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Marcio Yuiti Tomiyoshi
A influência do convívio com
parceiro doente sobre parâmetros
fisiopatológicos de células
dendríticas
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A influência do convívio com parceiro doente
sobre parâmetros fisiopatológicos de células
dendríticas
MARCIO YUITI TOMIYOSHI
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Imunologia do Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de
São Paulo, para obtenção do Título
de Mestre em Imunologia.
São Paulo
2007
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A influência do convívio com parceiro doente
sobre parâmetros fisiopatológicos de células
dendríticas
MARCIO YUITI TOMIYOSHI
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Imunologia do Instituto
de Ciências Biomédicas da Universidade de
São Paulo, para obtenção do Título de
Mestre em Imunologia.
Área de Concentração: Imunologia
Orientador: Prof. Dr. José Alexandre M. Barbuto
São Paulo
2007
Aos meus pais e à minha irmã
AGRADECIMENTOS
Aviso a todos os incautos que irei me dedicar com afinco na escrita deste item por
acreditar que qualquer trabalho se faz e é melhor aproveitado se feito em conjunto.
Ao Professor Doutor José Alexandre Marzagão Barbuto (Alex, the Boss) cujos
agradecimentos não cabem e nem ouso colocar em palavras. Mesmo assim,
agradeço pela enorme contribuição na minha formação acadêmico-pessoal,
guiando-me e deixado-me autoguiar quando necessário.
Ao Professor Doutor João Palermo-Neto por, apesar de inúmeros tropeços meus,
estar sempre de braços abertos para me apoiar e me dar subsídios para continuar
nesta empreitada.
À Doutora Cristina de Oliveira Massoco (Cris!!) embora nem sempre perto, sempre
presente, agradeço por, entre outros, ter me apresentado ao modelo experimental e
ter me apoiado sempre.
Aos inúmeros camundongos C57BL/6 que deram suas vidas em contribuição à
pesquisa.
Aos estimados colegas do laboratório de Imunologia de Tumores que, desde a
iniciação científica me ajudaram a tentar compreender o que significa fazer pesquisa:
- a, assim apelidada, “velha guarda”: Alexandra, Luis Ensina, Angela,
Giovana e Camila com quem pouco convivi, mas me ajudaram nos passos
iniciais;
- ao Renato (Renatson Bói) ou Márcio, nunca sei o nome, pelo
companheirismo ao longo deste caminho que tive o prazer de trilhar;
- aos de toda e para qualquer hora: Clara (Crarabóia), Bruno (Brunóideo),
Andréia (Amigandréia), Roberto, João Paulo (Ruanitos, el Pablitos),
Patricia (Patty), Célia, Marisa, Gabriela (Gabidson Girl), Ana Paula
(Donana etc...), Graziela (Grá), Leonardo (Leo); por todos os momentos de
discussões fundamentadas e as nem tanto;
- a nova, quase velha, geração, sendo que uns vão mas todos ficam:
Adriana (Catita Infante); Simone (Simonelo´s), Vivian (Vizinha);
- aos novíssimos integrantes que ainda não possuem apelidos: Valéria,
Cristiano, Lourran e Lilian que farão parte da incrível história deste
laboratório.
Aos que tive o prazer em ajudar e, principalmente ser ajudado do grupo de
Neuroimunomodulação da Faculdade de Veterinária e Zootecnia: Mônica, Glaucie,
Alison, Viviane, Milena, Karin, Andreia, Maria Silvia Morgulis, Luciana V., Daniela e
aos técnicos de laboratório Priscila, Magali e Ricardo (Jibóia). Especialmente ao
Daniel Stankevicius que me ensinou a trabalhar no Ethovision.
Aos amigos deste departamento por todos os momentos de descontração, por me
apoiarem, por me confundirem e desconfundirem e, mais importante, por me
aguentarem todo esse período:
- àquelas do laboratório carinhosamente denominado de “anexo”, que, aliás
não sabemos até hoje quem é anexo de quem: Juliana (Judith), Cintia,
Fernanda (Zezones), Claudinha e Mônica;
- aos “maláricos” e “chagásicos”: Rogério (Urtigones), Ana Paula
(Professorinha), Sandra (Sandroca´s), Sheila, Ricardo, Sergio (Colega);
- as “Veretes”: Adriana (Eudrieininha) e Maíra;
- aos que estão acima da gente, literalmente: Mariane (Marymana) e Rafael
(Rafinha);
- e também àqueles que não foram sistematicamente classificados: Edimara
(Edicildes), Camila, Cristiane (Zunha), Andreia, Ivo (Dr. Ivus), Silvana e
Marilu.
A todos os doutores que se fizeram presentes na minha banca de qualificação: Ises
de Almeida Abrahamsohn, Diana Helena de Benedetto Pozzi, Luciana de Deus
Vieira de Moraes, Frederico Azevedo da Costa Pinto e Niels Olsen Saraiva Câmara,
uns por me ajudarem na composição de um trabalho melhor arquitetado, outros por
me abrirem os olhos.
Às doutoras Sônia Jancar Negro, Lourdes Isaac, Vera Lucia G. Calich e Karina R.
Bortolucci, que em muito me ajudaram em momentos que eu realmente precisava.
A todos aqueles que me emprestaram reagentes nos momentos de maior dificuldade
experimental, meus sinceros agradecimentos em mostrar que, antes de mais nada,
somos um departamento.
Às secretárias do departamento de Imunologia: Valéria, Jotelma, Maria Eni, Amanda
e, agora, ao Amarildo, por me aturarem e estarem sempre prontos para ajudar.
Aos membros dos biotérios do ICB e do VPT: Silvia, Sueli, Joelma, Fernando,
Andreia; Claudia, Idalina, Herculano por não só cuidarem dos preciosos
camundongos e realmente se importarem com isso.
A todos os funcionários desta Universidade, ou não, que foram deveras prestativos
quando precisei: Milton (Miltovski), Otacílio (Otacilius Fernandus), Roberto, Moisés
(Maomé), Márcio e Débora e a todos os FAISCA.
A todo o pessoal da biblioteca do ICB – USP, por me ajudarem na confecção deste
trabalho que lês.
Aos meus amigos de sempre: Caio, Daniel e Galego, embora amizades verdadeiras
não precisam de agradecimentos.
À minha Célia simplesmente por me permitir compartilhar de sua vida.
Aos meus assessores e revisores, tanto os formais quanto aos informais, por
estarem dispostos a corrigir arduamente minhas falhas de escrita e lógica.
A FAPESP e ao CNPq pelo fomento à pesquisa, mais especificamente à minha
pesquisa e à dos laboratórios de que fiz parte.
“Science provides us with some of the most elegant stimulating
puzzles that life has to offer. It throws some of the most
provocative ideas into our arenas of moral debate. And
occasionally, it improves our lives. I love science, and it pains
me to think that so many are terrified of the subject or
compassion, or the arts, or being awed by nature. Science is
not meant to cure us of mystery, but to reinvent and reinvigorate
it.”
Robert M. Sapolsky
RESUMO
Tomiyoshi MY. A influência do convívio com parceiro doente sobre parâmetros
fisiopatológicos de células dendríticas. [Dissertação]. São Paulo: Instituto de Ciências
Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2007.
As intercomunicações existentes entre o sistema nervoso e o sistema imune
parecem ser de grande importância para a manutenção e restabelecimento da
homeostasia. Em humanos, a convivência com portadores de doenças, uma
condição denominada “caregiving”, tem sido relatada como um agente estressor
capaz de causar alterações inclusive imunológicas. A transposição desta condição
para modelos experimentais é complexa e nunca se pode pretender atingir uma
equivalência real entre espécies. Todavia, num modelo descrito recentemente
demonstrou-se que camundongos Swiss que conviveram com outros, portadores do
tumor ascítico de Ehrlich, apresentam alterações em parâmetros comportamentais e
imunes indicando que é possível estudar em roedores, alterações fisiológicas
decorrentes do convívio com parceiro doente. Diante disto, avaliamos, no presente
trabalho, se algumas destas alterações também poderiam ser observadas em
decorrência do convívio de fêmeas da linhagem C57Bl/6 sadias com parceira
singenêica portadora do melanoma B16F10. Analisamos, nos animais sadios, alguns
parâmetros comportamentais e imunes. Dentre os últimos estudamos o fenótipo das
células apresentadoras de antígenos presentes no baço, nos linfonodos e daquelas
diferenciadas, in vitro, a partir de precursores de medula óssea, a indução de
hipersensibilidade tardia (DTH) e a resposta linfocitária in vitro ao antígeno indutor
da DTH. Esta convivência, por 20 dias, foi capaz de: 1) alterar significativamente o
comportamento das parceiras sadias aumentando a movimentação geral no campo
aberto e diminuindo o tempo em exploração e o número de entradas nos braços
abertos do labirinto em cruz; 2) aumentar a expressão da molécula co-estimuladora
CD80 nas populações MHCII
+
CD11c
+
presentes no baço; 3) diminuir o percentual de
células derivadas de precursores de medula óssea, MHCII
+
CD80
+
após cultura por
sete dias em meio de diferenciação (GM-CSF e IL-4) e ativação com LPS; 4)
interferir negativamente na resposta cutânea à ovalbumina, um fenômeno
aparentemente associado à proliferação de uma subpopulação linfocitária produtora
de IL-10. No entanto, o convívio com portador do melanoma B16F10 não alterou: 1)
o fenótipo dos precursores de medula óssea; 2) o fenótipo de células dos linfonodos;
3) o estabelecimento do melanoma e; 4) a concentração sérica média de
corticosterona no 20º de convivência. Podemos concluir, portanto, que o convívio
com parceiro portador do melanoma B16F10 foi capaz de alterar o comportamento
dos animais e de afetar tanto a diferenciação de células dendríticas in vitro, quanto a
expressão de moléculas de superfície nas subpopulações apresentadoras de
antígenos presentes no baço dos animais. Estes fatores, em conjunto, podem
contribuir para a modificação do padrão de resposta imune nos animais e, portanto,
este modelo pode servir para a análise das alterações imunológicas observadas em
indivíduos envolvidos em “caregiving”.
Palavras-chave: Estresse, “caregiving”, células dendríticas, neuroimunomodulação,
comportamento animal, psiconeuroimunologia.
ABSTRACT
Tomiyoshi MY. The influence of cohabitation with a sick cage mate on physiopathological
parameters of dendritic cells. [Master thesis]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas,
Universidade de São Paulo; 2007.
The existing communications between the nervous and the immune systems
seem to play an important role for both the maintenance and the reestablishment of
homeostasis. In humans, living with a sick person, a condition designated as
caregiving has been reported as a psychological stressor capable of affecting many
aspects of physiology, including the immune response. The transposition of such
conditions to animal models is complex and one can never assume to achieve real
equivalence between species. However, in a recently described model, healthy Swiss
mice, which cohabited with ascitic Ehrlich tumor-bearers, presented both behavioral
and immunological alterations, indicating that it is possible to study, in rodents,
physiological alterations due to the cohabitation with a sick partner. Therefore, we
evaluated, herein, behavioral and immunological alterations in healthy C57Bl/6
female mice caused by cohabiting with syngeneic mice bearing the B16F10
melanoma. Among the immune parameters we analyzed the antigen-presenting cells
phenotype (in the spleen, lymph nodes and after in vitro differentiation of bone
marrow precursors), the induction of a delayed-type hypersensitivity (DTH) and the in
vitro lymphocyte response to the antigen used to induce the DTH. This cohabitation,
for 20 days with a melanoma-bearer: 1) significantly altered the behavior of the
healthy partners, increasing the general locomotion at the Open Field and decreasing
the exploration time and number of entries at the plus-maze open-arms; 2) enhanced
the expression of the CD80 co-stimulatory molecule on MHC
+
CD11c
+
cells harvested
from the spleen; 3) interfered in the dendritic cell differentiation in vitro, since the
percentage of MHC
+
CD80
+
cells was smaller after differentiation in the presence of
GM-CSF e IL-4 and activation with LPS; 4) negatively interfered in the establishment
of a DTH to ovalbumin, a phenomenon that was associated with the proliferation of
an IL-10-producing lymphocyte subpopulation. However, cohabitation with a
melanoma-bearer did not significantly alter: 1) the phenotype of bone marrow
precursors; 2) the phenotype of lymph node adherent cells; 3) the B16F10 melanoma
development; 4) the mean corticosterone serum level, at the 20
th
day of cohabitaion.
In summary, the cohabitation with a B16F10-bearer was able to modify behavioral
aspects and to affect both DC differentiation and co-stimulatory molecules expression
on the splenic antigen presenting cells. These factors, together, could contribute to a
change in the immune response pattern in the animals and, therefore, this model
could be proposed as a means to analyze the immune alterations observed in
caregivers.
Keyword: Stress, caregiving, dendritic cells, neuroimmunomodulation, animal
behavior, psychoneuroimmunology.
LISTA DE ABREVIATURAS
5HIAA – Ácido 5-hidroindol 3 acético
ACTH – Hormônio Adrenocorticotrófico
AD – Animal Doente
AIDS – Síndrome da imunodeficiência adquirida
APC – Célula apresentadora de antígeno
CAS – Companheiro de Animal Saudável
CD – “Cluster of Differentiation”
CEEA – Comissão de ética em experimentação animal
CFA – “Complete Freund Adjuvant”
CFSE – Carboxyfluorescein succinimidyl ester
COBEA – Colégio Brasileiro de experimentação animal
CPT – Companheiro de Portador de Tumor
CRH – Hormônio liberador de corticotropina
CTLA – “Cytotoxic T-lymphocyte antigen”
DC – Célula Dendrítica
DHEA – Diidroepiandrosterona
DOPAC – Ácido 4,4-diidroxifenilacético
DTH – “Delayed-Type Hypersensitivity”
EAE – Encefalomielite Autoimune Experimental
ED – Dia Experimental
ELISA – “Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay”
EUA – Estados Unidos da América
FSC – “Forward Scatter”
GCs – Glicocorticóides
GH – Hormônio do Crescimento
GM-CSF – “Granulocyte Macrophage - Colony Stimulating Factor”
HBSS – “Hanks Balanced Salt Solution”
HEL – “Hen Egg Lysozyme”
HIV – Vírus da Imunodeficiência humana
HPA – Hipotálamo Pituitária Adrenal
HPLC – “High Performance Liquid Cromatography”
HVA – Ácido homovalínico
IFN – “Interferon”
IL – Interleucina
IP – índice de proliferação
LPS – Lipolissacarídeo
MAPK – “Mitogen Activated Protein Kinase”
MFI – “Mean Fluorescent Intensity”
MHC – Complexo principal de histocompatibilidade
MO – Medula Óssea
NE – Norepinefrina
NF-B – “Nuclear Factor – Kappa B”
NK – “Natural Killer”
NIM – Neuroimunomodulação
NO – Óxido Nítrico
NOD – “Non-Obese Diabetes”
OVA – Albumina de ovo
PBS – Solução Tamponada de Fosfato
PNI – Psiconeuroimunologia
POMC – Proopiomielocortina
PRL – Prolactina
REM – “Rapid-eye movement”
S.C. – subcutâneo
SD – Desvio padrão
SEM – Erro padrão da média
SI – Sistema Imune
SN – Sistema Nervoso
SNA – Sistema Nervoso Autônomo
SNC – Sistema Nervoso Central
SSC – “Side Scatter”
TAE – Tumor Ascítico de Ehrlich
Th – Linfócito T “helper”
TLR – “Toll-Like Receptor”
TNF – “Tumor Necrosis Factor”
Sumário
18
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 20
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 39
3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 40
3.1 ANIMAIS ................................................................................................................ 40
3.2 TUMOR .................................................................................................................. 40
3.3 ESTABELECIMENTO DO CONVÍVIO COM PARCEIRO DOENTE ......................................... 41
3.4 ANÁLISE DO COMPORTAMENTO DOS ANIMAIS ............................................................ 41
3.4.1 Campo Aberto .................................................................................................. 42
3.4.2 Labirinto em Cruz Elevado ............................................................................... 43
3.5 AVALIAÇÃO DO NÍVEL DE CORTICOSTERONA NO SORO .............................................. 44
3.6 COLETA DAS CÉLULAS ADERENTES DOS CAMUNDONGOS .......................................... 45
3.6.1 Isolamento da subpopulação CD11c
+
.............................................................. 46
3.7 DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS A PARTIR DE CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA 46
3.8 ANÁLISE FENOTÍPICA EM CITÔMETRO DE FLUXO ....................................................... 47
3.9 ESTABELECIMENTO DE HIPERSENSIBILIDADE DO TIPO TARDIO ................................... 48
3.9.1 Ensaio de proliferação linfocitária ................................................................ 48
3.9.2 Quantificação de IL-10 ..................................................................................... 49
3.10 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO TUMORAL ................................................................. 49
3.11
ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................... 50
3.12
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ............................................................................ 50
3.12.1 Caracterização dos efeitos do convívio com parceiro doente através de
metodologias comportamentais e bioquimicas .......................................................... 50
3.12.2 Análise da influência do convívio com portador de tumor nas células
provindas de órgãos linfóides .................................................................................... 50
3.12.3 Caracterização dos efeitos do convívio com parceiro portador de tumor sobre
as células dendríticas derivadas de medula óssea ................................................... 51
3.12.4 Análise da influência do convívio com parceiro portador de tumor sobre o
estabelecimento de Hipersensibilidade do Tipo Tardio à Ovalbumina ...................... 51
3.12.5 Caracterização dos efeitos do convívio com parceiro portador de tumor sobre
o estabelecimento do tumor B16F10 ......................................................................... 51
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 53
Sumário
19
4.1 CARACTERIZAÇÕES COMPORTAMENTAIS DOS EFEITOS DO CONVÍVIO COM UM PARCEIRO
DOENTE
...................................................................................................................... 53
4.1.1 Campo Aberto .................................................................................................. 53
4.1.2 Labirinto em Cruz-Elevado ............................................................................... 56
4.2 ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE CORTICOSTERONA NO SORO DOS ANIMAIS ................. 58
4.3 ANÁLISE FENOTÍPICA DE CÉLULAS DOS BAÇOS .......................................................... 58
4.3.1 População aderente total .................................................................................. 58
4.3.2 População CD11c
+
........................................................................................... 62
4.4 ANÁLISE FENOTÍPICA DAS CÉLULAS ADERENTES ISOLADAS DE LINFONODOS ............... 63
4.5 ANÁLISE FENOTÍPICA DE CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA DIFERENCIADAS IN VITRO ........... 66
4.6 ESTABELECIMENTO DE REAÇÃO DE HIPERSENSIBILIDADE DO TIPO TARDIO ................. 68
4.6.1 Condições subótimas de sensibilização ........................................................... 68
4.6.1.1 Ensaio de Proliferação .................................................................................. 69
4.6.1.2 Quantificação de IL-10 .................................................................................. 71
4.6.2 Sensibilização em condições aprimoradas ....................................................... 71
4.7 AVALIAÇÃO DO ESTABELECIMENTO DO MELANOMA B16F10 ....................................... 72
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 74
6 CONCLUSÔES ...................................................................................................... 88
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 89
Introdução
20
1 INTRODUÇÃO
“If you believe you have control over
inevitable stressor, you may consider
it somehow to be your fault that the
inevitable ocurred.”
(Robert M. Sapolsky, Why Zebras don´t get ulcers)
A exposição de um indivíduo a uma situação de estresse pode acarretar uma
série de respostas coordenadas que incluem alterações nas funções
neuroendócrinas e complexas mudanças comportamentais. O principal motivo pelo
qual o tais respostas foram selecionadas parece ser o de proteger o indivíduo e
restabelecer a homeostase. A percepção do agente estressor leva a uma ativação
de inúmeras regiões do Sistema Nervoso Central (SNC) e esta atividade do SNC
acaba influenciando a resposta e função de diversos outros sistemas que compõem
o organismo, dentre os quais, o Sistema Imune (SI) (BUCKINGHAM et al., 1997).
Apesar do SNC, de fato, interferir no SI, é interessante notar que tanto o
Sistema Nervoso quanto o Sistema Imune foram classificados como supersistemas
devido à plasticidade de responder a diferentes estímulos e, suas capacidades de
adaptação e de auto-regulação (TADA, 1997). Assim, esta característica de variação
de resposta de acordo com o estímulo torna ambos sistemas de especial interesse,
uma vez que as possibilidades de perguntas e, conseqüentemente de respostas,
são bastante amplas. Exatamente esta plasticidade é que torna o estudo individual
destes sistemas complexo e o da interação deles, ainda mais.
Nos últimos anos, a investigação destas interações tem sido englobada nos
termos “Psiconeuroimunologia” (PNI) ou “Neuroimunomodulação” (NIM). Entretanto,
a investigação desta área não é, de fato, tão recente, pois desde 200 a.C., Galeno já
havia observado em mulheres melancólicas uma maior susceptibilidade ao
desenvolvimento de tumores de mama (STERNBERG, 1997). Os primeiros relatos
científicos modernos de que a atividade cerebral é capaz de interferir no curso de
Introdução
21
uma resposta imune são de 1891 quando Sawchenko demonstrou, em pombos, que
lesões cerebrais modificavam a resistência destes animais a determinadas doenças
(SPECTOR, 1996). Em 1904, os experimentos de Loeper e Crouzon também
apontam para esta mesma direção, demonstrando, pela primeira vez, que a injeção
de adrenalina é capaz de alterar os níveis de leucócitos circulantes (BENSCHOP et
al., 1996).
Já na década de 1920 tivemos o primeiro estudo científico que analisou a
capacidade de modulação da resposta imune através do condicionamento do
indivíduo (ADER, 2003). A partir de então diversos outros trabalhos demonstraram
que é possível condicionar o curso de uma resposta imune por meio de um estímulo
de condicionamento (ADER e COHEN, 1975; ROGERS et al., 1976), mais uma vez
confirmando a inter-relação entre estes sistemas. Como exemplo, podemos utilizar o
trabalho de Ader et al. (1979) em que os autores associaram, em ratos, a
administração via oral de ciclofosfamida, uma droga imunomoduladora (BERGER,
1993), com uma solução adocicada de sacarina. Após algumas sessões de
condicionamento, os autores constataram que a simples apresentação da solução
adocicada era capaz de diminuir a resposta imune, medida pela menor produção de
anticorpos frente a um estímulo específico, com hemácias de carneiro.
Apesar de terem sido descritos já há algum tempo, os protocolos de
condicionamento ainda são alvo de muitos estudos devido a sua metodologia até
certo ponto, simples. Madden et al., (2001), por exemplo, demonstraram que uma
única exposição a um estímulo condicionador associado à imunização com uma
proteína (HEL, “hen egg lysozyme”) foi capaz de induzir produção de anticorpos em
um posterior desafio com o estímulo condicionador, sem que houvesse re-exposição
à proteína. Mostrando a complexidade das interações envolvidas neste tipo de
resposta, Mormede et al. (2004) demonstraram que o condicionamento a um
estímulo aversivo, apesar de modular a resposta imune, não é capaz de condicionar
diretamente a ativação dos genes responsáveis pela produção de citocinas em sítios
periféricos ou no hipotálamo, embora, no mesmo estudo, o condicionamento da
expressão dos genes que codificam o “Nuclear factor kappa B” (NF-B) assim como
a “mitogen activated protein kinase” (MAPK) pudesse ter sido constatado.
É interessante notar que nos trabalhos citados, os autores utilizam estímulos
palatáveis – solução de sacarina – como agentes causadores de distúrbio; outra
maneira corriqueiramente utilizada para o estudo das inter-relações entre o SNC e o
Introdução
22
SI é o uso de estímulos ambientais agressores, tais como aqueles utilizados por
Hans Selye, em 1936, em um trabalho que se tornou um marco no estudo da área
de neuroimunomodulação. Neste trabalho, Selye descreveu o desenvolvimento de
uma síndrome decorrente da exposição a um conjunto muito diversificado de
estímulos lesivos/nocivos (frio, injúria tecidual, excesso de exercícios, intoxicação,
etc), que era caracterizada por hipertrofia de glândulas adrenais, úlceras gástricas e,
curiosamente, atrofia de órgãos linfóides (incluindo o timo, o baço e linfonodos).
Como tais achados eram independentes do agente empregado, Selye concluiu que
representavam uma resposta orgânica à injúria denominando-os coletivamente de
“Síndrome de Adaptação Geral”. Deste trabalho, dois conceitos foram estabelecidos:
1) a resposta aos estímulos ambientais parecia adaptativa, representando uma
tentativa do organismo de acomodar-se a esta nova situação e 2) a resposta era
sempre a mesma, independente do estímulo (SELYE, 1936). Posteriormente estes
diversos estímulos passaram a ser chamados, genericamente, de estresse.
Existem muitas maneiras de indução de estresse em modelos experimentais,
usando protocolos baseados em estresses físicos ou psicológicos/sociais, como a
aplicação de choques escapáveis e/ou inescapáveis (PALERMO-NETO et al., 2003),
por desequilíbrio ou por confinamento (SAINT-MEZARD et al., 2003), pelo convívio
com um parceiro agressivo (VEGAS et al., 2004) ou doente (MORGULIS et al., 2004;
ALVES et al., 2006), entre outros. Além dessa separação de acordo com a natureza
os agentes estressores também podem ser classificados, considerando-se a
duração do evento estressor, isto é, agudo ou crônico. Estas classificações são úteis
porque diferentes condições de estresse acarretam diferentes respostas fisiológicas
(DHABHAR et al., 1997; KEENEY et al., 2006), por exemplo, estresses agudos
acarretam ativação mais proeminente do Sistema Nervoso Autônomo (SNA)
culminando na liberação de catecolaminas; já em situações de estresse crônico
existe uma predominância de ativação do eixo Hipotálamo-Pituitária-Adrenal (HPA)
que resulta na liberação de hormônios, entre os quais os glicocorticóides (NORMAN
e LITWACK, 1997). Ora, se diferentes agentes estressores causam diferentes
consequências fisiológicas, o SI também deveria ser afetado de forma diferente em
cada situação. De fato já foi constatado que, enquanto estresses crônicos
normalmente suprimem a resposta imune, os agudos estão associados à
intensificação da mesma (VISWANATHAN et al., 2005).
Vale notar ainda que além do estímulo variar, a percepção do estímulo é
Introdução
23
passível de enormes variações de acordo com o indivíduo (AVITSUR et al., 2003).
Esta variação acontece entre dois pólos bem descritos pela analogia feita por Korte
et al. (2005). Estes autores propõem a classificação das respostas (quer seja em
humanos, quer seja em roedores), em dois padrões: o das águias, no qual a
resposta frente a uma agressão é luta ou fuga (fight-flight), caracterizando-se assim,
uma resposta “ativa” à agressão; e o das pombas, em que a resposta mais freqüente
é a de se esconder ou paralisar-se (hide-freeze). É interessante ressaltar que estas
respostas fisiológicas “opostas” podem ocorrer em indivíduos submetidos ao mesmo
estímulo, inclusive em animais de experimentação homogêneos, teoricamente
mantidos em condições “uniformes”. Isto torna muito claro que a forma pela qual
cada indivíduo compreende, assimila e responde a um estímulo é muito variável e,
até o momento, dificilmente controlável.
Além das manifestações fisiológicas após a percepção de um agente
estressor serem inúmeras, as interpretações do significado do que é o estresse
também são diversas. Tomaremos como base para o presente estudo, a proposta
por Gatchell e Baum (1983) no qual o estresse é definido como “um processo
complexo pelo qual o organismo reage a eventos internos ou externos ou a eventos
psicológicos que representem um desafio ou um perigo a este organismo”.
Do Sistema Nervoso ao Sistema Imune
“The stressor is inevitable;
the warning cannot change the stressor,
just the perception of it!”
(Robert M. Sapolsky Why Zebras dont get ulcers)
A conexão entre o SN e o SI já pode ser notada anatomicamente, uma vez
que todos os órgãos linfóides são inervados pelo SN, embora de maneira diferente
(MADDEN e FELTEN, 1995). A inervação do baço, por exemplo, é composta
principalmente por fibras da via simpática (cerca de 98%), sendo que há uma maior
densidade destas fibras na polpa branca do baço, mas, curiosamente, bastante
esparsa nos folículos (locais onde se encontram os linfócitos B); já nos linfonodos,
as fibras noradrenérgicas e as colinérgicas se equivalem e inervam tanto a zona
cortical quanto a paracortical, mas, novamente, parecem ausentes nos centros
Introdução
24
germinativos (ELENKOV et al., 2000). Desta forma, o estabelecimento de uma
resposta imune ocorre em regiões que podem ser influenciadas por estímulos
neuroquímicos desencadeados pela ativação do SNC (DEL REY et al., 2000), uma
vez que existem tanto receptores para catecolaminas (KOHM e SANDERS, 2000;
WRONA; 2006) quanto para opióides (CARR et al., 1996) nas superfícies celulares
de diversas células do SI.
Além da interferência direta de mediadores do SN sobre células e órgãos do
SI, estes mesmos compostos podem atuar em sítios do Sistema Endócrino e ativá-
los (WRONA, 2006). Em decorrência, há liberação de hormônios que, por sua vez,
podem atuar como importantes moduladores da resposta imune.
Assim, a influência do SNC sobre o SI, pode ocorrer por 3 vias principais
(esquematizadas na figura 1): 1) a via endócrina, desencadeada pela ativação do
SNC mediada principalmente por hormônios provindos do hipotálamo e da pituitária,
tendo como via comum final, principalmente, a secreção de corticosteróides; 2) a
inervação simpática e, 3) a inervação parassimpática (WRONA, 2006).
Introdução
25
Figura 1 Exemplos da influência do Sistema Nervoso Central e sua modulação do Sistema
Imune. 1) A acetilcolina produzida pelo nervo vago age em macrófagos reduzindo a
produção de citocinas proinflamatórias; 2) Hormônios derivados do eixo
hipotálamo-pituitária-adrenal modulam a função de linfócitos; 3) A inervação
simpática pode regular a função dos tecidos de órgãos linfóides e as células neles
contidas. (BLALOCK e SMITH, 2007).
A primeira via, a de produção de glicocorticoides, tem sido descrita com a
principal via de modulação da resposta imune após a percepção de um agente
estressor (BESEDOVSKY e DEL REY, 1996; ELENKOV et al., 2002). Para ativação
desta via os sinais neurossensórios devem ser processados no núcleo
paraventricular do hipotálamo e no centro noradrenérgico do “locus coeruleus”,
também no hipotálamo (REICHE et al., 2004). Destas regiões partem estímulos que
ativam o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) e, em determinadas situações, o
sistema nervoso simpático (ADER et al., 1993). A estimulação neural do hipotálamo
Introdução
26
o leva a liberar o hormônio liberador de corticotropina (CRH) que, por sua vez,
estimula a glândula pituitária a aumentar a produção do hormônio
adrenocorticotrófico (ACTH) a partir da clivagem da proopiomelanocortina (POMC).
Finalmente, o ACTH estimula as adrenais a liberarem glicocorticóides (GCs)
(SAPOLSKY, 1993). Aqui vale ressaltar que além dos glicocorticóides, os principais
hormônios envolvidos na reação ao estresse, os mesmos hormônios que levam ao
aumento da liberação de GCs, também podem atuar diretamente como moduladores
da resposta imune, sendo usados, em determinadas situações, como sinais
indicativos de situações de estresse (ZHOU et al., 1993).
Os GCs são importantes moduladores da resposta inflamatória e imune
(ELENKOV e CHROUSOS, 2002). Entre outros efeitos significativos sobre estas
respostas, os GC são capazes de modificar o padrão de resposta dos linfócitos T,
pois têm capacidade de suprimir a produção de citocinas pró-inflamatórias como o
fator de necrose tumoral (TNF)-α, o Interferon (IFN)-γ e a Interleucina (IL)-2
(BOUMPAS et al., 1993) e, provocam um aumento da produção de IL-10 (ELENKOV
et al., 1996). Isto leva os T CD4
+
a assumir um padrão do tipo Th2 (DAY et al.,
2001), com aumento da expressão de citocinas características deste padrão, como a
IL-4, IL-10 e IL-13, e uma inibição de expressão de IFN- γ e de TNF- α
(RAMIERZ et al., 1996).
Outros hormônios, cuja liberação ocorre em resposta a situações de estresse,
também podem influenciar a resposta imune. Dentre estes podemos incluir: alguns
produtos da zona reticularis do córtex adrenal como androsterona, progesterona e a
dehidroepiandrosterona (DHEA). É interessante notar que esta última, ao contrário
da corticosterona (CHROUSOS e GOLD, 1992), parece aumentar a síntese de IL-2 e
IFN-, sem afetar a produção de IL-4 (DAYNES et al., 1990), fazendo com que os
linfócitos T apresentem uma resposta do tipo Th1.
Ainda mais, hormônios produzidos na glândula pituitária também podem atuar
como moduladores da resposta imune. Neste contexto, o hormônio do crescimento
(GH) parece ser capaz de aumentar a capacidade fagocítica de macrófagos e
aumentar a produção de IL-1 e TNF- por estas células (KELLEY, 1989); a
prolactina (PRL), também é capaz de estimular o sistema imune de maneira
antagônica aos efeitos de glucocorticóides, além de aumentar a atividade
proliferativa no timo (BERNTON et al., 1991); o CRH também aparece como capaz
de modular a resposta, já que, além de atuar diretamente na produção de
Introdução
27
corticosterona e, portanto ser capaz de alterar positiva ou negativamente a
quantidade deste hormônio no sistema, também faz com que linfócitos produzam
maiores quantidades de IL-1 e IL-2 (SINGH et al., 1990).
Da mesma forma, a ativação do SNA também contribui nesta conversa entre
o sistema nervoso e o imune. Para ativação desta via, muitas regiões do cérebro, em
particular o córtex cerebral, a amígdala, e partes da formação reticular, são ativadas
após a percepção do agente estressor e terão suas ações sobre o SNA através do
hipotálamo. Aí ocorre a integração das informações a partir dessas estruturas e
estabelece-se em uma resposta “coerente”. Isto pode acontecer de diferentes
maneiras, pois o hipotálamo age sobre o SNA através de três vias principais:
projetando-se para o núcleo do trato solitário (o principal recipiente dos influxos
sensoriais a partir das vísceras que atua sobre o núcleo no nervo vago e sobre
outros neurônios parassimpáticos do tronco cerebral); projetando-se para regiões do
tronco cerebral no bulbo ventral rostral (que controla a saída pré-ganglionar,
importante para a função simpática) e projetando-se diretamente para a saída
autonômica da medula espinhal (KANDEL et al., 2000).
Estas vias de influência sobre a atividade adrenérgica são significativas para
a modulação da resposta imune, uma vez que, por exemplo, tem sido vastamente
descrito que a inoculação de adrenalina ou noradrenalina altera a distribuição das
subpopulações celulares presentes no sangue de indivíduos sadios (BENSCHOP et
al., 1996) e que situações de estresse psicológico agudo, provocando liberação de
catecolaminas, são capazes de aumentar a população de células NK e diminuir a de
linfócitos T CD4
+
bem como de linfócitos B no sangue de seres humanos (MILLS et
al., 1995). Além da capacidade de atuarem diretamente, a norepinefrina e a
epinefrina também podem atuar indiretamente sobre a função imune, afetando a
produção de hormônios como os mineralocorticoides (ex: aldosterona) que também
têm ações moduladoras do SI (NORMAN e LITWACK, 1997);
Desta forma, embora, em geral, se estude o SI isoladamente e se detecte sua
capacidade de responder diretamente a estímulos antigênicos e, ao mesmo tempo,
se auto-regular, é preciso considerar que, fazendo parte de um organismo complexo,
nenhum sistema, por mais autônomo, ou “autopoiético”, que possa parecer, escapa
da influência, direta ou indireta, do controle nervoso.
Introdução
28
Do Sistema Imune ao Sistema Nervoso
“There is no incurable disease,
only incurable people”
(Robert M. Sapolsky Why Zebras dont get ulcers)
A influência do SN sobre as ações do SI tornou-se tão evidente que James E.
Blalock criou, em 1984, uma teoria na qual o SI atuaria como um órgão sensorial;
sensível a estímulos outros que não aqueles que somos capazes de ouvir, ver,
cheirar, tocar ou palatizar. Segundo esta teoria, o SI foi desenvolvido para que o
organismo fosse capaz de detectar moléculas não pertencentes ao próprio com
grande sensibilidade e especificidade e, conseqüentemente mobilizar-se e
responder ao estímulo (BLALOCK, 1984; BLALOCK e SMITH, 2007).
Para que esta “função” sensorial do SI pudesse ser considerada, é preciso
demonstrar transferência de informações deste sistema ao SN. Caracterizações
iniciais desta via de comunicação demonstraram que após três dias de um dado
desafio antigênico, a subseqüente ativação do SI foi acompanhada por mudanças na
ativação do hipotálamo (BESEDOVSKY et al., 1977). Este trabalho abriu as portas
para muitos outros que vieram a descrever melhor as formas pelas quais o SI é
capaz de interagir com o SNC. Assim, foi descrito que inúmeras células que
compõem o SI são capazes de produzir diversos hormônios (ex: prolactina,
hormônio do crescimento), além de neuropeptídeos (encefalinas e endorfinas),
catecolaminas e opióides endógenos (LOLAIT et al., 1984; MONTGOMERY et al.,
1987; HARBOUR et al., 1987; BLALOCK, 1989; 1994; CARR e BLALOCK, 1991).
Estes dados demonstram que, assim como as células que compõem o sistema
imune estão sujeitas a modulações oriundas do SN, estas também são capazes de
sinalizar para o SN, e, aparentemente, de maneira direta.
É interessante notar que, já na resposta inata do organismo à injúria – a
inflamação – ocorrem interações claras entre o SN e o SI. Recentemente, foi
descrito em macrófagos alveolares e em neutrófilos, um aumento na produção, de
novo, de epinefrina e norepinefrina após estímulo com lipopolissacarídeo (LPS) que,
aparentemente, está relacionado com o aumento da injúria tecidual inflamatória
(FLIERL et al., 2007). Portanto, ao mesmo tempo em que o SN pode influenciar o
processo inflamatório, através da inervação vascular e, provavelmente da liberação
Introdução
29
local de neurotransmissores, estes, liberados pelas células recrutadas pelo processo
inflamatório, podem sinalizar para o SN, mostrando a possibilidade de modulação
bidirecional da inflamação.
Outra forma de inter-relação entre o SI e o SNC ocorre por intermédio de
citocinas, dentre as quais, se destacam: IL-1, IL-6, IL-10, TNF-, TGF-, e os
Interferons (DANTZER, 2006). Além de sua função local, normalmente associada à
regulação da resposta imune e inflamatória, algumas citocinas são capazes de
interferir diretamente no comportamento de um indivíduo, como é bem descrito no
caso dos pirógenos endógenos, IL-1, IL-6 e TNF- (NETEA et al., 2000). Além da
febre e do comportamento doentio potencialmente induzido na presença destas
citocinas, outro comportamento também parece ser influenciado por estas citocinas:
o sono (OPP, 2006). Não só as citocinas influenciam no sono como algumas fases
do sono, como a fase REM (rapid eye movement) parecem ser capazes de induzir
produção de citocinas, como a IL-7 e a IL-15 (BENEDICT et al., 2007), modulando,
provavelmente, a resposta imune. Adicionalmente podemos citar a participação de
citocinas na manutenção do ritmo circadiano, sendo que essa modulação pode
acontecer tanto indiretamente, por intermédio de outros fatores como a melatonina
(PONTES et al., 2007) como diretamente por ativação de genes que atuam no
controle do ciclo (CAVADINI et al., 2007). Outra situação na qual citocinas também
parecem desempenhar um papel importante é a depressão, uma vez que a
concentração sérica de citocinas como IL-2, IL-6, IFN- e TNF- já foi diretamente
correlacionada com a severidade da doença, e que estas citocinas contribuem para
o desenvolvimento do quadro, tanto em humanos quanto em camundongos
(HAYLEY et al., 2005).
As citocinas podem também agir diretamente em vias neuroendócrinas. Neste
âmbito poderíamos citar a ação da IL-1, que pode tanto estimular a secreção de
CRH (SAPOLSKY et al., 1987) como atuar diretamente nas células do córtex adrenal
aumentando a síntese de cortisol (WINTER et al., 1990). A IL-6 é outra citocina que
aparentemente tem função importante na regulação endócrina, uma vez que animais
transgênicos para IL-6, que superexpressam esta citocina, apresentam uma
quantidade elevada de corticosterona no soro, e têm aumento da liberação de
vasopressina e de ACTH pela pituitária, sob ação da mesma citocina (RABER et al.,
1997).
Introdução
30
As maneiras pelas quais as citocinas parecem ser capazes de atuar em
componentes do SN (esquematizadas na Fig. 2) podem ser subdivididas em três. A
primeira delas é pela estimulação de nervos aferentes viscerais, tendo como
principal representante o nervo vago (MAIER et al., 1998): alguns processos
inflamatórios e infecciosos viscerais são capazes de, por intermédio de aferências
vagais, estimular o “locus coeruleus” e desencadear uma resposta de estresse
mediada pela liberação de CRH (McCANN et al., 1998). A segunda maneira é pela
produção local de citocinas no SN, por astrócitos e células da microglia (WIESELER-
FRANK et al., 2005). A terceira via seria uma via “endócrina”, onde citocinas
presentes na circulação sanguínea agiriam sobre o SNC, seja pela passagem
passiva através da barreira hemato-encefálica, seja pelo transporte ativo, que ocorre
para algumas citocinas (BANKS et al., 1995; ROTHWELL e HOPKINS; 1995).
Portanto, não se pode negar a passagem de informações do SI para o SN,
que, como discutimos, pode ocorrer e ocorre de diferentes maneiras. Por outro lado,
a classificação do SI como um órgão sensorial, de Blalock, parece extrapolar os
dados atualmente disponíveis, parecendo-nos mais apropriado considerar a ambos,
sistemas complexos que interagem intensamente, mas não de maneira dependente
como os órgãos sensoriais e o SN.
Introdução
31
Figura 2 Exemplos da influência do Sistema Imune sobre o Sistema Nervoso. 1) A ação de
citocinas (IL-1, por exemplo) no nervo vago ocasionando alterações
comportamentais; 2) Neuropeptídeos (-endorfina, por exemplo) provindo de
linfócitos podem atuar em nervos sensoriais periféricos modulando a dor; 3)
Algumas citocinas também podem atuar no hipotálamo e glândula pituitária
aumentando a produção de CRH e ACTH, respectivamente; 4) Hormônios
(estimulador de -melanócito, por exemplo) podem atravessar a barreira
hematoencefálica e atuar no Sistema Nervoso Simpático. (BLALOCK e SMITH,
2007).
Introdução
32
Convivência com doentes
Em humanos, é notória a quantidade de eventos que podem acarretar uma
vida “estressada”. O termo estresse já foi, há muito, incorporado em nosso
vocabulário cotidiano designando desde situações banais até as mais “catastróficas”
o que é condizente com a definição do que é estresse, uma vez que esta é, de fato,
muito ampla. Dentre as inúmeras situações já descritas como capazes de atuarem
como agente estressor, o convívio e o ato de cuidar de doentes são considerados
como agentes estressores, que, além do mais, podem se prolongar por muito tempo.
Essa convivência afeta, em geral, principalmente familiares ou pessoas próximas ao
indivíduo doente. Nos EUA, cerca de 73% dos pacientes que apresentam câncer em
estágios avançados preferem permanecer em suas residências e receber cuidados
em casa, ao invés de ficar internados em hospitais e ter atenção profissional
(FINUCANE, 2002). Esta porcentagem é semelhante ao observado no caso de
pacientes portadores de Alzheimer, pois, de acordo com os dados da “Alzheimer’s
Association” (EUA), de 70 a 80% dos pacientes vivem em suas casas, onde
recebem os cuidados de que precisam (THOMPSOM et al., 2004).
Muitos destes “caregivers” não realizam tal atividade só por escolha, mas
muitas vezes pelo fato do doente ser um parente próximo. Ora, esta atividade exige
dedicação exclusiva em alguns casos, que leva os indivíduos a interromper suas
atividades sociais e relacionamentos, resultando em perdas de amizade e,
eventualmente isolamento social, outro evento que também pode ser considerado
como agente estressor (NAVAIE-WALISER, 2002). Desta forma, não é
surpreendente que um dos principais reflexos deste convívio seja o estabelecimento
de quadros semelhantes ao de depressão (DORE e ROMANS, 2001).
Por outro lado, Wolff, em 2007 reportou que cerca de 70% dos “caregivers“ de
pacientes terminais concordam que o ato de cuidar faz com que eles “se sintam
melhor consigo mesmos” e que “permitem a eles apreciar mais o fato de estarem
vivos”. Evidenciando que a depressão, embora seja o aspecto clínico mais
observado em “caregivers”, não é a único fenômeno emocional desencadeado neste
processo. Assim, embora as conseqüências do convívio com doente ainda não
estejam claras, parece ser consenso que este evento é capaz de interferir
diretamente em aspectos psicológicos daqueles que o fazem.
Introdução
33
Além desta interferência, o ato de conviver com um parceiro portador de
doença é capaz de alterar, não só parâmetros emocionais, mas também imunes
(KIECOLT-GLASER et al., 1995 e 2002). Estudos clínicos demonstraram uma maior
susceptibilidade a infecções e alterações hematológicas em indivíduos que
convivem/cuidam de portadores de Alzheimer (KIECOLT-GLASER et al., 1995), de
HIV/AIDS (FLASKERUD e LEE, 2001) ou com recém-nascidos prematuros
(GENNARO et al., 1997). Mais especificamente podemos citar o caso de caregivers
para portadores do mal de Alzheimer, nos quais já foi observado um aumento do
nível de cortisol salivar, uma menor proliferação de linfócitos e menor produção de
IL-2 (BAUER et al., 2000) e uma diminuição no número de linfócitos T circulantes,
tanto CD4
+
quanto CD8
+
(MILLS et al., 1999).
É interessante notar que parece, até certo ponto, simples, imaginar que seres
humanos são capazes de demonstrar e manifestar fisicamente afetividade um pelo
outro e, portanto de responder a condições emocionais com alterações da função
imunológica, como ocorre em situações mais “clássicas” de estresse. No entanto, ao
extrapolarmos esta condição para modelos experimentais, torna-se difícil propor
situações em que animais apresentem alterações fisiológico-comportamentais
causadas por estresses ambientais “sutis”, como a doença de um parceiro. Neste
sentido o trabalho de Palermo-Neto et al. (2003) nos ajuda a aceitar o fato de que
animais podem e reagem ao ambiente emocional em que se encontram. Neste
trabalho os autores descrevem que tanto animais que foram submetidos a choques
inescapáveis quanto animais que somente observavam os animais sendo
submetidos a tais choques (tinham contato visual, auditivo e olfativo) apresentaram
alterações comportamentais, aumento dos níveis de corticosterona e diminuição na
resistência ao tumor ascítico de Ehrlich (TAE). Adicionalmente, animais que foram
submetidos a choques escapáveis também apresentavam aumento compatível no
nível de corticosterona, porém nenhuma das outras alterações foi observada
(sugerindo, então, que os resultados obtidos para o comportamento e
susceptibilidade ao TAE são independentes do aumento deste hormônio). Ainda na
discussão sobre a capacidade de roedores de perceberem estados emocionais em
outros roedores, Langford et al. (2006) descrevem, em camundongos, um
comportamento que, talvez pudesse ser descrito como empatia. Nestes
experimentos, os autores analisam o comportamento de animais submetidos a
tratamentos aversivos (inoculação de ácido acético 0,9%) na presença ou não de um
Introdução
34
companheiro de gaiola submetido ou não a este mesmo tratamento. Eles puderam
observar que quando os animais eram submetidos a este tratamento, na presença
de um companheiro submetido ao mesmo ou a outro tratamento indutor de dor, o
comportamento associado à dor era maior do que quando os animais eram
submetidos ao mesmo tratamento, porém isolados ou até mesmo na presença de
um animal com o qual os mesmos não tinham convivido. Ainda mais, os autores
também descrevem como fator crucial para este comportamento a possibilidade de
visualização entre os animais. Destes trabalhos (PALERMO-NETO et al, 2003;
LANGFORD et al, 2006) depreende-se que, embora seja complicado assumirmos
que roedores como camundongos possuam, de fato, algo similar à empatia, é
notório que estes animais são capazes de perceber o estado emocional de um
companheiro e de reagir a ele. De maneira mais interessante, estes dois trabalhos
denotam que este comportamento é mais evidente em animais que conviveram entre
si por um determinado período de tempo, isto é, foram companheiros de gaiola.
No trabalho de Morgulis et al. (2004), partindo do princípio que animais
sociais estabelecem hierarquias e apresentam comportamento social bem definido,
os autores puderam constatar que camundongos Swiss que apenas conviveram com
animais de mesma linhagem portadores do TAE apresentaram uma menor
resistência a este mesmo tumor quando desafiados após 11 dias de convívio. Ao
analisarem o comportamento dos animais submetidos a esta condição, puderam
verificar que houve modificações em diversos parâmetros analisados, mas
surpreendentemente não constataram alterações significativas na quantidade de
cortocsterona sérica destes mesmos animais. Esta falta de alteração da
corticosterona foi inesperada, pois situações ansiogênicas classicamente induzem
um aumento na produção de GCs, como vimos anteriormente. Ao analisar
parâmetros fisiológicos dos animais, os autores puderam constatar um menor
número de leucócitos no sangue, indicando a possibilidade de que o modelo de
convívio com parceiro doente seja capaz de modular alguns parâmetros
imunológicos como a distribuição dos subtipos celulares de maneira independente
de glicocorticóides. Neste mesmo modelo, o grupo demonstrou também que este
convívio com parceiro portador do TAE faz com que ocorra uma redução na
atividade oxidativa e fagocítica de neutrófilos, bem como uma redução nos níveis de
noradrenalina e um aumento em seu turnover no hipotálamo dos animais (ALVES et
al., 2006).
Introdução
35
É interessante notar que, nestes últimos trabalhos, observou-se a facilitação
do crescimento do TAE em camundongos Swiss e uma diminuição da contagem
periférica de leucócitos, dois fatores associados, uma vez que a atividade citotóxica
de neutrófilos contra o tumor de Ehrlich parece ser relevante para o controle do
desenvolvimento desta neoplasia nos animais (BERGAMI-SANTOS et al., 2004).
Esta observação ilustra a possibilidade da existência de mecanismos diversos, em
ação nos animais submetidos ao convívio, capazes de afetar o controle e o
desenvolvimento de tumores. Entretanto, em diversos modelos de estresse, há
grande quantidade de informações que mostram a existência de alterações dos mais
diversos parâmetros da resposta imune adquirida (PARIANTE et al., 1977; SKLAR e
ANISMAN, 1980; DHABHAR e McEWEN, 1997; VILLANO et al., 2001; AVITSUR et
al., 2002, PALERMO-NETO et al., 2003; SAINT-MEZARD et al., 2003; MORGULIS
et al., 2004; HOGLUND et al., 2006; KINSEY et al., 2007).
Ora, considerando-se que o estabelecimento de praticamente qualquer
resposta imune adquirida depende da apresentação antigênica aos linfócitos T, e
que esta depende fundamentalmente das DCs, seria possível que a modulação
funcional deste tipo celular fosse um mecanismo comum a diversas situações
estressoras.
Células Dendríticas (DCs)
Inicialmente caracterizadas pelo aspecto morfológico (STEINMAN e COHN,
1973), estas células são atualmente descritas desempenhando papel fundamental
no desencadeamento da resposta imune, pois são as únicas capazes de ativar
células T “naive” e induzir a resposta imune primária, promovendo,
conseqüentemente o estabelecimento da memória imunológica (BANCHEREAU et
al., 2000). Por outro lado, embora as DCs possam desencadear de maneira eficaz a
resposta imune, acredita-se que em seus estágios imaturos são tolerogênicas,
induzindo a anergia das células T (RUTELLA et al., 2004), as quais, então, poderiam
atuar como células reguladoras/supressoras da resposta imune (LECHLER et al.,
2001). Um outro atributo importante das DCs é a sua mobilidade. Esta propriedade
permite às DCs se movimentarem do sangue para os tecidos periféricos e dos
tecidos periféricos para os órgãos linfóides. A seletividade da migração das DCs, sua
Introdução
36
residência em determinado tecido e sua capacidade migratória são eventos
fortemente regulados sendo que fatores quimiotáticos liberados pelos tecidos alvos e
as moléculas de adesão expressas em sua superfície estão envolvidos nestes
processos (BELL et al., 1999).
As DCs iniciam a resposta dos linfócitos T quando migram para os órgãos
linfóides secundários,como linfonodos, baço ou tecidos linfóides da mucosa,
sofrendo um processo de maturação (STOLL et al., 2002; BOUSSO et al, 2003).
Nesse estágio, expressam altos níveis de moléculas co-estimulatórias (CD80 e
CD86), aumentam a expressão de moléculas do MHC I e MHC II e passam a
expressar o marcador CD83, característico da DC ativada (ZHOU et al.,1992;
EGNAER e HART et al., 1995).
No órgão linfóide, as DCs maduras apresentam antígenos aos linfócitos T
naive antígeno-específicos, dando início, assim, à resposta imune adquirida
(BANCHEREAU et al., 2000). A resposta principal dos linfócitos T é dependente de
muitos fatores, incluindo a concentração de antígenos nas DCs, a afinidade dos
receptores pelo pMHC correspondente, o estado de maturação da DC e o tipo de
estímulo para maturação (GUETT et al., 2003). Por outro lado, a apresentação de
antígenos por DCs imaturas é considerado um importante caminho pelo qual a
tolerância a antígenos próprios do corpo é mantida. Os antígenos apresentados
pelas DCs imaturas podem induzir tolerância, impossibilitando a proliferação e
causando anergia dos linfócitos T, enquanto, simultaneamente, a apresentação de
antígenos por DCs maduras estimula a ação efetiva destes linfócitos (PROBST et
al., 2003; STEINMAN et al., 2003). A produção de citocinas como IL-12 (interleucina
12) durante o processo de maturação das DCs promove a indução de respostas do
tipo Th1 (HEUFLER et al., 1996). Em contraste, IL-10 (interleucina 10) está
identificada como a principal citocina que pode inibir tanto a diferenciação das DCs a
partir de monócitos quanto a maturação das DCs, por bloquear a liberação de IL-12
(XIA e KAO, 2003). Dado o papel central das DCs na resposta imune, tais células
são alvos de estudo em uma série de situações clínicas que envolvem
principalmente linfócitos T, como: transplantes, alergias, doenças auto-imunes,
imunodeficiência, resistência a infecções e a tumores, bem como a produção de
vacinas (BANCHEREAU e STEINMAN, 1998). Contudo, diversos fatores podem
interferir no comportamento das DCs e comprometer sua utilização em situações
clínicas.
Introdução
37
Assim como outras células do SI, as DCs também estão sujeitas a modulação
de suas respostas pela ação do SN. Existem várias maneiras pelas quais a
funcionalidade destas células pode ser modulada pela ação do sistema
neuroendócrino. Uma delas é via catecolaminas, que atuam diretamente no
processo de migração de células dendríticas (ROUGASCH et al., 1999;
MAESTRONI, 2000), além de atuare na distribuição das DCs, a norepinefrina atua
também, via receptores adrenérgicos presentes na membrana celular, na função
destas células, fazendo com que estas diminuam a produção de IL-12 e aumentem
de IL-10, após estímulo com LPS (MAESTRONI, 2006).
Outra via de modulação é a ação inibitória dos glucocorticóides sobre a
maturação das DCs em seres humanos (PIEMONTI et al., 1999) ou em
camundongos (MOSER et al., 1995), alterações que poderiam ter conseqüências
muito amplas sobre a resposta imune. Essa ação dos GCs sobre a maturação de
DCs parece depender também do momento no qual estas células foram tratadas,
isto é, ao longo do processo de diferenciação de precursores em DCs, o uso da
dexametasona (análogo sintético das GCs), acarretou diferentes alterações
fenotípicas (MATYSZAK et al., 2004). É interessante notar que, embora os GCs
sejam capazes de induzir uma maior expressão de receptores do tipo “toll” (TLR)
isto, aparentemente, não interfere o processo de maturação das DCs (ROSKOVA et
al., 2006).
Embora os mecanismos desta ação dos GCs sobre as DCs ainda não sejam
completamente conhecidos, a liberação de GCs pode provocar um aumento nos
níveis de IL-10, citocina que é capaz de induzir DCs murinas a manter um fenótipo
imaturo (CD80
low
CD86
low
) (WAKKACH et al., 2003). Alternativamente, a IL-10 pode
inibir diretamente a função de apresentação de antígenos das DCs, deste modo
prevenindo a resposta imune mediada por células T, fenômeno que pôde ser
demonstrado pela inibição da atividade lítica de células CD8
+
frente a melanócitos
humanos quando estas foram cocultivadas com DCs tratadas com IL-10
(STEINBRIK et al., 1999). No entanto, neste mesmo trabalho foi possível observar
que esta ação da IL-10 parece não ser eficaz em DCs maduras, da mesma forma
que o observado com os GCs (MATYSAK et al., 2004).
Além disso, células T reguladoras/supressoras, potencialmente induzíveis na
presença de IL-10 (CHEN et al., 2003), são capazes de prejudicar a capacidade
estimuladora das DCs, uma vez que parecem ser capazes de impedir a expressão
Introdução
38
de moléculas co-estimuladoras pelas mesmas (MISRA et al.,2004) ou interferir com
a duração de interação entre os linfócitos T e as DCs (TADOKORO et al., 2006).
Desta forma a IL-10, uma citocina cuja produção é aumentada em diferentes
condições de estresse (ELENKOV et al., 1996), poderia regular a resposta imune de
duas maneiras: ou atuando diretamente na célula dendrítica ou agindo em células
reguladoras que podem, por sua vez, afetar funcionalmente as DCs.
Embora a via mais comumente associada a este aumento de produção de IL-
10 em indivíduos submetidos ao estresse dependa da produção de GCs, sabe-se
que as diferentes maneiras de se induzir o estresse ou que diferentes constituições
genéticas podem resultar em diferentes mudanças neuroquímicas nos mesmos
(ADER et al., 1993; PARÉ et al., 1993; STRATAKIS et al., 1995). Ao mesmo tempo,
os mais variados modelos de estresse já foram associados ao favorecimento do
estabelecimento de tumores, evidenciando que, apesar de gerar situações
endócrinas diferentes, as diversas formas de indução de estresse parecem ser
capazes de criar um micro-ambiente favorável ao estabelecimento tumoral (SKLAR
et al., 1980; VILLANO et al., 2001; PALERMO-NETO et al., 2003) mesmo que não
se detecte o aumento, normalmente característico, de GCs nos animais estressados
(MORGULIS et al., 2004).
Assim, o presente trabalho teve como objetivo inicial a caracterização
comportamental dos animais submetidos ao convívio com parceiro portador de um
tumor diverso do já descrito na literatura (MORGULIS et al., 2004), o melanoma
B16F10. Confirmada a alteração comportamental nestes animais, seria possível
reforçar a validade do convívio com parceiro doente como modelo de estudo e,
assim, utilizá-lo para avaliar as alterações funcionais de DCs de animais submetidos
a agentes estressores aparentemente sutis. Além disto, procurou-se avaliar, ainda
que não profundamente, alterações funcionais do sistema imune dos animais, frente
a estímulos diferentes.
Objetivos
39
2 OBJETIVOS
O objetivo do presente trabalho foi verificar se o convívio de camundongos,
fêmeas, C57Bl/6, sadias, com animais de mesma linhagem e idade, portadoras do
melanoma murino B16F10, altera o comportamento e parâmetros imunofisiológicos
dos animais sadios.
Desta forma, pretendeu-se, especificamente:
- avaliar se o modelo era capaz de alterar (no dia 20), o comportamento dos
animais sadios (através de análises em Campo Aberto e Labirinto em Cruz-Elevado)
e a concentração de corticosterona sérica;
- avaliar os efeitos do convívio, sobre a expressão das moléculas CD80,
CD86, MHC classe II e CD11c pelas células apresentadoras de antígenos (células
dendríticas) presentes no baço e nos linfonodos dos animais;
- avaliar a expressão destes mesmos marcadores em células de medula
óssea obtidas dos animais que conviveram com parceiro doente e diferenciadas, in
vitro, em meio contendo GM-CSF e IL-4;
- avaliar os efeitos do convívio sobre o estabelecimento, in vivo, de uma
reação de hipersensibilidade do tipo tardio (frente à ovalbumina) analisando
também, in vitro, a proliferação celular das células não-aderentes provindas de baço
e dos linfonodos destes animais;
- avaliar o crescimento do melanoma B16F10 em animais sadios que
conviveram com portadoras do tumor.
Material e Métodos
40
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados cerca de 160 camundongos fêmeas da linhagem C57Bl/6,
com 4 a 8 semanas de idade, provenientes de proles obtidas no Biotério do
Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo (FMVZ – USP).
Antes do início dos experimentos, os animais foram alojados, por um período
de cinco dias, em gaiolas de polipropileno (28 x 17 x 12 cm) em número de dois
animais por gaiola para adaptação às condições experimentais. Estas gaiolas foram
devidamente acondicionadas em salas cuja temperatura ambiente (24 a 26 C) e
umidade (65 a 70%) foram mantidas por meio de aparelhos de ar condicionado
central, com ventilação, exaustão e luminosidade controladas, obedecendo-se a um
ciclo claro – escuro de 12 horas, com início da fase clara às 7 horas. Os animais
foram alimentados com ração balanceada para roedores NUTRILABOR GUABI
.
Ração e água foram fornecidas aos animais ad libitum durante todos os
experimentos.
Todos os experimentos foram realizados de acordo com os princípios éticos
de experimentação animal da Comissão de Bioética da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da USP (protocolo #720/2005) e com os Princípios Éticos de
Experimentação Animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA) conforme aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal
(CEEA) do Instituto de Ciências Biomédicas da USP (protocolo #089, fl.19, livro 2).
3.2 Tumor
Células do melanoma murino da linhagem B16F10 foram cultivadas em meio
R-10 (RPMI 1640, GibCo BrL com 10% de Soro bovino fetal, GibCo BrL). As células
foram mantidas em cultura a 37 C em incubadoras com atmosfera contendo 5% de
CO
2
e saturada de água. A cada dois dias as culturas foram avaliadas quanto à
necessidade de troca de meio e repique.
Material e Métodos
41
3.3 Estabelecimento do convívio com parceiro doente
Como modelo experimental foi utilizado um protocolo adaptado de Morgulis et
al. (2004). Para tanto, os animais foram mantidos em pares nas caixas micro-
isoladoras. Este pareamento foi realizado cinco dias antes do início dos
experimentos (ED
0
), observando apenas a equivalência de peso entre os animais de
uma mesma caixa. As caixas foram denominadas aleatoriamente como “controle” e
“estresse”.
No dia experimental 0 (ED
0
), um dos camundongos da caixa “estresse” foi
inoculado com 10
6
/50 L de células viáveis do melanoma B16F10 na pata traseira
direita (via sub-cutânea), este foi chamado de animal doente (AD). Ao animal que
convivia com este, nenhum procedimento foi adotado sendo ele designado como
Companheiro de Portador de Tumor (CPT), objeto de nosso estudo.
Nesta mesma ocasião, um animal da caixa “controle” recebeu, por via sub-
cutânea na pata traseira direita, 50 μL de R-10 (considerado como o AD). Ao outro
nenhum procedimento foi realizado sendo designado como Companheiro de Animal
Sadio (CAS), objeto controle de nosso estudo.
Esta interação entre os camundongos foi mantida por cerca de 20 dias após a
inoculação do tumor ou PBS, sendo que o tumor tornava-se detectável por volta do
dia 10 a 12 (ED
10-12
).
3.4 Análise do comportamento dos animais
Ao final dos 20 dias de interação (ED
20
), os camundongos foram analisados
quanto ao comportamento. É importante ressaltar que todos os experimentos
comportamentais foram realizados sempre em um mesmo período estipulado (8h –
9h) para minimizar a possível interferência do ritmo circadiano, e que os aparelhos
foram lavados com uma solução a 5% de álcool em água entre cada utilização, este
protocolo foi utilizado para evitarmos uma possível interferência dos odores
produzidos pelo animal anterior. Vale lembrar também que, antes das medições, os
animais permaneceram por um período superior a uma hora no ambiente onde
seriam realizados os experimentos comportamentais (embora todo o equipamento
se encontre no biotério) para aclimatação. De qualquer forma, realizamos os
experimentos alternadamente, sendo que sempre iniciávamos as aquisições de
dados introduzindo um animal do grupo controle e, posteriormente um do grupo
Material e Métodos
42
experimental.
Estes experimentos foram realizados nas dependências da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo sob a supervisão da
Dr
a
. Cristina de Oliveira Massoco e do Prof. Dr. João Palermo Neto sendo que
contamos com o auxílio do pós-graduando Daniel Stankevicius, todos do
Departamento e Patologia da Faculdade supra citada.
3.4.1 Campo Aberto
Neste experimento os animais foram colocados individualmente, na zona
central de uma arena redonda feita de madeira (40 cm de diâmetro e com paredes
de 20 cm de altura, sendo o conjunto todo elevado a 60 cm do solo) e a atividade
locomotora analisada por cinco minutos com o auxílio de uma câmera de vídeo
montada verticalmente à arena e conectada a um computador localizado em uma
sala adjacente à experimental. A arena foi virtualmente divida em quatro zonas:
tigmotáctica, externa, média e central, da região mais próxima às paredes para o
centro do aparelho (Fig. 3). Esta divisão foi realizada para que pudéssemos avaliar
não só a atividade locomotora geral dos animais, mas também para avaliarmos a
preferência manifestada por ele, em cada zona.
Este aparato fornece dados referentes principalmente à atividade locomotora
geral dos animais, dados que poderiam ser indicativos também de uma maior
ativação do Sistema Nervoso em decorrência de diversas situações. Desta forma,
sabe-se que animais ansiosos apresentam uma menor atividade exploratória do
campo aberto sendo que permanecem preferencialmente na zona tigmotáctica e
tendem a evitar a zona interna (KELLEY, 1993).
Os dados analisados foram referentes à distância movida (cm), velocidade
média (cm/s), tempo em exploração em cada zona (s) e número de entradas em
cada zona, sendo estes dados adquiridos com o auxílio do software Ethovision
System (Noldus Information Technology).
Material e Métodos
43
Tigmo
Externa
Interm.
Central
Tigmo
Externa
Interm.
Central
Figura 3.Fotografia da arena (aparelho total) do campo aberto. Na foto estão graficamente
representadas as quatro diferentes zonas analisadas: Tigmotáctica (Tigmo),
Externa, Intermediária (Interm.) e Central.
3.4.2 Labirinto em Cruz Elevado
Os animais foram colocados (um a um) no centro de um labirinto em forma de
cruz e ficaram livres para explorá-lo por cinco minutos. Os animais foram
introduzidos imediatamente após o campo aberto, pois este procedimento faz com
que os animais explorem mais intensamente o labirinto em cruz e,
consequentemente torna as diferenças de comportamento no aparelho, mais
evidentes (PELLOW et al., 1985; LISTER, 1987).
O labirinto consiste e assim foi virtualmente dividido em quatro braços: dois
abertos (30 x 5 x 0,25 cm) e dois fechados (parede de 20 cm) mais uma região
central, sendo o sistema todo elevado a 60 cm do solo (Fig. 4). Os animais foram
introduzidos na intersecção dos quatro braços (zona central) com a cabeça voltada
para um braço fechado. O uso deste aparato é recomendado para avaliações de
situações ansiolíticas, uma vez que, animais nesta condição permanecem menos
tempo nos braços fechados e apresentam um maior número de entradas nos braços
abertos (PELLOW et al., 1985; LISTER, 1987).
Os dados analisados foram: número de entradas em cada zona, tempo de
permanência em cada zona e distância movida em cada componente do aparato. Os
dados foram adquiridos com o mesmo sistema de informática descrito no item 3.4.1.
Material e Métodos
44
BA
BA
BF
BF
BA
BA
BF
BF
Figura 4. Fotografia da arena (aparelho total) do labirinto em cruz-elevado. Na foto estão
graficamente representadas as duas principais zonas analisadas: os dois braços
abertos (BA) e os braços fechados (BF). A intersecção dos quatro braços foi
denominada como zona central.
3.5 Avaliação do Nível de Corticosterona no Soro
Os animais foram sacrificados no ED
20
por decapitação. Para tanto, foram
habituados a este procedimento nos cinco dias que antecederam ao protocolo de
coleta de soro. A habituação ocorreu em relação ao ambiente onde a coleta seria
realizada e à própria guilhotina, sendo que a cabeça dos animais era introduzida
alternadamente na região de corte da guilhotina e, após cerca de cinco segundos
nesta condição, os animais eram retirados e colocados de volta em suas gaiolas.
Estes procedimentos foram adotados para que o animal se habituasse com o
procedimento de forma tal que, no momento de coleta, os níveis de corticosterona
não estivessem exacerbados em decorrência desta situação ansiogênica frente ao
novo.
A determinação quantitativa de corticosterona presente no soro dos animais
foi realizada através de kits comerciais (Coat-a-Count DPC MedLab). Para tanto, o
sangue coletado dos animais foi acondicionado em tubos de 1,5 mL que foram
mantidos em temperatura ambiente até a formação de coágulos (cerca de 2 horas).
Os tubos foram centrifugados (629 g, 20min) e os soros obtidos e armazenados em
Material e Métodos
45
freezer (-80 C) até a data da dosagem hormonal. A coleta de soro foi realizada
sempre em uma mesma hora estipulada (7h00 – 8h00) a fim de não haver influência
do ritmo circadiano na produção deste hormônio.
A concentração hormonal foi determinada por radioimunoensaio. Nesta
técnica há competição da corticosterona marcada radioativamente (com I
125
) e do
hormônio contido em cada amostra pelos sítios de anticorpos fixados na parede dos
tubos de ensaio. Experimentalmente, foram adicionados 50 μL de cada amostra e
1mL da corticosterona marcada em cada tubo e, este complexo mantido em
temperatura ambiente por 2 horas até o equilíbrio ser atingido. A seguir, o conteúdo
foi desprezado, sendo a leitura da radioatividade remanescente desta reação
realizada no Contador Automático de Radiação Gama (Packard). Os resultados
finais das contagens foram expressos em ng/mL.
Para obtenção da curva padrão foram utilizados calibradores-padrão (50 μL)
com concentrações previamente conhecidas de corticosterona, quais sejam: 0-20-
50-100-200-500-1000-2000 ng/mL, no ensaio realizado.
Como controle foi utilizado um soro controle (50 μL) com concentração de 200
ng/mL de corticosterona no início, no meio e no final de ensaio. Os seguintes
parâmetros de validação do ensaio foram registrados:
Sensibilidade do método: 91,30%
Coeficiente de variação baixo: 4,16%
Coeficiente de variação alto: 0,17%
Limite de detecção 3,161 ng/mL
Este experimento de quantificação de corticosterona sérica foi realizado no
Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da USP - SP.
3.6 Coleta das Células Aderentes dos Camundongos
Utilizamos um protocolo adaptado de Bjorck (2001) no qual os baços e
linfonodos dos animais foram removidos cirurgicamente e mantidos em HBSS
gelada. Estes foram macerados em telas de aço inoxidáveis estéreis com
porosidade de 0,25 mm e lavadas três vezes em HBSS a 4C, 290g por 10 minutos.
Seguiu-se então a lise de eritrócitos através de uma solução de Cloreto de Amônio
Material e Métodos
46
(0,16M). Após contagem das células, estas foram mantidas em placas plásticas por
um período de 2 horas em estufa (37 ºC, 5% CO
2
) para aderência. As células
aderentes foram imunofenotipadas (item 3.8) ou foi realizado a separação
imunomagnética (item 3.6.1).
3.6.1 Isolamento da subpopulação CD11c
+
A população CD11c
+
foi isolada por seleção positiva em coluna
imunomagnética. Para tanto, após a aderência das células esplênicas, estas foram
incubadas por 20 minutos, a 4ºC, com esferas magnéticas específicas (Miltenyi
Biotec), ajustando-se a concentração celular pela indicada. Após este período, as
células foram lavadas para remoção de esferas excedentes, e introduzidas em
coluna de afinidade (tipo MS) acoplada ao VarioMACS (Miltenyi Biotec). Para maior
pureza as células foram reintroduzidas na coluna. As células positivas (CD11c
+
)
foram isoladas e ressuspendidas em solução tampão para posterior
imunofenotipagem.
3.7 Diferenciação de Células Dendríticas a partir de Células de Medula Óssea
Para a diferenciação de células dendríticas a partir de precursores de medula
óssea foi utilizado o método proposto por Inaba et al. (1992) com algumas
modificações. Em suma, a medula óssea foi retirada de fêmures e tíbias dos animais
pela lavagem do interior dos ossos com meio R-1 (meio R10 diluído 10x em meio
RPMI-1640) ou HBSS (Hanks Balanced Salt Solution), por intermédio de agulhas
estéreis. Estas células foram lavadas (4 C, 290 g e 10min) neste mesmo meio e os
eritrócitos foram removidos pela lavagem em tampão de lise de hemácias (Cloreto
de amônio – 0,16M). As células restantes foram novamente lavadas, contadas e
mantidas em meio de diferenciação contendo 8 x 10
-3
g/mL de mGM-CSF (R&D,
Peprotech) e 1ng/mL de IL-4 (R&D, Peprotech). Este meio foi renovado no 4º dia de
cultura (removendo 75% do meio). Como estímulo de maturação foi adicionado 1
g/mL de lipopolisacarídeo (LPS, SigmaAldrich) no quinto dia de cultura.
Material e Métodos
47
3.8 Análise Fenotípica em Citômetro de Fluxo
As células foram lavadas e ressuspendidas em 100l/poço de tampão de
citometria (PBS contendo 0,5% (p/v) de soroalbumina bovina e 0,02% (p/v) de azida
sódica). Após outro ciclo de lavagem (290 g, 10min) as células foram
ressuspendidas em tampão e adicionadas aos marcadores específicos. Após
incubação por 20 minutos a 4 C e no escuro, as células foram lavadas duas vezes
em tampão para citometria (100 l/poço). As células foram, então ressuspendidas
em 150 L de tampão para citometria contendo 2% de paraformaldeído, para fixação
das células. A seguir foram submetidas à leitura em citômetro de fluxo, analisando-
se 10.000 eventos por reação. Para a análise dos resultados foi utilizado o “software”
CellQuest (BD).
A imunofenotipagem das células geradas in vitro (item 3.7) e isoladas do baço
(item 3.6) foi realizada analisando a freqüência e a intensidade de fluorescência
(MFI) dos marcadores CD80, CD86, I-A
b
e CD11c (tabela I). A aquisição dos dados
foi realizada por citometria de fluxo em aparelho FACSCalibur (Becton & Dickinson).
Para análise utilizamos o software WinMDI versão 2.8. O anticorpo anti-CD14
humano foi utilizado como controle isotípico para o anti-IA
b
.
Tabela I – Anticorpos monoclonais utilizados nos experimentos de citometria de fluxo.
Especificidade Clone Origem Marcação Fabricante
Anti-CD80 RMMP-1 IgG2a, rato PE
BD Biosciences
Anti-CD11c HL3 IgG1k, hamster APC BD Biosciences
Anti-CD11c HL3 IgG1k, hamster FITC
BD Biosciences
Anti-Iab I-A
b
IgG2ak, murino PE BD Biosciences
Anti-CD86 RMMP-2 IgG2a, rato FITC
BD Biosciences
Anti-CD14 humano M5E2 IgG2ak, murino FITC BD Biosciences
Material e Métodos
48
3.9 Estabelecimento de Hipersensibilidade do Tipo Tardio
Foi utilizado um protocolo adaptado de Macedo & Barbuto (1988) com
algumas modificações. Os animais sadios de ambos os grupos (ao final do protocolo
de indução de estresse, ED
20
) foram inoculados subcutaneamente com 50 g de
OVA (albumina de ovo – SIGMA Aldrich) emulsificada em 0,1 mL de adjuvante
completo de Freund (CFA, Gibco – BRL). Decorridos oito dias da data de
sensibilização com OVA, os animais foram desafiados também s.c. no coxim plantar
com uma solução de OVA agregada a 2%. O crescimento na espessura da pata foi
medida em momentos estipulados (1h, 6h e 48h), para verificação do processo
inflamatório inicial e do estabelecimento de uma hipersensibilidade do tipo tardio.
Para avaliar o crescimento da pata, os dados de cada momento foram subtraídos do
valor inicial de cada coxim plantar. Ao final das 48 horas, os animais foram
eutanasiados e seus baços e linfonodos foram removidos e processados para
avaliações in vitro.
3.9.1 Ensaio de proliferação linfocitária
Após aderência de pelo menos 2 horas em estufa (5% de CO
2
a 37 ºC), as
células não-aderentes provenientes dos órgãos linfóides obtidos dos animais no item
3.9 foram coradas com CFSE (5mM, Molecular Probes) por 20 minutos em
temperatura ambiente. Após a incubação, as células foram lavadas (400 g por 8
minutos a 20
o
C), sendo quantificadas.
As células aderentes, oriundas do mesmo ensaio de aderência, foram
pulsadas com 1 mg de Ovalbumina, por uma hora. Neste, as células foram
incubadas por uma hora com 1 mg de OVA e, após este período, foram novamente
lavadas para a remoção da OVA excedente.
Co-incubamos, então as células não-aderentes com células aderentes na
concentração de 30:1 (não-aderentes:aderentes) por quatro ou sete dias. Após estes
períodos as células foram coletadas, lavadas e analisadas em citômetro de fluxo
quanto à perda de fluorescência.
Para a análise dos dados de proliferação, foi criado um índice de proliferação
(IP), permite mensurar a queda na intensidade de fluorescência das células
marcadas, que será tanto maior, quanto maior for o número de divisões, e foi
Material e Métodos
49
calculado da seguinte maneira:
Média geométrica da intensidade de fluorescência de LT cultivados isoladamente
Média geométrica da intensidade de fluorescência das co-culturas
3.9.2 Quantificação de IL-10
O sobrenadante das co-culturas estabelecidas no item 3.9.1 foi coletado e
armazenado para posterior quantificação de IL-10. As dosagens de citocinas foram
realizadas por ELISA, utilizando os kits OptEIA para citocinas (BD Biosciences).
Neste método, placas de 96 poços Maxisorp (Nalge Nunc International) foram
sensibilizadas com 100 L por poço de anticorpo de captura diluído em tampão PBS,
e incubadas por uma noite. Após 3 lavagens com 400 L/poço de tampão de
lavagem para ELISA, as placas foram bloqueadas com 300 L/poço de tampão de
bloqueio por 2 horas a temperatura ambiente. Após 3 lavagens, as amostras foram
incubadas por um período de 2 horas em temperatura ambiente. Para a curva
padrão da citocina foram incubadas duplicatas de 50 L/poço das diluições seriadas
das citocinas recombinantes, conforme recomendações do fabricante. O período de
incubação das amostras e curva padrão foram de 2 horas em temperatura ambiente.
Após três lavagens foram adicionados 50 L/poço do anticorpo de detecção, com
incubação por 2 horas à temperatura ambiente. Novamente, a placa foi lavada três
vezes, 50 L/poço de estreptoavidina foi adicionada e incubada por 20min, no
escuro, em temperatura ambiente. Por fim, 50 L/poço de H
2
SO
4
(2N) foram
adicionados para interromper a reação e a densidade óptica foi determinada em
espectrofotômetro com filtro de 450 nm.
3.10 Avaliação do crescimento tumoral
Ao final dos 20 dias de convívio com o parceiro doente tanto animais dos
grupos CAS como os do CPT foram “desafiados” com o melanoma B16F10. Para
tanto, 10
6
células tumorais viáveis foram inoculadas no coxim plantar direito (s.c.) e a
espessura da pata medida com o auxílio de paquímetro (Mitutoyo) pelos 21 dias
seguintes. O crescimento da pata foi calculado subtraindo o valor obtido em cada dia
Material e Métodos
50
com o respectivo valor inicial.
3.11 Análise estatística
Os resultados foram analisados utilizando o software GraphPad Prisma.
Inicialmente realizamos teste de Bartlet para verificar se os dados eram
paramétricos. Após esta constatação, utilizamos o Teste t de Student para
determinar diferenças estatísticas entre os CPT e CAS. Os dados estão
apresentados como média aritmética desvio padrão (SD) ou erro padrão (SEM),
conforme indicado na legenda. A probabilidade de p<0,05 foi considerada como
capaz de mostrar diferenças significativas.
3.12 Delineamento Experimental
3.12.1 Caracterização dos efeitos do convívio com parceiro doente através de
metodologias comportamentais e bioquimicas
Para determinarmos se o convívio com parceiro portador do melanoma
B16F10 alterava o comportamento dos animais realizamos dois procedimentos de
avaliação comportamental: campo aberto (item 3.4.1) e labirinto em cruz elevado
(item 3.4.2). Foram realizados dois experimentos independentes (replicações)
partindo de cinco animais de cada grupo. Para análise dos resultados tivemos um
número amostral de oito animais para cada grupo, uma vez que não se observou
crescimento tumoral adequado no parceiro doente em todas as ocasiões. A
quantificação dos níveis de corticosterona (item 3.5) foi realizada com o soro de
outros cinco animais de cada grupo. Estes animais foram sacrificados por
decapitação e o sangue coletado para dosagem hormonal. Os órgãos linfóides foram
coletados para imunofenotipagem de algumas subpopulações celulares presentes
no baço e no linfonodo. Os fêmures destes animais foram coletados para posterior
diferenciação de precursores em DCs.
3.12.2 Análise da influência do convívio com portador de tumor nas células
provindas de órgãos linfóides
Foram realizados três experimentos independentes com cinco animais cada.
Material e Métodos
51
Adicionalmente utilizamos o material obtido no experimento 2. No ED
20
os animais
foram eutanasiados em câmara de CO
2
e removemos cirurgicamente os órgãos
linfóides (baço ou linfonodos). Após ensaio de aderência (item 3.6) de, pelo menos
duas horas separamos as células não-aderentes das aderentes e, nestas a sub-
população CD11c
+
(item 3.6.1). Estas diferentes sub-populações foram
imunofenotipadas e analisadas por citometria de fluxo (item 3.8).
3.12.3 Caracterização dos efeitos do convívio com parceiro portador de tumor sobre
as células dendríticas derivadas de medula óssea
Os animais utilizados nos experimentos 2 também tiveram seus fêmures e
tíbias removidos para obtenção, após lavagem, de células precursoras da medula
óssea. Ao total realizamos três experimentos independentes. Estas células foram
mantidas em meio de diferenciação contendo GM-CSF e IL-4 por sete dias, sendo
ativadas com LPS nos últimos dois dias (item 3.7). Ao final deste período as células
foram marcadas e analisadas por citometria de fluxo.
3.12.4 Análise da influência do convívio com parceiro portador de tumor sobre o
estabelecimento de Hipersensibilidade do Tipo Tardio à Ovalbumina
Foram realizados três experimentos independentes com cinco animais em
cada grupo (totalizando 20 animais por experimento). Nestes experimentos os
animais (CAS e CPT) foram mantidos isolados (uma vez que os seus companheiros
foram eutanasiados) e inoculados, no ED
20
, com uma solução contendo Ovalbumina
emulsificada em adjuvante completo de Freund. Decorridos oito dias, realizamos um
desafio antigênico (OVA agregada) e acompanhamos por 48 horas o crescimento da
pata inoculada (item 3.9). Neste mesmo momento, os animais foram eutanasiados
por CO
2
e tiveram seus baços e linfonodos removidos para as análises in vitro (itens
3.9.1 e 3.9.2).
3.12.5 Caracterização dos efeitos do convívio com parceiro portador de tumor sobre
o estabelecimento do tumor B16F10
Foi realizado apenas um experimento para avaliarmos o crescimento do
tumor B16F10, sendo utilizados, no total, 20 animais (número amostral final de cinco
animais por grupo). No ED
20
, os animais dos grupos CAS ou CPT foram isolados
Material e Métodos
52
(uma vez que o animal que convivia, portador ou não do melanoma foi eutanasiado),
sendo inoculados, por via subcutanea na pata traseira esquerda com 10
6
células
viáveis do melanoma B16F10. O crescimento do tumor foi acompanhado por outros
21 dias (item 3.10).
Vale ressaltar que em todos os experimentos, caso não fosse constatado o
aparecimento do tumor no companheiro doente (AD) até o ED
12
, o par era
descartado da amostragem experimental.
Resultados
53
4 RESULTADOS
4.1 Caracterizações comportamentais dos efeitos do convívio com um parceiro
doente
Com o objetivo de avaliar os efeitos do convívio com um parceiro portador de
um tumor (B16F10) sobre o comportamento dos animais, realizamos experimentos
no Campo Aberto e no Labirinto em Cruz-Elevado, metodologias que permitem
inferências sobre situações que envolvem ansiedade. Realizamos dois experimentos
independentes sendo que o número amostral total foi de oito animais (n=8).
4.1.1 Campo Aberto
Os resultado obtidos no campo aberto indicam que os animais que
conviveram com animais portadores do B16F10 (CPT) apresentaram uma maior
movimentação quando comparados aos animais controles (CAS), esta
movimentação foi caracterizada pelo aumento significante na distância total movida
na arena; no entanto, não pôde ser caracterizada preferência por alguma zona
específica do campo aberto (Fig. 5). Também observamos o desenvolvimento de
uma maior velocidade média pelos animais, principalmente na exploração da zona
tigmotáctica (Fig. 6). Os animais CPT apresentaram, ainda em relação aos do grupo
CAS, o mesmo tempo de exploração em cada zona (Fig. 7) e trocaram de zonas
com a mesma freqüência (Fig. 8).
Vale lembrar que, neste aparelho, os animais, não importando o tratamento,
apresentam maior atividade locomotora nas zonas mais próximas à parede. Ao
contrário, os dados referentes à velocidade média apresentam-se maiores em locais
afastados da parede, isto é, nas zonas centrais foram encontrados maiores valores.
Resultados
54
Arena Tigmo Externa Media Interna
0
1000
2000
3000
Zonas
Distância Movida (cm)
Figura 5. Distância total (cm) movida nas diferentes zonas (arena total, tigmotáctica, externa,
média e Interna) do Campo Aberto por animais sadios que conviveram por 20 dias
com um parceiro sadio, CAS (□) ou com parceiro portador de tumor, CPT (■). Os
dados foram apresentados como média aritmética erro padrão (SEM) com n=8
em dois experimentos independentes. indica p< 0,05 (teste t de Student).
Arena Tigmo Externa Média Interna
0
5
10
15
Zonas
Velocidade Média (cm/s)
Figura 6. Velocidade Média (cm/s) nas diferentes zonas (arena, tigmotáctica, externa, média
e interna) do Campo Aberto por animais sadios que conviveram por 20 dias com
um parceiro sadio, CAS (□) ou com parceiro portador de tumor, CPT (■). Os dados
foram apresentados como média aritmética erro padrão (SEM) com n=8 em dois
experimentos independentes. indica p< 0,05 (teste t de Student).
Resultados
55
Tigmo Externa Média Interna
0
25
50
75
Zonas
Tempo em exploração
(%)
Figura 7. Percentual de tempo em exploração nas diferentes zonas (tigmotáctica, externa,
média e interna) do Campo Aberto por animais sadios que conviveram por 20 dias
com um parceiro sadio, CAS (□) ou com parceiro portador de tumor, CPT (■). Os
dados foram apresentados como média aritmética erro padrão (SEM) com n=8
em dois experimentos independentes. indica p< 0,05 (teste t de Student).
Total Tigmo Externa Média Interna
0
100
200
300
Zonas
Nº de entradas
Figura 8. Número de entradas nas diferentes zonas (tigmotáctica, externa, média e interna)
do Campo Aberto por animais sadios que conviveram por 20 dias com um parceiro
sadio, CAS (□) ou com parceiro portador de tumor, CPT (■). Os dados foram
apresentados como média aritmética erro padrão (SEM) com n=8 em dois
experimentos independentes. indica p< 0,05 (teste t de Student).
Resultados
56
4.1.2 Labirinto em Cruz-Elevado
Logo após os experimentos no Campo Aberto, os animais foram introduzidos
no Labirinto em Cruz-Elevado. Embora não tenhamos constatado diferenças na
distância movida pelos animais CPT quando comparados aos CAS em nenhuma das
zonas deste aparelho (Fig. 9), notamos que os animais do grupo CPT
permaneceram mais tempo explorando os Braços Fechados e menos tempo nos
Braços Abertos e na Zona Central (Fig. 10); os animais do grupo CPT apresentaram,
também uma menor freqüência de entradas nos Braços Abertos em relação àquela
do grupo CAS (Fig. 11).
Braço Aberto Central Braço Fechado
0
250
500
750
1000
1250
1500
Zonas
Distância Movida (cm)
Figura 9. Distância Movida (cm) nas diferentes zonas (braços abertos, central e braços
fechados) do Labirinto em Cruz-Elevado por animais sadios que conviveram por 20
dias com um parceiro sadio (□) ou com parceiro portador de tumor (■). Os dados
foram apresentados como média aritmética erro padrão (SEM) com n=8 em dois
experimentos independentes.
.
Resultados
57
Braço Aberto Central Braço Fechado
0
25
50
75
Zonas
Tempo em exploração
(%)
Figura 10. Percentual de tempo em exploração nas diferentes zonas (braços abertos, central
e braços fechados) do Labirinto em Cruz-Elevado por animais sadios que
conviveram por 20 dias com um parceiro sadio (□) ou com parceiro portador de
tumor (■). Os dados foram apresentados como média aritmética erro
padrão(SEM) com n=8 em dois experimentos independentes. indica p< 0,05.
Braço Aberto Central Braço Fechado
0
10
20
30
40
50
Zonas
Nº de entradas
Figura 11. Número de entradas nas diferentes zonas (braços abertos, central e braços
fechados) do Labirinto em Cruz-Elevado por animais sadios que conviveram por
20 dias com um parceiro sadio (□) ou com parceiro portador de tumor (■). Os
dados foram apresentados como média aritmética erro padrão (SEM) com n=8
em dois experimentos independentes. indica p< 0,05 (teste t de Student).
Resultados
58
4.2 Análise da concentração de corticosterona no soro dos animais
Para verificar uma possível ativação do eixo HPA, em decorrência do convívio
com o parceiro doente, coletamos o soro dos animais dos grupos CAS e CPT e
quantificamos a concentração de corticosterona. Este experimento foi realizado em
uma única ocasião, com um número amostral de cinco animais/grupo (n=5).
Não constatamos diferenças significantes na concentração de corticosterona
presente nos soros dos animais do grupo CPT (CAS: 41,68 38,36 X CPT: 31,57
8,86, media SD). O alto valor de desvio padrão observado para os animais do
grupo controle indica uma maior variação individual do hormônio nesse grupo doque
no grupo CPT. Ao analisarmos a variância, pudemos evidenciar que esta variação
individual foi significativamente diferente entre os grupos (CAS: 92,04% X CPT:
28,07%, p=0,019).
4.3 Análise fenotípica de células dos baços
Para avaliar o efeito do convívio com um parceiro doente sobre o fenótipo das
células esplênicas, coletamos os baços dos animais e analisamos a expressão de
algumas moléculas de superfície, por citometria de fluxo, após marcação.
4.3.1 População aderente total
Baços dos animais dos grupos CAS ou CPT foram cirurgicamente retirados e,
após lise de eritrócitos, procedeu-se à marcação para moléculas co-estimuladoras
(CD80 e CD86), integrina CD11c e a molécula apresentadora de antígeno I-A
b
(MHCII), as quais foram analisadas em Citômetro de Fluxo.
Observamos que tanto as células provenientes dos animais do grupo CAS
quanto aquelas do grupo CPT apresentaram uma alta frequência de células I-A
+
(Fig. 15C e 15D). Vale ressaltar, ainda, que para a molécula I-A
b
utilizamos um
controle isotípico (no caso o anti-CD14 humano) para eliminar a possibilidade de
marcação inespecífica (MFI: não-marcado:2,14; controle isotípico: 2,80).
Em relação à expressão da integrina CD11c, notamos uma alta freqüência de
células duplo positivas em ambos os grupos (CAS: 58,39% 2,54; CPT: 57,85%
3,49, p=0,81; Fig. 15C e 15D). Tendo em vista que estas células esplênicas tinham
sido inicialmente separadas por aderência, a porcentagem de células encontradas
Resultados
59
excedeu as expectativas que tinhamos para a população de células dendríticas
presentes no baço. É interessante notar, ainda, que a maioria das células I-Ab
+
expressa também o marcador B220 (Fig. 15E e 15F), o que nos possibilitou
caracterizá-las como possíveis linfócitos B. Desta forma, subdividimos virtualmente
as células em duas subpopulações, de acordo com o nível de expressão de CD11c;
I-Ab
+
CD11c
low
e I-Ab
+
CD11c
high
(Fig. 15G e 15H). Mesmo após esta subdivisão, não
constatamos diferenças no nº de células que compõe cada subpopulação (Fig. 16).
CAS CPT CAS CPT
FL1
FL2
CD11c
IAb
CD11c
IAb
A
B
C
D
EF
GHB220
IAb
Figura 15. Dot Plots representativos de três experimentos independentes (n=8
animais/grupo). Como controle utilizamos as células dos animais do grupo CAS
ou do grupo CPT sem marcação (A e B) e avaliamos a expressão de Iab x
CD11c (C, D, G e H), de Iab x B220 (E e F). Para posterior análise as células
foram subdivididas de acordo com o nível de expressão de CD11c em CD11c
low
e CD11c
high
(G e H).
Resultados
60
Total CD11c Low CD11c High
0
25
50
75
%
Figura 16. Porcentagem de células I-Ab
+
CD11c
+
. Após aderência de, pelo menos 2 horas,
as células esplênicas de animais do grupo CAS (barras vazias) ou CPT (barras
cheias) foram incubadas com anti-CD11c e anti-Iab. A população CD11c
+
foi
posteriormente dividida em CD11c
low
e CD11c
high
. Dados apresentados como
média aritmética erro padrão (SEM) de três experimentos (n=8 animais/grupo).
Quanto às moléculas co-estimuladoras, verificamos que as células esplênicas
provenientes dos animais do grupo CPT apresentaram uma maior quantidade de
células CD80
+
CD86
+
(Fig.17A e 17B). Adicionalmente, observou-se que esta
diferença deveu-se, principalmente a um aumento na intensidade de fluorescência
de CD80 (MFI: CAS=6,45; CPT=20,47 - Fig.17D) sendo que a intensidade do CD86
pouco se alterou (MFI: CAS=15,54; CPT=17,65 - Fig. 17C).
Resultados
61
Figura 17. Expressão de moléculas co-estimuladoras pelas células aderentes de baço de
animais do grupo CAS (A) ou CPT (B). Sobreposição de histogramas da
expressão de CD80 (C) ou CD86 (D) em células de animais do grupo CAS (- -)
ou de animais do grupo CPT (-). Como controle, células sem marcação do grupo
CAS (■) ou do grupo CPT (□). Figuras representativas de dois experimentos
independentes (n=6 animais/grupo).
Este aumento na expressão da molécula co-estimuladora CD80, observado
para as células aderentes totais de animais de ambos os grupos, também pôde ser
evidenciado após definirmos as subpopulações CD11c
low
e CD11c
high
(Fig. 18A); da
mesma forma, a expressão de CD86 não apresentou diferenças entre os grupos
CAS e CPT após a subdivisão das células de acordo com o nível de expressão da
molécula CD11c (Fig. 18B).
CD86
Controles
CAS
CPT
C
CD80
CAS
CPT
D
A
B
Resultados
62
Figura 18. Expressão das moléculas co-estimuladoras CD80 (A) e CD86 (B) nas células
aderente s I-Ab
+
CD11c
low
ou CD11c
high
de animais do grupo CAS (barras vazias)
ou CPT (barras cheias). Dados apresentados como média aritmética erro
padrão (SEM) de dois experimentos independentes (n=6 animais/grupo).
indica p< 0,05 (test t de Student).
4.3.2 População CD11c
+
Para analisar, de outra maneira, se o fenômeno observado ocorria na
subpopulação de células dendríticas, os baços de animais de ambos os grupos
foram cirurgicamente retirados e, após lise de eritrócitos, a população CD11c
+
foi
isolada por separação em coluna imunomagnética.
Procedeu-se, então à marcação para as moléculas co-estimuladoras (CD80 e
CD86) e as células foram analisadas em Citômetro de Fluxo. De fato, pudemos
comprovar que tanto os esplenócitos como a subpopulação CD11c
+
provenientes
dos animais do grupo CPT expressaram moléculas co-estimuladoras em maiores
quantidades quando comparadas aos do grupo controle, CAS (Fig. 19C e 19D).
Low High
0
10
20
30
50
150
250
MFI
Low High
0
10
20
30
MFI
AB
Resultados
63
Figura 19. Análise fenotípica de esplenócitos CD11c
+
provenientes de animais que
conviveram com parceiro sadio (C) ou com parceiro portador de tumor (D).
Como controle foram utilizadas células não marcadas do grupo CAS (A) e do
CPT (B). Dot Plots representativos de dois experimentos independentes (n=6
animais/grupo).
4.4 Análise fenotípica das Células Aderentes Isoladas de Linfonodos
Após analisarmos as células esplênicas, analisamos a distribuição e
expressão destes mesmos marcadores nas populações dos linfonodos. Assim
como os baços, os linfonodos poplíteos foram removidos cirurgicamente e, após lise
dos eritrócitos em tampão de cloreto de amônio e aderência por 2 horas, as células
aderentes foram marcadas para CD80, CD86, CD11c e I-A
b
.
FL-2
F
L
-
1
AB
CD
CD80
C
D
8
6
Resultados
64
De maneira interessante, verificamos a presença de uma população I-A
b
com
marcação intermediária nas células dos linfonodos provenientes dos animais do
grupo CPT (Fig. 20C) quando comparadas às células dos animais do grupo CAS
(Fig. 20B). No entanto, a intensidade de fluorescência não tenha se alterou de forma
significante entre os dois grupos (MFI: CAS= 319,1 36,27; CPT= 365,6 145,6 –
Fig. 21A). De maneira semelhante, a população IAb
+
CD11c
+
também não foi
alterada após o convívio com parceiro doente (CAS: 4,33% 1,3 X CPT: 3,19 0,81
– Fig. 20).
Além disso e ao contrário do observado para as células esplênicas,
constatamos uma leve diminuição no nº de células CD80
+
CD86
+
no grupo CPT (Fig.
20E) quando comparado com os dados do grupo CAS (Fig. 20D). Todavia a MFI da
molécula CD80 (MFI: CAS= 12,67 1,35; CPT= 20,05 8,8 – Fig. 19B) e a de CD86
não apresentaram alterações significantes (MFI: CAS= 10,72 2,11; CPT= 10,65
0,65 – Fig. 21C).
Resultados
65
Sem
Marcação
A
CAS
CPT
IAb
CD11c
B
C
CAS CPT
CD80
CD86
D
E
Sem
Marcação
A
Sem
Marcação
A
CAS
CPT
IAb
CD11c
B
C
CAS
CPT
IAb
CD11c
CAS
CPT
IAb
CD11c
IAb
CD11c
B
C
CAS CPT
CD80
CD86
D
E
CAS CPT
CD80
CD86
CAS CPT
CD80
CD86
D
E
Figura 20. Avaliação fenotípica de células aderentes de linfonodos poplíteos provenientes de
animais controle (A e C) ou estressados (B e D). As células foram avaliadas
quanto à expressão de CD11c e I-A
b
(A e B) ou CD86 e CD80 (C e D). Dot Plots
representativos de três experimentos independentes (n=8 animais/grupo
/experimento).
Resultados
66
CD86
Controle Estresse
0
10
20
30
MFI
CD80
Controle Estresse
0
10
20
30
MFI
IAb
Controle Estresse
0
250
500
750
MFI
A
BC
CD86
Controle Estresse
0
10
20
30
MFI
CD80
Controle Estresse
0
10
20
30
MFI
IAb
Controle Estresse
0
250
500
750
MFI
A
BC
Figura 21. Expressão das moléculas do IAb (A), CD80 (B) ou CD86 (C) nas células
aderentes dos linfonodos de animais do grupo CAS (barras vazias) ou CPT
(barras cheias). Dados apresentados como média aritmética erro padrão (SEM)
de dois experimentos independentes (n=6 animais/grupo).
4.5 Análise fenotípica de células de medula óssea diferenciadas in vitro
Uma vez que havia a possibilidade do convívio com um parceiro doente
influenciar as células presentes nos órgãos linfóides e também os seus precursores,
analisamos fenotipicamente as células diferenciadas a partir de precursores das
medulas ósseas, mantidas por sete dias em meio contendo GM-CSF e IL-4 e
ativadas por 48 horas com LPS.
Ao compararmos a porcentagem de células IAb
+
no início da cultura, com o
observado após o período de diferenciação, notamos um aumento na porcentagem
destas células nos animais dos dois grupos (Fig. 22A). Tendo em vista que a
porcentagem de células apresentadoras (IAb
+
) não era diferente, analisamos a
expressão das moléculas co-estimuladoras em ambos os períodos. Quanto ao
CD86, observamos aumento do nº de células positivas nos animais dos dois grupos.
Este aumento seria esperado, uma vez que as condições de cultura deveriam induzir
a diferenciação de precursores em células dendríticas. No entanto, apenas nas
células provenientes de animais do grupo CPT pudemos constatar diferenças
significativas (Fig. 22B). Já para a porcentagem de células expressando CD80
notamos que eventos diferentes aconteceram com as células dos animais dos
grupos CAS e CPT. Após sete dias em cultura, grande parte das células dos animais
do grupo CAS passaram a expressar este marcador, enquanto as células dos
animais do grupo CPT deixaram de expressar esta mesma molécula de superfície
(Fig. 22C).
Resultados
67
07
0
25
50
75
Dias
IAb+ (%)
07
0
10
20
30
Dias
CD86 (%)
07
0
25
50
75
p=0.054
Dias
CD80 (%)
A
B
C
07
0
25
50
75
Dias
IAb+ (%)
07
0
10
20
30
Dias
CD86 (%)
07
0
25
50
75
p=0.054
Dias
CD80 (%)
A
B
C
Figura 22. Porcentagem de células Iab
+
(A), CD86
+
(B) ou CD80
+
(C). Células de medula
óssea de animais do grupo CAS (barras vazias) ou CPT (barras cheias) foram
diferenciadas em meio contendo GM-CSF e IL-4 por sete dias e ativadas nas
últimas 48 horas. Dados apresentados como média aritmética erro padrão
(SEM) de dois experimentos independentes (n=6 animais/grupos). indica p<
0,05 e p<0,01 (test t de Student).
De maneira interessante, além do nº de células CD80
+
ter diminuído, as
células diferenciadas dos animais do grupo CPT apresentaram uma redução não
significante no nível de expressão desta molécula (MFI: CAS= 162,2 39,18 X CPT=
81,1 40,62, n=6), enquanto que a MFI de CD86 pouco se alterou (Fig. 23C e 23D).
Embora a porcentagem de células CD80
+
CD86
+
tenha permanecido em níveis
semelhantes, foi possível constatar visivelmente o desaparecimento de uma
subpopulação CD80
high
, como ilustrado na figura 23.
Resultados
68
Figura 23. Análise fenotípica das células de Medula Óssea tratadas por sete dias com GM-
CSF e IL-4 proveniente de animais que conviveram com parceiro sadio (C) ou
com parceiro portador de tumor (D). Como controle foram utilizadas células não
marcadas de animais do grupo CAS (A) ou do CPT (B). Dot plots representativos
de três experimentos independentes (n=6 animais por grupo).
4.6 Estabelecimento de Reação de Hipersensibilidade do Tipo Tardio
4.6.1 Condições subótimas de sensibilização
Para avaliar se o convívio com companheiro portador de tumor interferiria em
parâmetros imunes, optamos por avaliar o estabelecimento de uma DTH frente a
Ovalbumina. Realizamos no total dois experimentos independentes, sendo que ao
final o número amostral foi de oito animais. No entanto, após estas repetições,
notamos um erro metodológico foi cometido quando na sensibilização dos animais
CD86
CD80
FL2
FL1
A
B
C
D
Resultados
69
com ovalbumina em adjuvante completo de Freund: a emulsificação não foi realizada
de maneira satisfatória.
De qualquer maneira, pudemos observar que animais de ambos os grupos
apresentaram uma reação inflamatória inicial de intensidade semelhante sendo esta
ainda detectada após cerca de seis horas após o desafio antigênico (Fig. 24).
Decorridas 48 horas do momento do desafio, a espessura das patas dos animais do
grupo CPT voltou a níveis próximos do basal enquanto que aquela dos
camundongos do grupo CAS apresentou um aumento, compatível com o esperado
numa reação de hipersensibilidade do tipo tardio, embora em valores absolutos
baixos (Fig. 24).
1648
0
10
20
30
Horas
Aumento da espessura
da pata (%)
Figura 24. Aumento da espessura da pata dos animais do grupo CAS () e CPT (■). Os
animais foram previamente sensibilizados com uma solução de OVA + CFA e,
após oito dias desafiados no coxim plantar com OVA 2% agregada. O aumento
da pata foi medido e subtraído do valor inicial. Dados apresentados como média
aritmética desvio padrão (SD) (n=8 animais/grupo) indica p< 0,05
4.6.1.1 Ensaio de Proliferação
Tendo em vista que os animais do grupo CPT não apresentaram uma
resposta cutânea à OVA da mesma maneira que os do grupo CAS o fizeram,
realizamos ensaios in vitro para avaliar a resposta proliferativa das células
esplênicas quando estimuladas com OVA. As células linfóides foram inicialmente
Resultados
70
definidas através de um “gate” em tamanho e granularidade (Fig 25A) e o índice de
proliferação foi calculado a partir de células não aderentes marcadas com CFSE e
não estimuladas (Fig 25B). Com quatro dias de co-cultura, o índice de proliferação
calculado para os animais de ambos os grupos foi bastante similar (Fig 25C; CAS:
1,97 X CPT: 1,72). No entanto, após sete dias em co-cultura, as células dos animais
CAS apresentaram um índice de proliferação maior que aquelas dos animais do
grupo CPT (Fig 25D; CAS: 2,00 X CPT: 1,09).
0 200 400 600 800 1000
FSC-H
0
200
400
600
800
1000
SS
C-H
28.5
A
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
FL1-H: cfse
0
20
40
60
80
100
%
of
Max
B
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
FL1-H: cfse
0
20
40
60
80
100
%
of
Max
C
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
FL1-H: cfse
0
20
40
60
80
100
%
of
Max
D
0 200 400 600 800 1000
FSC-H
0
200
400
600
800
1000
SS
C-H
28.5
A
0 200 400 600 800 1000
FSC-H
0
200
400
600
800
1000
SS
C-H
28.5
A
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
FL1-H: cfse
0
20
40
60
80
100
%
of
Max
B
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
FL1-H: cfse
0
20
40
60
80
100
%
of
Max
B
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
FL1-H: cfse
0
20
40
60
80
100
%
of
Max
C
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
FL1-H: cfse
0
20
40
60
80
100
%
of
Max
C
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
FL1-H: cfse
0
20
40
60
80
100
%
of
Max
D
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
FL1-H: cfse
0
20
40
60
80
100
%
of
Max
D
Figura 25. Sobreposição dos histogramas representativos da intensidade de fluorescência,
pela subpopulação linfocitária determinada através de um “gate” por tamanho
(FSC) e granularidade (SSC) (A), e o índice de proliferação calculado de acordo
com a perda de fluorescência (B; histograma cheio representa a proliferação
após estímulo pelo mitógeno conA e o histograma vazio a incorporação de CFSE
sem estímulo) .Células não-aderentes foram incubadas com CFSE e co-
cultivadas com células aderentes pulsadas com 1 mg de OVA por quatro dias (C)
ou sete dias (D). Células de animais controles (CAS) representados nos
histogramas cheios e os estressados (CPT) em vazio. n=8 animais/grupo
Resultados
71
4.6.1.2 Quantificação de IL-10
Com o intuito de avaliar a concentração de IL-10 no sobrenadante das co-
culturas descritas acima, realizamos a quantificação desta interleucina pelo método
de ELISA.
Nos animais do grupo CPT, o sobrenadante das co-culturas mantidas por
quatro dias apresentou quantidade detectável de IL-10 (248,90 5,99 pg/mL; Fig.
26) ao passo que as co-culturas do grupo CAS apresentaram níveis abaixo do limiar
de detecção para esta mesma citocina. Após sete dias, no entanto, a concentração
de IL-10 presente no sobrenadante de ambas co-culturas foi semelhante (CAS:
79,70 68 pg/mL X CPT: 75,19 29,51 pg/mL; Fig. 26).
4.0 7.0
0
100
200
300
N.D.
Dias
IL-10 (pg/mL)
Figura 26. Quantificação de IL-10 no sobrenadante de co-culturas de células esplênicas
aderentes pulsadas com 1mg de ovalbumina e co-cultivadas com células
esplênicas não aderentes por 4 ou 7 dias. As células foram isoladas de animais
do grupo CAS (barras vazias) ou CPT (barras cheias). Os dados foram
apresentados como média aritmética desvio padrão (SD) de triplicatas (n=8
animais/grupo) N.D. = não detectado.
4.6.2 Sensibilização em condições aprimoradas
O protocolo de sensibilização utilizado foi revisto, sendo a emulsificação feita,
agora, de maneira apropriada. No entanto, não foi possível a realização de muitos
experimentos devido a problemas ocorridos com o estabelecimento do melanoma
B16F10. Nesta nova condição, não pudemos constatar as diferenças observadas
para a sensibilização em condições subótimas, sendo que os valores obtidos neste
Resultados
72
experimento são mais elevados, estando, assim, de acordo com o descrito na
literatura (Fig. 27).
1.0 6.0 48.0
0
25
50
75
Horas
Aumento da espessura
da pata (%)
Figura 27. Aumento da espessura da pata de CAS () ou CPT (■). Os animais foram
previamente sensibilizados com uma emulsão de OVA em CFA e, após oito
dias desafiados no coxim plantar com OVA 2% agregada. O aumento da pata
foi medido e subtraído do valor inicial. Dados apresentados como média
aritmética desvio padrão (SD) (n=3 animais/grupo) indica p< 0,05
4.7 Avaliação do estabelecimento do melanoma B16F10
Um dos objetivos do presente projeto foi analisar a influência do convívio com
parceiro portador do melanoma B16F10 sobre o estabelecimento deste mesmo
tumor.
Para tanto, decorridos os 20 dias de convívio, animais de ambos os grupos
(CAS e CPT) foram inoculados, via subcutânea, com 10
6
células de B16F10 viáveis.
Após acompanhamento por 22 dias após a data da inoculação do melanoma (que
ocorreu no ED
20
), não evidenciamos, em nenhum momento, diferenças significativas
entre os dados dos dois grupos (Fig. 28).
Resultados
73
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
0
100
200
300
400
500
Dias após desafio
Aumento da espessura
da pata (mm x 10
-2
)
Figura 28. Aumento da espessura da pata em animais CPT (▲) ou CAS (■) após inoculação
de 10
6
células viáveis do melanoma B16F10. Dados representados pela média
aritmética desvio padrão (SD) de um único experimento (n=5 animais/grupo).
Discussão
74
5 DISCUSSÃO
Os resultados do presente trabalho apontam para a mesma direção que
outros do grupo de neuroimunomodulação (MORGULIS et al., 2004; ALVES et al.,
2006) e acrescentam novas informações, pois animais que conviveram com
portadores do melanoma B16F10 apresentaram: 1) aumento na locomoção geral
observada no campo aberto; 2) aumento no tempo em exploração dos braços
fechados e diminuição no tempo em exploração e no nº de entradas nos braços
abertos do labirinto em cruz-elevado; 3) alteração na variância do nível de
corticosterona, mas não no valor médio de concentração hormonal quando
comparado aos animais controle; 4) aumento no nível de expressão de CD80 por
células esplênicas, mas não nas células provenientes de linfonodos; 5) diminuição
na quantidade de células CD80
+
e aumento de células CD86
+
após cultura in vitro de
precursores de medula óssea em meio para diferenciação de células dendríticas; 6)
diminuição de uma resposta cutânea à ovalbumina, fenômeno aparentemente
relacionado à expansão de células produtoras de IL-10. No entanto, o convívio com
um parceiro doente não alterou o estabelecimento do melanoma B16F10.
Assim, analisando-se estes resultados em seu conjunto depreende-se que a
convivência por 20 dias com parceiro portador do melanoma B16F10 produz
alterações fisiológicas que foram constatadas tanto no comportamento destes
animais, assim como por alterações fenotípicas de células que compõem o Sistema
Imune. Todas estas alterações serão interpretadas e discutidas dentro de um
contexto de neuroimunomodulação.
Inicialmente era essencial caracterizar o modelo aqui proposto como capaz de
alterar significativamente parâmetros comportamentais e validá-lo como um modelo
para o estudo das interrelações do SN e do SI. Esta caracterização foi necessária
uma vez que o modelo no qual nos baseamos (MORGULIS et al., 2004; ALVES et
al., 2006) utilizou-se de camundongas da linhagem Swiss portadoras do tumor
ascítico de Ehrlich (TAE) como animal doente e, no modelo aqui proposto, foi
utilizado o melanoma B16F10 como agente indutor da doença e outra linhagem de
camundongos (C57Bl/6). Outra alteração feita foi o tempo de convívio, no modelo
original os animais eram mantidos em pares por 11 dias, tempo no qual o TAE, na
concentração utilizada já estava bastante aparente, causando comportamento
doentio em seu portador (MORGULIS et al., 2004), enquanto no protocolo aqui
Discussão
75
adotado os animais conviveram por um período superior, de 20 dias, uma vez que o
melanoma, na forma e concentração que foi inoculada, é somente visivel de maneira
significativa após este periodo. Neste contexto, é interessante o observado por
Langford et al. (2006), que animais que convivem por um periodo de 14 a 21 dias
parecem ser mais suscetíveis a alterações em seus parceiros. É fato, porém, que
estes autores não utilizaram o convívio com animal doente, mas sim a capacidade
de um parceiro demonstrar comportamento associado à dor ao mesmo tempo em
que observa outro sendo submetido a outro ou ao mesmo tratamento indutor de dor.
Outro aspecto metodológico que optamos em manter foi o uso de fêmeas
para o estudo, tendo em vista que machos são mais territorialistas e agressivos, ao
passo que fêmeas são mais tolerantes, principalmente com outras fêmeas
(PARMIGIANI et al., 1989) sendo, inclusive mais suscetíveis a estresses baseados
em instabilidade social (HALLER et al., 1999). Isto se reflete no fato de que modelos
de estresses sociais variam de acordo com o sexo dos animais (BROWN e
GRUNBERG, 1995). Outro motivo pelo qual foi mantido o uso de fêmeas foi o fato
de que camundongos machos, quando pareados em gaiolas, corriqueiramente
estabelecem uma situação de hierarquia de dominância - submissão que é capaz de
alterar inúmeros aspectos fisiológicos que poderiam interferir tanto no
comportamento quanto em parâmetros imunológicos de cada animal (STEFANSKI,
2000; KINSEY et al., 2007). Por outro lado, a utilização de fêmeas em trabalhos de
comportamento pode acarretar conclusões imprecisas, devido a um possível viés
causado pelos hormônios sexuais, já que cada animal poderia estar em momento
diferente do ciclo estral. Neste caso, alterações fisiológicas poderiam decorrer não
só do estímulo controlado, mas também dos níveis de hormônios sexuais de cada
animal, uma vez que estes são capazes de influenciar o estabelecimento de
situações de estresse (GRAY e LEVINE, 1964; ZIMMERBERG e FARLEY, 1993;
MORA et al., 1997). Para minimizarmos os efeitos destes hormônios estrais e suas
variações, utilizamos sempre animais de uma mesma prole, habituadas por cinco
dias antes do início dos experimentos. Assim, não só se conseguiu a habituação
propriamente dita, mas também se tentou sincronizar os ciclos estrais (FOX et al.,
1984). No entanto, em nenhum momento dosamos objetivamente a concentração de
qualquer hormônio desta natureza. Mesmo assim, considerar que os resultados
obtidos de repetições experimentais fossem decorrentes das fases do ciclo estral,
seria considerar que, nestes experimentos diferentes, os animais dos grupos
Discussão
76
estivessem em momentos igualmente diferentes do ciclo.
Ainda sobre o modelo experimental, um ponto que merece discussão é a
extrapolação dos resultados obtidos no modelo de convívio com parceiro doente,
quer seja o aqui proposto quer o proposto inicialmente por Morgulis et al. (2004),
com a situação descrita para humanos, denominada de caregiving. Talvez seja, até
certo ponto, simples compreendermos, mesmo em camundongos, que estresses
físicos e agressivos como choques elétricos aplicados nas patas (PALERMO-NETO
et al., 2003) e até mesmo aqueles induzidos por Hans Selye em 1936, possam
acarretar distúrbios em diversos sistemas de um organismo, dentre os quais o
Sistema Imune. Por outro lado, a compreensão de que estresses psicológicos, por
serem mais sutis, podem alterar significativamente a resposta fisiológica e, dentro
disso, alterar o curso de uma resposta imune pode ser de difícil aceitação para
alguns. No entanto, diversos estudos, inclusive em camundongos, demonstram que
é possível estabelecermos condições de estresses psicológicos em modelos
experimentais e que estes afetam o sistema imune. Mais ainda, é possível induzir
alterações semelhantes ao estresse em animais que observam outro animal sendo
submetido a um dado tratamento. Como exemplo podemos citar o trabalho de
Palermo-Neto et al. (2003), no qual um camundongo foi exposto a choques nas
patas e um outro, em uma câmara adjacente, apenas observava este procedimento
(portanto tendo contato visual, auditivo e olfativo com aquele submetido aos
choques). O interessante deste trabalho é que tanto os animais que receberam os
choques quanto os animais que presenciavam a aplicação do estímulo aversivo
apresentaram aumento nos níveis de ansiedade, medidos pelo campo aberto e
labirinto em cruz-elevado, uma diminuição na resposta imune inata e menor
resistência ao crescimento do TAE. Além deste trabalho, podemos citar também o
de Langford et al. (2006) no qual os autores descrevem um aumento do
comportamento associado à dor em animais que visualizam seus respectivos
companheiros sendo submetidos ao mesmo ou outro tratamento de dor. Em
conjunto, estes resultados sugerem que tanto estresses físicos quanto psicológicos
são capazes de alterar parâmetros comportamentais e imunes. Mais ainda, estas
observações sugerem que, de fato, existe uma intercomunicação entre diferentes
animais capaz de interferir na fisiologia de cada um deles, em modelos que, até
certo ponto, se aproximam de uma situação humana de “caregiving”.
Diante disso, não é surpreendente o observado por Morgulis et al. (2004), que
Discussão
77
o convívio com animais portadores do TAE é capaz de induzir alterações
comportamentais indicativas de ansiedade e, associados a estas, leucopenia e
redução na resistência ao próprio tumor de Ehrlich. Em um estudo posterior, Alves et
al. (2006), com o mesmo modelo, observaram outras alterações imunológicas como:
diminuição do burst oxidativo e intensidade de fagocitose de neutrófilos e diminuição
do burst oxidativo de macrófagos. Assim, retomando o observado por Palermo-Neto
et al. (2003) de que animais que apenas observam a aplicação de choques nas
patas de um outro animal apresentam-se ansiosos e, fazendo um paralelo com o
trabalho de Langford et al., (2006) e ainda mais com o de Morgulis et al., (2004), que
animais que convivem com um outro portador do TAE também se apresentam
ansiosos, cabem as perguntas: até que ponto um camundongo é capaz de
reconhecer um evento como agressor em um outro animal? Quais seriam as
alterações decorrentes desta percepção na fisiologia deste animal? Seriam estas
alterações equivalentes às observadas em “caregivers” humanos? Embora não
pretendendo responder definitivamente a estas questões, mas procurando ampliar a
aplicabilidade do modelo descrito por Morgulis et al. (2004), estudamos alterações
de comportamento e do sistema imune induzidas pelo convívio com portador de um
outro tumor, o melanoma B16F10, em animais de outra linhagem, os camundongos
C57Bl/6.
Desta forma, os experimentos iniciais foram no intuito de caracterizar as
alterações comportamentais, se é que estas existiam, após o convívio por 20 dias
com um parceiro portador do melanoma B16F10. Para discutirmos melhor os
significados dos dados obtidos nos aparelhos de análise comportamental, faz-se
necessário compreender qual o racional existente nestes aparelhos e suas possíveis
consequências fisiológicas. Em um ambiente novo, existem duas maneiras pelas
quais os animais podem se portar, uma delas é a tendência natural de explorar este
ambiente, ou, alternativamente, os animais podem ficar imóveis (freezing). Este
último comportamento é detectado no aparelho chamado de “Campo Aberto”, como
uma diminuição do comportamento exploratório e da atividade locomotora geral dos
animais. Sendo capaz de aferir tal mudança comportamental, o Campo Aberto é
considerado um bom teste para quantificação de alguns efeitos comportamentais de
ansiedade (BELZUNG e GRIEBEL, 2001).
Em nosso estudo, porém, as análises no campo aberto indicaram que os
animais que conviveram com parceiro doente tiveram maior atividade locomotora
Discussão
78
geral. Embora aparentemente não condizente com o descrito como característico de
animais ansiosos, esta atividade locomotora aumentada pode ser decorrência de
uma maior ativação de fibras noradrenérgicas do “locus coeruleus” (JORDAN, 1998),
fenômeno também descrito em animais submetidos a estresses psicológicos
(LEVINE et al., 1990). Esta hipótese parece plausível, uma vez que no modelo do
convívio com parceiro portador do TAE foi observada uma diminuição nos níveis de
noradrenalina hipotalâmica (ALVES et al., 2006), compatível com um consumo
aumentado deste mediador, que parece, de fato ocorrer em situações de estresse,
uma vez que Glavin et al., (1983) demonstraram uma correlação inversa entre a
quantidade de noradrenalina hipotalâmica e as respostas ao agente estressor.
Já no Labirinto em Cruz-Elevado, sabe-se que animais ansiosos preferem os
braços fechados do aparelho, um comportamento que faz parte do repertório
defensivo natural dos roedores (GROSSEN e KELLEY, 1972), provavelmente por
ficarem menos expostos a possíveis predadores (BARNETT, 1956; 1958) e que tem
sido observado em diversos modelos onde animais são submetidos a tratamentos
ansiogênicos (FAGGIN e PALERMO-NETO, 1985; ADER et al., 1993, PALERMO-
NETO et al., 2003; MORGULIS et al., 2004). Confirmando esta hipótese observa-se
que drogas ansiolíticas aumentam a exploração dos braços abertos deste aparelho
(PELLOW et al., 1985). Coerentemente, em nossas neste aparelho, obtivemos
dados que apontam para uma maior ansiedade em animais que conviveram com
parceiro doente, uma vez que estes apresentam uma menor exploração e menor
número de entradas nos braços abertos.
Tendo, dentro do proposto, caracterizado o comportamento dos animais como
o de animais “ansiosos”, avaliamos a concentração de corticosterona presente no
soro, uma vez que este hormônio é abundante em situações de estresse (ELENKOV
et al., 2002) em decorrência da ativação do eixo HPA. Esta dosagem hormonal foi
realizada apenas em uma ocasião com cinco animais de cada grupo e não
observamos, no ED
20
, diferenças entre os valores médios de corticosterona presente
no soro dos animais que conviveram com parceiro doente, em relação àqueles que
não conviveram. Estes resultados não são surpreendentes, já que o modelo de
convívio com portadores do TAE foi inicialmente caracterizado como um indutor de
ansiedade comportamental independente de corticosterona (MORGULIS et al.,
2004). Além disso, poderíamos especular que o fato dos animais conviverem por
cerca de 10 dias com um companheiro portador de um tumor visível poderia ter
Discussão
79
ocasionado uma adaptação do eixo HPA (REUL e DE KLEUT, 1985; MILLER et al.,
1992) sem que ocorresse o mesmo comportamentalmente. Neste caso, em
momentos anteriores ao ED
20
talvez tivéssemos podido observar alterações na
concentração de corticosterona, já que a adaptação requer uma manutenção de
níveis hormonais elevados. Entretanto, é interessante notar que no modelo do
convívio com parceiro portador do TAE, o convívio era mantido apenas por 11 dias,
sendo este o dia de coleta do soro, e, mesmo com este período de tempo menor,
não foram observadas diferenças. Esta diferença no tempo de convívio, como
discutido previamente, é justificável pela biologia de cada tumor utilizado, uma vez
que com cerca de 11 dias o TAE já está, visivelmente comprometendo a saúde do
indivíduo, ao passo que após este período o B16F10 ainda não está suficientemente
desenvolvido.
Apesar de não apresentarem diferenças significativas no valor médio de
concentração de corticosterona, as dosagens mostraram uma diferença significativa
em sua variância, isto é, a concentração deste hormônio em cada animal analisado
do grupo CPT, quando comparado a outro animal de mesmo grupo, apresentou-se
mais uniforme do que os valores do grupo CAS. Estes resultados indicam que,
enquanto animais controles tiveram uma produção variável deste hormônio, os
animais que conviveram com portadores do melanoma B16F10 tiveram
concentrações mais uniformemente distribuídas. Uma possível explicação, ainda
especulativa, para essa menor variação entre os indivíduos que compõe o grupo
CPT, poderia ser a questão do confronto social com o parceiro (KEENEY e HOGG,
1999; KEENEY et al., 2006). Animais do grupo CAS conviveram durante todo o
período de 20 dias com outro animal saudável e, portanto, tiveram de competir com
este animal. Por outro lado, animais do grupo CPT poderiam ter se habituado a
conviver com um animal doente cuja capacidade locomotora poderia estar
prejudicada. Isto é, o desenvolvimento do melanoma B16F10 prejudicaria a
movimentação e alteraria o comportamento do animal de tal forma, que apresentaria
menos desafios para o seu parceiro. Esta teoria esbarra no fato de que ambos
animais tinham acesso ad libidum tanto à comida quanto à bebida, ou seja, os
companheiros de gaiola não tinham, a princípio o que disputarem.
Outra possibilidade, ainda especulativa para os valores de corticosterona é
que os animais do grupo CPT apresentavam, no ED
20
um valor máximo de
concentração de corticosterona sendo este nível mantido e, por isso apresentaram
Discussão
80
menor variância entre as amostras, já para os animais do grupo CAS a variação
deste hormônio pode ser reflexo de variações no momento do ritmo circadiano que
cada animal se encontrava na hora da coleta. Isto porque o material foi extraído no
período de maior concentração sérica de corticosterona, no entanto, para o grupo
controle, alguns animais já haviam, de fato, apresentado este pico de produção
enquanto que outro ainda não, os animais experimentais, porém apresentavam uma
produção já mais elevada e, por isso, tendo menos variações de acordo com este
ciclo diário. Novamente, existe um problema nesta hipótese, caso os animais do
grupo CPT apresentem um valor constante e máximo, para que os animais do grupo
CAS apresentem um valor médio igual ao dos animais CPT, mas com variação
diferente, teríamos de pressupor que alguns dos animais controles possuem, no
ED
20
, um valor superior ao máximo presente no soro dos animais CPT.
Devemos levar em conta também que, além dos glucocorticóides, outros
hormônios oriundos da ativação do eixo HPA ou não (ex: DHEA, GH, CRH, PRL)
também poderiam estar envolvidos em alterações imunes (KELLEY, 1989; DAYNES
et al., 1990; SINGH et al., 1990; BERNTON et al., 1991; CHROUSOS e GOLD,
1992), e atuar na habituação do eixo HPA, o que poderia acarretar a manutenção
dos níveis de corticosterona observados.
Passamos então para a avaliação fenotípica das células apresentadoras de
antígenos presentes no baço e nos linfonodos dos animais, uma vez que, o
desencadeamento de uma resposta imune adquirida está intimamente
correlacionado não só com a presença destas células, mas também com o estado
de ativação em que se encontram (STEINMAN e BANCHEREAU, 2007).
Neste contexto, analisamos, nas células provenientes dos órgãos linfóides
dos animais de ambos os grupos, a expressão da integrina CD11c e da molécula de
MHC de classe II (IAb), uma vez que a expressão destes dois marcadores na
membrana celular, as classifica, em camundongos, como células dendríticas (INABA
et al., 1997). Esta última molécula, a IAb, é de particular interesse, uma vez que a
sua expressão, em C57Bl/6 já foi descrito um aumento na expressão de moléculas
do complexo do MHC por células de microglia após eventos estressantes (FRANK et
al. 2006), por um mecanismo aparentemente independente de glicocorticóides (LI et
al., 2007). No entanto, as células esplênicas dos animais do grupo CPT não
apresentaram diferenças significantes na expressão de CD11c e de IAb quando
comparadas ao nível de expressão das células dos animais do grupo CAS.
Discussão
81
Analisamos também a expressão das moléculas co-estimuladoras CD80 e
CD86, tendo em vista a importância destas na apresentação antigênica (MONDINO
e JENKINS, 1994). Após análise dos resultados, notamos que eventos distintos
ocorrem no linfonodo e no baço. Nos linfonodos dos animais que conviveram com
parceiro doente constatamos uma manutenção no número de células positivas e no
nível de expressão de CD80 e de CD86, em relação aos animais controle; ao passo
que, no baço destes mesmos animais foi possível observar um aumento na
expressão de CD80, quer seja pelas células aderentes totais como pelas células
CD11c
+
subdivididas de acordo com o nível de expressão (CD11c
low
ou CD11c
high
).
Constatamos também que este aumento no nível de expressão de CD80 também foi
detectado em células do baço CD11c
+
purificadas por esferas imunomagnéticas,
evidenciando que este fenômeno se dá, não somente na população global de
células esplênicas, como também na subpopulação CD11c
+
.
Vale ressaltar que estas análises demonstraram variação na expressão da
molécula co-estimuladora CD80, enquanto que a expressão da CD86 pouco se
alterou. Vale lembrar que as moléculas da família B7, dentre as quais a B7.1 (CD80)
e a B7.2 (CD86), são importantes reguladoras da apresentação de antígenos, que
apresentam características de expressão diferentes. Por exemplo, a molécula CD80
tem sua expressão aumentada em APCs em resposta a estímulos de maturação
enquanto que a CD86 é expressa constitutivamente em níveis baixos e, após
estimulação da células, há um aumento rápido e transitório de sua expressão
(GREENWALD et al., 2005). A função destas moléculas, enquanto acessórias à
apresentação antigênica, está, corriqueiramente associada à ativação de linfócitos T,
por intermédio da ligação com o CD28, apesar disto, muito se tem dito a respeito da
inibição de linfócitos T, mediada principalmente pela interação entre estas moléculas
com a molécula “cytotoxic T-lymphocyte antigen” (CTLA)-4. (KEIR e SHARPE,
2005). No entanto, o papel de cada uma destas moléculas na interação com os
diversos ligantes e as conseqüências desta interação ainda é controverso. Por
exemplo, o tratamento de camundongos não-obesos diabéticos (NOD) com anti-
CD86 preveniu o estabelecimento da doença enquanto que o uso de anti-CD80
potencializou os efeitos da doença. Por outro lado, foi possível observar o oposto no
tratamento da encefalomielite aguda experimental (EAE), isto é, o uso de anti-CD80
diminuiu a progressão da doença ao passo que o anti-CD86 a exacerbou (SUBUDHI
et al., 2005). Apesar desta controvérsia acerca dos resultados da interação com
Discussão
82
estas moléculas co-estimuladoras, é evidente que a expressão diferencial destas
moléculas pode modificar o processo de apresentação antigênica e a resposta de
linfócitos T, fenômeno que, a julgar por nossas observações, poderia ocorrer nos
animais submetidos ao convívio com parceiro doente.
Outro resultado interessante foi a expressão diferenciada destes marcadores
nos diferentes órgãos linfóides analisados – linfonodos e baço. Interessante, mas
não surpreendente, uma vez que este fenômeno já foi observado por Xu et al. (2000)
em um modelo de EAE, em ratos, sendo que, associado à maior freqüência de
células CD80
+
e CD86
+
no baço houve um aumento na produção de óxido nítrico
(NO) neste ambiente. Esta possibilidade de que existe um aumento de moléculas co-
estimuladoras, associado a uma maior produção de NO é bastante intrigante, uma
vez que, o NO é capaz de promover apoptose de linfócitos T (WILLIANS et al., 1998)
e também inibir sua proliferação (LIEW, 1995) indicando que, de fato, esta
expressão diferencial acarreta em resoluções diferentes na ativação ou inibição e até
mesmo na sobrevivência de linfócitos após o contato com as APCs.
Esta regulação na expressão das moléculas co-estimuladoras de acordo com
o local analisado deve ser compatível com efeitos diversos do SNC sobre os
diferentes órgãos, uma vez que a inervação nestes órgãos linfóides é, de fato,
diferente (MADDEN e FELTEN, 1995; MIGNINI et al., 2003). Enquanto o baço é
inervado praticamente por fibras da via simpática, os linfonodos possuem
distribuição semelhante de inervação simpática e parassimpática (ELENKOV et al.,
2000).
Em conjunto, os dados obtidos quanto à expressão dos marcadores
analisados (IAb, CD11c, CD80 e CD86) levam a um panorama indicativo de que as
células dos animais do grupo CPT parecem possuir uma maior capacidade de iniciar
uma resposta imune, mesmo sem que nenhum estímulo “externo” tenha sido
fornecido (indicado pelo aumento da expressão da molécula co-estimuladora CD80).
Assim, ainda que muito especulativamente, poderíamos sugerir que algumas das
correlações existentes entre situações de estresse e o desenvolvimento de doenças
auto-imunes (WARD et al., 2002) poderiam ser reflexo de uma maior ativação de
células apresentadoras de antígenos que, apresentando antígenos próprios
poderiam quebrar estados prévios de tolerância.
Poderíamos também interpretar que a diferença na expressão de moléculas
co-estimuladoras apresentada pelas células dos animais do grupo CPT poderia ser
Discussão
83
decorrente da expressão diferencial destas moléculas já nos precursores de medula
óssea, bem como alteração no processo de diferenciação destes precursores em
DCs, uma vez que tanto glicocorticoides (PIEMONTI et al., 1999; MATYSZACK et
al., 2000; MAESTRONI et al., 2002) quanto catecolaminas (TABAROWSKY et al.,
1996) parecem influenciar in vitro a diferenciação de DCs a partir de precursores de
medula óssea. Para verificar esta hipótese, coletamos a medula óssea de animais
de ambos os grupos e cultivamos em meio de diferenciação contendo GM-CSF.
Os resultados obtidos nestes experimentos indicaram que os precursores de
MO dos animais que conviveram com parceiro doente não apresentaram diferenças
significantes quando comparadas aos dos animais controle, no entanto, após a
cultura em meio suplementado com IL-4 e GM-CSF, houve um aumento na
quantidade de células expressando a molécula CD86 de ambos os grupos,
sugerindo a diferenciação dos precursores presentes na MO. Por outro lado, para a
molécula CD80 houve um aumento na quantidade de células positivas no grupo
controle (mais um indicativo desta diferenciação), mas uma diminuição significativa
nas células do grupo CPT, que pode ser interpretada como uma deficiência de
diferenciação dos precursores em células dendríticas. Mais ainda, notamos que,
enquanto em culturas de células de animais CAS, é visível o aparecimento na
cultura, de uma população CD86
+
CD80
high
após o estímulo com lipopolissacarídeo
(LPS) bacteriano, em culturas de células de animais CPT esta população não foi
detectada. Esta diminuição na expressão de moléculas co-estimuladoras observada
na diferenciação em DCs é um fenômeno normalmente associado à presença e
ação de glicocorticóides (PIEMONTI et al., 1999; MATYSZACK et al., 2000;
MAESTRONI, 2002), que, no entanto, no dia da coleta da medula óssea (ED
20
) não
foi observada em nossos animais. Isto suscita a possibilidade de que o modelo do
convívio com parceiro doente seja capaz de influenciar a diferenciação de células
dendríticas de uma maneira independente da liberação de glicocorticóides.
Uma das possibilidades para explicar o observado seria a ativação do SNA
que culmina no aumento de NE, também na medula óssea, que possui inervação
autônoma e, portanto estando sujeita a sua regulação (TABAROWSKY et al., 1996).
Embora o processo de diferenciação tenha sido realizado in vitro já foi demonstrado
que uma rápida exposição dos precursores à NE, já é um estímulo suficientemente
capaz de alterar a diferenciação de DCs, fazendo com que as células resultantes
produzam menores concentrações de IL-12 e maiores de IL-10 em resposta à
Discussão
84
estímulos como o LPS e KLH (“keyhole lympet hemocyanin”) ou a ligação pelo CD40
(MAESTRONI, 2002) ou seja, adquiram um perfil de menor ativação, condizente com
o esperado para uma menor expressão de moléculas co-estimuladoras.
Outra forma de explicarmos esta alteração no processo de diferenciação seria
a diferente sensibilidade dos precursores às citocinas adicionadas para
diferenciação celular. Apesar de ainda não haver consenso quanto às citocinas e
nem à quantidade de cada uma para a diferenciação em células dendríticas, parece
ser necessária a utilização tanto do GM-CSF quanto da IL-4. Assim sendo,
poderíamos especular que a diferenciação apresentada por animais submetidos ao
convívio com parceiro doente pode ter sido reflexo de uma menor expressão de
receptores para IL-4, fato que já foi observado em células após tratamento com
corticosteróides (SO et al., 2002). Podemos também sugerir que a diferença
fenotipica encontrada nas células derivadas de precursores de medula óssea dos
animais do grupo CPT, ao final dos sete dias em cultura pudesse ser decorrente de
diferenças na ativação destas células pelo estímulo, o LPS. Diante disto, o TLR4 (do
inglês toll-like receptor 4), um reconhecido receptor para estímulos como o LPS
(TAKEUCHI et al., 1997), poderia ter a sua expressão alterada nas células
diferenciadas in vitro. Neste sentido Zhang e Daynes (2007) demonstram que a
diferenciação de macrófagos a partir de precursores de medula óssea, na presença
de GCs, leva à maior expressão de TLR4 associada a uma superexpressão de
citocinas pró-inflamatórias. Além do mais, estresses psicológicos já foram
demonstrados também como capazes de induzirem à maior expressão de TLR4 por
macrófagos esplênicos (BAILEY et al., 2007). Apesar destes trabalhos apontarem
para uma situação na qual o estresse, via modulação por GCs, é capaz de aumentar
a expressão de receptores do tipo toll e, consequentemente exacerbar uma
resposta, o observado no presente trabalho não corrobora essas observações, pois
notamos que as DCs que se diferenciaram dos precursores oriundos de animais que
conviveram com portador de tumor apresentaram uma menor expressão da
molécula coestimuladora CD80, fato que poderia se considerado como indicador de
uma menor atividade linfoestimuladora por estas células. De qualquer forma, é
preciso notar que estas alterações foram descritas como acontecendo na prsença de
níveis elevados de GC, o que não observamos em nosso modelo.
Após estes experimentos de fenotipagem de células presentes nos baços,
nos linfonodos e daquelas diferenciadas in vitro, realizamos ensaios in vivo para
Discussão
85
avaliarmos se as diferenças encontradas poderiam se refletir no curso de uma
resposta imune. Para tanto, optamos por um ensaio de hipersensibilidade tardia
(DTH) frente a um estímulo antigênico, a ovalbumina, e por um ensaio de
crescimento do tumor B16F10.
Nos experimentos de DTH, os resultados apontaram para um caráter
imunossupressor do convívio com parceiro portador do melanoma B16F10, pois,
após 48 horas do desafio antigênico, as patas dos animais que conviveram com
parceiro doente não apresentaram nenhum aumento de volume ao passo que as
patas dos animais controle demonstravam um aumento significativo, sugerindo a
possibilidade de existência de uma resposta imune, com migração celular, nos
animais do grupo CAS, que estava ausente nos CPT, mesmo considerando que a
intensidade da reação observada foi inferior ao usualmente descrito na literatura
(JACYSYN et al., 2001). Embora esta baixa intensidade possa indicar que a
resposta observada não se caracteriza perfeitamente como uma reação de DTH
típica, sua reprodutibilidade, por sua vez, indica que se trata de fenômeno real e não
de um artefato de um único experimento. É interessante notar que, apesar desta
falha no estabelecimento de DTH após eventos psicológicos já ter sido observada,
tanto em camundongos (BASSO et al., 1994) quanto em humanos (SMITH et al.,
2004), existem outros autores que demonstram que, após estresses agudos existe
um aumento na geração de uma resposta migratória de leucócitos, acarretando uma
melhora na DTH e que este fenômeno é dependente da adrenal, uma vez que a sua
remoção elimina esta melhora na resposta (DHABHAR e McEWEN, 1999).
Uma explicação que se poderia aventar para esta diferença após 48 horas,
seria a de uma extensão da resposta inflamatória inicial nos animais do grupo CPT.
Esta diferença seria compatível com alguns dados da literatura, que dizem que
estresses crônicos podem também ter efeitos imunossupressores em eventos
inflamatórios iniciais (DHABHAR & McEWEN, 1997; PARIANTE et al., 1997;
ZORRILA et al., 2001). Além disso, o modelo de convívio com parceiro portador de
TAE foi capaz de diminuir a atividade de células envolvidas no processo inflamatório,
como os neutrófilos (ALVES et al., 2006) e, portanto poderíamos esperar que a
reação inflamatória pudesse estar debilitada. Porém, esta explicação não se
sustenta, uma vez que a espessura da pata destes animais após uma e seis horas
era de mesma magnitude que a dos animais controle, também em experimentos
independentes. Assim, a visão em conjunto destes dados sugere que, mesmo tendo
Discussão
86
um processo inflamatório visualmente semelhante, os animais CPT não foram
capazes de estabelecer uma resposta à OVA equivalente à dos animais CAS.
Para avaliar se a alteração observada quanto à espessura das patas era
decorrente de modificações no processo de apresentação antigênica realizamos
ensaios de proliferação in vitro com as células dos mesmos animais utilizados para o
ensaio de DTH. Observamos que tanto os linfócitos dos animais controle como os
dos que conviveram com parceiro doente foram capazes de proliferar, com
intensidade semelhante, após quatro dias de co-cultura com células aderentes de
baço, pulsadas com OVA. No entanto, a proliferação das células dos CPT foi
acompanhada por uma elevada concentração de IL-10 no sobrenadante das
culturas, enquanto nas culturas de células dos animais CAS, não foi detectada esta
citocina. Além disso, pudemos observar que após três dias desta primeira análise
(ou seja, uma co-cultura de sete dias) as células dos animais do grupo CPT
cessaram a proliferação, ao passo que as dos controles continuaram.
Nestes experimentos, sempre foram co-cultivadas as células de um mesmo
grupo, isto é, células apresentadoras de animais do grupo CPT com linfócitos de
animais do grupo CPT, sendo o mesmo válido para as co-culturas dos animais do
grupo CAS. Desta forma, embora tenhamos mostrado diferenças na proliferação
celular e na produção de IL-10, não podemos inferir, por estes experimentos, se
estas alterações foram decorrentes de diferenças nas células apresentadoras ou nos
linfócitos dos animais que conviveram com portador de tumor, uma vez que ambos
os tipos celulares podem ser modulados após um evento estressor (BAUER et al.,
2000; AVITSUR et al., 2002; KINSEY et al., 2007).
Todavia, nestes ensaios de DTH realizados, um erro metodológico
fundamental ocorreu - a emulsão do adjuvante completo de Freund não foi realizada
de maneira eficiente. Este erro certamente comprometeu a indução de resposta
frente ao estimulo antigênico. Ao notarmos este erro, refizemos o experimento de
modo apropriado e, desta feita, observamos resposta mais intensa à OVA, mas não
pudemos constatar diferenças do aumento de pata em nenhum dos momentos
analisados. No entanto, estes resultados são de apenas uma repetição com número
amostral baixo e, portanto têm de ser analisados com cautela. Mesmo assim,
podemos especular que as diferenças observadas nos primeiros experimentos de
DTH tenham aparecido exatamente pela falta de emulsificação. Isto é, no segundo
momento, em que a emulsificação ocorreu, o estímulo foi maior que as alterações
Discussão
87
proporcionadas por um agente sutil como o convívio com parceiro doente e, desta
forma camuflando qualquer interferência que este tinha no estabelecimento da DTH.
Finalmente, embora tenhamos constatado que o convívio com parceiro
doente pareça alterar o estabelecimento de uma resposta imune, isto não modificou
o crescimento do melanoma B16F10 nos animais. É interessante notar que no
modelo original, de convívio com parceiro portador do TAE, os animais estressados
apresentaram maior susceptibilidade ao desenvolvimento deste mesmo tumor
(MORGULIS et al., 2004). Esta diferença entre o TAE e o melanoma poderia ser
decorrente da relação dos dois tumores com o sistema imune. Por exemplo, o TAE é
uma linhagem suscetível aos neutrófilos (BERGAMI-SANTOS et al., 2004), cuja
função está alterada nos animais que convivem com portadores do TAE (ALVES et
al, 2006), enquanto estas células não parecem estar envolvidas na resistência ao
melanoma B16F10 (SA-ROCHA et al., 2006).
Em suma, demonstramos que o modelo inicialmente descrito por Morgulis et
al. em 2004 e investigado por Alves et al. (2006), no qual os autores utilizam
camundongos Swiss, portadores do tumor ascítico de Ehrlich para induzirem em
companheiros de mesma linhagem e sadios, alterações comportamentais e
fisiológicas e que os autores, muito cautelosamente, comparam com situações de
caregiving em humanos, pôde ser adaptado para camundongos da linhagem
C57Bl/6 com o melanoma B16F10. São inegáveis, no entanto, as perguntas que
este trabalho levanta, quer estas sejam acerca do modelo propriamente dito, isto é:
como ocorre exatamente a interação entre os animais na gaiola? O animal de fato
possui algo semelhante à empatia e prefere a companhia de seu companheiro? Qual
o estímulo sensorial que leva às alterações fisiológicas? Quer seja a respeito das
alterações imunológicas aqui descritas. Mas afinal, qual trabalho científico não tem,
como objetivo principal, mesmo que subliminar, essa capacidade de abrir novas
questões?
Conclusões
88
6 CONCLUSÔES
Os resultados obtidos mostram que o convívio com parceiro portador do
melanoma B16F10:
- alterou significantivamente o comportamento dos animais 1) aumentando a
atividade locomotória geral, medida no campo aberto e o tempo em exploração dos
braços fechados do labirinto em cruz e 2) diminuindo o tempo em exploração e
número de entradas nos braços abertos do labirinto em cruz-elevado;
- aumentou significativamente a expressão da molécula co-estimuladora CD80, mas
não a expressão da molécula CD86 pelas células apresentadoras de antigeno
(MHCII
+
) presentes no baço destes animais, mas não nas presentes nos linfonodos
dos mesmos;
- diminuiu a quantidade de células CD80
+
por células diferenciadas in vitro a partir de
precursores de medula óssea mantidas por sete dias em meio contendo GM-CSF e
IL-4 e ativadas com LPS por 48horas;
- diminuiu a resposta cutânea à ovalbumina, fenômeno que esteve associado à
maior proliferação de uma subpopulação linfocitária aparentemente produtora de IL-
10;
- não interferiu no estabelecimento do melanoma B16F10.
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