ads:
UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
DIRETORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
EFEITOS DA N-ACETILCISTEÍNA E DEFEROXAMINA NA LESÃO
PULMONAR INDUZIDA POR BLEOMICINA
Kelly Coan Teixeira
CRICIUMA - SC
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
1
UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
DIRETORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
EFEITOS DA N-ACETILCISTEÍNA E DEFEROXAMINA NA LESÃO PULMONAR
INDUZIDA POR BLEOMICINA
Kelly Coan Teixeira
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde da
Universidade do Extremo Sul Catarinense, para
obtenção do título de Mestre em Ciências da
Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Pinho
Co-orientador: Prof. Dr. Emilio Streck
CRICIUMA - SC
2007
ads:
2
EFEITOS DA N-ACETILCISTEÍNA E DEFEROXAMINA NA LESÃO PULMONAR
INDUZIDA POR BLEOMICINA
Kelly Coan Teixeira
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde da
Universidade do Extremo Sul Catarinense, para
obtenção do título de Mestre em Ciências da
Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Pinho
Co-orientador: Prof. Dr. Emilio Streck
CRICIUMA - SC
2007
3
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Bibliotecária: Flávia Cardoso –CRB 14/840
Biblioteca Central Prof. Eurico Back –UNESC
T266e Teixeira, Kelly Coan.
Efeitos da N-acetilcisteína e deferoxamina na lesão
pulmonar induzida por bleomicina / Kelly Coan Teixeira;
orientador: Ricardo Pinho. -- Criciúma: Ed. do autor, 2007.
54 f. : il. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) - Universidade do Extremo Sul
Catarinense, Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde, 2007.
1. N-acetilcisteína. 2. Deferoxamina. 3. Pulmões -
Doenças. 4. Bleomicina. 5. Estresse oxidativo. I. Título.
CDD. 21ª ed. 615.1
4
5
Dedico esta dissertação ao meu marido
Alexandro, que além de proporcionar
condições para a realização deste mestrado,
é a pessoa que tem todo o meu mais
profundo amor, carinho e afeto.
6
AGRADECIMENTOS
Embora sejamos os únicos responsáveis pelo caminho que tomamos, a vida é
repleta de pessoas que vêm ao nosso encontro e nos orientam para tomarmos a
direção certa. Portanto tenho muito a agradecer.
Ao meu querido Deus, agradeço por estar presente sempre em todos os meus
dias. Por ter me deixado nascer em uma família repleta de amor, amparo e carinho,
por todas as conquistas que já realizei e realizarei e até mesmo por àquelas que não
aconteceram, porque não fazia parte do Seu plano para mim. Obrigada por tudo o
que sou e tenho meu Deus!
Ao meu Orientador Prof. Dr. Ricardo Pinho, por ter concedido a gentileza de
trabalhar com ele e proporcionar este tema para a minha dissertação a qual me
apaixonei.
A todo o pessoal do Laboratório de Fisiologia do Exercício, Paulo, Luiz,
Fernanda, Talita, Aderbal, Luciano, Cleber, Marília, Renata, Professora Josete ao
Co-Orientador Emílio, que foram pessoas maravilhosas e me ajudaram muito para
que este trabalho fosse executado. Acreditem, sem vocês dificilmente eu iria
dominar aqueles “ratinhos”. Quero agradecer especialmente ainda, ao meu querido
amigo Paulo, que esteve ao meu lado em todos os experimentos com sua
experiência, amizade e que foi pessoa fundamental para que eu concluísse este
trabalho, e também aos amigos Luiz e Fernanda, que mesmo estando
ocupados com suas atividades na universidade sempre dispunham de um
tempo para ajudar.
À minha querida amiga Cecília Guglielmi, sua amizade foi um presente que
ganhei deste mestrado e que vai fazer parte para sempre em minha vida.
7
E como jamais eu poderia esquecer de vocês meus amores, minha família
querida que tanto amo. Meu pai Edson e minha mãe Zenair: vocês são um presente
de Deus para mim, meu porto seguro, meu aconchego e exemplo. Obrigada por tudo
que fizeram e fazem por mim, vocês serão meu espelho sempre. Ao meu irmão
Rafael, por cuidar de mim, ser uma pessoa maravilhosa, carinhosa e por
proporcionar ainda, junto com minha cunhada Carol, a presença do meu sobrinho e
afilhado Arthur, que é o “amor da vida da dinda”. Amo muito vocês!
E por fim, àquele que tomou meu coração para si, minha metade cuja presença me
completa: meu marido Alexandro. Amo-te muito amor, meus dias ao teu lado são
sempre mais felizes.
8
RESUMO
As Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) apresentam um importante papel na
patogênese da lesão pulmonar e a terapia antioxidantes pode ser usada para
melhorar os mecanismos de defesa. Este estudo teve por objetivo avaliar os efeitos
da N-acetilcisteína (NAC) e Deferoxamina (DFX) sobre os indicadores inflamatórios
e de estresse oxidativo em pulmão camundongos expostos a bleomicina (BLM). Os
animais receberam endotraquealmente uma única dose de BLM (2,5 U/kg massa de
corporal dissolvida em 0,25 mL de NaCl 0.9%) ou salina (0.9%) e foram divididos
randomicamente em 8 grupos (n=8): salina; BLM; salina+NAC; BLM+NAC;
salina+DFX; BLM+DFX; salina+NAC+DFX; BLM+NAC+DFX. Tratamento com NAC
(20 mg/kg) ou DFX (30 mg/kg) foram administrados por 60 dias após BLM. A
atividade da enzima Lactato Desidrogenase (LDH), a quantidade total de células e a
concentração de neutrófilos e proteínas foram determinados em lavado bronco-
alveolar. A peroxidação lipídica (TBARS), os danos oxidativos em proteínas
(carbonil) e a atividade da enzima catalase e da superóxido dismutase (SOD) foram
determinadas no tecido pulmonar. A administração de BLM resultou em significativa
lesão pulmonar e foi completamente reduzida pela administração de NAC mais DFX.
A quantidade total de células e de neutrófilos e a atividade da LDH aumentadas
após a exposição à BLM foram significativamente reduzidas com o uso da NAC mais
DFX. A LDH também foi reduzida com após a suplementação de DFX e NAC. O
aumento nos níveis de lipoperoxidação e carbonilação de proteínas também foi
reduzido com o uso associado de NAC e DFX. Entretanto, o uso isolado da NAC
aumentou a lipoperoxidação. A atividade da SOD aumentou após a administração
de BLM e somente no grupo tratado com DFX a atividade da enzima catalase não foi
alterada na presença de BLM. Os resultados sugerem que o uso isolado da NAC
apresenta limitações na defesa contra o estresse oxidativo pulmonar induzido por
BLM e o uso de DFX melhora os mecanismos de defesa. Portanto, a associação
NAC mais DFX pode ser uma alternativa no tratamento ou prevenção de doenças
pulmonares que tem o ferro e ERO envolvidas em sua patogênese.
Palavras-chave: NAC, DFX, bleomicina, pulmão, estresse oxidativo
9
ABSTRACT
Reactive oxygen species (ROS) play an important role in the pathogenesis of
pulmonary injury and antioxidant therapy may be useful with impaired oxidative
defense mechanism. This study examines the effect of N-acetylcysteine (NAC) and
Deferoxamine (DFX) on inflammatory indicators and oxidative stress in the lungs of
mice exposed to bleomycin (BLM). The animals received endotracheally a single
dose of BLM (2.5 U/kg body weight dissolved in 0.25 mL of 0.9% NaCl) or saline
(0.9% NaCl) and were divided into eight groups (n=8): saline; BLM; saline+NAC;
BLM+NAC; saline+DFX; BLM+DFX; saline+NAC+DFX; BLM+NAC+DFX. Treatments
with NAC (20 mg/kg) or DFX (30mg/kg) were administered for 60 days after BLM
exposure. Lactate dehydrogenase (LDH) activity and total cell count, neutrophil and
protein concentration were determined in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF).
Hydroxyproline content, lipid peroxidation (TBARS), oxidative protein damage
(carbonyl contents), and catalase and superoxide dismutase activities were
determined in the lung tissue. BLM administration resulted in lung fibrosis as
measured by lung hydroxyproline content and lung histology, which is almost
completely prevented by NAC plus DFX. The results of total cell counts and
neutrophils and LDH increased after BLM exposure and were reduced with NAC.
DFX and NAC plus DFX also caused a significant decrease of LDH activity. The
increased malondialdehyde levels and carbonyl contents in lung tissue produced by
bleomycin were also prevented by NAC plus DFX. However, the isolated use of NAC
increased lipid peroxidation. SOD activity increased after BLM exposure only in the
group treated with DFX and catalase activity not was altered in the presence of BLM.
Data presented here indicates that the isolated use of NAC had limited effects on
bleomycin-induced pulmonary oxidative stress in mice. The use of DFX improves the
defense response and in association with NAC may be a good alternative in the
treatment or prevention of diseases that have ROS and iron involved in their
pathogenesis.
Key-words: NAC, DFX, bleomycin, lung, oxidative stress
10
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1: Lung morphologic alterations after bleomycin (BLM) exposure. Lung tissues
were obtained 60 days after instillation of BLM (2.5 U/kg body weight,
intratracheal). Control animals received only saline solution 0,9%. Cuts were made
in sheets of 4m and stained with H-E……………………..…………………………40
Fig. 2: Bleomycin-induced effects of N-acetylcysteine (NAC) and Deferoxamine
(DFX) on malondialdehyde (MDA) levels……………………………………………..41
Fig. 3: Bleomycin-induced effects of N-acetylcysteine (NAC) and Deferoxamine
(DFX) on Carbonyl contents. Values are presented as Mean±SEM and results are
expressed in nmol/mg of protein............................……………..............................41
Fig. 4: Effects of N-acetylcysteine (NAC) and Deferoxamine (DFX) on superoxide
dismutase (SOD) activity after bleomycin-induced lung lesion. Values are
presented as Mean±SEM and results are expressed in U of SOD/mg of
protein…………………………………………………………………………………….42
Fig. 5: Effects of N-acetylcysteine (NAC) and Deferoxamine (DFX) on catalase
activity after bleomycin-induced lung lesion. Values are presented as Mean±SEM
and results are expressed in U of catalase/mg of protein…………………………..42
11
LISTA DE TABELAS
Table 1: Effects of N-acetylcysteine and deferoxamine on bleomycin-induced
changes in total and differential cell counts in BAL fluids from mice. Data presented
as mean±SEM of groups............................................................................................40
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Al –Alumínio
BLM –Bleomicina.
Ca –Cálcio.
CAT –Catalase.
CoQ –Coenzima Q ou Ubiquinona.
Cu –Cobre.
DFX –Deferoxamina.
EROs –Espécies Reativas de Oxigênio.
Fe –Ferro.
FP –Fibrose Pulmonar.
FADH –Flavina Adenina Dinucleotídeo, Forma Radical.
GPX –Glutationa Peroxidase.
GSH –Glutationa Reduzida.
GSSH –Glutationa Oxidada.
H
2
O –Água.
H
2
O
2
–Peróxido de Hidrogênio.
HOCl –Ácido Hipocloroso.
IL –Interleucina.
BAL –Lavado Bronco-Alveolar.
BALF–Fluido do Lavado Bronco-Alveolar.
LDH –Enzima Lactato Desidrogenase.
MPO –Mieloperoxidase.
NAC –N-acetilcisteína.
NADH –Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo, Forma Reduzida.
NaCl –Cloreto de Sódio.
NO –Óxido Nítrico.
NO
2-
–Nitrito.
O
2
–Oxigênio.
O
2
-
–Ânion Superóxido.
13
OH
–Radical Hidroxil.
QH°–Semiquinona.
RL–Radical Livre.
RLO –Radical Livre de Oxigênio.
ROOH –Hidroperóxido Orgânico.
SOD –Superóxido Dismutase.
TBARS –Espécies Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico.
14
SUMÁRIO
CAPÍTULO I - Introdução
1 Justificativa ........................................................................................................16
2 Fundamentação Teórica ...................................................................................17
2.1 Fibrose Pulmonar
2.2 Espécies Reativas de Oxigênio
2.3 Sistema de Defesa Antioxidante
2.4 N- Acetilcisteína e Deferoxamina
2.5 Bleomicina
3 Objetivos ............................................................................................................24
3.1 Geral
3.2 Específicos
4 Organização da Dissertação ............................................................................24
CAPÍTULO II- Artigo
EFEITOS DA N-ACETILCISTEÍNA E DEFEROXAMINA NA FIBROSE PULMONAR
INDUZIDA POR BLEOMICINA...................................................................................26
CAPÍTULO III
Discussão Geral ..................................................................................................46
CAPÍTULO IV
Conclusão e Perspectiva ....................................................................................50
REFERÊNCIAS .........................................................................................................51
15
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
16
1 Justificativa
Para melhor compreender as respostas pulmonares estruturais e bioquímicas
da lesão pulmonar, diversos estudos têm utilizado a administração de bleomicina em
ratos, como modelo específico de Fibrose Pulmonar (FP). (BORZONE ET AL., 2001;
CORTIJO ET AL., 2001; SERRANO-MOLLAR ET AL., 2002; MATA ET AL., 2003;
YILDIRIMA ET AL., 2005).
A bleomicina é um dos agentes quimioterápicos utilizado no tratamento inicial
de linfomas, tumores testiculares e carcinoma de células escamosas. Dependendo
da dose, seu uso em humanos pode produzir, ao longo do tempo, uma série de
lesões associadas com as mudanças funcionais e bioquímicas da FP, processos
inflamatórios e infiltração de células inflamatórias, aumento do conteúdo de
colágeno, e redução da capacidade e volume pulmonar (SNIDER ET AL., 1978;
BOWDEN, 1984).
É possível que os danos pulmonares causados pela bleomicina estejam
diretamente relacionados à formação de Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) por
um mecanismo dependente de ferro (HAY ET AL., 1991). Ademais, a produção de
ERO pode aumentar o dano pulmonar por inativação de antiproteases, rompimento
de membranas e danos alveolares. (DISCROLL ET AL., 1995; TSUDA ET AL.,
1997;).
É possível que um eficiente sistema de defesa tenha condições de minimizar
o dano oxidativo pulmonar induzido pela bleomicina. De acordo com Halliwell e
Gutteridge (1999), esse sistema de defesa pode atuar de forma associada ou
independente pela ativação de enzimas antioxidantes ou pela ação de antioxidantes
biológicos não-enzimáticos. Sobre esse último, destaca-se a glutationa (GSH). Em
sua forma reduzida, a GSH tem um importante papel no mecanismo de defesa do
pulmão contra ataques de radicais livres (SMITH ET AL., 1994; ZHANG ET AL.,
1999; PINHO ET AL., 2005).
Tem sido proposto, em diversos estudos (SPRONG ET AL., 1998;
PATERSON ET AL, 2003; RITTER ET AL, 2004; PINHO ET AL., 2005), que uma
das formas de alterar o conteúdo de GSH, na célula, é através da suplementação de
N-acetilcisteína (NAC). Entretanto, segundo Ritter et al. (2004), é possível que o uso
17
isolado de NAC pode ter limitações e apresentar efeitos pró-oxidantes,
provavelmente, pela sua fácil interação com ferro. Dessa forma, presume-se que o
uso de deferoxamina (DFX), um quelante de ferro, poderia melhorar a resposta
antioxidante ao uso de NAC.
2 Fundamentação Teórica
2.1 Fibrose pulmonar
Por definição, a Fibrose Pulmonar (FP) é uma doença degenerativa
caracterizada por um acúmulo excessivo de fibroblastos, deposição de proteínas da
matriz extracelular como o colágeno, e mudança na estrutura tecidual acompanhada
por uma lesão e inflamação (WARD E HUNNINGHAKE, 1998).
A lesão pulmonar intersticial, provocada por agentes fibrogênicos, estimula a
proliferação de células fagocitárias e polimorfonucleares, como macrófagos,
neutrófilos, linfócitos T e linfócitos B (VALLYATHAN E CASTRANOVA,1998,
SERRANO-MOLLAR ET AL., 2002).
Segundo Mosman (2003) o macrófago alveolar, em particular, desempenha
um papel central no desenvolvimento da fibrose e, cujo número aumenta em todas
as doenças intersticiais. Ele libera fatores quimiotáticos para os neutrófilos (p.ex., IL-
8, leucotrieno B
4
). Os neutrófilos recrutados secretam proteases e ERO, que
proporcionam um mecanismo da manutenção da alveolite e lesão dos pneumócitos
membranosos do tipo I. Subseqüentemente, ocorre hiperplasia dos pneumócitos do
tipo II na tentativa de regenerar o revestimento epitelial alveolar liberando citocinas
fibrogênicas e quimiotáticas. A seguir, os fibroblastos proliferam, ocasionando uma
resposta inflamatória estereotipada da parede alveolar, denominada de fibrose
(SIME E O’REILLY, 2001).
Na atualidade, acredita-se que, qualquer que seja o tipo de doença intersticial
ou de causa específica, a manifestação comum mais precoce da maioria das
doenças intersticiais pulmonares consiste em alveolite.
18
A alveolite é um acúmulo de células efetoras inflamatórias e imunes no
interior das paredes e espaços alveolares. Em condições normais, essas células são
responsáveis por no máximo 7% da população celular total e consistem em
macrófagos (93%), linfócitos (7%) e neutrófilos e eosinófilos (<1%). (VINAY ET AL.,
2005)
A alveolite ocorre após um dano inicial provocado por algum agente
fibrogênico, deste modo o pulmão responde com uma inflamação difusa intersticial e
alveolar. É provocada principalmente por um influxo de células inflamatórias e auto-
imunes vindas dos vasos sangüíneos para o interior das paredes e espaços
alveolares. Uma variedade de fatores quimiotáxicos se envolve na expansão da
inflamação tissular e recentes estudos revelam a existência de citocinas
quimiotáxicas chamadas de quimiocininas, que parecem estar envolvidas no
desenvolvimento da inflamação intersticial crônica do pulmão (BAGGIOLINI E
DAHINDEN, 1994).
Os estímulos iniciais que levam ao desenvolvimento de alveolites e outras
lesões pulmonares são muito heterogêneos, porém são mediados, provavelmente,
por ERO (PINHO ET AL., 2004).
De acordo com Vinay (2005), as alterações morfológicas da FP variam de
acordo com o estágio da doença. Nos casos iniciais, os pulmões exibem
consistência firme e, ao exame microscópico, apresentam edema pulmonar,
exsudação intra-alveolar, membranas hialinas e infiltração dos septos alveolares
com células mononucleares. Ocorre hiperplasia dos pneumócitos do tipo II, que
aparecem como células cubóides ou, até mesmo, colunares revestindo os espaços
alveolares. Com a evolução da doença, observa-se a organização do exsudato intra-
alveolar por tecido fibroso, bem como o espessamento dos septos intersticiais,
devido à fibrose e a quantidades variáveis de inflamação. Nesse estágio os pulmões
tornam-se sólidos, com áreas alternadas de fibrose e aspecto normal. Nos estágios
finais da doença, o pulmão consiste em espaços revestidos de epitélio cubóide ou
colunar e separados por tecido fibroso inflamatório. Surge, em conseqüência, o
aspecto do pulmão em colméia. Com freqüência são observados pequenos cistos, e
ocorre também espessamento da íntima das artérias pulmonares, bem como
hiperplasia linfóide.
19
2.2 Espécies Reativas de Oxigênio
Durante a respiração celular, na cadeia transportadora de elétrons, o oxigênio
molecular é completamente reduzido à água. A molécula de oxigênio pode aceitar
um total de quatro elétrons para ser reduzida a duas moléculas de água, mas pode,
também, ser reduzida por um elétron por vez, levando à produção de Radical Livre
(RL) (MATSUO E KANEKO, 2000). Dois a cinco por cento do oxigênio utilizado
nesse processo são desviados para a formação desses radicais. Após a formação,
agentes antioxidantes atuam minimizando seus efeitos deletérios sobre a célula.
Durante esse processo podem ser formados outros elementos químicos que ao
reagirem com metais de transição formam radicais livres adicionais. O conjunto
dessas substâncias é denominado Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) (MATSUO
E KANEKO, 2000).
A produção de ROS nem sempre é prejudicial ao organismo, pelo contrário, é
necessária em vários processos biológicos: sinalização celular, contração muscular
e sistema imune (MATSUO E KANEKO, 2000). Por exemplo, quando as células são
agredidas por algum agente estressor (que também pode ser RL), elas acabam
produzindo RL para combater esses agentes. O grande problema é quando os
níveis totais gerados de RL forem maiores que a capacidade de defesa. A produção
excessiva pode induzir danos a biomoléculas entre elas ácidos nucléicos, proteínas
e lipídeos que, em grande extensão, podem levar à morte celular (HALLIWELL E
GUTTERIDGE, 1999).
A redução do oxigênio molecular leva à formação das principais ERO:
superóxido (O
2
-
), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e radical hidroxil (OH
). Essas
substâncias são capazes de reagir com qualquer tipo de molécula orgânica,
extraindo elétrons e gerando novos radicais livres em cadeias citotóxicas. O radical
hidroxil, segundo Ames et al. (1993), é o mais potente dos radicais e sua ação
resulta na formação de peróxido de lipídeos e radicais orgânicos.
Os complexos II e III da cadeia respiratória, citados acima, são locais
conhecidos para a produção de superóxido e H
2
O
2
e isso é causado pela transição
de um elétron (e
) da NADH e FADH para ubiquinona, formando a semiquinona
(QH°), e o outro e
forma o superóxido. O superóxido é rapidamente reduzido pela
superóxido dismutase (SOD) mitocondrial a H
2
O
2
. Quando um metal é catalisado
20
pela reação de Fenton (Fe) ou Haber-weis (Cu) entre a dismutação de superóxido
para H
2
O
2
, é formado o hidroxil (MATSUO E KANEKO, 2000).
A produção de Radical Livre de Oxigênio (RLO) ocorre em cascatas em três
fases: 1) Iniciação: quando duas moléculas se condensam e formam um radical; 2)
Progressão: quando o radical se liga a outra molécula qualquer (lipídeos, proteínas,
núcleos), gerando um radical e 3) Término: quando a cascata de geração de radical
acaba. Isso ocorre por “scanvegers” ou elementos antioxidantes, que, ao se ligarem
ao RL, formam novos radicais menos reativos e estes se esgotam ao reagirem com
outros antioxidantes (HALLIWELL E GUTTERIDGE,1999).
2.3 Sistema de Defesa Antioxidante
É possível que um eficiente sistema de defesa tenha condições de minimizar
o dano oxidativo pulmonar induzido pela bleomicina. De acordo com Halliwell e
Gutteridge (1999), esse sistema de defesa pode atuar de forma associada ou
independente por duas vias:
a) Ativação de enzimas antioxidantes: as principais enzimas antioxidantes
incluem a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase
(GPX) que são ativadas normalmente durante o metabolismo celular, porém suas
atividades podem aumentar em função da presença de ERO.
A SOD constitui a primeira linha de defesa enzimática contra a produção
intracelular de radicais livres, catalisando a dismutação do O
2
-
(HOLLANDER ET
AL., 2000). Está presente na matriz mitocondrial (Mn-SOD), no citosol (CuZn-SOD) e
no meio extracelular. Embora o O
2
-
não seja altamente danoso, pode extrair elétrons
de diversos componentes celulares causando reações em cadeia de radicais livres
(HALLIWELL E GUTTERIDGE ,1999). O produto resultante da reação catalisada
pela SOD é o H
2
O
2
que deve ser retirado do meio o mais rápido possível.
A enzima Catalase catalisa a degradação do H
2
O
2.
Na reação, uma das
moléculas de peróxido de hidrogênio é oxidada a oxigênio molecular e a outra é
reduzida à água (CHANCE ET AL., 1979). Está localizada, principalmente no
peroxissoma, entretanto, outras organelas como as mitocôndrias podem conter
alguma atividade CAT. A catálise do H
2
O
2
é importante, pois, na presença de Fe
2+
,
21
leva à formação de radical hidroxil (OH
) (reação de Fenton), altamente reativo e
danoso às biomoléculas .
A GPX é uma enzima selênio-dependente que catalisa a redução do H
2
O
2
e
hidroperóxidos orgânicos (ROOH) para H
2
O e álcool, usando a glutationa (GSH)
como doador de elétrons (FLOHE, 1982). Está localizada tanto no citosol quanto na
matriz mitocondrial.
b) Antioxidantes biológicos não-enzimáticos: são constituídos por
antioxidantes hidrossolúveis que incluem glutationa (GSH), ácido ascórbico, e ácido
úrico e antioxidantes lipossolúveis que incluem alfa-tocoferol, ubiquinóis e
carotenóides.
Segundo Halliwell e Gutteridge (1999), a glutationa reduzida é um dos mais
abundantes antioxidantes biológicos, atua na conversão de dissulfetos para tióis e
serve como um substrato para a GPX e glutationa S-tranferase. A GSH, em sua
forma reduzida, tem um importante papel no mecanismo de defesa do pulmão contra
ataques de radicais livres (SMITH ET AL., 1994; ZHANG ET AL., 1999) e,
dependendo do nível na célula, a GSH pode ser uma fonte importante contra
respostas inflamatórias causadas por partículas industriais (ZHANG ET AL., 1999).
Em muitas doenças pulmonares inflamatórias como fibrose pulmonar,
síndrome de stress respiratório agudo, fibrose cística, e síndrome da imuno
deficiência adquirida, a depleção dos níveis de GSH intracelular ou o aumento dos
níveis de GSSH estão presentes com concomitante indução de mediadores
inflamatórios e citocinas quimiotáticas. Isto sugere que o estado redox intracelular
(níveis de GSH/GSSG) possa ter um papel central na regulação e potencialização
nas respostas inflamatórias celular.
O nível intracelular de GSH é regulado pelo equilíbrio entre sua utilização e
síntese. Embora a GSH seja essencial para a função normal de célula, muitos
órgãos não realizam a sua ressíntese e, portanto, precisam importá-la de fontes
extracelulares (DENEKE E FANBURG, 1989).
2.4 N-acetilcisteína e Deferoxamina
Tem sido proposto, em diversos estudos (SPRONG ET AL., 1998;
PATERSON ET AL., 2003; RITTER ET AL, 2004; PINHO ET AL., 2005), que uma
22
das formas de alterar o conteúdo de GSH, na célula, é através da suplementação de
N-acetilcisteína (NAC). A NAC é uma doadora de grupo tióis que atua como
precursora da cisteína intracelular, indispensável para a síntese de GSH,
assegurando-lhe sua função normal na proteção celular. É considerado um
importante agente terapêutico, utilizada comumente na prática clínica por manter a
capacidade antioxidante pulmonar.
Vários estudos (GON ET AL., 2000; SERRANO-MOLLAR ET AL., 2002;
CORTIJO ET AL., 2001) sugerem que as propriedades antioxidantes da NAC estão
associadas à diminuição do peróxido de hidrogênio, à diminuição da inativação de
alfa-1-antitripsina mediada por HOCl e à diminuição de anormalidades em células
polimorfonucleares, macrófagos alveolares, fibroblastos e células epiteliais.
A administração oral ou intravenosa de NAC em pacientes com FP tem
melhorado a reposta oxidativa pulmonar por elevar os níveis de glutationa, como
também, melhorar os efeitos adversos da FP (CORTIJO ET AL., 2001; BEHR ET
AL., 2002; MATA ET AL., 2003). Entretanto, segundo Ritter et al. (2004), é possível
que o uso isolado de NAC possa ter limitações como agente antioxidante e
apresentar efeitos pró-oxidantes, provavelmente, pela sua fácil interação com ferro.
Segundo Childs et al., (2001) o ferro é um metal de transição que tende a seqüestrar
os sítios ativos de antioxidantes hidrossolúveis desestabilizando-os quimicamente.
Dessa forma, presume-se que o uso de um quelante de ferro como a deferoxamina
(DFX), poderia melhorar a resposta antioxidante ao uso de NAC.
Embora a DFX forme complexos predominantemente com íons trivalentes
(Fe
3+
, Al
3+
) sua afinidade com íon divalente também é significativa, dando-lhe uma
capacidade antioxidante. A DFX atua no deslocamento do ferro na forma livre,
encontrado no plasma e nas células, dando origem ao complexo ferrioxamina. O
ferro pode ser quelado a partir da ferritina e da hemossiderina, mas não da
hemoglobina, mioglobina, transferrina, citocromos e outras substâncias contendo
grupo heme.
2.5 Bleomicina
A bleomicina é um glicopepitídio citotóxico e pertence ao grupo de antibióticos
dentro dos agentes quimioterápicos (SERRANO-MOLLAR ET AL., 2002). É utilizado
23
no tratamento inicial de linfomas, tumores testiculares e carcinoma de células
escamosas. Induz a uma menor mielossupressão ou imunossupressão em relação a
outras drogas citotóxicas, entretanto por apresentar uma toxidade pulmonar dose-
dependente, seu uso clínico tem sido limitado (COOPER ET AL., 1986).
Dependendo da dose, seu uso em humanos pode produzir, ao longo do
tempo, uma série de lesões associadas com as mudanças funcionais e bioquímicas
da FP, processos inflamatórios e infiltração de células inflamatórias, aumento do
conteúdo de colágeno, e redução da capacidade e volume pulmonar (SNIDER ET
AL., 1978; BOWDEN, 1984). Embora a literatura apresente inúmeros estudos,
citados por Azambuja et al., (2005), demonstrando as complicações pulmonares em
pacientes tratados com bleomicina, ainda existem controvérsias quanto seus efeitos,
como também, os mecanismos ou agentes terapêuticos que possam amenizar os
feitos deletérios do uso dessa droga.
É possível que os danos pulmonares causados pela bleomicina estejam
diretamente relacionados à formação de ERO por um mecanismo dependente de
ferro (HAY ET AL., 1991). A bleomicina tem um efeito sobre o íon Fe
2+
que se liga ao
DNA. Essa combinação, bleomicina mais Fe
2+
, reduz o oxigênio do meio e formam
Radicais Livres (RL), o que possivelmente, estejam mediando a formação de
fibroses (SERRANO-MOLLAR ET AL., 2002). Além dessa interação, a produção de
ERO pode aumentar o dano pulmonar por inativação de antiproteases, rompimento
de membranas e danos alveolares. (DISCROLL ET AL., 1995; TSUDA ET AL.,
1997).
3 Objetivos
Diante das evidências de que a administração de bleomicina altera a resposta
oxidativa pulmonar, pressupõe-se que a suplementação de NAC combinada ou não
com DFX possa amenizar esses efeitos. A partir de tais pressupostos foram
elaborados os seguintes objetivos:
24
3.1 Geral:
Verificar os efeitos da N-acetylcysteina (NAC) e Deferoxamina (DFX) sobre os
marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo em pulmão camundongos expostos
à bleomicina.
3.2 Específicos:
Verificar se a administração de NAC associada ao DFX melhora a resposta
oxidativa pulmonar após administração de bleomicina.
Verificar as atividades de enzimas antioxidantes e os marcadores de danos
oxidativos no tecido pulmonar após administração de bleomicina.
Verificar a resposta inflamatória no tecido pulmonar e lavado bronco-alveolar
após administração de bleomicina.
4 Organização da Dissertação
A dissertação está organizada em capítulos, onde o Capítulo I, na forma de
introdução, apresenta a justificativa, revisão de literatura os objetivos do estudo. Os
resultados estão apresentados na forma de artigo, o qual foi submetido à publicação
O capítulo II apresenta resultados referentes aos efeitos da NAC e DFX sobre os
marcadores de estresse oxidativo pulmonar e sobre as respostas inflamatórias
induzidas pela bleomicina (submetido à Pulmonary Pharmacology and
Therapeutics). Uma discussão abrangendo o artigo e as conclusões gerais estão
apresentadas respectivamente nos capítulos III e IV. As referências bibliográficas
apresentadas nos itens que não àqueles referentes aos artigos estão presentes no
final dessa dissertação.
25
CAPÍTULO II
ATTENUATION OF BLEOMYCIN-INDUCED LUNG INJURY AND OXIDATIVE
STRESS BY N-ACETYLCYSTEINE PLUS DEFEROXAMINE
Submetido a Pulmonary Pharmacology and Therapeutics
26
ATTENUATION OF BLEOMYCIN-INDUCED LUNG INJURY AND OXIDATIVE
STRESS BY N-ACETYLCYSTEINE PLUS DEFEROXAMINE
Kelly C. Teixeira, MSc
a
; Fernanda Cioff, BSc
a
; Luís G. C. Rocha, BSc
a
; Paulo C. L.
Silveira, MSc
a
; Samuel S. Valença, PhD
b
; Felipe Dal Pizzol, PhD
c
; Emilio L. Streck,
PhD
c
; Ricardo A. Pinho, PhD
a
a
Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício/UNESC
b
Laboratório de Reparo Tecidual/UERJ
c
Laboratório de Fisiopatologia Experimental/UNESC
Address:
Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício/UNESC
Av. Universitária, 1105 –Bairro Universitário
88806-000 - Criciúma –SC/Brasil
e-mail: [email protected]
27
Abstract
Reactive oxygen species (ROS) play an important role in the pathogenesis of
pulmonary injury and antioxidant therapy may be useful with impaired oxidative
defense mechanism. This study examines the effect of N-acetylcysteine (NAC) and
Deferoxamine (DFX) on inflammatory indicators and oxidative stress in the lungs of
mice exposed to bleomycin (BLM). The animals received endotracheally a single
dose of BLM (2.5 U/kg body weight dissolved in 0.25 mL of 0.9% NaCl) or saline
(0.9% NaCl) and were divided into eight groups (n=8): saline; BLM; saline+NAC;
BLM+NAC; saline+DFX; BLM+DFX; saline+NAC+DFX; BLM+NAC+DFX. Treatments
with NAC (20 mg/kg) or DFX (30mg/kg) were administered for 60 days after BLM
exposure. Lactate dehydrogenase (LDH) activity and total cell count, neutrophil and
protein concentration were determined in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF).
Lipid peroxidation (TBARS), oxidative protein damage (carbonyl contents), and
catalase and superoxide dismutase activities were determined in the lung tissue.
BLM administration resulted in lung lesion as determinated lung histology, which is
almost completely prevented by NAC plus DFX. The results of total cell counts and
neutrophils and LDH increased after BLM exposure and were reduced with NAC.
DFX and NAC plus DFX also caused a significant decrease of LDH activity. The
increased malondialdehyde levels and carbonyl contents in lung tissue produced by
bleomycin were also prevented by NAC plus DFX. However, the isolated use of NAC
increased lipid peroxidation. SOD activity increased after BLM exposure only in the
group treated with DFX and catalase activity not was altered in the presence of BLM.
Data presented here indicates that the isolated use of NAC had limited effects on
bleomycin-induced pulmonary oxidative stress in mice. The use of DFX improves the
defense response and in association with NAC may be a good alternative in the
treatment or prevention of diseases that have ROS and iron involved in their
pathogenesis.
Key-words: NAC, DFX, bleomycin, lung, oxidative stress
28
1 Introduction
Bleomycin (BLM) is a chemotherapeutic drug used clinically for a variety of
human malignancies. It has been reported that administration of a high dose of
bleomycin often leads to lung injury and pulmonary fibrosis in BLM-treated patients
[1].
Several studies have indicated that reactive oxygen species (ROS) are
involved in BLM-induced lung injury [1,2,3,4]. It has been suggested that the activity
of BLM results from its reaction with DNA to cleave the backbone. The mechanism of
this cleavage apparently involves the initial formation of Fe(II)BLM and then a redox
reaction between the iron center and oxygen to produce Fe(III)-BLM and a ROS as
the hydroxyl radical [5,6]. In lung, ROS may inactivate these enzymes provoking
genetic injury and death of cells sensitive to oxygen, resulting in a typical alveolar
cells injury [7].
N-acetylcysteine (NAC) is considered an important therapeutic agent and is
commonly used in clinical practice as it presents properties capable of maintaining
the oxidant capacity of the lungs acting as an intracellular L-cysteine precursor,
increasing the production of glutathione (GSH). NAC is possibly one of the most
widely investigated compounds and it has beneficial effects in clinical conditions in
which free radicals are involved and has been reported to attenuate BLM-induced
lung injury [2,3,8,9].
Additionally, it is suggested that the potential effect of NAC reduces H
2
O
2
,
altering the pulmonary oxidant-antioxidant balance [10]. Furthermore, the use of NAC
alone may have limitations and present pro-oxidant effects, due to the facility with
which it interacts with iron [11]. Given this, the use of an iron chelator may improve
response to the use of NAC [12]. Deferoxamine (DFX) is an iron chelator used in
several therapies. It acts by binding free iron in the bloodstream and reduces the
damage done to various organs and tissues, such as the lung [13].
Although the pulmonary antioxidant effect of the NAC plus DFX has been
tested in several researches [12,14,15], no studies have reported the beneficial
effects of that association and few studies have reported the isolated use of DFX on
BLM-induced lung injury and oxidative response [13,16,17].
The evidences demonstrate that DFX is capable of blocking harmful effects of
the hydroxyl radical, of inhibiting lipid peroxidation and of protecting tissue and
29
organs against the effects of ischemia-reperfusion mediated by the derived free
radicals [12,15].
We hypothesize that the accumulation of hydrogen peroxide in the presence of
iron during the inflammatory process induced by BLM may lead to the formation of
the hydroxyl radical. Thus, the main aim of this study was to verify whether NAC
administered alone or in combination with DFX significantly reduced the inflammatory
indicators and oxidative stress in the lungs of mice exposed to BLM.
2 Methods
2.1 Animals
A total of 64 CF1 8-week old male mice weighing 30–35g were used. Nuvilab
CR1 food (Nuvital Nutrientes S/A, Curitiba, PR Brazil) and water were available ad
libitum. The room was maintained at 70% humidity, 20±2ºC and a 12-h light-dark
cycle. All procedures involving animals were approved by the institutional committee
for animal care.
2.2 Animal model of bleomycin-induced lung lesion
To produce pulmonary lesion, animals received endotracheally a single
sublethal dose of BLM (2.5 U/kg body weight dissolved in 0.25 mL of 0.9% NaCl) [2].
Control animals were subjected to the same protocol but received the same volume
of intratracheal saline instead of bleomycin. Tracheal instillation was carried out
under ketamin (80 mg/kg of body weight, i.p.) and xylazine (20mg/kg de body weight,
i.p) anesthesia. Sixty days after endotracheal bleomycin or saline, the animals were
killed by a lethal injection of sodium pentobarbital followed by exsanguination of
abdominal aorta. Bronchoalveolar lavage was performed and lungs were weighed
and processed separately for biochemical (homogenate right lung, n=8) and
histological (left lung, n=3) studies as indicated below.
30
2.3 Experimental groups
The animals were randomly divided into eight groups: control-saline (n-8) and
control+BLM (n=8); saline+NAC (n=8) and BLM+NAC (n=8); saline+DFX (n=8) and
BLM+DFX (n=8); saline+NAC+DFX (n=8) and BLM+NAC+DFX (n=8). Treatments
vehicle or NAC (20mg/kg of body weight/day, i.p.) or DFX (30mg/kg of body
weight/weeks, i.p) were administered for 60 days.
2.4 Bronchoalveolar lavage (BAL)
BAL was performed thrice through a tracheal cannula with 1 ml PBS (4 vezes
de 1 ml). Approximately 2.5 ml (90%) of BALF were recovered from each mice
examined. A 100-ul aliquot was used for the total cell count and the remainder was
immediately centrifuged at 300g for 10 min and the cell pellets were washed twice
and resuspended. The total cell count was performed using a hemocytometer, and
cell differentiation was performed on cytocentrifuge slides with Wright-Giemsa
staining of more than 500 cells. The supernatants of BALF were stored at -70
o
C to
measure LDH and total protein.
2.5 Histological assessment
For histological studies, the left lung was first perfused by its main bronchus
with a fixative solution (10% neutral-buffered formalin) at a pressure of 25 cmH
2
O,
immersed in fixative for 12 –24 h, and blocks taken. Tissue blocks were placed in
formalin, dehydrated in a graded series of ethanols, embedded in paraffin, cut into 4
mm-thick serial sections, and stained with hematoxylin-eosin. Histological
assessment was performed in a blind fashion and judged by two independent
observers to assure that the data presented is representative. We analyzed, under
both low- and high-power fields, ten samples in each lobe.
31
2.6 Lactate dehydrogenase activity (LDH)
LDH activity was determinate in BAL with the aid of a specific kit obtained from
Labtest Diagnóstica SA, Brazil. The reading was made starting from enzymatic
system with kinetic method, according to the technical orientations observed in the
instructions of the referred kit.
2.7 Thiobarbituric acid-reactive species and Protein Carbonyl content
As an index of lipid peroxidation we used the formation of thiobarbituric acid-
reactive species (TBARS) during an acid-heating reaction as previously described by
Draper and Hadley [18]. TBARS were determined by absorbance at 535nm and were
expressed as malondialdehyde equivalents (MDA nmol/mg protein). The oxidative
damage to proteins was assessed by determining carbonyl groups based on a
reaction with dinitrophenylhidrazine (DNPH) as previously described by Levine et al.
[19]. Carbonyl contents were determined from the absorbance at 370nm using a
molar absorption coefficient of 220.000M
-1
and were expressed as carbonyl derivates
(Carbonyl nmol/mg protein).
2.8 Catalase and superoxide dismutase activity
In order to determine catalase (CAT) activity, organ systems were sonicated in
a 50 mM phosphate buffer and the resulting suspension was centrifuged at 3000g for
10 min. The supernatant was used for enzyme assay. CAT activity was measured by
the rate of decrease in hydrogen peroxide absorbance at 240nm [20]. Superoxide
dismutase (SOD) activity was assayed by measuring the inhibition of adrenaline
autoxidation, as previously described [21].
32
2.9 Protein determination
The amount of proteins in the assays of catalase, SOD, TBARS, and protein
carbonyl was determined using the Lowry et al [22].
2.10 Statistical analysis
Data was expressed as mean±SEM. Statistical analysis was carried out by
analysis of variance (ANOVA) followed by appropriate post hoc tests including Tukey.
All analyses were made using the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS)
version 12.0 for Windows and probability value of less than 0.05 was considered as
statistically significant.
Reagents: Thiobarbituric acid, catalase, dinitrophenylhidrazine, adrenaline, and
hydrogen peroxide were purchased from Sigma Chemical (USA). NAC was
purchased from Zambon Laboratórios Farmacêuticos (Brazil) and DFX was
purchased from Novartis (Brazil).
3 Results
3.1 Lung histopathology
Hematoxylin-eosin stained lung sections were examined by light microscopy to
determine whether bleomycin-induced pulmonary injury was decreased by treatment
with antioxidants. Lungs of mice in the control-saline, saline-NAC, saline-DFX and
saline-NAC plus DFX groups were histologically normal (data not shown). Bleomycin
induced a marked neutrophil inflammatory infiltration, alveolar disruption and
thickening of interalveolar septa characteristic of the pre-fibrotic lesion induced by
bleomycin (figure 1A). The isolate use of NAC or DFX could decrease inflammatory
infiltration and alveolar disruption (figure 1B and 1C), but only the combinated use of
NAC and DFX could completely prevented histopathological alterations induced by
bleomycin (figure 1D).
33
3.2 Total and differential cell count, protein and LDH activity in BAL
The total and differential cell numbers in the BAL of the various groups are
shown in Table 1. BLM treatment caused a significant increase in the total cell count
and LDH activity in the BAL as compared to mice not exposed to BLM (control-
saline). The differential cell count showed that neutrophil were markedly increased in
lungs of mice exposed to BLM and this increase was significantly inhibited by the
treatment of NAC. We also observed that the treatment with NAC or DFX or NAC
plus DFX caused a significant decrease of LDH activity. Protein content did not
significantly differ among the experimental groups.
3.3 Oxidative damage parameters
We evaluated the formation of TBARS and protein carbonylation as an index
of oxidative damage. Results show that TBARS were increased after BLM exposure
and only the association of NAC plus DFX decrease those effects (figure 2). Carbonyl
results were similar to those found in TBARS; however, the use of NAC alone had a
pro-oxidant effect (figure 3).
3.4 Antioxidant enzymes activities
Pulmonary antioxidant defenses are widely distributed and include both
enzymatic and non-enzymatic systems. SOD and catalase are one of the major
enzymatic antioxidant defenses in lung tissue. These defenses are generally
up-regulated in the presence of oxidative stress. We observed significant variations in
SOD activity. Only the BLM group treated with DFX increased SOD activity (figure 4).
Catalase activity not was altered in the presence of BLM (figure 5).
34
4. Discussion
The purpose of this study was to evaluate whether NAC administered alone or
in combination with DFX significantly reduced pulmonary lesion and oxidative stress
in lungs of mice exposed to BLM.
The mechanism involved in the development of pulmonary damage after BLM
administration is not well defined. It is possible that reactive oxygen species (ROS)
play an important role in those processes. BLM-induced lung fibrosis appears to be
the consequence of a primary inflammatory lesion characterized by an accumulation
of alveolar macrophages and neutrophils in the lower respiratory tract [23]. It has
been hypothesized that activated inflammatory cells which accumulate in the lower
airways release harmful amounts of ROS that result in parenchymal injury, and
interstitial and alveolar fibrosis [24] probably involves generation of ROS by an iron-
dependent mechanism [9]. NAC is probably one of the most widely investigated
drugs in the lung defense against the attacks of free radicals and has been reported
to attenuate BLM-induced lung injury [24].
We hypothesize that the accumulation of hydrogen peroxide in the presence of
iron during the inflammatory process induced by BLM may lead to the formation of
the hydroxyl radical. Furthermore, the use of NAC alone may have limitations and
present pro-oxidant effects, due to the facility with which it interacts with iron [11].
Given this, the use of deferoxamine (DFX), an iron chelator, may improve response
to the use of NAC.
Initially, we demonstrated that BLM induced a lung injury and only the
combinated use of NAC and DFX could completely prevented histopathological
alterations induced by BLM (figure 1).
While the physiological mechanisms of lesions by BLM may not be well
established, evidence demonstrates that the pulmonary response to chemical agents
provoke a chain inflammatory response, resulting in an increase in pro-inflammatory
factors, extracellular matrix synthesis and proliferation of fibroblasts [23,25].
However, a number of authors have suggested that the use of antioxidants reduces
the inflammatory response and the effects generated by the ROS in animals [3,9,10].
As indicators of the inflammatory response and the alteration in the
permeability of the pulmonary epithelium, the total quantity of cells, neutrophils and
proteins count in the BAL of mice following administration of BLM and concomitant
35
supplementation of NAC, DFX or NAC plus DFX was verified. In table I, it can be
seen that the animals that received a combined supplement of NAC and DFX
showed a significant reduction in these indicators, except for protein count, when
compared to the BLM group.
According to MacNee and Selby [26], the first phase in the recruitment of
neutrophils in the air spaces is the uptake of these cells by the pulmonary
microcirculation. This permits the adherence of the neutrophils to the capillary
endothelium and the migration through the alveolar membrane to the intersticium and
air spaces of the lungs. While passing through the pulmonary microcirculation the
neutrophils may be activated by cytokines, alveolary macrophages and endothelial
and epithelial cells [27].
In order to evaluate cell membrane permeability and integrity, we assessed
LDH activity. As seen in Table I, the group exposed to BLM alone presented a
significant increase in LDH when compared to the control-saline. The data indicates
that exposure to BLM provokes alveolar lesion in the lungs of mice. Moreover, the
results show that LDH activity in the group supplemented with NAC, DFX and
NAC+DFX was significantly reduced.
The significant reduction of cellular permeability following supplementation
with NAC and DFX may be directly related to the antioxidant properties. This effect is
important in guaranteeing an enhanced pulmonary integrity, in the failure of which the
production of oxidants may increase the inflammatory response by the inactivation of
antiproteases, by rupturing membranes and by causing alveolar damage and fibroses
[12,28].
The mechanism of the effect of BLM is that the BLM-iron complex reduces
molecular oxygen to superoxide and hydroxyl radicals that can then attack DNA and
cause strand cleavage [29]. According to Kim et al. [28] the amount of iron in the
tissue may be the main mediator of toxicity and of oxidative damage in the lungs.
Our results showed that exposure to BLM leads to a significant increase in the
oxidative damage parameters through the carbonylation of proteins and peroxidation
of lipids (figures 2 and 3). We also demonstrated that only the administration of NAC
in combination with DFX significantly reduces these parameters. It is possible to
diminish the oxidative effects of the exposure to BLM with the use of iron chelates
such as DFX. That could directly attenuate lung injury by reducing superoxide and
hydroxyl radical concentrations in the lung. First, the NAC increases the production of
36
glutathione and reduces H
2
O
2
, and second, the presence of the DFX reduces the
formation of the radical hydroxyl. These two mechanisms alter the pulmonary
oxidant-antioxidant balance. The use of other chelates such as EDTA or DETAPAC
can produce the opposite effect, stimulating the production of the radical hydroxyl
[30].
The limitation of the use of the NAC alone can be associated with the ability to
donate electrons to the BLM-iron complex. According to Antholine et al. [6] thiols
increase the rate at which double-stranded DNA is cleaved in the presence of
Fe(II)BML. Enhancement of this reaction by cysteine may result from its ability to
reduce Fe(III)BLM to Fe(II)BLM. However, the ability of GSH to enhance the strand-
scission reaction cannot be attributed to this mechanism. Because several electrons
are needed for each bond scission, GSH may provide an electron to an intermediate
reduced oxygen species bound to BLM-iron complex. In this way, it could increase
the amount of strand scission without donating electrons directly to Fe(III)BLM. To do
this, GSH would need to bind to the Fe(III)BLM-DNA complex.
The depletion in SOD and catalase activities in the tissue reflects indirectly the
generation of free radicals. Some studies have been showing a decrease in the
activity of enzymes after the bleomycin administration [4,31,32], however, our results
did not confirm these findings. We observed significant variations in SOD activity.
Only the bleomycin group treated with DFX increased SOD activity (figure 4).
Although this result is important, we did not find a justification for the increase in SOD
activity in the DFX group. However, SOD could directly attenuate lung injury by
reducing superoxide concentrations in the extracellular space. This reduction may
decrease stimulation of fibroblasts and diminish inflammatory cell recruitment [31].
The catalase activity not was altered in the presence of both bleomycin and
antioxidants (figure 5).
Although SOD activity increased in the group treated with DFX, it is likely that
other antioxidants act as defense mechanisms in the lung, as for example, GSH and
GPX. GSH, in its reduced form, plays an important role in the pulmonary defence
mechanism against attacks from free radicals [33] diminishing the H
2
O
2
content and
altering the balance of the pulmonary oxidant-antioxidant capacity [34]. Depending
on its level in the cell, it may represent an important resource against the
inflammatory responses caused by BLM.
37
In summary, the results suggest that the use of NAC alone had limited effects
on bleomycin-induced pulmonary oxidative stress in mice. The use of DFX improves
the defense response possibly by a decrease in iron present during the inflammatory
process induced by BLM. DFX is a relatively new antioxidant drug and in association
with NAC may be a good alternative in the treatment or prevention of diseases that
have ROS and iron involved in their pathogenesis.
References
1. Mata M, Ruíz A, Cerda M, Martinez-Losa M, Cortijo J, Santangelo F et al. Oral N-
acetylcysteine reduces bleomycin-induced lung damage and mucin Muc5ac
expression in rats. Eur Respir J 2003;22:900–905.
2. Cortijo J, Cerda-Nicola M, Serrano-Mollar A, Bioque G, Estrela JM, Santangelo F,
et al. Attenuation by oral N-acetylcysteine of bleomycin-induced lung injury in rats.
Eur Respir J 2001;17:1228–1235.
3. Serrano-Mollar A, Closa D, Cortijo J, Morcillo EJ, Prats N, Gironella M et al. P-
selectin upregulation in bleomycin induced lung injury in rats: effect of N-acetyl-L-
cysteine. Thorax 2002;57:629–634.
4. Iraz M, Erdogan H, Kotuk M, Yagmurca M, Kılıc T, Ermis H, Fadillioglu E, Yildirim
Z. Ginkgo biloba inhibits bleomycin-induced lung fibrosis. Pharmacol Res
2006;53:310–316.
5. Burger RM, Peisach J, Blumberg WE, Horwitz SB. Ironbleomycin interactions with
oxygen and oxygen analogues. J Biol Chem 1979;254:10906-10912.
6. Antholine WE., Petering DH, Saryan LA, Brown CE. Interactions among Iron (II)
Bleomycin, Lewis Bases, and DNA. PNAS 1981;78;7517-7520.
7. Jackson RM. Pulmonary oxygen toxicity. Chest 1985;88:900–905.
8. Hagiwara S, Ishii Y, kitamura S. Aerosolized administration of N-acetylcysteine
attenuates lung fibrosis induced by bleomycin in mice. Am J Respir Crit Care Med
2000;162:225–231.
9. Yildirim Z, Kotuk M, Iraz M, Kuku I, Ulu R, Armutcu F, Ozen S. Attenuation of
bleomycin-induced lung fibrosis by oral sulfhydryl containing antioxidants in rats:
erdosteine and N-acetylcysteine. Pul Pharmacol Ther 2005;18: 367–373.
38
10. MacNee W, Rahman I. Is oxidative stress central the pathogenisis of chronic
obstructive pulmonary disease? Trends Mol Med 2001;7:55-62.
11. Ritter C, Andrades ME, Reinke A, Menna-Barreto S, Moreira JCF, Dal-Pizzol F.
Treatment with N-acetylcysteine plus deferoxamine protects rats against oxidative
stress and improves survival in sepsis. Crit Care Med 2004;32: 342-349.
12. Pinho RA, Silveira PC, Silva LA, Streck EL, Dal-Pizzol F, Moreira JCF. N-
acetylcysteine and deferoxamine reduce pulmonary oxidative stress and
inflammation in rats after coal dust exposure. Environ Res 2005;99:355-360.
13. Ward HE, Hicks M, Nicholson A, Berend N. Deferoxamine infusion does not
inhibit bleomycin-induced lung damage in the rat. Am Rev Respir Dis
1988;137:1356-9.
14. Dal-Pizzol F. Alternative activated macrophage: a new key for systemic
inflammatory response syndrome and sepsis treatment? Crit Care Med
2004;32:1971-1972.
15. Ritter C, Cunha AA, Echer IC, Andrades M, Reinke A, Lucchiari N et al. Effects of
N-acetylcysteine plus deferoxamine in lipopolysaccharide-induced acute lung
injury in the rat. Crit Care Med 2006;34:471-477.
16. Cross CE, Warren D, Gerriets JE, Wilson DW, Halliwell B, Last JA.
Deferoxamine injection does not affect bleomycin-induced lung fibrosis in rats. J
Lab Clin Med 1985;106:433-438.
17. Chandler DB, Butler TW, Briggs DD, Grizzle WE, Barton JC, Fulmer JD.
Modulation of the development of bleomycin-induced fibrosis by deferoxamine.
Toxicol Appl Pharmacol 1988;92:358-67.
18. Draper HH, Hadley M. Malondialdehyde determination as index of lipid
peroxidation. Meth. Enzymol 1990;186:421-431.
19. Levine RL, Garland D, Oliver CN, Amici A, Climent I, Lenz AG, et al.
Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Meth Enzymol
1990;186:464-478.
20. Aebi H. Catalase in vitro. Meth Enzymol 1984;105:121-126.
21. Bannister JV, Calabrese L. Assays for SOD. Meth Bioch Analyt 1987;32:279-
312.
22. Lowry OH, Rosebough NG, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the
folin phenol reagent. J Biol Chem 1951;193:265-275.
39
23. Crystal RG, Bitterman PB, Rennard SI, Hance AJ, Keogh BA. Interstitial lung
diseases of unknown cause: disorders characterized by chronic inflammation of
the lower respiratory tract. N Engl J Med 1984;310:154–166.
24. Serrano-Mollar A, Closa D, Prats N, Blesa S, Martinez-Losa M, Cortijo J et al. In
vivo antioxidant treatment protects against bleomycin-induced lung damage in
rats. Br J Pharmacol 2003;138:1037–1048.
25. Kappus H. Oxidative stress in chemical toxicity. Arch Toxicol 1987;60:144-149.
26. MacNee W, Selby C. Neutrophil traffic in the lungs, the role of hemodynamics,
cell adhesion and deformabilty. Thorax 1993;48:79–88.
27. Tao F, Gonzalez-Flecha B, Kobzik L. Reactive oxygen species in pulmonary
Inflammation by ambient particulates. Free Rad Biol Med 2003;35:327–340.
28. Kim KA, Kim EK, Chang HS, Kim JH, Lim Y, Park CY, et al. Effect of
deferoxamine on silica-induced pulmonary reaction. Inhal Toxicol 2000;12:117-
123.
29. Sausville EA, Stein RW, Peisach J, Horwitz SB. Properties and products of the
degradation of DNA by bleomycin and iron(II). Biochemistry 1978;17:2746–2754.
30. Halliwell B, Gutteridge JMC. Free Radical in Biology Medicine University Press,
Oxford, NY, 1999.
31. Bowler RP, Nicks M, Warnick K, Crapo JD. Role of extracellular superoxide
dismutase in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol
Physiol 2002;282:L719–L726.
32. Erdogan H, Fadillioglu E, Kotuk M, Iraz M, Tasdemir S, Oztas Y, Yildirim Z.
Effects of Ginkgo biloba on plasma oxidant injury induced by bleomycin in rats.
Toxicol Ind Health 2006;22:47-52.
33. Rahman I, MacNee W. Oxidative stress and regulation of glutathione in lung
inflammation. Eur Respir J 2000;16:534–54.
34. Repine JE, Bast B, Lankhorst I. Oxidative stress in chronic obstructive pulmonary
disease. Am J Respir Crit Care Med 1997;156:341–357.
40
Figures e Legends
Treatment groups N
Protein
Concentration
(g/ml)
LDH
(U/dl serum)
Total cells
(X10
5
)
Neutrophils
(X10
5
)
Control-saline
8
0.34±0.04 112.33±1.59 885 ± 94 77 ± 44
Control-BLM
8
0.30±0.05 151.71±5.64
*
1287 ± 103* 202 ± 73*
saline+NAC
8
0.33±0.02
79.57±2.54
#
1060 ± 244 155 ± 37
BLM+NAC
8
0.31±0.05 84.55±7.40
#
1360 ± 250 184± 74
saline+DFX
8
0.27±0.02 59.45±7.18
#
1030 ± 244 150 ± 62
BLM+DFX
8
0.32±0.03 89.19±5.77
#
1100 ± 86 141 ± 14
saline+NAC+DFX
8
0.29±0.04 51.64±4.25
#
1050 ± 138 129 ± 62
BLM+NAC+DFX
8
0.30±0.03 51.48±3.61
#
850 ± 272
#
99 ± 53
#
Table 1: Effects of N-acetylcysteine and deferoxamine on bleomycin-induced
changes in total and differential cell counts in BAL fluids from mice. Data presented
as mean±SEM of groups. BLM, Bleomycin, NAC, N acetylcysteine, DFX,
Deferoxamine; * P<0.05 versus saline,
#
P<0.05 versus control groups.
Fig. 1: Lung morphologic alterations after bleomycin (BLM) exposure. Lung tissues
were obtained 60 days after instillation of BLM (2.5 U/kg body weight, intratracheal).
Control animals received only saline solution 0,9%. Cuts were made in sheets of 4m
and stained with H-E. Extensive inflammation, alveolar disruption and thickening of
41
interalveolar septa induced by BLM (figure 1A). Partial prevention of the BLM-
induced histological changes by NAC or DFX (figure 1B and 1C) and use of NAC and
DFX completely prevented histopathological alterations induced by BLM (figure 1D).
Fig. 2: Bleomycin-induced effects of N-acetylcysteine (NAC) and Deferoxamine
(DFX) on malondialdehyde (MDA) levels. Values are presented as Mean±SEM and
results are expressed in nmol of MDA/mg of protein. The significant difference used
in relation to saline (
*
) and in relation to control (
#
) was from p<0.05.
Fig. 3: Bleomycin-induced effects of N-acetylcysteine (NAC) and Deferoxamine
(DFX) on Carbonyl contents. Values are presented as Mean±SEM and results are
expressed in nmol/mg of protein. The significant difference used in relation to saline
(
*
) and in relation to control (
#
) was from p<0.05.
42
Fig. 4: Effects of N-acetylcysteine (NAC) and Deferoxamine (DFX) on superoxide
dismutase (SOD) activity after bleomycin-induced lung lesion. Values are presented
as Mean±SEM and results are expressed in U of SOD/mg of protein. The significant
difference used in relation to saline (
*
) was from p<0.05.
Fig. 5: Effects of N-acetylcysteine (NAC) and Deferoxamine (DFX) on catalase
activity after bleomycin-induced lung lesion. Values are presented as Mean±SEM
and results are expressed in U of catalase/mg of protein. The significant
difference used was from p<0.05.
43
CAPÍTULO III
DISCUSSÃO GERAL
44
O objetivo desta dissertação foi verificar os efeitos terapêuticos da N-
acetilcisteína (NAC) associada ou não com Deferoxamina (DFX) sobre marcadores
inflamatórios e de estresse oxidativo na lesão pulmonar induzida pela bleomicina
(BLM). Foram utilizados camundongos (CF1) machos com idade inicial de 60 dias.
Para lesão pulmonar, os animais foram expostos a uma dose única
endotraquealmente de BLM. Os animais foram tratados com NAC e DFX e
sacrificados 60 dias após a exposição. Para tanto, partimos das seguintes
evidências científicas:
a) A lesão pulmonar induzida por BLM inicia-se como uma lesão inflamatória
primária caracterizada por um acúmulo de macrófagos alveolares e neutrófilos no
trato respiratório inferior, denominada alveolite (CRYSTAL ET AL., 1984).
b) A lesão pulmonar induzida por BLM é mediada pela produção de Espécies
Reativas de Oxigênio (ERO) e conseqüente estresse oxidativo (YILDIRIM ET AL.,
2005).
c) A interação ferro e BLM reduzem o oxigênio molecular formando superóxido e
radical hidroxil (SAUSVILLE ET AL., 1978). Portanto, a quantidade de ferro no tecido
pode ser o principal mediador da toxidade e dos danos oxidativos pulmonar.
d) A administração de NAC tem melhorado a resposta oxidativa pulmonar em
diversos modelos experimentais por elevar os níveis de glutationa (CORTIJO ET
AL., 2001; MATA ET AL., 2003).
e) É possível que o uso isolado de NAC possa ter limitações como agente
antioxidante ou apresentar efeitos pró-oxidantes, provavelmente, pela sua fácil
interação com ferro (RITTER ET AL., 2004).
d) O uso da DFX reduz o dano oxidativo em vários organismos e tecidos, como o
pulmão (PINHO ET AL., 2005). Embora a DFX forme complexos com íons trivalentes
(Fe
3+
, Al
3+
) sua afinidade com íon bivalente também é significativa, dando-lhe uma
capacidade antioxidante.
Os resultados encontrados em nosso estudo mostram inicialmente
significativas alterações histológicas no tecido pulmonar após a administração de
BLM. Possivelmente, este mecanismo esteja associado com a produção local de
ERO. De acordo com MacNee e Selby (1993), a exposição pulmonar a agentes
químicos como a BLM, faz com que a microcirculação pulmonar recrute neutrófilos
para o espaço aéreo, permitindo sua aderência no endotélio capilar e sua migração,
através da membrana alveolar, para o interstício pulmonar. Os neutrófilos recrutados
45
secretam proteases e ERO, que proporcionam um mecanismo da manutenção da
alveolite e lesão dos pneumócitos membranosos do tipo I. Subseqüentemente,
ocorre hiperplasia dos pneumócitos do tipo II na tentativa de regenerar o
revestimento epitelial alveolar liberando citocinas fibrogênicas e quimiotáticas. A
seguir, os fibroblastos proliferam, ocasionando uma resposta inflamatória
estereotipada da parede alveolar, denominada de Fibrose (SIME E O’REILLY, 2001).
É provável que o ânion superóxido seja a principal ERO produzido durante esse
processo por estimular os fibroblastos a secretarem colágeno. Portanto,
antioxidantes como a SOD, tem um importante papel no sistema de defesa pulmonar
contra a lesão causada pela BLM (BOWLER ET AL., 2001).
Alterações nos indicadores de resposta inflamatória (células totais e presença
de neutrófilos) e na permeabilidade do epitélio pulmonar (LDH) foram observadas.
Os animais que receberam a suplementação de NAC+DFX apresentaram redução
destes indicadores após a administração de BLM.
Esta significante redução da permeabilidade celular pode ser diretamente
relacionada com as propriedades antioxidantes (KIM ET AL., 2000; PINHO ET AL.,
2005). Esse efeito protetor é importante para garantir a integridade celular. Caso
contrário, a produção excessiva de agentes oxidantes pode levar a inativação de
antiproteases e causar danos alveolares significativos e conseqüente fibrose (KIM
ET AL., 2000; PINHO ET AL., 2005).
Nossos resultados ainda mostram um aumento significativo dos marcadores
de dano oxidativo após a administração de BLM (carbonilação de proteínas e
lipoperoxidação) e que esses marcadores foram significativamente reduzidos com o
uso associado de NAC e DFX. Acreditamos que a NAC mais DFX possam diminuir
a resposta oxidativa por reduzir a concentração de superóxido e radical hidroxil no
pulmão. Primeiramente, porque a NAC aumenta a produção de glutationa e reduz o
H
2
O
2
, em segundo, porque a presença de DFX reduz a formação de radical hidroxil.
Entretanto, a limitação do uso isolado da NAC, pode estar associado com sua
facilidade em doar elétrons para o complexo BLM-ferro (ANTHOLINE ET AL., 1981).
A depleção da atividade da SOD e catalase no tecido reflete diretamente a
produção de radicais livres no pulmão. Nossos resultados mostraram significante
variação na atividade da SOD. Somente o grupo tratado com DFX teve a atividade
da SOD aumentada. Embora isso seja importante, nós não encontramos justificativa
na literatura. Porém, a SOD atua diretamente sobre a concentração de superóxido e
46
isso pode diminuir a proliferação de fibroblastos e do recrutamento de células
inflamatórias (BOWLER ET AL., 2001). Embora a atividade da SOD e da catalase
não tenha apresentado resultados significativos é possível que outros agentes
antioxidantes possam estar atuando no mecanismo de defesa contra ataques de
radicais livres, como por exemplo, a glutationa e glutationa peroxidase (Rahman and
MacNee, 2000) o que poderia estar sendo estimulado pela presença de NAC.
Em resumo, sugerimos que o uso isolado de NAC apresenta limitações na
defesa contra os ataques de radicais livres e que o uso de DFX melhora os
mecanismos de defesa por diminuir os níveis de ferro presentes durante o processo
inflamatório induzido por BLM. Portanto, a associação NAC e DFX pode ser uma boa
alternativa no tratamento e prevenção de doenças que tem o ferro e ERO envolvidas
em sua patogênese.
47
CAPÍTULO IV
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
48
CONCLUSÕES
Atentos aos objetivos iniciais deste estudo, chegamos às seguintes conclusões:
1) A administração de Bleomicina provoca significativas alterações histológicas
no tecido pulmonar.
2) A administração de Bleomicina provoca alterações significativas nos
marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo no tecido pulmonar.
3) A suplementação isolada de NAC apresenta limitações na defesa pulmonar
contra os ataques de Radicais Livres.
4) A associação NAC mais DFX é eficiente na defesa oxidativa pulmonar, nos
indicadores de resposta inflamatória e na permeabilidade do epitélio
pulmonar.
PERSPECTIVAS
Embora os resultados sugerem um efeito positivo na associação da NAC mais DFX
no tratamento da lesão pulmonar induzida por bleomicina, pretende-se:
1) Verificar a resposta dos marcadores oxidativos e inflamatórios na fibrose
pulmonar induzida por bleomicina.
2) Estudar o efeito da NAC e DFX sobre outros marcadores inflamatórios como,
TNF-, IL-1, IL-8.
3) Analisar outras variáveis relacionadas a estresse oxidativo, como a atividade
da GPX e de seu substrato, GSH.
49
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALESSIO, H.M.; HAGERMAN A.E.; FULKERSON B.K.; et al. Generation of reactive
oxygen species after exhaustive aerobic and isometric exercise. Med Sci Sports
Exerc., v. 32, p.1576-81, 1999.
AMES, B.N.; SHIGENAGA, M.K.; HAGEN, T.M. Oxidants, antioxidants, and the
degenerative diseases of aging. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 90, p. 7915-7922,
1993.
AZAMBUJA, E.; FLECKA, J.F.; BATISTAB, R.G.; MENNA BARRETO, S.S.
Bleomycin lung toxicity: who are the patients with increased risk? Pulmon
Pharmacol Therap. 18: 363–366, 2005.
BAGGIOLINI, M.; DAHINDEN, C.A. C.C. Chemokines in allergic inflammation. Im-
munology Today, 15: 127-133, 1994.
BEHR, J., DEGENKOLB, B.; KROMBACH, F.; VOGELMEIER, C. Intracellular
glutathione and bronchoalveolar cells in fibrosing alveolitis: effects of N-
acetylcysteine. Eur Respir J 2002;19: 906–911.
BORZONE, G.; MORENO. R.; URREA, R.; MENESES, M.; OYARZÚN, M.; LISBOA,
C. Bleomycin-Induced Chronic Lung Damage Does Not Resemble Human Idiopathic
Pulmonary Fibrosis. Am J Respir Crit Care Med Vol 163. pp 1648–1653, 2001.
BOWDEN, D.H. Unraveling pulmonary fibrosis: the bleomycin model. Lab Invest;
50:487–488. 1984.
CARMELI, E.; LAVIAM, G.; REZNICK, A.Z. The role of antioxidant nutrition in
exercise and aging. In: Radák Z, editor. Free radicals in exercise and aging.
Champaign: Human Kinetics, p. 73-115, 2000.
CHANCE B., SIES CH, BOVERIS A. Hydroperoxide metabolism in mammalian
organs. Physiol. Rev. 1979; 59:527-605.
CHILDS, A. C. JACOBS, T. KAMINSKI, B HALLIWELL, AND C. LEEUWENBURGH.
Supplementation with vitamin C and
N-acetylcysteine increases oxidative stress in
humans after an acute muscle injury induced by eccentric exercise. Free Radic Biol
Med. 31: 745-753, 2001.
COOPER, J.A.; WHITE, D.; MATTHAY, R. Drug-induced pulmonary disease. Am
Rev Respir Dis 1986;133:321–340.
CORTIJO, J.; CERDÁ-NICOLÁS, M.; SERRANO-MOLLAR, A.; BIOQUE, G.;
ESTRELAZ, J.M.; SANTANGELO, F.; ESTERAS, A.; LLOMBART-BOSCH, A.;
MORCILLO, E.J. Attenuation by oral N-acetylcysteine of bleomycin-induced lung
injury in rats. Eur Respir J; 17: 1228–1235, 2001.
50
DENEKE S.M., FANBURG B.L. 1989. Regulation of cellular glutathione. Am. J.
Physiol. 257, L163-L173.
DISCROLL KE, HASSENBEIN DG, CARTER JM, KUNKEL SL, QUINLAN TR,
MOSSMAN, BT. TNF alpha and increased chemokine expression in rat lung after
particle exposure. Toxicol. Lett. 1995; 82-83: 483-489.
GON, Y.; HASHIMOTO, S.; NAKAYAMA, T.; MATSUMOTO, K.; KOURA, T.;
TAKESHITA, I.; HORIE, T. N- acetyl-cysteine inhibits bleomycin- induced interleukin-
8 secretion by bronchial epithelial cells. Respirology 2000; 5: 309-313
HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.M.C. Free Radical in Biology Medicine
University Press, Oxford, NY., 1999.
HAY, J.; SHAHZEIDI, S.; LAURENT, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung
damage. Arch Toxicol; 65: 81 –94, 1991.
HOLLANDER J, BEJMA J, OOKAWARA T, OHNO H, JI LL. Superoxide dismutase
gene expression in skeletal muscle: fiber-specific effect of age. Mech. Ageing Dev.
2000; 116: 33-45.
KÖNIG, D.; BERG, A. Exercise and oxidative stress: is there a need for additional
antioxidants. Österreichisches J. Für Sportmedizini., v. 3, 2002.
LEWLWE JM, POWERS SK, VAN DIJIK H, VISSER T, KORDUS MJ, JI LL.
Metabolic and antioxidant enzyme activities in the diaphragm: effect of acute
exercise. Respir Physiol 1994; 96: 139-149.
LIU J, YEO HC, ÖVERVIK-DOUKI E, HAGEN T, DONIGER SJ, CHU DW, BROOKS
GA, Ames BN. Chronically and acutely exercised rats: biomarkers of oxidative stress
and endogenous antioxidants. J. Appl. Physiol. 2000; 89: 21-28.
MATA, M.; RUÝZ, A.; CERDÁ.; MARTINEZ-LOSA, M.; CORTIJO, J.;
SANTANGELO, F.; SERRANO-MOLLARZ, A.; LLOMBART-BOSCH, A.; MORCILLO,
E.J. Oral N-acetylcysteine reduces bleomycin-induced lung damage and mucin
Muc5ac expression in rats. Eur Respir J; 22: 900–905, 2003.
MATSUO, M.; KANEKO, T. The chemistry os reactive oxygen species and related
free radicals. In: Radák Z, editor. Free radicals in exercise and aging. Champaign:
Human Kinetics, p. 73-115, 2000.
PATERSON R.L., GALLEY H.F., WEBSTER NR. 2003. The effect of N-
acetylcysteine on nuclear factor-B activation, interleukin-6, interleukin-8, and
intercellular adhesion molecule-1 expression in patients with sepsis. Crit. Care Med.
31, 2574-2578.;
PINHO R.A., BONATTO F., ANDRADES M., FROTA M.L. JR, RITTER C., KLAMT
F.F., DAL-PIZZOL F., ULDRICH-KULCZYNSKI J.M., MOREIRA J.C. 2004. Lung
oxidative response after acute coal dust exposure. Environ. Res. 96, 290-297.
51
PINHO, R.A.; SILVEIRA, P.C.L.; SILVA, L.A.; STRECK, E.L.; DAL-PIZZOL, F.;
MOREIRA, J.C.F. N-acetylcysteína and desferoxamine reduce pulmonary oxidative
stress and inflammation in rats after coal dust exposure. Environ Res; 2005 (in
press).
POLIDORI, M. C.; MECOCCI, P.; CHERUBINI, A.; SENIN, U. Physical activity and
oxidative stress during aging. Inter. J. Sports Med., v. 21, p. 154 –157, 2000.
POWER, S. K.; Ji, L. L.; LEEUWENBURG, C. Exercise training-induced alterations in
skeletal muscle antioxidant capacity: a brief review. Med. Sci. Sports Exerc., v. 31,
p. 987 –997, 1999.
RADÁK, Z.; KANEKO, T.; TAHARA, S.; NAKAMOTO, H.; OHNO, H.; SASVÁRI, M.;
NYAKAS, C; GOTO, S. The effect of exercise training on oxidative damage of lipids,
proteins, and dna in rat skeletal muscle: evidence for beneficial outcome. Free Rad.
Biol. Med., v. 27(1/2), p. 69 –74, 1999.
RITTER C, ANDRADES ME, REINKE A, MENNA-BARRETO S, MOREIRA JCF,
DAL-PIZZOL F. Treatment with N-acetylcysteine plus deferoxamine protects rats
against oxidative stress and improves survival in sepsis. Crit. Care Med. 2004; 32:
342-349.
SERRANO-MOLLAR, A.; CLOSA, D.; CORTIJO, J.; MORCILLO, E.J.; PRATS, N.;
GIRONELLA, M.;PANÉS, J.; ROSELLÓ-CATAFAU, J.; BULBENAB, O. P-selectin
upregulation in bleomycin induced lung injury in rats: effect of N-acetylcysteine.
Thorax; 57: 629–634. 2002.
SIME, P.J.; O’REILLY, K.M.A. Fibrosis of the Lung and Other Tissues: New
Concepts in Pathogenesis and Treatment. Clin Immun Vol. 99, pp. 308–319, 2001.
SMITH CM, KELSEY KT, WIENCKE JK, LEYDEN K, LEVIN S, CRISTIANI DC.
Inherited glutathione-s-transferase deficiency is a risk factor for pulmonary
asbestosis. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1994;. 3: 471-477.
SNIDER, G.L.; CELLI, B.R.; GOLDSTEIN, R.H.; O’BRIEN, J.J.; LUEY, E.C. Chronic
interstitial pulmonary fibrosis produced in hamsters by endotracheal bleomycin. Am
Rev Respir Dis 1978;117:289–297.
SPRONG RC, WINKELHUYZEN-JANSSEN AML, AARSMAN CJM, VAN
OIRSCHOT JFLM, BRUGGEN T, VAN ASBECK BS. Low-dose N-acetylcysteine
protects rats against endotoxin-mediated oxidative stress, but high-dose increases
mortality. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998; 157: 1283–1293.
TERBLANCHE SE. The effects of exhaustive exercise on the activity levels of
catalase in various tissues of male and female rats. Cell Biol. Int. 2000; 23: 749-753.
TSUDA T, MORIMOTO Y, YAMOTO H, NAKAMURA H, HORI H, NAGATA N, KIDO
M, HIGASHI T, TANAKA I. Effects of mineral fibers and the expression of genes
whose product may play a role in fiber pathogenesis. Environ. Health Perspect.
1997; 105(suppl): 1173-1178.
52
VALLYATHAN, V.;Shi, X.; CASTRANOVA, V. (1998). Reactive oxygen Species: their
relation to pneumoconiosis and carcinogenesis. Environ. Health Perspect.
106(suppl. 5), 1151–1155.
VINAY K., ABUL K. A., NELSON F. Robbins e Cotran: Patologia:Bases Patológicas
das Doenças. Elsevier,2005; 712-722.
ZHANG Z, SHEN H-M, ZHANG Q-F, ONG C-N. Critical role of GSH in silica-induced
oxidative stress, cytotoxicity, and genotoxicity in macrophages. Am. J. Physiol.
1999; 277: L743-L748.
WARD, P. A.; HUNNINGHAKE, G. W. Lung inflammation and fibrosis. Am. J.
Respir. Crit. Care Med. 157, S123–S129, 1998.
YILDIRIMA, Z.; KOTUKA, M.; IRAZB, M.; KUKUC, I.; ULUC, R.; ARMUTCUD, F.;
OZENE, S. Attenuation of bleomycin-induced lung fibrosis by oral sulfhydryl
containing antioxidants in rats: erdosteine and N-acetylcysteine. Pulmon Pharmacol
Therap. 18: 367–373, 2005.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
