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FUNDAÇÃO FACULDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS MÉDICAS DE
PORTO ALEGRE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: FARMACOLOGIA E TERAPÊUTICA
CLÍNICA
ESTUDO DO ESTRESSE OXIDATIVO E DA RESPOSTA
INFLAMATÓRIA PULMONAR POR EXPOSIÇÃO AGUDA AO
MATERIAL PARTICULADO E O PAPEL DA VIA DO ÓXIDO
NÍTRICO
Dissertação de Mestrado
Carlos Eurico da Luz Pereira
Porto Alegre, 2006.
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
MÉDICAS
ESTUDO DO ESTRESSE OXIDATIVO E DA
RESPOSTA INFLAMATÓRIA PULMONAR POR
EXPOSIÇÃO AGUDA AO MATERIAL
PARTICULADO E O PAPEL DA VIA DO ÓXIDO
NÍTRICO
Aluno: Carlos Eurico da Luz Pereira
Orientadora: Profa. Dra. Claudia Ramos Rhoden
Co-orientador: Prof. Paulo Hilário Nascimento Saldiva
Área de Concentração: Farmacologia e Terapêutica Clínica
Dissertação de Mestrado
Porto Alegre, 2006
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AGRADECIMENTOS
Tudo na vida tem um princípio, e foi no Laboratório de Estresse Oxidativo e Poluição
Atmosférica, que tive meu primeiro contato com pesquisa experimental, onde realmente
iniciei meu sonho idealizado nos bancos da faculdade quando da minha graduação em
medicina, se tornar um pesquisador. Agradeço imensamente a Prof
a
. Cláudia Ramos
Rhoden, que ao chegar de seu Pós-doutoramento em Harvard, aceitou orientar um médico,
com todos os problemas de horários que a profissão nos impõe, agravados pela distância
entre minha cidade de atuação Santa Cruz do Sul, e nosso laboratório em Porto Alegre.
Obrigado pelo grande exemplo de disciplina científica, dedicação e, sobretudo obrigado
pela confiança, paciência e tolerância.
Agradeço a forma carinhosa que sempre fui recebido pelo pessoal do Laboratório de
Poluição Atmosférica Experimental (LIM 5) da USP, sob o comando do Prof. Paulo
Hilário N. Saldiva, que é um exemplo de pessoa e pesquisador.
Um agradecimento especial a minha companheira e cúmplice, que sempre me apoiou
em todas minhas empreitadas e loucuras, meu esteio, meu porto seguro, minha esposa
Luciane Bernardi Pereira.
Obrigado a minha família, que mantém meu equilíbrio emocional, e que sempre me
apoiou e soube entender minhas prolongadas ausências, minha mãe
Arlete Viana
Machado da Luz, irmãos João Guilherme Machado da Luz e José Loutar da Luz
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Pereira, e meu avô, pessoa impar que me possibilitou cursar Medicina, Sr. Eurico
Machado da Luz.
Obrigado a todos os colegas e alunos do Laboratório de Estresse Oxidativo e
Poluição Atmosférica, pelo auxílio na parte experimental, e principalmente pela
convivência e parceria, em especial aos amigos Thiago Heck, Carina Venturini, Ana
Cláudia Zanchi e Eduardo Ribeiro.
Não poderia também deixar de expressar minha gratidão, aos funcionários da
FFFCMPA que de boa vontade, sempre estiveram prontos a auxiliar na realização da parte
experimental deste trabalho: Alexandre Maslinkiewicz, Mario Serapião Andrade e
Maria Letícia Maya Vasquez.
Obrigado aos meus alunos, pelo estímulo constante e razão para seguir adiante.
E por fim, obrigado a Deus pela minha vida perfeita, pelas pessoas extraordinárias
que sempre colocou em meu caminho, e especialmente pela vida de meu filho Enzo
Bernardi Pereira.
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RESUMO:
Estudos in vitro e in vivo demonstraram toxicidade aguda e crônica do material particulado
(MP) do ar. Exposições a elevadas concentrações de MP a curto prazo promovem resposta
inflamatória pulmonar, secundária a estresse oxidativo (EO). Neste estudo avaliamos a
habilidade de baixas concentrações de MP, em uma exposição experimental “real” de ratos
à poluição, em promover EO e inflamação, e o papel da via do óxido nítrico modulando
estas alterações. Animais foram expostos ao ar coletado em uma área de grande
concentração de veículos em Porto Alegre, ou ao ar filtrado por períodos de 6 horas
contínuas ou 20 horas de forma contínua ou intermitente. Ratos que inalaram ar poluído por
20 horas contínuas mostraram aumento no EO medido pelo teste de substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (TBARS) (p=0,04) no tecido pulmonar, e na inflamação pulmonar
medida pelo aumento de leucócitos no lavado broncoalveolar (LBA) (p= 0,041). Não
foram encontradas diferenças nos grupos de exposição por 6 horas contínuas (LBA p=
0,464; EO p=0,95) ou 20 horas intermitentes (EO p=0,272). Outro grupo de animais foi
exposto por 20 horas contínuas a MP ou ar filtrado e tratados com salina ou L-NAME
(20mg/kg) ou L-arginina (200mg/kg), ou associação L-NAME + L-arginina (20mg/kg,
200mg/kg) i.p. Os ratos que receberam L-arginina foram protegidos do EO por inalação de
MP (p <0.05). O estudo sugere que inalação de MP, mesmo em níveis considerados seguros
pela legislação vigente, pode desencadear danos biológicos ao pulmão após 20 horas de
exposição contínua, e que a via do ON desempenha um papel fundamental no EO induzido
por MP, protegendo da ocorrência de danos celulares.
Palavras-chave: Estresse oxidativo, espécies reativas de oxigênio, material particulado,
inflamação pulmonar, óxido nítrico.
6
ABSTRACT:
In vitro and in vivo studies demonstrate chronic and acute toxicity of particulate air
pollution (PM). Short term exposure to elevated concentrations of PM promotes significant
oxidative stress (OS) in lung and oxidants are mediators responsible by the lung
inflammatory responses. In our study we initially tested the ability of low concentrations of
PM in a “real” world exposition to promote OS and inflammatory responses in vivo. Finally
we studied the role of nitric oxide pathway in the lung OS of these rats. Animals were
exposed to the air collected in an area of great automobile concentration, or filtered air for
periods of 6 hr continuous and 20 hr continuous and intermittent. Rats breathing polluted
air for 20 hr continuously showed significant increase in the OS measured by the TBARS
(p =0.04) in the lung tissue, and in the inflammation (increase of leukocytes in BAL (p=
0.041). There was not difference in the group of 6 hr continuously (BAL p= 0.464; OS
p=0.95) and 20 hr intermittently (OS p=0.272). After animals treated with saline, L-NAME
(20mg/kg) or L-arginine (200mg/kg), or L-NAME (20mg/kg) + L-arginine (200mg/kg), i.p.
were exposed to PM
10
inhalation or filtered air for 20 hr continuously. Rats that received L-
arginine breathing PM
10
had a protection against OS (p <0.05). The study indicated that
even if pollutant concentrations are below the prevailing legal limits may occur biological
hazards by particulate matter in a 20 hours exposition, and that nitric oxide pathway has a
critical role in the OS induced by PM, protecting cellular damage.
Keywords
: oxidative stress, reactive oxygen species, particulate air pollution, lung
inflammation, nitric oxide.
7
LISTA DE ABREVIATURAS:
CPAs: Concentrado de partículas aéreas
eNOS; Óxido nítrico sintase endotelial
EPA: “Environmental Proctection Agency” (EUA)
ERN: Espécies reativas de nitrogênio
ERO: Espécies reativas de oxigênio
H
2
O
2
: Peróxido de nitrogênio
iNOS: Óxido nítrico sintase inflamatória
L-NAME: N
G
-nitro-L-arginina-metiléster
L-NMMA: N
G
-monometil-L-arginina
L-NNA: N
G
-nitro-Larginina
LPAE-USP: Laboratório de Poluição Atmosférica Experimental da Universidade de São
Paulo
LPO: lipoperoxidação
MP: Material particulado
MP
0,1
: Material particulado com diâmetro menor que 0,1 µm (partículas ultrafinas)
MP
10
: Material particulado com diâmetro entre 2,5 e 10 µm (partículas grosseiras)
MP
2,5
: Material particulado com diâmetro entre 0,1 e 2,5 µm (partículas finas)
NADPH: Forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
nNOS: Óxido nítrico sintase neuronal
8
NOS: Óxido nítrico sintase
O
2
·-
: Radical superóxido
·
OH: Radical hidroxil
OMS: Organização Mundial da Saúde
ON: óxido nítrico
PED: Partículas de exaustão de diesel
ROFA: Partículas resultantes da queima de óleo diesel
SOD: Superóxido dismutase
TBARS: Teste de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TCA: Ácido tricloroacético
9
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO....................................................................................................................10
POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA – HISTÓRICO............................................................................
10
POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA – CARACTERIZAÇÃO E TOXICOCINÉTICA.......................
12
POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA – MECANISMOS TOXICODINÂMICOS................................
15
MODELOS ANIMAIS DE ESTUDO DE POLUIÇÃO POR MATERIAL PARTICULADO:..
17
ESTRESSE OXIDATIVO – GENERALIDADES.......................................................................
21
ESTRESSE OXIDATIVO – ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO.......................................
24
ESPÉCIES REATIVAS DE NITROGÊNIO................................................................................
30
INTERAÇÃO ENTRE ÓXIDO NÍTRICO E ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO:............
35
OBJETIVO GERAL............................................................................................................. 38
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................... 38
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 39
ARTIGO 1:...........................................................................................................................64
ARTIGO 2:...........................................................................................................................90
CONCLUSÕES..................................................................................................................125
ANEXO I: PRÊMIOS: ....................................................................................................... 126
10
INTRODUÇÃO
POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA – HISTÓRICO
A poluição atmosférica constitui-se em um problema de saúde pública,
principalmente em áreas urbanas, em áreas industrializadas, e /ou em áreas próximas a local
de queima de biomassa (BÖHM, 1987; POPE et al., 1992; SALDIVA, 1998; SCHWELA,
2000; EZZATI et al., 2002; ARBEX et al., 2004), especialmente para indivíduos portadores
de doenças respiratórias e cardiovasculares (DOCKERY & POPE, 1994; GARCIA-
AYMERICH et al., 2000; DOCKERY, 2001; ETZEL, 2003).
Historicamente, os acidentes que ocorreram no Vale do Meuse (França) em 1930, em
Donora (EUA), em 1948 e em Londres em 1952, estabeleceram a associação entre a
elevação dos índices de poluição atmosférica e ações deletérias à saúde (COSTA &
DREHER, 1999; HAUCK, 1998). Esses eventos tiveram como característica comum a
permanência por longo período de tempo (dias) de elevadas concentrações de material
particulado (MP) e gases no ar, produzindo aumento da mortalidade principalmente por
agravamento de doenças respiratórias (HUNT et al., 2003). Estes fatos levaram os governos
de vários países a estabelecerem programas de controle da poluição. Dentre eles, podemos
citar o britânico “Air Pollution Control Act of London” (1956); o norte-americano “Clean
Air Act Amendments” (1970); e o Europeu “Air Quality Guidelines for Europe” (EPA,
1996, 2001; HAUCK, 1998; WHO, 2000).
11
A partir desses achados, na década de 70, houve um avanço na investigação
epidemiológica dos efeitos da poluição atmosférica sobre a saúde, culminando com a
publicação de dois grandes estudos, um da Organização Mundial da Saúde (OMS) (WHO,
1979) e, outro, da Pollution Atmosphérique et Affections Respiratoires Chroniques ou à
Répetition (PAARC, 1982). Estes encontraram relação entre os níveis elevados de dióxido
de enxofre e a prevalência de bronquite crônica e tosse.
No final dos anos 80, e no início dos anos 90, estudos epidemiológicos realizados nos
Estados Unidos (DOCKERY et al., 1993; POPE et al., 1992, 1995) na Europa, na Ásia e na
América do Sul (BRAUN-FAHRLÄNDER et al., 1992; KATSOUYANNI et al., 1997;
SPIX et al., 1993; SALDIVA et al., 1995) demonstraram associação da exposição a MP e
morbimortalidade, especialmente, por doenças respiratórias e cardiovasculares.
No Brasil, mais especificamente em São Paulo, vários estudos demonstraram relação
entre a poluição do ar e mortalidade de idosos (SALDIVA et al., 1995) e de crianças
(SALDIVA et al., 1994; CONCEIÇÃO et al., 2001; BRAGA et al., 2001; LIN et al., 2004);
problemas respiratórios em crianças e poluição (LIN et al., 1999; BRAGA et al., 2001),
determinando aumento do número de admissões hospitalares, e de consultas em serviços de
emergência (BRAGA et al., 1999; FARHAT et al., 2005); aumento de atendimentos de
emergência por doenças isquêmicas cardiovasculares (LIN et al., 2003), por problemas
respiratórios crônicos em idosos (MARTINS et al., 2002b) ou por pneumonia e influenza
(MARTINS et al., 2002a) em indivíduos expostos à poluição. Foram relacionados ainda
com a exposição à poluição atmosférica em estudos nacionais: baixo peso ao nascimento
(GOUVEIA et al., 2004), e aumento da mortalidade intra-uterina (PEREIRA et al., 1998) e
neonatal (LIN et al., 2004).
12
Cabe ressaltar que os estudos epidemiológicos podem evidenciar associações entre
desfechos de saúde e algumas medidas de exposição, não podendo, no entanto, estabelecer
uma relação de causa-efeito definitiva entre exposição e resposta. Desta forma, são
necessários estudos controlados em humanos e animais para o estabelecimento de relações
causa-efeito de exposição de materiais específicos e/ou de misturas de materiais a níveis
específicos de exposição e o desenvolvimento de perfis de exposição-dose resposta
(SAMET et al., 1994; COSTA & DREHER, 1999; ANDRÉ et al., 2000; LIPPMANN et al.,
2000; DYE et al., 2001).
POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA – CARACTERIZAÇÃO E
TOXICOCINÉTICA
Poluentes aéreos são contaminantes do ar potencialmente tóxicos quando inalados por
pessoas ou animais, e podem afetar a saúde dos mesmos, além de afetar as plantas e o meio
ambiente. Estes contaminantes aéreos, que incluem partículas e gases, são lançados
diretamente para o ar ou são formados no mesmo a partir de outros contaminantes, pela
ação da luz solar e da umidade (SIOUTAS et al., 1995; DOCKERY et al., 1993;
LIPPMANN et al., 2000; KLEINMAN et al., 2003). Os poluentes atmosféricos são
classificados como primários quando os produtos são emitidos diretamente pelas fontes
poluidoras e, secundários, quando resultam da sua transformação na atmosfera (SIOUTAS
et al., 1995; GOMES, 2002). Os efeitos tóxicos destes poluentes vão depender da sua
13
concentração na atmosfera, do período de exposição e da sua composição química
(GODLESKI & CLARKE, 2002; MEDEIROS et al., 2004).
Conforme dados da “Environmental Protection Agency” (EPA, 2001) dos Estados
Unidos, os principais poluentes atmosféricos são: ozônio, dióxido de nitrogênio, dióxido de
enxofre, monóxido de carbono, chumbo e material particulado (MP). De acordo com a
OMS, a exposição a MP é responsável por 800.000 mortes prematuras por ano (EZZATI et
al., 2002; WHO, 2002) e representa o pior problema global de poluição do ar nos dias de
hoje. Entre as 20 maiores megacidades (aquelas com população > 10 milhões habitantes),
12 delas apresentam sérios problemas de poluição por MP que se encontra,
persistentemente, acima nos índices preconizados por várias agências regulamentadoras
(WHO, 1992).
O MP compreende uma mistura heterogênea de substâncias incluindo carbono,
metais, nitratos, sulfatos, e material biológico, cuja composição varia de acordo com a fonte
predominante de partículas, estação do ano, e clima prevalente (LIPPMANN et al., 2000;
SUNYER & BASAGANÃ, 2001; HEI, 2002; SCHINS et al., 2004). É classificado de
acordo com o diâmetro aerodinâmico em 3 categorias: “coarse” com diâmetro entre 2,5 e
10 µm (partículas grosseiras – MP
10
), geradas por processos mecânicos que produzem
fumos não combustíveis de minerais e do solo; partículas finas com diâmetro entre 0,1 e 2,5
µm (MP
2,5
), e partículas ultrafinas com diâmetro menor que 0,1 µm (MP
0,1
), ambas
produzidas a partir da combustão de veículos e usinas elétricas, e que tem sido mais
freqüentemente responsabilizadas pelos efeitos deletérios a saúde (KAISER, 2000;
LIPPMANN et al., 2000; FRAMPTON et al., 2001; KLEINMAN et al., 2003), em função
de atingirem vias aéreas inferiores e principalmente alvéolos (FERIN et al., 1992; TAO et
14
al., 2003). Entretanto, o aumento da morbimortalidade está associado às três frações de MP
(HAUCK, 1998).
A inalação, a deposição e a absorção do MP são mecanismos importantes
envolvidos na extensão dos danos produzidos por este poluente. O destino das partículas
inaladas depende do seu comportamento aerodinâmico além de fatores anatômicos e
fisiológicos. As propriedades dinâmicas das partículas aéreas dependem da sua dimensão,
forma, densidade, inércia (sobretudo das partículas com um diâmetro superior a 0,5 µm) e
difusão (mais importante para as partículas com diâmetro inferior a 0,5 µm), além da
dependência da sua composição química (HAUCK, 1998). As partículas de materiais mais
solúveis depositam-se no pulmão e rapidamente entram na corrente sanguínea, podendo
atingir outros órgãos, enquanto que as menos solúveis se depositam e podem causar lesões
epiteliais e atuar sobre vários receptores (GOMES, 2002).
Gomes (2002) descreve que:
Partículas aéreas que entram em contato com paredes brônquicas úmidas
ficam irreversivelmente depositadas e são removidas da corrente aérea. Os
processos físicos mais importantes associados à deposição de partículas
inaladas são a impactação, a ação da gravidade e a difusão. A deposição
por impacto é o mecanismo predominante para partículas de diâmetro
superior a 3 µm e dá-se essencialmente nas vias aéreas superiores e na
árvore traqueobrônquica. A deposição por ação da gravidade é mais
importante nas porções mais distais da árvore brônquica e nas porções
mais proximais da região de trocas gasosas e diz respeito às partículas
menores. Finalmente a deposição de partículas por difusão é importante
para partículas de diâmetro inferior a 0,5 µm e ocorre na região alveolar,
mas também no nariz, boca, faringe, para partículas inferiores a 0,01 µm.
As partículas depositadas podem sofrer uma série de alterações de
natureza biológica, física e química, como a dissolução nos líquidos
orgânicos e passagem para a corrente sanguínea; podem sofrer fagocitose
ou pinocitose e podem ser arrastadas pelo muco ou outros líquidos
orgânicos.
15
POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA – MECANISMOS TOXICODINÂMICOS
Como descrito anteriormente, a literatura mostra uma associação entre elevações da
poluição atmosférica e aumento de morbimortalidade por doenças cardiovasculares e
respiratórias (POPE et al., 1992; DOCKERY et al., 1993; SALDIVA et al., 1994;
DOCKERY & POPE, 1994; SALDIVA et al., 1995; DOCKERY, 2001; SCHWARTZ,
1994, 1995, 2001; GARCIA-AYMERICH, et al. 2000; SAMET et al., 2000;
DONALDSON et al., 2000, 2001; ZAREBA et al., 2001; POPE III, 2000; HONG, et al.
2002; GOLDBERG et al., 2003; ETZEL, 2003). Entretanto, os mecanismos responsáveis
por esta associação não estão completamente definidos. Várias pesquisas sugerem que a
poluição por partículas ambientais desencadeia inflamação pulmonar resultando tanto em
efeitos autonômicos sistêmicos (HEI, 2002; GONZALEZ-FLECHA et al., 2003; RHODEN
et al., 2005), quanto em liberação de produtos pró-inflamatórios sistêmicos (como
citocinas) (BECKER et al., 1996), que podem influenciar o tônus vascular (DWEICK et al.,
1998; SALVI et al., 1999; BATALHA et al., 2002) e as funções pulmonar e cardiovascular
(BARNES, 1990; LI et al., 1997; CHAPMAN et al., 1997; DRISCOLL et al., 1997;
STRINGER & KOBZIK, 1998; GODLESKI, 1998; GHIO et al., 2000; FRAMPTON et al.,
2001; GODLESKI & CLARKE, 2002).
Alguns autores sugerem que as propriedades inflamatórias das partículas ultrafinas
são mediadas por sua grande quantidade, pequeno tamanho e alta taxa de penetração no
interstício, independentemente de sua composição química (SCHINS et al., 2000;
FRAMPTON et al., 2001; HEI, 2002), porém a maior parte dos estudos atuais indicam a
composição química como uma das grandes responsáveis por estas respostas inflamatórias
16
(COSTA & DREHER, 1997; KENNEDY et al., 1998; RICE et al., 2001; GODLESKI et
al., 2002; SALDIVA et al., 2002; MEDEIROS et al., 2004). Becker et al (2002) em estudo
in vitro e Tao et al (2003) e Kadiiska et al (1997) em estudos in vivo demonstraram que a
propriedade oxidativa do MP pode estar modulando a resposta inflamatória pulmonar. A
capacidade oxidativa do MP pode ser atribuída à presença de substâncias adsorvidas às
partículas de carbono finas e ultrafinas que compõem este poluente. Dentre elas podemos
citar: ferro, metais de transição, componentes orgânicos voláteis, hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos e material biológico (endotoxinas) (GONZALEZ-FLECHA, 2004).
Entretanto, ainda não se conhecem na totalidade os mecanismos e o(s) componente(s)
predominantes na resposta tóxica do MP (KLEINMAN et al., 2003). Estudos sugerem os
metais de transição como uma causa primária de dano pulmonar (CHAPMAN et al., 1997;
COSTA et al., 1997; FRAMPTON et al., 2001; GHIO et al., 1996, 2000; RICE et al., 2001;
SCHINS et al., 2004; RHODEN et al., 2004) no qual o estresse oxidativo é um importante
mecanismo de indução de inflamação como resultado da formação de espécies reativas de
oxigênio a partir da reação de Fenton (BARNES, 1990; DONALDSON et al., 1997;
KADIISKA et al., 1997; JIMENEZ et al., 2000; MACNEE, 2001; KELLY, 2003). Modelos
in vivo e in vitro demonstram que o estresse oxidativo leva a perda de integridade epitelial,
o que pode favorecer a transferência de partículas (LI et al., 1996; DONALDSON et al.,
1997; BECKER et al., 2002) e o desenvolvimento de lesões em diferentes tecidos.
17
MODELOS ANIMAIS DE ESTUDO DE POLUIÇÃO POR MATERIAL
PARTICULADO:
Os estudos epidemiológicos demonstrando os efeitos tóxicos do MP coincidem com o
avanço de tecnologia vinculada a métodos de coleta, classificação, determinação e de
concentração de MP de amostras urbanas sem alteração de suas propriedades físico-
químicas, proporcionando o desenvolvimento de modelos animais de exposição à poluição
do ar, próximos a situações reais de exposição (SIOUTAS et al., 1995; PEREIRA et al.,
1995; DYE et al., 2001; GURGUEIRA et al., 2002; GODLESKI et al., 2002; GONZALEZ-
FLECHA, 2004).
Trabalhos realizados na década de 80 pelos pesquisadores do Laboratório de Poluição
Atmosférica Experimental da Universidade de São Paulo (LPAE – USP) demonstraram que
ratos Wistar comuns são excelentes indicadores de poluição aérea, sendo que os animais
adultos jovens são os mais indicados para estudos de função respiratória (BÖHM et al.,
1989).
Estudos toxicológicos experimentais com ratos incluem modelos de inalação dentre
os quais destacam-se os por exposição simples direta ao ar em locais poluídos (BÖHM et
al., 1989; SALDIVA et al., 1992; LEMOS et al., 1994; REYMÃO et al., 1997) ou por
exposição controlada ao ar poluído em câmaras de exposição com maior ou menor
tecnologia (SIOUTAS et al., 1995; GHIO et al., 2000; CLARKE et al., 2000a, 2000b;
SALDIVA et al., 2002; GURGUEIRA et al., 2002; BATALHA et al., 2002; WELLENIUS
et al., 2002; ZHOU et al, 2003; GONZALEZ-FLECHA et al, 2003; RHODEN et al., 2004,
18
2005) e modelos de instilação traqueal de poluição atmosférica resuspensa após coleta
atmosférica através de filtros com uso de amostradores e impactadores (MEDEIROS et al.,
2004; DOLORES et al., 2005a, 2005b).
Estudos iniciais utilizavam ratos, em gaiolas normais, expostos diretamente ao ar em
locais poluídos (que se pretendia estudar) utilizando-se como controles animais nas mesmas
condições só que respirando ar de locais livres de poluição (controles). Esta metodologia
foi empregada nos trabalhos nacionais clássicos realizados com animais alocados em São
Paulo e Cubatão com controles na cidade de Ubatuba (litoral de São Paulo) (BÖHM et al.,
1989), e com animais expostos à atmosfera do centro da cidade de São Paulo, comparados
com animais vivendo na atmosfera de Atibaia, pequena cidade localizada na Serra da
Mantiqueira, à cerca de 65 Km de São Paulo, com mesmas características climáticas da
capital, porém livre de poluição (SALDIVA et al., 1992; LEMOS et al., 1994; REYMÃO et
al., 1997).
Para estudos de exposição aguda por inalação em condições controladas, surgiu então
o emprego de pequenas câmaras de policarbonato seladas (ZHOU et al, 2003) ou
“plexiglass” (WELLENIUS et al., 2002). Estas câmaras têm dimensões em geral em torno
30 x 30 x 60 cm, com somente uma abertura para entrada de fluxo controlado de ar e outra
para saída, que recebem partículas de concentração e/ou composição conhecidas,
resuspensas através de um gerador de aerossol, como o “black carbon” e partículas
residuais provenientes da queima de óleo (ROFA) (WELLENIUS et al., 2002;
GURGUEIRA et al., 2002). O controle geralmente é feito com uma câmara nas mesmas
condições acima descritas, com um filtro para MP na entrada de ar e/ou resuspensão de
material inerte.
19
Utilizamos em nosso experimento um modelo de exposição animal semelhante ao
acima descrito, com câmaras de exposição de vidro, baseado na experiência do LPAE –
USP, que se propõe a estudar os efeitos da poluição de uma maneira mais próxima à
realidade de exposição dos seres humanos, e com tecnologia mais acessível (ver material e
métodos artigo 2). Apresentam como desvantagem serem destinadas somente para
experimentos agudos, para poucos animais.
Baseados no fato de que os níveis ambientais de poluentes não são elevados o
suficiente para estudos de dose-resposta, foi desenvolvido no início da década de 90, na
Escola da Saúde Pública da Universidade de Harvard, um sistema de inalação dinâmica
utilizando uma série de impactadores para concentrar o MP sem alterar suas características
físico-químicas, gerando o chamado concentrado de partículas aéreas (CPAs). Este
concentrador de partículas pode ser utilizado para estudos de toxicologia do MP tanto
agudos, subagudos como crônicos (SIOUTAS et al., 1995; GHIO et al., 2000; CLARKE et
al., 2000a, 2000b; SALDIVA et al., 2002; GURGUEIRA et al., 2002; BATALHA et al.,
2002; GONZALEZ-FLECHA et al, 2003; RHODEN et al., 2004, 2005).
Outra possibilidade de estudos de exposição por inalação são câmaras de exposição
coletiva, maiores, que servem para exposição concomitante de grande número de animais.
As utilizadas pelo LPAE da USP são estruturas cilíndricas de 1,5 m de diâmetro por 2,5 m
de altura, cobertas por um plástico duplo com proteção contra raios UV e com orifícios
internos de distribuição de ar. O ar entra na base, impulsionado por um sistema de
ventilação que distribui o mesmo e o direciona para a saída no topo da estrutura. Após as
pás do sistema de impulsão de ar, podem ser utilizados filtros para diferentes tamanhos de
partículas e substâncias químicas (MOHALLEM et al., 2005).
20
Uma alternativa à inalação são os estudos agudos ou crônicos com instilação traqueal
de concentrações e composição conhecidas de ROFA, “black-carbon” ou MP, previamente
coletado através de impactadores ou amostradores como o HIVOL (Energética, Brasil)
(DOLORES et al., 2005a, 2005b). Após a coleta, os filtros retirados destes aparelhos são
colocados em suspensão aquosa e submetidos à remoção das partículas por agitação através
de ultrassom, sendo possível calcular sua concentração através da diferença de peso dos
filtros antes e após a extração das partículas. Outra possibilidade seria a instilação nasal,
onde alíquotas em torno de 10 µl da solução a ser estudada, é colocada através de uma
pipeta automática na abertura de uma das narinas do rato acordado. Esta instilação provoca
um reflexo de apnéia, seguido de uma inspiração profunda que leva a aspiração da solução
(MEDEIROS et al., 2004). Apesar de ser um método aceito e aplicável para estudo de
alterações pulmonares por MP, a limitação deste último é a incapacidade de prever-se a
quantidade de substância administrada que atinge as vias aéreas inferiores, enquanto com a
instilação traqueal a quantidade de substância administrada é seguramente a mesma que irá
atingir as vias aéreas inferiores.
Os estudos de inalação têm por vantagem simularem situação real de exposição, o
que gera uma crítica aos estudos de instilação, por não mimetizarem a realidade da
exposição ao MP. Ambos os estudos permitem uso de MP em concentrações e composição
conhecidas, o que facilita o entendimento dos fatores causais do processo inflamatório
pulmonar por inalação de poluentes. Uma crítica, principalmente aos estudos com
concentrado de partículas, é o uso de concentrações elevadas de poluentes, diferente da
realidade da exposição a particulados na maioria das cidades.
21
ESTRESSE OXIDATIVO – GENERALIDADES
De maneira simplificada, radical livre é o átomo ou molécula que apresenta alta
reatividade por apresentar número ímpar de elétrons em sua última camada eletrônica. São
espécies químicas capazes de existência independente apesar de conter um ou mais elétrons
não pareados. São formados através de reações de óxido-redução, ou doando elétron
solitário, oxidando-se, ou recebendo elétron, reduzindo-se. Estas reações podem ocorrer
com moléculas biológicas “não-radicais” tornando-as instáveis e se instalando desta forma
uma reação em cadeia (HALLIWELL & CROSS, 1994; HALLIWELL & GUTTERIDGE,
1995; ROMALDINI et al., 1997).
Na verdade, radical livre não é o termo ideal para designar os agentes reativos
patogênicos, pois alguns deles não apresentam elétrons desemparelhados em sua última
camada, como é o caso do peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), oxigênio singlet e ácido
hipocloroso. Como em sua maioria são derivados do metabolismo do O
2
ou do nitrogênio,
dá-se preferência aos termos "espécies reativas de oxigênio" (ERO) e “espécies reativas de
nitrogênio” (ERN).
ERO e ERN são geradas em todo organismo na tentativa de defender o organismo de
agressões (BARNES, 1990; ZHU et al., 1998; COMHAIR & ERZUDUM, 2002). Se a
produção destas espécies for excessiva pode causar dano celular (KELLY, 2003).
Para manter o equilíbrio e defender o organismo do eventual excesso de substâncias
oxidantes, além do mecanismo natural de reparo celular, existem antioxidantes enzimáticos
(superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase) e não-enzimáticos (constituídos de
22
macromoléculas como ceruloplasmina e transferrina, e pequenas moléculas como
glutationa, metionina, ácido úrico, vitaminas C e E) que reduzem a toxicidade destas
espécies ativas, minimizando os danos às biomoléculas (HALLIWELL & CROSS, 1994;
ROMALDINI et al., 1997; MORCILLO et al., 1999; COMHAIR & ERZURUM, 2002;
GONZALEZ-FLECHA, 2004; ANDRADE JÚNIOR et al., 2005).
Se o estímulo oxidante é suficientemente grande ocorre um desequilíbrio entre a
produção de espécies reativas e a capacidade antioxidante levando a um estado de estresse
oxidativo (MORCILLO et al., 1999). O resultante excesso de espécies reativas pode lesar
componentes celulares maiores, incluindo lipídios de membrana, proteínas, carbohidratos, e
DNA (MACNEE, 2001). As conseqüências fisiológicas desta injúria são inflamação e dano
tecidual disseminado, que contribui para a patogênese de inúmeras doenças, incluindo
doenças do trato respiratório tais como: dano por isquemia e reperfusão como em
tranplantes, pneumoconioses, toxicidade por paraquat ou bleomicina, doença pulmonar
obstrutiva crônica, asma, fibrose pulmonar, síndrome do desconforto respiratório agudo,
hipertensão arterial pulmonar, carcinoma brônquico, entre outras. (MCCORD, 1985;
BARNES, 1990; CROSS et al., 1994; COMHAIR & ERZURUM, 2002).
Exposição prolongada a partículas ambientais, hiperóxia, uso de drogas, entre outras,
com ativação recorrente de macrófagos podem levar a perda dos mecanismos de regulação
da liberação de ERO tóxicos e mediadores pró-inflamatórios (KOBAYASHI et al., 2001;
MONN et al., 2003). Conforme mencionado acima, o estresse oxidativo resultante é uma
via final de lesão pulmonar frente a esses fatores, sendo considerado um dos principais
mecanismos envolvidos na inflamação pulmonar decorrente de inalação de poluentes como
o MP (MACNEE, 2001).
23
Mais recentemente, o radical diatômico óxido nítrico (ON) tem sido relacionado a
mecanismos antioxidantes (JOSHI et al., 1999; PAXINOU et al., 2001; COMHAIR &
ERZURUM, 2002). Ironicamente, a produção de ON pode desencadear a produção de
ERN, que podem atuar como as ERO, causando dano celular direto. A propriedade única
do ON de agir como pró-oxidante ou antioxidante, tem levantado a hipótese de que o
mesmo desempenha um papel fundamental em diversas cascatas sinalizadoras redox
reguladas (KRÖNCKE et al., 1997; JOSHI et al., 1999).
Para demonstrar o envolvimento do estresse oxidativo como mecanismo
fisiopatológico em doenças ou modelos experimentais, muitas abordagens são possíveis.
Uma vez que o estresse oxidativo leva a dano celular, qualquer marcador de lesão celular
pode confirmar sua participação, embora seja necessário demonstrar diretamente a
intervenção do estresse oxidativo. Isto pode ser alcançado através da detecção direta de
espécies ativadas in situ, em ensaio de produtos finais da oxidação protéica e lipídica, como
os testes de quimioluminescência (BOVERIS et al., 1980, 1985; HALLIWELL & CROSS,
1994; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1995; GONZALEZ-FLECHA et al., 1991) e o
método de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), ou com qualquer outra
modificação oxidativa de macromoléculas (como por exemplo modificação de bases de
nucleotídeos) (OHKAMA et al., 1979; MAKLUND, 1985). Evidência adicional do papel
do estresse oxidativo pode, ainda, ser obtido através do estudo do conteúdo e da atividade
de enzimas antioxidantes (GUTTERIDGE, 1995; COMHAIR & ERZURUM, 2002).
24
ESTRESSE OXIDATIVO – ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO
O oxigênio é um dos elementos mais abundantes no planeta, constituindo 21% do ar
que respiramos, sendo essencial para a oxidação de componentes orgânicos, processo
através do qual as células dos mamíferos geram energia necessária para a manutenção da
vida (COMHAIR & ERZURUM, 2002). Em seres humanos expostos a concentrações
normais de oxigênio, cerca de 98% do oxigênio sofre uma redução catalítica com
incorporação de quatro elétrons para formar água através da citocromo C oxidase
mitocondrial. Os 2% restantes de oxigênio podem sofrer redução seqüencial incompleta
monovalente formando uma série de elementos intermediários tóxicos e reativos
denominados ERO (HALLIWELL & CROSS, 1994) (figura 1). Os principais
representantes são o radical superóxido (O
2
·-
), o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), o oxigênio
“singlet” e o radical hidroxil (
·
OH) (ZHU et al., 1998; BOWLER et al., 2002; ANDRADE
JÚNIOR et al., 2005).
O
2
+ e
O
2
•−
+ e
- + 2H
+
H
2
O
2
+ e
- + H
+
•
OH
+ e
- + H
+
H
2
O
H
2
O
Figura 2 - Mecanismo univalente para redução do oxigênio molecular em água. O
2
=
oxigênio
molecular;
O
2
•
−
= radical superóxido; H
2
O
2
= peróxido de hidrogênio;
•
OH = radical hidroxil
(RHODEN, 2000).
25
A ativação de células fagocíticas como macrófagos, neutrófilos e eosinófilos geram
o ânion superóxido, que é rapidamente convertido pela superóxido dismutase em H
2
O
2
,
formando
·
OH, na presença de ferro, como uma reação secundária (figura 2) (BARNES,
1990; BECKMAN et al., 1990; DONALDSON et al., 1997; MACNEE, 2001; MONN et
al., 2003).
Para Rhoden (2000):
A reatividade das ERO varia, sendo o H
2
O
2
altamente estável, e a maioria
tendendo a ser extremamente reativa e instável. Apresentam uma vida
média muito curta e, devido a sua reatividade, a maioria dos radicais
existe apenas em baixas concentrações (10
-4
a 10
-9
M), não se distanciando
de seu sítio de formação. Entretanto, reações à distância, com efeitos
biológicos, podem ocorrer quando um radical livre reage com um
composto não-radical formando outro radical livre, induzindo
sucessivamente reações em cadeia, como é o caso da lipoperoxidação
(LPO).
O estudo sobre os mecanismos de lesão oxidativa tem, progressivamente,
confirmado a ação catalítica dos metais nas reações que levam a estas lesões. O papel dos
metais na formação in vitro das ERO é confirmado pela geração de
·
OH nas células através
da decomposição do peróxido de hidrogênio pela reação de Fenton (figura 3), e a e
interação do peróxido de hidrogênio com o radical superóxido através da reação de Haber-
Weiss (figura 4) (DONALDSON et al., 1997; COMHAIR & ERZURUM, 2002). Ou ainda
pela formação de
·
OH quando uma forma reduzida do cobre entra em contato com o
peróxido de hidrogênio, conforme observado na reação (KENNEDY et al., 1998):
Cu
+
+ H
2
O
2
Cu
+2
+
·
OH + OH
-
26
O radical hidroxil é a espécie mais reativa, e a que apresenta meia vida mais curta.
Esta ERO reage amplamente com aminoácidos, fosfolípidios, ácido desoxirribonucleico,
ácido ribonucleico e ácidos orgânicos. O mesmo é tão reativo que não possui sistema de
varredura (“scavenger”), sendo que praticamente todas as moléculas dos organismos vivos
reagem com ele em uma constante de segunda-ordem de 10
9
a 10
10
M
-1
s
-1
(essencialmente,
se o
·
OH entrar em contato com um componente orgânico, uma reação ocorre). Lesões
causadas pelo
·
OH são provavelmente inevitáveis e somente revertidas por processos de
reparo tecidual (BARNES, 1990; BECKMAN, 1990; HALLIWELL & CROSS, 1994).
Fe
++
+ O
2
<————> Fe
+++
+ O
2
-.
2O
2
-.
+ 2H
+
————> O
2
+ H
2
O
2
Fe
++
+ H
2
O
2
————> Fe
+++
+ OH
-
+ OH
.
Figura 3:
Reação de Fenton
Fe
+++
+ O
2
-.
<———-> Fe
++
+ O
2
Fe
++
+ H
2
O
2
————> Fe
+++
+ OH
-
+ OH
.
O
2
-.
+ H
2
O
2
————> O
2
+ OH
-
+ OH
-
Figura 4:
Reação de Haber Weiss.
O radical superóxido, menos reativo do que o
·
OH, ocorre em quase todas as células
aeróbicas e é produzido durante a ativação máxima de neutrófilos, monócitos, macrófagos e
eosinófilos. Apresenta meia vida mais longa do que o
·
OH, sendo capaz de reagir com as
moléculas por mais tempo (ANDRADE JÚNIOR et al., 2005). Apesar de ser considerado
27
pouco reativo em soluções aquosas, tem sido observada lesão biológica secundária a
sistemas geradores de O
2
·-
.
O O
2
·
-
é convertido pela enzima superóxido dismutase (SOD) a H
2
O
2
, sendo este um
mecanismo de combate à formação de radicais livres (KINNULA & CRAPO, 2003;
ANDRADE JÚNIOR et al., 2005). Pode ainda reagir com o ON também pela ação da SOD
para formar o peroxinitrito, em estados inflamatórios (BECKMAN, 1990; CROSS et al.,
1994; ROBBINS et al., 2000; KINNULA & CRAPO, 2003).
O H
2
O
2
, apesar de não ser um radical livre, pela ausência de elétrons
desemparelhados na última camada, é um metabólito do oxigênio que pode ser deletério.
Participa da reação de Fenton (figura 3) que produz
·
OH, ou pode ter um papel
detoxificador pela ação da enzima glutationa peroxidase que pela adição de dois elétrons,
reduz o mesmo a água (FARBER, 1994).
Se não for detoxificado pela glutationa peroxidase, o H
2
O
2
pode reagir com o íon
ferro para gerar espécies oxidantes potentes, como o
·
OH, que interage com alvos celulares
podendo resultar em morte celular (FARBER, 1994; ROMERO et al., 1998; PAXINOU et
al., 2001). Quando este fenômeno envolve ácidos graxos de membrana celular, ocorre a
extração de uma molécula de hidrogênio pela espécie oxidante, gerando uma reação em
cadeia chamada de lipoperoxidação, que apresenta 3 estágios: Iniciação, propagação e
terminação (figura 5).
Na iniciação, a perda do hidrogênio deixa o carbono com um elétron
desemparelhado em sua órbita, formando um radical lipídico, que
tende a se estabilizar, por
rearranjo molecular, formando um dieno conjugado que, ao se combinar com o oxigênio produz
28
lipídios peróxidos (radical peroxil), que são também reativos e podem extrair hidrogênio de
outra molécula lipídica, e assim por diante, gerando um processo autocatalítico em cadeia
que converte muitos dos carbonos dos ácidos graxos de membranas fosfolipídicas em
hidroperóxidos (propagação). Estes peróxidos que são instáveis na presença de complexos
com metais (ferro e cobre), sofrem uma decomposição, originando aldeídos (exemplo:
malondialdeído), hidroperóxidos voláteis (exemplos: pentano, etano) e outros produtos
passíveis de serem identificados laboratorialmente. Nesta etapa de terminação, dois radicais
peroxil poderiam reagir entre si formando um tetróxido instável que se decompõe,
originando oxigênio singlet e carbonilas excitadas. Estas espécies excitadas retornam ao
estado fundamental, emitindo quantas de luz visível. Este processo é conhecido como
quimiluminescência e se constitui num importante método de quantificação da LPO (Figura
5) (BUEGE & AUST, 1978; BOVERIS et al., 1980, 1985; HALLIWELL & CROSS, 1994;
FARBER, 1994; GUTTERIDGE, 1995; ROMERO et al., 1998; RHODEN, 2000).
De acordo com Rhoden (2000):
A lipoperoxidação é uma das mais conhecidas manifestações do dano
oxidativo celular. Representa um processo fisiológico e contínuo nas
membranas celulares, com alterações estruturais e na permeabilidade das
membranas celulares. É um fator de renovação das membranas celulares
e um passo essencial na biossíntese de prostaglandinas e leucotrienos,
bem como na fagocitose, pinocitose e lise de membranas de importantes
organelas intracelulares como as lisossomais e mitocondriais, com
liberação de seus conteúdos, como as enzimas hidrolíticas dos lisossomas,
e formação de produtos citotóxicos (como o malondialdeído), culminando
com a morte celular.
29
Emissão
de luz
visível
á
c
id
o graxo
abstração H
+
radical lipídico
Iniciação
rearranjo molecular
dieno conjugado
combinação O
2
O2O
radical peroxil ácidos graxos
Propagação
(combinação com H
+
)
hidroperóxido lipídico
Fe/Cu reação com outro radical
malondialdeído
1
O
2
pentano
Terminação
QL QL
O
2
CO*
CO
Figura 5:
Representação esquemática das etapas da lipoperoxidação (LPO) de membranas
celulares
1
O
2
= oxigênio singlet e CO* = carbonila excitada (RHODEN, 2000).
30
ESPÉCIES REATIVAS DE NITROGÊNIO
A química das ERN em sistemas biológicos é complexa e ainda não está bem
estabelecida. As principais ERN compreendem o ON, o dióxido de nitrogênio, o ânion
peroxinitrito, o cátion nitronium, nitrosil, ânion nitroxil, e o peroxinitrito alcil. Estas
espécies participam na gênese dos processos oxidativos inflamatórios (ROBBINS et al.,
2000).
A ERN mais estudada é o ON, um radical livre, altamente reativo, gerado por
diversos tipos celulares a partir do aminoácido L-arginina, com características físico-
químicas que permitem ampla difusão entre as células, reagindo principalmente com
espécies de oxigênio, metais de transição e radicais protéicos ou lipídicos (JORENS et al.,
1993; VAN DER VLIET et al., 1997; CONDORELI et al., 2002; ROBBINS et al., 2000).
O ON participa de uma gama de importantes ações biológicas, dentre as quais se destacam
a regulação do tônus vascular, neurotransmissão, citotoxicidade e modulação da resposta
inflamatória, dependendo do tipo celular e do estímulo (MONCADA & HIGGS, 1993;
IGNARRO et al., 1993; VAN DER VLIET et al., 1997; JOSHI et al., 1999; LASS et al.,
2002; RICCIARDOLO et al., 2004). Uma de suas propriedades distintas é possuir uma
meia vida curta (na ordem de segundos) em sistemas biológicos, o que determina sua
variação espacial e extensão temporal de ações. Um mecanismo geralmente reconhecido
para o desaparecimento de ON é a reação com o ânion superóxido, que é responsável pela
formação de nitrito como um produto da oxidação do ON (CROSS et al., 1994;
KRÖNCKE et al., 1997; FLORA FILHO & ZILBERSTEIN, 2000). Intermediários nesta
31
reação são responsáveis por reações nitrosativas que resultam na formação de espécies
biologicamente importantes como as nitrosaminas e nitrosotióis (KRÖNCKE et al., 1997;
WINK & MITCHELL, 1998; LIU et al., 1998).
A conversão de L-arginina para ON é catalisada pelas oxido nítrico sintases (NOS)
uma família de enzimas contendo grupamento heme, com a participação da forma reduzida
do fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídio (NADPH), como um doador de elétron
(JORENS et al., 1993; MONCADA & HIGGS, 1993; GASTON et al., 1994; LASS et al.,
2002). Três isoformas principais de oxido nítrico sintetases (NOS) foram caracterizadas,
sendo cada uma, produto de genes localizados em diferentes cromossomos, com diferenças
em suas propriedades estruturais e bioquímicas: NOS neuronal ou NOS1 (nNOS), NOS
induzível ou NOS2 (iNOS) e NOS endotelial ou NOS3 (eNOS) (DWEICK et al., 1998;
RICCIARDOLO et al., 2004).
As enzimas nNOS e eNOS são constitutivas (cNOS), geralmente presentes nas
células e ativadas por alterações dos níveis de cálcio intracelular por despolarização ou
ativação celular induzida por agonistas, que resulta na geração de pequenas quantidades de
ON (picomolar) que serve como um sinalizador molecular de processos intracelulares. O
ON gerado pela nNOS está envolvido com neurotransmissão, e o ON poduzido pela eNOS
está relacionado com relaxamento do músculo liso vascular na regulação da pressão arterial
sistêmica e pulmonar. Estando esta última relacionada com a homeostase das vias aéreas,
mantendo o calibre brônquico e regulando a freqüência dos movimentos ciliares; com a
circulação pulmonar, equilibrando a relação ventilação-perfusão (WINK & MITCHELL,
1998; FLORA-FILHO & ZILBERSTEIN, 2000; EYNOTT et al., 2002; RICCIARDOLO et
al., 2004).
32
A terceira forma, iNOS é produzida por estímulo imunológico ou inflamatório a partir
de algum mecanismo externo e é expressa via mecanismos independentes de cálcio,
levando a produção de quantidades mais elevadas de ON (nanomolar), que pode ter efeitos
citostáticos e citotóxicos (WINK & MITCHELL, 1998; EYNOTT et al., 2002). A iNOS
epitelial brônquica, continuamente formada em seres humanos saudáveis, é responsável
pela defesa imunológica a agentes externos inalados, principalmente pelo recrutamento de
macrófagos epiteliais e subepiteliais (KOBZIK et al., 1993; GUO et al., 1995). Isto é
demonstrado pela queda da resistência às infecções broncopulmonares com administração
de análogos da L-arginina in vitro e in vivo (FLORA FILHO & ZILBERSTEIN, 2000). A
indução da síntese do ON durante processos inflamatórios representa um mecanismo de
defesa contra microorganismos invasores (COFFEY et al., 2000), mas sua formação
excessiva está implicada em lesão tecidual do hospedeiro (PITT & CROIX, 2002).
A síntese enzimática de ON pode ser inibida por análogos da L-arginina tais como
N
G
-monometil-L-arginina (L-NMMA), N
G
-nitro-Larginina (L-NNA) e N
G
-nitro-L-
arginina-metiléster (L-NAME). Estes inibidores têm grande importância na pesquisa dos
prováveis efeitos do ON nos tecidos, uma vez que a substituição do substrato habitual (L-
arginina) pelos análogos irá inibir a produção de ON e seus efeitos conseqüentes (WINK &
MITCHELL, 1998).
O ON possui propriedades pró e antioxidantes, dependendo do tecido onde irá atuar, e
das suas concentrações locais, isto é, baixos níveis de ON (nanomolar) têm ação protetora e
níveis mais elevados (micromolar), gerados durante condições patológicas, têm ações
deletérias (CROSS et al., 1994; KRÖNCKE et al., 1997; WINK & MITCHELL, 1998;
JOSHI et al., 1999). Efeitos imunomoduladores do ON têm sido documentados, com um
33
efeito antiinflamatório com suplementação de ON e com um efeito pró-inflamatório com
inibição das enzimas NOSs (COMHAIR & ERZURUM, 2002; TAVAF-MOTAMEN et al.,
1998).
A produção do ON através da L-arginina em macrófagos de ratos constitui um
mecanismo primário de defesa contra células tumorais e microorganismos extracelulares,
através da síntese de nitrato e nitritos, que são citotóxicos contra estas células (MONCADA
& HIGGS, 1993). Por outro lado, esta geração dependente de L-arginina, ao ser inibida por
análogos da L-arginina, reduz o efeito protetor demonstrando que a síntese de óxidos de
nitrogênio nos macrófagos é dependente da intermediação do ON. Já a produção de ON sob
condições de estresse oxidativo gera, secundariamente agentes oxidantes poderosos (ERN)
que podem modular o desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas das vias aéreas
e/ou amplificar a resposta inflamatória. Muitos estudos demonstram uma participação
significativa dos óxidos de nitrogênio na modulação da função pulmonar e na patogênese
de várias doenças pulmonares como a asma (EYNOTT et al., 2002; RICCIARDOLLO et
al., 2004).
Alguns autores demonstraram que a concentração de S-nitrosotióis, nitrito, e óxido
nítrico exalado (ONe) estão aumentados em algumas doenças inflamatórias das vias aéreas.
Estudos prévios têm demonstrado que vários componentes da poluição aérea estão
associados com aumento dos níveis de ONe (KIM et al., 2003; STEERENBERG et al.,
2001; VAN AMSTERDAM et al., 1999), sugerindo a participação do ON nos processos
inflamatórios pulmonares secundários a poluição do ar. Essas alterações inflamatórias
subclínicas, detectadas pela medida do ONe, desempenham uma importante etapa na
patogênese dos efeitos cardiopulmonares induzidos pela exposição à poluição do ar
34
(ADAMKIEWICZ et al., 2004). Um estudo realizado com crianças de centros urbanos
demonstrou um aumento significativo no ONe com aumento de exposição a MP e fumaça
negra (“black smoke”) (STEERENBERG et al., 2001). Em um estudo animal, a exposição
a partículas de exaustão de diesel, outro componente de poluição aérea, resultou em
aumento do ONe em ratos (LIM et al., 1998).
Muto et al (1996) e Takano et al (1999) demostraram que ON produzido pelo iNOS
pode aumentar a resposta induzida por partículas de exaustão de diesel (PED), enquanto
ON derivado de cNOS pode desempenhar um papel protetor contra a inflamação de vias
aéreas. Devido ao fator protetor do ON derivado da cNOS, a redução de níveis de ON pode
ser um fator que contribui para o aumento da inflamação das vias aéreas e sintomas
respiratórios vistos em estudos prévios em indivíduos expostos a ROFA e outras partículas.
LIM et al (1998) demonstraram um aumento significativo na produção do ON a partir da L-
arginina por cNOS e iNOS nas vias aéreas que está envolvido em desordens respiratórias.
Medindo as alterações na concentração do ON no ar exalado de ratos, bem como alterações
no tônus das vias aéreas em resposta a partículas de exaustão de diesel, encontraram um
aumento de duas vezes no ONe de ratos tratados, comparado com os animais controle, um
efeito que pode ser suprimido pela administração de L-NMMA (inibidor de NOS). Assim
como a hiperresponsividade induzida por PED.
35
INTERAÇÃO ENTRE ÓXIDO NÍTRICO E ESPÉCIES REATIVAS DE
OXIGÊNIO:
A interação entre ON e ERO tem assumido um papel importante devido à geração
simultânea de ambos em diversas condições fisiopatológicas. Estas interações seguem
diferentes vias resultando em proteção ou produção de produtos finais mais tóxicos (ZHU
et al., 1998; PAXINOU et al., 2001).
Em condições normais ou em baixas concentrações, o ON pode interagir com o O
2
·-
,
protegendo o pulmão contra as ações deletérias deste último, atuando por ação direta na
“varredura” (“scavenger”) deste radical livre ou através da inibição da geração de O
2
·-
por
ação direta em componentes de membrana da NADPH oxidase como demonstrado em
neutrófilos (CLANCY et al., 1992; CROSS et al., 1994). Este efeito citoprotetor pode ainda
ocorrer por reagir com radicais lipídicos com redução da lipoperoxidação, bem como com
íon de ferro interferindo com a reação de Fenton, atuando assim como um antioxidante
(JOSHI et al., 1999; COMHAIR & ERZURUM, 2002).
Por outro lado, a potencialização de estresse oxidativo por altas concentrações de ON
ocorre quando este reage com O
2
·-
rapidamente para formar peroxinitrito, um forte oxidante
que pode contribuir para destruição tecidual pulmonar e inflamação, quando citocinas
promovem o aumento da produção de ambos ON e O
2
·-
(BECKMAN et al., 1990;
ROBBINS et al., 2000). Esta ação oxidativa do ON está relacionada com disfunção
mitocondrial (JOSHI et al., 1999). O achado de nitrotirosina formado pela reação do
peroxinitrito com aminoácidos aromáticos, nos pulmões de pacientes com síndrome do
36
desconforto respiratório agudo e a atenuação experimental por inibidores da NOS de dano
pulmonar causado por estresse oxidativo sugerem um papel para o ON via produção de
peroxinitrito no dano pulmonar (CROSS et al., 1994).
Níveis elevados de iNOS têm sido encontrados em macrófagos alveolares e células
teciduais pulmonares de humanos obtidos de pacientes com síndrome do desconforto
respiratório agudo e outras doenças pulmonares inflamatórias (CROSS et al., 1994;
MATALON et al., 2003). É provável que a expressão do iNOS e a geração de ON no
compartimento alveolar de humanos esteja sob um controle delicado para proteger o
hospedeiro do ON e de radicais peroxinitrito, que podem causar destruição progressiva e/ou
remodelação fibrótica do tecido pulmonar. (PECHKOVSKY et al., 2002).
Durante um estado inflamatório como isquemia/reperfusão intestinal, o metabolismo
do óxido nítrico é precipitado por reação com ERO. Esta redução por parte de ERO nos
níveis de ON endógenos pode funcionar como um acelerador da cascata da inflamação. A
iNOS atinge picos de ação 4 horas após isquemia/reperfusão intestinal ou administração de
lipopolisacarides. Talvez o estado pró-inflamatório produzido pela aceleração do
metabolismo do ON pelas ERO seja balanceado por aumento na síntese de ON pela iNOS
(TAVAF-MOTAMEN et al., 1998).
A capacidade do ON interromper as reações envolvendo a lipoperoxidação sugere
que esta molécula desempenha um papel crítico na patogênese de várias doenças.
Aumentos na concentração de ON versus O
2
•-
pode ser essencial na terapia de doenças
pulmonares e cardiovasculares, uma vez que elevadas concentrações de ON
favorecem a
inibição da lipoperoxidação. Enquanto estudos têm proporcionado evidências significativas
37
de que o óxido nítrico funciona como um antioxidante (MUTO et al., 1996) investigações
devem prosseguir para melhorar a nossa compreensão sobre a importância desta molécula
em outras doenças pulmonares e cardiovasculares (COMHAIR & ERZURUM, 2002).
De acordo com Hart (1999) a falta de conhecimento sobre o comportamento em
sistemas orgânicos complexos limita nossa capacidade para predizer com acurácia quais
efeitos prevalecem em um estado patofisiológico qualquer. Por estas condições, existe um
consenso que intervenções terapêuticas envolvendo a modulação dos níveis de óxido nítrico
são de difícil realização porque a quantidade de ON deveria ser mantida em um nível
crítico, alto o bastante para ser protetor, mas não alto o suficiente para ser lesivo.
A maioria dos estudos sobre material particulado tem focado os mecanismos de
espécies reativas de oxigênio; poucos têm examinado o envolvimento de espécies reativas
de nitrogênio, embora, por exemplo, o ON possa potencialmente contribuir para a ativação
do fator nuclear κB em células epiteliais e macrófagos alveolares de roedores por material
particulado. Entretando a produção de ON em macrófagos alveolares humanos é baixa ou
indetectável em resposta a estímulos que aumentam produção de citocinas, tanto que um
papel para o ON na reposta de citocinas a MP em seres humanos é menos bem
estabelecido. Estresse oxidativo por ERO e ERN permanece como um provável mecanismo
fundamental de toxicidade a MP apesar de muitas questões sobre componentes específicos
e detalhes nos alvos celulares e interações partículas-células permanecem sem resposta
(TAO et al., 2003).
38
OBJETIVO GERAL
Estudar a injúria tecidual e o estresse oxidativo induzidos pela exposição aguda
ao material particulado (MP
10
) da atmosfera da cidade de Porto Alegre e sua modulação
pela via do óxido nítrico.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar as alterações inflamatórias (contagem celular total e proteínas no lavado
broncoalveolar e edema tecidual) e oxidativas (lipoperoxidação pulmonar) induzidos
pela exposição a MP
10
do ar da cidade de Porto Alegre por períodos de tempo de 6 ou
20 horas contínuas, bem como por 20 horas intermitentes (5h/dia por 4 dias
consecutivos);
2. Avaliar se a exposição a MP
10
do ar de Porto Alegre por 20 horas contínuas promove
alterações histológicas no pulmão de ratos;
3. Avaliar se as alterações oxidativas, inflamatórias, histológicas decorrentes da exposição
a MP
10
podem ser moduladas pelo pré-tratamento com L-NAME e/ou L-arginina,
respectivamente antagonista e precursor do óxido nítrico.
39
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ARTIGO CIENTÍFICO 1:
Submetido a Brazilian Journal of Medical and Biological Research (Fator de Impacto:
0,824 - JCR-2004).
65
Lung Oxidative Stress and Inflammatory Responses in Rats After Short-Term Inhalation
Exposure to Particulate Air Pollution in Porto Alegre, Brazil.
C.E.L., Pereira
1
T.G., Heck
1
P.H.N., Saldiva
2
C.R., Rhoden
1
1
Curso de Pós-graduação em Ciências Médicas e Laboratório de Estresse Oxidativo e
Poluição Atmosférica. Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre.
Porto Alegre, RS, Brasil.
2
Laboratório de Poluição Atmosférica Experimental, Departamento de Patologia (LIM05).
Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
This work was supported by Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto
Alegre, Brasil. C.E.L. Pereira is supported by a fellowship from Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, and Dr C.R. Rhoden and Dr.
P.H.N. Saldiva are supported by - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico – CNPq. The authors declare they have no conflict of interest.
66
Correspondence:
Claudia Ramos Rhoden.
Rua: Jaraguá, 370/302. Bela Vista.
CEP: 90450-140. Porto Alegre – RS. Brasil
e-mail: crhoden@fffcmpa.edu.br
phone:55 51 32248822 ramal 112
fax: 55 51 32248822 ramal 129
Running Title:
Lung effects of air pollution in city of Porto Alegre
Key words: Oxidative stress, reactive oxygen species, particulate air pollution, lung
inflammation, acute effects.
67
Abstract:
In vitro and in vivo studies have demonstrated chronic and acute toxicity of particulate air
pollution. The aim of the current study was to analyze the acute effects of ambient levels of
particulate matter in the city of Porto Alegre on lung oxidative stress and inflammatory
responses in rats. Animals were maintained in the chambers 6 h (continuous), 20 h
(continuous) or 20 h (intermittent – 5h, 4 consecutive days). The first chamber received air
that had passed through on filter and the second received ambient air. Rats breathing
polluted air for 20 h continuously showed significant increase in the number of leukocytes
in bronchoalveolar lavage, as compared with air-filtered group (p= 0.041) and in the lung
oxidative stress (p =0.04), determined by the Thiobarbituric Substances Reactive Test
(TBARS). There was not difference in these outcomes in the group of rats breathing air
pollution for 6 h continuously (leukocytes - p= 0.464; oxidative stress - p= 0.95). The
oxidative stress imposed by 20-h exposure to polluted air was not associated with
significant increases in the lung water content. This study suggests that short-term
inhalation of ambient concentrations of particulate air pollution in Porto Alegre, was able to
promote biological hazards.
68
Introduction:
Airborne particulate matter (PM) consists of a heterogeneous mixture of solid and
liquid particles suspended in air, varying in size and chemical composition, as well as in
space and time. PM is classified considering to the size of its components in 3 categories:
coarse fraction – aerodynamic diameter between 10 and 2.5 µm (PM
10-2.5
) that penetrate
and deposit in the tracheobronchial tree; fine particles - aerodynamic diameter between 2.5
and 0.1 µm (PM
2.5
) that can reach the small airways and alveoli; and ultra fine particles-
aerodynamic diameter < 0.1 µm (PM
0.1
) that demonstrate very high deposition in human
alveoli and may be able to pass directly into the circulatory system, which could allow them
to the disseminated systemically (1-3).
Primary particles are emitted directly into the atmosphere, such as diesel soot,
whereas secondary particles are created through physicochemical transformation of gases.
The natural and anthropogenic sources of PM include motor vehicle emissions, tine
fragmentation and resuspension of rood dust, volcanic emissions, forest fires, power
generation, and industrial activities. Common constituents of PM include nitrates, sulfates,
elemental and organic carbon, organic compound, biological compounds (eg: endotoxin),
and a variety of metals (eg: iron, copper, fragment nickel, zinc and vanadium) (4).
Epidemiological studies show that exposure to PM is associated with increased of
cardiopulmonary morbidity and mortality (5-13), hospital admissions (14, 15) and sudden
death (16). However, the mechanism by which PM promotes these effects is still not well
understood. Stringer & Kobzik (17) suggested that PM toxicity might be due to increased
69
generation of reactive oxygen species in target cells. Gurgueira et al. (18) reported that
short-term exposure to concentrated ambient particles (CAPs) leads to significant increase
in the levels of oxidants in the heart and lung of rats which was associated with edema in
these tissues. Two years later, Rhoden et al. (19) showed that previous treatment with a
general antioxidant (N-acetylcysteine- NAC) prevented lung inflammation induced by
short-term CAPs exposure.
Experimental studies have demonstrated significant respiratory (20) reproductive
(21) and cardiovascular (22) alterations after prolonged exposures to ambient levels of PM.
The aforementioned results indicate that particles in the atmosphere of the large cities of
developing countries contain levels of toxic species in levels high enough to induce
damage. In the present study we investigated the acute pulmonary adverse of ambient levels
of PM of the city of Porto Alegre, by evaluating the ability of PM to promote oxidative
stress and inflammatory responses in the lung of rats.
Materials and Methods
Site of Exposure
Porto Alegre has a population of approximately 1.5 million inhabitants; it is the
central city of a metropolitan industrialized area of 3.2 million inhabitants. The vehicle fleet
was of 522.555 vehicles in March 2004 (23), approaching 1 vehicle for every 2.7
individuals, and there is a significant increased of 4.5% vehicles by year. The vehicular
traffic is the mainly source of air pollution in the bigger cities of Brazil, being responsible
70
by approximately 90% of CO and PM
10
emissions, with the air pollution representing a
serious problem in many regions. (24, 25). Porto Alegre has a 496.827 Km
2
of total area,
with 40% of the urban area occupied by the transportation structure (23). This city
frequently presents thermal inversions and defined climate seasons. Over the year the
average of temperature varies from 18 e 25ºC, and the average of rain days varies from 3 to
6 days/month (based on 8 years of historical weather readings) (climate zone
http://www.climate-zone.com/climate/brazil/fahrenheit/porto-alegre.htm
).
Animals
Adult, 3 month old, male, Wistar rats from the Animal Facility of Fundação
Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre were used. Animals were fed with
a conventional laboratory diet (Supra-lab, Alisul Alimentos S/A., Brazil) and water ad
libitum, before and during the exposure.
Exposure Chambers
Exposure chambers were made of glass (30 x 30 x 50 cm) and were hermetically
closed, with the exception of one entrance (connected to the outdoor environment) and one
exit. A vacuum pump was connected to the exit and pumped outdoor air through the
exposure chambers at a flow rate of 10 liters per minute (Figure 1). Inhalation chambers
were located in the second floor the Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de
Porto Alegre Building, located in Porto Alegre, downtown, at a crossroad with heavy
traffic, facing an automated air pollution monitoring station of the State Environmental
71
Agency, that provides continuous PM
10
measurements (beta monitor). One of the chambers
(designated as control) received a Teflon filter (Millipore, Ireland) in the inlet, thus
avoiding the admission of ambient particles major than 2,5 µm (PM<10
µ
m - filtered air
group), whereas the other received atmospheric air without the filter system (designed as
polluted group). The temperature in the room and in the chamber was 22
±
2ºC.
Experimental Protocol
Continuous Short-Term Exposure to PM
Rats were exposed to ambient particles (polluted group) or filtered air (control group)
for periods of 6 (on August 4
th
, 2004) or 20 hours (on August 17
th
, 2004), as described
above. The animals were awake and unrestricted during the exposure and both groups were
exposed and tested simultaneously. Immediately after the exposure animals were
anesthetized (pentobarbital, 50 mg/kg, ip) and killed by exsanguination. The right lung of
each animal from both groups was excised and quickly frozen in liquid nitrogen for
oxidative stress evaluation and the left lung of each animal was excised and used to
determine the lung edema. Another set of animals followed the same protocol described
previously and submitted to bronchoalveolar lavage 24 h later to determine the
inflammatory parameters. The protocol of bronchoalveolar lavage for the six-hour exposure
was performed in two different days (July, 12
th
and July 20
th
, 2004), whereas the twenty-
hour exposure was performed on September 17
th
, 2004. Ambient levels of PM
10
in the days
of exposure are depicted in Table 1.
72
Intermittent Short-Term Exposure to PM
Rats were exposed to consecutive PM
inhalations (polluted group) or filtered air
(control group) during periods of 20 hours (5 h/day, 4 consecutive days, from September 6
th
to 9
th
, 2004), as described above. Ambient PM
10
concentrations of exposure days are
depicted in Table 1. The animals were awake and unrestricted during the exposure and both
of the groups were exposed and tested simultaneously. Immediately after the last exposure
the animals were submitted to the same procedure to collect the lung samples for oxidative
stress determination and edema evaluation.
Tissue preparation
After the excision of the lung, they were excised, washed in saline solution and
quickly frozen in liquid nitrogen. For the determination of Thiobarbituric Acid Reactive
Substances (TBARS) tissue samples were homogenized in 5 volumes of 120mM KCl,
30mM phosphate buffer (pH = 7.4) added with protein inhibitors 0.5mM PMSF at 0-4
0
C.
The suspensions were centrifuged at 600g for 10 min at 0-4
0
C to remove nuclei and cell
debris. The pellets were discarded and the supernatants were used as homogenates.
Determination of TBARS – Lipid Peroxidation
TBARS were measured in lung homogenates. Homogenates were precipitated with
10 % TCA, centrifuged, and incubated with thiobarbituric acid (Sigma, Chem. Co.) for 15
73
minutes at 100
0
C. TBARS were extracted using butanol (1:1). After centrifugation, the
absorbance of the butanol layer was measured at 535nm (26). The concentration of
TBARS formed was expressed in nanomoles of malondialdeyde per milligram of protein.
Protein concentration in homogenates was measured by the Bradford Protein Assay (27)
using bovine serum albumin as standard. Measurements were carried out in a Perkin Elmer
Lambda 40 spectrophotometer.
Lung edema (Wet-dry ratio)
The severity of pulmonary edema was assayed by the wet-dry ratio. Lung samples
(around 200mg) taken from the same animals used for the determinations of TBARS were
weighed and then dried in a conventional oven at 90˚C and reweighed 24h after to obtain
the wet/dry ratios.
Bronchoalveolar lavage (BAL)
Rats exposed to polluted or filtered air were anesthetized with sodium pentobarbital
(50mg/kg body weight) 24 h after exposure. They were euthanasied by exsanguinations and
the trachea was sectioned and one fine catheter was introduced and fixed with cotton
thread, and 21 mL of sterile saline solution was injected in three series of 7 mL, followed
by aspiration. The rate of recovery of the injected solution was approximately 80%. Each
aliquot represents one in and out recovery of fluid. The recovered fluid was centrifuged
(400g) at 6°C, and the supernatant from the first lavage was saved for measurement of
protein level. Total cell counts were determined after trypan blue stain using a Neubauer
74
chamber. Total protein levels, as measure of vascular permeability, were measured in the
supernatant of the first lavage aliquot using the Bradford Protein Assay (27). This
measurement was carried out in a Perkin Elmer Lambda 40 spectrophotometer.
Statistical analysis
Data were analyzed statistically by the Student-t Test for comparison of the means.
All statistical analyses were performed using Sigma-Stat 2.0 Software (Jandel Corporation,
1992-1995) for windows. The level of significance was set in 5%.
Results
Rats breathing PM
for 6 h did not show increase of oxidative stress in lung (p= 0.95,
Figure 2A). However, rats exposed to PM
for 20h (continuous) presented an increase of
oxidative stress in the lung (p =0.04, Figure 2B), that was not found in the group of rats
exposed to PM
10
20 h intermittently (p=0.272, Figure 2C).
Rats exposed to filtered air or not during 6 hours did not demonstrate increase in
leukocytes in BAL (p= 0.464, Figure 3A). In agreement with the results of lipid
peroxidation, rats exposed to PM
for 20 hours (continuous) led to a significant
accumulation of leukocytes in BAL, as compared with BAL from rats of air filtered group
(p= 0.041, Figure 3B). However, accumulation of leukocytes in BAL was not accompanied
by significant changes of total levels of protein (Table 2). Finally, the wet/dry ratio, a
measurement of global tissue damage, was not changed by PM
exposure as demonstrated in
Figure 4 (p>0.05).
75
Discussion
This research was conducted exposing rats to polluted (urban) or clean (filtered)
ambient air for short-term. Their lungs were evaluated for oxidative stress and showed
time-dependent increase of lipid peroxidation. Rats exposed to PM for 20 hours presented
almost 2-fold increase of oxidative stress as compared to rats exposed for 6 hours. Our
results agree with previous studies with animals breathing CAPS for 5 hours, which
presented an increase on the oxidant level in the lung and heart (18, 28). The rapid increase
in the lung/heart concentrations of reactive oxygen species upon exposure to PM indicates
an almost immediate effect of particles, or particle components, on the intracellular sources
of free radicals (29). The transient nature of these increases points to a reversible
interaction of particle components with cellular targets. Both observations would be
compatible with Fenton-type reactions catalyzed by transition metals, redox-cycling
processes, or biochemical changes triggered by non-covalent binding to membrane
receptors. It is also important to notice that PM concentrations in the CAPs model studies
were 300-400
µ
g/m
3
(total mass- in average) while in our study it was between 110 - 140
µg/m
3
. In addition, our findings showed that even lower concentration of PM, considered
safe, was able to promote oxidative stress in the lung with exposition of 20 hours.
The ability of particulate air pollution to up-regulate antioxidant enzymes (18)
could explain why rats exposed to intermittent 20 hours (5 hours/day on 4 consecutive
days) did not demonstrate increase in the oxidant levels in the lung. This pattern of
response agrees with results of another author (Godleski JJ, personal communication)
76
showing that exposure to CAPS increase by 70% MnSOD and 30% catalase activities as
well as the lung mRNA levels of these enzymes, what was found in rats exposed to CAPs
aerosol for 6 hours/day on 3 consecutive days.
Proinflammatory and toxic effects of PM have been reproduced in the laboratory in
humans (30), in animal models (31, 32) and in cells in culture (33). Pulmonary oxidative
stress is related to polymorphonuclear neutrophil (PMN) count in BAL, PMN infiltration
(34-37) and these biological effects were prevented by NAC treatment (19). We observed
that rats exposed to PM for 20 hours in the Porto Alegre atmosphere led to a significant
accumulation of PMN leukocytes in BAL (Figure 3B), but this was not detected in rats
submitted to 6 hours of exposure (Figure 3A). PMN influx was not accompanied by
significant changes in total protein levels similar to the findings of Rhoden et al (19) (Table
2). PM-induced oxidative stress is associated with the development of lung inflammation
and tissue damage, as described by other authors (35, 38, 39). However, the wet/dry ratio, a
measurement of global tissue damage, did not show significant increase as a function of
exposure-time in the present study which is in disagreement with results observed by other
authors that showed significant development of lung edema in animals exposed to CAPs for
5 hours (18). One explanation for these different results may be related to the different
levels and/or composition of PM observed in atmospheric air regarding geographical sites.
Unfortunately, one limitation of the present study is that we did not determine the
composition of PM. To emphasize this point of view is the fact that experimental studies
with CAPs have been performed with higher doses of PM, resulting on different levels of
lung inflammatory effects. However, our experimental design has an advantage to
reproduces real concentration of PM in which effects have been detected in epidemiological
77
studies (5-13) and the results observed offer important evidence regarding inflammation
and oxidant effects of PM in locals with acceptable pollution indexes.
In conclusion, our data showed for the first time that the short-term inhalation of
“acceptable”, (below the current Brazil standard of 150
g/m
3
/24 hr) concentrations of
particulate air pollution in Porto Alegre was able to generate oxidative stress in the lung
tissue and inflammatory response of broncheoalveolar tree, in rats.
Acknowledgments:
Special thanks for technical assistance to the staff of Laboratory of Experimental Air
Pollution of Medical School – University of São Paulo, Brazil. We also thank the Porto
Alegre Ambient Protection State Foundation (FEPAM) for providing atmospheric data.
78
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84
Table 1: Composition Experimental table day by day:
Date Time of exposure [PM] µg/m
3
July/12/2004 6 hs Missing
July/20/2004 6 hs Missing
August/04/2004 6 hs 224,7
August/17/2004 20 hs 138,6
September/ 6 to 9/2004 5 hs by day (20 hs total) 99,2
September/17/2004 20 hs 122,4
85
Table 2. Total protein level in bronchoalveolar lavage of rats exposure to PM
10
for
continuous short-term – 6hours or for continuous short-term – 20 hours.
______________________________________________________________________
Groups Time of exposure (hours) Total Protein (mg/mL) p
______________________________________________________________________
Control 6 0.96± 0.10
Polluted 6 1.05
±
0.08 0.607
Control 20 1.34
±
0.14
Polluted 20 1.39± 0.09 0.763
_____________________________________________________________________
Values represent the mean of 5- 6 independent determinations ± SEM .
86
List of figures:
Figure 1. Schematic representation of exposure chambers
87
Figure 2. Lipid peroxidation in lung of rats exposure to PM
10
for continuous short-term –
6h (A), continuous short-term – 20 hours (B) and intermittent short-term – total 20 hours.
Values represent the mean of 4- 8 independent determinations ± SEM . * p=0.040 as
compared to control group (B).
88
Figure 3. Total cell number in bronchoalveolar lavage of rats exposure to PM
10
for
continuous short-term – 6h (A), continuous short-term – 20 hours (B). Values represent the
mean of 5- 6 independent determinations ± SEM . * p=0.041 as compared to control group
(B).
89
Figure 4. Wet/dry ratio in lung of rats exposure to PM
10
for continuous short-term – 6h (A),
continuous short-term – 20 hours (B) and intermittent short-term – total 20 hours (C).
Values represent the mean of 4- 8 independent determinations ± SEM . p>0.05.
90
ARTIGO CIENTÍFICO 2:
Submetido a Environmental Research (Fator de Impacto: 1.793 - JCR-2004).
91
Lung Oxidative Stress Induced by Particulate Matter Inhalation – The Role of the Nitric
Oxide Pathway.
Carlos Eurico L. Pereira
a
, Paulo H. N. Saldiva
b
, Claudia R. Rhoden
a
a
Course of Pos-Graduation in Medical Sciences and Laboratory of Oxidative Stress and
Atmospheric Pollution. Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto
Alegre (FFFCMPA). Porto Alegre, RS, Brazil.
b
Laboratory of Experimental Air Pollution. Medical School – University of São Paulo
(USP). São Paulo, SP, Brazil.
Correspondence:
Claudia Ramos Rhoden.
Rua: Jaraguá, 370/302, Bela Vista. Porto Alegre – RS. CEP: 90450-140. Brazil
Phone: 55-51-32248822 ramal 112
Fax:55-51-32248822 ramal 129
e-mail: crhoden@fffcmpa.edu.br
Page proofs should be sent to Claudia Ramos Rhoden
92
Abstract:
Epidemiological studies have demonstrated that exposure to particulate air pollution (PM)
is associated with an increase of cardiopulmonary diseases. Short term exposure to
concentrated ambient particles (CAPs) promotes significant oxidative stress (OS) in lung
and oxidants are mediators of the lung inflammatory responses induced by CAPs in animal
models. Our objective was to study the role of nitric oxide (NO) pathway in the lung OS of
rats exposed to PM for a short term in a real world situation in Porto Alegre city, Brazil.
Adult, male, Wistar rats were exposed to inhalation of either PM
10
(polluted) or filtered air
(control –PM <10µm) for 20 hours. Immediately prior to exposure rats received saline, L-
NAME (20mg/kg), L-arginine (200mg/kg) or L-NAME (20mg/kg) + L-arginine
(200mg/kg), i.p. After the exposure the animals were sacrificed and the lungs excised to
histology and oxidative studies. Histology demonstrated inflammatory bronchiolar lesions
in the exposed animals, but no differences between groups tested with drugs were detected.
OS was immediately evaluated by the thiobarbituric reactive substances method (TBARS)
and showed increase of OS in the lung of animals exposed to PM10 (control= 0.148±0.015;
polluted=0.226±0.005 nmol MDA/mg protein, p =0.04). L-NAME pre-treatment promoted
significant OS in the polluted group (0.301±0.012 nmol MDA/mg protein, p <0.05) and L-
arginine prevented OS (0.176±0.025 nmol MDA/mg protein, p <0.05) and the association
of L-arginine + L-NAME (0.119±0,026 nmol MDA/mg protein, p <0.05) did not attenuate
the index of oxidative stress. These results suggest that the NO pathway has a critical role
in the OS induced by PM, protecting cellular damage
Key words: Oxidative stress, particulate air pollution, reactive oxygen species, lung
inflammation, nitric oxide.
93
This work was supported by Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto
Alegre, Brasil. C.E.L. Pereira is supported by a fellowship from Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, and Dr C.R. Rhoden and Dr.
P.H.N. Saldiva are supported by - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico – CNPq. The authors declare they have no conflict of interest.
The authors assure that the study was conducted in accordance with national and
institutional guidelines for animal welfare. All animals used in the research were treated
humanely, with due consideration to the alleviation of distress and discomfort. This
protocol was approved by the Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas Ethical
Committee for Research (CPA 085/03).
94
1. Introduction
The toxic effects of particulate air pollution has been linked to numerous adverse
health effects (Schwartz 1994, 1995, 2002; Pope et al. 1995; Pope 2000; Hunt et al. 2003)
including increased hospital admissions (Braga et al. 1999; Zanobetti et al. 2000; Atkinson
et al. 2001; Farhat et al. 2005) increase of emergency room visits (Jaffe et al. 2003; Martins
et al 2002a, 2002b; Farhat et al 2005) respiratory symptoms (Jalaludin et al. 2004),
exacerbation of chronic respiratory (Schwartz 1993; Luttinger et al. 2003) and
cardiovascular diseases (Peters et al. 2001; Dockery 2001), decreased lung function
(Chestnut et al. 1991; Koenig et al, 1993; Delfino et al. 2004), and premature mortality
(Dockery et al. 1993; Saldiva et al. 1995; Pereira et al. 1998; Pope III 2000; Samet et al.
2000; Kaiser et al. 2004; Lin et al. 2004).
The mechanisms by which PM is responsible for the observed health effects is not
well understood yet. Several studies have demonstrated increase of oxidative stress in the
lung cells by direct or indirect actions. At the first one, the components of particles
stimulate the intracellular sources of reactive oxygen species (ROS) on critical cells in
pulmonary inflammation such as alveolar macrophages, epithelial cells, and
polymorphonuclear granulocytes (Barnes 1990; Gurgueira et al. 2002; Kelly 2003; MacNee
2001; Tao et al. 2003). The second one is related to pro-inflammatory mediators released
from PM-stimulated macrophages or neural stimulation after particle deposition in the
lungs. (Barnes et al. 1990; Becker 2002; Tao et al. 2003; González-Flecha 2004; Rhoden
et al. 2005).
Nitric oxide (NO) may play diverse roles in physiological and pathological
processes. Depending on its concentration, NO can be involved in neurotransmission, in
95
regulation of smooth muscle and vascular tone, in vascular permeability as well as in
immune response (Gross, 1995). In the respiratory tract NO has multifunction, varying
from an endogenous modulator of the airway function to a proinflammatory and
immunomodulatory mediator in pathophysiological conditions, characterizing a dual effect:
cytotoxic or cytoprotective (Ricciardollo, 2004). NO is synthesized from the oxidation of
L-arginine to NO by a family of isoforms of nitric oxide synthases (NOS). Some isoforms
are constitutive (neuronal and endothelial NOS) and activated by calcium, whereas other
isoforms are inducible (iNOS) and regulated by transcriptional mechanisms (Moncada and
Higgs 1993; Ignarro et al. 1993). These enzymes are localized in a variety of cells of the
respiratory tract, including epithelial cells, smooth muscle cells, and also pulmonary
leukocytes such as macrophages, eosinophils and neutrophils. Guo et al (1995)
demonstrated that iNOS is continuously expressed in airway epithelial cells of normal
nonsmoking individuals, suggesting that respiratory epithelial cells are key inflammatory
cells in the airway. NO is considered a free radical reacting with other molecules such as
thiols, transition metals and oxygen and will be rapidly and spontaneously auto-oxidize to
yield a variety of nitrogen oxides (NO
2
, N
2
O
3
, NO
2
-
). NO may also interact with the
superoxide radical (O
2
•-
) to generate peroxynitrite anion (
•
ONOO
-
), which contributes to
the tissue destruction and inflammation. On the other hand, NO may attenuate
inflammation by nitrating inflammatory proteins such as the chemokines (Robbins et al.
2000). These mechanisms could explain the dual effects of NO.
The purpose of this study was to determine the role of L-arginine (a precursor of
NO) and N
G
-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), a NOS inhibitor on oxidative stress
96
and histologic alterations in the lungs of rats exposed for short-term to PM air pollution in
the city of Porto Alegre, Brazil.
2. Materials and Methods
2.1 Site of Exposure
Porto Alegre has a population of approximately 1.5 million inhabitants; it is the
central city of a metropolitan industrialized area of 3.2 million inhabitants. The vehicle fleet
was of 522.555 vehicles in March 2004 (BNDES, 2003), approaching 1 vehicle for every
2.7 individuals, and there is a significant increase of 4.5% vehicles by year. The vehicular
traffic is the main source of air pollution in the bigger cities of Brazil, being responsible by
approximately 90% of CO and PM
10
emissions, with the air pollution representing a serious
problem in many regions. (Massad et al., 1985; Saldiva, 1998). Porto Alegre has a 496.827
Km
2
of total area, with 40% of the urban area occupied by the transportation structure
(BNDES, 2003). This city presents thermal inversions frequently and defined climate
seasons. In average the temperature varies from 18 e 25ºC, and the average of rain days
varying from 3 to 6 days/month (based on 8 years of historical weather readings) (climate
zone http://www.climate-zone.com/climate/brazil/fahrenheit/porto-alegre.htm
).
2.2 Animals
97
Adult, 3 months old, male, Wistar rats from the animal facility of Fundação
Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre were used. Animals were fed with
a conventional laboratory diet (Supra-lab, Alisul Alimentos S/A., Brazil) and water ad
libitum, before and during the exposure.
2.3 Drugs
We used the following drugs: solution of L-arginine (200 mg/ml – VETEC Química
Fina Ltda, Brazil), L-NAME (20 mg/ml - Sigma, USA), and saline as a control group.
2.4 Exposure Chambers
Exposure chambers were made of glass (30 x 30 x 50 cm) and were hermetically
closed, with the exception of one entrance (connected to the outdoor environment) and one
exit. A vacuum pump was connected to the exit and pumped outdoor air through the
exposure chambers at a flow rate of 10 liters per minute (Figure 1). Inhalation chambers
were located in the second floor of the Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de
Porto Alegre Building, located in Porto Alegre, downtown, at a crossroad with heavy
traffic, near an automated air pollution monitoring station of the State Environmental
Agency, that provides continuous PM
10
measurements (beta monitor). One of the chambers
(designated as control) received a Teflon filter (Millipore, Ireland) in the inlet, thus
avoiding the admission of ambient particles, whereas the other received atmospheric air
without the filter system (designed as polluted). The temperature in the room and in the
chamber was 22±2ºC.
98
2.5 Experimental Protocol. Exposure to PM – Oxidative Stress and Inflammation.
Rats were exposed to PM
10
inhalation (polluted group) or filtered air (control group)
for a period of 24 hours (on March16
th
, 17
th
, 18
th
, 26
th
or May 5
th
, 6
th
, 13
th
, 2005) as
described above. Immediately prior to exposure, rats received saline, L-NAME (20mg/kg),
L-arginine (200mg/kg), or L-NAME (20mg/kg) + L-arginine (200mg/kg), intraperitoneally
(i.p.) (n=10 animals/group). The animals were awake and unrestricted during the exposure
and all groups were exposed and tested simultaneously. Without delay after the exposure,
animals were anesthetized (pentobarbital, 50 mg/kg, i.p.) and killed by exsanguination. In a
group of animals the right lungs were excised and quickly frozen in liquid nitrogen for
oxidative stress evaluation, and the left lungs of these rats were excised and used to
determine lung edema. Another set of animals followed the same protocol described
previously and the lungs were fixed with formaldehyde for 24 hours for subsequent
histology study described elsewhere.
2.6 Filter Analysis
Trace element determinations of the material collected were carried out on filters by
neutron activation analysis. Filter samples and elemental standards were irradiated under
thermal neutron flux of the IEA-R1 nuclear research reactor for 0.5 min and 16 h. After
adequate decay times, the irradiated samples and standards were measured using a hyper
pure Ge detector coupled a multichannel analyzer. Element concentrations were calculated
through a comparative method. Blank filters were analyzed using the same experimental
99
conditions adopted for the analysis of filter samples, and the concentrations of the measured
elements in the blank filter were subtracted to provide their net concentration. Contribution
from the blank filter was also subtracted from results and then the final results were
expressed as a function of collected air volume. This analysis was performed by Institute of
Research in Nuclear Energy of São Paulo State, Brazil.
2.7 Tissue preparation.
The lung was excised, washed in saline and quickly frozen in liquid nitrogen. For
the determination of Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS) tissue samples
were homogenized in 5 volumes of 120mM KCl, 30mM phosphate buffer (pH = 7.4) added
with protein inhibitors 0.5mM PMSF at 0-4
0
C. The suspensions were centrifuged at 600 x g
for 10 min at 0-4
0
C to remove nuclei and cell debris. The pellets were discarded and the
supernatants were used as homogenates.
2.8 Determination of TBARS - Lipid Peroxidation.
TBARS were measured in lung homogenates. Homogenates were precipitated with
10 % TCA, centrifuged, and incubated with thiobarbituric acid (Sigma, Chem. Co.) for 15
minutes at 100
0
C. TBARS were extracted using butanol (1:1). After centrifugation, the
absorbance of the butanol layer was measured at 535nm (Buege and Aust, 1978). The
concentration of TBARS formed was expressed in nanomoles of malondialdeyde per
milligram of protein. Protein concentration in homogenates was measured by the Bradford
100
Protein Assay (Schleicher and Wieland, 1978) using bovine serum albumin as standard.
Measurements were carried out in a Perkin Elmer Lambda 40 spectrophotometer.
2.9 Lung edema (Wet-dry ratio)
The severity of pulmonary edema was assayed by the wet-dry ratio. Lung samples
(~ 200 mg) taken from the same animals used for the determinations of TBARS were
weighed and then dried in a convention oven at 90˚C and reweighed 24h after to obtain the
wet/dry ratios.
2.10 Pulmonary histology.
All lobes were sampled for histological analysis. The samples were embedded in
paraffin and processed using routine histological procedures. Five-micrometer-thick slides
were stained with hematoxylin and eosin and submitted to descriptive histological analysis.
2.11 Animal care.
The authors assure that the study was conducted in accordance with national and
institutional guidelines for animal welfare. All animals used in the research were treated
humanely, with due consideration to the alleviation of distress and discomfort. This
protocol was approved by the Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas Ethical
Committee for Research (CPA 085/03).
101
2.12 Statistical analysis
Data were analyzed statistically using ANOVA one-way for independent groups,
setting the level of significance at 5%. Bonferroni post-hoc analysis was used when
significant statistical differences were detected by general linear models or ANOVA one-
way. The statistical package employed was the Sigma Stat V3.1 for Windows.
3. Results
3.1 Filter Analysis
The means of daily ambient levels of PM and the values of element composition
measured by neutron activation analysis during the exposure period are illustrated in table
1. In general, the concentrations of combustion-derived particles are lower them those
reported for other locations (Rivero et al. 2005; Prahalad et al. 1999).
3.2 Oxidative Stress
The results demonstrated that exposure to PM
10
air pollution provided a marked
increase on oxidative stress in the lungs, as measured by MDA concentrations (control=
0.148±0.015, polluted =0.354±0.014 nmolMDA/mg protein, p =0.0001). Similar result was
found in the L-NAME polluted group (0.301±0.092 nmolMDA/mg protein, p=0.0001).
Pretreatment with L-arginine significantly decreased the lung levels of MDA (polluted
=0.354 ±0.014; L-arginine polluted =0.176 ±0.025 nmolMDA/mg protein, p =0.0001), just
102
as with the concomitant administration of L-arginine + L-NAME (0,119±0.026
nmolMDA/mg protein, p=0.0001) (Figure 2).
3.3 Wet-to-dry Weight ratio
The wet/dry ratio, a measurement of global tissue damage, was not changed by PM
exposure and by pretreatments, as demonstrated in table 2 (p>0.05).
3.4 Histology
The animals exposed to PM
10
developed a characteristic acute pulmonary
inflammation, characterized by neutrophil recruitment, hyperplasia of the bronchiolar
epithelium with desquamation of epithelial cells and macrophage accumulation within the
alveolar spaces (figure 3). There was not statistically significant difference among the
groups of animals that received the drugs and the exposed control animals.
4. Discussion
This research was performed at the end of Summer, period when dispersion
conditions are more favorable in Porto Alegre, leading to low levels of PM
10
concentration
(average of PM
10
concentration in the experiment’s days 68.9 µg/m
3
, table 2), compared
with the average of PM
10
concentration reported by Environmental Authority of Porto
Alegre for the same location during one aleatory Winter day (average of PM
10
concentration of 159.8 µg/m
3
, FEPAM data). However, despite of the low concentrations of
PM, the present results indicate that oxidative stress to the lungs was present.
103
Particulate air pollution has been extensively reported to contribute to cardiovascular
and pulmonary diseases (Dockery et al., 1993; Saldiva et al., 1994; Saldiva et al., 1995;
Dockery, 2001; Schwartz et al., 1993; Schwartz, 2001; Donaldson et al., 2001; Zareba et
al., 2001; Pope III, 2000). There is substantial evidence showing the involvement of
oxidative stress as a mediator of tissue damage induced by PM inhalation. Experimental
studies have demonstrated that exposure to residual oil fly ash (ROFA) or concentrated
particles (CAPs) are highly toxic to the lung and able to induce oxidative stress and
inflammation in this tissue (Gurgueira et al.,2002, Rhoden et al., 2003; Wellenius et al.
2002; Pope 2000; Souza et al. 1998; Rivero et al. 2005). In a previous study (manuscript
submitted), we demonstrated that short-term PM inhalation even in low concentration was
able to generate increase of lipid peroxidation as well as increase of inflammatory response
in the bronchoalveolar tree in rats.
The inflammatory effects of PM are being associated with its chemical and
biological constituents (Kodavanti et al. 1998; Saldiva et al. 2002; Schins et al. 2004;
Medeiros et al, 2004; Carter et al., 1997; Prahalad et al., 1999; González-Flecha, 2004),
specially to transition metals, which typically include Fe, V, Cr, Mn, Co, Ni, Cu, Zn, and Ti
(Chapman et al. 1997; Costa and Dreher 1997; Rice et al. 2001; Rhoden et al. 2004).
In the present study we confirmed preliminary data, showing that lipid peroxidation
has increased 2.4 times in the lung tissue of rats breathing ambient air pollution (figure 2).
We reasoned that if the oxidants play an important role in pulmonary damage induced by
PM this injury could be modulated by NO pathway. Our results showed that pretreatment
with L-arginine, donor of NO, prevented lung oxidative stress in rats exposed to PM. These
results are corroborated by other authors who demonstrated that NO precursors, especially
L-arginine, may have protective effects on tissue damage induced by overproduction of
104
ROS, such as in ischemia-reperfusion injury (Burra et al. 1997; Nilsson et al. 1997;
Farraresso et al. 1997). Our result may be explained by the antioxidant properties of NO (its
ability to nitrosate organic radicals, preventing the lipid peroxidation cascade) (Sharpe et
al., 2003) as well as its interaction with superoxide radical (O
2
•
-
). NO can react with O
2
•
-
holding up the chain of reaction for additional production of ROS such as hidroxil radical
(
•
OH) and hydrogen peroxide (H
2
O
2
) (Kobayahi et al. 1995). However, the interaction
between NO and O
2
•-
can be able to origin peroxynitrite free radical (
•
ONOO
-
), which
could promote lipid peroxidation of cellular membranes (Gross and Wolin 1995). These
facts indicate that the interaction between NO and ROS may be beneficial, since the NO
possibly acts as a O
2
•-
scavenger, making it impossible to perpetuate the lipid peroxidation
chain reactions, which result in the generation of other free radicals (Gonzalez-Flecha,
2004; Tao et al., 2003). If the ratio O
2
•-
/NO increases via overproduction of O
2
•-
or
impairment of NO synthesis, O
2
•
-
will produce H
2
O
2
and promote the activation of
proinflammatory mediators synthesis.
The effects of NOS inhibitors on pulmonary injury induced by pollutants are still
controversial. Pharmacological inhibition of iNOS reduces lung injury and permeability
changes caused by smoke inhalation (Soejima et al. 2000) and the use of L-NAME
decreases the inflammatory acute-phase of pulmonary response to silica in rats (DiMatteo
1996). On the other hand, inhibition of NO availability by diesel exhaust particles may be
responsible for its adverse respiratory effects (Muto et al, 1996), like the use of L-NAME
aggravates pulmonary oxygen toxicity in rats (Capellier et al. 1996). In our study, the
inhibition of NO pathway (by L-NAME) in rats exposed to PM did not worsen oxidative
stress when compared to polluted group, suggesting that inhibition of nitric oxide by L-
105
NAME does not directly cause inflammatory responses in animals exposed to air pollution.
Similar results was found by Huang et al. (2003) that showed that membrane NADPH
oxidase but not NOS might contribute to ROFA-induced ROS production, because
diphenyleneiodonium (DPI) a flavoprotein inhibitor, but not L-NAME, nitric oxide
synthase (NOS) inhibitor attenuated the chemiluminescence burst in their experiment.
Since the NOSs can make a range of RNS, depending on the isoform and the
circumstances, then this could be of crucial importance in understanding the physiological
and pathophysiological implications of NOSs and their inhibition. Many NO donors
specifically release NO; if the RNS produced endogenously in vivo is, at least in part, not
NO, then this can explain the differences sometimes observed between activation of NOS
and addition of exogenous NO. It could, for example, explain the apparent paradox that NO
donors have many anti-inflammatory and cytoprotective effects, whereas NOS inhibition
also appears to be anti-inflammatory and cytoprotective if the key effect of NOS inhibition
is to prevent nitroxyl and/or peroxynitrite synthesis (Alderton et al. 2001).
The impact of nitric oxide (NO) synthesis on different biological cascades can rapidly
change dependent on the rate of NO formation and composition of the surrounding milieu.
NO has been shown to possess either antioxidant or pro-oxidant properties (Beckman
1996). The factors that dictate this protective versus damaging effect of NO on oxidative
injury remain poorly defined.
Whilst it is clear that cells and tissues containing NOS, can make NO, this does not
necessarily mean that it is the initial reactive nitrogen species (RNS) formed, and `NO'
synthesis is often inferred from the accumulation of breakdown products, such as nitrite and
nitrate, or from reactions with haem proteins, such as the oxidation of oxyhaemoglobin to
methaemoglobin, or the stimulation of guanylate cyclase.
106
Other potential RNS [e.g. nitroxyl (NO− ion or the protonated species HNO), peroxynitrite
(ONOO− ion or the protonated species ONOOH) and nitrosothiols] could in principle be
formed first, with the same products and reactions occurring either directly or indirectly
after subsequent reactions to form NO. Thus, independently of whether NO or nitroxyl is
the initial product of NOS, peroxynitrite could be formed subsequently.
Most inhibitors identified so far are competitive with the substrate L-arginine and
have therefore been inferred to be binding at the arginine-binding site. However, with
many arginine-site NOS inhibitors there are mechanisms involved in their effects on NOS
beyond simple binding in competition with L-arginine.
Probably this finding is correlated with the narrow concentration limits of
•
NO and
its dual effect in the physiology and pathophysiology of the lungs: protective or aggressive.
Probably its distinctive properties like relatively short half-life (4-50 seconds) in biological
systems, determines its spatial range and temporal extent of actions (Beckman 1990). A
next step to a better comprehension of the participation of
•
NO in the oxidative stress
imposed by PM could be the construction of a dose-response curve with this drugs (L-
arginine, L-NAME). The incontestable result until here is that the
•
NO participates of the
modulation of oxidative stress imposed by PM
10
.
The wet/dry ratio, a measurement of global tissue damage, did not show significant
increase in our study which is in disagreement with results observed by other authors that
showed significant development of lung edema in animals exposed to CAPs for 5 hours
(Gurgueira et al., 2002), but our exposure system is based on ambient levels of pollution
rather than concentrated particles, i.e
, the animals being exposed to low concentrations of
PM.
107
One study demonstrated that particles derived from oil combustion elicited a more
intense pulmonary inflammation, compared which particles rich in metals (Medeiros, et al,
2004). Our results demonstrated that even without elevated concentrations of metals except
iron, occurred inflammatory and oxidative alterations.
Recent discoveries demonstrating the relevance of ROS/RNS to the lung have
provided new insights into the pathophysiology of
pulmonary disease, and they have
opened a new horizon of therapeutic
possibilities for pulmonary medicine (Jorens 1993).
There are reports suggesting that both inhibitors of nitric
oxide synthase and
•
NO donors
protect against
some forms of injury, probably due to the dual nature
of nitric oxide
(Moncada 1993).
The antioxidant properties of
•
NO with respect to Fenton chemistry have previously
been proposed to be indirect from its ability to nitrosate organic radicals, such as lipid
peroxyl and protein based radicals, thus acting as terminator of organic radical propagation
(Sharpe et al., 2003).
Impaired release of endothelium NOS inhibitors are also able to slow ciliary beat
frequency of bovine airway epithelial cells pre-stimulated with isoproterenol, bradykinin,
and substance P, and this effect is completely reversed by L-arginine, an
•
NO precursor,
which indicates that an
•
NO -dependent mechanism upregulates ciliary motility in response
to stimulation (Ricciardolo, 2003)
In the two indicative parameters of pulmonary inflammation— wet/dry weight ratio
and lung histology — wet/dry weight ratio was not sensitive enough to detect the
inflammatory changes 24 h after the exposition, while the histology exhibited an acute
bronchiolar inflammation in the exposed animals, that persisted unchanged in the animals
tested with drugs, probably by the low number of animals studied in each group.
108
Our results suggest that exposure of mature rats in a situation of “real world” to low
levels of environment particles promotes pulmonary injuries in healthy rats, detected by the
occurrence of oxidative stress and inflammatory histological changes, and that the oxidative
damage in these situation can be prevented by the stimulation of NO pathway with the use
of the precursor L-arginine.
Acknowledgments:
Special thanks for technical assistance to the staff of Laboratory of Experimental Air
Pollution of Medical School – University of São Paulo, Brazil. We also thank the Porto
Alegre Ambient Protection State Foundation (FEPAM) for atmospheric data.
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.
120
Table 1: Elemental composition and concentration of PM
10
:
PM
10
mass
*
Na
†
Mg
†
Al
†
Si
†
P
†
S
†
Cl
†
K
†
Ca
†
Ti
†
Cr
†
Mn
†
Fe
†
SD 41.1 0.13 0.15 0.89 2.6 0.03 0.14 0.09 0.22 0.24 0.08 0.05 0.03 1.46
Aver 68.9 0.10 0.13 0.57 1.51 0.02 0.12 0.11 0.13 0.38 0.06 0.03 0.02 0.84
Min 32.0 0.01 0.01 0.07 0.01 0.00 0.01 0.03 0.0 0.09 0.0 0.0 0.0 0.0
Max 127.2 0.39 0.47 2.54 7.33 0.09 0.41 0.28 0.61 0.77 0.22 0.14 0.08 4.09
* PM
10
mass values in µg/m
3
†
elements results in Weight %. SD= standard deviation,
Aver= average, Min= minimum, max=maximum
121
Table 2: Wet-dry ratio in lung of rats exposure or not to PM
10
for 20 hr and treated or not
with NO synthesis modulators.
Experimental Groups Wet-dry ratio
Control
Saline 5.255 ± 0.209
L-NAME 5.015 ± 0.109
L-arginine 5.269 ± 0.504
L-NAME + L-arginine 5.083 ± 0.161
Polluted
Saline 5.168 ± 0.199
L-NAME 4.844 ± 0.218
L-arginine 5.109 ± 0.155
L-NAME + L-arginine 5.175 ± 0.215
Values represent the mean of independent determinations ± SEM. F
1.773
; p=0.124. 5-6
animals/group
122
Figure 1: Exposure glass chambers. (1= filtered air chamber, 2= polluted air chamber, 3= air
counter, 4= vacuum pump, 5= Teflon filter for PM
10
- Millipore, Ireland).
Filtered air Polluted
1
2
3
4
5
123
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Cont/cont Cont/L-NAME Cont/L-arg Cont/L-N+L-
arg
Pol/Cont Pol/L-NAME Pol/Larg Pol/L-N+L-arg
Groups
[MDA] (nmol/mg protein)
*
*
Figure 2: Lipid peroxidation in lungs of rats exposure or not to PM
10
for 20 hr and treated or not
with NO synthesis modulators. Values represent the mean of 5-6 independent determinations ±
SEM (* p<0.009, as compared to other groups). (Cont= control group; Pol= polluted group; L-
arg= L-arginine; L-N= L-NAME)
124
Figure 3: Photomicrographs of pulmonary tissue in control animals (A and B), and polluted
animals (C and D). The figures show a normal bronchoalveolar junction area of a membranous
bronquioli (A) and a normal respiratory (gas-exchange) region of lung tissue (B), and a acute
125
alveolar inflammation with desquamation of epithelial cells and macrophage accumulation within
the alveolar spaces (C and D).
CONCLUSÕES
1. O período de exposição de ratos ao MP
10
do ar de Porto Alegre por 20 horas promoveu
aumento da inflamação e estresse oxidativo pulmonar;
2. A análise histológica dos pulmões dos animais expostos por 20 horas ao MP
10
corrobora os
resultados da conclusão 1, demonstrando presença de inflamação pulmonar aguda
característica;
3. O oxido nítrico foi capaz de modular o estresse oxidativo induzido pela exposição a MP
10
uma vez que a L-arginina (precursora do oxido nítrico) protegeu do dano oxidativo.
Entretanto, não foi capaz de melhorar as alterações inflamatórias.
No conjunto, nossos resultados demonstram que a exposição de MP
10
em níveis
considerados dentro dos limites de segurança previstos pela legislação atual pode causar danos
biológicos in vivo, e sugerem que a via do óxido nítrico pode mediar os danos oxidativos
induzidos por este poluente.
126
ANEXO I
PRÊMIOS:
1. ASPET- Young Scientist Travel Award, American Society for Pharmacology
Experimental Therapeutics. pela apresentação do poster Oxidative Stress Induced by
Particulate Matter Inhalation – the Role of Nitric Oxide Pathway durante o Encontro
Anual da Federation of American Societies for Experimental Biology (FASEB) e
XXXV International Congress of Physiological Sciences
realizado no San Diego
Convention Center, San Diego, CA – EUA, de 31 de março a 5 de abril de 2005.
2. Menção Honrosa pela apresentação do poster Papel da Via do Óxido Nítrico (NO) no
Estresse Oxidativo Pulmonar Induzido Pela Exposição Aguda a Material
Particulado Inalado, durante a XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de
Biologia Experimental (FESBE) e XXXVII Congresso Brasileiro de Farmacologia e
Terapêutica Experimental, realizado em Águas de Lindóia, São Paulo, de 24 a 27 de
agosto de 2005.
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