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Andréia Pastana Penteado
Avaliação dos mecanismos de resistência a carbapenens
em amostras de Klebsiella pneumoniae
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de Medicina
para obtenção do título de Mestre em
Ciências.
São Paulo
2007
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Andréia Pastana Penteado
Avaliação dos mecanismos de resistência a carbapenens em
amostras de Klebsiella pneumoniae
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de Medicina
para obtenção do título de Mestre em
Ciências.
Orientadora: Prof
a
Dra. Ana Cristina Gales
Co-orientadora: Dra. Mariana Castanheira
Este trabalho foi realizado com auxílio
financeiro fornecido pela Fundação de Amparo
à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP
São Paulo
2007
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PENTEADO, Andreia
Avaliação dos mecanismos de resistência a carbapenens em
amostras de Klebsiella pneumoniae - Andréia Pastana Penteado - São
Paulo, 2007.
xvi, 78f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola
Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia
Título em inglês: Evaluation of the mecansims of resistance to
carbapenem in Klebsiella pneumoniae strains
1. Klebsiella pneumoniae 2. Resistência 3. β-lactamases 4.
Metalo-β-lactamases 5. Trimetoprim 6. Polimixina B.
__________________________________________________________________________
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLÓGIA
Chefe de Departamento: Prof. Dr. Sergio Barsanti Wey
Coordenador do Curso de Pós-graduação: Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
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Andréia Pastana Penteado
Avaliação dos mecanismos de resistência a carbapenens em
amostras de Klebsiella pneumoniae
Banca Examinadora:
Prof
a
. Dra. Elsa Masae Mamizuka
Prof
a
. Dra. Marinês Dalla Valle Martino
Dra. Thaís Guimarães
Prof
a
. Dra. Lourdes Botelho Garcia
__________________________________________________________________________
Dedico este trabalho aos meus pais, Carlos e Arlete,
e à minha adorada irmã Adriana, pela grandeza
do seu amor, que sempre protegeu e iluminou
meus caminhos,não apenas neste trabalho,
mas em todos os momentos da minha vida.
Amo vocês!
Dedico também este trabalho, ao meu amor
Rubens, pelo incentivo, pela compreensão e por
permanecer do meu lado em todos os momentos.
AGRADECIMENTOS
__________________________________________________________________________
À minha orientadora, Profª. Dra. Ana Cristina Gales, muito obrigada pela excelente
orientação, pelo apoio, pelos ensinamentos e paciência a mim direcionada. Ana,
obrigada por me proporcionar várias oportunidades de crescimento profissional, você é
um exemplo de ética, caráter e dedicação.
À minha co-orientadora Mariana Castanheira e ao Rodrigo Elisandro Mendes excelente
colega de trabalho. Muito dos conhecimentos adquiridos, das oportunidades e das
alegrias vividas no laboratório, eu devo a você Mari, meu muito obrigado!
Ao Prof. Dr. Antônio Carlos Campos Pignatari meu respeito e admiração.
À professora Dra. Maria Cristina Bronharo Tognin, obrigado por ter sido uma paciente
professora e pelos seus ensinamentos que propiciaram os meus primeiros passos
como pesquisadora. Você é muito especial.
Aos queridos colegas do Laboratório ALERTA, Adriana, Anderson, Cecília, Danilo,
Eloísa e Renata, dos quais jamais esquecerei pelos momentos de convívio e de
descontração.
Aos colegas de pós-graduação do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica Ana
Paula Takano, Andrea dos Santos Pereira, Fernanda Inoue, Fernanda Marques,
Jussimara Monteiro, Kelly Santiago, Martha Rivero, Paulo Bispo, Rodrigo Cayô, Soraya
Sgambatti de Andrade e Thais Fernandes pela convivência, pela amizade e pelo apoio
durante a realização deste estudo. Adoro todos vocês.
Aos estagiários e funcionários do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica, em
especial a Rosana Capecce e Jacira Donizetti pela amizade, trabalho e dedicação.
__________________________________________________________________________
Às meninas do IDIPALab, Agda, Mirella, Renata e Roseli, pela amizade, pela troca de
conhecimentos e pelos momentos descontraídos no café do LEMC.
A Profa. Dra. Elsa Masae Mamizuka da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, da
Universidade de São Paulo, obrigado por fornecer a amostra estudada.
Ao Grupo de Controle de Infecção Hospitalar do Hospital Servidor Público Estadual de São
Paulo, em especial, Prof. Dr. Renato Satovschi Grinbaum e Dra. Thaís Guimarães, por fornecer
as amostras estudadas.
A todas as pessoas que participaram direta ou indiretamente do meu trabalho, o meu
muito obrigado.
__________________________________________________________________________
SUMÁRIO
Agradecimentos........................................................................................................... vi
Figuras........................................................................................................................ xi
Tabelas........................................................................................................................ xii
Abreviaturas................................................................................................................. xiii
Resumo....................................................................................................................... xiv
1-Introdução................................................................................................................. 1
1.1-Klebsiella pneumoniae....................................................................................... 1
1.2-Infecções causadas por Klebsiella pneumoniae................................................ 3
1.3-Resistência aos β-lactâmicos em Klebsiella pneumoniae.................................. 4
1.4-Mecanismos de resistência aos β-lactâmicos em Klebsiella pneumoniae......... 5
1.4.1-Alteração de proteínas de membrana externa.......................................... 6
1.4.2-Hiperexpressão de sistemas ou bombas de efluxo................................... 7
1.4.3-Alteração do sítio de ligação do antimicrobiano........................................ 8
1.4.4-Produção de β-lactamases........................................................................ 9
1.4.4.1-β-lactamases de espectro ampliado.............................................. 13
1.4.4.2-Metalo-β-lactamases..................................................................... 18
1.4.4.3-Contexto genético das metalo-β-lactamases adquiridas............... 22
1.4.4.4-Integrons classe 1......................................................................... 23
2-Objetivos................................................................................................................... 26
3-Material e métodos................................................................................................... 27
__________________________________________________________________________
3.1-Amostras bacterianas......................................................................................... 27
3.2-Confirmação do fenótipo de resistência aos carbapenens................................. 28
3.2.1-Técnica de ágar diluição........................................................................... 28
3.3-Avaliação dos mecanismos de resistência aos carbapenens........................... 30
3.3.1-Pesquisa dos genes que codificam as metalo-β-lactamases e estudo
do contexto genético, onde estes genes estão inseridos.................................
30
3.3.2-Reação de sequenciamento..................................................................... 32
3.3.3-Avaliação fenotípica das alterações da permeabilidade das proteínas
da membrana externa.......................................................................................
33
3.3.4-Avaliação fenotípica da hiperexpressão dos sistemas de efluxo............. 34
3.4-Transferência do gene codificador de metalo-β-lactamase............................... 35
3.5-Localização do gene bla
IMP-1
............................................................................. 36
3.5.1-Extração de DNA cromossomal............................................................... 36
3.5.2-Extração de DNA plamsídial..................................................................... 37
3.5.3-Eletroforese do DNA plasmidial e cromossomal e Southern-blot............ 38
3.5.4-Hibridização da membrana............................................................................ 39
3.6-Avaliação da similaridade genética por eletroforese em campo elétrico
pulsado (“Pulsed Field Gel Electrophoresis” – PFGE)..................................................
39
3.6.1-Extração do DNA das amostras bacterianas 40
3.6.2-Digestão do DNA com enzima de restrição e eletroforese........................... 41
4-Resultados..................................................................................................................... 42
4.1-Amostras bacterianas........................................................................................ 42
4.2-Confirmação do fenótipo de resistência aos carbapenens................................ 42
4.2.1-Técnica de ágar diluição........................................................................... 42
__________________________________________________________________________
4.3-Avaliação dos mecanismos de resistência aos carbapenens........................... 42
4.3.1-Pesquisa dos genes que codificam as metalo-β-lactamases e estudo
do contexto genético, onde estes genes estão inseridos.................................
42
4.3.2-Avaliação fenotípica das alterações da permeabilidade das proteínas
de membrana externa.......................................................................................
46
4.3.3-Avaliação fenotípica da hiperexpressão dos sistemas de efluxo 48
4.4-Transferência do gene codificador de metalo-β-lactamase............................... 48
4.5-Localização do gene bla
IMP-1
............................................................................. 48
4.5.1-Análise de plasmídios.............................................................................. 48
4.5.2-Eletroforese do DNA plasmidial e cromossomal e Southern-blot............ 48
4.6-Avaliação da similaridade genética por eletroforese em campo elétrico pulsado
(“Pulsed Field Gel Electrophoresis” – PFGE)................................................................
49
5-Discussão....................................................................................................................... 50
6-Conclusões…………………………………………………………………………………. 63
7-Referências bibliográficas.............................................................................................. 65
Abstract............................................................................................................................. 89
__________________________________________________________________________
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação esquemática de um integron da classe 1 e de um
gene cassete circular livre. As flechas representam os genes do integron e o
sentido das flechas representa o sentido da transcrição dos genes. À
esquerda, a seqüência conservada 5’, contendo o gene que codifica a
integrase e o sítio de ligação attI. À direita, a 3’-CS, contendo a estrutura
truncada qacE
Δ
1/sul1.............................................................
25
Figura 2. Eletroforese em gel de agarose mostrando o produto de
amplificação para o gene bla
IMP-1
.............................................................. 43
Figura 3. Representação esquemática do integron In86, abrigando três
determinantes de resistência: bla
IMP-1
, seguido por aacA30 e aadA1. As
flechas representam os genes do integron e o sentido das flechas representa
o sentido da transcrição dos genes ........................................
44
Figura 4. Representação esquemática do novo integron In87 que possui um
único gene cassete. As flechas representam os genes do integron e o sentido
das flechas representa o sentido da transcrição dos
genes............................................................................................................. 45
Figura 5. Uma única alteração na seqüência de aminoácidos na posição 121
foi encontrada na proteína DFR23 em comparação à proteína DFR22,
assinalado na figura com um quadrado......................................................... 46
Figura 6. Caracterização genotípica das nove amostras de K. pneumoniae
por PFGE....................................................................................................... 49
__________________________________________________________________________
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características funcionais e moleculares dos principais grupos de β-
lactamases.......................................................................................... 12
Tabela 2. Dados dos primeiros exemplares de cada uma das variantes
encontradas nas cinco subclasses de MβLs adquiridas descritas até o
momento........................................................................................................ 20
Tabela 3. Oligonucleotídeos utilizados como “primers” para as reações de
PCR............................................................................................................... 31
Tabela 4. Alterações no perfil de proteínas de membrana externa encontradas
nas nove amostras de K. pneumoniae..................................... 47
__________________________________________________________________________
LISTA DE ABREVIATURAS
ESBLs - Extended spectrum
β
-lactamases
OMP - Outer membrane protein
PBPs - Penicilin binding proteins
MβLs - Metalo-β-lactamases
UFC - Unidades formadoras de colônia
HSPE - Hospital Servidor Público Estadual
HU-USP - Hospital Universitário da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo
NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute
MIC - Concentração inibitória mínima
PCR - Polimerase Chain Reaction
PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis
__________________________________________________________________________
RESUMO
Introdução: K. pneumoniae é um importante patógeno no ambiente hospitalar. Os
antimicrobianos da classe dos carbapenens têm sido amplamente utilizados para o
tratamento das infecções causadas por amostras de K. pneumoniae produtoras de β-
lactamases de amplo espectro. As metalo-β-lactamases (MβL) são enzimas
bacterianas com habilidade de hidrolisar os carbapenens e, embora, ainda sejam raras,
amostras de K. pneumoniae produtoras de MβL têm sido reportadas com uma
freqüência cada vez maior. Objetivo: Avaliar os mecanismos de resistência a
carbapenens em amostras de K. pneumoniae. Metodologia: Nove amostras de K.
pneumoniae isoladas até o momento na cidade de São Paulo foram avaliadas. A
relação genética entre estas amostras foi estudada utilizando-se a técnica de PFGE.
Os testes de sensibilidade aos antimicrobianos foram realizados pela técnica de
diluição em ágar, segundo as padronizações do NCCLS. A técnica da reação em
cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para determinar a presença dos genes
responsáveis pela codificação das MβL, assim como para o contexto genético que
abriga estes genes. A detecção de outros mecanismos de resistência, como alterações
da permeabilidade da membrana externa e a presença de efluxo, também foi realizada
em todas as amostras. Resultados: Todas as amostras foram altamente resistentes a
ceftazidima (MIC, > 128 μg/ml), apresentando também resistência a imipenem (MIC,
128 μg/ml) e a meropenem (MIC, 64 µg/ml). Dentre as nove amostras de K.
pneumoniae, todas apresentaram produto de amplificação de PCR positivo para o gene
bla
IMP-1
. A resistência aos carbapenens também foi correlacionada à ausência de uma
proteína de membrana externa de aproximadamente 36 kDa. A diminuição da
expressão de uma proteína de 35 KDa também foi notada em todas as amostras. A
avaliação do contexto genético de gene bla
IMP-1
mostrou que este gene encontra-se
__________________________________________________________________________
inserido em um integron de classe 1, previamente denominado In86. Além do gene
bla
IMP-1
localizado na primeira posição do integron, também estavam contidos dois
genes que conferem resistência aos aminoglicosídeos: o gene aacA30 e o gene aadA1.
Um novo gene, denominado dfr23, foi encontrado em todas as amostras de K.
pneumoniae provenientes do HSPE, o qual encontrava-se inserido em um novo
integron, In87. Um único clone foi detectado em todas as amostras de K. pneumoniae
estudadas. Conclusão: Altas taxas de resistência aos antimicrobianos testados foram
observadas e a produção da metalo-β-lactamase IMP-1 envolvida na resistência aos
carbapenens foi detectada em todas as amostras K. pneumoniae avaliadas.
Recentemente, amostras de Acinetobacter spp. e Pseudomonas putida produtoras de
IMP-1 isoladas na cidade de São Paulo, revelaram abrigar o bla
IMP-1
inserido em um
integron de classe 1 denominado In86, o mesmo integron encontrado em todas as
amostras de K. pneumoniae estudadas. Diante destes dados, pode-se inferir que o
In86 encontra-se disseminado na cidade de São Paulo em diferentes espécies
bacterianas e que é provável que o surgimento de amostras da família de
Enterobacteriaceae produtoras de MβL seja devido a uma transmissão horizontal de
determinantes de resistência.
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1-INTRODUÇÃO
1.1-Klebsiella pneumoniae
A aplicação de novas tecnologias para o estudo da taxonomia dos
microrganismos tem propiciado um rápido aumento do número de gêneros e espécies
bacterianas que se encaixam nos critérios para a classificação da família
Enterobacteriaceae. Em 1972, Edwards e Ewing descreveram 11 gêneros e 26
espécies pertencendo a família Enterobacteriaceae. Em 1985, Farmer e colaboradores
descreveram 22 gêneros que compreendiam 69 espécies e 29 grupos entéricos. Em
1997, Konemam e colaboradores descreveram 31 gêneros e 139 espécies, biogrupos e
grupos entéricos como pertencentes à família Enterobacteriaceae.
A família Enterobacteriaceae compreende atualmente sete tribos relacionadas a
seguir, relacionada a seguir: tribo I - Escherichieae, tribo II - Edwardsielleaea, tribo III -
Salmonelleae, tribo IV - Citrobactereae, tribo V - Klebsielleae, tribo VI - Proteeae, tribo
VII - Yersinieae. A tribo Klebsielleae é constituída por cinco gêneros: Klebsiella,
Enterobacter, Hafnia, Pantoea e Serratia.
As espécies do gênero Klebsiella, nome dado em homenagem ao
microbiologista alemão Edwin Klebs, eram comumente classificadas de acordo com as
suas reações bioquímicas em Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae e Klebsiella
rhinoscleromatis. Com a introdução de métodos de hibridização do ácido
desoxirribonucléico (DNA), ficou demonstrado que essas espécies bacterianas
possuiam sequências de DNA homólogas (Brenner, Steingerwalt, Fanning, 1972),
pertencendo assim à mesma espécie: Klebsiella pneumoniae. Amostras de Klebsiella
__________________________________________________________________________
pneumoniae passaram então a ser classificadas em três subespécies: pneumoniae,
ozaenae e rhinoscleromatis.
Estudos moleculares adicionais à hibridização do DNA, descreveram outras
espécies: Klebsiella oxytoca, Klebsiella mobilis, Klebsiella planticola e Klebsiella
terrigena (Martínez et al., 2004). Até o presente, ainda não foi determinado se
Klebsiella orinthinolytica pertence a um grupo independente, porém, as evidências
indicam que pertencem à K. planticola.
As espécies bacterianas do gênero Klebsiella estão amplamente distribuídas
pela natureza, e provavelmente apresentam dois habitats principais, o meio ambiente,
onde são encontradas na água, solo e plantas e, como colonizadoras do trato
gastrointestinal de mamíferos como humanos, cavalos e suínos.
Em humanos, K. pneumoniae está presente como saprófita na nasofaringe e no
trato gastrointestinal. A detecção destas amostras nas fezes varia de 5 a 38%,
enquanto que na nasofaringe fica em torno de 1 a 6%. Estas taxas mudam
drasticamente quando o ambiente analisado é o hospitalar, onde a colonização é
diretamente proporcional aos dias de permanência do paciente no hospital. Em um
levantamento em pacientes hospitalizados, 77% dos pacientes apresentavam amostras
de Klebsiella spp. nas fezes, 19% na orofaringe e 42% nas mãos (Podschun &
Ullmann,1998).
As bactérias do gênero Klebsiella possuem 0,3 a 1 μm de diâmetro e 0,6 a 6 μm
de comprimento e caracterizam-se por não esporularem, serem imóveis, anaeróbias
facultativas, fermentadoras de glicose, não produtoras de ácido sulfídrico e utilizarem o
citrato como fonte de carbono, além de hidrolisarem a uréia (Konemam et al., 2001).
__________________________________________________________________________
Em ágar MacConkey, a presença de espécies de Klebsiella deve ser presumida
quando são isoladas colônias grandes, de consistência mucóide e róseas, em geral
com difusão do pigmento róseo para o ágar circundante, indicando a fermentação de
lactose e produção de ácidos (Konemam et al., 2001).
1.2-Infecções causadas por Klebsiella pneumoniae
As amostras de K. pneumoniae são uma importante causa de infecções
comunitárias e relacionadas à assistência à saúde, especialmente infecções do trato
urinário, do trato respiratório e da corrente sangüínea (Sader et al., 2001). Com a
aquisição de mecanismos de resistência a novos antimicrobianos e um numero cada
vez maior de casos de infecção, este microrganismo têm alcançado notoriedade como
patógeno hospitalar responsável por diversos surtos, principalmente em enfermarias de
neonatologia (Ardanuy et al., 1998). Os principais reservatórios para a transmissão de
Klebsiella são o trato gastrointestinal e as mãos dos profissionais de saúde (Podschum
& Ullmann, 1998).
K. pneumoniae é freqüentemente isolada em espécimes clínicos e pode causar
uma forma clássica de pneumonia primária. Não é um colonizante freqüente da
orofaringe de pessoas normais (1% a 6%), entretanto, pode ser encontrada em cerca
de 20% dos pacientes hospitalizados. Em pacientes com doenças de base específicas,
como, por exemplo, alcoolismo, diabetes mellitus e doença pulmonar obstrutiva
crônica, a colonização da orofaringe por K. pneumoniae pode evoluir para infecção
pulmonar. Essa infecção é caracterizada por apresentar início agudo e caráter
necrotizante e hemorrágico, resultando na produção de escarro, de coloração
avermelhada, mucoso e classicamente descrito como “geléia de groselha”. Abscesso
__________________________________________________________________________
pulmonar, doença cavitária crônica, hemorragia e hemoptise podem acometer também
estes pacientes. A K. pneumoniae também causa uma grande variedade de infecções
extrapulmonares, incluindo diarréia e meningite em crianças, e infecção do trato
urinário e sepse em crianças e adultos.
1.3-Resistência aos β-lactâmicos em Klebsiella pneumoniae
Durante as duas últimas décadas, o aumento no uso de cefalosporinas para o
tratamento de infecções relacionadas à assistência à saúde causadas por K.
pneumoniae foi acompanhado pelo surgimento de amostras de K. pneumoniae
produtoras de β-lactamases de amplo espectro, conhecidas como ESBLs (“extended-
spectrum β-lactamases”). Além das cefalosporinas, estas enzimas são capazes de
hidrolisar todos os antimicrobianos β-lactâmicos com exceção das cefamicinas e dos
carbapenens.
Um estudo publicado por Sader e colaboradores mostrou que a prevalência de
cepas produtoras de ESBL varia muito de região para região, sendo muito mais alta na
América Latina quando comparada a outras regiões do mundo. Nos Estados Unidos a
prevalência de amostras de K. pneumoniae produtoras de ESBL de forma geral não
ultrapassa 5%, na Europa varia entre 15% e 20%, e, na África do Sul, a prevalência
dessas infecções é de 36,1% (Jones, Pfaller, 1998; Babini, Livermore, 2000; Bell et al.,
2002). No entanto, no Brasil as taxas das infecções causadas por este microrganismo
são muito maiores do que as taxas encontradas em outras partes do mundo. Em um
estudo realizado em três cidades localizadas em diferentes estados brasileiros, sendo
elas, Florianópolis, Porto Alegre e São Paulo, constatou-se que 50,3% das amostras de
K. pneumoniae eram produtoras de ESBL (Sader et al., 2001). Em outro estudo
__________________________________________________________________________
realizado por Marra e colaboradores (Marra et al., 2006), constatou-se que 51% das
amostras de K. pneumoniae isoladas em infecções da corrente sanguínea entre 1996 e
2001, eram produtoras de ESBL.
Amostras bacterianas produtoras destas enzimas são geralmente resistentes a
outras classes de antimicrobianos, incluindo aminoglicosídeo, fluroquinolonas e
sulfonamidas, limitando ainda mais, as opções terapêuticas (Bradford et al., 2004).
Atualmente, os carbapenens, cujos representantes mais amplamente utilizados são o
imipenem e o meropenem, representam a principal opção terapêutica para o
tratamento de infecções graves causadas por bactérias resistentes aos demais β-
lactâmicos, principalmente, em regiões onde as taxas de resistência são elevadas. Os
carbapenens são considerados os agentes mais potentes contra infecções causadas
por bactérias Gram-negativas devido à sua elevada afinidade pelas proteínas ligadoras
de penicilina, estabilidade diante da maioria das β-lactamases, incluindo as ESBLs e as
do tipo AmpC, e pela excelente permeabilidade através da membrana externa
bacteriana (Woodford et al., 2000). No entanto, nos últimos anos o isolamento de
bactérias Gram-negativas resistentes também aos carbapenens vêm se tornando mais
freqüente em diversas partes do mundo (Nordmann and Poirel, 2002).
1.4-Mecanismos de resistência aos β-lactâmicos em Klebsiella pneumoniae
Diferentes mecanismos de resistência são descritos em K. pneumoniae. Em
relação aos β-lactâmicos temos: (i) a perda ou expressão reduzida de proteínas de
membrana externa, conhecidas como porinas; (ii) a hiperexpressão de bombas de
efluxo; (iii) as alterações nas proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs) e, (iv) a
produção de β-lactamases
__________________________________________________________________________
1.4.1-Alteração de proteínas de membrana externa
As proteínas de membrana externa (OMP) dos microrganismos Gram-negativos,
também chamadas de porinas, são proteínas capazes de formar canais constituídos de
água no seu interior, que permitem a difusão de solutos hidrofílicos através da
membrana externa e a extrusão de produtos não utilizados pela célula bacteriana
(Nikaido, 1985, Nikaido, 1989). As porinas variam de tamanho e carga elétrica. A perda
ou a diminuição da expressão dos genes que codificam as OMPs causam a redução da
entrada de antibióticos na célula, diminuindo a concentração interna do antimicrobiano,
o que pode conferir resistência aos β-lactâmicos (Quinn et al., 1989). Como somente os
microrganismos Gram-negativos possuem membrana externa, este mecanismo de
resistência ocorre somente neste grupo de bactérias e, geralmente, é também
associado à produção de β-lactamases.
A perda de porina, como um importante mecanismo de resistência, têm sido
reportada em inúmeras espécies bacterianas (Domenech-Sanchez et al., 1999). A
perda das porinas OmpC e OmpF como causa de resistência a antimicrobianos têm
sido relatada principalmente em Escherichia coli e em Salmonella typhimurium
(Nikaido,1989). Em K. pneumoniae, três porinas de membrana externa foram descritas:
Omp K35, Omp K36 e Omp K37 (Domenech-Sanchez et al., 2003). A redução de
expressão ou perda destas porinas pode causar aumento nos níveis de resistência aos
β-lactâmicos (Martinez-Martinez et al., 1999).
A perda da porina OmpK36 está associada com a resistência à cefoxitina e
aumento da concentração inibitória mínima (MIC) de cefalosporinas e quinolonas
(Martinez-Martinez et al., 1996). A associação entre perda de porinas e resistência ao
imipenem foi descrita em K. pneumoniae produtora de β-lactamases AmpC (Bradford et
al., 1997; Martinez-Martinez et al., 1997). Em outros membros da família
__________________________________________________________________________
Enterobacteriaceae como em Enterobacter cloacae e Proteus rettgerii, a resistência a
carbapenens também têm sido relacionada à diminuição da permeabilidade da
membrana externa associada à hiperprodução de β-lactamases cromossômicas
(Cornaglia et al., 1995). O principal mecanismo de resistência a carbapenens em
Pseudomonas aeruginosa está relacionada à perda da porina OprD (D2) associado a
hiperprodução de β-lactamases Amp C (Livermore,1992; Livermore, 1991; Quinn et al.,
1986).
1.4.2-Hiperexpressão de sistemas ou bombas de efluxo
Os sistemas de efluxo são agrupados em cinco famílias de acordo com a
homologia da sequência de aminoácidos que as compõe. As famílias são: MFS ("major
facilitator superfamily"), ABC ("ATP binding cassette"), RND ("resistance-nodulation-
division"), SMR ("small multidrug resistance") e MATE ("multidrug and toxic compound
extrusion"). Os sistemas de efluxo que extruem antimicrobianos de importância clínica,
geralmente, pertencem às famílias RND ou MFS (Poole, 2002).
As proteínas que compõem os sistemas de efluxo são proteínas específicas
codificadas por genes cromossômicos ou plasmidiais. Esses sistemas contribuem para
a resistência intrínseca e adquirida da K. pneumoniae através da extrusão de vários
antimicrobianos, como tetraciclinas, fluoroquinolonas e cloranfenicol.
Os genes que codificam essas proteínas são constituintes normais do genoma
bacteriano e sua expressão está sob o controle de genes reguladores (Poole, Srikumar,
2001). A hiperexpressão dos sistemas de efluxo é causada por mutação ou mesmo
deleção dos genes reguladores levando à extrusão de antimicrobianos em níveis
elevados, impedindo-os, assim, de atingir seu sítio de ação. Uma vez que os genes que
__________________________________________________________________________
codificam esses sistemas de efluxo são principalmente constitutivos, cromossomais,
existe a possibilidade que qualquer microrganismo possa desenvolver este fenótipo de
resistência (Livermore, 2001, Hasdemir et al., 2004).
Os sistemas de efluxo são normalmente formados por proteínas de membrana
especializadas, que podem ser dividas de acordo com sua função em: i) bomba de
efluxo na membrana citoplasmática, ii) proteína formadora do canal extrusor na
membrana externa; e iii) proteína de fusão que liga os outros dois componentes da
bomba de efluxo (Nikaido, 1994). Em Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa os
sistemas de efluxo AcrAB e MEX, respectivamente, já foram descritos como sendo um
importante mecanismo de resistência a diversos antimicrobianos. Em K. pneumoniae o
sistema de efluxo AcrAB foi descrito e contribui para a extrusão de fluroquinolonas,
cloranfenicol e tetraciclina, porém, não contribui para a extrusão de β-lactâmicos
(Ogawa et al., 2006).
1.4.3-Alteração do sítio de ligação do antimicrobiano
O peptideoglicano é um constituinte essencial da parede celular bacteriana (Spratt,
Cromie, 1988). As proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs) são carboxipeptidases
localizadas na membrana citoplasmática que atuam em uma etapa importante na síntese
do peptideoglicano bacteriano, catalisando a reação de transpeptidação entre as duas
subunidades de mureína.
As PBPs são os sítios-alvo para a atividade dos antimicrobianos da classe dos
β-lactâmicos, que se ligam covalentemente a estas estruturas impedindo a formação da
parede celular e causando a lise osmótica da célula. A resistência aos antimicrobianos
__________________________________________________________________________
β-lactâmicos devido a alterações nas PBPs é mais comum em microrganismos Gram-
positivos que nos Gram-negativos (Dougherty et al., 1980).
Este mecanismo já foi demonstrado em Haemophilus influenza e também em
entrobactérias como Escherichia coli onde a modificação da PBP3 foi associada à
resistência à cefalexina e outras cefalosporinas (Mendelman et al., 1990; Hedge,
Spratt, 1985). Resistência ao imipenem pode também estar relacionada a alterações
nas PBPs em microrganismos como Enterobacter aerogenes e Acinetobacter
baumannii (Chow, Shlaes, 1991;Gehrlein et al., 1991). Entretanto, até o momento não
há nenhum relato de resistência aos carbapenens devido a alterações das PBPs em K.
pneumoniae.
1.4.4-Produção de β-lactamases
Dentre os diferentes mecanismos de resistência aos β-lactâmicos que já foram
descritos em amostras de K. pneumoniae, a produção de β-lactamases é o mecanismo
mais prevalente e importante nesta espécie. As β-lactamases são enzimas que
catalisam a hidrólise do anel β-lactâmico, impossibilitando assim a sua atividade
antimicrobiana (Livermore, 1995). As penicilinas, as cefalosporinas, os
monobactâmicos e os carbapenens podem ser hidrolisados por vários membros da
família das β-lactamases, e a interação entre estas enzimas e seus substratos resultam
em compostos inativos que permitem a sobrevivência da célula bacteriana (Bush,
2001).
A capacidade ou não da β-lactamase conferir resistência irá depender da
quantidade de enzima produzida, da habilidade dessa enzima em hidrolisar o
antimicrobiano em questão e da velocidade com que o β-lactâmico penetra pela
__________________________________________________________________________
membrana celular externa (Livermore, 1991). As β-lactamases são produzidas por
inúmeras espécies bacterianas, porém com diversidades estruturais e localizações
diferentes. Nas bactérias Gram-positivas, as β-lactamases são secretadas para o meio
extracelular, dessa forma irão apresentar uma atividade menor que as β-lactamases
produzidas pelas bactérias Gram-negativas. Nestas bactérias, as β-lactamases
encontram-se estrategicamente situadas no espaço periplasmático, podendo alcançar
maiores concentrações e agir de modo mais eficaz sobre os β-lactâmicos que estão
atravessando este espaço para atingir as PBPs (Bush et al.,1995).
Os genes que codificam as β-lactamases podem estar localizados no DNA
cromossômico, ou no DNA extracromossômico (plasmídeos e transposons) bacteriano
(Livermore, 1991).
Diferentes tipos de β-lactamases já foram descritas e inúmeras tentativas de
estabelecer um sistema de classificação para estas enzimas foram propostas ao longo
dos anos. Atualmente, duas classificações têm sido consideradas como de maior
importância: as classificações de Ambler e a de Bush-Jacoby-Medeiros (Ambler, 1980;
Bush et al., 1995).
A classificação de Ambler foi proposta com base na estrutura molecular das β-
lactamases, ou seja, de acordo com a seqüência de aminoácidos que as compõe.
Somente quatro classes moleculares principais de β-lactamases foram descritas: A) β-
lactamases de espetro ampliado (ESBLs), penicilinases e carbenicilinases; B) metalo-
β-lactamases; C) cefalosporinases cromossomais; e D) oxacilinases.
A classificação de Bush (Bush, 1989) foi a primeira a correlacionar o substrato
preferencial e propriedades inibitórias com a estrutura molecular da enzima. Em 1995,
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
uma atualização da classificação de Bush foi proposta. Esta nova classificação
combina características estruturais e funcionais das β-lactamases (Bush et al., 1995).
A Tabela 1 apresenta de modo simplificado a correlação entre a classificação
molecular de Ambler (1980) e a de Bush-Jacoby-Medeiros (1995) e as características
funcionais das β-lactamases
Tabela 1. Características funcionais e moleculares dos principais grupos de β-lactamases.
Classificação de BUSH- JACOBY-
MEDEIROS, 1995
Classificação de
AMBLER, 1989
Características funcionais
Grupo Funcional Subgrupos Classe Molecular
1 C
Enzimas cromossômicas e plasmidiais dos Gram-negativos. Isoladamente
conferem resistência a todos os β-lactâmicos, exceto carbapenens. Não são
inibidas pelo ácido clavulânico.
2 A, D
A grande maioria das enzimas é inibida por ácido clavulânico
2a A
Penicilinases produzidas por Staphylococcus spp. e Enterococcus spp.
Conferem altos níveis de resistência às penicilinas
2b A
β-lactamases de espectro reduzido de bactérias Gram-negativas. Inclui TEM-
1 e SHV-1.
2be A
β-lactamases de espectro ampliado conferem resistência às cefalosporinas de
amplo espectro e monobactâmicos (ESBLs)
2br A
β-lactamases derivadas da TEM resistentes aos inibidores de β-lactamases
(IRT)
2c A Enzimas que hidrolisam a carbenicilina
2d D
Enzimas que hidrolisam a cloxacilina (oxacilina), pouco inibidas pelo ácido
clavulânico
2e A Cefalosporinases inibidas pelo ácido clavulânico
2f A
Enzimas que possuem um sítio ativo serina, que hidrolisam carbapenens e
são inibidas pelo ácido clavulânico
3 3a, 3b, 3c B
Metalo-β-lactamases que conferem resistência aos carbapenens e todos os
outros β-lactâmicos com exceção dos monobactâmicos. Não são inibidas pelo
ácido clavulânico, tazobactam e sulbactam
4 ND Enzimas não seqüenciadas que não são categorizadas em outros grupos
Abreviatura: N.D., não determinada (Adaptado do artigo de Bush, 2001).
__________________________________________________________________________
1.4.4.1-β-lactamases de espectro ampliado
As β-lactamases de espectro ampliado pertencem majoritariamente à classe A
de Ambler e estão distribuídas no grupo 2 de Bush-Jacoby-Medeiros (1995). São
enzimas capazes de hidrolisar todos os antimicrobianos β-lactâmicos com exceção das
cefamicinas (cefoxitina, cefotetan) e os carbapenens (imipenem, meropenem) e, são
inibidas pelo ácido clavulânico.
O primeiro relato de uma β-lactamase, denominada TEM-1, ocorreu em 1960.
Esta enzima foi encontrada em uma amostra clínica de Escherichia coli isolada da
corrente sanguínea de uma jovem paciente grega. A disseminação da enzima TEM-1
para outras espécies bacterianas foi facilitado pelo o fato de esta enzima ser codificada
por genes localizados, usualmente, em elementos genéticos móveis, plasmídios e
transposons, que por meio de uma série de eventos de transposição e
rearranjamentos, migram para diferentes plasmídios entre microrganismos da mesma
espécie ou de espécies diferentes (Paterson D, Bonomo R, 2005).
Atualmente, a β-lactamase TEM-1 têm sido reportada em diversos países, sendo
encontradas em diferentes espécies bacterianas como Pseudomonas aeruginosa,
Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae e em membros da família das
Enterobacteriaceae, entre elas a Klebsiella pneumoniae. Uma outra β-lactamase
comumente encontrada em K. pneumoniae e E. coli é a enzima SHV-1. SHV vem de
uma propriedade bioquímica da enzima variável sulfidrila (“sulphydryl sariable”).
O sucesso da indústria farmacêutica no desenvolvimento de novos β-lactâmicos
resistentes à hidrólise das β-lactamases TEM-1 estimularam a introdução do uso clínico
de β-lactâmicos de amplo espectro, em 1978, na Europa, e, em 1981, nos Estados
Unidos. O uso de antimicrobianos β-lactâmicos favorece a seleção e o crescimento de
mutantes do gene bla
TEM
, que conferem resistência às cefalosporinas de amplo
__________________________________________________________________________
espectro. Desta maneira, pelo uso extensivo de antimicrobianos β-lactâmicos de amplo
espectro, na década de 80, microrganismos que possuíam β-lactamases mediadas
pelo gene bla
TEM
desenvolveram resistência às cefalosporinas de amplo espectro e
monobactâmicos (Naumoviski et. al.,1992; Meyer et al., 1993). Este desenvolvimento
de resistência se deve a mutações nos genes bla
TEM-1
e bla
SHV-1
,
que resultam na
substituição de aminoácidos alterando o substrato específico das enzimas.
Essas β-lactamases plasmídiais que começaram a ser descritas estavam
relacionadas às enzimas TEM-1, TEM-2 e SHV-1, porém muito mais potentes. Elas
conferem resistência a cefalosporinas de amplo espectro e monobactans e foram
denominadas β-lactamases de espectro ampliado ou estendido (“extended spectrum β-
lactamases” - ESBL). Espécies produtoras de ESBL podem sobreviver por longos
períodos de tempo em hospitais, ocasionando surtos. Além disso, esses grandes
plasmídios geralmente contêm genes de resistência a outros antimicrobianos como
aminoglicosídeos, sulfonamidas, tetraciclina e cloranfenicol (Thomson et al.,1996).
O isolado bacteriano mais antigo produtor de ESBL foi descrito em 1982 em
Liverpool na Inglaterra, tratava-se de uma amostra de Klebsiella oxytoca produtora de
TEM-12. Essa amostra foi responsável por um surto ocorrido em uma UTI neonatal
(Amyes, Gemmel, 1997).
Em 1983, foi descrito o primeiro relato de uma SHV de espectro ampliado,
denominada SHV-2, encontrada em amostras clínicas de K. pneumoniae, Klebsiella
ozanenae e Serratia marcescens (Knothe et al., 1983). Em 1988, SHV-3 e SHV-4 foram
descritas por Jarlier e colaboradores (Jarlier et al., 1988) e Buré e colaboradores (Buré
et al., 1988), respectivamente. Ambas foram encontradas em amostras clínicas de K.
pneumoniae recuperadas em hospitais Franceses. Desde então, inúmeros relatos de
__________________________________________________________________________
surtos envolvendo Klebsiella pneumoniae produtoras de β-lactamases de espectro
ampliado têm sido reportados (GniadkowskiI et al., 1998; Schooneveldt et al., 1998).
As β-lactamases CTX-M constituem um grupo crescente de enzimas que têm a
propriedade de conferir resistência a todas as cefalosporinas de espectro ampliado,
porém, apresentam como substrato preferencial a cefotaxima e a ceftriaxona. Estas β-
lactamases são codificadas por genes, bla
CTX-M
, localizados em plasmídios, os quais,
normalmente, abrigam outros genes que conferem resistência aos aminoglicosídeos,
ao cloranfenicol, ás sulfonamidas, ao trimetoprim e à tetraciclina.
Os primeiros relatos destas enzimas ocorreram a partir dos anos 80 e sua
disseminação aumentou drasticamente, em diferentes espécies bacterianas e em
distintos países do mundo, a partir de 1995.
No início dos anos de 1990, a β-lactamase CTX-M-2 disseminou rapidamente na
Argentina e, atualmente, também é freqüente em Israel (Quinteros et al., 2003,
Chmelnitsky et al., 2005). Outros membros da família CTX-M estão distribuídas em
diversos lugares; CTX-M-9 e -14 predominantemente na Ásia e na Espanha (Munday et
al., 2004, Hernandez et al., 2005) e CTX-M-3 e -15 na Europa. Desconhecida no Reino
Unido antes de 2001, a enzima CTX-M-15 é a ESBL mais prevalente em amostras
bacterianas de E. coli e K. pneumoniae (Livermore, Hawkey, 2005).
Em um estudo realizado no Rio de Janeiro, Brasil, por Bonnet e colaboradores
(Bonnet et al., 2000), constatou-se que a enzima CTX-M é a segunda ESBL mais
freqüente entre amostras bacterianas da família Enterobacteriaceae produtoras de
ESBL, perdendo apenas para as enzimas SHV.
As oxacilinases (OXA) são β-lactamases pertencentes à classe D de Ambler e
ao grupo 2d de Bush-Jacoby-Medeiros. Similarmente, as ESBLs das classes TEM e
SHV produzidas por amostras bacterianas de K. pneumoniae, as enzimas do tipo OXA
__________________________________________________________________________
apresentam resistência as cefalosporinas, monobactâmicos e penicilinas, porém,
apresentam como substrato preferencial a oxacilina. Estas enzimas também se
caracterizam por serem fracamente inibidas pelo ácido clavulânico (Danel et al., 1999).
O primeiro relato de uma enzima OXA ocorreu, em 1993, no Reino Unido,
isolada de uma amostra bacteriana de Acinetobacter baumannii, a qual foi denominada
ARI-1 (“Acinetobacter resistant to imipenem”), hoje em dia, conhecida como OXA-23.
Em virtude desta amostra de A. baumannii ter sido isolada em 1985, antes da
introdução do imipenem nos hospitais, suspeita-se que o uso clínico do imipenem não
tenha sido responsável pelo aparecimento das enzimas carbapenemases classe A e D
(Brown, Amyes, 2006).
Atualmente, 121 variantes de β-latamases classe D foram identificados, sendo
que 45 dessas enzimas apresentam atividade hidrolítica aos carbapenens: oxa-
carbapenemases. As oxa-carbapenemases são divididas em oito subgrupos, de acordo
com a seqüência de aminoácidos. Dos oito subgrupos quatro deles foram encontrados
em amostras de A. baumannii isoladas na Europa, América do Sul, Ásia e a Polinésia
Francesa (Walther-Rasmussen, Høiby, 2006).
A grande maioria das oxa-carbapenemases, até o momento, foi encontrada em
espécies não pertencentes à família Enterobacteriaceae, principalmente, em A.
baumannii. As oxa-carbapenemases OXA-50, OXA-51 e OXA-60 parecem ser enzimas
produzidas naturalmente ou constitutivamente em P. aeruginosa, A. baumannii e R.
pickettii, respectivamente (Walther-Rasmussen, Høiby, 2006).
A maioria das oxa-carbapenemases confere apenas sensibilidade reduzida aos
carbapenens, entretanto, a produção destas enzimas em associação com um outro
mecanismo de resistência, como por exemplo, alteração da permeabilidade da
__________________________________________________________________________
membrana externa, hiperexpressão de um sistema de efluxo ou alteração do sítio de
ligação do antimicrobiano, pode resultar alto grau de resistência aos carbapenens.
Diversos relatos de surtos envolvendo amostras de A. baumannii produtoras de
oxacilinases com capacidade hidrolítica sobre os carbapenens têm sido reportados em
diversas partes do mundo. O primeiro relato de uma oxa-carbapenemase no Brasil foi
publicado em 2003 (Dalla-Costa et al., 2003). Tratava-se de um surto de oito amostras
de A. baumannii, resistentes aos carbapenens (MIC > 32µg/ml), produtoras da enzima
OXA-23.
Recentemente, em 2004, uma oxacilinase, denominada OXA-48, com alta
atividade hidrolítica contra os carbapenens (MIC 64µg/ml) foi identificada em uma
amostra clínica de K. pneumoniae, na Turquia (Poirel et al., 2004). Dentre as oxa-
carbapenemases somente a OXA-23, OXA-40, OXA-58 em A. baumannii e OXA-48 em
K. pneumoniae são codificadas por genes inseridos em plasmídios, o restante são
codificadas por genes localizados no cromossomo bacteriano, fato que contribui para a
lenta propagação destas enzimas.
O aumento da resistência a cefalosporinas acarretou na dependência dos
carbapenens como uma das últimas opções terapêuticas para o tratamento das
infecções causadas por bacilos gram-negativos. Esta necessidade foi enfatizada pelo
fato de que muitas amostras bacterianas produtoras de ESBL são multirresistentes,
sendo resistentes aos aminoglicosídeos, a trimetoprim, a tetraciclina e, especialmente,
ás fluroquinolonas. A resistência aos carbapenens tem surgido lentamente em
membros da família Enterobacteriaceae, com taxas inferiores a 1%, mesmo após 20
anos de uso do imipenem.
__________________________________________________________________________
1.4.4.2-Metalo-β-lactamases
Dentre as diferentes classes de enzimas que degradam os β-lactâmicos, as
metalo-β-lactamases (MβLs) são notáveis pelo seu amplo espectro de atividade,
incluindo os carbapenens e também pela resistência que estas enzimas apresentam
aos inibidores de β -lactamases (Laraki et al., 1999).
As MβLs são β-lactamases pertencentes à classe B de Ambler ou à classe 3 de
Bush-Jacoby-Medeiros que hidrolisam todos β-lactâmicos comercialmente disponíveis,
sendo a única exceção o monobactam, aztreonam.
As MβLs caracterizam-se por apresentarem a mesma estrutura tridimensional
(αββα), necessitarem de dois íons divalentes, usualmente zinco, como co-fator para
atividade catalítica, e por apresentarem resíduos conservados, os quais são
responsáveis pela interação da enzima com cátions divalentes (Murphy et al., 2003).
Adicionalmente, estas enzimas são inibidas por ácido etileno-diamino-tetracético
(EDTA) ou compostos derivados do ácido tiolático (por exemplo, ácido 2-
mercaptopropiônico) e não são inibidas por inibidores de serino-β-lactamases
disponíveis comercialmente, como o ácido clavulânico, o sulbactam e o tazobactam
(Bush et al., 1995)
As metalo-enzimas eram encontradas em um número limitado de espécies,
como: Bacilus cereus, Aeromonas hydrophila, Flavobacterium odoratum, Legionella
gormanii, Bacteriodes fragilis, Stenotrophomonas maltophilia (Hirakata et al, 1998), nas
quais são produzidas constitutivamente. Atualmente, embora sejam mais
freqüentemente isoladas em outras espécies de bactérias Gram-negativas não-
fermentadoras, como Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, cada vez
mais estas enzimas têm sido reportadas em membros da família Enterobacteriaceae,
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
incluindo K. pneumoniae (Giakkoupi et al., 2004a, Luzzaro et al., 2004). Nestas
espécies, os determinantes de resistência são conhecidos como MβLs móveis ou
também MβLs adquiridas, por serem encontrados inseridos em estruturas genéticas
que fornecem mobilidade ao gene. A Tabela 2 contém os dados de cada uma das
variantes encontradas dentre as cinco subclasses de MβLs adquiridas descritas até o
momento.
Tabela 2. Dados dos primeiros exemplares de cada uma das variantes encontradas nas cinco subclasses de MβLs adquiridas
descritas até o momento.
Enzima Variante Nucleotídeo Microrganismo País Localização Referência
IMP-1 S71932
S. marcescens
Japão Cromossomal Osano E et. al
IMP-2 AJ243491
A. baumannii
Itália Cromossomal Riccio M L et al.
IMP-3 AB010417
S. flexneri
Japão Plasmidial Iyobe S et al.
IMP-4 AF244145
Acinetobacter spp.
Japão Cromossomal Chu Y W et al.
IMP-5 AF290912
A. baumannii
Portugal Cromossomal Da Silva G J et al.
IMP-6 AB040994
S. marcescens
Japão Plasmidial Yano H et al.
IMP
IMP-7 AF318077
P. aeruginosa
Canadá Não determinado Gibb A P et al.
IMP-8 AF322577
K. pneumoniae
Taiwan Plasmidial Yan J J et al.
IMP-9 AY033653
P. aeruginosa
China Não determinado Xiong J et al.
IMP-10 AB074433
P. aeruginosa
Japão Plasmidial Iyobe S et al.
IMP-11 AB074437
P. aeruginosa
Japão Não determinado Iyobe S et al.
IMP-12 AJ420864
P. putida
Itália Plasmidial Docquier J D et al.
IMP-13 AJ550807
P. aeruginosa
Itália Não determinado Toleman M A et al.
IMP-16 AJ584652
P. aeruginosa
Brasil Cromossomal Mendes R E et al.
IMP-18 AY780674
P. aeruginosa
EUA Não determinado Hanson et al.
VIM-1 Y18050
P. aeruginosa
Itália Cromossomal Lauretti L et al.
VIM-2 AF191564
P. aeruginosa
França Plasmidial Poirel L et al.
VIM-3 AF300454
P. aeruginosa
Taiwan Cromossomal Yan J J et al.
VIM-4 AY135661
P. aeruginosa
Grécia Não determinado Pournaras S et al.
VIM-5 AY144612
K. pneumoniae
Turquia Não determinado Bahar G et al.
VIM
VIM-6 AY165025
P. putida
Cingapura Plasmidial Koh T H et al.
VIM-7 AJ536835
P. aeruginosa
EUA Plasmidial Toleman M A et al.
VIM-8 AY524987
P. aeruginosa
Colômbia Não determinado Crespo M P et al.
VIM-9 AY524988
P. aeruginosa
Reino Unido Não determinado Woodford N et al.
VIM-10 AY524989
P. aeruginosa
Reino Unido Não determinado Woodford N et al.
VIM-11 AY605049
P. aeruginosa
Argentina Cromossomal Pasteran F et al.
VIM-12 DQ143913
K. pneumoniae
Grécia Plasmidial Pournaras S et al.
SPM
SPM-1 PAE492820
P. aeruginosa
Brasil Plasmidial Toleman M A et al.
GIM
GIM-1 AJ620678
P. aeruginosa
Alemanha Plasmidial Castanheira M et al.
SIM
SIM-1 AY887066
A. baumannii
Coréia Não determinado Lee K et. Al
__________________________________________________________________________
O primeiro relato de MβL adquirida, ocorreu em 1994 (Osano et al., 1994), onde
foi descrito uma subclasse denominada IMP-1. Esta enzima foi encontrada em uma
cepa clínica de Serratia marcescens isolada no Japão, a qual apresentava fenótipo de
resistência a imipenem e cefalosporinas de amplo espectro. Durante muitos anos, a
ocorrência de isolados produtores de IMP-1 foi restrita a este país, entretanto,
atualmente novas variantes desta subclasse têm sido reportada em diversos países,
sendo comumente encontradas em microrganismos não-fermentadores da glicose,
Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas spp. e Acinectobacter spp., no entanto, já
houveram relatos destas enzimas em microrganismos pertencentes à família
Enterobacteriaceae (Yan et al., 2001b; Osano et al., 1994).
O primeiro relato de uma MβL no continente americano ocorreu em 2002 por
Gibb e coladoradores (Gibb et al., 2002). Os autores descreveram a detecção de uma
cepa de Pseudomonas aeruginosa em um hospital canadense que apresentava alto
grau de resistência à ceftazidima e aos carbapenens. Análises posteriores revelaram a
presença de uma nova enzima, designada IMP-7.
Em 1999, a segunda classe de MβL adquirida foi descrita e denominada VIM-1
(Vereona imipenemase). A presença desta enzima foi observada em uma amostra de
P. aeruginosa isolada em Verona, Itália (Lauretti et al., 1999). As enzimas pertencentes
à subclasse VIM apresentam um menor número de variantes atualmente descritas,
bem como distribuição concentrada em determinadas regiões geográficas, quando
comparadas àquelas pertencentes à subclasse IMP.
As variantes de VIM foram encontradas tanto em microrganismos fermentadores
de glicose quanto naqueles não fermentadores. Estas enzimas são mais prevalentes
em países da Comunidade Européia, região onde foram originariamente isoladas
__________________________________________________________________________
(Laraki et al., 1999). Entretanto, as variantes de VIM também foram relatadas na Ásia
(Yan et al., 2001a; Yum et al., 2002), e, mais recentemente, nos Estados Unidos
(Toleman et al., 2004), no Chile e na Venezuela (Mendes et al., 2004a).
Recentemente, três novas MβLs móveis foram descritas. SPM-1 (sigla para São
Paulo Metalo-β-Lactamase) foi isolada de uma amostra de P. aeruginosa, recuperada
do trato urinário de uma paciente hospitalizada no complexo Hospital São
Paulo/UNIFESP (São Paulo, SP). (Toleman et al., 2002). O gene que codifica SPM-1
parece estar especificamente relacionado à espécie P. aeruginosa, uma vez que, até o
presente momento, a enzima SPM-1 não foi detectada em outras espécies bacterianas.
Posteriormente, uma nova e a quarta subclasse de MβL adquirida, denominada GIM-1,
foi encontrada em cinco cepas de P. aeruginosa provenientes de Dusseldorf, Alemanha
(Castanheira et al., 2004). Mais recentemente, em 2005, a quinta subclasse de MβL
adquirida, SIM-1 foi encontrada na Coréia em uma amostra de Acinetobacter spp.(Lee
et al., 2005).
1.4.4.3-Contexto genético das MβL adquiridas
Diversos fatores contribuem para o êxito das ESBLs e das MβLs como
determinantes de resistência, no entanto, a grande capacidade de disseminação dos
genes que codificam estas β-lactamases mostram que este é um problema
contemporâneo, de grande importância e que aumenta as preocupações com o uso
indiscriminado de cefalosporinas de amplo espectro e carbapenens no ambiente
hospitalar (Spencer et al., 2001). A habilidade dos bacilos Gram-negativos de adquirir
genes de resistência aos antimicrobianos e, subseqüentemente, disseminá-los para
inúmeras espécies bacterianas é justificada pela transferência de plasmídios,
transposons e integrons. Os genes de resistência presentes em transposons e/ou
__________________________________________________________________________
integrons podem ser mobilizados para diversos plasmídios, e uma vez presentes nos
plasmídios, podem ser transferidos de uma bactéria para outra e assim disseminados
(Recchia & Hall, 1997).
Os plasmídios são responsáveis pela disseminação de muitas β-lactamases, no
entanto, os genes que codificam estas enzimas são encontrados inseridos em
integrons, que freqüentemente, também, contém outros genes que conferem
resistência a uma variedade de antibióticos. Por esta razão as β-lactamases são
usualmente produzidas por organismos que também são resistentes a múltiplos
agentes antimicrobianos (Jacoby & Munoz-Price, 2005).
As MβL adquiridas são codificadas por genes que podem estar localizados tanto
no plasmídeo como no cromossomo bacteriano. No entanto, com exceção da enzima
SPM-1, a qual é codificada por um gene localizado em um plasmídeo (Toleman et al.,
2002; Poirel et al., 2004), as demais MβL adquiridas são codificadas por genes
localizados em integrons de classe 1 (Mendes et al., 2004a; Walsh et al., 2003; Mendes
et al., 2004b).
1.4.4.4-Integrons classe 1
Os integrons da classe 1 são elementos genéticos que possuem em cada uma
de suas extremidades seqüências conservadas (conserved sequence - CS). A
extremidade 5’ ou 5’-CS, é composta por; (i) um gene intI1 que codifica uma integrase
de classe 1, responsável pela integração e excisão de genes cassetes, (ii) um sítio de
recombinação attI1, onde os genes cassetes são preferencialmente integrados e (iii)
um promotor, que regula a expressão dos genes cassetes que estarão localizados
entre as duas CS. A extremidade 3’ (3’-CS) é, geralmente, composta de um gene
__________________________________________________________________________
qacE∆1 conjugado a um gene sul1, sendo que estes genes codificam resistência para
compostos de amônio quaternário e sulfonamidas, respectivamente (Collis and Hall,
1992; Collis and Hall, 1995; Bennett, 1999). Os integrons são capazes de inserir e
excluir genes cassetes, os quais em sua grande maioria conferem resistência
bacteriana.
Os genes que codificam as MβLs estão localizados em estruturas chamadas
genes cassetes ou cassetes gênicos, que têm normalmente entre 500–1000-bp e são
constituídos de dois componentes funcionais, um gene, responsável pela codificação
de uma proteína, e um sítio de recombinação, sendo este último conhecido como 59-
elementos de base (59-be). Genes cassetes podem ser encontrados como parte do
contexto genético de um integron ou como forma circular livre, porém incapazes de
promover a auto-mobilização ou a auto-replicação. Estes genes também não possuem
promotores, portanto, tanto a sua expressão gênica quanto a sua mobilização, são
dependentes do próprio integron ao qual o gene cassete encontra-se inserido (Collis
and Hall, 1992; Collis et al., 1993).
A integrase, enzima codificada pelo intI1, é uma recombinase sítio-específico e
possui como substrato preferencial dois sítios de ação, um na porção do 59-be,
pertencente ao gene cassete, e outro no receptor do gene cassete ou no sítio de
recombinação (attI1) localizado no integron (Collis and Hall, 1995; Partridge et al.,
2000). Geralmente, as reações de recombinação ocorrem entre attI1 (localizado no
integron) e 59-be (localizado no gene cassete). Sendo assim, esta enzima promove a
incisão, a excisão e o rearranjo de genes cassetes presentes em determinado integron
sendo, em parte, grande responsável pela disseminação de genes de resistência
(Figura 1).
__________________________________________________________________________
attI1
5´CS
´
Figura 1. Representação esquemática de um integron da classe 1 e de um gene
cassete circular livre. As flechas representam os genes do integron e o sentido das
flechas representa o sentido da transcrição dos genes. À esquerda, a seqüência
conservada 5’, contendo o gene que codifica a integrase e o sítio de ligação attI. À
direita, a 3’-CS, contendo a estrutura truncada qacE
Δ
1/sul1.
intI1 gene gene qacE∆1/sul1
59’-be
Gene cassete livre
__________________________________________________________________________
2-OJETIVOS
Objetivo principal
2.1-Avaliar os mecanismos de resistência aos carbapenens presentes em amostras de
K. pneumoniae isoladas de hospitais da cidade de São Paulo
Objetivos secundários
2.2-Identificar os genes que codificam as MβLs envolvidos na resistência aos
carbapenens
2.3-Identificar o contexto genético, no qual estão inseridos os genes que codificam as
MβLs
2.4-Avaliar fenotipicamente as alterações da permeabilidade das proteínas da
membrana externa
2.5-Avaliar fenotipicamente a hiperexpressão dos sistemas de efluxo
2.6-Caracterizar a relação genética entre as amostras de K. pneumoniae resistentes
aos carbapenens
__________________________________________________________________________
3- MATERIAL E MÉTODOS
3.1-Amostras bacterianas
Foram enviadas ao Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC), nove
amostras clínicas identificadas como K. pneumoniae resistentes a carbapenens, sendo
oito delas procedentes do Hospital Servidor Público Estadual (HSPE) e apenas uma
amostra isolada no Hospital Universitário da Faculdade de Medicina da Universidade
de São Paulo (HU-USP). Posteriormente, as amostras foram enviadas ao Laboratório
ALERTA e armazenadas para caracterização dos mecanismos de resistência aos
carbapenens.
Das oito amostras de K. pneumoniae procedentes do HSPE, duas foram
isoladas em urina, enquanto, as outras seis foram isoladas em hemocultura, durante
dezembro de 2003 e janeiro de 2004. A única amostra do Hospital Universitário foi
isolada em hemocultura, no ano de 2003.
Data de isolamento Local de
isolamento
Sítio de isolamento Banco LEMC
Abril 2003 HU-USP hemocultura A11775
Dezembro 2003 HSPE hemocultura A13304
Dezembro 2003 HSPE urina A13305
Dezembro 2003 HSPE hemocultura A13306
Janeiro 2004 HSPE hemocultura A13307
Janeiro 2004 HSPE hemocultura A13308
Janeiro 2004 HSPE urina A13309
Janeiro 2004 HSPE hemocultura A13310
Janeiro 2004 HSPE hemocultura A13311
__________________________________________________________________________
3.2-Confirmação do fenótipo de resistência aos carbapenens
As amostras foram retiradas do banco de microrganismos do ALERTA e
subcultivadas por duas vezes em ágar sangue. Após isolamento de colônias puras, os
testes de sensibilidade aos carbapenens e à ceftazidima foi realizado pela técnica de
diluição em ágar, seguindo as padronizações estabelecidas pelo “National Committee
for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS, 2003) e interpretados segundo as
recomendações do “Clinical and Laboratory Standard Institute” (CLSI, 2005). Para o
controle de qualidade dos testes de sensibilidade foram utilizadas as amostras da
“American Type Culture Collection” (ATCC), Escherichia coli ATCC 25922 e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
3.2.1-Técnica de ágar diluição
De acordo com as normas estabelecidas pelo NCCLS (2003), a seguinte fórmula
foi utilizada para calcular a quantidade de sal de antimicrobiano necessária, a fim de
obter a concentração desejada da solução estoque.
P = Volume x Concentração solução
Potência
P= Peso do sal (mg)
Volume = volume da solução estoque desejada (ml)
Conconcentração solução = concentração da solução desejada (µg/ml)
Potência = atividade do antimicrobiano (µg/mg)
__________________________________________________________________________
Os agentes antimicrobianos testados e as respectivas concentrações (µg/ml)
foram: ceftazidima (0,25-128 μg/ml), meropenem (0,25-64 μg/ml), de imipenem (0,25-
128 μg/ml).
As soluções estoques foram preparadas numa concentração 100 vezes superior
à maior concentração testada. Essas soluções foram distribuídas em alíquotas e
conservadas à -70°C (NCCLS, 2003). A partir da concentração da solução estoque,
foram realizadas diluições seriadas do respectivo antimicrobiano, simultaneamente, em
tubos contendo 19 ml de ágar Müeller-Hinton (Oxoid
®
, Basingstoke, Inglaterra),
previamente esterilizados, fundidos e estabilizados em banho-maria a 45 e 50
o
C. Uma
vez estabilizada a temperatura, 1 ml de uma solução de antimicrobiano com
concentração 20 vezes superior a ser testada, foi adicionado nos 19 ml de ágar
Müeller-Hinton. Após homogeneização, o conteúdo foi vertido em placas de Petri de
90 x 15 mm, estéreis e pré-identificadas. As placas contendo os antimicrobianos foram
utilizadas no mesmo dia ou armazenadas a 4
o
C até sua utilização, que ocorreu no
máximo em 24 horas.
Para cada amostra, uma suspensão contendo aproximadamente 4 colônias foi
preparada em caldo de Müeller-Hinton (Oxoid
®
, Basingstoke, Inglaterra), e a turbidez
ajustada a 0,5 na escala de McFarland. Para o teste de diluição em ágar a solução a
0,5 na escala McFarland, foi diluída com água destilada estéril na proporção de 1:10,
resultando em um inóculo de aproximadamente 10
7
UFC/ml. Trezentos microlitros
dessa suspensão bacteriana foi transferido para a base do inoculador de Steers de 37
pinos. Desse modo, 1 a 3 µl de cada amostra foi inoculado simultaneamente na
superfície do ágar obtendo um inóculo final de 1x10
4
Unidades Formadoras de
Colônias (UFC)/ml (NCCLS, 2003).
__________________________________________________________________________
As placas foram deixadas à temperatura ambiente até a absorção do inóculo
pelo ágar sendo, logo após, incubadas a 35
o
C por 18 horas. Após o tempo de
incubação, as placas foram lidas de acordo com os critérios de sensibilidade
estabelecidos pelo CLSI para Enterobacteriaceae (CLSI, 2005).
A concentração inibitória mínima (MIC) foi definida como sendo a menor
concentração de cada antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano.
3.3-Avaliação dos mecanismos de resistência aos carbapenens
3.3.1-Pesquisa dos genes que codificam as metalo-β-lactamases e estudo do
contexto genético, onde estes genes estão inseridos
A técnica da reação em cadeia da polimerase (“Polimerase Chain Reaction” –
PCR) foi utilizada para determinar a presença dos genes que codificam as MβLs e o
contexto genético que abrigava estes genes, utilizando “primers” específicos (Tabela
3). Todos os “primers” utilizados foram desenhados no laboratório e, posteriormente,
encaminhados para síntese.
Para a extração do DNA bacteriano, as amostras foram cultivadas em ágar
nutriente contendo de 4 a 10 μg/ml de imipenem e, após isolamento de colônias puras,
de três a cinco colônias de cada amostra foram transferidas para um tubo tipo
“eppendorf” contendo 200 μl de água destilada estéril. Esta suspensão foi utilizada
diretamente para a etapa de amplificação do DNA. Em fluxo laminar, foi preparada uma
solução-mãe (“master mix”) contendo: H
2
O deionizada estéril, tampão MgCl
2
1,5 mM,
tampão NH
4
Cl 50 mM, desoxinucleotídeo trifosfato 0,2 mM (dATP, dTTP, dGTP e
dCTP), 2,5 unidades/L de Taq DNApolimerase e “primers”. A solução mãe foi mantida a
aproximadamente 4°C durante seu preparo e, após leve agitação 45 μl foi transferido
__________________________________________________________________________
para cada tubo de amplificação, que já continha 5 μl da suspensão celular. As
condições para amplificação do DNA foram específicas para cada um dos “primers”
utilizados. Após amplificação do DNA, a revelação do produto amplificado foi feita com
eletroforese em gel de agarose a 1% e visualização sob luz ultravioleta.
Tabela 3. Oligonucleotídeos utilizados como “primers” para as reações de PCR.
Primer Sequência (5’-3’)
Condições de
termociclagem
Tamanho do
amplicon
Gene alvo
IMP-1F CTACCGCAGCAGAGTCTTTGC
Desnaturação: 95ºC – 10’
Desnaturação: 95ºC – 1’
Anelamento: 55ºC - 1’
Extensão: 72ºC - 1’
34 ciclos
Extensão final: 72ºC - 10’
740bp
bla
IMP-1
-
like
IMP-1R GAACAACCAGTTTTGCCTTACC
IMP-2 F CTGCCGCGGGAGCGCGTTTG
Desnaturação: 95ºC – 10’
Desnaturação: 95ºC – 1’
Anelamento: 55ºC - 1’
Extensão: 72ºC - 1’
34 ciclos
Extensão final: 72ºC - 10’
740bp
bla
IMP-2
-
like
IMP-2 R GCCCTTTAACAGCCTGTTCCC
VIM-1F TCTACATGACCGCGTCTGTC
Desnaturação: 94ºC – 10’
Desnaturação: 94ºC – 1’
Anelamento: 55ºC - 1’
Extensão: 72ºC - 1’
35 ciclos
Extensão final: 72ºC - 10’
800bp
bla
VIM-1
-
like
VIM-1R TGTGCTTTGACAACGTTCGC
VIM-2 F ATGTTCAAACTTTTGAGTAGTAAG
Desnaturação: 94ºC – 10’
Desnaturação: 94ºC – 1’
Anelamento: 40ºC - 1’
Extensão: 68ºC - 1’
30 ciclos
Extensão final: 68ºC - 10’
800bp
bla
VIM-2
-
like
VIM-2 R CTACTCAACGACTGAGCG
SPM-1 F CCTACAATCTAACGGCGACC
Desnaturação: 95ºC – 10’
Desnaturação: 95ºC – 1’
Anelamento: 45ºC - 1’
Extensão: 68ºC - 1’
29 ciclos
Extensão final: 68ºC - 10’
840bp
bla
SPM-1
SPM-1 R TCGCCGTGTCCAGGTATAAC
att1 F GCCTGTTCGGTTCGTAAGCT
Desnaturação: 95ºC – 10’
Desnaturação: 95ºC – 1’
Anelamento: 55ºC - 1’
Extensão: 72ºC - 1’
34 ciclos
Extensão final: 72ºC - 10’
50bp
attI 1
att1 R GCCTGTTCGGTTCGTAAGCT
__________________________________________________________________________
Primer Sequência (5’-3’)
Condições de
termociclagem
Tamanho do
amplicon
Gene alvo
intI1 F CCGTAGAAGAACAGC
Desnaturação: 95ºC – 10’
Desnaturação: 94ºC – 1’
Anelamento: 50ºC - 1’
Extensão: 72ºC - 3’
34 ciclos
Extensão final: 72ºC - 10’
1013bp
IntI 1
Qac R CGGATGTTGCGATTACTTCG 347bp
qacE∆1
aadA1 F CGCCGAAGTATCGACTCAAC
Desnaturação: 95ºC – 10’
Desnaturação: 95ºC – 1’
Anelamento: 55ºC - 1’
Extensão: 72ºC - 1’
34 ciclos
Extensão final: 72ºC - 10’
790bp
aadA 1
aadA1 R GACTACCTTGGTGATCTCGC
sul1 F CTCACCGAGGACTCCTTC
Desnaturação: 95ºC – 10’
Desnaturação: 95ºC – 1’
Anelamento: 55ºC - 1’
Extensão: 72ºC - 1’
34 ciclos
Extensão final: 72ºC - 10’
50bp
sul 1
sul1 FR GAAGGAGTCCTCGGTGAG
3.3.2-Reação de sequênciamento
Os produtos de PCR obtidos com os oligonucleotídeos descritos foram
excisados do gel de agarose após eletroforese e purificados com o kit “QIAquick Gel
Extraction” (Qiagen, Hilden, Alemanha), conforme as instruções do fabricante. O DNA
foi quantificado no espectrofotômetro e 100 μg foi utilizado para a reação de
seqüenciamento com kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems,
Foster City, CA). As reações de sequenciamento foram realizadas no aparelho ABI
PRISM 377 - Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Perkin Elmer, Califórnia, EUA).
As seqüências de DNA obtidas e as seqüências protéicas derivadas foram
analisadas utilizando o programa Lasergene Software Package (DNASTAR, Madison,
WI, EUA) e, então submetidas, à comparação nas bases de dados de nucleotídeos
disponíveis na internet (BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ e EMBL
http://www.ebi.ac.uk/fasta33/).
__________________________________________________________________________
3.3.3-Avaliação fenotípica das alteração da permeabilidade das proteinas da
membrana externa
Com auxílio de uma alça estéril, de três a cinco colônias bacterianas foram
inoculadas em 5 ml de caldo “brain heart infusion” (BHI, Oxoid, Basingstoke, Inglaterra)
e incubadas sob leve agitação a 37°C por 18 a 20 horas. Após este período, 5 ml desta
cultura foi transferido para outro tubo contendo 50ml de BHI, o qual foi incubado por 4 a
5 horas a 37°C. Em seguida as células bacterianas foram centrifugadas a 8 000 rpm
por 10 minutos, à temperatura ambiente, e suspensas em 5 ml de Tris-HCl 30mM pH
8.0. Após a suspensão das células, as mesmas foram centrifugadas a 8 000 rpm por 10
minutos, suspensas novamente em 5ml de Tris-HCl 30mM pH 8.0 e lisadas por
sonicação (4 pulsos de 30 segundos cada). Em seguida, a suspensão de células foi
centrifugada a 8 000 rpm por 25 minutos a 4°C para a remoção dos restos celulares. O
sobrenadante foi submetido à centrifugação de 38 200 rpm por 34 minutos a 4°C, em
ultracentrífuga Hitachi Himac CP85β utilizando o rotor fixo P55AT (Hitachi Koki Corp.
Tokio, Japão). Em seguida, o precipitado foi suspenso em 1 ml de Tris-HCl 30mM pH
8.0 e, após a suspensão, 100 μl de sarcosil a 20% foi adicionado. Após cuidadosa
agitação, este precipitado foi incubado à temperatura ambiente por 20 minutos. Em
seguida, foi realizada uma nova etapa de centrifugação a 38 200 rpm por 34 minutos a
22°C e, finalmente, o precipitado suspenso em 100 μl de água deionizada. Após a
quantificação protéica de cada uma das amostras, utilizando-se o espectrofotômetro
“Termo Spectronic” (Fisher Scientific Company, Pensilvania, EUA) e o kit “Bradford Die
Concentrate” (USB, Ohio, EUA), as amostras foram incubadas a 100°C por 10 minutos.
Em seguida as amostras foram aplicadas no gel de dodecil sulfato de sódio contendo
11% (pt/vol) de acrilamida (SDS-PAGE). Após a corrida, o gel foi corado durante uma
hora com coomassie blue R250 (Sigma-Aldrich Corp. StLouis, MO, EUA). Como
__________________________________________________________________________
descorante foi utilizado ácido acético a 10%. A inspeção das frações protéicas foi feita
utilizando-se o equipamento “Gel Doc - Quantity One” (BioRad Laboratories, Califórnia,
EUA). Foram utilizadas como controle de qualidade, nesta etapa, duas amostras de K.
pneumoniae selvagens, KPN 173 e KPN Y194. O peso molecular das respectivas
proteínas de membrana externa foi estimado através do padrão de peso molecular.
3.3.4-Avaliação fenotípica da hiperexpressão dos sistemas de efluxo
Os antimicrobianos meropenem e imipenem foram diluídos em ágar na ausência e
na presença de
β-naphthylamide de arginina do phenylalanine (PAβN), composto que
atua como inibidor de bomba de efluxo (Schumacher et al., 2006).
A partir da solução estoque, foram realizadas diluições seriadas em caldo de
Müeller-Hinton (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) em concentrações 20 vezes superiores às
concentrações testadas (NCCLS, 2003). A concentração da solução estoque e as
concentrações testadas dos antimicrobianos meropenem e imipenem foram de 12800
μg/ml e de 1 a 128 μg/ml, respectivamente. Para o PAβN a concentração da solução
estoque foi de 5000 μg/ml e a concentração testada foi fixa de 25 μg/ml.
Simultaneamente às diluições dos antimicrobianos, tubos contendo 19 ml de ágar
Müeller-Hinton (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra), previamente esterilizados, foram
fundidos e estabilizados em banho-maria a 45 e 50
o
C. Uma vez estabilizada a
temperatura, 1ml da solução do antimicrobiano com concentração 20 vezes superior a
ser testada e 1ml do inibidor PAβN, foram adicionados ao tubo de caldo de Müeller-
Hinton. Após homogeneização, o conteúdo foi vertido em placas de Petri de 90 x 15
mm, descartáveis e pré-identificadas. As placas contendo os antimicrobianos foram
__________________________________________________________________________
utilizadas no mesmo dia. Após o preparo das placas a metodologia empregada neste
teste foi exatamente à mesma descrita anteriormente no item 3.2.1.
A MIC do antimicrobiano sozinho foi comparada à MIC do antimicrobiano
associado ao inibidor de bomba de efluxo, PAβN. O decréscimo da MIC ≥ 1 diluição
logarítmica na presença da PAβN em relação à MIC do antimicrobiano sozinho, poderia
sugerir a hiperexpressão de bombas de efluxo envolvidas na resistência aos
antimicrobianos (Schumacher et al., 2006).
3.4-Transferência do gene codificador de metalo-β-lactamase
Uma amostra de K. pneumoniae produtora de metalo-β-lactamsase IMP-1
(A13304) foi selecionada como doadora para o processo de transferência dos genes de
resistência por conjugação. A E. coli K12 foi utilizada como bactéria receptora dos
plasmídios contidos nas amostras de K. pneumoniae.
As amostras de K. pneumoniae e E. coli K12 foram cultivadas, isoladamente, em
ágar MacConkey (Oxoid®, Inglaterra) por 18 horas a 37
o
C. Com colônias isoladas foi
feita uma suspensão em caldo Luria Bertani (LB) e incubada a 37
o
C por 4 horas até
atingir a fase logarítmica (log) do crescimento bacteriano. Posteriormente, em um
frasco tipo erlenmeyer esterilizado, já contendo 1 ml de caldo LB, foi adicionado uma
alíquota de 1 ml do caldo contendo a amostra de K. pneumoniae na fase log de
crescimento e uma alíquota de 1 ml do caldo contendo E. coli K12 também na fase log
de crescimento. Esta suspensão de células foi incubada a 37
o
C por 18 horas. Após
este período, uma alíquota de 100 μl foi semeada com o auxílio de uma alça de
Drigalsky sobre a superfície de uma placa de ágar MacConkey, contendo 30 μg/ml de
ceftazidima e 300 μg/ml de estreptomicina. As colônias transconjugantes, que
__________________________________________________________________________
cresceram nesta placa de seleção, foram novamente subcultivadas em ágar
MacConkey, suplementado com ceftazidima (20 μl/ml), e submetidas à confirmação da
transferência dos genes de resistência através da analise do DNA plasmidial da
transconjugante, receptora e doadora obtidos por extração de DNA plasmidial como
descrito a seguir no item 3.5.2.
3.5-Localização do gene bla
IMP-1
3.5.1-Extração de DNA cromossomal
O DNA total das amostras foi obtido com a técnica de brometo de
cetiltrimetilamônio - CTAB. As amostras foram cultivadas em ágar nutriente com 4
μg/ml de ceftazidima e incubadas a 37°C. O crescimento bacteriano foi coletado com
auxílio de alça descartável e ressuspenso em tubo de microcentrífuga com 400 μl de
tampão TE. Foi adicionado 50 μl de uma solução a 10 mg/ml de lisozima e as amostras
foram incubadas a 37°C por duas horas. Então, foi adicionado 70 μl de uma solução a
10% de dodecil-sulfato de sódio (SDS) e 5 μl de Proteinase K (10 mg/ml). A solução foi
homogeneizada e incubada por 10 minutos a 65°C. Foi adicionado 100 μl de cloreto de
sódio (5M) e 100 μl de solução de CTAB/NaCl, previamente aquecida a 65°C. As
amostras foram incubadas por 10 minutos a 65°C e um volume igual de uma solução
de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) foi adicionada. Após homogeneização as
amostras foram centrifugadas por 7 minutos a 13 000 rpm, a temperatura ambiente. O
sobrenadante obtido foi então, transferido para um novo tubo, no qual foi adicionado
60% do volume de isopropanol. A solução foi homogeneizada lentamente e a
precipitação do DNA foi feita por 30 minutos a -20°C. As amostras foram centrifugadas
por 15 minutos a 13 000 rpm a temperatura ambiente. Após a remoção do
__________________________________________________________________________
sobrenadante, foi adicionado 1 ml de etanol gelado e a solução foi centrifugada por 10
minutos a 12 000 rpm. O sobrenadante foi removido e as amostras foram secas à
temperatura ambiente e o DNA foi ressuspenso em 30 μl de água deionizada estéril.
3.5.2-Extração de DNA plamsídial
Inicialmente, a extração do DNA plasmidial foi realizado pela técnica de lise
alcalina por meio do kit “QIAprep Spin Midi prep” (Qiagen, Hilden, Alemanha). Porém,
devido às dificuldades em se obter bons resultados, outras metodologias foram
utilizadas. O DNA plasmidial foi então extraído pelo método descrito por Birnboim e
Doly (1979). As amostras foram cultivadas em 10 ml de caldo LB com 4 μg/ml de
ceftazidima e incubadas a 37°C por 18-24 horas. Após este período, as amostras foram
centrifugadas por 5 minutos a 15 000 rpm. O sobrenadante foi desprezado e o
precipitado foi suspenso em 1ml da solução I (lisozima 2 mg/ml, glicina 2%, Na
2
EDTA
10 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8,0) e incubado no gelo por 30 minutos. Em seguida, foi
adicionado 2 ml da solução II (NaOH 0,2 N, SDS 1%). O conteúdo dos tubos foi
homogeneizado suavemente e incubada em gelo por exatos 7 minutos. Transcorrido
este período, 1,5 ml da solução III (acetato de sódio 3 M pH 4,8) foi adicionada e após
suave homogeneização, foi mantida no gelo por 4 horas. Após este período, as
amostras foram centrifugadas por 30 minutos a 10 000 rpm a 4
0
C. O sobrenadante foi
transferido para um novo tubo, ao qual foi adicionado 4,5 ml de etanol p.a. gelado.
Após a inversão lenta dos tubos, as amostras foram incubadas a -20
o
C “overnight”. No
dia seguinte, as amostras foram centrifugadas a 10 000 rpm a 4
o
C por 30 minutos. O
sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi suspenso em 0,5 ml da solução IV
(acetato de sódio 100 mM, Tris-HCl 50mM pH 8,0). Em seguida, foi adicionado 0,5 ml
de etanol p.a. gelado. Nesta etapa, a solução foi incubada a -20
o
C por 2 horas. Após
__________________________________________________________________________
centrifugação por 10 minutos, o sobrenadante foi aspirado e o sedimento foi seco em
câmera de fluxo laminar por 15 minutos. O sedimento foi ressuspenso em 15 μl de
tampão TE (Tris 10mM e EDTA 1mM). A revelação da extração foi realizada por
eletroforese em gel de agarose a 0,8% por, aproximadamente, 2 horas a 100 V. O peso
molecular dos plasmídios das amostras de K. pneumoniae foi estimado através da
curva padrão em papel mono-log.
3.5.3-Eletroforese do DNA plasmidial e cromossomal e Southern-blot
Alíquotas de DNA plasmidial e DNA cromossomal das amostras foram submetidas
à eletroforese em gel de agorose 0,8%. Em seguida, o material genético presentes no gel
de agarose foi transferido para uma membrana de nylon (Hybond-N+, Amershan
Biosciences, Uppsala, Suécia) pela técnica de “Southern blot”.
O gel foi incubado sobre agitação em temperatura ambiente por 10 minutos com
HCl 0,25M, lavado rapidamente em água e tratado com NaOH 0,4N por duas vezes por
20 minutos. O gel foi recoberto de um lado com papel de filtro e do outro lado com a
membrana de nylon nas dimensões exatas do gel e papel de filtro novamente,
constituindo assim um sanduíche. Este sanduíche foi colocado sobre uma base de vidro
suspensa em recipiente contendo uma solução de SCC 2 x (citrato de sódio 0,03M e
NaCl 0,3M, pH 7,0). Em seguida, foi colocada uma grossa camada de papel absorvente e
um peso sobre o mesmo. Por capilaridade, a solução de SCC 2 x do recipiente passou
através do sanduíche, transferindo os fragmentos de DNA do gel para a membrana de
nylon. Após 18-24 horas, a membrana foi retirada e lavada quatro vezes com SCC 2 x por
15 minutos, para a neutralização do pH. Em seguida a membrana foi seca ao ar ambiente
e guardada ao abrigo da luz até o momento do uso.
__________________________________________________________________________
3.5.4-Hibridização da membrana
A membrana foi submetida a uma reação de hibridização com o Kit ECL Direct
Nucleic Acid Labelling and Detection Systems (Amershan Biosciences, Uppsala, Suécia)
segundo as especificações do fabricante. O fragmento de DNA utilizado como sonda foi
obtido pela amplificação de um fragmento interno do gene bla
IMP-1
, presente na amostra
clínica A13304. A sonda foi preparada com o kit ECL Direct Nucleic Acid Labelling and
Detection Systems (Amershan Biosciences, Uppsala, Suécia), segundo as instruções do
fabricante.
Após incubação de 18 a 24 horas a 37
o
C sob leve agitação, a membrana foi lavada
por duas vezes em solução de “Primary buffer” por 10 minutos e duas vezes em solução
de “Secundary buffer” por 5 minutos, sob agitação.
A membrana, úmida, foi exposta a um filme de hyperfilm (Amershan Biosciences,
Uppsala, Suécia ) em um cassete durante 10 minutos. O filme foi revelado de acordo com
as recomendações do fabricante. As bandas de DNA que hibridizaram com a sonda
foram visualizadas, após a revelação, como manchas escuras no filme de hyperfilm.
3.6-Avaliação da similaridade genética por eletroforese em campo elétrico pulsado
(“Pulsed Field Gel Electrophoresis” – PFGE)
A amostra de K. pneumoniae (A11775) procedente do HU-USP foi avaliada
através da técnica de PFGE para determinar se existia relação genética com as amostras
procedentes do HSPE.
__________________________________________________________________________
3.6.1-Extração do DNA das amostras bacterianas
As amostras foram incubadas de 18 a 24 horas em 10 ml de caldo TSB. Após este
período, as amostras foram centrifugadas por 20 minutos a 3 000 rpm. O sobrenadante
foi removido e o precipitado, contendo as células bacterianas, foi diluído em 1 ml de
solução salina. As amostras foram homogeneizadas e transferidas para tubo de
microcentrífuga previamente pesado.
Os tubos foram centrifugados por 5 minutos a 12 000 rpm. O sobrenadante foi
cuidadosamente aspirado e desprezado, e o precipitado foi diluído em solução de salina
na proporção 1:1 entre o volume de salina e o peso do material obtido pela centrifugação.
O peso precipitado foi calculado pela subtração do peso do tubo vazio pelo peso do tubo
contendo o precipitado de células.
Após minuciosa homogeneização da mistura, foi transferido 40 μl para outro tubo,
contendo 300 μl de tampão TEN (Tris 100mM pH 7.5; EDTA 100mM, NaCl 150mM). Essa
nova solução foi homogeneizada e misturada com 340 μl de agarose de baixo ponto de
fusão. A mistura foi colocada, com o auxílio de uma pipeta, em moldes para a formação
de pequenos blocos de agarose contendo o DNA bacteriano.
Depois de solidificados, os blocos foram incubados a 37
o
C, por no mínimo 4 horas
em solução EC (Tris 6mM pH 6.5, NaCl 1M; EDTA 0,01M, Brij 58 0,5%, Sarcosil 0,5% e
Deoxiglicolato 0,2%). A solução de EC foi removida e substituída por 2 ml de solução ES
(EDTA 0,4M pH 9,3 e Sarcosil 10%) contendo 1 mg/ml de proteinase K (20 mg/ml). Essa
solução permaneceu em contato com as amostras por 18 a 24 horas a temperatura de
50
o
C. Posteriormente, ao tratamento com proteinase K, foram realizadas quatro lavagens
com CHEF-TE (Tris 0,1M pH 7.5, EDTA 0,1M) a 60 minutos e os blocos foram
__________________________________________________________________________
armazenados a -4
o
C nesta solução até serem submetidos à digestão enzimática e,
posterior, a eletroforese.
3.6.2 Digestão do DNA com enzima de restrição e eletroforese
A clivagem do DNA foi realizada com 2 μl da enzima Spe I (New England Biolab,
Inc., Beverly, Mass, USA - 10U por amostra), a 37
o
C por 16-18 horas, de acordo com
instruções do fabricante. A eletroforese foi realizada no sistema CHEF-DR III (BioRad
Laboratories, Califórnia, EUA) em gel de agarose 1%, TBE 0,5x (Tris 0,089M, Ácido
Bórico 0,089M e EDTA 0,002M), a temperatura de 13
o
C, utilizando corrente elétrica de
200 volts (6 V/cm), com “switch” time inicial e final de 5 e 60 segundos, respectivamente,
durante 23 horas.
O gel foi corado com brometo de etídio 0,08 μl/ml por uma hora e descorado em
água destilada por mais uma hora, quando foi fotografado sob iluminação ultravioleta
(Maslow; Mulligan, 1996). A análise dos perfis eletroforéticos foi realizada por
comparação visual.
As amostras foram consideradas idênticas (derivadas de uma mesma cepa ou
pertencentes a um mesmo clone) quando apresentaram perfil eletroforético de todas as
bandas idêntico. As amostras que apresentaram diferenças do perfil de até seis bandas
foram consideradas semelhantes (subtipos) e pertencentes a um mesmo clone. As
amostras que apresentaram sete ou mais bandas discordantes foram consideradas
amostras distintas (Tenover et al., 1995).
__________________________________________________________________________
4. RESULTADOS
4.1-Amostras bacterianas
Todas as oito amostras de K. pneumoniae procedentes do HSPE e uma amostra
do HU-USP foram estudadas. Como todas as amostras do HSPE pertenciam a um
mesmo clone, somente a primeira amostra isolada (A13304) foi submetida aos demais
experimentos de caracterização do contexto genético que abrigava o gene bla
IMP-1
e de
sua localização, juntamente com a amostra isolada no HU-USP (A11775).
4.2-Confirmação do fenótipo de resistência aos carbapenens
4.2.1-Técnica de ágar diluição
As amostras de K. pneumoniae inicialmente classificadas como resistentes aos
carbapenens foram submetidas à metodologia de ágar diluição para confirmação dos
níveis de resistências a ceftazidima, a imipenem e a meropenem. Todas as amostras
foram altamente resistentes a ceftazidima (MIC, >
128 μg/ml), apresentando também
resistência a imipenem (MIC, 128 μg/ml) e a meropenem (MIC, 64 µg/ml).
4.3-Avaliação dos mecanismos de resistência aos carbapenens
4.3.1-Pesquisa dos genes que codificam as metalo-β-lactamases e estudo do
contexto genético, onde estes genes estão inseridos
As amostras foram submetidas à técnica de PCR utilizando oligonucleotídeos
específicos para a detecção dos genes que codificam as MβLs subclasses IMP, VIM e
SPM. Para a detecção das enzimas pertencentes às subclasses IMP e VIM, foram
__________________________________________________________________________
utilizados os “primers” IMP-1, IMP-2, VIM-1 e VIM-2, capazes de detectar todas as
variantes pertencentes à família IMP e as da família VIM, descritas até a execução
deste estudo. Dentre as nove amostras de K. pneumoniae, todas apresentaram produto
de amplificação de PCR positivo para o gene bla
IMP-1
(Figura 2). Nenhuma amostra
apresentou produto de amplificação positivo para nenhum outro gene que codifica as
outras subclasses de MβLs pesquisadas. A presença do gene que codifica a enzima
IMP-1 foi confirmada por sequenciamento em todas as amostras.
298
396
344
517
λ 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1636
1018
Figura 2. Eletroforese em gel de agarose mostrando o produto de amplificação para o
gene bla
IMP-1
. Linha 1, marcador de peso molecular; Linha 2, amostra A13304; linha 3,
amostra A13305; linha 4, amostra A13306; linha 5, amostra A13307; linha 6, amostra
A13308; linha 7, amostra A13309; linha 8, amostra A13310; linha 9, amostra A13311 e
nha 10, amostra A11775.
li
__________________________________________________________________________
Uma vez que o gene bla
IMP-1
, geralmente, se encontra inserido em um integron
de classe 1, reações de PCR utilizando oligonucleotídeos específicos para as regiões
conservadas 5’-CS (gene da integrase - intI) e 3’-CS (gene truncado qacE
Δ
1/sul1) e
para outros genes de resistência, normalmente, encontrados em integrons de classe 1,
foram utilizados para elucidar o contexto genético do gene bla
IMP-1
. Todas as amostras
de K. p
h Interscience
Confer
e o gene aadA1, que codifica uma aminoglicosídeo-adenil-tranferase
(Figura 3).
do integron e o sentido das flechas representa o sentido da transcrição dos
genes.
neumoniae apresentaram o gene intI e o gene qacE
Δ
1/sul1.
A avaliação do contexto genético de gene bla
IMP-1
mostrou que este gene estava
inserido em um integron de classe 1 de 2,5 Kb em todas as amostras de K.
pneumoniae estudadas. Este integron foi seqüenciado na amostra A13304 e mostrou-
se idêntico a um integron previamente descrito em amostras de Acinetobacter spp. e
Pseudomonas putida isoladas no Hospital São Paulo ( Mendes et al., “46t
ence on Antimicrobiol Agents and Chemotherapy” – ICAAC 2006)
Este integron, denominado In86, contém além do gene bla
IMP-1
, localizado na
primeira posição, dois cassetes gênicos que conferem resistência aos
aminoglicosídeos: aacA30, que faz parte da família das aminoglicosídeo-acetil-
transferases
3´CS
intI1 bla
IMP-
aacA3
aadA
5´CS
59’-be attI1
qacE∆1/sul1
Figura 3. Representação esquemática do integron In86, abrigando três determinantes
de resistência: bla
IMP-1
, seguido pelos genes aacA30 e aadA1. As flechas representam
os genes
__________________________________________________________________________
Análises adicionais dos produtos de seqüenciamento revelaram que as amostras
de K. pneumoniae do HSPE abrigavam dois integrons distintos: uma cópia do In86 e
um novo integron de classe 1, denominado In87, contendo apenas um cassete gênico.
As seqüências de DNA obtidas e as seqüências protéicas derivadas da reação de
seqüenciamento revelaram a presença de um novo gene, denominado dfr23, que
codifica uma dihidrofolato sintetase e confere resistência a trimetoprim. Este gene está
flanqueado pela integrase (intI1), o sítio de recombinação específica (attI1) e pelo
promotor na seqüência conservada 5’, e pela estrutura truncada qacE
Δ
1/sul1 na
extremidade 3’ (Figura 4).
attI1
Figura 4. Representação esquemática do novo integron In87 que possui um único
gene cassete. As flechas representam os genes do integron e o sentido das flechas
representa o sentido da transcrição dos genes.
A seqüência de aminoácidos obtida a partir do produto da reação de
amplificação do gene dfr23 presentes nas oito amostras de K. pneumoniae do HSPE,
gerou um produto de 497pb, o qual foi alinhado com seqüências conhecidas dos
diversos aminoácidos da enzima DFR. A seqüência de aminoácidos do gene dfr23
59’-be
3´CS
5´CS
dfr23 qacE∆1/sul1
intI1
__________________________________________________________________________
demonstrou uma homologia de 99% ao dfr22 (código de acesso ao “GenBank”
AJ628423), com uma única substituição de aminoácidos, Ser121-Tyr (Figura 5).
Figura 5. Uma única alteração na seqüência de aminoácidos foi encontrada no DFR23
em comparação com o DFR22 na posição 121, assinalado na figura com um quadrado.
4.3.2-Avaliação fenotípica das alterações da permeabilidade das proteínas de
membrana externa
O perfil das proteínas da membrana externa foi avaliado em todas as amostras
clínicas de K. pneumoniae. Todas das nove amostras clínicas apresentaram alterações
quando comparadas às duas amostras selvagens inseridas no gel como controles. A
avaliação dos resultados obtidos pode ser observada na Tabela 4.
__________________________________________________________________________
Tabela 4. Alterações no perfil de proteínas de membrana externa encontradas nas
nove amostras de K. pneumoniae.
Amostra Perfil observado
KPN 173 Expressão das proteínas de aproximadamente 35kDa e 36kDa
KPN 194 Expressão das proteínas de aproximadamente 35kDa e 36kDa
A13304 Expressão reduzida da proteína de aproximadamente 35kDa
A
usência da
p
roteína de a
p
roximadamente 36kDa
A13305 Expressão reduzida da proteína de aproximadamente 35kDa
Ausência da proteína de aproximadamente 36kDa
A13306 Expressão reduzida da proteína de aproximadamente 35kDa
A
usência da
p
roteína de a
p
roximadamente 36kDa
A13307 Expressão reduzida da proteína de aproximadamente 35kDa
A
usência da
p
roteína de a
p
roximadamente 36kDa
A13308 Expressão reduzida da proteína de aproximadamente 35kDa
A
usência da
p
roteína de a
p
roximadamente 36kDa
A13309 Expressão reduzida da proteína de aproximadamente 35kDa
A
usência da
p
roteína de a
p
roximadamente 36kDa
A13310 Expressão reduzida da proteína de aproximadamente 35kDa
A
usência da
p
roteína de a
p
roximadamente 36kDa
A13311 Expressão reduzida da proteína de aproximadamente 35kDa
Ausência da proteína de aproximadamente 36kDa
A11775 Expressão reduzida da proteína de aproximadamente 35kDa
A
usência da
p
roteína de a
p
roximadamente 36kDa
A resistência aos carbapenens correlacionou-se com alterações em uma
proteína de membrana externa, cujo peso molecular foi de aproximadamente 36kDa.
Foi observado a ausência desta proteína nas nove amostras clínicas de K.
pneumoniae.
__________________________________________________________________________
4.3.3-Avaliação fenotípica da hiperexpressão dos sistemas de efluxo
Nenhuma das nove amostras clínicas de K. pneumoniae avaliadas apresentou
redução do valor da MIC dos β-lactâmicos (ceftazidima, imipenem e meropenem)
quando associadas ao inibidor de bomba de efluxo PAβN.
4.4-Transferência do gene codificador da metalo-β-lactamase IMP-1
Após sucessivas tentativas de transferência dos genes de resistência por
conjugação, utilizando-se como doadora a amostra de K. pneumoniae produtora da
metalo-β-lactamase IMP-1 (A13304) e como receptora a amostra de E. coli K12,
nenhuma colônia transconjugante foi obtida.
4.5-Localização do gene bla
IMP-1
4.5.1-Análise de plasmídios
A análise do plasmídeo obtido das duas amostras de K. pneumoniae (A13304 e
A11775) permitiu identificar que ambas as amostras apresentaram um perfil de
plasmídeo idêntico e permitiu observar a presença de cinco plasmídios com pesos
moleculares estimados em ~280Kb, ~35Kb, ~33Kb, ~18,5Kb e ~14,5Kb.
4.5.2-Eletroforese do DNA plasmidial e cromossomal e Southern-blot
As duas amostras de K. pneumoniae (A13304 e A11775) foram submetidas à
extração do DNA cromossomal e plasmidial, e hibridizadas com sonda especifica para
bla
IMP-1
. Pela metodologia do Southern-blot foi possível verificar que o gene bla
IMP-1
está
inserido em um plasmídeo.
__________________________________________________________________________
4.6--Avaliação da similaridade genética por eletroforese em campo elétrico
pulsado (“Pulsed Field Gel Electrophoresis” – PFGE)
A amostra de K. pneumoniae procedente do HU-USP foi avaliada através do
PFGE para determinar se existia relação genética em comparação com as amostras de
K. pneumoniae procedentes do HSPE. As amostras apresentaram um perfil
eletroforético idêntico, portanto, foram consideradas idênticas, ou seja, derivadas de
uma mesma cepa e pertencentes a um mesmo clone, denominado clone A (Figura 6).
λ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 λ
Figura 6. PFGE das nove amostras de K. pneumoniae. Linha 1, amostra A13304; linha
2, amostra A13305; linha 3, amostra A13306; linha 4, amostra A13307; linha 5, amostra
A13308; linha 6, amostra A13309; linha 7, amostra A13310; linha 8, amostra A13311;
linha 9, amostra A11775.
__________________________________________________________________________
5-DISCUSSÀO
K. pneumoniae é um importante patógeno no ambiente hospitalar, sendo um
agente etiológico comum de infecções do trato urinário, do trato respiratório e da
corrente sangüínea, principalmente em pacientes imunocomprometidos. A escolha
apropriada de agentes antimicrobianos efetivos para o tratamento de infecções
causadas por K. pneumoniae pode ser dificultada pelo aparecimento de amostras
multirresistentes (Thomson, Bonomo, 2005).
O aumento no uso de cefalosporinas de amplo espectro foi acompanhado pelo
surgimento de enzimas, em enterobactérias, e, particularmente, em K. pneumoniae,
que tem a habilidade de hidrolisar estes antimicrobianos, conhecidas como β-
lactamases de amplo espectro (ESBL). Infecções relacionadas à assistência à saúde
(IRAS), causadas por bactérias produtoras de ESBL, representam um sério problema
em nosso meio e têm sido relatadas com freqüência crescente mundialmente (Lucet et
al., 1996; Sader et al., 1994b; Martínez-Martínez et al., 1996). Geralmente, essas
infecções apresentam morbi-mortalidade elevada, e freqüentemente atingem pacientes
com estado geral comprometido (Gori et al, 1996). Na ultima comunicação do “National
Nosocomial Infections Surveillance System” (NNIS) publicou-se que a resistência as
cefalosporinas de terceira geração em amostras de K. pneumoniae aumentou 20,6%
entre 1998 e 2002 e para quase 50% entre 2002 e 2003.
O aumento da resistência às cefalosporinas acarretou na utilização dos
carbapenens como uma das últimas opções terapêuticas para o tratamento das
infecções causadas por bacilos Gram-negativos, principalmente, devido ao fato de
muitas amostras bacterianas produtoras de ESBL serem também resistentes aos
aminoglicosídeos, ao trimetoprim, à tetraciclina e, especialmente, às fluroquinolonas.
__________________________________________________________________________
A superioridade dos carbapenens frente aos demais antimicrobianos fez com
que os carbapenens se tornassem amplamente utilizados para o tratamento de
infecções hospitalares graves, principalmente, em regiões onde a prevalência de
bactérias Gram-negativas multirresistentes é alta (Woodford et al., 2000). A resistência
aos carbapenens ainda é rara em membros da família Enterobacteriaceae, com taxas
inferiores a 1%, mesmo após 20 anos de uso do imipenem (Livermore, Woodford,
2006). Entretanto, o uso indiscriminado dos carbapenens no ambiente hospitalar tem
acarretado em maior pressão seletiva para o desenvolvimento de resistência e, nos
últimos anos, o isolamento de bactérias Gram-negativas resistentes também aos
carbapenens tem se tornando mais comum (Nordmann, Poirel, 2002).
Em um estudo realizado por Andrade e colaboradores em 2003 (Andrade et al.,
2003), observou-se a diminuição da sensibilidade aos carbapenens em isolados de P.
aeruginosa recuperadas de pacientes internados em hospitais na América Latina. A
taxa de sensibilidade que era de 83.0%, em 1997, passou para 64.4%, em 2001. No
Brasil, 11,9% das amostras de Acinetobacter spp. e 30,2% das amostras de P.
aeruginosa são resistentes aos carbapenens (Sader et al., 2001). Estas taxas são
ainda mais elevadas em amostras de P. aeruginosa e Acinetobacter spp. isoladas de
pacientes hospitalizados em unidades de terapia intensiva. Dados coletados entre 1997
e 2001, mostram que nestas unidades as taxas de resistência aos carbapenens em P.
aeruginosa e Acinetobacter spp. eram de 40,0% e 11,0%, respectivamente.
Um estudo publicado por Sader e colaboradores (Sader et al., 2004) mostrou que
a prevalência de cepas produtoras de ESBL, principalmente, em K. pneumoniae e E.
coli, é muito mais alta na América Latina quando comparada a outras regiões do
mundo. No mesmo estudo, observou-se uma diminuição da sensibilidade a
carbapenens em amostras de K. pneumoniae produtoras de ESBL (sensibilidade
__________________________________________________________________________
passou de 98,9% para 96,8% entre os anos de 1997 e 2001).
Embora mecanismos de resistência aos β-lactâmicos relacionados à
hiperexpressão de bombas de efluxo, às alterações nas proteínas ligadoras de
penicilinas e/ou à perda ou à expressão reduzida de proteínas de membrana externa
sejam relatadas em bactérias Gram-negativas, o mecanismo mais importante é a
produção das enzimas β-lactamases. Diversas β-lactamases são capazes de hidrolizar
agentes antimicrobianos como as penicilinas, as cefalosporinas e os monobactams,
porém, a enzima mais temida é a metalo-β-lactamase (MβL). Estas enzimas são
notáveis por seu amplo espectro de atividade, incluindo os carbapenens, e também
pela resistência que estas enzimas apresentam aos inibidores de β-lactamases
disponíveis clinicamente (Laraki et al., 1999).
As MβLs são produzidas intrinsecamente por determinados microrganismos, tais
como Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus cereus, Legionella gormanii, entre outros.
Contudo, desde o início da década de 90, novos genes que codificam as MβLs
adquiridas da subclasse IMP tem sido descritos em patógenos clinicamente
importantes, tais como Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e em membros da
família Enterobacteriaceae (Riccio et al., 2000, Poirel et al., 2000, Yan et al., 2001).
O primeiro relato de MβL adquirida, denominada IMP-1, ocorreu em 1994,
detectada em uma amostra clínica de Serratia marcens isolada no Japão. Durante
muitos anos, a ocorrência de isolados produtores de IMP-1 foi restrito ao Japão.
Atualamente, as variantes pertencentes a subclasse IMP parecem ser mais prevalentes
na Àsia, entretanto, IMP-1 tem sido detectada em diferentes microrganismos e em
diferentes regiões geográficas.
Entre as enterobactérias, a MβL da subclasse IMP tem sido reportada em
__________________________________________________________________________
amostras de Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, e em Citrobacter freudii. Em
2001, IMP-1 e IMP-8 foram descritas em amostras de K. pneumoniae, isoladas do
Japão e Taiwan, respectivamente (Yan et al., 2001).
No Brasil, o primeiro relato da ocorrência de amostras produtoras de MβL ocorreu
em 2002 (Pellegrino et al., 2002). Entretanto, esse relato não caracterizou o
determinante de resistência envolvido e, mais tarde, em 2003, uma variante de IMP foi
relatada por Gales e colaboradores. Estes autores descreveram o encontro de uma
cepa de A. baumannii isolada no complexo Hospital São Paulo/UNIFESP produtora de
uma variante de IMP que, posteriormente, foi caracterizada como IMP-1 (Gales et al.,
2003).
Em um trabalho realizado na Universidade Federal de São Paulo, investigou-se a
presença de MβL adquirida em Acinetobacter spp. isolados de pacientes internados no
Hospital São Paulo entre maio de 1993 e novembro de 2001. Observou-se que entre as
amostras que apresentaram resistência aos carbapenens, 54,8% (40/73) eram
produtoras de IMP-1, sendo que o surgimento deste determinante de resistência foi
detectado em amostras bacterianas isoladas a partir de 1998. Após este ano, a
produção de MβL adquirida tornou-se o único mecanismo responsável pelo fenótipo de
resistência aos carbapenens nas amostras estudadas (Tognim et al., 2006).
Em um estudo posterior realizado com cepas clínicas deste mesmo hospital,
isoladas durante os anos de 2002 e 2003, relatou-se e caracterizou-se o encontro do
gene bla
IMP-1
em sete cepas de Acinetobacter spp. e uma cepa de P. aeruginosa
(Castanheira et al., 2003). Em 2004, um estudo publicado por Mendes e colaboradores
(Mendes et al., 2004) relatou uma nova variante da subclasse IMP, designada IMP-16,
isolada de uma amostra de P. aeruginosa de um paciente internado no Hospital de
Base de Brasília em 2002.
__________________________________________________________________________
Curiosamente, embora a produção de IMP-1 tenha sido frequentemente
detectada em amostras de P. aeruginosa e Acinetobacter spp. isoladas no Hospital São
Paulo, até o momento, não detectamos a presença desta enzima em enterobactérias.
Mais recentemente, uma amostra bacteriana de K. pneumoniae, isolada no
Hospital Universitário da Universidade de São Paulo, foi caracterizada como produtora
de IMP-1 (Lincopan et al., 2005). Este foi o primeiro relato de MβL adquirida em
membros da família Enterobacteriaceae na América Latina. Esta amostra foi
posteriormente incluída neste estudo com o intuito de estudar o contexto genético do
determinante de resistência, gene bla
IMP-1
, e caracterizar a relação genética com as
amostras de K. pneumoniae isoladas no HSPE.
As amostras isoladas no HSPE fazem parte do primeiro surto de K. pneumoniae
produtoras de MβL IMP no Brasil (Grinbaum et al., 2004). Na literatura, há apenas dois
relatos de surtos causados por amostras de K. pneumoniae produtoras de MβL. O
primeiro ocorreu em Taiwam, em 2001 (Yan et al; 2001), no qual um surto de K.
pneumoniae produtora de IMP-8 foi identificado e, mais recentemente, em 2007,
Fukigai e colaboradores descreveram o primeiro relato de um surto de amostras de K.
pneumoniae produtoras de IMP-1 no Japão (Fukigai et al., 2007).
No presente estudo, as nove amostras de Klebsiella pneumoniae anteriormente
caracterizadas como resistentes aos carbapenens produtoras de IMP-1 apresentaram
resistência aos outros agentes antimicrobianos avaliados, pela técnica de ágar diluição.
De acordo com a análise dos resultados do PFGE foi possível observar que todas
as amostras pertenciam a um único clone. Este fato evidencia que, além do surto de K.
pneumoniae produtora da metalo-β-lactamase IMP-1 ocorrido no HSPE, existe a
disseminação inter-hospitalar deste clone entre o HSPE e o HU-USP. Este fato é
__________________________________________________________________________
condizente com um trabalho recentemente publicado por Lincopan e colaboradores
(Lincopan et al., 2006) no qual foi observado que cinco amostras de K. pneumoniae
produtoras de MβL IMP-1, isoladas, entre 2003 e 2005, e em diferentes hospitais
situados na cidade de São Paulo, também pertenciam a um único clone. Sendo assim,
estudos epidemiológicos adicionais são necessários para poder esclarecer a relação
epidemiológica entre estas amostras.
Recentemente, amostras de Acinetobacter spp. e Pseudomonas putida
produtoras de IMP-1 isoladas na cidade de São Paulo, revelaram abrigar o bla
IMP-1
inserido em um integron de classe 1 denominado In86, uma estrutura genética capaz
de capturar genes de resistência e que demonstra habilidade na mobilização e
disseminação destes genes entre diferentes bactérias (Mendes et al., 2006). O integron
In86 caracteriza-se por apresentar o gene bla
IMP-1
na primeira posição, seguido por dois
genes que conferem resistência aos aminoglicosídeos: aacA30, que faz parte da
família das aminoglicosídeo-acetil-transferases e o gene aadA1, que codifica uma
aminoglicosídeo-adenil-transferase. O fato preocupante é que estas amostras de
Acinetobacter spp. e Pseudomonas putida foram isoladas no Hospital São Paulo –
Universidade Federal de São Paulo / Escola Paulista de Medicina, apenas algumas
quadras do Hospital Servidor Publico Estadual, local onde oito das nove amostras
deste estudo foram isoladas.
Os resultados deste trabalho revelam as amostras de K. pneumoniae produtoras
de IMP-1 isoladas no HSPE e no HU-USP também carregam o In86. Portanto, o In86
abrigando o gene bla
IMP-1
encontra-se disseminado na cidade de São Paulo em
diferentes espécies bacterianas. Diante destes dados, pode-se inferir que existe um
“pool” de genes que fazem parte do ambiente nosocomial e que as espécies de
Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. podem estar constituindo um reservatório para
__________________________________________________________________________
genes de resistência. Eventualmente, estes genes provenientes destas outras espécies
podem ser incorporados por microrganismos nosocomiais oportunistas (Walsh et al.,
2005).
É provável que o surgimento de amostras da família de Enterobacteriaceae
produtoras de MβL seja devido a uma transmissão horizontal de determinantes de
resistência, que podem ocorrer via plasmídios ou eventos de recombinação aleatória, e
de acordo com a pressão seletiva presente no ambiente hospitalar, aqueles
microrganismos mais adaptados às condições adversas serão selecionados (Walsh,
2005; Tenover, 2006). Este fato é condizente com os dados obtidos neste estudo, no
qual através da hibridização foi possível verificar que o gene bla
IMP-1
está inserido no
In86, o qual por sua vez se encontra localizado em um plasmídio. Entretanto, a
localização de um integron em um plasmídio não é uma regra, e um plasmídio nem
sempre é transferido facilmente para outras espécies bacterianas. No presente estudo
foram realizadas sucessivas tentativas, sem sucesso, de transferência dos genes de
resistência por conjugação.
A presença de determinantes de resistência em sistemas de recombinações é
realmente preocupante, uma vez que estes apresentam grande potencial de
disseminação, tanto intra- quanto inter-espécies. Além disto, genes que se
encontravam em integrons ancestrais localizados na primeira posição, logo à montante
da integrase, com o passar do tempo, provavelmente devido à extensa utilização dos
agentes antimicrobianos, foram permanentemente incorporados à estrutura dos
integrons, tal como os genes qacE∆1/sul1. Estes genes conferem resistência às drogas
cloranfenicol e sulfonamida, e fazem parte da região conservada 3’ de integrons de
classe 1 (Bennett, 1999). Este fato pode ter implicações sérias, uma vez que, os genes
de resistência freqüentemente encontrados nas primeiras posições do integron, como
__________________________________________________________________________
os genes que codificam resistência à MβL e aos aminoglicosídeos, podem vir,
futuramente, a fazer parte da região conservada 3’, acarretando assim, em resistência
intrínseca à classe de antimicrobiano para o qual estes genes conferem resistência.
Os integrons de classe 1 podem conter inúmeros tipos de genes cassetes, todos
os quais, descritos até o presente, foram caracterizados como determinantes de
resistência. A presença do gene que codifica resistência a MβL juntamente com outros
genes de resistência no mesmo integron, tais como aminoglicosídeos e trimetoprim,
tem se tornado freqüente, por isso, a importância de estudar o contexto genético no
qual os genes que codificam as MβLs se encontram inseridos, uma vez que, estes
sistemas de recombinações podem promover a disseminação de determinantes de
resistência a múltiplas classes antimicrobianas. Adicionalmente, o uso clínico de
diversos antimicrobianos, estruturalmente não-relacionadas, proporciona uma pressão
seletiva comum, a qual promove a permanência destes genes de resistência. Da
mesma forma, regimes de tratamento antimicrobiano que contenham, por exemplo,
aminoglicosídeos, podem aumentar a prevalência de genes que codificam resistência a
antimicrobianos não-relacionados, incluindo cefalosporinas de amplo espectro e
carbapenens, pela seleção de integrons que abrigam concomitantemente genes para
resistência a estes diferentes antimicrobianos (Gootz, 2006).
A associação trimetoprim/sulfametoxazol (TMP/SMX) foi amplamente utilizada na
prática clínica como opção terapêutica para o tratamento de infecções urinárias
causadas por enterobactérias, como E. coli e K. pneumoniae (Houvinen, 2001).
Trimetoprim/sulfametoxazol também tem sido utilizado no tratamento e na prevenção
da infecção causada por Pneumocystis jiroveci, um patógeno oportunista em pacientes
infectados com o vírus da imunodeficiência humana.
__________________________________________________________________________
Trimetoprim (TMP) e sulfametoxazol (SMX) inibem a síntese do ácido fólico em
etapas diferentes e impedem o crescimento bacteriano. TMP é uma diaminopirimidina
que inibe seletivamente a dihidrofolato redutase, evitando a redução de dihidrofolato
em tetrahidrofolato. O tetrahidrofolato é importante para a síntese das purinas, dos
aminoácidos e das vitaminas, a ausência dessas substâncias leva à morte celular
(Grape et al., 2003). Resistência à TMP/SMX é resultado da produção da dihidrofolato
redutase alterada por mutação no gene que codifica a enzima ou por aquisição de
genes exógenos que codificam uma enzima alterada, o gene dfr. Todos os genes dfr
codificam uma dihidrofolato redutase trimetoprim resistente (Houvinen, 2001).
Em países em desenvolvimento, como no Brasil, devido ao seu baixo custo e ao
grande número de indivíduos infectados pelo HIV, o consumo de
trimetoprim/sulfametoxazol tem aumentado nos últimos anos, e, portanto, é esperado
que novos mecanismos de resistência surjam. Este fato fornece uma explicação para a
presença de um novo gene, denominado dfr23, que codifica resistência a trimetoprim
encontrado nas amostras estudadas de K. pneumoniae, procedentes do Hospital
Servidor Publico Estadual. O gene dfr23 encontra-se na primeira posição de um
integron de classe 1, denominado In87. Este novo gene está fortemente relacionado ao
gene dfr22 (homologia de 99%), previamente, descrito em amostras de bactérias
Gram-negativas isoladas na Suíça (Grape et al., 2005). A pressão seletiva exercida em
um antimicrobiano pode, simultaneamente, selecionar outros genes que conferem
resistência a outros antimicrobianos, quando estes estão associados, tal como
trimetoprim/sulfametoxazol. Este fato pode explicar a presença de determinantes de
resistência a trimetoprim, inseridos em integrons de classe 1, os quais abrigam na
região conservada 3’ o gene sulI1 que confere resistência a sulfonamidas.
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Mutações nos genes que codificam as proteínas de membrana externa em
bactérias Gram-negativas também contribuem para resistência aos antimicrobianos.
Diversos estudos relatam que uma alteração tanto na estrutura e como na carga da
membrana externa resulta na resistência a certos antimicrobianos (Poole K, 2002). Tais
alterações são, geralmente, em resposta a pressões seletiva exercida por
antimicrobianos e, se caracterizam por uma mutação em um gene responsável pela
síntese e montagem do polissacarídeo da membrana externa.
As proteínas de membrana externa (OMP) ou porinas dos microrganismos Gram-
negativos são canais, constituídos de água no seu interior, pelas quais diversos
antibióticos hidrofílicos se difusão para atingirem a membrana celular e o interior de
célula. A capacidade ou não do antimicrobiano atravessar as porinas irá depender da
sua forma, carga e de seu tamanho. As porinas OmpK36 e OmpK35 descritas em K.
pneumoniae são homologas as porinas OmpC e OmpF encontrada em E. coli,
respectivamente.
As amostras de K. pneumoniae possuem três proteínas de membrana externa de
35 KDa, 36 kDa e 37 KDa, as quais são envolvidas na entrada de beta-lactâmicos na
célula bacteriana. Não foi possível identificar a presença da proteína de 37 KDa nas
amostras estudadas. Isto poderia ter ocorrido devido à metodologia empregada, já que
esta proteína não pode ser identificada nem nas amostras controles. Como o peso
molecular destas proteínas é muito próximo, as proteínas de 35 e 36 KDa poderiam ter
migrado para a mesma posição no gel. No presente estudo, a análise do perfil protéico
da membrana externa bacteriana por SDS-PAGE mostrou a ausência de uma banda
correspondente a aproximadamente 36kDa e a expressão reduzida de uma outra
banda de aproximadamente 35kDa, em todas as nove amostras de K. pneumoniae
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avaliadas. Este resultado era esperado uma vez que estas amostras pertenciam a um
único clone.
A perda da porina OmpK36 está associada com a resistência à cefoxitina e
aumento da resistência à cefalosporinas em amostras produtoras de ESBL e, com a
resistência aos carbapenens em amostras produtoras da β-lactamase AmpC (Bradford
et al., 1997). A perda da porina OmpK36 também causa um aumento na resistência à
fluoroquinolonas em amostras com mutações prévias nos genes que codificam as
topoisomerases (Doménech-Sanchez et al., 2003).
Em 2001, Koh e colaboradores relataram que um alto nível de resistência aos
carbapenens em amostras de K. pneumoniae depende da perda de porina assim como
a produção de uma β-lactamase IMP-1(Koh et al., 2001). Apenas a produção de uma
MβL não confere, geralmente, um alto grau de resistência aos carbapenens em
membros da família Enterobacteriaceae. Portanto, a produção da MβL IMP-1
associada à alteração do perfil das proteínas da membrana celular externa podem
justificar o alto grau de resistência aos carbapenens encontrados nas amostras
avaliadas.
Os carbapenens representam importantes componentes do arsenal terapêutico
para infecções graves causadas por microrganismos Gram-negativos, porém, nos
últimos anos o surgimento de amostras multiresistentes devido à produção de metalo-
β-lactamases aumentou drasticamente no mundo; dados do SENTRY demonstram que
na Itália 39,1% das amostras de P. aeruginosa são produtoras de MβL e no Brasil essa
porcentagem é ainda maior, 43,9% (Fritsche et al., 2005). Desta forma, as opções
terapêuticas se tornam severamente limitadas, principalmente, na Ásia, Europa e na
América do Sul.
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O encontro de diferentes enzimas em diferentes espécies bacterianas evidencia a
real capacidade de disseminação destes elementos e causam grande preocupação,
uma vez que estes eventos de disseminação podem alcançar maiores proporções. Isto
acarretaria em um importante impacto clínico já que as opções terapêuticas para os
casos de infecções por membros da família Enterobacteriaceae poderiam se tornar
ainda mais restritas. Entretanto, a porcentagem de amostras produtoras de ESBL é alta
em muitos dos hospitais brasileiros e os carbapenens constituem a droga de escolha
para o tratamento destas infecções. Desta maneira, é difícil reduzir o consumo dos
carbapenens e, assim reduzir a pressão seletiva, em hospitais, onde a taxa de
prevalência de amostras produtoras de ESBL é alta, como no caso do Hospital São
Paulo.
Como uma última opção terapêutica, antimicrobianos mais antigos e mais tóxicos,
como a polimixina B e a polimixina E (colistina) poderiam ser utilizados como agentes
terapêuticos no tratamento das infecções causadas por amostras de K. pneumoniae
resistentes aos carbapenens. Entretanto, em um estudo publicado, em 2005, por Bratu
e colaboradores, observou-se a resistência à polimixina B em amostras de K.
pneumoniae resistentes aos carbapenens devido a presença do gene bla
KPC
, que
codifica a produção de uma β-lactamase da class A de Ambler (Bratu et al., 2005). No
começo deste ano, a resistência à colistina também foi detectada em amostras
multirresistentes de K. pneumoniae na Grécia (Antoniadou et al., 2007). O surgimento
de resistência a estes antimicrobianos representam uma séria ameaça aos pacientes
criticamente enfermos.
Em nosso meio, onde as taxas de infecções causadas por microrganismos
produtores de ESBL ou MβL não param de crescer, as polimixinas são a principal
escolha para o tratamento das infecções causadas por P. aeruginosa e Acinetobacter
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spp. multirresistentes e poderiam constituir uma terapia antimicrobiana alternativa para
os pacientes com infecções causadas por amostras de K. pneumoniae resistentes aos
carbapenens, como dito anteriormente. Embora a tigeciclina possua excelente
atividade in vitro contra amostras de K. pneumoniae, inclusive contra aquelas
produtoras de ESBL, a experiência clínica com a utilização deste composto é ainda
limitada.
O controle da resistência bacteriana é complexo e exige atuação em vários
setores, sendo que as medidas mais eficazes envolvem o controle da disseminação
horizontal (paciente-paciente) de bactérias resistentes e a introdução de uma política
de uso racional de antimicrobianos (Coignard et al. 2000). Para que as medidas de
controle sejam implantadas com sucesso, é necessário que se conheça a magnitude
do problema e que sejam baseadas em estudos locais, pois existe um grande número
de variáveis envolvidas. É necessário que os laboratórios estejam preparados para
detectar os diferentes fenótipos de resistência, isto é, que os testes diagnósticos sejam
acurados e realizados adequadamente para a detecção dos mecanismos de resistência
mais freqüentemente encontrados em nosso meio e que se entenda como os diferentes
tipos de resistência se disseminam (Pfaller et al., 2001). Além disto, estudos
epidemiológicos são fundamentais para que possa estabelecer o vínculo de ligação
entre os achados microbiológicos e o impacto destes no tratamento dos pacientes
acometidos por este tipo de infecção.
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6-CONCLUSÕES
6.1- Altas taxas de resistência aos antimicrobianos testados foram detectadas em
todas as amostras de K. pneumoniae avaliadas neste estudo.
6.2- A produção da metalo-β-lactamase IMP-1 envolvida na resistência aos
carbapenens foi detectada em todas as amostras de K. pneumoniae avaliadas
neste estudo.
6.3- O gene bla
IMP-1
encontra-se inserido em um integron de classe 1 em todas as
amostras de K. pneumoniae estudadas, previamente denominado In86. Além do
gene bla
IMP-1
localizado na primeira posição do integron, também estavam
contidos dois genes que conferem resistência aos aminoglicosídeos: o gene
aacA30 e o gene aadA1.
6.4- Um novo gene, denominado dfr23, foi encontrado em todas as amostras de K.
pneumoniae provenientes do HSPE, o qual encontrava-se inserido em um novo
integron, In87.
6.5- A resistência aos carbapenens nas nove amostras de K. pneumoniae estudadas
também foi correlacionada à ausência de uma proteína de membrana externa de
aproximadamente 36 kDa. A diminuição da expressão de uma proteína de 35 KDa
também foi notada em todas as amostras.
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6.6- Um único clone foi detectado em todas as amostras de K. pneumoniae estudadas,
o que evidencia uma disseminação inter-hospitalar de um clone de K. pneumoniae
produtor de IMP-1 na cidade de São Paulo.
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ABSTRACT
Background: The increasing prevalence of multi-drug resistant Klebsiella pneumoniae
(KPN) isolates is an emerging problem worldwide. Integrons are common among these
bacteria and play an important role in the development, capture and expression of
resistance genes. Methods: The genetic context around the bla
IMP-1
gene was
evaluated in 8 clonally related KPN isolates, recovered from a hospital from the city of
Sao Paulo (SP), Brazil. The integron was revealed by a walking sequencing strategy.
The plasmid obtained from the index isolate was electroporated into Escherichia coli
XL1 Blue. Selection of recipient cells was performed in 5 µg/ml ceftazidime plates.
Plasmid size was calculated based on the size of the plasmid restriction fragments. The
amplicon of the dfr gene was cloned in TOPO vector and transformed into E. coli host.
Trimethoprim MICs were performed by NCCLS agar dilution. Results: PCR and
sequence analysis revealed that the strain carried two different class 1 integrons, a
copy of the previously described In86 and a new integron, named In87. In86 carried
bla
IMP-1
in the first position, followed by aacA30 and aadA1 genes. The second integron,
In87, carried a single gene cassette closely related to dfr22. The product of dfr23
showed 99% of amino-acid homology with DFR22 (one amino-acid substitution,
Ser121-Tyr). Further characterization of the isolates revealed that In86 was likely to be
located in a non-transferable 30 Kb plasmid. Conclusions: IMP-1 producing
Acinetobacter spp. recently isolated in SP was the likely source of In86 acquisition since
they carry an identical integron to those encountered in the studied KPN isolates. The
presence of trimethoprim resistance gene cassettes in class 1 integrons which normally
harbor sul1 gene at the 3’CS is most likely driven by the use of trimethoprim-
sulfamethoxazole combination.
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