( PDF ) Expressão de survivina em tumores do estroma gastrointestinal

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Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul

Faculdade de Medicina

Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde

Tese de Doutorado

EXPRESSÃO DE SURVIVINA EM TUMORES DO

ESTROMA GASTROINTESTINAL

SHEILA SCHUCH FERREIRA

Orientador: Prof. Dr. Bernardo Garicochea

Co-orientador: Prof. Dr. Vinícius Duval da Silva

Porto Alegre, julho de 2007.

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DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)

Rosária Maria Lúcia Prenna Geremia

Bibliotecária CRB10/196

F383e Ferreira, Sheila Schuch

Expressão de survivina em tumores de estroma gastrointestinal /

Sheila Schuch Ferreira; orient. Bernardo Garicochea; co-orient. Vinicius

Duval da Silva. Porto Alegre: PUCRS, 2007.

70f.: il. tab. graf.

Tese (Doutorado) – Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande

do Sul. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em

Medicina e Ciências da Saúde. Área de concentração: Clínica Médica .

1. T

UMORES DO ESTROMA GASTROINTESTINAL

. 2. S

URVIVINA

. 3.

ROTEÍNAS INIBIDORAS DE APOPTOSE

ARCADORES BIOLÓGICOS DE

TUMOR

PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS

AGENTES INDUTORES DA

ANGIOGÊNESE

NEOPLASIAS GASTROINTESTINAIS

IMUNOISTOQUÍMICA

PROGNÓSTICO

10.

ESTUDOS DE COORTES

I. Garicochea, Bernardo. II.

Silva, Vinícius Duval da. III.Título.

C.D

.D. 616.99433

C.D.U. 616.33-006:577.27(043.2)

N.L.M. WI 149

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Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul

Faculdade de Medicina

Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde

Tese de Doutorado

EXPRESSÃO DE SURVIVINA EM TUMORES DO

ESTROMA GASTROINTESTINAL

SHEILA SCHUCH FERREIRA

Orientador: Prof. Dr. Bernardo Garicochea

Co-orientador: Prof. Dr. Vinícius Duval da Silva

Tese para postular o Título de Doutor em

Clínica Médica. Programa de Pós-Graduação

em Medicina e Ciências da Saúde,

concentração em Oncologia, Faculdade de

Medicina da Pontifícia Universidade Católica

do Rio Grande do Sul.

Porto Alegre, julho de 2007.

“May I never see in the patient anything but a fellow creature in pain.

Grant me the strength, time and opportunity always to correct what I

have acquired, always to extend its domain; for knowledge is immense

and the spirit of man can extend indefinitely to enrich itself daily with

new requirements.“

Maimonides, 1135-1204

AGRADECIMENTOS

Durante o período de execução deste trabalho pude contar com o auxílio de

inúmeras pessoas que se tornaram referências como colaboradores e amigos verdadeiros e

que, além da contribuição técnica e científica, confirmaram sua importância na minha vida.

Deste modo, gostaria de agradecer:

Ao Prof. Dr.Bernardo Garicochea, meu orientador, pelo incentivo para realização

deste trabalho, sugestões e pela confiança e carinho demonstrados;

Ao Prof. Dr.Vinicius Duval da Silva, meu co-orientador, pela acolhida

incondicional em um momento crítico deste trabalho, pela inestimável contribuição e

disponibilidade;

À Dra. Alice de Medeiros Zelmanowicz, pela amizade e importante colaboração na

análise estatística dos dados;

À Doutoranda Virgínia Nóbrega pela dedicação no auxílio na revisão de

prontuários e coleta de dados;

Ao bioquímico Tiago Giuliani, pela inestimável ajuda e capacidade profissional na

realização das análises imunoistoquímicas;

Às secretárias e demais funcionários do Laboratório de Anatomia Patológica;

Às minhas dedicadas secretárias Elaine Barbosa e Fernanda Martins que auxiliaram

na busca de dados e prontuários;

Aos funcionários da Pós-Graduação em Medicina, Eloá e Maurício e em especial à

Sônia pela simpatia e competência;

Aos meus colegas do Serviço de Oncologia do HSL-PUCRS: Dra. Fabiana Viola,

Dra. Fernanda Costa, Dra. Maria Helena Sostruznik,Dr.Alan Azambuja, Dr.Carlos Barrios Dr.

Sergio Lago pelo apoio, amizade e companheirismo durante as atividades do dia-a-dia e no

manejo de situações muitas vezes sofridas e delicadas;

Ao Hospital São Lucas da PUCRS, que nos últimos 15 anos se tornou uma

extensão da minha própria casa;

À minha mãe Maria Carmem Schuch Ferreira pelo exemplo de vitalidade, alegria e

compreensão e ao meu irmão Fernando pelo carinho;

Ao meu namorado, Sergio Soares, meu melhor amigo, confidente e companheiro,

por sua alegria , espontaneidade e por seu amor;

Ao CNPQ, pelo auxílio financeiro para execução deste trabalho;

Aos pacientes e suas famílias que diariamente nos estimulam a aprimorar a arte do

cuidar e nos trazem ensinamentos constantes e exemplares.

RESUMO

Base Teórica:Os GIST são as neoplasias mesenquimais mais freqüentes do trato

gastrointestinal.Os fatores de prognóstico relevantes dos GIST são: o tamanho do tumor,

topografia e índice mitótico.Survivina é uma proteína inibidora da apoptose envolvida na

regulação do ciclo celular, normalmente expressa no núcleo de células pluripotenciais e

geralmente inexistente em tecido normais.Survivina possui alta expressividade em neoplasias

epiteliais.A expressão de survivina em GIST é desconhecida.

Métodos: Amostras teciduais de 43 GIST foram analisadas através de estudo

imunoistoquímico com método TMA e utilizando anticorpo monoclonal para survivina com a

técnica de avidina-biotina-peroxidase.O objetivo primário foi determinar a prevalência da

expressão de survivina nos GIST e definir sua associação com achados patológicos e evolução

clínica.A expressão de survivina foi considerada positiva quando mais de 10% das células

tumorais observadas em cinco campos de grande aumento apresentavam imunoreatividade.

Resultados: Survivina foi expressa em 31 (72%) das 43 amostras.A predominância da

expressão ocorreu no citoplasma enquanto que nenhuma reatividade nuclear foi encontrada.

Não houve associação entre a expressão de survivina e achados clínico-patológicos.Houve

uma tendência em favor da expressão de survivina e diminuição para tempo para progressão.

Conclusões:A prevalência de survivina em GIST é semelhante ao anteriormente demonstrado

em neoplasias epiteliais e mesenquimais.Os resultados do presente estudo sugerem que a

inibição da apoptose mediada por survivina pode se tornar um fator de prognóstico em GIST.

ABSTRACT

Background: Gastrointestinal stromal tumors are the most common mesenchymal tumors of

the gastrointestinal tract. The well-described prognostic factors are tumor size, digestive tract

localization and mitotic index.Survivin is an apoptosis inhibitor involved in cell cycle

regulation normally expressed in the nucleus of embryogenic and pluripotent stem cells, but

is usually absent in normal tissues. Survivin is aberrantly expressed in epithelial neoplasms.

The expression profile of survivin in GIST is unknown.

Methods: Tissue samples of 43 gastrointestinal stromal tumors specimens were analyzed by

immunohistochemistry using TMA method and monoclonal antibodies for survivin with the

avidin-biotin-peroxidades technique.The purpose was to determine the prevalence of survivin

expression and to define its association with clinical and pathologic features and the clinical

outcome.Expression of survivin was considered positive when more than 10% of observed

tumor cells in the microscopic field demostrated immunostaining.

Results:Survivin was expressed in 31 ( 72%) of 43 samples.Immunostaining ocurred in

cytoplasm and no nuclear expression was seen.The correlation between survivin expression

and clinical or pathologic features was not demonstrated.There is a trend in favor of survivin

expression and time to progression in our data.

Conclusions: The prevalence of survivin in GIST is similar to others studies previously

related.The results of present study suggest that the apoptosis inhibition mediated by survivin

has the potential to become an independent prognostic factor in GIST.

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS

AINE Anti-inflamatório não esteróide

ASCO Sociedade Americana de Oncologia Clínica

CIC Células intersticiais de Cajal

CGA Contagem por campo de grande aumento

COX-2 Ciclo-oxigenase – 2

CT Tomografia Computadorizada

DNA Ácido desoxirribonucléico

GIST Tumores do estroma gastrointestinal

HSL Hospital São Lucas

IHQ Imunoistoquímica

KIT Oncogene KIT

kDa KiloDaltons

m-RNA Ácido ribonucléico mensageiro

NCCN National Comprehensive Cancer Network

PCR Reação em cadeia da polimerase

PET Tomografia com emissão de pósitrons

PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas

PIA Proteína inibidora da apoptose

PUCRS Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul

RECIST Response Evaluation Criteria in Solid Tumors

RT-PCR Reação em cadeia da polimerase em tempo real

SCF Stem cell factor

SMA Actina anti-músculo liso

S100 Proteína S-100

TGI Trato gastrointestinal

TK Tirosina quinase

VEGF Fator de crescimento vásculo –endotelial

LISTA TABELAS

Tabela 1. Sistema de consenso de graduação de risco (56)...............................................10

Tabela 2. Categorias de risco baseadas em tamanho, índice mitótico e localização

anatômica (57) .................................................................................................10

Tabela 3 . Expressão de survivina em várias neoplasias..................................................... 26

Tabela 4. Características clínicopatológicas da população estudada ( n=43)..................... 38

Tabela 5. Características clínico-patológicas dos tumores sincrônicos.............................. 39

Tabela 6. Expressão de marcadores imunoistoquímicos...................................................40

Tabela 7. Achados imunoistoquímicos da população estudada.........................................43

Tabela 8. Expressão de survivina e características clínico-patológicas .............................44

LISTA FIGURAS E ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Sinalização de KIT e PDGF em GIST (50).........................................................7

Figura 2. Localização e freqüência das mutações em KIT e PDGF (extraído de

www.gistsupport.org).........................................................................................7

Figura 3. Vias de apoptose (extraído de www. imgenex.com). ........................................22

Figura 4. Blocos de parafina e TMA ...............................................................................33

Figura 5. Lâminas de TMA.............................................................................................34

Figura 4. Expressão imunoistoquímica de Survivina .......................................................41

Figura 5. Expressão imunoistoquímica de Ki 67..............................................................42

Figura 6. Expressão de Survivina e sobrevida .................................................................45

Figura 7. Expressão de survivina e sobrevida em doença localizada ................................46

Figura 8. Expressão de survivina e sobrevida livre de progressão....................................47

Figura 9. Expressão de survivina e chance de recidiva ....................................................47

Figura 10. Expressão de Ki 67 e sobrevida........................................................................48

Figura 11. Expressão de Ki 67 e sobrevida livre de progressão..........................................49

Figura 12. Expressão de Ki 67 e chance de recidiva ..........................................................49

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...................................................................................................................1

2 REVISÃO DA LITERATURA............................................................................................3

2.1 Epidemiologia dos GIST...............................................................................................3

2.2 GIST: Aspectos Clínicos...............................................................................................4

2.2.1 Sintomatologia dos GIST .......................................................................................5

2.2.2 GIST e Síndromes Hereditárias ..............................................................................6

2.2.3 Patogênese .............................................................................................................6

2.2.4 Fatores de prognóstico ...........................................................................................9

2.2.5 Mutações de KIT e biologia dos GIST..................................................................11

2.3 Métodos Diagnósticos.................................................................................................12

2.4 Diagnóstico Patológico ...............................................................................................13

2.5 Tratamento da Doença Localizada ..............................................................................15

2.6 Tratamento da Doença Avançada................................................................................17

2.7 Avaliação de Resposta ao Tratamento Farmacológico.................................................20

2.8 Apoptose e Survivina..................................................................................................21

2.9 Características e Funções da Survivina........................................................................23

2.10 Expressão Tecidual de Survivina em Câncer .............................................................25

3 HIPÓTESE........................................................................................................................29

4 OBJETIVOS .....................................................................................................................30

5 MÉTODOS .......................................................................................................................31

5.1 Delineamento, População e Amostra...........................................................................31

5.2 Critérios de Inclusão ...................................................................................................31

5.3 Critérios de Exclusão ..................................................................................................32

5.4 Variáveis em estudo....................................................................................................32

5.5 Imunoistoquímica .......................................................................................................33

5.6 Análise Estatística.......................................................................................................35

6 RESULTADOS.................................................................................................................36

6.1 Caracterização da Amostra..........................................................................................36

6.2 Análise Imunoistoquímica...........................................................................................39

6.3 Expressão de Survivina...............................................................................................40

6.4 Expressão de Ki 67 .....................................................................................................42

6.5 Expressão de survivina e achados clínico-patológicos .................................................44

6.6 Expressão de survivina e sobrevida livre de doença em 3 anos....................................45

7. DISCUSSÃO....................................................................................................................51

8.CONCLUSÕES.................................................................................................................59

9 REFERÊNCIAS ................................................................................................................60

1 INTRODUÇÃO

O desenvolvimento e progressão neoplásica envolve desregulação seqüencial de

múltiplos reguladores do ciclo celular promovendo proliferação celular desordenada e

vantagem de sobrevida de células tumorais agressivas associadas a múltiplas alterações

genéticas cumulativas.Há evidências que a sobrevida prolongada de células geneticamente

instáveis e sua transformação no fenótipo maligno esteja associada à inibição progressiva da

apoptose.(1)

A apoptose é uma forma morfologicamente distinta de morte celular, geneticamente

regulada, e desempenha papel vital como mecanismo protetor contra o desenvolvimento de

neoplasias através da remoção de células portadoras de dano de DNA(2).A inibição da

apoptose confere vantagem de sobrevida em células com alterações genéticas e pode

promover a aquisição de mutações subseqüentes que estimulam a progressão tumoral e

também contribuem para resistência à radioterapia e quimioterapia.(3,4)

Survivina é um membro da família das proteínas inibidoras da apoptose,

abundantemente expressa durante a embriogênese e em tecidos tumorais e praticamente

inexistente em tecidos adultos normais, exceto em tecidos altamente proliferativos como o

parênquima testicular, timo e placenta(5).Os mecanismos reguladores da expressão de

survivina em células malignas ainda não estão suficientemente esclarecidos, porém estudos

em diversas linhagens tumorais têm demonstrado que a expressão desta proteína pode estar

associada à piora da sobrevida global.

(6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25)

Os tumores de estroma gastrointestinal (GIST) são as neoplasias mesenquimais mais

freqüentes do trato gastrointestinal e tipicamente caracterizados pela expressão

imunoistoquímica de KIT e PDGF.

Tradicionalmente, múltiplos parâmetros histológicos tais como índice mitótico,

tamanho tumoral, celularidade, presença de necrose e pleomorfismo têm sido utilizados para

se predizer o comportamento biológico dos GIST. ( 26,27,28,29,30,31,32)

Embora uma variedade de características clínico-patológicas possa afetar o

prognóstico, se faz necessário identificar marcadores moleculares sensíveis e específicos que

possam monitorar expressão de genes associados à apoptose e proliferação celular e

possivelmente capazes de se tornarem fatores prognósticos consistentes.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Epidemiologia dos GIST

Os tumores de estroma gastrointestinal ( GIST) são neoplasias mesenquimais pouco

freqüentes; representam aproximadamente 0,1 % a 3% de todas as neoplasias do trato

gastrointestinal (TGI) e possuem origem provável nas células de Cajal, localizadas no

interstício,com características neuromotoras e responsáveis pela motilidade do TGI.(28, 32)

De acordo com estudos populacionais se estima que a incidência de GIST seja de 10-

20 casos por milhão de habitantes.(33)

Nos Estados Unidos da América, houve um aumento na taxa de incidência, de 0,028

por 100.000 habitantes em 1992 para 0,688 para 100.000 habitantes no ano de 2002;

representando uma incidência estimada anual de 4320 casos (34,35).Nilsson e cols. relataram

a incidência de aproximadamente 14,5 casos por milhão na Suécia, enquanto que na Holanda

a incidência anual dos GIST apresentou acréscimo de 20,8 por milhão de habitantes em 1995

para 25,7 por milhão de habitantes em 2003.(36,37)

Previamente os GIST eram confundidos com leiomoiossarcomas intestinais pois

ambos têm aparência microscópica semelhante; a utilização de um marcador

imunoistoquímico ( CD 117) para a proteína KIT contribuiu sobremaneira para a

diferenciação dos GIST de outras neoplasias fusiformes do TGI.( 37)

Em adição às taxas crescentes de incidência houve um marcado aumento de

sobrevida desde 2000, devido ao melhor entendimento da patobiologia dos GIST, do papel

central da mutações do KIT na patogênese dos GIST à introdução do inibidor de tirosina

quinase ( TK), imatinib, na prática clínica.(36 ,37)

A exata incidência de GIST no Brasil, assim como em outros países, é difícil

determinar uma vez que estes tumores só recentemente foram reconhecidos como entidade

patológica distinta.(38).

Entretanto, devido a dificuldades de diagnóstico e de suspeição, se acredita que esta

neoplasia seja freqüentemente subdiagnosticada.

2.2 GIST: Aspectos Clínicos

Os GIST caracteristicamente ocorrem em indivíduos acima de 50 anos de idade; a

média de idade varia de 55 a 65 anos.( 39)

São raros antes da idade de 40 anos e extremamente raros em crianças; a maioria dos

tumores identificados como GIST em crianças são na realidade tumores inflamatórios

miofibroblásticos. (28,29)

Apresentam distribuição semelhante entre os gêneros, enquanto que alguns estudos

apontam discreta predominância masculina.(40)

Podem ser diagnosticados em qualquer localização do TGI ,porém aproximadamente

60% dos tumores ocorrem no estômago, 30% no intestino delgado, 5% no cólon e reto e 5%

no esôfago; raramente os GIST se desenvolvem no mesentério, omento e retroperitônio.(39)

O tamanho tumoral médio na apresentação é de 8 cm( 40, 41,42,43).

GIST comumente se apresentam como lesões solitárias; a multiplicidade é rara em

GIST esporádicos.

Tumores menores de 2 cm geralmente são assintomáticos e detectados

incidentalmente em endoscopias digestivas altas, exames radiológicos ou durante exploração

abdominal; considera-se que um terço dos GIST são descobertos ao acaso devido a cirurgias

abdominais realizadas para outras patologias.(44)

Os GIST podem coexistir com diferentes tipos de câncer de maneira sincrônica ou

metacrônica.A freqüência global de segundos tumores em diferentes séries varia de 4,5 a 33%

(média 13%); os carcinomas de TGI constituem o maior percentual( 47%).( 45)

Por exemplo, em estudo coordenado por Kawanowa, 100 espécimes

anatomopatólogicas de estômago de pacientes portadores de câncer gástrico submetidos à

gastrectomia total foram reanalisadas e demonstraram a presença de GIST em 35 % dos

casos; os tumores apresentavam diâmetro médio de 1,5 mm e somente 8% possuíam mutação

do KIT.(46)

2.2.1 Sintomatologia dos GIST

De maneira similar a outros sarcomas, os GIST tendem a deslocar ou comprimir

órgãos adjacentes sem apresentar invasão direta destas estruturas, portanto, podem adquirir

grandes volumes antes de se tornarem sintomáticos. Um recente estudo populacional

demonstrou que aproximadamente 70% dos GIST são sintomáticos, 20% não o são e 10% são

detectados em autópsia.(37)

Os GIST sintomáticos de esôfago tipicamente se apresentam com disfagia e

ocasionalmente como massa mediastinal que no momento transoperatório pode ser

identificada junto ao esôfago.( 44 )

A maior parte dos pacientes com GIST gástricos e de intestino delgado apresenta

sangramento digestivo devido á erosão da luz do TGI e outros sintomas não específicos, tais

como náuseas, vômitos, desconforto ou aumento da circunferência abdominal.

Infreqüentemente podem romper para a cavidade peritoneal causando hemorragia

intraperitonial grave.(37,47)

Os GIST colorretais podem se manifestar por sangramento retal, dor, perfuração

cólica ou obstrução intestinal.A maioria dos GIST colorretais são de alto risco, possuem

probabilidade significativa de desenvolverem doença metastática e estão associados com mau

prognóstico ; tais pacientes devem ser seguidos de maneira intensa por períodos de tempo

prolongados e considerados para terapia adjuvante com inibidores da TK.( 48)

O padrão de disseminação metastático dos GIST difere dos outros sarcomas de partes

moles.Os GIST freqüentemente metastatizam para o fígado e cavidade abdominal e raramente

para linfonodos loco-regionais.Disseminação extra-abdominal envolvendo parênquima

pulmonar e ósseo é pouco freqüente, exceto em casos avançados.(28)

2.2.2 GIST e Síndromes Hereditárias

Sete por cento dos pacientes portadores de neurofibromatose tipo I desenvolvem

GIST; usualmente se manifestam com múltiplos tumores, mais freqüentes em jejuno e com

ausência de mutações em KIT ou PDGF.

O GIST familiar é uma doença genética infreqüente, do tipo autossômica dominante;

a maioria das famílias afetadas apresenta mutação no KIT na linhagem germinativa. Várias

outras mutações nos exons 8,11,13 e 17 de KIT e exon 12 de PDGF foram identificadas nos

GIST familiares.(49,50)Tendem a ocorrer em vários membros da mesma família, os quais

apresentam múltiplas neoplasias primárias, lesões multifocais e diagnóstico em idades mais

precoces que os GIST esporádicos.(51)GIST familiares apresentam como característica a

negatividade para expressão de CD 34.(47)Alguns achados adicionais incluem máculas

pigmentadas na pele do períneo, axila, mãos e face e mastocitose cutânea(urticária

pigmentosa).

A tríade de Carney é uma síndrome de etiologia indeterminada, ocorrendo

predominantemente em mulheres jovens( abaixo dos 35 anos) , caracterizada pela presença de

GIST gástricos multifocais, condroma pulmonar e paraganglioma extra-adrenal. Geralmente

possui melhor prognóstico que GIST esporádicos e não apresenta mutações em KIT ou

PDGF. ( 45,48)

2.2.3 Patogênese

O protooncogene KIT codifica a glicoproteína transmembrana KIT que funciona

como receptora para o ligante SCF ( stem cell factor) ; após esta interação, ocorre a ativação

destes receptores, dimerização e autofosforilação do KIT que ativa a cascata de sinalização

intracelular envolvida na tumorigênese, incluindo proliferação, adesão e diferenciação

celular.(49)

Figura 1. Sinalização de KIT e PDGF em GIST (50)

A expressão de KIT é observada nas células intersticiais de Cajal, e também em

células tronco hematopoiéicas, mastócitos, melanócitos, células de Leydig, espermatogônias

,células germinativas, células basais cutâneas e epiteliais da mama.( 52)

A mutação com ganho de função do KIT ocorre em 91-99% dos casos, resultando na

ativação da função tirosina quinase independentemente da ligação com SCF.

Figura 2. Localização e freqüência das mutações em KIT e PDGF (extraído de

www.gistsupport.org)

Os sítios mais freqüentes de mutação são os exon 11( 70% ) , exon 9 ( 10% ) e

raramente os exons 13 e 17.O tipo de mutação é aparentemente relacionado ao prognóstico,

com deleções tendo comportamento mais agressivo em comparação com inserções e mutações

de ponto.( 53)

A mutação do exon 9 no domínio extracelular é descrita em 5 a 18% dos casos

,ocorrendo principalmente nos códons 501-502 e representada por duplicação-inserção.Está

associada com localização em intestino delgado e cólon direito e tem comportamento

biológico agressivo.( 48)

As deleções, inserções ou mutações de ponto no exon 11 ocorrem no domínio

justamembrana.A freqüência desta mutação varia de 20 a 92% dependendo do método de

conservação do material ( congelado ou fixado em parafina) e da técnica utilizada para sua

identificação.

As mutações do exon 11 estão associadas à melhor taxa de sobrevida global,

sobrevida livre de recorrência e resposta ao uso do imatinib.(54)

A maioria das mutações do exon 11 estão localizadas entre os códons 559 e 560, com

deleções e inserções preferencialmente afetando códons 557-559 e mutações de ponto

afetando códons 559 e 560.

A mutação do exon 13 é rara, afeta códon 642 e ocorre em 0,8- 4,1% dos casos e está

relacionada à resistência ao tratamento com imatinib.

A mutação do exon 17 é ainda mais raro, apenas acometendo 0,6 % dos casos e

afetando códons 820 e 822 e tem mecanismo de ativação incerto.

As mutações no gene PDGF são observadas em 7-12% dos casos, ocorrendo mais

freqüentemente no exon 18 e raramente em exon 12 e 14.Estão associadas com o tipo

histológico epitelióide, localização gástrica e demonstram fraca ou nula imunoreatividade

para KIT, mas são funcionalmente similares ao mutante KIT.

As mutações do exon 18 ocorrem nos códons 842-849 e algumas delas estão

vinculadas à resistência considerável ao tratamento com imatinib; enquanto que as mutações

no exon 12, que envolvem os códons 561-571 estão associadas a alta taxa de resposta ao

imatinib.A mutação do exon 14 é rara e demonstra sensibilidade in vitro ao imatinib

comparável à observada em mutantes KIT exon 13.

Ao redor de 10% dos GIST não demonstram mutação detectáveis no KIT ou no

PDGF.( 53, 54,55)

2.2.4 Fatores de prognóstico

Tradicionalmente, os três fatores de prognóstico mais relevantes em GIST são a

topografia, tamanho tumoral e índice mitótico.

GIST com tamanhos maiores que 5 cm estão associados com prognóstico

desfavorável.O sítio anatômico de origem está relacionado com o comportamento biológico;

pacientes com GIST originários no reto ou intestino delgado tem pior prognóstico

comparados com evoluções mais favoráveis de pacientes com GIST gástricos.Da mesma

forma, GIST que exibem número de mitoses igual ou maior que 5 mitoses por campo de

grande aumento estão associados com prognóstico desfavorável independentemente do sítio

de origem.(55)

As duas classificações de graduação de risco mais freqüentemente utilizadas são as

de Fletcher (56) e de Miettinem (57); enquanto que a primeira leva em consideração o

tamanho tumoral e índice mitótico, a segunda incorpora o sítio de localização como fator

prognóstico independente.Os dois sistemas de classificação encontram-se detalhados nas

tabelas abaixo:

Tabela 1. Sistema de consenso de graduação de risco (56)

Tamanho tumoral ( cm) Contagem mitótica (CGA)

Muito baixo risco < 2 < 5/50

Baixo risco 2-5 < 5/50

Risco intermediário < 5 > 5 a < 10

> 5 ou < 10 < 5/50

Alto risco > 5 > 5/50

> 10 qualquer taxa mitótica

qualquer tamanho > 10 /50

Tabela 2. Categorias de risco baseadas em tamanho, índice mitótico e localização

anatômica (57)

Grupo Tamanho( cm ) Mitoses ( 50 CGA) Categoria de Risco

1 < 2 < 5 EST : benigno

ID : benigno

2 2-5 < 5 EST: potencial maligno muito baixo

ID: potencial maligno baixo

3A 5-10 < 5 EST: potencial maligno muito baixo

ID: potencial maligno

3B > 10 < 5 EST: potencial baixo a moderado

ID: potencial maligno

4 < 2 > 5 EST: incerto

ID: potencial maligno

5 2-5 > 5 EST: baixo a moderado

ID: potencial maligno

6 A > 5 > 5 EST: potencial maligno

6B > 10 > 5 ID:potencial maligno

Benigno : nenhuma morte relacionada ao tumor detectada

Potencial maligno muito baixo: < 3% de doença progressiva

Incerto: dados insuficientes

Potencial maligno baixo a moderado : 12 a 15% mortalidade relacionada ao tumor

Potencial maligno: 49 a 86% de mortalidade relacionada ao tumor.

Enquanto GIST de alto grau ou com disseminação intra e extra-abdominal estão

associados com altas taxas de morte relacionadas ao tumor (83%),estas taxas também são

descritas em 1,2 % nos pacientes com neoplasias de muito baixo risco, baixo risco e risco

intermediário.De acordo com estes dados, atualmente todos os GIST devem ser considerados

como tendo potencial maligno, com possível exceção de tumores muito pequenos( menores de

1 cm ).Entretanto, mesmo em tumores desta dimensão já é possível detectar a mutação do

KIT ; deste modo o termo “ GIST benigno “ não deveria ser ainda utilizado.( 39, 53)

A ressecção incompleta é também fator preditivo de mau prognóstico; enquanto que

pacientes com margens microscópicas negativas a sobrevida em 5 anos varia de 34-63%,

ressecções macroscópicas incompletas têm sobrevida global em 5 anos de somente 8%. ( 58)

Fatores de prognóstico adversos independentes adicionais incluem gênero masculino,

histologia tumoral (epitelióide) e mutações em KIT excetuando as do exon 11.( 59)

2.2.5 Mutações de KIT e biologia dos GIST

Mutações KIT específicas também se correlacionam com comportamento clínico.

Não há evidência, entretanto, que a progressão a partir de doença localizada para

doença metastática se origine a partir de mutações adicionais ou cumulativas em KIT.

Em estudo efetuado por Singer e cols., a sobrevida livre de recorrência em 5 anos foi

de 89% para aqueles com mutação ”missense” de exon 11 versus 40% para aqueles com

outras mutações em KIT e 0% para os que apresentavam mutação no exon 13 versus 51%

para todos ou outros.( 60 )

Entre os tumores com deleções no exon 11, aqueles envolvendo códons 562-579

demostravam maior taxa de metástases do que aqueles com deleções em códons 550-561.(58).

Pacientes com deleções no exon 11 códons 557-558 possuem pior sobrevida livre de

recorrência ( 23%)do que outros ( 74%).( 59)

Mutações no exon 9 são mais freqüentes em GIST francamente malignos (17%) do

que nos tumores de baixo risco( 3%).( 60 )

Semelhantemente às neoplasias epiteliais do TGI, os GIST também apresentam

expressão de enzimas envolvidas na proliferação celular ,como a Cox -2 ,que se encontra

expressa no citoplasma de 80- 92 % dos GIST ; este achado poderia sugerir o uso potencial

de AINE no tratamento. ( 61,62 )

Aberrações nos reguladores do ciclo celular é um achado freqüente, podem

representar um evento precoce e serem um fator contribuinte para a patogênese dos GIST.

GIST são mais freqüentemente associados ao fenótipo E2 F1 ( 92,9% ) , p 53

positivo(43%), e p16 e p21 negativos; a expressão de proteínas pró-apoptóticas foi observada

em 92 e 100 % dos GIST.( 63,64,65 )

Steinert e cols. evidenciaram através de análise de 81 pacientes metastáticos e sem

exposição prévia ao imatinib que houve pior sobrevida global em pacientes que expressavam

níveis elevados de Bcl-2.( 66 )

Até o momento, se desconhece estudos envolvendo a expressão de proteínas

relacionadas aos mecanismos anti-apoptóticos e sua correlação com a sobrevida de pacientes

com GIST.

2.3 Métodos Diagnósticos

Os GIST costumam ser detectados incidentalmente como massa submucosa durante

a realização de endoscopia digestiva alta.

O emprego da ecoendoscopia pode ser útil em determinar a extensão de um tumor de

menor volume, entretanto, os achados radiológicos característicos dos GIST incluem lesões

grandes, heterogêneas e geralmente maiores que 5 cm de diâmetro.

Em estudos convencionais com bário, as lesões da submucosa se apresentam como

defeitos de enchimento, com ulceração central, eventualmente com extensão intraluminal e

raramente com calcificações.Alguns tumores podem ser contíguos com a parede do intestino

apenas através de um pedículo.

A ecografia demonstra massa altamente vascular com ecogenicidade mista e pode ser

útil para realização de procedimentos de biópsia por agulha fina ou core e no transoperatório

para avaliação de lesões hepáticas.(67)

Na tomografia computadorizada contrastada (CT) os GIST são massas heterogêneas

bem definidas com halo periférico marcado e de espessura variável, e freqüentemente

apresentando atenuação central, resultado de necrose, hemorragia ou transformação

cística.(68)

Extensão extra-gástrica pode ocorrer para o ligamento gastro-hepático, gastro-

esplênico ou cavidade do pequeno omento.Este achado diferencia os GIST de outros tumores

do estômago como linfoma ou adenocarcinoma, os quais não têm crescimento exofítico

marcado e geralmente estão associados com linfadenomegalias, o que não é um achado usual

encontrado nos GIST.(69)

A utilização da CT de abdômen pode ser apropriada tanto para se avaliar o tumor

primário quanto para se determinar a presença de metástases e é considerado o método de

imagem de escolha para planejamento cirúrgico.

A Ressonância Nuclear Magnética apresenta-se como método adjunto para se

determinar o sítio de origem de tumores volumosos e acessar envolvimento de órgãos

adjacentes e vasos sangüíneos.Os componentes sólidos dos tumores apresentam baixo sinal na

seqüência em T1, alto sinal em T2 e intensificação da imagem após injeção de gadolíneo.

Os GIST geralmente demonstram intensa captação no 18F-fluoro-deoxiglicose PET (

PET) , assim como outras neoplasias intra-abdominais.A sensibilidade diagnóstica do PET e

CT tem se demonstrado comparável em 90% e pode ser aumentada combinando-se as duas

modalidades.(70)

2.4 Diagnóstico Patológico

“GIST” foi inicialmente um termo descritivo proposto em 1983 por Mazur e Clark

para definir tumores não carcinomatosos intra-abdominais que não exibiam achados

morfoestruturais de células de músculo liso ou características imunoistoquímicas de células

neurais.(71)

Anteriormente ao ano de 2000 não havia critérios objetivos para classificação de

GIST; eram designados como leiomiomas, leiomioblastomas, leiomiossarcomas,

Schwannomas, ou tumores gastrointestinais neuro-autonômicos.(72,73 )

Recentemente, Kindblom e outros autores propuseram que a maioria dos tumores de

estroma se originariam a partir de células tronco mesenquimais que se diferenciariam no

fenótipo das células intersticiais de Cajal (CIC).As CIC, também conhecidas como células-

marcapasso, são uma população de células que têm papel no controle da motilidade do

TGI.Todavia, estas células não são encontradas exclusivamente no TGI, também foram

descritas em outros órgãos como pâncreas, trato urinário, útero e tuba uterina, mama, coração,

e parede de vasos sangüíneos.(74)

As CIC expressam o protooncogene KIT e sua maturação depende da interação do

ligante SCF ao receptor KIT .(74,75)

Os GIST são freqüentemente diagnosticados somente após o exame patológico do

espécime ressecado.

Os achados macroscópicos típicos dos GIST incluem tumor circunscrito e lobulado

com superfície granular, e freqüentes áreas de hemorragia e necrose , alterações císticas e

predominante localização e crescimento extraluminal.

A maioria dos tumores são localizados na submucosa, muscular própria ou ambos e

apresentam 3 morfologias microscópicas distintas : fusiforme ( 70%), epitelióide (20%) ou

combinação destes dois subtipos.(39,74)

Em função do risco de ruptura tumoral, com conseqüentes disseminação tumoral e

hemorragia, o uso rotineiro de biópsia pré-operatória nos GIST é controverso.(36)

Estudos coordenados por Elliot e Wilimore-Payne, nos quais a coleta de tecido foi

realizada através de biópsia com agulha fina, concluíram que este método fornece espécime

quantitativa e qualitativamente adequado para fins diagnósticos utilizando técnicas de

imunoistoquímica ou avaliação molecular.(76,77)

Na análise imunoistoquímica, em contraste com tumores verdadeiramente originários

em musculatura lisa, os GIST são positivos para expressão do receptor de TK ( antígeno CD

117 ou KIT) em 95% dos casos.

KIT é o marcador mais sensível e específico para o diagnóstico de GIST, embora

também possa ser expresso em outras neoplasias como melanoma, sarcomas de células claras,

angiossarcomas, sarcoma de Ewing, tumor mielóide extra-medular, tumores germinativos de

testículo, especialmente seminomas e alguns carcinomas, notadamente carcinoma de

pequenas células de pulmão.( 78,79 )

Aproximadamente 60-70% dos GIST apresentam positividade para CD34, 30-40%

para actina anti-músculo liso( SMA), e 5% demonstram imunopositividade para proteína S-

100.(6).( 39,41)

A positividade para SMA pode ser focal ou global e é inversamente relacionada com

a expressão de CD34, isto é, tumores SMA positivos são geralmente CD34 negativos e vice-

versa.

Hassan e cols. demonstraram , após análise de 300 espécimes de GIST de esôfago e

reto, alta positividade para CD34( acima de 90%), enquanto que os GIST de intestino delgado

apresentam menor positividade( 50%).(48)

Segundo Wang e cols. o marcador CD34 é considerado o melhor indicador do

fenótipo maligno dos GIST.(73)

A expressão de Desmina, proteína típica de células musculares lisas, esqueléticas e

cardíacas é raramente encontrada em GIST.(56)

Ocasionalmente podem apresentar expressão de citoqueratinas, o que pode dificultar

o diagnóstico histoquímico.(55)

2.5 Tratamento da Doença Localizada

A ressecção cirúrgica completa é a terapia padrão dos GIST localizados e permanece

como única alternativa de cura desta patologia.

A ressecção completa é atingida em aproximadamente 85 % dos pacientes com

doença localizada, entretanto a taxa de sobrevida global para pacientes com GIST que foram

submetidos à ressecção completa da doença primária com margens livres varia de 20-63% em

5 anos, com taxa de recorrência em torno de 50% .(39, 80)

Nas situações onde os GIST aderem a órgãos contíguos pode ser necessário a

ressecção em bloco, embora nesta situação não haja benefício aparente em margens amplas.

Linfadenectomia geralmente não é indicada, a menos que haja linfonodos regionais

aumentados, já que metástases linfonodais são raramente encontradas.(29,30 )

Uma vez que a ressecção linfonodal não é necessária para o manejo cirúrgico do

GIST, a laparoscopia poderia ser um método apropriado para tratamento destes tumores,

principalmente em GIST gástricos.(79)

Cirurgia laparoscópica também pode ser considerada uma opção adequada para

tumores com padrão de crescimento intragástrico.

A freqüência de complicações pós-operatórias da laparoscopia é comparável à da

técnica cirúrgica convencional e a taxa de conversão para cirurgia a céu aberto é de 15%( 81).

É fundamental evitar ruptura acidental dos tumores durante o procedimento

laparoscópico pois a ruptura antes ou durante a execução deste é um fator prognóstico

estatisticamente significativo de má evolução.A ruptura tende a ocorrer em grandes tumores,

assim a laparoscopia estaria contraindicada em tumores volumosos.( 80)

Embora o National Comprehensive Cancer Network ( NCCN) - Clinical Practice

Guidelines for Optimal Management of Patients with GIST recomende que a técnica

laparoscópica deva ser limitada a tumores menores que 2 cm ,a remoção segura e completa

de GIST maiores, de até 8,5 cm foi relatada.( 81,82)

Não há rotina estabelecida em termos de seguimento pós-operatório para pacientes

que são submetidos à ressecção de GIST primário; uma vez que não há estudo comprobatório

de que a detecção precoce da recorrência possa interferir de maneira positiva na

sobrevida.(39)

Nilsson e cols. recentemente demonstraram, em estudo piloto incluindo 23 pacientes

com GIST de alto risco submetidos á ressecção cirúrgica completa e tratados com imatinib

por 12 meses, um aumento significativo da sobrevida livre de recorrência ( 4% no grupo

tratado versus 67% ,comparando com grupo de controle histórico).( 83)

O uso de terapia adjuvante com inibidores de TK após a ressecção completa do GIST

primário está atualmente sendo avaliado por 4 estudos utilizando imatinib em doses usuais e

em diferentes regimes de duração de tratamento.

2.6 Tratamento da Doença Avançada

Classicamente os GIST apresentam resistência ao uso de drogas quimioterápicas

convencionais e ao emprego de radioterapia.

O desenvolvimento do inibidor de TK no ano de 2000 , mesilato de imatinib,

revolucionou o tratamento dos GIST.

Imatinib inibe seletivamente TK específicas, incluindo KIT, ABL, BCR-ABL e

PDGF e foi primeiramente utilizado em pacientes com Leucemia Mielóide Crônica ,neoplasia

hematológica produzida pela fusão dos genes BCR e ABL resultante da transferência de

material genético entre os cromossomos 9 e 22.(83)

O primeiro paciente portador de GIST metastático iniciou o tratamento com imatinib

em 2000 após ter falhado a diversas terapias e atingiu resposta radiológica excepcional

acompanhada por PET com virtual desaparecimento das lesões.(43)

Este achado estimulou a realização de diversos estudos clínicos que comprovaram a

excelente taxa de resposta dos pacientes com GIST metastáticos ao imatinib.

No atual momento, se considera que o uso de imatinib em GIST recidivados

apresente um benefício clínico( determinado pela taxa de resposta objetiva e permanência de

doença estável ) em mais de 85% dos pacientes.

Em pacientes com doença avançada, o imatinib produz taxa de resposta completa em

4-7% , parcial em 67% dos pacientes e permanência de doença estável em 18 a 30%, com

sobrevida livre de progressão em 1 ano de 73%.( 84,85,86,87 )

Atualmente a sobrevida de 2 anos de pacientes com doença metastática é em torno de

70%.Em contraste, antes da introdução do imatinib, a sobrevida média dos pacientes após

ressecção cirúrgica por GIST recorrente era de apenas 15- 20 meses.( 88)

A dose usualmente recomendada de imatinib é de 400 mg diários.

A dose diária de 800 mg está associada a aumento de sobrevida livre de progressão,

contudo acarreta maior toxicidade e encontra-se recomendada somente em pacientes que

apresentem sinais de progressão, produzindo estabilidade da doença em 29,4% dos pacientes

,com sobrevida média de 11,5 semanas.(83)

O uso de imatinib geralmente está associado a boa tolerância à medicação, com perfil

de toxicidade facilmente manejável e sem relato de mortalidade relacionada ao tratamento.

As toxicidades mais freqüentemente relatadas são anemia (92%), edema periorbitário

(69%), rash cutâneo ( 69%), fadiga (76% ) , náusea(57%), granulocitopenia (47%) , e diarréia

( 47%).(84)

Apesar de apresentar excelentes resultados com o tratamento, o imatinib não leva à

cura e em torno de 50% dos pacientes apresentam resistência à droga no período aproximado

de 2 anos.(89,90).Adicionalmente, 10-15% dos GIST são primariamente resistentes ao uso de

imatinib.

Os mecanismos da resistência ao imatinib são ainda pouco conhecidos embora o tipo

de mutação do KIT possa ser preditivo da evolução ao tratamento.Pacientes com mutação do

exon 11 têm maior probabilidade de resposta ao imatinib do que aqueles com mutação no

exon 9 ; pacientes sem mutação em KIT raramente respondem ao imatinib.(52).

A resistência também pode estar associada à diminuição de níveis séricos da droga

em função de maior depuração plasmática após maior tempo de exposição à droga e à

aquisição de nova mutações em KIT na vigência do tratamento.(52,92,93 )

A resistência primária ou secundária ao imatinib impulsionou o desenvolvimento de

novas drogas com funções inibitórias de TK.

Sunitinib é um inibidor multialvo de TK com atividades antitumorais e

antiangiogênicas.(94,95).Seus efeitos estão associados ao bloqueio de receptores de TK

sinalizados por KIT, PDGF e das 3 isoformas de receptores de VEGF.(95)

Em estudo prospectivo e randomizado, desenvolvido em 312 pacientes com GIST

avançado com falha ao imatinib , o sunitib demonstrou taxa de resposta completa de 2,9 %,

resposta parcial de 24,6 % e 42 % de doença estável.O tempo médio de sobrevida livre de

progressão foi de 27,3 semanas.

Efeitos adversos relacionados ao uso de sunitinib raramente levaram à

descontinuação do tratamento e foram facilmente manejáveis com redução de dose,

interrupção temporária da medicação ou tratamento médico de suporte.( 92).

Análises preliminares dos pacientes com doença resistente ao imatinib demonstram

que o sunitinib mostra maiores taxas de resposta antitumoral e benefício clínico em pacientes

com mutações primárias no exon 9 do KIT , comparados com aqueles com mutações

primárias no exon 11 do KIT.( 95,96)

Estudo multicêntrico em andamento, com resultados parciais apresentados no

encontro anual da Sociedade Americana de Oncologia Clínica ( ASCO ) de 2006 ,avalia a

eficácia de nilotinib, droga planejada para uso em terceira linha de inibição de TK.Utilizando-

se doses variando de 200 mg a 800 mg diárias foi atingida taxa de estabilização de doença em

71 a 100% dos pacientes.( 96)

A cirurgia tradicionalmente desempenha papel paliativo no manejo de pacientes com

GIST localmente avançado ou metastático.Em pacientes que apresentam doença indolente e

volumosa, a cirurgia de citorredução pode oferecer alívio significativo da dor e dos sintomas

compressivos.( 97)

Em pacientes com GIST primário localmente avançado e que apresentam resposta ao

uso de imatinib ,tornando-se ressecáveis, a cirurgia está associada a alta taxa de ressecção

completa, e aumento de sobrevida livre de doença quando comparados a controles

históricos.(98)

A ressecção cirúrgica após terapia com imatinib ou sunitinib pode ser realizada com

intuito curativo em alguns pacientes com doença avançada que tenham apresentado resposta

ao tratamento, enquanto que pacientes que apresentam franca progressão de doença não

possuem nenhum benefício em ser submetidos a tentativas de ressecção.(87,95, 99,100)

Recentemente, Kobayashi e cols. avaliaram a eficácia de quimioembolização arterial

utilizando cisplatina em 110 pacientes com GIST avançado não elegíveis para ressecção

cirúrgica; foi demonstrado taxa de 14 % de resposta parcial e 74% de estabilização de doença

; a mediana de sobrevida livre de progressão foi de 8,2 meses , com 77 % dos pacientes vivos

em 1 ano.Estes achados sugerem a utilização de quimioembolização como uma opção efetiva

e segura para pacientes com GIST metastático envolvendo o fígado e com falha à terapia

sistêmica convencional. ( 100)

2.7 Avaliação de Resposta ao Tratamento Farmacológico

Diferentemente de outros tumores sólidos, os critérios de resposta da classificação

RECIST são considerados inadequados para avaliação de resposta nos GIST em virtude deste

sistema ser baseado fundamentalmente na redução do volume tumoral (critério de resposta

parcial requer diminuição de 30% no volume tumoral avaliado ).

A redução de volume nos GIST não se correlaciona apropriadamente com resposta

ao tratamento; as lesões podem permanecer estáveis após a terapia devido à substituição de

tumor por tecido fibroso e eventualmente podem até apresentar aumento de volume devido a

diminuição da densidade tumoral por edema ou hemorragia.

Segundo critérios de Choi, a resposta dos GIST ao tratamento medicamentoso ocorre

quando há redução na densidade radiológica das lesões em mais de 15% , degeneração cística

ou diminuição do volume tumoral em mais de 10% .(101)

Stroobants e cols. demonstraram que PET apenas 8 dias após o início do imatinib

prediz corretamente a resposta ao tratamento e precede em 7 semanas os resultados

semelhantes por CT. (70)

A resposta metabólica precoce verificada por PET foi associada a maior sobrevida

livre de progressão.(101)

Tanto PET como CT são considerados métodos confiáveis para a avaliação de

resposta ao imatinib (69,101).Após 30 dias de tratamento com imatinib a resposta é

acuradamente prevista em 85% casos usando PET e em 95% usando a combinação dos 2

métodos , enquanto usando somente CT esta percentagem atinge somente 44%.(102,103)

Deste modo, considera-se o uso de PET importante para avaliação de resposta precoce ao

tratamento.(104)

Estudo realizado por Goh e cols. utilizando imatinib neoadjuvante em 23 pacientes

sugere que a resposta ao PET não se correlaciona adequadamente com resposta patológica;

esta foi acuradamente prevista somente em 26% dos casos.(105)

Embora extremamente útil na constatação de resposta precoce ao tratamento com

imatinib, este exame não substitui uso rotineiro de CT contrastada, que é mais acessível no

nosso meio e pode adequadamente avaliar resposta em aproximadamente 8 semanas; ressalta-

se ainda que 25 % dos pacientes apresentam resposta radiológica mais lenta ao imatinib e o

fato de não haver modificação do quadro radiológico não sugere mudança na abordagem

terapêutica.(106)

A mensuração de níveis séricos de KIT através da técnica de ELISA não se

correlacionou com a resposta ao tratamento; houve decréscimo da concentração de KIT

porém se acredita que esta diminuição esteja associada predominantemente a diminuição do

“ turnover “do KIT sérico e não ao reflexo da diminuição de volume tumoral.(52)

2.8 Apoptose e Survivina

O desenvolvimento e progressão das neoplasias envolve proliferação celular

desordenada causada por alterações genéticas que se acumulam com o passar do tempo. Há

evidências que a sobrevida prolongada de células geneticamente alteradas esteja associada à

inibição progressiva da apoptose.(1)

A apoptose designa um padrão de morte celular morfologicamente distinta da

necrose.(107,108) Na necrose observa-se destruição da membrana celular através de aumento

na pressão osmótica a partir do ambiente extra-celular(107). A apoptose é um processo

geneticamente regulado em que estímulos extranucleares induzem à condensação de

cromatina, degradação do DNA , “blebbing” da membrana, o que leva em última análise à

fragmentação irreversível da célula.(4,108). Representa um mecanismo protetor vital contra o

desenvolvimento câncer, através da remoção de células com dano severo do DNA.(2)

consistindo em uma das funções celulares mais importantes para a manutenção da homeostase

de tecidos normais. (108,109)

Os principais efetores bioquímicos da apoptose são as proteases cisteína -aspartil-

serina, - as caspases - que são sintetizadas como zimógenos inativos ,porém uma vez

ativadas, sistematicamente e em um processo hierárquico, degradam o DNA e proteínas vitais

constitucionais, resultando na perda irreversível da viabilidade celular.(8).As caspases são

classificadas como iniciadoras( caspases 8 e 9) e executoras ( caspases 3,6 e 7

).(3,4,5,6).Embora as características estruturais sejam compartilhadas entre as caspases

iniciadoras e executoras, sua ativação ou inibição são diferentemente reguladas.

Dependendo da origem do estímulo que provoca a ativação do processo de apoptose,

a mesma é desencadeada por duas vias distintas: intrínseca ou extrínseca , conforme ilustrado

abaixo:

Figura 3. Vias de apoptose (extraído de www. imgenex.com).

A via intrínseca é mediada pela mitocôndria e, em resposta ao estímulo apoptótico (

p.ex. ativação de oncogene ou dano ao DNA), várias proteínas são liberadas a partir do espaço

intermembrana da mitocôndria para o citoplasma.(3)Algumas destas proteínas incluem

citocromo c ,SMAC ( segundo ativador de caspase derivado de mitocôndria), DIABLO(

inibidor direto da apoptose ), Endo G( endonuclease G)e OMI /HTRA2 ( proteína A2

requerente de alta temperatura)(4,5).Entre estas proteínas pró-apoptóticas destaca-se o

citocromo c,liberado devido ao aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial

externa. Uma vez liberado, o citocromo c liga-se à proteína APAF-1, ativando-a e induzindo

uma alteração conformacional que permite que esta se ligue ao ATP e forme um complexo

protéico chamado corpo apoptótico, ou apoptossomo, que medeia a ativação da caspase 9

,que por sua vez ativa a caspase efetora 3 ,desencadeando o processo apoptótico.(111)

A via extrínseca é iniciada mediante a interação de um ligante extracelular, como por

exemplo TNF ou FasL, com receptor da superfície celular , como TNF-R1 ou Fas.A

conexão destes ligantes ao receptores promove a ativação das caspases através da formação

de um complexo sinalizador de indução da morte ( DISC).A formação deste complexo leva à

ativação da caspase iniciadora 8 que subseqüentemente ativa a caspase executora 3. (110)

Adicionalmente , após a ativação de Fas e TNF-R1 é estabelecida uma preponderância de

proteínas pró-apoptóticas da família Bcl-2;com conseqüente aumento de permeabilidade da

membrana mitocondrial e liberação de ativadores das caspases como citocromo c e SMAC.(

111,112)

Outras proteínas regulatórias, pertencentes á família das proteínas inibidoras de

apoptose ( PIA) , foram implicadas neste processo.As PIA incluem ML-IAP, XIAP, cIAP1,

cIAP2 , NIAP,livina, apollon e survivina e possuem a capacidade de bloquear uma etapa

comum da cascata após a liberação do citocromo c mitocondrial pela inibição ou promoção da

degradação das caspases efetoras 3 e 7 e interferindo com a atividade e processamento da

caspase 9.( 4,112)

2.9 Características e Funções da Survivina

O gene, denominado Survivina, implicado no controle da progressão do ciclo celular,

foi identificado a partir de banco de genoma humano por Altieri em 1997.(113)Em contraste

com Bcl-2, Survivina não parece estar envolvido na regulação fisiológica da apoptose de

tecidos epiteliais mas é proeminentemente expresso em várias malignidades.

O gene Survivina humano consiste em 4 exons e 3 introns, está localizado na posição

telomérica do cromossomo 17 banda 25 e sua transcrição está ligada à progressão mitótica e

regulação do “checkpoint” do fuso mitótico.(4,113)

A translação do mRNA survivina origina uma proteína citoplasmática de 142

aminoácidos, com peso molecular de 16,5 kDa e usualmente expressa no desenvolvimento

embriônico mas indetectável em tecidos adultos normais, mesmo em queratinócitos da pele ,

região de altos índices mitóticos.(4,13)Também é fortemente responsável pela modulação da

angiogênese através de vários mecanismos incluindo ativação de VEGF , migração e invasão

celular através da ativação de Rac-1. (114)

Foram descritas 5 isoformas de survivina em humanos:

• survivina “ wild type” : forma mais comum e que apresenta preferencialmente localização

citoplasmática; (114 ,115)

• survivina -2B: gerada pela inserção de um exon alternativo (exon 2B) que apresenta perda da

capacidade antiapoptótica , também com localização citoplasmática;

• survivina-deltaEx3 : originária da remoção do exon 3 resultando em mudança de fase de leitura

preferencialmente localizada no núcleo; (116)

• survivina -3B : produto da introdução de um novo exon (exon 3B) resultando em mudança de fase de

leitura com término prematuro da proteína ;

• survivina 2alfa : contém seqüências codificadoras a partir do exon 1 e 2 e um aminoácido adicional

antes do término.Esta última forma, recentemente descrita, é altamente expressa em tumores e parece

atenuar a atividade anti-apótótica de survivina e sensibilizar células à quimioterapia.(115)

A expressão de survivina está desregulada nas neoplasias por vários mecanismos

moleculares incluindo ganho de função do gene ( p. ex. em neuroblastoma) , metilação de

exon 1 Survivina( produzindo silenciamento no epitélio ovariano normal) , aumento da

atividade proliferativa exclusiva em células tumorais , alteração no fator transcricional NF-

kB anti-apoptótico durante a proliferação celular, aumento da atividade da via PI3K/Akt, e,

perda da função do p53.(4 ,118)

Endoh e cols. , através de RT-PCR, demonstraram que survivina hiper-regula a

atividade da telomerase aumentando a transcrição gênica da transcriptase reversa da

telomerase humana. (117)

O papel da survivina na biologia do câncer excede sua simples função na inibição da

apoptose;a superexpressão de survivina em câncer que está associada à perda de diferenciação

tecidual, pode permitir que células com defeito nos fusos ou centrômeros desalinhados

continuem no ciclo de divisão celular. (119,120)

2.10 Expressão Tecidual de Survivina em Câncer

Em geral, survivina apresenta uma distribuição tecidual diferente das outras PIA e

representa a principal PIA expressa em neoplasias Está presente no timo, placenta,células

tronco CD34 positivas , endométrio proliferativo e células do epitélio cólico basal.(16).

Enquanto a expressão de survivina não ocorre em linhagens teciduais não

proliferativas de qualquer órgão, foi seletivamente expressa em 34-100% de tecidos

neoplásicos( incluindo cânceres de mama, pulmão, câncer colorretal, gástrico, fígado, bexiga,

rim, neuroblastoma, gliomas, sarcomas de partes moles , e neoplasias hematológicas ); altos

níveis de expressão foram considerados preditivos de progressão tumoral em termos de

sobrevida livre de doença e em sobrevida global (24). Foi seletivamente limitada ao núcleo e

citoplasma das células, e nenhuma imunoreatividade foi observada em linfócitos e outras

células do estroma.Os estudos mais recentes que avaliaram a expressão de survivina em

tumores epiteliais estão resumidos na tabela abaixo:

Tabela 3. Expressão de survivina em várias neoplasias

Autor N Neoplasia Método Expressão (Ref.)

Sarela, 2000 144 Cólon RT PCR 63,5% (1)

Sarela , 2002 52 Pâncreas IHQ 88% (12)

Yu, 2002 50 Gástrico RTPCR 68% (121)

Ikehara, 2002 79 Pulmão IHQ 41% (23)

Hofmann, 2002 24 Pulmão RTPCR 100% (24)

Takai, 2002 31 Endométrio IHQ 43,5% (122)

Ito, 2003 129 Tireóide IHQ 84% (119)

Lin, 2003 188 Cólon IHQ 63,2% (8)

Chen, 2004 52 Cólon PCR 67,3% (123)

Meng, 2004 79 Gástrico RTPCR 64% (9)

Knutsen, 2004 98 Reto IHQ 51% (16)

Qiao , 2004 42 Pâncreas IHQ 81,95% (13)

Li, 2004 80 Gástrico IHQ 76% (10)

Kami, 2004 52 Pâncreas IHQ 68% (14)

Oshita, 2004 72 Pulmão IHQ 49% (18)

Lu, 2004 48 Pulmão IHQ 83% (19)

Vischioni, 2004 53 Pulmão IHQ 40% (20)

Ku, 2004 88 Bexiga IHQ 58% (124)

Weikert, 2005 35 Testículo PCR 100% (120)

Monzó, 2005 83 Pulmão RTPCR 85,5% (21)

Ryan, 2006 420 Mama ELISA 90% (125)

Byun, 2007 85 Rim IHQ 79% (126)

RTPCR: reação em cadeia da polimerase em tempo real; PCR: reação em cadeia da polimerase;

IHQ:imunoistoquímica; ELISA: enzyme linked immunosorbent serology assay.

O nível de expressão de survivina parece estar relacionado à faixa etária; foi

demonstrado que em idosos portadores de câncer colorretal (acima de 70 anos) as taxas de

expressão de survivina foram maiores do que indivíduos igualmente portadores de câncer

colorretal abaixo desta faixa etária.(127)

A taxa de expressão de survivina costuma observar um gradiente crescente

conforme a evolução da neoplasia : em amostras de câncer colorretal foi descrita em 0% em

adenomas, 31,7% em displasias de baixo grau, 56,7% em displasias de alto grau e 63,2% em

carcinomas.(17, 18).

Estudos coordenados por Ito e Weickert correlacionaram a expressão de survivina

com grau de diferenciação tumoral e concluíram que níveis elevados de survivina estão

relacionados com maior indiferenciação dos tumores.(119,120)

Apesar de haver resultados contraditórios em considerar a expressão de survivina

como fator prognóstico, diversos estudos identificaram correlação com pior sobrevida livre de

doença, sobrevida global e recorrência local com a expressão de survivina em linhagens

tumorais distintas como câncer de esôfago, estômago ( 9,10,11 ,119) pâncreas( 12,13,14),

reto ( 16 ) , pulmão (18,19,20,21,22,23),bexiga( 124) e endométrio(122).

A expressão de survivina em tumores mesenquimais foi pouco estudada.

Caldas e cols. descreveram a expressão de survivina utilizando análise

imunoistoquímica em 63 pacientes portadores de rabdomiossarcoma com positividade de

80%.(128)

Estudo coordenado por Taubert em 2001, através de PCR em tempo real, identificou

m-RNA de survivina em 94 pacientes com sarcomas de partes moles; utilizando análise de

regressão de Cox, encontrou relação inversa entre o nível de mRNA de survivina e sobrevida

global( p=0,009 , RR =2,7).A expressão de transcritos de survivina foi detectada em 64% dos

pacientes e, neste estudo foi considerado um fator preditor independente de sobrevida.(129)

Em 2003, Kappler avaliou a expressão de survivina através de ELISA e Western blot

em amostras de sarcomas de partes moles.Altos níveis de survivina foram detectados em

extratos de tumores e lisados de células tumorais.Além de haver uma correlação significativa

entre os dois métodos, este estudo revelou altos níveis de survivina nos espécimes tumorais e

sugeriu valor preditivo negativo independente na taxa de sobrevida em pacientes com

sarcomas de partes moles.(130)

Diferentemente destes estudos anteriores, a expressão de survivina nuclear

demonstrada por imunoistoquímica em amostras tumorais de 40 pacientes portadores de

osteossarcoma foi associada à sobrevida prolongada, enquanto que a expressão citoplasmática

não evidenciou correlação com a evolução clínica destes pacientes.(131)

Embora a expressão de survivina tenha sido detectada em várias linhagens tumorais,

até o momento, inexistem dados na literatura em relação à expressão de survivina em

sarcomas intestinais.

Assim, o objetivo primário deste estudo é a verificação da expressão de survivina em

amostras de tecido tumoral de pacientes portadores de GIST submetidos a tratamento

cirúrgico e identificar sua relação com achados clínico-patológicos e sobrevida livre de

doença em 3 anos.

3 HIPÓTESE

A hipótese deste estudo é que a expressão de survivina esteja relacionada com

achados clínicos e patológicos de pacientes com GIST e com a diminuição da taxa de

sobrevida livre de doença em 3 anos.

4 OBJETIVOS

1. Determinar a expressão imunoistoquímica de survivina em amostras de tecidos

obtidas de pacientes portadores de GIST submetidos á cirurgia com intuito curativo.

2. Correlacionar a expressão de survivina com achados clínicos e patológicos de

pacientes com GIST.

3. Avaliar a associação entre expressão de survivina e sobrevida livre de doença em 3

anos de pacientes com GIST.

5 MÉTODOS

5.1 Delineamento, População e Amostra

Foi desenvolvido estudo de observação, descritivo e analítico.Inicialmente, foi

realizado estudo transversal para determinar a prevalência da expressão imunoistoquímica de

survivina nas amostras tumorais.Em um segundo momento, procedeu-se estudo do tipo coorte

histórico com componentes contemporâneos para determinar a ocorrência dos desfechos

clínicos de interesse nos pacientes.

Foram revisados e analisados dados clínicos e anatomopatológicos de pacientes

submetidos a cirurgias efetuadas no período entre janeiro de 1998 e julho de 2006, a partir de

revisão de prontuário.Os dados epidemiológicos foram analisados mediante seguimento dos

pacientes no ambulatório de Oncologia do HSL-PUC, através de revisão de prontuário ou

mediante coleta de dados diretamente do paciente ou familiar.

A variável principal do estudo ( expressão de survivina ) foi analisada através da

expressão imunoistoquímica em blocos de parafina armazenados no Laboratório de Anatomia

Patológica do HSL- PUCRS.

5.2 Critérios de Inclusão

Foram incluídos pacientes maiores de 18 anos de idade com diagnóstico

histopatológico e imunoistoquímico de GIST ( KIT ou PDGF positivos) submetidos á

ressecção cirúrgica com intuito curativo atendidos no período de janeiro de 1998 a julho de

2006 nos serviços de Cirurgia Geral e Cirurgia do Aparelho Digestivo do HSL – PUCRS ou

pacientes encaminhados após a ressecção cirúrgica ao Serviço de Oncologia do HSL –

PUCRS.

5.3 Critérios de Exclusão

Foram excluídos todos os pacientes que apresentavam uma ou mais das condições

abaixo listadas:

• Pacientes submetidos previamente a tratamento radioterápico e/ou quimioterápico;

• Pacientes com registros médicos insuficientes em relação aos dados epidemiológicos;

• Espécimes de anatomia patológica inadequadas para análise patológica e

imunoistoquímica.

5.4 Variáveis em estudo

As variáveis analisadas em relação à expressão de survivina foram:

• Idade ;

• Gênero ;

• Localização do tumor ;

• Tamanho tumoral ;

• Índice mitótico ;

• Tempo para progressão de doença, definido como o tempo decorrido entre o

diagnóstico e o aparecimento de recorrência da doença ;

• Sobrevida livre de doença em 3 anos.

5.5 Imunoistoquímica

Após a ressecção tumoral, a totalidade da peça cirúrgica foi enviada ao Serviço de

Anatomia Patológica a fim de ser avaliada com métodos convencionais utilizando coloração

de hematoxilina e eosina e subseqüentemente a análise imunoistoquímica com os reagentes

comercialmente disponíveis para KIT, CD34,Vimentina ,Desmina, Proteína S-100, Actina,

Enolase neuroespecífica, Panqueratinas, Sinaptofisina, Cromogranina, PDGF e EGFR.

A técnica de imunoistoquímica foi realizada em tecidos fixados em formalina e

incluídos em parafina utilizando o método avidina-biotina peroxidase.Foram realizados cortes

histológicos com 3um de espessura em micrótomo rotativo Leica RT2150 e para montagem

dos espécimes em lâmina foi utilizada a técnica de arranjo em matriz de amostras teciduais(

TMA).Esta técnica permite a elaboração de um bloco de parafina contendo amostras tumorais

obtidas de dezenas de blocos de parafina originais, desta forma simplificando o trabalho e

diminuindo o custo da determinação da expressão do marcador.(132)

Figura 4. Blocos de parafina e TMA

GIST HE GIST HE GIST SURVIVIN GIST KI-67

Figura 5. Lâminas de TMA

As lâminas foram desparafinizadas em estufa histológica (De Leo) por 20 minutos

com temperatura de 69ºC, 2 incubações em xilol por 5 minutos cada, 5 incubações com álcool

etílico 99º por 2 minutos cada , lavagem em água corrente até remoção completa do álcool e

depois mantidas em tampão PBS.

A recuperação antigênica foi realizada utilizando tampão Tris/Edta pH 9.0 para

Survivina e tampão citratro pH 6.0 para Ki 67 por 20 minutos em microondas, a atividade da

peroxidase endógena foi bloqueada com solução de peróxido de hidrogênio a 5% em álcool

metílico com 2 incubações de 15 minutos cada e o bloqueio de ligações inespecíficas foi

realizado com leite em pó desnatado 10% em tampão PBS.

Os anticorpos foram diluídos em 1:100 para anti-survivina ( clone 12C4 do

laboratório Dako ) e 1:250 para anti-Ki 67 ( clone MM1 do laboratório Novocastra) usando

como diluente tampão PBS. As incubações com os anticorpos primários foi realizada em

incubadora BOD a 5ºC durante a noite.

Para detecção da reação antígeno-anticorpo foram utilizados anticorpo secundário

biotinilado e complexo avidina-HRP.

A marcação foi realizada utilizando como cromógeno a diamina benzidina (DAB,

DAKO). Por fim as lâminas foram contra-coradas utilizando hematoxilina de Harris,

desidratadas em uma série de álcool etílico 99º, clarificadas em xilol e montadas com bálsamo

do Canadá.

A imunoexpressão de survivina foi avaliada em, no mínimo, 5 campos de grande

aumento e foi considerada positiva quando a reatividade citoplasmática e/ou de membrana

com o anticorpo ocorria em 10% ou mais das células tumorais examinadas.Adicionalmente

foi utilizado escore de intensidade das células coradas, variando de 0 a +++; sendo que 0=

reatividade nula, + = reatividade fraca , ++ = reatividade moderada, e +++ reatividade forte.O

controle positivo utilizado foi tecido placentário e controle negativo tecido epitelial

circunjacente não neoplásico.

A análise do Ki 67 foi realizada segundo sistema de observação em 5 campos de

grande aumento e se levou em consideração a proporção de células tumorais coradas

verificadas em cinco campos de grande aumento.O escore de proporção variou de zero a três (

0 = sem mitoses ou não avaliável , 1= 0-5 mitoses , 2 = mais do que 5 e menos do que 10

mitoses e 3 = acima de 10 mitoses por campo ).

A leitura e interpretação de todas colorações realizadas para análise do índice

mitótico através do marcador de proliferação celular Ki 67 e de survivina foi realizada em

observação simultânea e sob supervisão direta do patologista co-orientador.

5.6 Análise Estatística

A análise estatística dos dados foi descrita segundo as suas distribuições em

freqüências e proporções para as variáveis categóricas e em medidas de tendência central e

dispersão para as variáveis contínuas.Inicialmente foi determinada a prevalência da expressão

de survivina na população estudada.A correlação entre a expressão de survivina e os achados

clínico-patológicos foram estatisticamente analisados usando teste do qui-quadrado( x2).

A análise de sobrevida livre de recorrência foi calculada utilizando método de

Kaplan –Meier.

Em todos os casos os testes foram bicaudais e os valores de p de < 0,05 foram

considerados significativos.

Todas as análises estatísticas foram realizadas pelos programas Epiinfo e SPSS

versão 12.0 para Windows.

6 RESULTADOS

6.1 Caracterização da Amostra

No período de janeiro de 1998 a julho de 2006, 45 pacientes com diagnóstico de

GIST foram submetidos à ressecção cirúrgica com intuito curativo pelas equipes de Cirurgia

ou encaminhados ao Serviço de Oncologia do HSL –PUCRS.

Na primeira revisão 2 pacientes ( 4%) foram excluídos ; devido à impossibilidade

de análise do material anátomo-patológico ou ausência de dados do seguimento clínico.

Dos 43 pacientes incluídos, 7 (16 %) apresentavam doença avançada ao diagnóstico

trans-operatório (doença parcialmente ressecada ou com evidência de metástases hepáticas ou

peritoniais).

Quinze ( 34,8%) pacientes eram homens e 28 ( 65%) mulheres.

A idade ao diagnóstico variou de 22 a 83 anos ( mediana de 62 anos) , sendo que 24

( 55,8% ) eram maiores de 60 anos.

Oitenta e cinco por cento dos pacientes eram sintomáticos; o sintoma mais

comumente apresentado foi dor abdominal.

A localização predominante dos GIST ocorreu no estômago (51%), seguida de

tumores em intestino delgado (34,9 %), 4,7% em cólon, e 7 % em mesentério.

O tamanho mediano dos tumores foi de 7,4 cm, variando de 0,4 a 30 cm.Somente em

um paciente não foi possível mensurar o tamanho da lesão, devido ao paciente ter se negado

a tratamento cirúrgico.

Dos 43 tumores, 18 % foram maiores que 2 cm e menores que 5 cm , 32 % foram

maiores que 5 cm e menores que 10 cm ,e 40 % foram maiores que 10 cm.Os tumores

maiores que 10 cm foram encontrados com freqüências semelhantes no estômago( 16%) e

intestino delgado ( 13%).Todos os tumores menores que 2 cm ( 7%) foram achados

incidentalmente durante o transoperatório.

A forma de apresentação macroscópica mais encontrada foi a nodular representando

88 % do total.

Os subtipos histológicos observados foram: 14 tumores fusiformes (32,5%)18

epitelióides( 41,8%) e 11( 25,5%) apresentando ambos os subtipos anteriores( mistos).

Quanto ao índice mitótico 55% das neoplasias foram avaliadas no laudo anátomo-

patológico inicial : 8 foram de alto grau e 13 de baixo grau.

Em 11 pacientes, submetidos à gastrectomia, foi realizada linfadenectomia no trans-

operatório; a média de linfonodos retirados foi de 13 por paciente.Não houve envolvimento

destes por metástases de GIST, entretanto, dois pacientes portadores de câncer gástrico

sincrônicos apresentavam comprometimento linfonodal por células do tipo adenocarcinoma.

As margens cirúrgicas microscópicas estavam comprometidas em 5 espécimes,

indeterminadas em 2 e não foram avaliáveis em 2 espécimes; no restante das amostras as

margens foram livres.

As principais características clínicas e patológicas dos pacientes estudados estão

demonstradas na Tabela 4:

Tabela 4. Características clínico-patológicas da população estudada ( n=43)

Caso Idade Gênero

Topografia Tamanho(cm) Margens Prof.Inv. Macro Status Subtipo

1 83 M DELG 11,5 livres submuc nodular Primário F

2 57 F EST 2 comprom submuc nodular Primário F

3 73 F DELG 16 comprom submuc nodular Avançado F

4 72 F EST 10,7 livres serosa nodular Primário F

5 69 F EST 0,7 livres musc e sub

nodular Primário M

6 75 M CECO 9 livres serosa nodular Avançado E

7 60 F EST 10,6 livres serosa polipoide Primário F

8 69 M EST 20 livres serosa nodular Primário F

9 69 F DELG 6,2 livres serosa nodular Primário F

10 44 F EST 30 comprom serosa nodular Avançado E

11 26 M EST 3,6 livres serosa polipoide Multicêntrico F

12 62 M EST 3,5 livres NA nodular Primário E

13 69 F DELG 5 livres serosa nodular Primário E

14 56 F EST 2,5 livres serosa nodular Primário E

15 67 F EST 4,1 livres serosa nodular Primário M

16 67 F DELG 23,7 livres fígado nodular Primário E

17 52 F DELG 7,2 indeterm serosa nodular Primário E

18 79 F EST 10,8 livres serosa nodular Primário M

19 75 F EST 5 livres submuc nodular Primário E

20 80 F CECO 7,5 livres serosa nodular Primário E

21 61 M EST 24 comprom serosa nodular Avançado F

22 43 F RETRO 17 livres serosa nodular Primário F

23 46 F DELG 16,4 livres serosa nodular Primário E

24 62 M EST 1,1 livres serosa nodular Primário E

25 48 M DELG 3 livres serosa ulcerada Primário E

26 53 M EST 2,5 livres serosa ulcerada Primário F

27 31 F EST 6,5 livres musc e sub

nodular Primário E

28 81 F DELG 5,5 comprom serosa nodular Avançado E

29 47 M RETRO 28 livres serosa nodular Primário M

30 63 F DELG 5,2 livres serosa nodular Primário M

31 42 F ABD 17,8 comprom serosa nodular Primário M

32 78 F EST 8,3 livres serosa nodular Primário M

33 36 F DELG 5 livres submuc nodular Primário F

34 44 F EST 6,3 livres serosa nodular Primário E

35 56 F DELG 9,2 livres indeterm exofítica Primário E

36 62 M EST 4,2 livres serosa nodular Primário M

37 63 F EST 5 livres indeterm nodular Primário F

38 42 M DELG 13 livres serosa nodular Avançado M

39 83 M EST 13,9 livres serosa nodular Primário M

40 51 M EST 0,4 NA NA NA Primário F

41 79 F DELG 7,6 Livres serosa nodular Primário E

42 55 M EST 1,9 Livres serosa nodular Avançado E

43 22 F DELG 10,6 Livres serosa nodular Primário M

M= masculino ; F= feminino ; EST= estômago ; DELG= intestino delgado ; CECO= ceco;

RETRO=retroperitônio ;Prof. Inv.= profundidade de invasão; submuc= submucosa; musc= muscular ; F= fusiforme;

E = epitelióide ; M= misto.

Sete pacientes apresentavam tumores sincrônicos com o diagnóstico de GIST(

16%).Cinco tumores foram descobertos incidentalmente durante laparotomia realizada para

tratamento de outras neoplasias gastrointestinais.O diagnóstico de GIST em dois pacientes foi

realizado no momento do estadiamento sistêmico de câncer de mama e linfoma não

Hodgkin.O tamanho médio dos GIST encontrados foi de 3,5 cm e apresentaram distribuição

semelhante entre estômago e intestino delgado.

As características clínicas e patológicas dos pacientes que apresentaram neoplasias

sincrônicas estão na tabela abaixo:

Tabela 5. Características clínico-patológicas dos tumores sincrônicos

GIST Tumores sincrônicos

Idade Gênero Localização Tamanho

(cm)

Tipo Localização Tamanho

(cm)

1. 36 F Intestino

delgado

5,0 Adenocarcinoma

(T3N0M0)

Cólon 5,5

2. 52 M Gástrico 1,1 Adeno carcinoma

(T3N1M0)

Gástrico 10,2

3. 65 F Gástrico 0,7 Adenocarcinoma

(T3N1M0)

Gástrico 4,8

4. 65 F Gástrico 1,0 Ca epidermóide

(T3 N1M0)

Esôfago 5,0

5. 69 F Intestino

delgado

5,0 Adenocarcinoma

(T3N0M0)

Cólon 5,8

6. 79 F Intestino

delgado

7,6 Carcinoma ductal invasor

(T3N1M0)

Mama 6,2

7. 62 M Gástrico 4,2 Linfoma Não Hodgkin

tipo manto (IV)

- -

6.2 Análise Imunoistoquímica

A reatividade para KIT ocorreu em 93 % tumores e para CD34 em 55 %. Cinqüenta

e um por cento evidenciaram expressão para Vimentina, 23 % para Desmina, 37 % para

Proteína S-100, 48 % para Actina e 14 % para Enolase neuroespecífica.

Somente 11 % apresentaram imunoreatividade para Panqueratinas, 11 % para

Sinaptofisina, 25% para Cromogranina, 20% para EGFR e 9 % foram PDGF

imunoreagentes.Dos 4 pacientes que apresentaram expressão para PDGF 3 eram KIT

negativos.

O resumo dos achados imunoistoquímicos está descrito na tabela abaixo:

Tabela 6. Expressão de marcadores imunoistoquímicos

Expressão de marcadores imunoistoquímicos

POS

NEG

NÃO AVALIADOS

Total Percentual

KIT (43) 40 93%

3 7%

SMA ( 26) 21 48%

5 11%

39 17%

DESM (34) 10 23%

24 55%

9 20%

S100 ( 35) 16 37%

19 44%

8 18,60%

NSE(9) 3 6,5%

6 13%

34 79%

CD34 ( 34) 24 55%

10 23%

9 20%

CK (22) 5 11%

17 40%

21 48,80%

VIM( 23) 22 51,20%

1 2,30%

20 46,50%

PDGF(4) 4 9,30%

39 90,70%

SYN( 14) 5 11%

9 20,90%

29 67,40%

CROMO(14) 11 25,60%

3 7%

29 67,40%

EGFR(12) 9 20%

3 7%

31 72%

POS: positivo ; NEG: negativo; SMA: actina ; DESM : desmina; S-100: proteína S-100; NSE: enolase neuro-

específica; CK: citoqueratinas; VIM:vimentina ; PDGF: fator de crescimento derivado de plaquetas; SYN:

sinaptofisina; CROMO: cromogranina; EGFR: fator de crescimento epitelial

6.3 Expressão de Survivina

Foi identificada expressão para a survivina em 72% dos tumores, nos quais a maioria

das células tumorais observadas apresentavam imunoreatividade.A expressão foi detectada

predominantemente no citoplasma (41,9%) e membrana celular ( 35,5%) e em concomitância

nestas duas localizações em 22,6% das células tumorais, não sendo evidenciada nenhuma

positividade nuclear.

Em adição, entre as espécimes positivas, 20, 9% apresentavam baixa reatividade ao

anticorpo, 23,3% apresentavam reatividade moderada e 27,9% demonstravam forte

imunoreatividade ao anticorpo.

Ocorreu imunoexpressão em 64,7% dos homens e 86,7% das mulheres.

Nos pacientes com idade acima de 60 anos foi observada expressão em 83,3% e em

57,9% nos pacientes com 60 anos ou menos.

Não houve diferença na proporção de expressão quanto ao sítio primário do tumor ou

relacionada ao subtipo histológico.

Houve imunoreatividade em 84,6% nos tumores menores que 7,5 cm e 55 % nos

tumores acima de 7,5 cm.

Figura 4. Expressão imunoistoquímica de Survivina

6.4 Expressão de Ki 67

O índice mitótico, avaliado através da expressão de Ki 67, foi classificado como alto

em 60 % , intermediário em 16 % e baixo em 21 % das amostras, somente em 2 amostras não

foi possível analisar a proliferação celular por este método.

Dentre os pacientes com altos índices proliferativos, 52% demonstraram acima de 20

mitoses por campo de grande aumento.

Houve equivalência na expressão de survivina em todas as categorias de índice

mitótico (70% de postitividade ) com exceção da classificação de baixa proliferação, onde

100% dos pacientes foram survivina negativos.

Figura 5. Expressão imunoistoquímica de Ki 67

Na tabela abaixo há a descrição de todos achados imunoistoquímicos da população

estudada.

Tabela 7. Achados imunoistoquímicos da população estudada

CASO

CKIT

SMA

DESM S 100 NSE

CD34 AE1/A3

VIM PDGF

SYN

CROMO

EGFR

Ki 67 SURV

1 POS

10-15 POS +++

2 POS POS

NEG NEG POS

POS 5-10 NEG

3 POS POS

POS POS POS POS POS POS POS POS POS > 20 POS +++

4 POS

NA POS +

5 POS POS

POS POS POS POS 10-15 POS++

6 POS

NEG POS NEG >20 POS+

7 POS POS

NEG NEG NEG NEG POS POS POS 10-15 NEG

8 POS

NEG NEG POS NEG 10-15 NEG

9 POS NEG

NEG NEG POS NEG POS NEG

NEG POS > 20 POS ++

10 POS

NEG NEG POS POS > 20 NEG

11 POS POS

POS POS POS POS POS POS POS POS 5-10 POS++

12 POS

NEG NEG POS NEG POS 15-20 POS +++

13 POS POS

NEG POS NEG NEG POS NEG

POS POS > 20 POS+++

14 POS NEG

NEG NEG NEG POS NEG

NEG 10-15 POS+

15 POS

0-5 POS+

16 POS POS

NEG NEG NEG NEG POS NEG

POS POS > 20 NEG

17 POS POS

POS POS

POS NEG POS POS NEG 10-15 POS+++

18 POS

NEG NEG POS 0-5 POS++

19 POS

10-15 POS+++

20 POS

NEG NEG POS

POS NEG 5 -10 POS+

21 POS NEG

NEG POS POS NEG POS NEG

POS POS > 20 POS++

22 NEG

POS 5 NEG

23 POS POS

NEG POS POS NEG POS NEG

POS POS 5 NEG

24 POS POS

POS POS POS NEG POS POS 4 POS+++

25 POS POS

NEG POS NEG

POS NEG POS 0-5 POS +

26 POS NEG

NEG NEG POS

POS NEG 15-20 POS++

27 POS POS

POS POS NEG NEG POS POS 5 POS+++

28 POS POS

POS POS POS POS POS POS POS > 20 POS+++

29 POS POS

NEG POS POS NEG

>20 POS+++

30 POS POS

POS POS NEG POS POS NEG

POS > 20 POS++

31 POS NEG

NEG POS POS

NEG POS >20 NEG

32 POS POS

NEG POS POS POS 15-20 POS+

33 NEG

POS 15-20 NEG

34 POS

NEG NEG NEG POS NEG

NEG 10-15 POS+++

35 POS

NEG NEG NEG NEG POS 5-10 NEG

36 POS NEG

NEG NEG POS

POS POS 5 -10 POS++

37 POS POS

NEG NEG NEG

POS >20 POS+

38 NEG

POS

POS NEG NEG NEG NEG POS > 20 POS++

39 POS

POS POS POS 5-10 POS+

40 POS POS

NEG NEG NEG

POS 10/15 NEG

41 POS

NEG NEG POS NEG NA POS+

42 POS POS

POS POS POS

POS 10/15 POS+++

43 POS POS

NEG NEG POS 5 NEG

6.5 Expressão de survivina e achados clínicos-patológicos

A expressão de survivina não foi relacionada significativamente com gênero,

topografia da lesão, subtipo histológico, localização celular ou índice mitótico.

Houve indicação de associação entre a expressão de survivina e idade, porém em

virtude do pequeno tamanho de amostra esta associação não atingiu significância

estatística.Em relação ao tamanho tumoral a associação atingiu nível de significância.

Os resultados das associações estão expostos a seguir:

Tabela 8. Expressão de survivina e características clínico-patológicas

Variável Categoria Total (%) Survivina p

NEG POS

Idade

< 60 19(44,2%) 42,1% 57,9% 0,06

>60 24 (55,8%) 16,7% 83,3%

Gênero

M 15 (34,9%) 13,3% 86,7% 0,11

F 28 (65,1%) 35,7% 64,3%

Localização

Gástrico 22 (51%) 27,3% 72,7% 0,86

Delgado 15(34,9%) 33,3% 66,7%

Retroperitônio 3 (7%) 33,3% 66,7%

Cólon 2 ( 4,7% ) 0 100%

Tamanho

< 2 5(11,9%) 40% 60% 0,02

2,1 -5 10 (23,8%) 10% 90%

5,1 -10 11 (26%) 9,1 % 90%

> 10 16 (38%) 50% 50%

Índice mitótico

0-5 9 (20%) 33,3% 66,7% 0,38

6-10 7 (16%) 29,6% 71,4%

> 11 26 (60%) 23,1% 76,9%

Nos sete pacientes que apresentavam doença avançada ao diagnóstico a expressão de

survivina não foi significativamente diferente dos pacientes com doença localizada.A maior

parte dos pacientes (70%) com doença avançada apresentava forte imunoreatividade ao

anticorpo e alto índice proliferativo (maior que 20 mitoses por campo).

No grupo de pacientes com GIST sincrônicos a outras neoplasias a expressão de

survivina foi observada em 72% dos espécimes, a maioria também apresentando alta

reatividade porém predominância de com índices mitóticos intermediários.

Não houve correlação significativa entre a taxa de proliferação celular e os achados

clínicos e patológicos estudados.( p=0,22).

6.6 Expressão de survivina e sobrevida livre de doença em 3 anos

O tempo de acompanhamento ambulatorial dos 43 pacientes estudados variou de 5 a

111 meses.

A sobrevida global do total de pacientes estudados (incluindo pacientes com doença

metastática e segundos tumores primários) foi de 27 meses, não tendo sido demonstrada

diferença significativa entre os pacientes que apresentavam ou não a expressão de survivina,

conforme a figura abaixo:

0 20 40 60 80 100 120

Sobrevida

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Cum Survival

survivina

categorizado

negativo

positivo

negativo-

censored

positivo-

censored

Survival Functions

Figura 6. Expressão de Survivina e sobrevida

Excluindo-se da análise possíveis fatores de confusão ( presença de segundo tumores

primários , doença avançada ao diagnóstico e pacientes falecidos por outra causa) a sobrevida

mediana foi de 29 meses.Neste subgrupo, não foi demonstrada diferença estatisticamente

significativa em relação à expressão de survivina, conforme ilustra a figura abaixo:

p=0,74

0 20 40 60 80 100 120

Sobrevida

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Cum Survival

survivina

categorizado

negativo

positivo

negativo-

censored

positivo-

censored

Survival Functions

Figura 7. Expressão de survivina e sobrevida em doença localizada

Quando foi realizada análise de subgrupos, os pacientes portadores de doença

metastática tiveram sobrevida mediana de 16 meses, significativamente menor em relação aos

com doença localizada.

Os pacientes com segundo tumores primários apresentaram sobrevida mediana de 27

meses.Dentre este grupo de pacientes com tumores sincrônicos, quatro não apresentavam

sinais de progressão da doença epitelial ou mesenquimal, um apresentava recidiva do GIST e

dois haviam falecido devido á progressão da neoplasia não GIST ( linfoma não Hodgkin e

carcinoma epidermóide de esôfago).

O tempo mediano para recorrência para os pacientes com doença localizada foi de 11

meses, variando de 3 a 77 meses.

Os pacientes com imunoexpressão de survivina apresentaram sobrevida mediana

livre de progressão em 3 anos de 25 meses comparada a 36 meses nos pacientes com ausência

da expressão do marcador.Este dado representou um acréscimo de 30% na sobrevida livre de

doença, porém não atingiu significância estatística ( p= 0,08).

p=0,64

As curvas de tempo para progressão e chance de recorrência em relação á expressão

de survivina estão demonstradas a seguir :

0 20 40 60 80

TTP

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Cum Survival

survivina

categorizado

negativo

positivo

Survival Functions

Figura 8. Expressão de survivina e sobrevida livre de progressão

0 10 20 30 40 50 60 70

TTP

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Cum Hazard

survivina

categorizado

negativo

positivo

Hazard Function

Figura 9. Expressão de survivina e chance de recidiva

p=0,08

Em relação ao índice mitótico, categorizado em grupos de alta, intermediária e baixa

proliferação celular, não foi encontrada diferença significativa na sobrevida mediana livre de

progressão em 3 anos; o grupo com alta taxa apresentou sobrevida mediana livre de

progressão em 3 anos de 27 meses comparada a 30 meses nos pacientes com baixa e

intemediária taxa de proliferação.

Houve uma tendência maior chance de recorrência nos pacientes com altas taxas de

proliferação quando comparados aos de proliferação baixa e intermediária, entretanto a

diferença entre estes dois grupos não atingiu significância estatística( p= 0,21).

Nos pacientes do grupo com alta taxa de proliferação celular o tempo mediano para

progressão foi de 3 meses ,diferentemente do grupo de baixa taxa de proliferação que foi de

14 meses.

As curvas de sobrevida, tempo para progressão e chance de recorrência estão

demonstradas abaixo :

0 20 40 60 80 100 120

Sobrevida

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Cum Survival

Ki67 Categorizado

alta

proliferação

baixa

proliferação

alta

proliferação-

censored

baixa

proliferação-

censored

Survival Functions

Figura 10. Expressão de KI67 e sobrevida

p=0,72

0 20 40 60 80

TTP

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Cum Survival

KI67 modificado

alta

proliferação

baixa

proliferação

intermediária

Survival Functions

Figura 11. Expressão de Ki67 e sobrevida livre de progressão

0 5 10 15 20 25 30

TTP

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Cum Hazard

KI67 modificado

alta

proliferação

baixa

proliferação

intermediária

Hazard Function

Figura 12. Expressão de Ki 67 e chance de recidiva

p=0,72

Ao final do estudo, em junho de 2007, havia 20 pacientes sem evidência de

progressão de doença, 3 haviam falecido pela neoplasia, 5 haviam falecido por causa não

neoplásica, e 15 estavam vivos com doença.

Dos 15 pacientes que apresentaram recidiva, 5 foram negativos para expressão de

survivina e 10 foram positivos.O tempo para recorrência entre os pacientes que não

demonstravam a expressão foi de 25 meses, enquanto que para os que apresentavam a

expressão de survivina foi de 11 meses.

Todos os pacientes que apresentaram recidiva ou com apresentação metastática ao

diagnóstico foram submetidos a tratamento com imatinib na dose de 400 mg diários, tendo

apresentado boa tolerância ao tratamento e perfil de toxicidade aceitável.Nenhum paciente

apresentou toxicidade que requeresse suspensão do imatinib.

A resposta ao tratamento medicamentoso foi avaliada através de revisão ambulatorial

mensal com anamnese, exame físico e utilizando-se tomografia computadorizada contrastada

de abdômen a cada 4 meses de tratamento.

No momento da análise, em junho de 2007, dos pacientes que estavam em uso de

imatinib ( incluindo os com doença avançada ao diagnóstico e os com recidiva da doença) 12

ainda estavam vivos, 3 apresentavam resposta radiológica completa, 3 resposta parcial , 4

com doença estável e 2 apresentavam progressão de doença.Dos pacientes que já se

apresentaram doença avançada ao diagnóstico, somente um havia falecido devido a

progressão da neoplasia, os demais apresentavam sobrevida mediana de 26 meses.

7. DISCUSSÃO

Os GIST, embora raros, constituem um importante grupo de tumores

gastrointestinais.Por muitos anos foram inadequadamente classificados como leiomiomas,

leiomioblastomas e leiomiossarcomas, baseando-se somente em achados histopatológicos.

A análise imunoistoquímica em conjunto com a microscopia eletrônica no início dos

anos 70 subseqüentemente evidenciou achados miogênicos ou neurais que identificaram os

GIST como uma entidade patológica distinta.(71).

Entretanto, os GIST não apresentam uniformidade no seu comportamento biológico;

este depende fundamentalmente de parâmetros clínico-patológicos clássicos (topografia

anatômica, tamanho tumoral e atividade mitótica) e características moleculares (tipo de

mutação do receptor de TK, alterações cromossômicas, expressão de proteínas do ciclo

celular, ativação e controle de vias de sinalização intracelulares, amplificação ou perda de

genes) (53)

Além disto, foi encontrada relação entre algumas características patológicas e

alterações moleculares( por ex.: GIST de intestino delgado são associados com morfologia

epitelióide e mutação no exon 9 do KIT).Este achado reforça a necessidade da combinação de

critérios patológicos a achados moleculares visando otimizar o entendimento de sua história

natural e identificação de fatores prognósticos.

Anormalidades na expressão gênica são a base de muitos processos fisiológicos e

patológicos, tais como diferenciação celular, transformação maligna e controle da morte

celular programada(21).A apoptose exerce um papel importante na gênese tumoral de

neoplasias epiteliais, contudo, até o momento foi pouco estudada nos sarcomas intestinais.

Survivina pertence à família das proteínas inibidoras da apoptose e está envolvida

neste processo através da inibição da atividade das caspases e indução da mitose.É

proeminentemente expressa durante a embriogênese e em linhagens de células com altas taxas

de proliferação, indetectável na maioria dos tecidos diferenciados e abundantemente re-

expressa em várias malignidades.

Na maioria das neoplasias investigadas para a expressão de survivina ( incluindo

câncer de mama, pulmão, gástrico, bexiga, pâncreas, sarcomas de partes moles) a alta

expressão desta proteína foi preditiva de progressão tumoral, em termos de sobrevida livre de

doença e sobrevida global, identificando informações prognósticas relevantes (3).

No presente estudo a prevalência da expressão de survivina foi analisada pela

primeira vez em GIST, mediante técnica de imunoistoquímica, e foi correlacionada com

evolução clínica.Adicionalmente foi feita descrição do perfil clínico e epidemiológico dos

pacientes portadores de GIST diagnosticados ou referenciados a hospital terciário.

A mediana de idade dos pacientes no presente estudo, 62 anos, foi similar ao relatado

na literatura (55-65 anos).Os GIST são raros em crianças e adultos jovens com apenas 60

casos relatados na literatura.Neste estudo, não se observou GIST antes dos 18 anos de idade,

nenhum dos pacientes tinha história familiar de GIST ou de outra neoplasia e nenhum

apresentava tríade de Carney’s.

Ocorreu predominância do gênero feminino (65%), discordante com outros centros,

pois a literatura relata equilíbrio entre os gêneros, às vezes com predominância masculina.

Os GIST podem se originar em qualquer topografia do TGI ; do esôfago ao reto.Na

presente análise, GIST foram mais usualmente encontrados no estômago, seguido de intestino

delgado e com freqüência semelhante no intestino grosso e retroperitônio; estes achados

foram similares ao relatados na literatura.

Os GIST geralmente são diagnosticados como tumores circunscritos, encapsulados,

de aparência nodular, podendo atingir grandes volumes.A multiplicidade é um achado pouco

usual.Nesta análise, o tamanho tumoral mediano foi de 7,4cm, alcançando até 30 cm e não foi

observado nenhum tumor multicêntrico.

A média de ocorrência de tumores sincrônicos com GIST é descrita em torno de 13%

na literatura.(45)No presente estudo a prevalência encontrada de segundos tumores primários

foi 16%.Os tumores mais freqüentemente identificados, em concordância com estudos

precedentes, foram adenocarcinomas do TGI; dois pacientes apresentaram linfoma não

Hodgkin e câncer de mama.

A maior parte dos pacientes com tumores sincrônicos era assintomática em relação

ao GIST, os quais foram descobertos incidentalmente durante procedimentos cirúrgicos

destinados ao tratamento de outras neoplasias.A sobrevida mediana deste grupo não foi

diferente do restante da amostra, sendo que dois pacientes evoluíram ao óbito em função das

outras neoplasias diagnosticadas em estágio avançado e reconhecidamente com pior

prognóstico ( carcinoma epidermóide de esôfago em estágio clínico III e linfoma não Hodgkin

em estágio clínico IV).

A grande maioria dos GIST é associada com mutações do KIT; vários estudos

identificaram a presença destas mutações em outras neoplasias, incluindo tumores

germinativos, carcinoma de pequenas células de pulmão, melanoma, câncer de mama, cólon e

ovário.Entretanto na maioria destes tumores o papel do KIT mutado não foi completamente

esclarecido, embora tenha sido relatado que atividade TK induziria proliferação celular e

transformação maligna em carcinoma de pequenas células de pulmão, câncer de mama e

ovário.(133)

Dois pacientes apresentaram tumores de cólon concomitantes com GIST; e embora

as principais vias envolvidas na carcinogênese do câncer colorretal não tenham sido

identificadas em associação com o desenvolvimento dos GIST, vários estudos demonstraram

a expressão de KIT em tumores de cólon.Por exemplo, Sanmarco e cols. relataram

expressão de KIT em acima de 30% em espécimes de câncer colorretal .( 133)

Ainda que a ocorrência sincrônica de GIST e outra neoplasia abdominal possa ser

apenas um fenômeno coincidente, o desenvolvimento destes tumores pode envolver agentes

carcinogênicos comuns.Estudo coordenado por Cohen demonstrou que a exposição

simultânea de nitrosoguanidina e ácido acetilsalissílico causa o desenvolvimento sincrônico

de câncer gástrico e leiomiossarcoma.(134)

Os subtipos histológicos fusiforme, epitelióide e misto foram encontrados em

proporções semelhantes, em discordância da literatura, onde 70% dos GIST apresentam

características fusiformes. A maior identificação de tumores epitelióides e mistos poderia ser

explicada por um viés proveniente do pequeno número de casos recrutados neste estudo.

Todavia, é necessário que este dado seja verificado mais detalhadamente na seqüência de

casos que se apresentarem futuramente no nosso registro de GIST. A predominância

inesperada de um determinado tipo histológico poderia sinalizar a presença de um “cluster”

hereditário ou de uma maior prevalência de variante genética rara ( p. ex. maior freqüência de

alelos ou polimorfismos nesta população). É possível também que a exposição a agente

carcinogênico incomum possa predispor a um tipo específico de variante histológica de GIST.

Qualquer uma destas hipóteses, se confirmadas, seria de extrema utilidade na investigação da

etiologia e dos eventos iniciais na carcinogênese de GIST.

As características imunoistoquímicas de Ki 67 e survivina foram analisadas

utilizando-se técnica de micro-arranjo tecidual.

O arranjo em matriz de amostras teciduais ou TMA( tissue microarray) é uma técnica

descrita em 1998 e consiste na elaboração de um bloco de parafina contendo fragmentos de

amostras teciduais obtidas de dezenas ou centenas de blocos de parafina convencionais,

seguindo uma ordem pré-determinada. No nosso estudo, optamos pela técnica de TMA,

sempre que possível, baseando-se na praticidade de se avaliar um grande número de amostras

simultaneamente, na redução de custos e na diminuição da variabilidade inter-espécimes e

inter-observador.(132)

As demais análises de imunoexpressão foram realizadas utilizando-se metodologias

convencionais de imunoistoquímica. Em função do nosso estudo se tratar de uma avaliação

restrospectiva, a análise com marcadores convencionais já havia sido realizada com intuito

diagnóstico; os marcadores adicionais ( p. ex. EGFR) foram acrescentados em um painel

imunoistoquímico de investigação de um grupo de estudos de GIST do HSL-PUCRS.

Preferencialmente, a análise de todos marcadores deveria ter sido feita seguindo a mesma

sistemática de análise imunoistoquímica, de maneira prospectiva, e por observadores

independentes na tentativa de se minimizar possíveis fatores de confusão.

Os achados imunoistoquímicos referentes à expressão de CD34, SMA, e CK foram

semelhantes aos habitualmente descritos em GIST, entretanto houve expressão aumentada de

Desmina e S-100. Estas características podem ser explicadas, em parte, pela metodologia da

técnica de imunoistoquímica utilizada( p.ex. diferenças na fixação do material ou reagentes)

ou pela interpretação das lâminas.

Em relação à expressão de CD 34 é importante salientar que, ao se realizar análise

deste subgrupo, foi constatada concomitância da expressão de survivina em relação a este

marcador, ou seja, todos os pacientes survivina-positivos também apresentavam

imunoreatividade para CD 34.Uma das possíveis razões para este achado está baseado no fato

que o efeito anti-apoptótico da survivina pode não estar apenas confinado ás células tumorais,

mas pode igualmente estar manifesto em células endoteliais, potencialmente induzindo

neoformação vascular.(125) No intuito de se estabelecer uma relação mais consistente entre

estas variáveis, estudos futuros avaliando o papel da angiogênese e expressão de survivina

serão desenvolvidos nesta amostra.

Altos índices mitóticos avaliados pela expressão de Ki 67 ( acima de 10 mitoses por

CGA) foram os mais habitualmente observados nesta amostra ; identificando maior

agressividade biológica tumoral e alta probabilidade de recidiva.Este achado pode refletir a

presença tumores volumosos; no entanto, como os dados foram coletados em hospital

terciário pode haver um vício de seleção de amostra, com análise de casos mais complexos.

No atual estudo, a prevalência da expressão de survivina foi observada em 72 % dos

espécimes tumorais. A alta freqüência desta expressão é semelhante à encontrada em estudos

anteriores em tumores epiteliais e mesenquimais.(

1,8,13,14,18,19,20,21,23,24,120,121,122,123,124,125,126).

A freqüência extremamente elevada de expressão de survivina não é surpreendente,

visto que, em outros tumores humanos, survivina está habitualmente expressa. É intrigante,

todavia, que um em cada quatro pacientes com GIST não expressa survivina. Estes pacientes

não apresentaram tumores com diferenças clínicas ou biológicas em relação aos que

expressavam survivina. As razões para que certos GIST possam prescindir da hiperexpressão

de survivina pode ter várias explicações, tais como, a ativação de subtipos de survivina (por

transcrição anômala, por mutações, etc.) que não são detectados pelos anticorpos utilizados,

por ativação de intermediários a montante da via da survivina, ou ainda pela utilização de vias

completamente distintas de sobrevivência celular, independentes de survivina.

Houve predominância da expressão no citoplasma e membrana celular,e nenhuma

imunoreatividade nuclear foi observada , em concordância com análises imunoistoquímicas

precedentes.Não houve expressão em células do epitélio normal adjacente.

Survivina é normalmente expressa no núcleo, em células embriônicas ou

pluripotentes normais.A expressão em topografia anômala, como vista no nosso estudo,

poderia ser explicada por alterações na estrutura da proteína, seja por mutação, seja por

alteração pós-tradução, que extravasaria o compartimento nuclear, indo-se alojar em outros

sítios, aos moldes do que ocorre com a proteína p53.Outra possibilidade seria a de que

inibidores naturais de survivina localizados no citoplasma estivessem desativados.De fato,

alterações em sistemas de ubiquinização são comuns em câncer e podem explicar a presença

aberrante de diversas proteínas.

Uma observação muito controversa, é a de que a localização subcelular de survivina

é dependente da linhagem tecidual podendo ter correlação com o prognóstico; enquanto a

localização citoplasmática, responsável pela inativação direta das enzimas efetoras da

apoptose estaria associada com piora do prognóstico em algumas neoplasias, ( p. ex. em

tumores gástricos, mama ,pulmão,cólon ) a expressão da survivina no núcleo, com prováveis

diferentes funções proteicas, pareceria afetar positivamente o prognóstico nestas mesmas

neoplasias.(3) Na medida em que nenhum caso do nosso estudo produziu reação positiva

nuclear, acreditamos que, pelo menos em GIST, a localização subcelular é tecido-dependente

e parece ser importante para a biologia do tumor, visto ser um fenômeno observado na vasta

maioria dos casos.

Houve uma tendência em favor de a expressão ser mais observada em pacientes

idosos (acima de 60 anos). Estes achados provavelmente não atingiram nível de significância

devido ao pequeno número da amostra, entretanto são semelhantes aos relatados por Endo e

cols. em que a expressividade survivina foi consistentemente aumentada em pacientes

portadores de câncer colorretal acima de 70 anos.(127)Este resultado poderia estar

relacionado ao fato de que indivíduos mais idosos pudessem apresentar maior chance de

mutações que regulam a expressão de survivina resultando em inibição da apoptose através da

desregulação da homeostase, reconhecidamente afetada na idade avançada. Outra hipótese

seria a de que a expressão mais elevada em idosos poderia acenar para um padrão mais

indolente de doença, sendo que doenças muito agressivas que afetassem indivíduos mais

jovens teriam desfechos mais rápidos.

Algumas observações sobre variáveis clínicas da nossa população foram muito

interessantes.A expressão de survivina em tumores metastáticos não foi diferente à encontrada

em tumores localizados, bem como não houve diferença na expressão em pacientes portadores

de GIST e outras neoplasias sincrônicas.Além disso, a imunoexpressão de survivina foi

correlacionada significativamente com tamanho tumoral, e foi mais evidente em tumores

menores que 7,5 cm.No entanto, é extremamente relevante a observação que a expressão de

survivina também ocorre em tumores iniciais (menores que 2 cm).Tomados em conjuntos

estes dados poderiam indicar que a inibição da apoptose mediado pela survivina , assim com

a expressão de KIT , deve ser um achado precoce na tumorigênese dos GIST e não uma

anormalidade adicional à desdiferenciação e progressão do tumor.Esta observação é muito

relevante pois sugere que a survivina pode constituir-se em alvo terapêutico importante no

tratamento de GIST.

Entre os pacientes KIT negativos e PDGF positivos a expressão de survivina foi

menor proporcionalmente em relação à amostra KIT positiva.Embora a proporção destes

pacientes seja muito pequena no nosso estudo, este achado de menor imunopositividade para

survivina e conseqüente menor inibição da via apoptótica poderia estar relacionado com

comportamento menos agressivo dos tumores com expressão de PDGF.(50)

No nosso estudo não houve relação entre a expressão de survivina e sobrevida global

da totalidade da população estudada, entretanto, pacientes com imunopositividade

apresentavam sobrevida mediana de 25 meses em contraste com os 36 meses entre os que não

apresentavam a expressão (ganho de sobrevida de 30%).Em análise do subgrupo dos

pacientes com doença inicial ao diagnóstico e expressão de survivina houve menor tempo

para recorrência, de 11 meses; enquanto que pacientes survivina-negativos apresentaram

tempo maior para recorrência, de 25 meses.Esta diferença entre os grupos não atingiu nível de

significância (p=0,08).

A identificação da expressão de survivina como fator de prognóstico, contribuindo

para aumento da agressividade do tumor e maior potencial para disseminação sistêmica já

havia sido relatada anteriormente na literatura (1,8,13,14).

Existe uma forte tendência que indica que a expressão de survivina possa ser

relacionada com a sobrevida.É interessante ressaltar que como apenas 28% dos pacientes não

expressaram survivina, a casuística deveria ser consideravelmente maior para que a diferença

estatística pudesse ser atingida.No entanto, se consideraria fortemente a possibilidade de

avaliar a expressão por método quantitativo na tentativa de se observar se níveis variáveis de

expressão poderiam ser correlacionados a diferentes expectativas de sobrevida.

Um dos achados mais significantes da survivina é sua distribuição diferencial em

células malignas comparada com tecidos normais; uma vez que survivina não é identificada

em tecidos sadios, encontra-se hiper-expressa nas neoplasias e envolvida em processos

determinantes da progressão tumoral tem sido investigada como alvo potencial para a terapia

anti-neoplásica; p. ex., um dos mecanismos de ação da quimioterapia convencional é a

indução de apoptose através da participação das caspases, sendo assim, atuações terapêuticas

neste alvo poderia aumentar a sensibilidade à quimioterapia.(10)

Foi recentemente demonstrado que a supressão de survivina utilizando

oligonucletídeos anti-senso induz apoptoses in vivo e in vitro, representando uma alternativa

no manejo de tumores que expressam esta característica.(10,20)

Em conclusão, este estudo identificou a presença citoplasmática de survivina em

grande maioria dos casos de GIST analisados. A prevalência da expressão de survivina

observadas nestes tecidos foi semelhante à descrita em estudos prévios em neoplasias de

outras linhagens.

Survivina foi igualmente expressa em tumores iniciais e em tumores em estágio

avançado, sugerindo que este achado represente um evento precoce na tumorigênese dos

GIST.

A expressão de survivina não foi associada às demais características clínico-

patológicas ( idade, gênero, localização tumoral, subtipo histológico e índice mitótico )

Embora os níveis estatísticos de significância não tenham sido atingidos, parece

haver uma tendência em favor da expressão de survivina relacionada à diminuição da

sobrevida livre de progressão nestes pacientes, identificando esta proteína como um potencial

marcador de prognóstico, sendo necessários estudos adicionais, com desenho prospectivo e

acompanhamento de desfecho, além de análises de sobrevida a longo prazo .

8.CONCLUSÕES

1) Setenta e dois por cento dos espécimes de GIST expressaram survivina enquanto esta

expressão não foi observada em células normais;

2) Não houve associação entre a expressão de survivina e as características clínico-

patológicas na amostra estudada;

3) Houve tendência de associação entre a expressão de survivina e sobrevida livre de

doença.

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