade interessante das ciclodextrinas está relacionada com a sua
capacidade de promover a liberação de fármacos em membranas biológicas, agindo
como verdadeiros carreadores, pois, este efeito pode ocasionar aumento da
disponibilidade do fármaco na superfície dessas barreiras biológicas (pele e mucosa,
por exemplo) e a promoção de sua penetração (DEL VALLE, 2004). As
ciclodextrinas também podem interagir com alguns componentes lipídicos da pele,
provocando a sua extração e conseqüente desorganização do extrato córneo
(LEGENDRE et al., 1995; BENTLEY et al., 1997). Neste caso, a ciclodextrina pode
ser simplesmente adicionada à formulação, sem prévia complexação com a
substância de interesse.
Além da associação de fármacos com ciclodextrinas, a adição de pequenas
quantidades de polímeros hidrodispersíveis tem resultado em aumento da
solubilidade do sistema, por meio da formação de co-complexos com as moléculas
do fármaco e da ciclodextrina. Esta associação tem sido referida como uma forma
de aumentar o índice de complexação, reduzindo, conseqüentemente, a quantidade
de ciclodextrina necessária para a solubilização do fármaco (LOFTSSON et al.,
1994; FRIDIKSDÓTTIR et al., 1997; LOFTSSON, 2000; CAPPELLO et al., 2001,
PETRY et al., 2007).
POSE-VILARNOVO e colaboradores (2004) fizeram um estudo do efeito da
β
CD e da hidroxipropil-
β
CD no comportamento de difusão e liberação de diclofenaco
de sódio e sulfametizol a partir de géis e comprimidos de HPMC K4M. Com a
realização dos experimentos, concluíram que as ciclodextrinas determinam a difusão
através dos géis e a taxa de dissolução a partir dos comprimidos contendo os
complexos de inclusão. Para uma dada proporção de HPMC e fármaco, baixas
concentrações das ciclodextrinas promovem a difusão do fármaco por meio da
diminuição das interações entre o fármaco e o polímero, enquanto que o efeito
contrário é observado para altas concentrações de ciclodextrinas: a ciclodextrina
28
livre aumenta a difusão. Para os comprimidos, deve-se ainda considerar a
capacidade de solubilização das ciclodextrinas, sendo este fator importante para o
fármaco mais hidrofóbico (sulfametizol), pois a taxa de liberação foi maior para
comprimidos contendo HPMC e ciclodextrinas.
29
4 MATERIAIS E MÉTODOS
30
31
4.1 Matérias-primas
• Produto seco por spray drying de Achyrocline satureioides;
•
β
-ciclodextrina (gentilmente fornecida pelo laboratório Roquette, França);
• HPMC (Methocel F4M, DOW Chemical Company).
4.2 Aparelhos e equipamentos
• Célula de difusão do tipo Franz;
• balança analítica AND
HM-202;
• aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência Shimadzu SCL-10,
composto por bomba Shimadzu LC-10AD; controlador automático de
fluxo Shimadzu SPD-10A; detector espectrofotométrico Shimadzu SPD-
10A; injetor automático; integrador LC10; coluna de aço inoxidável
Shimadzu Shimpack CLC-ODS (M) RP-18, 5 µm (250 mm x 4 mm d.i.);
pré-coluna Lichrosorb RP-18 (10 µm);
• agitador magnético de 15 pontos IKA
RO 15 Power Labortechnik;
• banho de água IKA
-WERKE;
• termostato IKA
EH4 Basic;
• freezer vertical Cônsul;
• espectrômetro no infravermelho FTIR-8101 Shimadzu;
• aparelho de ressonância magnética nuclear de RMN de
1
H BRUKER
DRX400 - Avance;
• liofilizador modular Edwards MODULYO 4K;
• ultracentrífuga MR 23i (Jouan);
• espectrofotômetro 8452A
®
(Hewlett Packard);
• banho de ultrasom Transsonic 460 (Elma);
• evaporador rotatório R-114 (Büchi).
4.3 Solventes e outros materiais
• Metanol (Nuclear
®
);
• clorofórmio (Nuclear
®
);
32
• ácido trifluoracético (Nuclear
®
);
• dimetilsulfóxido deuterado (Synth
®
);
• solução tampão pH 7,4 (USP 29);
• acetato de etila (Nuclear
®
);
• metanol grau CLAE (Merck
);
• etanol grau CLAE (Merck
);
• n-octanol (Vetec
®
);
• membrana para filtração HVLP, 0,45 µm, 13 mm (Durapore
);
• membrana para filtração HAWP, 0,45 µm, 25 mm (Durapore
);
• membrana para filtração HAWP, 0,45 µm, 47 mm (Durapore
);
• pele de suíno (Dália-Consuelo, Brasil);
• sílica gel 60 Merck, 0,063-0,2 mm (Merck
®
);
• cromatoplaca de alumínio com sílica gel 60 F
254
- 20x20 cm (Merck
®
).
4.4 Métodos
4.4.1 Isolamento da 3-O-metilquercetina
O isolamento da substância de referência, a partir de extrato seco de
Achyrocline satureioides (Lam.) D.C. (Patente INPI PI 0103468-5, BASSANI et al.,
2001) foi realizado por meio de cromatografia em coluna. Para cada coluna, utilizou-
se empacotamento constituído de 50 g de sílica gel 60 Merck (0,063-0,2 mm)
dispersa em 50 mL de clorofórmio, sendo esta empacotada e deixada em repouso
por 24 horas.
Um grama de extrato seco de Achyrocline satureioides foi submetido à
extração, em agitador magnético, em erlenmeyer de tampa esmerilhada, com 200
mL de acetato de etila, por 2 horas em temperatura ambiente. A suspensão
resultante foi filtrada e levada a resíduo, em rotavapor, sob pressão reduzida (com
temperatura inferior a 60 ºC). A amostra foi dissolvida em metanol e então aplicada
uniformemente no topo da coluna de sílica. A eluição foi realizada,
subseqüentemente, com 50 mL de clorofórmio, 150 mL de solução
clorofórmio:metanol (98:2) e 200 mL de solução clorofórmio:metanol (95:5),
33
adicionados de forma sucessiva. Foram coletadas alíquotas de 10 mL da fração
clorofórmio:metanol (95:5) em frascos âmbar, com velocidade de gotejamento de
aproximadamente 30 gotas por minuto. Para identificar as alíquotas contendo 3-
OMQ, procedeu-se, preliminarmente, análise cromatográfica em camada delgada
(clorofórmio:metanol 90:10 como eluente, em cromatoplaca de alumínio com sílica
gel 60 F
254
- 20x20 cm). O grau de pureza da substância foi, em seguida, analisado
por cromatografia líquida de alta eficiência.
4.4.2 Caracterização da 3-O-metilquercetina
A caracterização da 3-OMQ isolada foi realizada por espectroscopia no
infravermelho e no ultravioleta, ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN
de
1
H) e por cromatografia líquida de alta eficiência comparada à substância de
referência de pureza conhecida, igualmente isolada. Também foi determinado o seu
coeficiente de partilha O/A.
4.4.2.1 Espectroscopia no Infravermelho (IV)
Os espectros de infravermelho da 3-OMQ foram obtidos após o preparo de
pastilhas de brometo de potássio e 3-OMQ, esta na concentração de 1 %. Para tal,
foram utilizados aproximadamente 1,5 mg de 3-OMQ e 150 mg de KBr, previamente
dessecados e triturados em gral de ágata. A análise foi realizada em aparelho FTIR-
8101, Shimadzu.
4.4.2.2 Ressonância Magnética Nuclear
Os experimentos de ressonância magnética nuclear foram realizados no
espectrômetro Bruker DRX400 – Avance, na freqüência de 400 MHz para o núcleo
de hidrogênio; equipado com: unidade controladora de temperatura BVT3000 digital,
sonda dual
∅
5mm – BB, detecção direta
13
C/
1
H, sonda multinuclear
∅
5mm, detecção
inversa z-grad, tendo DMSO-d
6
como solvente e TMS como referência interna (
δ
0,0), pertencente ao Departamento de Química/ICEx - UFMG.
34
Foram realizados experimentos uni- e bidimensionais (homo e heteronuclear)
para a atribuição dos sinais de ressonância. Os experimentos foram realizados sob
controle de temperatura, a 27 ºC (300 K). Experimentos de detecção direta em RMN
de
1
H foram realizados sob condições padrões de acordo com a biblioteca do
equipamento, assim como os experimentos bidimensionais COSY, HSQC [
1
J(C, H)]
e HMBC [
n
J (C, H), n= 2, 3 e 4] (DEROME, 1987; BRAUN et al., 1988; CLARIDGE,
1999; WERNER, 2001).
4.4.2.3 Espectroscopia no Ultravioleta (UV)
Foi realizada varredura em espectrofotômetro na região do ultravioleta de uma
solução metanólica de 3-OMQ na concentração de 50 µg/mL. O espectro foi
analisado quanto aos picos de absorção máxima, proporcionando a seleção de
comprimento de onda para posterior análise em aparelho de cromatografia líquida
de alta eficiência.
4.4.2.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Para fins de identificação da 3-OMQ isolada, as frações foram analisadas por
cromatografia líquida de alta eficiência, segundo método desenvolvido por DE
SOUZA (2002) para doseamento de quercetina, luteolina e 3-OMQ, em extratos de
Achyrocline satureioides. A 3-OMQ apresentou tempo de retenção de 30 minutos.
Por meio de comparação dos cromatogramas com os obtidos por DE SOUZA, foi
determinado o tempo de retenção da substância isolada, sendo posteriormente
desenvolvido e validado o método para quantificação da mesma nos testes de
permeação.
4.4.3 Validação do método analítico para a quantificação de 3-OMQ
Para a quantificação da 3-OMQ nas alíquotas e posteriormente nos testes de
permeação, foi desenvolvido e validado um método utilizando CLAE, cujas
condições cromatográficas foram coluna em fase reversa Shimadzu Shimpack CLC-
ODS (M) RP-18, 5 µm (250 mm x 4 mm d.i.) com pré-coluna Lichrosorb RP-18 (10
µm); sistema de eluição isocrático constituído de fase móvel metanol:água (70:30)
35
acidificada com ácido trifluoracético 0,1 %, filtrada em membrana de
politetrafluoretileno (0,45 µm) e desaerada com gás hélio; fluxo de 0,8 mL/min;
injeção de 50 µL de amostra e detecção no ultravioleta em 354 nm com
sensibilidade de 0,05 AUFS, em temperatura ambiente (23 ± 1 ºC). Os parâmetros
utilizados para a validação do método analítico foram os estabelecidos pelo ICH
(2005) e pela ANVISA (Resolução nº 899, 2003): linearidade, precisão (repetibilidade
e intermediária), exatidão, especificidade e os limites de detecção e quantificação.
Linearidade
Foram analisadas três curvas da substância de referência (3-OMQ pureza 99
% por CLAE em 354 nm), a partir de soluções metanólicas nas concentrações de
0,05; 0,15; 0,30; 0,60; 0,90 e 1,50 µg/mL. Cada ponto foi injetado em triplicata,
sendo o resultado expresso como a média das três determinações. Foram
determinados a equação da reta e o coeficiente de regressão linear. Os dados foram
analisados estatisticamente por meio de análise de variância (ANOVA), com um
nível de significância de 95 % (p < 0,05).
Precisão
Os ensaios para determinar a precisão do método foram realizados intra-dia
(repetibilidade) e inter-dia (precisão intermediária). Para análise intra-dia, o ponto de
concentração 0,6 µg/mL de 3-OMQ foi injetado nove vezes, determinando-se o seu
coeficiente de variação (CV%). Para determinar a precisão intermediária, foram
analisadas curvas médias obtidas em três dias consecutivos. Cada ponto foi
analisado em triplicata e o resultado expresso por meio da média de três
determinações. A análise do coeficiente de variação foi realizada para cada ponto.
Exatidão
A exatidão de um método se dá pela recuperação de quantidades de padrão
adicionadas a uma solução de concentração conhecida. Foram utilizadas duas
soluções de mesma concentração (1,5 µg/mL): uma amostra e uma padrão. Cada
36
solução-referência (SR) foi preparada em balão volumétrico de 10 mL, sendo este o
volume final.
Tabela 1 - Protocolo para ensaio de exatidão na determinação da 3-OMQ por CLAE.
Solução
Solução Amostra Solução Padrão
Volume
(mL)
Conc.
3-OMQ
(µg/mL)
3-OMQ na
alíquota
(µg)
Volume
adicionado
(mL)
3-OMQ
adicionada
(µg)
Conc.
teórica
final*
(µg/mL)
SR 1 2,0 1,5 3,0 2,0 3,0 0,6
SR 2 2,0 1,5 3,0 4,0 6,0 0,9
SR 3 2,0 1,5 3,0 8,0 12,0 1,5
*O volume de todas as soluções (SR1, SR2 e SR3) foram completados a 10,0 mL.
Para fins de aplicação aos ensaios de permeação da 3-OMQ, a exatidão
também foi determinada utilizando-se extrato de pele de orelha suína. Após 8 horas
de cinética de permeação, sem aplicação de amostra, a pele foi retirada da célula de
Franz e reduzida a fragmentos de, aproximadamente, 2 mm
2
e submetida a
homogeneizador de tecidos de vidro sinterizado. Foram realizadas 3 extrações,
constituídas de adição de alíquotas de 2 mL de etanol 50 %, 5 minutos de trituração
em homogeneizador e 10 minutos em banho de ultrasom para cada extração.
Detalhes do processo estão descritos nos procedimentos de permeação neste
mesmo capítulo.
Tabela 2 - Protocolo para ensaio de exatidão em extrato de pele suína.
Solução S1 S2 S3
Branco 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL
SR de 3-OMQ adicionada (1,5 µg/mL) 1,0 mL 3,0 mL 6,0 mL
Volume final 3,0 mL 5,0 mL 8,0 mL
Concentração teórica final de 3-OMQ 0,5 µg/mL 0,9 µg/mL
1,1 µg/mL
Especificidade
O ensaio de especificidade foi realizado para detectar possíveis interferências
na quantificação da 3-OMQ, ocasionadas pelos demais componentes da formulação
37
como
β
CD e HPMC, além dos constituintes extraídos da pele de orelha de suíno.
Foram injetadas soluções etanólicas contendo
β
CD (1,07 mg/mL), HPMC (30
mg/mL) e extrato de pele para observação dos respectivos cromatogramas,
especialmente de ausência de picos interferentes no tempo de retenção da 3-OMQ.
Limite de Detecção
O limite de detecção de 3-OMQ pelo método foi calculado dividindo-se o desvio
padrão do intercepto com o eixo do Y de 3 curvas médias, pela inclinação da curva
média, multiplicando-se este valor por 3,3.
Limite de Quantificação
O limite para quantificação de 3-OMQ pelo método proposto foi calculado
dividindo-se o desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de 3 curvas médias pela
inclinação da curva média, multiplicando-se este valor por 10.
4.4.4 Determinação do coeficiente de partição octanol/água
Para determinar o coeficiente de partição octanol/água da 3-OMQ,
primeiramente foi realizada a saturação dos dois solventes (mistura de 2 mL de água
e 2 mL de n-octanol em frasco âmbar com tampa) em agitador magnético durante 24
horas, com o objetivo de estabelecer equilíbrio entre as fases imiscíveis. Num
segundo momento, retirou-se uma alíquota de 0,5 mL de cada fase, acrescentando-
as um excesso de 3-OMQ (aproximadamente 4 mg) para saturação das duas fases,
mantendo-se a agitação por mais 12 horas em temperatura ambiente (25 ± 1 ºC).
Por fim, foi realizada centrifugação a 10000 rpm por 15 minutos para a separação
das fases, sendo retirada uma alíquota de 0,1 mL de cada fase, a qual foi
posteriormente diluída em metanol. A concentração de 3-OMQ foi analisada por
CLAE e o resultado foi obtido pela média de 3 determinações para cada fase.
O coeficiente de partição foi então calculado e expresso na forma de logaritmo
do quociente entre a concentração de saturação de 3-OMQ (µg/mL) nas fases
octanólica e aquosa, respectivamente.
38
4.4.5 Estudo de solubilidade da associação 3-OMQ/
β
ββ
β
CD
O diagrama de solubilidade foi construído segundo HIGUCHI e CONNORS
(1965), em que quantidades de 3-OMQ em excesso foram adicionadas a 3 mL de
dispersões aquosas contendo concentrações crescentes de
β
CD. Proporções
molares de uma parte de 3-OMQ para zero, 1, 2 e 3 partes de
β
CD foram
empregadas (Tabela 3). Após agitação a 37 ± 1 ºC durante 24 horas, cada mistura
foi filtrada em membrana hidrofílica (Millipore HAWP, 0,45 µm, 25 mm) para balões
de 5,0 mL, cujos volumes foram completados com água. Destes balões retirou-se
alíquotas de 300 µL as quais foram diluídas a 20,0 mL, com metanol, e o teor de 3-
OMQ foi analisado por CLAE. O resultado foi expresso pela média de três
determinações para cada solução metanólica.
Tabela 3 - Proporções molares empregadas de 3-OMQ e
β
CD.
Proporção 3-OMQ:
β
ββ
β
CD
1:0 1:1 1:2 1:3
Massa 3-OMQ (mg) 1,52 1,5 1,51 1,5
Massa
β
CD (mg)
0 5,388 10,775 16,163
Concentração 3-OMQ (mM) 0,96 0,95 0,96 0,95
Concentração
β
CD (mM)
0 0,95 1,90 2,85
Volume da solução final (mL)
5,0 5,0 5,0 5,0
4.4.6 Preparação do complexo 3-OMQ:
β
ββ
β
CD em meio líquido
De acordo com o incremento de solubilidade obtido e a viabilidade tecnológica,
foram preparados complexos na proporção molar de 1:1. A dispersão aquosa foi
filtrada e o sobrenadante foi então liofilizado, sendo a secagem realizada nas
condições de -60 °C e aproximadamente 2 x 10
-1
torr.
4.4.7 Preparação da simples mistura entre 3-OMQ e
β
ββ
β
CD
Esta associação foi obtida pela simples mistura dos dois componentes, na
proporção equivalente à utilizada para a preparação do complexo, em gral de vidro,
por 10 minutos.
39
4.4.8 Caracterização do complexo 3-OMQ:
β
ββ
β
CD
A caracterização do complexo foi realizada por espectrometria no infravermelho
de quatro amostras (
β
CD isolada, 3-OMQ, simples mistura entre 3-OMQ/
β
CD e
complexo 3-OMQ:
β
CD) e por ressonância magnética nuclear da 3-OMQ,
β
CD e
complexo.
4.4.8.1 Espectro no infravermelho (IV)
Os espectros no infravermelho das amostras foram obtidos em pastilhas de
KBr (1,5 mg de amostra e 150 mg de KBr previamente dessecado) numa faixa de
freqüência entre 400 e 4000 cm
-1
e resolução de 4 cm
-1
.
4.4.8.2 Espectro de ressonância magnética nuclear (RMN de
1
H)
Os espectros de RMN de
1
H foram realizados com solução de,
aproximadamente, 10 mg de cada amostra em dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-
d
6
) segundo o item 4.4.2.2. Para verificar a existência de interações espaciais entre
os hidrogênios pertencentes a ciclodextrina e suas moléculas hóspedes foram
realizados experimentos bidimensionais de efeito nuclear Overhauser (NOESY e/ou
ROESY). O tempo de mistura ideal para cada experimento foi calculado utilizando
uma seqüência de pulsos baseada em um experimento de inversão-recuperação, de
modo a evitar o aparecimento de manchas de correlação como resultado de difusão
de spins e maximizar o efeito NOE. As análises foram realizadas a partir de soluções
saturadas dos analitos (3-OMQ,
β
CD e complexo) dissolvidos em DMSO-d
6
.
(DEROME, 1987; BRAUN et al., 1988; CLARIDGE, 1999; WERNER, 2001).
4.4.8.3 Modelagem Molecular
A modelagem molecular foi executada pelo software Chem3D Ultra (Versão
9.0, CambridgeSoft), utilizando-se o método empírico de Mecânica Molecular (MM2).
A simulação da complexação foi realizada com a inserção manual da 3-OMQ em
posição vertical, dentro da cavidade da
β
CD, através da borda de hidroxilas
40
secundárias ou primárias, e perpendicular ao diâmetro da mesma. Os cálculos de
dinâmica molecular foram realizados por MM2 a 300 Kelvin.
4.4.9 Incorporação da 3-OMQ e
β
ββ
β
CD associadas em gel hidrofílico
A 3-OMQ, na forma livre ou na forma associada com
β
CD (simples mistura e
complexada), foi incorporada em gel de HPMC, de acordo com a composição
qualitativa e quantitativa que segue:
Tabela 4 - Composição do hidrogel contendo 3-O-metilquercetina.
COMPONENTE QUANTIDADE
Methocel
F4M
3,0 %
3-O-metilquercetina 0,17 %
Água deionizada qsp 100,0 g
Para a preparação de 10 g do gel, 300 mg de Methocel
F4M foram triturados
em gral de porcelana com movimentos em espiral. Adicionou-se 9,7 mL de água
destilada, aos poucos, sob constantes e lentos movimentos ascendentes e
descendentes em espiral, para evitar a formação de bolhas e grumos. A 3-OMQ
isolada ou associada com
β
CD foi previamente solubilizada em quantidade suficiente
de etanol e, então, incorporada ao gel pela mistura com espátula. Na preparação de
10 g de gel utilizou-se 78 mg de 3-OMQ/
β
CD ou 3-OMQ:
β
CD, correspondendo a 17
mg de 3-OMQ.
4.4.10 Estudo de penetração cutânea
O estudo do perfil de penetração cutânea ex vivo da 3-OMQ, a partir das
formulações preparadas, foi realizado em células de difusão tipo Franz, com área de
interface correspondente a 2,54 cm
2
e volume interno de aproximadamente 10 mL.
Foi utilizada pele de orelha de suíno como modelo de membrana, obedecendo às
normas para experimentação animal (GOLDIM, 1995; CORNÉLIO, 2003, WEBBER,
2003).
41
Após o início da cinética de permeação cutânea, foi realizada a retirada de
alíquotas do meio receptor nos intervalos 1, 2, 3, 4, 6 e 8 horas, com posterior
análise e quantificação de 3-OMQ por CLAE. Os parâmetros de permeação cutânea
determinados foram: fluxo cutâneo, tempo de latência e quantidade total permeada
em 8 horas.
4.4.10.1 Preparação das membranas para difusão
Foram utilizadas orelhas de porco selecionadas e desprovidas de pêlos e
danificações teciduais, as quais foram armazenadas em temperatura de
aproximadamente -20 ºC e, lentamente descongeladas em temperatura ambiente no
momento antecedente do experimento. Depois de descongeladas, as orelhas foram
higienizadas com água corrente, com posterior secagem com papel absorvente.
Com um bisturi, a pele da parte posterior da orelha foi destacada da cartilagem e,
com auxílio de uma pinça, foram removidos restos de vasos sangüíneos e gorduras
excedentes a fim de se obter uma melhor homogeneidade na espessura da pele (em
torno de 2 mm). Cortes circulares da pele suína foram colados na célula de Franz,
com auxílio de cola acrílica, na borda contígua à fase aceptora. Estas peles foram
utilizadas como interface entre o meio doador e o meio aceptor da célula de Franz,
sendo que a face interna da pele ficou voltada para o interior da célula. Depois de
montadas as células, as peles das células foram hidratadas com tampão fosfato pH
7,4, durante 12 horas sob refrigeração.
Antes do início da cinética de permeação, o meio aceptor foi substituído por
uma solução hidroetanólica 50 % (v/v). As células foram mantidas sob agitação com
barra magnética em banho termostatizado em temperatura de 37 ± 1 ºC, durante
todo o período do experimento (8 horas).
42
Figura 3. Etapas do procedimento de preparo das células de Franz para ensaio de
permeação. (a) corte da parte posterior da orelha de suíno; (b) seleção
das partes mais adequadas e homogêneas; (c) célula de Franz; (d)
colocação em banho termostatizado sob agitação; (e) posicionamento das
células de Franz em banho termostatizado; (f) coleta do meio aceptor por
meio de catéter.
4.4.10.2 Cinética de permeação
No estudo de permeação cutânea da simples mistura 3-OMQ/
β
CD, dissolveu-
se 27,6 mg desta em 1,2 mL de acetona, aplicando-se 200 µL no meio doador de
cada célula de difusão, totalizando 1 mg de 3-OMQ por célula. Para o complexo
procedeu-se da mesma forma, utilizando-se seis células de Franz para a mistura e
seis células para o complexo.
Para avaliar a permeação da 3-OMQ associada ou não à
β
CD a partir da base
de HPMC, pesou-se individualmente para cada célula 600 mg de gel contendo o
flavonóide isolado ou as associações, correspondendo a 0,17 % de 3-OMQ. O gel foi
uniformemente espalhado na superfície da pele com o auxílio de uma espátula.
Cada célula teve um total de 1 mg de 3-OMQ aplicado. Para cada formulação, seis
células de difusão foram preparadas e testadas simultaneamente.
43
Foram retiradas alíquotas de 3,0 mL da fase aceptora nos intervalos de tempo
pré-determinados, com reposição do meio (etanol 50 %, v/v) a cada coleta. Tais
alíquotas foram filtradas e quantificadas por CLAE, sendo a quantidade de 3-OMQ
permeada por área (µg/cm
2
) calculada. A determinação do fluxo (µg.cm
-2
.h
-1
) de
permeação (calculado pela inclinação da porção linear da reta) e do tempo de
latência (h) da difusão (intersecção com eixo das abscissas) foi realizada
graficamente, plotando-se a quantidade de 3-OMQ permeada por área de pele em
função do tempo.
4.4.10.3 Quantificação da 3-OMQ remanescente na pele após permeação
Para quantificar a 3-OMQ que ficou retida na pele, após o término do ensaio de
permeação, primeiramente, retirou-se a pele das células com posterior remoção de
amostra excedente em sua superfície (meio doador). Os discos de pele foram então
pesados e cortados com bisturi até atingirem fragmentos de tamanho próximo a 2
mm
2
, a fim de se obter uma maior superfície de contato. Os pequenos fragmentos de
pele foram submetidos a homogeneizador de tecidos de vidro sinterizado, onde
receberam uma alíquota de 2,0 mL de etanol 50 % (v/v). A extração foi feita durante
5 minutos de trituração e, em seguida, 10 minutos em banho de ultrasom. O
sobrenadante desta alíquota foi então transferido para um balão de 10,0 mL e o
processo foi repetido por mais duas vezes. Após três extrações, o balão teve o seu
volume completado com etanol 50 % (v/v). Esta suspensão (extrato de pele) foi
primeiramente filtrada para um béquer por membrana hidrofílica (Millipore HAWP,
0,45 m, 25 mm) e, em seguida, filtrada novamente para um vial por membrana
hidrofílica (Millipore HVLP 0,45 m, 13 mm de diâmetro). Todo esse processo foi
repetido para todas as células de cada experimento, sendo o resultado obtido por
CLAE expresso pela média de três determinações para cada célula e seis
determinações para cada experimento.
44
45
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
46
47
5.1 Validação do método analítico
O método de quantificação de 3-OMQ por CLAE foi validado segundo os
parâmetros estabelecidos pelo ICH (2005) e ANVISA (RE n° 899, 2003), a fim de
comprovar sua adequação às análises propostas. O método desenvolvido difere do
apresentado por DE SOUZA (2002) e por FASOLO e colaboradores (2007) pois foi
analisada uma faixa de concentração de 0,05 µg/mL a 1,5 µg/mL, sendo o sistema
constituído de fase móvel metanol:água (70:30) acidificada com ácido trifluoracético
(TFA) 0,1 %; fluxo de 0,8 mL/min; injeção de 50 µL de amostra e detecção em 354
nm.
Primeiramente, foi feita análise do espectro de absorção de uma solução
metanólica da 3-OMQ no UV (200 – 400 nm) (Figura 4). A partir deste espectro, foi
selecionado o comprimento de onda de 354 nm para detecção da 3-OMQ nas
análises por CLAE. Tal escolha justificou-se pela ocorrência de um número menor
de interferências neste comprimento de onda, além de corresponder a um dos picos
máximos apresentados pelo espectro. Neste caso, não se optou pelo comprimento
de onda geral de absorção dos flavonóides (362 nm), como relatado por DE SOUZA
(2002), que analisou, simultaneamente, diversos flavonóides de Achyrocline
satureioides.
Figura 4. Espectro de absorção da 3-O-metilquercetina no ultravioleta e visível.
48
Observando-se os cromatogramas obtidos nas análises por CLAE (Figura 5),
constata-se que a 3-OMQ apresenta tempo de retenção em torno de 7 ± 0,1
minutos. O pico formado apresentou-se estreito e com área reprodutível.
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
2000
4000
6000
8000
Área (mV.s
-1
)
Tempo (min)
Figura 5. Perfil cromatográfico da 3-O-metilquercetina obtido por cromatografia
líquida de alta eficiência. Fase móvel: metanol:água (70:30) com ácido
trifluoracético 0,1 %, fluxo 0,8 mL/min, detecção em 354 nm.
Linearidade
A linearidade representa a capacidade do método em produzir respostas de
áreas dos picos diretamente proporcionais à concentração do analito presente na
amostra. Para tanto, foram analisadas três curvas diárias repetidas por três dias. A
área média destas curvas foi plotada em função das concentrações (Figura 6),
obtendo-se uma curva padrão média, a partir da qual foi determinada a equação da
reta e o coeficiente de regressão linear.
49
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
Concentração (
µ
g/mL)
y = 86172x - 2106,6
R
2
= 0,9991
Área do pico (mV.s
-1
)
Figura 6. Curva padrão da 3-O-metilquercetina obtida por CLAE. Coeficiente de
regressão linear (r
2
) = 0,9991; y = 86172x – 2106,6 (y = área do pico e x =
concentração de 3-O-metilquercetina em µg/mL).
A avaliação estatística dos valores obtidos na curva padrão foi realizada por
análise de variância (ANOVA). Os resultados obtidos demonstraram que a
linearidade é estatisticamente válida, pois a curva apresentou regressão linear
significativa (p<0,05), com valor de F
calculado
de 7,467 e F
crítico
igual a 5,318. Em
suma, o método apresentou linearidade de resposta na faixa de 0,05 µg/mL a 1,5
µg/mL.
Precisão
O método proposto apresentou resultados satisfatórios tanto para a
repetibilidade (precisão intra-dia) quanto para a precisão intermediária (precisão
inter-dia), tendo em vista que os valores de DPR (desvio padrão relativo) são
inferiores a 2 %, o que é aceitável numa análise quantitativa.
50
Tabela 5 - Precisão inter-dia para a análise de 3-O-metilquercetina por CLAE.
Concentração (µg/mL) Área média do pico (mV.s
-1
)
DP CV %
0,05 3648 18,930 0,52
0,15 11778 103,241 0,88
0,3 22807 196,945 0,86
0,6 47873 827,718 1,73
0,9 74261 961,053 1,29
1,5 128598 1299,012 1,01
DP = desvio padrão; CV % = coeficiente de variação.
Tabela 6 - Repetibilidade (precisão intra-dia) para a análise de 3-O-metilquercetina
por CLAE.
Concentração
0,6 µg/mL
Área média (mV.s
-1
) 48462,6
DP 808,12
CV % 1,67
DP = desvio padrão; CV % = coeficiente de variação.
Exatidão
A exatidão do método foi medida em termos de porcentagem recuperada de
quantidades conhecidas da substância de referência adicionadas à amostra. A
tabela 7 apresenta as taxas de recuperação obtidas, situando-se estas dentro da
faixa de ± 5 % de variação.
Tabela 7 - Exatidão da análise de 3-O-metilquercetina por CLAE.
Solução
Concentração teórica
Área média DP CV (%) Recuperação (%)
S1
0,9 µg/mL
71590 357 0,50 104,52
S2
1,2 µg/mL
94503 171 0,18 103,71
S3
1,5 µg/mL
113567 253 0,22 100,72
DP = desvio padrão; CV % = coeficiente de variação.
51
A tabela 8 apresenta taxa de recuperação de 3-OMQ em presença dos
componentes extraídos da pele suína. Os resultados obtidos demonstram uma
recuperação dentro dos limites aceitáveis de variação, indicando que não há
interferência do extrato de pele na quantificação de 3-OMQ.
Tabela 8 - Exatidão da análise de 3-OMQ em extrato de pele suína por CLAE.
Solução Área Média
DP CV (%) Recuperação (%)
S1 (0,5 µg/mL)
40516 237,451 0,59 97,54
S2 (0,9 µg/mL)
71786 98,460 0,14 96,01
S3 (1,13 µg/mL)
93243 311,176 0,33 99,77
DP = desvio padrão; CV % = coeficiente de variação.
Especificidade
A análise do perfil cromatográfico dos possíveis interferentes para a
determinação da 3-OMQ, demonstrou que não observa-se picos nas proximidades
do tempo de retenção da 3-OMQ (7 minutos), sugerindo que as substâncias
utilizadas concomitantemente no experimento ex vivo e formulações, não interferem
na sua quantificação. HPMC e
β
CD apresentaram uma linha sem picos.
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Área (mV.s
-1
)
Tempo (min)
.
Figura 7. Cromatograma do extrato de pele suína na ausência de 3-OMQ (354 nm).
52
Limite de detecção
O limite de detecção é definido como a menor concentração absoluta do analito
na amostra que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada sob as
condições de análise determinadas. A menor concentração da 3-OMQ detectável
pelo método desenvolvido neste trabalho foi 0,0058 µg/mL.
Limite de quantificação
O limite de quantificação corresponde à concentração mais baixa do analito na
amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis, sendo que a
concentração mínima de 3-OMQ quantificável pelo método proposto foi 0,0177
µg/mL. Esse valor mostra-se adequado para análise quantitativa da 3-OMQ nos
experimentos desenvolvidos, portanto, com sensibilidade adequada para fluidos
diluídos como os analisados em ensaios de permeação cutânea.
5.2 Associação da 3-O-metilquercetina com
β
ββ
β
-ciclodextrina
5.2.1 Diagrama de solubilidade
A representação gráfica do Diagrama de Solubilidade visualizada na figura 8
apresenta uma curva do tipo A
P
, pois pode-se observar um desvio positivo no
aumento da solubilidade. Este tipo de curva é indicativo da formação de complexos
solúveis entre 3-OMQ e CD, aumentando a quantidade total do flavonóide em
solução. Isto reflete a formação de complexos de maior ordem molecular, sendo que
na medida em que a concentração de ciclodextrina é aumentada, mais do que uma
molécula de
β
CD pode ser complexada com cada molécula de 3-OMQ. Para a
confirmação deste fenômeno, seria necessária a realização de análise por RMN
1
H
para as proporções 1:2 e 1:3. Foi observado um incremento na hidrossolubilidade da
3-OMQ de até 2,45 vezes em relação à ausência de CD, sendo este alcançado
com a proporção de 1:3.
53
Tabela 9 - Incrementos de solubilidade da 3-OMQ observados em função da
proporção molar de
β
CD.
Proporção molar
(3-OMQ:
β
ββ
β
-CD)
Concentração de 3-OMQ (µ
µµ
µg/mL)
na solução
Incremento de
Solubilidade
1:0 39,148 -
1:1 43,592 1,114
1:2 55,842 1,426
1:3 96,896 2,475
Figura 8. Diagrama de solubilidade da 3-OMQ associada à
β
CD.
5.2.2 Espectroscopia na região do infravermelho
Os espectros no infravermelho da 3-OMQ, da
β
CD, simples mistura (3-
OMQ/
β
CD) e complexo (3-OMQ:
β
CD) estão apresentados, respectivamente, nas
figuras 9, 10, 11 e 12. No espectro da 3-OMQ podem ser observadas, na região
entre 4000 e 3000 cm
–1
, uma banda característica de hidroxila fenólica (3400 cm
–1
)
e outra banda de anel aromático (3250 cm
–1
). Também são observados um sinal em
1630 cm
–1
, que sugere a presença de uma carbonila em ponte na molécula, e um
54
sinal em 1250 cm
-1
, indicando a ligação do heteroátomo (O-C). O que mais
caracteriza a substância é a presença de um sinal em 2850 cm
-1
, indicando a
presença do grupamento metoxila.
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
760
780
800
820
840
860
880
900
920
940
Figura 9. Espectro no infravermelho da 3-OMQ.
O espectro da
β
CD (Figura 10) apresenta uma banda larga entre 3800 e 3200
cm
–1
e um pico na região de 2800 cm
–1
, que caracteriza um estiramento C-H
próprio de açúcares. O grupo complexo de picos entre 1000 e 1300 cm
–1
caracterizam o estiramento C-O de éter e de OH. O pico duplo por volta de 900 cm
–1
também é um pico característico de açúcares.
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
700
750
800
850
900
950
1000
Figura 10. Espectro no infravermelho da
β
CD.
55
No espectro da mistura 3-OMQ/
β
CD (Figura 11) pode-se observar grande
similaridade com o espectro da
β
CD. Esta observação era esperada uma vez que a
quantidade de 3-OMQ presente na mistura é bastante reduzida em relação à
quantidade de ciclodextrina nestas dispersões. No entanto, pode ser observado que
o sinal característico da mistura em 2850 cm
-1
ainda está presente, indicando a
expressão da presença do grupamento metoxila da 3-OMQ e a ausência de
interação com a cavida da
β
CD.
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
Figura 11. Espectro no infravermelho da mistura 3-OMQ/
β
CD.
O espectro do complexo pode ser considerado como a combinação do
espectro da
β
CD com o espectro da 3-OMQ. Na região entre 1700 a 500 cm
-1
pode-
se observar uma modificação mais pronunciada nos formatos e intensidades dos
picos, podendo este fato estar relacionado com a interação do anel aromático orto-
substituído com o interior da cavidade da
β
CD. Muito embora a análise no IV não
seja suficiente para inferir se há inclusão da molécula hóspede na cavidade, ela
serve como análise auxiliar na detecção de interações entre estas. O sinal em 2850
56
cm
-1
apresentado pelos espectros de 3-OMQ e mistura, não foi detectado para o
complexo, indicando a ocorrência de interação nesta parte da molécula com a
β
CD.
Figura 12. Espectro no infravermelho do complexo 3-OMQ:
β
CD.
5.2.3 Ressonância Magnética Nuclear (RMN de
1
H) e Modelagem Molecular
A análise por RMN de
1
H da 3-OMQ isolada foi realizado com a finalidade de
se obter a confirmação de estrutura molecular deste flavonóide, bem como o
indicativo de pureza da amostra. Nos espectros de ressonância, podem ser
observados deslocamentos químicos característicos que permitiram a atribuição de
todos os sinais da 3-OMQ, cujos dados estão apresentados na tabela 10.
57
Tabela 10 – Atribuições e deslocamentos químicos de RMN de
1
H da 3-OMQ e da
β
CD (DMSO-d
6
, 400 MHz)
3-O-metilquercetina
β
-ciclodextrina
O
H
HO
H
HO
H
OH
OH
H
H
OH
1
2
3
4
5
6
7
Hidrogênio
δ
(ppm) e J (Hz)
Hidrogênio
δ
(ppm)
H-2’ 7,57 (d, 2,02) H-1 4,83 (d)
H-5’ 6,93 (d, 8,59) H-2 3,28-3,30 (m)
H-6’ 7,47 (dd, 8,59 e 2,02) H-3 3,61-3,67 (m)
H-6 6,22 (d, 2,02) H-4 3,32-3,38 (m)
H-8 6,43 (d, 2,02) H-5 3,55-3,61 (m)
O-CH
3
3,80 (s) H-6 3,61-3,67 (m)
As Figuras 13 e 14 apresentam, respectivamente, os espectros de ressonância
magnética de hidrogênio da 3-OMQ e da
β
CD obtidos em DMSO-d
6
a 400 MHz.
Figura 13. Espectro de RMN de
1
H da 3-OMQ (400 MHz, DMSO-d
6
).
58
Figura 14. Espectro de RMN de
1
H da
β
CD (400 MHz, DMSO-d
6
).
As figuras 15 e 16 apresentam, respectivamente, o espectro de ressonância
magnética de hidrogênio e o mapa de contornos NOESY do complexo.
Figura 15. Espectro de RMN de
1
H do complexo 3-OMQ:
β
CD (400 MHz, DMSO-d
6
).
59
Figura 16. Mapa de contornos NOESY do complexo 3-OMQ:
β
CD (tempo de mistura
600 ms, 400 MHz, DMSO-d
6
).
Comparando-se o espectro da 3-OMQ (Figura 13) com o do complexo (Figura
14), observa-se uma variação nos deslocamentos químicos dos sinais de
ressonância atribuídos aos hidrogênios H-2' (
δ
7,54), H-5' (
δ
6,91) e H-6' (
δ
7,45) do
anel B do flavonóide. A variação nos deslocamentos químicos dos sinais de
hidrogênio induzidos pela complexação do tipo hóspede-hospedeiro é uma
característica importante na avaliação da formação do composto de inclusão. Logo,
essa análise pode dar as primeiras indicações do processo de inclusão, fornecendo
informações a respeito de posições ou sítios de complexação. O uso do RMN tem
contribuído significativamente no estudo de ciclodextrinas e seus compostos de
inclusão, fornecendo informações sobre interações e modos de ligação nas
associações e complexações, além de disposições espaciais de grupos funcionais
destas moléculas e/ou complexos (LOFTSSON et al., 1993; SCHNEIDER et al.,
1998).
60
O fenômeno de complexação altera a distribuição de densidade de carga sobre
os grupos funcionais envolvidos e, conseqüentemente, altera o momento magnético
nuclear resultante sobre estes grupos, levando a variações de deslocamento
químico nos espectros dos compostos de inclusão em relação às moléculas livres.
Entretanto, os efeitos de deslocamentos químicos, após a inclusão na cavidade da
ciclodextrina, são limitados a poucos décimos de ppm, visto que nos complexos
formados ocorrem apenas interações intermoleculares fracas do tipo interações
dipolares, que não alteram consideravelmente a polaridade dos complexos finais.
Os deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio localizados no interior
da
β
CD (H-3 e H-5) (Figura 14) tornaram-se blindados, apresentando deslocamentos
para um campo externo de maior energia (deslocamento gráfico para ppm menor)
na presença da 3-OMQ. Os átomos de hidrogênio da superfície externa da
β
CD (H-
1, H-2, H-4 e H-6) não foram afetados ou sofreram um deslocamento insignificante
devido a complexação. No mapa de contornos NOESY do complexo (tempo de
mistura 600 ms, 400 MHz, DMSO-d
6
) (Figura 16) podem ser observadas correlações
indicativas de acoplamento dipolar entre os hidrogênios do anel B da 3-OMQ com os
hidrogênios H-3 e H-5 da cavidade da
β
CD, somente justificáveis pela formação do
composto de inclusão 3-OMQ:
β
CD.
A figura 17 apresenta a estrutura conformacional de menor energia do
flavonóide, obtida pelo método empírico de Mecânica Molecular (MM2), com o
auxílio do software Chem3D Ultra (Versão 9.0, CambridgeSoft). Os átomos de
carbono da molécula estão representados pelas esferas em cinza, os de oxigênio
pelas esferas vermelhas e os hidrogênios pelas esferas brancas. Na tabela 10
também estão representados os deslocamentos químicos referentes à
β
CD, e na
figura 18 a sua conformação de menor energia, também obtida por MM2.
61
Figura 17. Estrutura tridimensional da 3-OMQ por MM2 (Chem3D Ultra, Versão 9.0).
Figura 18. Estrutura tridimensional da
β
CD por MM2 (Chem3D Ultra, Versão 9.0).
62
A simulação da complexação (por MM2) foi realizada com a inserção manual
da 3-OMQ em posição vertical, dentro da cavidade da
β
CD, através da borda de
hidroxilas secundárias (Figura 19) ou primárias (Figura 20), e perpendicular ao
diâmetro da mesma. Os cálculos de dinâmica molecular foram realizados por MM2 a
300 Kelvin. A inserção do flavonóide pela borda das hidroxilas secundárias foi mais
favorável do que pela borda das hidroxilas primárias. Esta orientação foi
conformacionada de acordo com características de energia, sendo que a energia
total para a inserção do anel B pela borda de hidroxilas secundárias foi menor
(Tabela 11). Em suma, os cálculos de termodinâmica sugerem que os dois
processos de complexação são entalpicamente favoráveis. Os resultados obtidos
por MM2 corroboram os obtidos por RMN bidimensional.
Figura 19. Simulação da complexação da 3-OMQ com
β
CD pela borda de OH
secundárias.
63
Figura 20. Simulação da complexação da 3-OMQ com
β
CD pela borda de OH
primárias.
Tabela 11 – Resultados de energia (kJ mol
-1
) da análise conformacional dos
complexos.
Borda OH secundárias Borda OH primárias
Estiramento
Dobramento
Estiramento-Dobramento
Torção
Van der Waals “não 1-4”
1
Van der Waals “1-4”
2
Dipolo/Dipolo
Total
10.2460
62.7997
5.3315
33.0960
-93.1549
97.7820
-25.3304
90.7698
10.6852
63.2711
5.4429
31.3828
-88.9635
97.4476
-26.7013
92.5647
1
A energia “não 1-4” de Van der Waals é a soma da energia das interações de Van der Waals para
dois átomos separados por mais de 3 ligações químicas.
2
A energia “1,4” de Van der Waals é a soma de energia de interações que ocorrem entre átomos
separados exatamente por 3 ligações químicas.
64
5.3 Determinação do coeficiente de partição octanol/água (log K
p
)
Valores de log P entre 2 e 3 indicam uma substância com um bom
comportamento de difusão através da pele. Foi encontrado para a 3-OMQ um log P
igual a 1,91, o que a caracteriza como uma molécula com características lipofílicas,
tendendo a formar reservatório no domínio lipídico do estrato córneo e derme.
Tabela 12 - Concentrações da 3-OMQ quantificadas nas fases aquosa e octanólica.
Fase aquosa (µ
µµ
µg/mL) Fase octanólica (µ
µµ
µg/mL)
log P
0,464 ± 0,007 38,479 ± 0,01 1,9186
P = coeficiente de partição.
5.4 Avaliação do perfil de penetração da 3-O-metilquercetina em pele de
orelha de suíno
As concentrações utilizadas para os ensaios de permeação correspondem a
exatamente 1 mg de 3-OMQ por célula de difusão, independente do ensaio, pois o
objetivo foi comparar os perfis de permeação da 3-OMQ isolada e em diferentes
associações. A tabela 13 apresenta os resultados obtidos em relação ao fluxo,
tempo de latência e quantidade permeada para as formulações testadas, após 8
horas.
Tabela 13 – Permeação de 3-O-metilquercetina em pele de orelha de suíno: fluxo,
tempo de latência e quantidade permeada, após 8 horas.
Fluxo Tempo de
(µg.cm
-2
.h
-1
) latência (h)
Quantidade permeada
após 8 h (µ
µµ
µg/cm
2
)
3-OMQ 0,054 ± 0,005 0,344 ± 0,210
0,442 ± 0,023
3-OMQ em gel 1,251 ± 0,004 2,062 ± 0,021
8,080 ± 0,057
Mistura 0,755 ± 0,006 0,054 ± 0,030
6,010 ± 0,069
Mistura em gel 2,116 ± 0,016 1,689 ± 0,023
13,378 ± 0,140
Complexo 4,502 ± 0,025 0,723 ± 0,013
31,935 ± 0,251
Complexo em gel
1,262 ± 0,012 2,236 ± 0,049
7,321 ± 0,124
65
Um aspecto geral a ser considerado é a diferença dos tempos de latência entre
a 3-OMQ, mistura e complexo, e o tempo destes nos géis correspondentes. Sendo o
tempo de latência o período necessário para alcançar o estado estacionário,
momento em que o fluxo ocorre em velocidade constante, foram observados tempos
superiores para os géis, indicando a necessidade do flavonóide de, primeiramente,
difundir através da matriz polimérica. Para a 3-OMQ em gel, a camada de gel
aplicada foi de aproximadamente 2 mm (600 mg de gel de HPMC 3 % com 0,17 %
de 3-OMQ), correspondendo a uma quantidade de 1 mg de 3-OMQ por célula. No
caso da permeação intrínseca da 3-OMQ, foi aplicado um volume de 200 µL de
amostra em solvente volátil (acetona) contendo 1 mg de 3-OMQ. A solução em
acetona, por evaporar totalmente, permite que todo o conteúdo de 3-OMQ presente
na solução fique rapidamente disponível sobre a pele. Além disso,
comparativamente ao complexo, o tempo de latência da 3-OMQ é menor, pois a
molécula não passa pela etapa de saída da cavidade da
β
CD, estando prontamente
apta a permear através da pele.
Quando a 3-OMQ incorporada em gel é aplicada, o volume da base é muito
maior e não sendo volátil, o volume permanece praticamente constante ao longo das
oito horas de experimento. A 3-OMQ deve difundir, inicialmente, através da matriz
polimérica de HPMC, para então alcançar o estrato córneo, e então difundir através
da matriz lipídica desta estrutura cutânea e, atravessar a pele para ser detectada no
meio aceptor. A tabela 13 também permite observar que esta característica repete-
se para a mistura e complexo quando inseridos em gel de HPMC, que apresentam
maiores tempos de latência do que às correspondentes mistura e complexo
isolados.
A figura 21 apresenta os perfis de permeação intrínseca da 3-OMQ isolada,
mistura e complexo, enquanto que a figura 22 apresenta a permeação destas a
partir de hidrogel de HPMC. O perfil de permeação da 3-OMQ isolada denota
reduzida capacidade de permear através da pele e alcançar o meio aceptor. No final
de 8 horas, somente uma quantidade em torno 1 µg foi capaz de alcançar o meio
aceptor. Seu coeficiente de partição octanol/água de 1,9 demonstra seu caráter
lipofílico acentuado. Entretanto, como nesta faixa de log P as moléculas tendem a
difundir através da pele, sendo bons candidatos a sistemas de liberação
66
transdérmicos, o comportamento de difusão da 3-OMQ não condiz com tais
sistemas, indicando que, provavelmente, outros fatores estejam envolvidos na
permeação cutânea, além do coeficiente de partição, tais como a disponibilidade da
molécula na superfície da pele. Quando inserida em matriz hidrofílica, a 3-OMQ
apresentou maior fluxo de permeação e a quantidade permeada, ao final de 8 horas,
que foi superior a 20 µg, denotando um efeito promotor do gel de HPMC,
provavelmente relacionado com o coeficiente de partição da 3-OMQ entre gel/estrato
córneo, que favorece a passagem da molécula para o estrato córneo.
Figura 21. Comparação entre os perfis de penetração intrínseca da 3-OMQ, da
mistura 3-OMQ/
β
CD e do complexo 3-OMQ:
β
CD.
67
Figura 22. Perfis de penetração da 3-OMQ, da mistura 3-OMQ/
β
CD e do complexo
3-OMQ:
β
CD incorporados em gel de HPMC.
A partir dos perfis de permeação da 3-OMQ em mistura com a
β
CD, e desta
mistura incorporada em gel de HPMC, pode-se observar efeito semelhante do gel,
que aumenta a cinética de permeação da 3-OMQ, também quando a
β
CD está
presente na forma de simples mistura com a 3-OMQ. As quantidades permeadas, ao
final de 8 horas foram, respectivamente, de 6 e 13 µg/cm
2
para a mistura 3-
OMQ/
β
CD e para esta incorporada em gel de HPMC. Comparativamente à
permeação da 3-OMQ em gel de HPMC, que alcançou 8 µg/cm
2
ao final de 8 horas,
verifica-se um claro efeito promotor de penetração, resultante da incorporação de
β
CD no sistema.
Contrariamente ao observado para a 3-OMQ isolada e para a simples mistura
3-OMQ/
β
CD, o complexo 3-OMQ:
β
CD apresenta comportamento diverso, em que a
matriz hidrofílica exerce efeito de retenção da 3-OMQ.
68
A hipótese que pode-se formular para explicar tal comportamento é o de que
no caso da 3-OMQ isolada e da simples mistura 3-OMQ/
β
CD, inseri-las em meio
hidrofílico favorece a partição da 3-OMQ no sentido do estrato córneo, pois trata-se
de molécula de caráter lipofílico. No entanto, na forma complexada com a
β
CD, a 3-
OMQ ao reduzir seu caráter lipofílico, há desfavorecimento de sua partição no
sentido do estrato córneo, permanecendo em maior proporção na matriz hidrofílica.
Na ausência desta matriz a complexação da 3-OMQ parece promover a
disponibilidade da molécula na superfície da pele, permitindo a penetração. Por sua
vez, as moléculas de
β
CD liberadas parecem exercer efeito de desorganização do
estrato córneo e, portanto, de promoção de penetração. A quantidade permeada
quando o complexo isolado é aplicado, atinge fluxo e quantidades tão elevadas que
dão indícios de que, nesta forma, a 3-OMQ alcançaria absorção sistêmica. Daí o
papel de modulação da HPMC, que revela-se de interesse para formas que visam
ação tópica.
Em suma, os ensaios de permeação em pele de orelha de suíno demonstram,
claramente, o efeito promotor de penetração de 3-OMQ apresentado pela
β
CD e
pelo gel hidrofílico de HPMC. O comportamento da 3-OMQ isolada e na forma de
simples mistura com
β
CD seguiu padrão semelhante, apresentando maior tempo de
latência, maior fluxo e quantidade total permeada ao final de 8 horas, quando
incorporados no gel hidrofílico. Na forma complexada, comportamento inverso foi
observado, denotando que o complexo apresenta características peculiares e
diversas da 3-OMQ livre.
Traçando-se um comparativo entre a 3-OMQ e as formulações estudadas,
verifica-se que a permeação ocorreu, de forma crescente (Figura 23), na seguinte
ordem: 3-OMQ < mistura 3-OMQ/
β
CD < complexo 3-OMQ:
β
CD em gel < 3-OMQ em
gel < mistura 3-OMQ/
β
CD em gel < complexo 3-OMQ:
β
CD.
69
Figura 23. Perfis de penetração da 3-OMQ e diferentes associações. (1) 3-OMQ; (2)
3-OMQ em gel; (3) mistura 3-OMQ/
β
CD em gel; (4) mistura 3-OMQ/
β
CD;
(5) complexo 3-OMQ:
β
CD; (6) complexo 3-OMQ:
β
CD em gel.
5.5 Determinação da quantidade de 3-O-metilquercetina acumulada
A figura 24 apresenta a quantidade total de 3-OMQ acumulada na pele de
orelha de suíno, ao final de 8 horas de permeação, de todas as preparações
testadas. Observa-se uma menor quantidade de 3-OMQ acumulada na pele quando
a
β
CD está presente e nas formulações. Entre as formulações estudadas, a 3-OMQ
incorporada no hidrogel apresentou maior retenção na pele, fato que pode ser
explicado por sua lipofilia e provável formação de depósito no estrato córneo. A
determinação da quantidade de 3-OMQ acumulada na pele, sem sua incorporação
em formulação, não mostrou-se viável, face à dificuldade de eliminação do excesso
da amostra da superfície da pele de forma aceitável, do ponto de vista analítico.
70
Figura 24. Quantidade total de 3-OMQ acumulada na pele de suíno após a
permeação de 8 horas na presença ou ausência de
β
CD, inserida ou
não em gel de HPMC 3 %.
O fato de as quantidades totais de 3-OMQ, permeada e acumulada somadas,
não resultarem no total da dose aplicada, deve-se à permanência de uma parte da
mesma no meio doador após a cinética de permeação.
Em suma, conhecendo-se o efeito de promoção de penetração cutânea da
β
CD e da matriz hidrofílica, abre-se como perspectiva de investigação a realização
de testes farmacodinâmicos de avaliação das diferentes formulações em modelos
experimentais in vivo, iniciando-se com estudo comparativo entre 3 formulações
preparadas com hidrogel de HPMC.
71
6 CONCLUSÕES
72
73
O isolamento e purificação do flavonóide 3-O-metilquercetina, a partir de
produto seco de Achyrocline satureioides foi possível, com o método proposto,
obtendo-se produto de pureza de 99 %.
O método de quantificação de 3-O-metilquercetina, por cromatografia líquida de
alta eficiência, mostrou-se linear, preciso e específico para o flavonóide na faixa de
concentração de 0,05 a 1,5 µg/mL.
As análises por espectroscopia no infravermelho e por ressonância magnética
nuclear de hidrogênio indicam a ocorrência de complexação da 3-O-metilquercetina
com
β
-ciclodextrina, sendo provável a inclusão do anel B do flavonóide na cavidade
hidrofóbica da
β
-ciclodextrina.
O diagrama de solubilidade resultou em curva do tipo A
P
, indicando a formação
de complexos solúveis entre 3-O-metilquercetina e -ciclodextrina, sendo observado
um incremento na hidrossolubilidade da 3-O-metilquercetina de até 2,45 vezes para
as proporções molares 3-O-metilquercetina:
β
-ciclodextrina de 1:3.
Os estudos preliminares de permeação ex vivo em pele de orelha de suíno
demostraram que a 3-O-metilquercetina apresenta baixa permeação através da
pele.
Tanto a
β
-ciclodextrina como a matriz hidrofílica promoveram a penetração da
3-O-metilquercetina através da pele. Quando associadas na forma de simples
mistura e incorporadas em gel de hidroxipropilmetilcelulose, o efeito de promoção de
penetração foi maior.
Na forma complexada com
β
-ciclodextrina, a 3-O-metilquercetina apresentou o
maior nível de penetração através da pele, provavelmente pelo efeito de aumento da
disponibilidade da 3-O-metilquercetina na superfície cutânea e/ou efeito de
desorganização do estrato córneo pela
β
-ciclodextrina.
74
O complexo 3-O-metilquercetina:
β
-ciclodextrina incorporado em hidrogel de
hidroxipropilmetilcelulose apresentou menor efeito de penetração cutânea da 3-O-
metilquercetina provavelmente pela maior afinidade do complexo pelo gel hidrofílico
do que pelo estrato córneo, denotando modulação da liberação da 3-OMQ pelo
hidrogel.
A permeação da 3-O-metilquercetina a partir das formulações ocorreu, de
forma decrescente, na seguinte ordem: complexo > mistura em gel > 3-O-
metilquercetina em gel > complexo em gel > mistura > 3-O-metilquercetina.
Em suma, o efeito promotor de penetração da 3-O-metilquercetina pela
β
-
ciclodextrina e hidrogel de hidroxipropilmetilcelulose, foi evidenciado no presente
trabalho. A realização de ensaios in vivo para a seleção da melhor formulação
constitui-se na principal perspectiva de continuidade de investigação científica do
tema, em que a comparação entre as três formulações contendo gel constituiria o
ponto de partida.
75
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