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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS - GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE MURINA APÓS
IMUNIZAÇÃO COM UM ANTÍGENO RECOMBINANTE DE
Leishmania chagasi /Leishmania infantum EM ASSOCIAÇÃO COM
DIFERENTES ADJUVANTES
RICARDO EVANGELISTA FRAGA
Salvador-Bahia-Brasil
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS - GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE MURINA APÓS
IMUNIZAÇÃO COM UM ANTÍGENO RECOMBINANTE DE
Leishmania chagasi /Leishmania infantum EM ASSOCIAÇÃO COM
DIFERENTES ADJUVANTES
RICARDO EVANGELISTA FRAGA
Orientador: Geraldo Gileno de Sá Oliveira
Salvador-Bahia
2007
Dissertação apresentada para
obtenção do grau de Mestre em
Imunologia
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AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE MURINA APÓS
IMUNIZACAO COM UM ANTIGENO RECOMBINANTE DE
Leishmania chagasi /Leishmania infantum EM ASSOCIAÇÃO COM
DIFERENTES ADJUVANTES
RICARDO EVANGELISTA FRAGA
FOLHA DE APROVAÇÃO
COMISSÃO EXAMINADORA
_____________________________ _____________________________
Dra. Maria Olívia A. Ramos Bacellar Dr. Edson Delgado Rodrigues
Banca Examinadora Banca Examinadora
_____________________________
Dr. Geraldo Gileno de Sá Oliveira
Orientador
A vida não tem ensaio
mas tem novas chances
Viva a burilação eterna, a possibilidade:
o esmaril dos dissabores!
Abaixo o estéril arrependimento
a duração inútil dos rancores
Um brinde ao que está sempre nas nossas mãos:
a vida inédita pela frente
e a virgindade dos dias que virão!
(Elisa Lucinda)
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz – CPqGM e ao Programa de Pós-Graduação em
Imunologia (PPGIm). Acredito que o resultado desta dissertação é um produto coletivo, embora
sua redação e responsabilidade sejam predominantemente individuais. Várias pessoas
contribuíram para que este trabalho chegasse a bom termo. A todas elas registro minha gratidão:
Ao Dr. Geraldo Gileno de Sá Oliveira
Pela dedicação, paciência e a sua forma exigente, crítica e criativa de argüir as idéias
apresentadas, creio que deram norte a este trabalho, facilitando o alcance de seus objetivos;
Aos Dr. Lain Carlos Pontes de Carvalho e Dr. Washington Luís Conrado dos Santos
Pela confiança e pelas importantes contribuições realizadas durante toda a minha trajetória no
Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz – CPqGM;
À Lenita Ramires
Que, além de uma extraordinária amiga, foi sumariamente eleita por mim, como uma co-
orientadora. Pela dedicação, apoio, incentivo e disponibilidade, pelas broncas e puxões de orelha
nos momentos corretos;
À Patrícia Meira
Por ser uma companheira sempre presente em todas as etapas deste trabalho;
À minha fantástica equipe de trabalho
Cristiane, Andréa, Raimundo, Adriano, Anselmo, Franklin, Lívia e Sergio que comprovaram que
o melhor trabalho é feito em equipe;
Aos meus inesquecíveis amigos
Roberto de Abreu, Paola Andrade que, mesmo sendo de outras áreas, colocaram a mão na massa
e me mostraram que ter amigos é ter alicerces seguros. A Miscely, Tiana, Virginia, Juliana
Coelho, Daniela, Hermes, Aline, Jaciara, Bel, Mauren e Leila pela amizade e carinho.
À minha fundamental família e a Deus
Meus eternos agradecimentos. Peças cruciais para a minha formação como ser humano.
Exemplos de vida.
A todos aqueles que, embora não nomeados, me brindaram com seus inestimáveis apoios em
distintos momentos e por suas presenças afetivas, o meu reconhecido e carinhoso: muito
obrigado.
SUMÁRIO
LISTA REAGENTES.....................................................................................................07
RESUMO.......................................................................................................................... 08
ABSTRACT...................................................................................................................... 09
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................... 10
2. REVISÃO DE LITERATURA...................................................................................... 11
2.1. Leishmanioses................................................................................................................ 11
2.2. Leismaniose visceral.......................................................................................................11
2.2.1 Aspectos epidemiológicos.......................................................................................11
2.2.1.1. Etiologia/vetor/reservatórios/hospedeiro............................................................. 11
2.2.1.2. Incidência e prevalência....................................................................................... 12
2.2.2. Quadro clínico....................................................................................................... 13
2.2.2.1. No reservatório..................................................................................................... 13
2.2.2.2. No hospedeiro...................................................................................................... 14
2.2.3. Resposta imune...................................................................................................... 15
2.2.3.1. No cão (reservatório)........................................................................................... 16
2.2.3.2. No homem (hospedeiro)...................................................................................... 16
2.2.3.3. No modelo murino.............................................................................................. 17
2.2.4. Controle................................................................................................................. 17
2.2.4.1. Vacina como ferramenta de controle de transmissão/infecção........................... 18
2.2.4.1.1. Desenvolvimento de vacinas............................................................................ 19
2.2.4.1.1.1. Primeira geração............................................................................................. 19
2.2.4.1.1.2. Segunda geração............................................................................................ 19
2.2.4.1.1.3. Terceira geração............................................................................................. 20
2.2.4.1.2. Uso de Adjuvantes (Adjuvante de Freund, Hidróxido de Alumínio,
Saponina, Óleo de Amendoim, IL-12).............................................................................. 21
2.2.5. Relevância.............................................................................................................. 22
3. OBJETIVOS..................................................................................................................... 23
Objetivo geral..................................................................................................................... 23
Objetivos específicos......................................................................................................... 23
4. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 24
4.1 Antígenos................................................................................................................... 24
4.1.1 Produção de extrato bruto de Leishmania chagasi/infantum................................... 24
4.1.2 Produção do antígeno recombinante Lc9 de Leishmania chagasi/infantum........... 25
4.1.2.1 Purificação............................................................................................................. 26
4.2. adjuvantes.................................................................................................................. 28
4.2.1. Adjuvante de Freund............................................................................................... 28
4.2.2. Óleo de amendoim................................................................................................. 28
4.2.3. Hidróxido de alumínio (alum)................................................................................ 28
4.2.4. Saponina.................................................................................................................. 29
4.2.5. plasmídeo codificando cadeia única de IL-12 murina,
pcDNA3.1- scmu-IL-12................................................................................................... 29
4.3. Animais......................................................................................................................30
4.4 Imunização................................................................................................................. 30
4.5 Avaliação da resposta imune.................................................................................... 31
4.5.1 Avaliação da resposta imune humoral..................................................................... 31
4.5.1.1 Produção de anticorpos da classe IgG................................................................... 31
4.5.1.2 Produção de anticorpos das subclasses IgG1 e IgG2a.......................................... 32
4.5.2 Avaliação da resposta imune celular........................................................................ 33
4.5.2.1 Avaliação de proliferação celular.......................................................................... 33
4.5.2.2 Avaliação da produção de citocinas...................................................................... 34
4.6. Análise estatística..................................................................................................... 35
5. RESULTADOS............................................................................................... 36
5.1 Avaliação da resposta imune.................................................................................... 36
5.1.1. Avaliação da resposta imune humoral específica................................................... 37
5.1.1.1. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG
reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi/infantum e Lc9............................. 37
5.1.1.2. Avaliação de anticorpos das subclasses IgG1 e IgG2a reativos a Lc9................ 40
5.1.2. Avaliação da resposta imune celular....................................................................... 42
5.1.2.1 Avaliação da resposta proliferativa de esplenócitos
após estimulação in vitro com antígeno recombinante Lc9.............................................. 42
5.1.2.2 Avaliação da produção de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-5)
por esplenócitos após estimulação in vitro com Lc9....................................................... 46
6. DISCUSSÃO.................................................................................................................... 49
7. CONCLUSÃO................................................................................................................. 57
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 58
LISTA DE REAGENTES:
Salina tamponada com fosfato – PBS: NaCl
137 mM, KCl 2,68 mM, Na
2
HPO
4
9,58 mM e
1,47 mM NaK
2
PO
4
, pH 7,2;
Meio de cultura Luria-Bertani - caldo LB: 1% de bacto-triptona (HiMedia, Mumbai,
Índia), 0,5% de extrato de levedura (Isofar, Duque de Caxias – RJ), 1% de cloreto de
sódio (Isofar, Duque de Caxias – RJ), pH 7.0;
Tampão de lise - 20mM Na2HPO4, 500mM Nacl, 10mM imidazol, pH 8,0;
Tampão de lavagem - 20 mM Na2HPO4, 500 mM NacL, 31,25 mM imidazol, pH 8,0;
Tampão de eluição - 20 mM Na2HPO4, 500 mM NacL, 500 mM imidazol, pH 8,0;
Salina - cloreto de sódio a 0,85 %, (ISOFAR,Duque de Caxias, RJ);
Tampão carbonato-bicarbonato de sódio 0,1 M - Na
2
HCO
3
a 15 mM e NaHCO
3
a 28 mM,
pH 9.6;
Meio RPMI 1640 suplementado - 1640 do Instituto Roswell Park Memorial (RPMI)
suplementado com 10% de soro fetal bovino [(v/v), SFB, Gibco BRL Life Technologies,
EUA], 2 mM L-glutamina (Sigma-Aldrich) e 0,01 mM 2-mercaptoetanol (Sigma-
Aldrich).
RESUMO
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE MURINA APÓS ADMINISTRAÇÃO DE UM
ANTIGENO RECOMBINANTE DE Leishmania chagasi/infantum EM ASSOCIAÇÃO A
DIFERENTES ADJUVANTES. Visando a avaliação de um antígeno recombinante candidato a
componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina, no presente trabalho,
camundongos BALB/c jovens foram injetados três vezes, com intervalo de 21 dias entre cada
duas injeções consecutivas, por via subcutânea, com salina (G1) ou com o antígeno recombinante
de Leishmania chagasi/infantum denominado Lc9 (G2) ou ainda com o Lc9 associado a
diferentes adjuvantes [adjuvante de Freund (G3), saponina (G4), óleo de amendoim (G5),
hidróxido de alumínio (G6) ou plasmídeo codificando IL-12 murina de cadeia única (G7). A
administração do último foi realizada por via muscular seguida de eletroporação]. A resposta
imune foi avaliada pela mensuração de anticorpos bem como pela mensuração da resposta
proliferativa e da produção de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-5) por esplenócitos, após estimulação
antigênica específica in vitro. Os grupos de animais injetados com o Lc9 em associação ou não
com adjuvantes desenvolveram resposta imune humoral específica, detectada pela presença de
anticorpos da classe IgG reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi/infantum (G3, G4,
G5 e G6) e ao antígeno recombinante Lc9 (G2, G3, G4, G5, G6 e G7) em amostras de soros.
Além disso, apenas o grupo G4 e os grupos G2, G3, G4, G5, G6 e G7 produziram anticorpos da
subclasse IgG2a e IgG1 reativos ao Lc9, respectivamente. Adicionalmente, o grupo de
camundongos injetados com o Lc9 associado a saponina foi o único que apresentou resposta
linfoproliferativa e produção de IFN-γ após estimulação in vitro com o Lc9. Finalmente, somente
grupos G2, G4 , G6, G7 produziram IL-5 e síntese de IL-4 não foi detectada em qualquer dos
grupos após estimulação especifica in vitro. Os resultados encontrados sugerem que o grupo de
camundongos injetados com o Lc9 associado a saponina (que produziram anticorpos classe IgG,
das subclasses IgG2a e IgG1, e citocinas IFN-γ e IL-5 e revelaram resposta lifonproliferativa)
desenvolveu resposta imune mista Th1/Th2 e que os demais grupos (que geraram anticorpos da
classe IgG, subclasse IgG1, e/ou IL-5) exibiram reposta imune do tipo Th2.
Descritores: Leishmania, vacina, adjuvante, antígeno recombinante
ABSTRACT
EVALUATION OF MURINE IMMUNE RESPOSE FOLLOWING ADMINISTRATION OF
Leishmania chagasi/infantum RECOMBINANT ANTIGEN IN ASSOCIATION WITH
DIFFERENT ADJUVANTS. To assess a potential vaccine candidate antigen for canine visceral
leishmaniasis, in the present work, groups of BALB/c mice were subcutaneously injected, three
times, at 21 days intervals between two consecutive injections, with saline or a Leishmania
chagasi/infantum recombinant antigen, so-called Lc9 (G2), or Lc9 in combination with either of
Freund’s adjuvant (G3), saponin (G4), peanut oil (G5), aluminum hydroxide (G6) or a plasmid
encoding single-chain murine IL-12 (G7). The plasmid DNA was injected intramuscularly,
followed by electroporation. After immunization, IgG, IgG2a and IgG1 reactive to crude
Leishmania antigens and/or Lc9 were measured by ELISA and specific cellular immune response
was assessed by lymphoproliferative assay and cytokine production (IFN-γ, IL-4 e IL-5). Mice
immunized with Lc9 alone or associated with adjuvants developed specific seric IgG reactive to
crude Leishmania antigens (G3, G4, G5, and G6) and to Lc9 (G2, G3, G4, G5, G6, and G7). IN
addition, the group G4 alone and the groups G2, G3, G4, G5, G6, and G7 produced anti-Lc9
IgG2a and IgG1, respectively. Furthermore, mice injected with Lc9 associated with saponin
developed lymphoproliferative response and produced IFN-γ after Lc9 in vitro stimulation.
Finally, only groups G2, G4, G6, and G7 synthetized IL-5 and IL-4 was not detected in any of the
mice groups, after specific in vitro stimulation. These results suggest that mice immunized Lc9
associated with saponin (that produced specific IgG, IgG2a, and IgG1, together with cytokines
IFN-γ, IL-5, and lymphoproliferative response) developed a Th1/Th2 immune response while all
the other Lc9 injected groups, regardless the use of adjuvant (that produced only specific IgG,
IgG1 and/or IL-5), showed a Th2 type of immune response.
Key Words: Leishmania, vaccine, adjuvant, recombinant antigen.
1. INTRODUÇÃO
Muitos organismos como bactérias, vírus, parasitas, e fungos são responsáveis por causar
importantes patologias que acometem os seres humanos (MACKAY et al., 2001). Dentre eles,
diferentes espécies de Leishmania, protozoário pertence à família Trypanosomatidae, são capazes
de promover diversas manifestações clínicas (GRIMALDI et al., 1989; HANDMAN, 2001) e
ocasionar uma endemia que está franca expansão (MAURICIO et al., 1999).
O cão é considerado o principal reservatório da Leishmania chagasi/infantum
(PARANHOS-SILVA et al., 1996; MAURICIO et al., 1999; CABRERA et al., 2003), uma vez
que o flebótomo (Lutzomyia longipalpis) ao exercer o hematofagismo na pele do cão pode
infectar-se com este protozoário e transmiti-lo para outros mamíferos, como outros cães ou
mesmo o homem. Após a infecção, na dependência de vários fatores, incluindo a resposta imune
específica, tanto o ser humano (BADARÓ et al., 1986) quanto o cão (POZIO et al.,1981) podem
apresentar desde formas clínicas assintomáticas até uma doença sistêmica grave.
Na dependência de que subpopulação de linfócitos T CD4+ é estimulada, células T
auxiliadoras do tipo 1 (T
H
1) ou células T auxiliadoras tipo 2 (T
H
2), a resposta imune adaptativa
em mamíferos pode ser predominantemente do tipo humoral ou do tipo celular. A resistência
adquirida a patógenos intracelulares, como por exemplo, a Leishmania, é mediada por células e
envolve linfócitos da subpopulação T
H
1 (ABBAS & LICHTMAN, 2003).
Uma estratégia para o controle da leishmaniose visceral canina e humana está no
desenvolvimento de uma vacina (TESH, 1995). Estudos para determinação de condições
apropriadas para indução de resposta imune a antígenos, incluindo a definição de adjuvantes, vias
de administração e protocolos de imunização são importantes no aperfeiçoamento de uma vacina
eficaz (ABATH et al., 1998; GRIFFIN, 2002).
Em processos de imunização, adjuvantes podem promover o desenvolvimento de
respostas imunes mais intensas, com início mais precoce, de maior duração, com menor
quantidade de antígeno (GUPTA & SIBER, 1995). O adjuvante mais adequado para o uso em
uma vacina irá depender do tipo de resposta imune adequada para o desenvolvimento de
imunidade protetora (SINGH & O’HAGAN 1999).
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Leishmanioses
Os protozoários patogênicos mais importantes para homens e animais pertencem às
ordens Eucoccidia e Kinetoplastida. Nesta última, encontram-se os gêneros Trypanosoma e
Leishmania (CORNELISSEN & SCHETTERS, 1996). O protozoário Leishmania pertence à
família Trypanosomatidae, onde 20 espécies são responsáveis pelo desenvolvimento de quatro
formas diferentes de apresentação clínica: a leishmaniose cutânea, a leishmaniose cutânea difusa,
a leishmaniose mucocutânea e a leishmaniose visceral (GRIMALDI et al., 1989; ASHFORD,
2000; DESJEUX, 2004).
Embora algumas espécies de Leishmania possam determinar várias formas da doença,
dependendo do tipo de resposta imune adquirida pelo hospedeiro, na maioria das vezes, cada
espécie de Leishmania causa uma ou duas formas de apresentação da doença (WILSON et al.,
2004; KAYE et al., 2004).
2.2 Leishmaniose visceral
2.2.1 Aspectos epidemiológicos
2.2.1.1. Etiologia/vetor/reservatórios/hospedeiro
A leishmaniose visceral, conhecida como calazar ou febre dun-dun na Índia, calazar
infantil na Bacia do Mediterrâneo e leishmaniose visceral americana nas Américas, é uma
endemia causada por protozoários intracelulares pertencentes ao gênero Leishmania.
Na maioria das áreas afetadas da África e Ásia, a espécie do protozoário responsável pela
infecção e/ou doença é a Leishmania donovani; enquanto que na Região Mediterrânea é a
Leishmania infantum e nas Américas é a Leishmania chagasi (MAURICIO, 1999; MAURICIO,
2000). Alguns autores consideram as espécies L. infantum e L. chagasi indistinguíveis do ponto
de vista genético (MOMEN et al., 1987; MAURICIO et al., 1999). No presente trabalho, será
usado o termo L. chagasi/infantum para referência a L. chagasi e a L. infantum.
Este protozoário é transmitido por insetos vetores da família Psychodidae, dos gêneros
Lutzomyia e Phlebotomus (KILLICK-KENDRICK, 1999), que são vulgarmente denominados
flebótomos. Esses insetos possuem 2-3 mm de comprimento, hábitos peridomésticos e
intradomiciliares e alimentam-se ao anoitecer (LAINSON et al., 1977; CABRERA et al., 2003).
No flebótomo, o parasito apresenta uma forma móvel e flagelada denominada promastigota, a
qual pode ser inoculada nos hospedeiros mamíferos durante o repasto sangüíneo das fêmeas do
inseto. Uma vez introduzida na pele do hospedeiro, a Leishmania é fagocitada por células do
sistema fagocítico mononuclear e transforma-se em uma forma imóvel e arredondada
denominada amastigota com o flagelo restrito a bolsa flagelar. Em princípio, após a fagocitose
pode ocorrer destruição ou proliferação do parasito. Quando ocorre proliferação do parasito, as
células infectadas tendem a liberar Leishmania após um processo lise ou exocitose (RITTIG &
BOGDAN, 2000). Durante a alimentação sangüínea, a fêmea do flebótomo ingere a forma
amastigota do parasito presente na pele do hospedeiro. No intestino médio do flebótomo, o
parasito se diferencia em promastigota e se multiplica e durante um novo repasto sangüíneo os
parasitos são inoculados em um novo hospedeiro (SCHLEIN et al., 1992; ASHFORD, 2000).
O flebótomo não exibe qualquer predileção para alimentar-se em cão. No entanto, pelo
fato desse animal, freqüentemente, apresentar parasitismo cutâneo após a aquisição da infecção,
muitos insetos vetores que se alimentam no cão infectado adquire o parasito (ALVAR et al.,
1994; SHERLOCK, 1996; COURTENAY, 2002). Alguns autores demonstraram
experimentalmente, usando-se Phlebotomus perniciosus, que cães, incluindo os assintomáticos e
oligossintomáticos, são capazes de transmitir Leishmania para o inseto vetor (GUARGA et al.,
2000). Como esses animais costumam acompanhar seus donos, eles podem contribuir para a
dispersão da doença durante as migrações humanas.
Na natureza, os flebótomos possuem tanto hábitos antropofílicos quanto zoofílicos,
(BONGIORNO, 2003). A leishmaniose visceral endêmica na América Latina e na Região
Mediterrânea é uma zoonose, que afeta, principalmente, o cão e o homem (ASHFORD, 2000).
2.2.1.2. Incidência e prevalência
A leishmaniose visceral é uma endemia existente em 62 países e encontra-se em franca
expansão. Mundialmente, ocorrem 500.000 casos novos da enfermidade por ano. Mais de 90%
dos casos de leishmaniose visceral ocorrem em cinco países: Índia, Sudão, Bangladesh, Nepal e
Brasil. No Brasil, a incidência média da doença é de 3.500 casos por ano (WHO 1990, Ministério
da Saúde 2006). No passado, o desenvolvimento da infecção humana estava relacionado a
habitação em áreas rurais ou silvestres por manterem um contato íntimo com a mata (DEANE &
DEANE, 1955a). Entretanto, com o desmatamento (DESJEUX, 1996; GUERRA et al., 2004) e a
migração da população humana, de áreas rurais para áreas urbanas, vem ocorrendo o
aparecimento de casos de infecção e/ou doença em áreas periurbanas de várias cidades do Brasil
(BRASIL, 2006).
A freqüência da infecção canina pode variar entre áreas endêmicas diferentes. Alguns
estudos realizados em cidades brasileiras revelaram uma taxa de 9% de cães soropositivos em
Montes Claros, Minas gerais (FRANCA-SILVA et al.,, 2003), de 15% em Pancas, Espírito Santo
(DIETZE, 1997), 25% em Guaratiba, Rio de Janeiro (CABRERA, 2003), e de 30% em Jequié e
Jacobina, Bahia (PARANHOS-SILVA, 1996; QUINNEL et al., 1997: ASHFORD et al., 1998).
Entretanto métodos diagnósticos mais sensíveis, como por exemplo, a reação em cadeia da
polimerase (PCR), revelam que o exame sorológico deixa de identificar muitos casos de infecção
canina, sugerindo que a freqüência da infecção no cão deve ser mais elevada (ASHFORD et al.,
1995; BERRAHAL et al., 1996; SOLANO-GALLEGO et al., 2001).
2.2.2. Quadro clínico
2.2.2.1. No reservatório
O cão pode apresentar desde formas assintomáticas até formas polissintomáticas graves
com comprometimento de pele e de vísceras que pode culminar com a morte do animal (POZIO
et al., 1981). As manifestações clínicas mais freqüentemente encontradas são linfadenopatia,
lesões cutâneas, perda de peso, anormalidade nas unhas, esplenomegalia, uremia, anorexia,
epistaxis e diarréia (CIARAMELLA et al., 1997; KOUTINAS et al., 1999).
As alterações dermatológicas encontradas são descamação cutânea excessiva,
principalmente na região periocular e nas bordas das orelhas, despigmentação, pelame seco,
queda de pêlos, áreas de hiperceratose, úlceras e pequenos nódulos intradérmicos. As úlceras
podem ocorrer em qualquer região da pele, porém, aparecem mais freqüentemente em zonas
ósseas salientes, no plano nasal, na orelha e na região interdigital. As úlceras podem estar
relacionadas inflamação devido à presença do parasito ou a vasculite necrotizante, essa última
decorrente do depósito de imunocomplexos (CABRAL et al., 1993; PINELLI et al., 1994;
LEANDRO et al., 2001).
Alguns cães com leishmaniose visceral podem apresentar blefarite associada à dermatite
facial e/ou ceratoconjuntivite serosa bilateral (GARCÍA-ALONSO et al., 1996; CIARAMELLA
et al., 1997). Em muitos animais observa-se também a presença da onicogrifose associada à
presença do parasita na matriz unguel. (CIARAMELLA et al., 1997).
2.2.2.2. No hospedeiro
O homem, após adquirir a infecção, pode exibir a forma clínica assintomática ou
oligossintomática (BADARÓ et al., 1986a; GAMA et al., 2004) que podem evoluir para cura
clínica espontaneamente ou para a forma clássica da doença. A maioria dos seres humanos
desenvolve a forma clínica assintomática com evolução para cura espontânea (BADARÓ et al.,
1986; EVANS et al., 1992; GAMA et al., 2004). Na forma clássica da doença, as principais
manifestações clínicas são a hepatoesplenomegalia, linfadenomegalia (HO et al., 1982; EVANS
et al., 1985; DE BEER et al., 1991), diarréia, epistaxis, icterícia, febre, anemia, leucopenia,
plaquetopenia, hipoalbuminemia e hiperglobulinemia, tosse seca, taquicardia e hipotensão arterial
(PEARSON et al., 2000).
A hiperglobulinemia é decorrente de uma intensa ativação policlonal de linfócitos B e
consequente produção de anticorpos, incluindo auto-anticorpos (CARVALHO et al., 1983).
Complexos imunes circulantes, formados a partir da reação de auto-anticorpos, podem ser
adsorvidos às hemácias e contribuir para a redução da sobrevivência destas células, favorecendo
o desenvolvimento de anemia. Sangramento do trato digestivo e infecções bacterianas
relacionadas à diminuição do número de neutrófilos podem representar complicações graves da
doença. Os agentes causadores mais comuns das infecções bacterianas são o Staphilococcus
aureus e a Pseudomonas aeroginosas (ANDRADE et al., 1990).
A febre e a perda de peso são características marcantes da forma clássica da leishmaniose
visceral e, provavelmente, decorrem da produção da citocina TNF-α. (BARRAL-NETO et al.,
1991).
2.2.3. Resposta imune
A população de linfócitos T CD4+ pode ser dividida em subpopulações de células T
auxiliadoras tipo 1 (T
H
1) e células T auxiliadoras do tipo 2 (T
H
2). Quando estimuladas, as células
T
H
1 produzem IFN-gama, interleucina 2 (IL-2) e linfotoxina (TNF-β), as quais promovem
mecanismos efetores celulares da resposta imune, incluindo hipersensibilidade tardia, reações
inflamatórias e, no camundongo, a produção de anticorpos da classe IgG2a, os quais capazes de
favorecer, direta ou indiretamente, a opsonização e toxicidade mediada por células. Tais
mecanismos efetores são direcionados ao combate a patógenos intracelulares. Por outro lado,
após estimulação, as células T
H
2 produzem interleucina 4 (IL-4), IL-5, IL-10, IL-13 e promovem
síntese de anticorpos IgE e, em camundongos, IgG1, responsáveis pela imunidade humoral e
reações alérgicas (MOSMANN et al., 1986, COFFMAN, 2006). Estas subpopulações exercem
um controle recíproco, uma resposta T
H
1 pode inibir o desenvolvimento de uma resposta T
H
2
(HOFSTRA et al., 1998; COTTREZ et al., 2000) e vice-versa (POWRIE et al., 1993; MURRAY,
et al., 1997).
A resposta imune adaptativa eficaz contra a infecção por Leishmania, que é um patógeno
intracelular obrigatório nos hospedeiros vertebrados, é dependente de células da subpopulação
T
H
1 (MELBY, et al., 2001; GONZALO, et al., 2001; ABBAS & LICHTMAN, 2003;
DUMONTEIL, et al., 2003). IFN-gama produzido nas fases iniciais da infecção, por células
Natural (NK), e, mais tarde, por células T CD4+ do tipo T
H
1 (LIEW et al., 1989; HARMS et al.,
1991; LASKAY et al., 1993) promove ativação de macrófagos parasitados e estimula a produção
da enzima óxido nítrico sintetase induzida que catalisa a geração de óxido nítrico (NO), o qual
proporciona a destruição dos parasitos intracelulares (MELBY, et al., 1998; MURRAY &
NATHAN, 1999; BOGDAN et al., 2000).
A produção de IFN-gama, por células T e pelas células NK, é estimulada por outra
citocina, secretada na fase inicial da infecção pela Leishmania, a interleucina 12 (REINER et al.,
1994; MANETTI, 1994; MURRAY, et al., 1997; STOBIE, te al., 2000). A IL-12 é produzida
principalmente por células apresentadoras de antígenos, e está associada com a diferenciação e
expansão das células T CD4+ do tipo T
H
1 e ativação das células NK (KOBAYASHI et al., 1989;
AFONSO, et al., 1994; BACELLAR et al, 1996).
2.2.3.1. No cão (reservatório)
Alguns estudos sugerem a ocorrência de uma dicotomia (T
H
1/T
H
2) da resposta imune
específica em cães infectados naturalmente e experimentalmente com Leishmania
chagasi/infantum (PINELLI et al., 1994; CABRAL et al., 1992 e 1998; da COSTA PINHEIRO
et al., 2004). Por um lado, cães que desenvolvem resposta imune humoral contra antígenos de
Leishmania e, após estimulação específica, produzem IL-4, IL-10, são incapazes de exibir
hipersensibilidade cutânea tardia (DTH), resposta linfoproliferativa, não sintetizam IFN-gama,
fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina 2 (IL-2) tendem apresentar a doença
(PINELLI et al., 1994; MARTINEZ-MORENO et al., 1995; RHALEM et al., 1999; da COSTA
PINHEIRO et al., 2004). Por outro lado, cães que revelam ausência da produção de anticorpos
específicos são capazes de desenvolver, depois da estimulação com antígenos de Leishmania,
DTH, resposta linfoproliferativa e produzem IFN-gama, TNF-α, IL-2 sem gerar IL4 e IL-10,
exibem a tendência a apresentar a forma assintomática da infecção (PINELLI et al., 1994;
MARTINEZ-MORENO et al., 1995; RHALEM et al., 1999; da COSTA PINHEIRO et al.,
2004). Embora, existam as situações onde ocorre uma polaridade aparente da resposta imune, um
grande número de animais naturalmente ou experimentalmente infectados pode apresentar
simultaneamente resposta imune humoral e celular (CABRAL et al., 1998; dos-SANTOS, et al.,
dados não publicados) ou profunda supressão da resposta imune celular (DE LUNA et al., 1999).
2.2.3.2. No homem (hospedeiro)
Vários estudos sugerem que no homem também ocorre uma dicotomia da resposta imune
específica, resposta T
H
1 ou T
H
2, subseqüente à infecção por L. chagasi/infantum ou L. donovani
(CARVALHO et al., 1985, 1989 e 1994; HALDAR et al., 1983; BACELLAR et al., 1991;
PERUHYPE-MAGALHAES et al., 2005).
Indivíduos que desenvolvem a doença, portanto susceptíveis, revelam tendência à
ativação das células T
H
2 que leva a produção de IL-4 e ativação policlonal das células B
(KHARAZMI et al., 1999 HANDMAN, 2001) e a supressão das células T
H
1. Além disso, esses
pacientes produzem citocina IL-10 que também promove inibição da resposta imune do tipo T
H
1
(GHALIB et al., 1993; HOLADAY et al., 1993b).
Por outro lado, os indivíduos que, após a infecção, apresentam formas subclínicas ou que
desenvolveram a doença e foram tratados com sucesso, tendem a exibir predomínio da resposta
imune do tipo T
H
1, com produção IFN-gama e sem geração de IL-4 e IL-10, frente à exposição in
vitro a antígenos específicos (CARVALHO et al., 1992; BACELLAR et al., 1996; HOLADAY
et al., 1993a).
2.2.3.3. No modelo murino
O camundongo é utilizado como modelo para a compreensão da leishmaniose visceral
humana e canina. Na dependência da evolução da infecção experimental, a maioria das linhagens
singênicas é definida, como susceptível (por exemplo, BALB/c e C57BL/6) ou resistente (por
exemplo, DBA e C3H/HeJ) (WILSON et al., 1998; KAYE et al., 2004). Camundongos das
linhagens comumente utilizadas, não modificadas geneticamente, mesmo as consideradas
susceptíveis, não desenvolvem uma forma grave da doença que resulta em morte (KAYE et al.,
2004). Após a inoculação experimental do parasito, camundongos BALB/c apresentam
parasitismo hepático, em uma fase precoce, que exibe declínio a partir da quarta semana da
infecção, e parasitismo esplênico, cujo início é mais tardio e é mais duradouro (MELBY et al.,
1998; AHMED et al., 2003; KAYE et al., 2004, CARRION et al., 2006). A resistência à infecção
depende tanto de células CD4+ e quanto de células CD8+ (STERN et al., 1988; TSAGOZIS et
al., 2003; AHMED et al., 2003). Durante a infecção, células CD4+ podem ser estimuladas a
produzir citocinas como IFN-gama e IL-2 (resposta do tipo T
H
1) ou IL-4 e IL-10 (resposta do
tipo T
H
2), sendo que as primeiras correlacionam-se com a resistência e as últimas com a
susceptibilidade a infecção (MURRAY et al., 1987, 1997, 2002; MIRALLES et al., 1994;
AHMED et al., 2003; WILSON et al., 1996).
2.2.4. Controle
As medidas de controle para leishmaniose visceral empregadas no Brasil baseiam-se nas
atividades de educação em saúde, no diagnóstico e tratamento dos casos humanos, borrifação de
casas e quintais com inseticidas de efeito residual e a identificação e sacrifício de cães
soropositivos (TESH, 1995; BRASIL, 2006). Contudo, para que tais medidas sejam eficazes,
provavelmente, elas devem realizadas de um modo sistemático e devem ser mantidas por um
longo período de tempo (DIETZE et al., 1997; ASHFORD, et al. 1998; BRAGA et al., 1998).
O tratamento quimioterápico em pacientes humanos propicia a cura clínica duradoura na
maioria dos casos. No entanto, as drogas que são utilizadas para o tratamento do cão, que na sua
maioria também são utilizadas na terapêutica humana, promovem cura clínica transitória. Cães
tratados podem ser fonte de infecção para o flébotomo (ALVAR, 1994; OLIVA et al., 1995;
SLAPPENDEL & TESKE, 1997; BANETH & SHAW, 2002). Desta forma, uma estratégia
alternativa para o controle da leishmaniose visceral canina está no desenvolvimento de uma
vacina.
2.2.4.1. Vacina como ferramenta de controle de transmissão/infecção
Em princípio, o desenvolvimento de uma vacina eficaz à leishmaniose visceral canina é
factível, uma vez que alguns cães exibem resistência à infecção (LANOTTE et al., 1979; POZIO
et al., 1981; SOLANO-GALLEGO et al., 2000; PINELLI et al., 1994 RHALEM et al., 1999).
Uma vacina eficaz seria de grande utilidade no combate à leishmaniose visceral por várias razões,
como por exemplo: a) uma campanha de vacinação canina seria menos onerosa e muito mais
rápida do que o atual programa de identificação e eliminação dos cães sorologicamente positivos;
b) a vacinação apresentaria maior aceitação pela comunidade e pelos médicos veterinários porque
evitaria o sacrifício de animais e c) os cães com resistência induzida pela vacinação
permaneceriam na área, diminuindo o aporte de novos cães susceptíveis (DYE, 1996).
Para controlar a leishmaniose visceral, uma vacina deve ser segura, induzir resposta
imune protetora e a gerar memória imunológica (WAHREN & BRYTTING, 1997), ter baixo
custo de produção, ser biologicamente estável e de fácil administração e acarretar pouco ou
nenhum efeito colateral (MONTGOMERY et al., 1997).
2.2.4.1.1. Desenvolvimento de vacinas
Vários grupos de pesquisadores vem trabalhando no desenvolvimento de uma vacina
contra leishmaniose visceral (HANDMAN, 1997, GRADONI, 2001; REQUENA et al, 2004) De
acordo com o tipo de material usado para indução de resposta imune, as vacinas podem
classificadas em gerações (ABATH et al., 1998; GRIFFIN, 2002).
2.2.4.1.1.1. Primeira geração
As vacinas de primeira geração são constituídas por parasitos mortos. Promastigotas das
espécies L. mexicana, L. brasiliensis, L. major e L. amazonensis mortas pelo calor através da
autoclavagem e em combinação ou não com adjuvantes como o bacilo de Calmette Guerin-BCG
do Mycobacterium bovis, o hidróxido de alumínio (alum) e a interleucina 12 recombinante, estão
atualmente sendo testadas em primatas e seres humanos (ABATH et al., 1998).
2.2.4.1.1.2. Segunda geração
As vacinas de segunda geração são compostas por microrganismos vivos geneticamente
modificados, como a Leishmania, bactérias e vírus; frações de antígenos de microrganismos;
antígenos sintéticos e recombinantes ou antígenos não protéicos (ABATH et al., 1998; GRIFFIN,
2002).
Indução de proteção contra infecção foi obtida após imunização de animais pela
inoculação de uma cepa de L. chagasi desprovida do gene que codifica a enzima dihidrofolato-
redutase-timidilato sintetase (DHFR-TS) (STREIT et al., 2001) ou uma cepa avirulenta de L.
donovani denominada UR6 (MUKHOPADHYAY et al., 2000). No entanto, para que tais cepas
de Leishmania possam ser utilizadas em uma vacina, será necessária a determinação dos riscos de
reversão para o fenótipo virulento (HANDMAN, 2001).
Em estudos realizados com antígenos ligantes de fucose-manose (FML), uma fração
complexa de glicoproteínas isolada de promastigotas de L. donovani, com massa molecular
variando de 9 a 95 kDa, PALATNIK-DE-SOUSA e colaboradores (PALATNIK-DE-SOUSA et
al., 1993) observaram-se efeito protetor contra a infecção, sendo o desafio realizado com
amastigotas de L. donovani. Camundongos BALB/c imunizados com FML associado à saponina
revelaram, após o desafio, uma baixa da carga parasitária no fígado, produção elevada de
anticorpos IgG, principalmente IgG2a, específicos contra a fração FML, desenvolvimento de
reação de hipersensibilidade do tipo tardia e de resposta proliferativa de linfócitos in vitro
(PARAGUAI-DE-SOUZA et al., 2001). Posteriormente, cães de uma área endêmica imunizados
com FML apresentaram proteção parcial (PALATNIK-DE-SOUSA et al., 2001; BORJA-
CABRERA et al., 2002).
A proteína gp63, também chamada leishmaniolisina, presente na superfície de formas
promastigotas de várias espécies de Leishmania (BUTTON & MCMASTER, 1988), mostrou-se
capaz de induzir a resposta linfoproliferativa e ativação de macrófagos peritoneais em
camundongos (AFRIN et al., 2002).
Outros antígenos recombinantes foram utilizados experimentalmente em imunizações
contra a leishmaniose, a saber: a) LeIF, um antígeno recombinante homólogo de proteína
ribossomal eucariótica, selecionado em uma biblioteca de cDNA de L. braziliensis (SKEIKY,
1995); b) o LmSTI1 ou M15, molécula homóloga a proteína de levedura indutora de stress
(WEBB, 1996); c) antígeno chamado PSA-2, gp46 ou M2, pertence a uma família de
glicoproteínas, formadas por polipeptídeos de glicosilinositol ancorados em fosfolipídeos
(HANDMAN, 2001); d) proteínas A2, consideradas fatores de virulência necessários para a
sobrevivência das formas amastigotas no hospedeiro mamífero (GHOSH et al., 2001); e) o PSA-
2, antígeno de superfície do parasito 2 (HANDMAN, 1995; SJOLANDER, 1998a); f) proteína
recombinante, a LCR1, uma proteína homóloga do antígeno flagelar de Trypanosoma brucei,
também foi isolada de uma biblioteca de cDNA de Leishmania (WILSON, 1995); g) uma
proteína quimérica denominada Q, produzida a partir da fusão genética de cinco determinantes
antigênicos das proteínas ribossomais LiP2a, LiP2b e LiP0 e da histona H2A (MOLANO et al.,
2003); h) outra proteína ribossomal ácida de L. infantum, LiP2a (SOTO et al., 2000); i) uma
fração de 24 kDa do receptor de proteína cinase ativada (rLACK) recombinante de L. major
(WEBB, 1996; SJOLANDER, 1998b).
2.2.4.1.1.3. Terceira geração
As vacinas de terceira geração compostas por DNA. Na maioria das vezes, utilizam-se como
candidatos à vacina plasmídeos codificando proteína(s) imunogênica(s) ou epitopos antigênicos.
Algumas das vantagens do emprego de plasmídeo são as facilidades de: a) produção em larga
escala, b) a caracterização molecular, c) estabilidade à temperatura ambiente, d) custos
relativamente baixo e e) indução de memória imunológica prolongada (GURUNATHAN, 2000).
Vários plasmídeos já foram testados, dentre os quais encontra-se um, o plasmídeo que codifica a
proteína gp63. Em camundongos, a injeção desse plasmídeo induziu uma resposta mais intensa
do que a alcançada pela proteína gp63 purificada (HANDMAN, 1990). Resultados similares
foram obtidos com o plasmídeo que codifica a proteína LACK (GURUNATHAN, et al., 1997).
2.2.4.1.2. Uso de Adjuvantes (Adjuvante de Freund, Hidróxido de Alumínio, Saponina,
Óleo de Amendoim, IL-12)
A resposta imune induzida por imunização pode variar na dependência do local da
administração do antígeno, associação à resposta inflamatória e do estado imunológico do
indivíduo (ADA, 2001). Substâncias naturais ou sintéticas adicionadas a antígenos que
favorecerem respostas imunes mais intensas são denominadas: adjuvantes (CHIN & SAN GIL,
1998). As substâncias adjuvantes também podem favorecer o desenvolvimento de uma resposta
imune de maior duração ou de instalação mais precoce (GUPTA & SIBER, 1995).
Essas substâncias podem modificar a resposta imune devido à capacidade que eles têm de:
a) suscitar inflamação no local onde foi administrado o antígeno, aumentando possibilidade de
contato de antígenos e células que são atraídas para o sítio da inflamação; b) promover formação
de um reservatório de antígeno de onde irá ocorrer a liberação de forma lenta e prolongada,
favorecendo assim, uma interação maior com os macrófagos (RUSH & FLAMINIO, 2000).
O adjuvante de Freund é composto por um óleo mineral livre de compostos aromáticos
policíclicos (forma incompleta) que pode ser associado a bactérias inativadas (Mycobacterium
tuberculosis ou Mycobacterium butyricum), passando a ser denominado de adjuvante completo
de Freund. Esse adjuvante, embora seja útil nas imunizações experimentais em camundongos,
quando utilizado no cão, pode ocasionar febre, intensa inflamação e a formação de abscesso no
local da injeção, tornando o seu uso inapropriado em tais animais (JOHNSTON et al., 1991;
SMITH et al., 1992; LEENAARS et al., 1997; FERBER et al., 1999).
Em princípio, óleos vegetais poderiam substituir o óleo mineral usado como veículo no
adjuvante completo de Freund (AUDIBERT et al., 1975; UPADHYAY et al., 1992;
EGHAFONA, 1996; HOURIANE, 1997). Dentre estes óleos vegetais, o óleo de amendoim
(HOURIANE, 1997) poderia ser usado na substituição uma vez que esse óleo promove uma
reação tecidual menor que aquela induzida por óleo mineral (STRAW et al., 1985). Durante o
desenvolvimento de vacina contra influenza, preparação de antígenos com óleo de amendoim
mostrou-se superior as preparações aquosas na capacidade de induz resposta imune (SMITH et
al., 1975). Entretanto, em experimentos visando a proteção contra a pleuropneumonia causada
pelo Actinobacillus pleuropneumoniae do tipo 1, que acomete suínos, uma preparação de
antígenos com óleo de amendoim proporcionou resultados inferiores aos obtidos com uma
preparação com saponina (RIOUX, et al., 1997) .
O Hidróxido de Alumínio (Al(OH)
3
) é um dos componentes de diversas vacinas
veterinárias (GOTO et al., 1993). Este adjuvante induz o aumento na migração de leucócitos para
o local de inoculação (SCHIRMBECK et al., 1994), estimula principalmente a imunidade
humoral e tende a não promover a indução de resposta mediada por células (SCHIRMBECK et
al., 1994; BURGHAUS te al., 1996; YANG et al., 1999; GHOSH & HOTEZ, 1999).
A saponina é um potente adjuvante derivado de espécies da planta da Calliandra, uma
substância terpenóide (MARCIANI et al., 2003) que vem sendo testada em diversas vacinas
contra patógenos intracelulares, acarretando tanto uma resposta humoral como celular (KENSIL
et al., 1991; PEREIRA DA SILVA et al., 2005).
Um outro importante adjuvante é a citocina IL-12. Está citocina desempenha um
importante papel na diferenciação e expansão de linfócitos T CD4+ do tipo T
H
1, estimulando a
produção de citocinas, principalmente o IFN-gama (STOBIE te al., 2000; MANETTI, 1994
2.2.5. Relevância
Gerar informações referentes a indução de reposta imune, em camundongos, contra um
antígeno recombinante (Lc9) candidato a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral
canina. Definir adjuvante(s) a ser(em) testado(s) futuramente em associação com Lc9 no cão.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Avaliar a capacidade de diferentes adjuvantes em promover resposta imune específica, em
camundongos, a um antígeno candidato a componente de uma vacina contra leishmaniose
visceral canina.
3.2. Objetivos Específicos:
Em camundongos injetados com a associação de um antígeno recombinante de
Leishmania chagasi/infantum e diversos adjuvantes diferentes (Adjuvante de Feund, saponina,
óleo de amendoim, hidróxido de alumínio ou plasmídeo codificando IL-12 murina de cadeia
única), avaliar a:
a) Produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1;
b) Resposta proliferativa de esplenócitos após estimulação específica in vitro;
c) Produção de citocinas (IFN-gama, IL-4 e IL-5) em sobrenadantes de esplenócitos após
estimulação específica in vitro.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Antígenos
4.1.1 Produção de extrato bruto de antígenos de Leishmania chagasi/infantum
Formas promastigotas da cepa de Leishmania chagasi MHOM/BR2000/Merivaldo2 foi
utilizada para a preparação de extrato bruto de antígenos de Leishmania. Essa cepa foi isolada
inicialmente através de punção esplênica de um paciente com quadro clínico de leishmaniose
visceral oriundo de Jequié-BA (PARANHOS-SILVA et al., 2001). A partir do isolamento e
expansão, alíquotas de formas promastigotas dessa cepa de L. chagasi foram armazenadas em
nitrogênio líquido. A cepa foi mantida em nosso laboratório através de cultivo em meio
Schneiders (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA) ou de passagens sucessivas em hamsters. A
infecção de hamsters foi realizada por injeção intraperitoneal de 1 x 10
7
formas promastigotas de
cultura ou de suspensão de fragmentos macerados de baço ou fígado de um hamsters previamente
infectado.
Para obtenção de formas promastigotas de L. chagasi/infantum, um fragmento de baço ou
fígado de hamster infectado foi macerado e incubado em meio de cultura Schneiders (Sigma-
Aldrich), pH 7.2, suplementado com 20% de soro bovino fetal inativado (SFB, Gibco BRL Life
Technologies, EUA), a temperatura de 24° C, conforme método descrito por Paranhos-Silva e
colaboradores (PARANHOS-SILVA et al., 1996). Formas promastigotas geradas foram
transferidas para frascos de cultura e submetidas passagens sucessivas em volumes de cultura
cada vez maiores. Volumes de meio de cultura com Leihsmania na fase logarítmica ou na fase
estacionária de multiplicação foram misturados de modo a originar uma suspensão com
proporção de 30 % e 70 % de parasitos da primeira e da última fase, respectivamente, conforme
descrito por Rodrigues, 2004. A suspensão resultante foi centrifugada a 500 g, a 4°C, por 10
minutos. Em seguida, os parasitos foram lavados três vezes com PBS a 15 mM, pH 7,2. O
sedimento obtido após a última lavagem, exibindo 7,5 X 10
9
parasitos por ml, foi ressuspenso
com 17 mL de PBS, pH 7.2, com inibidores enzimáticos para inibir proteólise, nas seguintes
concentrações finais: antipaína 5 µg/ml, fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 1 mM, pepstatina
A 5 µg/ml, L-trans-epoxisuccinil-L-leucilamino-4-guanidinobutano (E-64) 8 µM, leupeptina 5
µg/ml (Sigma-Aldrich). A suspensão foi submetida a sonicação com cinco pulsos de 40 Hz, sob
gelo. Os pulsos foram realizados cada um com dez segundos de duração, com intervalo de 60
segundos entre cada dois pulsos consecutivos, usando-se o aparelho Ultrasonic Processor (PGC
Scientifics, Gaithersburg, Maryland, EUA). Depois desse processo, a concentração protéica foi
mensurada pelo método da fluorescamina, conforme método descrito em Udenfriend et al., 1972
e Bohlen et al., 1973. Algumas amostras, antes de serem armazenadas a – 20° C, foram
submetidas à esterilização por irradiação gama para uso posterior em ensaios celulares. Para isso,
tubos Eppendorf com amostra de extrato bruto de antígenos, colocados em um saco contendo
gelo, foram expostos a 60.000 rads, usando-se um irradiador gama IBL Cs
137
(CIS Bio
International, Gif-Sur-Yvette Cedex, França).
4.1.2 Produção do antígeno recombinante Lc9 de Leishmania chagasi/infantum
Pesquisadores do laboratório LPBI do Centro de Pesquisa Gonçalo Muniz (CPqGM –
FIOCRUZ) confeccionaram uma biblioteca de DNA complementar (cDNA) de formas
amastigotas da L. chagasi (cepa MHOM/BR2000/Merivaldo2) em fago lambda (fago lambda
ZAP Express, Stratagene, La Jolla, CA, EUA) visando o desenvolvimento de uma vacina, um
método imunoterápico e ensaios imunodiagnósticos para a leishmaniose visceral humana ou
canina utilizando antígenos protéicos recombinantes de Leishmania chagasi/infantum.
Foram selecionados clones de fagos recombinantes produzindo, em Escherichia coli,
antígenos capazes de reagir com anticorpos de uma mistura de soros de quatro cães naturalmente
infectados por Leishmania, que apresentavam resposta imune humoral e celular específicas. Após
a seleção foram submetidos à excisão, seguindo-se recomendações da Stratagene, de modo a
gerar clones correspondentes de fagímideos (plasmídeos que exibem a seqüência COS de fago
lambda). Um desses clones de plasmídeo foi denominado pBKCMV-Lc9 (Teixeira, MCA, dados
não publicados). A seqüência de DNA das extremidades 5’e 3’do inserto desse clone foi
determinada e o gene que codifica o polipeptídio foi identificado no genoma de Leishmania
infantum do banco de dados do Instituto Sanger (http://www.genedb.org/genedb/linfantum/),
através de uma colaboração com o Dr. Osvaldo Pompilio de Melo Neto do Departamento de
Microbiologia do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (FIOCRUZ, Recife, PE). Parte do
inserto codificando o polipeptídeo Lc9 foi subclonado em pRSET (Invitrogen, Carlsbad,
California, EUA), gerando a construção pRSETB-Lc9, capaz de promover super-expressão do
polipeptídeo recombinante Lc9 na linhagem de Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (Invitrogen).
O plasmídeo pRSET acrescenta, na extremidade amina do polipeptídio recombinante, uma
seqüência de seis histidinas.
Para a produção de proteína recombinante Lc9, cinco litros de cultura de E. coli da cepa
BL21(DE3)pLysS (Invitrogen) transformada com a construção plasmideal pRSETB-Lc9 foram
utilizados. Resumidamente, uma colônia de E. coli foi inoculada em um volume 50 ml de meio
de cultura Luria-Bertani com 50 µg/ml de ampicilina (Sigma-Aldrich) e 35 µg/ml de
cloranfenicol (Sigma-Aldrich), a 37° C, sob agitação constante a 250 rpm, por aproximadamente
16 horas. Após esse período, frascos Ehrlenmeyer de 2000 ml receberam volumes de 6 a 16 ml de
suspensão bacteriana e meio de cultura LB para alcançar 400 ml por frasco. Os frascos
Ehrlenmeyer foram incubados, a 37° C, sob agitação constante a 250 rpm (aproximadamente 3
horas). Quando a medida da densidade óptica da cultura, avaliada a 600 nm, atingiu um valor
entre 0,4 e 0,6, isopropil-thio-β-D-galactosídio (IPTG, Invitrogen) foi acrescentado para obter-se
a concentração final de 0,25 mM, com a finalidade de induzir a produção da proteína
recombinante. Depois disso, cada frasco Erlenmeyer foi incubado por mais três horas nas
condições indicadas acima. A suspensão bacteriana de cada frasco foi centrifugada a 5.000 g, a 4°
C, por 15 minutos, sendo o sedimento pesado e armazenado a –20° C até o momento do uso.
Sedimentos obtidos a partir de alíquotas de um mililitro da cultura de bactéria, coletadas antes e
após três horas de indução com IPTG, foram usadas para avaliação da produção da proteína
recombinante.
4.1.2.1 Purificação
A proteína recombinante de Leishmania chagasi/infantum Lc9 foi purificada usando-se
uma coluna cromatografia de afinidade preparada com sefarose quelada por níquel (“Sepharose
Chelating Sepharose Fast Flow”, Amersham Biosciences Corp., New Jersey, EUA), seguindo-se
as recomendações do fabricante. Resumidamente, sedimento bacteriano de 5 litros do cultivo de
bactéria [BL21(DE3)pLysS transformada com pRSETB-Lc9], pesando 8.5 g, foi descongelado a
4° C e ressuspenso em tampão de lise, com auxílio de um agitador vórtex (Labnet, Woodbridge,
NJ). Para cada grama de sedimento usaram-se três mililitros de tampão de lise. Um miligrama de
lisozima (Sigma) foi acrescentado para cada mililitro da suspensão. Em seguida, o tubo foi
incubado por 20 minutos sobre gelo. Posteriormente, para auxiliar no processo de lise bacteriana,
foram adicionados quatro miligramas de ácido deoxicólico (Fisher Scientific GmbH, Schwerte,
Germany) para cada grama do sedimento bacteriano original. O material foi, então, incubado a
37ºC, durante 15 minutos, em banho-maria. Depois disso, o conteúdo do tubo foi submetido a
sonicação sob gelo. A sonicação foi realizada pela aplicação de quatro pulsos ultrassônicos com
potência de 300 Watts, cada pulso teve 30 segundos duração e os intervalos entre cada dois
pulsos consecutivos foram de 10 segundos, usando-se um aparelho ultrasonicador (Sonifier Cell
Disruptor, Branson Sonic Power Company, Danbury, Conneticut, EUA). A suspensão resultante
foi centrifugada a 17.000 g, 4° C, por 15 minutos. O sobrenadante e o sedimento, esse último
depois de três lavagens com tampão de lise, foram separadamente transferidos para tubos Falcon
de 50 ml, os quais foram armazenados a -20° C até o uso. Uma amostra do sobrenadante e outra
do sedimento, retiradas antes do armazenamento, foram analisadas através de gel de
poliacrilamida em duodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE, Laemmli, 1970) para determinar-se
qual das duas frações exibia maior enriquecimento da proteína recombinante Lc9. A análise
revelou que a fração solúvel exibia cerva de 80 % da proteína Lc9 produzida em E. coli.
Um volume de 25 ml de proteínas da fração solúvel de bactéria BL21(DE3)pLysS-
pRSET-Lc9 foi aplicado, oito vezes, sobre uma coluna de 2 ml da resina sefarose-níquel
(“Sepharose Chelating Sepharose Fast Flow”, Amersham Biosciences Corp., New Jersey, EUA),
preparada seguindo-se as recomendações do fabricante. Resumidamente, para preparação da
coluna, 2 ml de resina foram lavadas três vezes com 10ml água destilada de cada vez e, em
seguida, expostas a um volume de 1.5ml de NiSO4 (Merck, São Paulo, São Paulo, Brasil) a 100
mM, por 15 minutos. A resina foi então lavada mais três vezes com água destilada e equilibrada
com 10ml de tampão de lise e depois transferida para o suporte da resina. Após drenagem do
tampão de lise, foram aplicados, em cada passagem, 3 ml da fração solúvel mencionada acima. A
resina foi lavada três vezes com 10 ml de tampão de lavagem, de cada vez e, em seguida,
proteínas foram eluídas da coluna com quatro lavagens de 04 ml de tampão de eluição, de cada
vez. Amostra do efluente da coluna, obtida após aplicação das proteínas, durante a lavagem e
durante a eluição, foram coletados para análise em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato
de sódio (SDS-PAGE), juntamente com material aplicado na coluna para avaliação do processo
de purificação da proteína recombinante. As frações cromatrográficas exibindo Lc9 foram
reunidas e submetidas à diálise contra PBS, pH 7.2, realizada em três banhos de 8 horas a 4° C.
Após a diálise, a fração solúvel obtida após a centrifugação a 17000 g durante 15 minutos a 4° C,
foi quantificada através do método da fluorescamina (Sigma-Aldrich) de determinação protéica, e
armazenadas, em PBS, a -20° C até o momento de uso. Algumas amostras, antes de serem
armazenadas, foram submetidas à esterilização por irradiação gama, como descrito anteriormente,
para uso posterior em ensaios celulares.
4.2 Adjuvantes
Visando a identificação de adjuvantes capazes de induzir resposta imune,
predominantemente do tipo T
H
1 a antígenos recombinantes de Leishmania chagasi/infantum
coadministrados, os seguintes adjuvantes foram avaliados em associação com Lc9 na imunização
de camundongos: adjuvante de Freund (Sigma-Aldrich), óleo de amendoin (Sigma-Aldrich),
hidróxido de alumínio (alum, Pepsamar, Sanofi-Synthelabo, Rio de Janeiro, Brasil), saponina
(Sigma, USA) e interleucina 12 (IL-12, na forma de DNA plasmideal).
4.2.1. Adjuvante de Freund
Emulsões foram preparadas com adjuvante de Freund completo ou incompleto (Sigma-
Aldrich) e Lc9. Para isso, volumes iguais de adjuvante de Freund e de Lc9 em PBS na
concentração de 1 mg/ml foram misturados.
4.2.2. Óleo de amendoim
Emulsões foram preparadas com óleo de amendoim e Lc9. Para isso, inicialmente, 30
miligramas de goma arábica (JB Química Indústria e Comércio Ltda, Suzano - SP) foram
misturados a cada mililitro de óleo de amendoim para favorecer a formação de emulsão. Depois,
volumes iguais de óleo de amendoim com goma arábica e Lc9 em PBS na concentração de 1
mg/ml foram misturados.
4.2.3. Hidróxido de alumínio (alum)
Volumes iguais de Pepsamar (Sanofi-Synthelabo) e de Lc9 em PBS na concentração de 1
mg/ml foram misturados.
4.2.4. Saponina
Volumes iguais de saponina (Sigma-Aldrich) em salina e Lc9 em PBS, ambos na
concentração de 1 mg/ml, foram misturados.
4.2.5. plasmídeo codificando cadeia única de IL-12 murina, pcDNA3.1-scmu-IL-12
Usando um inserto codificando IL-12 murina de cadeia única (Noormohammadi et al.,
2001), confeccionada com pCI-neo (Promega Corporation,
Madison, EUA), que foi doada ao
nosso grupo de pesquisa por Dra. Emanuela Handman (Eliza and Walter Institute, Melbourne,
Austrália), foi elaborada a construção plasmideal pcDNA3.1-scmu-IL-12 (Barrouin-Melo et al,
dados não publicados). Para a realização de experimentos envolvendo eletroporação, um
eletroporador foi projetado e construído por Dr. Yuri Pepe, Departamento de Física da
Universidade Federal da Bahia.
Plasmídeo codificando IL-12 murina, foi purificado a partir de E. coli da cepa a TOP10F’
(Invitrogen, Carlsbad, California, EUA), transformada com pcDNA3.1-scmu-IL-12, usando-se
reagentes, materiais e coluna de troca iônica da Qiagen QIAGEN (Plasmid Mega Kit, QIAGEN
Inc., Valencia, CA, EUA), seguindo-se as recomendações do fabricante. Resumidamente, uma
colônia isolada de E. coli, TOP10F’-pcDNA3.1-scmu-IL-12, foi cultivada em caldo de cultura
Luria Bertrani com 100 µg/mL de ampicilina (Sigma-Aldrich). O sedimento bacteriano obtido
por centrifugação foi armazenado a -20° C até o momento do uso. O sedimento bacteriano foi
usado para a realização do método lise alkalina. O sobrenadante gerado foi aplicado a uma coluna
de troca-iônica. A coluna lavada e o DNA plasmideal foi eluído. Em seguida, DNA plasmideal
foi precipitado, lavado com etanol, resuspenso em salina, e a medida da densidade óptica a 260 e
280 nm foi determinada para estimar a concentração de DNA e a pureza da preparação. A partir
daí, foram feitas alíquotas de 5,6 mg/ml, as quais foram armazenadas a -20° C até o uso.
4.3 Animais
Foram utilizados 42 camundongos fêmeas da linhagem isogênica BALB/c, com oito
semanas de idade, produzidos pelo biotério do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz (CPqGM-
FIOCRUZ-Salvador-Bahia). Foram formados sete grupos de seis animais, (denominados: G1,
G2, G3, G4, G5, G6 e G7). Os camundongos foram alojados em caixas de 30x19,5x12 cm, seis
animais por caixa, durante todo o período do experimento, no biotério do CPqGM, sob condições
adequadas de temperatura (21 ± 1° C) e de umidade (50 - 60 %). Os animais foram mantidos com
alimentação e água ad libitum.
4.4 Imunização
Os animais foram imunizados três vezes, por via subcutânea na região dos flancos, com
intervalo de 21 dias, nos dias 0, 21 e 42 do experimento. Em cada imunização, foram injetados de
cada flanco 100 µl de salina (grupo controle negativo, G1), Lc9 em salina (G2 e G7), Lc9 em
emulsão (preparada com adjuvante de Freund, G3, óleo de amendoim, G5), Lc9 em combinanção
com hidróxido de alumínio (G6) ou saponina (G4). Portanto, quando antígeno recombinante foi
usado, cada animal foi injetado 100 µg de Lc9 cada vez, sendo 50 µg em cada flanco. Além
disso, imediatamente antes de cada imunização, os animais do grupo G7 foram injetados com
plasmídeo cDNA3.1-scmu-IL-12 e submetidos a eletroporação (MIR et al., 1999; MIR & GEHL,
1999; GEHL, et al.,1999; LUCAS & HELLER, 2001). Para isso, os animais foram previamente
anestesiados com 100 mg/kg de quetamina (Agribrands do Brasil Ltda, Paulínia, SP) e 15 mg/kg
de xilazina (Bayer S.A., São Paulo, SP) por via intraperitoneal. Depois disso, cada animal desse
grupo foi injetado, por via muscular, na região do quadriceps, com 50 µl de plasmídeo na
concentração de 1 mg/ml. Em seguida, eletrodos do eletroporador foram introduzidos na região
muscular e foram aplicados cinco pulsos elétricos de 100 volts/cm, com duração de 20
milisegundos por pulso e intervalo de um segundo entre cada dois pulsos consecutivos.
4.5 Avaliação da resposta imune
A avaliação da resposta imune dos camundongos imunizados com Lc9 foi avaliada nas
duas vertentes, a humoral e a celular, em cada animal. A resposta imune humoral foi avaliada
pela mensuração da produção de anticorpos específicos no soro, enquanto que a resposta imune
celular foi avaliada pela mensuração da proliferação de esplenócitos e da produção de citocinas
após estimulação específica in vitro.
4.5.1 Avaliação da resposta imune humoral
A avaliação da produção de anticorpos (IgG total ou subclasses IgG1 e IgG2a) anti-
Leishmania (extrato bruto de antígenos ou antígeno recombinante) foi realizada em amostras de
soro obtidas 10 dias após a terceira dose de imunização (dia 52 do experimento), realizando-se
ensaios imunoenzimáticos em fase sólida (ELISAs).
Para obtenção dos soros, amostra de sangue de cada animal, coletada pelo plexo retro-
orbitário após aplicação de uma gota de anestésico (cloridrato de proximetacaína a 0,5 %,
Anestalcon, Alcon Laboratórios do Brasil Ltda, São Paulo, SP) na mucosa ocular, em tubo
Eppendorf foi incubada a temperatura ambiente por 1 a 2 horas para permitir a coagulação.
Depois disso, os tubos Eppendorf foram centrifugados a 1500 g e a temperatura ambiente, por 10
minutos. As amostras de soro coletadas foram armazenadas a -20 °C até o momento de uso.
4.5.1.1 Produção de anticorpos da classe IgG
Para avaliar a produção de anticorpos específicos da classe IgG, ensaios
imunoenzimáticos foram realizados em placas de microtitulação de poliestireno com 96 poços
(Cliniplate, Thermo Labsystems, Helsinki, Finlândia). Poços das placas de microtitulação foram
sensibilizados com 100 µL de Lc9 a 5 µg/ml ou 100 µL de extrato bruto de antígenos de
Leishmania chagasi/infantum (10 µg/ml) diluídos em tampão carbonato-bicarbonato de sódio 0,1
M, por 16 horas, a 4° C. Após a sensibilização, os poços das placas foram lavados duas vezes
com PBS. Em seguida, os poços foram incubados por 1 h, a 37° C com 200 µl/poço de leite
Molico Nestlé desnatado (Nestlé Brasil Ltda, São Paulo, SP) a 10 % em PBS (m/v). Os poços
foram lavados três vezes com PBS contendo 0,05 % de Tween 20 (v/v, PBS-T, Sigma-Aldrich).
Cem microlitros de cada amostra de soro diluída foram colocados por poço e as placas foram
incubadas por 1 h, a 37° C. As amostras de soros foram testadas nas diluições de 1:200, 1:1000,
1:5000, 1:25000 e 1: 125000 em PBS-T, com 10% de leite desnatado. Para controles negativo e
positivo de ensaio, foram usados soros de camundongos C3Hej injetados com salina ou com a
proteína recombinante Lc9 associada a saponina, respectivamente, obtidos em um experimento
realizado previamente. Os poços das placas de microtitulação foram lavados 3 vezes com PBS-T.
Cem microlitros de anticorpo de cabra conjugado a peroxidase anti-IgG de camundongo (Sigma-
Aldrich) diluído a 1: 400 em PBS-T com 10 % de leite desnatado foram colocados por poço e as
placas foram incubadas por 1 h, a 37° C. Os poços foram lavados 3 vezes com PBS-T e a reação
foi revelada pela adição de 150µL substrato tetrametilbenzidina (TMB; Sigma), por 30 minutos, a
temperatura ambiente e ao abrigo de luz. O substrato foi preparado pela mistura de 150µL de
TMB (10mg/mL), 2,91mL de acetato de sódio 0,05M (Sigma), 90µL de ácido cítrico 0,5M
(Sigma), 12mL de água destilada e 15µL de peróxido de hidrogênio 30% P.A. (Isofar). A reação
foi neutralizada com 50 µL de ácido sulfúrico 4 M (Quimex). A leitura de densidade óptica foi
realizada com filtro de 450 nm, usando-se um espectrofotômetro modelo Microplate Reader
EL311 (Boehring Mannheim, Mannheim, Alemanha). Os resultados foram expressos em media
dos ponto médios.
4.5.1.2 Produção de anticorpos das subclasses IgG1 e IgG2a
A produção de anticorpos específicos das subclasses IgG1 e IgG2a foi avaliada através de
ensaios imunoenzimáticos realizados, essencialmente, conforme método descrito acima.
Resumidamente, placas de microtitulação com poços sensibilizados com antígeno recombinante
Lc9, submetidos à lavagem, bloqueio e novamente lavagem, receberam 100 µl de amostras de
soros diluídas de 1:50.000, em PBS contendo 10% soro fetal bovino. Após incubação das placas
e lavagem, os poços receberam 100 µl anticorpos de rato anti-IgG1 ou IgG2a de camundongos
conjugado a biotina (Sigma-Aldrich) diluídos a 1:500 em PBS com 10% soro fetal bovino e
incubados por 2 horas a temperatura ambiente seguidas por lavagens. Os poços receberam 100 µl
de avidina-peroxidase (Sigma-Aldrich) 1 mg/ml. As placas foram incubadas por 45 minutos, a
temperatura ambiente, e lavadas. Os poços receberam 150 µl de substrato TMB por 15 minutos.
O substrato foi preparado pela mistura de 1mL de TMB a 1mg/mL em dimethylsulfoxide
(DMSO; Sigma), 9mL de tampão citrato-fosfato 0,05M, pH 5.0 [Fosfato de sódio dibásico 0,2M
(Isofar), ácido cítrico 0,1M (Sigma)] e 2µL de peróxido de hidrogênio 30% P.A
(Isofar).Transcorridos 5 minutos, a reação enzimática foi interrompida pela adição de 50µl/poço
de ácido fosfórico (Quimex) a 1:20 (v/v). Finalmente, foi realizada a leitura da densidade óptica
usando-se filtro de 450 nm.
4.5.2 Avaliação da resposta imune celular
A avaliação da resposta imune celular específica foi realizada quatro semanas após a
terceira dose de imunização (dias 69 a 71 do experimento), através da mensuração da proliferação
de esplenócitos expostos a antígeno recombinante Lc9 ou extrato bruto de antígenos de L.
chagasi/infantum in vitro. Entretanto, um camundongo do grupo G4 e outro do grupo G6 foi
encontrado morto após dois dias da primeira dose de imunização e cerca de 15 dias da segunda
dose de imunização, respectivamente.
4.5.2.1 Avaliação de proliferação celular
O baço de cada animal foi removido em condições assépticas, e transferido para uma
placa de petri de poliestireno (Corning Incorporated, Nova Iorque, EUA) contendo 2 mL de meio
1640 do Instituto Roswell Park Memorial (RPMI 1640, Sigma-Aldrich) e gentamicina a 60
µg/mL (Sigma-Aldrich). Em seguida, o baço de cada animal foi macerado separadamente
gerando uma suspensão celular. Cada suspensão foi submetida à centrifugação a 100 x g, por 15
segundos, para a remoção de debris celulares, e posteriormente, a 450 x g, por 10 minutos, a 4ºC.
Cada sedimento celular foi ressuspenso em 2 mL de meio RPMI 1640 suplementado. A partir daí,
uma amostra de cada suspensão celular foi diluída de 1:10 em azul de tripan 0,4% (Sigma-
Aldrich) e a concentração de células foi determinada, usando-se uma câmara de Newbauer. A
concentração de células de cada suspensão foi ajustada para 3 x 10
6
/ml, usando-se RMPI 1640
suplementado. Células foram cultivadas em placas de microtitulação 96 poços, de poliestireno, de
fundo chato (Costar Corning Inc., Nova Iorque, EUA). Foi acrescentado 3 x 10
5
células por poço,
e estimuladas com meio, 2µg/mL de concanavaliana A (Sigma Chemical Co., EUA), 10 µg/mL
de antígeno total de promastigota de L. chagasi/infantum ou com 0.1, 1 e 10µg/mL de proteína
recombinate Lc9, em um volume final de 200µL por poço. As placas de microtitulação foram
incubadas a 37º C, em atmosfera úmida com CO
2
a 5 %. Após incubação por três dias, para
placas onde células foram incubadas com Con A, e de cinco dias, para placas onde células foram
incubadas com antígenos, 20 µl de RPMI 1640 suplementado contendo 1 µCi de timidina[H]
3+
(Amersham Biosciences, Uppsalla, Suécia) foram acrescentados a cada poço. As placas foram
incubadas por mais 18 horas nas mesmas condições anteriores e, depois disso, foram mantidas a
-20º C até a coleta de células. As células foram coletadas em papel de filtro de fibra de vidro
(Packard Canberra Company, Meriden, EUA) e partículas beta emitidas durante o período de um
minuto (cpm) foram determinadas por um contador beta modelo Matrix 9600 (Packard Canberra
Company).
4.5.2.2 Avaliação da produção de citocinas
Para a mensuração da produção de citocinas (interferon-gama, IL-4 e IL-5) esplenócitos
foram cultivados em placas de 24 poços, de poliestireno, de fundo chato (Costar Corning Inc.).
Para isso, um volume de 300 µl de suspensão de esplenócitos de cada animal na concentração de
3 x 10
6
/ml, cuja obtenção foi descrita acima, foi colocado em cada um de quatro poços de uma
placa. Em seguida, em cada um dos poços, foram acrescentados 300 µl de RMPI 1640
suplementado, 300 µl de concanavaliana A (04 µg/mL), 300 µl de antígeno bruto de L.
chagasi/infantum (20 µg/mL), 300 µl de antígeno recombinante Lc9 (10 µg/mL). As células
foram incubadas durante 48 horas em estufa a 37ºC, em atmosfera úmida com 5% CO
2
. Após
este período, o sobrenadante de cada poço foi centrifugado a 280 x g, durante 5 minutos, à
temperatura ambiente, para a remoção de células e debris celulares e estocado a -20º C.
Ensaios imunoenzimáticos de captura (ELISA) foram utilizados para a mensuração da
concentração de IFN-γ, IL-4 e IL-5 presente em sobrenadantes de esplenócitos cultivados
conforme descrição acima. Para a sensibilização das placas de microtitulação de 96 poços (“High
Binding”; Corning Incorporated Life Sciences) anticorpos de rato monoclonal anti-IFN-γ, anti-
IL-4 murino e anti-IL-5 murino (BD Pharmigen) foram usados na concentração de 2µg/mL, em
um volume de 50 µL/poço, durante 16h de incubação em câmara úmida, a 4ºC. Os poços foram
lavados duas vezes com 200 µL/ poço de PBS-T e em seguida, 200 µL/ poço de PBS contendo
10% de soro bovino fetal (CULTILAB) foram adicionados para bloquear os sítios livres, por 2
horas em câmara úmida, a temperatura ambiente. Diluições duplas e seriadas de IFN-γ murino,
IL-4 e IL-5 recombinante (BD Pharmigen) foram usadas em duplicatas de poços, no volume de
100 µL/poço, para a curva de calibração. As amostras do sobrenadante de cultura foram testadas
em duplicatas com 100 µL/poço, diluídas 1:2, em pool ou individualmente, por 4 horas em
câmara úmida, a temperatura ambiente. Após 4 lavagens dos poços com PBS-T, anticorpos de
detecção biotinilados de rato (BD Pharmigen) para cada uma das citocinas foram usados na
concentração de 2 µg/mL e incubados por 45 minutos em câmara úmida, a temperatura ambiente.
Em seguida, foram feitas 6 lavagens com PBS-T e 100µL/poço de avidina conjugada a
peroxidase (SIGMA), diluída 1:400 foram adicionados e incubados por mais 30 min, sob as
mesmas condições. Os poços foram lavados 8 vezes com PBS-T e a reação foi revelada pela
adição de 100µL/ poço do substrato TMB, preparado pela mistura de 1mL de TMB a 1mg/mL
em DMSO, 9mL de tampão citrato-fosfato e 2µL de peróxido de hidrogênio 30%. A reação foi
neutralizada com a adição de 50 µL de ácido fosfórico, diluído 1:20. A leitura da densidade
óptica a 450 nm foi realizada em espectrofotômetro (Emax Precison Microplate Reader,
Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, EUA), e a concentração de cada citocina
estimada pela comparação dos valores de densidade óptica das duplicatas de cada amostra com os
da curva padrão, usando o programa Softmax 3.0, corrigidas pelo fator de diluição e expressas
em ng/mL ou pg/mL.
4.6. Análise estatística
Com o objetivo de avaliar e compara as respostas humorais, produção de anticorpos, e as
respostas celulares, proliferação e produção de citocinas, obtidas pela associação da proteína
recombinante Lc9 a diferentes adjuvantes análises estatísticas foram realizadas através dos testes
paramétricos de análise de variância (ANOVA) e a comparação entre os grupos foi realizada pelo
pós-teste Tukey. O valor fixado para significância estatística foi de p < 0.05.
KDa
Raias
1 2
3
4 5 6
Lc9
205
116
97
66
45
29
20
14,4
6,5
5. RESULTADOS
5.1 Avaliação da resposta imune
A resposta imune foi avaliada pela mensuração de anticorpos, em amostras de soros, bem
como pela mensuração da resposta proliferativa e da produção de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-5)
por esplenócitos, após estimulação antigênica específica in vitro. Para realização destes ensaios
foi produzida a proteína recombinante Lc9 purificada (Figura 1).
Figura 1. Avaliação da purificação da proteína recombinante de Leishmania chagasi/infantum
Lc9 através de SDS-PAGE. Para a análise foi elaborado um gel de separação de poliacrilamida a
12 % e sistema de tampão com gradiente descontínuo (Laemmli, 1970). Após a corrida
eletroforética, o gel foi corado pelo azul de Coomassie. Raias: 1) marcadores de peso molecular
Bio Rad wide-range; 2) E. coli BL21(DE3)pLysS-pRSETB vazio zero hora; 3) E. coli
BL21(DE3)pLysS-pRSETB vazio três horas após IPTG; 4) E. coli BL21(DE3)pLysS-pRSETB-
Lc9 zero hora; 5) E. coli BL21(DE3)pLysS-pRSETB-Lc9 três horas e 6) Proteína recombinante
Lc9 purificada por cromatografia de afinidade (coluna de sepharose-níquel).
5.1.1. Avaliação da resposta imune humoral específica
A avaliação da resposta imune humoral específica foi realizada pela mensuração da
concentração de anticorpos da classe IgG reativos ao extrato bruto de antígenos ou ao antígeno
recombinante de Leishmania chagasi/infantum Lc9. Além disso, também foi avaliada a
concentração de anticorpos das subclasses IgG1 e IgG2a reativos ao antígeno recombinante Lc9.
Avaliação dos anticorpos da classe IgG foi realizada, por ELISA, em amostras individuais nas
diluições: 1:200, 1:1.000, 1:5.000, 1:25.000 ou 1:125.000, enquanto que, para análise de
anticorpos das subclasses IgG1 e IgG2a, as amostras de soros foram usadas em uma única
diluição: 1:50.000.
5.1.1.1. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG reativos ao extrato bruto de
antígenos de L. chagasi/infantum e Lc9
Para a mensuração da concentração de anticorpos da classe IgG, placas de 96 poços foram
sensibilizadas com extrato bruto de antígenos de L. chagasi/infantum (10 µg/mL) ou com
antígeno recombinante Lc9 (5 µg/mL).
Nos ensaios realizados com extrato bruto de antígenos de L. chagasi, cada um dos
camundongos do grupo controle negativo, composto por animais injetados com salina (G1),
apresentou como recíproca do título de anticorpos (medido na DO de 0.2) um valor inferior a
200. Os grupos de camundongos injetados apenas com Lc9 (G2) ou com Lc9 em associação com
adjuvante de Freund (G3), saponina (G4), óleo de amendoim (G5), alum (G6) ou plasmídeo
codificando IL-12 murina (G7), exibiram as seguintes médias geométricas das recíprocas dos
títulos de soro: 593, 2.123, 7.482, 1.683, 2.767 e 429, respectivamente (Figura 2a). O menor e
maior valor da recíproca do título de soro de cada grupo, na ordem em que foram citados, foram
400 e 1.000, 1.000 e 4.900, 4.900 e 16.000, 800 e 3.100, 2.000 e 4.000, 200 e 1.200,
respectivamente.
A comparação da média geométrica das recíprocas dos títulos de soro dos grupos de
animais, realizada por ANOVA, revelou diferença estatisticamente significante (p < 0,0001).
Além disso, a comparação dos títulos de soro dos grupos de animais, feita com o pós-teste de
Tukey, mostrou a seguinte relação: G4 > G6 = G3 = G5 > G7, G2 e G1 (p < 0.01).
Nos ensaios realizados com a proteína recombinante Lc9, todos os animais do grupo
controle negativo revelaram recíproca do título de anticorpos (medido na DO de 0.7) inferior a
200 (G1). Os grupos injetados somente com a proteína recombinante Lc9 (G2) ou com Lc9 em
combinação com adjuvante de Freund (G3), saponina (G4), óleo de amendoim (G5), alum (G6)
ou plasmídeo codificando IL-12 murina (G7), exibiram as seguintes médias geométricas das
recíprocas dos títulos de soros: 4.645, 14.588, 23.714, 10.914, 14.894, 3.459, respectivamente
(Figura 2b). Os menores e os maiores valores de títulos de soros observados nos grupos
mencionados acima, na ordem citação, foram: 3.050 e 10.000, 13.000 e 15.200, 20.000 e 25.100,
8.000 e 14.000, 13.000 e 16.500, 2.800 e 4.800.
A comparação estatística dos títulos de soro dos grupos de animais, realizada por
ANOVA, mostrou diferença estatisticamente significante (p < 0,0001). Comparação adicional
entre os grupos, usando-se o pós-teste Tukey, mostrou a seguinte relação: G4 > G6 = G3 = G5 >
G2 = G7 > G1 (p < 0.05).
Figura 2. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG reativos ao extrato total de
antígenos de L. chagasi/infantum ou ao antígeno recombinante Lc9 em camundongos BALB/c.
Os camundongos foram injetados três vezes com salina (G1) ou 100 µg da proteína recombinante
Lc9 (G2) ou Lc9 associada a diferentes adjuvantes [adjuvante de Freund (G3), saponina (G4),
óleo de amendoim (G5), alum (G6) ou plasmídeo codificando IL-12 murina na forma de cadeia
única (G9)]. Amostras de soro foram testadas, em duplicatas, nas diluições de 1:200, 1:1000,
1:5000, 1:25000 e 1: 125000. O título de soro de cada animal foi determinado usando-se o valor
de DO, escolhido arbitrariamente dentro da faixa na qual existe uma relação linear entre DO e a
concentração de anticorpos. Em (A) recíprocas dos títulos de soro (medido na DO de 0.2) frente
ao extrato total de antígenos de L. chagasi/infantum. Em (B) recíprocas dos títulos de soro
(medido na DO de 0.7) frente ao antígeno recombinante Lc9. A comparação entre os grupos foi
realizada por ANOVA, revelando p < 0,0001. Pos-teste de Tukey mostrou G4 > G6 = G3 = G5 >
G7, G2 e G1 (p < 0.01) e de G4 > G6 = G3 = G5 > G2 = G7 > G1 (p < 0.05) respectivamente.
5.1.1.2. Avaliação de anticorpos das subclasses IgG2a e IgG1 reativos a Lc9
A análise da produção de anticorpos das subclasses IgG2a e IgG1 reativos ao antígeno
recombinante Lc9 foi realizada em placa de microtitulação de 96 poços cujos poços foram
sensibilizados com 5 µg/ml desse antígeno. As amostra de soro foram testadas, por ELISA, na
diluição de 1:50.000 e os valores de DO correspondentes as amostras foram utilizados para a
comparação entre os grupos.
O grupo de camundongos injetados com salina (G1) apresentou média aritmética e desvio
padrão (X ± SD) de densidade óptica no ensaio para mensuração de IgG2a e de IgG1 de: 0,08 ±
0,02 e 0,07 ± 0,01, respectivamente. Os grupos de animais injetados exclusivamente com Lc9
(G2) ou Lc9 associado a adjuvante de Freund (G3), saponina (G4), óleo de amendoim (G5), alum
(G6), plasmídeo codificando IL-12 por eletroporação (G7), apresentaram os seguintes valores de
densidade óptica para IgG2a e IgG1: 0,16 ± 0,11 e 1,47 ± 0,24; 0,16 ± 0,06 e 1,90 ± 0,10; 1,66 ±
0,22 e 2,16 ± 0,07; 0,15 ± 0,05 e 2,23 ± 0,04; 0,11 ± 0,01 e 2,25 ± 0,08; 0,33 ± 0,27 e
1,92 ± 0,06, respectivamente (Figura 3a). A proporção IgG2a/IgG1 encontrada para os grupos
G2, G3, G4, G5, G6 e G7 foram: 0,10; 0,17; 0,76; 0,06; 0,05; 0,16; respectivamente (Figura 3b).
A comparação estatística entre a proporção de densidade óptica IgG2a/IgG1 dos grupos de
animais, realizada por ANOVA, p < 0,0001. Comparação entre os grupos, usando-se o pós-teste
Tukey, mostrou a seguinte relação: G4 > G6 = G3 = G5 = G2 = G7.
Figura 3. Avaliação da concentração de anticorpos das subclasses IgG2a e IgG1 reativos a
proteína recombinante Lc9 em camundongos BALB/c. Os animais foram injetados três vezes
com salina (G1), 100 µg da proteína recombinante Lc9 (G2) ou 100 µg de Lc9 associada a
adjuvante de Freund (G3), saponina (G4), óleo de amendoim (G5), alum (G6), plasmídeo
codificando IL-12 murina por eletroporação (G7), conforme descrito em Material e Métodos. As
amostras de soro foram avaliadas, em duplicata, na diluição de 1:50.000, anticorpos foram
detectados por anticorpos de rato anti-IgG1 ou anti-IgG2a de camundongo. Em (a) são mostradas
as médias valores de densidade óptica das duplicatas obtidos na avaliação de IgG2a (□) e IgG1
(∆) e em (b) são mostradas as proporções de densidade óptica obtidas para IgG2a/IgG1. A
comparação estatística entre a proporção de densidade óptica IgG2a/IgG1 dos grupos de animais,
realizada por ANOVA, p < 0,0001. Comparação entre os grupos, usando-se o pós-teste Tukey,
mostrou a seguinte relação: G4 > G6 = G3 = G5 = G2 = G7.
5.1.2. Avaliação da resposta imune celular
Para a avaliação da resposta proliferativa de esplenócitos e produção de citocinas (IFN-γ,
IL-4 e IL-5) no sobrenadante de células esplênicas, após estimulação in vitro com Lc9 foi
realizada cerca de quatro semanas após a terceira série de injeções.
5.1.2.1 Avaliação da resposta proliferativa de esplenócitos após estimulação in vitro com
antígeno recombinante Lc9.
As células esplênicas de cada animal, na concentração de 3 x 10
5
células/poço, foram
cultivadas nas seguintes condições: (a) exclusivamente em meio de cultura (controle negativo) ou
com meio de cultura contendo (b) concanavaliana A (Con A, controle positivo de ensaio) a
2 µg/mL, (c) extrato bruto de antígeno de L. chagasi/infantum a 10 µg/mL, ou ainda Lc9 na
concentração de (d) 0,1 µg/mL, (e) 1 µg/mL ou (f) 10 µg/mL. Poços com células submetidas às
condições descritas em (a) e (b) foram mantidos por 3 dias e poços com células submetidas às
condições descritas em (a), (c), (d), (e) ou (f) foram mantidos por 5 dias em ambiente apropriado
de cultura até a adição de timidina radiativa.
Os índices de proliferação [valor de cpm de células cultivadas na presença de estímulo
(Con A) dividido pelo valor de cpm de células cultivadas somente com meio de cultura]
apresentaram média aritmética e desvio padrão (X ± SD) de: 94,07 ± 28,50; 112,1 ± 92,45; 55,43
± 44,55; 36,20 ± 22,30; 45,95 ± 23,29; 34,82 ± 34,54; 126,7 ± 170,6; respectivamente (Figura
4a). A comparação das médias de índice de proliferação, realizada por ANOVA, não revelou
diferença significante entre os grupos. Os valores de cpm relacionados a esses resultados foram
apresentados na Tabela 1.
Os índices de proliferação (X ± SD), correspondentes às condições “c”, “d”, “e”, e “f”,
foram demonstrados na tabela 2 e representados na figura 4b. Os valores de cpm relacionados a
esses resultados foram apresentados na Tabela 3. A comparação das médias dos índices de
proliferação, realizada por ANOVA, revelou diferença significante entre os grupos quando as
células esplênicas foram cultivadas na presença de Lc9 na concentração de 0,1 µg/mL
(p < 0,0001) e 1 µg/mL (p < 0,0001), contudo não mostrou diferença significante quando tais
células foram cultivadas em meio contendo extrato bruto de antígenos de L. chagasi/infantum ou
Lc9 na concentração de 10 µg/mL. Quando o índice de proliferação de esplenócitos submetidos a
estimulação com 1 µg/mL de Lc9 foram comparados entre os grupos, usando-se pós-teste de
Tukey, houve diferença estatística significante entre os animais injetados com a proteína
recombinante associada à saponina em relação aos demais grupos (G4 > G1 = G2 = G3 = G4 =
G5 = G6 = G7, p < 0,01). Resultados semelhantes foram encontrados quando a comparação dos
índices de proliferação foi realizada com o pós-teste de Tukey quando os esplenócitos foram
estimulados com 0.1 µg/mL de proteína recombinante Lc9 (dados não mostrados).
Tabela 1. Valores de cpm da média e desvio padrão.
Condições de cultivo celular
Grupos de
animais
Meio Con A
2 µg/mL
G1 211 ± 74 19.080 ± 6.491
G2 337 ± 408 17.449 ± 2.872
G3 395 ± 252 14.675 ± 6.414
G4 432 ± 503 9.153 ± 3.606
G5 495 ± 248 18.587 ± 4.866
G6 635 ± 398 13.730 ± 2.700
G7 277 ± 177 16.275 ± 5.020
Tabela 2 valores de índice de proliferação da média e desvio padrão.
Condições de cultivo celular
Grupos
de
animais
Ext bruto de
Ag
de L. chagasi
a 10 µg/mL
Lc9 a
0,1 µg/mL
Lc9 a
1 µg/mL
Lc9 a
10 µg/mL
G1 1,8 ± 1,8 6,8 ± 1,9
9,9 ± 3,9 39,4 ± 10,3
G2 4,7 ± 4,2 4 ± 1,3 6,1 ± 3,7 22,1 ± 12,3
G3 2,8 ± 1,6 8,3 ± 3,3
16,2 ± 8,6
33,8 ± 14,6
G4 1,6 ± 0,7 28,6
± 25,8
43 ± 24,2 51,6 ± 31,7
G5 1,6 ± 0,6 4,4 ± 2,2
8,6 ± 4,2 24,7 ± 12,3
G6 1,3 ± 0,5 5,8 ± 4,8
14,9 ± 12,5
33,4 ± 36,3
G7 1,5 ± 0,7 3,1 ± 1,4
5,8 ± 2,4 39,1 ± 25,9
Tabela 3 Valores de cpm da média e desvio padrão.
Condições de cultivo celular
Grupos
de
animais
Meio Ext bruto de Ag
de L. chagasi
a 10 µg/mL
Lc9 a
0,1 µg/mL
Lc9 a
1 µg/mL
Lc9 a
10 µg/mL
G1 161 ± 54 476 ± 261 1.053 ± 242 1.477 ± 462 6.226 ± 2.046
G2 537 ± 757 1.518 ± 1.870 1.736 ± 2.114 2.707 ± 3.389
6.343 ± 3.520
G3 416 ± 309 1.921 ± 1.246 2.970 ± 1.477 5.468 ± 2.836
10.351 ± 2.501
G4 428 ± 353 1.141 ± 1.537 8.598 ± 5.058 12.794 ± 3.572
14.115 ± 3.453
G5 361 ± 206 1.299 ± 805 1.328 ± 489 2.693 ± 1.147
7.513 ± 2.388
G6 639 ± 447 1.914 ± 715 2.351 ± 2.032 6.048 ± 5.244
11.274 ± 5.064
G7 141 ± 86 704 ± 489 366 ± 181 894 ± 690 5.288 ± 3.263
Figura 4. Avaliação da resposta proliferativa de células esplênicas de camundongos BALB/c. Os
animais foram injetados três vezes com salina (G1), 100 µg da proteína recombinante Lc9 (G2)
ou 100 µg de Lc9 associada a adjuvante de Freund (G3), saponina (G4), óleo de amendoim (G5),
alum (G6), plasmídeo codificando IL-12 murina por eletroporação (G7), conforme descrito em
Material e Métodos. Os esplenócitos estimulados com concanavalina A a 2 µg/mL (a) ou
proteína recombinante Lc9 a 1µg/mL da (b). Triplicatas de poços de placas de microtitulação de
96 poços, que receberam 3 x 10
5
células/poço em meio de cultura, com Con A ou com a proteína
recombinante Lc9 foram incubadas por 3 ou 5 dias, respectivamente. Dezoito horas antes da
interrupção da cultura, 1 µCi de timidina tritiada foi acrescentado em cada poço. Índices de
proliferação foram determinados apresentando diferença estatística significante entre os animais
injetados com a proteína recombinante associada à saponina em relação aos demais grupos (G4 >
G1 = G2 = G3 = G4 = G5 = G6 = G7, p < 0,01), quando estimuladas com Lc9 a 1µg/mL.
5.1.2.2 Avaliação da produção de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-5) por esplenócitos, após
estimulação in vitro com Lc9
A avaliação da produção das citocinas IFN-γ, IL-4 e IL-5 foi realizada em sobrenadante
de esplenócitos cultivados por 48 horas nas condições descritas a seguir: a) exclusivamente em
meio de cultura ou meio de cultura contendo b) 2 µg/mL de Con A ou c) 10 µg/mL de antígeno
recombinante Lc9. Em cada poço de uma placa microtitulação de 24 poços, foram cultivados 9 x
10
5
esplenócitos em um volume de 600 µL. A mensuração de IFN-γ dos camundongos foi
realizada individualmente, enquanto que, a mensuração de IL-4 e IL-5 foi realizada em uma
mistura (“pool”), com partes iguais, de sobrenadante de esplenócitos de cada animal do grupo.
Os valores de concentração (X ± SD) encontrados de IFN-γ nos sobrenadantes de
esplenócitos dos grupos salina (G1), Lc9 (G2), Lc9 e adjuvante de Freund (G3), Lc9 e saponina
(G4), Lc9 e óleo de amendoim (G5), Lc9 e alum (G6), e Lc9 e plasmídeo codificando IL-12
murina (G7), quando as células foram cultivadas nas condições “a”, “b” e “c” descritas acima,
foram de: (G1) abaixo do nível de detecção do ensaio (ND); 3,8 ± 0,5 ng/mL; ND; (G2) ND; 3,5
± 0,9 ng/mL; ND; (G3) ND; 3,2 ± 0,5 ng/mL; 0,03 ± 0,06 ng/mL; (G4) ND; 3,7 ± 1,7 ng/mL; 0,9
± 0,8 ng/mL; (G5) ND; 4,0 ± 0,9 ng/mL; ND; (G6) ND; 4,9 ± 0,8 ng/mL; 0,06 ± 0,08 ng/mL;
(G7) ND; 3,4 ± 2,0 ng/mL; ND (Figura 5a e 5b, respectivamente).
A comparação das médias da concentração de IFN-γ em sobrenadante de esplenócitos dos
grupos de animais nas condições de cultivo “a” e “c”, realizada por ANOVA, não mostrou
diferença significante. No entanto, a comparação das médias da concentração de IFN-γ de
correspondentes a esplenócitos cultivados na presença de 10 µg/mL de Lc9 (condição 5b) revelou
diferença estatisticamente significante (p < 0,0015) entre os grupos. A comparação adicional dos
grupos, usando-se o pós-teste de Tukey mostrou uma diferença estatística significante entre o
grupo de animais injetados com a proteína Lc9 associada à saponina aos demais grupos (G4 > G1
= G2 = G3 = G5 = G6 = G7, p < 0,01).
A concentração de IL-4 e IL-5, em ng/mL, das misturas de sobrenadantes de esplenócitos
de cada grupo, quando as células foram cultivadas com meio de cultura contendo Con A, foram
as seguintes: (G1) 1,5; 1,8; (G2) 1,5; 1,6; (G3) 1,4; 1,6; (G4) 1,3; ND; (G5) 1,3; 1,6; (G6) 1,6;
1,9; (G7) ND; ND; respectivamente (Figura 5c e 5e, respectivamente).
A concentração de IL-4 nas misturas de sobrenadantes dos grupos, quando os esplenócitos
foram cultivados somente com meio de cultura ou meio de cultura contendo Lc9 não apresentou
níveis detectáveis (Figura 5d).
Já as concentrações de IL-5 nas misturas de sobrenadantes, de células esplênicas
cultivadas somente meio de cultura ou meio contendo Lc9, foram de: (G1) ND; ND; (G2) ND;
1,7; (G3) ND; ND; (G4) ND; 1,8; (G5) ND; ND; (G6) ND; 1,7; (G7) ND; 1,8; respectivamente
(Figura 5f).
Figura 5. Avaliação da concentração de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-5), em sobrenandante de
células esplênicas de camundongos BALB/c. Os animais foram injetados três vezes com salina
(G1), 100 µg da proteína recombinante Lc9 (G2) ou 100 µg de Lc9 associada a adjuvante de
Freund (G3), saponina (G4), óleo de amendoim (G5), alum (G6), plasmídeo codificando IL-12
murina por eletroporação (G7), conforme descrito em Material e Métodos. Os esplenócitos
foram estimulados in vitro por 48 h com de concanavalina A a 2 µg/mL (A, C e E) ou 10µg/mL
da proteína recombinante Lc9 (B, D e F). A concentração de IFN-γ foi determinada em amostras
individuais de sobrenadante (A e B), enquanto que a concentração de IL-4 (C e D) e IL-5 (E e F)
foram avaliadas em mistura de sobrenadantes de esplenócitos.
6. DISCUSSÃO
Com vista ao desenvolvimento de uma vacina contra leishmaniose visceral canina, no
presente trabalho, foi avaliada a resposta imune de camundongos BALB/c imunizados com um
antígeno recombinante de Leishmania chagasi/infantum denominado Lc9, naturalmente
imunogênico para o cão. Esta proteína foi injetada em associação a diferentes adjuvantes
(adjuvante de Freund, saponina, óleo de amendoim, hidróxido de alumínio ou plasmídeo
codificando cadeia única de IL-12 murino, pcDNA3.1-scmu-IL-12). Como controles, foram
utilizados grupos de camundongos BALB/c injetados com salina ou com Lc9, sem adjuvante.
Todos os grupos de animais injetados com a proteína recombinante desenvolveram
resposta imune humoral específica, detectada pela presença de anticorpos da classe IgG reativos a
extrato bruto de antígenos de Leishmania chagasi/infantum e a Lc9. Em comparação com os
demais, os camundongos injetados com Lc9 em combinação com saponina produziram
significativamente maior quantidade de anticorpos específicos da subclasse IgG2a. Dentre os
animais injetados, o grupo que foi administrado com a combinação Lc9 e saponina foi o único
que apresentou resposta imune celular especifica avaliada pelo ensaio de proliferação de
esplenócitos após a estimulação in vitro com Lc9, bem como foi o único que revelou produção
significante de interferon gama após estimulação especifica in vitro. Além disso, ao avaliarmos a
produção da citocina IL-5, ocorreu produção somente nos grupos: apenas a proteína
recombinante Lc9; saponina; hidróxido de alumínio; e plasmídeo codificando cadeia única de IL-
12 murino, pcDNA3.1-scmu-IL-12. Nenhum dos grupos de animais apresentou produção de IL-4
por esplenócitos estimulados in vitro com Lc9.
A vastidão dos estudos voltados ao desenvolvimento de novas vacinas, iniciados com as
vacinações contra a varíola em 1796 por Edward Jenner (ABBAS & LICHTMAN, 2003), está
relacionada com a quantidade de organismos, entre bactérias, vírus, parasitas, e fungos,
envolvidos no desenvolvimento de diversas patologias. Desta forma, o desenvolvimento de
mecanismos que possam estimular e/ou mobilizar a resposta imunológica dos organismos frente a
tais patógenos se torna uma importante ferramenta no combate a tais patógenos (HANDMAN,
1997; MACKAY, et al., 2001). De certo, as vacinas propiciam uma proteção a infecções
estimulando o desenvolvimento de células direcionadas a destruição de um patógeno especifico
(HANDMAN, 1997; SANTOS et al., 1999; SKEILY et al., 2002). Inúmeras proteínas
recombinantes, antígenos sintéticos, oriundas das diversas espécies de Leishmania vêm
demonstrando eficácia na elaboração de vacinas contra a leishmaniose, em modelos murinos.
Estes antígenos apresentam diversas vantagens quando comparados a outras substâncias
imunogênicas utilizadas nas vacinações. Dentre elas, a praticidade nos métodos empregados na
produção e purificação destas proteínas (como descrito em Materiais e Métodos), e na qualidade
do material obtido (COLER & REED, 2005), fazendo destas proteínas recombinantes valiosas
ferramentas.
Em experimentos preliminares realizados em nosso laboratório, dois antígenos
recombinantes de L. chagasi/infantum (Lc9 ou Lc13) foram separadamente injetados em
associação com adjuvante de Freund em camundongos e mostraram-se capazes de induzir a
produção de anticorpos. No presente trabalho, foi imunogenicidade de Lc9 para camundongos foi
confirmada. Após a imunização com Lc9, os títulos de anticorpos (IgG total) anti-Lc9 foram
maiores quando comparados aos títulos encontrados anti-leishmania. Um dos possíveis motivos
para esta discriminação está na representatividade desta proteína recombinante na forma
promastigota da L. chagasi/infantum, uma vez que tal proteína foi selecionada a partir de formas
amastigotas da L. chagasi/infantum. Achados semelhantes foram observadas em um estudo no
qual camundongos foram injetedos com plasmídeo codificando Lc9 (RODRIGUES, 2004).
Embora os anticorpos tenham pouca ou nenhuma importância na proteção contra infecção
por Leishmania (Bogdan et al., 1996), a avaliação da produção de anticorpos pode proporcionar
informações úteis a respeito da imunogenicidade de diferentes candidatos a vacinas
(SJOLANDER et al., 1998b).
Vários autores observaram que um mesmo antígeno pode induzir diferentes respostas
imunes, na dependência de sua associação com adjuvantes (BRUGH, et al., 1983; STRAW, et
al., 1985; DALY & LONG, et al., 1996; EGHAFONA, 1996; SANTOS et al., 1999; SANTOS et
al., 2002).
Straw e colaboradores (1985), estudaram a resposta imune de camundongos após injecao
de antígenos de Haemophilus pleuropneumoniae em combinação a diferentes adjuvantes,
incluindo o adjuvante incompleto de Freund e hidróxido de alumínio.
Brugh e colaboradores (1983) e Eghafona (1996) avaliaram a utilização de diferentes
emulsões, tanto com óleos minerais como com óleos vegetais, durante o desenvolvimento de
vacina contra a doença de Newcastle (pneumoencefalite aviária viral) ou contra o sarampo,
respectivamente.
Santos e colaboradores, 1999, avaliaram o uso de adjuvante de Freund, a saponina e o
hidróxido de alumínio no desenvolvimento de vacina contra a leishmaniose. Estes mesmos
autores, em 2002, avaliaram a resposta imune de camundongos após a injeção de FML em
combinação com saponina, IL-12 ou BCG.
No presente trabalho, comparando os grupos de camundongos nos quais Lc9 foi injetada
em associação a diferentes adjuvantes (Adjuvante de Freud, Saponina, Óleo de Amendoim e IL-
12) com o grupo de animais injetados exclusivamente com Lc9, os primeiros desenvolveral
títulos mais elevados de anticorpos específicos para Lc9 e para extrato bruto de Leishmania, com
aos grupos imunizados com esta proteína, sendo exceção ao grupo que recebeu o plasmídeo
codificando IL-12 murino. A relação entre as médias geométricas das recíprocas dos títulos de
anticorpos encontrados foi de 3,1; 5,1; 2,3; 3,2; e 0.7 dos grupos: adjuvante de Freund; saponina;
óleo de amendoim; hidróxido de alumínio; e plasmídeo codificando IL-12 murino na forma de
cadeia única; respectivamente. A saponina foi o adjuvante que apresentou a maior capacidade em
induzir a produção de anticorpos.
A resposta imune esperada contra patógenos intracelulares envolve as células da
subpopulação T
H
1 (WILSON et al., 1995; GURUNATHAN et al., 1997; MELBY et al., 2001;
GONZALO et al., 2001; DUMONTEIL et al., 2003). Neste sentido, a avaliação das subclasses
de anticorpos IgG produzidos nos animais podem indicar um envolvimento de linfócitos T CD4+
do tipo T
H
1 e/ou T
H
2. Assim, mesmo com valores de IgG total sendo similares, observa-se uma
diferenciação entre os subtipos de anticorpos (IgG2a e IgG1) em linhagens diferentes de
camundongos, quando infectados com L. chagasi/infantum, relacionando-se com a cura (IgG2a)
ou com o desenvolvimento da doença (IgG1) (HONOREÉ, et al., 1998). Desta maneira uma
resposta T
H
1 estaria relacionada com a produção de anticorpos da classe IgG2a (MOSMANN et
al., 1986; GURUNATHAN et al., 1997; HONOREÉ et al., 1998; PARAGUAIA de SOUZA et
al., 2001; SANTOS et al., 2002, CAMPBELL et al., 2003), enquanto os linfócitos T
H
2 estão
envolvidos com a produção de anticorpos de classe IgG1 (MOSMANN et al., 1986;
GURUNATHAN et al., 1997; HONOREÉ et al., 1998; SJÖLANDER et al., 1998; GHOSH et
al., 2002; CAMPBELL et al., 2003).
Esta dicotomia T
H
1/T
H
2 relacionada com as subclasses dos anticorpos IgG foi notada
predominantemente no grupo imunizado com a proteína recombinante agregada a saponina
sugerindo uma possível resposta mista T
H
1/T
H
2, com produção tanto de IgG2a quanto IgG1. Ao
passo que, os demais adjuvantes aqui testados produziram principalmente a subclasse IgG1,
estando relacionados a uma resposta T
H
2. Estes resultados estão em consonância com a literatura,
salva guardados alguns relatos onde não se observam boas correlações entre estas associações
(SOLANO-GALLEGO et al., 2000).
Desta maneira, a avaliação linfoproliferativa, onde se avalia a capacidade celular em
proliferar frente a um determinado antígeno, torna-se um valioso instrumento. Nas avaliações
linfoproliferativas de cães acometidos com a Leismaniose visceral, animais sintomáticos de área
endêmica, exprimiram uma redução da resposta linfoproliferativa quando estimulados com
antígenos parasitários, manifestando uma supressão da imunidade mediada por células durante a
progressão da doença. Por outro lado, cães assintomáticos exibiram linfoproliferação aumentada
contra antígenos de Leishmania (PINELLI, 1994; DE LUNA et al., 1999), relacionando a
presença da resposta linfoproliferativa a uma resposta do tipo T
H
1. A demonstração do
envolvimento da imunidade mediada por células a antígenos sintéticos da leishmania, nas
avaliações linfoproliferativas, são relatados em diversos trabalhos em modelos murinos (WHITE
et al., 1990; RACHAMIM et al., 1993; SUKUMARAN et al., 2003; IBORRA et al., 2003).
Desta maneira, apenas o grupo que utilizou a saponina como adjuvante apresenta proliferação
celular quando estimulada com a proteína recombinante, relacionando-se ao incremento de uma
resposta mediada por células. A avaliação da proliferação celular encontrada ao estimulo da
concanavalina A remete a capacidade proliferativa das células de todos os grupos.
A avaliação da produção de citocinas, encontradas no sobrenadante dos esplenócitos
estimulados com a proteína recombinante Lc9, foi realizada. Com efeito, o interferon gama,
sendo uma importante citocina gerada por células do tipo T
H
1, está presente no desenvolvimento
da resistência (WUILSON et al., 1996; GURUNATHAN et al., 1997; CAMPBELL et al., 2003;
IBORRA et al., 2003). Em quanto que a amplificação das manifestações clínicas está voltada à
propagação de uma resposta do tipo T
H
2 com produção de IL-4 (MURRAY et al., 1997;
SJÖLANDER et al., 1998; SEREZANI et al., 2002; CAMPBELL et al., 2003), e IL-5
(WUILSON et al., 1996b; SJÖLANDER et al., 1998; RAFATI et al., 2001).
De certo, as avaliações destas citocinas são importantes na caracterização de uma resposta
imune frente a um antígeno específico. No entanto, não é observada uma padronização no
intervalo de tempo para o estimulo celular com o antígeno. A determinação da concentração da
citocina interferon gama já foi determinada com: 24h (MÉNDEZ te al., 2001), 48h
(GURUNATHAN et al., 1997), 72h (WUILSON et al., 1996; SJÖLANDER et al., 1998;
RAFATI et al., 2001; SEREZANI et al., 2002; CAMPBELL et al., 2003; IBORRA et al., 2003;
AHMED et al., 2003). A citocina IL-4, já foi avaliada em: 36h (SEREZANI et al., 2002), 48h
(GURUNATHAN et al., 1997), 72h (SJÖLANDER et al., 1998; CAMPBELL et al., 2003). E a
citocina IL-5 sendo avaliada com: 72h (WUILSON et al., 1996; SJÖLANDER et al., 1998;
RAFATI et al., 2001). Ao passo que, objetivando abranger todas as citocinas aqui avaliadas, foi
determinado o período de 48h para a realização das nossas análises.
Assim sendo, ao avaliarmos a concentração de interferon gama produzido no
sobrenadante das células estimuladas com a proteína recombinante, apenas os animais injetados
com a proteína recombinante coadministrada a saponina apresentou uma produção detectável.
Mas também, foi observada, neste mesmo grupo, em uma menor concentração, a produção da
citocina IL-5, caracterizando uma resposta com envolvimento tanto de células produtoras de
interferon gama (T
H
1) como células produtoras de IL-5 (T
H
2), evidenciando uma resposta mista
T
H
1/T
H
2. Desta forma, confirmando a dicotomia observada neste mesmo grupo quando
avaliamos os subtipos de anticorpos (IgG1 e IgG2a) e pela presença da resposta linfoproliferativa
neste grupo.
Entretanto não foi observada a produção da citocina IL-4 em nenhum dos grupos
analisados, possivelmente devido ao período de avaliação (48h), que pode não ter contemplado a
detecção desta citocina. Ao passo que a detecção da citocina IL-5 foi realizada em outros grupos,
além da saponina, a saber: apenas a proteína recombinante, e dos adjuvantes (hidróxido de
alumínio, e plasmídeo codificando IL-12 murino). Estes mesmos grupos não apresentaram
respostas proliferativas nos ensaios de linfoproliferação, logo a avaliação da produção de
citocinas parece ser mais sensível na caracterização da resposta imune celular.
Os dados aqui apresentados estão em consonância com a literatura (BRUGH et al., 1983;
STRAW et al., 1985; SANTOS et al., 1999; SANTOS et al., 2002), onde o mesmo antígeno, a
proteína recombinante da Leishmania chagasi/infantum (Lc9), apresentou diferentes respostas
imunológicas no uso de diferentes adjuvantes. Ademais, é notada também uma alteração na
resposta imune esperada frente a um determinado adjuvante. Onde o adjuvante de Freund,
considerado um potente adjuvante que promove uma resposta celular do tipo T
H
1 (IGARASHI et
al., 2000), quando associado a esta proteína recombinante não apresentou resultados, nem
linfoproliferativo nem pela quantificação da citocina interferon-gama. Ao invés, ocorreu uma
produção mais elevada do anticorpo IgG1, característica de uma resposta T
H
2.
Era de se esperar uma resposta imune T
H
1, também, na utilização do plasmídeo
codificando IL-12 murino, como adjuvante, uma vez que, a citocina IL-12 estaria associada à
capacidade de promover a diferenciação e expansão das células T CD4+ do tipo T
H
1 (AFONSO
et al., 1994; MURRAY et al., 1997; GONZALO et al., 2001), apresentando um menor
envolvimento da resposta humoral (WILSON et al., 1995), como foi insinuado através dos dados
aqui apresentados ao avaliarmos a produção de anticorpos. Outrossim, a utilização do plasmídeo
codificando a cadeia única de IL-12 murino, seguida de eletroporação fomenta uma alta produção
de interferon gama. Lucas e Heller em 2001, observaram uma produção de interferon gama, de
quase 250 pg/mL no soro de camundongos após sete dias da aplicação. Por sua vez, alguns
autores relatam a diminuição da resposta antigênica na utilização do plasmídeo codificando a
citocina IL-12 como adjuvante, onde tanto a quantidade quanto o número de doses estão
relacionados (KURZAWA et al., 1998; LASARTE et al., 1999; CHEN, te al., 2001)
Lasarte e colaboradores, em 1999, relatam que a ação imunopotencializadora deste
adjuvante está relacionada com a administração de baixas doses. Uma vez que foi observada uma
supressão das células T, provocada pela abundância de óxido nítrico estimulado pelo interferon
gama. A administração concomitante de inibidores da enzima responsável pela produção desta
substância foi proposta por alguns autores objetivando a redução da produção do óxido nítrico,
(KOBLISH et al., 1998; GONZALO et al., 2001). Além do que, o protocolo de imunização aqui
apresentado também foi associado a efeitos tóxicos, ocasionando esplenomegalia e
linfoadenomegalia, podendo comprometer a resposta imune do animal (MEIRA e PINHEIRO,
dados não publicados).
A observação da produção de IL-5 quando a citocina IL-12 é utilizada também esta em
consonância com a literatura. O envolvimento de uma resposta imune T
H
1, promovida por esta
citocina, não interrompe completamente a ação das células T
H
2 (BLISS et al., 1996). Na verdade
a caracterização de um outro protocolo, empregado na utilização desta citocina como adjuvante,
deve ser apreciado.
O comportamento do hidróxido de alumínio, quando combinado à proteína recombinante
Lc9, está de acordo com o encontrado na literatura. Sendo um potente estimulador de uma
resposta imune humoral quando associados a antígenos vacinais (SCHIRMBECK et al., 1994;
BURGHAUS te al., 1996; YANG et al., 1999; GHOSH & HOTEZ, 1999; LEE et al., 1999). No
entanto, Near e colaboradores, em 2002, avaliando uma vacina murina contra a malária,
observaram que este adjuvante pode, em associações a outros adjuvantes, promover uma resposta
mista. Estes autores demonstraram altas produções de anticorpos específicos, mas com produções
elevadas de interferon gama (~9000pg/mL) e concentrações não detectáveis da citocina IL-5.
Estas quantificações foram determinadas através das análises nos sobrenadantes de esplenócitos
dos animais imunizados com o hidróxido de alumínio e um oligodeoxinucleotideo com CpG
associados a uma proteína recombinante do Plasmodium yoelii (1yMSP1
19
). Como visto, a partir
dos dados apresentados, este adjuvante pode ser avaliado em associações com outros adjuvantes
que promovam uma resposta imune do tipo T
H
1, uma vez que a sua ação imunopotencializadora
foi aqui demonstrada.
Embora Tadokoro e colaboradores em 1996 observem uma resposta imune mediada por
células do tipo T
H
2 no uso do adjuvante saponina, outros autores advogam o poder
imunopotencializador da saponina à indução de células do tipo T
H
1 (SCOTT, et al., 1984; KHAN
et al., 1991; PEREIRA DA SILVA et al., 2005). Este adjuvante, quando associado à proteína
recombinante Lc9, apresenta uma resposta mista T
H
1/T
H
2, observada também na utilização de
outros antígenos associados a saponina, como a proteína recombinante A2 para a leishmaniose
(GHOSH et al., 2002), como o pAg, contra a malária (BURNS, JR. te al., 1997). Entretanto, no
presente experimento, este grupo foi o único a apresentar animais letárgicos e com eriçamento de
pêlos após a realização das imunizações, podendo estar relacionada com o óbito encontrado neste
grupo. Mesmo não sendo realizada a avaliação dos efeitos tóxicos da saponina neste experimento,
as alterações hemolíticas são as principais manifestações detectáveis relacionados com a
letalidade deste adjuvante (KENSIL et al., 1991; SANTOS et al., 1997; WAITE et al., 2001;
SANTOS et al., 2002; PEREIRA DA SILVA et al., 2005). Contudo, Santos e colaboradores, em
2002, avaliando os efeitos hemolíticos da saponina quando administrada em 200 µg, três vezes,
não detectou letalidade, nem a presença de dor ou de edema no local da aplicação, apenas uma
queda de pêlos localizada. Como foi realizada a aplicação de 100 µg da saponina por dose, no
experimento aqui apresentado, esta morte pode não estar associada a efeitos tóxicos.
Honoreé e colaboradores, em 1998, observaram que os camundongos da linhagem
resistente (C57Bl/6) a infecções por L. chagasi/infantum apresentam uma resposta mista
T
H
1/T
H
2. A proteção lograda nos camundongos imunizados com a proteína A2 em associação
com a saponina também apresenta uma resposta mista. Esta proteção é alcançada através de uma
alta resposta humoral, que limita a internalização das amastigotas da L. donovani nos
macrófagos, e pela ativação macrofagica observada pela produção do interferon gama (GHOSH
et al., 2002). Desta maneira, imunizações efetivadas com a proteína recombinante Lc9 associada
a saponina poderão levar a uma real proteção.
7. CONCLUSÕES
De acordo com os objetivos do nosso estudo, podemos concluir que:
• As diversas combinações da proteína recombinante de L. chagasi/infantum (Lc9) com os
adjuvantes aqui testados, induziram resposta imune humoral específica com uma maior produção
de IgG, quando comparado ao grupo injetado apenas com a proteína recombinante Lc9, com
exceção ao grupo que utilizou a citocina IL-12 em forma de plasmídeo. Contudo, apenas a
combinação Lc9/saponina levou a produção de anticorpos dos subtipos IgG2a e IgG1.
• Através da avaliação da resposta celular foi observada proliferação de esplenócitos e produção
IFN-gama somente nos animais que receberam a proteína recombinante Lc9 associada a
saponina.
• O protocolo de imunização utilizando plasmídeo codificando a citocina IL-12 seguida de
eletroporação, em três aplicações com intervalos de 21 dias entre as aplicações, não promove, de
forma detectável, uma resposta imune do tipo T
H
1.
• Portanto a imunização com a combinação (Lc9 e saponina) induz resposta imune mista
T
H
1/T
H
2, enquanto que as outras associações de Lc9 e adjuvantes utilizadas promoveram o
desenvolvimento de uma resposta imune predominantemente do tipo T
H
2.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA
ABATH, F. G., S. M. MONTENEGRO & GOMES, Y. M.. Vaccines against human parasitic
diseases: an overview. Acta Trop, 71(3):237-54, 1998.
ADA, G. Vaccines and vaccination. N. Engl. J. Med., 345: 1042-1053, 2001.
AFONSO, L. C. C.; SCHARTON, T. M.; VIEIRA, L. Q.; WYSOCKA, M.; TRINCHIERI, G.;
SCOTT, P. The adjuvant effect of interleukin-12 in a vaccine against Leishmania major. Science.
263: 235-237, 1994.
AFRIN, F.; RAJESH R.; ANAM, K.; GOPINATH, M.; PAL, S.; ALI, N.. Characterization of
Leishmania donovani antigens encapsulated in liposomes that induce protective immunity in
BALB/c mice. Infect Immun, 70(12):6697-706, 2002.
AHMED, S., M. COLMENARES, L. SOONG, K. GOLDSMITH-PESTANA, L.
MUNSTERMANN, R. MOLINA AND D. MCMAHON-PRATT. Intradermal infection model
for pathogenesis and vaccine studies of murine visceral leishmaniasis. Infect Immun 71(1): 401-
10, 2003.
AHMED, S.; COLMENARES, M.; SOONG, L.; GOLDSMITH-PESTANA, K.;
MUNSTERMANN, L.; MOLINA, R.; MCMAHON-PRATT, D. Intradermal Infection Model for
Pathogenesis and Vaccine Studies of Murine Visceral Leishmaniasis. Infection And Immunity;
71(1): 401–410, 2003.
ALVAR, J.; MOLINA R.; SAN ANDRES, M.; TESOURO, M.; NIETO, J.; VITUTIA, M.;
GONZALEZ, F.; SAN ANDRES, M. D.; BOGGIO, J.; RODRIGUEZ, F.. Canine leishmaniasis:
clinical, parasitological and entomological follow-up after chemotherapy. Ann Trop Med
Parasitol, 88(4):371-8, 1994.
ANDRADE TM, CARVALHO EM, ROCHA H. Bacterial infections in patients with visceral
leishmaniasis. Journal of infectious Diseases 162: 1354-1359, 1990.
ASHFORD, D. A.; BOZZA, M.; FREIRE, M.; MIRANDA, J. C.; SHERLOCK, I.; EULALIO,
C.; LOPES, U.; FERNANDES, O.; DEGRAVE, W.; BARKER, Jr., R. H. Comparasion of the
polymerase chain reaction and serology for the detection of canine visceral leishmaniasis. Am. J.
Trop. Med. Hyg 53:251-5, 1995.
ASHFORD, D. A.; DAVID J. R.; FREIRE, M.; DAVID, R.; SHERLOCK, I.; EULALIO, M. C.;
SAMPAIO, D. P.; BADARO, R.. Studies on control of visceral leishmaniasis: impact of dog
control on canine and human visceral leishmaniasis in Jacobina, Bahia, Brazil. Am J Trop Med
Hyg, 59(1):53-7, 1998.
ASHFORD, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. Int J Parasitol,
30(12-13):1269-81, 2000.
AUDIBERT, M. F.; CHEDID, M. L.TRÉFOUËL, M. J. Augmentation de la réponse immunitaire
par administration d’émulsions à base d’huile végétale métabolisable. C. R. Acad. Sc. Paris.
280: 1629-1632, 1975.
BACELLAR, O., C. BRODSKYN, J. GUERREIRO, M. BARRAL-NETTO, C. H. COSTA, R.
L. COFFMAN, W. D. JOHNSON AND E. M. CARVALHO. Interleukin-12 restores interferon-
gamma production and cytotoxic responses in visceral leishmaniasis. J Infect Dis 173(6): 1515-
8., 1996.
BACELLAR, O., M. BARRAL-NETTO, R. BADARO AND E. M. CARVALHO. Gamma
interferon production by lymphocytes from children infected with L. chagasi. Braz J Med Biol
Res 24(8): 791-5, 1991.
BARRAL-NETTO M, BADARO R, BARRALA, ALMEIDA RP, SANTOS SB, BADARO F,
PEDRAL-SAMPAIO D, CARVALHO EM, FALCOFF E, FALCOFFR. Tumor necrosis factor
(cachectin) in human visceral leishmaniasis. Journal of Infectious Diseases 163: 853-857, 1991.
BERRAHAL, F., C. MARY, M. ROZE, A. BERENGER, K. ESCOFFIER, D. LAMOUROUX
AND S. DUNAN. Canine leishmaniasis: identification of asymptomatic carriers by polymerase
chain reaction and immunoblotting. Am J Trop Med Hyg 55(3): 273-7, 1996.
BLISS, J.; CLEAVE, V. V.; MURRAY, K.; WIENCIS, A.; KETCHUM, M.; MAYLOR, R.;
HAIRE, T.; RESMINI, C.; ABBAS, A. K.; WOLF, S. F. IL-12, as an adjuvant, promotes a T
helper 1 cell, but does not suppress a T helper 2 cell recall response. The Journal of
Immunology, 156: 887-894, 1996.
BOGDAN C, ROLLINGHOFF M, DIEFENBACH A. The role of nitric oxide in innate
immunity. Immunology Review 173: 17-26, 2000.
BOGDAN, C.; GESSNER A.; SOLBACH, W.; ROLLINGHOFF, M.. Invasion, control and
persistence of Leishmania parasites. Curr Opin Immunol, 8(4):517-25, 1996.
BONGIORNO G, HABLUETZEL A, KHOURY C E MAROLI M. Host preferences of
phlebotomine sand flies at a hypoendemic focus of canine leishmaniasis in central Italy. Acta
Trop.; 88(2): 109-16, 2003.
BORJA-CABRERA, G. P., N. N. CORREIA PONTES, V. O. DA SILVA, E. PARAGUAI DE
SOUZA, W. R. SANTOS, E. M. GOMES, K. G. LUZ, M. PALATNIK AND C. B. PALATNIK
DE SOUSA. Long lasting protection against canine kala-azar using the FML-QuilA saponin
vaccine in an endemic area of Brazil (Sao Goncalo do Amarante, RN). Vaccine 20(27-28): 3277-
84, 2002.
BRAGA M D, COELHO I C, POMPEU M M, EVANS T G, MACAULLIFE I T, TEIXEIRA M
J E LIMA J W. [Control of canine visceral leishmaniasis: comparison of results from a rapid
elimination program of serum-reactive dogs using an immunoenzyme assay and slower
elimination of serum-reactive dogs using filter paper elution indirect immunofluorescence]. Rev
Soc Bras Med Trop; 31(5): 419-24. 1998.
BRASIL. Ministério da Saúde. Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral,
Brasília, Secretaria de Vigilância em Saúde, 2006.120p.
BRUGH, M.; STONE, H. D.; LUPTON, H. W.. Comparison of inactivated Newcastle disease
viral vaccines containing different emulsion adjuvants. Am. J. Res.. 44(1): 72-75, 1983.
BURGHAUS, P. A.; WELLDE, B. T.; HALL, T.; RICHARDS, R. L.; EGAN, A. F.; RILEY, E.
M.; BALLOU, W. R.; HOLDER, A. A. Immunization of Aotus nancymai with recombinant C
terminus of Plasmodium falciparumi merozoite Surface protein 1 in Liposomes and Alum
Adjuvant Does Not Induce Protection against a Challenge Infection. Infection and Immunity.
64(9): 3614-3619, 1996.
BURNS, JR., J. M.; DUNN, P. D.; RUSSO, D. M. Protective immunity against Plasmodium
yoelii Malaria induced by immunization with particulate blood-strage antigens. Infect. Imun.
65(8): 3138-3145, 1997.
BUTTON, L. L. & MCMASTER W. R.. Molecular cloning of the major surface antigen of
leishmania. J Exp Med, 167(2):724-9, 1988.
CABRAL, M., J. E. O'GRADY, S. GOMES, J. C. SOUSA, H. THOMPSON AND J.
ALEXANDER. The immunology of canine leishmaniosis: strong evidence for a developing
disease spectrum from asymptomatic dogs. Vet Parasitol 76(3): 173-80, 1998.
CABRAL, M., J. O'GRADY AND J. ALEXANDER. Demonstration of Leishmania specific cell
mediated and humoral immunity in asymptomatic dogs. Parasite Immunol 14(5): 531-9., 1992.
CABRERA M A, PAULA A A, CAMACHO L A, MARZOCHI M C, XAVIER S C, DA SILVA
A V E JANSEN A M. Canine visceral leishmaniasis in Barra de Guaratiba, Rio de Janeiro,
Brazil: assessment of risk factors. Rev Inst Med Trop Sao Paulo; 45(2): 79-83, 2003.
CAMPBELL, K.; DIAO, H.; JI, J.; SOONG, L. DNA Immunization with the Gene Encoding P4
Nuclease of Leishmania amazonensis Protects Mice against Cutaneous Leishmaniasis. Infection
and immunity. 71(11): 6270–6278, 2003.
CARRION, J., A. NIETO, S. IBORRA, V. INIESTA, M. SOTO, C. FOLGUEIRA, D. R.
ABANADES, J. M. REQUENA AND C. ALONSO. Immunohistological features of visceral
leishmaniasis in BALB/c mice. Parasite Immunol 28(5): 173-83, 2006.
CARVALHO EM, ANDREWS BS, MARTINELLI R, DUTRA M, ROCHA H. Circulating
immune complexes and rheumatoid factor in schistosomiasis and visceral leishmaniasis.
American Journal of Tropical Medicine and Hygene 32: 61-68, 1983.
CARVALHO, E. M., A. BARRAL, D. PEDRAL-SAMPAIO, M. BARRAL-NETTO, R.
BADARO et al, Immunologic markers of clinical evolution in children recently infected with
Leishmania donovani chagasi. J Infect Dis 165: 535-540, 1992.
CARVALHO, E. M., O. BACELLAR, A. BARRAL, R. BADARO AND W. D. JOHNSON, JR.
Antigen-specific immunosuppression in visceral leishmaniasis is cell mediated. J Clin Invest
83(3): 860-4, 1989.
CARVALHO, E. M., O. BACELLAR, C. BROWNELL, T. REGIS, R. L. COFFMAN AND S.
G. REED. Restoration of IFN-gamma production and lymphocyte proliferation in visceral
leishmaniasis. J Immunol 152(12): 5949-56, 1994.
CARVALHO, E. M., R. BADARO, S. G. REED, T. C. JONES AND W. D. JOHNSON, JR.
Absence of gamma interferon and interleukin 2 production during active visceral leishmaniasis. J
Clin Invest 76(6): 2066-9, 1985.
CHEN, H. W.; PAN, C. H.; HUAN, H. W.; LIAU, M. Y.; CHIANG, J. R.; TAO, M. T.
Suppression of Immune Response and Protective Immunity to a Japanese Encephalitis Virus
DNA Vaccine by Coadministration of an IL-12-Expressing Plasmid. The Journal of
Immunology, 166: 7419–7426, 2001.
CHIN, J.; SAN GIL, F.. Skin delivery of a hybrid liposome/ISCOM vaccine implicates a role for
adjuvants in rapid modulation of inflammatory cells involved in innate immunity before the
enhancement of adaptive immune responses. Immunol Cell Biol.; 76:245-55, 1998.
CIARAMELLA, P.; OLIVA, G.; DE LUNA, R.; GRADONI, L.; AMBROSIO, R.; CORTESE,
L.; SCALONE, A.; PERSECHINO, A.. A retrospective clinical study of canine leishmaniasis in
150 dogs naturally infected by Leishmania infantum. Veterinary Record; 141(21): 539-43,
1997.
COFFMAN, R. L. Origins of the T(H)1-T(H)2 model: a personal perspective. Nat Immunol
7(6): 539-41, 2006.
CORNELISSEN, A. W. & SCHETTERS T. P.. Vaccines against protozoal diseases of veterinary
importance. FEMS Immunol Med Microbiol, 15(2-3):61-72. 1996.
COTTREZ, F.; HURST, S. D.; COFFMAN, R. L.; GROUX, H. T regulatory cells 1 inhibit a
Th2-specific response in vivo. J. Immunol. 165: 4848-4853, 2000.
COURTENAY O, QUINNELL R J, GARCEZ L M, SHAW J J E DYE C. Infectiousness in a
cohort of brazilian dogs: why culling fails to control visceral leishmaniasis in areas of high
transmission. J Infect Dis; 186(9): 1314-20, 2002.
DA COSTA PINHEIRO, P. H., S. DE SOUZA DIAS, K. D. EULALIO, I. L. MENDONCA, S.
KATZ AND C. L. BARBIERI. Recombinant cysteine proteinase from Leishmania (Leishmania)
chagasi implicated in human and dog T-cell responses. Infect Immun 73(6): 3787-9, 2005.
DALY, T.; LONG, C. A. Influence of adjuvants on protection induced by a recombinant fusion
protein against malarial infection. Infect. Immune. 64(7): 2602-2608, 1996.
DE BEER, P., A. EL HARITH, L. L. DENG, S. J. SEMIAO-SANTOS, B. CHANTAL et al. A
killing disease epidemic among displaced Sudanese population identified as visceral
leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 44: 283-289, 1991.
DE LUNA R, VUOTTO M L, IELPO M T, AMBROSIO R, PIANTEDOSI D, MOSCATIELLO
V, CIARAMELLA P, SCALONE A, GRADONI L E MANCINO D. Early suppression of
lymphoproliferative response in dogs with natural infection by Leishmania infantum. Vet
Immunol Immunopathol; 70(1-2): 95-103, 1999.
DE LUNA, R., M. L. VUOTTO, M. T. IELPO, R. AMBROSIO, D. PIANTEDOSI, V.
MOSCATIELLO, P. CIARAMELLA, A. SCALONE, L. GRADONI AND D. MANCINO. Early
suppression of lymphoproliferative response in dogs with natural infection by Leishmania
infantum. Vet Immunol Immunopathol 70(1-2): 95-103, 1999.
DESJEUX, P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comp Immunol Microbiol
Infect Dis 27: 305-318, 2004.
DIETZE R, BARROS G B, TEIXEIRA L, HARRIS J, MICHELSON K, FALQUETO A E
COREY R. Effect of eliminating seropositive canines on the transmission of visceral
leishmaniasis in Brazil. Clin Infect Dis.; 25(5): 1240-2, 1997.
DUMONTEIL, E.; JESUS, R. S. M.; JAVIER, E. O.; DEL ROSÁRIO, G. DNA vaccines induce
partial protection against Leishmania mexicana. Vaccine 21: 2161–2168, 2003.
DYE, C. The logic of visceral leishmaniasis control. Am J Trop Med Hyg, 55(2):125-30, 1996.
EGHAFONA, N. O. Immune responses following cocktails of inactivated measles vaccine and
Arachis hypogaea L. (groundnut) or Cocos nucifera L. (coconut) oils adjuvant. Vaccine.
14(17/18): 1703-1706, 1996.
EVANS, T., F. REIS MDE, J. E. DE ALENCAR, T. G. NAIDU, J. A. DE JESUS et al. American
visceral leishmaniasis (kala-azar). West J Med 142: 777-781, 1985.
FERBER, P.C.; OSSENT, P.; HOMBERGER, F.R.; FISCHER, R.W.. The generation of
monoclonal antibodies in mace: influence of adjuvants on the immune response, fusion efficiency
and distress. Lab. Anim. Oct; 33(4):334-50, 1999.
FRANCA-SILVA J C, DA COSTA R T, SIQUEIRA A M, MACHADO-COELHO G L, DA
COSTA C A, MAYRINK W, VIEIRA E P, COSTA J S, GENARO O E NASCIMENTO E.
Epidemiology of canine visceral leishmaniosis in the endemic area of Montes Claros
Municipality, Minas Gerais State, Brazil. Vet Parasitol, 111(2-3): 161-73, 2003.
GARCÍA-ALONSO, M.; BLANCO, A.; REINA, D.; SERRANO, F. J.; ALONSO, C.; NIETO,
C. G.. Immunopathology of the uveitis in canine leishmaniasis. Parasite Immunology; 18(12):
617-23, 1996.
GEHL, J. & MIR, M. M. Determination of Optimal Parameters for in Vivo Gene Transfer by
Electroporation, Using a Rapid in Vivo Test for Cell Permeabilization. Biochemical and
Biophysical Research Communications 261: 377–380, 1999.
GEHL, J.; SFRENSEN, T. H.; NIELSEN, K.; RASKMARK, P.; NIELSEN, S. L.;
SKOVSGAARD, T.; MIR, L. M. In vivo electroporation of skeletal muscle: threshold, eFcacy
and relation to electric eld distribution. Biochimica et Biophysica Acta 1428: 233-240,1999.
GERMANN, T., M. BONGARTZ, H. DLUGONSKA, H. HESS, E. SCHMITT, L. KOLBE, E.
KOLSCH, F. J. PODLASKI, M. K. GATELY AND E. RUDE. Interleukin-12 profoundly up-
regulates the synthesis of antigen-specific complement-fixing IgG2a, IgG2b and IgG3 antibody
subclasses in vivo. Eur J Immunol 25(3): 823-9, 1995.
GHALIB, H. W., M. R. PIUVEZAM, Y. A. SKEIKY, M. SIDDIG, F. A. HASHIM et al.
Interleukin 10 production correlates with pathology in human Leishmania donovani infections. J
Clin Invest 92: 324-329, 1993.
GHOSH, A.; ZHANG, W.W.; MATLASHEWSKI, G. Immunization with A2 protein results in a
mixed Th1/Th2 and a humoral response which protects mice against Leishmania donovani
infections. Vaccine. 20: 59-66, 2002.
GHOSH, K.; HOTEZ, P. J. Antibody-dependent reductions in mouse hookworm burden after
vaccination with Ancylostoma caninum Secreted Protein 1. The J. of Infectious Diseases. 180:
1674-81, 1999.
GOTO N, KATO H, MAEYAMA J, ETO K, YOSHIHARA S. Studies on the toxicities of
aluminium hydroxide and calcium phosphate as immunological adjuvants for vaccines. Vaccine.;
11: 914-8, 1993.
GRADONI, L. An update on antileishmanial vaccine candidates and prospects for a canine
Leishmania vaccine. Vet Parasitol 100(1-2): 87-103, 2001.
GRIFFIN, J. F. A strategic approach to vaccine development: animal models, monitoring vaccine
efficacy, formulation and delivery. Adv Drug Deliv Rev, 54(6):851-61, 2002.
GRIMALDI, G., JR.; TESH R. B.; MCMAHON-PRATT, D.. A review of the geographic
distribution and epidemiology of leishmaniasis in the New World. Am J Trop Med Hyg,
41(6):687-725, 1989.
GUARGA J L, LUCIENTES J, PERIBANEZ M A, MOLINA R, GRACIA M J E CASTILLO J
A. Experimental infection of Phlebotomus perniciosus and determination of the natural infection
rates of Leishmania infantum in dogs. Acta Trop.; 77(2): 203-7, 2000.
GUPTA RK, SIBER GR. Adjuvents for human vaccines—current status, problems and future
prospects. Vaccine; 13: 1263-76, 1995.
GURUNATHAN, S.; SACKS, D. L.; BROWN, D. R.; REINER, S. L.; CHAREST, H.;
GLAICHENHAUS, N.; SEDER, R. A. Vaccination with DNA Encoding the Immunodominant
LACK Parasite Antigen Confers Protective Immunity to Mice Infected with Leishmania major.
The Journal of Experimental Medicine.186(7): 1137–1147, 1997.
GURUNATHAN, S.; STOBIE L.; PRUSSIN, C.; SACKS, D. L.; GLAICHENHAUS, N.;
IWASAKI, A.; FOWELL, D. J.; LOCKSLEY, R. M.; CHANG, J. T.; WU, C. Y.; SEDER, R. A..
Requirements for the maintenance of Th1 immunity in vivo following DNA vaccination: a
potential immunoregulatory role for CD8+ T cells. J Immunol, 165(2):915-24, 2000.
HALDAR, J. P., S. GHOSE, K. C. SAHA AND A. C. GHOSE. Cell-mediated immune response
in Indian kala-azar and post-kala-azar dermal leishmaniasis. Infect Immun 42(2): 702-7, 1983.
HANDMAN E, BUTTON L L E MCMASTER R W. Leishmania major: production of
recombinant gp63, its antigenicity and immunogenicity in mice. Exp Parasitol; 70(4): 427-35,
1990.
HANDMAN E, SYMONS F M, BALDWIN T M, CURTIS J M E SCHEERLINCK J P.
Protective vaccination with promastigote surface antigen 2 from Leishmania major is mediated
by a TH1 type of immune response. Infect Immun; 63(11): 4261-7, 1995.
HANDMAN E. Leishmania vaccines: Old and New. Parasitol Today; 13(6): 236-8, 1997.
HANDMAN, E. Leishmaniasis: current status of vaccine development. Clin Microbiol Rev,
14(2):229-43, 2001.
HOFSTRA, C. L.; VAN ARK, I.; HOFMAN, G.; KOOL, M.; NIJKAMP, F. P.; VAN
OOSTERHOUT, A. J.. Prevention of Th2-like cell responses by coadministration of IL-12 and
IL-18 is associated with inhibition of antigen-induced airway hyperresponsiveness, eosinophilia,
and serum IgE levels. J. Immunol. 161: 5054-5060, 1998.
HOLADAY, B. J., M. M. POMPEU, S. JERONIMO, M. J. TEXEIRA, A. SOUSA ADE et al.
Potential role for interleukin-10 in the immunosuppression associated with kala azar. J Clin
Invest 92: 2626-2632, 1993b.
HOLADAY, B. J., M. M. POMPEU, T. EVANS, D. N. BRAGA, M. J. TEXEIRA et al.
Correlates of Leishmania-specific immunity in the clinical spectrum of infection with Leishmania
chagasi. J Infect Dis 167: 411-417, 1993a.
HONOREÈ, S.; GARIN, Y. J.; SULAHIAN, A.; GANGNEUX, J.; DEROUIN, F. Influence of
the host and parasite strain in a mouse model of visceral Leishmania infantum infection. FEMS
Immunology and Medical Microbiology 21: 231-239, 1998.
HOURIANE, J. O.; BEDWANI, S. J.; WARNER, J. O.; DEAN, T.P. Randomised, double blind,
crossover challenge study of allergenicity of peanut oils in subjecs allergic to peanuts. BMJ, 12:
1084-1088, 1997.
IBORRA, S.; SOTO, M.; CARRIO´N, J.; NIETO, A.; FERNA´NDEZ, E.; ALONSO, C.;
REQUENA, J. M. The Leishmania infantum Acidic Ribosomal Protein P0 Administered as a
DNA Vaccine Confers Protective Immunity to Leishmania major Infection in BALB/c Mice.
Infection and immunity. 71(11): 6562–6572, 2003.
IGARASHI, I.; ASABA, U.; XUAN, X.; OMATA, Y.; SAITO, A.; NAGASAWA, H.;
FUJISAKI, K.; SUZUKI, N.; IWAKURA, Y.; MIKAMI, T. Immunization with recombinant
surface antigens p26 with Freund’s adjuvants against Babesia rodhaini infection. J. Vet. Med.
Sci. 62(7): 717-723, 2000.
JOHNSTON, B. A.; EISEN, H.; FRY, D.. An evaluation of several adjuvant emulsion regimens
for the production of polyclonal antisera in rabbits. Lab. Anim. Sci.. Jan; 41(1): 15-21, 1991.
KAYE, P. M.; SVENSSON, M.; ATO, M.; MAROOF, A.; POLLEY, R.; STAGER, S.;
ZUBAIRI, S.; ENGWERDA, C. R. The immunopathology of experimental visceral
leishmaniasis. Immunol. Rev., 201:239-253, 2004.
KENSIL, C. R.; PATEL, U.; LENNICK, M.; MARCIANI, D. Separation and characterization of
saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina cortex. J. Immunol. 146(2):
431-437, 1991.
KHARAZMI, A.; KEMP K.; ISMAIL, A.; GASIM, S.; GAAFAR, A.; KURTZHALS, J. A.; EL
HASSAN, A. M.; THEANDER, T. G.; KEMP, M. T-cell response in human leishmaniasis.
Immunol Lett, 65(1-2):105-8, 1999.
KILLICK-KENDRICK, R. The biology and control of phlebotomine sand flies. Clin Dermatol
17(3): 279-89, 1999.
KOBAYASHI, M.; FITZ, L.; RYAN, M.; HEWICK, R. M.; CLARK, S. C.; CHAN, S.;
LOUDON, R.; SHERMAN, F.; PERUSSIA, B.; TRINCHIERI, G. Identification and purification
of natural killer cell stimulatory factor (NKSF), a cytokine with multiple biologic effects on
human lymphocytes. J. Exp. Méd. 170(3): 827-45, 1989.
KOBLISH, H. K.; HUNTER, C. A.; WYSOCKA, M.; TRINCHIERI, G.; LEE, W. M. F.
Immune Suppression by Recombinant Interleukin (rIL)-12 Involves Interferon & Induction of
Nitric Oxide Synthase 2 (iNOS) Activity: Inhibitors of NO Generation Reveal the Extent of rIL-
12 Vaccine Adjuvant Effect. J. Exp. Med. 188(9):1603–1610, 1998.
KOUTINAS, A. F., Z. S. POLIZOPOULOU, M. N. SARIDOMICHELAKIS, D. ARGYRIADIS,
A. FYTIANOU AND K. G. PLEVRAKI. Clinical considerations on canine visceral leishmaniasis
in Greece: a retrospective study of 158 cases (1989-1996). J Am Anim Hosp Assoc 35(5): 376-
83, 1999.
KURZAWA, H.; WYSOCKA, M.; ARUGA, E.; CHANG, A. E.; TRINCHEIRI, G.; LEE, W. M.
F. Only After a Period of Suppression. Cancer Research 58: 491-499, 1998.
LANOTTE, G.; RIOUX, J. A.; PERIERES, J.; VOLLHARDT, Y. Ecology of leishmaniasis in
the south of France. 10. Developmental stages and clinical characterization of canine
leishmaniasis in relation to epidemiology. (author's transl). Ann. Parasitol. Hum. Comp.,
54(3):277-295, 1979.
LASARTE, J. J.; CORRALES, F. J.; CASARES, N.; CERIO, A. L.; QIAN, C.; XIE, X.;
BORRA´S-CUESTA, F.; PRIETO, J. Different Doses of Adenoviral Vector Expressing IL-12
Enhance or Depress the Immune Response to a Coadministered Antigen: the Role of Nitric
Oxide1. The Journal of Immunology; 162: 5270–5277, 1999.
LEE, C. K.; SOIKE, K.; GIANNASCA, P.; HILL, J.; WELTZIN, R.; KLEANTHOUS, H.;
BLANVHARD, J.; MONATH, T. P. Immunization of rhesus monkeys with a mucosal prime,
parenteral goost strategy protects against infection with Helicobacter pylori. Vaccine. 17: 3072-
3082, 1999.
LEENAARS, P. P.; SAVELKOUL, H. F.; HENDRIKSEN, C. F.; VAN ROOIJEN, N.;
CLAASSEN, E.. Increased adjuvant efficacy in stimulation of antiboby responses after
macrophage elimination in vivo. Immunology., 90(3):337-43, 1997.
LUCAS, M. L. & HELLER, R. Immunomodulation by Electrically Enhanced Delivery of
Plasmid DNA Encoding IL-12 to Murine Skeletal Muscle. Molecular Therapy, 3(1): 47-53,
2001.
MANETTI, R.; GEROSA, F.; GIUDIZI, M. G.; BIAGIOTTI, R.; PARRONCHI, P.; PICCINNI,
M. P.; SAMPOGNARO, S.; MAGGI, E.; ROMAGNANI, S.; TRINCHIERI, G. Interleukin 12
induces stable priming for interferon γ (IFN-γ) production during differentiation of human T
herper (Th) cells and transient IFN-γ production in established Th2 cell clones. J. Exp. Med.
179: 1273-1283, 1994.
MARCIANI, D. J.; REYNOLDS, ROBERT. C.; PATHAK, A. K.; FINLEY-
WOODMAN, K. AND MAY, R. D. Fractionation, structural studies, and immunological
characterization of the semi-synthetic Quillaja saponins derivative GPI-0100. Vaccine 21: 3961–
3971, 2003.
MARTINEZ-MORENO, A., T. MORENO, F. J. MARTINEZ-MORENO, I. ACOSTA AND S.
HERNANDEZ. Humoral and cell-mediated immunity in natural and experimental canine
leishmaniasis. Vet Immunol Immunopathol 48(3-4): 209-20, 1995.
MAURICIO I L, HOWARD M K, STOTHARD J R E MILES M A. Genomic diversity in the
Leishmania donovani complex. Parasitology; 119(3): 237-46, 1999.
MAURICIO I L, STOTHARD J R E MILES M A. The strange case of Leishmania chagasi.
Parasitol Today; 16(5): 188-9, 2000.
MELBY, P. C., A. TABARES, B. I. RESTREPO, A. E. CARDONA, H. S. MCGUFF AND J. M.
TEALE. Leishmania donovani: evolution and architecture of the splenic cellular immune
response related to control of infection. Exp Parasitol 99(1): 17-25, 2001.
MELBY, P. C., Y. Z. YANG, J. CHENG AND W. ZHAO. Regional differences in the cellular
immune response to experimental cutaneous or visceral infection with Leishmania donovani.
Infect Immun 66(1): 18-27, 1998.
MELBY, P. C.; TABARES, A.; RESTREPO, B. I.; CARDONA, A. E.; McGUFF, S.; TEALE, J.
M. Leishmania donovani: Evolution and Architecture of the Splenic Cellular Immune Response
Related to Control of Infection. Experimental Parasitology. 99: 17–25, 2001.
MELBY, P. C.; YANG, Y.; CHENG, J.; ZHAO, W. Regional Differences in the Cellular
Immune Response to Experimental Cutaneous or Visceral Infection with Leishmania donovani.
Infection and Immunity; 66(1): 18–27,1998.
MÉNDEZ, S.; GURUNATHAN, S.; KAMHAWI, S.; BELKAID, Y.; MOGA, M. A.; SKEIKY,
Y. A. W.; CAMPOS-NETO, A.; REED, S.; SEDER, R. A.; SACKS1, D. The Potency and
Durability of DNA- and Protein-Based Vaccines Against Leishmania major Evaluated Using
Low-Dose, Intradermal Challenge. The Journal of Immunology; 166: 5122–5128, 2001.
MIR, L. M.; BUREAU, M. F.; GEHL, J.; RANGARA, R.; ROUY, D.; CAILLAUD, J.;
DELAERE, P.; BRANELLEC, D.; SCHWARTZ, B.; SCHERMAN, D. High-efficiency gene
transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc. Natl. Acad. Sci.; 96: 4262–4267,
1999.
MIRALLES, G. D., M. Y. STOECKLE, D. F. MCDERMOTT, F. D. FINKELMAN AND H. W.
MURRAY. Th1 and Th2 cell-associated cytokines in experimental visceral leishmaniasis. Infect
Immun 62(3): 1058-63, 1994.
MOLANO, I.; ALONSO M. G.; MIRON, C.; REDONDO, E.; REQUENA, J. M.; SOTO, M.;
NIETO, C. G.; ALONSO, C.. A Leishmania infantum multi-component antigenic protein mixed
with live BCG confers protection to dogs experimentally infected with L. infantum. Vet
Immunol Immunopathol, 92(1-2):1-13, 2003.
MOMEN, H.; GRIMALDI JUNIOR, G.; DEANE, L. M. Leishmania infantum, the aetiological
agent of American visceral leishmaniasis (AVL)? Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 82(3):447-448,
1987.
MONTGOMERY, D. L.; ULMER J. B.; DONNELLY, J. J.; LIU, M. A.. DNA vaccines.
Pharmacol Ther, 74(2):195-205, 1997.
MOSMANN, T. R.; CHERWINSKI H.; BOND, M. W.; GIEDLIN, M. A.; COFFMAN, R. L..
Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine
activities and secreted proteins. J Immunol, 136(7):2348-57, 1986.
MUKHOPADHYAY, S.; BHATTACHARYYA S.; MAJHI, R.; DE, T.; NASKAR, K.;
MAJUMDAR, S.; ROY, S.. Use of an attenuated leishmanial parasite as an immunoprophylactic
and immunotherapeutic agent against murine visceral leishmaniasis. Clin Diagn Lab Immunol,
7(2):233-40, 2000.
MURRAY, H. W., C. M. LU, S. MAUZE, S. FREEMAN, A. L. MOREIRA, G. KAPLAN AND
R. L. COFFMAN. Interleukin-10 (IL-10) in experimental visceral leishmaniasis and IL-10
receptor blockade as immunotherapy. Infect Immun 70(11): 6284-93, 2002.
MURRAY, H. W., J. HARIPRASHAD AND R. L. COFFMAN. Behavior of visceral Leishmania
donovani in an experimentally induced T helper cell 2 (Th2)-associated response model. J Exp
Med 185(5): 867-74, 1997.
MURRAY, H. W., J. J. STERN, K. WELTE, B. Y. RUBIN, S. M. CARRIERO AND C. F.
NATHAN. Experimental visceral leishmaniasis: production of interleukin 2 and interferon-
gamma, tissue immune reaction, and response to treatment with interleukin 2 and interferon-
gamma. J Immunol 138(7): 2290-7, 1987.
MURRAY, H. W.; RUBIN B. Y.; ROTHERMEL, C. D.. Killing of intracellular Leishmania
donovani by lymphokine-stimulated human mononuclear phagocytes. Evidence that interferon-
gamma is the activating lymphokine. J Clin Invest, 72(4):1506-10, 1983.
NEAR, K. A.; STOWERS, A. W.; JANKOVIC, D.; KASLOW, D. C. Improved Immunogenicity
and Efficacy of the Recombinant 19-Kilodalton Merozoite Surface Protein 1 by the Addition of
Oligodeoxynucleotide and Aluminum Hydroxide Gel in a Murine Malaria Vaccine Model.
Infection and Immunity. 70(2): 692-701, 2002.
PALATNIK-DE-SOUSA, C. B., W. R. DOS SANTOS, J. C. FRANCA-SILVA, R. T. DA
COSTA, A. B. REIS, M. PALATNIK, W. MAYRINK AND O. GENARO. Impact of canine
control on the epidemiology of canine and human visceral leishmaniasis in Brazil. Am J Trop
Med Hyg 65(5): 510-7, 2001.
PALATNIK-DE-SOUSA, C. B.; DUTRA H. S.; BOROJEVIC, R.. Leishmania donovani surface
glycoconjugate GP36 is the major immunogen component of the fucose-mannose ligand (FML).
Acta Trop 53(1):59-72, 1993.
PARAGUAI DE SOUZA, E.; BERNARDO R. R.; PALATNIK, M.; PALATNIK DE SOUSA,
C. B.. Vaccination of Balb/c mice against experimental visceral leishmaniasis with the GP 36
glycoprotein antigen of Leishmania donovani. Vaccine, 19(23-24): 3104-15, 2001.
PARANHOS-SILVA, M.; FREITAS L. A.; SANTOS, W. C.; GRIMALDI, G. JUNIOR;
PONTES-DE-CARVALHO, L. C.; OLIVEIRA-DOS-SANTOS, A. J.. A cross-sectional
serodiagnostic survey of canine leishmaniasis due to Leishmania chagasi. Am J Trop Med Hyg,
55(1):39-44, 1996.
PARANHOS-SILVA, M.; PONTES-DE-CARVALHO, L. C.; OLIVEIRA, G. G. S.;
NASCIMENTO, E. G.; DOS-SANTOS, W. L. C. Skin Reactions to Thimerosal and Leishmania
in Dogs from a Leishmaniasis Endemic Area: it is Better to Keep them Apart. Mem Inst
Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro; 96(5): 679-681, 2001.
PERUHYPE-MAGALHAES, V., O. A. MARTINS-FILHO, A. PRATA, A. SILVA LDE, A.
RABELLO, A. TEIXEIRA-CARVALHO, R. M. FIGUEIREDO, S. F. GUIMARAES-
CARVALHO, T. C. FERRARI AND R. CORREA-OLIVEIRA. Immune response in human
visceral leishmaniasis: analysis of the correlation between innate immunity cytokine profile and
disease outcome. Scand J Immunol 62(5): 487-95, 2005.
PINELLI, E.; BOOG C. J.; RUTTEN, V. P.; VAN DIJK, B.; BERNADINA, W. E.;
RUITENBERG, E. J.. A canine CD8+ cytotoxic T-cell line specific for Leishmania infantum-
infected macrophages. Tissue Antigens, 43(3):189-92, 1994.
POWRIE, F.; MENON, S.; COFFMAN, R. L.. Interleukin-4 and interleukin-10 synergize to
inhibit cell-mediated immunity in vivo. Eur. J. Immun., 23: 2223-2229, 1993.
POZIO, E.; GRADONI, L.; BETTINI, S.; GRAMICCIA, M. Leishmaniasis in Tuscany (Italy):
VI. Canine leishmaniasis in the focus of Monte Argentario (Grosseto). Acta Trop., 38(4): 383-
393, 1981.
RACHAMIM, N. & JAFFE C. L. Pure protein from Leishmania donovani protects mice against
both cutaneous and visceral leishmaniasis. J Immunol, 150(6):2322-31, 1993.
RAFATI, S.; SALMANIAN, A.; TAHERI, T.; VAFA, M.; FASEL, N. A protective cocktail
vaccine against murine cutaneous leishmaniasis with DNA encoding cysteine proteinases of
Leishmania major. Vaccine 19: 3369–3375, 2001.
REINER, S. L.; ZHENG, S.; WANG, Z.; STOWRING, L.; LOCKSLEY, R. M. Leishmania
promastigotes evade interleukin 12 (IL-12) induction by macrophages and stimulate a broad
range of cytokines from CD4+ T cells during initiation of infection. J. Exp. Med. 179: 447-456,
1994.
REQUENA, J. M., S. IBORRA, J. CARRION, C. ALONSO AND M. SOTO. Recent advances in
vaccines for leishmaniasis. Expert Opin Biol Ther 4(9): 1505-17, 2004.
RHALEM A, SAHIBI H, GUESSOUS-IDRISSI N, LASRI S, NATAMI A, RIYAD M E
BERRAG B. Immune response against Leishmania antigens in dogs naturally and experimentally
infected with Leishmania infantum. Vet Parasitol; 81(3): 173-84, 1999.
RHALEM, A., H. SAHIBI, N. GUESSOUS-IDRISSI, S. LASRI, A. NATAMI, M. RIYAD AND
B. BERRAG. Immune response against Leishmania antigens in dogs naturally and
experimentally infected with Leishmania infantum. Vet Parasitol 81(3): 173-84, 1999.
RIOUX, S.; DUBREUIL, D.; BÉGIN, C.; LAFERRIÉRE, C.; MARTIN, D.; JACQUES, M.
Evaluation of protective efficacy of an Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1
lipopolysaccharide-protein conjugate in mice. Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 20(1): 63-
74, 1997.
RITTIG, M. G. AND C. BOGDAN. Leishmania-host-cell interaction: complexities and
alternative views. Parasitol Today 16(7): 292-7, 2000.
SANTOS, W. R.; BERNARDO, R. R.; PEÇANHA, L. T.; PALATNIK, M.; PARENTE, J. P.;
PALATNIK de SOUSA, C. B. Haemolytic activities of plant saponins and adjuvants. Effect of
Periandra meiterranea saponina on the humoral response to the FML antigen of Leishmania
donovani. Vaccine. 15: 1024-9, 1997.
SANTOS, W. R.; de LIMA, V. M. F.; PARAGUAI de SOUZA, E.; BERNARDO, R. R.;
PALATNIK, M.; PALATNIK de SOUSA, C. B. Saponins, IL 12 and BCG adjuvant in the FML-
vaccine formulation against murine visceral leishmaniasis. Vaccine. 21: 30-43, 2002.
SANTOS, W. R.; PARAGUAI de SOUZA, E.; PALATNIK, M.; PALATNIK de SOUSA, C. B.
Vaccination of Swiss Albino mice against experimental visceral leishmaniasis with the FML
antigen of Lishmania donovani. Vaccine. 17: 2554-2561, 1999.
SCHIRMBECK, R.; MELBER, K.; KUHROBER, A.; JANOWICZ, Z.A.; REIMANN, J..
Immunization with soluble hepatitis B virus surface protein elicits murine H-2 class I-restricted
Cd8+ cytotoxic T lymphocyte responses in vivo. J. Immunol.; 152:1110-9; 1994.
SCHLEIN, Y., R. L. JACOBSON AND G. MESSER. Leishmania infections damage the feeding
mechanism of the sandfly vector and implement parasite transmission by bite. Proc Natl Acad
Sci U S A 89(20): 9944-8, 1992.
SCOTT, M. T.; BAHR, G.; MODABBER, F.; CHEDID, L. Adjuvant requirement for protective
immunization of mice using Trypanossoma cruzi 90K cell surface glycoprotein.Int. Arch. Aller.
Appl. Immuol. 74: 373-7, 1984.
SEREZANI, C. H. C.; FRANCO, A. R.; WAJC, M.; YOKOYAMA-YASUNAKA, J. K. U.;
WUNDERLICH, G.; BORGES, M. M.; ULIANA, S. R. B. Evaluation of the murine immune
response to Leishmania meta1 antigen delivered as recombinant protein or DNA vaccine.
Vaccine. 20: 3755-3763, 2002.
SHERLOCK, I. A. Ecological interactions of visceral leishmaniasis in the state of Bahia, Brazil.
Mem Inst Oswaldo Cruz, 91(6):671-83, 1996.
SILVA, B. P.da; SOARES, J. B. R. C.; PARAGUAI de SOUZA, PALATNIK, M.; PALATNIK
de SOUSA, C. B.; PARENTE, J. P. Pulcherrimasaponin, from the leaves of Calliandra
pulcherrima, as adjuvant for immunization in the murine model of visceral leishmaniasis.
Vaccine 23: 1061-1071, 2005.
SING M, O`HAGAN D. Advances in vaccine adjuvants. Nat Biotechnol.; 17: 1075-81, 1999.
SJÖLANDER A, BALDWIN T M, CURTIS J M E HANDMAN E. Induction of a Th1 immune
response and simultaneous lack of activation of a Th2 response are required for generation of
immunity to leishmaniasis. J Immunol; 160(8): 3949-57, 1998.
SJÖLANDER A, BALDWIN T M, CURTIS J M, BENGTSSON K L E HANDMAN E.
Vaccination with recombinant Parasite Surface Antigen 2 from Leishmania major induces a Th1
type of immune response but does not protect against infection. Vaccine; 16(20): 2077-84,
1998a.
SJÖLANDER, A.; BALDWIN, T. M.; CURTIS, J.M.; HANDMAN, E. Induction of a Th1
Immune Response and Simultaneous Lack of Activation of a Th2 Response Are Required for
Generation of Immunity to Leishmaniasis. The Journal of Immunology. 160: 3949–3957,
1998b.
SKEIKY Y A, GUDERIAN J A, BENSON D R, BACELAR O, CARVALHO E M, KUBIN M,
BADARO R, TRINCHIERI G E REED S G. A recombinant Leishmania antigen that stimulates
human peripheral blood mononuclear cells to express a Th1-type cytokine profile and to produce
interleukin 12. J Exp Méd.; 181(4): 1527-37, 1995.
SMITH, D.E.; O’BRIEN, M.E.; PALMER, V.J.; SADOWSKI, J.A.. The selection of an adjuvant
emulsion for polyclonal antibody production using a low-molecular-weight antigen in rabbits.
Lab. Anim. Sci.. Dec;42(6):599-601, 1992.
SMITH, J. W. G.; FLETCHER, W. B.; PETERS, M.; WESTWOOD, M.; PERKINS, F. J..
Response to influenza vaccine in adjuvant 65-4. J. Hyg., Camb. 74: 251, 1975.
SOLANO-GALLEGO, L., P. MORELL, M. ARBOIX, J. ALBEROLA AND L. FERRER.
Prevalence of Leishmania infantum infection in dogs living in an area of canine leishmaniasis
endemicity using PCR on several tissues and serology. J Clin Microbiol 39(2): 560-3, 2001.
SOLANO-GALLEGO, L.; LLULL J.; RAMOS, G.; RIERA, C.; ARBOIX, M.; ALBEROLA, J.;
FERRER, L. The Ibizian hound presents a predominantly cellular immune response against
natural Leishmania infection. Vet Parasitol, 90(1-2):37-45, 2000.
SOTO, M.; ALONSO C.; REQUENA, J. M.. The Leishmania infantum acidic ribosomal protein
LiP2a induces a prominent humoral response in vivo and stimulates cell proliferation in vitro and
interferon-gamma (IFN-gamma) production by murine splenocytes. Clin Exp Immunol,
122(2):212-8, 2000.
STERN, J. J., M. J. OCA, B. Y. RUBIN, S. L. ANDERSON AND H. W. MURRAY. Role of
L3T4+ and LyT-2+ cells in experimental visceral leishmaniasis. J Immunol 140(11): 3971-7,
1988.
STOBIE, L.; GURUNATHAN, S.; PRUSSIN, C.; SACKS, D. L.; GLAICHENHAUS, N.; WU,
C. Y.; SEDER, R. A. The role of antigen and IL-12 in sustaining Th1 memory cells in vivo: IL-12
is required to maintain memory/effector Th1 cells sufficient to mediate protection to an infectious
parasite challenge. PNAS. 97(15): 8427-8432, 2000.
STREIT, J. A.; RECKER T. J.; FILHO, F. G.; BEVERLEY, S. M.; WILSON, M. E. Protective
immunity against the protozoan Leishmania chagasi is induced by subclinical cutaneous infection
with virulent but not avirulent organisms. J Immunol, 166(3):1921-9, 2001.
SUKUMARAN , B.; TEWARY, P.; SAXENA, S.; MADHUBALA, R.Vaccination with DNA
encoding ORFF antigen confers protective immunity in mice infected with Leishmania donovani.
Vaccine 21:1292–1299, 2003.
TADOKORO, C. E.; MACEDO, M.S.; ABRAHAMSOHN, I. A. Saponin adjuvant primes for a
dominant interleukin-10 production to ovalbumin and to Trypanossoma cruzi antigen.
Immunology. 89: 368-374, 1996.
TESH, R. B. Control of zoonotic visceral leishmaniasis: is it time to change strategies? Am J
Trop Med Hyg, 52(3):287-92, 1995.
TSAGOZIS, P., E. KARAGOUNI AND E. DOTSIKA. CD8(+) T cells with parasite-specific
cytotoxic activity and a Tc1 profile of cytokine and chemokine secretion develop in experimental
visceral leishmaniasis. Parasite Immunol 25(11-12): 569-79, 2003.
WAHREN, B. & BRYTTING M.. DNA increases the potency of vaccination against infectious
diseases. Curr Opin Chem Biol, 1(2):183-9, 1997.
WAITE, D. C.; JACOBSON, E. W.; ENNIS, F. A.; EDELMAN, R.; WHITE, B.; KAMMER, R.;
ANDERSON, C.; KENSIL, C. R. Three double-blind, randomized trials evaluating the safety and
tolerance of different formulations of the saponina adjuvant QS-21. Vaccine. 19: 3957-3967,
2001.
WEBB J R, KAUFMANN D, CAMPOS-NETO A E REED S G. Molecular cloning of a novel
protein antigen of Leishmania major that elicits a potent immune response in experimental
murine leishmaniasis. J Immunol; 157(11): 5034-41, 1996.
WILSON, M. E., M. SANDOR, A. M. BLUM, B. M. YOUNG, A. METWALI, D. ELLIOTT, R.
G. LYNCH AND J. V. WEINSTOCK. Local suppression of IFN-gamma in hepatic granulomas
correlates with tissue-specific replication of Leishmania chagasi. J Immunol 156(6): 2231-9,
1996.
WHO Expert Committee. Control of the leishmaniasis World Health Organ. Tech. Rep. Ser.,
793, Geneva, Suíça, 1-14, 1990.
WILSON, M. E.; YOUNG B. M.; ANDERSEN, K. P.; WEINSTOCK, J. V.; METWALI, A.;
ALI, K. M.; DONELSON, J. E.. A recombinant Leishmania chagasi antigen that stimulates
cellular immune responses in infected mice. Infect Immun, 63(5):2062-9, 1995.
YANG, C.; COLLINS, W. E.; SULLIVAN, J. S.; KASLOW, D. C.; XIAO, L.; LAL, A. A.
Partial protection against Plasmodium vivax blood-stage infection in Saimiri Monkeys by
immunization with a recombinant C-terminal fragment of merozoite surface protein 1 in block
copolymer adjuvant. Infection and Immunity. 67(1): 342-349, 1999.
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