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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ANTICORPO
MONOCLONAL, INFLIXIMABE, NA
CICATRIZAÇÃO DE ANASTOMOSES COLÔNICAS.
ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATOS.
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
LUIZ ALBERTO MENDONÇA DE FREITAS
Brasília, 2007.
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ii
LUIZ ALBERTO MENDONÇA DE FREITAS
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ANTICORPO
MONOCLONAL, INFLIXIMABE, NA
CICATRIZAÇÃO DE ANASTOMOSES COLÔNICAS.
ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATOS.
Dissertação submetida ao Programa de
Pós-graduação em Ciências Médicas da
Faculdade de Medicina da Universidade
de Brasília como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre.
Área de concentração: Medicina
Orientador:
Prof. Dr. Paulo Gonçalves de Oliveira
BRASÍLIA
2007
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iii
TERMO DE APROVAÇÃO
LUIZ ALBERTO MENDONÇA DE FREITAS
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ANTICORPO MONOCLONAL, INFLIXIMABE,
NA CICATRIZAÇÃO DE ANASTOMOSES COLÔNICAS. ESTUDO
EXPERIMENTAL EM RATOS.
Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciências
Médicas, área de concentração: Medicina, da Faculdade de Medicina da Universidade de
Brasília – UnB, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre.
Orientador: __________________________________________________
Professor Doutor Paulo Gonçalves de Oliveira – FM-UnB
Examinador: __________________________________________________
Professor Doutor João Batista de Sousa – FM-UnB
Examinador: __________________________________________________
Professor Doutor Luiz Pinto Fernandes – ESCS-FEPECS
Suplente: __________________________________________________
Professora Doutora Anamélia Lorenzetti Bocca – IB/FM-UnB
Brasília, 14 de Dezembro de 2007.
iv
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho:
A meus pais, Marly e José Antonio, pelo
carinho, formação e educação que me
proporcionaram.
A minha esposa Vanessa e aos meus filhos,
Luiz Gustavo e Pedro Paulo, pela compreensão
das horas de ausência de seu convívio e pelo
incentivo na realização deste trabalho.
v
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a
realização desta pesquisa e especialmente:
Prof. Dr. Paulo Gonçalves de Oliveira, Diretor da Faculdade de
Medicina da Universidade de Brasília - UnB, professor do Curso de Pós-
Graduação em Ciências Médicas, meu orientador e grande amigo.
Prof. Dr. João Batista de Sousa, Diretor do Hospital Universitário
da Universidade de Brasília - UnB, professor do Curso de Pós-Graduação em
Ciências Médicas, amigo, companheiro e meu grande incentivador neste
projeto.
Prof. Dr. Luiz Pinto Fernandes, professor da graduação do Curso
de Medicina da Escola Superior de Ciências da Saúde – ESCS, da Fundação
de Ensino e Pesquisa em Ciências da Saúde – FEPECS, colega de trabalho na
ESCS e no Hospital de Base do Distrito Federal, amigo sincero e incentivador.
Prof
a
. Dr
a
. Anamélia Lorenzetti Bocca, professora do Curso de
Pós-Graduação em Patologia Molecular da Faculdade de Medicina da
Universidade de Brasília – UnB.
vi
Prof. Dr. Ruy de Souza Lino Júnior, professor da disciplina
Patologia Geral do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás – UFG.
Prof
a
. Dr
a
. Flávia Aparecida de Oliveira, professora da disciplina
Patologia Geral do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás – UFG.
Médico-veterinário Rafael Rocha de Andrade, do Laboratório de
Cirurgia Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília
– UnB.
Prof. Dr. Albino Verçosa Magalhães, chefe do Laboratório de
Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília - UnB.
Dr
a
. Maria Fátima de Carvalho Pires, patologista clínica do
Hospital de Base do Distrito Federal e do Laboratório Central - LACEN,
Secretaria de Saúde do Distrito Federal, colega do curso de graduação e de
trabalho no Hospital de Base do Distrito Federal, amiga sincera.
Prof
a
. Ms Yanna Karla de Medeiros Nóbrega, farmacêutica-
bioquímica do Laboratório de Imunopatologia da Faculdade de Medicina da
Universidade de Brasília – UnB.
Prof. João Vieira Lopes, professor da graduação da Faculdade de
Medicina da Universidade de Brasília – UnB, grande amigo, incentivador e
parceiro nesta jornada.
vii
Ao LIB - Laboratório de Imunopatologia de Brasília e ao Prof.
Dr. Florêncio Figueiredo pela realização da imunohistoquímica e fotografias
das lâminas de histologia.
Engenheiro Eletricista José Cláudio Mendonça de Freitas, pela
ajuda no trabalho estatístico.
Médica-veterinária Helenira Melo de Moura, Sr. José Tavares
(Dedé), funcionários do Laboratório de Cirurgia Experimental da Faculdade
de Medicina da Universidade de Brasília.
Professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas
da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília.
viii
EPÍGRAFE
“Uma droga é uma substância
que quando injetada em um rato,
produz um trabalho científico”.
Autor anônimo, in Corman: Colon & Rectal Surgery
... Valeu a pena? Tudo vale a pena
Se a alma não é pequena.
Quem quer passar além do Bojador
Tem que passar além da dor.
Deus ao mar o perigo e o abismo deu,
Mas nele é que espelhou o céu.
Fernando Pessoa, in Mensagem
ix
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS......................................................................................x
LISTA DE GRÁFICOS ...............................................................................xiii
LISTA DE TABELAS .................................................................................xiv
RESUMO .......................................................................................................xv
ABSTRACT ..................................................................................................xvi
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................1
2 OBJETIVO ...................................................................................................8
3 MATERIAL E MÉTODO .........................................................................10
3.1 ANIMAL DE EXPERIMENTAÇÃO .......................................................11
3.2 DISTRIBUIÇÃO E ALOCAÇÃO DOS ANIMAIS EM GRUPOS .........12
3.3 PRÉ-OPERATÓRIO .................................................................................13
3.4 ANESTESIA E TÉCNICA OPERATÓRIA .............................................14
3.5 EVOLUÇÃO PÓS-OPERATÓRIA ..........................................................19
3.6 RE-OPERAÇÃO E ANÁLISE OPERATÓRIA .......................................21
3.7 EXAME HISTOLÓGICO E MORFOMÉTRICO ....................................25
3.8 DEPOSIÇÃO DO COLÁGENO ...............................................................26
3.9 RESISTÊNCIA TÊNSIL DA ANASTOMOSE .......................................28
3.10 QUANTIFICAÇÃO DO TNF-α ............................................................30
3.11 QUANTIFICAÇÃO TECIDUAL DO TGF-β ........................................32
3.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA .....................................................................32
4 RESULTADOS ...........................................................................................33
4.1 MODELO EXPERIMENTAL ..................................................................34
4.2 EVOLUÇÃO CLÍNICA PRÉ-OPERATÓRIA.........................................34
4.3 EVOLUÇÃO CLÍNICA PÓS-OPERATÓRIA ........................................34
4.4 AVALIAÇÃO PONDERAL .....................................................................37
4.5 ANÁLISE DA RE-OPERAÇÃO ..............................................................39
4.6 FORÇA TÊNSIL DA ANASTOMOSE.....................................................41
4.7 HISTOLOGIA............................................................................................43
4.8 MORFOMETRIA E COLÁGENO ...........................................................46
4.9 TNF-α SÉRICO E TECIDUAL.................................................................51
4.10 TGF-β TECIDUAL (IMUNOHISTOQUÍMICA) .................................55
5 DISCUSSÃO ...............................................................................................56
6 CONCLUSÃO ............................................................................................72
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................74
APÊNDICES .................................................................................................94
ANEXOS
......................................................................................................128
x
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – EXPOSIÇÃO DO CÓLON A SER OPERADO .......................15
FIGURA 2 – SECÇÃO DO CÓLON COM TESOURA RETA .....................16
FIGURA 3 – ANASTOMOSE TÉRMINO-TERMINAL COM PONTOS DE
REPARO (A) E ANASTOMOSE DA HEMICIRCUNFERÊNCIA
POSTERIOR COM SUTURA CONTÍNUA (B)............................17
FIGURA 4 – ANASTOMOSE DA HEMICIRCUNFERÊNCIA POSTERIOR
(A) E ANASTOMOSE COMPLETA COM SUTURA DA BORDA
ANTERIOR DO CÓLON (B) ........................................................17
FIGURA 5 – INJEÇÃO DE SOLUÇÃO DE NaCl A 0,9% NA LUZ DO
CÓLON PARA TESTE DE IMPERMEABILIDADE DA
ANASTOMOSE (A) E DEMONSTRANDO QUE NÃO HOUVE
VASAMENTO DA SOLUÇÃO DE NaCl A 0,9% PELA
ANASTOMOSE (B) .......................................................................18
FIGURA 6 – COMPLETADO O PRIMEIRO PLANO DE FECHAMENTO
DA PAREDE ABDOMINAL (MÚSCULO APONEURÓTICO),
POR MEIO DE SUTURA CONTÍNUA COM FIO DE
POLIPROPILENO 5-0 (A) E SUTURA EM BARRA GREGA DA
PELE COM O MESMO FIO (B) ....................................................18
FIGURA 7 – OS FIOS DE POLIPROPILENO, 5-0 E 6-0, UTILIZADOS NO
FECHAMENTO DA PAREDE E DA ANASTOMOSE,
RESPECTIVAMENTE, (A) E COMPLETADA A SUTURA EM
BARRA GREGA DA PELE (B) ....................................................19
FIGURA 8 – ALOJAMENTO DOS ANIMAIS E GAIOLAS COM ÁGUA E
RAÇÃO AD LIBITUM (A) E (B) ...................................................20
FIGURA 9 – RÓTULO DE IDENTIFICAÇÃO DAS GAIOLAS (A) E
GAIOLA COM CINCO ANIMAIS NO PÓS-OPERATÓRIO
(B) ...................................................................................................20
FIGURA 10 – SEGMENTOS DE PAREDE ABDOMINAL CONTENDO A
LINHA DE SUTURA AO CENTRO (A) E (B) .............................21
FIGURA 11 – CAVIDADE PERITONEAL EXPOSTA PARA ANÁLISE,
APÓS A RETIRADA DO SEGMENTO DE PAREDE
ABDOMINAL (A) E (B) ................................................................22
xi
FIGURA 12 – SEGMENTO DO CÓLON RESSECADO PARA ANÁLISE
CONTENDO A ANASTOMOSE AO CENTRO (A) E APÓS A
ABERTURA LONGITUDINAL DO SEGMENTO PELA BORDA
MESENTÉRICA, OS DOIS SEGMENTOS PARA TESTE DE
RESISTÊNCIA TÊNSIL, PARA EXAME HISTOLÓGICO E
MORFOMÉTRICO (B) ..................................................................23
FIGURA 13 – SEGMENTO DE CÓLON ABERTO COM A ANASTOMOSE
AO CENTRO PARA TESTE DE RESISTÊNCIA TÊNSIL (A) E
DEMONSTRANDO ULCERAÇÃO DE MUCOSA EM UM DOS
SEGMENTOS DESIGNADO PARA EXAME HISTOLÓGICO E
MORFOMÉTRICO (B) ..................................................................23
FIGURA 14 – EXPOSIÇÃO DA VEIA CAVA INFERIOR DURANTE A
REOPERAÇÃO (A) E COLETA COM SERINGA DE 1 ML DE
SANGUE DA VEIA CAVA INFERIOR PARA DOSAGEM
QUANTITATIVA DO TNF-α (B) .................................................24
FIGURA 15 – SISTEMA DIGITALIZADOR DE IMAGENS ......................27
FIGURA 16 – TENSIÔMETRO DE FORÇA CONSTANTE ACOPLADO A
DINAMÔMETRO DIGITAL (A) E MAIOR DETALHE DO
DINAMÔMETRO (B) ....................................................................28
FIGURA 17 – POSICIONAMENTO DO SEGMENTO DE CÓLON A SER
TESTADO NO TENSIÔMETRO COM A LINHA DE
ANASTOMOSE AO CENTRO (A) E (B) .....................................29
FIGURA 18 – SEGMENTO DE CÓLON JÁ POSICIONADO NO
TENSIÔMETRO (A) E ROTURA DO SEGMENTO DE CÓLON
TESTADO (B) ................................................................................29
FIGURA 19 – KIT ELISA – IBL – PARA DOSAGEM DE TNF-α
ESPECÍFICO PARA RATOS, COM PLACA DE 96 POÇOS ......31
FIGURA 20 – LAVADORA E LEITORA AUTOMÁTICAS DE ELISA
(THERMO PLATE) DO LABORATÓRIO DE
IMUNOPATOLOGIA ....................................................................31
FIGURA 21 – AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA DA
CICATRIZAÇÃO DE ANASTOMOSE COLÔNICA TÉRMINO-
TERMINAL (PICRO-SIRIUS) ......................................................48
FIGURA 22 – AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA DAS LÂMINAS
CORADAS PELO PICRO-SIRIUS COM LUZ POLARIZADA. O
COLÁGENO TIPO I TEM COLORAÇÃO ALARANJADA E O
TIPO III ESVERDEADA, SUBGRUPOS E3 E C3 .......................49
xii
FIGURA 23 – AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA DAS LÂMINAS
CORADAS PELO PICRO-SIRIUS COM LUZ POLARIZADA. O
COLÁGENO TIPO I TEM COLORAÇÃO ALARANJADA E O
TIPO III ESVERDEADA, SUBGRUPOS E7 E E14 .....................50
FIGURA 24 - IMUNOHISTOQUÍMICA. AUMENTO: 400X. PRESENÇA
DE HISTIÓCITOS PRODUTORES DE TNF-α EM ANIMAIS DO
SUBGRUPO C3 ..............................................................................52
FIGURA 25 - IMUNOHISTOQUÍMICA. AUMENTO: 400X. PRESENÇA
DE HISTIÓCITOS PRODUTORES DE TNF-α (SETAS) EM
ANIMAL DO SUBGRUPO E3 ......................................................53
FIGURA 26 – PRODUÇÃO TECIDUAL DO TNF-α POR MEIO DE
IMUNOHISTOQUÍMICA EM ANIMAIS DOS SUBGRUPOS C3
E E3. AUMENTO DE 40X E 400X, DEMONSTRANDO QUE
NÃO HOUVE DIFERENÇA ENTRE OS SUBGRUPOS .............54
FIGURA 27 – PRODUÇÃO TECIDUAL DO TGF-β POR MEIO DE
IMUNOHISTOQUÍMICA EM ANIMAIS DOS SUBGRUPOS C14
E E14. AUMENTO 400 X .............................................................55
xiii
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 – ÓBITOS ..................................................................................36
GRÁFICO 2 – ALTERAÇÃO DE PESO APÓS ADMINISTRAÇÃO DE
INFLIXIMABE OU SOLUÇÃO NaCl A 0,9% .........................38
GRÁFICO 3 – ALTERAÇÃO DE PESO APÓS CIRURGIA .......................39
GRÁFICO 4 – RESISTÊNCIA TÊNSIL DA ANASTOMOSE .....................42
GRÁFICO 5 – DISPOSIÇÃO DE FIBROBLASTOS ....................................43
GRÁFICO 6 – PRESENÇA DE ABSCESSO ................................................44
GRÁFICO 7 – CONCENTRAÇÃO DO COLÁGENO EM PIXELS % À
HISTOMORFOMETRIA ...........................................................47
GRÁFICO 8 – PRODUÇÃO DO TNF-α SÉRICO NOS GRUPOS
CONTROLE, EXPERIMENTAL E “REFERÊNCIA” (pg/mL).52
xiv
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – FORÇA TÊNSIL EM NEWTON (N) DA ANASTOMOSE
COLÔNICA DE CADA ANIMAL AFERIDA
IMEDIATAMENTE APÓS A EUTANÁSIA CONFORME OS
GRUPOS EXPERIMENTAL (E), FORMADOS PELOS
SUBGRUPOS E3, E7, E14, E CONTROLE (C) FORMADO
PELOS SUBGRUPOS C3, C7 e C14 .........................................41
TABELA 2 – FREQÜÊNCIAS DA QUANTIDADE DE
FIBROBLASTOS........................................................................43
TABELA 3 – FREQÜÊNCIAS DA MATURAÇÃO DE
FIBROBLASTOS........................................................................44
TABELA 4 – FREQÜÊNCIAS DE FIBROSE ...............................................44
TABELA 5 – FREQÜÊNCIAS DE INFILTRADO MONONUCLEAR .......45
TABELA 6 – FREQÜÊNCIAS DE INFILTRADO
POLIMORFONUCLEAR...........................................................45
TABELA 7 – FREQÜÊNCIAS DE VASCULARIZAÇÃO ..........................45
TABELA 8 – FREQÜÊNCIAS DE ULCERAÇÃO ......................................45
TABELA 9 – MÉDIA, MEDIANA, DESVIO PADRÃO E VARIÂNCIA DA
HISTOMORFOMETRIA DO COLÁGENO DAS
ANASTOMOSES COLÔNICAS, UTILIZANDO-SE A
COLORAÇÃO COM PICRO-SIRIUS .......................................46
xv
RESUMO
A cicatrização das anastomoses do tubo digestivo depende de variáveis,
como técnica cirúrgica, fatores locais e sistêmicos, condições gerais do paciente e uso de
agentes farmacológicos, com conseqüente variação na freqüência de deiscência das
anastomoses. Drogas antiinflamatórias podem prejudicar a cicatrização das anastomoses,
interferindo na etapa inflamatória da cicatrização. O objetivo deste estudo experimental foi
avaliar os possíveis efeitos do infliximabe, um anticorpo monoclonal quimérico, humano-
murino, com ação anti-TNF-α, no processo de cicatrização de anastomoses colônicas em
ratos. Foram utilizados 60 ratos (Rattus norvergicus), distribuídos aleatoriamente em dois
grupos de 30 cada. Ambos os grupos foram posteriormente randomizados em três
subgrupos de dez animais, de acordo com o dia pós-operatório (DPO) de eutanásia (3º, 7º
ou 14º). No grupo de estudo (E), foi administrado infliximabe na dose de 5 mg/kg, via
subcutânea, 48 horas antes da operação e no grupo controle (C) foi administrado solução de
NaCl a 0,9%, volume equivalente. Após laparotomia, os animais de ambos os grupos foram
submetidos à secção do cólon e imediata anastomose término-terminal. Os animais foram
reoperados no 3º, 7º e 14º DPO. Realizado ressecção de um segmento colônico de 4 cm,
contendo a anastomose e dividido longitudinalmente em dois segmentos semelhantes. Um
dos segmentos foi ao acaso designado para teste de resistência tênsil e outro para estudo
histológico e de deposição do colágeno, após processamento e coloração com hematoxilina-
eosina, tricrômico de Masson e Picro-Sirius. A deposição do colágeno foi avaliada por
digitalização de imagens e calculada através do software Image J. Foi coletado sangue, por
punção, da veia cava inferior para quantificação do TNF-α sérico, pelo método ELISA,
utilizando-se um kit específico para ratos. A concentração tecidual do TNF-α foi avaliada
por imunohistoquímica. Os animais que receberam o infliximabe perderam peso nas 48
horas entre a administração da droga e a operação, enquanto que no grupo controle os
animais ganharam peso no mesmo período. Houve três óbitos no grupo estudo e um no
grupo controle, sem que esta diferença tenha significância estatística e que se possa
relacionar com o uso do infliximabe. Todos os animais, de ambos os grupos perderam peso
no pós-operatório, porém observou-se que no 14º DPO os ratos recuperaram o peso
perdido. A resistência tênsil das anastomoses foi maior, estatisticamente significante, no
grupo estudo, no 14º DPO, enquanto não houve diferenças significantes no 3º e 7º dias. Não
houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos na avaliação histológica
bem como na histomorfométrica. Na avaliação do TNF-α sérico por ELISA houve
diferença estatisticamente significante entre os subgrupos C3 e E3 (3º DPO) e entre o grupo
de referência e C3. Não houve diferença no TNF-α tecidual avaliado por
imunohistoquímica. O TGF-β tecidual foi maior no subgrupo E14 quando comparado com
o subgrupo C14 (14º DPO). O estudo sugere que a administração subcutânea do
infliximabe foi efetiva, exeqüível e segura. Nas condições que foi realizado este estudo o
infliximabe interferiu na fase inflamatória caracterizando-se por redução na concentração
de colágeno e melhorou a resistência tênsil das anastomoses na fase de remodelação.
xvi
ABSTRACT
It has been well established that several factors affect healing of colonic
anastomosis, resulting in the rise of morbidity and mortality rate. Drugs such steroids and
anti-inflammatory non-steroids impair anastomotic healing, by affecting the inflammatory
step. The aim of this experimental study was to evaluate the effects of infliximab, the
mouse/human IgG1 chimeric anti-TNF-α monoclonal antibody, on the healing process of
colonic anastomosis in rats. Sixty male Wistar rats were used, and were randomized in two
groups of 30 each. Both groups were further randomized in to three sub-groups, each of ten
animals, according with the post-operative day of sacrifice (third, seventh and fourteenth).
The study group was subjected to infliximab subcutaneously administered at a dose of 5
mg/kg of body weight and the control group was subjected to 0.9% sodium chloride (NaCl)
solution subcutaneously administered at volume equivalent dose to infliximab, 48 hours
prior to surgery. Both groups underwent to colonic section followed by an immediate end-
to-end anastomosis. Lots of five animals were killed in each session on post-operative days
3, 7 and 14. A colonic segment of 4 cm containing the anastomosis in its mid portion was
resected, and divided longitudinally in two. One of these segments were stained with
hematoxilin-eosin, Masson’s tricromic and picrosirius red and examined by light
microscopy. Deposition of collagen was evaluated by image digitalization and calculated
by specific software (Image J). In the other segment of the colon, anastomotic breaking
strengths were assessed using a tensiometer. Blood samples were collected from the
inferior vena cava and underwent an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for
quantitative detection of rat TNF-α. Imunohistochemistry techniques were used for tissue
evaluation of TNF-α and TGF-β. There were 3 deaths in the infliximab group and one in
the saline group and there was no statistical significance in this difference and we cannot
state the deaths as related to infliximab. All animals that received infliximab lost weight
prior to operation while all whom received saline solution gained weight in the same period
of time. Animals of both groups lost weight in post-operative period but by the fourteenth
post-operative day there were a tendency to recover the lost weight. The anastomosis
breaking strength was significantly higher in the infliximab group by the fourteenth post-
operative day while there were no differences by days 3 and 7. There were no significantly
differences between the groups in the histology and morphometric evaluation. There were
statistic significant difference between infliximab and control groups on post-operative day
3 and reference group and control group on post-operative day 3, when serum TNF-α was
measured by ELISA. There were no significantly differences in tissue TNF-α evaluation by
imunohistochemistry. TGF-β concentrations were higher in infliximab group on post-
operative day 14 as compared with controls. This study suggests that the subcutaneous
administration of the infliximab was effective, feasible and safe. In the conditions this
research was done, the infliximab interfered in the inflammatory step of anastomotic
healing characterized by reduction on collagen concentration and improvement in
anastomotic breaking strengths in collagen remodeling step.
1- INTRODUÇÃO
2
1- INTRODUÇÃO
A realização de anastomoses no aparelho digestivo é utilizada no
tratamento de diversas doenças há mais de um século. As complicações das
anastomoses colônicas são potencialmente devastadoras, com altas taxas de
morbidade e mortalidade, apesar dos avanços tecnológicos nos últimos 50
anos. Nas anastomoses colorretais, particularmente, a ocorrência de deiscência
e vazamento, que pode variar de 3 a até 30%, tem maior gravidade pelo risco
de ocasionar peritonites fecais (SCHIEDECK et al., 2000; TOCCHI et al.,
2000; NESBAKKEN et al., 2001; REGADAS et al., 2005; FERREIRA et al.,
2006; KONSTANTINIDIS et al., 2006; PLATELL et al., 2006; PARRA-
MEMBRIVES et al., 2007; ORTIZ et al., 2007).
A cicatrização das anastomoses do tubo digestivo depende de
variáveis, como técnica cirúrgica, infecção, fatores locais e sistêmicos,
condições gerais do paciente e uso de agentes farmacológicos, com
conseqüente variação na freqüência da deiscência das anastomoses
(HAWLEY, 1973; IRVIN & HUNT, 1974; CARRICO et al., 1984;
OLIVEIRA, 1989; SOUSA, 1991; SOUSA, 1994; ALMEIDA, 2006;
FERREIRA et al., 2006; PLATELL et al., 2006; KOSTANTINIDIS et al.,
2006; PARRA-MEMBRIVES et al., 2007).
Pela ação de vários fatores sintetizados por macrófagos,
plaquetas, células endoteliais e linfócitos T, a secção do cólon seguida de
anastomose, desencadeia uma seqüência organizada e complexa de eventos
celulares e bioquímicos que resultam na reparação do tecido (CLARK, 1996;
STEED, 1997).
3
Os principais eventos biológicos da cicatrização podem,
didaticamente, ser divididos em três fases distintas, porém, complexas e que se
sobrepõe uma à outra. São a inflamação, a fibroblástica ou proliferativa, e
remodelagem do colágeno (STEED, 1997; CLARK et al., 2000; HÖER et al.,
2002).
O termo inflamação provém do latim enfflamare, que significa
“atear fogo”. A origem da palavra provém de um símbolo hieroglífico de um
papiro egípcio datado de 1500 a.C., representado por um braseiro, que foi
traduzido como inflamação (SIQUEIRA JR. & DANTAS, 2000).
Inflamação pode ser definida como reação da micro circulação
induzida por lesão aos tecidos, com a conseqüente movimentação de
elementos intravasculares, como fluidos, células e moléculas, para o espaço
extra vascular. A agressão tecidual estimula a liberação de substâncias
químicas no local afetado, denominadas de mediadores químicos da
inflamação que podem ter origem plasmática ou tecidual (SIQUEIRA JR. &
DANTAS, 2000).
A inflamação normal é um processo intrínseco da cicatrização
tecidual, daí a máxima: Sem inflamação não haverá cicatrização (CARRICO
et al., 1984).
Segue-se de imediato à resposta inflamatória normal expressa
pelo aumento da permeabilidade capilar, aumento dos neutrófilos periféricos,
migração de monócitos, transformação em macrófagos, fagocitose
(LEIBOVICH & ROSS, 1976), liberação local de citocinas, como as
interleucinas 1 e 6 (Il-1 e Il-6), o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e fatores
de crescimento α-plaquetários, como o fator de crescimento transformante-β
(TGF-β), de enzimas, de mediadores químicos, como a serotonina e síntese do
colágeno (SIQUEIRA JR. & DANTAS, 2000).
4
O TGF-β é uma proteína que atua na cicatrização estimulando a
angiogênese e está relacionada ao desenvolvimento de fibrose na cicatriz
(SIQUEIRA JR. & DANTAS, 2000).
Drogas com atividade antiinflamatória, como os corticosteróides
e antiinflamatórios não esteróides, têm despertado o interesse de
pesquisadores, devido a seu potencial de interferência no processo cicatricial
(SOUSA, 1989; EUBANKS et al., 1997; SIRIMARCO, 2000; GOGIA 2003;
MANTZOROS et al., 2004, 2006).
Na fase proliferativa os fibroblastos e as células endoteliais têm
um papel relevante, migrando dos tecidos circunjacentes e de vênulas intactas
próximas à anastomose. Com a ativação de macrófagos, das células
endoteliais, e a expressão do fator de crescimento do endotélio vascular
(VEGF), formam-se novos capilares pelo processo de angiogênese, iniciando-
se a formação de tecido de granulação. Os fibroblastos desenvolvem grande
capacidade sintetizadora de colágeno, proteína constitutiva das fibras do
tecido conjuntivo dos metazoários em geral. Este tecido conjuntivo frouxo é
rico em capilares, leucócitos e em matriz extracelular formada por fibras finas
de colágeno (tipo III) e proteínas estruturais não-fibrosas como o ácido
hialurônico, as glicosaminoglicanas e as proteoglicanas (REGAN et al., 1993;
SIQUEIRA JR. & DANTAS, 2000; REYS, 2004).
Durante a fase proliferativa, o colágeno da ferida é submetido
tanto a colagenólise quanto a síntese, com predominância da última na
cicatrização normal (JIBORN et al., 1980). A quantidade de colágeno
aumenta a partir do terceiro dia na evolução da cicatrização e, em cerca de 14
dias, suas fibras passam a predominar na matriz extracelular. O colágeno tipo I
predomina em relação ao colágeno tipo III e a matriz de colágeno vai sendo
remodelada, por meio de aumento e estabilização de suas ligações
5
transversais, tornando-se dessa forma mais resistente. Qualquer alteração em
uma fase pode resultar no retardo ou falha da cicatrização da anastomose
(SIQUEIRA JR. & DANTAS, 2000; REYS, 2004).
O colágeno, glicoproteína composta por três cadeias
polipeptídicas em conformação de tripla hélice, é constituído pelos
aminoácidos glicina, alanina, lisina, prolina, hidroxilisina e hidroxiprolina. A
enzima prolil-hidroxilase transforma a prolina em hidroxiprolina, que passa a
ser um aminoácido exclusivo do colágeno e é indispensável para a
estabilidade da tripla hélice de proteína (PROCKOP & KIVIRIKKO, 1995). A
concentração da hidroxiprolina no tecido cicatricial possibilita estimar o
conteúdo de colágeno na área da anastomose.
Em condições normais, na ausência de infecção ou de qualquer
outro fator prejudicial, a cicatrização de anastomoses colônicas é mais rápida
em relação a outras anastomoses do trato digestivo, considerando-se a
deposição de colágeno (JÖNSSON et al., 1985; RAVO et al., 1988;
ALMEIDA, 2006).
Múltiplos fatores podem atuar sobre as diferentes fases da
cicatrização de anastomoses do tubo digestivo, sendo de especial interesse
aqueles que alteram o conteúdo de colágeno, por interferirem no equilíbrio
entre a lise e a síntese desta proteína (OLIVEIRA, 1989), como a infecção,
que aumenta a produção de colagenase e inibe a cicatrização (HAAN et al.,
1974; CLARK et al., 2000; CAHILL et al., 2004).
As citocinas, são proteínas responsáveis pela modulação da
função de diferentes tipos celulares e possuem várias funções, dentre elas:
mediação da resposta imunológica adaptativa e da inflamação, regulação da
ativação do crescimento e da diferenciação de linfócitos e de outras células.
Citocinas exercem a sua função sobre diferentes tipos celulares, propriedade
6
esta denominada de pleiotropismo. Elas podem ter vários efeitos diferentes
sobre o mesmo tipo celular e alguns, inclusive, ocorrendo simultaneamente.
Esses efeitos dependem da interação de citocinas com receptores de superfície
na célula-alvo (SIQUEIRA JR. & DANTAS, 2000).
O Fator de Necrose Tumoral – alfa (TNF-α) é uma citocina
presente na inflamação, com atividade pró-inflamatória, podendo interferir na
cicatrização tecidual. Foi assim denominada devido a sua atividade em
provocar necrose tumoral in vivo, quando injetado em ratos portadores de
tumores (MAURY, 1986; MOONEY et al., 1990; SALOMON et al., 1991;
BAKER et al., 2006).
O TNF-α é expresso em várias células, mas principalmente em
macrófagos como resposta imunológica a outras citocinas, a bactérias, vírus,
parasitas e ao estímulo de outras citocinas. Acredita-se que o TNF-α
desempenhe papel importante na atividade antitumoral, imunomodulação,
caquexia, choque séptico, hematopoiese, replicação viral e inflamação
(SIQUEIRA JR. & DANTAS, 2000; ISHIMURA et al., 2002; DWINELL et
al., 2003; BAKER et al., 2006, BIOMYX TECHNOLOGY, 2007).
O papel do TNF-α na cicatrização ainda não está totalmente
esclarecido (BETTINGER et al., 1994; STREIT et al., 2006). Citocinas pró-
inflamatórias como o TNF-α, demonstram respostas sinérgicas ou antagônicas
em relação à cicatrização (interferindo na fase inflamatória e na fase de
deposição do colágeno), dependendo da sua concentração (BAKER et al.,
2006).
O infliximabe é um anticorpo monoclonal quimérico, humano-
murino, da classe IgG1, que se liga com alta afinidade a formas solúveis e
transmembranais de TNF-α, mas não à linfotoxina (TNF-β). O infliximabe
inibe a atividade funcional do TNF-α em vários tipos de bioensaios in vitro
7
(KNIGHT et al., 1993; SIEGEL et al., 1995). In vivo, o infliximabe forma
rapidamente complexos estáveis com o TNF-α, um processo paralelo à perda
da bioatividade do TNF-α (SIEGEL et al., 1995; SCALLON et al., 1995).
Estudos clínicos com o infliximabe, feitos pelo laboratório
Schering-Plough, relatam comprometimento de cicatrização como um efeito
indesejável pouco comum (GUIA DE ADMINISTRAÇÃO DO
REMICADE
®
), porém um estudo recente sugere melhora na cicatrização de
feridas crônicas com o uso tópico do infliximabe (STREIT et al., 2006).
O infliximabe é eficaz na indução e manutenção da terapia da
doença de Crohn fistulizante ativa e um dos compostos biológicos aprovados
para seu tratamento, mas com limitações no tocante à imunogenicidade
(desenvolvimento de anticorpos anti-infliximabe) que pode ocorrer em alguns
casos, devido a sua fração murina. Também há relatos de reações de
hipersensibilidade imediata ou tardia e fenômenos auto-imunes, levando a
perda de sua eficácia ou mesmo impossibilitando a continuidade do tratamento
(SANDBORN, 2003; DANESE et al., 2006; SANDBORN, 2006).
Em humanos, o uso do infliximabe no tratamento da doença de
Crohn, aumenta em quatro vezes o risco de infecções por microrganismos
oportunistas (ABREU, 2006) e tem uma taxa de mortalidade de 1%, na
maioria das vezes, devido a infecções (COLOMBEL, et al., 2004).
A utilização do infliximabe é de grande interesse clínico nos
pacientes portadores de doença inflamatória intestinal. Estes pacientes estão
sujeitos a tratamentos cirúrgicos com anastomoses de forma eletiva ou de
urgência, podendo ou não estar em uso do infliximabe. Em decorrência disto o
estudo dos efeitos potenciais do anticorpo monoclonal infliximabe na
cicatrização das anastomoses torna-se importante por suas implicações
práticas.
2- OBJETIVO
9
2- OBJETIVO
Avaliar os possíveis efeitos do anticorpo monoclonal quimérico,
humano-murino, o infliximabe, na cicatrização de anastomoses colônicas em
ratos.
3 - MATERIAL E MÉTODO
11
3 – MATERIAL E MÉTODO
O estudo foi realizado nos Laboratórios de Cirurgia Experimental
da Área de Clínica Cirúrgica, de Patologia e de Imunopatologia da Faculdade
de Medicina da Universidade de Brasília – UnB e no Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública - Disciplina de Patologia Geral - da Universidade
Federal de Goiás - UFG.
O protocolo da pesquisa foi avaliado e aprovado pelo Comitê de
Ética no Uso Animal – CEUA, do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade de Brasília – UnB em 31 de outubro de 2006 e pela Área de
Clínica Cirúrgica da Faculdade de Medicina (FM) da Universidade de Brasília
– UnB.
Na redação do trabalho foram adotadas as Normas para
Apresentação de Documentos Científicos do Instituto Paranaense de
Desenvolvimento Econômico e Social (IPARDES) da Universidade Federal
do Paraná e da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT).
Na editoração foram utilizados os softwares IPARDES.DOT e o
Microsoft Word
®
.
3.1- ANIMAL DE EXPERIMENTAÇÃO
Foram utilizados sessenta ratos, Rattus norvergicus, linhagem
Wistar, machos, aparentemente sadios, com peso corporal inicial entre 215 e
390 g e 60 e 90 dias de vida.
12
Os animais foram fornecidos pelo Laboratório Bioagri Ltda,
Planaltina – DF, alimentados com dieta padrão de laboratório (ração
peletizada para pequenos roedores marca Biotec, modelo Biobase Nutrição
Animal – (Basequímica Produtos Químicos Ltda – Águas Frias, SC) e água a
vontade.
3.2- DISTRIBUIÇÃO E ALOCAÇÃO DOS ANIMAIS
EM GRUPOS
Os animais de experimentação foram distribuídos em dois grupos
com trinta ratos cada, designados estudo (E) e controle (C).
Grupo E
Administrado dose única de 5mg/Kg de infliximabe (Remicade
®
-
Ind. Química e Farmacêutica Schering-Plough S.A., Rio de Janeiro - RJ), via
subcutânea (dorso à direita), 48 h antes da operação.
Preparo da droga:
O conteúdo de um frasco com 100 mg de pó liofilizado do
infliximabe foi dissolvido em 10 ml de água destilada. Em seguida, a solução
foi diluída em 90 ml de solução de NaCl a 0,9%, perfazendo um volume total
de 100 ml.
Grupo C
Administrado dose única, volume equivalente, de solução de
NaCl a 0,9% (Equiplex Indústria Farmacêutica Ltda., Goiânia – GO), via
subcutânea (dorso à direita), 48 h antes da operação.
13
Subgrupos
Os animais dos grupos E e C foram distribuídos em três
subgrupos de dez animais, denominados E3, E7 e E14 e C3, C7 e C14,
correspondendo, respectivamente, ao 3º, 7º e 14º dia pós-operatório em que
foram submetidos a reoperação e eutanásia.
Os animais foram distribuídos de forma aleatória, efetivada por
sorteio, uma a uma, por seis fichas semelhantes, identificadas pelas siglas E3,
C3, E7, C7, E14 e C14.
Ao final do sorteio para determinação dos subgrupos, os animais
tiveram a sua cauda marcada com canetas coloridas de retroprojetor para
identificação.
Após a marcação, os animais tiveram seus pesos aferidos em
balança eletrônica, modelo AS5500 C (Marte Balanças e Aparelhos de
Precisão Ltda. – São Paulo, SP) e, em seguida, receberam a solução de
infliximabe ou a solução de NaCl.
As operações foram realizadas em sessões, por lotes de cinco
animais, 48 horas após receberem a medicação ou o placebo.
3.3- PRÉ-OPERATÓRIO
Os animais permaneceram no alojamento de animais do
Laboratório de Cirurgia Experimental, confinados em gaiolas, em lotes de
cinco, com regime de doze horas de luz artificial (06h00min a 18h00min) e
doze horas de escuro, recebendo dieta padrão de laboratório e água à vontade,
após período de vinte dias de aclimatação.
14
Jejum pré-operatório de seis horas.
Imediatamente antes da indução anestésica, tiveram seus pesos
aferidos e anotados.
3.4- ANESTESIA E TÉCNICA OPERATÓRIA
Os procedimentos anestésicos e cirúrgicos nos animais foram
supervisionados por médico-veterinário do Laboratório de Cirurgia
Experimental e estão de acordo com os princípios éticos emanados pelo
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
As operações foram realizadas com material cirúrgico limpo,
desinfetado com solução de glutaraldeído (C5H8O2) a 2% antes de cada
sessão.
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados pelo mesmo
cirurgião, utilizando-se técnica asséptica e obedecendo a seguinte
padronização de etapas (OLIVEIRA, 1989):
• Anestesia inalatória por éter etílico - (C
2
H
5
)
2
O - (VETEC – Vetec Química
Fina Ltda. Duque de Caxias - RJ), seguido de anestesia com xilazina
(Calmiun, Agener União Saúde Animal - União Química Farmacêutica
Nacional S/A, Embu-Guaçu – SP) na dose de 10 mg/kg associada à quetamina
(Francotar, Virbac Saúde Animal – Eurofarma Laboratórios Ltda., São Paulo
– SP) na dose de 100 mg/kg, administrados via intramuscular, na face medial
da coxa direita do animal, por médico veterinário anestesista. No trans-
operatório, doses adicionais de anestésico foram administradas, conforme a
necessidade (MEZADRI et al., 2004).
15
• Imobilização do animal em decúbito dorsal sobre placa de madeira revestida
com Fórmica
®
e fixação de seus membros com esparadrapo;
• Tricotomia da parede abdominal anterior;
• Anti-sepsia da pele do abdome com solução degermante de iodo-
polivinilpirrolidona e álcool a 70%;
• Laparotomia mediana de três cm de extensão a um cm da genitália;
• Exposição do cólon distal (FIGURA 1);
FIGURA 1 – EXPOSIÇÃO DO CÓLON A SER OPERADO.
16
• Malaxação divergente caso o segmento a ser operado apresentasse conteúdo
fecal;
• Secção cólica: 2,5 cm proximal à reflexão peritoneal, com tesoura reta
(FIGURA 2);
FIGURA 2 – SECÇÃO DO CÓLON COM TESOURA RETA.
• Reconstrução do trânsito colônico com anastomose término-terminal em
plano único, com sutura contínua, englobando todas as camadas da parede
intestinal, com fio de polipropileno 6-0 e agulha cilíndrica de 1,3 cm,
(Prolene
®
, ETHICON – São José dos Campos – SP) (FIGURAS 3 e 4);
17
●
Depois de completado a anastomose realizou-se teste de permeabilidade da
anastomose por injeção de solução de NaCl a 0,9%, com seringa de 1 ml, sob
pressão, na luz intestinal (FIGURA 5);
FIGURA 3 – ANASTOMOSE TÉRMINO-TERMINAL COM PONTOS DE
REPARO (A) E ANASTOMOSE DA BORDA POSTERIOR COM SUTURA
CONTÍNUA (B).
FIGURA 4 – ANASTOMOSE DA BORDA POSTERIOR (A) E
ANASTOMOSE COMPLETA COM SUTURA DA BORDA ANTERIOR
DO CÓLON (B).
18
FIGURA 5 – INJEÇÃO DE SOLUÇÃO DE NaCl A 0,9% NA LUZ DO
CÓLON PARA TESTAR A IMPERMEABILIDADE DA ANASTOMOSE
(A) E DEMONSTRANDO QUE NÃO HOUVE VASAMENTO DA
SOLUÇÃO DE NaCl A 0,9% PELA ANASTOMOSE (B).
• Síntese da parede abdominal em dois planos: o primeiro com sutura contínua
simples interessando peritônio, músculo e aponeurose na linha média e o
segundo com sutura contínua em barra grega interessando a pele – ambos com
fio de polipropileno 5-0 e agulha cilíndrica de 1,5 cm, (Prolene
®
, ETHICON –
São José dos Campos – SP) (FIGURAS 6 E 7).
FIGURA 6 – PRIMEIRO PLANO DE FECHAMENTO DA PAREDE
ABDOMINAL (MÚSCULO APONEURÓTICO), SUTURA CONTÍNUA
COM FIO DE POLIPROPILENO 5-0 (A) E SUTURA EM BARRA GREGA
DA PELE COM O MESMO FIO (B).
19
FIGURA 7 – FIOS DE POLIPROPILENO, 5-0 E 6-0, UTILIZADOS NO
FECHAMENTO DA PAREDE E DA ANASTOMOSE (A) E
COMPLETADA A SUTURA EM BARRA GREGA DA PELE (B).
3.5 - EVOLUÇÃO PÓS-OPERATÓRIA
Após a recuperação anestésica, os animais foram colocados em
gaiolas em grupos de cinco, com água e ração a vontade. Analgesia pós-
operatória com morfina na dose de 5 mg/kg via subcutânea a cada 8 horas,
nas primeiras 24 horas. As maravalhas das gaiolas foram esterilizadas em
autoclave e trocadas duas vezes por semana (FIGURAS 8 e 9). Os animais
foram observados, diariamente, quanto ao aparecimento das seguintes
alterações: apatia, eriçamento de pêlos, diarréia, distensão abdominal,
hematomas ou sinais inflamatórios na ferida cirúrgica da parede abdominal.
Cada um desses indicadores foi analisado e classificado em escores: (0)
ausente; (+) leve; (++) moderado; (+++) marcante; e (++++) intenso.
20
FIGURA 8 – ALOJAMENTO DOS ANIMAIS E GAIOLAS COM ÁGUA E
RAÇÃO AD LIBITUM (A) E (B).
FIGURA 9 – RÓTULO DE IDENTIFICAÇÃO DAS GAIOLAS (A) E
GAIOLA COM CINCO ANIMAIS NO PÓS-OPERATÓRIO (B).
Em caso de óbito, os animais foram submetidos a exame post
mortem por dois examinadores independentes que desconheciam a que grupo
ou subgrupo o animal pertencia e não foram repostos.
21
3.6- REOPERAÇÃO E ANÁLISE OPERATÓRIA
• Os animais sobreviventes foram reoperados nos dias previamente
determinados (3º, 7º e 14º dias).
• Antes da indução anestésica tiveram seus pesos novamente aferidos e
anotados.
• Anestesia como descrito previamente.
• Após a anestesia, foi ressecada uma área retangular da parede abdominal de
cinco por seis centímetros, englobando a cicatriz da laparotomia anterior
(FIGURA 10).
FIGURA 10 – SEGMENTOS DE PAREDE ABDOMINAL CONTENDO A
LINHA DE SUTURA AO CENTRO (A) E (B).
22
• Exame da cavidade peritoneal, para análise das seguintes ocorrências:
aderências, obstrução intestinal mecânica, abscessos, hematomas, peritonite,
deiscência ou vazamento da anastomose. Cada indicador foi classificado em
escores: (0) ausente; (+) leve; (++) moderado; (+++) marcante; e (++++)
intenso (FIGURA 11).
FIGURA 11 – CAVIDADE PERITONEAL EXPOSTA PARA ANÁLISE,
APÓS A RETIRADA DO SEGMENTO DE PAREDE (A) E (B).
• Ressecção de segmento intestinal de 4 cm contendo a anastomose em sua
porção central (FIGURA 12).
• Abertura pela borda mesentérica e fixação em papel cartão, ficando exposta
a superfície mucosa. A peça foi seccionada ao meio em sentido longitudinal.
Um fragmento escolhido ao acaso foi submetido ao teste de resistência tênsil
no dinamômetro padronizado (FIGURA 13).
23
FIGURA 12 – SEGMENTO DO CÓLON RESSECADO PARA ANÁLISE,
CONTENDO A ANASTOMOSE AO CENTRO (A) E APÓS A ABERTURA
LONGITUDINAL DO SEGMENTO PELA BORDA MESENTÉRICA. OS
DOIS SEGMENTOS PARA TESTE DE RESISTÊNCIA TÊNSIL E PARA
EXAME HISTOLÓGICO E MORFOMÉTRICO (B).
FIGURA 13 – SEGMENTO DE CÓLON ABERTO COM A ANASTOMOSE
AO CENTRO PARA TESTE DE RESISTÊNCIA TÊNSIL (A) E
SEGMENTOS DE CÓLON ABERTOS COM ANASTOMOSE AO
CENTRO, DEMONSTRANDO ULCERAÇÃO DE MUCOSA EM UM DOS
SEGMENTOS, PARA EXAME HISTOLÓGICO E MORFOMÉTRICO (B).
24
• O segundo fragmento foi fixado em formol tamponado a 10% para exame
histopatológico, morfométrico e quantificação de colágeno (FIGURA 13).
●
Com o animal vivo, realizado coleta de sangue com seringa de 1 ml, por de
punção sob visão direta da veia cava inferior, centrifugação, separação do soro
e congelamento a – 80ºC para posterior dosagem de TNF-α (FIGURA 14).
FIGURA 14 – EXPOSIÇÃO DA VEIA CAVA INFERIOR DURANTE A
REOPERAÇÃO (A) E COLETA COM SERINGA, DE 1 ML DE SANGUE
DA VEIA CAVA INFERIOR PARA DOSAGEM QUANTITATIVA DO
TNF α (B).
• Em seguida, os animais foram submetidos à eutanásia pela secção da veia
cava inferior e abertura da cavidade torácica.
25
3.7- EXAME HISTOLÓGICO E MORFOMETRIA
As peças cirúrgicas, após fixação em formol a 10% foram
processadas e coradas pelos métodos de hematoxilina-eosina (HE), tricrômico
de Masson e Vermelho da Síria (Picro-Sirius Red).
Para análise das condições de cicatrização, os seguintes
indicadores foram utilizados:
Fibroblastos: Quantidade
Disposição: horizontalização X enovelamento
Maturação
Fibrose
Vascularização
Infiltrado mononuclear
Infiltrado polimorfo nuclear
Abscesso
Ulceração
• A avaliação histológica da cicatrização foi realizada por microscopia óptica
por observador que desconhecia a que grupo ou subgrupo pertencia o material.
Cada indicador foi analisado e classificado em escores.
Fibroblastos:
Quantidade: (0) ausente; (+) discreta; (++) moderado; (+++)
acentuada.
Disposição: horizontalização X enovelamento.
Maturação: (0) ausente; (+) discreta; (++) moderado; (+++) acentuada.
26
Fibrose: (0) ausente; (+) discreta; (++) moderado; (+++) acentuada.
Vascularização: (0) ausente; (+) discreta; (++) moderado; (+++) acentuada.
Infiltração mono e polimorfo nuclear: (0) ausente; (+) infiltração focal; (++)
infiltração multifocal; (+++) infiltração difusa.
Abscesso: sim X não.
Úlcera: (0) ausente; (+) discreta; (++) moderado; (+++) acentuada.
• As lâminas foram examinadas para quantificação da densidade de colágeno e
dos elementos da reação inflamatória.
3.8 - DEPOSIÇÃO DE COLÁGENO
Análise quantitativa por histomorfometria do colágeno presente
nas regiões peri-anastomóticas foi realizada pela avaliação das lâminas
coradas pelo Picro-Sirius, através de sistema digital de análise de imagens.
Observou-se a área total dos campos por microscopia de luz com objetiva de
10X e a análise foi realizada por um observador que desconhecia de que grupo
ou subgrupo de animais a lâmina provinha. A captura das imagens foi obtida
através de câmera digital Sony S85 (Tóquio – Japão) acoplada a um
Microscópio de luz Zeiss Axion Star (Carl Zeiss Vision – Alemanha). O sinal
de vídeo foi digitalizado em 8 bits em computador pessoal (notebook – HP-
Pavilion ze2000). Todas as imagens tiveram uma resolução de 1280 x 960
pixels e foram analisadas através do software Image J (Wayne Rasband,
27
Research Services Branch, National Institute of Menthal Health, Bethesda,
Maryland, USA) por observador diferente do que captou as imagens e que
desconhecia de que grupo ou subgrupo de animais as imagens provinham
(FIGURA 15).
A análise da presença de colágeno, quanto ao aparecimento das
formas jovem (tipo III) e madura (tipo I), foi realizada através da coloração de
Picro-Sirius (Vermelho da Síria) das lâminas contendo a região
perianastomótica e leitura das mesmas por microscopia de luz polarizada
(JUNQUEIRA, 1979, 1982; MONTES, 1991).
FIGURA 15 – SISTEMA DIGITALIZADOR DE IMAGENS.
28
3.9 - RESISTÊNCIA TÊNSIL DA ANASTOMOSE
Avaliação por análise computadorizada dos dados obtidos em
tensiômetro de força constante, com capacidade de tração de 2.500N, máquina
de ensaio vertical Versa Test (Mecmesin
®
Versa Test, United Kingdon)
acoplada a dinamômetro digital AGF (Panambro Indústria Técnica S.A. – SP)
de segmento colônico de 4 cm com anastomose central, conservado em
solução de NaCl 0,9%, fixado no aparelho por suas bordas livres (FIGURAS
16, 17 E 18).
A velocidade do teste de ruptura foi de 25 mm/min. e o valor de
ruptura foi expresso em Newtons (N). O dinamômetro foi aferido antes de
cada série de medidas.
FIGURA 16 – TENSIÔMETRO DE FORÇA CONSTANTE ACOPLADO A
DINAMÔMETRO DIGITAL (A) E MAIOR DETALHE DO
DINAMÔMETRO (B).
29
FIGURA 17 – POSICIONAMENTO DO SEGMENTO DE CÓLON A SER
TESTADO NO TENSIÔMETRO COM A LINHA DE ANASTOMOSE AO
CENTRO (A) E (B).
FIGURA 18 – SEGMENTO DE CÓLON JÁ POSICIONADO NO
TENSIÔMETRO (A) E ROTURA DO SEGMENTO DE CÓLON TESTADO
(B).
30
3.10- QUANTIFICAÇÃO DO TNF-α
Foram coletados em seringa, 1 ml de sangue, por punção da veia
cava inferior e em seguida transferido para um microtubo (Microtimer
®
) com
gel separador. Após centrifugação por 5 minutos a 4000 RPM em temperatura
ambiente o soro foi transferido para outro micro tubo (Ependorf
®
) e
imediatamente armazenado a - 80ºC. A dosagem quantitativa do TNF-α no
soro de ratos foi realizada por meio de ensaio imunoenzimático – Instant
ELISA, de acordo com protocolo referendado (MAURY, 1986;
ECONOMOU, et al., 1989; SMITH, et al., 1990; CERDAN, et al. 1991). Foi
utilizado kit ELISA específico para ratos (IBL
®
- Immuno-Biological
Laboratories Co. Ltd., Gunma, Japan) – (FIGURA 19). Todas as instruções e
recomendações do fabricante foram seguidas rigorosamente. Foi utilizada
lavadora automática Thermo Plate
®
e leitora de ELISA automática Thermo
Plate
®
(Thermo Scientific, Inc.; MA, USA) - (FIGURA 20 A e B) . Um painel
de amostras séricas randomizadas de ratos aparentemente saudáveis e sem
manipulação prévia foi testado para TNF-α e um intervalo referencial de
valores obtidos. As amostras controle foram estabelecidas das concentrações
de TNF-α de ratos conhecidas. Padrões e amostras foram corridos no mesmo
ensaio.
Para confirmação dos dados obtidos através da dosagem
quantitativa do TNF-α no soro por ELISA, foi quantificada a produção de
TNF-α tecidual por imunohistoquímica utilizando-se os blocos de parafina. A
imunomarcação foi feita com anticorpo anti-TNF-α (anti-rato) – marca Santa
Cruz
®
, na diluição 1:75.
31
FIGURA 19 – KIT ELISA – IBL
®
– PARA DOSAGEM DE TNF-α
ESPECÍFICO PARA RATOS, COM PLACA DE 96 POÇOS.
FIGURA 20 – LAVADORA E LEITORA AUTOMÁTICAS DE ELISA
(THERMO PLATE
®
) DO LABORATÓRIO DE IMUNOPATOLOGIA.
32
3.11 – QUANTIFICAÇÃO TECIDUAL DO TGF-β
Através de imunohistoquímica, utilizando-se os blocos de
parafina, apenas nos subgrupos C14 e E14, foi quantificada a produção do
Fator de Crescimento Transformante - beta (TGF-β).
A imunomarcação foi feita com anticorpo anti-TGF-β – marca
Phamigen
®
, na diluição 1:100.
3.12 - ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram analisados sob o ponto de vista
estatístico, utilizando-se os softwares SPSS
®
13.0 (Special package for social
sciences), SigmaStat
®
2.0 e Microsoft
®
Excel:
a) Teste t de Student, para comparação entre os dois grupos com
distribuição “normal” e com variância semelhante.
b) Teste de Mann-Whitney.
c) Teste exato de Fisher para análise de dados não paramétricos
(tabelas de contingência).
d) Teste de Levene para homogeneidade das variâncias e
Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance (ANOVA).
Todas as probabilidades menores que 5% (p<0,05) foram
consideradas significantes.
4- RESULTADOS
34
4- RESULTADOS
4.1 - MODELO EXPERIMENTAL
O modelo experimental permitiu a realização do estudo de acordo
com o desenho do mesmo.
4.2– EVOLUÇÃO CLÍNICA PRÉ-OPERATÓRIA
Três animais do grupo experimental apresentaram apatia, dois
apresentaram eriçamento de pêlos e um apresentou agitação nas 48 horas entre
a administração do infliximabe e o procedimento cirúrgico. Nenhum animal
do grupo controle apresentou qualquer alteração neste mesmo período.
Em dois animais do grupo controle (C 3.4 e C 3.10), foi
verificado a presença de verminose à abertura do cólon, porém os ratos
sobreviveram até a data da eutanásia.
4.3 – EVOLUÇÃO CLÍNICA PÓS-OPERATÓRIA
Um animal do grupo experimental (E 7.1), que deveria ter sido
submetido a eutanásia no sétimo dia, apresentou apatia, eriçamento de pêlos,
distensão abdominal, diarréia e desidratação, foi encontrado morto na gaiola
35
no 5º DPO. A observação macroscópica da cavidade abdominal revelou sinais
de deiscência anastomótica parcialmente bloqueada por aderências com
pequeno extravasamento de conteúdo fecal e sinais de peritonite.
Dois animais do grupo experimental (E 14.5 e E 14. 10) que
deveriam se submeter à eutanásia no décimo - quarto dia pós-operatório
apresentaram apatia, eriçamento de pêlos e distensão abdominal, morreram no
10º e 7º dia pós-operatório, respectivamente. Em ambos, a observação
macroscópica da cavidade abdominal não revelou sinais de deiscência
anastomótica, hemorragia, abscesso ou peritonite.
Um animal do grupo controle (C 7.10) que deveria ser submetido
a eutanásia no sétimo dia pós-operatório, apresentou apatia, eriçamento de
pêlos e distensão abdominal, morreu no 6º dia pós-operatório. O exame
macroscópico da cavidade peritoneal mostrou grande quantidade de
aderências, distensão do cólon proximal à anastomose e necrose parcial da
mucosa colônica no segmento proximal à anastomose, sem sinais de
deiscência da anastomose ou de peritonite.
As observações post mortem da cavidade peritoneal foram
realizadas em conjunto por médico veterinário e médico cirurgião que não
participaram das operações e ambos desconheciam a que grupo pertencia os
animais. Os animais mortos no pós-operatório não foram repostos.
A mortalidade foi de 10% no grupo experimental e 3,3% no
grupo controle, perfazendo uma mortalidade global de 6,66%. Não houve
significância estatística entre os grupos (p = 0,306) (GRÁFICO 1).
36
GRÁFICO 1 – ÓBITOS.
p = 0,306
C3 – Subgrupo Controle sacrificado no 3º DPO
E3 – Subgrupo Estudo sacrificado no 3º DPO
C7 – Subgrupo Controle sacrificado no 7º DPO
E7 – Subgrupo Estudo sacrificado no 7º DPO
C14 – Subgrupo Controle sacrificado no 14º DPO
E14 – Subgrupo Estudo sacrificado no 14º DPO
Os demais 56 ratos sobreviveram até as datas estabelecidas para a
eutanásia, sendo verificado um caso de desidratação (E 14.2) e um caso de
sangramento nos olhos e nariz (C 7.2).
Apatia foi verificada em 10 animais do grupo experimental
(33,33%) e em 8 animais do grupo controle (26,66%) perfazendo um total de
30%. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos estudo
e controle (p= 0,389).
Eriçamento de pêlos foi observado em 9 animais do grupo
experimental (30%) e em 8 animais do grupo controle (26,66%), perfazendo
um total de 28,33%, também sem que esta diferença seja estatisticamente
significante (p=0,500).
Óbitos
0
2
4
6
8
10
12
Não
Sim
C3
E3
C7
E7
C14
E14
37
Distensão abdominal foi observada em 13 ratos do grupo
experimental (43,33%) e em 11 do grupo controle (36,66%), perfazendo um
total de 40%. A diferença entre os dois grupos demonstrou-se sem
significância estatística (p=0,396).
Diarréia foi verificada em dois ratos do grupo experimental
(6,66%) e em sete do grupo controle (23,33%), perfazendo um total de 15%.
Aqui também não houve diferença estatisticamente significante entre os
grupos (p=0,073).
Nenhum dos sessenta animais, de ambos os grupos, apresentaram
sinais de flogose ou hematoma na ferida abdominal.
Dois animais, um de cada grupo (C 7.4 e E14.4) apresentaram
deiscência da pele, porém o restante da parede abdominal permaneceu íntegra
e os animais sobreviveram até a data programada para eutanásia.
4.4 – AVALIAÇÃO PONDERAL
As tabelas 1, 2 e 9 do apêndice exibem a distribuição dos pesos
dos animais nos diferentes subgrupos e períodos.
Todos os animais do grupo experimental apresentaram perda de
peso no período de 48 horas entre a administração do infliximabe e o
procedimento cirúrgico, enquanto que todos os animais do grupo controle
tiveram um ganho ponderal significativo. A comparação entre os dois grupos
foi estatisticamente significativa (p=0,0001)(GRÁFICO 2).
Dos 27 animais do grupo experimental que sobreviveram até as
datas da eutanásia apenas três animais do subgrupo E 14, tiveram ganho
ponderal no período entre o procedimento cirúrgico inicial e a eutanásia. Em
38
29 animais do grupo controle, seis animais do subgrupo C 14 tiveram ganho
de peso no mesmo período. Foi observado também que esta perda ponderal foi
menor nos subgrupos E 14 e C 14, quando comparada com os outros
subgrupos. Não houve diferença de peso estatisticamente significante na
comparação entre os subgrupos (GRÁFICO 3).
GRÁFICO 2 – PESO DOS ANIMAIS (GRUPOS CONTROLE E ESTUDO)
EM g, APÓS ADMINISTRAÇÃO DE INFLIXIMABE OU SOLUÇÃO DE
NaCl A 0,9%.
39
GRÁFICO 3 – PESO DOS ANIMAIS (SUBGRUPOS E3, C3, E7, C7, E14 E
C14) EM g, APÓS OPERAÇÃO.
C3 – Subgrupo Controle sacrificado no 3º DPO
E3 – Subgrupo Estudo sacrificado no 3º DPO
C7 – Subgrupo Controle sacrificado no 7º DPO
E7 – Subgrupo Estudo sacrificado no 7º DPO
C14 – Subgrupo Controle sacrificado no 14º DPO
E14 – Subgrupo Estudo sacrificado no 14º DPO
4.5 – ANÁLISE DA REOPERAÇÃO
A grande maioria dos animais de ambos os grupos apresentaram
aderências, 25 no grupo experimental (83,33%) e 22 no grupo controle
(73,33%), levando a um total de 78,33%. Estas aderências foram
principalmente de epíplon e vesículas seminais. No grupo experimental, além
do número maior de aderências, foi verificado que estas eram mais firmes que
40
as do grupo controle que se desfaziam facilmente com tração. Não houve
diferença estatisticamente significante entre os grupos (p=0,266).
Nenhum dos animais de ambos os grupos apresentaram
hematoma ou sinais de hemorragia intraperitoneal.
Apenas um animal (E 7.1) do grupo experimental, que teve a
morte constatada no 5º DPO, apresentou sinais de peritonite e pequeno
vazamento fecal pela anastomose.
Três animais do grupo experimental tiveram deiscência parcial da
anastomose, com bloqueio por epíplon, sem vazamento de conteúdo fecal e
sem peritonite: E 7.5, E 7.9 e E 14.10, que morreu. Um animal do grupo
controle, C 7.10, que foi encontrado morto, apresentou deiscência parcial de
anastomose, com bloqueio de epíplon, sem vazamento de conteúdo fecal e
sem peritonite.
Nenhum animal de ambos os grupos apresentou obstrução
intestinal mecânica. Entretanto, no grupo experimental, oito animais do
subgrupo E 3, oito do subgrupo E 7 e três do subgrupo E 14, apresentaram
distensão do cólon proximal à anastomose. No grupo controle foi verificada
distensão do cólon proximal à anastomose em oito animais do subgrupo C3,
em cinco do subgrupo C 7 e em um do subgrupo C14. Estes dados
demonstram um prevalência de distensão abdominal nos primeiros dias do
período pós-operatório.
Em quatro ratos do subgrupo C 3 (C3.4, C3.5, C 3.8 e C 3.10) foi
verificado aparente necrose de mucosa colônica no segmento proximal a
anastomose (sero-muscular íntegra), porém sem sinais de deiscência,
vazamento da anastomose ou peritonite. O mesmo achado foi observado no
animal C 7.10 que morreu.
41
4.6 – FORÇA TÊNSIL DA ANASTOMOSE
A resistência tênsil das anastomoses colônicas submetidas ao
teste de força em dinamômetro foi semelhante quando comparados os
subgrupos E3 e C3 (média de 5,09 N x 4,15 N), (p=0,5119). Também, nos
subgrupos E7 e C7 não houve diferença (média de 12,91 N x 13,03 N) com
valor de p sem significância estatística. Comparados os subgrupos E14 e C14,
verificou-se que a força tênsil no subgrupo E14 foi maior (média de 18,58 N)
em relação ao subgrupo C14 (média de 13,74 N) e que esta diferença foi
estatisticamente significante (p=0,0004). Observou-se também que não houve
diferença entre C7 e C14 (TABELA 1 E GRÁFICO 4).
TABELA 1 – FORÇA TÊNSIL EM NEWTON (N) DA ANASTOMOSE
COLÔNICA DE CADA ANIMAL, AFERIDA IMEDIATAMENTE APÓS A
EUTANÁSIA CONFORME OS GRUPOS EXPERIMENTAL (E),
FORMADO PELOS SUBGRUPOS E3, E7, E14, E CONTROLE (C),
FORMADO PELOS SUBGRUPOS C3, C7 e C14.
Grupos
Experimental
Controle
Animal E3 E7 E14
C3 C7 C14
1 0,17 ------- 2,94
0,05 1,02 0,93
2 0,19 1,37 2,92
0,27 0,94 1,33
3 0,39 2,80 1,95
0,07 1,76 1,43
4 0,23 0,88 1,85
0,84 2,06 1,36
5 0,52 0,49 -------
0,43 1,11 2,31
6 1,03 2,94 2,76
0,33 1,47 0,84
7 0,33 1,17 1,96
0,31 1,78 1,35
8 0,51 1,19 2,41
0,43 1,78 1,55
9 1,00 1,27 1,79
1,05 1,11 1,11
10 0,72 0,80 -------
0,37 ------- 1,53
42
GRÁFICO 4 – RESISTÊNCIA TÊNSIL DA ANASTOMOSE.
C3 – Subgrupo Controle sacrificado no 3º DPO
E3 – Subgrupo Estudo sacrificado no 3º DPO
C7 – Subgrupo Controle sacrificado no 7º DPO
E7 – Subgrupo Estudo sacrificado no 7º DPO
C14 – Subgrupo Controle sacrificado no 14º DPO
E14 – Subgrupo Estudo sacrificado no 14º DPO
43
4.7 – HISTOLOGIA
No estudo não se encontraram diferenças estatisticamente
significantes entre os grupos e subgrupos, em nenhuma das variáveis
histológicas avaliadas como: quantidade, disposição e maturação de
fibroblastos, fibrose, abscesso, infiltrado mono e polimorfonuclear,
vascularização e ulceração, de acordo com o teste exato de Fisher (TABELAS
2, 3 , 4, 5, 6, 7 E 8; GRÁFICOS 5 E 6).
TABELA 2 – FREQÜÊNCIAS DA QUANTIDADE DE FIBROBLASTOS.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
0 0 0 0 0 0 0 0 0
+ 1 3 0 1 1 1 2 5
++ 7 6 5 3 6 4 18 13
+++ 2 1 4 5 3 3 9 9
p=1
GRÁFICO 5 – DISPOSIÇÃO DE FIBROBLASTOS.
p=0,5075
C3 – Subgrupo Controle sacrificado no 3º DPO
E3 – Subgrupo Estudo sacrificado no 3º DPO
C7 – Subgrupo Controle sacrificado no 7º DPO
E7 – Subgrupo Estudo sacrificado no 7º DPO
C14 – Subgrupo Controle sacrificado no 14º DPO
E14 – Subgrupo Estudo sacrificado no 14º DPO
Fibro
blastos: disposição
0
2
4
6
8
10
12
Horizontalização
Enovelamento
C3
E3
C7
E7
C14
E14
44
TABELA 3 – FREQÜÊNCIAS DA MATURAÇÃO DE FIBROBLASTOS.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
0 9 8 0 0 0 0 9 8
+ 1 2 4 3 0 0 5 5
++ 0 0 5 5 4 4 9 9
+++ 0 0 0 1 6 4 6 5
p=0,5704
TABELA 4 – FREQÜÊNCIAS DE FIBROSE.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
0 9 9 0 0 0 0 9 9
+ 1 1 5 2 0 0 6 3
++ 0 0 4 6 6 4 10 10
+++ 0 0 0 1 4 4 4 5
p=0,6909
GRÁFICO 6 – PRESENÇA DE ABSCESSO.
Abscesso
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Sim Não
C3
E3
C7
E7
C14
E14
p=0,308
C3 – Subgrupo Controle sacrificado no 3º DPO
E3 – Subgrupo Estudo sacrificado no 3º DPO
C7 – Subgrupo Controle sacrificado no 7º DPO
E7 – Subgrupo Estudo sacrificado no 7º DPO
C14 – Subgrupo Controle sacrificado no 14º DPO
E14 – Subgrupo Estudo sacrificado no 14º DPO
45
TABELA 5 – FREQÜÊNCIAS DE INFILTRADO MONONUCLEAR.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
0 0 0 0 0 0 0 0 0
+ 7 7 6 2 0 0 13 9
++ 3 3 3 7 5 3 11 13
+++ 0 0 0 0 5 5 5 5
p=1
TABELA 6 – FREQÜÊNCIAS DE INFILTRADO POLIMORFONUCLEAR.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
0 0 0 0 0 0 0 0 0
+ 0 1 0 0 5 4 5 5
++ 6 5 6 6 5 4 17 15
+++ 4 4 3 3 0 0 7 7
p=1
TABELA 7 – FREQÜÊNCIAS DE VASCULARIZAÇÃO.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
0 7 5 0 0 0 0 7 5
+ 3 5 2 1 0 0 5 6
++ 0 0 7 6 5 5 12 11
+++ 0 0 0 2 5 3 5 5
p=0,4274
TABELA 8 – FREQÜÊNCIAS DE ULCERAÇÃO.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
0 4 4 3 4 8 7 15 15
+ 3 4 3 3 2 1 8 8
++ 2 2 3 2 0 0 5 4
+++ 1 0 0 0 0 0 1 0
p=0,4925
46
4.8 – MORFOMETRIA E COLÁGENO
Na análise histomorfométrica do colágeno das regiões das
anastomoses e peri-anastomóticas observou-se que a diferença entre as
medianas dos percentuais de pixels foi maior que o esperado pela chance, e foi
estatisticamente significante (p< 0,001) de acordo com o teste de Kruskal-
Wallis. A análise das variâncias (ANOVA) também mostrou médias diferentes
do ponto de vista estatístico (p= 0,0017), assim como variâncias
significativamente diferentes (p=0,0002) pelo teste de Bartlett.
Quando comparado o percentual de pixels entre os subgrupos, de
acordo com o dia da eutanásia, utilizando-se o teste t de Student observou-se
que a diferença das médias de C3 e E3 são estatisticamente significantes
(p=0,0266). Já comparando C7 com E7 e C14 com E14, as diferenças das
médias obtidas não foram estatisticamente significantes (TABELA 9,
GRÀFICO 7 E FIGURAS 21 e 22).
TABELA 9 – MÉDIA, MEDIANA, DESVIO PADRÃO E VARIÂNCIA DA
HISTOMORFOMETRIA DO COLÁGENO DAS ANASTOMOSES
COLÔNICAS, UTILIZANDO-SE A COLORAÇÃO COM PICRO-SIRIUS.
Dia da eutanásia
3º DPO 7º DPO 14º DPO
p=0,0266
p=0,1456 p=0,7015
C3 E3 C7 E7 C14 E14
Média 6,028 4,250 6,463 7,446 7,450 7,837
Percentual
Mediana 4,650 4,150 5,600 6,550 6,500 6,700
de Pixels (%)
Desvio padrão 4,663 2,884 4,483 5,710 4,740 5,097
Variância 21,743 8,317 20,097 32,604 22,467 25,979
47
GRÁFICO 7 – CONCENTRAÇÃO DO COLÁGENO EM PIXELS % À
HISTOMORFOMETRIA.
C3 – Subgrupo Controle sacrificado no 3º DPO
E3 – Subgrupo Estudo sacrificado no 3º DPO
C7 – Subgrupo Controle sacrificado no 7º DPO
E7 – Subgrupo Estudo sacrificado no 7º DPO
C14 – Subgrupo Controle sacrificado no 14º DPO
E14 – Subgrupo Estudo sacrificado no 14º DPO
48
FIGURA 21 – AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA DA
CICATRIZAÇÃO DE ANASTOMOSE COLÔNICA TÉRMINO-
TERMINAL (PICRO-SIRIUS).
C3.7 E3.6
C7.7 E7.10
C14.9 E14.3
49
FIGURA 22 – AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA DAS LÂMINAS
CORADAS PELO PICRO-SIRIUS COM LUZ POLARIZADA. O
COLÁGENO TIPO I TEM COLORAÇÃO ALARANJADA E O TIPO III
ESVERDEADA, SUBGRUPOS E3 E C3.
E3.6
C3.7
50
FIGURA 23 – AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA DAS LÂMINAS
CORADAS PELO PICRO-SIRIUS COM LUZ POLARIZADA. O
COLÁGENO TIPO I TEM COLORAÇÃO ALARANJADA E O TIPO III
ESVERDEADA, SUBGRUPOS E7 E E14.
E7.10
E14.3
51
4.9–TNF-α SÉRICO E TECIDUAL
Os resultados da quantificação do TNF-α no soro dos animais
demonstraram que seus níveis de TNF-α circulantes são normalmente baixos
como demonstrado pelo grupo “referência” (não submetidos a procedimentos
cirúrgicos e administração de infliximabe ou solução de NaCl a ,9%), que
foram utilizados para se estabelecer um valor padrão para o TNF-α em ratos.
Os valores do TNF-α não foram alterados de forma significativa com os
procedimentos cirúrgicos a não ser no subgrupo C3 no qual a elevação da
quantidade de TNF-α foi significante, quando comparada aos demais
subgrupos. Comparado com os animais normais, o grupo E3 não apresentou
produção aumentada de TNF-α, assim como os demais grupos. Comparando
os grupos com o mesmo tempo de pós-operatório, observou-se diferença
estatisticamente significante (p=0,0427) no 3º dia (C3 e E3). Nos demais
subgrupos não se observa diferenças (GRÁFICO 8).
Ao contrário, a produção tecidual de TNF-α avaliada por
imunohistoquímica se manteve semelhante em ambos os subgrupos C3 e E3,
assim como nos demais subgrupos avaliados (C7, E7, C14 e E14). A produção
do TNF-α tecidual foi aparentemente igual e constante para todos os animais
ao longo do estudo (FIGURAS 24, 25 e 26).
52
GRÁFICO 8 – PRODUÇÃO DO TNF-α SÉRICO NOS GRUPOS
CONTROLE, EXPERIMENTAL E “REFERÊNCIA” (pg/mL).
R – Grupo de referência (não manipulados)
C3 – Subgrupo Controle sacrificado no 3º DPO
E3 – Subgrupo Estudo sacrificado no 3º DPO
C7 – Subgrupo Controle sacrificado no 7º DPO
E7 – Subgrupo Estudo sacrificado no 7º DPO
C14 – Subgrupo Controle sacrificado no 14º DPO
E14 – Subgrupo Estudo sacrificado no 14º DPO
FIGURA 24 - IMUNOHISTOQUÍMICA. AUMENTO: 400X. PRESENÇA
DE HISTIÓCITOS PRODUTORES DE TNF-α EM ANIMAIS DO
SUBGRUPO C3.
53
FIGURA 25 - IMUNOHISTOQUÍMICA. AUMENTO: 400X. PRESENÇA
DE HISTIÓCITOS PRODUTORES DE TNF α (SETAS) EM ANIMAL DO
SUBGRUPO E3.
54
FIGURA 26 – PRODUÇÃO TECIDUAL DO TNF-α POR MEIO DE
IMUNOHISTOQUÍMICA EM ANIMAIS DOS SUBGRUPOS C3 E E3.
AUMENTO DE 40X E 400X, DEMONSTRANDO QUE NÃO HOUVE
DIFERENÇA ENTRE OS SUBGRUPOS.
Grupo C3 Grupo E3
40X
400X
55
4.10 – TGF-β TECIDUAL (IMUNOHISTOQUÍMICA)
A produção tecidual de TGF-β através de imunohistoquímica
demonstrou maior produção no subgrupo E14 quando comparado ao subgrupo
C14 (FIGURA 27).
FIGURA 27 – PRODUÇÃO TECIDUAL DO TGF-β POR MEIO DE
IMUNOHISTOQUÍMICA EM ANIMAIS DOS SUBGRUPOS C14 E E14.
AUMENTO 400 X.
C14 E14
5- DISCUSSÃO
57
5- DISCUSSÃO
No presente estudo os parâmetros de avaliação de anastomoses
utilizados foram: evolução clínica dos animais, avaliação do peso corporal,
aspecto da cavidade peritoneal, medida da resistência tênsil da anastomose,
concentração sérica e produção tecidual do TNF-α, avaliação dos achados
operatórios macroscópicos, assim como a avaliação histológica e
histomorfométrica das regiões peri-anastomóticas e das anastomoses. Estes
parâmetros estão em concordância com a literatura pertinente (HENDRIKS &
MASTBOOM, 1990). Previamente foi realizado estudo piloto no qual se
utilizou cinco animais para padronização da técnica cirúrgica e de toda a
metodologia empregada na experimentação.
Apesar de seu pequeno porte, diversos autores têm escolhido o
Rattus norvergicus, linhagem Wistar, como animal de experimentação para
estudo de anastomoses intestinais (JIBORN et al., 1978b; JIBORN et al.,
1978c; OLIVEIRA, 1994; OLIVEIRA, 1995; SIRIMARCO, 2000; HÖER et
al., 2002; REYS, 2004; MANTZOROS et al., 2004; TRIANTAFILLIDIS et
al., 2005; MANTZOROS et al., 2006; ALMEIDA, 2006; FERREIRA et al.,
2006; KONSTANTINIDIS et al., 2006, DE HINGH et al., 2006; PARRA-
MEMBRIVES et al., 2007; ORTIZ et al., 2007; ZACHARAKIS et al., 2007;
KANELLOS et al., 2007). O rato é de fácil padronização quanto à raça, sexo e
peso, além de ter grande resistência a infecções e ter sua anatomia bem
conhecida (LOPES, 2006). Entre outras vantagens, o rato apresenta
praticidade para experimentos que requeiram um grande número de animais
com similaridade genética e fisiológica, baixo custo, grande taxa de fertilidade
e facilidade de manutenção em biotério (HERRMANN et al., 1964).
58
Os animais do grupo estudo, sem exceção, perderam peso nas 48
horas após a administração do infliximabe, enquanto que o oposto ocorreu no
grupo controle, sugerindo toxicidade do infliximabe.
MASTBOOM et al. (1991) relataram que a perda de peso dos
ratos que ocorre no pós-operatório é recuperada ao se alcançar o sétimo dia.
No presente estudo apenas a metade dos animais alcançaram o peso inicial no
14º DPO.
No período pós-operatório ocorreu perda de peso nos grupos
estudo e controle, sem diferença estatisticamente significante no terceiro,
sétimo ou décimo quarto DPO, o que condiz com a literatura. Observa-se
perda de peso inicial, sendo recuperada em seguida, atingindo níveis próximos
dos iniciais com o decorrer da pesquisa, e que esta perda deve estar
relacionada ao estresse cirúrgico (HERMANN et al., 1964; SIRIMARCO,
2000; REYS, 2004; ALMEIDA, 2006). No presente estudo a perda de peso
inicial também foi imputada à toxicidade do infliximabe logo após sua
administração.
Os períodos programados para a reoperação e eutanásia dos
animais foram fundamentadas no estudo de HERRMANN et al. (1964) em
que foi pesquisado a cicatrização de anastomoses colônicas em duzentos e
vinte ratos, sacrificados a intervalos desde três horas até um ano após a
operação, e submetidos a avaliações histológicas. Os eventos histológicos do
processo cicatricial apresentaram três fases justapostas: exudativa ou de
resposta inflamatória aguda (zero a quatro dias); proliferativa ou de fibroplasia
(3 a 14 dias); e de remodelagem ou de maturidade do colágeno (10 a 180 dias
ou mais). Desta forma as datas de reoperação representaram as três fases
descritas acima.
59
A cicatrização da anastomose colônica é semelhante à que ocorre
em outros órgãos, diferindo apenas no que tange ao colágeno. Estudos têm
demonstrado que nas primeiras 48 horas ocorre diminuição da ordem de 72%
na força de ruptura dessas anastomoses devido ao desequilíbrio entre a síntese
e lise do colágeno nos primeiros três dias da cicatrização (HAWLEY, 1973;
IRVIN & HUNT, 1974; RAVO et al., 1988; CAHILL et al., 2004). O
metabolismo do colágeno parece não ser idêntico na pele e na parede intestinal
(KLEIN & CHANDRARAJAN, 1977; SOUSA, 1989; HÖER, et al., 2002;
CAHILL et al., 2004).
No estudo da força tênsil das anastomoses no terceiro e sétimo
DPO ambos os grupos obtiveram resultados semelhantes, porém a resistência
tênsil das anastomoses do subgrupo E 14 foi maior, sugerindo que o
infliximabe pode aumentar a resistência tênsil das anastomoses no período
remodelagem ou maturação do colágeno (10 a 180 dias). Estudo recente de
STREIT et al. (2006) em humanos, sugere melhora na cicatrização de feridas
crônicas com o uso tópico do infliximabe.
No presente estudo, a produção tecidual de TGF-β, uma proteína
envolvida no desenvolvimento de fibrose (SIQUEIRA JR. & DANTAS,
2000), foi mensurada através de imunohistoquímica e corroborou os
resultados da avaliação da resistência tênsil entre os subgrupos C14 e E14
sugerindo um efeito positivo do infliximabe na fase de remodelagem ou
maturação do colágeno.
A infecção peritoneal contribui para a deiscência de anastomoses
por favorecer a inflamação e por alterar o metabolismo do colágeno
(SCHROCK et al., 1973 IRVIN, 1976; BALLANTYNE, 1984; OLIVEIRA,
1995; ISBISTER, 2001; STUMPF et al., 2006; PLATELL et al., 2007;
KANELLOS et al., 2007). A produção da enzima colagenase encontra-se
60
aumentada na vigência de infecção, levando à degradação e diminuição do
colágeno no intestino, retardando a cicatrização e propiciando a deiscência da
sutura (HAWLEY, 1973; HESP et al., 1984; CLARK, et al., 2000). Estudos
têm demonstrado níveis circulantes elevados do TNF-α em associação a
infecção da cavidade peritoneal e que a cicatrização na vigência de peritonite,
depende de um balanço de citocinas pró-inflamatórias e antiinflamatórias
(MARTINEAU & SHEK, 2000; RICHE et al., 2000; CLARK, et al., 2000;
KHALILI et al., 2001; YAMAMOTO et al., 2005a; YAMAMOTO et al.,
2005b).
Alterações na qualidade e quantidade do colágeno presente no
intestino, sobretudo na camada submucosa, influenciam de forma substancial
na integridade da anastomose. O colágeno não é uma proteína inerte, pois está
em constante equilíbrio entre lise e síntese. A diminuição da quantidade de
colágeno pode ocorrer tanto por aumento na lise, quanto por diminuição da
síntese protéica (HAWLEY, 1973; SIRIMARCO, 2000; STUMPF et al.,
2004; DE HINGH et al., 2006).
É importante a especificação do local das anastomoses, uma vez
que podem ocorrer diferenças de cicatrização ao longo do trato digestório. No
intestino grosso do rato, além dos aspectos histológicos serem diversificados,
a concentração e o metabolismo do colágeno mostram-se variáveis nos
diferentes segmentos (JIBORN et al., 1978a, JIBORN et al., 1980). Em
coelhos a atividade da colagenase varia ao longo do trato gastrintestinal após
anastomoses colônicas (HAWLEY et al., 1970). Tendo em vista estes estudos
prévios, as ressecções e anastomoses foram realizadas em segmento colônico
distal, padronizado pela distância fixa em relação à reflexão peritoneal, para
que não ocorressem erros de interpretação de resultados (SIRIMARCO,
61
2000). No nosso estudo a anastomose foi padronizada a 2,5 cm da reflexão
peritoneal.
O rigor técnico, a manipulação adequada dos tecidos, hemostasia
e a utilização de materiais de suturas apropriados, diminuem a incidência de
deiscência da anastomose intestinal (IRVIN et al., 1976; SCHROCK et al.,
1973; WANINGER et al., 1992; BURCH et al., 2000; REYS, 2004;
PLATELL, 2007). Alguns pesquisadores têm realizado anastomoses colônicas
em murinos com pontos separados invertidos, em plano único, com bons
resultados (CALI et al., 1993; OLIVEIRA, 1995; EUBANKS et al. 1997). No
entanto a literatura mostra relatos de excelentes resultados com anastomoses
colônicas em ratos, empregando-se sutura contínua em plano único
(HERRMANN et al., 1964; HOUDART et al., 1985; SIRIMARCO, 2000;
REYS, 2004; ALMEIDA, 2006). Esse método tem a vantagem de ser simples,
rápido e econômico, promovendo impermeabilidade e pouca reação
inflamatória tecidual, o que o torna tão seguro quanto aquele realizado em um
plano com pontos separados (ROCHA, 1989, BURCH et al., 2000).
O sucesso da anastomose tem na fase inicial da cicatrização um
momento crítico, pois a sua integridade nos primeiros dias depende da
capacidade da sutura em manter a tensão na anastomose, responsabilidade esta
que é aos poucos substituída pelos próprios tecidos da alça anastomosada
(BURCH et al., 2000; ALMEIDA, 2006).
A confecção das anastomoses com sutura contínua em plano
único mostrou-se eficaz também no presente estudo, com a utilização de fio
inabsorvível monofilamentar (polipropileno 6-0) para a confecção das
anastomoses cólicas. As qualidades que favorecem alguns materiais de sutura
na utilização em anastomoses intestinais são: manter a força de tensão por
longo prazo, que exclua a falha da sutura como possível causa de deiscência
62
até que a integridade da anastomose tenha sido garantida pelo processo de
cicatrização; causar reação tecidual mínima; não favorecer a infecção (KATZ
et al., 1981; BURCH et al., 2000; HÖER et al., 2002; STUMPF et al, 2005).
Portanto, os fios monofilamentares, tanto absorvíveis sintéticos, polidioxanona
ou poliglecaprone, quanto inabsorvíveis, polipropileno ou poliamida (náilon),
aproximam-se mais do material ideal no sentido de promover a cicatrização
adequada da anastomose intestinal com sutura manual (KHOURY &
WAXMAN, 1983; REYS, 2004; GARCIA-OSOGOBIO et al., 2006).
No estudo de anastomoses intestinais os métodos utilizados têm
sido clínicos, radiológicos, mecânicos, bioquímicos e histológicos (ROCHA,
1989; OLIVEIRA, 1989; SOUSA, 1989; SOUSA 1994; OLIVEIRA 1995;
SIRIMARCO, 2000; BURCH et al., 2000; ISBISTER, 2001; REYS, 2004;
OLAISON, 2004; ALMEIDA, 2006; PLATELL et al., 2007). No presente
estudo foram utilizou-se métodos clínicos, mecânicos, imunológicos e
histológicos.
HENDRIKS & MASTBOOM (1990) na discussão sobre
parâmetros de cicatrização em anastomoses intestinais experimentais não
relacionam a evolução clínica como critério de avaliação, mas o índice de
deiscência das anastomoses tem importância crucial por tratar-se na prática
médica, da complicação mais grave de uma anastomose pela sua associação
com altas taxas de morbidade e mortalidade (SOUSA, 1994).
No presente estudo só houve um caso de deiscência, com
vazamento para a cavidade peritoneal, de um animal do grupo estudo, que
morreu no 5º DPO. Outros três animais no grupo estudo e um animal no grupo
controle apresentaram deiscência parcial, bloqueada por epíplon, sem
repercussão clínica e sem relação com o uso do infliximabe.
63
Variados fármacos como determinados antimicrobianos,
quimioterápicos, imunomoduladores, corticosteróides e antiinflamatórios não
hormonais foram descritos como prejudiciais à cicatrização de feridas e
anastomoses. Os corticosteróides diminuem a resistência à tensão, a taxa de
epitelização, a neovascularização, e também inibem intensamente a contração
da ferida. Além disto, os corticosteróides suprimem o sistema imune, que
torna as feridas suscetíveis à infecção (EHLRICH & HUNT, 1969;
STEPHENS et al., 1971; OLAISON, 2004; MANTZOROS et al., 2004;
MANTZOROS et al., 2006). O uso pré-operatório de corticosteróides em
pacientes com doença inflamatória intestinal submetidos à cirurgia eletiva dos
intestinos foi associada a risco aumentado de complicações infecciosas pós-
operatórias (ABERRA et al., 2003).
De modo similar, drogas antiinflamatórias não hormonais causam
vaso constrição, suprimem a resposta inflamatória, diminuem a síntese de
colágeno e reduzem a resistência à tensão e a contração da ferida. Essas
drogas também interferem na migração leucocitária para a ferida, causando
suscetibilidade maior à infecção. Medicamentos antineoplásicos e
imunossupressores podem prejudicar a produção de fibroblastos, resultando
em resistência à tensão diminuída (GOGIA, 2003; KANELLOS et al., 2007),
entretanto algumas drogas antineoplásicas como a capecitabine, um precursor
do 5-fluorouracil, não demonstrou nenhum impacto negativo na cicatrização
de anastomoses colônicas em ratos (KONSTANTINIDIS et al., 2006).
Apesar de seu pequeno efeito em culturas de células humanas
normais, o TNF-α aparenta ser tóxico ao endotélio vascular. Outras ações
incluem estímulo ao crescimento de fibroblastos, de outras linhagens
celulares, ativação de neutrófilos polimorfonucleares, indução da IL1,
Prostaglandina E2 e produção de colagenase (MARGETTS et al., 2002;
64
BIOMYX TECHNOLOGY, 2007). Teoricamente, estimulando o crescimento
de fibroblastos o TNF-α estaria promovendo ou melhorando a cicatrização,
mas ao mesmo tempo, quando aumenta a produção de colagenase estaria
prejudicando a cicatrização.
O TNF-α induz expressão da citocina promotora da angiogênese,
o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), a um aumento da
expressão da citocina pró-fibrótica, o fator de crescimento transformante -
beta (TGF-β), e expressão da fibronectina, além de promover deposição de
colágeno nos tecidos peritoneais (MARGETTS et al., 2002).
As citocinas Th1(linfócito T auxiliar – resposta imunológica
voltada para ativação de macrófagos), tais como o interferon (IFN)-γ, a
Interleucina (IL)-2 e o TNF-α, estão freqüentemente elevadas na mucosa de
pacientes com doença de Crohn e outras doenças inflamatórias crônicas. O
TNF-α não é formalmente considerado uma citocina Th1 por ser
habitualmente uma citocina derivada de macrófago, mas as evidências
sugerem que as células T são uma importante fonte de TNF-α na lâmina
própria. Na doença de Crohn, biópsias obtidas da região da anastomose nos
primeiros três meses após cirurgia revelam um padrão de citocinas com
predomínio de Th2 (linfócito T auxiliar – resposta imunológica voltada para
produção de anticorpos) em vez da inflamação de Th1 na doença de Crohn
estabelecida. Outras citocinas podem influenciar a cascata inflamatória em
diferentes momentos (ABREU, 2003).
Para alguns autores o TNF-α adquiriu uma conotação negativa.
Contudo, na concentração apropriada, é um potencializador de vários
processos biológicos como a hematopoiese e angiogênese (MOONEY et al.,
1990; CLARK et al., 2000). Quando localmente aplicado a ferimentos,
demonstrou-se estimulação da angiogênese e aumento da força de ruptura
65
(MOONEY et al., 1990) ou de deposição de hidroxiprolina (REGAN et al.,
1993). Já outros estudos não demonstraram alterações (STEENFOS, et al.,
1989) ou relataram redução da força de ruptura e diminuição do gene de
expressão do colágeno (SALOMON et al., 1991). Este último estudo é
corroborado por uma pesquisa envolvendo camundongos com a produção de
TNF-α prejudicada, nos quais se obteve aumento significativo da força de
ruptura em associação a um aumento na produção de colágeno e da transcrição
do gene procolágeno (BETTINGER, et al., 1994).
Pacientes submetidos a bloqueio sistêmico do TNF-α, por
receberem tratamento com anticorpo monoclonal anti TNF-α, dentro de 12
horas do diagnóstico de sépse, não apresentaram alteração na deposição de
colágeno (CLARK, et al., 1998).
A produção de mediadores pró-inflamtórios pelo cólon
seccionado, como o TNF-α, interleucinas, ecosanóides entre outros podem
ocasionar efeitos não só no local da lesão, como em outros tecidos e órgãos a
distância. Estes fatores pró-inflamatórios em excesso, podem inclusive
contribuir para a síndrome de disfunção de múltiplos órgãos (CLARK et al.,
2000).
Na doença de Crohn o tratamento de pacientes com infliximabe
foi associado com redução substancial do marcador inflamatório sérico
comumente elevado, a proteína C reativa. Células mononucleares de sangue
periférico (CMSP) de pacientes tratados com infliximabe não apresentaram
diminuição das respostas proliferativas em resposta a estímulos em
comparação com pacientes não tratados; não foram observadas alterações
substanciais na produção de citocinas pelas CMSP estimuladas depois do
tratamento com infliximabe. A análise de células da lâmina própria obtidas
por biópsia da mucosa intestinal mostrou que o tratamento com infliximabe
66
provoca redução do número de células capazes de expressar o TNF-α e a
interferona gama. Estudos histológicos adicionais forneceram evidência que o
tratamento com infliximabe reduz a infiltração de células inflamatórias em
áreas afetadas do intestino e a presença de marcadores inflamatórios nesses
sítios (GUIA DE ADMINISTRAÇÃO-REMICADE
®
). Em nosso estudo os
resultados obtidos não demonstraram diferenças entre os grupos na avaliação
do parâmetro infiltrado inflamatório.
A avaliação histológica de biópsias de cólon obtidas em humanos,
antes e quatro semanas após administração de infliximabe, revelou redução
substancial de TNF-α detectável (YAMAMOTO et al., 2005a).
No presente estudo, ao contrário, a produção tecidual de TNF-α
se manteve constante e igual no 3º dia pós-operatório em ambos os subgrupos
C3 e E3, assim como nos demais subgrupos avaliados (C7, E7, C14 e E14). A
produção do TNF-α tecidual foi aparentemente igual e constante para todos os
animais ao longo do estudo. O resultado do estudo imunohistoquímico sugere
que o infliximabe não alterou de forma significativa a produção tecidual do
TNF-α. Ao contrário, estudo de TRINTAFILLIDIS et al (2005), obteve uma
diminuição do TNF-α tecidual em ratos com colite induzida, tratados com
infliximabe.
Estudos sugerem que o infliximabe pré-operatório não foi
associado a aumento de complicações pós-operatórias precoces após cirurgia
abdominal eletiva para doença de Crohn (COLOMBEL et al., 2004) e que, na
verdade, citocinas antiinflamatórias podem melhorar a cicatrização
bloqueando a liberação do TNF-α (TAY et al., 2003).
O Picro-Sirius é um corante aniônico forte, que age por reação de
seu grupamento ácido sulfônico com grupamentos básicos presentes na
molécula do colágeno. Suas moléculas alongadas são fixadas paralelamente às
67
fibras do colágeno. Esta relação de paralelismo entre as moléculas do corante
e do colágeno resulta em um aumento de sua birrefringência podendo,
portanto, ser considerado um corante específico para colágeno. A análise
histomorfométrica tem a vantagem de quantificar e inclusive analisar
qualitativamente os subtipos de colágenos presentes no reparo cicatricial,
utilizando-se luz polarizada (por filtro ótico específico) devido às diferenças
características de birrefringência entre os colágenos tipos I e III
(JUNQUEIRA et al.,1979; JUNQUEIRA et al.,1982; MONTES &
JUNQUEIRA, 1991; REYS, 2004).
Na avaliação histológica, no presente estudo, não foram
encontradas diferenças significativas entre os grupos estudo e controle e entre
os subgrupos. Na avaliação histomorfométrica do colágeno, em lâminas
coradas pelo Picro-Sirius, através de análise (quantitativa e qualitativa) por
imagem digitalizada e software específico (Image J), houve diferenças
estatisticamente significantes quando comparados os animais dos subgrupos
E3 e E14. Entretanto quando comparado o subgrupo C14 com o E 14 não foi
observada diferença estatisticamente significante que pudesse inclusive
corroborar os resultados da avaliação pelo teste de resistência tênsil.
Em uma revisão sistemática examinando o uso de
imunomoduladores e os riscos de complicações pós-operatórias em pacientes
com doença inflamatória intestinal submetidos à cirurgia abdominal, concluiu-
se que, no momento, não existe evidência de aumento da taxa de complicações
pós-operatórias associadas ao uso de imunomoduladores (SUBRAMANIAN
et al., 2006). O tratamento com imunomodulador (infliximabe) perioperatório,
melhorou de forma significativa os resultados de pacientes com doença de
Crohn submetidos à ressecção e anastomose (TAY et al., 2003). Alguns
68
autores consideram como uma indicação potencial o uso do infliximabe no
pré-operatório de pacientes com doença de Crohn (SIPAHI, 2004).
Apesar de o infliximabe, um anticorpo monoclonal quimérico,
produto de engenharia genética, ser constituído por frações humanas (maioria)
e de camundongo, interferiu na concentração sérica do TNF-α em ratos, como
demonstrado no resultado verificado ao se comparar os subgrupos C3 e E3
com o grupo referência. A administração do infliximabe diminuiu no 3º dia
pós-operatório os valores do TNF-α sérico, que deveriam estar aumentados
com o estímulo cirúrgico.
Neste estudo os resultados da quantificação do TNF-α no soro
dos animais demonstraram que os níveis de TNF-α circulante são
normalmente baixos como demonstrado pelo grupo “referência” (não
submetidos a procedimentos cirúrgicos ou a administração de fármacos), que
foram utilizados para se estabelecer um valor de referência para o TNF-α em
ratos. Os valores do TNF-α não foram alterados de forma significativa com os
procedimentos cirúrgicos a não ser no subgrupo C3 no qual a elevação sérica
de TNF-α foi estatisticamente significante, sugerindo que a agressão cirúrgica
eleva o TNF-α nos pós-operatório precoce, porém por volta do 7º DPO estes
valores estão semelhantes ao do grupo “referência”. Também não houve
alterações significativas dos valores no grupo estudo (E). Os resultados da
comparação entre os subgrupos C3 e E3 foram estatisticamente significantes,
sugerindo um efeito do infliximabe sobre o TNF-α em ratos na fase
inflamatória da cicatrização.
Apesar de atualmente não existir nenhuma prova definitiva de
ligação entre a terapia com infliximabe e câncer, foi descrito na literatura um
caso de carcinoma anorretal após terapia com infliximabe na doença de Crohn,
deixando dúvidas quanto ao aumento na incidência de câncer em pacientes
69
tratados com infliximabe (MELICHAR et al., 2006). Outros autores relatam
associação da terapia com infiximabe com linfoma, sepses e óbito.
Em um estudo de tratamento de doença de Crohn em duas coortes
feitas no Massachusetts General Hospital em Boston, EUA, os autores
concluíram que apesar do risco aumentado de linfoma e morte associados ao
uso do infliximabe, a melhora clínica substancial e um menor número de
operações como resultado do tratamento com infliximabe resultaram em
aumento da qualidade de vida e que em pacientes selecionados, os benefícios
do infliximabe são muito maiores que os riscos, justificando o seu uso
(SIEGEL et al., 2006).
Em recente revisão sobre o uso do infliximabe no tratamento da
retocolite ulcerativa, verificou-se que o infliximabe foi efetivo induzindo a
remissão como resposta clínica, promovendo cicatrização e diminuindo o
número de colectomias, pelo menos em curto prazo. Efeitos adversos
atribuídos ao infliximabe não foram comuns nos estudos incluídos na revisão
(LAWSON et al., 2006). No presente estudo não observamos reações
anafiláticas ou eventos sépticos.
O guia de administração do infliximabe preconiza a
administração através de infusão endovenosa em doses que variam de 1 a 20
mg/kg de peso. Na doença de Crohn, atualmente a maior indicação para o uso
do infliximabe, a dose recomendada é de 5 mg/kg de peso. A administração
por infusão endovenosa do infliximabe pode apresentar efeitos indesejáveis.
Em estudos clínicos, 19% dos pacientes tratados com infliximabe em
comparação com 8% dos pacientes tratados com placebo apresentaram efeito
relacionado à infusão durante a infusão ou nas 2 horas de pós-infusão.
Aproximadamente 3% das infusões foram acompanhadas de sintomas
inespecíficos como febre e calafrios, 0,7% de prurido ou urticária, 1% por
70
reações cardiopulmonares (dor torácica primária, hipotensão, hipertensão ou
dispnéia) e 0,1% por sintomas combinados ou prurido/urticária e reações
cardiopulmonares. A interrupção do tratamento ocorreu em 0,3% dos
pacientes e todos se recuperaram, com ou sem terapia clínica (GUIA DE
ADMINISTRAÇÃO – REMICADE
®
).
Vias alternativas de administração do infliximabe vêm sendo
estudadas e existem estudos demonstrando que a administração subcutânea do
infliximabe reduz os níveis de atividade inflamatória do intestino grosso de
ratos com colite química, bem como o TNF-α tecidual, tendo os melhores
resultados quando administrados na dose de 5 mg/kg de peso
(TRINTAFILLIDIS et al., 2005). Um estudo fase I, para avaliação da
segurança, resposta clínica, e farmacocinética de uma formulação
experimental do infliximabe para administração subcutânea ou intramuscular
concluiu que esta formulação foi bem tolerada e foi associada a uma resposta
favorável (WESTHOVENS et al., 2006).
A administração subcutânea do infliximabe foi bem tolerada
pelos animais neste estudo. Optamos por esta via baseado nos trabalhos de
TRIANTAFILLIDIS (2005) e WESTHOVENS (2006) descritos acima, face
às dificuldades em se administrar o infliximabe por infusão venosa prolongada
em ratos, o que poderia requerer procedimento anestésico ou de sedação do
animal. Entendemos que a apatia observada em alguns e a perda ponderal
observada em todos os animais do grupo experimental tem relação com a
droga e não com a via de administração e que a via subcutânea pode ser uma
excelente alternativa.
No estudo, a mortalidade foi de 10% no grupo experimental e 3,3% no
grupo controle, perfazendo uma mortalidade global de 6,66% e está de acordo
com a literatura pertinente que relata taxas de mortalidade entre 0 a 11,4%,
71
por diversos motivos, desde os efeitos diretos das drogas utilizadas, como a
toxicidade, até a deiscência da anastomose, a peritonite e as intercorrências
anestésicas (MASTBOOM et al., 1991; EUBANKS et al., 1997;
SIRIMARCO, 2000; ALMEIDA, 2006).
Novas pesquisas são necessárias para a confirmação destes
resultados obtidos neste estudo experimental.
6-CONCLUSÃO
73
6-CONCLUSÃO
Nas condições e forma em que foi realizado o presente estudo, o
infliximabe interferiu na fase inflamatória, caracterizando-se por redução na
concentração de colágeno e melhorou a resistência tênsil das anastomoses na
fase de remodelação.
7-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
75
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14.
APÊNDICES
95
TABELA 1 – PESO PRÉ-OPERATÓRIO, PESO NO DIA DA OPERAÇÃO, PESO NO DIA DA EUTANÁSIA, EVOLUÇÃO CLÍNICA APÓS
ADMINISTRAÇÃO DO INFLIXIMABE E RESISTÊNCIA TÊNSIL DA ANASTOMOSE E DOSAGEM QUANTITATIVA DO TNF-α.
Animal Peso
inicial
Infliximabe 5mg/kg
(ml)
Evolução Peso na
operação
Peso
na
re-operação
Resistência tênsil (N)
Anastomose
Dosagem quantitativa
do TNF-α (ng/mL)
E 3.1 347 1,75 s/ alterações 337 279 0,17 0,005
E 3.2 368 1,85 s/ alterações 358 340 0,19 0,007
E 3.3 317 1,60 s/ alterações 309 280 0,39 0,010
E 3.4 349 1,75 eriçamento 336 306 0,23 0,048
E 3.5 363 1,80 s/ alterações 350 320 0,52 0,009
E 3.6 348 1,75 apatia 336 313 1,03 0,009/0,072
E 3.7 357 1,80 s/ alterações 352 337 0,33 0,013
E 3.8 390 1,90 s/ alterações 379 358 0,51 0,002/0,002
E 3.9 334 1,65 s/ alterações 330 293 1,00 0,017/0,025
E 3.10 358 1,80 s/ alterações 345 294 0,72 0,007/0,007
E 7.1 381 1,90 s/ alterações 379 ------ ------- -------
E 7.2 364 1,80 s/ alterações 358 312 1,37 0,041
E 7.3 328 1,65 apatia 317 277 2,80 0,025
E 7.4 355 1,75 s/ alterações 351 300 0,88 0,003/0,004
E 7.5 338 1,70 s/ alterações 332 284 0,49 0,017
E 7.6 326 1,65 agitação 316 269 2,94 0,023/0,011
E 7.7 295 1,45 s/ alterações 292 256 1,17 0,013/0,174
E 7.8 335 1,70 s/ alterações 328 267 1,19 0,007/0,004
E 7.9 336 1,70 s/ alterações 329 272 1,27 0,006/0,024
E 7.10 324 1,60 s/ alterações 313 264 0,80 0,006/0,009
E 14.1 326 1,65 s/ alterações 318 290 2,94 0,009
E 14.2 320 1,60 s/ alterações 309 312 2,92 0,087
E 14.3 351 1,75 apatia 345 303 1,95 0,025/0,002
E 14.4 306 1,55 s/ alterações 300 250 1,85 0,005/0,006
E 14.5 344 1,70 s/ alterações 335 ------ ------- -------
E 14.6 360 1,80 s/ alterações 348 364 2,76 0,014/0,008
E 14.7 325 1,65 s/ alterações 318 337 1,96 0,004/0,057
E 14.8 357 1,80 s/ alterações 347 366 2,41 0,016/0,008
E 14.9 345 1,75 s/ alterações 335 338 1,79 0,007/0,029
E14.10 354 1,75 eriçamento 347 ------ ------- -------
96
TABELA 2 – PESO PRÉ-OPERATÓRIO, PESO NO DIA DA OPERAÇÃO, PESO NO DIA DA EUTANÁSIA, EVOLUÇÃO CLÍNICA APÓS
ADMINISTRAÇÃO DA SOLUÇÃO DE NaCl 0,9% E RESISTÊNCIA TÊNSIL DA ANASTOMOSE E DOSAGEM QUANTITATIVA DO TNF-α.
Animal Peso
inicial
Solução de NaCl
0,9% (ml)
Evolução Peso na
operação
Peso
na
re-operação
Resistência tênsil (N)
Anastomose
Dosagem quantitativa
do TNF-α (ng/mL)
C 3.1 215 1,10 s/ alterações 225 199 0,05 0,084
C 3.2 221 1,10 s/ alterações 238 202 0,27 0,017
C 3.3 238 1,20 s/ alterações 255 213 0,07 0,026
C 3.4 338 1,70 s/ alterações 352 326 0,84 0,319
C 3.5 338 1,70 s/ alterações 346 296 0,43 0,009
C 3.6 380 1,90 s/ alterações 393 341 0,33 0,005
C 3.7 219 1,10 s/ alterações 231 220 0,31 0,007
C 3.8 350 1,75 s/ alterações 359 310 0,43 0,024
C 3.9 384 1,90 s/ alterações 397 332 1,05 0,085
C 3.10 380 1,90 s/ alterações 391 338 0,37 0,023
C 7.1 334 1,65 s/ alterações 346 285 1,02 0,024
C 7.2 325 1,65 s/ alterações 336 245 0,94 0,496
C 7.3 378 1,90 s/ alterações 391 330 1,76 0,007
C 7.4 390 1,95 s/ alterações 400 310 2,06 0,007
C 7.5 359 1,80 s/ alterações 368 334 1,11 0,006
C 7.6 370 1,85 s/ alterações 383 296 1,47 0,132
C 7.7 352 1,75 s/ alterações 354 307 1,78 0,023
C 7.8 351 1,75 s/ alterações 372 306 1,78 0,007
C 7.9 356 1,80 s/ alterações 371 300 1,11 0,004
C 7.10 370 1,85 s/ alterações 382 ------ ------- -------
C 14.1 350 1,75 s/ alterações 355 341 0,93 0,053
C 14.2 347 1,75 s/ alterações 358 333 1,33 0,011
C 14.3 238 1,20 s/ alterações 246 283 1,43 0,004
C 14.4 222 1,10 s/ alterações 233 257 1,36 0,005
C 14.5 339 1,70 s/ alterações 352 410 2,31 0,015
C 14.6 334 1,65 s/ alterações 337 331 0,84 0,021
C 14.7 365 1,80 s/ alterações 379 384 1,35 0,009
C 14.8 244
328
1,20 s/ alterações 256 291 1,55 0,004
C 14.9 1,65 s/ alterações 336 306 1,11 0,077
C14,10 255 1,30 s/ alterações 262 313 1,53 0,005
97
TABELA 3 – EVOLUÇÃO CLÍNICA PÓS-OPERATÓRIA (GRUPO ESTUDO).
Animal Apatia Eriçamento
de pelos
Distensão
abdominal
Diarréia Hematoma Flogose Deiscência de
parede
E 3.1 ++ + + 0 0 0 0
E 3.2 0 0 0 0 0 0 0
E 3.3 0 0 + 0 0 0 0
E 3.4 + 0 + 0 0 0 0
E 3.5 + + 0 0 0 0 0
E 3.6 0 0 + 0 0 0 0
E 3.7 0 0 0 0 0 0 0
E 3.8 0 0 0 0 0 0 0
E 3.9 + 0 + 0 0 0 0
E 3.10 0 0 0 0 0 0 0
E 7.1
++ ++ + + 0 0 0
E 7.2 0 + 0 0 0 0 0
E 7.3 0 0 0 0 0 0 0
E 7.4 0 0 0 0 0 0 0
E 7.5 + + ++ 0 0 0 0
E 7.6 0 0 0 0 0 0 0
E 7.7 0 0 0 0 0 0 0
E 7.8 0 0 0 0 0 0 0
E 7.9 + + ++ 0 0 0 0
E 7.10 0 0 0 0 0 0 0
E 14.1 0 0 + 0 0 0 0
E 14.2 + + 0 0 0 0 0
E 14.3 0 0 0 0 0 0 0
E 14.4 0 0 +++ ++ 0 0 +++ (pele)
E 14.5
++ +++ + 0 0 0 0
E 14.6 0 0 0 0 0 0 0
E 14.7 0 0 0 0 0 0 0
E 14.8 0 0 0 0 0 0 0
E 14.9 0 0 + 0 0 0 0
E14.10
+++ ++ + 0 0 0 0
98
TABELA 4 – EVOLUÇÃO CLÍNICA PÓS-OPERATÓRIA (GRUPO CONTROLE).
Animal Apatia Eriçamento
de pelos
Distensão
abdominal
Diarréia Hematoma Flogose Deiscência de
parede
C 3.1 0 + 0 + 0 0 0
C 3.2 + 0 + 0 0 0 0
C 3.3 + 0 + 0 0 0 0
C 3.4 0 0 + 0 0 0 0
C 3.5 0 + + 0 0 0 0
C 3.6 0 0 0 0 0 0 0
C 3.7 + 0 0 0 0 0 0
C 3.8 0 0 + 0 0 0 0
C 3.9 0 0 0 + 0 0 0
C 3.10 0 0 + 0 0 0 0
C 7.1 0
++
0 0 0 0 0
C 7.2 + + 0 ++ 0 0 0
C 7.3 0 0 + 0 0 0 0
C 7.4 0 0 0 + 0 0 +++ (pele)
C 7.5 0 + +++ 0 0 0 0
C 7.6 0 0 0 0 0 0 0
C 7.7 0 0 0 0 0 0 0
C 7.8 0 0 + 0 0 0 0
C 7.9 0 + 0 + 0 0 0
C 7.10
++
0
0 0 0 0 0
C 14.1 + 0 + 0 0 0 0
C 14.2 0 + 0 0 0 0 0
C 14.3 0 0 0 0 0 0 0
C 14.4 0 0 0 0 0 0 0
C 14.5 0
+++
0 0 0 0 0
C 14.6 + 0 0 0 0 0 0
C 14.7 0 0 0 0 0 0 0
C 14.8 0 0 0 + 0 0 0
C 14.9 + 0 + 0 0 0 0
C14,10 0
++
0 + 0 0 0
99
TABELA 5 – AVALIAÇÃO DOS ACHADOS CIRÚRGICOS NA RE-OPERAÇÃO (GRUPO ESTUDO).
Animal Aderência Hematoma Abscesso Análise operatória Obstrução intestinal Deiscência da anastomose
E 3.1 ++ 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 3.2 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 3.3 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 3.4 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 3.5 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 3.6 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 3.7 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 3.8 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 3.9 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 3.10 0 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 7.1
++ 0 0 peritonite fecal s/ obstrução vazamento
E 7.2 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 7.3 ++ 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 7.4 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 7.5 +++ 0 0 s/ peritonite s/ obstrução bloqueio epiplon
E 7.6 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 7.7 ++ 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 7.8 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 7.9 ++ 0 0 s/ peritonite s/ obstrução bloqueio epiplon
E 7.10 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 14.1 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 14.2 ++ 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 14.3 0 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 14.4 ++ 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 14.5
++ 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 14.6 0 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 14.7 0 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 14.8 0 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E 14.9 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
E14.10
++ 0 0 s/ peritonite s/ obstrução bloqueio epiplon
100
TABELA 6 – AVALIAÇÃO DOS ACHADOS CIRÚRGICOS NA RE-OPERAÇÃO (GRUPO CONTROLE).
Animal Aderência Hematoma Abscesso Análise operatória Obstrução intestinal Deiscência da anastomose
C 3.1 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 3.2 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 3.3 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 3.4 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
*
C 3.5 0 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
*
C 3.6 0 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 3.7 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 3.8 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
*
C 3.9 0 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 3.10 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
*
C 7.1 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 7.2 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 7.3 ++ 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 7.4 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 7.5 ++ 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 7.6 +++ 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 7.7 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 7.8 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 7.9 0 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 7.10
+++ 0 0 s/ peritonite s/ obstrução bloqueio epiplon
C 14.1 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 14.2 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 14.3 0 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 14.4 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 14.5 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 14.6 0 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 14.7 0 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 14.8 0 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C 14.9 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
C14.10 + 0 0 s/ peritonite s/ obstrução s/ vazamento
*Necrose de mucosa perianastomótica proximal
101
TABELA 7 – PARÂMETROS HISTOLÓGICOS ANALISADOS (GRUPO ESTUDO).
Animal Fibroblastos
quantidade
Fibroblastos
disposição
Fibroblastos
maturação
Fibrose Abscesso Infiltrado
mononuclear
Infiltrado
polimorfonuclear
Vascularização Ulceração
E 3.1 ++ enov + 0 S + ++ 0 0
E 3.2 + enov 0 0 S + +++ + ++
E 3.3 + enov 0 0 S + ++ + +
E 3.4 ++ enov 0 0 S + ++ 0 0
E 3.5 ++ enov 0 0 N + ++ + +
E 3.6 +++ enov + 0 S + +++ 0 +
E 3.7 ++ enov 0 0 S + +++ + 0
E 3.8 ++ enov 0 + S ++ ++ + +
E 3.9 ++ enov 0 0 N ++ + 0 0
E 3.10 + enov 0 0 S ++ +++ 0 ++
E 7.1 ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- -------
E 7.2 ++ horiz ++ ++ N ++ ++ ++ ++
E 7.3 +++ enov + + S + +++ + +
E 7.4 + enov + ++ N ++ ++ ++ ++
E 7.5 +++ horiz ++ ++ N ++ ++ +++ +
E 7.6 +++ horiz +++ ++ N ++ ++ ++ 0
E 7.7 +++ horiz ++ ++ S + +++ ++ +
E 7.8 ++ horiz ++ +++ N ++ ++ +++ 0
E 7.9 ++ enov + + S ++ +++ ++ 0
E 7.10 +++ horiz ++ ++ S ++ ++ ++ 0
E 14.1 +++ horiz +++ +++ N +++ + +++ +
E 14.2 +++ horiz +++ +++ N ++ ++ ++ 0
E 14.3 ++ horiz ++ ++ N +++ + ++ 0
E 14.4 ++ horiz ++ +++ S +++ + +++ 0
E 14.5 ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- -------
E 14.6 + horiz ++ ++ N ++ ++ ++ 0
E 14.7 +++ horiz +++ ++ N +++ ++ ++ 0
E 14.8 ++ horiz ++ +++ N +++ + +++ 0
E 14.9 ++ horiz +++ ++ N ++ ++ ++ 0
E14.10 ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- -------
102
TABELA 8 – PARÂMETROS HISTOLÓGICOS ANALISADOS (GRUPO CONTROLE).
Animal Fibroblastos
quantidade
Fibroblastos
disposição
Fibroblastos
maturação
Fibrose Abscesso Infiltrado
mononuclear
Infiltrado
polimorfonuclear
Vascularização Ulceração
C 3.1 ++ enov 0 0 S + +++ + 0
C 3.2 +++ enov + 0 S ++ ++ 0 ++
C 3.3 ++ enov 0 0 N + ++ 0 ++
C 3.4 ++ enov 0 0 S + +++ 0 0
C 3.5 ++ enov 0 + S ++ ++ + 0
C 3.6 + enov 0 0 S + ++ 0 +++
C 3.7 ++ enov 0 0 N ++ ++ 0 +
C 3.8 ++ enov 0 0 N + +++ 0 +
C 3.9 ++ enov 0 0 S + +++ 0 +
C 3.10 +++ horiz 0 0 N + ++ + 0
C 7.1 ++ enov + + N + ++ ++ ++
C 7.2 ++ horiz ++ ++ S + ++ ++ ++
C 7.3 +++ horiz ++ ++ S + +++ ++ ++
C 7.4 ++ enov + + S ++ ++ ++ +
C 7.5 +++ horiz ++ ++ N + ++ ++ 0
C 7.6 ++ horiz ++ + N + +++ + 0
C 7.7 +++ enov + + N ++ ++ + 0
C 7.8 +++ horiz ++ ++ N ++ ++ ++ +
C 7.9 ++ enov + + S + +++ ++ +
C 7.10 ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- -------
C 14.1 +++ horiz +++ ++ N +++ + ++ 0
C 14.2 ++ horiz +++ +++ N ++ ++ +++ +
C 14.3 ++ horiz +++ ++ N +++ + ++ 0
C 14.4 +++ horiz ++ ++ N ++ ++ +++ 0
C 14.5 ++ horiz ++ +++ N ++ ++ ++ 0
C 14.6 ++ horiz ++ ++ S ++ ++ +++ 0
C 14.7 +++ horiz +++ +++ N +++ + ++ +
C 14.8 + horiz ++ ++ N +++ + ++ 0
C 14.9 ++ horiz +++ ++ N ++ ++ +++ 0
C14.10 ++ horiz +++ +++ N +++ + +++ 0
103
TABELA 9 - VARIAÇÃO PONDERAL DOS ANIMAIS - ANOVA
n Média Desvio Padrão Erro Padrão
95% Intervalo de confiança
para a média
Mínimo Máximo Faixa inferior
Faixa superior
Peso
inicial
E3
10 353,10 19,63 6,21 339,06 367,14 317,00 390,00
E7
10
338,20
23,84
7,54
321,15
355,25
295,00
381,00
E14
10 338,80 18,29 5,78 325,72 351,88 306,00 360,00
C3
10
306,30
73,57
23,27
253,67
358,93
215,00
384,00
C7
10
358,50
19,62
6,20
344,46
372,54
325,00
390,00
C14
10 302,20 55,21 17,46 262,70 341,70 222,00 365,00
Total
60 332,85 44,91 5,80 321,25 344,45 215,00 390,00
Peso: dia da
operação
E3
10
341,90
17,89
5,66
329,10
354,70
309,00
379,00
E7
10 331,50 25,19 7,97 313,48 349,52 292,00 379,00
E14
10
330,20
17,66
5,58
317,57
342,83
300,00
348,00
C3
10 316,70 74,76 23,64 263,22 370,18 225,00 397,00
C7
10
369,30
22,18
7,01
353,44
385,16
326,00
400,00
C14
10
311,40
55,26
17,48
271,87
350,93
233,00
379,00
Total
60 333,50 44,15 5,70 322,10 344,90 225,00 400,00
Peso: dia da
re-operação
E3
10
312,00
26,72
8,45
292,89
331,11
279,00
358,00
E7
9
277,89
18,01
6,00
264,05
291,73
256,0
0
312,00
E14
8 320,00 39,31 13,90 287,13 352,87 250,00 366,00
C3
10
277,70
61,23
19,36
233,90
321,50
199,00
341,00
C7
9 301,44 26,19 8,73 281,31 321,58 245,00 334,00
C14
10
324,90
46,08
14,57
291,94
357,86
257,00
410,00
Total
56 302,14 42,24 5,65 290,83 313,46 199,00 410,00
104
TABELA 10 - COMPARAÇÃO DAS VARIÂNCIAS DOS PESOS DOS ANIMAIS AFERIDOS NO INÍCIO DO
EXPERIMENTO, NO DIA DA OPERAÇÃO E NO DIA DA REOPERAÇÃO.
Pesos Fonte
Soma dos
quadrados df
Mediana
quadrada F Sig.
Peso Inicial Entre os grupos (Combinado)
27763,35
5,00
5552,67
3,29
,012
Dentro dos grupos
91212,30
54,00
1689,12
Total
118975,65
59,00
Peso dia da
operação
Entre os grupos (Combinado)
21377,40
5,00
4275,48
2,47
,044
Dentro dos grupos
93613,60
54,00
1733,59
Total
114991,00
59,00
Peso dia da
re-operação
Entre os grupos (Combinado)
19974,75
5,00
3994,95
2,56
,039
Dentro dos grupos
78178,11
50,00
1563,56
Total
98152,86
55,00
105
TABELA 11- PROVA DE HOMOCEDASTICIDADE DOS PESOS DOS ANIMAIS NO DIA DA
ADMINISTRAÇÃO DO INFLIMABE, NO DIA DA OPERAÇÃO E NO DIA DA REOPERAÇÃO.
Levene Statistic df1 df2 Sig.
Peso
Inicial
22,221
5
54
,000
Peso dia operação
21,683
5
54
,000
Peso dia re
-
operação
6,048
5
50
,000
106
TABELA 12 – VARIAÇÃO PONDERAL APÓS ADMINISTRAÇÃO DO INFLIXIMABE OU SOLUÇÃO DE NaCl A
0,9%. TESTE DE LEVENE E TESTE t.
Subgrupo
N Média
Desvio
padrão
Erro
padrão
E 30,000 -8,400 3,114 0,569
C
30,000 11,133 3,998 0,730
Teste de Levene
para igualdade de
variâncias Teste T para comparação de médias
F Significância
t df
Signifi-
cância
(bi-
caudal)
Diferença
das médias
Diferença
do erros
padrão
Intervalo de confiança
- 95%
Inferior Superior
Variâncias
iguais
presumidas
0,226
0,636 -21,113 58,000
0,000
-19,533 0,925 -21,385 -17,681
Variâncias
diferentes
presumidas
-21,113 54,722
0,000 -19,533 0,925 -21,388 -17,679
107
TABELA 13 – VARIAÇÃO PONDERAL APÓS A OPERAÇÃO (3º DIA PÓS-OPERATÓRIO). TESTE DE LEVENE
E TESTE t.
Subgrupo
N Média
Desvio
padrão
Erro
padrão
E3
10,000
-31,200
13,983
4,422
C3
10,000
-41,000
16,200
5,123
Teste de Levene
para igualdade de
variâncias Teste T para comparação de médias
F
Significân-
cia t df
Signifi-
cância
(bi-
caudal)
Diferença
das
médias
Diferença
do erros
padrão
Intervalo
confiança - 95%
Inferior Superior
Variâncias
iguais
presumidas
0,429
0,521
1,448
18,000
0,165
9,800
6,767
-4,417
24,017
Variâncias
diferentes
presumidas
1,448
17,624
0,165
9,800
6,767
-4,439
24,039
108
TABELA 14 – VARIAÇÃO PONDERAL APÓS A OPERAÇÃO (7º DIA PÓS-OPERATÓRIO). TESTE DE LEVENE
E TESTE t.
Subgrupo N Média
Desvio
padrão
Erro
padrão
E7
9,000
-48,333
7,681
2,560
C7
9,000
-67,556
19,622
6,541
Teste de Levene
para igualdade de
variâncias Teste T para comparação de médias
F
Significân-
cia t df
Signifi-
cância
(bi-
caudal)
Diferença
das
médias
Diferença
do erros
padrão
Intervalo de 95%
Inferior
Superior
Variâncias
iguais
presumidas
5,866
0,028
2,737
16,000
0,015
19,222
7,024
4,332
34,112
Variâncias
diferentes
presumidas
2,737
10,396
0,020
19,222
7,024
3,652
34,792
109
TABELA 15 – VARIAÇÃO PONDERAL APÓS A OPERAÇÃO (14º DIA PÓS-OPERATÓRIO). TESTE DE
LEVENE E TESTE t.
Subgrupo
N Média
Desvio
padrão
Erro
padrão
E14
8,000
-7,500
28,269
9,995
C14
10,000
13,500
31,788
10,052
Teste de Levene
para igualdade de
variâncias Teste T para comparação de médias
F
Significân-
cia t df
Signifi-
cância
(bi-
caudal)
Diferença
das
médias
Diferença
do erros
padrão
Intervalo de 95%
Inferior Superior
Variâncias
iguais
presumidas
0,293
0,596
-1,461
16,000
0,163
-21,000
14,372
-51,467
9,467
Variâncias
diferentes
presumidas
-1,481
15,772
0,158
-21,000
14,175
-51,086
9,086
110
TABELA 16 – TESTE EXATO DE FISHER, PARA ÓBITO.
Óbito C3 E3 C7 E7 C14 E14 C E
Não 10 10 9 9 10 8 29 27
Sim 0 0 1 1 0 2 1 3
p 1,000 0,763 0,237
0,306
111
TABELA 17 – FREQÜÊNCIA DE APATIA PÓS-OPERATÓRIA.
Apatia C3 E3 C7 E7 C14 E14 C E
0 7 6 8 7 7 7 22 20
+ 3 3 1 2 3 1 7 6
++ 0 1 1 1 0 1 1 3
+++ 0 0 0 0 0 1 0 1
TABELA 18 – TESTE EXATO DE FISHER PARA APATIA PÓS-OPERATÓRIA.
Apatia C3 E3 C7 E7 C14 E14 C E
Ausente 7 6 8 7 7 7 22 20
Presente 3 4 2 3 3 3 8 10
p 0,500
0,500
0,686
0,389
112
TABELA 19 – FREQÜÊNCIA DE ERIÇAMENTO DE PELOS.
Eriçamento C3 E3 C7 E7 C14 E14 C E
0 8 8 7 6 7 7 22 21
+ 2 2 2 3 3 1 7 6
++ 0 0 1 1 0 1 1 2
+++ 0 0 0 0 0 1 0 1
TABELA 20 – TESTE EXATO DE FISHER PARA ERIÇAMENTO DE PELOS.
Eriçamento C3 E3 C7 E7 C14 E14 C E
Ausente 8 8 7 6 7 7 22 21
Presente 2 2 3 4 3 3 8 9
p 0,709
0,500
0,686
0,500
113
TABELA 21 – FREQÜÊNCIA DE DISTENSÃO ABDOMINAL.
Dist. abdominal C3 E3 C7 E7 C14 E14 C E
0 4 5 7 7 8 5 19 17
+ 6 5 2 1 2 4 10 10
++ 0 0 0 2 0 0 0 2
+++ 0 0 1 0 0 1 1 1
TABELA 22 – TESTE EXATO DE FISHER PARA DISTENSÃO ABDOMINAL.
Dist. abdominal C3 E3 C7 E7 C14 E14 C E
Ausente 4 5 7 7 8 5 19 17
Presente 6 5 3 3 2 5 11 13
p 0,500
0,686
0,175
0,396
114
TABELA 23 – FREQÜÊNCIA DE DIARRÉIA.
Diarréia C3 E3 C7 E7 C14 E14 C E
0 8 10 7 9 8 9 23 28
+ 2 0 2 1 2 0 6 1
++ 0 0 1 0 0 1 1 1
+++ 0 0 0 0 0 0 0 0
TABELA 24 – TESTE EXATO DE FISHER PARA DIARRÉIA.
Diarréia C3 E3 C7 E7 C14 E14 C E
Ausente 8 10 7 9 8 9 23 28
Presente 2 0 3 1 2 1 7 2
p 0,237 0,291
0,500
0,073
115
TABELA 25 – FREQÜÊNCIA DE ADERÊNCIAS.
Aderência C3 E3 C7 E7 C14 E14 C E
0 3 1 1 0 4 4 8 5
+ 7 8 5 5 6 2 18 15
++ 0 1 2 4 0 4 2 9
+++ 0 0 2 1 0 0 2 1
TABELA 26 – TESTE EXATO DE FISHER PARA ADERÊNCIAS.
Aderência C3 E3 C7 E7 C14 E14 C E
Ausente 3 1 1 0 4 4 8 5
Presente 7 9 9 10 6 6 22 25
p 0,291
0,500
0,675
0,266
116
TABELA 27 – FREQÜÊNCIA DE HEMATOMA.
Hematoma E3 C3 E7 C7 E14 C14 E C
0 10 10 10 10 10 10 30 30
+ 0 0 0 0 0 0 0 0
++ 0 0 0 0 0 0 0 0
+++ 0 0 0 0 0 0 0 0
TABELA 28 – TESTE EXATO DE FISHER PARA HEMATOMA.
Hematoma E3 C3 E7 C7 E14 C14 E C
Ausente 10 10 10 10 10 10 30 30
Presente 0 0 0 0 0 0 0 0
p 1,000
1,000
1,000
1,000
117
TABELA 29 – FREQÜÊNCIA DE FLOGOSE.
Flogose E3 C3 E7 C7 E14 C14 E C
0 10 10 10 10 10 10 30 30
+ 0 0 0 0 0 0 0 0
++ 0 0 0 0 0 0 0 0
+++ 0 0 0 0 0 0 0 0
TABELA 30 – TESTE EXATO DE FISHER PARA FLOGOSE.
Flogose E3 C3 E7 C7 E14 C14 E C
Ausente 10 10 10 10 10 10 30 30
Presente 0 0 0 0 0 0 0 0
p 1,000 1,000
1,000
1,000
118
TABELA 31 – RESISTÊNCIA TÊNSIL DA ANASTOMOSE COLÔNICA NO 3º DIA PÓS-OPERATÓRIO, TESTE DE
LEVENE E TESTE
t.
Subgrupo
N Média
Desvio
padrão
Erro
padrão
E3 10,000
0,509
0,316
0,100
C3
10,000
0,415
0,312
0,099
Teste de Levene
para igualdade de
variâncias Teste T para comparação de médias
F
Significân-
cia t df
Signifi-
cância
(bi-
caudal)
Diferença
das
médias
Diferença
do erros
padrão
Intervalo de 95%
Inferior
Superior
Variâncias
iguais
presumidas
0,110
0,744
0,669
18,000
0,512
0,094
0,140
-0,201
0,389
Variâncias
diferentes
presumidas
0,669
17,998
0,512
0,094
0,140
-0,201
0,389
119
TABELA 32 – RESISTÊNCIA TÊNSIL DA ANASTOMOSE COLÔNICA NO 7º DIA PÓS-OPERATÓRIO, TESTE DE
LEVENE E TESTE
t.
Subgrupo
N Média
Desvio
padrão
Erro
padrão
E7 9,000
1,434
0,858
0,286
C7
9,000
1,448
0,413
0,138
Teste de Levene
para igualdade de
variâncias Teste T para comparação de médias
F
Significân-
cia t df
Signifi-
cância
(bi-
caudal)
Diferença
das
médias
Diferença
do erros
padrão
Intervalo de 95%
Inferior Superior
Variâncias
iguais
presumidas
2,314
0,148
-0,042
16,000
0,967
-0,013
0,317
-0,686
0,660
Variâncias
diferentes
presumidas
-0,042
11,511
0,967
-0,013
0,317
-0,708
0,682
120
TABELA 33 – RESISTÊNCIA TÊNSIL DA ANASTOMOSE COLÔNICA NO 14º DIA PÓS-OPERATÓRIO, TESTE DE
LEVENE E TESTE
t.
Subgrupo
N Média
Desvio
padrão
Erro
padrão
E14 8,000
2,323
0,495
0,175
C14
10,000
1,374
0,407
0,129
Teste de Levene
para igualdade de
variâncias Teste T para comparação de médias
F
Significân-
cia t df
Signifi-
cância
(bi-
caudal)
Diferença
das
médias
Diferença
do erros
padrão
Intervalo de 95%
Inferior
Superior
Variâncias
iguais
presumidas
2,084
0,168
4,469
16,000
0,000
0,949
0,212
0,499
1,398
Variâncias
diferentes
presumidas
4,368
13,536
0,001
0,949
0,217
0,481
1,416
121
TABELA 34 – TESTE EXATO DE FISHER PARA QUANTIDADE DE FIBROBLASTOS.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
Ausente 0 0 0 0 0 0 0 0
Presente 10 10 9 9 10 8 29 27
p 1 1 1
1
TABELA 35 – TESTE EXATO DE FISHER PARA DISPOSIÇÃO DE FIBROBLASTOS.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
Horizontalização 1 0 5 6 10 8 16 14
Enovelamento 9 10 4 3 0 0 13 13
p 0,5 0,5 1
0,5075
TABELA 36 – TESTE EXATO DE FISHER PARA MATURAÇÃO DE FIBROBLASTOS.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
Ausente 9 8 0 0 0 0 9 8
Presente 1 2 9 9 10 8 20 19
p 0,5 1 1
0,5704
122
TABELA 37 – TESTE EXATO DE FISHER PARA FIBROSE.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
Ausente 9 9 0 0 0 0 9 9
Presente 1 1 9 9 10 8 20 18
p 0,763
1 1
0,6809
TABELA 38 – TESTE EXATO DE FISHER PARA ABSCESSO.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
Sim 4 2 5 5 9 7 18 14
Não 6 8 4 4 1 1 11 13
p 0,314
0,681
0,706
0,308
123
TABELA 39 – TESTE EXATO DE FISHER PARA INFILTRADO MONONUCLEAR.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
Ausente 0 0 0 0 0 0 0 0
Presente 10 10 9 9 10 8 29 27
p 1 1 1
1
TABELA 40 – TESTE EXATO DE FISHER PARA INFILTRADO POLIMORFONUCLEAR.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
Ausente 0 0 0 0 0 0 0 0
Presente 10 10 9 9 10 8 29 27
p 1 1 1
1
124
TABELA 41 – TESTE EXATO DE FISHER PARA VASCULARIZAÇÃO.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
Ausente 7 5 0 0 0 0 7 5
Presente 3 5 9 9 10 8 22 22
p 0,325
1 1
0,4274
TABELA 42 – TESTE EXATO DE FISHER PARA ULCERAÇÃO.
C3 E3 C7 E7 C14
E14 C E
Ausente 4 4 3 4 8 7 15 15
Presente 6 6 6 5 2 1 14 12
p 0,675
0,5 0,588
0,4925
125
TABELA 43 – RESULTADOS DA DOSAGEM QUANTITATIVA DO TNF-α SÉRICO, ATRAVÉS DO
MÉTODO ELISA, COM KIT ESPECÍFICO PARA RATOS, INCLUSIVE AS DOSAGENS EM DUPLICATA
(ng/mL).
Grupos
Experimental Controle
Rato E3 E7 E14 C3 C7 C14
1 0,005 ------- 0,009 0,084 0,024 0,053
2 0,007 0,041 0,087 0,017 0,496 0,011
3 0,010 0,025 0,025/0,002 0,026 0,007 0,004
4 0,048 0,003/0,004 0,005/0,006 0,319 0,007 0,005
5 0,009 0,017 ------- 0,009 0,006 0,015
6 0,009/0,072 0,023/0,011 0,014/0,008 0,005 0,132 0,021
7 0,013 0,013/0,174 0,004/0,057 0,007 0,023 0,009
8 0,002/0,002 0,007/0,004 0,016/0,008 0,024 0,007 0,004
9 0,017/0,025 0,006/0,024 0,007/0,029 0,085 0,004 0,077
10 0,007/0,007 0,006/0,009 ------- 0,023 ------- 0,005
126
TABELA 44 – RESULTADO DA DOSAGEM QUANTITATIVA DO TNF-α SÉRICO, ATRAVÉS DO
MÉTODO ELISA, COM KIT ESPECÍFICO PARA RATOS, EM ANIMAIS NÃO SUBMETIDOS A
MEDICAÇÃO OU PROCEDIMENTO CIRÚRGICO, PARA ESTABELECIMENTO DE VALOR REFERÊNCIA
(ng/mL).
Animais não manipulados
Rato TNF-α (ng/mL)
1
2
3
4
5
0,996
0,936
0,824
0,850
0,953
127
CURVA PADRÃO DO TNF-α EM RATOS
TNF-α rato ng/mL
(A) – Absorbância 450 nm
ANEXOS
129
DECLARAÇÃO
Declaramos junto a Universidade de Brasília, a Área de Clínica
Cirúrgica da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília, ao CNPq e
ao Comitê de Ética no Uso Animal – CEUA, do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade de Brasília, que os resultados da pesquisa
“Avaliação dos Efeitos do Infliximabe na Cicatrização de Anastomoses
Colônicas em Ratos”, serão tornados públicos, sejam eles favoráveis ou não.
Declaramos ainda que os dados coletados serão enviados para
publicação em revista indexada, de preferência em língua inglesa e as lâminas
com os cortes histológicos ficarão arquivadas na Faculdade de Medicina.
Prof. Dr. Paulo Gonçalves de Oliveira – Pesquisador responsável
Diretor da Faculdade de Medicina
Luiz Alberto Mendonça de Freitas – Pesquisador colaborador
Aluno de Pós-Graduação – Mestrado – Faculdade de Medicina
130
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