ads:
-1-
Dayseanne Araujo Falcão
DEFICIÊNCIAS CONCOMITANTES DA
PROTEÍNA REGULADORA FATOR H E DO
COMPONENTE C9 DO COMPLEMENTO
-São Paulo-
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
-2-
Dayseanne Araujo Falcão
DEFICIÊNCIAS CONCOMITANTES DA
PROTEÍNA REGULADORA FATOR H E DO
COMPONENTE C9 DO COMPLEMENTO
Tese apresentada ao
Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para obtenção de
Título de Doutor em Ciências (Imunologia).
-São Paulo-
2007
ads:
-3-
Dayseanne Araujo Falcão
DEFICIÊNCIAS CONCOMITANTES DA
PROTEÍNA REGULADORA FATOR H E DO
COMPONENTE C9 DO COMPLEMENTO
Tese apresentada ao
Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para obtenção de
Título de Doutor em Ciências (Imunologia).
Área de concentração:
Imunologia
Orientadora:
Prof. Dra. Lourdes Isaac
-São Paulo-
2007
-4-
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
Candidato(a): Dayseanne Araujo Falcão.
Tese: Deficiências concomitantes da proteína reguladora Fator H e do
componente C9 do complemento.
Orientador(a): Lourdes Isaac.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão pública
realizada a ........../........../.........., considerou
( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a) Assinatura ........................................................................................................
Nome ...............................................................................................................
Instituição ........................................................................................................
Examinador(a) Assinatura ........................................................................................................
Nome ...............................................................................................................
Instituição ........................................................................................................
Examinador(a) Assinatura ........................................................................................................
Nome ...............................................................................................................
Instituição ........................................................................................................
Examinador(a) Assinatura ........................................................................................................
Nome ...............................................................................................................
Instituição ........................................................................................................
Presidente Assinatura ........................................................................................................
Nome ...............................................................................................................
Instituição ........................................................................................................
-5-
A Tese de Doutorado intitulada “Deficiências Concomitantes da Proteína Reguladora
Fator H e do Componente C9 do Complemento” foi desenvolvida no Laboratório de
Complemento do Departamento de Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, com auxílio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo (FAPESP) e do Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento
(CNPq).
-São Paulo-
2007
-6-
Ao meu Deus
Ao meu DeusAo meu Deus
Ao meu Deus
Porque sem ELE eu sequer seria.
Aos meus pais, Ruth e Nicodemos
Aos meus pais, Ruth e NicodemosAos meus pais, Ruth e Nicodemos
Aos meus pais, Ruth e Nicodemos
Porque diante da grandeza de vocês as palavras são
infinitamente pobres, as expressões insuficientes e os gestos
absolutamente dispensáveis. Juntos, as palavras, as expressões
e os gestos silenciam, enquanto o exemplo de vida dado por vocês
anuncia ao mundo o quanto sou abençoada por tê-los como pais.
-7-
Agradecimentos
À Dra. Lourdes Isaac. Os anos ainda por vir da minha vida serão insuficientes para te
retribuir tanta confiança, tanta dedicação, tanto apoio, a fim de que este grande dia chegasse.
Muito mais do que orientadora e profissional exemplar você foi companheira, mãe e amiga.
Nos momentos mais difíceis você sempre esteve lá, sempre! Lou, muito obrigada por tanto,
tanto, tanto...
Ao Dr. Shaker Chuck Farah do Departamento de Bioquímica da USP por ser sempre
alguém com quem pudemos contar em tantas dificuldades enfrentadas.
À Dra. Anete Grumach do Departamento de Dermatologia do Hospital das Clínicas,
pelo encaminhamento do paciente e pela indispensável colaboração na obtenção de amostras
e dados.
Aos Drs. José Alexandre Barbuto do Departamento de Imunologia da USP, Marcelo
De Franco da Imunogenética do Instituto Butantã e Beatriz Carvalho da UNIFESP, pela
análise e sugestões promovidas durante o exame de Qualificação, sempre acompanhadas de
muito carinho, respeito e valorização deste trabalho. Muito obrigada, professores!
À Dra. Ises Abrahamson do Departamento de Imunologia da USP, por ter recebido
de braços abertos em seu laboratório uma sergipana sem eira nem beira. Um dia você me
deu um voto de confiança e, por isso, aqui estou. Obrigada, professora!
Às Dras. Gláucia Machado Santelli e Patrícia Gama pela paciência e inestimável
colaboração na obtenção das imagens por microscopia confocal e fluorescência. A Luciana,
por ter sempre tido tanta boa vontade e simpatia ao nos receber nesses momentos de
captação de imagens.
A minha amada vovó Gláucia por uma vida de completa dedicação à família que
construiu com tanto amor e competência. Aos meus amados irmãos, Nicodemos Jr., Delman,
-8-
Neander, Miguel, Rejane e Bruno, pelo amor incondicional e por estarem sempre ao meu
redor tentando remover as pedras que insistem em aparecer no meu caminho. As minhas tão
queridas cunhadas, Sileide (Dão), Laura (Lídia) e Fabiana (Sabi) e Kátia (Kascas), porque
vocês não têm idéia do quanto o amor de vocês me faz andar a segunda milha vida a fora. As
minhas vidas, meus amados sobrinhos Sarah (Sassá, meu catatau), Nicole (Saborosa), Ester
(Téca) e Yan (Zanzo), por serem sempre uma excelente razão pra voltar pra casa. Amo todos
vocês!
Ao meu namorado, José Antônio, pelas tantas horas de companheirismo no
laboratório, pelas sugestões, apoio e auxílio quando tentamos tantas vezes vencer os desafios
diários da ciência. Mas mais ainda, por tanta cumplicidade, carinho e compreensão que me
fazem sentir tão especial e tornam a minha vida muito mais completa e feliz.
Aos demais membros da minha enorme família, amados tios, tias e primos
(especialmente Jardelzinho, Fuca, Cecéu, Nana, Éden), por serem uma parte tão importante
de mim, por me amarem e protegerem desde o dia em que nasci e pela torcida e apoio pra
que este grande dia chegasse. Amo todos vocês!
A amada Marlene, por tantos abraços carinhosos, pelos conselhos, por tanta paciência
e compreensão, por não medir esforços para ajudar nas atividades do laboratório, por sempre
colocar amor em tudo que faz, mesmo que seja um simples sorriso. Má, sem você a
caminhada teria sido insuportável. Obrigada por você ter estado ao meu lado todo o tempo!
À amiga irmã, Edimara, por estar sempre pronta a dividir seus vastos conhecimentos,
sua experiência, por nunca ter medido esforços pra me ajudar, estando em São Paulo ou em
Cincinnati, e principalmente por ser amiga em todos os sentidos da palavra. Di, sem você eu
não teria chegado até aqui.
Às irmãs caçulas Mariane, Bel e Lorena, pela ajuda inestimável na construção desse
trabalho, e principalmente por sempre me darem uma razão para sorrir durante o trabalho,
mesmo naqueles dias em que todos os experimentos dão errado.
-9-
A Simone Bernardino, por ter sido a primeira pessoa a me oferecer amizade em São
Paulo e por ter me dado tanto apoio num dos momentos mais difíceis da minha vida. Si,
jamais vou esquecer! Obrigada por tanto carinho.
A Roseane Costa, por tanto carinho e por ter me suportado nos bons e maus dias.
Obrigada pela amizade tão carinhosa, Rose!
Aos demais companheiros de laboratório, Fábio, Alda e Priscilia, pela ajuda preciosa
nos mais diversos momentos, e aos companheiros que já não estão mais conosco, mas cuja
ajuda foi da mesma forma inestimável, Danielle Paixão, Maria Amélia, Benício, Raphael,
Vítor e Carol.
Às secretárias Jotelma, Valéria e Eny, por pacientemente nos socorrerem pelos
caminhos da burocracia.
Aos queridos funcionários da portaria, principalmente Milton, Otacílio e Nélson,
segurança, limpeza, áudio-visual e biblioteca por estarem sempre prontos a fazer a parte de
vocês com tanta dedicação o que facilita imensamente a conclusão da nossa parte. Obrigada,
pessoal!
À FAPESP e ao CNPq, pelo suporte financeiro para a realização deste trabalho.
-10-
RESUMO
FALCÃO, D.A. Deficiências concomitantes da proteína reguladora Fator H e do
componente C9 do complemento. Dissertação (Doutorado em Imunologia) – Instituto de
Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, 2007.
A deficiência completa de FH é um fenômeno raro, com apenas 22 casos descritos na
literatura até o momento, e com poucos esclarecimentos acerca dos aspectos moleculares
dessa deficiência. O componente C9 é a última proteína a ser incorporada no complexo de
ataque à membrana e sua deficiência, apesar de rara em caucasianos é de alta prevalência
entre os japoneses. Nosso paciente, um menino de aproximadamente 4 anos, é brasileiro,
mas de família descendente de japoneses e com histórico de consagüinidade. Ele apresenta
deficiência das duas proteínas, FH e C9, cujos aspectos clínicos e moleculares são descritos
e avaliados neste trabalho.
O paciente apresentou episódios recorrentes e graves de pneumonia. Ensaios de
imunodifusão radial e ELISA determinaram níveis reduzidos de FH (faixa normal em
crianças de em crianças de 1 a 5 anos: 233 a 1319 µg/ml e em adultos: 241 a 758 µg/ml
[Ferreira de Paula et al, 2003]) no soro do paciente (16,8 µg/ml) e no de seus familiares. O
componente C3 e o Fator B (FB) também estavam reduzidos no soro do paciente (abaixo do
limite de detecção do método e <57 µg/ml, respectivamente) e no de sua mãe (382, 6 µg/ml
e 62,4 µg/ml, respectivamente), mas normal nos soros do pai e da irmã. Através do método
de Western Blot observamos a completa ausência das proteínas de 150 kDa (FH) e de 42
kDa (FHL-1) no soro do paciente, mas a presença de outras proteínas antigenicamente
relacionadas a ele, como, FHR-1β (42 kDa) e FHR-1α (37 kDa). Nos soros de seus pais
todas as proteínas estavam presentes. Apesar de termos detectado concentrações normais dos
componentes C5-C8, participantes da via terminal, no soro do paciente, a presença de C9
não pôde ser detectada. Assim, usando o Western Blot pudemos observar a presença do
-11-
componente C9 (70 kDa) no soro do paciente, mas em intensidade muito reduzida quando
comparada à encontrada no soro controle. Esta observação reduz a possibilidade de um stop
códon prematuro como causa da deficiência de C9 neste paciente. Utilizando o método de
RT-PCR nós amplificamos diversos fragmentos do cDNA de FH do paciente e, em seguida,
os seqüenciamos. Foi detectada a substituição homozigota de um nucleotídeo na posição 453
(G453A), levando à substituição de uma Arg por uma His na posição 127. Esta mesma
mutação foi encontrada na mãe do paciente e também na forma homozigota e deve alterar a
estrutura secundária da proteína e/ou afetar seu perfil de secreção. Através da técnica de
PCR amplificamos todos os éxons do DNA genômico de C9 do paciente e os seqüenciamos.
Foi observado que o paciente não tem a mutação localizada na posição da Arg95 no éxon 4 e
que é considerada como a principal causa da deficiência de C9 entre os japoneses. Assim, o
paciente tem ausência completa da proteína reguladora FH, mas dispõe de outros membros
da família de proteínas do FH. Ele apresenta uma alteração molecular que leva à codificação
de uma His na posição 127 ao invés da Arg na proteína, causando transtornos à secreção
desta proteína pelas células do paciente, uma vez que detectamos a produção desta proteína
nos fibroblastos do paciente por microscopia confocal. O C9 não está completamente
ausente, mas presente em concentrações muito reduzidas em comparação com o controle
normal. Entretanto, o paciente não tem a mutação comumente associada com a deficiência
desta proteína entre os japoneses e nenhuma mutação que pudesse explicar a deficiência
desta proteína pôde ser encontrada. Este paciente é o primeiro caso de deficiência de FH
descrita em uma família brasileira e, até onde temos conhecimento, o único caso no mundo
de deficiência concomitante entre a proteína reguladora FH e o componente C9.
PALAVRAS-CHAVES: Complemento. Imunologia. Fator H. C9. Imunodeficiências.
-12-
ABSTRACT
FALCÃO, D.A. Concomitant deficiencies of complement Factor H regulatory protein
and C9 component. Doctor thesis (Immunology) – Instituto de Ciências Biomédicas,
Universidade de São Paulo, 2007.
Complete Factor (F) H deficiency e rare, with only 22 cases described so far and little
is known concerning its molecular basis. C9 component is the last one to be incorporated
into the Membrane Attack Complex (MAC) and its deficiency, while rare in Caucasians is
quite prevalent in Japanese population. The proband, a 9 years old boy, is Brazilian with a
Japanese descent and history of consanguinity. He presents both, FH and C9 deficiency
(C9D), and here we describe its clinical aspects and molecular basis.
The patient presented with severe and recurrent pneumonia. Radial Immunodiffusion
and ELISA assays showed low levels of FH (1 to 5 years old normal range: 233 a 1319
µg/ml and adults: 241 a 758 µg/ml [Ferreira de Paula et al, 2003]) in patient’s (16,8 µg/ml)
and his family sera. C3 and Factor B (FB) were also present at low levels in patient’s
(undetectable) and his mother sera (382, 6 µg/ml e 62,4 µg/ml, respectively), while normal
in his father and sister sera. Western Blot assays showed the complete absence of the 150
kDa (FH) and the 42 kDa (FHL-1) in patient’s serum, while others antigenicaly FH related
proteins, such as FHR-1β (42 kDa) e FHR-1α (37 kDa) were present. His parent’s sera
presented all the proteins of FH protein family evaluated. While C5-C8 components,
terminal pathway components, were detected at normal levels at patient’s serum, the C9
could not bet detected. Western Blot assays showed a very ~70 KDa band (C9 size) in
patient’s serum, when compared with the normal control. This result makes unlikely a stop
codon as the probable cause of the patient’s C9D. Using RT-PCR assays we amplified
different patient’s FH cDNA fragments and sequenced them. We detected a homozygous
mutation at 453 position (G453A), encoding and His
127
Arg. The same mutation is also
-13-
homozygous in the mother and may alter the protein tertiary structure and/or affect is
secretion profile. Using PCR assays we amplified all 11 exons of patients C9 genomic DNA
and sequenced them. We detected that the patient lacks The Arg
95
, at exon 4, mutation, the
main cause of the C9D in the Japanese population. In conclusions, the patient has a complete
absence of the FH and FHL-1 regulatory proteins, but does have others members of FH
protein family. He carries a His
127
Arg mutation that may difficult FH secretion, as we could
detect FH production in patient’s fibroblast by confocal microscopy. C9 is not completely
absent, but present in very low concentrations compared with normal control. The patients
lacks the Arg
95
mutation and couldn’t detect another mutation that could be related to his
C9D. This is the first case of complete FH and C9 deficiency in a Brazilian patient and to
our knowledge the first case in the literature of a FH and C9 concomitant deficiency.
Key words: Complement. Immunology. Factor H. C9. Immunodefficiencies.
-14-
LISTA DE ABREVIATURAS
aa: aminoácido.
AP50: ensaio hemolítico da via alternativa que compara valores obtidos para 50% de lise no
soro.
BCIP: 5-bromo-4-cloro-3-indoil fosfato.
C4BP: do inglês C4b binding protein.
cDNA: DNA complementar.
C: Complemento.
C1-In: Inibidor de C1
C3FNe: fator nefrítico de C3.
C4FNe: fator nefrítico de C4.
CH50: ensaio hemolítico da via clássica que compara valores obtidos para 50% de lise no
soro.
CFD: do inglês complement fixation buffer.
CPN: carboxipeptidase N.
CR1: do inglês complement receptor 1.
CR3: do inglês complement receptor 3.
CRP: Proteína-C reativa.
DAF: do inglês decay -accelerating factor.
DMEM: do inglês Dubbelco’s Modified Eagle’s Médium.
DMRI: degeneração da mácula associada à idade.
DNA: ácido desoxirribonucléico.
dNTP: desoxirribonucleotídeo trifosfato.
EDGF: do inglês Epidermal Grouwth Factor.
-15-
EGTA: ácido etileno glicol tetracético.
EtOH: etanol.
FB: Fator B.
FD: Fator D.
FH: Fator H.
FHL-1: do inglês Factor H-like 1 protein.
FHR-1/2/3/4/5: do inglês Factor H related proteins.
FI: Fator I.
GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.
GVB: do inglês gelatin veronal buffer.
HRF: do inglês homologous restriction factor.
HPN: hemoglobinúria paroxística noturna.
INF: interferon.
LPS: lipopolissacarídeo.
MAC: complexo de ataque à membrana.
Map19: do inglês mannose associated plasma protein of 19 kDa.
MASP – 1/2/3: do inglês MBL-associated serino protease.
MBL: lectina ligadora de manose.
MCP: do inglês membrane cofactor protein.
MPGN II: glomerulonefrite membranoproliferativa tipo II.
NaOAc: acetato de sódio.
NBT: tetrazólico nitroazul.
P: properdina.
PBS: do inglês phosphate buffer saline.
PCR: do inglês polymerase chain reaction.
RNA: ácido ribonucléico.
-16-
RT-PCR: do inglês reverse transcriptase – polymerase chain reaction.
SBF: soro bovino fetal.
SCR: do inglês short consensus repeat.
SDS: dodecil sulfato de sódio.
SFLT: seqüência de aminoácidos terminais She, Phe, Thr e Leu.
SHU: síndrome hemolítico-urêmica.
TBE: do inglês Tris-buffer-EDTA.
TE: do inglês Tris-EDTA.
-17-
LISTA DE FIGURAS:
Figura 1: Cascatas de ativação das vias clássica e das lectinas do complemento....................3
Figura 2: Cascata de ativação da via alternativa do complemento..........................................7
Figura 3: Representação esquemática do gene C9...................................................................9
Figura 4: Representação esquemática da estrutura do C9 e do poli (C9)..............................10
Figura 5: Representação esquemática da estrutura do FH.....................................................16
Figura 6: Representação esquemática do gene FH. O gene compreende 94 kb e 23
éxons.......................................................................................................................................15
Figura 7: Representação esquemática da inibição da via alternativa pelo FH.......................17
Figura 8: Representação esquemática da influência de superfícies ativadoras e não
ativadoras do complemento na ligação do FH ao C3b............................................................18
Figura 9: Modelo proposto para a ligação do FH a células endoteliais.................................19
Figura 10: A família Fator H.................................................................................................22
Figura 11: Seqüência de eventos que levam à lesão tecidual em pacientes com SHU e
mutações no FH......................................................................................................................42
Figura 12: Mutações descritas no gene FH e sua equivalente distribuição pelos SCRs do
Fator H....................................................................................................................................45
Figura 13: Representação esquemática dos fragmentos do cDNA de FH (3926 pb)
amplificados e posteriormente seqüenciadas..........................................................................70
Figura 14: Análise do perfil do FH, e das proteínas antigenicamente relacionadas a ele,
presentes no soro do paciente e de sua família através de Western Blotting usando anticorpo
policlonal de cabra anti-FH humano.......................................................................................84
Figura 15: Análise do perfil do FH e do FHL-1 presentes no soro do paciente e de sua
família através de Western Blotting utilizando anticorpo policlonal de coelho anti-SCR(1-4)
humano....................................................................................................................................86
-18-
Figura 16: Avaliação da presença de C9 no soro do paciente e de seus familiares em
comparação com o controle normal através da imunodifusão dupla......................................89
Figura 17: Análise do perfil do C9 presente no soro do paciente e de sua família através de
Western Blotting utilizando anticorpo policlonal de cabra anti-C9 humano como
primário...................................................................................................................................92
Figura 18: Análise de fragmentos do cDNA de FH do paciente e de um controle normal
amplificados por RT-PCR......................................................................................................94
Figura 19: Alteração molecular encontrada no cDNA de FH do paciente de forma
homozigota..............................................................................................................................95
Figura 20: Alterações moleculares encontradas no cDNA de FH do
paciente........................96
Figura 21: Alteração molecular encontrada nos dois alelos do DNA genômico de FH da mãe
do
paciente................................................................................................................................97
Figura 22: Alteração molecular encontrada em um dos alelos do DNA genômico de FH do
pai do
paciente..........................................................................................................................98
Figura 23: Análise de fragmentos éxon-específicos, amplificados por PCR, do DNA de C9
do paciente em comparação com um controle
normal..............................................................99
Figura 24: Polimorfismos encontrados no DNA genômico do paciente na região do gene
C9............................................................................................................................................10
1
Figura 25: Presença de FH no citoplasma de fibroblastos observados por microscopia
confocal.................................................................................................................................103
-19-
LISTA DE TABELAS:
Tabela 1: Casos de Deficiência Hereditária de FH................................................................36
Tabela 2: Valores dos parâmetros de hemograma avaliados no paciente..............................56
Tabela 3: Concentrações das classes de imunoglobulinas encontradas no soro do
paciente...................................................................................................................................57
Tabela 4: Concentrações das subclasses de IgG encontradas no soro do paciente................57
Tabela 5: Avaliação da presença de anticorpos da classe IgM e IgG contra os agentes
etiológicos da rubéola, sarampo e AIDS.................................................................................58
Tabela 6: Avaliação das subpopulações de linfócitos encontradas no soro do
paciente...................................................................................................................................58
Tabela 7: Avaliação da resposta proliferativa dos linfócitos do paciente a determinados
mitógenos................................................................................................................................59
Tabela 8: Avaliação da produção de anticorpos anti-pneumococo pelo paciente após
administração da vacina pneumo............................................................................................59
Tabela 9: Porcentagem das Atividades Hemolíticas Dependentes das Vias Clássica e
Alternativa nos Soros do Paciente e de Sua Família...............................................................77
Tabela 10: Concentração de C3, C4, FB, FI e properdina no soro do paciente e de su
família.....................................................................................................................................79
Tabela 11: Concentração de FH nos Soros do Paciente e de Sua Família.............................82
Tabela 12: Proteínas da família FH encontradas nos soros do paciente e de seus
familiares.................................................................................................................................87
Tabela 13: Concentração de C9 nos Soros do Paciente e de Sua Família.............................90
-20-
LISTA DE QUADROS:
Quadro 1: Oligonucleotídeos utilizados em RT-PCR, PCR e seqüenciamento do cDNA de
FH...........................................................................................................................................69
Quadro 2: Oligonucleotídeos utilizados em PCR e seqüenciamento das regiões de C9 a
partir de DNA genômico.........................................................................................................72
Quadro 3: Alinhamento do FH entre espécies.....................................................................113
-21-
I_INTRODUÇÃO
A história do complemento inicia-se em 1888, quando Nutall observou que o soro de
animais normais exibia uma toxicidade espontânea contra determinados microorganismos
(SILVERSTEIN, 1989). Em 1899, Buchner identificou, em soros frescos e livres de células,
um componente termolábil capaz de provocar bacteriólise, e o chamou de “alexina” (palavra
grega que significa “sem nome”) (MORLEY & WALPORT, 2000). Ainda em 1899, Ehrlich
deu a esse componente o nome de “complemento” (SILVERSTEIN, 1989). Entretanto, o
primeiro trabalho descrevendo a fixação do complemento e seu papel quantitativo na lise de
células foi elaborado por Bordet e Gengou em 1909, rendendo a Bordet o crédito pelo
descobrimento do sistema complemento (MORLEY & WALPORT, 2000; SILVERSTEIN,
1989).
Sabe-se, hoje, que o termo complemento refere-se a um grupo complexo de
aproximadamente 30 proteínas (plasmáticas ou ligadas a membranas celulares), que, juntas,
desempenham um papel essencial no reconhecimento e eliminação de microorganismos,
remoção de imunocomplexos e células apoptóticas, bem como na inflamação (KÖHL,
2006). Por ser encontrado principalmente no soro e em outros fluidos corporais, o
complemento foi caracterizado como integrante da imunidade humoral da resposta imune
(MAYER, 1973).
O complemento é também o principal elemento da imunidade inata, sendo capaz de
participar da primeira barreira defensiva contra microorganismos invasores, através da
ativação de sua cascata enzimática, com conseqüente opsonização e lise dos
microorganismos (KÖHL, 2006).
-22-
1.1 Ativação do Sistema Complemento
1.1.1 Via Clássica
A formação do complexo antígeno-anticorpo é o primeiro passo para início da
cascata de ativação da via clássica do complemento (COLTEN, 1992). A união do antígeno
ao anticorpo acaba por expor sítios ativos na porção Fc do anticorpo, das classes IgM ou IgG
onde se liga o complexo C1, formado por uma molécula de C1q e duas de C1s e de C1r,
unidas por pontes não-covalentes dependentes de Ca
2+
(Figura 1). Ao ligar-se ao anticorpo o
C1q sofre mudanças estruturais que o tornam ativo e capaz de clivar C1r que, também uma
vez ativo, cliva o C1s.
Por meio de uma reação dependente de Mg
2+
, o C1s cliva o componente C4, em C4a
e C4b, e o componente C2, em C2a e C2b. Uma vez complexados, os fragmentos C4a e C2b
formam uma protease (C4b2a), a C3 convertase da via clássica. Esta convertase cliva o
componente C3 em C3a e C3b. Unindo-se ao complexo C4aC2b, o C3b participa da
formação da segunda enzima da via clássica, a C5 convertase (C4b2aC3b
n
). Esta enzima tem
o poder de clivar o C5 em C5a e C5b. Com a formação do fragmento C5b tem início a via
terminal, para a qual convergem todas as vias de ativação do C (JAMES, 1982).
Costuma-se associar a ativação da via clássica do complemento como um fenômeno
dependente da presença de anticorpos. Entretanto, vários estudos já mostraram que DNA,
proteína C-reativa, membranas mitocondriais e vírus são capazes de ativar diretamente a via
clássica, independentemente da presença de anticorpos (COLTEN, 1992), uma vez ligadas
diretamente ao C1q.
-23-
Figura 1: Cascatas de ativação das vias clássica e das lectinas do complemento. C1-
inh: inibidor de C1, CRP: proteína C reativa, C4BP: proteína ligante de C4b, CPN:
carboxipeptidase-N, DAF: fator de aceleração do decaimento, MAC: complexo de
ataque à membrana, MCP: proteína co-fator de membrana. Modificado a partir de
FUJITA et al, 2004 e MOLLNES et al, 2002.
a
a
Fase fluida
Membrana
Reguladores solúveis
Superfície bacteriana
Antígenos bacterianos
Carboidratos
Superfície bacteriana
V
V
i
i
a
a
C
C
l
l
á
á
s
s
s
s
i
i
c
c
a
a
V
V
i
i
a
a
d
d
a
a
s
s
L
L
e
e
c
c
t
t
i
i
n
n
a
a
s
s
Fator I
imunoglobulinas
C1 In
C1 In
Fator I
Fator I
-24-
1.1.2 Via das Lectinas
Em 1975, observou-se que proteínas encontradas nas células do fígado de mamíferos
apresentavam afinidade pela manose, semelhante à exibida pelas lectinas. Três anos depois
elas foram purificadas de extratos hepáticos de coelho e no soro de humanos, bovinos, ratos
e camundongos. Estava identificada, então, a MBL (mannose-binding lectin) (TURNER,
1996).
A MBL humana é uma lectina do tipo C que se liga a N-acetilglicosamina, D-
manose, L-fucose, glicose, e galactose (TURNER, 1996) encontradas, por exemplo, na
parede de bactérias Gram-negativas, na presença de íons cálcio (MATSUSHITA & FUJITA,
1992). A MBL é muito semelhante estrutural e funcionalmente à subunidade C1q do
complexo C1 encontrado na via clássica (ROOS et al, 2001).
Em 1987, Ikeda et al propuseram que a MBL seria capaz de ativar o complemento
por meio da via clássica (IKEDA et al, 1987). Três anos depois, dois estudos afirmaram que
a ativação ocorreria por meio da interação da MBL com o complexo C1r
2
-C1s
2
após ligação
da primeira à manose encontrada na superfície dos microorganismos (LU et al, 1990; OHTA
et al, 1990).
Sabe-se hoje, entretanto, que a MBL encontra-se associada a serino-proteases
distintas de C1r
2
e C1s
2
. Essas enzimas, conhecidas como MASPs (MBL-associated serine
proteases) são as responsáveis pela propriedade de ativação do complemento exibidas pela
MBL. Ao se ligarem a açúcares presentes na membrana de microorganismos, a MBL sofre
uma modificação estrutural capaz de ativar as MASP-1 e MASP-2 que, então, clivam C3
(MASP-1), além de C4 e C2 (MASP-2) (Figura 1) (ROOS et al, 2001; FUJITA, 2002).
Stover e seus colaboradores (1999) definiram a estrutura primária de uma outra proteína
encontrada também acoplada à MBL, a MAp19, mas sem função enzimática conhecida,
enquanto Dahl et al (2001) registraram a existência da MASP-3, uma inibidora da clivagem
de C4 e C2 pela MASP-2.
-25-
Ainda em 2001, Roos et al revelaram a possibilidade de ativação da via das lectinas
através da ligação da MBL com IgA. Essa ligação ocorreria na presença de Ca
2+
, através do
domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD) da MBL de forma diretamente
proporcional à concentração de MBL e IgA. Uma vez ligada à IgA, a MBL foi capaz
provocar a deposição de C3b e C4b pela degradação de C3 e C4 encontrados no soro
humano normal (ROOS et al, 2001).
1.1.3 Via Alternativa
Descoberta em 1954 por Louis Pillemer e Ecker, que demonstraram a ligação e
ativação do C3 nas paredes celulares das leveduras (SILVERSTEIN, 1989), a via alternativa
só foi oficialmente aceita pela comunidade científica após o trabalho de Gewurz et al em
1968, que mostraram o consumo do componente C3 na presença de lipopolissacarídeo (LPS)
e sem a participação de C1, C2 ou C4 (JAMES, 1982).
Esta via difere da via clássica primeiramente pela possibilidade de ativação na
ausência de moléculas de anticorpo, fornecendo uma linha de defesa inata imediata,
dispensando imunização prévia (PANGBURN & MÜLLER-EBERHARD, 1984). Associado
a isso, existe o fato de que a via alternativa é ativada constantemente em condições
fisiológicas, mesmo em níveis baixos (JÓZSI et al, 2004). Para tanto, esta via requer a
participação de C3 e de pelo menos três outras proteínas exclusivas desta via: o Fator B
(FB), o Fator D (FD) e a properdina (MORGAN & HARRIS, 1999).
A ativação da cascata enzimática da via alternativa é iniciada pela hidrólise
espontânea da ligação tiól-éster localizada intramolecularmente na cadeia α da molécula
nativa de C3, levando-a a um rearranjo conformacional responsável pela formação de uma
molécula estrutural e funcionalmente semelhante ao fragmento C3b, o C3(H
2
O). C3(H
2
O)
tem a capacidade de ligar-se ao FB, à Properdina, ao Fator H e C5. Vale ressaltar que, apesar
-26-
da iniciação desta via ser espontânea e ocorrer constantemente em condições fisiológicas, a
formação do C3(H
2
O) ocorre em percentuais muito baixos (0,2-0,4 %/h), além de ser
passível de regulação pelas proteínas FH e Fator I (FI) (PANGBURN & MÜLLER-
EBERHARD, 1983a).
Uma vez formado, e na presença de Mg
2+
, o C3(H
2
O) liga-se ao FB que é, então,
clivado pela protease FD, produzindo os fragmentos Ba e Bb (Figura 2). O fragmento Bb
permanece ligado ao C3(H
2
O) e forma-se, então a primeira C3 convertase da via alternativa,
C3(H
2
O)Bb (PANGBURN & MÜLLER-EBERHARD, 1984).
Uma vez formados os novos fragmentos de C3, eles se ligam às superfícies
aceptoras, assim como visto com o C3(H
2
O), e podem se ligar ao FB e gerar o complexo
C3bBb, após a clivagem do FB pelo FD. Desta maneira, forma-se a segunda C3 convertase
da via alternativa, C3bBb. Fica então caracterizada a alça de amplificação da via alternativa
(Figura 2), onde cada molécula de C3(H
2
O) gerada espontaneamente pode formar uma C3
convertase e gerar novas moléculas de C3b que, por sua vez, formarão outras C3 convertases
(PANGBURN, 1983b).
A segunda C3 convertase da via alternativa, C3bBb, clivará novas moléculas nativas
de C3 e novas unidades de C3b serão formadas. Quando permanecer ligado à C3 convertase,
o C3b formará então a C5 convertase da via alternativa: C3bBbC3b. Formada a C5
convertase, moléculas nativas de C5 serão clivadas, e os fragmentos C5a e C5b serão
gerados (PANGBURN & MÜLLER-EBERHARD, 1983a).
-27-
-28-
1.1.4 O Complexo de Ataque à Membrana (MAC)
Apesar de serem iniciados por mecanismos diferentes, todos os mecanismos de
ativação levam à formação de uma via comum (terminal) que resulta na deposição de um
complexo denominado complexo de ataque à membrana (MAC, do inglês Membrane Attack
Complex). Este complexo normalmente deposita-se principalmente sobre as superfícies de
microorganismos, ou sobre as membranas de células infectadas por alguns tipos de vírus e
de certas linhagens de células tumorais (PANGBURN, 1984).
A formação deste complexo é iniciada pela clivagem do C5, seja pela via clássica,
alternativa ou das lectinas, e envolve a deposição de outros componentes, (C6, C7, C8 e C9).
A ligação do C8 ao complexo já depositado C5b67 permite a formação de pequenos poros
nas células-alvo, tornando-as vulneráveis à lise. A ligação da primeira molécula de C9 causa
modificações conformacionais que possibilitam a associação de outras unidades do mesmo
componente, permitindo o aumento do tamanho do poro na membrana do microorganismo
até serem adicionadas até 18 moléculas de C9 (MORGAN & HARRIS, 1999). A principal
conseqüência da formação do MAC é a lise osmótica de microorganismos (MÜLLER-
EBERHARD, 1986; FEARON & LOCKSLEY, 1996).
1.1.4.1 A Proteína C9
O componente C9 é uma proteína de cadeia simples com 538 aa e peso molecular
aproximado de 71 kDa. O gene C9 tem aproximadamente 100 kb, é composto por 11 éxons
(Figura 3) e está localizado no cromossomo humano 5p13. (WITZEL-SCHLÖMP et al,
1997).
-29-
A cadeia polipeptídica de C9 contém vários domínios independentes, com 40 a 60 aa
(aa) cada, incluindo 24 cisteínas envolvidas na formação de pontes dissulfídicas intra-cadeia
(LENGWEILER et al, 1996). Na porção N-terminal encontram-se os dois primeiros
domínios, homólogos à trombospondina e ao receptor tipo A de LDL, respectivamente. A
estes dois domínios segue-se uma porção central, com aproximadamente 330 aa, homóloga
àquela encontrada na perforina (proteína formadora de poros presente nos linfócitos TCD8
+
e células NK) e um domínio na porção C-terminal de estrutura homóloga àquela encontrada
no fator de crescimento epidermal (EDGF) (LICHTENHELD et al, 1988; SHINKAI et al,
1988).
C9 é o último componente a tomar parte na cascata de ativação do C. Ele é produzido
principalmente pelo fígado, mas também por monócitos, fibroblastos e células da glia
(MORLEY & WALPORT, 2000) e secretado no plasma na forma de uma proteína
monomérica solúvel (STANLEY et al, 1985) (Figura 4).
Figura 3: Representação esquemática do gene C9. O gene compreende 100 kb e
contém 11 éxons. O tamanho dos éxons varia de 100 a 350 pb, com exceção do éxon
11 que tem aproximadamente 1000 pb. Os íntrons têm tamanhos variando entre 260 e
> 20 kb.
> 20kb > 10kb > 5kb > 5kb > 20kb > 15kb
-30-
Esta proteína tem a capacidade de polimerizar espontaneamente e criar túbulos
circulares com aproximadamente 100 Å de diâmetro [poli C9] (DISCIPIO &BERLIN,
1999). Em um estudo muito elegante, DiScipio e Berlin (1999) utilizaram fragmentos
recombinantes de C9, correspondendo às regiões N-terminal, central e C-terminal da
proteína, além de anticorpos específicos para cada fragmento, a fim de determinar qual
região da proteína seria diretamente implicada na formação do poli (C9). Eles observaram
que a porção N-terminal estava implicada na formação da borda superior do cilindro, a
região central assumia uma posição transversa da borda superior à borda inferior do cilindro,
enquanto a C-terminal retornava às proximidades da borda superior (Figura 4). Eles
observaram também que a porção N-terminal da proteína estava diretamente implicada na
solubilidade do poli (C9), enquanto a região central e a região C-terminal estavam
envolvidas na formação do túbulo e na sua capacidade de associação a lipídios (DISCIPIO
&BERLIN, 1999).
Já em 1985, Tschopp et al haviam demonstrado que a presença do complexo C5b-8
acelerava a polimerização circular do C9 (TSCHOPP et al, 1985). E em 1986, Young e seus
colaboradores mostraram que a associação do C9 com o complexo C5b-8 em membranas
Estrutura Primária do C9
Monômero de C9
Poli(C9)
Figura 4: Representação esquemática da estrutura do C9 e do poli (C9) (modificado
a partir de DISCIPIO & BERLIN, 1999).
-31-
fosfolipídicas criava discretos poros transmembrana que não eram dependentes de íons
(YOUNG et al, 1986).
Quando ocorre a formação do C5b67, este se transforma automaticamente em um
complexo hidrofóbico e liga-se espontaneamente a membranas celulares. A ligação deste
primeiro complexo ao C8 gera um segundo complexo, o C5b-8, de formato circular que se
insere profundamente na bicamada lípidica, formando um poro pequeno e frágil. Embora o
complexo C5b-8 já possa funcionar como um canal iônico, o tamanho e a funcionalidade do
MAC estão diretamente relacionados ao número de moléculas de C9 que se associa ao
complexo C5b-8. Conseqüentemente, quanto mais moléculas de C9 se ligarem ao C5b-8
(máximo de 18) mais túbulos estruturalmente completos serão formados e um maior número
de poros largos, estáveis e funcionais estará disponível (FARKAS et al, 2002; DISCIPIO &
BERLIN, 1999; STANLEY et al, 1985).
1.2 Regulação da Ativação do Sistema Complemento
O grau de importância dos mecanismos de regulação do sistema complemento pode
claramente ser medido pelo fato de existirem quase tantas proteínas reguladoras, pelo menos
11, quantos componentes participantes das vias do complemento.
A participação de tantas proteínas nesse sistema de controle e, conseqüentemente, a
necessidade de sua existência, pode ser justificada de duas maneiras: em primeiro lugar, o
sistema complemento é constantemente ativado em níveis baixos sobre as células do
organismo e, em segundo lugar, as vias de ativação são cascatas proteolíticas que têm
enorme tendência à amplificação, de forma que pequenos estímulos podem levar a respostas
imunológicas de grande magnitude e potencialmente danosas ao próprio organismo, e ao
consumo excessivo de proteínas participantes das cascatas de ativação, como C3 e FB, o que
-32-
levaria o indivíduo a apresentar sintomas semelhantes aos exibidos pelos deficientes
primários de reguladores da ativação do C (MORGAN & HARRIS, 1999).
As várias proteínas reguladoras que impedem a ativação contínua do sistema
complemento encontram-se agrupadas em duas categorias distintas: a das proteínas
reguladoras solúveis no plasma e a das proteínas reguladoras presentes nas membranas
celulares. Compondo o grupo das proteínas reguladoras solúveis encontra-se o inibidor de
C1, o FI e FH, a proteína ligante de C4b (C4BP), a vitronectina, a clusterina, a properdina e
o inibidor de anafilotoxina. Já no outro grupo, encontra-se a proteína co-fator de membrana
(MCP), o fator acelerador do decaimento (DAF), o receptor-1 do complemento (CR1), o
fator homólogo de restrição (HRF) e o CD59. Todas essas proteínas desempenham papéis
fundamentais nos mecanismos envolvidos na regulação dos procedimentos de ativação do
Sistema Complemento, seja pela via clássica, alternativa ou das lectinas (SIM et al, 1993).
1.2.1 Proteínas Reguladoras Solúveis
A proteína inibidora de C1 (C1-In) foi descoberta em 1957 por Ratnoff e Lepow
ao estudarem preparados frescos do componente C1 do plasma humano e detectarem a
presença de uma esterase com capacidade de inibir esse componente. Entretanto, apenas em
1961 Pensky e seus colaboradores conseguiram isolar parcialmente esta enzima e
caracterizá-la como um inibidor de protease diferente dos já descritos (MORGAN &
HARRIS, 1999). Sabe-se hoje, que o C1-In é uma proteína de cadeia simples, de
aproximadamente 104 kDa e alto índice de glicosilação (30%) (BOS et al, 2002), com
capacidade de inibir diferentes serino-proteases, como C1r, C1s, MASPs entre outras
(CICARDI et al, 2005). No caso de C1r e C1s, o C1-In encontra-se firmemente ligado ao
sítio catalítico dessas enzimas, impedido a sua ativação espontânea (ZICCARDI, 1983) ou
mesmo promovendo a dissociação delas do complexo C1 e deixando o C1q ligado ao
-33-
anticorpo (LISZEWSKI et al, 1996). Como já foi dito, este inibidor pode também ligar-se a
MASPs, desfavorecendo a ativação tanto da via clássica como da via das lectinas (SIM et al,
1979; MATSUSHITA et al, 2000), mas a importância dessa interação in vivo ainda não está
completamente esclarecida (BOS et al, 2002).
A properdina foi descrita pela primeira vez em 1954 por Louis Pillemer ao estudar
os mecanismos de inativação do C3 durante incubação com zymosan (MORGAN &
HARRIS, 1999). A properdina é uma glicoproteína solúvel encontrada no plasma na forma
de oligômeros (principalmente dímeros, trímeros e tetrâmeros) formados a partir de
monômeros com peso molecular aproximado de 53 kDa (TRUEDSSON et al, 1997).
A properdina funciona como um regulador positivo de ativação da via alternativa do
complemento, pois ao ligar-se ao complexo C3bBb estabiliza esta enzima, aumentando o seu
tempo de vida (WEILER et al, 1976). Além disso, a properdina inibe a ligação do FI ao C3b,
provavelmente por competição (MEDICUS et al, 1976).
A C4BP é uma proteína oligomérica de aproximadamente 500 kDa, composta por
sete cadeias α e uma β, organizadas quase exclusivamente em SCRs, oito nas cadeias α e
três na β (do inglês Short Consensus Repeat). Esta proteína é capaz de controlar as reações
mediadas pelo C4b e, conseqüentemente, inibir a ativação da via clássica em pelo menos três
estágios: como co-fator do FI, prevenindo a formação da C3 convertase da via clássica
(C4bC2a) e acelerando o decaimento da atividade dessa enzima (SIM et al, 1993; BLOM et
al, 2004).
Além do seu papel na regulação do complemento, sabe-se que a C4BP pode, ainda,
ligar-se à heparina, à proteína anticoagulante, conhecida por proteína S, e a proteínas
presentes na membrana de diversas bactérias (BLOM, 2002).
A vitronectina e a clusterina, ambas proteínas plasmáticas, desempenham papéis
similares ao desfavorecer a formação do MAC por competir com o componente 8 (C8) pela
-34-
ligação com o complexo C5b-67 associado à membrana (PODACK et al, 1977; PODACK,
1984).
O inibidor de anafilatoxinas (C3a e C5a) é uma enzima presente no plasma, a
carboxipeptidase N (CPN), com a capacidade de remover a arginina presente na porção C-
terminal das anafilatoxinas, C3a, C4a e C5a, o que elimina ou diminui muito o poder
inflamatório desses fragmentos (GERARD & HUGLI, 1981).
O FI é uma glicoproteína formada por duas cadeias (uma leve com 38 kDa e uma
pesada com 50 kDa), com 88 kDa. A cadeia pesada é responsável pela interação com os co-
fatores, enquanto a cadeia leve contém o sítio catalítico serino-proteinase (DISCIPIO, 1992).
O FI regula a ativação de C3 ao clivar o fragmento C3b em iC3b e posteriormente em
C3c e C3d, bem como a ativação de C4 ao clivá-lo em iC4b e, posteriormente em C4c e
C4d. Entretanto, para desempenhar tal papel, o FI necessita da colaboração de outras
proteínas, seus co-fatores: FH, C4BP, MCP e CR1 (MORLEY & WALPORT, 2000).
A Proteína Reguladora Fator H (FH)
O FH é uma glicoproteína de cadeia única, pesando 150 kDa, descoberta em 1965
por Nilsson e Müller-Eberhard como uma proteína contaminante de preparações contendo
C3 (NILSSON & MÜLLER-EBERHARD, 1965; SIM & DISCIPIO, 1982). É composto por
uma seqüência de 1213 aa organizados em 20 domínios SCRs (do inglês short consensus
repeat) cada um com aproximadamente 61 aa (Figura 5) (RIPOCHE et al, 1988). Cada
SCR, com exceção do SCR2 que é codificado pelos éxos 3 e 4, é codificado por um éxon
dos 23 que compõem o gene FH (Figura 6), localizado no cromossomo 1 humano, próximo
a gene outros reguladores da ativação do complemento (RODRIGUEZ DE CÓRDOBA et
al, 2004).
-35-
Figura 6: Representação esquemática do gene FH. O gene compreende 94 kb e 23
éxons. O tamanho dos éxons varia de 77 a 360 pb e o dos íntrons de 100 a > 20 kb.
Os éxons em azul são responsáveis pela codificação da molécula de FH. O éxon 10,
em preto, não contribui para a molécula de FH, mas é utilizado para codificar o FHL-
1 (do inglês complemt Factor H Like-1). Os éxons 1 a 9, em verde e preto, são
compartilhados pelo FH e FHL-1.
> 20kb
> 10kb
> 5kb
>
> 10kb
> 10kb
-36-
-37-
Alguns anos depois de sua descoberta, entre 1976 e 1989, diferentes estudos
atribuíram ao FH seu papel central na regulação da ativação da via alternativa, agindo como
co-fator para o FI na clivagem de C3b em iC3b, e como inibidor da atividade da C3
convertase (SILVERSTEIN, 1989).
Para evitar a formação da C3 convertase da via alternativa e a conseqüente
amplificação da ativação do C característica desta via, o FH se liga ao sítio não catalítico do
C3b (ou do C3H
2
O), prevenindo a ligação com o FB ou com o Bb ou mesmo deslocando-os
caso já estejam ligados (Figura 7). Uma vez ligado ao C3b, o FH pode, ainda, atuar como
co-fator para o FI. Este, por sua vez, cliva o C3b em uma molécula enzimaticamente inativa,
o iC3b, liberando um fragmento de 3 kDa, o C3f (MORGAN & HARRIS, 1999).
Mesmo sendo um regulador solúvel, o FH pode, ainda, regular a ativação do C sobre
superfícies celulares, uma vez que possui a habilidade de discriminar superfícies ativadoras
(não próprias) das não ativadoras (próprias) das cascatas do C. Esta habilidade lhe é
atribuída pela sua capacidade de ligação a integrinas (CR3) e a poliânions, como ácido
siálico (da mesma forma que proteoglicanos, sulfato de heparana, e glicosaminoglicanos),
presentes na membrana das células próprias. A presença desses poliânions aumenta a
Fator I
Fator H
Figura 7: Representação esquemática da inibição da via alternativa pelo FH
(modificado a partir de MORGAN & HARRIS, 1999).
-38-
afinidade do FH pelo C3b, impedindo a formação da C3 convertase e a conseqüente ativação
do C sobre essa membrana (Figura 8). Quando em superfícies não próprias, superfícies
despidas de poliânions, ou mesmo na fase fluida, o FH tem baixa afinidade pelo C3b,
permitindo, então, a sua ligação com o FB, a formação da C3 convertase e a amplificação da
via alternativa (Figura 8) (GIANNAKIS et al, 2001).
Esta capacidade de ligação do FH a células próprias é de importância crucial para
células que não expressam, ou expressam pouco, proteínas reguladoras da ativação do C em
suas membranas, como as células da membrana basal do glomérulo. Durante a inflamação
ou mesmo infecção, quando a ativação do C precisa ser rápida e maciça, essas células
superfície
ativadora
superfície
não ativadora
fase
fluida
formação da
convertase
amplificação da
via alternativa
formação
do iC3b e
Figura 8: Representação esquemática da influência de superfícies ativadoras e não
ativadoras do complemento na ligação do FH ao C3b (modificado de MORGAN &
HARRIS, 1999).
-39-
ganham um reforço adicional na manutenção de sua integridade, principalmente quando
localizadas na vizinhança de um foco infeccioso (Figura 9) (JÓZSI et al, 2004).
1.2.7.1 DOMÍNIOS FUNCIONAIS DO FH
Figura 9: Modelo proposto para a ligação do FH a células endoteliais (Jozsi et al,
2004). A) Regulação da ativação do complemento na superfície endotelial mediada
pelos reguladores de membrana e intensificada pelo FH ligado a proteoglicanos
presentes na matriz extracelular. B) Modelo de regulação da ativação do
complemento mediada pelo FH com mutações que interferem na sua ligação a
proteoglicanos, muito comum em pacientes com síndrome hemolítico-urêmica.
superfície da célula
interna
membrana
proteoglicano
externa
A)
B)
C3b
C3bC3b
C3b
C3b
C3bC3b
C3b
C3
C3C3
C3b
bb
b
C3b
C3bC3b
C3b
C3b
C3bC3b
C3b
membrana
Proteo-
glicano
C3b
C3bC3b
C3b
C3b
C3bC3b
C3b
C3b
C3bC3b
C3b
C3b
C3bC3b
C3b
C3b
C3bC3b
C3b
C3b
C3bC3b
C3b
Fator H
fase fluida
-40-
Estudos aprofundados da estrutura do FH utilizando anticorpos monoclonais que
bloquearam sítios específicos na proteína nativa ou mesmo estudos com deleções
recombinantes em proteínas mutantes revelaram diferentes domínios da proteína envolvidos
com funções distintas, exercidas pelo mesmo domínio, ou mesmo uma hierarquia de ligação
dos domínios do FH com diferentes estruturas (Figura 5) (ZIPFEL et al, 1999a; ZIPFEL et
al, 2001).
As funções de regulação da ativação do C como co-fator do FI, bem como de
aceleração do decaimento da C3 convertase da via alternativa são desempenhadas pelos
quatro SCRs da porção N-terminal da proteína (SCR-1 a -4) pela ligação ao C3b íntegro
(GORDON et al, 1995; KUHN et al, 1995). Estudos subseqüentes revelaram a existência de
sítios adicionais para ligação com a molécula de C3 nos seus diferentes fragmentos, SCRs-6
a -10 e 19-20, ligando C3c e C3d, respectivamente (SHARMA & PANGBURN, 1996).
Por meio da sua propriedade de se ligar à heparina, o FH interage com as células
próprias do indivíduo de maneira mais estável, através dos SCRs-7, -9 e -20 (BLACKMORE
et al, 1996; PANGBURN et al, 1991; BLACKMORE et al, 1998; PRODINGER et al, 1998;
ORMSBY et al, 2005). Já os SCRs-7 e 8-11 são capazes de se ligar à proteína C reativa
(PCR) em reações de fase aguda (JARVA et al, 1999). Os autores sugerem que esta
interação é importante para direcionar a atividade reguladora do FH sobre tecidos
danificados após processo inflamatório (JARVA et al, 1999).
Através de seus SCRs-16 a -20, o FH pode ligar-se ao ácido siálico e a
lipopolissacarídeos presentes nas membranas celulares próprias do organismo. Mesmo
ligados, tanto o FH quanto o FHL-1 não perdem a sua capacidade de controlar a ativação do
C na superfície em que se encontram. Desta forma, o FH desempenha um papel protetor
importante para as células do corpo que não têm reguladores de membrana ou que os
expressam em concentração muito reduzida (PERKINS & GOODSHIP, 2002).
-41-
Aproveitando-se dessa capacidade do FH de ligar-se a membranas celulares e de
nelas inibir a ativação do C, alguns microorganismos desenvolveram meios para mimetizar
as membranas celulares do hospedeiro e conseguir ligar-se ao FH/FHL-1, através dos SCRs-
6 a 10, SCR-13 e SCRs-16 a -20, impedindo a ativação do C em suas membranas e a
conseqüente opsonização e lise (KRAICZY & WÜRZNER, 2006) (Figura 5).
Há, ainda, relatos sobre a ligação do FH à integrina CR3 de neutrófilos humanos.
Essa ligação desempenharia papel importante para a capacidade de adesão dessa célula, bem
como para aumentar os sinais intracelulares de ativação, fazendo do neutrófilo uma célula
mais eficiente (ZIPFEL et al, 1999a).
A FAMÍLIA DE PROTEÍNAS DO FH
A identificação de mais de um tipo de RNAm nas células hepáticas humanas que
hibridavam com o cDNA do FH iniciou a busca por proteínas que exibissem algum grau de
homologia com esta proteína (ZIPFEL & SKERKA, 1994).
Em 1987, Schwaeble et al (SCHWAEBLE et al, 1987) isolaram dois RNAm
diferentes (4,4 kb e 1,8 Kb) para a proteína FH, expressos constitutivamente pelas células
hepáticas. O primeiro RNA tinha o tamanho equivalente e adequado para codificação da
proteína de 150 kDa, o FH, enquanto que o RNA de 1,8 Kb correspondia a um produto de 43
kDa, hoje caracterizado e conhecido como FHL-1 (do inglês complement Factor H Like-1
protein) (Figura 10). Neste primeiro trabalho, eles levantaram a hipótese dessa proteína de
43 kDa ser produto de um splicing alternativo do gene FH que levaria a um transcrito de 1,8
kb, mas, somente em 1991, o mesmo grupo conseguiu provar essa hipótese (ESTALLER et
al, 1991).
-42-
Figura 10: A família Fator H. Duas regiões do FH, SCRs-6 a -7 e SCRs-19 a -20,
são as mais conservadas entre as demais proteínas, entretanto, com diferentes graus
de homologia. A) Representação esquemática dos éxons do gene FH e os respectivos
SCRs por eles codificados; B) Representação esquemática das proteínas da família
FH (modificado a partir de ZIPFEL, 2001 e ZIPFEL et al, 2002).
1
11
1
2
22
2
3
33
3
4
44
4
5
55
5
1
11
1
2
22
2
3
33
3
4
44
4
3
33
3
4
44
4
1
11
1
2
22
2
5
55
5
4
44
4
5
55
5
3
33
3
1
11
1
2
22
2
1
11
1
2
22
2
8
88
8
9
99
9
3
33
3
4
44
4
5
55
5
6
66
6
7
77
7
FH
FHL-1
FHR-1
FHR-2
FHR-3
FHR-4
FHR-5
100%
100%
57%
88%
61%
52%
36%
54%
40%
64%
42%
36%
45%
36%
44%
94%
87%
63%
70%
64%
53%
45%
74%
57%
47%
71%
SFLT
Peptídeo
sinal
A)
B)
-43-
Estudos subseqüentes (SKERKA et al, 1991; SKERKA et al, 1992; SKERKA et al,
1993) revelaram a existência de proteínas adicionais, com diferentes pesos moleculares e
graus de glicosilação, estruturalmente relacionadas ao FH.
A descoberta dessas proteínas tornou necessária a criação de uma nomenclatura
sistemática e racional dessas proteínas e sua reunião em num mesmo grupo de proteínas, a
família de proteínas FH. Assim, definiu-se como FHL-1 a proteína codificada por transcrito
de RNAm originado por splicing alternativo do gene FH, enquanto que as FHRs (do inglês
complement Factor H Related proteins) são proteínas antigênica e estruturalmente
relacionadas ao FH, mas codificadas por genes distintos (ZIPFEL & SKERKA, 1994).
Agrupadas dessa forma a família Fator H exibe características que a torna um grupo
único entre as proteínas plasmáticas humanas: 1) são as únicas proteínas plasmáticas
organizadas estruturalmente apenas com domínios SCR; 2) todas são secretadas e/ou
carregam na porção N-terminal um peptídeo que sinaliza uma possível secreção plasmática;
3) os SCRs exibem alto grau de homologia com os SCRs do FH; 4) as proteínas são
antigenicamente relacionadas e reagem com anticorpos anti-FH (ZIPFEL et al, 1999b).
Atualmente, os membros da família Fator H compreendem desde um polipeptídeo
idêntico ao FH a proteínas estrutural e antigenicamente relacionadas a ele (sete proteínas
diferentes), sendo elas FH, FHL-1, FHR-1, FHR-2, FHR-3, FHR-4 e FHR-5 (ZIPFEL et al,
2002).
O FHL-1
-44-
O FHL-1 é uma proteína solúvel de 43 kDa codificada pelo mesmo gene FH, por
meio de um splicing alternativo. Em virtude disso, o FHL-1 é idêntico aos primeiros sete
SCRs da porção N-terminal do FH, e está presente no plasma nas concentrações de 10 a 50
µg/mL, sendo o fígado a sua principal fonte (FRIESE et al, 1999).
O FHL-1 desempenha funções semelhantes às do FH na regulação da ativação do C e
na capacidade de ligação a membranas celulares. O FHL-1 é capaz de funcionar como uma
proteína de adesão, ao ligar fibroblastos pelo seu domínio RGD no SCR-4, facilitando o
processo de “espraiamento” dessas células. Através do seu SCR-7, o FHL-1 pode também,
como o FH ligar-se à heparina, presente nas membranas das células próprias, e à proteína M,
expressa na membrana de microorganismos, principalmente estreptococos (ZIPFEL &
SKERKA, 1999).
FHR-1 E FHR-2
A proteína FHR-1 é encontrada no plasma humano em diferentes perfis de
glicosilação. Assim, existem dois tipos de FHR-1: FHR-1α com 37 kDa e FHR-1β com 43
kDa, ambas com cinco SCRs, que apresentam alto grau de homologia com os SCRs-6 e -10
do FH (ZIPFEL et al, 2002).
Também para a proteína FHR-2 existem duas formas plasmáticas: FHR-2 como 24
kDa não-glicosilada e FHR-2a com 29 kDa, glicosilada. As duas formas são compostas por
quatro SCRs e estes apresentam homologia com os SCRs-6 a 10 e -18 a -20 do FH
(RODRIGUEZ DE CÓRDOBA et al, 2004).
Tanto as proteínas FHR-1 como as FHR-2 são codificadas por genes distintos do
gene FH e suas funções ainda não foram totalmente esclarecidas, tendo sido identificadas
como participantes de complexos lipoprotéicos que aparentemente facilitam a resposta de
neutrófilos ao LPS (ZIPFEL et al, 2002; MCRAE et al, 2005).
-45-
FHR-3 E FHR-4
O FHR-3 pode apresentar-se no plasma em cinco diferentes formas, pesando de 35 a
56 kDa de acordo com o grau de glicosilação. É formado por cinco SCRs que apresentam
alto grau de homologia com os SCRs da região intermediária e C-terminal do FH (ZIPFEL
et al, 2002).
O FHR-4 é expresso no plasma somente na sua forma dimérica glicosilada com 86
kDa. Os SCRs apresentam o mesmo perfil de homologia que os SCRs do FHR-3 e também
são em número de cinco (RODRIGUEZ DE CÓRDOBA et al, 2004).
Estudos mais aprofundados sobre as funções dessas duas proteínas revelam que
ambas são capazes de ligar-se ao C3b e ao C3d. O FHR-3 pode ainda ligar-se à heparina e à
proteína M presente nos estreptococos (BLACKMORE et al, 1998; KOTARSKY et al,
1998).
FHR-5
O FHR-5 é uma proteína de 65 kDa identificada pela primeira vez em preparações de
glomérulos humanos. Está presente no plasma na concentração de 3 a 6 µg/mL e é composta
por nove SCRs que apresentam homologia com as proteínas FHR-1 e FHR-2, SCRs-1 e -2,
respectivamente, e com os SCRs-10 a -14 e -19 a -20 do FH (MCRAE et al, 2005).
Em um estudo utilizando moléculas de FHR-5 recombinantes, McRae et al relataram
que o FHR-5 é capaz de ligar C3b e heparina independentemente da presença de FH, bem
como inibir a atividade da C3 convertase da via alternativa na fase fluida. Estudando a
distribuição plasmática do FHR-5 descobriu-se sua associação com a HDL (do inglês high-
density lipoprotein) do plasma (MCRAE et al, 2005).
-46-
1.2.2 Proteínas Reguladoras Ligadas à Membrana Celular
A MCP (CD46) foi descoberta em 1985 durante estudo de proteínas ligantes de C3b
e C4b em células mononucleares do sangue periférico (COLE et al, 1985). Com peso
molecular variando entre 46 kDa e 65 kDa (a depender da isoforma), é uma glicoproteína
transmembrana composta por quatro SCRs, que ao se ligarem ao C3b ou C4b facilitam a
clivagem desses dois fragmentos pelo FI, por ser um dos co-fatores desse regulador
(NANGAKU, 1998).
Além de seu papel na regulação do C, a MCP parece desempenhar outras funções
adicionais. Alguns estudos afirmam a interação da MCP com a patogênese de vários
microorganismos, como adenovírus e estreptococos, de forma que as células infectadas têm
a expressão de MCP diminuída e aumentada a sensibilidade ao C (SCHNORR et al, 1995).
Outros ainda, afirmam que a sinalização via CD46 nas células T leva essa linhagem celular a
adquirir o fenótipo de célula reguladora (KEMPER et al, 2003). Há, ainda, um provável
papel da MCP na reprodução e fertilização, uma vez que esta proteína está localizada na
membrana interna do acrossoma dos espermatozóides (RILEY-VARGAS et al, 2004).
O DAF foi descoberto em 1969 por Hoffman ao inibir a lise de eritrócitos de carneiro
e permanecer em soluções de extratos de hemácias humanas (LUBLIN & ATKINSON,
1989). É uma glicoproteína de aproximadamente 70 kDa, composta por quatro SCRs
(NICHOLSON-WELLER & WANG, 1994) e que está ancorada às membranas de células
sangüíneas, endoteliais e epiteliais através da ligação com moléculas de
glicosilfosfatidilinositol (GPI) presentes nas membranas celulares (DAVITZ, 1987).
A participação do DAF na regulação da ativação do C envolve a inibição da
formação ou mesmo a aceleração do decaimento da atividade das C3 e C5 convertases das
-47-
vias clássica e alternativa, por ligar-se ao C4b e ao C3b e impedir a associação destes com o
C2a e o FB, respectivamente (NICHOLSON-WELLER & WANG, 1994).
O CR1 é uma glicoproteína transmembrana de caráter polimórfico, com pelo menos
quatro diferentes isoformas expressas (A, B, C e D), com pesos moleculares variando entre
190 kDa e 280 kDa. Em todas as isoformas, a porção extracelular é composta
exclusivamente por SCRs, em número de cinco a oito a depender da isoforma expressa. Está
presente em quase todas as células sangüíneas, com exceção das plaquetas, linfócitos NK e a
maioria dos linfócitos T, enquanto nos tecidos pode ser encontrado nas células dendríticas e
glomerulares (HOURCADE et al, 2000).
A função de regulador da ativação do C desempenhada pelo CR1 envolve o papel de
co-fator na clivagem de C3b e C4b pelo FI em iC3b e iC4b e também na clivagem do iC3b
em C3dg pelo mesmo regulador, além de aumentar a velocidade de decaimento da atividade
das C3 e C5 convertases. Além da atividade de regulação do C, o CR1 atua como mediador
na fagocitose de partículas opsonizadas pelo C3b. As partículas opsonizadoras (C3b) ligam-
se ao CR1 presente na membrana das hemácias, que, então, transportam as partículas para o
fígado ou baço, onde serão entregues aos macrófagos residentes (LISZEWSKI et al, 1996).
As proteínas HRF (do inglês Homologous Restriction Factor) e CD59 também se
apresentam amplamente distribuídas pelo organismo, pelos mesmos motivos que o DAF.
Estas proteínas apresentam propriedades semelhantes, pois ambas impedem os processos de
formação do MAC ao se ligarem aos complexos C5b-8 ou C5b-9 (LEHTO et al, 1995;
TANDON et al, 1992).
-48-
1.3 Deficiências do Sistema Complemento
1.3.1 Deficiência de Componentes da Via Clássica
C1 é o primeiro componente desta via. É uma proteína de estrutura complexa
composta por três subunidades: C1q, C1r e C1s. C1q é composto por 18 cadeias
polipeptídicas dos tipos A, B e C ligadas entre si por pontes dissulfídicas. As três cadeias são
codificadas por um gene 24 kb no cromossomo 1. A deficiência de C1q está associada com o
desenvolvimento de doença auto-imunes, como lúpus eritematoso sistêmico e
glomérulonefrite, e maior susceptibilidade a infecções. C1r e C1s são codificados por genes
distintos (mas próximos) localizados no cromossomo 12 e secretadas como proteínas de
cadeia polipeptídica simples. A deficiência de C1r está geralmente associada com a
deficiência parcial de C1s, em virtude da proximidade desses dois genes. A deficiência
dessas duas proteínas também está associada com o desenvolvimento de lúpus e aumento da
susceptibilidade a infecções (PICKERING et al, 2000).
C4 é codificado por dois genes diferentes C4A e C4B. As proteínas C4A e C4B
codificadas pelos dois genes diferem entre si por apenas quatro aa na cadeia, sendo,
entretanto, o C4B mais hemoliticamente ativo. Existe uma freqüência extremamente alta de
polimorfismo e de alelos nulos nos genes C4. Aproximadamente 35% da população mundial
não expressa C4A ou C4B. A deficiência completa de C4 é rara e está associada ao
desenvolvimento de lúpus sistêmico ou discóide, bem como doença renal associada à
deposição de complexos imune (BARBA et al, 1993).
C2 é uma proteína de cadeia polipeptídica simples de 84 kDa codificada por um gene
14 kb situado nas proximidades de gene FB, cujo produto o C2 tem 35% de homologia. A
deficiência de C2 é uma das deficiências do complemento mais comuns entre os
caucasianos, aproximadamente 1 - 1,5% destes tem alelos nulos no gene C2 e 1 em cada
10.000 tem deficiência completa da referida proteína. A deficiência completa de C2 tem sido
-49-
associada com infecções piogênicas recorrentes, polimiosistes, púrpura e vasculites, além de
lúpus eritematoso sistêmico, alteração mais comum.
1.3.2 Deficiência dos Componentes da Via Alternativa
O FD é uma serino-protease de 25 kDa sintetizada principalmente nos adipócitos e
macrófago (SCHIFFERLI & MIOT, 2000). A deficiência completa de FD está associada a
infecções recorrentes por microorganismos do gênero Neisseria e infecções respiratórias
recorrentes (HIEMSTRA et al, 1989; BIESMA et al, 2001).
O FB é uma serino proteinase trilobular composta por 739 aa sintetizada
principalmente no fígado e com peso molecular de 83 kDa (ARLAUD et al, 1998). Existem
apenas dados preliminares sobre a deficiência completa desta proteína (DENSEN, 1991)
associando-a com infecções meningocócicas graves e recorrentes.
O C3 é uma molécula de aproximadamente 185 kDa secretada inicialmente como
uma molécula de cadeia única, o pró-C3, e que após modificações pós-translacionais passa a
possuir duas cadeias (α: 110 kDa e β: 75 kDa), ligadas entre si por pontes dissulfídicas, e
uma ligação tiól-éster na sua cadeia α. É esta ligação que lhe confere a possibilidade de
ligar-se covalentemente a moléculas aceptoras nas superfícies celulares (LAMBRIS &
MÜLLER-EBERHARD, 1986).
O C3 é a proteína do C mais abundante no soro humano (aproximadamente 1200
µg/ml) e é também a mais central e versátil. Em virtude disso, o C3 desempenha diversos
papéis essenciais para a ativação e/ou funções biológicas do C após clivagem nos seus
diversos fragmentos: 1) formação das C3 e C5 convertases; 2) opsonização (através de seus
fragmentos C3b e iC3b); 3) ativação dos linfócitos B e aumento da produção de
imunoglobulinas (C3d e C3dg); 4) desgranulação de mastócitos e basófilos (C3a); 5)
-50-
solubilização e remoção de complexos imunes (C3b); 6) remoção de células apoptóticas
(iC3b) (Revisado em WALPORT, 2001).
Diante de tantas funções desempenhadas pelo C3 não é surpreendente que a
deficiência desta proteína esteja associada com infecções recorrentes graves e doenças
mediadas por deposição de complexos imunes, principalmente glomerulonefite. Assim, dos
27 pacientes relatados como deficientes primários desta proteína, 13 foram acometidos por
pneumonia, sinusite, tonsilite e otite e 9 por meningite. Sete deles tiveram, ainda,
complicações renais, como glomerulonefrite masangiocapilar (REIS et al, 2006).
Existem, ainda, os pacientes com deficiência secundária de C3, nos quais a ausência
dos reguladores FH e FI, ou a presença dos fatores nefríticos (FNe) de C3 e C4 (C3FNe e
C4FNe), auto-anticorpos que estabilizam as C3 convertases das vias alternativa e clássica,
leva a um consumo descontrolado de C3 e diminuição acentuada dos seus níveis
plasmáticos. Assim, da mesma forma que nos deficientes primários de C3, pacientes com
deficiência de FH ou FI também são muito susceptíveis a pneumonia e meningite, além de
doenças causadas por deposição de complexos imunes, como lúpus e glomerulonefrite
membranoproliferativa. Vale ressaltar que, apesar da semelhante predisposição a infecções
encontrada tanto nos deficientes primários de C3 quanto nos deficientes de FH e FI, as
doenças auto-imunes são mais freqüentes nos deficientes primários de C3, as infecções
respiratórias e meningite nos deficientes primários de C3 e de FI, enquanto que as
complicações renais são mais freqüentes nos deficientes de FH (REIS et al, 2006).
Por fim, a presença dos fatores nefríticos leva ao desenvolvimento de doenças renais,
principalmente a glomerulonefrite do tipo III (DAHA et al, 1976).
-51-
1.3.3 Deficiência dos Componentes da Via Terminal
As deficiências dos componentes C5, C6, C7, C8 e C9 são clinicamente
caracterizadas pelo aumento da susceptibilidade a infecções pelo gênero Neisseria, ou seja,
pacientes acometidos por esse tipo de deficiência são acometidos por meningite
meningocócica recorrente, meningococemia aguda e crônica e/ou doença extragenital
gonocócica (ALPER, 1987).
C5 é um heterodímero, com pontes dissulfídicas inter-cadeia, de aproximadamente
190 kDa e sua ausência impede a formação do MAC e a produção de C5a (Morgan
&Walport, 1991). Assim, a deficiência de C5 está associada com o aumento da
susceptibilidade a infecções respiratórias, infecções graves por microorganismos do gênero
Neisseria, otite, febre, além de sintomas mais inespecíficos como alopecia, hipopigmentação
do couro cabeludo, crostas e eritema (ASGHAR et al, 1991; NIELSEN & KOCH 1987).
Sabe-se ainda que os soros de alguns indivíduos C5D não exibem atividade quimiotáxica
para neutrófilos, provavelmente em virtude da produção diminuída de fragmentos C5a
(ROSENFELD et al, 1976; SNYERMAN et al, 1979).
C6 e C7 são proteínas de cadeia única, ambas com 115 kDa, de estrutura e função
muito semelhantes. A deficiência de C6 é a segunda mais freqüente entre os caucasianos
(1:60.000), enquanto a de C7 é rara entre caucasianos, mas a segunda mais freqüente entre
japoneses (1:25.000) (MORGAN & WALPORT, 1991). Deficiências isoladas das duas
proteínas já foram registradas na literatura e associadas a infecções por Neisseria sp e
doenças reumatológicas (COLTEN & ROSEN, 1992).
C8 é uma proteína complexa formada por três cadeias ligadas entre si por ponte
dissulfídica, α (64 kDa) e γ (22 kDa), e por interações não covalentes, β (64 kDa). Cada
cadeia é codificada por um RNA diferente de dois cromossomos diferentes, 1p e 9q. Três
tipos de deficiência de C8 já foram relatados na literatura: pacientes deficientes de cadeia α-
-52-
γ, pacientes deficientes de cadeia β e pacientes com cadeia β disfuncional, mas as
características clínicas são idênticas para os três tipos de deficiência dessa proteína
(COLTEN & ROSEN, 1992)
Deficiência de C9
A deficiência congênita de C9 foi descrita pela primeira vez nos anos 70 (KIRA et al,
1998). É a deficiência do complemento mais comum no Japão, com incidência de um
deficiente a cada mil pessoas (1:1000), mas é rara em outros países (ICHIKAWA et al,
2001).
Enquanto a deficiência congênita dos componentes da via terminal C5, C6, C7 e C8
sempre esteve associada com o aumento do risco de infecções por Neisseria sp, a deficiência
do componente C9 estava aparentemente relacionada a indivíduos assintomáticos e
saudáveis (KIRA et al, 1998). Entretanto, Nagata e seus colaboradores em 1989, estudando
doadores de sangue em Fukuoka (NAGATA et al, 1989), demonstraram que o risco de
pacientes deficientes de C9 desenvolverem infecções meningocócicas em relação a
indivíduos normais era muito maior (KIRA et al, 1998).
Dos inúmeros estudos já realizados na população japonesa sobre deficiência de C9,
um merece destaque especial, no qual Horiuchi et al em 1998 encontraram a mesma
mutação C343T nos 10 pacientes estudados, gerando um códon de parada prematura no local
da Arg
95
, seria a mutação mais freqüente responsável pela deficiência de C9 entre os
japoneses. Em 8 dos 10 pacientes a mutação estava presente e nos dois restantes haviam
mutações adicionais, C507Y e outra que não pôde ser determinada, que, associadas à
mutação na Arg
95
se responsabilizariam pela ausência da proteína nos soros do paciente
(HORIUCHI et al, 1998). Os mesmos autores sugeriram que a presença desta mutação na
posição da Arg
95
possa ter estado presente entre os indivíduos fundadores desta população
-53-
japonesa, possibilidade confirmada posteriormente por Khajoee et al (2003), quando eles
encontraram a mesma mutação nas populações coreana e chinesa com uma freqüência de 2%
e 1%, respectivamente.
Outro estudo feito com uma família suíça deficiente em C9 (WITZEL-SCHLÖMP et
al, 1997) mostrou ser esta dependente de duas outras mutações pontuais ambas encontradas
concomitantemente nos dois pacientes estudados (heterozigotos) e ambas responsáveis pela
geração de códons de parada prematura: uma localizada no éxon 2 (C166A) e outra no éxon
4 (C464T). O mesmo grupo realizou, ainda, outro estudo para avaliar as causas moleculares
da deficiência de C9 em dois pacientes irlandeses não relacionados (WITZEL-SCHLÖMP et
al, 1998). Eles encontraram a mesma mutação na posição 166 descrita no estudo anterior e
uma substituição pontual (C350T) no éxon 4, como causas da deficiência no primeiro
paciente. No segundo paciente, uma outra substituição pontual C→G na posição 1284
(C1284G) do éxon 9, levando a um códon de parada prematura na posição do aaminoácio
406, e uma substituição T359G no éxon 4, substituindo a Cys
98
por uma Gly
98
(WITZEL-
SCHLÖMP et al, 1998) foram associadas à deficiência completa da proteína.
1.3.4 Deficiência de Proteínas Reguladoras da Ativação do Complemento
1.3.4.1 Deficiência de Proteínas Reguladoras Solúveis
A deficiência de C1-In foi descrita pela primeira vez em 1963 em pacientes
acometidos por agioedema. Esta deficiência tem perfil hereditário autossômico dominante,
uma exceção aos mecanismos de herança genética das deficiências de proteínas do
complemento, e permanece associada a essa patologia até os dias de hoje. Diferentes perfis
de alterações moleculares já foram descritos como causas dessa deficiência, desde mutações
pontuais até grandes inserções e deleções, com conseqüente variação do fenótipo exibido
pelos pacientes: níveis plasmáticos reduzidos do inibidor ou mesmo níveis normais, mas
-54-
funcionalmente comprometidos deste regulador (PAPPALARDO et al, 2002; GOMPELS et
al, 2005).
A deficiência de FI é um fenômeno raro e seus sinais clínicos são semelhantes aos
apresentados na deficiência de FH: desenvolvimento de infecções por bacterianas piogênicas
nos primeiros anos de vida, como meningite ou mesmo septicemia e aumento do risco de
desenvolvimento de glomerulonefrite e doenças auto-imunes (NAKED et al, 2000;
AMADEI et al, 2001; BARACHO et al, 2003; GENEL et al, 2005).
A deficiência de FI está normalmente associada com baixos níveis de C3 e C5, em
virtude do consumo excessivo dessas proteínas na ausência de regulação da atividade das C3
e C5 convertases e, conseqüentemente a problemas na opsonização e formação do MAC na
membrana de microorganismos, entretanto, o desenvolvimento de complicações renais,
como a glomerulonefrite, não está normalmente associado com a deficiência desta proteína
(VYSE et al, 1994). Recentemente, mutações no gene FI têm sido associadas com o
desenvolvimento de Síndrome Hemolítico-Urêmica (DRAGON-DUREY & BACCHI,
2005).
A deficiência de properdina foi relatada pela primeira vez em 1982 (SJÖHOLM et
al, 1982) numa família sueca associada a uma infecção meningocócica fulminante. Mais de
100 casos de deficiência de properdina já foram descritos e três fenótipos principais da
deficiência definidos. No primeiro fenótipo os indivíduos que têm níveis plasmáticos de
properdina reduzidos, principalmente em decorrência de um códon de parada prematura nos
éxons 4-6, enquanto no tipo II os indivíduos têm níveis entre 1-10% ou mesmo normais da
proteína, mas ela é incapaz de formar os oligômeros que normalmente caracterizam este
regulador. Por fim, no fenótipo tipo III, os indivíduos têm níveis normais da proteína em
oligômeros, entretanto, sem atividade de estabilização de convertases. Nos tipos II e III desta
deficiência, alterações moleculares que levaram à substituição de um e/ou dois aa foram
-55-
identificadas como as principais causas da deficiência (LINTON & MORGAN, 1999; FIJEN
et al, 1999)
DEFICIÊNCIA DE FH
A deficiência completa de FH (homozigota) é um fenômeno raro, com apenas 22
casos de 12 famílias diferentes, relatados até agora na literatura. Os pacientes manifestam
diferentes características clínicas e são originários de diversas populações, incluindo
brancos, africanos, asiáticos, beduínos, americanos, entre outras (Tabela 1) (VYSE et al,
1994; AULT et al, 1997; DRAGON-DUREY et al, 2004; REIS et al, 2006).
-56-
-57-
-58-
Existem poucos dados publicados sobre as mutações genéticas responsáveis pela
deficiência de FH. Na primeira publicação, os autores estudaram a seqüência do cDNA e o
DNA genômico do paciente e identificaram duas mutações nos códons para dois resíduos de
cisteína, uma no SCR-9 e outra no SCR-16. As duas mutações T1679C (Cys
518
→Arg) e
G2949A (Cys
941
→Tyr) modificam resíduos conservados de cisteína, que formam as pontes
dissulfídicas que mantêm a estrutura terciária dos domínios de SCR (AULT et al, 1997). No
estudo seguinte, o mesmo grupo analisou dois mutantes de FH (C518R e C941Y) produzidos
artificialmente. Eles observaram que estes mutantes ficavam retidos no retículo
endoplasmático celular, mostrando que a esta deficiência de FH era causada por um
impedimento na secreção desta proteína pelas células do paciente (SCHMIDT et al 1999).
Um outro grupo estudou três pacientes italianos deficientes de FH e encontraram uma
mutação nonsense (G638T) manifestada de forma homozigota, criando códons de parada
prematura na posição 171 do SCR-3. Por se localizar nos primeiros códons codificadores da
proteína, esta mutação é responsável pela ausência completa do FH e do FHL-1
(SÁNCHEZ-CORRAL et al 2000).
Mais recentemente, Dragon-Durey et al (2004) analisaram o gene FH de dezesseis
pacientes com síndrome hemolítico-urêmica (SHU) e todos apresentaram anormalidades nas
formas homozigota ou heterozigota, envolvendo uma mutação nonsense ou códons para
resíduos de cisteína no gene FH.
DOENÇAS RELACIONADAS À DEFICIÊNCIA DE FH
-59-
Glomerulonefrite Membranoproliferativa Tipo II
A glomerulonefrite membranoproliferativa tipo II (MPGN II) é uma doença renal
rara, caracterizada por proteinúria persistente, hematúria e síndrome nefrótica, mais comum
em crianças.
A MPGN II está associada com a ativação desregulada da via alternativa e
conseqüente hipocomplementenemia, com massivos depósitos de C3 nos capilares dos
glomérulos. Alguns estudos relatam também a associação entre MPGN II e deficiência de
FH em vários pacientes que desenvolveram essa patologia (WEST, 1994; MERI et al, 1992).
Ault e seus colaboradores (1997) caracterizaram molecularmente um desses pacientes
deficientes de FH que desenvolveram MPGN II com um ano de idade. Identificaram duas
mutações pontuais que afetavam dois resíduos conservados de cisteína e, por isso, alteravam
a conformação estrutural da proteína e impediam sua secreção no plasma (AULT et al,
1997).
Em um trabalho subseqüente, HEGASY et al (2002) observaram que porcos
deficientes de FH desenvolveram MPGN II, com baixos níveis plasmáticos de C3, ativação
excessiva do C e depósitos de C3 nos glomérulos. Os animais que tiveram seus níveis
plasmáticos de FH reconstituídos à faixa normal sobreviveram à doença, enquanto os demais
foram a óbito por falência renal (HEGASY et al, 2002).
Existem, ainda, relatos de pacientes que produziram auto-anticorpos contra o SCR-3
do FH, também chamados de proteína LOI, e desenvolveram MPGN II com características
semelhantes às encontradas em deficientes de FH: hipocomplementenemia e massivos
depósitos glomerulares de C3. Os autores acreditavam que, ao se ligar ao SCR-3 do FH e do
FHL-1, este auto-anticorpo impedia suas atividades de regulação da ativação da via
alternativa do C (ZIPFEL et al, 1999b; ZIPFEL, 2001).
-60-
Síndrome Hemolítico-Urêmica
A síndrome hemolítico-urêmica (SHU) é caracterizada pela tríade: anemia hemolítica
microangiopática, trombocitopenia e falência renal aguda. A doença é considerada rara e
classificada em diarréica (forma “típica”) e não diarréica (forma “atípica”). A forma típica
afeta principalmente crianças e é caracterizada por diarréia com eliminação de sangue,
causada pela Escherichia coli enterohemorrágica produtora de verotoxina/shigatoxina,
principalmente a cepa 0157:H7. O prognóstico é normalmente bom com a completa
recuperação da função renal. A forma atípica, por sua vez, pode apresentar-se na forma
esporádica ou associada à herança genética, afeta crianças mais velhas ou adultos e tem
prognóstico bem pior que o primeiro tipo, sendo a morte e danos permanentes, renais ou
neurológicos, finais comuns para os pacientes acometidos por este mal (TAYLOR, 2001).
Níveis reduzidos de C3 em pacientes com SHU típica e atípica são registrados na
literatura desde 1975 (KAPLAN et al, 1975), mas o primeiro registro associando essa
patologia com baixos níveis de FH foi feito por Thompson e Winterborn em 1981
(THOMPSON & WINTERBORN, 1981; ZIPFEL et al, 2001). Desde então, inúmeros
estudos associando baixos níveis de FH ao desenvolvimento de SHU foram levados a efeito
(dentre eles: PICHETTE et al, 1994; ROUGIER et al, 1998; OHALI et al, 1998) com níveis
de proteína variando entre menos de 10% e 50% dos níveis encontrados em indivíduos
normais. O mecanismo sugerido como responsável pela associação entre esses dois fatores
envolve uma ativação desregulada das cascatas do complemento sobre tecidos próprios dos
indivíduos deficientes de FH. Este prejuízo na regulação da ativação do complemento
levaria ao surgimento das alterações encontradas na SHU (ZIPFEL, 2001; ZIPFEL et al,
2006; ZIPFEL & SKERKA, 2006).
A deficiência da proteína reguladora predispõe ao desenvolvimento da SHU,
entretanto, existem outros fatores considerados como desencadeadores etiológicos dessa
patologia. No caso da forma típica afirma-se que este fator desencadeador seria a toxina
-61-
produzida pela cepa específica de E. coli. Na forma atípica, existem vários fatores
ambientais envolvidos, como gravidez, período pós-parto, uso de contraceptivo oral,
indutores de mitose, tumores malignos e infecções (menos freqüente) (ATKINSON et al,
2005).
A seqüência de eventos envolvidos no desenvolvimento de SHU é iniciada quando os
fatores etiológicos citados acima levam à lesão das células do tecido endotelial (Figura 11).
Uma vez danificado, o tecido endotelial passa a induzir a ativação das cascatas do
complemento, que, na presença de seus reguladores, seria benéfica e importante para o
reparo tecidual. Todavia, na ausência de regulação apropriada as células endoteliais
danificadas, passam a induzir os efeitos biológicos decorrentes da ativação completa das
cascatas do complemento sobre as suas próprias membranas a partir da deposição do C3b.
Assim, o C3b depositado servirá como ligante para células fagocitárias e os fragmentos C3a
e C5a gerados sinalizarão positivamente para o recrutamento de células inflamatórias. Estas
células inflamatórias, quando ativadas, liberarão mediadores pró-inflamatórios, como TNFα
e IL-8, que, por sua vez, levam à retração do tecido endotelial e conseqüente exposição da
camada subendotelial. A exposição do tecido subendotelial, deficiente em proteínas
reguladoras ligadas à membrana celular, leva a uma intensificação na deposição de C3b e,
conseqüentemente, a uma amplificação na ativação do complemento. Por fim, o MAC, induz
a desestabilização ou mesmo lise das membranas celulares (ZIPFEL, 2001; ATKINSON et
al, 2005).
-62-
Corroborando com modelo sugerido acima, estudos moleculares conduzidos por
Warwicker e seus colaboradoes em 1998 (WARWICKER et al, 1998) identificaram uma
área no cromossomo 1q32 diretamente associada com o desenvolvimento de SHU, região
cromossômica onde está localizado o gene FH.
Análises mais aprofundadas revelaram, ainda, uma forte relação entre a alta
incidência de mutações pontuais na região C-terminal do FH e pacientes acometidos pela
SHU (YING et al, 1999; PÉREZ-CABALLERO et al, 2001; CAPRIOLI et al, 2001;
RICHARDS et al, 2001; SÁNCHEZ-CORRAL et al, 2002). Sabe-se que esta região do FH é
Endotélio intacto
Células endoteliais
Matriz extracelular subendotelial
Agente inflamatório
Condições normais
FH com atividade
sub
-
ótima
Reparo
Lesão
Figura 11: Seqüência de eventos que levam à lesão tecidual em pacientes com SHU e
mutações no FH (ZIPFEL, 2001). A) Tecido endotelial intacto; B) Seqüência de
eventos que levam ao dano tecidual; C) Regulação da ativação do complemento num
indivíduo normal e num indivíduo com mutações no FH.
-63-
capaz de se ligar a poliânions presentes na superfície das células endoteliais dos vertebrados,
o que poderia explicar porque estas células são protegidas da ativação autóloga do
complemento sobre suas membranas (RICHARDS et al 2002). Esta hipótese tornou-se ainda
mais contundente após a publicação do trabalho de Józsi e seus colaboradores (JÓZSI et al
2004), onde eles provaram que as células endoteliais do cordão umbilical se ligavam ao FH
por meio do SCR-20. A presença de uma mutação nesta região impedia a ligação do FH a
estas células e a conseqüente proteção desta contra a ativação do complemento. Este
mecanismo de proteção é, provavelmente, importante para todos os tipos celulares, mas em
especial para as células que expressam pouco ou nenhum regulador da ativação do
complemento na sua membrana celular, como é o caso das células da membrana glomerular
do rim. Este achado definitivamente revela uma ligação entre o desenvolvimento de SHU e a
existência de mutações deletérias na região C-terminal do FH.
As mutações foram, então, classificadas por Perkins e Goodship (PERKINS &
GOODSHIP, 2002) em dois tipos distintos. O tipo I envolve mutações responsáveis por
alterar a secreção e a velocidade de degradação da proteína, diminuindo, conseqüentemente,
seu nível no plasma do paciente. O tipo II relaciona-se a mutações que não alteram o nível
plasmático da proteína, mas sim suas características funcionais.
Inúmeros estudos destinados a identificar e caracterizar mutações no gene FH
associadas com o desenvolvimento de SHU foram desenvolvidos desde então por diferentes
grupos e em distintas etnias. Até o momento, foram relatadas 59 mutações em 58 pacientes,
que foram associadas ao desenvolvimento de SHU. Dessas mutações, 64% são substituições
missense ou nonsense, 11% são inserções ou deleções, 1% mutações de splicing e 22% são
polimorfismos sem associação com a doença. Embora essas mutações estejam distribuídas
por diferentes SCRs, a grande maioria delas concentra-se na porção C-terminal da proteína,
SCRs 16-20, e 48% nos SCRs 19-20 (revisado em ZIPFEL et al, 2003; SAUNDERS et al,
-64-
2006). Um resumo das mutações encontradas nestes estudos, bem como a localização de
cada uma delas pode ser encontrado na Figura 12.
Apesar da direta associação entre a presença de alterações no gene FH e o
desenvolvimento de SHU, a inexistência de mutações no gene FH em diferentes pacientes
com SHU, bem como a penetrância incompleta da doença em pacientes com mutação no
gene FH ou mesmo a associação entre mutações no gene MCP e o desenvolvimento de SHU
impulsionaram vários estudos moleculares destinados a aprofundar a associação entre
mutações na região do cromossomo 1q32 e o desenvolvimento de SHU. Sabendo que essa
região cromossômica engloba não só o gene FH como também de outras proteínas, como
gene MCP e FI, não surpreende a compilação de dados recentes afirmando a associação de
SHU não só com mutações no gene FH, como também com mutações nos gene MCP e FI,
presentes de forma independente ou em concomitância com mutações no gene FH (NORIS
et al, 2003; ESPARZA-GORDILLO et al, 2005; DRAGON-DUREY et al, 2005; ZIPFEL &
SKERKA, 2006; ESPARZA-GORDILLO et al, 2006; SAUNDERS et al, 2006).
-65-
-66-
Degeneração da Mácula Relacionada à Idade (DMRI)
A mácula é a porção central da retina e responsável pela nossa visão detalhada e
central dos objetos e pessoas. A degeneração dessa porção da retina relacionada à idade,
conhecida por DMRI, é a principal causa de cegueira entre maiores de 60 anos. Este tipo de
doença surge com o aparecimento de drusas resultantes do depósito de material de descarte
(lipoproteínas) que se acumula entre a membrana basal (membrana de Bruch) e o epitélio
onde se localizam as células fotoreceptoras.
Existem dois tipos de DMRI: “seca” e “úmida”. A DMRI seca é caracterizada pela
formação das “drusas” sob a mácula tornando-a mais fina e completamente ressecada. A
maioria dos casos de DMRI é do tipo “seco”, entre 85% e 90%. Na DMRI “úmida” novos
vasos sanguíneos são formados sob a mácula. Esses vasos aumentam de volume,
progressivamente, e rompem, gerando tecido de cicatrização que invade a membrana de
Bruch e danifica permanentemente a visão.
Existem vários fatores de risco atualmente associados com o desenvolvimento de
DMRI: predisposição genética, fatores ambientais como fatores nutricionais e fumo,
obesidade, níveis lipídicos, isquemia, senescência e oxidação. Mas se sabe que a incidência
de DMRI aumenta espontaneamente com a idade (KLEIN et al, 1992).
Sabe-se que a DMRI desenvolve-se em ambiente inflamatório. A etiologia de uma
reação inflamatória, por sua vez, sofre grande influência do grau de ativação do C e dos
fragmentos formados em conseqüência dessa ativação. Assim, vários trabalhos têm mostrado
que fragmentos do sistema complemento podem ser encontrados depositados nas drusas e no
próprio ambiente da retina e a ativação deste sistema poderia ser um dos contribuintes da
resposta inflamatória instalada nestas estruturas. Esta ativação pode ser regulada por
proteínas encontradas no fluido intra-ocular como MCP, DAF e CD59 (SOHN et al, 2000),
regulação observada tanto para a via clássica quanto alternativa nos humores vítreo e aquoso
de um indivíduo normal.
-67-
A associação de DMRI com fatores genéticos é conhecida há algum tempo e, por
meio de estudos familiais, sabe-se que, o cromossomo 1, mais especificamente na região
1q31, está implicado com a DMRI. Nesta região, coincidentemente localizam-se os genes da
família do FH. Como conseqüência do Projeto Genoma Humano e do estudo de
polimorfismo de único nucleotídeo (SNP, do inglês single nucleotide polymorphism), vários
grupos norte-americanos e europeus (KLEIN et al, 2005; HAINES et al, 2005; EDWARD
set al, 2005; ZAREPARSI et al, 2005; SOUIED et al, 2005; HAGEMAN et al, 2005;
CONLEY et al, 2005) mostraram que uma determinada variante de FH (contendo His
402
, ao
invés de Tyr
402
) poderia ser apontada como um dos marcadores genéticos relacionados com
maior taxa de risco para desenvolver DMRI. Os estudos acima propuseram que indivíduos
com um dos alelos codificando para FH His
402
tinham 2 a 5 vezes maior risco de
desenvolver DMRI, do que indivíduos que tivessem os dois alelos codificando para FH
Tyr
402
. Este risco aumentava para 5 a 7 vezes, se ambos os alelos codificassem para FH
His
402
. Interessante ressaltar que este polimorfismo localiza-se no SCR7 de FH, que é uma
das regiões que se ligam a C3b, heparina e proteína de fase aguda inflamatória Proteína C-
Reativa (Figura 7).
1.3.4.2 Deficiência de Proteínas Reguladoras Associadas à Membrana Celular
Diferentes estudos têm associado várias mutações no gene MCP com o
desenvolvimento da SHU. Essas mutações são divididas em dois grandes grupos: mutações
que levam à diminuição da expressão de MCP nas membranas celulares e mutações que não
alteram a expressão desta proteína. A maioria dos pacientes incluídos no primeiro grupo tem
a expressão de MCP reduzida a 50% do índice normal de expressão, com capacidade de
ligação ao C3b também reduzida à metade. Já no segundo grupo, os pacientes apresentam
níveis normais de expressão de MCP nas suas membranas celulares. Entretanto, na maioria
-68-
dos indivíduos, essas proteínas têm suas capacidades funcionais muito prejudicadas, com
perda da capacidade de ligação ao C3b e/ou C4b, bem como da atividade de co-fator do FI
na clivagem de um ou dos dois fragmentos (revisado em RICHARDS et al, 2007).
A deficiência de DAF tem sido diretamente relacionada ao desenvolvimento da
hemoglobinúria paroxística noturna (HPN). Estes pacientes apresentam hemólise
intravascular mediada pelo C em conseqüência da ausência do DAF nas membranas das
células sangüíneas. As causas moleculares dessa deficiência foram determinadas como
sendo mutações somáticas no gene do fosfatidilinositol da classe A, que é essencial para a
formação das âncoras de GPI nas membranas celulares. Assim, esses indivíduos não são
completamente deficientes de DAF, mas sim da ligação deste regulador às membranas
celulares (KIM & SONG, 2006).
A deficiência de CD59 está da mesma forma que na deficiência de DAF, associada
ao desenvolvimento da HPN. Entretanto, existem relatos de indivíduos com alterações
genéticas que levam à deficiência de CD59 que desenvolveram a HPN, enquanto que outros
deficientes exclusivamente de DAF não desenvolveram a doença. Estes dados parecem
implicar mais diretamente a deficiência de CD59 e não de DAF com o desenvolvimento de
HPN (KIM & SONG, 2006).
-69-
Em virtude da existência de poucos casos de deficientes de FH descritos na literatura
e ainda mais escassos estudos sobre suas possíveis causas moleculares; e sabendo da vital
importância de tais estudos para o melhor entendimento das múltiplas atividades fisiológicas
do C, bem como das patologias associadas às deficiências de seus componentes, tornou-se
de nosso interesse estudar e analisar geneticamente a deficiência de FH (detectada pelo
grupo da Dra. Anete Grumach da Faculdade de Medicina da USP e inicialmente
diagnosticada como deficiência do componente C3) encontrada pela primeira vez num
paciente brasileiro e pela primeira vez na literatura em concomitância com a deficiência do
componente C9.
-70-
II_HIPÓTESE E OBJETIVOS DO TRABALHO
2.1 Hipótese do Trabalho
Pacientes com deficiência primária da proteína reguladora FH desenvolvem
deficiência secundária do componente C3 e, possivelmente, de outros componentes da via
alternativa. Podem, ainda, ser portadores de deficiência concomitante de outros componentes
do C, por exemplo, C9, de forma aparentemente não relacionada.
2.2 Objetivos Gerais
Caracterizar esta imunodeficiência (dupla), utilizando métodos de avaliação
funcional e quantificação das proteínas do C presentes no soro do paciente e ainda
estabelecer as possíveis causas moleculares da deficiência.
2.3 Objetivos Específicos
⇒ Avaliar a atividade funcional das vias de ativação mediadas pelas vias clássica e
alternativa do C;
⇒ Determinar a concentração sérica do FH, C3, C9 e outras proteínas do sistema
complemento;
⇒ Estabelecer se a deficiência do componente C3 encontrada no paciente é do tipo
primário ou secundário;
⇒ Avaliar os aspectos estruturais das proteínas FH e C9;
⇒ Identificar possíveis mutações no genes FH e C9 presentes no material genético do
paciente, extraído de seus fibroblastos, responsáveis pela deficiência combinada;
⇒ Confirmar o padrão de herança genética das mutações encontradas nesta família
deficiente.
-71-
-72-
-73-
-74-
-75-
IV_MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Paciente
O paciente de 7 anos portador da deficiência de FH manifestou pneumonia com
derrame pleural e necessidade de internação para drenagem torácica e uso de antibiótico
endovenoso (Amoxicilina) aos 2 anos e 8 meses. Na ocasião, o paciente, que já havia
recebido todo o programa vacinal recomendado pelo Ministério da Saúde, foi imunizado
contra bactérias encapsuladas.
Aos 3 anos e 2 meses foi acometido por um novo episódio de pneumonia que evoluiu
para insuficiência respiratória, necessitando de tratamento na Unidade de Terapia Intensiva,
mas respondeu prontamente à antibioticoterapia, fato não observado anteriormente à
vacinação para encapsulados. Não houve isolamento do agente etiológico responsável,
entretanto, a imagem pulmonar mostrou condensação lobar, o que sugere infecção pelo
pneumococo. Foi realizada, ainda, a avaliação da atividade hemolítica do soro do paciente
pelas vias clássica (CH50) e alternativa (AP50), que se mostrou indetectável (resultado não
mostrado).
Ainda durante esse episódio foi feito um hemograma do paciente, cujos resultados se
apresentaram dentro da normalidade (Tabela 2), e também uma avaliação imunológica do
paciente, incluindo, dosagem de imunoglobulinas e subclasses de IgG, sorologia para
sarampo, rubéola e HIV, pesquisa de anticorpos anti-pneumocícicos antes e após vacinação
com pneumo 23 (23 sorotipos diferentes de pneumococos), fenotipagem de linfócitos e
resposta proliferativa de linfócitos a mitógenos.
-76-
Tabela 2: Valores dos parâmetros de hemograma avaliados no paciente*.
Parâmetro Resultado
Hemácias 4,36 milhões/mm3
Hemoglobina 11,7 g/L
Hematócrito 35,10%
Vol. Corp. Médio 80,4
Leucócitos 8400 céls./mm3
Neutrófilos 41,20%
Monócitos 42,90%
Linfócitos 7,90%
Eosinófilos 6,50%
Basófilos 1,50%
Plaquetas 478000 céls./mm3
* Teste realizado pelo Departamento de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo.
Foram dosadas as imunoglobulinas G, M e A (Tabela 3), bem como as subclasses de
IgG 1, 2, 3 e 4, quando então não foi possível detectar a presença de IgG4 (Tabela 4).
-77-
Tabela 3: Concentrações das classes de imunoglobulinas encontradas no soro do paciente*.
Tipo de
Imunoglobulina
Resultado
IgG 698 mg/dl
IgM 280 mg/dl
IgA 96 mg/dl
IgE 3270 U/ml
* Teste realizado pelo Departamento de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo.
Tabela 4: Concentrações das subclasses de IgG encontradas no soro do paciente *.
Subclasse
de IgG
Resultado
(mg/dl)
IgG1 569
IgG2 164
IgG3 12
IgG4 Indetectável
* Teste realizado pelo Departamento de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo.
O restante da avaliação mostrou a presença de uma resposta positiva para a sorologia
de rubéola, mas negativa para sarampo e HIV (Tabela 5), a existência subpopulações
normais de linfócitos (Tabela 6), bem como uma resposta proliferativa normal dessas
células a determinados mitógenos (Tabela 7) e uma resposta normal de anticorpos à vacina
anti-pneumocócica (pneumo 23) (Tabela 8).
Tabela 5: Avaliação da presença de anticorpos da classe IgM e IgG contra os agentes
etiológicos da rubéola, sarampo e AIDS*.
-78-
Tipo de
Sorologia
IgM IgG
Rubéola - +
Sarampo - -
HIV - -
* Teste realizado pelo Departamento de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo.
Tabela 6: Avaliação das subpopulações de linfócitos encontradas no soro do paciente*.
Valor
Relativo (%)
Valor Absoluto
(céls./mm
3
)
Leucócitos Totais 8.400
Linfócitos 44,4 3.730
Céls. T CD3
+
70 2.611
Céls. T CD4
+
37,8 1.410
Céls. T CD8
+
25,1 936
Céls. CD19
+
21,7 809
Céls. CD56
+
5,5 205
* Teste realizados pelo Departamento de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo.
Tabela 7: Avaliação da resposta proliferativa dos linfócitos do paciente a determinados
mitógenos*.
-79-
Mitógeno
Índice de
Estimulação
Valor de Referência
Percentil 5
Valor de Referência
Percentil 95
PHA 42,49 18,2 343
OKT3 23,97 15,62 219,3
PWM 124,43 8,42 107,4
* Teste realizados pelo Departamento de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo.
Tabela 8: Avaliação da produção de anticorpos anti-pneumococo pelo paciente após
administração da vacina pneumo 23*.
Sorotipo Ps1 Ps5 Ps6B Ps8
Pré-vacinal 3,9 8,22 2,43 3,83
Pós-vacinal 5,18 8,77 2,91 5,75
* Teste realizado pelo Departamento de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo.
Após esses episódios graves de pneumonia o paciente tem sido mantido sob
antibioticoterapia profilática com amoxicilina e não ocorreram novos episódios infecciosos.
Exames de urina tipo I e ultrasonografias do abdômen (prevenção de SHU) têm sido
realizados periodicamente como protocolo de monitoração do paciente.
Os pais do paciente são primos de primeiro grau e não manifestaram episódios
infecciosos nem qualquer sintoma associado com a deficiência de FH. O casal possui, ainda,
uma outra filha também saudável.
O paciente foi inicialmente diagnosticado como deficiente do componente C3 pela
Dra. Anete Grumach (Grupo de Imunodeficiências Primárias de Pacientes Não
Hospitalizados – Departamento de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Universidade
de São Paulo) e posteriormente caracterizado por nós como deficiente da proteína reguladora
FH em concomitância com o componente C9.
-80-
4.2 Atividade Hemolítica mediada pela Via Clássica
O ensaio hemolítico empregado para a via clássica do C é uma modificação da
metodologia publicada por NILSSON & NILSSON (1984).
Um volume de 4 ml de hemácias de carneiro foi lavado em 6 ml de tampão CFD
(Complement Fixation Buffer- 4mM de Barbital de sódio; 145 mM cloreto de sódio; 830
mM cloreto de magnésio; 250 mM cloreto de cálcio) e a mistura centrifugada por 5 min a
720 x g. O sobrenadante foi desprezado e as hemácias ressuspensas em CFD q.s.p. para 10
ml. O processo foi repetido mais duas vezes e as hemácias diluídas a 10% em CFD.
Para sensibilizar as hemácias, 1 ml de soro de coelho anti-carneiro (1:100) foi
adicionado à suspensão, incubando-se a 4 °C por 30 min. O processo de lavagem foi
repetido por três vezes, como descrito acima, e a mistura ressuspensa em CFD q.s.p. para 10
ml. Um volume de 500 µL dessa solução foi retirado e misturado a agarose a 1% em CFD. A
mistura foi despejada sobre placas de vidro (8 cm x 8 cm) e as placas colocadas em câmera
úmida a 4 °C até o gel polimerizar por completo, quando então poços de 3 mm de diâmetro
foram cortados no gel.
Uma mistura de soros de 47 indivíduos normais foi diluída em várias porcentagens
(100%, 75%, 50%, 25% e 12,5%) e utilizada para construção da curva-padrão. Um volume
de 7,5 µL/poço das amostras e de cada uma das diluições da curva padrão foi aplicado e
colocado pra difundir no gel por 18h a 4 °C. Em seguida, a placa foi incubada em estufa a 37
°C por 90 min e o tamanho dos halos de hemólise medido.
4.3 Atividade Hemolítica mediada pela Via Alternativa
O ensaio hemolítico empregado para avaliação da via alternativa do C é uma
modificação da metodologia publicada por NILSSON & NILSSON (1984).
-81-
Um volume de 4 ml de agarose (1%) foi misturado a 5,1 ml de GVB-EGTA-Mg
2+
(143,4mM de cloreto de sódio; 0,96 mM de barbital de sódio; 2,5 mM de barbital; 2mM de
magnésio; 8mM de EGTA) a 56°C. Em seguida foram adicionados (a 45°C) 500 µL de uma
suspensão de hemácias de cobaia a 10% (previamente lavadas em GVB-EGTA-Mg
2+
,
semelhante ao realizado para a via clássica) e a mistura despejada em placas de vidro (8 cm
x 8 cm), que foram colocadas em câmera úmida a 4 °C até a polimerização do gel. As placas
foram retiradas da geladeira e poços de 3 mm de diâmetro cortados no gel.
Uma mistura de soros de 47 indivíduos normais foi diluída em várias porcentagens
(100%, 75%, 50%, 25% e 12,5%) em tampão PBS/EGTA/Mg
2+
e utilizada como curva-
padrão. Um volume de 7,5 µL/poço das amostras e de cada uma das diluições da curva
padrão foi aplicado e colocado pra difundir no gel 18h a 4 °C. Em seguida, a placa foi
incubada em estufa a 37 °C por 90 min e o tamanho dos halos de hemólise formados
avaliado.
4.4 Imunodifusão Radial
O método de imunodifusão radial (Mancini et al, 1965) foi utilizado para determinar
as concentrações de C3, C4, FB, Properdina e FI nos soros do paciente e de seus familiares
em comparação com as concentrações dessas proteínas encontradas nos soros de indivíduos
normais (Ferriani et al, 1999; Ferreira de Paula et al, 2001).
Foram utilizadas placas de vidro (8 cm x 8 cm) recobertas por uma camada (~1 mm)
de agarose a 1% em PBS (1,6 mM de fosfato de sódio monobásico; 15 mM de fosfato de
sódio bibásico; 140 mM de cloreto de sódio) contendo 2% de soro policlonal feito em cabra
(Calbiochem) contendo anticorpos específicos para cada proteína.
Após solidificação do gel foram cortados orifícios de 3 mm de diâmetro, onde foram
aplicados 5µL das amostras, em duplicada. Após 24h de difusão a 4 °C em ambiente úmido,
-82-
as lâminas foram submergidas em solução salina (0,15 M de cloreto de sódio) por mais 24h
a 4 °C. Após esse período, as amostras foram secadas em estufa a 37 °C por 48h, coradas em
solução de Coomassie Blue (1mM de Comassie Blue, 10% de ácido acético glacial e 45% de
etanol P.A.) por 20 min e descoradas por 15 min em solução descorante (10% de ácido
acético glacial e 25% de etanol P.A.).
Uma mistura de soros de 47 indivíduos normais, com concentração conhecida de C3,
C4, FB, Properdina e FI, foi empregada em diferentes diluições, para estabelecimento de
uma curva-padrão. A partir dela as concentrações das proteínas nos soros do paciente e de
seus familiares foram extrapoladas por regressão linear.
4.5 Imunodifusão dupla
Utilizando a imunodifusão dupla (Ouchterlony & Nilsson, 1978) avaliamos de forma
semi-quantitativa as proteínas C5, C6, C7, C8 e C9 nos soros dos pacientes e de seus
familiares diluídos de 1:2 a 1:32 seriadas em PBS.
Após 48h de difusão a 4 °C, as lâminas foram lavadas e coradas como descrito
anteriormente para a imunodifusão radial. Os resultados foram avaliados de acordo com a
formação de uma linha visível de precipitação entre os poços contendo o soro e o poço
contendo o anticorpo específico.
4.6 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
4.6.1 ELISA para FH
O anticorpo policlonal anti-FH feito em coelho (13,6 mg/ml - gentilmente cedido
pela Dra. Pilar Sánchez-Corral, Hospital Universitario La Paz, Madri, Espanha) foi diluído
-83-
no tampão contendo 0,1M bicarbonato/carbonato de sódio, pH 9,6, na concentração de 3,4
µg/ml e adicionado à placa de ELISA (96 poços - 100 µL/poço) por 18 h a 4 °C. Após cinco
lavagens com 200 µL/poço de PBS-Tween (1,6 mM de fosfato de sódio monobásico; 15 mM
de fosfato de sódio bibásico; 140 mM de cloreto de sódio; 0,05% de Tween 20), foi
realizado o bloqueio com leite desnatado a 5% (200 µL/poço) em PBS-Tween por 1 h a 37
°C (A partir deste momento, todos os soros e anticorpos foram diluídos em tampão PBS-
Tween e incubados (100 µL/poço) a 37 °C por 1h).
Terminado o bloqueio e realizado mais um ciclo de lavagens, foram adicionados os
soros do paciente e de seus familiares diluídos a 1:2000, 1:4000 e 1: 8000, além de um pool
de soro humano normal diluído a 1:2000, 1:4000, 1:8000 e 1:16000 e da proteína FH
purificada (Calbiochem) em diferentes concentrações (0,06 ng/ml a 1000 ng/ml). Após a
incubação e lavagens o anticorpo policlonal anti-FH feito em cabra (Calbiochem) diluído a
1:4000 foi adicionado. Finda a incubação e novo ciclo de lavagens foi realizada a incubação
com o anticorpo terciário, anti-IgG de cabra policlonal conjugado com fosfatase alcalina
(Calbiochem), diluído a 1:5000.
Após novo ciclo de lavagens foi realizada a etapa de revelação, adicionando 200
µL/poço de uma solução de p_NPP (para-nitrofenil fosfato) a 1 mg/ml em tampão para
fosfatase alcalina (0,1M de dietanolamina; 0,02% de azida sódica; 0,5 mM de cloreto de
magnésio - pH 9,8). Passados aproximadamente 35 min a leitura das absorbâncias foi feita
em leitor de ELISA a 405 nm.
O método ELISA sanduíche para avaliação da concentração do FH estabelecido em
nosso laboratório teve como limite mínimo de detecção a concentração de 0,24 ng/ml e
como limite máximo 125 ng/ml. A curva padrão com a proteína purificada foi construída e o
valor de R
2
obtido foi de 0,99.
-84-
As amostras foram testadas em triplicata e os valores das absorbâncias obtidos com
os soros diluídos a 1:8000 foram os escolhidos para determinação da concentração de FH
nos soros do paciente e de sua família.
4.6.2 ELISA para C9
O ELISA para determinação da concentração da proteína C9 no soro do paciente e de
seus familiares foi estabelecido com pequenas diferenças em relação às condições definidas
para o ELISA de detecção da proteína FH. Assim, as particularidades citadas a seguir são as
únicas distinções entre o ELISA estabelecido para FH e o estabelecido para C9.
O anticorpo policlonal anti-C9 feito em cabra (Calbiochem) foi diluído a 1:1000 e
usado para sensibilizar a placa de ELISA.
A etapa de bloqueio foi realizada pela adição de 200 µL de Soro Fetal Bovino
inativado (SFBi) em cada poço da placa e incubação por 1h a 37 °C. A partir desta etapa
todos os soros e anticorpos foram diluídos em SFBi.
Os soros e a proteína C9 purificada foram diluídos e incubados por 2h a 37 °C. Após
a incubação com as amostras, o anticorpo policlonal anti-C9 feito em coelho (Serotec) foi
diluído a 1:2000 e usado como anticorpo secundário.
O método ELISA sanduíche para avaliação da concentração de C9 estabelecido em
nosso laboratório teve como limite mínimo de detecção a concentração de 1,95 ng/ml e
como limite máximo 125 ng/ml. A curva padrão com a proteína purificada foi construída e o
valor de R
2
obtido foi de 0,99.
As amostras foram testadas em triplicata e os valores das absorbâncias obtidos com
os soros diluídos a 1:2000 foram os escolhidos para determinação da concentração de C9 nos
soros do paciente e de sua família.
-85-
4.7 Western Blot
As amostras foram submetidas à análise em SDS-PAGE. Findada a corrida, o gel e
algumas folhas de papel de filtro foram embebidos em tampão de transferência (Tris-Cl pH
7,5 48 mM, glicina 39 mM, dodecilsulfato de sódio 0,037% (p/v), metanol 20%). Feito isto,
o gel foi posto sobre uma membrana de nitrocelulose e esta sobre uma camada de 3 folhas de
papel de filtro que, por sua vez, repousam sobre um eletrodo. Para finalizar este processo,
mais uma camada de folhas de papel de filtro foi colocada diretamente sobre o gel. Esse
material foi, então, submetido a uma corrente de 0,8 mA/cm
2
de membrana durante 4h. Após
a eletrotransferência, a membrana de nitrocelulose foi lavada em água Milli-Q e corada em
solução de Ponceau S 0,1% (p/v) em ácido acético 10% (v/v) por 1 min. O excesso de
corante foi retirado após lavagens sucessivas com água Milli-Q. Em seguida, a membrana
foi lavada com tampão TBST [Tris-Cl pH 8,0 5,0 mM, NaCl 75 mM, Tween 20 0,028%
(v/v)] e incubada por aproximadamente 18 h, sob agitação, em solução de albumina a 3% no
mesmo tampão, à temperatura ambiente. Após o tempo determinado, foram feitas 3 lavagens
com o próprio tampão, para retirar o excesso de albumina. Neste momento, foi realizada a
incubação com o primeiro anticorpo (anticorpo policlonal anti-FH feito em coelho –
gentilmente cedido pela Dra. Pilar Sánchez-Corral), diluído a 1:5000 em 25 ml do tampão
TBST, por 2h à temperatura ambiente, sob agitação. Novas lavagens foram feitas e, então,
realizada a incubação com o segundo anticorpo (1:10.000) (anticorpo policlonal anti-IgG de
coelho marcado com fosfatase alcalina – Calbiochem) em condições semelhantes às da
incubação anterior. Finalmente, após novas lavagens, foi realizada a etapa de revelação das
bandas, por meio da incubação da membrana com 10 ml de solução APB (NaCl 100 mM,
Tris-Cl pH 9,5 100 mM, MgCl
2
5 mM), acrescida de 6 µL de nitroazul tetrazólico [NBT,
Nitro Blue Tetrazolium) a 0,3 mg/ml (preparado em formamida 70% v/v)] e de 3 µL de 5-
bromo-4-cloro-3-indolil fosfato 0,15 mg/ml (preparado em formamida 100%). O processo de
-86-
revelação foi interrompido ao lavar a membrana com água Milli-Q, quando o nível de
coloração desejado foi atingido.
4.8 Cultura de Fibroblastos da Pele
Os fibroblastos foram obtidos a partir de fragmentos de pele retirados do probando,
de seus familiares e de indivíduos normais, após concentimento informado, de acordo com
VYSE et al. (1996), e funcionaram como fonte de ácidos nucléicos.
Os fragmentos de pele foram descontaminados em meio de cultura contendo excesso
de penicilina (500 U/ml) e estreptomicina (500 µg/ml) por 2h. Cortes finos deste material
foram colocados em garrafas de cultura contendo meio DMEM (pH 7,2: meio de cultura
comercial contendo HEPES a 25 mM, bicarbonato de sódio a 24 mM, L-glutamina a 2 mM e
glicose a 25 mM, suplementado com de soro fetal bovino inativado (SFBi - 10%), glutamina
(1%), penicilina (50 U/ml) e estreptomicina (50 µg/ml) e incubados a 37 °C. Após alguns
dias de incubação, os fibroblastos atingiram 80% de confluência e, neste ponto, foram
removidos com solução de tripsina (pH 7,8: 0,08% de tripsina, glicose a 5,5 mM, cloreto de
sódio e EDTA a 0,5 mM em água Millli-Q), centrifugados e ressuspendidos novamente em
meio DMEM suplementado (10% SFBi) e semeados em novas garrafas. Por fim, quando as
células estavam ocupando completamente o fundo da garrafa, elas foram estimuladas a
produzir RNAm pela adição de 100U de INFγ/ml e incubadas por 24h. Após esse período, o
RNA total dessas células foi, então, extraído (Reis et al., 2002; Ulbrich, 1999).
4.9 Extração de RNA Total
O RNA total foi extraído empregando-se o kit Total RNA Isolation System (Promega
Corporation – Madson, WI, EUA), conforme PERRY et al (1972) e CHIRGWIN et al
-87-
(1979), seguindo-se as instruções do fabricante. Para tal procedimento, aproximadamente
2x10
6
células foram lavadas em PBS e lisadas com solução de desnaturação [(fornecida pelo
fabricante Promega: citrato de sódio 26 mM (pH 6,8), N-lauril sarcosina 0,5%, β-
mercaptoetanol 0,125 M e tiocianato de guanidina 4 M)]. Após a lise, o DNA e o RNA
foram separados das proteínas por exposição ao NaOAc 2M e à solução de
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (na proporção de 125:24:1). Após 15 min em gelo, o
lisado foi centrifugado a 12.000 x g por 20 min a 4 °C e o sobrenadante transferido para um
outro tubo, onde foi diluído a 1:1 em isopropanol. Esta solução foi, então, precipitada a –20
°C, por 24h, para que o RNA pudesse ser separado dos demais componentes da solução.
Após precipitação, nova centrifugação foi realizada a 12.000 x g a 4 °C por 40 min e o
sobrenadante desprezado. O precipitado, por sua vez, foi lavado com 1 ml de EtOH 75%
gelado e ressuspendido em água autoclavada.
4.10 Quantificação do RNA
O RNA total extraído foi quantificado por meio da absorbância a 260 e 280 nm em
espectrofotômetro GeneQuant (GE), considerando-se 1 D.O.= 40 µg/ml de RNA. As
amostras que apresentaram valor de 260/280 nm (grau de pureza) entre 1,7 e 2,0 foram
empregadas.
4.11 “Reverse transcriptase-polymerase chain reaction” (RT-PCR) para Amplificação do
cDNA de FH
As reações de RT-PCR foram realizadas empregando-se o kit “SuperScript One-Step
RT-PCR System” (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Califórnia), seguindo-se as
-88-
instruções do fabricante. Foram utilizados oligonucleotídeos específicos (Quadro 1) para
amplificação das porções desejadas do cDNA, conforme esquematizado na Figura 13.
-89-
Quadro 1: Oligonucleotídeos utilizados em RT-PCR, PCR e seqüenciamento do cDNA de
FH.
Primer Sentido
1 ATT TCT
TGG AAG
AGG AGA
AC F
753 ATA AGG AGA ATG AAC GAT TTC F
1483 TTT TAA GGC ATA TGT ATA CGT R
1560 AAG ATG GAT GGT CAG CTC AAC F
1662 TCA TTC AGC TTA AAC CAT GTG R
1969 ACC TCC TGA ACT CCT CAA TG F
2698 CTG AGG TGG TTG TGA ACA TG R
3167 TGC ATT AAT AGC
AGA TGG
AC F
3186 GTC CAT CTG CTA TTA ATG CA R
3919 CCA CCG GTC TCA GCT TAT AA R
FH GEN F CAG TCC ATG CAC
CAA GAA
GGA F
FH GEN R CAG GCT GCA TTC GTT TTT GGC R
F: amplificação no sentido 5' - 3'; R: amplificação no sentido 3' - 5'.
Seqüência 5'
→
→→
→
3'
PCR
RT - PCR
-90-
As reações foram preparadas para um volume final de 50 µL contendo 100 ng de
RNA total, 20 pmoles de oligonucleotídeos, tampão (tampão contendo 0,4 mM de cada
dNTP e 2,4 mM de sulfato de magnésio – fornecido pelo fabricante) e 1 µL de RT/Taq mix
(mistura de Taq DNA polimerase recombinante com SuperScript
TM
H transcriptase reversa).
A primeira fita de cDNA correspondente ao RNAm poliadenilado foi produzida ao manter-
se a reação a 50 °C por 30 min. Em seguida, as moléculas de DNA foram desnaturadas a 94
°C por 2 min e os fragmentos específicos do cDNA amplificados após 40 ciclos na seguintes
condições: 30 s a 94 °C, 30 s a 54 °C e 1 min a 72 °C. Uma extensão final de 7 min a 72 °C
foi realizada e os tubos mantidos a 4 °C. A amplificação do cDNA do gliceraldeído 3-fosfato
dehidrogenase (GAPDH) humano foi realizada como controle técnico das quantidades de
RNA total empregadas nas reações.
Os produtos amplificados foram analisados após eletroforese em géis de agarose a
1% em tampão Tris-borato-EDTA submetidos a 8 V/cm durante 45-60 min. Após coloração
com brometo de etídio, as bandas foram analisadas sob luz ultra-violeta e fotografadas.
1560 2698
1671 210
1 1483
1969
3186
3167
3919
Figura 13: Representação esquemática dos fragmentos do cDNA de FH (3926 pb)
amplificados e posteriormente seqüenciadas. Os números indicam o início e o fim de
cada fragmento, compatíveis com os primers utilizados.
-91-
4.12 PCR para Amplificação dos Éxons de C9
As reações foram preparadas para um volume final de 25 µl quando foram
adicionados de 1 a 2 µl do DNA genômico (100 ng/µL) do paciente ou de um controle
normal, 2,5 µL do tampão 10X (500 mM KCL, 15 mM MgCl2 e 100 mM Tris-HCL – GE
Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, UK), 10 mM de dNTPs, os oligonucleotídeos
específicos (50 ng/µL) (Quadro 2), 5 U de rTaq DNA polymerase (GE Healthcare UK
Limited, Buckinghamshire, UK) e água q.s.p. para 25 µL. A reação de amplificação
propriamente dita foi feita a 95
o
C por 1 min seguida por 40 ciclos de: 1 min s a 95
o
C, 1 min
a 54-62
o
C (dependendo dos oligonucleotídeos utilizados) e 1 min de extensão a 72
o
C. Ao
final dos ciclos, foi realizada uma extensão final a 72
o
C por 7 min e os tubos foram
mantidos a 4
o
C. Os produtos amplificados foram analisados após eletroforese em géis de
agarose a 1% em tampão Tris-borato-EDTA (TBE - 100 mM de Tris, 100 mM de ácido
bórico e 2 mM de EDTA) submetidos a 8 V/cm durante 45-60 min. Após coloração com
brometo de etídio, as bandas foram analisadas sob luz ultra-violeta e fotografadas.
-92-
Quadro 2: Oligonucleotídeos utilizados em PCR e seqüenciamento das regiões de C9 a
partir de DNA genômico.
Primer Sentido
1F F
1R R
2 F F
2 R R
3 F F
3 R R
4 F F
4 R R
5 F F
5 R R
6 F F
6 R R
7 F F
7 R R
8 F F
8 R R
9 F F
9 R R
10 F F
10 R R
11A F F
11A R R
11B F F
11B R R
F: amplificação no sentido 5' - 3'; R: amplificação no sentido 3' - 5'.
AAC CAT TGA CTG ATT GCA GGG
PCR
Seqüência 5'
→
→→
→
3'
GAC TTC TTG GAA ACA GAT ATA C
GGC TCC CTG CCT CAT AAT CAT
TTC ATT CAG GAA GGC ACA CAG
GAT ACC TCA CCT CCA GGG TTA
CAC CTA TGT CCC TCG CAC AAA
GTT GTG GTA TTT CCA CTT CTG
CAG GAC AGA CAT GAT GGC ACA
CAT TGA CAT CTA CCC TCA GGC
CTT TTG ATA ACT GGC TTC TC
TCC AAA CTA CAT CGC CTC TTC
TTG CTC TTA ACT CCT TTG TTC
TGG GTA GTT TGG AAC CTT TC
GGT ATC TCA TGG TCA CTG CTA
CTG AAT GAA TGT ATG CAC ACC
GTA TGG TTA ACA TAT TCT GCC
TAA GCA CCA TGT TCT CTA ATG
ATT CTC CTT TGG TTG GAC TTC
CAT TGT CAT GTA CTT TGC TGC
AAT GAC ACA GTC TTC TGT TTG
GTA TTC TAC AAG TTC TCT CAG
AAT TAG ATA ACC CCA AAG TGC
GGA CCC AAA GTA AAA TCC TAT TG
GCA GGT TAC AGG GCT TTG TAT
-93-
4.13 Purificação do DNA a Partir do Gel de Agarose
Os fragmentos de cDNA amplificados foram aplicados em gel de agarose 1% sob
tampão TBE. Após a coloração em brometo de etídio, a área contendo o cDNA foi cortada
do gel e utilizou-se o kit “Concert
TM
Gel Extraction Systems” (GIBCO Invitrogen
Incorporation, Carlsbad, Califórnia), segundo Vogelstein & Gillespie (1979), para a
extração. A área contendo o cDNA foi colocada em um tubo, onde foi adicionado o tampão
de solubilização (perclorato de sódio, acetato de sódio e TBE, fornecido pelo fabricante),
com posterior incubação de 15 min a 50 °C.
Transferiu-se o material solubilizado para uma coluna de filtração e centrifugou-se a
12.000 x g por 1 min. Descartou-se o eluato e adicionou-se à coluna mais 500 µL de tampão
de lavagem (NaCl, EDTA, Tris-HCL e EtOH, fornecido pelo fabricante), com nova
centrifugação. Por fim, o cDNA foi eluído em 50 µL de tampão TE (10 mM Tris-HCl e 0,1
mM de EDTA).
4.14 Extração de DNA Genômico Utilizando DNAzol
As células da garrafa de cultura foram removidas usando tripsina (0,1% de tripsina e
1mM de EDTA) (~ 2x10
6
céls.) por aproximadamente 3 min a 37 °C. Adicionou-se 0,5 ml
de DNAzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Califórnia) às células, homogeinizando
com a pipeta para auxiliar a lise. Adicionou-se, então, 0,3 ml de EtOH 100% e centrifugou-
se a 1.000 x g por 10 min. Retirou-se o sobrenadante e lavou-se o precipitado com 1 ml de
etanol 95%. Esperou-se o precipitado secar, com o tubo aberto à temperatura ambiente,
dissolvendo-o em 200 µL de TE.
-94-
4.15 Reações de Seqüenciamento
Em um volume final de 20 µL de reação, adicionamos: 300 ng de DNA/cDNA, 1 µL
de oligonucleotídeos específicos (3,2 pmols/µL), 6 µL de tampão (200 mM tris-HCL e 5
mM MgCL
2
pH 9,0), 2 µL de enzima mix (fornecido pelo fabricante GE Healthcare UK
Limited, Buckinghamshire, UK) e água suficiente para completar 20 µL. Esta mistura foi
colocada para reagir a 96 °C por 10 s (desnaturação), a 50 °C por 5 s (anelamento) e a 60 °C
por 4 min (amplificação propriamente dita). Estas etapas repetiram-se seguidamente por 40
vezes. Terminados os ciclos, 80 µL de isopropanol 75% foram adicionados e deixando-se
reagir por 15 min à temperatura ambiente. Terminado este tempo, centrifugou-se o material
por 20 min e lavou-se o precipitado com 250 µL de isopropanol 75%, seguida de nova
centrifugação por 5 minutos. As reações, uma vez preparadas em nosso laboratório, foram
seqüenciadas no Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São
Paulo, quando contamos com a colaboração do Prof. Dr. Shaker Chuck Farah.
4.16 Microscopia Confocal
A metodologia empregada neste experimento foi adaptada a partir da publicada por
Fishelson et al (1999).
Fibroblastos foram cultivados sobre lamínulas por 24h em meio de cultura DMEM
completo e em seguida estimulados por 20h com LPS 1 µg/ml. Após este período, as células
foram lavadas com PBS (fosfato de potássio dibásico a 5 mM, fosfato de potássio
monobásico a 1,2 mM e cloreto de sódio a 150 mM - pH 7,2) e fixadas com 3,7%
formaldeído em PBS por 15 min. Logo após, as células foram lavadas com glicina 0,1M em
PBS (PBS-glicina) e depois apenas com PBS. As células foram, então, permeabilizadas com
0,2% Triton X-100 em PBS por 2 min, lavadas 2X com PBS contendo 10% soro bovino fetal
inativado (PBS-SBFi) e incubadas por 10 min com PBS-SBFi. O tampão foi aspirado e as
-95-
células incubadas a 4º C com anticorpo anti-FH humano feito em cabra diluído 1:200 em
PBS-glicina, por pelo menos 16h. Em seguida, as células foram lavadas 3X com PBS-SBFi e
incubadas à temperatura ambiente com soro normal de coelho diluído 1:200 em PBS-SBFi,
por 30 min. O material foi, então, lavado 5X com PBS-SBFi e incubado com anticorpo de
coelho anti-IgG de cabra marcado com FITC, por 1h à temperatura ambiente no escuro.
Após novo ciclo de lavagens com PBS-SBFi (5X) foi feita nova incubação com RNAse
10mg/ml em PBS por 30 min à temperatura ambiente no escuro. Finalmente, o material foi
novamente lavado com PBS-SBFi (3X), incubado com iodeto de propídeo 10 mg/ml por 30
min à temperatura ambiente no escuro e as lâminas montadas com Gel Mount (Vectashield).
As análises foram feitas no dia seguinte à montagem, em microscópio confocal.
-96-
V_RESULTADOS
5.1 Determinação das Atividades Hemolíticas das Vias Clássica e Alternativa no Soro do
Paciente e de Seus Familiares
Uma vez que deficiências de proteínas do C estão diretamente associadas com o
comprometimento funcional desse sistema, optamos por avaliar essa funcionalidade através
do poder que as proteínas componentes das vias clássica e alternativa, presentes no soro do
paciente e de seus familiares, teriam para provocar a lise de hemácias não próprias.
Foram feitos dois tipos de ensaio hemolítico para avaliar a ativação das vias clássica
e alternativa nos soros do paciente e de seus familiares.
O soro do paciente não apresentou evidências de atividade hemolítica por qualquer
das vias (Tabela 9), indicando a possibilidade da presença em baixas concentrações de uma
proteína do C comum às duas vias, como é o caso do C3 e/ou dos componentes da via
terminal. A queda na concentração de C3 pode acontecer como resultado de um processo
infeccioso, que leva a um consumo elevado desta proteína, de uma alteração genética que
leve a problemas de produção ou secreção de C3 no soro do paciente (deficiência primária)
ou da deficiência de proteínas reguladoras do C, que, uma vez ausentes, não impediriam o
consumo excessivo de C3 quando da ativação do C (deficiência secundária). Uma vez que o
paciente apresentava-se assintomático no momento da coleta de soro, restaram apenas as
possibilidades de deficiências primárias e secundárias de C3 a serem investigadas, bem
como a deficiência de componentes da via terminal do C.
-97-
Tabela 9: Porcentagem das Atividades Hemolíticas Dependentes das Vias Clássica e
Alternativa nos Soros do Paciente e de Sua Família.
Via Alternativa (%) Via Clássica (%)
Paciente Sem lise Sem lise
Pai 117,47 127,59
Mãe 43,28 75,72
Irmã 82,2 119,67
Normal 71-171 56-192
Atividade Hemolítica
O soro da mãe foi capaz de provocar hemólise em níveis normais pela via clássica
(75,7%), mas não pela via alternativa (43,3%). Este resultado indica uma provável
deficiência de proteínas da via alternativa do C também no soro da mãe. Diante das
possibilidades citadas acima e uma vez que o soro da mãe foi menos capaz de provocar
hemólise pela via alternativa, sinais da existência da deficiência de proteínas do C
pertencentes à via alternativa, mas não às vias clássica e terminal tornaram-se evidentes.
Os soros do pai e irmã foram capazes de mediar hemólise em níveis normais, tanto
pela via clássica (127,6% e 119,7%, respectivamente) quanto pela via alternativa (117,5%,
82,2%, respectivamente). Estes dados indicam a presença de níveis próximos do normal ou
mesmo níveis normais das proteínas do C nos soros do pai e irmã do paciente, habilitando-os
a mediarem hemólise pelas duas vias avaliadas.
-98-
5.2 Determinação da Concentração das Proteínas do Complemento no Soro do Paciente e
de sua Família
Indivíduos deficientes de C3 de forma primária ou secundária apresentam atividade
hemolítica inexistente ou reduzida, tanto pela via clássica (e via das lectinas) como pela
alternativa, por ser este um componente central para a ativação das três vias do C. Assim,
decidimos avaliar a sua concentração no soro do paciente e de seus familiares, bem como de
outras proteínas também envolvidas na via alternativa, como FB, de reguladores que atuam
ao nível de C3, como FH e FI, de C4, componente da via clássica, e de properdina, proteína
envolvida na via terminal.
Sabendo que algumas proteínas do C encontram-se normalmente em concentrações
séricas elevadas, como é o caso do C3 (em torno de 1.300 µg/ml) e do FH (em torno de 600
µg/ml), optamos inicialmente por um método menos sensível e cuja sensibilidade limita-se à
detecção de proteínas presentes na amostra a partir da escala de microgramas, como é o caso
da Imunodifusão Radial (Mancini). Uma vez que o FH foi encontrado em concentrações
muito baixas (abaixo do limite de detecção do método) (resultado não mostrado) no soro do
paciente em diferentes ensaios, decidimos, então, substituir a imunodifusão radial por um
método mais sensível na detecção da concentração desta proteína, o ELISA, cujo limite de
detecção permite a identificação de proteínas presentes na amostra desde a escala de
picogramas.
Assim, para determinar a concentração de C3, C4, FB e FI nós utilizamos o método
de imunodifusão radial, enquanto que a concentração do FH no soro do paciente e de seus
familiares foi avaliada pelo método de ELISA sanduíche.
Avaliamos, ainda, a concentração de properdina pela utilização de kit de
imunodifusão radial (The Binding Site) de acordo com as instruções fornecidas pelo
fabricante.
-99-
5.2.1 Determinação da Concentração de C3, C4, FB, FI e properdina no Soro do
Paciente e de sua Família Utilizando o método de Imunodifusão Dupla
Usando imunodifusão radial (Mancini et al, 1965) nós determinamos a concentração
de C3, C4, FB, FI e properdina no soro do paciente e de seus familiares (Tabela 10). Os
valores normais usados para comparação foram estabelecidos por Ferriani et al, 1999 e
Ferreira de Paula et al, 2003.
Tabela 10: Concentração de C3, C4, FB, FI e properdina no soro do paciente e de su
família.
C3
µg/mL
C4
µg/mL
FB
FI
µg/mL
Properdina
µg/mL
Paciente Indetectável 467,7 <25% 51,6 12
Pai 1270,7 807,3 46,4% 52,2 Nd
Mãe 382,6 514,4 27,4% 23,6 Nd
Irmã 1271,1 615,5 Nd Nd Nd
Normal (3-4 anos
a
; 1-6anos
b
):
média
905
a
16,4
a
-
57,9
b
23,1
b
Normal (3-4 anos
a
; 1-6anos
b
):
intervalo
610-1410
a
95-302
a
-
29,97 - 103,54
b
13,22 - 38,01
b
Normal (adulto): média
- -
180
d
63,9
b
26,48
b
Normal (adulto): intervalo
800-1900
c
450-600
a
38,78 - 100,49
b
14,53 - 40,61
b
Nd = Não determinado;
a
Ferriani et al, 1999;
b
Ferreira de Paula et al , 2003;
c
Ritchie et al , 2003;
d
Oglesbu et al , 1998.
Como esperado, o paciente apresentou níveis muito baixos de C3 (abaixo do limite
de detecção do método) e surpreendentemente elevados de C4 (467,7 µg/ml). Entretanto,
observamos que o paciente apresentava, além dos níveis muito reduzidos de C3, níveis
-100-
também muito reduzidos de FB (abaixo do limite de detecção do método) e níveis reduzidos,
porém dentro da faixa de normalidade, da proteína reguladora FI (51,6 µg/ml).
Sabendo que pacientes deficientes de proteínas que regulam a ativação C podem ter
consumo excessivo de outras proteínas envolvidas na sua ativação, como o C3 e FB, em
virtude da ativação desregulada, este último achado levou-nos a suspeitar que a deficiência
de C3 do paciente em questão seria secundária à deficiência primária de uma proteína
reguladora. Como as proteínas excessivamente consumidas pertenciam à via alternativa e
sabendo que a concentração do componente C4, pertencente à via clássica, encontrava-se
dentro da normalidade, pudemos, então sugerir que a proteína reguladora ausente no soro do
paciente seria possivelmente responsável pela regulação da via alternativa. Uma vez que os
principais reguladores da via alternativa são o FI e seu co-fator, o FH, e sabendo que a
concentração de FI no soro do paciente, apesar de reduzida, encontrava-se dentro da faixa de
normalidade, pudemos então propor que o paciente em questão era deficiente primário da
proteína reguladora FH.
Avaliamos, ainda, a concentração de properdina no soro do paciente, e encontramos
concentrações levemente reduzidas (12 µg/ml) desse regulador, entretanto, com valor muito
próximo ao do limite inferior da faixa de normalidade.
O soro da mãe do paciente apresentou níveis normais de C4 (514,4 µg/ml), mas
muito reduzidos de C3 (382,6 µg/ml) e FB (62,45 µg/ml). Este resultado indica que a
concentração de FH no soro da mãe está possivelmente também muito reduzida, a ponto de
também ser insuficiente para evitar o consumo excessivo de C3 e FB. Da mesma forma que
no paciente, a concentração de FI no soro apresentou níveis reduzidos, 23,6 µg/ml.
O soro do pai, por sua vez, apresentou concentrações normais de C3 (1270,7 µg/ml) e
FB (46,4%). Os níveis de FI (52,2 µg/ml) estavam levemente reduzidos, entretanto dentro da
faixa de normalidade considerada, enquanto os de C4 (807,6 µg/ml) estavam
surpreendentemente muito elevados.
-101-
Da mesma forma que o soro do pai, o soro da irmã apresentou concentrações normais
de C3 (1271,1 µg/ml) e muito elevadas de C4 (615,5 µg/ml).
5.2.2 Determinação da Concentração de FH no Soro do Paciente e de sua Família
Utilizando o método ELISA
Tendo proposto que o paciente estudado seria deficiente primário da proteína
reguladora FH, decidimos avaliar sua concentração no soro do paciente e de seus familiares
pelo método ELISA.
A concentração de FH encontrada no soro do paciente foi de 16,8 µg/ml (Tabela 11).
Este valor representa menos de 5% da concentração encontrada em indivíduos normais,
enquadrando o nosso paciente entre os deficientes totais desta proteína. Este resultado é
compatível com os encontrados para a atividade hemolítica do soro do paciente, e com as
concentrações de C3 e FB detectadas na etapa anterior, uma vez que a ausência desta
proteína reguladora levaria ao consumo excessivo de C3 e, conseqüentemente à
incapacidade ativar o C por qualquer três das vias.
Tabela 11: Concentração de FH nos Soros do Paciente e de Sua Família
-102-
Indivíduo FH (µg/mL)
Paciente 16,8
Pai 190,9
Mãe 140,5
Irmã 143,6
Normal (1-6 anos):
média
606,1
a
Normal (1-6 anos):
intervalo
233,46 - 1319,49
a
Normal (Adultos):
média
442,7
a
Normal (Adultos):
intervalo
241,8 - 758,91
a
a
Ferreira de Paula et al, 2003
A concentração de FH encontrada no soro da mãe (140,5 µg/ml) representa 31,7% da
concentração encontrada em indivíduos normais.
Nos soros do pai e irmã do paciente o FH foi encontrado nas seguintes
concentrações: 190,9 µg/ml e 143,6 µg/ml, respectivamente. Estes valores representam
43,1% e 23,7%, respectivamente, da concentração encontrada em indivíduos normais e são
compatíveis com uma deficiência parcial desta proteína. Estes dados também estão em
acordo com a atividade hemolítica exibida por esses soros, uma vez que níveis de FH
garantem a presença deste regulador em concentração suficiente para evitar o consumo
excessivo de C3, quando da ativação do C e a capacidade de induzir hemílise a níveis
normais.
-103-
5.3 Avaliação do Perfil das Proteínas da Família FH no Soro do Paciente e de Seus
Familiares Utilizando o Western Blot.
De posse de todos os dados corroborando com a proposição do paciente estudado ser
portador de deficiência de FH, e diante da possibilidade de alterações funcionais do FH
encontrado no soro da mãe, tornou-se indispensável a utilização de um método que
possibilitasse a avaliação do perfil eletroforético desta proteína e que, conseqüentemente,
nos fornecesse algumas informações estruturais do FH presente no soro do paciente e de sua
família. Por esta razão, procedemos com a análise do FH no soro desta família por Western
Blot.
Adicionalmente, o conhecimento da existência de proteínas antigenicamente
relacionadas ao FH (família FH), contudo sem atividade de regulação da ativação do C
completamente esclarecida e que estas poderiam ser as responsáveis pela concentração
residual de FH detectada no soro do paciente e de sua mãe, tornou-se, então, necessário
avaliar quais membros da família FH estariam presentes no soro do paciente e de seus
familiares também pelo Western Blot; uma vez que os anticorpos utilizados nos métodos de
imunodifusão radial e ELISA não eram capazes de fazer tal distinção. Nossos resultados
mostram o perfil das proteínas da família FH presentes no soro do paciente e de sua família
em comparação com o controle normal (Figura 14).
-104-
O FH (150 kDa) estava completamente ausente no soro do paciente, mas presente no
soro de seus pais e irmã, resultado que confirma o enquadramento do paciente entre os
deficientes totais desta proteína. Apesar disso, o resultado mostrou a presença no soro do
paciente de outras proteínas, com aproximadamente 37 kDa, peso molecular equivalente ao
do FHR-1α, 42 kDa, peso correspondente ao do FHL-1 e do FHR-1β e 116 kDa, de
identidade por nós desconhecida. Vale ressaltar que esta proteína de 116 kDa estava presente
em concentração aparentemente muito reduzida quando comparada à encontrada no soro
controle.
Figura 14: Análise do perfil do FH, e das proteínas antigenicamente relacionadas a
ele, presentes no soro do paciente e de sua família através de Western Blotting usando
anticorpo policlonal de cabra anti-FH humano (gentilmente cedido pela Dra. Pilar
Sánchez-Corral, Espanha) como anticorpo primário. 1) Irmã; 2) Mãe; 3) Pai; 4)
Paciente; 5) Controle.
1 2 3 4 5
150 kDa
37 kDa
42 kDa
-105-
Pudemos observar também que no soro da mãe do paciente o FH (150 kDa) estava
presente em concentração aparentemente baixa, quando comparadas com o controle normal,
entretanto mais elevadas que as detectadas no paciente, resultado que está de acordo com os
obtidos pelo método ELISA. Entretanto, vale destacar que as proteínas de 37 kDa e 42 kDa
estavam presentes em concentrações possivelmente mais elevadas que as encontradas no
paciente e no controle normal. Este resultado leva-nos a vislumbrar a possibilidade de que a
concentração aumentada de FH detectada no soro da mãe pelo método ELISA, em
comparação com a detectada no soro do paciente, possa sofrer influência parcial da
concentração mais elevada dessas duas proteínas. A proteína de 116 kDa também estava
presente no soro da mãe.
Finalmente, observamos nos soros do pai e irmã do paciente, a presença tanto da
proteína reguladora (FH), como também de outros membros de sua família de proteínas,
FHL-1, FHR-1α, FHR-1β, além da proteína de aproximadamente 116 kDa. Até o momento
não temos conhecimento de qualquer proteína da família de proteínas do FH com tamanho
equivalente ao desta proteína, não sendo possível, portanto, determinar a sua identidade.
Vale ressaltar que todas as proteínas detectadas neste ensaio tiveram perfil
eletroforético semelhante ao das detectadas tanto no soro do controle como na amostra de
proteínas purificadas, indicando a ausência de alterações estruturais grosseiras nas
respectivas proteínas.
Como comentado previamente, tínhamos conhecimento de uma limitação técnica
presente no ensaio anterior, já que o anticorpo usado não possibilitava a distinção antigênica
entre alguns membros da família FH, FHL-1 e FHR-1β, com peso molecular muito
semelhante. Sabendo que uma alteração molecular no gene FH que cause a deficiência de
FH num indivíduo pode causar também a deficiência de FHL-1, uma vez que são
codificadas pelo mesmo gene, foi usado um outro anticorpo policlonal feito em coelho capaz
-106-
de reagir apenas com os SCRs-1 a -4 (anti-SCR1-4) humanos (gentilmente cedido pelo Dr.
Peter Zipfel, Alemanha), e, portanto, capaz de detectar somente as proteínas de 150 kDa
(FH) e 42 kDa (FHL-1), por serem as únicas proteínas da família FH a possuírem tais SCRs
em sua estrutura (Figura 15).
A proteína FHL-1 de 42 kDa estava também completamente ausente no soro do
paciente, mas presente nos soros de seus familiares. Este resultado nos leva a sugerir que,
uma vez que esta proteína e o FH são codificados pelo mesmo gene e sabendo que as duas
proteínas estão ausentes no soro do paciente, a alteração molecular responsável pela
ausência do FH no soro do paciente está possivelmente localizada nos primeiros quatro
150 kDa
43 kDa
1 2 3 4 5 6 7
Figura 15: Análise do perfil do FH e do FHL-1 presentes no soro do paciente e de
sua família através de Western Blotting utilizando anticorpo policlonal de coelho anti-
SCR(1-4) humano (gentilmente cedido pelo Dr. Peter Zipfel, Alemanha) como
anticorpo primário. 1) Fator H e FHL-1 purificados; 2) Controle normal; 3) Paciente;
4) Pai; 5) Mãe; 6) Irmã; 7) Fator H e FHL-1 purificados.
~86 kDa
~65 kDa
-107-
SCRs desta proteína, já que são os SCRs compartilhados exclusivamente pelo FH e pelo
FHL-1, ou afeta a expressão de ambas as proteínas.
Detectamos, ainda, duas outras proteínas, presentes em todos os soros examinados,
com pesos moleculares aproximados entre 86 kDa e 65 kDa. Sabemos que os pesos
moleculares do FHR-4 e do FHR-5 são de aproximadamente de 86 kDa e 65 kDa,
respectivamente. Entretanto, o anticorpo usado no ensaio detecta apenas os primeiros quatro
SCRs do FH e estes não são compartilhados pelos FHRs da família FH. Assim, torna-se
pouco provável que a identidade dessas duas proteínas detectadas neste ensaio possa ser
atribuída a essas duas proteínas. Como, até o momento, não temos conhecimento de outros
membros da família FH que tenham pesos moleculares semelhantes aos dessas proteínas
detectadas neste ensaio, não pudemos identificá-las e determinar sua identidade. A Tabela
12 apresenta um resumo das proteínas da família FH encontradas no soro do paciente e de
seus familiares.
Tabela 12: Proteínas da família FH encontradas nos soros do paciente e de seus familiares.
Indivíduo FH FHL-1
FHR-1
α
αα
α
FHR-1
β
ββ
β
Paciente - - + +
Pai + + + +
Mãe + + + +
Irmã + + + +
Proteínas
A esta altura do projeto, já tínhamos ciência de que o paciente estudado era portador
da deficiência de FH e de FHL-1, e que outras proteínas do C haviam sido afetadas
-108-
secundariamente por esta deficiência primária, estando também ausentes ou presentes em
baixas concentrações no soro do paciente, como C3 e FB. Assim, como passo seguinte,
optamos por fazer uma triagem semi-quantitativa das proteínas pertencentes à via terminal,
pelo método de imunodifusão dupla, a fim de nos certificar de que outras proteínas não
estariam de alguma forma afetando a funcionalidade do C.
5.4 Imunodifusão Dupla Para Detecção das Proteínas da Via Terminal: C6, C6, C7, C8 e
C9.
Através de ensaios de imudifusão dupla (Ouchterlony & Nilsson, 1978) nós
avaliamos semi-quantitativamente a presença das proteínas da via terminal do C, C5, C6,
C7, C8 e C9 no soro do paciente e de seus familiares.
As primeiras quatro proteínas (C5, C6, C7 e C8) estavam presentes nos soros do
paciente e de seus familiares, mesmo quando diluídos até 1: 32 (resultado não mostrado). Já
o componente C9 (Figura 16), estava presente nos soros de seus pais e irmã, mas ausente no
soro do paciente mesmo quando testado na forma pura (não diluída).
-109-
A princípio, este resultado pareceu surpreendente, mas, uma vez que nosso paciente é
descendente de japoneses e que a deficiência desta proteína acomete um indivíduo a cada
1000 dessa população, ficou evidente que havíamos encontrado uma deficiência
concomitante, mas não necessariamente relacionada, à deficiência de FH previamente
identificada.
De posse deste resultado, tornou-se indispensável a determinação da concentração de
C9 no soro do paciente e de seus familiares por um método mais sensível, o ELISA, bem
como a análise do perfil eletroforético desta proteína nos soros dos mesmos indivíduos, em
Figura 16: Avaliação da presença de C9 no soro do paciente e de seus familiares em
comparação com o controle normal através da imunodifusão dupla. Soros do paciente
e de seus familiares na forma não diluída (1), diluída a 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 e 1:32 (2, 3,
4, 5 e 6, respectivamente), anticorpo policlonal anti-C9 feito em cabra (7 e 14) e soro
normal na forma não diluída (8) e diluída a 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 e 1:32 (9, 10, 11, 12 e
13, respectivamente).
Paciente
Pai
Mãe
Irmã
1
2
3
4
5
6
Normal
7
8
10
11
12
13
14
9
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
-110-
comparação com o controle normal, pelo método Western Blot, a fim de investigar a
presença de possíveis alterações estruturais nesta proteína.
5.5 Determinação da Concentração de C9 no Soro do Paciente e de Seus Familiares
Utilizando o Método ELISA.
A concentração de C9 detectada no soro do paciente foi de 5,6 µg/ml (Tabela 13), o
que equivale a 17,5% da concentração encontrada no controle normal (28,5 µg/ml). Este
resultado enquadra nosso paciente entre os deficientes deste componente e confirma a
hipótese formulada na etapa anterior sobre a possível existência da deficiência desta proteína
em concomitância com a deficiência de FH neste paciente.
Tabela 13: Concentração de C9 nos Soros do Paciente e de Sua Família.
Indivíduo C9 (µg/ml)
Paciente
5,6
±
0,34
Pai
38,5
±
4,5
Mãe
33,5
±
0,9
Irmã
30
±
0,5
Normal (média) 28,5
Normal (faixa de
normalidade)
22 - 35
A concentração de C9 detectada no soro do pai do paciente (38,5 µg/ml) está
sutilmente acima dos níveis encontrados no controle normal. Já no soro da mãe e irmã,
foram encontradas concentrações normais deste componente, 33,5 µg/ml e 30 µg/ml,
respectivamente.
-111-
Vale ressaltar ainda que a concentração de C9 detectada no soro normal foi
determinada em diferentes amostras contendo uma de mistura de soros pertencentes a
indivíduos normais (47 e 130 indivíduos), e ainda em amostras simples de indivíduos
normais, em quatro diferentes ensaios de ELISA. Ainda assim, o valor obtido é inferior ao
registrado na literatura como concentração de referência (60 µg/ml), levantando a hipótese
de que esta proteína encontra-se em concentrações inferiores na população brasileira quando
comparada a outras populações.
Tentando endossar essa hipótese nós medimos a concentração de C9 em 31 diferentes
amostras de soros de indivíduos normais não relacionados, a fim de detectar primariamente a
faixa de normalidade da concentração desta proteína na população brasileira. As
concentrações variaram entre 12,2 µg/ml e 41,9 µg/ml, com média de 28,65 µg/ml e desvio
padrão de 6,46. Este resultado nos leva a sugerir que a concentração de C9 na população
brasileira é aparentemente menor do que a concentração detectada em outras populações.
5.6 Avaliação do Perfil do C9 no Soro do Paciente e de Sua Família Pelo Western Blot.
Tendo detectado o C9 em concentrações residuais no paciente através do método
ELISA, e sabendo da alta freqüência de indivíduos deficientes de C9 na população japonesa,
da qual nosso paciente é descendente, decidimos então avaliar a presença e o perfil desta
proteína no soro do paciente através de um método mais sensível, como o Western Blot.
Pudemos observar que a proteína C9 (70 kDa) está presente no soro do paciente, mas
em concentração aparentemente muito reduzida, se comparada à encontrada no soro controle
ou mesmo nos soros de seus familiares (Figura 17), dado que concorda com a concentração
da proteína detectada no soro do paciente pelo ELISA. Entretanto, a proteína apresenta-se
com peso molecular e perfil de migração em gel semelhantes aos exibidos pela proteína
detectada no soro controle.
-112-
No soro do pai do paciente pudemos observar que o C9 está presente em
concentração aparentemente elevada, não só quando comparada com a proteína detectada no
soro do paciente, mas também quando comparada à encontrada no soro controle. Apenas
quando o seu soro foi diluído duas vezes mais que os demais soros (linha 3) foi possível
aproximar a quantidade de C9 encontrada no seu soro à detectada no soro da mãe do
paciente. Este resultado está de acordo com a concentração de proteína detectada no soro do
pai pelo método ELISA.
Já no soro da mãe o C9 detectado apresenta-se em concentração aparentemente
semelhante à encontrada no soro controle. Este dado também está de acordo com as
concentrações de C9 nos soros da mãe e irmã determinadas pelo método ELISA.
Figura 17: Análise do perfil do C9 presente no soro do paciente e de sua família
através de Western Blotting utilizando anticorpo policlonal de cabra anti-C9 humano
como primário. 1) Irmã; 2) Mãe; 3) Pai (1:20); 4) Pai; 5) Paciente; 6) Controle
normal. Todos os soros foram utilizados na diluição 1:10, com exceção da coluna 3,
onde o soro foi utilizado na diluição 1:20.
1 2 3 4 5 6
~70 kDa
-113-
Encerradas as etapas de avaliação funcional do C, de determinação das concentrações
das proteínas pertencentes a esse sistema no soro do paciente e de seus familiares, em
comparação com o controle normal, bem como de avaliação dos aspectos estruturais das
proteínas encontradas em deficiência nesses soros, decidimos partir para outro nível do
projeto, a fim de avaliarmos as bases moleculares dessas deficiências. Assim, iniciamos os
procedimentos que nos permitiriam analisar o material genético do paciente e de seus
familiares na busca por alterações não encontradas em indivíduos normais e que pudessem
ser responsáveis pelas deficiências em questão, procedimentos estes que serão descritos a
partir deste momento.
5.7 Amplificação do cDNA do FH do Paciente
O primeiro passo na caracterização molecular da deficiência de FH no nosso paciente
foi utilizar a cultura de seus fibroblastos como fonte de RNA total para RT-PCRs
específicos. Vale ressaltar que, mesmo sendo de nosso conhecimento que fibroblastos não
são a principal fonte de FH, e sim o fígado, a facilidade de obtenção do material, a partir de
uma pequena incisão externa sob anestesia local, em oposição ao que ocorreria numa coleta
de hepatócitos, impulsionou-nos a fazer de tais células as mais adequadas para o
fornecimento desse material. Também temos ciência de que células sangüíneas, monócitos,
por exemplo, seriam possivelmente fontes mais ricas de FH do que os fibroblastos,
entretanto, a necessidade de punção venosa freqüente, na tentativa de obtenção de material
para realização dos ensaios, desencorajou-nos de escolhê-las como fonte desse material.
Diante disso, o RNA foi extraído e quantificado de acordo com o que foi descrito na
seção de Materiais e Métodos e procedeu-se com a caracterização molecular da deficiência
do paciente em questão.
-114-
Usando, então, o RNA total do paciente e de um indivíduo normal, nós amplificamos
vários fragmentos do cDNA de FH (como esquematizado na Figura 13) do paciente e
comparamos com os fragmentos obtidos de um controle normal após eletroforese em gel de
agarose (Figura 18). Todos os fragmentos amplificados do paciente apresentaram tamanho e
intensidade equivalentes àqueles obtidos com cDNA de um indivíduo normal. Esta
observação indica a ausência de grandes deleções ou inserções no RNAm de FH do
probando.
5.8 Seqüenciamento do cDNA de FH do Paciente
Todos os fragmentos obtidos do cDNA de FH do paciente foram seqüenciados como
descrito nos Materiais e Métodos e as seqüências obtidas comparadas com as depositadas no
site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast, utilizando o programa BLAST N (Altschul et al,
1997) tendo por base a referência /NM Y00716/HF1/Homo sapiens complement Factor H
(FH) mRNA (Ripoche et al, 1988).
FH
GAPDH
N P
N P
N P
N P
N P
Figura 18: Análise de fragmentos do cDNA de FH do paciente e de um controle
normal amplificados por RT-PCR.
-115-
A primeira alteração encontrada foi a substituição de um nucleotídeo na posição
G453A em ambos os alelos. Esta substituição altera o códon (CG
453
T→CA
453
T) de tal forma
que a His
127
é substituída pela Arg
127
(Figura 19). Vale a pena ressaltar que o nucleotídeo
453 localiza-se no SCR-2 da proteína FH, também encontrado no FHL-1.
A segunda alteração encontrada foi uma segunda substituição de nucleotídeo de
forma homozigota, desta vez na posição 2089 (A2089G) (Figura 20A). Esta segunda
alteração modificou o códon de CAA
2089
para CAG
2089
, mas não modificou o resíduo de
aminoácido a ser codificado, uma Glu na posição 672 do SCR-11, sendo, portanto uma
mutação silenciosa, descrita como polimorfismo por Neumann et al, 2003.
A última alteração encontrada também foi a substituição de um nucleotídeo e
também de forma homozigota, mas agora na posição 2881 (G2881A) (Figura 20B). Como
na mutação anterior, esta substituição causa modificações no códon respectivo
(GA
2881
G→GA
2881
A), mas desta vez com modificação do resíduo de aminoácido codificado,
sendo codificada uma Asp em substituição à Glu na posição 936 do SCR-15. Esta mutação
já foi previamente descrita por Neumann e seus colaboradores em 2003 (Neumann et al,
Figura 19: A) Alteração molecular encontrada no cDNA de FH do paciente de forma
homozigota. Substituição de um nucleotídeo na posição 453 (G453A) alterando o
códon de uma Arg para uma His.
5’
→
3”
TAC CGT GAA TGT
T
yr Arg Phe Val
TAC C
A
T GAA TGT
Tyr His Phe Val
-116-
2003) como um polimorfismo e foi fortemente associada à SHU no estudo conduzido por
Caprioli e seus colaboradores no mesmo ano (Caprioli et al, 2003).
A fim de confirmar o perfil hereditário da mutação homozigota encontrada na
posição 453 do cDNA do paciente, amplificamos e seqüenciamos a porção do DNA
genômico da mãe do paciente em que está contido o nucleotídeo 453. A mesma mutação foi
identificada no DNA genômico da mãe e surpreendentemente também na forma homozigota.
Uma vez que no paciente esta mutação seria a provável responsável pela ausência de FH e
Figura 20: Alterações moleculares encontradas no cDNA de FH do paciente. A)
Substituição silenciosa de um nucleotídeo na posição 2089 (A2089G) com
conservação do resíduo de Glu na posição 672; B) Substituição de um nucleotídeo na
posição 2881 (G2881T) alterando o códon de uma Glu para uma Asp na posição 936
(polimorfismo descrito por Neumann e colaboradores em 2003).
5’
→
3”
CCT GAG ATT TCT
Pro Glu Ile Ser
CCT GA
T
ATT TCT
Pro Asp Ile Ser
5’
→
3”
ATT CAA TGT GTT
Ile Gln Cys Val
ATT CAG TGT GTT
Ile Gln Cys Val
B)
A)
-117-
de FHL-1 no seu soro parece contraditório que a mãe carregue a mesma mutação e ainda
disponha das duas proteínas (Figura 21).
Figura 21: Alteração molecular encontrada no nos dois alelos do DNA genômico de
FH da mãe do paciente. Substituição de um nucleotídeo na posição 453 (G→A)
alterando o códon de uma Arg para uma His.
5’
→
3”
AAT TAC CGT GAA TGT
Asn Tyr Arg Phe Val
AAT TAC C
A
T GAA TGT
Asn Tyr His Phe Val
-118-
Avaliando, por sua vez, o DNA genômico do pai do paciente observamos a presença
da mesma mutação, entretanto, em apenas um dos alelos, enquanto o outro apresentou a
mesma seqüência de nucleotídeos encontrada num indivíduo normal (Figura 22).
5.9 Amplificação Éxon-específica do DNA Genômico de C9 do Paciente
Várias tentativas de amplificar porções do cDNA de C9 do paciente a partir de
amostras de RNA total extraídas de seus fibroblastos foram levadas a efeito, mas sem
sucesso. Estas tentativas infrutíferas sugerem que fibroblastos não são uma boa fonte de
RNA mensageiro para C9, talvez por não o produzirem em grandes concentrações. Assim,
baseados nessa hipótese e amparados pela ampla literatura disponível sobre o uso de DNA
genômico para o estudo do gene de C9 optamos pela amplificação dos éxons do gene de
acordo com Witzel-Schlömp et al, 1997; 2001.
A partir do DNA genômico extraído de fibroblastos do paciente e utilizando pares de
oligonucleotídeos éxon-específicos, que permitiram a amplificação de pelo menos vinte
nucleotídeos das porções intrônicas, amplificamos os 11 éxons do DNA de C9 do paciente e
comparamos os fragmentos obtidos com os obtidos a partir do DNA de um indivíduo
3’
→
5”
ACA TTC ACG
GTA ATT
Val Phe Arg Tyr Asn
ACA TTC ACG GTA ATT
Asn Tyr Arg Phe Val
ATG
His
Figura 22: Alteração molecular encontrada em um dos alelos do DNA genômico de FH do pai do
paciente. Substituição de um nucleotídeo na posição 453 (C→T) alterando o códon de uma Arg para uma
His.
-119-
controle (Figura 23). Todos os fragmentos amplificados do paciente apresentaram tamanhos
e intensidade equivalentes aos do obtidos com DNA de um indivíduo normal. Esta
observação indica a ausência de grandes deleções e inserções no DNA de C9 do probando.
5.10 Seqüenciamento dos Éxons e Pequenas Porções dos Íntrons do DNA genômico para C9
do Paciente
Como feito para o cDNA do FH, todos os fragmentos obtidos foram seqüenciados e
as seqüências obtidas comparadas com as depositadas no site
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast, utilizando o programa BLAST N (Altschul et al, 1997)
tendo por base a referência /NM 001737.2/Homo sapiens complement C9 mRNA (DiScipio et
al, 1984).
Já no íntron 1 foi detectada a substituição de um nucleotídeo (G→A) na posição
39315066 do DNA genômico (Schmutz et al, 2004) (Figura 24), mutação esta que não
modifica o sítio de splicing. Esta alteração já foi descrita como um polimorfismo por Witzel-
Figura 23: Análise de fragmentos éxon-específicos, amplificados por PCR, do DNA
de C9 do paciente em comparação com um controle normal.
-120-
Schlömp et al em 2001 (Witzel-Schlömp et al, 2001). No éxon 1 foi encontrada em um dos
alelos a substituição de um nucleotídeo na posição 17 (C17T) (Figura 24) alterando o códon
(CC
17
G→CT
17
G) e o aminoácido codificado na posição 5, Trp em substituição à Arg. Esta
mutação também já foi descrita como um polimorfismo (Witzel-Schlömp et al, 2001). Uma
outra substituição de nucleotídeo foi encontrada no éxon 11 na posição 1975 (C1975T)
(AC
1975
T→AT
1975
T) (Figura 24C). Esta alteração também foi anteriormente descrita como
um polimorfismo por Witzel-Schlömp et al (Witzel-Schlömp et al, 2001).
-121-
Diante da suposição de que as alterações encontradas no gene FH do paciente
modificariam o perfil de secreção e/ou expressão do FH pelas células do paciente, decidimos
avançar mais uma etapa no projeto e utilizar um método que permitisse a avaliação da
presença ou ausência desta proteína no compartimento intracelular do paciente em
Figura 24: Polimorfismos encontrados no DNA genômico do paciente na região do
gene C9. A) Substituição de um nucleotídeo (C→T) na posição 39315066 sem
alteração do sítio para splicing; B) Substituição de um nucleotídeo na posição 17
(C17T) do éxon 1 com substituição de uma Arg pelo Trp na posição 5; C)
Substituição de um nucleotídeo na posição 1975 (A1975T) do éxon 11 com
conservação do aminoácido Asn.
5’
→
3”
5’
→
3”
TGGGATGTTCTGTTCTCTT
TCA GCC TGC CGG AGC TTT GCA
Ser A
la Cys Arg Ser Phe Ala
TCA GCC TGC
T
GG AGC TTT GCA
Ser Ala Cys Trp Ser Phe Ala
5’
→
3”
ACA AAA TTA AAC TAA
Thr Phe Leu Asn Stop
ACA AAA TTA AA
T
TAA
Thr Phe Leu Asn Stop
TGGGATGTTCT
A
TTCTCTT
B)
A)
C)
-122-
comparação com o perfil encontrado nas células de um indivíduo normal. O método
escolhido para realização de tal etapa foi a Microscopia Confocal.
A microscopia confocal possibilita a visualização de proteínas que estejam
armazenadas dentro das células pela utilização de anticorpos conjugados com moléculas
fluorescentes (que, neste ensaio, emitem luz de cor verde) e que, após solubilização das
membranas dessas células, conseguem atingir o espaço intracelular. A fim de melhor
visualizar e dimensionar o espaço intracelular, optamos pela utilização adicional do iodeto
de propídeo, que cora somente material nuclear e emite luz vermelha.
5.11 Avaliação do FH Intracelular em Fibroblastos do Paciente por Microscopia Confocal.
Os resultados mostram a presença de FH (verde) nas células do paciente (Figura 25)
em intensidade semelhante, ou mesmo mais intensa, que a detectada nas células do indivíduo
normal. Este dado indica que os mecanismos responsáveis pela produção (expressão) do FH
estão intactos, a ponto de podermos concluir que, apesar das alterações moleculares no gene
FH, as células do paciente continuam sendo capazes de produzir a proteína. Contudo, a
ausência de FH no espaço extracelular, soro, por exemplo, leva-nos a propor que as células
do paciente são capazes de produzir a proteína, possivelmente em concentrações até mais
elevadas que o indivíduo normal, sem, contudo, serem capazes de secretá-la para o meio
externo à célula.
-123-
Figura 25: Presença de FH no citoplasma de fibroblastos observados por microscopia
confocal. A) e C) Controle negativo: células do indivíduo normal (A) e do paciente
(C) marcadas somente com iodeto de propídio (vermelho) e anticorpo anti-IgG de
coelho marcado com FITC (anticorpo secundário); B) e D) Células do indivíduo
normal (B) e do paciente (D) marcadas com iodeto de propídio (vermelho) e
anticorpo policlonal anti-FH humano feito em coelho (anticorpo primário).
B) A)
C)
D)
Controle negativo
FH
-124-
Diferentemente dos fibroblastos do paciente, os fibroblastos de sua mãe apresentaram
uma marcação de FH menos intensa que a exibida pelas células do indivíduo normal (Figura
26), dado condizente com a concentração de FH encontrada no seu soro. Equivalentes
resultados foram observados com fibroblastos do pai e irmã (Figura 27).
-125-
B) A)
C)
D)
Controle negativo
FH
Figura 26: Presença de FH no citoplasma de fibroblastos observados por
fluorescência. A) e C) Controle negativo: células do indivíduo normal (A) e da mãe
do paciente (C) marcadas somente com iodeto de propídio (vermelho) e anticorpo
anti-IgG de coelho marcado com FITC (anticorpo secundário); B) e D) Células do
indivíduo normal (B) e da mãe do paciente (D) marcadas com iodeto de propídio
(vermelho) e anticorpo policlonal anti-FH humano feito em coelho (anticorpo
primário).
-126-
B) A)
Controle negativo FH
C)
D)
Figura 27: Presença de FH no citoplasma de fibroblastos observados por fluorescência. A),
C) e E) Controle negativo: células do indivíduo normal (A), do pai (C) e da irmã do paciente
(E) marcadas somente com iodeto de propídio (vermelho) e anticorpo anti-IgG de coelho
marcado com FITC (anticorpo secundário); B), D) e F) Células do indivíduo normal (B) do
pai (D) e da irmã do paciente (F) marcadas com iodeto de propídio (vermelho) e anticorpo
policlonal anti-FH humano feito em coelho (anticorpo primário).
E)
F)
-127-
5.12 Avaliação do C9 Intracelular em Fibroblastos do Paciente por Microscopia Confocal.
Os resultados mostram uma marcação referente à presença de C9 nos fibroblastos do
paciente menos intensa do que a exibida pelo indivíduo normal (Figura 28). Este resultado é
condizente com a baixa concentração deste componente encontrada no soro do paciente.
Já nos fibroblastos da mãe (Figura 28E e F), do pai e da irmã do paciente (Figura
29) a marcação referente à presença de C9 foi equivalente àquela exibida pelas células do
indivíduo normal.
-128-
B)
A)
Controle negativo C9
C)
D)
Figura 28: Presença de C9 no citoplasma de fibroblastos observados por fluorescência. A),
C) e E) Controle negativo: células do indivíduo normal (A), do paciente (C) e da mãe (E)
marcadas somente com iodeto de propídio (vermelho) e anticorpo anti-IgG de cabra marcado
com FITC (anticorpo secundário); B), D) e F) Células do indivíduo normal (B) do paciente
(D) e da mãe (F) marcadas com iodeto de propídio (vermelho) e anticorpo policlonal anti-
C9 humano feito em cabra (anticorpo primário).
E) F)
-129-
B)
A)
Controle negativo C9
C)
D)
E) F)
Figura 29: Presença de C9 no citoplasma de fibroblastos observados por fluorescência. A),
C) e E) Controle negativo: células do indivíduo normal (A), do pai (C) e da irmã do paciente
(E) marcadas somente com iodeto de propídio (vermelho) e anticorpo anti-IgG de cabra
marcado com FITC (anticorpo secundário); B), D) e F) Células do indivíduo normal (B) do
pai (D) e da irmã do paciente (F) marcadas com iodeto de propídio (vermelho) e anticorpo
policlonal anti-C9 humano feito em cabra (anticorpo primário).
-130-
-131-
-132-
-133-
-134-
-135-
-136-
-137-
-138-
-139-
-140-
-141-
-142-
-143-
-144-
-145-
-146-
-147-
-148-
-149-
-150-
-151-
-152-
-153-
-154-
-155-
-156-
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
