( PDF ) Caracterização de seqüências expressas do genoma café potencialmente relacionadas com a resistência a doenças

SAMUEL MAZZINGHY ALVARENGA

CARACTERIZAÇÃO DE SEQÜÊNCIAS EXPRESSAS DO

GENOMA CAFÉ POTENCIALMENTE RELACIONADAS

COM A RESISTÊNCIA A DOENÇAS

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das exigências

do Programa de Pós-Graduação em Genética

e Melhoramento, para obtenção do título de

Magister Scientiae.

VIÇOSA

MINAS GERAIS – BRASIL

2007

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Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e

Classificação da Biblioteca Central da UFV

T

Alvarenga, Samuel Mazzinghy , 1981-

A473c Caracterização de seqüências expressas do genoma café

2007 potencialmente relacionadas com a resistência a doenças /

Samuel Mazzinghy Alvarenga. – Viçosa, MG, 2007.

xiv, 107f. : il. (algumas col.) ; 29cm.

Orientador: Ney Sussumu Sakiyama.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de

Viçosa.

Inclui bibliografia.

1. Café - Genética. 2. Genética molecular. 3. Marcadores

genéticos. 4. Seqüenciamento de nucleotídeo. 5. Café -

Resistência a doenças e pragas. 6. Bioinformática.

I. Universidade Federal de Viçosa. II.Título.

CDD 22.ed. 633.732

i

SAMUEL MAZZINGHY ALVARENGA

CARACTERIZAÇÃO DE SEQÜÊNCIAS EXPRESSAS DO

GENOMA CAFÉ POTENCIALMENTE RELACIONADAS

COM A RESISTÊNCIA A DOENÇAS

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das exigências

do Programa de Pós-Graduação em Genética

e Melhoramento, para obtenção do título de

Magister Scientiae.

APROVADA: 16 de julho de 2007

______________________

Prof. Ney Sussumu Sakiyama

(Orientador)

______________________

Pesq. Eveline Teixeira Caixeta

(Co-Orientadora)

______________________

Pesq. Eunize Maciel Zambolim

(Co-Orientadora)

______________________

Pesq. Felipe Rodrigues da

Silva

______________________

Prof. Cosme Damião Cruz

ii

“Você faz suas escolhas, e as suas escolhas fazem você”.

Steve Beckman

iii

Aos meus pais, Aurelino Ferreira Alvarenga e Maria de Jesus

Mazzinghy Alvarenga, dedico.

iv

AGRADECIMENTOS

À Deus, pela vida em abundância, pela saúde, pela força que tem me

dado e pela sua presença em TODOS os momentos.

À Universidade Federal de Viçosa e ao Programa de Pós Graduação em

Genética e Melhoramento, pela oportunidade de realizar esse curso.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) pela concessão da bolsa.

Ao Professor Ney Sakiyama, pela orientação, pelas nossas longas e

ricas conversas, pelo exemplo de vida e por ter acreditado em mim.

À Doutora Eveline Caixeta, pela amizade, pelos ensinamentos, por sua

paciência, e por ter confiado a mim a execução desse trabalho.

À Doutora Eunize Zambolim, pelos conselhos, pela amizade e por estar

sempre pronta a ajudar.

Ao Professor Cosme, pelas críticas e sugestões no aperfeiçoamento

desse trabalho.

Ao Doutor Felipe Rodrigues da Silva, com quem pude aprender muito

sobre Bioinformática e Genômica, pela suas sugestões e colaboração com

esse trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Biotecnologia do Cafeeiro (BIOCAFÉ),

onde tive a oportunidade de realizar esse trabalho, pela amizade, brincadeiras

v

e festas, pelo convívio super agradável, pelos ensinamentos e pelo apoio

durante esse tempo.

Aos meus grandes amigos Paulinho Monteiro, Marlon Pereira, Eduardo

Franklin, Felipe Louback e Fernanda Lelis, pela amizade incondicional, por me

fazerem acreditar em mim e pelo apoio nas horas difíceis.

Aos meus amigos da Igreja Presbiteriana de Viçosa (IPV),

especialmente Márcio Veríssimo, Alisson Xavier, Frederico Prado, Jeanne

Scardini, Ana Carolina Camargo, Juliano Pinheiro, e Paulo Alexandre Lobato,

pelo convívio, pelas boas influências, pelas orações e por me fazerem sentir

especial e importante.

Ao Zilbinho e à Marô, meus discipuladores, pelas conversas, pelos

conselhos, pelo carinho e pela amizade.

Aos meus amigos do curso de Genética e Melhoramento, em especial

Maíra Freire, Salvador Lima, Janaína Melo e Ramon de Almeida, pelo

companheirismo, pela ajuda nas disciplinas cursadas e pela troca de

experiências.

A todos os meus companheiros de república, Ti-Burga, Lulu, Andrezón,

Tonhão e Fabão, pela amizade e pelos momentos de descontração.

Aos meus pais, pelo apoio, pelo compromisso comigo, por nunca

deixarem faltar nada, pelos conselhos, pelas orações e pela atenção.

Ao meu irmão Áquila e sua esposa Mirella, pelo carinho, preocupação e

companheirismo.

A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização desse

trabalho.

Muito obrigado !

vi

BIOGRAFIA

Samuel Mazzinghy Alvarenga, filho de Aurelino Ferreira Alvarenga e

Maria de Jesus Mazzinghy Alvarenga, nasceu em Teófilo Otoni, Minas Gerais,

no dia cinco de Agosto de 1981.

Em Março de 2000 ingressou no curso de Ciências Biológicas na

Universidade Federal de Viçosa, graduanduo-se em janeiro de 2005, como

Bacharel em Ciências Biológicas.

Em Agosto de 2005 ingressou no Programa de Pós-Graduação, em nível

de Mestrado, em Genética e Melhoramento da UFV, submeteu-se à defesa de

dissertação em Julho de 2007.

vii

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................ IX

RESUMO.......................................................................................................... XI

ABSTRACT.................................................................................................... XIII

1. INTRODUÇÃO GERAL..................................................................................1

1.1. GENÔMICA EM PLANTAS ............................................................................................................ 3

1.2. BIOINFORMÁTICA .......................................................................................................................... 5

1.2.1. BANCOS DE DADOS.............................................................................................................. 6

1.2.2. BUSCA DE SEQÜÊNCIAS..................................................................................................... 7

1.2.3. BIOINFORMÁTICA NO PROJETO BRASILEIRO DO GENOMA CAFÉ........................ 8

1.3. MARCADORES MOLECULARES NO MELHORAMENTO DE PLANTAS ......................... 11

1.3.1. TIPOS DE MARCADORES MOLECULARES................................................................... 11

1.3.2. MARCADOES MOLECULARES NO MELHORAMENTO DO CAFEEIRO.................. 13

1.4. GENES DE RESISTÊNCIA A DOENÇAS.................................................................................. 15

1.4.1. REGIÃO NBS.......................................................................................................................... 19

1.4.2. REGIÃO LRR .......................................................................................................................... 20

2. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................22

CAPÍTULO 1....................................................................................................45

IDENTIFICAÇÃO DE SEQÜÊNCIAS EXPRESSAS DO GENOMA DO CAFÉ

POTENCIALMENTE ASSOCIADAS COM A RESISTÊNCIA A DOENÇAS...45

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................... 46

2. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................................. 47

2.1. Base de dados .......................................................................................................................... 47

viii

2.2. Estratégias de mineração ...................................................................................................... 47

2.2.1. Electronic Northern ......................................................................................................... 47

2.2.2. Palavras-Chave................................................................................................................. 49

2.2.3. Seqüências Publicadas .................................................................................................. 51

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................................... 52

3.1 Electronic Northern .................................................................................................................. 52

3.2. Palavras-chave ......................................................................................................................... 56

3.3. Seqüências publicadas .......................................................................................................... 84

4. CONCLUSÃO..................................................................................................................................... 87

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................................... 88

CAPÍTULO 2....................................................................................................94

MARCADORES MOLECULARES DERIVADOS DE SEQÜÊNCIAS

EXPRESSAS DO GENOMA DO CAFÉ POTENCIALMENTE ENVOLVIDAS

NA RESISTÊNCIA À FERRUGEM ..................................................................94

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................... 95

2. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................................. 96

2.1. Material Vegetal e Extração de DNA ................................................................................... 96

2.2. Seqüências do Banco de Dados do PBGC........................................................................ 97

2.3. Desenvolvimento de Marcadores Moleculares ................................................................ 97

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................................... 98

4. CONCLUSÃO................................................................................................................................... 104

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................................. 105

ix

LISTA DE ABREVIATURAS

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism.

BAC: Bacterial Artificial Chromosome.

BIOCAFÉ: Laboratório de Biotecnologia do Cafeeiro.

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool.

CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior.

CBD: Coffee Berry Disease.

CBP&D-Café: Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café.

CC: Coiled Coil.

CENARGEN: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.

CIFC: Centro de Investigação das Ferrugens do Cafeeiro.

dbEST: EST database.

EMBRAPA: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária.

EPAMIG: Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais.

EST: Expressed Sequence Tag.

FAPESP: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo.

FISH: Fluorescent In Situ Hybridization.

GENOLYPTUS: Rede Brasileira de pesquisa do Genoma do Eucalyptus.

GISH: Genomic In Situ Hybridization.

HSP: Heat Shock Protein.

IPV: Igreja Presbiteriana de Viçosa.

ITS: Internal Transcribed Spacer.

LGE: Laboratório de Genômica e Expressão.

LRR: Leucine Rich Repeats.

LZ: Leucine Zipper.

x

NBS: Nucleotide Binding Site.

NCBI: National Center for Biotechnology Information.

NR: Non Redundant.

OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man.

ONSA: Organization for Nucleotide Sequencing and Analysis.

PBGC: Projeto Brasileiro do Genoma Café.

PCR: Polymerase Chain Reaction.

PFP: Hypertext Preprocessor.

PlantGDB: Plant Genome DataBase.

QTL: Quantitative Trait Loci.

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA.

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism.

RGA: Resistance Gene Analog.

SCAR: Sequence Characterized Amplified Regions.

SNP: Single Nucleotide Polymorphism.

SRAP: Sequence Related Amplified Polymorphism.

SSAP: Sequence Specific Amplification Polymorphism.

SSR: Simple Sequence Repeat.

STS: Sequence Tagged Sites.

SUCEST: Sugar Cane EST Genome Project.

TIR: Toll/Interleukin-1 Receptor-like.

TMV: Tobacco Mosaic Vírus.

TRAP: Target Region Amplification Polymorphism.

UFV: Universidade Federal de Viçosa.

VNTR: Variable Number of Tandem Repeats.

xi

RESUMO

ALVARENGA, Samuel Mazzinghy, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa,

julho de 2007. Caracterização de seqüências expressas do genoma café

potencialmente relacionadas com a resistência a doenças. Orientador:

Ney Sussumu Sakiyama. Co-orientadoras: Eveline Teixeira Caixeta e

Eunize Maciel Zambolim.

Seqüências potencialmente envolvidas na resistência do cafeeiro a doenças

foram identificadas, por meio de análise in silico, a partir das informações

geradas pelo Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC). Para isso foram

usadas três estratégias. Inicialmente, palavras-chave correspondentes a

termos relacionados aos mecanismos de resistência de plantas a patógenos

foram identificadas na literatura e utilizadas como “iscas” para a mineração dos

dados. Com o auxílio de ferramentas disponíveis na plataforma de

bioinformática do PBGC, foram identificadas ESTs (Expressed Sequence Tags)

relacionadas a cada uma destas palavras. Outra estratégia utilizada foi a busca

por similaridades entre algumas seqüências públicas envolvidas com a

resistência do cafeeiro a doenças com as seqüências do PBGC, por meio do

programa BLAST. Utilizou-se, também, o Electronic Northern, uma ferramenta

desenvolvida pelo Laboratório de Genômica e Expressão (LGE). A mineração,

usando as três estratégias, identificou 14.060 seqüências do PBGC. Essas

seqüências apresentaram similaridade com proteínas conhecidamente

relacionadas com o processo de defesa da planta contra doenças como, por

exemplo, quitinase, proteína quinase, citocromo P450, proteína de resistência a

doenças, proteína relacionada com patogênese, proteínas com domínio LRR e

NBS, proteínas induzidas por hipersensibilidade, entre outras. Os processos

biológicos com os quais essas seqüências estão envolvidas incluíram

metabolismo, transporte, regulação da transcrição, enovelamento de proteínas,

biossíntese entre outros. A análise global baseada em ontologia de função

molecular das seqüências obtidas mostrou que os genes estão envolvidos com

metabolismo, resposta a estímulos externos, diferenciação celular, ligação a

ácidos nucléicos, ligação a nucleotídeos, resposta de defesa, apoptose entre

xii

outras. Visando verificar o envolvimento destas seqüências com a resistência

do cafeeiro à ferrugem foram desenhados 40 primers para amplificar algumas

das seqüências mineradas. Os primers foram desenhados com o programa

computacional Primer3 e a estabilidade desses foi verificada por meio do

programa PrimerSelect. Diferentes concentrações dos componentes da reação

de PCR foram analisadas. Utilizando as condições de reação e amplificação

otimizadas, os 40 primers foram testados em 12 genótipos resistentes e 12

susceptíveis a Hemileia vastatrix, fungo causador da ferrugem. Vinte e nove

destes 40 primers resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo um

polimórfico. Este trabalho permitiu obter, até o momento, um marcador

molecular polimórfico entre os indivíduos resistentes e susceptíveis. Esse

marcador, denominado CARF 005, amplifica uma região do DNA que

corresponde a uma ORF parcial de Coffea arabica que codifica uma proteína

de resistência a doenças.

xiii

ABSTRACT

ALVARENGA, Samuel Mazzinghy, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa,

July, 2007. Caracterization of expressed sequences from coffee

genome potentially related with the resistance to diseases. Adviser: Ney

Sussumu Sakiyama. Co-advisers: Eveline Teixeira Caixeta and Eunize

Maciel Zambolim.

Sequences potentially involved with the coffee resistance were identified, by

in silico analyses, using information generated by the Projeto Brasileiro do

Genoma Café (PBGC). For that, three strategies were used. Initially, keywords

related to the plants resistance mechanism to pathogens were searched in

scientific literature and used as drivers for data mining. Using the available tools

at the PBGC bioinformatics

platform, ESTs (Expressed Sequence Tags) related

to each one of these words were identified. The search for similarities between

some published sequences and sequences from the PBGC, by using the

BLAST program was another strategy. The Electronic Northern, a tool

developed by the Laboratório de Genômica e Expressão (LGE), was also used.

Those strategies allowed the identification of 14,060 sequences of the PBGC.

These sequences were similar to proteins known to be related to de plant

disease defense process, for instance chitinase, kinase protein, cytochrome

P450, disease resistance protein, pathogenesis related protein, LRR and NBS

proteins, hypersensibility induced protein among others. The biological

processes with witch these sequences are involved included metabolism,

transport, transcription regulation, protein folding, biosynthesis and others. The

ontology-based global analysis for molecular function showed that the genes

are involved with metabolism, external stimulus response, cellular

differentiation, nucleic acid binding, nucleotide binding, defense response,

apoptosis and others. Aiming to verify the involvement of these sequences with

the coffee tree resistance to leaf rust, 40 primers were designed to amplify the

mined sequences. The primers were synthesized using the computational

program Primer3 and their stability was tested by the program PrimerSelect.

Different PCR conditions were tested. Using optimized reaction and

xiv

amplification conditions, those 40 primers were tested in 12 resistant and 12

susceptible genotypes to Hemileia vastatrix, fungus that causes coffee leaf rust.

Twenty nine of those resulted in unique and sharp bands, and only one of these

was polymorphic. The 40 primers permitted to find one molecular marker

polymorphic between the resistant and susceptible genotypes. This marker

amplifies a region of the DNA which corresponds to a Coffea Arabica ORF for

disease resistance protein.

1

1. INTRODUÇÃO GERAL

O café, produzido em mais de 60 países, é um dos mais importantes

produtos de exportação mundial, movimentando US$10-12 bilhões por ano. Em

2004, os cinco maiores países produtores responderam por 64,5% da produção

mundial. O Brasil, na primeira posição, respondeu por uma participação de

31,80%, três vezes maior do que a dos concorrentes mais próximos: Vietnã

(10,49%), Indonésia (9,10%) e Colômbia (8,78%) (Siqueira, 2005).

O cafeeiro pertence ao subgênero Coffea, família Rubiaceae, formado

por cerca de 100 espécies conhecidas. Das espécies cultivadas, Coffea arabica

(café arábica) e Coffea canephora (café robusta) são as mais importantes

economicamente, sendo o primeiro responsável por 70% da produção mundial

e 99% da produção da América Latina (Dolzan, 2005).

A produção do café, no entanto, é freqüentemente afetada por doenças

e pragas que ocorrem durante praticamente todo o ciclo. Dentre as doenças

que ocorrem no cafeeiro, a ferrugem é a mais importante, por causar grandes

prejuízos para a cafeicultura. Ela ocorre em todas as regiões produtoras de

café no Brasil e na América Central (Carvalho e Chalfoun, 2005). Na ausência

de controle químico, a ferrugem do cafeeiro pode causar perdas em torno de

35% na produção (Zambolim et al., 2005).

O agente etiológico da ferrugem é o fungo biotrófico Hemileia vastatrix

Berk. et Br., que sobrevive na forma de raças. No Centro de Investigação das

Ferrugens do Cafeeiro (CIFC), Oeiras, Portugal, foram biologicamente

caracterizadas mais de quarenta e cinco raças que atacam os cafeeiros

2

(Várzea e Marques, 2005), enquanto que no Brasil foram encontradas 12

(Cardoso et al.,1988).

Atualmente, a principal forma de controle da ferrugem é por meio de

fungicidas. Embora potencialmente eficiente, o controle químico é um método

oneroso para ser adotado pelos produtores, sem falar nos riscos aos quais eles

e o ambiente estão sujeitos. Nesse contexto, o desenvolvimento de cultivares

resistentes se torna o melhor método de controle, pois é econômico, eficiente e

não causa danos ao meio ambiente (Zambolim et al., 2005).

Todavia, os grandes esforços despendidos para a obtenção de cultivares

resistentes por meio dos programas convencionais de melhoramento têm

mostrado um progresso lento (Vieira et al., 2005). Várias dificuldades podem

ser observadas, como por exemplo, o ciclo longo do cafeeiro; a baixa

variabilidade genética dentro das espécies de interesse comercial; o alto custo

dos ensaios de campo; a necessidade de avaliar vários anos de produções

consecutivas para conhecer a capacidade produtiva a longo prazo; e a falta de

marcadores genéticos disponíveis. Além disso, existe ainda a possibilidade da

resistência do cultivar ser suplantada pela grande variabilidade genética do

patógeno (Zambolim et al., 2005) e a capacidade do fungo de aumentar o nível

de agressividade (Eskes, 1989).

Desta forma, existe a necessidade do desenvolvimento e utilização de

métodos alternativos para auxiliar o melhoramento do café, proporcionando

maior eficiência, velocidade e direcionamento para os programas de

melhoramento (Vieira et al., 2005). Nesse sentido, as pesquisas em

biotecnologia estão causando grande impacto na agricultura em todo o mundo.

O recente desenvolvimento da tecnologia genômica tem gerado muitas

informações e criado bancos de dados de seqüências de DNA, que possibilitam

a identificação dos fatores genéticos determinantes e/ou associados com

características de interesse agronômico. O seqüenciamento de cDNAs em

larga escala para produzir Etiquetas de Seqüências Expressas (ESTs -

Expressed Sequence Tags) e a comparação dessas seqüências com as

disponibilizadas em banco de dados tem se tornado a opção para obtenção

rápida de dados sobre a capacidade codificadora de genomas e para identificar

novos genes.

3

1.1. GENÔMICA EM PLANTAS

A genômica em plantas sofreu uma revolução com a liberação da

seqüência do genoma completo de Arabidopsis thaliana pela Arabidopsis

Genome Initiative em 2000, quatro anos antes do previsto (The Arabidopsis

Genome Iniative). O projeto de seqüenciamento do genoma da arabidopsis

começou em 1995-1996, durante um período transitório na análise de

seqüência em genomas. O sucesso da abordagem clone-a-clone para

seqüenciar um genoma complexo era evidente nessa época tendo como base

o projeto de seqüenciamento do nematóide Caenorhabditis elegans

(Martienssen e McCombie, 2001).

A conclusão do seqüenciamento do genoma completo do arroz (Oryza

sativa) por um consórcio público foi anunciada em 2002. Este trabalho foi

complementado pelos projetos de seqüenciamento realizados pela Syngenta

(Goff et al., 2002), Monsanto (Barry, 2001) e o Instituto de Genômica de

Pequim, que seqüenciou a subespécie indica. Devido a similaridades no nível

genômico entre arroz e outras culturas importantes (Moore et al., 1995), a

conclusão do genoma do arroz teve um impacto significante na biotecnologia

vegetal e na bioinformática.

O seqüenciamento completo de espécies com genomas grandes é

demorado, oneroso e trabalhoso, apesar das técnicas modernas. O

seqüenciamento parcial de clones de cDNA, por ser rápido e apresentar boa

relação de custo benefício para a obtenção de dados em genomas, tem se

tornado um segmento crescente nas bases de dados públicas (Wolfsberg e

Landsman, 1997). Em plantas, o seqüenciamento de ESTs foi inicialmente feito

para as espécies modelos arabidopsis (Höfte et al., 1993) e arroz (Yamamoto e

Sasaki, 1997). Posteriormente, grande quantidade de seqüências ESTs de

outras espécies, incluindo pinheiro (Pinus taeda L., Allona et al., 1998), milho

(Zea mays L., Gai et al., 2000), soja (Glycine max (L.) Merr., Shoemaker et al.,

2002), trigo (Triticum aestivum L., Lazo et al., 2001), batata (Solanum

tuberosum, Ronning et al., 2003), maçã (Malus domestica, Newcomb et al.,

2006), uva (Vitis vinifera, Silva et al., 2005), algodão (Gossypium hirsutum,

Udal et al., 2006), cacau (Theobroma cacao, Gesteira et al., 2007) e várias

outras foram depositadas no dbEST, o banco de dados de seqüências ESTs.

4

A relação completa pode ser encontrada acessando

<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/dbEST_summary.html>.

No Brasil, alguns projetos de seqüenciamento baseados na metodologia

de geração de ESTs foram concluídos ou estão em andamento.

O projeto genoma da cana-de-açúcar, (SUCEST – Sugar Cane EST

Genome Project), realizado pelo grupo brasileiro ONSA (Organization for

Nucleotide Sequencing and Analysis) resultou em uma base de dados

contendo 238.000 ESTs de 37 bibliotecas. O projeto foi voltado para o estudo

dos genes relacionados com o metabolismo da sacarose, resistência a pragas

e tolerância a condições desfavoráveis de clima e solo (Grivet e Arruda, 2001).

Criado em 2001, o Genolyptus (Rede Brasileira de pesquisa do Genoma

do Eucalyptus) ainda está em andamento. O objetivo do projeto é entender a

genética molecular e quantitativa de Eucalyptus voltada para o controle das

características de importâncias econômicas silvicultural e industrial, com maior

enfoque no processo de formação da madeira (Grattapaglia, 2003).

O Projeto Brasileiro do Genoma da Banana teve início em 2002, com o

objetivo de desenvolver as bases do programa de genômica e biotecnologia de

banana. Este projeto resultou na criação do DATAMusa, hoje o segundo maior

banco de dados de genômica de banana no mundo, que é composto de

informações de Genômica Estrutural (BACs), de Seqüências Expressas e de

Análogos de Genes de Resistência (RGAs) (Santos et al., 2003).

A cultura cafeeira também está se beneficiando da revolução genômica.

Por iniciativa do Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café

(CBP&D-Café), coordenado pela Embrapa Café, em colaboração com a

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen), teve início em

fevereiro de 2002 o Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC). O projeto foi

criado para desenvolver ferramentas úteis para a descoberta de genes e

análise genética funcional em café e espécies relacionadas e ajudar no avanço

de conhecimento da organização e evolução do genoma do café. A base de

dados das ESTs de C. arabica, C. canephora e C. racemosa gerada pelo

projeto resultou na identificação de mais de 30 mil unigenes (seqüências que

representam um único gene) diferentes. Esta informação básica fornece um

recurso valioso para estudos da biologia e fisiologia do café que poderá resultar

5

no isolamento e a caracterização de genes agronômicos importantes para o

melhoramento genético de Coffea. Os genes identificados poderão ser úteis

para acelerar a escolha de variedades mais produtivas, tolerantes à seca e

resistentes ao ataque de pragas e doenças. Também terá utilidade para

obtenção de novos cultivares com qualidades superiores em aroma e sabor e

com melhores características nutritivas e farmacêuticas, com vistas à maior

satisfação dos consumidores e à conquista do mercado com produtos de maior

qualidade e valor agregado (Vieira et al., 2006).

1.2. BIOINFORMÁTICA

Com a expansão das pesquisas em genômica, possibilitada pelo

desenvolvimento de novas tecnologias de obtenção de dados em larga escala

(High Throughput Technology), a quantidade de informação biológica vem

crescendo exponencialmente. Essa grande quantidade de dados de

seqüências de genomas disponível tende a aumentar (Winslow e Boguski,

2003). No mês de agosto de 2007, o seqüenciamento de mais de 2.863

projetos genomas havia sido finalizado ou estava em progresso (Genomes

Online Database – http://www.genomesonline.org), e os resultados podem ser

encontrados em vários bancos de dados públicos.

Esse crescimento está exigindo recursos computacionais cada vez mais

sofisticados. A bioinformática é uma disciplina que tem auxiliado a suprir essas

necessidades pelo desenvolvimento de novas ferramentas para o

gerenciamento de grande quantidade de informações. Além do

armazenamento, existe a necessidade de análise dos dados, o que torna

indispensável a utilização de plataformas computacionais eficientes para a

interpretação dos resultados (Prosdocimi et al., 2002; Zatz, 2002).

Desde o advento do GenBank em 1982 e do Projeto Genoma Humano

em 1990, a bioinformática se tornou um sinônimo de análise e gerenciamento

de dados de seqüência de DNA e proteína (Boguski, 1999). A tendência da

bioinformática é continuar sendo desenvolvida com o surgimento de novos

dados. O GenBank vem dobrando de tamanho a cada 18 meses e atualmente

contém mais de 145 bilhões de bases (Benson et al., 2007). Portanto, a

6

habilidade em navegar e realizar buscas de seqüências nos bancos de dados é

fundamental para os pesquisadores que trabalham na área de genômica.

1.2.1. BANCOS DE DADOS

Devido a imensa quantidade de dados de seqüências de DNA gerados

por vários laboratórios no mundo, faz-se necessário organizá-los de maneira

acessível, para evitar redundância na pesquisa científica e possibilitar as

análises pelo maior número possível de pesquisadores (Roos, 2001). A

construção de bancos de dados para armazenamento de informações de

seqüências de DNA e de genomas inteiros, proteínas e suas estruturas

tridimensionais, bem como vários outros produtos da era genômica, tem sido

um grande desafio.

O Centro Nacional para Informação Biotecnológica dos EUA (NCBI) é

considerado a central de informações genômicas. O NCBI foi criado em 1988

para desenvolver sistemas de informações para a biologia molecular (Wheeler

et al., 2007). Vários outros bancos de dados similares estão distribuídos por

países da Europa (Kulikova et al., 2007) e Japão (Tateno et al., 2002), que

trocam dados em um intervalo de 24 horas com o NCBI (Pruitt et al., 2005;

Benson et al., 2007). O GenBank é o principal banco de dados do NCBI e

armazena todas seqüências de DNA (de seqüências pequenas a genomas

inteiros), RNA e proteínas disponíveis publicamente (Benson et al., 2007). Além

do GenBank, outros bancos do NCBI apresentam as informações organizadas

de diferentes maneiras. Por exemplo, o banco de dados UniGene agrupa todas

as seqüências parciais do transcriptoma de um organismo formando clusters,

onde cada um representa a seqüência consenso de um gene (Pontius et al.,

2003). Também no NCBI, o banco de dados RefSeq reúne somente as

seqüências de referência, ou seja, a mais representativa de um transcrito,

editada e inspecionada por um curador (Pruitt et al., 2005). O RefSeq é,

freqüentemente, o melhor banco de dados para evitar a redundância natural

num universo com muitas informações. Para acessar o RefSeq e outros bancos

de seqüências curadas foi desenvolvida a ferramenta LocusLink no NCBI

(Pruitt et al., 2000). Outros bancos são específicos de um organismo, como o

7

OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) que foi criado para catalogar

todos os genes e alelos relacionados a doenças e outras características

humanas, bem como fornecer o detalhamento técnico e bibliografia

correspondente a cada característica (Hamosh et al., 2000). O PlantGDB (Plant

Genome DataBase) é um banco de dados de seqüências de várias espécies de

plantas. O objetivo do PlantGDB é estabelecer uma base para a identificação

de conjuntos de genes comuns a todas as plantas ou genes específicos de

determinadas espécies. Isso é feito por meio da integração de várias

ferramentas de bioinformática que podem facilitar a predição de genes e a

comparação entre as espécies. Estes bancos de dados, ditos secundários, são

tão importantes quanto o GenBank.

Nos bancos de dados há também uma grande variedade de informações

sobre estruturas moleculares, expressão gênica diferencial, diversidade

genética, evolução e outras que podem ser obtidas pela bioinformática. O

desenvolvimento de procedimentos pelos quais esses dados podem ser

inseridos e extraídos de bancos de dados secundários é um dos grandes

desafios dos pesquisadores. Apesar da existência de várias ferramentas

disponíveis no NCBI e em outras instituições, ainda existem muitos campos

para o desenvolvimento de procedimentos específicos (Santos e Ortega, 2003).

1.2.2. BUSCA DE SEQÜÊNCIAS

Várias ferramentas desenvolvidas pela bioinformática permitem o acesso

e análise dos bancos de dados. A ferramenta mais conhecida para a

comparação de seqüências de DNA com as dos bancos de dados genômicos é

o BLAST ou Basic Local Alignment Search Tool (Altschul et al., 1990). Este

programa compara uma seqüência de DNA ou de uma proteína com todas as

seqüências genômicas de domínio público.

O programa BLAST não faz uma comparação da extensão total das

seqüências analisadas, mas apenas identifica, no banco de dados, a presença

de uma seqüência suficientemente semelhante com a pesquisada. Dessa

forma, descarta rapidamente os resultados não relevantes, e estende a

8

vizinhança da região de similaridade detectada até um determinado valor de

corte (Pertsemlidis e Fondon, 2001).

Esta busca resulta em seqüências (DNA ou proteínas) depositadas com

maior similaridade. Desta forma, várias regiões de DNA podem ser anotadas

por meio do BLAST. O resultado dessa busca pode ser usado para atribuir uma

função a qualquer segmento de DNA que apresenta similaridade significativa

com outras seqüências de DNA ou proteínas previamente depositadas no

GenBank com função conhecida experimentalmente (Santos e Ortega, 2003).

1.2.3. BIOINFORMÁTICA NO PROJETO BRASILEIRO DO GENOMA CAFÉ

O Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC) gerou 214.964 ESTs de

Coffea arabica, C. canephora e C. racemosa. Estas seqüências são oriundas

de clones de 37 bibliotecas de cDNA provenientes de diferentes tecidos de

cafeeiros em diferentes estádios de desenvolvimento e/ou sob estresses

bióticos e abióticos (Vieira et al., 2006).

As seqüências geradas foram processadas, com remoção de

seqüências provenientes de rRNA e eliminação de porções contendo

seqüências de vetor, adaptador, caudas de poliA e bases de baixa qualidade, e

agrupadas para a formação do conjunto UniGene do Café (Sales et al., 2007).

Esses dados foram armazenados em duas plataformas de

bioinformática. Uma delas foi desenvolvida pelo Laboratório de Genômica e

Expressão (LGE - http://www.lge.ibi.unicamp.br/cafe/) e está disponível desde o

segundo semestre de 2004. A outra plataforma, disponibilizada em março de

2007, foi criada pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen -

https://alanine.cenargen.embrapa.br/cafEST/).

Essas plataformas foram desenvolvidas com o objetivo de armazenar os

dados gerados e dispor de medidas de segurança para garantir a integridade

dos mesmos. Além disso, por meio dessas plataformas, os dados foram

organizados de forma a permitir aos seus usuários a obtenção e manipulação

das informações de maneira simplificada (Vieira et al., 2006).

Apesar do conjunto de dados ser o mesmo nas duas plataformas, os

tratamentos empregados na sua organização não foram idênticos. Algumas

9

diferenças são grandes, como por exemplo, o modo de tratamento dos dados.

Na plataforma do LGE as ESTs foram agrupadas separadamente por espécies,

resultando em 14.886 contigs e 24.426 singletons para C. arabica, 2.147contigs

e 4.622 singletons para C. canephora, e 949 contigs e 3.107 singletons para C.

racemosa (Vieira et al., 2006). No caso da plataforma do Cenargen, as ESTs

das três espécies foram tratadas conjuntamente. Outra diferença foi a

estratégia de limpeza das seqüências antes do agrupamento.

Depois de agrupadas, as seqüências consenso de cada UniGene foram

comparadas com seqüências protéicas presentes no GenBank utilizando-se o

software BlastX, contra NR, considerando o e-value 10

-5

como limite para

identidade (Vieira et al., 2006).

A interface Web foi desenvolvida nas linguagens PHP e Perl rodando

sobre o Apache para permitir aos usuários o acesso aos dados de maneira

simplificada e rápida. A escolha destas ferramentas se deve ao fato de serem

todas de código livre, permitindo personalizações, se necessárias, e por não

agregarem nenhum vinculo de licença (Sales et al., 2007).

A vantagem de ter os dados disponíveis online é que qualquer um, com

conexão à internet, pode ter acesso. Entretanto esta vantagem é

contrabalançada pelo risco de panes quando se dispõe de apenas um sistema

central de armazenamento de dados. Esta é mais uma razão de existirem as

duas plataformas de acesso aos dados do PBGC. Além disso, a possibilidade

de gerenciar os dados por meio de dois grupos de bioinformática permite que o

usuário escolha aquela com o qual ele melhor se identifica (Vieira et al., 2006).

 A plataforma do LGE dispõe das seguintes funcionalidades:

• Gene Projects: é um sistema de gerenciamento e manipulação de

seqüências. É possível incluir ESTs de interesse em cada projeto criado

por meio de buscas por ESTs (Reads Search), palavras-chave (Keyword

Search), similaridade com alguma seqüência (BLAST Search) ou a partir

de um determinado padrão (Pattern Search). As seqüências que

atendam aos requisitos desejados pelo usuário podem ser armazenadas

em projetos. Depois de armazenadas podem ser agrupadas, e os

contigs formados podem ser submetidos a uma nova comparação com o

GenBank para se verificar uma nova anotação (ou não).

10

• Electronic Northern: Essa ferramenta é utilizada para calcular o nível de

expressão de um gene em diferentes bibliotecas, e se baseia no número

de ESTs de um dado gene que foi identificado em diferentes bibliotecas

de cDNA.

• Microssatellites: Ferramenta que apresenta microssatélites nos clusters

do genoma café. A tela mostra o contig, a posição do microssatélite, o

número de cópias, a composição percentual de cada nucleotídeo do

microssatélite e o padrão da repetição.

• SNPs: Ferramenta que apresenta SNPs (Single Nucleotide

Polymorphism – Polimorfismo de Um Nucleotídeo) em clusters do

genoma café. Por essa ferramenta são apresentados o contig, o número

de ESTs que forma esse contig, o número de SNPs presente e a

anotação do BLAST.

• Search: Ferramenta que permite a busca de seqüências por palavras-

chave ou por BLAST.

 A plataforma do Cenargen dispõe das seguintes funcionalidades:

• Busca: Sistemas de busca por cluster, read, palavra-chave ou biblioteca

específica.

• Teste Exato de Fisher (Northern Blot Eletrônico): Determina diferenças

de expressão de um unigene, estatisticamente significativas, em

diferentes bibliotecas.

• BLAST Local: Ferramenta de busca de seqüências por similaridade.

• Sistemas de Etiquetas: criação de Etiquetas para organizar as

seqüências da maneira que o usuário preferir. As etiquetas têm

comportamento similar à estrutura de diretórios encontrada em vários

sistemas operacionais. Diferentemente do sistema de pastas ou

projetos, entretanto, o usuário pode marcar uma mesma seqüência com

uma ou mais etiquetas.

Sales et al. (2007) descrevem em detalhes as funcionalidades da

plataforma de bioinformática do Cenargen. Além disso, essa plataforma possui

um manual de ajuda que pode ser acessado pelo endereço eletrônico

<https://alanine.cenargen.embrapa.br/Manual_Rapido_Genoma-Cafe.htm>.

11

1.3. MARCADORES MOLECULARES NO MELHORAMENTO DE PLANTAS

As análises in silico (em computadores) são necessárias para minerar os

dados (data mining) gerados pelos projetos de sequenciamento. O objetivo

dessas análises é de encontrar seqüências de genes relacionadas com

processos biológicos de interesse. No entanto, o envolvimento do gene no

processo biológico de interesse deve ser confirmado por metodologias de

genômica funcional. Uma delas é a tecnologia de marcadores moleculares, que

permite a detecção de variabilidade do DNA.

Um marcador molecular é definido como qualquer fenótipo molecular

oriundo de um gene expresso ou de um segmento específico de DNA (Ferreira

e Grattapaglia, 1998). Segundo Milach (1998), marcadores moleculares são

características de DNA que diferenciam dois ou mais indivíduos e são

herdados geneticamente. Os marcadores moleculares têm sido empregados no

melhoramento de plantas para diversos fins, constituindo-se uma ferramenta

importante, em virtude das vantagens que apresentam, como por exemplo,

maior rapidez na obtenção de resultados e maior confiabilidade dos dados

obtidos (Ferreira, 2003).

Alguns dos exemplos da utilização dos marcadores moleculares no

melhoramento de plantas incluem: estudos de diversidade genética,

caracterização de bancos de germoplasma, genealogia, construção de mapas,

mapeamento comparativo, mapeamento gênico, seleção de genitores,

certificação de cruzamentos, predição de fenótipos, fingerprinting, análises de

pureza genética de sementes, melhoramento assistido, proteção varietal,

mapeamento físico de genomas, integração de mapas genéticos e físicos,

clonagem posicional, estudos de desequilíbrio de ligação, mapeamento de

associação, filogenia, estudo de pedigree, isolamento de genes e diagnose

(Borém e Caixeta, 2006).

1.3.1. TIPOS DE MARCADORES MOLECULARES

Os tipos distintos de marcadores moleculares atualmente disponíveis

diferenciam-se pela tecnologia utilizada para revelar variabilidade ao nível de

12

DNA, e variam de acordo com a habilidade de detectar diferenças entre

indivíduos, custo, facilidade de uso, consistência e repetibilidade. Os principais

tipos de marcadores moleculares podem ser classificados em dois grupos,

conforme a metodologia utilizada para identificá-los: hibridização ou

amplificação do DNA via PCR. Entre os identificados por hibridização estão os

marcadores RFLP - “Restriction Fragment Length Polymorphism” (Bostein et

al., 1980) e minissatélites ou locos VNTR – “Variable Number of Tandem

Repeats” (Jeffreys et al., 1985). Os revelados por amplificação incluem os

marcadores do tipo RAPD – “Random Amplified Polymorphic DNA” (Williams et

al., 1990), SCAR – “Sequence Characterized Amplified Regions”, STS -

“Sequence Tagged Sites” (Paran e Michelmore, 1993), Microssatélite (Litt e

Lutty, 1989) e AFLP – “Amplified Fragment Length Polymorphism” (Vos et al.,

1995). Além desses, existem vários outros marcadores moleculares diponíveis

atualmente.

Com o avanço da genômica, alguns tipos de marcadores moleculares

têm sido beneficiados, pois o seqüenciamento do DNA tem facilitado o

desenvolvimento e a identificação dos mesmos. Dentre estes marcadores

existem os denominados marcadores Expressed Sequence Tag-Polymerase

Chain Reaction (EST-PCR). Alguns tipos de marcadores EST-PCR incluem:

SRAP (Sequence Related Amplified Polymorphism) (Li e Quiros, 2001), SSAP

(Sequence Specific Amplification Polymorphism) (Nagy e Lelley, 2003) e TRAP

(Target Region Amplification Polymorphism) (Hu e Vick, 2003). Os marcadores

SRAP usam pares de primers com núcleos ricos em AT ou GC para amplificar

fragmentos intragênicos na detecção de polimorfismos. Os marcadores SSAP

exploram o polimorfismo de regiões LTR (Long Terminal Repeat) de

retrotransposons ao longo do genoma. A técnica TRAP revela fragmentos

polimórficos em torno de seqüências alvo de genes candidatos putativos.

Existem várias vantagens em realizar estudos genéticos com

marcadores EST-PCR ou outros baseados em cDNA em relação aos que

utilizam primers aleatórios. Eles marcam genes expressos e, portanto são

particularmente úteis para mapeamento de QTLs. Se um marcador EST-PCR é

encontrado ligado a um QTL é possível que o gene, a partir do qual o marcador

EST-PCR foi derivado, controle a característica em questão. Pelo fato de

serem originados de regiões codificadoras, que são mais conservadas entre

13

populações e espécies do que as não codificadoras, os marcadores EST-PCR

são úteis para o estudo de mapeamento comparativo. Além disso, os EST-PCR

podem ser herdados codominantemente, o que permite a identificação de dois

alelos diferentes em locos heterozigotos de organismos diplóides (Rowland et

al., 2003). Os EST-PCR foram desenvolvidos para várias espécies vegetais,

incluindo pinheiro - Pinus taeda L. - (Temesgen et al., 2001), pícea - Picea

mariana - (Perry e Bousquet, 1998) e Picea abies (Schubert et al., 2001),

criptoméria - Cryptomeria japonica - (Tsumura et al., 1997), mirtilo - Vaccinium

sp. - (Rowland et al., 2003), girassol - Helianthus annus - (Pashley et al, 2006),

amendoim - Arachis hypogaea L. - (Luo et al., 2005), cana de açúcar -

Saccharum sp. - (Alwala et al., 2006), feijão - Phaseolus

vulgaris L. - (Miklas et

al., 2006) e muitas outras.

Outro tipo de marcador molecular beneficiado com o grande número de

projetos de seqüenciamento em larga escala são os SNPs (Single Nucleotide

Polymorphism). Esses marcadores se baseiam na variação de um único

nucleotídeo em regiões codificadoras ou não do genoma. Os SNPs são as

variações mais abundantes no genoma. Eles podem contribuir diretamente

para um fenótipo ou podem estar associados a ele como resultado de um

desequilíbrio de ligação (Nasu et al., 2002).

1.3.2. MARCADOES MOLECULARES NO MELHORAMENTO DO CAFEEIRO

Como o café é uma cultura perene, de ciclo longo, e em que o

melhoramento é efetuado ao longo de várias gerações, o desenvolvimento de

variedades melhoradas é bastante demorado. Desta forma, torna-se importante

a incorporação de técnicas avançadas de biotecnologia aos métodos

tradicionais de melhoramento (Fontes, 2001). A utilização de marcadores

moleculares pode auxiliar o melhoramento dessa espécie de forma bem ampla.

As avaliações com esse tipo de tecnologia podem, por exemplo, ser realizadas

em estádios iniciais de desenvolvimento da planta, com a obtenção de

resultados similares aos que seriam alcançados na avaliação de plantas

adultas (Oliveira et al., 2003).

14

Relações taxonômicas dentro do gênero Coffea foram estudadas usando

marcadores específicos para DNA mitocondrial e do cloroplasto (Berthou et al.

1983; Orozco-Castillo et al. 1996). Estudos de filogenia molecular das espécies

de Coffea foram realizados com marcadores para detectar variação na

seqüência da região ITS2 (Internal Transcribed Spacer) e do DNA do

cloroplasto (Lashermes et al., 1996; Cros et al., 1998).

Para verificar a constituição do genoma e a origem de C. arabica,

estudos utilizando marcadores RFLP, FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) e

GISH (Genomic In Situ Hybridization) demonstraram que esta espécie é um

alotetraplóide (Raina et al., 1998; Lashermes et al., 1999), resultante da

hibridação natural de C. eugenioides com C. canephora (Lashermes et al.,

1999).

Estudos com marcadores RAPD detectaram diversidade genética entre

acessos de C. arabica, cultivares etíopes e acessos derivados de Típica e

Bourbon (Orozco-Castillo et al.,1994; Lashermes et al., 1996; Anthony et

al.,2001). Marcadores RAPD foram utilizados para caracterização e estimação

de distâncias genéticas entre acessos do banco de germoplasma do Programa

de Melhoramento da UFV/EPAMIG (Cabral et al., 2002; Alvarenga et al., 2005)

e do IAPAR (Sera et al., 2003).

Steiger et al. (2002), usando marcadores AFLP, não conseguiram

distinguir cultivares de C. arabica. Entretanto, a avaliação da diversidade

genética entre esses cultivares forneceu informações necessárias para estimar

o potencial dos marcadores para o melhoramento do cafeeiro. Também

utilizando marcadores AFLP, Lashermes et al. (2000) distinguiram um grupo

formado por genótipos derivados de Híbrido de Timor de acessos de C.

arabica. Neste trabalho foi observado que a diversidade genética observada

nos genótipos derivados de Híbrido de Timor era aproximadamente o dobro do

que em C. arabica.

Maluf et al. (2005) identificaram polimorfismos entre cultivares de Coffea

utilizando marcadores RAPD, SSR e AFLP. A variabilidade genética detectada

por esses marcadores foi muito semelhante, ainda que reduzida. Neste estudo,

os marcadores do tipo RAPD e SSR foram mais eficientes em análises de

parentesco e o agrupamento das linhagens correspondeu à sua origem

15

genealógica. No entanto, nenhum dos métodos testados permitiu a

identificação individual de linhagens.

Alguns marcadores moleculares ligados a genes controlando

características qualitativas foram identificados em café, como auto-

incompatibilidade em C. canephora (Lashermes et al., 1996), resistência ao

CBD – Coffee Berry Disease - (Agwanda et al., 1997), resistência à ferrugem

(Tedesco et al., 2000; Moreno et al., 2000; Prakash et al., 2004), porte de

planta (Ruas et al., 2000) e resistência a M. exigua (Noir et al., 2003). Os

marcadores ligados ao gene de resistência a M. exigua foram utilizados,

posteriormente, para avaliar a introgressão do gene em linhagens

possivelmente resistentes a esse patógeno (Diniz et al., 2005).

Em estudo realizado para identificar marcadores do tipo microssatélite

(SSR) associados à resistência ao bicho-mineiro, 32 seqüências expressas em

folhas de cafeeiro e relacionadas a mecanismos de defesa foram encontradas.

Embora nenhuma marca molecular tenha sido identificada, o estudo

exploratório pode ser importante para o entendimento de eventos de natureza

genética envolvidos em cruzamentos interespecíficos, especialmente em

espécies poliplóides como o cafeeiro (Pinto et al., 2007).

1.4. GENES DE RESISTÊNCIA A DOENÇAS

Dentre as várias aplicações dos marcadores moleculares estão os

estudos dos genes de resistência de plantas a doenças.

Devido à inexistência de um sistema circulatório e de anticorpos, as

plantas precisam ter, em cada uma das suas células, um mecanismo de defesa

(Hammond-Kosack e Jones, 1997). As plantas normalmente são resistentes à

maioria dos patógenos. Portanto, a habilidade do fitopatógeno em causar

doença é geralmente a exceção, não a regra. Isto porque as plantas possuem

uma habilidade natural de reconhecer potenciais patógenos invasores e

preparar uma defesa bem sucedida. De maneira oposta, patógenos bem

sucedidos causam doença porque são capazes de evitar o reconhecimento ou

conter os mecanismos de defesa da planta ou as duas coisas (Staskawicz,

2001). Em trabalho clássico, Flor, em 1942, propôs a existência do sistema de

16

reconhecimento gene-a-gene, com interação específica: uma planta com o

gene dominante de resistência R reconhece um patógeno com o gene

dominante de avirulência Avr correspondente. Assim, a presença do gene Avr

torna o patógeno não-virulento se a planta tiver o gene R apropriado. Se o

gene não existe na planta e no agente patogênico, não há reconhecimento nem

resistência e a doença se instala. O gene R codifica o receptor, que por sua

vez reconhece a molécula elicitora gerada direta ou indiretamente pela ação do

gene Avr, ativando os mecanismos de defesa (Jia et al., 2000; Deslandes et al.,

2003; Belkhadir et al., 2004).

Em muitos casos, um único gene R pode conferir resistência para uma

ou mais raças de um determinado patógeno quando transferido para uma

planta suscetível de mesma espécie. Por esta razão, os genes R têm sido

explorados em programas de melhoramento de plantas (McDowell e

Woffenden, 2003).

A identificação e isolamento de genes R em plantas têm aumentado

muito nos últimos anos (Richter e Ronald, 2000). O seqüenciamento genômico

de várias espécies de plantas aliado a busca de mutantes em larga escala tem

permitido aumentar, sobremaneira, a quantidade de informações relacionadas

ao isolamento e identificação das funções dos produtos gênicos, regulação das

vias de biossíntese e de transdução de sinal (Staskawicz et al., 1995). Os

genes R codificam pelo menos cinco tipos diferentes de proteínas (proteínas R)

(Dangl e Jones, 2001), que podem ser classificadas de acordo com as suas

características estruturais.

O primeiro gene R clonado foi o Pto do tomate, que codifica uma

proteína serina/treonina quinase e confere resistência às raças de

Pseudomonas syringae que carregam o gene de avirulência AvrPto (Martin et

al., 1993). Este gene pertence à primeira classe das proteínas R.

Na classe 2 estão genes como o Cf9 do tomate que confere resistência

a Cladosporium fulvum e codifica proteínas transmembranas, cuja região N-

terminal extracelular é composta de repetições ricas de leucinas (LRR –

Leucine Rich Repeats) (Jones et al., 1994). No entanto essas proteínas não

possuem uma região intracelular significante, que poderia constituir um

componente sinalizador que ativaria o mecanismo de defesa (Ellis e Jones,

1998).

17

A classe 3, representada pelo gene Xa21 (resistência a Xanthomonas

oryzae) do arroz, inclui proteínas com um formato clássico de receptor-quinase,

uma região LRR extracelular, uma região transmembrana e um domínio

serina/treonina quinase citosólico (Song et al., 1995; Ellis e Jones, 1998).

Entretanto, a maioria dos genes de resistência codifica proteínas com

um domínio N-terminal variável, seguido por um sítio de ligação de nucleotídeo

(NBS – Nucleotide Binding Site) tripartida e uma região LRR (Baker et al.,

1997; Ellis et al., 2000; Dangl e Jones, 2001). Baseando-se no seu domínio N-

terminal, essas proteínas podem ser subdivididas em dois grupos. O grupo

TIR-NBS-LRR (classe 4) exibe uma seqüência similar à da proteína Toll da

Drosófila e ao do receptor interleucina-1 de mamíferos. A subclasse TIR-NBS-

LRR inclui o gene N do tabaco (que confere resistência ao Tobacco Mosaic

Virus – TMV), os genes L6 e M do linho (resistência à ferrugem), e os genes

RPP5, RPP1 (resistência ao fungo Peronospora parasitica) e RPS4 (resistência

a Pseudomonas syringae) de Arabidopsis (Ellis e Jones, 1998; Gassman et al.,

1999).

O outro grupo (classe 5) é o de proteínas não TIR-NBS-LRR, que não

possuem a seqüência TIR (Meyers et al., 1999; Pan et al., 2000; Cannon et al.,

2002; Richly et al., 2002) e/ou contêm um domínio zíper de leucina (LZ –

Leucine Zipper) ou coiled coil (CC) potencial nas suas regiões N-terminais (Pan

et al., 2000). CCs são estruturas formadas por duas a cinco hélices, que

possuem um empacotamento distinto de cadeias laterais de aminoácidos na

interface hélice-hélice (Lupas, 1996). A estrutura CC exibe uma organização de

repetições de sete resíduos de aminoácidos com as cadeias laterais

hidrofóbicas de dois deles formando uma interface para interações entre coils

(Young, 2000).

A classe CC-NBS-LRR inclui os genes RPM1 e RPS2 e a classe LZ-

NBS-LRR inclui os genes RPS5 de Arabidopsis e o gene Prf do tomate, que

conferem resistência a P. syringae, o gene RPP8, também de Arabidopsis

(resistência a Peronospora parasitica), Mi do tomate (resistência ao nematóide

Meloidogyne incognita) e o Rx1 da batata (resistência ao Potato Virus X – PVX)

(Ellis e Jones, 1998; Bendahmane et al., 1999). Os genes I2 do tomate, Rp1-D

do milho, RGC2 da alface e o Bs2 da pimenta não contêm a região TIR nem a

LZ (Tai et al., 1999). Além das regiões mencionadas acima, os produtos de

18

alguns genes R possuem ainda um domínio conservado de função

desconhecida chamado GLPLAL entre as regiões NBS e LRR (Dinesh-Kumar

et al., 2000). A figura 1 resume as 5 classes acima descritas.

Figura 1: Representação esquemática das 5 classes de proteínas de resistência. Adaptado

de Lehman, 2002; Hammond-Kosack e Parker, 2003; Michelmore e Meyers, 1998;

Toyoda et al., 2002; McDowell e Woffenden, 2003 e Belkhadir et al., 2004.

Para o cafeeiro, já foram encontradas ESTs com similaridade com

proteínas R da classe NBS-LRR, sugerindo que várias classes dos genes R

estão presentes no genoma desta espécie. Utilizando vários primers

degenerados para dois motivos conservados entre as regiões NBS dos genes

R de diferentes espécies, Noir et al. (2001) amplificaram e clonaram

seqüências de nove motivos distintos de proteínas do tipo NBS em café. Neste

mesmo trabalho, foram identificados 18 RGAs (Resistance Gene Analog) em

um único acesso de cafeeiro, sugerindo a presença de grande número de

genes R no genoma do café.

Em 2004, Fernandez et al. identificaram duas ESTs de café com alta

similaridade às proteínas DND1 e NDR1, que codificam componentes de

sinalização de resistência em Arabidopsis thaliana. A proteína DND1 (defence,

19

no death – defesa, não morte) é um canal iônico que está envolvido na via de

sinalização da reação de hipersensibilidade. A proteína NDR1 (non race-

specific disease resistance – resistência a doenças, raça não específica) é um

componente chave na via de sinalização de muitas proteínas da classe CC-

NBS- LRR (Silva et al., 2006).

Guzzo (2004) isolou genes de acessos de cafeeiros apresentando

funções relacionadas à defesa de plantas contra fitopatógenos. Estes genes

estão envolvidos em diferentes processos como: resposta de

hipersensibilidade, morte celular programada, síntese de proteínas

antimicrobianas e degradação controlada de proteínas, dentre outros.

Lin et al (2005) encontraram genes de cafeeiro com funções putativas

relacionadas com resistência a doenças, tais como proteínas da classe TIR-

NBS-LRR, e com patogênese, entre outras.

1.4.1. REGIÃO NBS

O domínio NBS é encontrado em uma grande variedade de proteínas

com função de ligação de ATP ou GTP em diversos organismos (Traut, 1994 e

Saraste et al., 1990). Além disso, o domínio NBS compartilha uma homologia

com as regiões NBS dos produtos dos genes CED4 de Caenorhabditis elegans

e dos genes Apaf-1, FLASH, CARD4 e Nod1, que estão envolvidos na

imunidade natural e na apoptose em animais (Saraste et al., 1990; Li et al.,

1997; Van Der Biezen e Jones, 1998; Aravind et al., 1999). Essa homologia

sugere um mecanismo conservado de morte celular programada em plantas e

animais, inclusive em mamíferos. Acredita-se que a região N-terminal,

juntamente com o domínio NBS, participa na ativação dos componentes da

transdução de sinais levando a respostas de resistência patógeno-específicas

(Aarts et al., 1998; Feys e Parker, 2000; Van Der Biezen et al., 2000). Os

domínios NBS são encontrados também em muitas famílias de proteínas,

incluindo as do grupo RAS, ATPases, fatores de elongação e proteínas G

(Saraste et al., 1990). Essas proteínas servem como chaves moleculares e são

fundamentais para muitos eventos celulares eucarióticos fundamentais como

crescimento celular, diferenciação, organização do citoesqueleto, transporte de

20

vesículas, apoptose e defesa (Van Der Biezen e Jones, 1998, Aravind et al.,

1999; Bourne et al., 1991).

O motivo P-loop [GXXXXGK(T/S)] dessas proteínas está envolvido em

interações com fosfatos e íons Mg

2+

(Saraste et al., 1990). O domínio quinase

2, que supostamente funciona numa reação de fosfotransferase, contém quatro

aminoácidos hidrofóbicos consecutivos seguidos de um aspartato, que

coordena os íons metálicos divalentes Mg

2+

. O domínio quinase 3a está

envolvido na ligação de purina ou ribose e contém uma tirosina ou uma

arginina. Além desses domínios discutidos acima, os domínios NKXD, DXXG e

(C/S)AX são altamente conservados na superfamília GTPase (Bourne et al.,

1991). A ausência desses domínios nas proteínas R e suas homologias com

CED4/Apaf-1 sugerem que as proteínas R podem se ligar ao ATP e/ou agir

como ATPases.

1.4.2. REGIÃO LRR

Este domínio consiste de nove a 40 unidades de repetições imperfeitas,

cada uma delas com aproximadamente 25 aminoácidos. Na região central de

cada repetição está uma estrutura fita β/volta β, que é hipervariável e tem a

seqüência consenso XX(L)X(L)XXXX, onde L corresponde a leucinas (ou

outros aminoácidos alifáticos) conservadas e X denota os aminoácidos

hipervariáveis flanqueadores (Parniske et al., 1997; McDoewell et al., 1998).

Nesta estrutura, diferentes repetições supostamente se ajustam e formam uma

folha β paralela exposta ao solvente (Kobe e Deisenhofer, 1995). Como é

exposta ao solvente, a superfície hipervariável poderia facilitar a interação da

proteína R com o seu fator Avr (elicitor) relacionado e poderia fornecer

diferentes especificidades de reconhecimento para fatores Avr alterados

(Parniske et al., 1997). De fato, em vários sistemas planta-patógeno, a variação

da seqüência na região LRR, particularmente na estrutura fita β/volta β, tem

mostrado ser responsável por diferentes especificidades de reconhecimento ou

de resistência (Parniske et al., 1997; Thomas et al., 1997; Botella et al., 1998;

Wang et al., 1998; Ellis et al., 1999). No entanto, outras regiões da proteína R,

21

como a TIR da proteína do linho (Ellis et al., 1999), podem também contribuir

para a especificidade do reconhecimento.

As proteínas de genes R que possuem a região LRR podem ser

subdividas em duas grandes classes: aquelas que contêm uma região N-

terminal LRR extracelular e uma âncora de membrana, e aquelas que são

citoplasmáticas. Exemplos da primeira classe incluem o gene Cf-2, que confere

resistência a Cladosporium fulvum em tomate (Dixon et al., 1996), Xa21, que

confere resistência a Xanthomonas oryzae em arroz (Song et al., 1995), e

Hs1

pro-1

, um gene que confere resistência ao nematóide Heterodera schachtii

(Cai et al., 1997). As proteínas citoplasmáticas incluem aquelas codificadas

pelo gene N do tabaco, que confere resistência ao Tobacco Mosaic Virus, os

genes RPS2 e RPM1 de arabidopsis, que conferem resistência a raças

específicas de Pseudomonas spp, os genes L6 e M do linho, que conferem

resistência à ferrugem, causada pelo fungo Melampsora lini, e o gene RPP5 de

arabidopsis, que confere resistência ao fungo Peronospora parasitica (Bent et

al., 1994; Mindrinos et al., 1994; Grant et al., 1995; Ellis et al., 1997; Parker et

al., 1997).

22

2. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aarts, N., Metz, M., Holub, E., Staskawicz, B. J., Daniels, M. J., Parker, J. E.

Different requirements for EDS1 and NDR1 by disease resistance genes

define at least two R gene-mediated signaling pathways in Arabidopsis

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America, v.95, n.17, p.10306-10311. 1998.

Aggarwal, R. K., Hendre, P. S., Varshney, R. K., Bhat, P. R., Krishnakumar, V.,

Singh, L. Identification, characterization and utilization of EST-derived genic

microsatellite markers for genome analyses of coffee and related species.

Theoretical and Applied Genetics, v.114, p.359-372. 2007.

Agwanda, C. O., Lashermes, P., Trouslot, P., Combes, M. C., Charrier, A.

Identification of RAPD markers for resistance to coffee berry disease,

Colletotrichum kahawae, inarabica coffee. Euphytica, v.97, p.241-248. 1997.

Allona, I., Quinn, M., Shoop, E., Swope, K., Cyr, S. S., Carlis, J., Riedl, J.,

Retzel, E., Campbell. M. M., Sederoff, R., Whetten, R. W. Analysis of xylem

formation in pine by cDNA sequencing. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, v.95, p.9693-9698.

1998.

Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local

alignment search tool. Journal of Molecular Biology, v.215, n.3, p.403-410.

1990.

Alvarenga, S. M., Caixeta, E. T., Oliveira, A. C. B., Rufino, R. J. N., Brito, G. G.,

Pereira, A. A., Zambolim, L., Sakiyama, N. S. Análise da diversidade

genética de cafeeiros do banco de germoplasma da UFV/EPAMIG

utilizando marcadores RAPD. IV Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil.

Londrina, PR, 2005.

Alwala, S., Suman, A., Arro, J. A., Veremis, J. C., Kimbeng, C. A. Target region

23

amplification polymorphism (TRAP) for assessing genetic diversity in

sugarcane germplasm collections. Crop Science, v.46, p.448-455. 2006.

Alwala, S., Kimbeng, C. A., Gravois, K. A., Bischoff, K. P. TRAP, a new tool for

sugarcane breeding: comparisson with AFLP and coefficient of parentage.

Journal American Society Sugar Cane Technologists, v.26, p.62-86. 2006.

Anthony, F., Bertrand, B., Quiros, O., Wilches, A., Lashermes, P., Berthaud, J.,

Charrier, A. Genetic diversity of wild coffee (Coffea arabica L.) using

molecular markers Euphytica, v.18, n.1, p.53-65. 2001.

Aravind, L. D., V. M, Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the

apoptosis machinery. Trends in Biochemical Sciences, v.24, n.2, p.47-53.

1999.

Baker, B., Zambryski, P., Staskawicz, B., Dinesh-Kumar, S. P. Signaling in

plant-microbe interactions. Science, v.276, p.726-733. 1997.

Barry, G. F. The use of the Monsanto draft rice genome sequence in research.

Plant Physiology, v.125, p.1164-1165. 2001.

Belaj, A., Trujillo, I., Rosa, R., Rallo, L., Giménez, M. J. Polymorphism and

discrimination capacity of randomly amplified polymorphic markers in an

olive germplasm bank. Journal of the American Society for Horticultural

Science, v.126, n.1, p.64-71. 2001.

Belkhadir, Y., Subramaniam, R., Dangl, J. Plant disease resistance protein

signaling: NBS-LRR proteins and their partners. Current Opinion in Plan

Biology, v.7, p.391-399. 2004.

Bendahmane, A., Kanyuka, K., Baulcombe, D. C. The Rx gene from potato

controls separate virus resistance and cell death responses Plant Cell, n.11,

p.781-791. 1999.

Bennetzen, J. Opening the door to comparative plant biology. Science, v.296,

p.60-63. 2002.

Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L.

GenBank. Nucleic Acids Research, v.35, p.21-25. 2007.

Bent, A. F., Kunkel, B. N., Dahlbeck, D., Brown, K. L., Schmidt, R., Giraudat, J.,

Leung, J., Staskawicz, B. J. RPS2 of Arabidopsis thaliana: a leucine-rich

repeat class of plant disease resistance genes. Science, v.265, p.1856-

1860. 1994.

Berthaud, J., Charrier, A. Genetic resources of Coffea. In: R. J. Clarke, Macrae,

R (Ed.). Coffee. London: Elsevier Applied Science, v.4, 1988. Genetic

resources of Coffea, p.1-42

Berthou, F., Trouslot, P., Hamon, S., Vedel, F., Quetier, F. Electrophoretic

24

analysis of the biochemical polymorphism of coffee trees - enzimatic

variation in 18 wild populations - variation of the mitochodrial DNA in the

species Coffea canephora, Coffea eugenioides and Coffea arabica. IX

Colloque Scientifique International sur le Café. Londres: ASIC (Paris), 1980.

16 p.

Berthou, P. Y., Correia, F., Prates, S., Taugourdeau, J. Essay de synthèse du

cretacé de l'Algarve. Biostratigrafie, paleogeografie et sedimentation

argileuse. Bulletin d'Information des Geologie du Bassin de Paris, v.20, n.2,

p.3-24. 1983.

Bevan, M., Mayer, K., White, O., Eisen, J. A., Preuss, D., Bureau, T., Salzberg,

S. L., Mewes, H. Sequence and analysis of the Arabidopsis genome.

Current Opinion in Plant Biology, v.4, p.105-110. 2001.

Bevan, M., Walsh, S. The Arabidopsis genome: A foundation for plant research.

Genome Research, v.15, p.1632-1642. 2005.

Bhat, P. R., Krishnakumar, V., Hendre, P. S., Rajendrakumar, P., Varshney, R.

K., Aggarwal, R. K. Identification and characterization of expressed

sequence tags-derived simple sequence repeats markers from robusta

coffee variety 'CxR' (an interspecific hybrid of Coffea canephora × Coffea

congensis). Molecular Ecology Notes, v.5, n.1, p.80-83. 2005.

Binneck, E. As ômicas: Integrando a bioinformação. Biotecnologia, Ciência &

Desenvolvimento, v.32, p.28-37. 2004.

Boguski, M. S. Biosequence exegesis. Science, v.286, p.453-455. 1999.

Borém, A., Giúdice, M., Sdiyama, T. Melhoramento Genômico. Viçosa, MG.

2003. 224 p.

Borém, A. Aplicação dos Marcadores Moleculares no Melhoramento de

Plantas. In: A. Borém, Caixeta, E. T. (Ed.). Marcadores Moleculares. Viçosa,

2006. Aplicação dos Marcadores Moleculares no Melhoramento de Plantas,

p.79-84

Borém, A., Caixeta, E. T. Marcadores Moleculares. Viçosa, MG. 2006. 374 p.

Botella, M. A., Parker, J. E., Frost, L. N., Bittner-Eddy, P. D., Beynon, J. L.,

Daniels, M. J., Holub, E. B., Jones J. D. G. Three genes of the arabidopsis

RPP1 complex resistance locus recognize distinct Peronospora parasitica

avirulence determinants Plant Cell, v.10, p.1847-1860. 1998.

Botstein, D., White, R.L., Skolnick, M., Davis, R.W. Construction of a genetic

linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms.

American Journal of Human Genetics, v.32, n.3, p.314-331. 1980.

Bourne, H. R., Sanders, D. A., Mccormick, F. The GTPase superfamily:

conserved structure and molecular mechanism. Nature

, v.349, n.6305,

25

p.117-127. 1991.

Brent, M. R. Genome annotation past, present, and future: How to define an

ORF at each locus. Genome Research, v.15, p.1777-1786. 2005.

Cabral, T. A. T. Padrões moleculares, diversidade genética e mapa parcial de

ligação do cafeeiro. Genética e Melhoramento, Universidade Federal de

Viçosa, Viçosa, MG, 2001. 112 p.

Cabral, T. A. T., Sakiyama, N. S., Zambolim, L., Pereira, A. A., Barros, E. G.,

Sakiyama, C. C. H. Reproducibility of the RAPD marker and its efficiency in

coffee tree genotype grouping analysis. Crop Breeding and Applied

Biotechnology, v.2, n.1, p.121-129. 2002.

Cai, D., Kleine, M., Kifle, S., Harloff, H., Sandal, N. N., Marcker, K. A., Klein-

Lankhorst, R. M., Salentijn, E. M. J., Lange, W., Stiekema, W. J., Wyss, U.,

Grundler, F. M. W., Jung, C. Positional cloning of a gene for nematode

resistance in sugar beet. . Science, v.275, p.832-834. 1997.

Cannon, S. B., Zhu, H., Baumgarten, A. M., Spangler, R., May, G., Cook, D. R.,

Young, N. D. Diversity, distribution, and ancient taxonomic relationships

within the TIR and non-TIR NBS-LRR resistance gene subfamilies. Journal

of Molecular Evolution, v.54, n.4, p.548-562. 2002.

Cardoso, R. M. L., Zambolim, L., Chaves, G. M. Ocorrência no Brasil da raça

XVI de Hemileia vastatrix Berk. et Br. coletada do germoplasma de Coffea

arabica L. no Estado de Minas Gerais. Fitopatologia Brasileira, v.12, p.343-

346. 1988.

Carvalho, V. L., Chalfoun, S. M. A ferrugem do cafeeiro.

http://www.coffeebreak.com.br/ocafezal.asp?SE=8&ID=158. 2005.

Cros J, C., M. C., Trouslot, P., Anthony, F., Hamon, S., Charrier, A.,

Lashermes, P. Phylogenetic analysis of chloroplast DNA variation in Coffea

L. Molecular Phylogenetics and Evolution, v.9, n.1, p.109-117. 1998.

Dangl, J. L., Jones, J. D. Plant pathogens and integrated defense responses to

infection. Nature, v.411, p.826-833. 2001.

Deslandes, L. O., J.; Peeters, N.; Feng, D. X.; Khounlotham, M.; Boucher, C.;

Somssich, I.; Genin, S., Marco, Y. Physical interaction between RRS1-R, a

protein conferring resistance to bacterial wilt, and PopP2, a type III effector

targeted to the plant nucleus. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America, v.13, p.8024-8029. 2003.

Dinesh-Kumar, S. P., Tham, W, Baker, B. J. Structure-function analysis of the

tobacco mosaic virus resistance gene N. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, v.97, n.26, p.14789-

14794. 2000.

26

Diniz, L. E. C. Mapeamento físico da região cromossômica próxima ao gene de

resistência a Meloidogyne exigua (Mex-1) em Coffea arabica L. Tese.

Genética e Melhoramento, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2004.

115 p.

Diniz, L. E. C., Sakiyama, N. S., Lashermes, P., Caixeta, E. T., Oliveira, A. C.

B., Zambolim, E. M., Loureiro, M. E., Pereira, A. A., Zambolim, L. Analysis of

AFLP markers associated to the Mex-1 resistance locus in Icatu progenies.

Crop Breeding and Applied Biotechnology, v.5, p.387-393. 2005.

Dita, M. A., Rispail, N., Prats, E., Rubiales, D., Singh, K. B. Biotechnology

approaches to overcome biotic and abiotic stress constraints in legumes.

Euphytica, v.147, p.1-24. 2006.

Dixon, M. S., Jones, D. A., Keddie, J. S., Thomas, C. M., Harrison, K., Jones, J.

D. The tomato Cf-2 disease resistance locus comprises two functional genes

encoding leucine-rich repeat proteins. Cell, v.84, n.3, Feb p.451-459. 1996.

Dolzan, M. 14 de abril é o dia internacional do café.

http://www.unificado.com.br/calendario/04/cafe.htm. 2005.

Durick, K., Mendlein, J., Xanthopoulos, K. G. Hunting with traps: genome-wide

strategies for gene discovery and functional analysis. Genome Research,

v.9, p.1019-1025. 1999.

Dvorak, J., Akhunov, E. D., Akhunov, A. R., Deal, K. R., Luo, M. Molecular

characterization of a diagnostic DNA marker for domesticated tetraploid

wheat provides evidence for gene flow from wild tetraploid wheat to

hexaploid wheat. Molecular and Molecular Evolution, v.23, p.1386-1396.

2006.

Ecker, J. R., Cook, D. Genome studies and molecular genetics Unwrapping

new layers of complexity in plant genomes. Current Opinion in Plant Biology,

v.7, p.99-101. 2004.

Edwards, D., Batley, J. Plant bioinformatics: from genome to phenome.

TRENDS in Biotechnology, v.22, n.5, p.232-237. 2004.

Ellis, J., Lawrence, G., Ayliffe, M., Anderson, P., Collins, N., Finnegan, J., Frost,

D., Luck, J., Pryor, T. Advances in the molecular genetic analysis of the flax-

flax rust interaction. Annual Review of Phytopathology, v.35, p.271-91. 1997.

Ellis, J., Jones, D. Structure and function of proteins controlling strain-specific

pathogen resistance in plants. Current Opinion in Plant Biology, v.1, p.288-

293. 1998.

Ellis, J., Dodds, P., Pryor, T. Structure, function and evolution of plant disease

resistance genes. Current Opinion in Plant Biology, v.3, p.278-284. 2000.

Ellis, J. G., Lawrence, G. J., Luck, J. E., Dodds, P. N. Identification of regions in

27

alleles of the flax rust resistance gene L that determine differences in gene-

for-gene specificity Plant Cell, v.11, n.3, p.495-506. 1999.

Eskes, A. B. Resistance. In: A. C. Kushallapa, Eskes, A. B. (Ed.). Coffee Rust:

epidemiology, resistance and management. Boca Raton, Florida: CRC

Press, 1989. Resistance, p.171-291

Fazuoli, L. C., Oliveira, A. C. B., Toma-Braghini, M., Silvarolla, M. B.

Identification and use of sources of durable resistance to coffee leaf rust at

IAC. In: L. Zambolim, Zambolim, E. M., Várzea, V. M. P. (Ed.). Durable

resistance to coffee leaf rust. Viçosa UFV, DFP 2005. Identification and use

of sources of durable resistance to coffee leaf rust at IAC, p.137-186

Fernandez, D., Santos, P., Agostini, C., Bon, M., Petitot, A., Silva, M. C.,

Guerra-Guimarães, L., Ribeiro, A., Argout, X., Nicole, M. Coffee (Coffea

arabica L.) genes early expressed during infection by the rust fungus

(Hemileia vastatrix). Molecular Plant Pathology, v.5, n.6, p.527-536. 2004.

Ferreira, M. A. J. F. Utilização das técnicas de marcadores moleculares na

genética de populações, na genética quantitativa e no melhoramento de

plantas. Boa Vista: Embrapa Roraima, v.1. 2003. 63 p. (Embrapa Roraima.

Documentos, 1).

Ferreira, M. E., Grattapaglia, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares

em análise genética. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN. 1998. 220 p.

Ferriol, M., Picó, B., Córdova, P. F., Nuez, F. Molecular diversity of a

germplasm collection of squash (Cucurbita moschata) determined by SRAP

and AFLP markers. Crop Science, v.44, p.653-664. 2004.

Feys, B. J., Parker. J. E. Interplay of signaling pathways in plant disease

resistance. Trends in Genetics, v.16, n.10, p.449-455. 2000.

Flavell, R. B. Plant biotechnology Moral dilemmas Current Opinion in Plant

Biology, v.3, p.143-146. 2000.

Fleischmann, R. D., Adams, M. D., White, O., Clayton, R. A., Kirkness, E. F.,

Kerlavage, A. R., Bult, C. J., Tomb, J., Dougherty, B. A., Merrick, J. M.,

Mckenney, K., Sutton, G., Fitzhugh, W., Fields, C., Gocayne, J. D., Scott, J.,

Shirley, R., Liu, L., Glodek, A., Kelley, J. M., Weidman, J. F., Phillips, C. A.,

Spriggs, T., Hedblom, E., Cotton, M. D., Utterback, T. R., Hanna, M. C.,

Nguyen, D. T., Saudek, D. M., Brandon, R. C., Fine, L. D., Fritchman, J. L.,

Fuhrmann, J. L., Geoghagen, N. S. M., Gnehm, C. L., Mcdonald, L. A.,

Small, K. V., Fraser, C. M., Smith, H. O., Venter, J. C. Whole-genome

random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd.(first

genome of free-living organism ever completely sequenced)(includes fold-

out genome map)(Cover Story). Science, v.269, n.5223, p.496-513. 1995.

Flor, H. H. Inheritance of pathogenicity in Melampsora lini. Phytopathology

,

v.32, p.653-669. 1942.

28

Fontes, J. R. M. Heterose, capacidade combinatória e divergência genética

estimada por análise de marcadores RAPD em cruzamentos entre cafeeiros

catuaí (Coffea arabica L.) e híbridos de timor. Fitotecnia, Universidade

Federal de Viçosa, Viçosa, 2001. 140 p.

Fridman, E., Pichersky, E. Metabolomics, genomics, proteomics, and the

identification of enzymes and their substrates and products. Current Opinion

in Plan Biology, v.8, p.242-248. 2005.

Gai, X. W., Lal, S., Xing, L.Q., Brendel, V., and Walbot, V. Gene discovery

using the maize genome database ZmDB. Nucleic Acids Research, v.28,

p.94-96. 2000.

Gassmann, W., Hinsch, M. E., Staskawicz, B. J. The Arabidopsis RPS4

bacterial-resistance gene is a member of the TIR-NBS-LRR family of

disease-resistance genes. Plant Journal, v.20, n.3, Nov p.265-277. 1999.

Gelbart, W. M. Databases in genomic research. Science, v.282, p.659-661.

1998.

Geromel, C., Ferreira, L. P., Carmelo Guerreiro, S. M. C., Cavalari, A. A., Pot,

D., Pereira, L. P. P., Leroy, T., Vieira, L. G. E., Mazzafera, P., Marraccini, P.

Biochemical and genomic analysis of sucrose metabolism during coffee

(Coffea arabica) fruit development. Journal of Experimental Botany, v.57,

n.12, p.3243-3258. 2006.

Gesteira, A. S., Micheli, F., Carels, N., Silva, A. C., Gramacho, K. P., Schuster,

I., Macedo, J. N., Pereira, G. A. G., Cascardo, J. C. M. Comparative

Analysis of Expressed Genes from Cacao Meristems Infected by

Moniliophthora perniciosa. Annals of Botany, v.100, p.129-140. 2007.

Goff, S. A., Ricke, D., Lan, T., Presting, G., Wang, R., Dunn, M., Glazebrook, J.,

Sessions, A., Oeller, P., Varma, H., Halley, D., Hutchison, D., Martin, C.,

Katagiri, F., Lange, B. M., Moughamer, T., Xia, Y., Budworth, P., Zhong, J.,

Miguel, T., Paszkowski, U., Zhang, S., Colbert, M., Sun, W., Chen, L.,

Cooper, B., Park, S., Wood, T. C., Mao, L., Quail, P., Wing, R., Dean, R.,

Yu, Y., Zharkikh, A., Shen, R., Sahasrabudhe, S., Thomas, A., Cannings, R.,

Gutin, A., Pruss, D., Reid, J., Tavtigian, S., Mitchell, J., Eldredge, G., Scholl,

T., Miller, R. M., Bhatnagar, S., Adey, N., Rubano, T., Tusneem, N.,

Robinson, R., Feldhaus, J., Macalma, T., Oliphant, A., Briggs, S. A draft

sequence of the rice genome genome (Oryza sativa L. ssp japonica).

Science, v.269, n.5565, p.92-100. 2002.

Gostimsky, S. A., Kokaeva, Z. G., Konovalov, F. A. Studying plant genome

variation using molecular markers. Russian Journal of Genetics, v.41, n.4,

p.378-388. 2005.

Gouveia, M. M. C., Ribeiro, A., Várzea, V. M. P., Rodrigues-Jr, C. J. Genetic

diversity in Hemileia vastatrix based on RAPD markers. Mycologia

, v.97,

29

n.2, p.396-404. 2005.

Grant, M. R., Godiard, L., Straube, E., Ashfield, T., Lewald, J., Sattler, A., Innes,

R. W., Dangl, J. L. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual

specificity disease resistance. Science, v.269, p.843-846. 1995.

Grattapaglia, D. Genolyptus. In: A. Borém, Giúdice, M., Sediyama, T. (Ed.).

Melhoramento Genômico. Viçosa, 2003. Genolyptus, p.51-72

Grivet, L., Arruda, P. Sugarcane genomics: depicting the complex genome of an

important tropical crop. Current Opinion in Plant Biology, v.5, p.122-127.

2001.

Guo, W., Cai, C., Wang, C., Han, Z., Song, W., Wang, K., Niu, X., Wang, C., Lu,

K., Shi, B., Zhang. T. A microsatellite-based, gene-rich linkage map reveals

genome structure, function, and evolution in Gossypium. Genetics:

Published Articles Ahead of Print, published on April 3, 2007 as

10.1534/genetics.107.070375. 2007.

Guzzo, S. D. Aspectos bioquímicos e moleculares da resistência sistêmica

adquirida em cafeeiro contra Hemileia vastatrix. Centro de Energia Nuclear

na Agricultura, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2004. 236 p.

Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. G. Resistance gene-dependent plant

defense responses. The Plant Cell, v.8, p.1773-1791. 1996.

Hammond-Kosack, K. E., Jones, D. G. Plant disease resistance genes. Annual

Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology v.48, p.575-607.

1997.

Hammond-Kosack, K. E., Parker, J. E. Deciphering plant-pathogen

communication: fresh perspectives for molecular resistance breeding.

Current Opinion in Biotechnology, v.14, p.177-193. 2003.

Hamosh, A., Scott, A. F., Amberger, J., Valle, D., Mckusick, V. A. Online

Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Human Mutation, v.15, p.57-61.

2000.

Höfte, H., Desprez, T., Amselem, J., Chiapello, H., Caboche, M., Moisan, A.,

Jourjon, M. F., Charpenteau, J. L., Berthomieu, P., Guerrier, D., Giraudat, J.,

Quigley, F., Thomas, F., Yu, D. Y., Mache, R., Raynal, M., Cooke, R.,

Grellet, F., Delseny, M., Parmentier, Y., Marcillac, G., Gigot, C., Fleck, J.,

Philipps, G., Axelos, M., Bardet, C., Tremousaygue, D., Lescure, B. An

inventory of 1152 expressed sequence tags obtained by partial sequencing

of cDNAs from Arabidopsis thaliana. Plant Journal, v.4, p.1051-1061. 1993.

Hu, J., Vick, B. A. Target Region Amplification Polymorphism: A Novel Marker

Technique for Plant Genotyping. Plant Molecular Biology Reporter, v.21,

p.289-294. 2003.

30

Hulbert, S. H., Webb, C. A., Smith, S. M., Sun, Q. Resistance gene complexes:

evolution and utilization. Annual Review of Phytopathology, v.39, p.285-312.

2001.

Jansson, S., Buckler, E. S. Genome studies and molecular genetics: Genomics

— deeper and wider in order to understanding plant diversity. Current

Opinion in Plan Biology, v.10, p.107-108. 2007.

Jeffreys, A. J. W., V.; Thein, S.L. Hypervariable minisatellite regions in human

DNA. Nature, v.314, p.67-73. 1985.

Jia, Y., Mcadams, S. A., Bryan, G. T., Hershey, H. P., Valent, B. Direct

interaction of resistance gene and avirulence gene products confers rice

blast resistance. European Molecular Biology Organization Journal, v.19,

p.4004-4014. 2000.

Jones, D. A., Thomas, C. M., Hammond-Kosack, K. E., Balint-Kurti, P. J.,

Jones, J. D. G. Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to

Cladosporiom fulvum by transposon tagging. Science, v.266, p.789-793.

1994.

Jones, J., D. G. Putting knowledge of plant disease resistance genes to work.

Current Opinion in Plan Biology, v.4, p.281-287. 2001.

Kaiser, J. From genome to functional genomics. Science, v.288, n.5472,

p.1715. 2005.

Kobe, B., Deisenhofer, J. Proteins with leucine-rich repeats. Current Opinion in

Structure Biology, v.8, n.5, p.409-416. 1995.

Kulikova, T., Aldebert, P., Althorpe, N., Baker, W., Baldwin, A., Bates, K.,

Browne, P., Van Den Broek, A., Castro, M., Cochrane, G., Duggan, K.,

Eberhardt, R., Faruque, N., Garcia-Pastor, M., Harte, N., Kanz, C.,

Leinonen, R. Lin, Q., Lombard, V., Lopez, R., Mancuso, R., Mchale, M.,

Nardone, F., Silventoinen, V., Stoehr, P., Stoesser, G., Tuli, M. A.,

Tzouvara, K., Vaughan, R., Wu, D., Zhu, W., Apweiler, R. The EMBL

nucleotide sequence database. Nucleic Acids Research, v.32, p.D27-D30.

2004.

Kulikova, T., Akhtar, R., Aldebert, P., Althorpe, N., Andersson, M., Baldwin, A.,

Bates, K., Bhattacharyya, S., Bower, L., Browne, P., Castro, M., Cochrane,

G., Duggan, K., Eberhardt, R., Faruque, N., Hoad, G., Kanz, C., Lee, C.,

Leinonen, R., Lin, Q., Lombard, V., Lopez, R., Lorenc, D., Mcwilliam, H.,

Mukherjee, G., Nardone, F., Pastor, M. P. G., Plaister, S., Sobhany, S.,

Stoehr, P., Vaughan, R., Wu, D., Zhu W., Apweiler, R. EMBL nucleotide

sequence database in 2006. Nucleic Acids Research, v.35, p.16-20. 2007.

Lashermes, P., Couturon, E., Moreau, N., Paillard, M., Louarn, J. Inheritance

and genetic mapping of self-incompatibility in Coffea canephora Pierre.

Theoretical and Applied Genetics

, v.93, p.458-462. 1996.

31

Lashermes, P., Andrzejewski, S., Bertrand, B., Combes, M. C., Dussert, S.,

Graziosi, G., Trouslot, P., Anthony, F. Molecular analysis of introgressive

breeding in coffee (Coffea arabica L.). Theoretical and Applied Genetics,

v.100, p.139-146. 2000.

Lashermes, P., Paczek, V., Trouslot, P., Combes, M. C., Couturon, E., Charrier,

A. Single-locus inheritance inthe allotetraployd Coffea arabica L. and

interspecific hybrid C. arabica X C. canephora. The Journal of Heredity,

v.91, n.1, p.81-85. 2000.

Lashermes, P. C., M-C., Robert, J., Trouslot, P., D'hont, A., Anthony, F.,

Charrier, A. Molecular characterisation and origin of the Coffea arabica L.

genome. Molecular and General Genetics v.261, p.259-266. 1999.

Lazo, G. R., Chao, S., Hummel, D. D., Edwards, H., Crossman, C. C., Lui, N.,

Matthews, D. E., Carollo, V. L., Hane, D. L., You, F. M., Butler, G. E., Miller,

R. E., Close, T. J., Peng, J. H., Lapitan, N. L. V., Gustafson, J. P., Qi, L. L.,

Echalier, B., Gill, B. S., Dilbirligi, M., Randhawa, H. S., Gill, K. S., Greene, R.

A., Sorrells, M. E., Akhunov, E. D., Dvorak, J.,Linkiewicz, A. M., Dubcovsky,

J., Hossain, K. G., Kalavacharla, V., Kianian, S. F., Mahmoud, A. A.,

Miftahudin,Ma, X. F., Conley, E. J., Anderson, J. A., Pathan, M. S., Nguyen,

H. T., Mcguire, P. E., Qualset, C. O., Anderson, O. D. Development of an

Expressed Sequence Tag (EST) Resource for Wheat (Triticum aestivum L.):

EST Generation, Unigene Analysis, Probe Selection and Bioinformatics for a

16,000-Locus Bin-Delineated Map. Genetics, v.168, p.585-593. 2004.

Lehman, P. Structure an evolution of plant disease resistance genes Journal Of

Applied Genetics, v.43, n.4, p.403-414. 2002.

Leister, R. T., Ausubel. F. M., Katagiri, F. Molecular recognition of pathogen

attack occurs inside of plant cells in plant disease resistance specified by the

Arabidopsis genes RPS2 and RPM1. Proceedings of the National Academy

of Sciences of the United States of America, v.93, p.15497-15502. 1996.

Li, G., Quiros, C. F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new

marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping

and gene tagging in Brassica. Theoretical and Applied Genetics, v.103,

p.455-461. 2001.

Li, L., Hong, R., Hastings, W. Three functional luciferase domains in a single

polypeptide chain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, v.94, n.17, p.8954-8958. 1997.

Liang, F., Holt, I., Pertea, G., Karamycheva, S., Salzberg, S. L., Quackenbush,

J. An optimized protocol for analysis of EST sequences. Nucleic Acids

Research, v.28, n.18, p.3657-3665. 2000.

Lin, C., Mueller, L. A., Carthy, J. M., Crouzillat, D., Pétiard, V., Tanksley, S. D.

Coffee and tomato share common gene repertoires as revealed by deep

32

sequencing of seed and cherry transcripts. Theoretical and Applied

Genetics, v.112, n.1, p.114-130. 2005.

Litt, M., Lutty, J.A 44:397-401. An hypervariable microsatellite revealed by in

vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin

gene. American Journal of Human Genetics, v.44, p.397-401. 1989.

Luo, M., Dang, P., Guo, B. Z., He, G., Holbrook, C. C., Bausher, M. G., Lee, R.

D. Generation of expressed sequence tags (ESTs) for gene discovery and

marker development in cultivated peanut. Crop Science, v.45, p.346-353.

2005.

Lupas, A. Coiled coils: new structures and new functions. Trends in Biochemical

Science, v.21, n.10, p.375-82. 1996.

Madlung, A., Comai, L. The effect of stress on genome regulation and structure.

Annals of Botany, v.94, p.481-495. 2004.

Maglott, D., Fatz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI's LocusLink and RefSeq.

Nucleic Acids Research, v.28, n.1, p.126-128. 2000.

Maglott, D., Ostell, J., Pruitt, K. D., Tatusova, T. Entrez Gene: gene-centered

information at NCBI. Nucleic Acids Research, v.35, p.D26–D31. 2007.

Maluf, M. P., Silvestrini, M., Ruggiero, L. M. C., Filho, O. G., Colombo, C. A.

Genetic diversity of cultivated Coffea arabica inbred lines assessed by

RAPD, AFLP and SSR marker systems. Scientia Agricola (Piracicaba,

Braz.), v.62, n.4, p.366-373. 2005.

Manifesto, M. M., Schlatter, A. R., Hopp, H. E., Suárez, E. Y., Dubcovsky, J.

Quantitative evaluation of genetic diversity in wheat germplasm using

molecular markers. Crop Science, v.41, p.682-690. 2001.

Margis-Pinheiro, M., Sandroni, M., Lummerzheim, M. Oliveira, D. E. A defesa

das plantas contra as doenças. Ciência Hoje. 147 1999.

Martienssen, R., Mccombie, W. R. The First Plant Genome. Cell, v.105, p.571-

574. 2001.

Martin, G., Brommonschenkel, S., Chunwongse, J., Frary, A., Ganal, M.,

Spivey, R., Wu, T., Earle, E., Tanksley, S. Map-based cloning of a protein

kinase gene confering disease resistance in tomato. Science, v.262, p.1432-

1436. 1993.

Martin, G. Functional analysis of plant disease resitance genes and their

downstream effectors. Current Opinion in Plan Biology, v.2, p.273-279.

1999.

Martin, G., Bogdanove, A., Sessa, G. Understanding the functions of plant

disease resistance proteins. Annual Review of Plant Biology

, v.54, p.23-61.

33

2003.

Matthews, B. F., Devine, T. E., Weisemann, J. M., Beard, H. S., Lewers, K. S.,

Macdonald, M. H., Park, Y., Maiti, R., Lin, J., Kuo, J., Pedroni, M. J., Cregan,

P. B., Saunders, J. A. Incorporation of sequenced cDNA and genomic

markers into the soybean genetic map. Crop Science, v.41, p.516-521.

2001.

Mcdowell, J. M., Dhandaydham, M., Long, T. A., Aarts, M. G. M., Goff, S.,

Holub, E. B, Dangl, J. L. Intragenic recombination and diversifying selection

contribute to the evolution of downy mildew resistance at the RPP8 locus of

Arabidopsis. Plant Cell, v.10, n.11, p.1861-1874. 1998.

Mcdowell, J. M., Woffenden, B. J. Plant disease resistance genes: recent

insights and potential applications. Trends in Biotechnology, v.21, n.4,

p.178-83. 2003.

Mcginnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of

sequence analysis tools. Nucleic Acids Research, v.32, p.w20-w25. 2004.

Meinke, D., Tanksley, S. Genome studies and molecular genetics: The

maturation and specialization of plant genomics. Current Opinion in Plan

Biology, v.3, p.95-96. 2000.

Meinke, D. W., Cherry, J. M., Dean, C., Rounsley, S. D., Koornneef, M.

Arabidopsis thaliana: A model plant for genome analysis. Science, v.282,

p.662-682. 1998.

Melchers, L. S., Stuiver, M. H. Novel genes for disease-resistance breeding.

Current Opinion in Plant Biology v.3, p.147-152. 2000.

Meyers, B. C., Dickerman, A. W., Michelmore, R. W., Sivaramakrishnan, S.,

Sobral, B. W., Young, N. D. Plant disease resistance genes encode

members of an ancient and diverse protein family within the nucleotide-

binding superfamily. Plant Journal, v.20, n.3, p.317-332. 1999.

Meyers, B. C., Kozik, A., Griego, A., Kuang, H., Michelmore, R. W. Genome-

wide analysis of NBS-LRR-encondingo genes in arabidopsis. The Plant Cell,

v.15, p.809-834. 2003.

Meyers, B. C., Kaushik, S., Nandety, R. S. Evolving disease resistance genes.

Current Opinion in Plan Biology, v.8, p.129-134. 2005.

Michelmore, R. Genomic approaches to plant disease resistance. Current

Opinion in Plan Biology, v.3, p.125-131. 2000.

Michelmore, R. W., Paran, I., Kesseli, R. V. Identification of markers linked to

disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to

detect markers in specific genomic regions by using segregating

populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

34

States of America, v.88, p.9828-9832. 1991.

Michelmore, R. W., Meyers, B. C. Clusters of resistance genes in plants evolve

by divergent selection and a birth-and-death process. Genome Research,

v.8, p.1113-1130. 1998.

Miklas, P. N., Hub, J., Grünwaldc, N. J., Larsena, K. M. Potential application of

TRAP (Targeted Region Amplified Polymorphism) markers for mapping and

tagging disease resistance traits in common bean Crop Science, v.46,

p.910-916. 2006.

Milach, S. C. K. Marcadores moleculares em plantas. Porto Alegre. 1998. 141

p. (UFRGS)

Mindrinos, M., Katagiri, F., Yu, G. L., Ausubel, F. M. The A. thaliana disease

resistance gene RPS2 encodes a protein containing a nucleotide-binding

site and leucine-rich repeats. Cell, v.78, n.6, p.1089-1099. 1994.

Mitchell-Olds, Y., Clauss, M. J. Plant evolutionary genomics. Current Opinion in

Plant Biology, v.5, p.74-79. 2002.

Mlot, C. Plant biology in the genome era. Science, v.281, n.5375, p.331-332.

1998.

Moffett, P., Farnham, G., Peart, J., Baulcombe, D. C. Interaction between

domains of a plant NBS-LRR protein in disease resistance-related cell

death. The EMBO Journal, v.21, n.17, p.4511-4519. 2002.

Moloney, M., Peacock, J. Plant biotechnology. Current Opinion in Plant Biology,

v.8, p.163-164. 2005.

Moore, G., Devos, K, M., Wang, Z., Gale, M. D. Grasses, line up and form a

circle. Current Biology, v.5, n.7, p.737-739. 1995.

Moreno, G., Peña, M., Acuña, R., Aponte, M. E., Herrera, J. C., Molina, D.,

Gaitán, A., Cristancho, M., Moncada, P., Góngora, C., Cadena, G.

Aplicaciones de la biotecnologia al mejoramiento genético del café, en

Colombia. In: I. Iapar (Ed.). International Seminar on Biotechnology in the

Coffee Agroindustry Londrina Curitiba : UFPR, 2000. Aplicaciones de la

biotecnologia al mejoramiento genético del café, en Colombia, p.47-53

Muñoz, L. C., Blair, M. W., Duque, M. C., Tohme, J., Roca, W. Introgression in

common bean X tepary bean interspecific congruity-backcross lines as

measured by AFLP markers. Crop Science, v.44, p.637-645. 2004.

Nagy, E. D., Lelley, T. Genetic and physical mapping of sequence-specific

amplified polymorphic (SSAP) markers on the 1RS chromosome arm of rye

in a wheat background. Theoretical and Applied Genetics, v.107, p.1271-

1277. 2003.

35

Nasu, S., Suzuki, J., Ohta, R., Hasegawa, K., Yui, R., Kitazawa, N., Monna, L.,

Minobe, Y. Search for and Analysis of Single Nucleotide Polymorphisms

(SNPs) in Rice (Oryza sativa, Oryza rufipogon) and Establishment of SNP

Markers. DNA Research, v.9, p.163-171. 2002.

Newcomb, R. D., Crowhurst, R. N., Gleave, A. P., Rikkerink, E. H. A., Allan, A.

C., Beuning, L. L., Bowen, J. H., Gera, E., Jamieson, K. R., Janssen, B. J.,

Laing, W. A., Mcartney, S., Nain, B., Ross, G. S., Snowden, K. C., Souleyre,

E. J. F., Walton, E. F., Yauk, Y. K. Analyses of Expressed Sequence Tags

from Apple. Plant Physiology, v.144, p.147-166. 2006.

Nogueira, F. T. S., Rosa-Jr, V. E., Menossi, M., Ulian, E. C., Arruda, P. RNA

expression profiles and data mining of sugarcane response to low

temperature. Plant Physiology, v.132, p.1811-1824. 2003.

Noir, S., Combes, M. C., Anthony, F., Lashermes, P. Origin, diversity and

evolution of NBS-type disease-resistance gene homologues in coffee trees

(Coffea L.). Molecular Genetics Genomics, v.265, p.654-662. 2001.

Noir, S., Anthony, F., Bertrand, B., Combes, M. C., Lashermes, P. Identification

of a major gene (Mex-1) from Coffea canephora conferring resistance to

Meloidogyne exigua in Coffea arabica. Plant Pathology, v.52, p.97-103.

2003.

Noir, S., Patheyron, S., Combes, M-C., Lashermes, P., Chalhoub, B.

Construction and characterisation of a BAC library for genome analysis of

the allotetraploid coffee species (Coffea arabica L.). Theoretical and Applied

Genetics, v.109, p.225-230. 2004.

Oliveira, A. C. B., Caixeta, E. T., Zambolim, E. M., Diniz, L. E. C. Avanços

Tecnológicos em Biologia Molecular: Marcadores de DNA no Melhoramento

do Cafeeiro. In: L. Zambolim (Ed.). Produção integrada de café. Viçosa:

UFV/DFP, 2003. Avanços Tecnológicos em Biologia Molecular: Marcadores

de DNA no Melhoramento do Cafeeiro, p.247-278

Ori, N., Eshed, Y., Paran, I., Presting, G., Aviv, D., Tanksley, S., Zamir, D.,

Fluhra, R. The 12C family from the wiIt disease resistance locus 12 belongs

to the nucleotide binding, leucine-rich repeat superfamily of plant resistance

genes. The Plant Cell, v.9, p.521-532. 1997.

Orozco-Castillo, C., Chalmers, K. J., Waugh, R., Powell, W. Detection of

genetic diversity and selective gene introgression in coffee using RAPD

markers. . Theoretical and Applied Genetics, v.87, p.934-940. 1994.

Orozco-Castillo, C., Chalmers, K. J., Powell, W., Waugh, R. RAPD and

organelle specific PCR re-affirms taxonomic relationships within the genus

Coffea. Plant Cell Reports, v.15, n.5, p.337-341. 1996.

Paillard, M. L., P., Pétiard, V. Construction of a molecular linkage map in coffee.

Theoretical and Applied Genetics

, v.93, p.41-47. 1996.

36

Pan, Q., Wendel, J., Fluhr, R. Divergent evolution of plant NBS-LRR resistance

gene homologues in dicot and cereal genomes. Journal of Molecular

Evolution, v.50, n.3, p.203-213. 2000.

Paran, I. M., R.W. Development of reliable PCR-based markers linked to downy

mildew resistence genes in lettuce. Theoretical and Applied Genetics, v.85,

p.985-993. 1993.

Parker, J. E., Coleman, M. J., Szabo, V., Frost, L. N., Schmidt, R.,

Vanderbiezen, E. A., Moores, T., Dean, C., Daniels, M. J., Jones, J. D. G.

The Arabidopsis downy mildew resistance gene RPP5 shares similarity to

the toll and interleukin-1 receptors with N and L6. Plant Cell, v.9, n.6, p.879-

894. 1997.

Parniske, M., Hammondkosack, K. E., Golstein, C., Thomas, C. M., Jones, D.

A., Harrison, K., Wulff, B. B. H.,Jones, J. D. G. Novel disease resistance

specificities result from sequence exchange between tandemly repeated

genes at the Cf-4/9 locus of tomato. Cell, v.91, n.6, p.821-832. 1997.

Pashley, C. H., Ellis, J. R., Mccauley, D. E., Burke, J. M. EST databases as a

source for molecular markers: Lessons from Helianthus. The Journal of

Heredity, v.97, n.4, p.381-388. 2006.

Pei, X., Li, S., Jing, Y., Zhang, Y., Wang, Z., Jia, S. Isolation, characterization

and phylogenetic analysis of the resistance gene analogues (RGAs) in

banana (Musa spp.). Plant Science. 2007.

Perrin, R. M., Wigge, P. A. Genome studies and molecular genetics: Plant

biotechnology - Web alert. Current Opinion in Plan Biology, v.5, p.89-90.

2002.

Perry, D. J., Bousquet, J. Genetic diversity and mating system of post-fire and

porst-harvest black spruce: an investigation using codominant sequence-

tagged-site (STS) markers. Canadian Journal of Forest Resources, v.31,

p.32-40. 2001.

Pertsemlidis, A., Fondon, J. Having a BLAST with bioinformatics (and avoiding

BLASTphemy). Genome Biology, v.2, n.10, p.1-10. 2001.

Pickeral, O., Boguski, M. S. The bioinformatics bookshelf: teach yourself

computational biology. Cell, v.96, n.4, p.451-455. 1999.

Picoult-Newberg, L., Ideker, T. E., Pohl, M. G., Taylor, S. L., Donaldson, M. A.,

Nickerson, D. A., Boyce-Jacino, M. Mining SNPs from EST databases.

Genome Research, v.9, p.167-174. 1999.

Pinto, F. O., Maluf, M. P., Guerreiro-Filho, O. Study of simple sequence repeat

markers from coffee expressed sequences associated to leaf miner

resistance. Pesquisa Agropecuária Brasileira

, v.42, n.3, p.377-384. 2007.

37

Poncet, V., Hamon, P., Sauvage De Saint Marc, M. B., Bernard, T., Hamon, S.,

Noirot, M. Base composition of Coffea AFLP sequences and their

conservation within the genus. The Journal of Heredity, v.96, n.1, p.59-65.

2005.

Pontius, J. U., Wagner, L., Schuler, G. D. UniGene: a unified view of the

transcriptome. In: J. Mcentyre, Ostell,J. (Ed.). The NCBI Handbook. National

Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD. , 2003. UniGene: a

unified view of the transcriptome.

Prakash, N. S., Marques, D. V., Varzea, V. M. P., Silva, M. C., Combes, M. C.

Lashermes, P. Introgression molecular analysis of a leaf rust resistance

gene from Coffea liberica into C. arabica L. Theoretical and Applied

Genetics, v.109, p.1311-1317. 2004.

Prosdocimi, P., Cerqueira, G. C., Binneck, E., Silva, A. F., Reis, A. N.,

Junqueira, A. C. M., Santos, A. C. F., Júnior, A. N., Wust, C. I., Filho, F. C.,

Kessedjian, J. L., Petretski, J. H., Camargo, L. P., Ferreira, R. G. M., Lima,

R. P., Pereira, R. M., Jardim, S., Sampaio, V. S., Folgueras-Flatschart, A. V.

Bioinformática: Manual do usuário. Biotecnologia, Ciência &

Desenvolvimento, v.29, p.12-25. 2002.

Pruitt, K., Maglott, D. R. RefSeq and LocusLink: NCBI gene-centered

resources. Nucleic Acids Research, v.29, n.1, p.137-140. 2001.

Pruitt, K. D., Katz, K. S., Sicotte, H., Maglott, D. R. Introducing RefSeq and

LocusLink: curated human genome resources at the NCBI. Trends in

Genetics, v.16, p.44-47. 2000.

Pruitt, K. D., Tatusova, T., Maglott, D. R. NCBI reference sequence project:

update and current status. Nucleic Acids Research, v.31, n.1, p.34-37. 2003.

Pruitt, K. D., Tatusova, T., Maglott, D. R. NCBI reference sequence (RefSeq): a

curated non-redundant sequence database of genomes, transcripts and

proteins. Nucleic Acids Research, v.33, p.501-504. 2005.

Rabinowicz, P. D., Bennetzen, J. L. The maize genome as a model for efficient

sequence analysis of large plant genomes. Current Opinion in Plant Biology,

v.9, p.149-156. 2006.

Raina, S. N., Mukai, Y., Yamamoto, M. In situ hybridization identifies the diploid

species of Coffea arabica (Rubiaceae). Theoretical and Applied Genetics,

v.97, p.1204-1209. 1998.

Richly, E., Kurth, J., Leister, D. Mode of amplification and reorganization of

resistance genes during recent Arabidopsis thaliana evolution. Molecular

Biology Evolution, v.19, p.76-84. 2002.

Richmond, T., Somerville, S. Chasing the dream: plant EST microarrays.

38

Current Opinion in Plan Biology, v.3, p.108-116. 2000.

Richter, T. E., Ronald, P. C. The evolution of disease resistance genes. Plant

Molecular Biology, v.42, n.1, p.195-204. 2000.

Ronald, P. C. Resistance gene evolution. Current Opinion in Plan Biology, v.1,

p.294-298. 1998.

Roos, D. S. Bioinformatics – trying to swim in a sea of data. Science, v.291,

p.1260-1261. 2001.

Rose, E. A. Applications of the polymerase chain reaction to genome analysis.

The FASEB Journal, v.5, p.46-54. 1991.

Rossi, M., Araujo, P. G., Paulet, F., Garsemeur, O., Dias, V. M., Chen, H.,

Sluys, V., D'hont, A. Genomic distribution and characterization of EST-

derived resistance genes analogs (RGAs) in sugarcane. Molecular Genetics

and Genomics, v.269, p.406-419. 2003.

Rouz, P., Pavyt, N., Rombauts, S. Genome annotation: which tools do we have

for it? Current Opinion in Plan Biology, v.2, p.90-95. 1999.

Rowland, L. J., Mehra, S., Dhanaraj, A. L., Ogden, O. L., Slovin, J. P.

Developmento of EST-PCR markers for DNA fingerprinting and genetic

relationship studies in blueberry (Vaccinum, section Cyanococcus). Journal

of the American Society for Horticultural Science, v.128, n.5, p.682-690.

2003.

Rowland, L. J., Dhanaraj, A. L., Polashock, J. J., Arora, R. Utility of Blueberry-

derived EST-PCR. HortScience, v.38, n.7, p.1428-1432. 2003.

Ruas, P. M., Ruas, C. F., Azevedo. L. B., Carvalho, V. P., Ruas, E. A., Sera, T.

Identificação de marcador molecular ligado ao porte de planta em C.

Arabica. I Simpósio de Pesquisa de Cafés do Brasil. Poços de Caldas/MG,

2000. 153-155 p.

Rudd, S., Schoof, H., Mayer, K. PlantMarkers—a database of predicted

molecular markers from plants. Nucleic Acids Research, v.33, p.d628-d632.

2005.

Sales, R. M. O. B., Barbosa, A. V., Silva, F. R. O banco de dados do “Projeto

Genoma Café” na EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia

(CENARGEN). V Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil. Águas de

Lindóia, SP, 2007.

Salmeron, J., Herrera-Estrella, L. R. Plant biotechnology Fast-forward genomics

for improved crop production. Current Opinion in Plan Biology, v.9, p.177-

179. 2006.

Santos, C. M. R., Martins, N. F., Silva, F. R., Costa, M. M., Souza-Jr., M. T. O

39

Projeto Genoma da Bananeira – uma iniciativa mundial para o benefício dos

pequenos produtores. Revista Brazila Esperantisto, v.325. 2003.

Santos, F. R., Ortega, J. M. Bioinformática. In: A. Borém, Del Giúdice, M.,

Sedyiama, T. (Ed.). Melhoramento Genômico. Viçosa, MG: UFV, v.1, 2003.

Bioinformática, p.165-185

Saraste, M., Sibbald, P. R., Wittinghofer, A. The P-loop--a common motif in

ATP- and GTP-binding proteins. Trends in Biochemical Sciences, v.15, n.11,

p.430-434. 1990.

Sasaki, T., Burr. B. International Rice Genome Sequencing Project: the effort to

completely sequence the rice genome. Current Opinion in Plan Biology, v.3,

p.138-141. 2000.

Schubert, R., Mueller-Starck, G., Riegel, R. Development of EST-PCR markers

and monitoring their intrapopulational genetic variation in Picea abies (L.)

Karst. Theoretical and Applied Genetics, v.103, p.1223-1231. 2001.

Sera, T., Ruas, P. M., Ruas, C. F., Diniz, L. E. C., Carvalho, V. P., Rampim, L.,

Ruas, E. A., Silveira, S. R. Genetic polymorphism among 14 elite Coffea

arabica L. cultivars using RAPD markers associated with restriction

digestion. Genetics and Molecular Biology, v.26, n.1, p.59-64. 2003.

Sera, T., Sera, G. H., Ito, D. S., Doi, D. S. Coffee breeding for durable

resistance to leaf rust disease at Instituto Agronômico do Paraná. In: L.

Zambolim, Zambolim, E. M., Várzea, V. M. P (Ed.). Durable resistance to

coffee leaf rust. Viçosa : UFV, DFP, 2005. Coffee breeding for durable

resistance to leaf rust disease at Instituto Agronômico do Paraná, p.187-214

Shanmugam, V. Role of extracytoplasmic leucine rich repeat proteins in plant

defence mechanisms. Microbiological Research, v.160, n.1, p.83-94. 2005.

Shoemaker, R., Keim, P., Vodkin, L., Retzel, E., Clifton, S. W., Waterston, R.,

Smoller, D., Coryell, V., Khanna, A., Erpelding, J., Gai, X., Brendel, V.,

Raph-Schmidt, C., Shoop., Vielweber, C. J., Schmatz, M., Pape. D.,

Theising, B., Martin, J., Dante, M., Wylie, T., Granger, C. A Compilation of

Soybean ESTs: Generation and Analysis. Genome, v.45, p.329-338. 2002.

Silva, A. B., Wanderley-Nogueira, A. C., Silva, R. R. M., Berlarmino, L. C.,

Soares-Cavalcanti, N. M., Benko-Iseppon, A. M. In silico survey of

resistance (R) genes in Eucalyptus transcriptome. Genetics and Molecular

Biology, v.28, n.3, p.562-574. 2005.

Silva, F. G., Iandolino, A., Al-Kayal, F., Bohlmann, M. C., Cushman, M. A., Lim,

H., Ergul, A., Figueroa, R., Kabuloglu, E. K., Osborne, C., Rowe, J.,

Tattersall, E., Leslie, A., Xu, J., Baek, J., Cramer, G. R., Cushman, J. C.,

Cook, D. R. Characterizing the grape transcriptome. Analysis of expressed

sequence tags from multiple Vitis species and development of a

compendium of gene expression during berry development. Plant

40

Physiology, v.139, p.574-597. 2005.

Silva, M. C., Várzea, V., Guerra-Guimarães, L., Azinheira, H. G., Fernandez, D.,

Petitot, A., Bertrand, B., Lashermes, P., Nicole, M. Coffee resistance to the

main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant

Physiology, v.18, n.1, p.119-147. 2006.

Siqueira, T. V. A cultura do Café: 1961-2005. BNDES Setorial. Rio de Janeiro,

p.205-270. 2005

Snowdon, R. J., Friedt, W. Molecular markers in Brassica oilseed breeding:

current status and future possibilities. Plant Breeding, v.123, p.1-8. 2004.

Somerville, C., Somerville, S. Plant functional genomics. Science, v.285, p.380-

383. 1999.

Song, W. Y., Wang, G. L., Chen, L. L., Kim, H. S., Pi, L. Y., Holsten, T.,

Gardner, J., Wang, B., Zhai, W., Zhu, L., Fauquet, C., Ronald, P. A receptor

kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene, Xa21.

Science, v.270, p.1804-1806. 1995.

Staskawicz, B. J., Ausubel, F. M., Maker, B. J., Ellis, J. G., Jones, J. D. G.

Molecular genetics of plant disease resistance. Science, v.268, p.661-667.

1995.

Staskawicz, B. J. Genetics of plant-pathogen interactions specifying plant

disease resistance. Plant Physiology, v.125, p.73-76. 2001.

Steiger, D. L., Nagai, C. Moore, P. H., Morden, C. W., Osgood, R. V., Ming, R.

AFLP analysis of genetic diversity within and among Coffea arabica

cultivars. Theoretical and Applied Genetics, v.105, p.209-215. 2002.

Stein, L. Genome annotation: from sequence to biology. Nature Reviews

Genetics, v.2, p.493-503. 2001.

Sterck, L., Rombauts, S., Vandepoele, K., Rouzé, P., Peer, Y. V. How many

genes are there in plants (. . . and why are they there)? Current Opinion in

Plan Biology, v.10, p.199-203. 2007.

Stokstad, E. Genomes highlight plant pathogens’ powerful arsenal. Science,

v.313, p.1217. 2006.

Tai, T. H., Dahlbeck, D., Clark, E. T., Gajiwala, P., Pasion, R., Whalen, M. C.,

Stall, R. E., Staskawicz, B. J. Expression of the Bs2 pepper gene confers

resistance to bacterial spot disease in tomato. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, v.96, n.4, p.14153-

14158. 1999.

Tateno, Y., Imanishi, T., Miyazaki, S., Fukami-Kobayashi, K., Saitou, N.,

Sugawara, H., Gojobori, T. DNA Data Bank of Japan (DDJB) for genome-

41

scale research in life science. Nucleic Acids Research, v.30, n.1, p.27-30.

2002.

Tedesco, N. S., Sakiyama, N. S., Zambolim, L., Teixera, T. A., Pereira, A. A.

Marcadores OPF-151280 e OPC-091120 ligados ao gene de resistência à

ferrugem do cafeeiro (Hemileia vastatrix Berk. et Br.). I Simpósio de

Pesquisa dos Cafés do Brasil. Poços de Caldas, 2000. 169-171 p.

Temesgem, B., Brown, G. R., Harry. D. E., Kinlaw, C. S., Sewell, M. M., Neal,

D.B. Genetic mapping pf expressed sequence tag polymorphism (ESTP)

markers in loblolly pine (Pinus taeda L.). Theoretical and Applied Genetics,

v.102, p.664-675. 2001.

The-Arabidopsis-Genome-Initiative. Analysis of the genome sequence of the

flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature, v.408, p.796-815. 2000.

Thomas, C. M., Jones, D. A., Parniske, M., Harrison, K., Balint-Kurti, P. J.,

Hatzixanthis, K., Jones, J. D. G. Characterization of the tomato Cf-4 gene for

resistance to Cladosporium fulvum identifies sequences that determine

recognitional specificity in Cf-4 and Cf-9. Plant Cell, v.9, n.12, p.2209-2224.

1997.

Torto, T. A., Li, S., Styer, A., Huitema, E., Testa, A., Gow, N. A. R., West, P. V.,

Kamoun, S. EST mining and functional expression assays identify

extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.

Genome Research, v.13, p.1675-1685. 2003.

Toyoda, K., Collins, N. C., Takahashi, A., Shirasu, K. Resistance and

susceptibility of plants to fungal pathogens. Transgenic Research, v.11,

p.567-582. 2002.

Traut, T. W. The functions and consensus motifs of nine types of peptide

segments that form different types of nucleotide-binding sites. European

Journal of Biochemistry, v.229, p.9-19. 1994.

Tsumura, Y., Suyama, Y., Yoshimura, K., Shirato, N., Mukai, Y. Sequence-

tagged-sites (STSs) of cDNA clones in Cryptomeria japonica and their

evaluation as molecular markers in conifers. Theoretical and Applied

Genetics, v.94, p.764-772. 1997.

Udall, J. A., Swanson, J. M., Haller, K., Rapp, R. A., Sparks, M. E., Hatfield, J.,

Yu, Y., Wu, Y., Dowd, C., Arpat, A. B., Sickler, B. A., Wilkins, T. A., Guo, J.

Y., Chen, X. Y., Scheffler, J., Taliercio, E., Turley, R., Mcfadden, H., Payton,

P., Klueva, N., Allen, R., Zhang, D., Haigler, C., Wilkerson, C., Suo, J.,

Schulze, S. R., Pierce, M. L., Essenberg, M., Kim, H., Llewellyn, D. J.,

Dennis, E. S., Kudrna, D., Wing, R., Paterson, A. H., Soderlund, C., Wendel,

J. F. A global assembly of cotton ESTs. Genome Research, v.16, p.441-450.

2006.

Udall, J. A., Swanson, J. M., Haller, K., Rapp, R. A., Sparks, M. E., Hatfield, J.,

42

Yu, Y., Wu, Y., Dowd, C., Arpat, A. B., Sickler, B. A., Wilkins, T. A., Guo, J.

Y., Chen, X. Y., Scheffler, J., Taliercio, E., Turley, R., Mcfadden, H., Payton,

P., Klueva, N., Allen, R., Zhang, D., Haigler, C., Wilkerson, C., Suo, J.,

Schulze, S. R., Pierce, M. L., Essenberg, M., Kim, H., Llewellyn, D. J.,

Dennis, E. S., Kudrna, D., Wing, R., Paterson, A. H., Soderlund, C., Wendel,

J. F. A global assembly of cotton ESTs. Genome Research, v.16, p.441-450.

20069.

Van Der Biezen, E. A., Jones, J. D. The NB-ARC domain: a novel signaling

motif shared by plant resistance gene products and regulators of cell death

in animals. Current Biology, v.8, n.7, Mar, p.R226-227. 1998.

Van Der Biezen, E. A., Sun, J., Coleman, M. J., Bibb, M. J., Jones, J. D. G.

Arabidopsis RelA/SpoT homologs implicate (p)ppGpp in plant signaling

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America, v.97, n.7, p.3747-3752. 2000.

Van Der Linden, C. G., Wouters, D. C. A. E., Mihalka, V., Kochieva, E. Z.,

Smulders, M. J. M., Vosman, B. Efficient targeting of plant disease

resistance loci using NBS profiling. Theoretical and Applied Genetics, v.109,

p.384-393. 2004.

Várzea, V. M. P., Marques, D. V. Population variability of Hemileia vastatrix vs.

coffee durable resistance. In: L. Zambolim, Zambolim, E. M., Várzea, V. M.

P. (Ed.). Durable resistance to coffee leaf rust. Viçosa : UFV, DFP, 2005.

Population variability of Hemileia vastatrix vs. coffee durable resistance,

p.53-74

Vettore, A. L., Silva, F. R., Kemper, E. L., Souza, G. M., Silva, A. M., Ferro, M. I.

T., Henrique-Silva, F., Giglioti, E. A., Lemos, M. V. F., Coutinho, L. L.,

Nobrega, M. P., Carrer, H., França, S. C., Bacci-Jr, M., Goldman, M. H. S.,

Gomes, S. L., Nunes, L. R., Camargo, L. E. A., Siqueira, W. J., Sluys, M. V.,

Thiemann, O. H., Kuramae, E. E., Santelli, R. V., Marino, C. L., Targon, M.

L. P. N., Ferro, J. A., Silveira, H. C. S., Marini, D. C., Lemos, E. G. M.,

Monteiro-Vitorello, C. B., Tambor, J. H. M., Carraro, D. M., Roberto, P. G.,

Martins, V. G., Goldman, G. H., Oliveira, R. C., Truffi, D., Colombo, C. A.,

Rossi, M., Araujo, P. G., Sculaccio, S. A., Angella, A., Lima, M. M. A., Rosa-

Jr, V. E., Siviero, F., Coscrato, V. E., Machado, M. A., Grivet, L., Mauro, S.

M. Z., Nobrega, F. G., Menck, C. F. M., Braga, M. D. V., Telles, G. P., Cara,

F. A. A., Pedrosa, G., Meidanis, J., Arruda, P. Analysis and functional

annotation of an expressed sequence tag collection for tropical crop

sugarcane. Genome Research, v.13, p.2725-2735. 2003.

Vieira, L. G., Andrade, A. C., Colombo, C.A., Pereira, G. A. Coffee genome

project: a resource for functional genomics. In: L. Zambolim, Zambolim, E.

M., Várzea, V. M. P. (Ed.). Durable resistance to coffee leaf rust. Viçosa :

UFV, DFP, 2005. Coffee genome project: a resource for functional

genomics, p.363-396

Vieira, L. G. E., Andrade, A. C., Colombo, C. A., Moraes, A. H. A., Metha, A.,

43

Oliveira, A. C., Labate, C. A., Marino, C. L. e C. B. Monteiro-Vitorello, Monte,

D. C., Giglioti, E., Kimura, E. T., Romano, E., Kuramae, E. E., Lemos, E. G.

M., Almeida, E. R. P., Jorge, E. C., Albuquerque, E. V. S., Silva, F. R.,

Vinecky, F., Sawazaki, H. E., Dorry, H. F. A., Carrer, H., Abreu, I. N.,

Batista, J. A. N., Teixeira, J. B., Kitajima, J. P., Xavier, K. G., Lima, L. M.,

Camargo, L. E. A., Pereira, L. F. P., Coutinho, L. H., Lemos, M. V. F.,

Romano, M. R., Machado, M. A., Costa, M. M. C., Sá, M. F. G., Goldman,

M. H. S., Ferro, M. I. T., Tinoco, M. L. P., Oliveira, M. V., Sluys, M. V.,

Shimizu, M. M., Maluf, M. P., Eira, M. T. S., Filho, O. G., Arruda, P.,

Mazzafera, P., Mariani, P. D. S. C., Oliveira, R. L. B. C., Harakava, R.,

Balbao, S. F., Tsai, S. M., Mauro, S. M. Z., Santos, S. N., Siqueira, W. J.,

Costa, G. G. L., Formighieri, E. F., Carazzolle, M. F., Pereira, G. A. G.

Brazilian coffee genome project: an EST-based genomic resource. Brazilian

Journal of Plant Physiology, v.18, n.1, p.95-108. 2006.

Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Van-De-Lee, T., Hornes, M.,

Friters, A., Pot, J., Paleman, J., Kuiper, M., Zabeau, M AFLP: a new

technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, v.23, n.21,

p.4407-4414. 1995.

Wang, G., Ruan, D., Song, W., Sideris, S., Chen, L., Pi, L., Zhang, S., Zhang,

Z., Fauquet, C., Gaut, B. S., Whalen, M. C., Ronald, P. C. Xa21D ecodes a

receptor-like molecule with a leucine-rich repeat domain that determines

race-specific recognition and is subject to adaptive evolution Plant Cell, v.10,

n.5, p.765-779. 1998.

Wheeler, D. L., Smith-White, B., Chetvernin, V., Resenchuk, S., Dombrowski, S.

M., Pechous, S. W., Tatusova, T., Ostell, J. Plant genome resources at the

National Center for Biotechnology Information. Plant Physiology, v.138,

p.1280-1288. 2005.

Wheeler, D. L., Barrett, T., Benson, D. A., Bryant, S. H., Canese, K.,

Chetvernin, V., Church, D. M., Dicuccio, M., Edgar, R., Federhen, S., Geer,

L. Y., Kapustin, Y., Khovayko, O., Landsman, D., Lipman, D. J., Madden, T.

L., Maglott, D. R., Ostell, J., Miller, V., Pruitt, K. D., Schuler, G. D., Sequeira,

E., Sherry, S. T., Sirotkin, K., Souvorov, A., Starchenko, G., Tatusov, R. L.,

Tatusova, T. A., Wagner, L., Yaschenko, E. . Database resources of the

National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research,

v.35, p.5-12. 2007.

Williams, J. C. G. K., A. R.; Livak, K. J.; Rafalski, J. A., Tingey, S. V. DNA

polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.

Nucleic Acids Research, v.18, p.6531-6535. 1990.

Winslow, R. L., Boguski, M. S. Genome informatics: current status and future

prospects. Circulation Research – Journal of The American Heart

Association, v.92, p.953-961. 2003.

Wolfsberg, T. G., Landsman, D. A comparison of expressed sequence tags

(ESTs) to human genomic sequences. Nucleic Acids Research

, v.25,

44

p.1626-1632. 1997.

Wolfsberg, T. G., Wetterstrand, K. A., Guyer, M. S., Collins, F. S., Baxevanis, A.

D. A user’s guide to the human genome. Nature Genetics v.32, p.1-79.

2002.

Yamamoto, K., Sasaki, T. L. Large-scale EST sequencing in rice. Plant

Molecular Biology, v.35, p.135-144. 1997.

Yang, W., Scheffler, B. E., Weston, L. A. Recent developments in primer design

for DNA markers in higher plants. HortScience, v.41, n.4, p.1006. 2006.

Young, N. D. The genetic architecture of resistance. Current Opinion in Plant

Biology, v.3, n.4, p.285-290. 2000.

Zambolim, L. Produção Integrada de Café. Viçosa: DFP/UFV. 2003. 4170 p.

Zambolim, L., Zambolim, E. M.,Várzea, V. M. P. Durable Resistance to Coffee

Leaf Rust. Viçosa. 2005. 540 p.

Zambolim, L., Zambolim, E. M., Do Vale, F. X. R., Pereira, A. A., Sakiyama, N.

S., Caixeta, E. T. Physiological races of Hemileia vastatrix Berk. Et Br. In

Brazil – Physiological variability, current situation and future prospects. In: L.

Zambolim, Zambolim, E. M., Várzea, V. M. P. (Ed.). Durable resistance to

coffee leaf rust. Viçosa : UFV, DFP, 2005. Physiological races of Hemileia

vastatrix Berk. Et Br. In Brazil – Physiological variability, current situation

and future prospects, p.75-98

Zatz, M. M. Bioinformatics training in the USA. Briefings in Bioinformatics, v.3,

n.4, p.353-360. 2002.

Zhang, J., Zhang, L., Coombes, K. R. Gene sequence signatures revealed by

mining the UniGene affiliation network. Bioinformatics, v.22, n.4, p.385-391.

2006.

45

CAPÍTULO 1

IDENTIFICAÇÃO DE SEQÜÊNCIAS EXPRESSAS DO GENOMA DO

CAFÉ POTENCIALMENTE ASSOCIADAS COM A RESISTÊNCIA A

DOENÇAS

46

1. INTRODUÇÃO

O seqüenciamento de ESTs (Expressed Sequence Tags) é um método

rápido e apresenta boa relação de custo benefício para a obtenção de dados

de interesse em genomas. Por esta razão, esse método tem se tornado um

segmento crescente nas bases de dados públicas (Wolfsberg e Landsman,

1997). Em plantas, o seqüenciamento de ESTs foi inicialmente feito para as

espécies modelo arabidopsis (Höfte et al., 1993) e arroz (Yamamoto e Sasaki,

1997). Posteriormente, grande quantidade de seqüência ESTs de outras

espécies, incluindo milho (Zea mays L., Gai et al., 2000), soja [Glycine max (L.)

Merr., Shoemaker et al., 2002], trigo (Triticum aestivum L., Lazo et al., 2001),

batata (Solanum tuberosum, Ronning et al., 2003) e algodão (Gossypium

hirsutum, Udal et al., 2006), além de várias outras foram depositadas no

dbEST.

As informações geradas pelo seqüenciamento desses genomas têm

facilitado e acelerado a identificação de genes responsáveis por características

agronômicas desejáveis, possibilitando a manipulação subseqüente de genes

de interesse por meio de técnicas de genética molecular.

A cultura do café também está sendo beneficiada pela revolução

genômica. No Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC) foram identificados

cerca de 33.000 unigenes a partir de 214.964 ESTs de 37 bibliotecas de

tecidos em diferentes estados fisiológicos de Coffea arabica, C. canephora e C.

racemosa. Estas ESTs foram agrupadas, resultando em 17.982 contigs e

32.155 singlets (Vieira et al., 2006). Todos estes dados, além de várias

ferramentas genéticas e genômicas que auxiliam os estudos e pesquisas,

foram disponibilizados pelo Laboratório de Genômica e Expressão (LGE) e pela

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen).

O objetivo principal de um trabalho de genômica é identificar genes

responsáveis por características importantes. Os genes de resistência a

doenças estão entre as classes de genes mais importantes para o

melhoramento, sendo responsáveis por respostas imunes específicas incluindo

o reconhecimento de patógenos e ativação de mecanismos de defesa.

Desta forma, este trabalho foi realizado com o objetivo de identificar, por

meio da análise in silico, seqüências do banco de dados do PBGC

47

potencialmente envolvidas com a resistência do cafeeiro a doenças. Estas

ESTs serão úteis para desenvolver novos e eficientes marcadores moleculares

para assistirem os programas de melhoramento do cafeeiro.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Base de dados

Para a mineração das seqüências potencialmente envolvidas com a

resistência do cafeeiro a patógenos, analisou-se as ESTs do PBGC por meio

da plataforma de bioinformática do LGE (http://www.lge.ibi.unicamp.br/cafe/).

2.2. Estratégias de mineração

Para o trabalho de mineração foram utilizadas três diferentes

estratégias, aqui denominadas de Electronic Northern, Palavras-Chave e

Seqüências Publicadas.

2.2.1. Electronic Northern

Esta estratégia foi baseada nos dados fornecidos pela ferramenta

Electronic Northern. Todas as 214.964 ESTs provenientes das 37 bibliotecas

de cDNA (Tabela 1.1) foram agrupadas e os clusters (contigs e singlets)

formados. A porcentagem normalizada de ESTs das bibliotecas que constituem

cada um dos contigs foi descrita. Nesta estratégia, foram selecionados para

análise apenas os clusters constituídos por pelo menos uma EST da biblioteca

RM1 (biblioteca de folhas de Coffea arabica infectadas com bicho mineiro e

ferrugem), pois esta biblioteca é uma fonte potencial de seqüências envolvidas

no processo de resistência da planta contra doenças.

48

Tabela 1.1: Bibliotecas do Projeto Brasileiro do Genoma Café com os respectivos números

de reads aceitos.

Coffea arabica

Biblioteca

Descrição Reads aceitos

AR1 Folhas com tratamento de ácido araquidônico 2.364

BP1 Bion positive - plântulas inteiras + células 6.218

CA1 Calo 4.278

CB1 Células em suspensão com bion e brassinosteróides 8.237

CL2 Calo com e sem bion - curta 9.294

CS1 Células em suspensão com sais 7.804

EA1 Calos embriogênicos 4.847

EB1 Embrião de frutos 138

EM1 Embrião de sementes germinando 139

FB1 Botão floral estádio 1 e botão floral estádio 2 - longa 7.537

FB2 Botão floral estádio 1 e botão floral estádio 2 - curta 5.429

FB4 Botão floral estádio 3 e botão floral estádio 4 - curta 2.705

FR1 Botão floral nº 6, chumbinho nº 1, frutos estádios 1 e 2 - longa

3.369

FR2 Botão floral nº 6, chumbinho nº 1, frutos estádios 1 e 2 - curta 5.474

IA1 Calos embriogênicos

IA2 Linhagem embriogênica (folha) com indução de 2,4D 2.052

IC1 Linhagem não embriogênica (folha) sem indução de 2,4D 2.227

LP1 Plântulas com tratamento de ácido araquidônico 2.301

LV4 Folhas de ponteiro ortotrópicas sem bion - longa 4.742

LV5 Folhas de ponteiro ortotrópicas sem bion - curta 6.724

LV8 Folhas plagiotrópicas de plantas adultas sem bion - longa 7.320

LV9 Folhas plagiotrópicas de plantas adultas sem bion - curta 3.017

NS1 Raízes com nematóide 321

PA1 Linhagem embriogênica (calos primários) 1.761

PC1 Linhagem não embriogênica (folhas) com indução de 2,4D 2.204

RM1 Folhas com ferrugem e bicho mineiro 3.512

RT3 Raiz sem bion - longa 356

RT5 Raiz com bion - longa 1.507

RT8 Raiz e células em suspensão na presença de aluminio - curta

5.074

RX1

Ramos infectados com Xylella

7.117

SH2 Estresse hídrico no campo (pool de tecidos) 5.185

SI3 Sementes germinando (inteira) 7.493

SS1 Condições normais - irrigado (pool de tecidos) 702

Coffea canephora

Biblioteca

Descrição Reads aceitos

EC1 Calos embriogênicos 6.632

SH1 Folhas - estresse hídrico - curta 89

Coffea racemosa

Biblioteca

Descrição Reads aceitos

FR4 Fruto 5.436

FV2 Fruto verde - estádio 1, 2 e 3 - curta 5.080

A ferramenta Electronic Northern está disponível na plataforma de

bioinformática do LGE. No lado esquerdo da página da plataforma estão

listadas as ferramentas e links de serviços. Para acessar a ferramenta

Electronic Northern, basta clicar sobre o link com esse nome. Uma nova página

49

se abre, onde o usuário deve escolher as espécies com as quais deseja

trabalhar. As opções são: CA - Coffee Arabica, CC – Coffee Canephora, CR –

Coffee Racemosa e All Species.

Assim que é feita a escolha, é necessário fornecer o login e a senha do

pesquisador responsável. Na página da ferramenta é possível organizar as

seqüências (Singlets ou Contigs) pelo nome, por meio da ordem alfabética; por

biblioteca, por meio da percentagem normalizada decrescente de ESTs da

biblioteca escolhida, presente em cada contig; por gene, por meio da ordem

crescente do número de identificação do gene (gi) ao qual o contig está

relacionado; e pelo componente celular, processo biológico ou função

molecular, por meio da ordem decrescente da numeração do GO.

2.2.2. Palavras-Chave

Realizou-se uma busca na literatura científica por termos

conhecidamente relacionadas com o mecanismo de resistência a doenças.

Estas palavras-chave foram utilizadas como “iscas” para mineração dos dados,

e as seqüências obtidas foram depositadas no sistema de gerenciamento e

manipulações de seqüências, o Gene Projects. Cada projeto recebe o nome de

uma palavra-chave e armazena as ESTs a ela relacionadas.

Os projetos criados foram: LRR, NBS, Resistance, Chitinase,

Cytochrome P450, Glucanase, HSP (Heat Shock Protein), Thaumatin

Chalconesyntase, Hypersensitive, Pathogenesis, Polyphenoloxidase, Importin,

Glucosyltransferase e Phytoalexin. As ESTs de cada projeto foram agrupadas

formando os contigs, que foram comparados com seqüências do GenBank pelo

programa BLAST.

O sistema Gene Projects pode ser acessado clicando sobre o link

presente no lado esquerdo da plataforma de bioinformática do LGE. Uma nova

página se abre, onde o usuário deve escolher as espécies com as quais deseja

trabalhar. As opções são: CA - Coffee Arabica, CC – Coffee Canephora e CR –

Coffee Racemosa. Assim que é feita a escolha, é necessário fornecer o login e

a senha do pesquisador responsável, e posteriormente, o login e a senha do

usuário.

50

Na página de Inclusão e Manutenção de Projetos é possível criar e

editar projetos. Para criar um projeto basta clicar em “criar novo projeto”. Deve-

se dar um título e uma breve descrição para o projeto, além de fornecer o e-

mail do usuário.

Para acrescentar seqüências ao projeto, deve-se selecionar o projeto

com o qual o usuário deseja trabalhar, na página de Inclusão e Manutenção de

Projetos. Na página do projeto em questão, clicar em “acrescentar novos

reads”. É possível buscar as ESTs desejadas por meio de cinco estratégias:

Reads Search, Keyword Search, BLAST Search, All Reads e Pattern Search.

Para a estratégia de Palavras-Chave foi uilizada a busca por palavras-chave

(Keyword Search). Após selecionar essa estratégia, basta digitar o termo de

busca e clicar em “find now”. È possível também fazer uma pesquisa booleana,

utilizando os operadores AND, OR e NOT, em caso de busca por mais de um

termo simultaneamente.

A página de respostas apresentará todas as seqüências que contenham

o termo de busca na anotação do BLAST. Nessa página pode-se selecionar as

seqüências uma a uma, clicando sobre os boxes laterias, ou pode-se

selecionar todas de uma só vez, clicando na opção “selecionar todas” na parte

inferior da página. Após a seleção deve-se enviar as ESTs selecionadas para

a página de busca, clicando em “enviar reads”.

Depois de enviar as ESTs selecionadas para a página de busca, é

necessário exportá-las para o projeto em questão. A seleção das ESTs pode

ser feita uma a uma, clicando sobre os boxes laterais, ou clicando na opção

“select all”. Posteriormente, deve-se clicar em “exportar reads selecionados”.

Após a exportação das ESTs para o projeto, basta clicar em “voltar” para

acessar a página do projeto onde estarão armazenadas as ESTs que foram

exportadas.

Na página do projeto é possível agrupar as ESTs, afim de obter

seqüências consenso, maiores e mais representativas. Para isso, deve-se

selecionar as seqüências a serem agrupadas, uma a uma ou todas, clicando

em “selecionar todos” e depois clicar em “clusterizar”. Para verificar o resultado

do agrupamento, basta clicar em “visualizar clusterização”.

Na página dos clusters pode-se visualizar os contigs e os singlets

formados pelo agrupamento. Clicando em “view” o usuário pode visualizar a

51

montagem do contig formado. O hyperlink da coluna “reads” permite a

verificação das ESTs que constituem cada contig. É possível organizar as

seqüências da página de clusters pelo nome, score, e-value, percentagem de

erro ou comprimento total da seqüência. É possível ainda, fazer uma busca de

similaridade para os contigs formados, clicando em “iniciar blastagem”.

2.2.3. Seqüências Publicadas

Nesta estratégia foi realizada uma busca por similaridade entre

seqüências publicadas que codificam genes de cafeeiros relacionados à

resistência a patógenos (Chen et al., 2003; Fernandez et al., 2004; Lin et al.,

2005; Ganesh et al., 2006) com as do PBGC. As ESTs encontradas no PBGC

foram, posteriormente, submetidas a uma comparação com o banco de dados

NR (non redundant) do NCBI, por meio do programa BLAST, para verificar a

sua anotação.

A estratégia Seqüências Publicadas foi realizada utilizando a ferramenta

“Search”, disponível na plataforma de bioinformática do LGE. O link para a

ferramenta está presente no lado esquerdo da plataforma. As opções dessa

ferramenta são: BLAST Local, Keyword Search in BLAST Results e All BLAST

Results. Para a estratégia Seqüências Publicadas foi utilizada a opção BLAST

Local. Depois de escolher a opção é necessário fornecer o login e a senha do

pesquisador responsável para acessar a ferramenta.

Na página do BLAST é possível escolher o tipo de programa a ser

utilizado: blastn, blastp, blastx, tblastn e tblastx. É possível também escolher a

base de dados do PBGC com a qual a seqüência publicada será comparada.

Para fazer a busca, basta colar a seqüência de interesse no campo de

busca e, após escolher o programa e a base de dados, clicar em “search”. A

página de resposta é bem similar à do BLAST do NCBI, apresentando um

resultado gráfico dos alinhamentos e mostrando as seqüências da base de

dados do PBGC que apresentam similaridade com a seqüência de interesse,

com seus respectivos valores de score e e-value.

52

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Electronic Northern

Após o agrupamento de todas as seqüências do genoma, foram

formados 2.206 clusters que continham pelo menos uma ESTs da biblioteca

RM1. Deste total, 602 foram formados apenas por ESTs da biblioteca

RM1(100% RM1), 21 por seqüências com 99% a 75% e 213 de 74% a 50%

das ESTs provenientes da RM1 (Tabela 1.2).

Tabela 1.2: Número de clusters formados por ESTs da Biblioteca RM1

Estratégia Electronic Northern Número de seqüências % em relação a RM1

Seqüências com ESTs da RM1 2.206

100

Seqüências 50% a 74% de ESTs da RM1 213

9,65

Seqüências 75% a 99% de ESTs da RM1 21

0,95

Seqüências 100% dos ESTs da RM1 602

27,29

Como essas seqüências são de genes expressos no momento de

infecção da planta por bicho mineiro e ferrugem, existe a possibilidade de que

elas tenham uma função no processo de infecção e ao mecanismo de defesa

da planta contra esses estresses bióticos. De fato, vários clusters formados

apenas por ESTs da biblioteca RM1 apresentaram similaridade com proteínas

reconhecidamente relacionadas com esse processo como, por exemplo, LRR,

proteína quinase, citocromo P450, proteína de susceptibilidade e apoptose

celular (importina - alfa), proteína putativa de ligação ao DNA, entre outras

(Tabela 1.3).

Tabela 1.3: Anotação dos clusters formados apenas por ESTs da

biblioteca RM1

Anotação Nº Clusters

No hits found

135

Proteína Expressa

48

Proteínas não-conhecidas Proteína Hipotética 113

Proteína Desconhecida 21

Proteína Quinase 8

Transportador ABC (Cassete de ligação a ATP) 6

Proteína LRR 4

Citocromo P450 3

Outros 264

Total 602

53

Das 602 seqüências formadas exclusivamente por ESTs da biblioteca

RM1, 317 (52,65%) não têm similaridade com nenhum gene presente no banco

de dados (Figura 1.1). Essas seqüências podem ser únicas de cafeeiro, ou de

algum gene que ainda não foi descrito. São, portanto dados novos e devem ser

analisados minuciosamente.

Os clusters formados por 50 a 99% de ESTs da biblioteca RM1 também

exibiram anotação de proteínas envolvidas no processo de defesa da planta

contra doenças. Alguns exemplos foram proteína dedo de zinco, proteína de

resistência a doença, proteína quinase putativa, proteína de membrana,

chalcone redutase, entre outras.

Anotação dos

clusters

100% RM1

317; 53%

285; 47%

Similaridade com genes não conhecidos

Similaridade com genes conhecidos

Figura 1.1. Anotação dos clusters formados exclusivamente

por ESTs da biblioteca RM1.

Os processos biológicos com os quais os clusters 100% RM1 estão

envolvidos incluem metabolismo, transporte, regulação da transcrição,

enovelamento de proteínas, biossíntese, entre outros (Tabela 1.4).

Tabela 1.4: Processos biológicos dos clusters formados

exclusivamente por ESTs da biblioteca RM1

Processo Biológico Nº Clusters

Não definido 281

Desconhecido 51

Transporte 105

Metabolismo 44

Biossínthese 32

Fosforilação de proteínas e aminácidos 20

Regulação da transcrição, DNA-dependente 17

Proteólise e Peptidolise 14

Enovelamento de Proteína 7

Outros 31

Total 602

54

Mais da metade dos clusters 100% RM1 (332; 55,15%) possuem

processo biológico desconhecido (Figura 1.2).

As funções moleculares apresentadas pelos clusters 100% RM1

incluíram atividade catalítica, ligação a ácidos nucléicos, ligação a nucleotídeos

entre outros (Tabela 1.5). A função de ligação a nucleotídeos pode estar

relacionada com o mecanismo de resistência da planta, uma vez que o domínio

NBS de proteínas de resistência a doenças é encontrado em uma grande

variedade de proteínas com a função de ligação a ATP ou GTP em diversos

organismos (Traut, 1994 e Saraste et al., 1990).

Processos biológicos dos

clusters

100% RM1

332; 55%

270; 45%

Processos biológicos não conhecidos

Processos biológicos conhecidos

Figura 1.2. Processos biológicos dos clusters formados

exclusivamente por ESTs da biblioteca RM1.

Tabela 1.5: Funções moleculares dos clusters formados

exclusivamente por ESTs da biblioteca RM1

Função Molecular Nº Clusters

Não definida 259

Desconhecida 23

Atividade Catalítica 29

Ligação a DNA 20

Ligação a Ácidos Nucleicos 13

Ligação a Nucleotídeos 12

Ligação a RNA 4

Outras 242

Total 602

De modo semelhante à anotação e ao processo biológico,

aproximadamente metade (282; 46,84%) dos clusters 100% RM1

apresentaram função molecular desconhecida (Figura 1.3).

55

Funções moleculares dos

clusters

100% RM1

282; 47%

320; 53%

Funções moleculares não conhecidas

Funções moleculares conhecidas

Figura 1.3. Funções moleculares dos clusters formados

exclusivamente por ESTs da biblioteca RM1.

A maior parte dos clusters 100% RM1 que possuem componente celular

definido está relacionada com a membrana (66 clusters). Foram encontrados

também clusters relacionados com o cloroplasto, núcleo e citoplasma, entre

outros (Tabela 1.6).

Tabela 1.6: Componentes celulares dos clusters formados

exclusivamente por ESTs da biblioteca RM1

Componente celular Nº Clusters

Não definido 393

Desconhecido 30

Membrana 66

Cloroplasto 36

Citoplasma 10

Núcleo 10

Mitocôndria 8

Outros 49

Total 602

Com relação ao organismo homólogo, foram encontrados clusters 100%

RM1 similares a seqüências de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Nicotiana

sp, Solanum tuberosum, Lycopersicon esculentum, entre outras espécies

(Tabela 1.7). Esta análise mostrou ainda que existem clusters similares a

seqüências de bactérias (Pseudomonas sp. e Bordetella sp.) e até mesmo à

mosca das frutas (Drosophila melanogaster). Esses resultados indicam que

pode ter ocorrido contaminação. Uma outra hipótese é a existência de genes

conservados entre essas espécies.

56

Tabela 1.7: Espécies que apresentaram seqüências similares

aos clusters formados exclusivamente por ESTs

da biblioteca RM1

Organismo homólogo Nº Clusters

Arabidopsis thaliana

177

Oryza sativa

39

Pseudomonas sp.

43

Nicotiana sp.

9

Bordetella sp.

6

Lycopersicon esculentum

3

Solanum tuberosum

3

Drosophila melanogaster

2

Outros 320

Total 602

3.2. Palavras-chave

Foram mineradas um total de 11.793 ESTs nos 15 projetos criados

(Figura 1.4). Os projetos CytochromeP450, Resistance e Chitinase foram os

que tiveram o maior número de ESTs, com 2.441 (20,70%), 1.864 (15,81%) e

1.855 (15,73%) respectivamente (Tabela 1.8). Os projetos menos abundantes

em ESTs foram Phytoalexin, Polyphenoloxidase e Hypersensitive, com 12

(0,10%), 67 (0,57%) e 86 (0,73%) respectivamente.

Após o agrupamento das ESTs presentes em cada um destes projetos

(Tabela 1.8), os contigs formados foram submetidos a uma análise

comparativa, por meio do BLAST. A anotação de cada contig foi analisada,

visando a obtenção do maior número de informações relevantes sobre os

prováveis genes de resistência a doenças.

Com a palavra-chave LRR (Leucine Rich Repeat – Repetições Ricas em

Leucina) foi possível minerar 825 ESTs.

O domínio LRR possui, entre outras funções, a de facilitar a interação da

proteína R com o seu fator Avr (elicitor) relacionado podendo fornecer

diferentes especificidades de reconhecimento para fatores Avr alterados

(Parniske et al., 1997). De fato, em vários sistemas planta-patógeno, a variação

da seqüência na região LRR, mostrou ser responsável por diferentes

especificidades de reconhecimento ou de resistência (Parniske et al., 1997;

Thomas et al., 1997; Botella et al., 1998; Wang et al., 1998; Ellis et al., 1999).

57

% de ESTs dos projetos

7,00%

4,19%

15,81%

15,73%

20,70%

5,44%

2,04%

2,69%

1,30%

0,73%

8,30%

0,57%

4,51%

10,90%

0,10%

LRR NBS Resistance

Chitinase CytochromeP450 Glucanase

HSP (Heat Shock Protein) Thaumatin Chalconesynthase

Hypersensitive Pathogenesis Polyphenoloxidase

Importin Glucosyltransferase Phytoalexin

Figura 1.4: Porcentagem relativa do numero de ESTs dos 15 projetos criados pela

estratégia Palavras-Chave.

Tabela 1.8: Número de ESTs de cada um dos 15 projetos criados a

partir de palavras-chave e número de contigs e singlets

formados como resultado do agrupamento.

Projeto

ESTs

Contigs

Singlets

Chalconesynthase 153

5

8

Chitinase 1.855

47

48

CytochromeP450 2.441

235

202

Glucanase 642

92

68

Glucosyltransferase 1.286

130

160

HSP (Heat Shock Protein) 240

31

27

Hypersensitive 86

8

4

Importin 532

11

14

LRR 825

160

243

NBS 494

105

142

Pathogenesis 979

63

37

Polyphenoloxidase 67

4

3

Phytoalexin 12

3

2

Resistance 1864

347

416

Thaumatin 317

16

7

TOTAL

11.793

1.257

1.381

58

Foram encontradas ESTs com similaridade a proteínas de resistência a

doenças, proteínas NBS-LRR, proteínas quinases, dentre outras (Tabela 1.9).

Tabela 1.9: ESTs encontradas no projeto LRR

Anotação Nº ESTs

Proteína de Resistência a Doenças 249

Proteína NBS-LRR 120

Proteína LRR 116

Proteína de Resistência 62

Receptor LRR de Proteína Quinase 62

Rad-51 (Fifty one) like, Short RFS-1, f-box protein Fbl2 (51.6 kD) (rfs-1Co)

20

Coronatina-insensível 1 (COI1), AtFBL2 19

Proteína Hipotética F6H11.60 12

Proteína EILP receptora de LRR Elicitora-indutível 11

Proteína F-box e LRR 10

Outras 144

Total

825

As ESTs encontradas nesse projeto tiveram similaridade com genes de

espécies vegetais como Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Nicotiana tabacum,

Glycine max e Phaseolus vulgaris, e também animais como Rattus norvegicus

e Homo sapiens (Tabela 1.10).

A análise dos contigs revelou a presença de genes de resitência a

doenças com domínios conservados pfam00931NB-ARC (Nucleotide Binding in

APAF-1, R gene products, e CED-4) e COG4886 LRR. Dos 160 contigs

formados, 58 apresentaram e-value menor que 1

-10

. As informações destes

contigs estão apresentadas na Tabela 1.11.

O contig 158, anotado como resistance protein KR4, Glycine max, foi o

de menor tamanho, com 476 pb. O contig 49, anotado como putative NBS-LRR

type disease resistance protein, de Prunus persica, foi o de tamanho maior,

com 3.281 pb.

Quatro contigs foram formados por pelo menos uma EST da biblioteca

RM1 (48, 95, 117 e 143). O contig 48 foi anotado como Disease resistance

protein (CC-NBS-LRR class), putative, de Arabidopsis thaliana, apresentou

2.255 pb e foi formado por 13 ESTs, sendo que apenas uma delas é da

biblioteca RM1. O contig 95, anotado como Disease resistance-like protein, de

Coffea arabica, com 778 pb, foi formado por duas ESTs da biblioteca RM1.

59

Tabela 1.10: Espécies que apresentaram

seqüências similares às

ESTs encontradas no

projeto LRR

Organismo Nº ESTs

Arabidopsis thaliana

287

Solanum sp.

120

Oryza sativa

102

Hordeum vulgare

37

Nicotiana tabacum

29

Rattus norvegicus

19

Phaseolus vulgaris

18

Glycine max

17

Manihot esculenta

15

Homo sapiens

10

Outros 171

Total

825

O contig 117 foi anotado como putative disease related protein 2, de

Oryza sativa, com 1.886 pb e formado por quatro ESTs, sendo uma da

biblioteca RM1.

O contig 143, anotado como NBS-LRR disease resistance protein

homolog, de Hordeum vulgare, com 841 pb, foi formado por três ESTs, sendo

uma da biblioteca RM1.

Usando a palavra-chave NBS (Nucleotide Binding Site – Sítio de Ligação

a Nucleotídeo) foram encontradas 494 ESTs do PBGC. Dentre elas, destacam-

se as anotações: proteínas de resistência, proteínas NBS-LRR e proteínas de

resistência a doenças (Tabela 1.12), que corresponderam a 84,81% do número

total de ESTs presentes nesse projeto.

Acredita-se que o domínio NBS participa da ativação dos componentes

da transdução de sinais, levando a respostas de resistência patógeno-

específicas (Aarts et al., 1998; Feys e Parker, 2000; Van Der Biezen et al.,

2000).

As ESTs encontradas nesse projeto apresentaram similaridade com

genes de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Glycine max, Solanum sp. e

Phaseolus vulgaris, entre outras (Tabela 1.13).

60

Tabela 1.11: Relação de Contigs com e-value menor que 1

-10

formados pelo agrupamento do projeto LRR e o respectivo número de ESTs de cada biblioteca.

Contig Definição Organismo Domínio 1 Domínio 2 # pb # ESTs

C

A

1

L

V

4

L

V

5

L

V

8

L

V

9

C

L

2

F

R

1

F

R

2

F

B

1

F

B

2

F

B

4

R

T

8

B

P

1

R

M

1

C

B

1

C

S

1

F

R

4

E

A

1

E

C

1

I

C

1

P

C

1

I

A

2

R

X

1

P

A

1

S

I

3

S

H

2

S

1

4

very similar to disease

resistance proteins

Arabidopsis thaliana pfam00931NB-ARC domain 985 2 1 1

6

NBS/LRR disease

resistance protein RPM1

Arabidopsis lyrata pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 1121 2 2

8

similar to NBS-LRR type

resistance gene

Oryza sativa pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 946 2 1 1

9

disease resistance protein

(CC-NBS-LRR class),

putative

Arabidopsis thaliana pfam00931NB-ARC domain pfam01576:Myosin tail 953 2 1 1

11

putative resistance

complex protein I2C-2

Solanum demissum pfam00931NB-ARC domain 762 2 1 1

12

putative late blight

resistance protein

Solanum demissum pfam00931NB-ARC domain 858 2 2

13 putative RGH1A Oryza sativa pfam00931NB-ARC domain 782 2 2

21 fom-2 protein Cucumis melo 1579 9 4 1 4

23

potato resistance-like

protein I2GA-SH23-1

Solanum tuberosum pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 996 2 1 1

24 fom-2 protein Cucumis melo pfam00931NB-ARC domain 1852 3 1 1 1

25 disease resistance protein Arabidopsis thaliana pfam00931NB-ARC domain 867 4 4

27 disease resistance protein Arabidopsis thaliana pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 912 4 2 2

30

putative leucine-rich

repeat disease resistance

protein

Arabidopsis thaliana pfam00931NB-ARC domain 1335 7 4 1 1 1

33

Disease resistance

protein BS2

Capsicum chacoense pfam00931NB-ARC domain 2540 15 1 4 2 5 2 1

35

putative disease

resistance protein RPH8A

Oryza sativa pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 1857 7 1 1 1 4

37

disease resistance protein

RPH8A (RPP8 homolog

A)

Arabidopsis thaliana pfam00931NB-ARC domain 2164 5 1 1 1 1 1

40

blight resistance protein

RGA1

Solanum bulbocastanum pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 1540 2 1 1

43

disease resistance

protein, putative

Arabidopsis thaliana pfam00931NB-ARC domain 561 2 1 1

44

putative disease

resistance protein RPH8A

Oryza sativa pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 1981 6 2 3 1

46

putative disease

resistance protein

Arabidopsis thaliana pfam00931NB-ARC domain 1500 2 1 1

47

disease resistance-like

protein

Coffea canephora pfam00931NB-ARC domain 1025 3 2 1

48

disease resistance protein

(CC-NBS-LRR class),

putative

Arabidopsis thaliana pfam00931NB-ARC domain 2255 13 1 1 4 1 1 1 1 1 2

49

putative NBS-LRR type

disease resistance protein

Prunus persica pfam00931NB-ARC domain 3281 15 4 1 1 1 2 3 1 2

*Bibliotecas: AR1 - Folhas com tratamento de ácido araquidônico. BP1 - Bion positive - plântulas inteiras + células. CA1 – Calo. CB1 - Células em suspensão com bion e brassinosteróides. CL2 - Calo com e sem bion – curta.

CS1 - Células em suspensão com sais. EA1 - Calos embriogênicos. EB1 - Embrião de frutos. EM1 - Embrião de sementes germinando. FB1 - Botão floral estádio 1 e botão floral estádio 2 – longa. FB2 - Botão floral estádio 1 e

botão floral estádio 2 – curta. FB4 - Botão floral estádio 3 e botão floral estádio 4 – curta. FR1 - Botão floral nº 6, chumbinho nº 1, frutos estádios 1 e 2 – longa. FR2 - Botão floral nº 6, chumbinho nº 1, frutos estádios 1 e 2 –

curta. IA1 - Calos embriogênicos. IA2 - Linhagem embriogênica (folha) com indução de 2,4D. IC1 - Linhagem não embriogênica (folha) sem indução de 2,4D. LP1 - Plântulas com tratamento de ácido araquidônico. LV4 - Folhas

de ponteiro ortotrópicas sem bion – longa. LV5 - Folhas de ponteiro ortotrópicas sem bion – curta. LV8 - Folhas plagiotrópicas de plantas adultas sem bion – longa. LV9 - Folhas plagiotrópicas de plantas adultas sem bion –

curta. NS1 - Raízes com nematóide. PA1 - Linhagem embriogênica (calos primários). PC1 - Linhagem não embriogênica (folhas) com indução de 2,4D. RM1 - Folhas com ferrugem e bicho mineiro. RT3 - Raiz sem bion –

longa. RT5 - Raiz com bion – longa. RT8 - Raiz e células em suspensão na presença de aluminio – curta. RX1 - Ramos infectados com Xylella. SH2 - Estresse hídrico no campo (pool de tecidos). SI3 - Sementes germinando

(inteira). SS1 - Condições normais - irrigado (pool de tecidos). EC1 - Calos embriogênicos (C. canephora). SH1 - Folhas - estresse hídrico – curta (C. canephora). FR4 – Fruto (C. racemosa). FV2 - Fruto verde - estádio 1, 2 e 3

– curta (C. racemosa).

60

61

Tabela 1.11 continuação

Contig Definição Organismo Domínio 1 Domínio 2 # pb # ESTs

C

A

1

L

V

4

L

V

5

L

V

8

L

V

9

C

L

2

F

R

1

F

R

2

F

B

1

F

B

2

F

B

4

R

T

8

B

P

1

R

M

1

C

B

1

C

S

1

F

R

4

E

A

1

E

C

1

I

C

1

P

C

1

I

A

2

R

X

1

P

A

1

S

I

3

S

H

2

S

1

53

blight resistance protein

T118

Solanum tarijense pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 768 4 4

54

putative disease

resistance gene homolog

Oryza sativa pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 1619 5 1 2 1 1

60

putative NBS-LRR type

resistance protein

Oryza sativa pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 900 2 1 1

62

disease resistance gene

homolog 9N

Brassica napus pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 917 2 1 1

64

putative late blight

resistance protein

Solanum demissum 693 2 2

65 resistance protein KR4 Glycine max pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 759 2 2

69 fom-2 Cucumis melo pfam00931NB-ARC domain 1022 3 2 1

73 RGC1 Solanum tuberosum pfam00931NB-ARC domain 1239 5 1 3 1

76 prf

Lycopersicon

pimpinellifolium

pfam00931NB-ARC domain 744 2 2

77 fom-2 protein Cucumis melo 1384 2 1 1

83

putative disease

resistance protein RPH8A

Oryza sativa pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 2376 4 3 1

86

putative disease

resistance protein Prf

Solanum demissum pfam00931NB-ARC domain 1571 7 1 4 2

87

NBS/LRR disease

resistance protein RPM1

Arabidopsis lyrata pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 694 2 2

95

disease resistance-like

protein

Coffea arabica pfam00931NB-ARC domain 778 2 2

96 resistance protein Tsu5 Arabidopsis thaliana pfam00931NB-ARC domain 931 2 1 1

97

disease resistance-like

protein

Coffea arabica pfam00931NB-ARC domain 1047 2 2

98 NBS-LRR protein Solanum tuberosum pfam00931NB-ARC domain 593 2 2

101

disease resistance protein

I2

Lycopersicon esculentum

pfam00931NB-ARC domain 715 2 2

106

putative disease

resistance protein

Solanum demissum pfam00931NB-ARC domain 729 2 2

109

disease resistance-like

protein

Coffea arabica pfam00931NB-ARC domain 1131 5 3 1 1

112

putative NBS-LRR

resistance protein

Oryza sativa pfam00931NB-ARC domain 1256 3 1 2

117

putative disease related

protein 2

Oryza sativa pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 1886 4 1 1 1 1

123

putative disease

resistance gene homolog

Oryza sativa pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 779 4 1 2 1

124

disease resistance

protein-like

Arabidopsis thaliana pfam00931NB-ARC domain COG4886:Lrr protein 936 2 1 1

126

putative late blight

resistance protein

Solanum demissum pfam00931NB-ARC domain 786 2 2