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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Atividade da xantina oxidase em pacientes com sepse
Marilene Nonnemacher Luchtemberg
Orientador: Prof. Dr. Emilio L. Streck
Co-orientador: Prof. Dr. Felipe Dal-Pizzol
Criciúma, 2007
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2
Resumo
A relação entre a atividade da xantina oxidase (XO), marcadores de dano
oxidativo e parâmetros clínicos de severidade em pacientes sépticos é pouco
compreendida. Além disso, o perfil temporal da atividade da XO e a sua
relação com a severidade e desfecho da sepse não está descrito na literatura.
Este trabalho determinou a relação entre a atividade da XO e o desfecho de
pacientes sépticos, bem como a sua relação ao dano oxidativo e parâmetros
clínicos de severidade de sepse. Setenta e dois pacientes admitidos na
Unidade de Terapia Intensiva de um Hospital universitário por um período de 6
meses foram utilizados nesse estudo. Os pacientes foram divididos nos
seguintes grupos, de acordo com parâmetros clínicos: sepse (n=8), sepse
grave (n=28) e choque séptico (n=36). A partir do momento do diagnóstico,
foram colhidas amostras de sangue dos pacientes, diariamente e por três dias,
para determinação de espécies reativas ao ácido tiobabritúrico (TBARS),
carbonilação de proteínas e atividade da XO. Nenhum dos parâmetros
oxidativos determinados no momento do diagnóstico correlacionaram-se com a
severidade da sepse. No entanto, a atividade da XO, mas não os parâmetros
oxidativos, estava significativamente mais elevada em pacientes não-
sobreviventes, no momento do diagnóstico. Além disso, 24 horas após o
diagnóstico de sepse, a atividade da XO estava menor em pacientes não-
sobreviventes. A atividade da XO parece estar mais elevada em pacientes
sépticos não-sobreviventes. Variações na atividade da XO podem ser usadas
para predizer o desfecho desses pacientes.
Palavras-chave: sepse, estresse oxidativo, xantina oxidase.
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3
Abstract
The relation between xanthine oxidase (XO) activity and oxidative damage
markers and clinical parameters of severity in septic patients is not well
understood. In addition, the temporal evolution of XO activity and its relation to
outcome in septic patients is not described in the literature. Thus, the aim of this
study is determine the relation of XO activity and the outcome of septic patients
and its relation to oxidative damage and clinical parameters of sepsis severity.
Seventy-two critically ill patients admitted over a 6-month period to the intensive
care unit at a tertiary care University Hospital were enrolled in this study.
Patients were assigned to groups according to the diagnosis of sepsis (n=8),
severe sepsis (n=28) or septic shock (n=36) and starting on the time of sepsis
diagnosis blood samples were collected daily for three consecutive days to the
determination of thiobarbituric acid reactive species (TBARS), protein carbonyls
and XO activity. None of the studied oxidative parameters determined at the
time of diagnosis were related to sepsis severity. In contrast, XO activity, but not
oxidative damage parameters, at the time of sepsis diagnosis was significantly
higher in non-survival septic patients. In contrast, 24h after sepsis diagnosis,
XO activity was lower in non-survivors septic patients. XO activity seemed to be
increased in non-survivors sepsis patients and the variations in XO activity
could be used for outcome prediction in these patients.
Keywords: sepsis, oxidative stress, xanthine oxidase.
4
Lista de abreviaturas
ADP – adenosina difosfato
AMIB – Associação de Medicina Intensiva Brasileira
AMP – adenosina monofosfato
APACHE II – do inglês “Acute Physiology and Chronic Health
Evaluation
” II
ATP – adenosina trifosfato
ERO – espécies reativas de oxigênio
HMG-I – proteínas do grupo de alta mobilidade I
ICAM-1 – molécula de adesão intercelular 1
NADPH – nicotinamida adenina dinucleotídio fosfato
NF-κB – fator nuclear κB
SIRS – síndrome da resposta inflamatória sistêmica
UTI – Unidade de Tratamento Intensivo
XO – xantina oxidase
Lista de figuras
Figura 1. Mecanismo de ativação da xantina oxidase na isquemia e
reperfusão....................................................................................................
16
5
Sumário
PARTE I..........................................................................................................
6
1.Introdução ...............................................................................................
6
2. Sepse......................................................................................................
8
3. Espécies reativas de oxigênio e sepse...................................................
13
4. Xantina oxidase......................................................................................
15
5. Objetivos ................................................................................................
18
PARTE II.........................................................................................................
19
Artigo: Xanthine oxidase activity in patients with sepsis ….........……….……
20
PARTE III........................................................................................................
31
1. Discussão……...........................................................................………..
31
2. Conclusões.............................................................................................
34
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................................
35
6
PARTE I
1. Introdução
A incidência da sepse tem aumentado desde os anos 1930 (PARKER e
PARRILO, 1983), e todas as recentes evidências sugerem que este aumento
persiste nos últimos anos. As razões para este aumento sustentado são
variadas, tais como o aumento do uso de procedimentos invasivos, o uso
amplo de imunossupressores e agentes citotóxicos, aumento na sobrevida de
pacientes crônicos e aumento na infecção por organismos multiresistentes.
Apesar dos consideráveis avanços, a sepse continua sendo uma importante
causa de mortalidade, com uma incidência estimada de 400.000 casos por ano
nos Estados Unidos, com metade deles evoluindo para choque séptico
(WICKEL et al, 1997).
No Brasil, pesquisas revelam que a sepse grave representa 33,7% dos
casos e o choque séptico, 65% (AMIB, 2003). Em 2005, 54.365 internações
para tratamento de sepse ocorreram no Brasil, pelo Sistema Único de Saúde
(SUS). A mortalidade apresentada foi de aproximadamente 38% (DATASUS,
2005).
Apesar da importância da sepse na mortalidade global em UTI, os
tratamentos atualmente empregados são meramente de suporte. O melhor
entendimento da fisiopatologia da sepse através de trabalhos experimentais
pode fornecer dados preliminares e novos protocolos experimentais de
tratamento para serem posteriormente validados em ensaios clínicos e
empregados na prática médica (FINK e HEARD, 1990).
7
Atualmente, o papel de diversos mediadores na patogênese da sepse
tem sido esclarecido (REINHART e KARZAI, 2001). Brevemente, os
microorganismos causadores liberam ou secretam na corrente sangüínea
componentes estruturais, como, por exemplo, lipopolissacarídeo, capazes de
estimular a liberação de mediadores derivados de células do sistema imune ou
de proteínas plasmáticas pré-formadas. Estes mediadores podem induzir
alterações profundas na fisiologia normal da vasculatura e órgãos-alvo. Apesar
de alguns mediadores serem mais importantes que outros, provavelmente
mediadores dos microorganismos e do hospedeiro interagem, e sua ação
conjunta é responsável pela patogênese da sepse.
Dentre os mediadores envolvidos na gênese da sepse podem-se
destacar as citocinas, selectinas, óxido nítrico, metabólitos do ácido
araquidônico, espécies reativas de oxigênio (ERO) e proteínas do grupo de alta
mobilidade I (HMG-I), antigamente conhecida como anfoterina (SZABO, 1998;
WANG, 1999; DAS, 2000; ZHANG et al, 2000).
A interação dos diversos mediadores leva à depressão miocárdica,
alteração da função vascular e dano em órgãos-alvo (principalmente fígado,
rim, pulmão e sistema nervoso central) e, em alguns casos, a morte por
hipotensão refratária ou falência de múltiplos órgãos.
8
2. Sepse
O termo sepse é utilizado desde a antiga Grécia para descrever casos
onde havia putrefação e sempre esteve associado com doença e morte
(MAJNO, 1991). A sepse é uma condição clínica resultante de infecção
bacteriana e bacteremia é a presença desses microorganismos na corrente
sanguínea (BONÉ, 1996). Conforme o Consenso Brasileiro de Sepse,
“o termo sepse significa putrefação, decomposição da matéria
orgânica por um agente agressor (bactérias, fungos, parasitas,
vírus). Os termos infecção e sepse são geralmente utilizados de
forma independente, no entanto a terminologia acaba
simplificando uma relação complexa. O termo infecção está
relacionado à presença de agente agressor em uma localização
(tecido, cavidade ou fluido corporal) normalmente estéril, e o
termo sepse está relacionado à conseqüente manifestação do
hospedeiro, i.e., à reação inflamatória desencadeada frente a
uma infecção grave. A distinção entre os dois não é fácil, pois
todo processo infeccioso desencadeia uma resposta do
hospedeiro, e cada indivíduo apresenta um tipo de reação com
magnitudes diferentes frente a um determinado insulto”.
Por maior que seja o progresso da ciência no entendimento de várias
patologias e suas conseqüências, e do grande avanço tecnológico e
terapêutico existentes, vários estudos ainda são realizados para melhor
compreensão da fisiopatologia da sepse e suas conseqüências.
Como a sepse é uma doença de alta prevalência mundial e com elevada
taxa de morbimortalidade, foi necessário padronizar critérios diagnósticos com
o objetivo de facilitar o diagnóstico precoce afim de melhor a sobrevida dos
pacientes (AMIB, 2003).
Em 1991 foi realizada a Conferência de Consenso de Sepse pelo
American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine, onde
9
se definiram os seguintes termos (HEARD e FINK, 1991; VARON e MARIK,
1999; VICENT e FERREIRA, 2002):
Síndrome da resposta inflamatória sistêmica (do inglês “systemic
inflammatory response syndrome”, SIRS) – Resposta do organismo a um
insulto variado (trauma, pancreatite, grande queimado, infecção sistêmica),
com presença de pelo menos 2 dos critérios abaixo:
1. Febre – temperatura corporal maior de 38
o
C; ou hipotermia – temperatura
corporal menor de 36
o
C.
2. Taquicardia – freqüência cardíaca maior de 90 bpm.
3. Taquipnéia – freqüência respiratória maior de 20 irpm ou PaCO2 menor de
32 mmHg.
4. Leucocitose – contagem de leucócitos maior de 12.000 células/mm
3
; ou
leucopenia – menor de 4000 células/mm
3
, ou presença de 10% de formas
jovens (bastões).
Sepse – Quando a síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) é
decorrente de um processo infeccioso comprovado.
Sepse grave – Quando a sepse está associada a manifestações de hipotensão
tecidual e disfunção orgânica, caracterizada por acidose lática, oligúria ou
alteração do nível de consciência, ou hipotensão arterial com pressão sistólica
menor que 90 mmHg – porém, sem a necessidade de agentes vasopressores.
10
Choque séptico – Quando a hipotensão ou a hipoperfusão induzidas pela
sepse são refratárias a ressuscitação volêmica adequada e com subseqüente
necessidade de administração de agentes vasopressores.
Falência de múltiplos órgãos – Alteração na função orgânica de forma que a
homeostasia não possa ser mantida sem intervenção terapêutica. A falência
orgânica é um processo contínuo e dinâmico, que pode variar desde disfunção
leve até falência total do órgão. Geralmente são utilizados parâmetros de 6
órgãos-chave: pulmonar, cardiovascular, renal, hepático, neurológico e
coagulação.
Em 2001, uma nova Conferência (LEVY et al, 2003) padronizou novos
critérios para detecção precoce de resposta inflamatória e falência orgânica,
pois já havia pesquisas embasadas na fisiopatologia que sugeriam o papel de
marcadores químicos no diagnóstico e que poderiam modificar a definição de
sepse e seus critérios diagnósticos (AMIB, 2003).
Nesta Conferência, novas tendências foram estabelecidas com o
sistema P.I.R.O. (do inglês P – “predisposition” predisposição; I- “infection”
infecção; R – “response” resposta inflamatória; O – “organ disfunction”
disfunção orgânica), para estadiamento da sepse, categorizando os pacientes
quanto aos fatores predisponentes, resposta ao insulto agressor e grau
orgânica conseqüente, tornando a estratificação mais direcionada para a
resposta inflamatória desencadeada pelo hospedeiro e disfunções orgânicas
secundária (LEVY et al, 2003).
11
Durante os últimos anos, vários estudos epidemiológicos sobre sepse
vêm sendo realizados. Um destes estudos foi conduzido por Rangem-Frausto e
colaboradores (1995), realizado com 3.708 pacientes. Desses, 68%
apresentaram, em algum momento, dois ou mais critérios de SIRS. Desses
68%, 17% desenvolveram sepse, 13% sepse grave e 3% apresentaram todos
os critérios de choque séptico. Um grande estudo epidemiológico conduzido
por Angus e colaboradores (2000) referiu a sepse como a décima causa de
morte, sendo responsável por 1,3% das mortes naquele ano com taxa de
mortalidade entre 35 e 50%, o que representaria de 200 a 300.000 mortes por
sepse grave e choque séptico. Este estudo foi baseado em análise
retrospectiva de 621.559 admissões hospitalares em 7 estados americanos
(aproximadamente 25% da população).
No Brasil, um grande projeto denominado sepse Brasil foi realizado no
ano de 2003 pela Associação de Medicina Intensiva (AMIB). O estudo foi
desenvolvido com 3.821 pacientes internados em Unidades de Tratatmento
Intensivo (UTI) do país. A pesquisa revela que a maioria dos casos de
mortalidade por sepse grave é conseqüência de infecções pulmonares e
abdominais. De acordo com a pesquisa, em 17% dos casos foi diagnosticada
sepse grave, em 57% dos pacientes ela manifestou-se por conseqüência de
infecções pulmonares e, em 21%, em conseqüência de infecções abdominais.
Nos casos pulmonares, a maior incidência é proveniente de pneumonia e nos
casos abdominais é decorrente de infecções urinárias, pancreatite e ruptura de
úlceras. A pesquisa ainda destaca que a sepse atinge mais homens do que
mulheres, sendo 57% dos casos masculinos, com idade média de 61,7 anos,
com mortalidade avaliada num período de 28 dias. A sepse grave representa
12
33,7% dos casos e choque séptico já chega a 65%, com tempo médio de
internação de 15 dias para esses casos (AMIB, 2003). Em 2004, Silva e
colaboradores realizaram um estudo brasileiro epidemiológico sobre sepse,
onde os resultados mostraram uma taxa de mortalidade de 21% e incidência de
sepse, sepse grave e choque séptico de 61,4, 35,5 e 30,0 casos por 1.000
pacientes-dia. Segundo dados do DATASUS, ocorreram 54.365 internações
para tratamento de sepse no SUS em 2005, representando aproximadamente
0,5% do total de internações no SUS, com taxa de mortalidade de 38,02%.
A grande incidência, associada à gravidade da sepse, seria por si só o
suficiente para justificar o aprofundamento no conhecimento de sua
fisiopatologia e a tentativa de novas possibilidades terapêuticas. Associada a
grande mortalidade envolvida, nota-se que o gasto direto e indireto com a
sepse atinge altas cifras em nosso país. A possibilidade de diminuir a
mortalidade por sepse e reduzir os gastos com internação em UTI (alto custo
com antibióticos de largo espectro, recursos técnicos, humanos e tecnológicos
associados com o manejo do paciente) justificam a necessidade de maior
investimento no estudo desta patologia.
13
3. Espécies reativas de oxigênio (ERO) e sepse
As ERO têm se tornado alvo de vários estudos, pois se acredita que os
mesmos estão relacionados com um grande número de doenças que afeta os
seres humanos. Os radicais livres não constituem a causa da maioria das
patologias, mas estão diretamente envolvidos nos mecanismos fisiopatológicos
que determinam a continuidade e as complicações das doenças. Essas
moléculas também participam de processos fisiológicos, como processos
inflamatórios e na transmissão de sinais, atuando como segundos mensageiros
mantendo as diversas funções celulares (ABDALLA, 2003; HALLIWELL, 2006;
HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007).
As ERO são moléculas eletronicamente instáveis e, por isso, altamente
reativas, tendo a capacidade de reagir com um grande número de compostos
que estejam próximos, podendo exercer a função de receptor e doador de
elétrons. Em nosso organismo, a formação de radicais livres é originada do
oxigênio nos vários processos metabólicos, exercendo um importante papel no
funcionamento do organismo humano (ABDALLA, 2003; HALLIWELL, 2006;
HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007).
Essas espécieis passam a ser prejudiciais ao nosso organismo quando
ocorre um aumento excessivo dos mesmos ou quando ocorre a diminuição dos
agentes antioxidantes endógenos, e em ambas situações é denominado
estresse oxidativo.
Segundo Abdalla (2003):
“O estresse oxidativo causa lesões em macromoléculas e
diversas estruturas celulares que, se não forem reparadas,
alterarão o funcionamento de células, tecidos e órgãos. Um
grande número de condições clínicas tem sido relacionado ao
14
estresse oxidativo. É importante saber se o aumento da geração
de espécies oxidantes é a causa ou a conseqüência de uma
determinada doença”.
Dentre os mediadores envolvidos na resposta sistêmica da sepse tem-se
dado atenção especial para as ERO. Durante a sepse as ERO são produzidas
no compartimento vascular e nos órgãos-alvo podendo ser os efetores de
diversas alterações patológicas envolvidas na gênese da doença. A produção
de ERO pode contribuir para o dano em órgãos-alvo e para a regulação da
produção de citocinas, tendo assim papel relevante na gênese da sepse
(ZHANG et al, 2000).
Fujimura e colaboradores (2000) e Callahan e colaboradores (2001)
demonstraram que a produção de ERO pode, em diferentes modelos animais
de sepse, estar associada com disfunção contrátil de proteínas musculares,
provavelmente por alteração mitocondrial. A produção de ERO parece também
estar associada ao choque refratário associado a sepse, provavelmente por
inativação de catecolaminas (McARTHUR et al, 2000). Basu e Eriksson (1998)
demonstraram aumento em marcadores plasmáticos de estresse oxidativo em
modelo de sepse induzida por endotoxina; este aumento era proporcional ao
índice de mortalidade observada após a administração da endotoxina. Em dois
trabalhos, Chang e colaboradores (1999; 2001) demonstraram que estes
efeitos podem ser parcialmente devido a ativação de fator nuclear κB (NF-κB) e
aumento de expressão de molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1). Nosso
grupo demonstrou recentemente que alguns parâmetros oxidativos plasmáticos
podem prever mortalidade em modelo animal de sepse (RITTER et al, 2003). O
aumento em parâmetros de estresse oxidativo também foi observado em
pacientes com sepse (ORTOLANI ET AL, 2000, WINTERBOUM et al, 2000).
15
4. Xantina oxidase (XO)
A hipotensão causada pela sepse grave deve ser corrigida
imediatamente a fim de aumentar a perfusão tecidual. A reposição volêmica
deve ser prioridade, pois com o aumento da pré-carga conseqüentemente
haverá aumento do débito cardíaco ocorrendo aumento na oferta de oxigênio
(GUTTERIDGE e HALLIWELL, 1990). Quando a oferta de oxigênio não ocorre
adequadamente, acaba ocorrendo uma diminuição dos nutrientes necessários
para o metabolismo celular, o que pode levar a morte de um determinado
tecido (MOORE, 1995).
Alguns estudos demonstram que a lesão não seria causada somente
pela isquemia, mas também pelo processo de reperfusão tecidual (CINELLI e
SACILOTTO, 2002; MOLNAR, 2002). Em um estudo realizado por Parks e
Granger (1986) foi demonstrado que três horas de isquemia seguidas de uma
hora de reperfusão causam maior lesão na mucosa intestinal do que quatro
horas de isquemia. O fenômeno que ocorre no processo entre a isquemia e a
reperfusão do tecido envolve ERO, pois se sabe que as mesmas são
originadas através do metabolismo anormal do oxigênio, podendo ser um dos
prováveis determinantes dos danos decorrentes (HOBSON et al, 1993;
YOUNG et al, 1996; LONGSTRETH et al, 1998; ROCKMAN et al, 2001).
A relação entre as ERO e o aumento da atividade da xantina oxidase
(XO), uma enzima aceptora de elétrons capaz de formar ânion superóxido,
radical hidroxil e peróxido de hidrogênio, tem sido alvo de novos estudos
(SBARIA et al, 1993; LIPTON, 1999). A lesão e morte celular na isquemia e
reperfusão envolvem vários mecanismos bioquímicos, como os danos
16
causados por metabólitos das purinas, pela formação de óxido nítrico e pela
ação dos leucócitos (TARDINI e YOSHIDA, 2003).
A isquemia causa diminuição de oxigênio nos tecidos e inibição da
fosforilação oxidativa nas mitocôndrias, levando à queda na formação de
adenosina trifosfato (ATP) (Figura 1). Mesmo com a diminuição dos níveis de
ATP, o consumo do mesmo continua a ser degradado, gerando adenosina
difosfato (ADP), adenosina monofosfato (AMP) e posteriormente adenosina,
inosina e hipoxantina (YOSHIDA, 2002). Com a redução de energia nas
células, ocorre diminuição nas atividades de bombas iônicas, como a bomba de
sódio e potássio. Com isso, ocorre acúmulo de sódio no interior da célula e
perda de potássio para fora da célula, causando edema celular. Ao mesmo,
ocorre influxo de cálcio e cloreto (LIPTON, 1999).
Figura 1. Mecanismo de ativação da xantina oxidase na isquemia e reperfusão
(TARDINI e YOSHIDA, 2003).
17
O acúmulo de cálcio ativa a protease calpaína, que remove uma porção
peptídica da xantina desidrogenase (XD), levando a formação da XO
(WATSON, 1993; BEETSCH et al, 1998; LIPTON, 1999). Na isquemia, ocorre
acúmulo de XO e hipoxantina e, quando ocorre a reperfusão celular, a
disponibilidade de oxigênio aumenta. A enzima XO, que necessita de oxigênio
para converter hipoxantina em xantina, é então ativada. Com a ativação da XO,
a hipoxantina é convertida em xantina e depois em ácido úrico. Além disso, o
oxigênio é convertido em ânion superóxido, que pode ser metabolizado pela
defesa antioxidante enzimática (enzimas superóxido dismutase e catalase)
tendo a água como produto final (KONTOS, 2001).
O superóxido é um agente oxidante fraco (BECKMAN et al, 1990;
CHAN, 1996), e sua ação tóxica ocorre mais por produtos de sua redução,
como o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxila, um potente agente
oxidante. Além disso, o superóxido, juntamente com outros mediadores
químicos, promove a ativação de leucócitos. Estando ativadas, essas células
liberariam enzimas como a mieloperoxidase e nicotinamida adenina
dinucleotídio fosfato (NADPH) oxidase, que formam mais ERO e contribuem
para o dano celular (TARDINI e YOSHIDA, 2003).
18
5. Objetivos
O presente trabalho tem como objetivo geral determinar a relação da
atividade da XO com a severidade e desfecho de sepse.
Os objetivos específicos são:
- Determinar a atividade da XO plasmática em pacientes com
sepse, sepse grave e choque séptico,
- Determinar se a atividade da XO pode prever a progressão da
sepse,
- Determinar se a atividade da XO pode prever a mortalidade
por sepse.
19
PARTE II
Artigo
Marilene N. Luchtemberg, Roberta A. Machado, Larissa Constantino, Daniel P.
Gelain, Michael Andrades, Cristiane Ritter, José Cláudio F. Moreira, Emilio L.
Streck, Felipe Dal-Pizzol. Xanthine oxidase activity in patients with sepsis.
Submetido a Journal of Surgical Research.
20
Xanthine oxidase activity in patients with sepsis
Marilene N. Luchtemberg
1
, Roberta A. Machado
1
, Larissa Constantino
1
,
Daniel P. Gelain
2
, Michael Andrades
2
, Cristiane Ritter
1,2
,
José Cláudio. F. Moreira
2
, Emilio L. Streck
1
, Felipe Dal-Pizzol
1,2*
.
1
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Universidade do Extremo Sul
Catarinense, Criciúma, SC, Brazil
2
Centro de Estudos em Estresse Oxidativo, Departamento de Bioquímica,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, RS, Brazil
Correspondence to: Felipe Dal-Pizzol. Laboratório de Fisiopatologia Experimental,
Universidade do Extremo Sul Catarinense, Criciúma, SC, Brazil. Avenida
Universitária, 1105, 88006-000. phone: 55 48 4312641, fax: 55 48 431 2750, e-
mail:piz@unesc.net
21
Abstract
Objective: The aim of this study is determine the relation of xanthine oxidase (XO)
activity and the outcome of septic patients and its relation to oxidative damage and
clinical parameters of sepsis severity.
Design: Cohort study.
Setting: Intensive care unit at a tertiary care University Hospital.
Patients and participants: Seventy-two critically ill patients admitted over a 6-month
period to the were enrolled in this study. Patients were assigned to groups according
to the diagnosis of sepsis (n=8), severe sepsis (n=28) or septic shock (n=36).
Measurements and results: Starting on the time of sepsis diagnosis blood samples
were collected daily for three consecutive days to the determination of thiobarbituric
acid reactive species (TBARS), protein carbonyls and XO activity. None of the studied
oxidative parameters determined at the time of diagnosis were related to sepsis
severity. In contrast, XO activity, but not oxidative damage parameters, at the time of
sepsis diagnosis was significantly higher in non-survival septic patients. In contrast,
24h after sepsis diagnosis, XO activity was lower in non-survivors septic patients.
Conclusions: XO activity seemed to be increased in non-survivors sepsis patients
and the variations in XO activity could be used for outcome prediction in these
patients.
Descriptor: SIRS/sepsis: clinical studies
Key-words: septic shock, oxidative stress, outcome, xanthine, reactive oxygen
species
22
Introduction
Sepsis and related syndromes, as the multiple organ dysfunction (MODS), are
the most frequent causes of morbidity and mortality in intensive care units (ICU),
contributing to 750,000 cases per year in the U.S. alone with an average mortality of
29% (1). It is a complex syndrome characterized by an imbalance between pro-
inflammatory and anti-inflammatory response to pathogen (2). Some of the postulated
molecular mechanisms of sepsis and its progression are linked with the imbalance
between reactive oxygen species (ROS) production and its degradation by cellular
antioxidants pathways, and this imbalance has provided clues to design new
treatment approaches (3-8). Some few studies demonstrated the appearance of
xanthine oxidase (XO) activity in the human plasma in septic patients (9,10). Xanthine
dehydrogenase is a molybdenum iron-sulfur flavin dehydrogenase which oxidizes
purines, pyrimidines, pteridins, and other heterocyclic nitrogenous compounds. In
mammals, the enzyme is converted from the nicotinamide-adenine dinucleotide-
dependent xanthine dehydrogenase to the oxygen-dependent oxidase form, either by
reversible sulfhydryl oxidation or irreversible proteolytic modification (11). Ischemia
results in cellular depletion of adenosine triphosphate with the accumulation of
hypoxanthine and xanthine, which are substrates for XO (11). With the restoration of
oxygen supply on reperfusion, the purines are converted to uric acid by XO, with
concomitant formation of superoxide radical anions (11).
It is not clear in the literature the relation between XO activity and the
occurrence of oxidative damage during sepsis development. In addition, the temporal
evolution of XO activity and its relation to outcome in septic patients is not described in
the literature. Thus, the aim of this study is to determine the relation of XO activity and
the outcome of septic patients and its relation to oxidative damage and clinical
parameters of sepsis severity.
23
Material and Methods
Study Population. The study protocol was approved by the Human Ethics
Committee from Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brazil. Seventy-two critically ill
patients admitted over a 6-month period to the intensive care unit at a tertiary care
University Hospital were enrolled in this study. Patients were assigned to groups
according to the diagnosis of sepsis (n=8), severe sepsis (n=28) or septic shock (n=36)
according to the Bone criteria for sepsis (12). Starting on the time of sepsis diagnosis
heparinized blood samples were collected daily for three consecutive days. After blood
collection, samples were putted immediately on ice and stored at -80
0
C for the
determination of xanthine oxidase activity and oxidative damage parameters (see
above). In parallel to the sample collection for plasma markers analysis, clinical data
relevant for the study were recorded daily until ICU discharge. In addition, we collected
blood from 6 healthy volunteers to determine oxidative damage parameters and
compare to septic patients.
As an index of lipid peroxidation we used the formation of thiobarbituric acid
reactive species (TBARS) (13). Briefly, the samples were mixed with thiobarbituric acid
0.67%. TBARS were determined by the absorbance at 535 nm and expressed as
malondialdehyde equivalents (nm/mg protein). The oxidative damage to proteins was
assessed by determination of carbonyl groups based on the reaction with
dinitrophenylhydrazine as previously described (14). Briefly, proteins were precipitated,
dissolved in dinitrophenylhydrazine and the absorbance read at 370 nm. Values are
expressed as nmol/mg protein. Activity of xanthine oxidase (XO) was assayed using
oxidation of pterin to isoxanthopterine (15).
Data are expressed as mean ± standard deviation for variables with normal
distribution. For repeated measurements a two-factorial analysis of variance was
performed. Comparison between means was carried out using the Newman-Keuls test.
Multivariate analyses were performed to control for potential confounding factors.
24
Results are reported as unadjusted means. Pearson’s correlation test was used to
study associations between markers levels and other variables. Differences with p
values below 0.05 were considered significant.
Results
Demographic data and oxidative parameters for the septic patients studied are
given in Table 1. APACHE II, but not MODS at the time of sepsis diagnosis, was
significantly higher in non-survival sepsis patients (Table 1). Protein carbonyls content
and XO activity at the time of sepsis diagnosis, but not TBARS, were significantly
higher in septic patients when compared to healthy volunteers (0.56 ± 0.12 vs 2.98 ±
2.06, p=0.001 for protein carbonyls and 1.2 ± 0.4 vs 4.2 ± 2.6, p=0.01 for XO activity).
None of the studied oxidative parameters determined at the time of sepsis diagnosis
or 24, 48 or 72 hours after the diagnosis were related to sepsis severity scores (data
not shown). In contrast, XO activity, but not TBARS or protein carbonyl, at the time of
sepsis diagnosis was significantly higher in non-survival septic patients, independent
of sepsis severity, APACHE II and MODS scores (Table 1). In contrast, 24 and 48
hours after sepsis diagnosis XO activity was lower in non-survivors septic patients
(Table 1). Thus, 75% of patients whose XO activity decreased by 10% during the first
24 hours of sepsis diagnosis died, and 75% of patients whose XO activity increased
by 10% during the first 24 hours of sepsis diagnosis survived. Protein carbonyls
content at 24, 48 and 72 hours was higher in non-survivors septic patients when
compared to survivors (Table 1).
Although XO activity was higher in non-survivors it seemed that APACHE II
score was a better marker of sepsis outcome when compared to XO activity when
analyzing ROC curves (Figure 1A). The area under the ROC curve was 0.675 to XO
activity and 0.75 to APACHE II, but adding XO activity to APACHE II score improved
APACHE II area under the ROC curve. Using a cut-off point of 4.0 U/mg protein
25
increased the APACHE II area under the ROC curve to 0.917. For example, APACHE
II score higher than 20 predicts mortality with sensitivity of 80% and specificity of 50%,
but selecting patients with XO activity higher that 4.0 U/mg protein and using APACHE
II score higher than 20 predicts mortality with sensitivity of 78% and specificity of 100%
(Figure 1B).
Discussion
We have shown for the first time that XO activity measured at time of sepsis
diagnosis was increased in non-survivors patients compared to survivors. This was
significantly correlated to plasma protein carbonyls levels, and adds to APACHE II
prediction of sepsis outcome. In addition, variations in XO activity during the first 24–48
hours after sepsis diagnosis could predict outcome in these patients.
In the early 1980s it was demonstrated
that ischemic bowel injury occurred only
on reperfusion and
was attenuated by superoxide dismutase (16). On the basis of this
observation, the hypothesis was put forward that XO-derived
reactive oxygen species
(ROS) contribute to the ischemic injury
via ATP catabolism during hypoxia and
increased electron acceptor
availability on reperfusion (16). Since the introduction
of
the concept of ischemia-reperfusion injury, several lines of evidence support the role
of XO-derived ROS generation and beneficial effects of XO inhibitors
against ischemic
damage of the heart, brain, intestine, liver,
kidney, lung and other tissues were shown
(for an excellent review see 11). The beneficial effects of XO inhibitors in inflammatory
diseases have been reported and include acute lung injury (17) and pancreatitis (18).
There are few evidences in the literature of a role to XO in the pathogenesis of
human sepsis. Galley and colleagues had demonstrated that XO activity was
increased in patients with sepsis in comparison to healthy volunteers and noninfected
patients (10). This was also true to infants and children with septic shock (9). The
increased XO activity in patients with sepsis could be a result of XO activation by
26
various mediators (like cytokines) or by ischemia-reperfusion injury (11). In contrast to
our results, Galley et al demonstrated that XO activity at the time of diagnosis was
lower in non-survivors septic patients (10). In addition, we demonstrated that a
decrease in XO activity during the first 24 hours after sepsis diagnosis was associated
to mortality. This was in accordance to more severe ischemia with incomplete
reperfusion resulting in less xanthine oxidase "wash-out" into the circulation in patients
whose XO activity decreases during the first 24–48 hours after sepsis diagnosis (10,
11). We had previously demonstrated this pattern in severe burn injury patients (19).
These results suggested that XO activity could be used as a prognostic index in the
time of sepsis diagnosis and as a marker of response to treatment during the first days
of intensive care, as do the serial measure of plasma lactate (20).
In conclusion, XO seemed to be increased in non-survivors patients and the
variations in its activity could be used for outcome prediction in these patients. In
addition, our findings strongly suggest that when XO activity when added to clinical
parameters of disease severity, like APACHEII, improved sepsis outcome prediction.
27
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29
Table 1. Demographic and plasma oxidative markers in survival and non-survival
sepsis patients
Non-Survivors Survivors p value
Male
Female
20
18
20
14
0.65
Age 60 + 15 55 + 18 0.42
Sepsis
Severe Sepsis
Septic Shock
0
16
22
8
12
14
0.036
APACHE II 26.5 + 7.7 19.2 + 8.07 0.009
MODS 10.4 + 2.9 9.8 + 3.7 0.57
TBARS (nm/mg protein) 0.30 + 0.09 0.27 + 0.12 0.33
TBARS 1 (nm/mg protein) 0.30 + 0.14 0.47 + 0.16 0.48
TBARS 2 (nm/mg protein) 0.41 + 0.43 0.65 + 0.71 0.40
TBARS 3 (nm/mg protein) 0.38 + 0.15 0.26 + 0.17 0.06
Protein Carbonyls (nm/mg protein) 3.8 + 2.2 2.9 + 1.2 0.2
Protein Carbonyls 1 (nm/mg protein)
4.6 + 2.8 2.7 + 2.5 0.01
Protein Carbonyls 2 (nm/mg protein)
5.8 + 3.2 3.3 + 2.1 0.07
Protein Carbonyls 3 (nm/mg protein)
5.4 + 2.6 2.7 + 1.1 0.02
XO activity (U/mg protein) 4.9 + 2.9 3.1 + 1.8 0.04
XO activity 1 (U/mg protein) 2.6 + 1.1 4.1 + 2.9 0.04
XO activity 2 (U/mg protein) 2.5 + 2.8 4.1 + 2.5 0.07
XO activity 3 (U/mg protein) 5.3 + 1.6 5.0 + 4.6 0.9
TBARS = TBARS content at the time of sepsis diagnosis (n=72)
TBARS 1 = TBARS content 24h after sepsis diagnosis (n=72)
TBARS 2 = TBARS content 48h after sepsis diagnosis (n=54)
TBARS 3 = TBARS content 72h after sepsis diagnosis (n=40)
Protein carbonyls = Protein carbonyls content at the time of sepsis diagnosis (n=72)
Protein carbonyls 1 = Protein carbonyls content 24h after sepsis diagnosis (n=72)
Protein carbonyls 2 = Protein carbonyls content 48h after sepsis diagnosis (n=54)
Protein carbonyls 3 = Protein carbonyls content 72h after sepsis diagnosis (n=40)
XO activity = XO activity at the time of sepsis diagnosis (n=72)
XO activity 1 = XO activity 24h after sepsis diagnosis (n=72)
XO activity 2 = XO activity 48h after sepsis diagnosis (n=54)
XO activity 3 = XO activity 72h after sepsis diagnosis (n=40)
30
Figure 1. ROC curve illustrating the accuracy of A. the isolate use of APACHE II or
xanthine oxidase activity at sepsis diagnosis or B. APACHE II in patients with xantine
oxidase activity equal or higher than 4.0 U/mg protein in septic patients.
31
PARTE III
1. Discussão
A geração de ERO pela XO foi demonstrada por McCord e Fridovich
(1968). Anos mais tarde, foi demonstrado que as ERO causam danos
oxidativos ao organismo e que alguns antioxidantes podem evitar esses danos
(McCORD, 1974). A partir desses estudos, novas pesquisas envolvendo as
ERO tiveram origem. Sabe-se que algumas espécies são necessárias para
processos fisiológicos das células, e quando há desequilíbrio entre a produção
e eliminação das mesmas ocorre oxidação (SILVEIRA, 2004). Poucos estudos
clínicos associando sepse e XO foram realizados. É com o intuito de
compreender e oferecer entendimento sobre as alterações bioquímicas
envolvendo a sepse que se deu origem a este estudo.
Nesse trabalho foi demonstrado que a atividade da XO, medida no
momento do diagnóstico da sepse, estava aumentada nos pacientes não-
sobreviventes, quando comparados aos sobreviventes. O aumento na atividade
da XO está correlacionado significativamente com os níveis de carbonilação de
proteínas do plasma, e melhorou a predição de APACHE II (do inglês “Acute
Physiology and Chronic Health Evaluation” II) no resultado do desfecho de
sepse. Além disso, variações na atividade da XO durante as primeiras 24 a 48
horas após o diagnóstico da sepse podem predizer o desfecho desses
pacientes.
Na década de 1980 demonstrou-se que o dano intestinal isquêmico
ocorreu somente na reperfusão e foi atenuado pela enzima superóxido
32
dismutase. Com base nessa observação, a hipótese proposta foi de que ERO
derivadas da XO contribuem para a lesão isquêmica através do catabolismo
do ATP durante a hipóxia e aumentou a disponibilidade do aceptores de
elétrons na reperfusão (PARKS et al, 1982). Desde a introdução do conceito
de lesão de isquemia e reperfusão, diversas evidências de literatura
confirmam o papel de ERO derivadas da XO e os efeitos benéficos de
inibidores da XO contra os danos isquêmicos no coração, cérebro, intestino,
fígado, rins, pulmões e os outros tecidos (PACHER et al, 2006). Os efeitos
benéficos de inibidores de XO em doenças inflamatórias foram relatados,
principalmente na lesão aguda pulmonar (WRIGHT et al, 2004) e pancreatite
(GOMEZ-CAMBRONERO et al, 2002).
Poucas evidências na literatura mostram o papel da XO na patogênese
da sepse humana. Galley e colaboradores (1996) demonstraram que a
atividade da XO estava aumentada nos pacientes com sepse, quando
comparados com voluntários saudáveis e pacientes não-infectados. O mesmo
resultado foi demonstrado em recém nascidos e crianças com choque séptico
(NÉMETH e BODA, 2001). A atividade aumentada de XO nos pacientes com
sepse poderia ser um resultado da ativação da XO por vários mediadores
(como citocinas) ou pela lesão de isquemia e reperfusão (PACHER et al,
2006). Em contraste aos nossos resultados, Galley e colaboradores (1996)
demonstraram que a atividade da XO no momento do diagnóstico era menor
nos pacientes sépticos não-sobreviventes. Além disso, foi demonstrado em
nosso trabalho que a diminuição na atividade da XO durante as primeiras 24
horas após o diagnóstico de sepse está associada a mortalidade. Isto pode
ser explicado por uma isquemia mais severa, com reperfusão incompleta
33
resultando em menor “depuração” da XO da circulação dos pacientes com
atividade reduzida da XO durante as primeiras 24 a 48 horas após o
diagnóstico de sepse (GALLEY et al, 1996; PACHER et al, 2006).
Foi previamente demonstrado esse padrão em pacientes com
queimaduras graves (RITTER et al, 2003). Estes resultados sugerem que a
atividade da XO pode ser usada como um índice prognóstico na época do
diagnóstico da sepse e como um marcador da resposta ao tratamento durante
os primeiros dias de tratamento, assim como é a medida do lactato plasmático
(BAKKER et al, 1996).
34
2. Conclusões
A XO parece estar aumentada em pacientes não-sobreviventes e as
variações em sua atividade podem ser usadas para a predição do desfecho
desses pacientes. Além disso, nossos achados sugerem fortemente que a
atividade da XO, quando somada a parâmetros clínicos de severidade da
doença, como APACHE II, melhorou a predição do desfecho da sepse.
35
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