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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE AGRONOMIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS
FLÁVIA ISABEL DA ROCHA OLIVEIRA
CLOSTRIDIUM ESTERTHETICUM EM LEITE CRU E EM QUEIJOS
PARMESÃO E PROVOLONE
Goiânia
2007
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FLÁVIA ISABEL DA ROCHA OLIVEIRA
CLOSTRIDIUM ESTERTHETICUM EM LEITE CRU E EM QUEIJOS
PARMESÃO E PROVOLONE
Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de
Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos
da Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos da
Universidade Federal de Goiás, como exigência para
obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia
de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Albenones José de Mesquita
Co-orientador (a): Prof. Drª Iolanda Aparecida Nunes
Goiânia
2007
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FLÁVIA ISABEL DA ROCHA OLIVEIRA
CLOSTRIDIUM ESTERTHETICUM EM LEITE CRU E EM QUEIJOS
PARMESÃO E PROVOLONE
.
Dissertação defendida e aprovada em 26 de outubro de 2007, pela Banca Examinadora
constituída pelos membros:
_____________________________________________
Prof. Dr. Guido Fontgalland Linhares - UFG
_____________________________________________
Prof. Dr. Celso José de Moura - UFG
_____________________________________________
Prof. Dr. Albenones José de Mesquita - UFG
(Orientador)
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, Arivaldo e
Léa, pelo incentivo e amor constante.
AGRADECIMENTOS
A Deus, o autor e consumador da minha fé. A quem devo toda honra e glória.
Agradeço por cada passo que Ele me conduziu, por cada pessoa que colocou em minha vida e
por me conceder saúde e condições financeiras para a realização desta etapa da minha vida.
À Universidade Federal de Goiás, à Escola de Agronomia e Engenharia de
Alimentos e ao Programa de Pós Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos. Ao
Centro de Pesquisa em Alimentos, da Escola de Veterinária da UFG.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES, pela
concessão da bolsa de estudo.
Aos meus pais Arivaldo Oliveira e Léa da Rocha Oliveira, irmãos Arivaldo O.
Júnior, Amanda da R. Oliveira e Daniel da R. Oliveira e cunhados Márcia C. Araújo e
Ricardo Cardoso por estarem sempre ao meu lado, incentivando e apoiando minhas decisões.
Muito obrigada! Vocês são fundamentais na minha vida!
Ao Rogério B. S. Araújo meu amigo e companheiro. Como você foi e é importante
na realização desse sonho. Você que está ao meu lado em cada momento de desânimo,
cansaço, mas também nos de alegria. Obrigada pela ajuda, compreensão, carinho e amor!
Ao professor Dr. Albenones José de Mesquita, obrigada pela confiança na execução
deste projeto, amizade, carinho e pelas orientações. Agradeço à professora Dra. Iolanda
Aparecida Nunes pelo auxílio, correções e ensinamentos dispensados a mim. Tenho certeza
que aprendi muito com vocês!
À amiga e fiel companheira Ursula Nunes Rauecker, nem sei se conseguirei
expressar o quanto você foi importante. Você que me deu forças, ensinando, auxiliando,
acompanhando-me em vários “experimentos”, sem impor limites para ajudar. Obrigada!
À Thays de Lima Dias que me acompanhou desde o inicio, sofrendo com várias
tentativas, mas também se alegrando com as vitórias. Uma amiga muito especial. Obrigada!
À Lívia Mara Felipe pela imensa ajuda na finalização deste trabalho, principalmente
na execução do seqüenciamento. Você que se tornou uma grande amiga! Como sou grata!
Aos amigos e colegas Leonardo França, Thiago Vilela Del’Acqua, Adriano Q.
Mesquita, Laura Cristina V. Resende, Joice Vinhal, Renan Bertazzi e Oyama Rodrigues da
Silva pela companhia, pelos momentos alegres e auxílios.
Àqueles que sempre me ajudaram com conselhos, disponibilizando materiais
indispensáveis para este trabalho, pela amizade e carinho. Vocês, Sandra Queiroz Porto de
Mesquita, Winder Macusuel Borges Oliveira e Cíntia Silva Minafra e Rezende.
Ao professor Dr. Guido Fontgalland Linhares por disponibilizar as fotos dos géis de
eletroforese com tanto carinho e dedicação.
À Karine Oliveira Coelho e Tainá Leite de Almeida pelo auxílio na coleta das
amostras de leite, as quais foram de grande importância.
Ao professor Robson Maia Geraldine pela grande ajuda na análise e interpretação
dos dados.
À Ângela Patrícia Santana da Universidade de Brasília, pela disponibilidade de
realizar o seqüenciamento das amostras.
Aos colaboradores, estagiários e mestrandos do Centro de Pesquisa em Alimentos,
Sr. Nilson Nunes Ribeiro e Sr. José Vieira, Wilson C. Ricardo, Fredsson M. Silva, Euza R.
Silva, Neuza D. S. Souza, Liliane S. Santos, Sandra M. dos Santos, Tatiane E. Parreira, Maria
Magali de Souza, Rosangela N. Carvalho, Gisele do N. Moreira, Silmara D. Fernandes,
Leandro Augusto Souza, Adriele N. Silva, Kesllye Karole Silva, Lisbônea Gomes (Liz),
Rodrigo A. Oliveira, Rodrigo Balduíno, Fabíola R. Santos, Carlos Henrique G. Moreira,
“Buxexa”, Suzy Darlen S. Almeida e Camila Silveira de Melo que tornaram o ambiente de
trabalho mais agradável com sua amizade, sorriso e carinho.
Aos Professores Antônio Nonato Oliveira, Edmar Soares Nicolau e Moacir Evandro
Lage pela atenção e carinho.
Aos meus colegas de pós-graduação Henrique E. Amorim, Marília M. Guimarães,
Lorena S. Rocha, Mayra Conceição P. Martins, Letícia Fleury Viana, Cláudia L. Munhoz e,
em especial à grande amiga Ana Maria da S. Rabelo. Como foi bom este tempo que passamos
juntos. Vocês fazem parte desta realização!
Aos professores Maria Célia L. Torres, Márcio Caliari, Manoel S. Soares Júnior,
Celso José de Moura, Maria Margareth V. Naves, Maria Sebastiana Silva, Mara R. Silva,
Raquel A. C. Santiago, Rosangela Vera e Miriam F. A. Silveira por todo ensinamento,
carisma e amizade.
Aos formandos de engenharia de alimentos UFG/2006 pelos momentos que
passamos juntos durante o Estágio Docência.
Aos amigos que, mesmo distante, sempre me apoiaram, Estela do Lago, Fabíola
Marques, Flávia Marques, Flávia Rodrigues, Ângela Rocha Silva Sousa, Isaac Nogueira, Sara
Nogueira, Clarissa Damiani, Sther Lenza e Maria do Livramento (“Lili”). Obrigada!
EPÍGRAFE
“Tu és digno, Senhor e Deus nosso, de receber
a glória, a honra e o poder, porque todas as
coisas tu criaste, sim, por causa da tua vontade,
vieram a existir e foram criadas”.
(Apocalipse 4:11)
RESUMO
A deterioração de queijos semicozidos e cozidos ou semiduros e duros, conhecida como
tufamento tardio, tem sido o foco de vários estudos. Alguns microrganismos já foram
relacionados com esta deterioração incluindo algumas espécies de Clostridium, como C.
tyrobutiricum, C. butyricum, C. sporogenes e C. beijerinckii. Uma nova espécie, C.
estertheticum, está sendo incriminada na deterioração de carnes refrigeradas embaladas a
vácuo, que apresenta características semelhantes ao tufamento tardio em queijos, como
produção de gás com distensão da embalagem, forte odor de ranço e presença de ácidos
butíricos. No entanto, não havia nenhum relato sobre a ocorrência de C. estertheticum em
leite cru e queijos. O presente trabalho avaliou 32 amostras de leite cru provenientes de
propriedades rurais de Goiás e 95 de queijos parmesão e provolone comercializados no
mercado varejista de Goiânia, produzidos em diferentes Estados do Brasil. C. estertheticum
foi detectado por meio da Reação em Cadeia da Polimerase com dois pares de primers,
RF/RR e 16SEF/16SER. O efeito do enriquecimento não-seletivo das amostras em caldo BHI
foi avaliado em três períodos de incubação, cinco, dez e 30 dias, a 10ºC em anaerobiose. O
DNA genômico foi extraído seguindo a metodologia do fenol:clorofórmio. Os resultados
obtidos revelam a ocorrência de C. estertheticum em amostras de leite cru (34,4%) e de
queijos parmesão e provolone (17,9%). A maior positividade foi obtida nos queijos parmesão
e provolone com sinais de deterioração (50,0%) e normais (29,6%) e no provolone com sinais
de deterioração (25,0%). C. estertheticum foi detectado com os dois pares de primers
utilizados na amplificação, sendo a totalidade de positivos obtida somente quando se associou
os dois pares. O pré-enriquecimento para extração do DNA genômico influenciou
substancialmente na detecção do microrganismo sendo o período de 10 dias, o que
proporcionou melhores resultados para o par RF/RR. C. estertheticum foi encontrado em
amostras de queijos provenientes de todos os Estados analisados, e em amostras de leite cru
colhidos em Goiás, o que indica sua disseminação no Brasil.
Palavras-chaves: produtos lácteos, deterioração de queijo, PCR, Clostridium.
ABSTRACT
The spoilage of semicooked and cooked cheeses and semihard and hard cheeses, known as
late blowing, has been the focus of some studies. Some microorganisms already had been
related with this spoilage including some species of Clostridium, as C. tyrobutiricum, C.
butyricum, C. sporogenes and C. beijerinckii. A new species, C. estertheticum, is being
incriminated in the spoilage of cooled meats packed the vacuum, which presents similar
characteristics to the late blowing in cheeses, as gas production with blowing of the packing,
fort flavor of rancid and presence of acid butyl. However, did not have a story on the
occurrence of C. estertheticum in raw milk and cheeses. The present work evaluated 32
samples of raw milk proceeding from country properties of Goiás and 95 samples of cheeses
commercialized parmesan and provolone in the retail market of Goiânia, produced in different
States of Brazil. C. estertheticum was detected using of the Polimerase Chain Reaction with
two pairs of primers, RF/RR and 16SEF/16SER. The effect of the not-selective enrichment of
the samples in broth BHI was evaluated, in three incubation periods, five, ten and 30 days
10ºC in anaerobes. The genomics DNA was extracted following the methodology
fenol:clorofórmio. The gotten results disclose to the occurrence of C. estertheticum in samples
of raw milk (34,4%) and samples of cheeses parmesan and provolone (17,9%). The highest
leves of C. estertheticum was gotten in the cheeses parmesan and provolone with signals of
spoilage (50,0%) and normal (29,6%) and in provolone with spoilage signals (25,0%). C.
estertheticum was detected with the two pairs of primers used in the amplification, being the
totality of positives only gotten when it associated the two pairs. The daily pay-enrichment for
extraction of the genomics DNA substantially influenced in the detention of the
microorganism being the period of 10 days, what it provided better resulted for pair RF/RR.
C. estertheticum was found in samples of cheeses proceeding from all the analyzed States,
and in raw milk samples harvested in Goiás, what it indicates its dissemination in Brazil.
Word-keys: dairy products, spoilage of cheese, PCR, Clostridium.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fluxograma geral de produção de queijo.................................................................16
Figura 2. Fontes possíveis de contaminação do leite com esporos de Clostridium. ...............21
Figura 3. Fotomicrografia de contraste de fase do Clostridium estertheticum subsp.
laramiense (a) e C. estertheticum subsp. estertheticum (b).....................................25
Figura 4. Distribuição das amostras de queijos parmesão e provolone segundo o Estado de
localização das indústrias.........................................................................................31
Figura 5. Mapa do Estado de Goiás destacando os Municípios de procedência das amostras
de leite cru................................................................................................................31
Figura 6. Eletroforese em gel de agarose a 1,0% de produtos de C. estertheticum em amostras
de leite cru e queijos parmesão e provolone, com os pares de primers RF/RR
(641pb) e 16SEF/16SER (790pb). Canaletas 01 e 11 padrão de peso molecular
(100bp DNA Ladder); 02 e 10 controles positivos (DSM 8809); 03 amostra
positiva para o par 16SEF/16SER; 04 e 05 controle negativo para o par
16SEF/16SER; 06 controle negativo para o par RF/RR; 07 a 09 amostras positivas
para o par RF/RR. ....................................................................................................43
Figura 7. Distribuição de C. estertheticum no total de amostras analisadas, segundo o uso
individual, simultâneo e independente dos pares de primers RF/RR e
16SEF/16SER. .........................................................................................................45
Figura 8. Distribuição de C. estertheticum em amostras de leite cru e queijos parmesão e
provolone, segundo o uso individual, simultâneo e independente dos pares de
primers RF/RR e 16SEF/16SER..............................................................................45
Figura 9. Distribuição de C. estertheticum detectados por PCR segundo os Municípios
goianos de colheita das amostras de leite cru. Goiânia-GO, 2007...........................56
Figura 10. Concentração de amplicons de C. estertheticum. Canaleta 1 padrão de peso
molecular Low DNA Mass Ladder, 2 amplicon de 790 pb (par 16SEF/16SER e 3
amplicon de 641 pb (par RF/RR).............................................................................57
Figura 11. Homologia de 99% resultante do alinhamento no programa BLAST (GENBANK,
2007) entre o resultado do seqüenciamento e a seqüência de referência para C.
estertheticum (nº de acesso S46734) realizada com o par de primers RF/RR
(HELPS; HARBOUR; CORRY, 1999). ..................................................................58
Figura 12. Homologia de 99% resultante do alinhamento no programa BLAST (GENBANK,
2007) entre o resultado do seqüenciamento e a seqüência de referência para C.
estertheticum (nº de acesso X68181) realizada com o par de primers RF/RR
(HELPS; HARBOUR; CORRY, 1999). ..................................................................58
Figura 13. Homologia de 99% resultante do alinhamento no programa BLAST (GENBANK,
2007) entre o resultado do seqüenciamento e a seqüência de referência para C.
estertheticum (nº de acesso X68181) realizada com o par de primers 16SEF/16SER
(BRODA; BOEREMA; BELL, 2003) .....................................................................59
LISTA DE TABELAS E QUADRO
Tabela 1. Distribuição de amostras de leite cru e queijos parmesão e provolone segundo a
apresentação do produto. Goiânia - GO, 2007.........................................................29
Tabela 2. Misturas de reação de amplificação de PCR e concentrações finais de reagentes,
segundo os pares de primers utilizados. Goiânia – GO, 2007. ................................35
Tabela 3. Distribuição de C. estertheticum em amostras de leite cru, queijos normais e
queijos com sinais de deterioração, segundo as fontes de detecção. Goiânia-GO,
2007..........................................................................................................................37
Tabela 4. Distribuição de C. estertheticum em amostras de queijos normais e com sinais de
deterioração, segundo o tipo de queijo. Goiânia-GO, 2007.....................................39
Tabela 5. Detecção de C. estertheticum em leite cru e em queijos parmesão e provolone,
segundo os pares de primers utilizados para amplificação. Goiânia-GO, 2007. .....42
Tabela 6. Detecção de C. estertheticum em amostras de leite cru e queijos parmesão e
provolone pré-enriquecidas e não enriquecidas. Goiânia-GO, 2007. ......................47
Tabela 7. Detecção de C. estertheticum em amostras de leite cru e queijos parmesão e
provolone submetidas ao pré-enriquecimento em caldo não seletivo, segundo os
períodos de incubação. Goiânia-GO, 2007..............................................................50
Tabela 8. Freqüência de C. estertheticum em amostras de leite cru e de queijos parmesão e
provolone, sem e com pré-enriquecimento, segundo os pares de primers utilizados
na amplificação e os períodos de incubação. Goiânia-GO, 2007. ...........................53
Quadro 1. Relação das amostras positivas para C. estertheticum, segundo a fonte, aspecto do
produto, pares de primers utilizados na amplificação e período de pré-
enriquecimento.........................................................................................................48
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................12
2. REVISÃO DE LITERATURA...............................................................................14
2.1 Fluxograma de produção dos queijos parmesão e provolone.............................15
2.2 Defeitos nos queijos parmesão e provolone..........................................................18
2.2.1 Tufamento tardio de queijos duros e semiduros.......................................................19
• Clostridium tyrobutyricum ..................................................................................20
• Clostridium butyricum.........................................................................................22
• Clostridium sporogenes.......................................................................................22
• Clostridium beijerinckii.......................................................................................23
• Clostridium estertheticum ...................................................................................24
2.3 Detecção de C. estertheticum pela reação em cadeia da polimerase...................26
3. OBJETIVOS............................................................................................................28
3.1 Objetivo Geral ........................................................................................................28
3.2 Objetivos Específicos..............................................................................................28
4. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................29
4.1 Amostragem............................................................................................................29
4.2 Colheita das amostras ............................................................................................32
4.3 Detecção Molecular de C. estertheticum ...............................................................33
4.3.1 Procedimento de preparo das amostras...............................................................33
4.3.2 Extração do DNA genômico ..................................................................................34
4.3.3 Protocolos para o PCR...........................................................................................34
4.4 Confirmação da identidade dos produtos de amplificação.................................36
4.5 Análise estatística....................................................................................................36
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................37
5.1
Detecção de C. estertheticum em leite cru e em queijos.......................................37
5.2 Detecção de C. estertheticum segundo os pares de primers e as fontes...............40
5.3 Avaliação do efeito do pré-enriquecimento não seletivo na detecção de C.
estertheticum pela técnica de PCR.........................................................................46
5.4 Avaliação dos períodos de incubação na detecção de C. estertheticum por
meio da técnica de PCR..........................................................................................49
5.5 Distribuição de C. estertheticum segundo os estabelecimentos de
procedência e a origem geográfica das amostras.................................................54
5.6 Confirmação da identidade dos produtos de amplificação.................................57
6. CONCLUSÕES........................................................................................................60
REFERÊNCIAS ......................................................................................................61
APÊNDICES............................................................................................................66
1. INTRODUÇÃO
O leite é considerado como um dos alimentos mais completos, por ser de grande
valor nutritivo, fornecendo macro e micronutrientes para crescimento, desenvolvimento e
manutenção da saúde do homem. Segundo o Anualpec (2006) a produção de leite no Brasil
cresceu vertiginosamente nas últimas décadas, atendendo atualmente o consumo interno e
exportando o excedente. A presença do leite no mercado internacional gera novas
perspectivas para o produtor, principalmente em relação aos ganhos financeiros decorrentes
da elevação dos preços e à qualidade nutricional e microbiológica da matéria-prima, o que já
foi revolucionado com a Instrução Normativa Nº 51 (IN51) através da definição dos
parâmetros de qualidade para a cadeia produtiva.
Desde 2000, o Brasil tem produzido anualmente, em torno de 20 bilhões de litros de
leite, sendo Goiás um dos maiores produtores, com consumo nacional de, em média, 1,5
bilhões de litros de leite. Com relação aos derivados, o Brasil está entre os três maiores
produtores de queijo, com 495 milhares de toneladas, consumindo, em torno de 2,6
kg/pessoa/ano. Segundo o Anualpec (2006) o Brasil exportou em 2005, cerca de 1,9 mil
toneladas de leite e sete mil toneladas de queijo.
Desta forma é importante destacar que as exigências quanto à qualidade do queijo e
conseqüentemente da matéria prima é fundamental não só em relação à saúde do consumidor,
mas também ao produtor que, na maioria das vezes, obtém o sustento de sua família da
comercialização destes produtos. Assim, é imprescindível destacar a necessidade de controle
de qualidade, higiênico-sanitária, no intuito de obter um produto apto para o consumo, sem
perigo para a saúde do consumidor e sem defeitos.
Os queijos podem apresentar vários defeitos perceptíveis pelo consumidor somente
no momento de uso, corte ou degustação, porém, outros são visualmente notáveis. Assim
podem ser citados: alteração de sabor, problemas de textura e consistência, manchas e
descoloração, trincas, ausência de derretimento, olhaduras indesejáveis ou ausência delas e,
ainda, fermentações indesejáveis que podem provocar o tufamento tardio.
Deteriorações como tufamento tardio têm ocorrido com grande freqüência em
produtos lácteos, principalmente em queijos duros e semiduros. Tufamento tardio se
diferencia do tufamento precoce, dentre outros fatores, pelo período de manifestação dos
sinais e tipo de microrganismo causador da deterioração.
13
O tufamento precoce ocorre rapidamente nos queijos processados e contaminados
por coliformes. Já o tufamento tardio provocado pela contaminação por clostrídios manifesta-
se em período de tempo maior. Geralmente o tufamento tardio gera um prejuízo para o
laticínio ou queijaria, pois o produto torna-se impróprio para o consumo devido à formação de
odor e sabor indesejáveis e deformação do mesmo, que se apresenta “inchado”, com grandes
olhaduras e trincas ou rachaduras.
As espécies bacterianas envolvidas em casos de tufamento tardio são Clostridium
tyrobutyricum, C. butyricum, C. sporogenes e C. beijerinckii. Provavelmente, demoram mais
tempo para se multiplicarem devido ao tempo de geração desses microrganismos, o que pode
ocorrer quando o produto já está no ponto de venda. Como esses microrganismos são
anaeróbios, os queijos duros e semiduros são os mais propícios a esta deterioração por
criarem em seu interior uma condição de anaerobiose.
Outras espécies de Clostridium têm sido detectadas em carnes refrigeradas
embaladas a vácuo e provocam na carne alterações semelhantes ao tufamento tardio em
queijos. Dentre essas espécies pode-se citar C. estertheticum. Pouco se sabe sobre estes
microrganismos, mas estudos revelam que estão presentes em fezes, na superfície de cortes
cárneos e carcaças e em ambientes de matadouros-frigoríficos, como câmaras frias e ralos.
C. estertheticum é um microrganismo deteriorante que apresenta faixa ótima de
temperatura inferior à das espécies até então incriminadas em casos de tufamento tardio de
queijos. Portanto, torna-se importante comprovar sua presença também em leite e produtos
lácteos no intuito de adotar medidas de higiene e sanitização adequadas, visando seu controle
nas plantas industriais de laticínios.
Os métodos convencionais de isolamento e identificação do microrganismo são
demorados e de difícil execução. Técnicas de biologia molecular, como a Reação em Cadeia
da Polimerase (PCR), têm sido utilizadas com freqüência e sucesso, devido à elevada
especificidade, sensibilidade e rapidez quando comparadas com os métodos convencionais.
Diante do exposto, propôs-se neste estudo verificar a ocorrência de C. estertheticum
em leite cru, queijos duros e semiduros. Partiu-se do princípio de que se o microrganismo está
presente em fezes de animais e pele do animal, portanto pode também estar presente no leite
cru. Além disso, como é esporulado, pode sobreviver ao tratamento térmico do leite para a
produção de queijos.
2. REVISÃO DE LITERATURA
De acordo com a Portaria Nº 146, de 07 de março de 1996 do Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), queijo é o produto fresco ou maturado
obtido por separação parcial do soro de leite ou leite reconstituído ou de soros lácteos,
coagulados, com ou sem adição de aditivos. Ainda segundo esta Portaria, queijo fresco é o
produto que está pronto para o consumo logo após sua fabricação e queijo maturado aquele
que sofreu as trocas bioquímicas e físicas necessárias e características da variedade do queijo
(BRASIL, 1996; BRASIL, 1997a).
Dentre os queijos maturados estão os queijos parmesão e provolone. O queijo
parmesão é obtido de leite cru ou pasteurizado, de massa cozida, prensado e maturado por, no
mínimo, seis meses. É classificado como queijo duro (BRASIL, 1952), de baixa umidade,
semi-gordo e maturado (BRASIL, 1997b).
De origem italiana, as principais características do queijo parmesão são: baixo teor
de umidade e textura granular, o que lhe confere em algumas regiões, o nome de queijo
Grana. Apresenta-se sob forma cilíndrica, com faces planas, crosta grossa (4 a 8 mm), bem
formada e lisa. A massa é dura, compacta e quebradiça, de untura seca, cor amarelo-palha,
odor e sabor picante e forte (BRASIL, 1952; ALBUQUERQUE, 2002). Segundo a Portaria nº
353, de 1997, do MAPA, o queijo parmesão pode pesar de cinco a 10 kg e, até a expedição,
deve ser armazenado a temperatura inferior que 18ºC (BRASIL, 1997b).
O queijo provolone é um queijo de massa filada, originário da Itália. É também
fabricado em vários países do mundo, inclusive no Brasil (ALBUQUERQUE, 2002). Obtido
de leite cru ou pasteurizado, não é prensado e pode ser comercializado fresco ou maturado.
Quando fresco, deve ser consumido até 20 dias após a fabricação (BRASIL, 1952). Possui
diversos formatos, sendo o mais comum o de um longo cilindro, com peso variando de quatro
a cinco quilos, podendo se apresentar também, no formato de uma pêra. Pode ser defumado, o
que lhe confere coloração e sabor especiais. Sua maturação varia de dois a quatro meses e
possui sabor pronunciado (BRASIL, 1952; ALBUQUERQUE, 2002). Quando frescos, devem
pesar de 500 g a 2 kg e maturados, de 2 a 8 kg. Sua crosta deve ser firme, lisa, resistente e de
cor amarelo castanho devido à defumação. Sua consistência é semidura, textura fechada,
coloração interna amarelo palha, odor forte e sabor levemente picante (BRASIL, 1952).
De acordo com Albuquerque (2002), uma boa parte da produção de queijo parmesão
é destinada à ralação. No entanto, a legislação brasileira permite a obtenção de queijos ralados
15
somente a partir de queijos aptos para o consumo humano, mas permite ralar os julgados não
adequados para venda ao público, tais como aqueles que apresentam falhas morfológicas ou
de comercialização, desde que não comprometam a qualidade do produto final (BRASIL,
1997c).
2.1 Fluxograma de produção dos queijos parmesão e provolone
A Figura 1 representa o fluxograma de produção geral de queijos. No presente
trabalho serão destacadas apenas as particularidade referentes à produção dos queijos
parmesão e provolone.
Leite Integral
Para a elaboração de queijo deve-se utilizar leite de boa qualidade, que envolve
desde sua composição à microbiota bacteriana e sua capacidade para fermentação e
coagulação (CHAPMAN; SHARPE, 1987; DUMAIS; BLAIS; CONRAD, 1991). Esses
fatores interferem tanto no rendimento quanto na microbiota, pois a qualidade microbiológica
dos produtos lácteos é influenciada pela carga microbiana do leite cru, das condições de
processamento e contaminação pós-pasteurização (RICHTER; LEDFORD; MURPHY, 1976).
O leite cru proveniente de animais sadios contém reduzida quantidade de
microrganismos, sendo os mais comuns os gêneros Micrococcus, Staphylococcus,
Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus e Corynebacterium (PERRY, 2004). No entanto, o
leite pode ser contaminado com microrganismos da pele da vaca, do ambiente e dos utensílios
e equipamentos higienizados inadequadamente utilizados na ordenha, que incluem bactérias
Gram-negativas como os coliformes e Gram-positivas como as ácido-láticas, Bacillus e
Clostridium (RICHTER; LEDFORD; MURPHY, 1976; CHAPMAN; SHARPE, 1987).
Corte, Cocção da coalhada e Dessoramento
Uma das particularidades dos queijos parmesão e provolone ocorrem nas etapas de
corte e cocção da coalhada e no dessoramento. Na elaboração de queijos mais duros, a
coalhada é predominantemente enzimática e corte intenso no intuito de obter proporções
menores, as quais condicionam a intensidade do dessoramento. Na cocção da coalhada, a
temperatura elevada favorece a formação de ligações intermicelares com a conseqüente
16
retração do coágulo, podendo chegar até 55 e 60ºC. Desta forma, o dessoramento torna-se
mais intenso (ORDOÑEZ, 2005).
Figura 1. Fluxograma geral de produção de queijo.
Fonte: Ordoñez, 2005 (Adaptado).
Leite Integral
Padronização / Pasteurização
Adição do Cultivo Iniciador
Formação da coalhada
Corte da coalhada
Cocção da Coalhada
Agitação da Coalhada
Dessoramento
Enformagem Fermentação
Filagem Prensagem
Salga Moldagem
Maturação Salga
Maturação
QUEIJO PROVOLONE
QUEIJO PARMESÃO
17
Filagem
Dentre os queijos estudados apenas o provolone é submetido ao processo de filagem
(Figura 1). A filagem ocorre quando a massa perde a maior parte do cálcio que integraliza a
matriz protéica desde a coagulação. A perda de cálcio ocorre à medida que aumenta a
acidificação da massa, ou seja, entre pH de 4,8 a 5,5. O ponto ideal da massa ocorre quando o
pH encontra-se na faixa citada, em média 5,1 - 5,2, momento no qual a mesma encontra-se
moderadamente mineralizada como paracaseinato bicálcico, apresentando boa elasticidade e à
temperatura de 55 a 58ºC (FURTADO, 1997).
Maturação
Os queijos maturados diferenciam-se dos frescos, essencialmente, pelas complexas
transformações bioquímicas que ocorrem na maturação, de forma progressiva e por um longo
tempo. Neste processo os componentes da coalhada são transformados em diferentes produtos
mais solúveis. A natureza destes novos produtos, sua diversidade e proporções relativas fazem
com que cada queijo tenha seu sabor e aroma típicos, textura e consistência características e
diferentes das demais variedades (SPREER, 1991).
Os períodos de maturação podem variar desde uma ou duas semanas até um ano ou
mais. Geralmente os queijos mais maturados, com sabor aguçado, requerem uma maturação
de um ano ou mais. As condições de umidade e temperatura durante este processo dependem
do tipo de queijo, sendo que para a maioria dos duros utiliza-se umidade baixa, aumentando
assim a atividade enzimática interna, ao mesmo tempo em que se previne o crescimento
microbiano superficial (SILIKER, 1980).
Os queijos semiduros, como o provolone, são fabricados com coalhadas mais firmes
e umidade de 45 - 50%. Os responsáveis pela maturação são as bactérias, as quais diminuem o
número após dois a três meses de maturação. Os queijos duros, como o parmesão, são
produzidos com coalhadas firmes, relativamente desidratadas e 35 - 45% de umidade. O
processo de maturação é lento e ocorre por meio de bactérias tendo duração de três a 12 meses
(CHAPMAN; SHARPE, 1987).
Os componentes mais envolvidos na maturação são a lactose, as proteínas e a
gordura, por meio das reações de glicólise, proteólise e lipólise, respectivamente (DUMAIS;
BLAIS; CONRAD, 1991). A glicólise é caracterizada pela acidificação do leite e da coalhada
devido à fermentação da lactose em ácido láctico por cepas selecionadas de bactérias lácticas,
denominadas cultivos iniciadores. Geralmente essa fermentação é realizada por bactérias
lácticas homofermentativas, cujo metabólito final majoritário é o ácido láctico. Quando há
18
presença de microrganismos heterofermentativos são formados compostos secundários como
o dióxido de carbono (CO
2
), o ácido acético e o etanol, sendo que alguns são indesejáveis por
produzirem defeitos nos queijos (ORDOÑEZ, 2005).
O ácido láctico resultante da fermentação da lactose pode se combinar com o cálcio e
formar o lactato. Tanto o ácido láctico quanto o lactato podem ser decompostos por bactérias
desejáveis e indesejáveis, por meio da fermentação propiônica formando ácido propiônico,
acético e CO
2
ou pela fermentação butírica formando ácido butírico, CO
2
e H
2
, alterando o
aroma e causando o tufamento tardio nos queijos (DUMAIS; BLAIS; CONRAD, 1991).
A proteólise é considerada como um fenômeno de grande relevância, que ocorre
durante a maturação, pois afeta tanto a textura como o sabor e o aroma. É um processo
gradual que começa com a ruptura da molécula protéica (ORDOÑEZ, 2005), que se inicia na
salmoura, primeiramente devido aos bolores e leveduras que crescem na superfície do
produto, mantendo durante a maturação (SPREER, 1991).
Na proteólise ocorre a fragmentação da molécula original em polipeptídeos de
tamanhos diversos até a formação de oligopeptídeos e de aminoácidos livres. Estes compostos
podem, junto com substâncias geradas durante a glicólise e a lipólise, participarem do sabor e
do aroma dos produtos ou permanecer no meio disponíveis para sofrer transformações
posteriores, produzindo outros compostos aromáticos e de sabor (ORDOÑEZ, 2005).
A lipólise é a reação na qual as lipases transformam os triglicerídeos em glicerídeos
parciais liberando ácidos graxos. A lipólise lenta e parcial de alguns componentes da gordura
conduz à formação de compostos que intensificam o aroma de alguns queijos de longa
maturação. Quando ocorre uma liberação excessiva de ácidos graxos, em particular do ácido
butírico, graves defeitos de aroma podem ocorrer no queijo (DUMAIS; BLAIS; CONRAD,
1991). As modificações sofridas pelo material lipídico durante a maturação do queijo não
afetam a textura, mas sim o sabor e o aroma do produto final (ORDOÑEZ, 2005).
2.2 Defeitos nos queijos parmesão e provolone
Diversos tipos de defeitos podem ocorrer nos queijos. Alguns decorrentes da
fabricação devido à tecnologia inadequada, outro, da má qualidade da matéria prima e
ingredientes, ou ainda, dos tratamentos físicos inadequados aplicados ao queijo como,
prensagem, cuidados na maturação e controle das temperaturas de maturação e estocagem
(FURTADO, 1991). Os defeitos geralmente produzem alterações físicas, químicas e
19
organolépticas tais como: sabor anormal de ranço e odor pútrido. Os tipos de microrganismos
implicados nas alterações de queijos maturados restringem àqueles que oxidam o lactato e aos
que utilizam as proteínas e gorduras, assim como os produtos de sua degradação. Os bolores,
as leveduras e os anaeróbios esporulados estão implicados, com maior freqüência, nas
deteriorações (SILIKER, 1980).
De acordo com Furtado (1991) um dos defeitos mais temidos, o tufamento, ocorre ao
final da fabricação (prensagem ou salga) ou no decorrer da maturação. O primeiro caso é
conhecido como tufamento precoce, provocado por bactérias do grupo coliforme. No
segundo, tufamento tardio, estão envolvidas as bactérias do gênero Clostridium, porém seu
controle é mais complexo do que o anterior (FURTADO, 1991).
2.2.1 Tufamento tardio de queijos duros e semiduros
A fermentação ácido-butírica, comumente conhecida como tufamento tardio,
constitui um defeito freqüentemente observado nos queijos semiduros e duros e de maturação
prolongada (FURTADO, 1985). Esse defeito é provocado pela presença de esporos de
clostrídios que podem germinar, multiplicar e, assim, produzir gás, gerando consideráveis
perdas do produto (COCOLIN et al., 2004; PERRY, 2004), representando um elevado
impacto econômico na produção de queijos (LE BOURHIS et al., 2005).
O fundamento bioquímico desse defeito baseia-se na fermentação do ácido lático em
ácido butírico, ácido acético, dióxido de carbono e hidrogênio. A formação de ácido butírico
confere ao queijo um flavor de ranço e a presença dos gases CO
2
e H
2
à formação de
olhaduras, que podem, em casos extremos, provocar ruptura do queijo, causando rachaduras
ou trincas (LE BOURHIS et al., 2005). O gás carbônico, bastante solúvel em água, só aparece
como olhaduras no queijo depois de saturar completamente o meio aquoso em que está
dissolvido. Já o hidrogênio, que não é solúvel em água, provoca a formação imediata de
olhaduras que aumentam de tamanho à medida que o defeito se manifesta mais precocemente
no queijo (FURTADO, 1991 e 2005; PERRY, 2004).
Geralmente, o tufamento manifesta-se no período de dez dias até oito semanas após a
fabricação do produto, pois os esporos só germinam sob certas condições, tais como: após o
abaixamento do potencial de oxirredução do queijo ou, antes da distribuição uniforme do sal
(BERESFORD et al., 2001; FURTADO, 2005) Os queijos apresentam-se bastante
“inchados”, com áreas descoradas e macias, odor desagradável e sabor estranho. Internamente
são observadas olhaduras grandes e irregulares na massa, resultantes do processo fermentativo
que leva à produção de hidrogênio (MESQUITA et al., 2001).
20
Bactérias esporogênicas do gênero Clostridium que sobrevivem ao processo de
pasteurização têm sido apontadas como responsáveis pela contaminação do leite (FURTADO,
1991; INGHAM et al., 1998) e como a principal causa da contaminação dos queijos
(MESQUITA et al., 2001). Vários autores (KLIJN et al., 1995; MESQUITA et al., 2001;
COCOLIN et al., 2004; LE BOURHIS et al., 2005) são unânimes em afirmar que a matéria-
prima contamina-se principalmente na ordenha, sendo a silagem de baixa qualidade
microbiológica uma das principais fontes. Na Figura 2 são apresentadas as principais fontes
de contaminação do leite com esporos de Clostridium.
As espécies de Clostridium que têm sido incriminadas como causadoras do
tufamento tardio são C. tyrobutyricum, C. butyricum, C. sporogenes e C. beijerinckii
(JONSSON, 1990; INGHAM et al., 1998; KLIJN et al., 1995; PERRY, 2004; LE BOURHIS
et al., 2005). Esses microrganismos são bastonetes móveis, Gram-positivos, medem de 0,8 a
6,0 µm de comprimento e crescem em uma faixa de temperatura ideal de 32 a 37ºC e de pH
entre 6,8 e 7,0 (FURTADO, 1991). Todas essas espécies são capazes de produzir ácido
butírico e gás hidrogênio em vários meios de cultivo artificiais (KLIJN et al., 1995).
• Clostridium tyrobutyricum
É uma bactéria Gram-positiva, β-hemolítica, móvel, anaeróbia, formadora de esporos
ovais e subterminais (HERMAN; BLOCK; WAES, 1995; SNEATH, 1986). É considerada
por vários autores como o principal organismo responsável pelo tufamento tardio de queijos
semiduros e duros (JONSSON, 1990; HERMAN; BLOCK; WAES, 1995; INGHAM et al.,
1998; SU; INGHAM, 2000), sendo a sua presença um pré-requisito para a ocorrência da
fermentação ácido-butírica em queijos (KLIJN et al., 1995; LE BOURHIS et al., 2007).
Esse microrganismo fermenta ácido lático para produzir ácido butírico, dióxido de
carbono e hidrogênio. As células vegetativas fermentam lactato (SU; INGHAM, 2000) para
produzir CO
2
, H
2
, ácido acético e ácido butírico (MESQUITA et al., 2001). Os gases
liberados causam o tufamento no queijo, enquanto o ácido butírico acima da concentração
crítica de 200 mg/L confere sabor desagradável (LE BOURHIS et al., 2005).
A faixa de temperatura de multiplicação do C. tyrobutyricum ocorre entre 30 e 37ºC,
sendo ótima de 25ºC. Sua multiplicação é estimulada pela fermentação de carboidratos, mas
inibida por 6,5% de NaCl ou 20% de bile. A cultura de C. tyrobutyricum não é tóxica para
camundongos, nem patogênica para humanos e outros animais (SNEATH, 1986).
21
TERRA
Silo
(silagem)
Água
(estábulo e
fábrica)
“Cama”
dos animais
Poeira
Higiene do
estábulo e
bebedouros
Condições
idênticas às
do silo
(restos de
forragem)
Mãos e
hábitos do
ordenhador
Alimentação
das vacas
Forragens
frescas
FEZES
(ESTERCO)
LEITE
QUEIJO
Figura 2. Fontes possíveis de contaminação do leite com esporos de Clostridium.
Fonte: Furtado, 1991.
22
Segundo Wasserfall e Teuber (1979) C. tyrobutyricum origina-se principalmente do
emprego de silagem na alimentação do gado, e como seus esporos sobrevivem facilmente à
temperatura de pasteurização, podem provocar o defeito tufamento tardio. De acordo com Su
e Ingham (2000), os esporos geralmente atingem o leite cru por meio da contaminação dos
tetos pelo esterco durante a ordenha. No entanto, o microrganismo também foi isolado de
solo, produtos lácteos, fezes de cães lebreiros, fezes bovinas e humanas, tanto de adultos
quanto de crianças (SNEATH, 1986).
• Clostridium butyricum
Bastonete Gram-positivo, anaeróbio estrito, móvel por flagelos peritríquios, que
apresenta esporos ovais, centrais a subterminais. A faixa de temperatura de multiplicação
ocorre entre 30 e 37ºC, mas não a 10ºC. A forma esporulada resiste 10 minutos à 80ºC
(PREVOT, 1966; SNEATH, 1986). A multiplicação é estimulada pela fermentação de
carboidratos e inibida por 6,5% de NaCl. Os produtos de fermentação são os ácidos butírico,
acético e fórmico, além do ácido lático e succínico. Butanol e etanol algumas vezes são
produzidos. A cultura não é tóxica para camundongos (SNEATH, 1986).
O microrganismo, assim como o C. tyrobutyricum, também tem sido detectado em
casos de deterioração em queijos com tufamento tardio. Mesquita et al. (2001) afirmaram que
C. butyricum desenvolve-se muito rapidamente, com correspondente produção intensa de gás
e tufamento com forte deformação do queijo.
No estudo realizado por Mesquita et al. (2001), C. butyricum foi o microrganismo
mais freqüentemente isolado de queijos provolone e parmesão considerados tufados,
provenientes dos Estados de Goiás e Minas Gerais. Os autores relatam que esse resultado
pode ter ocorrido porque à época, poucas vacas leiteiras dos dois Estados recebiam silagem na
alimentação.
C. butyricum tem sido isolado de várias fontes, como solo, água doce e sedimentos
marinhos, queijo, rúmen de bezerros sadios, fezes de animais e humanos, incluindo de
crianças sadias, serpentes venenosas e, ainda que raramente em cultura pura, espécime clínica
de humanos e animais, incluindo sangue, urina, trato respiratório, cavidade pleural, abdome,
feridas e abcessos (SNEATH, 1986).
• Clostridium sporogenes
Bastonete Gram-positivo, estritamente anaeróbio (PREVOT, 1966), móvel por
flagelos peritríquios, mede de 0,3 a 1,4 por 1,3 a 16,0 µm. Os esporos são ovais e
23
subterminais (SNEATH, 1986) e resistem de 15 minutos a 1 hora à 100ºC (PREVOT, 1966).
Usualmente, são β-hemolíticos. A faixa de temperatura ótima de multiplicação ocorre entre 30
e 40ºC, com intervalo entre 25 e 45ºC. A multiplicação ótima ocorre em atmosfera contendo
100% de CO
2
. Em 6,5% de NaCl, 20% de bile ou pH 8,5, a multiplicação é variável,
dependendo do isolado. Os produtos de metabolismo incluem grandes quantidades de ácidos
acético e butírico e pequenas quantidades de ácidos isobutírico e isovalérico, podendo ser
produzidos ácidos propiônico, valérico, isocapróico, lático e succínico. Também são
produzidos etanol e abundante H
2
(SNEATH, 1986).
Esse microrganismo foi isolado do solo, em toda parte do mundo, esterco, fezes de
homens e animais (PREVOT, 1966), sedimentos marinhos, lago de água doce, carne
conservada, produtos lácteos, serpente venenosa, de infecções em animais domésticos e em
humanos, incluindo bacteremia, endocardite infecciosa, infecções do sistema nervoso central
e pleuropneumonia, lesões penianas, abcessos, feridas de guerra e outras infecções piogênicas
(SNEATH, 1986).
Assim como C. tyrobutyricum e C. butyricum, C. sporogenes também tem sido
detectado em queijos com tufamento tardio (LE BOURHIS et al., 2005), porém com pouca
freqüência e sempre associado com as outras espécies de Clostridium.
• Clostridium beijerinckii
São bastonetes com cantos arredondados, móveis por flagelos peritríquios e medem
0,5 a 1,7 por 1,7 a 8,0 µm. São Gram-positivos em caldo peptona extrato de levedura glicose
(PYG), podendo ser Gram-negativos em outros meios de cultura. Os esporos são ovais,
excêntricos a subterminais. Isolados podem ser β-, α- ou não hemolítico. A temperatura ótima
de multiplicação é 37ºC, mas não multiplicam a 25ºC ou 45ºC. A multiplicação é estimulada
pela fermentação de carboidratos e inibida por 6,5% de NaCl ou 20% de bile. Como produtos
de fermentação citam-se os ácidos butírico e acético, moderada quantidade de succínico,
lático e fórmico. Traços de ácido propiônico também podem ser detectados. Alguns isolados
produzem quantidades substanciais de n-butanol e outros produzem quantidades moderadas
de acetona ou isopropanol (SNEATH, 1986).
O microrganismo foi isolado de solo, feridas infeccionadas, azeitona fermentada,
doce deteriorado e de fezes humanas (SNEATH, 1986). Le Bourhis et al. (2005) detectaram a
presença de C. beijerinckii, além de outras espécies de Clostridium, em amostras de queijos
com defeitos. Neste estudo, os autores observaram a relação entre a presença do defeito e a
quantidade de ácido butírico. Ao contrário de C. tyrobutyricum, que produz uma grande
24
quantidade de ácido butírico, C. beijerinckii produz uma quantidade inferior durante a
maturação em queijos, levando à formação de olhaduras. Desta forma, Le Bourhis et al.
(2007) destacaram que sinais como rachaduras ou trincas em queijos contaminados por C.
beijerinckii deve-se à sua habilidade para produzir hidrogênio. No entanto, os mesmos autores
salientam que este defeito pode ser causado por outra bactéria produtora de gás.
• Clostridium estertheticum
Foi isolado pela primeira vez por Dainty, Edwards e Hibbard (1989) de carne bovina
refrigerada embalada a vácuo, no Reino Unido. Posteriormente, foi nominado por Collins et
al. (1992) devido à sua habilidade em produzir ésteres. Desde então, há relatos de sua
presença em carnes comercializadas no Reino Unido (DAINTY; EDWARDS; HIBBARD,
1989), na Nova Zelândia (BRODA et al., 1996) e no Brasil (MESQUITA et al., 2006;
RAUECKER et al., 2005, 2006; RAUECKER, 2007).
Broda et al. (2002) detectaram o microrganismo em fezes bovinas e pele do animal.
Os autores apontaram a presença do clostrídio nas fezes pela sua presença no trato
gastrintestinal do animal. A presença na pele do animal foi relatada como conseqüência de
contaminação fecal durante o transporte e na evisceração (BRODA et al., 2002). Boerema,
Broda e Bell (2003) também detectaram esta espécie em ambientes de matadouros-
frigoríficos, fezes e pele de bovino e solo de abatedouros da Nova Zelândia que apresentavam
incidência de tufamento de produtos cárneos embalados a vácuo.
No Brasil, estudo conduzido por Rauecker (2007) verificou a presença de C.
estertheticum em ambiente de oito matadouros-frigoríficos de bovinos, fezes de bovinos,
superfícies de meias-carcacas e em cortes cárneos refrigerados embalados a vácuo normais e
tufados. No entanto, na literatura internacional consultada não há relato da presença deste
microrganismo em queijos normais ou tufados e nem em outros produtos lácteos.
Collins et al. (1992) caracterizaram o microrganismo como um bastonete Gram-
positivo, móvel e estritamente anaeróbio, podendo ocorrer isoladamente ou em pares. Seus
esporos são ovais, subterminais, terminais ou centrais. É um psicrofílico (SPRING et al.,
2003), com faixa ótima de temperatura entre 1 e 15ºC e pH ótimo ao redor de 6,5, sem
multiplicação a 22ºC (COLLINS et al., 1992; SPRING et al., 2003). A forma esporulada
resiste ao aquecimento a 80ºC por 10 minutos (COLLINS et al., 1992). Na fermentação são
formados butirato, acetato, lactato, 1-butanol, etanol, hidrogênio e dióxido de carbono
(SPRING et al., 2003).
25
Segundo Spring et al. (2003), há duas subespécies, C. estertheticum subsp.
laramiense e C. estertheticum subsp. estertheticum (Figura 3). Diferenciam-se essencialmente
por o primeiro ser β-hemolítico em ágar sangue de carneiro, apresentar temperatura ótima de
multiplicação a 15ºC, com limite superior de 21ºC e faixa de pH de multiplicação entre 4,5 e
7,5, com ótima em 6,5. A subespécie estertheticum não é hemolítico em ágar sangue de
carneiro, e se multiplica em uma faixa de temperatura entre 6 e 8ºC, com limite superior a
13ºC, e numa faixa de pH entre 5,5 e 7,8, com ótima variando de 6,5 a 7,2 (SPRING et al.,
2003).
Figura 3. Fotomicrografia de contraste de fase do
Clostridium estertheticum subsp.
laramiense (a) e C. estertheticum
subsp. estertheticum (b)
Fonte: Spring et al., 2003.
26
2.3 Detecção de C. estertheticum pela reação em cadeia da polimerase
Os métodos convencionais para a identificação e detecção de Clostridium em queijo
são difíceis e inespecíficos (HERMAN; BLOCK; YAN RENTERGHEM, 1997). A
identificação segura se faz por meio de métodos baseados no DNA, como hibridização com
sondas de DNA espécie-específica ou da reação em cadeia da polimerase espécie-específica
(KLIJN et al., 1995; HERMAN; BLOCK; VAN RENTERGHEM, 1997).
A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi desenvolvida por Kary Mullis e
colaboradores em 1986. Desde então, tem provocado um grande impacto na biologia
molecular, devido à sua enorme sensibilidade e especificidade para amplificar pequena
quantidade de DNA ou RNA em milhões de cópias para detecção, seqüenciamento, clonagem
e diagnóstico, dentre outros (GU, 1995).
A técnica de PCR foi popularizada pela introdução de termocicladores automáticos e
pela descoberta da enzima termoestável Taq DNA polimerase (GU, 1995). Essa enzima é
proveniente da bactéria Thermus aquaticus, cujo habitat são águas de temperatura alta. Nesse
ambiente mantém-se estável mesmo a 94ºC, porém sua temperatura ótima é de 72ºC
(FARAH, 1997; POWLEDGE, 2004).
Um importante aspecto na avaliação de qualquer teste baseado no DNA é a
especificidade das seqüências do DNA selecionado do gene e cepa de interesse. A presença
do amplicon com tamanho esperado é usada como evidência de que o PCR é positivo.
Entretanto, a identidade do fragmento amplificado deverá ser confirmada por meio de
hibridização por sondas específicas de DNA, digestão com enzima de restrição ou pelo
seqüenciamento do fragmento do DNA - alvo (OLSEN et al., 1995).
Alguns cuidados devem ser observados quando se utiliza o PCR para detectar
microrganismos em alimentos. A composição do alimento pode inibir a reação; a técnica não
distingue células vivas de mortas; partículas do alimento podem interferir na reação, devendo
ser removidas antes da adição da mistura de reagentes porque somente 1 a 10 µL da amostras
será submetida ao PCR. Alguns procedimentos têm sido usados para remover os interferentes
e inibidores, tais como isolamento do DNA e métodos de purificação, cultura de
enriquecimento com e sem etapas de isolamento de DNA e técnicas imunomagnéticas
(WANG; CAO; CERNIGLIA, 1997).
Helps, Harbour e Corry (1999) e Broda, Boerema e Bell (2003) pesquisaram
Clostridium estertheticum em amostras de carnes tufadas por meio da técnica de PCR e
obtiveram sucesso em seus estudos. Esses autores são unânimes em afirmar que o método é
27
vantajoso por ser específico e de execução rápida. Entretanto, Herman, Block e van
Renterghem (1997) relatam que a detecção de células bacterianas em queijo requer um
preparo adequado da amostra a fim de eliminar os componentes inibidores do PCR.
Visando a detecção de C. estertheticum por meio da técnica de PCR, quatro pares de
primers já foram desenhados. Helps, Harbour e Corry (1999) desenharam dois pares, sendo
um de baixa especificidade. Para compensar essa inadequação acrescentaram a utilização de
enzimas de restrição. Assim, os mesmos autores desenharam outro par de primers,
denominados de revised forward (RF) e revised reverse (RR), que anelam nas posições 173-
197 e 813-792, respectivamente, da seqüência do C. estertheticum 16S rDNA (Nº de acesso
ao GenBank S46734) e amplificam um produto de PCR de 641pb.
Broda, Boerema e Bell (2003) desenharam mais dois pares de primers um específico
para C. estertheticum DSM 8809
T
(T = cepa-tipo), o EISR, e outro que detecta tanto o C.
estertheticum DSM 8809
T
,
quanto C. estertheticum-like, 16SE. O primeiro par amplifica um
produto de PCR de 230pb, enquanto o segundo par anela nas posições 205-222 e 996-977,
respectivamente, da seqüência do C. estertheticum 16S rDNA (Nº de acesso ao GenBank
S46734), e obtém um produto de PCR de 790pb. Ambos os pares apresentam um nível
mínimo de detecção de 10
4
células/g para amostras de carne sem enriquecimento e 10
2
células/g para amostras enriquecidas (BRODA; BOEREMA; BELL, 2003).
28
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Verificar a ocorrência de Clostridium estertheticum em leite cru e em queijos
parmesão e provolone por meio da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
3.2 Objetivos Específicos
Determinar a freqüência de ocorrência de C estertheticum em leite cru
provenientes de propriedades localizadas em municípios do entorno de Goiânia,
Goiás;
Determinar a freqüência de ocorrência de C. estertheticum em queijos parmesão e
provolone comercializados no mercado varejista de Goiânia, Goiás;
Avaliar o efeito do uso do pré-enriquecimento não-seletivo e do não-
enriquecimento das amostras na detecção de C. estertheticum em leite e queijos
pela técnica de PCR;
Avaliar o efeito da incubação em três períodos distintos do pré-enriquecimento
não-seletivo para a detecção de C. estertheticum em leite e queijos por meio da
técnica de PCR.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Amostragem
No presente trabalho foram analisadas 127 amostras, sendo 95 de queijo e 32 de leite
cru. Dentre as amostras de queijo, 29 eram de queijo parmesão, 35 de provolone e 31 de
queijo ralado, sendo duas de provolone e 29 de parmesão. O número de amostras foi
calculado tendo como base SAMPAIO (1998).
A distribuição das amostras segundo a apresentação do produto encontra-se na
Tabela 1. Já a distribuição segundo a fonte, Estado da Federação e estado de conservação,
não-deteriorada (normal) ou deteriorada, encontra-se detalhada nos Apêndices A, B, C e D.
Tabela 1. Distribuição de amostras de leite cru e queijos parmesão e provolone segundo a
apresentação do produto. Goiânia - GO, 2007.
FONTE Nº DE AMOSTRAS
Leite Cru 32
Queijo Parmesão 29
peça inteira 03
fracionado pela indústria 12
fracionado pela rede de distribuição 14
Queijo Provolone 35
peça inteira 13
fracionado pela indústria 14
fracionado pela rede de distribuição 08
Queijo Parmesão Ralado 29
ralado pela indústria 25
ralado pela rede de distribuição 04
Queijo Provolone Ralado 02
ralado pela indústria 01
ralado pela rede de distribuição 01
TOTAL 127
30
Relativamente às amostras de queijo, 76/95 (80,0%) eram produtos aparentemente
normais, aptos ao consumo, enquanto que 19/95 (20,0%) apresentavam sinais de deterioração,
com tufamento, olhaduras, excesso de oleosidade e crescimento de bolores. Entre as amostras
com sinais de deterioração, 11/19 (57,9%) eram de queijo parmesão, 4/19 (21,0%) de
provolone, 1/19 (5,3%) de provolone ralado e 3/19 (15,8%) de parmesão ralado.
Ainda em relação às amostras de queijo, 42/95 (44,2%) foram fabricadas por
indústrias localizadas no Estado de Goiás, 22/95 (23,2%) em São Paulo, 19/95 (20,0%) em
Minas Gerais, 6/95 (6,3%) em Mato Grosso e 6/95 (6,3%) em outros estados (Tocantins e
outros não informados) (Figura 4).
Todas as amostras de leite (32) originaram do Estado de Goiás, sendo oito (25,0%)
de Piracanjuba, seis (18,8%) de Hidrolândia, seis (18,8%) de Inhumas, cinco (15,6%) de
Aragoiânia, três (9,4%) de Professor Jamil, duas (6,2%) de Caturaí, uma (3,1%) de Cromínia
e uma (3,1%) de Goiânia (Figura 5).
31
Goiás
44,2%
São Paulo
23,2%
Minas Gerais
20,0%
Mato Grosso
6,3%
Outros
6,3%
Figura 4. Distribuição das amostras de queijos parmesão e provolone segundo o Estado de
localização das indústrias.
Figura 5. Mapa do Estado de Goiás destacando os Municípios de
procedência das amostras de leite cru.
Fonte: DNIT, 2002. Modificado.
32
4.2 Colheita das amostras
Compuseram a amostragem 36 marcas comerciais de queijos parmesão e provolone.
Durante a colheita tomou-se o cuidado de colher o máximo de marcas existentes no mercado.
As amostras foram colhidas aleatoriamente, levando em consideração o prazo de validade e a
chancela dos Serviços de Inspeção Estadual - SIE, ou Federal - SIF. Tanto as amostras
aparentemente não deterioradas, portanto consideradas aptas para o consumo, como aquelas
com sinais de deterioração, foram colhidas em 15 estabelecimentos do mercado varejista de
Goiânia, na forma como eram comercializadas, ou seja, peça inteira, fracionada ou ralada pela
própria indústria ou pela empresa que comercializava o produto no varejo.
Os queijos foram embalados e/ou re-embalados no período compreendido entre
fevereiro 2006 a janeiro 2007. A data de fabricação corresponde à data de embalagem dos
queijos, após serem submetidos ao período de maturação e a data de re-embalagem ao
processo de fracionamento ou ralação do produto no mercado varejista (Apêndices B, C e D).
As amostras de leite foram colhidas em janeiro de 2007, em 29 propriedades
produtoras de matéria-prima para laticínios e queijarias do Estado de Goiás. A colheita foi
realizada em tanques individuais de refrigeração por expansão direta, armazenados na
propriedade por, no máximo, 48 horas, em temperaturas entre 0,8 e 6,3ºC (Apêndice A).
A colheita seguiu o procedimento recomendado pela Instrução Normativa nº 51/2002
(BRASIL, 2002). Após homogeneização do leite no tanque por, no mínimo, cinco minutos
eram transferidos, com auxílio de uma concha, 50 mL para um frasco de poliproprileno
esterilizado. À amostra não foi adicionado nenhum conservante para evitar interferência na
reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma vez colhidas, as amostras foram identificadas e
acondicionadas em caixas isotérmicas contendo gelo reciclável.
Todas as amostras foram encaminhadas ao Laboratório de Biologia Molecular do
Centro de Pesquisa em Alimentos (CPA/EV/UFG), onde foram imediatamente analisadas.
Após a recepção, foram descaracterizadas por etiqueta adesiva que continha um código de
modo a permitir a análise sem a identificação do nome da empresa em questão.
33
4.3 Detecção Molecular de C. estertheticum
4.3.1 Procedimento de preparo das amostras
A retirada da unidade analítica da cada amostra foi precedida pela sanitização com
etanol a 70%, por um tempo mínimo de 30 segundos, da superfície de cada embalagem
comercial de queijo e dos frascos de polipropileno que continham o leite. Após a sanificação
as embalagens foram abertas assepticamente, pesados cinco gramas de queijo e
homogeneizados em 25 mL de solução salina 0,85%, pH 7,0 (Mallinckrodt Baker) em
Stomacher (Stomacher 400, Seward) por três minutos. O volume de solução salina foi
estipulado em função da quantidade necessária para a perfeita homogeneização. Após um
período de repouso para decantação, fez-se a filtração, sendo utilizado 4 mL do filtrado para
análise.
As amostras de leite foram homogeneizadas em vortex (AP 56, Phoenix) e uma
alíquota de 4 mL utilizada para análise. As amostras foram aquecidas a 80ºC/10 min em
Banho-Maria no intuito de estimular a germinação dos esporos e inativar as células
vegetativas.
A amplificação do DNA genômico foi avaliada nas amostras submetidas ou não ao
pré-enriquecimento em caldo infusão cérebro coração (BHI, Difco).
A) Amostras sem pré-enriquecimento
Volumes de 2 mL do filtrado ou do leite foram utilizados para a extração do DNA
genômico. Após a centrifugação da amostra a 10.000 rpm por 10 min a 4ºC, o sobrenadante
foi lavado com solução salina a 0,85% por no mínimo três vezes para remoção da gordura e
resíduos. O sedimento foi ressuspendido em 400 µL de tampão TE (Tris HCl 10 mM, EDTA
1 mM, pH 8,0).
B) Amostras pré-enriquecidas em caldo BHI
Para o cultivo do microrganismo 2 mL do filtrado ou do leite foram inoculados em
20 mL de caldo BHI pré-reduzido. A incubação foi realizada em jarra de anaerobiose (Gas
Pack
TM
, BD) durante cinco, 10 e 30 dias a 10ºC. Após cada período de incubação, foram
retirados 5 mL da cultura para o processamento das amostras, sendo reposto igual volume de
caldo BHI pré-reduzido. O cultivo foi centrifugado e processado conforme procedimento
descrito anteriormente.
34
4.3.2 Extração do DNA genômico
A extração do DNA genômico foi realizada em conformidade com a metodologia
proposta por van Soolingen et al. (1991), com as seguintes modificações: às amostras
ressuspendidas em TE foram adicionados 150 µL de lisozima (10 mg/mL) (Gibco
Corporation), homogeneizados em vortex e incubados a 37ºC por 24 horas; a lise das células
dos microrganismos foi completada com 70 µL de Dodecylsulfato de Sódio 10% (pH 7,2)
(SDS, Invitrogen), 100 µL de NaCl 5M (Mallinckrodt Baker) e 80 µL de Brometo de
hexadeciltrimetilamônio a 10% (CTAB, ICN Biomedicals), seguido de homogeneização e
incubação a 65ºC/15min. A purificação do DNA genômico foi realizada com
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) (JT Baker) e a precipitação com etanol absoluto
gelado durante 18h a 18ºC. Após centrifugação a 10.000 rpm por 30 minutos à temperatura
ambiente o “pellet” de DNA foi lavado com etanol 70% e submetido à secagem à temperatura
ambiente por duas horas, conforme van Soolingen et al. (1991). Após este período, foi
ressuspendido em 100 µL de tampão TE (pH 8,0).
Para avaliação da qualidade e determinação da concentração, 2 µL de solução de
DNA foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 0,8% em tampão TBE 0,5X, pH 8,0
(Tris-Borato-EDTA) a 80 V/40 min. O λ DNA/Hind III (Invitrogen®) foi utilizado como
padrão de peso molecular (PM). O gel de agarose foi corado com brometo de etídeo
(5 mg/mL), visualizado em transiluminador de luz ultravioleta (UV-25, Hoefer) e fotografado
em câmara digital (Doc Print, Vilber Lourmat).
A concentração de DNA foi estimada por comparação visual com diluições
conhecidas de λ DNA (Invitrogen®). Uma vez determinada a concentração do DNA em
solução, esta foi diluída para 100 ηg/5 µL para a reação de PCR e estocada a -20ºC.
4.3.3 Protocolos para o PCR
A amplificação foi realizada com pares de primers complementares à região
conservada da subunidade 16S do DNA ribossômico. Utilizaram-se os pares revised forward
(RF) e revised reverse (RR) (HELPS; HARBOUR; CORRY, 1999) e 16SEF e 16SER
(BRODA; BOEREMA; BELL, 2003).
O par RF/RR (HELPS; HARBOUR; CORRY, 1999) apresenta as seqüências 5’-
TGA TCG CAT GAT CTT AAC ATC AAA G-3’ e 5’-TCG ACC CCC GAC ACC TAG
TAT T-3’, que se anelam nas posições 173-197 e 813-792, respectivamente, do 16S DNAr da
sequência S46734 (GENBANK, 2007) e formam um produto de PCR de 641 pares de base
(pb), enquanto que o par 16SEF/16SER (BRODA; BOEREMA; BELL, 2003) possui as
35
seqüências 5’-TCG GAA TTT CAC TTT GAG-3’ e 5’-AAG GAC TTC ACT CAT CTC TG-
3’, que anelam nas posições 205-222 e 996-977 do 16S DNAr da sequência S46734
(GENBANK, 2007) e formam um produto de amplificação de 790pb. As concentrações finais
dos reagentes que compuseram as soluções de amplificação com cada par de primers estão
detalhadas na Tabela 2.
Tabela 2. Misturas de reação de amplificação de PCR e concentrações finais de reagentes,
segundo os pares de primers utilizados. Goiânia – GO, 2007.
PARES DE PRIMERS
REAGENTES
RF/RR 16SEF/16SER
Referência Helps, Harbour, Corry (1999) Broda, Boerema, Bell (2003)
Tampão 1x
Tris-HCl, pH 8,3 100 mM 100 mM
KCl 500 mM 500 mM
Solução de DNA 100 ηg 100 ηg
dNTP 0,2 mM 0,2 mM
MgCl
2
1,5 mM 1,5 mM
Primer reverse
0,3 mM 0,5 mM
Primer foward
0,3 mM 0,5 mM
Taq DNA polimerase 2 U 4 U
Volume Total 50 µL 50 µL
Para a amplificação do par RF/RR, a desnaturação inicial foi de 94ºC/5 min,
seguindo-se 40 ciclos de desnaturação a 94ºC/1 min, anelamento a 60ºC/1 min e extensão a
72ºC/1 min, com extensão final de 72ºC/10 min (HELPS; HARBOUR; CORRY, 1999). Para
o par 16SEF/16SER, a desnaturação inicial foi a 93ºC/3 min, seguido de 30 ciclos de
desnaturação a 92ºC/1 min, anelamento a 55ºC/1 min e extensão a 72ºC/3 min com extensão
final a 72ºC/3 min (BRODA; BOEREMA; BELL, 2003).
Os fragmentos de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a
1% em tampão TBE 0,5X, pH 8,0, com corrida a 120 V/40 min. O gel foi corado com
brometo de etídeo (5 mg/mL) e os resultados visualizados em transiluminador de luz
ultravioleta (UV-25, Hoefer). A documentação fotográfica foi realizada com câmara digital
(Doc Print, Vilber Lourmat).
Como controle negativo de reagentes foi utilizada a mistura de reação adotada para
cada par, com substituição do DNA por água ultra-pura. Como controle positivo foi utilizada
36
a cepa de referência adquirida junto à coleção alemã de microrganismos e culturas celulares
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Alemanha), C. estertheticum
DSM 8809
T
. Utilizou-se como padrão de peso molecular (PM) o 100bp DNA Ladder
(Invitrogen).
4.4 Confirmação da identidade dos produtos de amplificação
Visando a confirmação da identidade dos produtos de amplificação obtidos foram
enviadas cinco amostras positivas para C. estertheticum com o par de primers RF/RR e quatro
com o 16SEF/16SER ao Laboratório de Biologia Molecular da Universidade de Brasília
(UNB) para seqüenciamento.
Os produtos de amplificação foram purificados utilizando-se kit comercial
(QIAquick PCR purification kit, Qiagen), e quantificados por comparação visual da
intensidade das bandas com as do Low DNA Mass Ladder (Invitrogen) em gel de agarose a
2% em tampão TBE 0,5X (pH8,0) após coloração com brometo de etídeo (0,6 µg/mL). As
amostras foram analisadas em seqüenciador automático (Megabace 1000, Amersham
Biotech®). As seqüências obtidas foram analisadas em ferramentas de bioinformática Phred,
Phrap e CAP3 e comparadas com as seqüências de referência registradas no BLAST, cujos
números de acesso são S46734 e X68181 (GENBANK, 2007).
4.5 Análise estatística
A análise dos dados referentes à detecção e distribuição do C. estertheticum foi
realizada com base na análise descritiva com distribuição de freqüência conforme Sampaio
(1998).
37
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Detecção de C. estertheticum em leite cru e em queijos
A Tabela 3 apresenta a distribuição de C. estertheticum em amostras de leite cru e de
queijos parmesão e provolone, normais ou com sinais de deterioração, detectado por meio da
técnica de PCR.
Do total de amostras analisadas, 28/127 (22,0%) foram positivas para o C.
estertheticum e 99/127 (78,0%) negativas, independente do procedimento de preparo das
amostras (extração do DNA genômico sem e com pré-enriquecimento) e do par de primers
utilizado para a amplificação. Em leite cru, 11/32 (34,4%) foram positivas e 21/32 (65,5%)
negativas, enquanto que em queijos parmesão e provolone, independente da forma de
apresentação, 17/95 (17,9%) foram positivas e 78/95 (82,1%) negativas (Tabela 3).
Em relação às amostras de queijos considerados normais, portanto aptas para o
consumo, 13/76 (17,1%) foram positivas para o C. estertheticum e 63/76 (82,9%) negativas.
Naquelas com sinais de deterioração, 04/19 (21,0%) foram positivas e 15/19 (78,9%)
negativas para o C. estertheticum (Tabela 3).
Tabela 3. Distribuição de C. estertheticum em amostras de leite cru, queijos normais e
queijos com sinais de deterioração, segundo as fontes de detecção. Goiânia-GO,
2007.
C. estertheticum
(+) (-)
FONTES
N
o
% N
o
%
Leite cru 11/32 34,4 21/32 65,6
Queijos Parmesão e Provolone
(Inteiros, Peças, Fatiados ou Ralados)
17/95 17,9 78/95 82,1
Queijos normais 13/76 17,1 63/76 82,9
Queijos com sinais de deterioração 04/19 21,0 15/19 78,9
Total 28/127 22,0 99/127 78,0
(+) resultado positivo ao PCR. (-) resultado negativo ao PCR. Nº: resultado obtido/amostras analisadas.
38
Analisando os resultados apresentados na Tabela 3 nota-se que o C. estertheticum foi
detectado em todas as fontes pesquisadas, em índices que variam de 17,1% a 34,4%, sendo a
maior ocorrência em leite cru. A elevada ocorrência em amostras de leite cru pode ser
explicada, em parte, pela presença dos esporos de C. estertheticum no solo, no trato
gastrintestinal, em fezes bovinas (BRODA et al., 2002; RAUECKER, 2007), associada à
higienização inadequada dos estábulos e equipamentos, ordenhadeira e/ou tetos antes da
ordenha.
Considerando a forma de apresentação das amostras de queijo analisadas verifica-se
que o C. estertheticum foi detectado em amostras inteiras, fracionadas e raladas, além dos
queijos aparentemente normais e com sinais de deterioração (Tabela 3). A presença de C.
estertheticum em todos os tipos de amostras de queijo analisadas pode estar associada às
várias fontes potenciais de contaminação por esse microrganismo. Devido à ocorrência do
microrganismo em amostras de leite cru, a matéria-prima torna-se uma importante fonte de
contaminação, apesar do tratamento térmico a que o leite e a massa de alguns queijos são
submetidos. Dados da literatura confirmam a resistência térmica dos esporos de C.
estertheticum a 80ºC/10 min (COLLINS et al., 1992). A contaminação da planta industrial
constitui uma fonte em potencial conforme relatado por Broda et al. (2002) e Rauecker (2007)
em ambientes de matadouros-frigoríficos, que também podem ter relação com o manipulador.
Além disso, a condição de anaerobiose que é criada no interior do produto e a temperatura de
maturação a que são submetidos, inferior a 18ºC (SPREER, 1991; BERESFORD et al., 2001)
são favoráveis à germinação do esporo de C. estertheticum.
Até o momento, não havia relato da ocorrência de C. estertheticum em produtos
lácteos no Brasil. No entanto, alguns estudos já comprovaram sua presença em carnes
refrigeradas embaladas a vácuo estando associado ao tufamento das embalagens e
deterioração da carne, e a disseminação no ambiente de matadouros-frigoríficos e em fezes
bovinas no Reino Unido (DAINTY; EDWARDS; HIBBARD, 1989), Nova Zelândia
(BRODA et al., 1996) e no Brasil (MESQUITA et al., 2006, RAUECKER et al., 2006,
RAUECKER, 2007).
Na Tabela 4 pode ser observada a distribuição de C. estertheticum em amostras de
queijos normais e com sinais de deterioração, segundo o tipo de queijo. Em relação ao tipo de
queijo analisado, 4/29 (13,8%) amostras de parmesão, 3/35 (8,6%) de provolone e 10/31
(32,3%) de parmesão e provolone ralados foram positivas, enquanto que 25/29 (86,2%) de
queijo parmesão, 32/35 (91,4%) de provolone e 21/31 (67,7%) de parmesão e provolone
ralados foram negativas.
39
Tabela 4. Distribuição de C. estertheticum em amostras de queijos normais e com sinais de
deterioração, segundo o tipo de queijo. Goiânia-GO, 2007.
C. estertheticum
(+)
(-)
FONTES
N
o
% N
o
%
Queijo Parmesão 04/29 13,8 25/29 86,2
Normal 03/18 16,7 15/18 83,3
Com sinais de deterioração 01/11 9,1 10/11 90,9
Queijo Provolone 03/35 8,6 32/35 91,4
Normal 02/31 6,4 29/31 93,6
Com sinais de deterioração 01/04 25,0 03/04 75,0
Queijos Parmesão e Provolone Ralados 10/31 32,3 21/31 67,7
Normal 08/27 29,6 19/27 70,4
Com sinais de deterioração 02/04 50,0 02/04 50,0
TOTAL 17/95 17,9 78/95 82,1
(+) resultado positivo ao PCR. (-) resultado negativo ao PCR. Nº: resultado obtido/amostras analisadas.
Quando se considerou o estado de conservação, o queijo parmesão normal
apresentou 3/18 (16,7%) amostras positivas, enquanto que no com sinal de deterioração
observou-se apenas 1/11 (9,1%) positiva. Por outro lado, em queijo provolone normal foram
observadas 2/31 (6,4%) amostras positivas e no com sinal de deterioração apenas 1/4 (25,0%)
positiva. Em queijos parmesão e provolone ralados normais foram verificadas 8/27 (29,6%)
amostras positivas e nos dois tipos de queijos ralados com sinais de deterioração 2/4 (50,0%)
positivas (Tabela 4).
A maior freqüência de ocorrência foi observada em queijos parmesão e provolone
ralados (32,3%). Apesar dos queijos ralados serem comercializados em embalagens
permeáveis ao oxigênio, o microrganismo pôde ser encontrado, pois sua forma esporulada
pode sobreviver em condições de aerobiose e anaerobiose facultativa. Além disso, o alto
percentual verificado pode ser atribuído, em parte, por um controle higiênico inadequado na
indústria ou rede de distribuição, conforme mencionado anteriormente. A condição de origem
do queijo destinado a ralação pode justificar sua contaminação, ou seja, algumas indústrias ou
estabelecimentos varejistas quando detectam algum sinal de deterioração no produto final ou
ao longo da maturação destina-os à ralação. Os queijos ainda podem ser contaminados pelo
40
manipulador, pois o processo de ralação exige manipulação do produto, o que aumenta a
probabilidade de contaminação pelo manipulador, equipamentos de ralação e contaminação
cruzada entre queijos.
Relativamente ao estado de conservação (Tabela 4), o microrganismo está presente
nos queijos normais e nos queijos com sinais de deterioração, mas a maior freqüência foi
observada nos queijos ralados com sinais de deterioração (50,0%) e nos normais (29,6%). O
queijo provolone com sinal de deterioração apresentou positividade de 25,0%. Queijos
ralados, tanto com sinais de deterioração quanto normais apresentaram maior positividade,
provavelmente pelos mesmos motivos citados anteriormente. Isto reforça a constatação de que
o processo de ralação eleva a contaminação devido a maior manipulação do produto e contato
com uma variedade de superfícies e equipamentos.
A elevada positividade de C. estertheticum nas amostras de provolone com sinal de
deterioração pode ser explicada, em parte, pelo seu processamento tecnológico, pois os
tratamentos térmicos a que são submetidos o leite (pasteurização) e a massa (filagem), são
insuficientes para eliminarem os esporos, além de eliminarem grande parte da microbiota
competidora para o C. estertheticum. O fato do período de maturação do queijo provolone ser
inferior ao do parmesão e à condição de que as indústrias estão reduzindo ao máximo o
período de maturação dos queijos podem contribuir para que o mesmo seja encontrado com
sinais de deterioração no mercado varejista, pois o curto tempo de maturação pode ser
insuficiente para germinação dos esporos ainda na indústria.
5.2 Detecção de C. estertheticum segundo os pares de primers e as fontes
Na Tabela 5 estão distribuídos os dados relativos à detecção de C. estertheticum em
amostras de leite cru e de queijos parmesão e provolone, segundo os pares de primers
utilizados no PCR. A Figura 6 refere-se a uma eletroforese em gel de agarose a 1,0% de
produtos de amplificação detectados com os pares de primers RF/RR e 16SEF/16SER do
gene 16S rDNA do C. estertheticum detectado em amostras de leite cru e queijo parmesão e
provolone.
Das amostras positivas de leite cru detectadas neste trabalho, 20/127 (15,7%) foram
positivas e 107/127 (84,3%) negativas quando se utilizou o par de primers RF/RR, enquanto
10/127 (7,9%) foram positivas ao par 16SEF/16SER e 117/127 (92,1%) negativas (Tabela 5).
41
Ambos os pares de primers utilizados permitiram detectar C. estertheticum, embora a maior
eficiência tenha sido apresentada pelo par RF/RR em todas as fontes analisadas.
Com relação às fontes analisadas o leite cru apresentou 7/32 (21,9%) amostras
positivas com o par RF/RR e 5/32 (15,6%) com 16SEF/16SER e, os queijos, 13/95 (13,7%)
positivas com o par RF/RR e 5/95 (5,3%) com 16SEF/16SER. Nas amostras de queijo
parmesão foram detectados 4/29 (13,8%) resultados positivos, sendo 3/29 (10,3%) com o par
RF/RR e 1/29 (3,4%) com o 16SEF/16SER. Já nas amostras de provolone, 3/35 (8,6%)
resultados foram positivos, sendo duas com o par RF/RR e uma com 16SEF/16SER. Já nos
queijos parmesão e provolone ralados, das dez amostras positivas neste trabalho, 8/31
(25,8%) foram identificadas com a amplificação com o par RF/RR e 3/31 (9,7%) com
16SEF/16SER.
Estes resultados evidenciam uma baixa eficiência do par 16SEF/16SER
comparativamente ao outro par de primers utilizado para detecção de C. estertheticum nas
fontes estudadas. De forma semelhante, Rauecker (2007) também obteve menor número de
amostras positivas ao utilizar o 16SEF/16SER para detecção de C. estertheticum em carne
bovina refrigerada embalada a vácuo, além de amostras de ambiente, equipamentos de
matadouros-frigoríficos e fezes bovinas.
.
42
Tabela 5. Detecção de C. estertheticum em leite cru e em queijos parmesão e provolone, segundo os pares de primers utilizados para
amplificação. Goiânia-GO, 2007.
Par RF/RR Par 16SEF/16SER
(+) (-) (+) (-)
FONTES
Nº % Nº % Nº % Nº %
Leite Cru 07/32 21,9 25/32 78,1 05/32 15,6 27/32 84,4
Queijos 13/95 13,7 82/95 86,3 05/95 5,3 90/95 94,7
Parmesão 03/29 10,3 26/29 89,7 01/29 3,4 28/29 96,6
Provolone 02/35 5,7 33/35 94,3 01/35 2,9 34/35 97,1
Parmesão e Provolone Ralado 08/31 25,8 23/31 74,2 03/31 9,7 28/31 90,3
TOTAL 20/127 15,7 107/127 84,3 10/127 7,9 117/127 92,1
(+) resultado positivo ao PCR. (-) resultado negativo ao PCR. Nº: resultado obtido/amostras analisadas.
43
Figura 6. Eletroforese em gel de agarose a 1,0% de produtos de C. estertheticum em amostras
de leite cru e queijos parmesão e provolone, com os pares de primers RF/RR
(641pb) e 16SEF/16SER (790pb). Canaletas 01 e 11 padrão de peso molecular
(100bp DNA Ladder); 02 e 10 controles positivos (DSM 8809); 03 amostra
positiva para o par 16SEF/16SER; 04 e 05 controle negativo para o par
16SEF/16SER; 06 controle negativo para o par RF/RR; 07 a 09 amostras positivas
para o par RF/RR.
44
Nas Figuras 7 e 8 estão apresentadas as distribuições de C. estertheticum segundo o
uso individual, simultâneo e independente dos pares de primers empregados na reação de
PCR, no total de amostras analisadas e em cada fonte analisada, respectivamente. Com o par
RF/RR foram detectadas 20/127 (15,7%) das amostras positivas enquanto que com o par
16SEF/16SER, 10/127 (7,9%). Apenas 2/127 (1,6%) amostras apresentaram resultados
positivos com o uso simultâneo dos dois pares de primers, porém quando os mesmos pares
foram empregados de forma independente foram detectadas 28/127 (22,0%) amostras
positivas (Figura 7).
Essa diferença de detecção dos pares de primers utilizados na detecção de C.
estertheticum em amostras de leite cru e de queijos parmesão e provolone pode ser explicada,
em parte, pela diferença de sensibilidade dos pares de primers, onde o par RF/RR mostrou-se
mais sensível à concentração e degradação do DNA extraído para amplificação, o que
também foi verificado por Rauecker (2007). Desta forma, justifica-se a associação de pares de
primers na detecção do microrganismo por PCR.
Considerando as fontes analisadas, apenas 1/32 (3,1%) amostra de leite cru e 1/31
(3,2%) de queijo parmesão e provolone ralados foram positivas simultaneamente com os dois
pares. Porém ao associá-los, mas mantendo a independência entre eles, proporcionaram os
seguintes resultados positivos 11/32 (34,4%) para leite cru, 4/29 (13,8%) para queijo
parmesão, 3/35 (8,6%) para queijo provolone e, 10/31 (32,3%) para queijos parmesão e
provolone ralados (Figura 8).
Quando se considera os resultados obtidos com o uso individual de cada par de
primers, verifica-se a maior positividade para o par RF/RR, como discutido anteriormente. No
entanto, ao analisar os resultados obtidos com o uso simultâneo dos dois pares, não se observa
o efeito desejado de aumentar o número de amostras positivas. Isto provavelmente se deve à
sensibilidade de cada par de primers utilizados e provável diferentes genogrupos nas
amostras.
A totalidade de amostras positivas detectadas neste trabalho foi obtida apenas com a
amplificação com ambos os pares de primers. Os resultados aqui descritos revelam a
necessidade de se realizar a amplificação de amostras para detecção de C. estertheticum com
mais de um par de primers para aumentar a sensibilidade da técnica, conforme já verificado
por Rauecker (2007). Desta forma, considerando os resultados obtidos sugere-se a associação
entre pares de primers com o intuito de reduzir o número de resultados falso-negativos,
permitindo a identificação da totalidade de amostras positivas, melhorando a sensibilidade do
método de detecção.
45
0
5
10
15
20
25
Total de amostras
RF/RR individual 16SEF/16SER individual
RF/RR e 16SEF/16SER simultâneo RF/RR e 16SEF/16SER independente
Figura 7. Distribuição de C. estertheticum no total de amostras analisadas, segundo o uso
individual, simultâneo e independente dos pares de primers RF/RR e
16SEF/16SER.
0
5
10
15
20
25
30
35
Leite cru Queijo Parmesão Queijo Provolone Queijo Ralado
RF/RR individual 16SEF/16SER individual
RF/RR e 16SEF/16SER simultâneo RF/RR e 16SEF/16SER independente
Figura 8. Distribuição de C. estertheticum em amostras de leite cru e queijos parmesão e
provolone, segundo o uso individual, simultâneo e independente dos pares de
primers RF/RR e 16SEF/16SER.
46
5.3 Avaliação do efeito do pré-enriquecimento não seletivo na detecção de C.
estertheticum pela técnica de PCR
Na Tabela 6 estão distribuídos os dados relativos à detecção de C. estertheticum em
amostras de leite cru e queijos parmesão e provolone pré- enriquecidas e sem enriquecimento.
No Quadro 1 estão relacionadas as amostras positivas para C. estertheticum, segundo a fonte,
aspecto do produto, pares de primers utilizados e períodos de pré-enriquecimento.
De 28/127 (22,0%) amostras positivas (Tabela 3), 5/127 (3,9%) foram detectadas
quando a extração do DNA genômico foi realizada sem pré-enriquecimento e 26/127 (20,5%)
quando o pré-enriquecimento não seletivo foi empregado no processo de extração (Tabela 6).
Quando se considera a totalidade das amostras analisadas e as diferentes fontes analisadas,
verifica-se que a maior positividade foi obtida nas amostras submetidas ao pré-
enriquecimento. Para amostras de leite cru, 2/32 (6,3%) foram positivas sem pré-
enriquecimento e 9/32 (28,1%) quando pré-enriquecidas. Em queijos, 3/95 (3,2%) foram
positivas sem pré-enriquecimento e 17/95 (17,9%) quando pré-enriquecidas.
Considerando somente as amostras de queijos, o parmesão só apresentou resultado
positivo quando submetido ao pré-enriquecimento, 4/29 (13,8%), enquanto que o provolone
apresentou 2/35 (5,7%) amostras positivas sem pré-enriquecimento e 3/35 (8,6%) quando pré-
enriquecidas. Nos queijos parmesão e provolone ralados, 1/31 (3,2%) amostra foi positiva
sem pré-enriquecimento e 10/31 (32,3%) quando pré-enriquecidas.
O pré-enriquecimento não seletivo em caldo BHI, sob anaerobiose, elevou o
percentual de positividade das amostras. Das amostras positivas apenas três foram positivas
quando submetidas à extração do DNA genômico com e sem pré-enriquecimento, PR22,
PR26 e RA09, e apenas duas amostras foram positivas sem pré-enriquecimento, LC11 e LC25
(Quadro 01).
O PCR realizado com DNA extraído de amostras pré-enriquecidas detecta, além de
células injuriadas e mortas, maior porcentagem de células vivas (HILL, 1996), fato que
justifica a maior positividade em amostras pré-enriquecidas, pois permite a revigoração das
células injuriadas. Além disso, devido ao tratamento térmico de 80ºC por 10minutos, os
esporos são estimulados a germinarem, o que explica, em parte, a maior porcentagem de
amostras positivas quando pré-enriquecidas. Vale ressaltar que no pré-enriquecimento o
microrganismo se multiplica, eliminando resultados falso-negativos, devido ao aumento do
número de células viáveis. Desta forma, o pré-enriquecimento foi importante para a detecção
de C. estertheticum em amostras de leite cru e de queijos parmesão e provolone.
47
Tabela 6. Detecção de C. estertheticum em amostras de leite cru e queijos parmesão e provolone pré-enriquecidas e não enriquecidas. Goiânia-
GO, 2007.
Sem pré-enriquecimento Pré-enriquecidas
(+) (-) (+) (-)
FONTES
Nº % Nº % Nº % Nº %
Leite Cru 02/32 6,3 30/32 93,7 09/32 28,1 23/32 71,9
Queijos 03/95 3,2 92/95 96,8 17/95 17,9 78/95 82,1
Parmesão 00/29 0,0 29/29 100,0 04/29 13,8 25/29 86,2
Provolone 02/35 5,7 33/35 94,3 03/35 8,6 32/35 91,4
Parmesão e Provolone Ralado 01/31 3,2 30/31 96,8 10/31 32,3 21/31 67,7
TOTAL 05/127 3,9 122/127 96,1 26/127 20,5 101/127 79,5
(+) resultado positivo ao PCR. (-) resultado negativo ao PCR. Nº: resultado obtido/amostras analisadas.
48
Quadro 1. Relação das amostras positivas para C. estertheticum, segundo a fonte, aspecto do
produto, pares de primers utilizados na amplificação e período de pré-
enriquecimento.
Sem 5 dias 10 dias 30 dias Sem 5 dias 10 dias 30 dias
LC04N--+----+
LC05N--+-----
LC10N-------+
LC11N----+---
LC12N-----+++
LC21N---+----
LC22N--++----
LC25N----+---
LC27N-+------
LC29N-+++----
LC30N-+------
PA03 N
------++
PA11N--+-----
PA17N--+-----
PA18D-+++----
PR21N--+-----
PR22D++++ ----
PR26N----++--
RA04N---+----
RA06N--+-----
RA09N+------+
RO15D---+----
RA20N--++----
RA23N-+++----
RA24N-----+--
RA25N--++----
RA30D------+-
RA31N--++----
2614113335
N: normal. D: com sinais de deterioração
RF/RR 16SEF/16SER
Pré-enriquecimento Pré-enriquecimento
TOTAL
Leite Cru
Queijo Parmesão
Queijo Provolone
Queijo Parmesão (RA) e Provolone (RO) Ralado
Amostra Aspecto
do
produto
C. estertheticum
49
5.4 Avaliação dos períodos de incubação na detecção de C. estertheticum por meio
da técnica de PCR
A freqüência de C. estertheticum em amostras de leite cru e queijos parmesão e
provolone submetidas ao pré-enriquecimento em caldo não seletivo, segundo os períodos de
incubação está apresentada na Tabela 7.
Aos cinco dias, 9/127 (7,1%) amostras foram positivas para C. estertheticum,
enquanto que aos 10 e 30 dias, 17/127 (13,4%) e 16/127 (12,6%), respectivamente (Tabela 7).
Considerando o total de amostras analisadas, pode-se afirmar que as pré-enriquecidas por 10
dias e 30 dias apresentaram o maior percentual de positividade.
Para as amostras de leite cru a freqüência de positividade pouco variou em função
dos períodos de incubação, ou seja, 4/32 (12,5%) foram positivas aos cinco dias de incubação,
5/32 (15,6%) aos 10 dias e 6/32 (18,7%) aos 30 dias (Tabela 7). Destas amostras, duas (LC12
e LC29) foram positivas em todos os períodos de incubação analisados e uma (LC22) aos 10 e
30 dias de incubação (Quadro 1).
Para as amostras de queijo parmesão e provolone a freqüência de positividade
observada foi de 5/95 (5,3%) aos cinco dias de incubação, 12/95 (12,6%) aos 10 dias e 10/95
(10,5%) aos 30 dias (Tabela 7). Aos cinco dias, 1/29 (3,4%) amostra foi positiva para o queijo
parmesão, 2/35 (5,7%) para o provolone e 2/31 (6,5%) para os queijos parmesão e provolone
ralados. Aos 10 dias, 4/29 (13,8%) foram positivas para o queijo parmesão, 2/35 (5,7%) para
o provolone e 6/31 (19,4%) para os queijos parmesão e provolone ralados. Aos 30 dias, 2/29
(6,9%) foram positivas para o queijo parmesão, 1/35 (2,9%) para o provolone e 7/31 (22,6%)
para os queijos parmesão e provolone ralados (Tabela 7). Das amostras de queijos, três
(PA18, PR22 e RA23) foram positivas em todos os períodos de incubação analisados e quatro
(PA03, RA20, RA25 e RA31) aos 10 e 30 dias de incubação (Quadro 1).
Ao analisar os resultados verifica-se que a detecção de C. estertheticum em amostras
de leite cru e queijos parmesão e provolone requer períodos de incubação maiores que cinco
dias, sendo aconselhável, períodos entre 10 e 30 dias. No entanto, não se sabe a sensibilidade
da técnica de PCR na detecção do C. estertheticum nos tipos de amostras analisadas, pois em
períodos superiores a 30 dias de incubação pode ocorrer degradação do DNA genômico e
interferir na reação podendo levar a um resultado falso-negativo.
50
Tabela 7. Detecção de C. estertheticum em amostras de leite cru e queijos parmesão e provolone submetidas ao pré-enriquecimento em caldo
não seletivo, segundo os períodos de incubação. Goiânia-GO, 2007.
5 dias 10 dias 30 dias
(+) (-) (+) (-) (+) (-)
FONTES
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
Leite Cru 04/32 12,5 28/32 87,5 05/32 15,6 27/32 84,4 06/32 18,7 26/32 81,3
Queijos 05/95 5,3 90/95 94,7 12/95 12,6 83/95 87,4 10/95 10,5 85/95 89,5
Parmesão 01/29 3,4 28/29 96,6 04/29 13,8 25/29 86,2 02/29 6,9 27/29 93,1
Provolone 02/35 5,7 33/35 94,3 02/35 5,7 33/35 94,3 01/35 2,9 34/35 97,1
Parmesão e Provolone Ralado 02/31 6,5 29/31 93,5 06/31 19,4 25/31 80,6 07/31 22,6 24/31 77,4
TOTAL 09/127 7,1 118/127 92,9 17/127 13,4 110/127 86,6 16/127 12,6 111/127 87,4
(+) resultado positivo ao PCR. (-) resultado negativo ao PCR. Nº: resultado obtido/amostras analisadas.
51
A freqüência de C. estertheticum em amostras de leite cru e de queijos parmesão e
provolone submetidas ou não ao pré-enriquecimento em caldo não seletivo, segundo os
períodos de incubação e os pares de primers utilizados na amplificação do DNA genômico
pode ser vista na Tabela 8.
O par de primers RF/RR detectou 2/127 (1,6%) amostras positivas quando não
submetidas ao pré-enriquecimento não seletivo, 6/127 (4,7%) quando pré enriquecidas
durante cinco dias de incubação, 14/127 (11,1%) durante 10 dias e 11/127 (8,7%) durante 30
dias. Já o par 16SEF/16SER detectou 3/127 (2,4%) amostras positivas não pré-enriquecidas e
pré-enriquecidas durante cinco e 10 dias, e 5/127 (3,9%) pré-enriquecidas durante 30 dias.
Em relação às amostras de leite cru, o par de primers RF/RR não detectou nenhuma
positiva quando a extração foi realizada sem pré-enriquecimento. Mas, foi capaz de detectar
3/32 (9,4%) amostras positivas durante cinco dias de incubação, 4/32 (12,5%) durante 10 dias
e 3/32 (9,4%) durante 30 dias (Tabela 8). Destas, uma amostra (LC29) foi positiva em todos
os períodos de incubação analisados, e uma (LC22) durante 10 e 30 dias de incubação
(Quadro 1).
Quando se analisou a eficiência do par RF/RR, em queijos, 2/95 (2,1%) amostras
foram positivas sem pré-enriquecimento, 3/95 (3,2%) durante cinco dias de incubação, 10/95
(10,5%) durante 10 dias e 8/95 (8,4%) durante 30 dias (Tabela 8). Destas amostras, uma
(PR22) apresentou resultado positivo quando submetida à extração de DNA genômico sem e
com pré-enriquecimento em todos os períodos de incubação analisados. Duas amostras (PA18
e RA23) foram positivas em todos os períodos de incubação analisados e três (RA20, RA25 e
RA31) durante 10 e 30 dias de incubação (Quadro 1).
O par RF/RR apresentou maior porcentagem de amostras positivas com pré-
enriquecimento durante 10 dias, sendo que três amostras (LC21, RA04 e RO15) foram
positivas apenas quando submetidas a 30 dias de incubação. Desta forma, recomenda-se a
utilização do par de primers RF/RR em amostras de leite cru e queijos parmesão e provolone
associada ao pré-enriquecimento das mesmas por um período de 10 dias.
Quando o par 16SEF/16SER foi considerado, as amostras sem pré-enriquecimento
apresentaram os seguintes resultados positivos 2/32 (6,3%) em leite cru e 1/95 (1,1%) em
queijos. Aos cinco e 10 dias de incubação, 1/32 (3,1%) em leite cru e 2/95 (2,1%) em queijos
foram positivas, enquanto que 3/32 (9,4%) em leite cru e 2/95 (2,1%) em queijos foram
positivas aos 30 dias de incubação (Tabela 8). Destas amostras, uma (PR26) apresentou
resultados positivos quando submetida à extração de DNA genômico sem e com pré-
52
enriquecimento aos cinco dias de incubação, uma (LC12) em todos os períodos de incubação
analisados e uma (PA03) aos 10 e 30 dias de incubação (Quadro 1).
Os resultados obtidos com o par 16SEF/16SER não permitiram eleger um período
ótimo de enriquecimento para detecção de C. estertheticum nas amostras analisadas. No
entanto, notou-se que esse par apresenta menor sensibilidade na detecção do microrganismo
em detrimento da quantidade de microrganismo presente ou do grau de degradação do DNA
extraído. Desta forma, recomenda-se que ao empregar este par em amostras de leite cru e
queijos parmesão e provolone, seja utilizado um período de incubação de 30 dias ou mais na
detecção do C. estertheticum.
53
Tabela 8. Freqüência de C. estertheticum em amostras de leite cru e de queijos parmesão e provolone, sem e com pré-enriquecimento, segundo
os pares de primers utilizados na amplificação e os períodos de incubação. Goiânia-GO, 2007.
Par RF/RR Par 16SEF/16SER
Pré-enriquecimento Pré-enriquecimento
Sem 5 dias 10 dias 30 dias Sem 5 dias 10 dias 30 dias
FONTES
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
Leite Cru 00/32 0,0 03/32 9,4 04/32 12,5 03/32 9,4 02/32 6,3 01/32 3,1 01/32 3,2 03/32 9,4
Queijos 02/95 2,1 03/95 3,2 10/95 10,5 08/95 8,4 01/95 1,1 02/95 2,1 02/95 2,1 02/95 2,1
Parmesão 00/29 0,0 01/29 3,4 03/29 10,4 01/29 3,4 00/29 0,0 00/29 0,0 01/29 3,4 01/29 3,4
Provolone 01/35 2,9 01/35 2,9 02/35 5,7 01/35 2,9 01/35 2,9 01/35 2,9 00/35 0,0 00/35 0,0
Parmesão
e Provolone
Ralado
01/31 3,2 01/31 3,2 05/31 16,1 06/31 19,4 00/31 0,0 01/31 3,2 01/31 3,2 01/31 3,2
TOTAL
02/127 1,6 06/127 4,7 14/127 11,1 11/127 8,7 03/127 2,4 03/127 2,4 03/127 2,4 05/127 3,9
(+) resultado positivo ao PCR. (-) resultado negativo ao PCR. Nº: resultado obtido/amostras analisadas.
54
5.5 Distribuição de C. estertheticum segundo os estabelecimentos de procedência e a
origem geográfica das amostras
Na Tabela 9 encontra-se a distribuição de C. estertheticum em amostras de leite cru e
de queijos parmesão e provolone segundo os Estados de procedência. Do total de 127
amostras analisadas, 16/74 (21,6%) amostras positivas foram detectadas em Goiás, 3/19
(15,8%) em Minas Gerais, 7/22 (31,8%) em São Paulo, 1/6 (16,7%) em Mato Grosso, 0/1
(0,0%) em Tocantins e 1/5 (20,0%) em Estado não identificado.
No Estado de Goiás, 2/11 (18,2%) amostras positivas para C. estertheticum foram
detectadas em queijo parmesão, 1/20 (5,0%) em provolone, 2/11 (18,2%) em queijos
parmesão e provolone ralados e 11/32 (34,4%) em leite cru. Em relação ao Estado de Minas
Gerais, nenhuma amostra de queijo parmesão apresentou resultado positivo, mas 1/8 (12,5%)
de queijo provolone e 2/4 (50,0%) de parmesão e provolone ralados foram positivas. Para São
Paulo, 1/5 (20,0%) amostra de queijo parmesão e de provolone e 5/12 (41,7%) desses queijos
ralados foram positivas. Para o Estado de Mato Grosso e as amostras não identificadas apenas
1/2 (50,0%) amostra de queijo parmesão e provolone ralado e 1/3 de parmesão foram
positivas, respectivamente.
Apesar da detecção de C. estertheticum em amostras provenientes dos Estados de
Goiás, Minas Gerais, São Paulo e Mato Grosso serem importantes para avaliar a disseminação
do microrganismo no país, estes resultados não são suficientes para classificar os Estados de
acordo com os percentuais observados, devido ao baixo número de amostra dos Estados de
Mato Grosso e Tocantins e a ausência de identificação do Estado de origem de alguns queijos.
No estudo conduzido por Rauecker (2007), o C. estertheticum também foi detectado
em cortes cárneos embalados a vácuo, em amostras de ambientes e equipamentos de
matadouros-frigoríficos e de fezes bovinas nos Estados do Mato Grosso do Sul, Pará, Minas
Gerais, Goiás, São Paulo, Mato Grosso, Acre e Bahia.
Assim considerando, os resultados obtidos são preocupantes, pois independente do
número de amostras positivas, a presença do microrganismo que durante a ordenha e/ou
processamento de queijos houve contaminação de origem ambiental ou fecal, pode provocar
contaminação do produto processado.
55
Tabela 9. Distribuição de C. estertheticum em amostras de leite cru e de queijos parmesão e provolone produzidos e/ou comercializados em
Goiânia, Goiás, no período de fevereiro/2006 a janeiro/2007, segundo os Estados de origem. Goiânia-GO, 2007.
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
Queijo Parmesão 2/11 18,2 0/7 0,0 1/5 20,0 0/3 0,0 0/0 0,0 1/3 33,3
Queijo Provolone 1/20 5,0 1/8 12,5 1/5 20,0 0/1 0,0 0/1 0,0 0/0 0,0
Queijo Ralado 2/11 18,2 2/4 50,0 5/12 41,7 1/2 50,0 0/0 0,0 0/2 0,0
Leite cru 11/32 34,4 0/0 0,0 0/0 0,0 0/0 0,0 0/0 0,0 0/0 0,0
TOTAL 16/74 21,6 3/19 15,8 7/22 31,8 1/6 16,7 0/1 0,0 1/5 20,0
FONTES
ORIGEM GEOGRÁFICA
GO MG SP MT TO Não Identificado
(+) resultado positivo ao PCR. (-) resultado negativo ao PCR. Nº: resultado obtido/amostras analisadas.
56
A Figura 9 apresenta a distribuição de C. estertheticum no total de amostras de leite
cru, segundo os municípios goianos de colheita. Nota-se que em 21/32 (65,6%) amostras, o C.
estertheticum não foi detectado, mas o microrganismo estava presente em amostras colhidas
nos municípios de Piracanjuba, Hidrolândia, Inhumas e Professor Jamil. Assim como
comentado anteriormente para os queijos, os percentuais de positividade nos municípios de
colheita das amostras de leite não são relevantes, mas sim a detecção revelando a
contaminação da matéria-prima na fonte de produção. Vale ressaltar que Broda et al. (2002) e
Rauecker (2007) detectaram C. estertheticum na pele e fezes de bovinos e, ainda no solo, o
que pode ser um indicativo da contaminação do leite no momento da ordenha, seja por
contaminação ambiental ou por falhas na higienização do úbere da vaca no momento da
ordenha.
A presença do microrganismo em leite cru preocupa sobremaneira devido à
resistência do esporo ao tratamento térmico a 80ºC por 10 minutos (COLLINS et al., 1992)
podendo permitir seu aparecimento em queijos, como verificado no presente estudo, bem
como em outros produtos lácteos.
Ausência
65,6%
Piracanjuba
12,5%
Hidrolândia
12,5%
Inhumas
6,3%
Professor Jamil
3,1%
Figura 9. Distribuição de C. estertheticum detectados por PCR segundo os Municípios
goianos de colheita das amostras de leite cru. Goiânia-GO, 2007.
57
5.6 Confirmação da identidade dos produtos de amplificação
Os produtos de amplificação purificados (Figura 10) obtidos com os pares RF/RR e
16SEF/16SER encaminhados para seqüenciamento foram parcialmente seqüenciados. Dos
produtos obtidos com o par RF/RR foram seqüenciados 122pb dos 641pb (19,0%), e os
obtidos com o 16SEF/16SER foram seqüenciados 135pb dos 790pb (17,0%).
Ao comparar os resultados obtidos das seqüências obtidas com as seqüências de
referência depositadas no banco de dados do GenBank (GENBANK, 2007), foram verificados
99,0% de homologia com C. estertheticum para ambos os pares utilizados. Para o par RF/RR,
a seqüência obtida foi similar às cepas de referência cujos números de acesso são S46734
(Figura 11) e X68181 (Figura 12) e para o par 16SEF/16SER a seqüência apresentou
similaridade com a cepa de número X68181 (Figura 13). No entanto, outros microrganismos
apresentaram similaridade, mas nenhum deles com determinantes de deterioração de leite e
queijos.
Figura 10. Concentração de amplicons de C.
estertheticum. Canaleta 1 padrão de
peso molecular Low DNA Mass
Ladder, 2 amplicon de 790 pb (par
16SEF/16SER e 3 amplicon de 641 pb
(par RF/RR).
641 pb
790 pb
58
16S rRNA [Clostridium estertheticum, NCIMB 12511, rRNA, 1427
nt]
Length=1427
Score = 220 bits (119), Expect = 6e-55
Identities = 121/122 (99%), Gaps = 0/122 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 1 CTCAGCGTCAGTTACAGTCCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCTAATCTCTA 60
|||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 730 CTCAGCGTCAGTTACAGTCCAGTAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCTAATCTCTA 671
Query 61 CGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCACTTACCTCTCCTGCACTCTAGACACCCAGTT 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 670 CGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCACTTACCTCTCCTGCACTCTAGACACCCAGTT 611
Query 121 TC 122
||
Sbjct 610 TC 609
Figura 11. Homologia de 99% resultante do alinhamento no programa BLAST (GENBANK, 2007)
entre o resultado do seqüenciamento e a seqüência de referência para C. estertheticum (nº
de acesso S46734) realizada com o par de primers RF/RR (HELPS; HARBOUR; CORRY,
1999).
C.estertheticum (NCIMB12511) rrn gene for 16S rRNA
Length=1435
Score = 220 bits (119), Expect = 6e-55
Identities = 121/122 (99%), Gaps = 0/122 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 1 CTCAGCGTCAGTTACAGTCCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCTAATCTCTA 60
|||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 738 CTCAGCGTCAGTTACAGTCCAGTAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCTAATCTCTA 679
Query 61 CGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCACTTACCTCTCCTGCACTCTAGACACCCAGTT 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 678 CGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCACTTACCTCTCCTGCACTCTAGACACCCAGTT 619
Query 121 TC 122
||
Sbjct 618 TC 617
Figura 12. Homologia de 99% resultante do alinhamento no programa BLAST (GENBANK, 2007)
entre o resultado do seqüenciamento e a seqüência de referência para C. estertheticum (nº
de acesso X68181) realizada com o par de primers RF/RR (HELPS; HARBOUR;
CORRY, 1999).
59
C.estertheticum (NCIMB12511) rrn gene for 16S rRNA
Length=1435
Score = 244 bits (132), Expect = 4e-62
Identities = 134/135 (99%), Gaps = 0/135 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 1 TCCCCACGCTTTCATGCCTCAGCGTCAGTTACAGTCCAGTAAGTCGCCTTCGCCACTGGT 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 755 TCCCCACGCTTTCATGCCTCAGCGTCAGTTACAGTCCAGTAAGTCGCCTTCGCCACTGGT 696
Query 61 GTACTTCCTAATCTCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCACTTACCTCTCCTGC 120
|| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 695 GTTCTTCCTAATCTCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCACTTACCTCTCCTGC 636
Query 121 ACTCTAGACACCCAG 135
|||||||||||||||
Sbjct 635 ACTCTAGACACCCAG 621
Figura 13. Homologia de 99% resultante do alinhamento no programa BLAST (GENBANK, 2007)
entre o resultado do seqüenciamento e a seqüência de referência para C. estertheticum (nº
de acesso X68181) realizada com o par de primers 16SEF/16SER (BRODA;
BOEREMA; BELL, 2003)
60
6. CONCLUSÕES
Em função dos resultados obtidos pode-se concluir que:
• O C. estertheticum foi detectado em amostras de leite cru e em queijos parmesão e
provolone.
• O microrganismo foi detectado com maior eficiência, por meio da técnica de PCR,
quando as amostras foram submetidas à extração do DNA genômico após pré-
enriquecimento não seletivo.
• Para o par RF/RR o período de 10 dias de incubação revelou ser o mais adequado na
detecção do microrganismo nas amostras analisadas.
• A associação dos pares de primers RF/RR e 16SEF/16SER revelou maior eficiência
na detecção de amostras positivas em leite cru e queijos parmesão e provolone.
• O C. estertheticum foi detectado em amostras de queijos parmesão e provolone
provenientes dos Estados de Goiás, Minas Gerais, São Paulo e Mato Grosso,
indicando sua disseminação no país.
• O microrganismo também foi detectado em amostras de leite cru colhidas nos
Municípios de Piracanjuba, Hidrolândia, Inhumas e Professor Jamil, do Estado de
Goiás.
61
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66
APÊNDICE A Relação das amostras de leite cru, segundo a temperatura do tanque de
refrigeração por expansão direta, o município de procedência e resultados do PCR de acordo
com os pares de primers utilizados.
Sem pré-
enriquecimento
Pré-
enriquecimento
Sem pré-
enriquecimento
Pré-
enriquecimento
LC013,4ºCCaturaí----
LC026,3ºCCaturaí----
LC032,2ºCInhumas----
LC04 5,8ºC Inhumas - + - +
LC05 4,8ºC Inhumas - + - -
LC065,1ºCGoiânia----
LC073,0ºCInhumas----
LC082,8ºCInhumas----
LC091,6ºCInhumas----
LC10 3,2ºC Prof. Jamil - - - +
LC11 4,1ºC Hidrolândia - - + -
LC12 1,8ºC Hidrolândia - - - +
LC133,2ºCCromínia----
LC144,3ºCHidrolândia----
LC153,2ºCAragoiânia----
LC165,2ºCAragoiânia----
LC175,3ºCAragoiânia----
LC183,9ºCAragoiânia----
LC194,4ºCAragoiânia----
LC204,4ºCHidrolândia----
LC21 5,2ºC Hidrolândia - + - -
LC22 5,0ºC Hidrolândia - + - -
LC233,4ºCProf. Jamil----
LC242,7ºCProf. Jamil----
LC25 5,4ºC Piracanjuba - - + -
LC262,7ºCPiracanjuba----
LC27 3,6ºC Piracanjuba - + - -
LC283,1ºCPiracanjuba----
LC29 4,3ºC Piracanjuba - + - -
LC30 3,0ºC Piracanjuba - + - -
LC315,0ºCPiracanjuba----
LC323,5ºCPiracanjuba----
Amostras
Temperatura
do tanque de
refrigeração
Procedência
C. estertheticum
RF/RR 16SEF/16SER
RF: Revised Foward, RR: Revised Reverse; (+) resultado positivo para o PCR; (-) resultado negativo para o PCR
67
APÊNDICE B Relação das amostras de queijo parmesão, segundo sua forma de
apresentação à venda, Estado de localização das indústrias e resultados do PCR de acordo
com os pares de primers utilizados.
Sem pré-
enriquecimento
Pré-
enriquecimento
Sem pré-
enriquecimento
Pré-
enriquecimento
PA01 F.I. N GO - - - -
PA02 F.I. N GO - - - -
PA03 P.I. N GO - - - +
PA04 P.I. N GO - - - -
PA05 F.I. N GO - - - -
PA06 F.I. N GO - - - -
PA07 F.I. N MT - - - -
PA08 F.I. N GO - - - -
PA09 F.I. D MG - - - -
PA10 F.D. N MT - - - -
PA11 F.I. N SP - + - -
PA12 P.I. N MG - - - -
PA13 F.D. N s/ identificação - - - -
PA14 F.D. N s/ identificação - - - -
PA15 F.I. N MG - - - -
PA16 F.D. D MG - - - -
PA17 F.I. N GO - + - -
PA18 F.D. D s/ identificação - + - -
PA19 F.D. D MG - - - -
PA20 F.D. N SP - - - -
PA21 F.D. N SP - - - -
PA22 F.D. D GO - - - -
PA23 F.D. D MT - - - -
PA24 F.I. D GO - - - -
PA25 F.D. D MG - - - -
PA26 F.D. D SP - - - -
PA27 F.D. N SP - - - -
PA28 F.D. D MG - - - -
PA29 F.I. D GO - - - -
UF
RF: Revised Foward, RR: Revised Reverse; F.I.: fracionado pela indústria, F.D.: fracionado pela rede de distribuição, P.I.: Peça
inteira, N: normal, D: sinal de deterioração; (+) resultado positivo para o PCR; (-) resultado negativo para o PCR
C. estertheticum
RF/RR 16SEF/16SER
Amostras
Forma
de
apresentação
Aspecto
do
produto
68
APÊNDICE C Relação das amostras de queijo provolone, segundo sua forma de
apresentação à venda, Estado de localização das indústrias e resultados do PCR de acordo
com os pares de primers utilizados.
Sem pré-
enriquecimento
Pré-
enriquecimento
Sem pré-
enriquecimento
Pré-
enriquecimento
PR01F.I.NGO----
PR02P.I.NGO----
PR03P.I.NGO----
PR04P.I.NGO----
PR05F.I.NGO----
PR06P.I.NGO----
PR07P.I.NTO----
PR08P.I.NMT----
PR09P.I.NGO----
PR10P.I.NGO----
PR11F.I.NMG----
PR12P.I.NGO----
PR13F.I.NMG----
PR14F.D.NSP----
PR15P.I.NGO----
PR16F.I.NMG----
PR17F.I.NSP----
PR18P.I.NMG----
PR19P.I.NMG----
PR20F.D.DMG----
PR21 F.D. N SP - + - -
PR22 P.I. D GO + + - -
PR23F.I.NSP----
PR24F.I.NSP----
PR25F.D.NGO----
PR26 F.D. N MG - - + +
PR27F.D.NGO----
PR28F.D.NGO----
PR29P.I.NGO----
PR30P.I.DGO----
PR31P.I.NMG----
PR32F.D.DGO----
PR33P.I.NGO----
PR34P.I.NGO----
PR35P.I.NGO----
RF: Revised Foward, RR: Revised Reverse; F.I.: fracionado pela indústria, F.D.: fracionado pela rede de distribuição, P.I.: Peça inteira,
N: normal, D: sinal de deterioração;
(
+
)
resultado
p
ositivo
p
ara o PCR;
(
-
)
resultado ne
g
ativo
p
ara o PCR
C. estertheticum
RF/RR 16SEF/16SER
Amostras
Forma
de
apresentação
Aspecto
do
produto
UF
69
APÊNDICE D Relação das amostras de queijo parmesão (RA) e provolone (RO)
ralado, segundo sua forma de apresentação à venda, Estado de localização das indústrias e
resultados do PCR de acordo com os pares de primers utilizados.
Sem pré-
enriquecimento
Pré-
enriquecimento
Sem pré-
enriquecimento
Pré-
enriquecimento
RA01R.I.NGO----
RA02R.I.NGO----
RA03R.I.NGO----
RA04 R.I. N GO - + - -
RA05R.I.NGO----
RA06 R.I. N MG - + - -
RA07R.I.NMG----
RA08R.I.NGO----
RA09 R.I. N MG + - - +
RA10R.I.NSP----
RA11R.D.NGO----
RA12R.D.DMT----
RO13R.D.NGO----
RA14R.I.DSP----
RO15 R.I. D SP - + - -
RA16R.I.NSP----
RA17R.I.NSP----
RA18 R.D. N s/ identificação - - - -
RA19R.I.NGO----
RA20 R.I. N SP - + - -
RA21R.I.NSP----
RA22R.I.NSP----
RA23 R.I. N SP - + - -
RA24 R.I. N MT - - - +
RA25 R.I. N SP - + - -
RA26R.I.NMG----
RA27R.I.NGO----
RA28 R.D. N s/ identificação - - - -
RA29R.I.NSP----
RA30 R.I. D SP - - - +
RA31 R.I. N GO - + - -
RF: Revised Foward, RR: Revised Reverse; F.I.: fracionado pela indústria, F.D.: fracionado pela rede de distribuição, P.I.: Peça inteira, N:
normal, D: sinal de deterioração;
(
+
)
resultado
p
ositivo
p
ara o PCR;
(
-
)
resultado ne
g
ativo
p
ara o PCR
C. estertheticum
RF/RR 16SEF/16SER
Amostras
Forma
de
apresentação
Aspecto
do
produto
UF
Livros Grátis
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