( PDF ) Papel das Yops de Yersinia Pseudotuberculosis na modulação da resposta imune celular durante infecção experimental

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Universidade Estadual Paulista

"Júlio de Mesquita Filho"

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Câmpus de Araraquara

"Papel das Yops de Yersinia pseudotuberculosis na modulação

da resposta imune celular durante infecção experimental."

Luis Gustavo Silva Monnazzi

ARARAQUARA

2007

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Universidade Estadual Paulista

"Júlio de Mesquita Filho"

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Câmpus de Araraquara

"Papel das Yops de Yersinia pseudotuberculosis na modulação

da resposta imune celular durante infecção experimental."

Luis Gustavo Silva Monnazzi

ARARAQUARA

2007

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"Júlio de Mesquita Filho"

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Câmpus de Araraquara

"Papel das Yops de Yersinia pseudotuberculosis na modulação

da resposta imune celular durante infecção experimental."

Luis Gustavo Silva Monnazzi

ORIETADOR: Profª. Drª. Beatriz Maria Machado de Medeiros

ARARAQUARA

2007

Tese apresentada ao Programa de Pós

Graduação da Faculdade de Ciências

Farmacêutic

as da Universidade Estadual

Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como pré

requisito para obtenção do título de doutor em

Análises Clínicas, área de Análises Clínicas.

Ficha Catalográfica

Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

UNESP – Campus de Araraquara

Monnazzi, Luis Gustavo Silva

M748p Papel das Yops de Yersinia pseudotuberculosis na modulação da

resposta imune celular durante infecção experimental. / Luis Gustavo Silva

Monnazzi. – Araraquara, 2007.

118 f.

Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de

Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação

em Análises Clínicas

Orientador: Beatriz Maria Machado de Medeiros

. 1.Yersínia pseudotuberculosis (Yops) 2.Citotoxicidade. 3.Citocinas. 4.

NF-kB. I..Medeiros, Beatriz Maria Machado de, orient..II. Título.

CDD: 616.0145

CAPES: 40300005

COMISSÃO EXAMIADORA

Profª. Drª. Beatriz Maria Machado de Medeiros

(Orientador e Presidente)

Profª. Drª. Leonilda Maria Barbosa dos Santos

(Membro Titular)

Profº. Drº. Phileno Pinge Filho

(Membro Titular)

Profª. Drª. Cleni Mara Marzochi Machado

(Membro Titular)

Profª. Drª. Alexandrina Sartori

(Membro Titular)

Araraquara, novembro de 2007.

Trabalho realizado no Laboratório de Imunologia Básica, Departamento de Ciências Biológicas, da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas (UNESP - Araraquara), com apoio financeiro da FAPESP

(Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), através do auxílio à pesquisa (Proc. n°

04/14079-9), e do CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico),

através do auxílio à pesquisa (Proc. n° 479860/2004-1) e concessão da bolsa.

“ Para todas as coisas tenho

força em virtude daquele que

me confere poder”

Filipenses 4:13

Aos m

eus pais, José Carlos e Maria Aparecida,

que por uma vida de dedicação, amor e

trabalho sempre possibilitaram a seus filhos a

oportunidade de realizar sonhos e conquistas.

Aos meus irmãos, Carlos, Marcelo e João Paulo,

exemplos de dignidade, bondade e caráter.

Aos meus queridos sobrinhos, Gabriel, Rafael,

Ana Carolina e Giancarlo.

AGRADECIMENTOS

AGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOS

AGRADECIMENTOS

A Deus, que por sua presença, luz e força sempre me abençoa e capacita para tudo aquilo que

Ele me destina.

À Profª. Drª. Beatriz Maria Machado de Medeiros, meu muito obrigado pela amizade, carinho,

paciência e orientação ao longo de todos estes anos.

À amiga Valéria Aparecida de Araújo Mallavolta, não só pela amizade, carinho e auxílio

técnico, mas, principalmente, pelo sorriso e bom humor constantes.

À minha querida amiga Profª. Drª. Ana Rita P. Tumitan pelo exemplo de persistência,

determinação, coragem e competência.

Às minhas grandes e inesquecíveis amigas Daniele C. G. Maia, Juliana L. Monteiro, Lílian C.

Baeza e Patrícia F. Andreotti, por fazerem parte, sem dúvida alguma, dos melhores momentos

desta jornada.

Aos amigos Adolfo C. Barreto, Ana Carolina Malaspina, Carolina F. Barbosa, Elisabeth E.

Aoki, Gabriela M. P. A. Camargo e José Mário L. Maia pelo carinho, amizade, presença e

apoio.

Aos colegas de laboratório Aline Tansine, Fabrício R. Ghiraldi, Gabriela D. Passerine, Jerusa

G. Magro, Larissa M. Zenatti, Orivaldo P. Ramos e Silvia E. S. de C. Pinto, pelo

companheirismo e agradáveis momentos de convivência.

À Profª. Drª. Alexandrina Sartori (ICB-UNESP-Botucatu) e ao Prof°. Dr°. Paulo Ignácio da

Costa (FCF-UNESP-Araraquara) que, como membros da banca de qualificação, contribuíram

com importantes e enriquecedoras sugestões.

Ao Prof° Dr° Luiz Carlos Spolidório (Odontologia-UNESP-Araraquara) pela colaboração na

análise histológica.

Ao Profº. Drº. Sandro R. Valentini, que permitiu o uso de equipamentos indispensáveis à

realização deste trabalho.

À Fabiana R. de Morais (FCF-USP-Ribeirão Preto), pelo carinho e prontidão com que sempre

me auxiliou no manuseio do citômetro de fluxo e nas análises dos resultados de citometria.

Ao Profº. Drº. Hans Wolf-Watz, da Universidade de Umea (Suécia), pelas amostras

bacterianas cedidas.

Às funcionárias da Seção de Pós-Graduação da FCF-UNESP (Araraquara), Cláudia, Laura e

Sônia, pela atenção, carinho e paciência.

Às bibliotecárias, Irani e Natalina, da FCF-UNESP (Araraquara) pela colaboração durante a

pesquisa e revisão bibliográfica.

À FAPESP e ao CNPq pelo apoio financeiro.

A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

RESUMO

ABSTRACT

I – ITRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA

II - OBJETIVOS 33

III – MATERIAIS E MÉTODOS

1 - Fluxograma de trabalho

2 – Animais de experimentação

3 - Amostras bacterianas

4 - Infecção experimental dos animais com as amostras de Yersinia

pseudotuberculosis YpIII

4.1 - Reativação das amostras de Yersinia

4.2 - Determinação da dose infectante

4.3 - Preparo do inóculo

4.4 - Esquema de infecção

5 - Cinética de Infecção

6 - Análise histológica de cortes de baço e fígado de animais infectados com a

amostra selvagem

7 - Quantificação das subpopulações de linfócitos T e determinação do padrão de

citocinas Th1 e Th2 através do método de citometria de fluxo

7.1 - Obtenção das células esplênicas

7.2 - Viabilidade das células esplênicas

7.3 - Análise fenotípica dos linfócitos esplênicos

7.4 - Detecção intracelular das citocinas IL-2, IL-4, IL-10, IF-γ

γγ

γ, TF-α e TGF-β

ββ

8 - Determinação da ativação de F-κ

κκ

κB nos linfócitos esplênicos

8.1 - Obtenção do extrato nuclear

8.2 - Ensaio de ativação do fator de transcrição F-κ

κκ

κB

9 - Avaliação da atividade citotóxica dos linfócitos esplênicos

9.1 - Obtenção das células do exsudato peritoneal

9.2 - Infecção dos macrófagos “in vitro”

9.3 - Obtenção dos linfócitos T CD8

9.4 - Ensaio de Citotoxicidade

10 - Análise Estatística

IV – RESULTADOS 45

1 – Determinação da dose infectante para as amostras de Yersinia

pseudotuberculosis

2 – Determinação da cinética de infecção no baço e fígado 47

3 – Verificação do peso do baço e do fígado no decorrer da cinética de infecção

4 - Alterações patológicas macroscópicas no fígado e no baço

5 - Análise histológica do baço e fígado

6 - Análise fenotípica das subpopulações de linfócitos T esplênicos

7 – Detecção intracelular das citocinas IL-2, IL-4, IL-10, IF-γ, TF-α e TGF-β

8 – Avaliação da ativação do fator nuclear κB (F- κB) nos linfócitos esplênicos

9 - Avaliação da atividade citotóxica dos LT-CD8

V - DISCUSSÃO

VI - COCLUSÕES

VII – REFERÊCIAS BIBLIOGRÁFICAS

VIII - APÊDICE 118

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µg

- Micrograma

µL

- Microlitro

BAB - “Blood Agar Base” (Agar base de sangue)

BOD - Demanda bioquímica de oxigênio

BSA - Albumina bovina

CD - “Cluster of Differentiation” (Grupo de diferenciação)

- Dióxido de Carbono

- Dose Letal mediana

D.O. - Densidade óptica

DTT - Ditiotreitol

EDTA - Ácido etileno diamino tetracético

EGTA - “Ethylenebis (oxyethylene-nitrilo) tetraacetic acid”

ELISA - “Enzyme Linked Immunosorbent Assay”

FITC - Isotiocianato de fluoresceína

g - Grama

g - Força gravitacional

GAP - Proteínas ativadoras de GTPases

GTP - Guanosina trifosfato

- Ácido Sulfúrico

Hepes - “N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethane sulfonic acid”

HKY - Antígeno da Yersinia morta pelo calor

HRP - “Horseradish peroxidase”

IFN-γ

- Interferon-gama

IL - Interleucina

kb - Quilobase

KCl - Cloreto de potássio

kDa - Quilodalton

L - Litro

LDH - Lactato dehidrogenase

LPS - Lipopolissacarídeo

LT - Linfócito T

MAPKs - Proteínas quinases ativadas por mitógenos

MHC - Complexo de Histocompatibilidade Principal

mL - Mililitro

mM - Milimolar

MOI - Multiplicidade de infecção

NaCl - Cloreto de sódio

NaOH - Hidróxido de sódio

NF-κB

- Fator Nuclear kappa B

NK - “Natural Killer”

NO - Óxido Nítrico

ºC - Graus Centígrados

PBS - Solução tampão salina-fosfato

PE - Ficoeritrina

pi - Pós-infecção

pg - Picogramas

PMA - Forbol-miristato-acetato

PMSF - “Penhylmethylsulfonyl fluoride”

SD - Desvio padrão

SPRD - “Spectral red”

TCR - Receptor de células T

TGF-β - “Transforming Growth Factor β”

TNF-α

- Fator de Necrose Tumoral

TSB - “Tryptic Soy Broth”

TTSS - Sistema de secreção do tipo três

UFC - Unidade formadora de colônia

WT - “Wild Type” (tipo selvagem)

Yops - Proteínas de membrana externa de Yersinia

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Esquema representativo dos mecanismos de ação das principais Yops efetoras, dentro

da célula do hospedeiro..................................................................................................................23

Figura 2 - Cinética de infecção no baço (A) e fígado (B) de camundongos BALB/c infectados

pela via intravenosa com as amostras WT, YopE

, YopH

, YopM

e YpIII de Y.

pseudotuberculosis. No 2°, 5°, 7°, 14° e 21° dia pós-infecção os animais foram sacrificados, o

baço e o fígado foram retirados, homogeinizados em salina 0,85% e alíquotas de 0,1 mL, de duas

diluições seriadas (1/10 e 1/100), foram semeadas em placas de BAB. Após 48 h de incubação a

26°C, o número de UFC por órgão foi determinado. Os valores apresentados correspondem às

medias de 4 animais por dia. O desvio padrão foi sempre menor que 25% dos valores

observados.....................................................................................................................................49

Figura 3 - Peso do baço (A) e fígado (B) de camundongos BALB/c no 2°, 5°, 7°, 14° e 21° dia

pós-infecção pela via intravenosa com as amostras WT, YopE

, YopH

, YopM

e YpIII de Y.

pseudotuberculosis. Os animais foram sacrificados, o baço e o fígado foram retirados,

homogeinizados em salina 0,85% e alíquotas de 0,1 mL, de duas diluições seriadas (1/10 e

1/100), foram semeadas em placas de BAB. Após 48 h de incubação a 26°C, o número de UFC

por órgão foi determinado. Os valores apresentados correspondem às medias dos pesos (em

gramas) de, no mínimo, 4 animais por dia + SD.......................................................................... 52

Figura 4 - Análise histológica de baço após infecção intravenosa com amostra selvagem (WT)

de Y. pseudotuberculosis. Os órgãos foram retirados de camundongos BALB/c infectados e não

infectados no 14° dia pós-infecção. Os cortes (5 µm) foram corados com hematoxilina e eosina

(HE). As figuras mostradas representam os aumentos de 100x (A e B), 200x (C e D) e 400x (E e

F)....................................................................................................................................................56

Figura 5 - Análise histológica de fígado após infecção intravenosa com amostra selvagem (WT)

de Y. pseudotuberculosis. Os órgãos foram retirados de camundongos BALB/c infectados e não

infectados no 14° dia pós-infecção. Os cortes (5 µm) foram corados com hematoxilina e eosina

(HE). As figuras mostradas representam os aumentos de 100x (A e B), 200x (C e D) e 400x (E e

F)....................................................................................................................................................57

Figura 6 - Quantificação das subpopulações de linfócitos T (LT) durante infecção com as

amostras WT, YopE

, YopH

, YopM

e YpIII de Y. pseudotuberculosis. Camundongos BALB/c

foram sacrificados no 5°, 7°, 14° e 21° dia após a infecção e os LT esplênicos e suas

subpopulações quantificadas através da metodologia de citometria de fluxo. Os resultados

apresentados correspondem às médias + SD do número absoluto de linfócitos (x 10

) por baço (n

= 6 animais por dia).......................................................................................................................60

Figura 7 - Cinética da produção de citocinas pelos LT-CD4 esplênicos após infecção

intravenosa com as amostras WT, YopE

, YopH

, YopM

e YpIII de Y. pseudotuberculosis.

Camundongos BALB/c foram sacrificados no 5°, 7°, 14° e 21° dia após a infecção e as citocinas

IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ, TNF-α e TGF-β detectadas e quantificadas intracelularmente através da

metodologia de citometria de fluxo. Os resultados apresentados referem-se aos valores médios

das medianas das intensidades de fluorescência (MIF) + SD obtidas com os linfócitos

estimulados em cultura com PMA + Ionomicina (n = 6 animais por dia).....................................65

Figura 8 - Cinética da produção de citocinas pelos LT-CD8 esplênicos após infecção

intravenosa com as amostras WT, YopE

, YopH

, YopM

e YpIII de Y. pseudotuberculosis.

Camundongos BALB/c foram sacrificados no 5°, 7°, 14° e 21° dia após a infecção e as citocinas

IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ, TNF-α e TGF-β detectadas e quantificadas intracelularmente através da

metodologia de citometria de fluxo. Os resultados apresentados referem-se aos valores médios

das medianas das intensidades de fluorescência (MIF) + SD obtidas com os linfócitos

estimulados em cultura com PMA + Ionomicina (n = 6 animais por dia).....................................66

Figura 9 - Histogramas representativos dos aumentos mais significativos na produção das

citocinas IL-2, IL-4, IL-10 e IFN-γ pelos LT-CD8, em relação aos animais controles, durante

infecção com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os valores apresentados nos

quadrantes dos histogramas correspondem aos valores médios das medianas das intensidades de

fluorescência de seis animais por dia.............................................................................................67

Figura 10 - Histogramas representativos dos aumentos mais significativos na produção das

citocinas TNF-α e TGF-β pelos LT-CD8, em relação aos animais controles, durante infecção

com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os valores apresentados nos quadrantes

dos histogramas correspondem aos valores médios das medianas das intensidades de

fluorescência de seis animais por dia.............................................................................................68

Figura 11 – Influência da infecção com a amostra selvagem (WT), com a amostra curada do

plasmídeo de virulência e com as amostras mutantes YopJ

, YopE

, YopH

e YopM

de Y.

pseudotuberculosis na ativação do fator de transcrição nuclear κB. Quatro grupos de seis

camundongos BALB/c foram infectados via intravenosa com as amostras acima citadas. Extratos

nucleares dos linfócitos destes animais foram obtidos no 5°, 7°, 14° e 21° dias após a infecção

com as respectivas amostras e o estado de ativação do NF-κB foi avaliado usando-se o kit

TransAM. Os resultados mostrados representam as médias de dois experimentos feitos em

triplicata + desvio padrão...............................................................................................................76

Figura 12 - Ensaio de citotoxicidade: LT-CD8 esplênicos foram obtidos de camundongos

BALB/c no 5°, 7°, 14° e 21° dia pós-infecção intravenosa com a amostra selvagem (WT), com a

curada do plasmídeo de virulência (YpIII) e com as amostras mutantes de Y.

pseudotuberculosis. Os LT-CD8 (10

células) foram cocultivados por 4 horas com os macrófagos

(10

células) infectados com a amostra WT (MOI de 10). A citotoxicidade foi determinada

através da detecção da enzima LDH no sobrenadante da cocultura usando o kit CytoTox 96

(Promega). Camundongos não infectados serviram como controles. Para cada dia do

experimento foram usados “pools” de LT-CD8 obtidos de três animais. Os resultados

representam a média de dois ensaios feitos em triplicata..............................................................78

Figura 13 – Esquema representativo dos parâmetros avaliados no presente trabalho, dos

respectivos resultados obtidos e das principais Yops envolvidas em cada uma das alterações

decorrentes da infecção intravenosa de camundongos BALB/c com Y. pseudotuberculosis.......97

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Descrição resumida dos mecanismos moleculares e respectivos efeitos celulares das

Yops efetoras.................................................................................................................................27

Tabela 2 - Doses das amostras bacterianas usadas para infecção dos lotes experimentais..........46

Tabela 3 – Número de UFC (log) no baço e fígado dos animais no decorrer da infecção com a

amostra selvagem de Y. pseudotuberculosis, as respectivas mutantes e a amostra curada do

plasmídeo de virulência (valores representam médias + SD de 4 animais por dia)......................50

Tabela 4 – Peso, em gramas, do baço e do fígado dos animais durante a cinética de infecção

(valores representam médias de, no mínimo, 4 animais por dia + desvio padrão)........................53

Tabela 5 - Número absoluto de linfócitos T e das subpopulações CD3

CD4

e CD3

CD8

, por

baço, no decorrer da infecção com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis (os valores

mostrados representam médias + desvio padrão de 6 animais para cada dia)...............................61

Tabela 6 - Detecção intracelular da citocina IL-2 nos LT-CD4 e CD8 esplênicos de

camundongos BALB/c infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os

resultados mostrados representam os valores médios das medianas das intensidades de

fluorescência

+ desvio padrão de 6 animais para cada dia............................................................69

Tabela 7 - Detecção intracelular da citocina IL-4 nos LT-CD4 e CD8 esplênicos de

camundongos BALB/c infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os

resultados mostrados representam os valores médios das medianas das intensidades de

fluorescência

+ desvio padrão de 6 animais para cada dia............................................................70

Tabela 8 - Detecção intracelular da citocina IL-10 nos LT-CD4 e CD8 esplênicos de

camundongos BALB/c infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os

resultados mostrados representam os valores médios das medianas das intensidades de

fluorescência

+ desvio padrão de 6 animais para cada dia............................................................71

Tabela 9 - Detecção intracelular da citocina IFN-γ nos LT-CD4 e CD8 esplênicos de

camundongos BALB/c infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os

resultados mostrados representam os valores médios das medianas das intensidades de

fluorescência

+ desvio padrão de 6 animais para cada dia............................................................72

Tabela 10 - Detecção intracelular da citocina TNF-α nos LT-CD4 e CD8 esplênicos de

camundongos BALB/c infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os

resultados mostrados representam os valores médios das medianas das intensidades de

fluorescência

+ desvio padrão de 6 animais para cada dia............................................................73

Tabela 11 - Detecção intracelular da citocina TGF-β nos LT-CD4 e CD8 esplênicos de

camundongos BALB/c infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os

resultados mostrados representam os valores médios das medianas das intensidades de

fluorescência

+ desvio padrão de 6 animais para cada dia............................................................74

Tabela 12 – Valores de citotoxicidade (%) apresentados pelos linfócitos T CD8

obtidos de

animais infectados com a amostra selvagem, com a amostra curada do plasmídeo de virulência

e com as mutantes de Y. pseudotuberculosis, nos diferentes dias após a infecção.....................78

RESUMO:

As três espécies patogênicas do gênero Yersinia, Y. pestis, Y. enterocolitica e Y.

pseudotuberculosis, compartilham um tropismo pelos tecidos linfóides e um plasmídeo de 70-kb

que é essencial para a virulência. O plasmídeo codifica um sistema de secreção do tipo III e

proteínas efetoras chamadas Yops (Yersinia outer proteins). Este sistema de secreção é

responsável por translocar as Yops para dentro das células do hospedeiro, onde elas interagem

com alvos específicos e alteram as funções destas células. As Yops são capazes de modular a

resposta imune do hospedeiro, permitindo à bactéria se replicar extracelularmente nos tecidos e

órgãos linfóides. Embora haja muita informação sobre os mecanismos usados pela Yersinia para

evadir do sistema imune inato de defesa, pouco se sabe sobre como ela afeta a resposta imune

adaptativa in vivo. O objetivo deste trabalho foi analisar a influência das Yops E, H e M,

translocadas pela Y. pseudotuberculosis, na colonização e persistência da bactéria no baço e

fígado dos animais infectados, nas quantidades de LT-CD4 e LT-CD8 durante a infecção e na

produção das principais citocinas Th1 e Th2 por estas subpopulações de linfócitos. Além disso,

foi verificado o papel destas Yops sobre a ativação do fator nuclear κB (NF-κB) e sobre a

atividade citotóxica dos LT-CD8. Para isso, camundongos BALB/c fêmeas foram infectados

intravenosamente com a amostra selvagem de Y. pseudotuberculosis (WT), ou com amostras

mutantes incapazes de secretar as Yops E, H e M (YopE

, YopH

e YopM

), ou ainda com a

amostra curada do plasmídeo de virulência (YpIII). No 5°, 7°, 14° e 21° dia pós-infecção (pi), os

animais foram sacrificados e as células esplênicas foram obtidas de camundongos infectados e de

camundongos não infectados (grupo controle). Os níveis de colonização no baço e no fígado

foram determinados por contagem do número de unidades formadoras de colônias. Tanto a

análise fenotípica quanto a detecção intracelular das citocinas foi feita por citometria de fluxo. A

ativação do NF- κB foi medida por ELISA e a citotoxicidade dos LT-CD8 foi determinada

espectrofotometricamente por análise enzimática da liberação da lactato desidrogenase. Embora

todas as amostras tenham sido eficientes na colonização do baço e do fígado, a amostra YopH

foi mais rapidamente eliminada dos mesmos. A população de LT esplênicos diminuiu durante a

infecção com todas as amostras estudadas, exceto durante a infecção com a amostra YopH

quando pudemos observar um aumento no número de ambas subpopulações de LT, CD3

CD4

CD3

CD8

. Constatamos também que YopE atua sinergicamente com a YopH na diminuição

das quantidades de LT durante a infecção, uma vez que os menores valores foram observados

quando ambas estavam presentes. As Yops E, H e M suprimiram a produção das citocinas pelos

LT-CD4 e mantiveram a produção pelos LT-CD8 em níveis basais. Nós não pudemos atribuir a

exatamente uma Yop o papel supressor sobre a produção de citocinas pelos LT-CD4, mas, ao

contrário, pudemos perceber as funções redundantes que elas apresentam e como isto mantém a

bactéria virulenta e apta a sobreviver dentro do hospedeiro. Por outro lado, a produção de

citocinas pelos LT-CD8 foi mais evidentemente influenciada pela presença da YopH. Todas as

amostras de Y. pseudotuberculosis inibiram a ativação do NF-κB e, mais uma vez, as Yops E e H

parecem ter papéis importantes nesta inibição. A infecção com a amostra YopH

apresentou os

maiores valores de citotoxicidade no 5° dia pi (cerca de 4 vezes maior do que a amostra WT), o

que conferiu à YopH um provável papel inibidor da atividade citotóxica dos LT-CD8. Os

resultados apresentados pela amostra YpIII deixaram clara a influência de fatores de virulência

não plasmideais em muitos resultados obtidos. De uma forma geral, os resultados apontaram a

YopH de Y. pseudotuberculosis como o fator de virulência mais importante entre as Yops E, H e

M, e que exerce os papéis mais relevantes na modulação da resposta imune celular após infecção

intravenosa de camundongos BALB/c.

Palavras-chaves: Yersinia pseudotuberculosis, Yops, citotoxicidade, citocinas Th1 e Th2, NF-

κB.

ABSTRACT:

The three pathogenic species of the genus Yersinia, Y. pestis, Y. enterocolitica and Y.

pseudotuberculosis, share a tropism for lymphoid tissues and a 70-kb plasmid essential for

virulence. The plasmid encodes a type III secretion system and effector proteins called Yops

(Yersinia outer proteins). This secretion system is responsible for translocating the Yops into the

host cells, where they interact with specific host targets and alter the functions of these cells.

Yops are able to modulate the host immune defenses allowing the bacteria to replicate

extracellularly in lymphoid tissues and organs. Although there is ample information on the

mechanisms used by Yersinia to evade the innate immune system, very little is known about how

it affects the adaptive immune response in vivo. The aim of this research was to analyze the

influence of translocated Yops E, H and M of Y. pseudotuberculosis on the colonization and

persistence of the bacterium in the spleen and liver of infected animals, on the quantities of CD4

and CD8 T cells during the infection and on the production of the main Th1 and Th2 cytokines

by these lymphocyte subpopulations. In addition, it was verified the role of these same Yops on

the activation of nuclear factor κB (NF- κB) and on the CD8 T cells cytotoxic activity. To this

end, female BALB/c mice were infected intravenously with the wild type Y. pseudotuberculosis

(WT), or with the mutant strains unable to secrete the Yops E, H and M (YopE

, YopH

and

YopM

) or with the plasmid-cured strain (YpIII). On the 5

, 7

, 14

and 21

days post-infection

(pi), the animals were sacrificed and the spleen cells were isolated from infected and uninfected

mice (control group). The levels of colonization in the spleen and liver were determined by

counting the number of colony-forming units. Both the phenotypic analysis of lymphocytes and

the intracellular detection of cytokines were measured by flow cytometry. The NF- κB activation

was measured by NF-κB ELISA and the CD8 T cells cytotoxicity was determined

spectrophotometrically by assaying the lactate dehydrogenase released. Although all the strains

had been efficient in the colonization of spleen and liver, the YopH

strain was more rapidly

eliminated from both. The splenic T-cell population decreased during the infection with all

studied strains except during the infection with the YopH

mutant strain, when we could observe

a rise in the number of both T-cell subpopulations, CD3

CD4

and CD3

CD8

. We also find that

YopE acts synergically with YopH in decreasing the number of T cells during the infection,

since the smallest values were observed when both were present. The Yops E, H and M

suppressed the cytokine production by the CD4 T cells, but maintained its production by the

CD8 T cells at background levels. We could not ascribe to exactly one of these Yops the

suppressive role on cytokine production by CD4 T cells but, on the contrary, we perceived a

redundancy in their roles and how this keeps the bacterium virulent and able to survive inside the

host. On the other hand, the production of cytokines by the CD8 T cells was more prominently

influenced by the presence of YopH. All the different strains of Y. pseudotuberculosis inhibited

the NF-κB activation and, once again, Yops E and H seem to have important roles in this

inhibition. The infection with YopH

mutant strain exhibited the greatest values of cytotoxicity

on the 5

day pi (about 4-fold higher than WT), which confers on the YopH a probable role as

inhibitor of the CD8 T cell cytotoxic activity. Many of results with strain YpÍII made clear the

influence of non-plasmidial virulence factors. Taken together, the results point to YopH of Y.

pseudotuberculosis as the most important virulence factor, among the Yops E, H and M, and it

exerts the most relevant role in the modulation of cellular immune response to intravenous

infection of BALB/c mice.

Keywords: Yersinia pseudotuberculosis, Yops, cytotoxicity, Th1 and Th2 cytokines, NF-κB.

I – ITRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA

O gênero Yersinia compreende três espécies patogênicas para humanos: Y. pestis, Y.

enterocolitica e Y. pseudotuberculosis. Embora existam diferenças no modo de entrada no

hospedeiro e na gravidade das doenças causadas, todas estas espécies de Yersinia apresentam um

tropismo pelo tecido linfóide (podendo se disseminar via corrente sangüínea) e uma notável

capacidade de resistir à resposta imune inata do hospedeiro. Vários dias após a infecção de

roedores por via oral, a bactéria Yersinia é encontrada nos linfonodos mesentéricos e,

subseqüentemente, no baço e fígado (CORNELIS et al., 1998).

Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis são capazes de se multiplicar no meio ambiente

e quando introduzidas no homem podem causar várias doenças gastrintestinais, desde enterite até

linfadenite mesentérica. A infecção geralmente se dá pela ingestão de água ou alimentos

contaminados (BOTTONE, 1997). No intestino delgado, a bactéria invade a barreira intestinal

passando através das células M, que são células especializadas do epitélio associado aos

folículos e cuja função é capturar antígenos. Após a invasão do epitélio intestinal, a bactéria se

replica dentro das placas de Peyer e também se espalha para os linfonodos mesentéricos,

provocando linfadenite mesentérica, um evento característico da infecção intestinal por Yersinia

(FALKOW et al., 1992). Barnes et al. (2006) mostraram que a colonização do baço e do fígado

de animais infectados com Y. pseudotuberculosis independe de replicação prévia da bactéria nas

placas de Peyer e linfonodos mesentéricos. Todas as três espécies patogênicas de Yersinia

possuem um plasmídeo de virulência de 70-kb, altamente homólogo, chamado pIB1 em Y.

pseudotuberculosis, pYV em Y. enterocolitica e pCD1 em Y. pestis (PORTNOY et al., 1981).

Estes plasmídeos constituem fatores de virulência essenciais à bactéria, uma vez que codificam

proteínas estruturais (“Yop secretion” - Ysc), reguladoras (“Low calcium response” - Lcr) e

efetoras (“Yersinia outer proteins” - Yops) de um sistema de secreção do tipo III (TTSS). Este

sistema de secreção permite à Yersinia secretar e translocar as Yops para dentro das células do

hospedeiro (CORNELIS, 2002). Graças à ação das Yops, Yersinia spp pode residir

extracelularmente nos tecidos infectados e resistir à eliminação pelo sistema imune, quer pela

indução de apoptose nas células de defesa do hospedeiro, quer pela inibição de respostas pró-

inflamatórias ou até mesmo da fagocitose (CORNELIS, 2002; JURIS et al., 2002; MONACK et

al., 1997; SCHESSER et al., 1998; GROSDENT et al., 2002; PALMER et al., 1998).

Enquanto algumas Yops são efetoras intracelulares outras, como a YopB e a YopD, são

secretadas no meio extracelular e têm como função translocar as efetoras para o interior das

células eucarióticas. Pelo menos seis proteínas efetoras seriam ativas na célula do hospedeiro:

YopH, YopE, YopJ, YpkA, YopM e YopT. Os efeitos destas Yops foram estudados inicialmente

em macrófagos e linhagens de células epiteliais (CORNELIS & WOLF-WATZ, 1997;

CORNELIS et al., 1998). Quando a bactéria estabelece contato com macrófagos, a maquinaria

tipo III injeta alguns desses fatores de virulência dentro do citosol da célula alvo, abolindo o

processo de fagocitose e induzindo apoptose nos mesmos (ROSQVIST et al., 1991; PERSSON

et al., 1997; LEE et al., 2001) (Figura 1). Estudos mais recentes propõem a existência de um

mecanismo de patogenicidade conservado no gênero Yersinia, importante nos estágios iniciais

do processo infeccioso, que consiste numa fase de sobrevivência dentro dos macrófagos, onde a

bactéria consegue alterar as funções antibacterianas destas células (PUJOL & BLISKA, 2005).

A atividade da YopE, uma proteína de 25 kDa, está associada com despolimerização do

citoesqueleto da célula do hospedeiro, prevenindo assim a ingestão da bactéria (ROSQVIST et

al., 1991), uma vez que a fagocitose é um processo citoesqueleto-dependente. A YopE é um

determinante de virulência essencial que contém um domínio efetor carbóxi-terminal (SORY et

al., 1995; SCHESSER et al., 1996) o qual compartilha um alto grau de similaridade com o

domínio amino-terminal da exoenzima S (ExoS) de Pseudomonas aeruginosa e SptP de

Figura 1 - Esquema representativo dos mecanismos de ação das principais Yops efetoras, dentro da célula do

hospedeiro. (Fonte: NAVARRO et al., 2005)

Salmonella typhimurium. Foi demonstrado que YopE e ExoS possuem atividade GAP (Proteínas

Ativadoras de GTP-ases) sobre as GTP-ases da família Rho (RhoA, Rac e Cdc42) in vitro, e que

esta atividade GAP é essencial para a citotoxicidade mediada pela YopE (GOEHRING et al.,

1999; BLACK & BLISKA, 2000; Von PAWELL-RAMMINGEN et al., 2000). Estudos mais

recentes apontaram um novo papel para a YopE na modulação da resposta inflamatória durante

infecção de macrófagos in vitro; demonstrou-se o envolvimento de Rho GTPases, em particular

Rac1, na regulação da ativação da caspase-1 (SCHOTTE et al., 2004).

As funções de YopT (35,5 kDa) ainda não são muito claras, o que é bastante

compreensível, considerando que ela foi descoberta há menos tempo que as demais

(CORNELIS, 2002). Esta maior demora na descoberta da YopT se deve, provavelmente, ao fato

dela não ser expressa pelo sorotipo O:3 de Y. pseudotuberculosis, que é uma cepa muito usada na

pesquisa com Yersinia. (VIBOUD & BLISKA, 2005). No entanto, tem sido demonstrado que as

funções da YopT muito se assemelham às da YopE (IRIARTE & CORNELIS, 1998), embora

seja secretada em quantidades bem menores que esta. A YopE e a YopT podem afetar diferentes

vias de sinalização a fim de potencializar o efeito citotóxico da bactéria e assegurar a

sobrevivência do patógeno no tecido linfóide (JURIS et al., 2002). Shao et al. (2002),

identificaram a YopT como um membro da nova família das cisteína-proteases que contêm

resíduos invariantes de Cys, His e Asp. Além disso, eles demonstraram que a YopT cliva as Rho

GTPases próximo à região carbóxi-terminal, liberando-as da membrana. Em um outro estudo,

eles mostraram que a YopT cliva as Rho GTPases RhoA, Rac e Cdc42 diretamente na cisteína da

porção C-terminal (SHAO et al., 2003).

A YopH é uma tirosina fosfatase com 51 kDa que desfosforiliza p130

Cas

, p125

FAK

paxilina e a proteína ligante de Fyn (FBP), todas elas proteínas tirosina-fosforiladas encontradas

nos complexos de adesão focal (FA). A atividade de YopH parece causar a desunião de FA, o

que diminui a entrada da bactéria nas células HeLa ou sua fagocitose pelos macrófagos (BLACK

& BLISKA, 1997; PERSSON et al., 1997; BLACK et al., 1998; HAMID et al., 1999), e também

inibe o “burst” oxidativo. Além disso, YopH pode funcionar cooperativamente com YopE na

inibição da fagocitose por neutrófilos (RUCKDESCHEL et al., 1996). Sauvonnet et al. (2002a)

evidenciaram a atuação da YopH na inativação da via do fosfatidilinositol-3 quinase, com

conseqüente supressão, nos macrófagos, da expressão da proteína 1 quimioatraente de monócitos

(MCP-1) e da proliferação de células T. A descoberta do efeito supressor sobre os linfócitos T e

B, atribuído à YopH (YAO et al., 1999), vem dando margem a uma série de pesquisas.

Recentemente foram apontados os alvos através dos quais a proteína fosfatase YopH atuaria

sobre os linfócitos T. Alonso et al. (2004), mostraram que a YopH inibe a sinalização pelo TCR,

uma vez que promove a desfosforilação de Lck na posição Tyr-394 e, conseqüentemente,

paralisa as células T, prevenindo o desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa.

A YpkA (“Yersinia protein kinase A”) é outra Yop com 81 kDa, que mostra extensa

homologia com proteínas eucarióticas, mais propriamente com a família PSK das proteínas

serina/treonina quinases. Ela se autofosforila e, assim como a Yop H, interfere com a transdução

de sinais nas células do hospedeiro por interferir com os níveis celulares de fosforilação

(GALIOV et al., 1993; HAKANSSON et al., 1996; HARTLAND & ROBINS-BROWNE, 1998).

Dentro das células, YpkA se posiciona na superfície interna da membrana plasmática

(HAKANSSON et al., 1996). Juris et al. (2000) relataram que a YpkA é inicialmente produzida

como uma quinase inativa, que é posteriormente ativada pela actina, durante a translocação para

dentro da célula do hospedeiro. A interação entre YpkA e actina sugere que mudanças

morfológicas induzidas pela YpkA poderiam ser causadas por alterações no citoesqueleto de

actina (JURIS et al., 2000), e que o rompimento deste se deve à ação da YpkA sobre a pequena

GTPase RhoA, a qual desempenha um importante papel na dinâmica da actina dentro das células

(BARZ et al., 2000; DUKUZUMUREMYI et al., 2000). Embora a actina possa ser fosforilada in

vitro (JURIS et al., 2000), seu substrato in vivo não é conhecido. Através dessa habilidade em

romper o citoesqueleto de actina, YpkA pode prejudicar a fagocitose da Yersinia por macrófagos

e também a movimentação dessas células às áreas de infecção (JURIS et al., 2002). Um estudo

recente revelou que a YpkA pode afetar o citoesqueleto através de mecanismos tanto

dependentes como independentes de sua atividade quinase (WILEY et al., 2006). Há evidências

de que a YpkA é capaz de induzir anergia em macrófagos, e que desta forma suprime a

fagocitose e favorece a sobrevivência da Yersinia (JURIS et al., 2006).

Essas Yops, ao dificultarem ou mesmo inibirem a fagocitose da bactéria, fornecem à

mesma tempo suficiente para se replicar no organismo do hospedeiro (Tabela 1).

A proteína YopM (41 kDa) possui uma função enigmática até o momento. Ela consiste

quase inteiramente de seqüências semelhantes às repetições ricas em leucinas (LRRs)

(EVDOKIMOV et al., 2001) e tem se mostrado essencial para a virulência em modelos murinos

de infecção (LEUNG et al., 1990). Ela se liga tanto à trombina quanto ao fator de von

Willebrand, mas essas propriedades são dispensáveis para a virulência (HINES et al., 2001).

Acredita-se que o domínio LRR seja um motivo funcional de interação entre proteínas numa

variedade de vias de sinalização no interior da célula e também no meio extracelular, e

exatamente esta diversidade tem dificultado a descoberta da via exata que a YopM poderia afetar

(JURIS et al., 2002). Estudos têm demonstrado que a YopM não é apenas translocada dentro das

células HeLa durante infecção com Yersinia, mas também se localiza no núcleo dessas células,

trafegando através de uma via associada a vesículas (SKRZYPEK et al., 1998). Foi constatado

que a YopM se liga e promove a atividade quinase da proteína quinase C2-like e da proteína

quinase-1 ribossomal S6 (McDONALD et al., 2003), o que poderia explicar o efeito da YopM

sobre a expressão de genes envolvidos na progressão do ciclo celular e crescimento celular

(SAUVONNET et al., 2002b). A YopM pode ter muitos efeitos patogênicos, e um deles pode

ocorrer no núcleo, modulando a expressão gênica do hospedeiro em benefício do patógeno

(SKRZYPEK et al., 2003).

A YopJ (32,5 kDa) é a Yop efetora que possui funções antiinflamatórias mais

importantes além de ser responsável pela indução de apoptose em macrófagos in vitro e in vivo

(MILLS et al., 1997; MONACK et al., 1997; MONACK et al., 1998). Após a indução transitória

de múltiplas vias de sinalização (MAPK e NF- κB) pelo lipopolissacarídeo (LPS), a infecção por

Yersinia resulta numa severa inibição das vias MAPK (Erk, JNK e p38) nos macrófagos

(RUCKDESCHEL et al., 1997) e também num bloqueio da ativação do fator nuclear κB (NF-

κB), através da inibição da degradação do IκB e subseqüente translocação do NF-κB em

macrófagos e células epiteliais. Estudos sobre as possíveis funções da YopJ têm sugerido,

também, que a mesma seja capaz de inibir a produção de citocinas como TNF-α e IL-8, graças à

presença de um domínio SH2-like, que constitui uma característica comum de muitas proteínas

sinalizadoras eucarióticas (SCHESSER et al., 1998; BOLAND & CORNELIS, 1998; PALMER

et al., 1998). Considerando que os promotores do TNF-α e da IL-8 possuem sítios de ligação

para o NF-κB e AP-1 (ROEBUCK, 1999; LIU et al., 2000), e que os sinais MAPK e NF-κB

convergem para os fatores de transcrição AP-1 e NF-κB, a inibição da produção de citocinas é

provavelmente resultado do rompimento da ativação da MAPK e NF-κB (JURIS et al., 2002). A

apoptose de macrófagos causada pela YopJ, muito provavelmente, também resulta da inativação

do NF-κB (PAGLIARI et al., 2000). Artigos de Orth et al. (2000) revelaram que a YopJ pode

funcionar como uma cisteína protease. Esses autores também sugerem que a YopJ possa ser uma

protease ubiquitina-like, a qual tem sido recentemente envolvida na modulação de várias vias de

sinalização de células eucarióticas (YEH et al., 2000). A sugestão de que a YopJ possa inibir a

sinalização por remover proteínas ubiquitina-like dá uma nova perspectiva no que diz respeito

aos mecanismos de patogenicidade da Yersinia e vias de sinalização das células eucarióticas

(JURIS et al., 2002).

Tabela 1 - Descrição resumida dos mecanismos moleculares e respectivos efeitos celulares das

Yops efetoras:

Yop Mecanismo molecular Efeito celular

YopE

Proteína ativadora de GTPases (GAP): induz

hidrólise do GTP das RhoGTPases (RhoA, Rac1,

Cdc42).

Rompimento do citoesqueleto de actina e

prevenção da produção de IL-1β através da

inibição da Rac1.

YopT

Cisteína protease: cliva as RhoGTPases (RhoA,

Rac1, Cdc42) em suas porções C-terminais,

liberando-as da membrana celular. Inibe

irreversivelmente a sinalização pela família Rho.

Rompimento do citoesqueleto de actina.

YopH

Proteína fosfatase (PTPase): desfosforila FAK,

p130Cas, paxilina, FBP, SKAP-HOM. Inibe a via

PI3K/Akt e interfere com a produção de MCP-1.

Rompimento do complexo de adesão focal e

inibição da produção de citocinas pró-

inflamatórias.

YpkA /YopO

Serina/Treonina quinase: alvo intracelular

desconhecido. Ativada pela actina celular. Sua

porção C-terminal interage com RhoA e Rac1.

Rompimento do citoesqueleto de actina.

YopM

Proteína constituída por repetições ricas em

leucinas (LRR): se localiza no núcleo, forma

complexos com RSK1 e PRK2 (substratos

desconhecidos) e diminui os níveis de produção de

IL-15 e IL-15Rα.

Depleção de células NK.

YopJ / YopP

Cisteína protease: rompe as vias MKK e NF-κB. Inibição da produção de citocinas pró-

inflamatórias e indução de apoptose em

macrófagos infectados.

A resposta imune adaptativa, com a participação de diversas citocinas é essencial para a

defesa do hospedeiro contra patógenos bacterianos, incluindo os membros patogênicos do gênero

Yersinia (AUTENRIETH et al., 1992; AUTENRIETH et al., 1993a). No entanto, o efeito da

Yersinia sobre os componentes do sistema imune adaptativo, o qual é tão importante à sobrevida

dos animais infectados e à ligação observada entre infecção por Yersinia e auto-imunidade, não

está claro. Durante o curso natural da infecção por Yersinia, a bactéria certamente encontra

linfócitos quando ela coloniza e se multiplica extracelularmente nas placas de Peyer, linfonodos

mesentéricos, baço e fígado (AUTENRIETH et al., 1993b; AUTENRIETH & FIRSCHING,

1996). Nas lesões de baço e fígado induzidas por Yersinia estão presentes tanto células T como

macrófagos (AUTENRIETH et al., 1993a).

Vários estudos têm demonstrado a importância de citocinas pró-inflamatórias como, por

exemplo, TNF-α, IFN-γ e IL-12 durante a resposta imune contra Yersinia. A neutralização destas

citocinas foi capaz de eliminar a resistência a este patógeno, sugerindo que macrófagos ativados

por células T são importantes células efetoras na resposta protetora à Yersinia (AUTENRIETH

& HEESEMAN, 1992; BOHN et al., 1994; BOHN & AUTENRIETH, 1996).

Estudos in vitro indicam que Yersinia pode se ligar tanto a linfócitos T quanto B,

presumivelmente através das integrinas presentes nos linfócitos (LUNDGREN et al., 1996;

ARENCIBIA et al., 1997). Assim, linfócitos T e B são alvos potenciais para a bactéria in vivo.

Yao et al. (1999) relataram que Y. pseudotuberculosis pode interferir diretamente na ativação

mediada por receptor de antígeno na célula B e T e que os efeitos inibitórios sobre os linfócitos

são dependentes da produção de YopH. A presença da YopH nas células T e B resulta na

hipofosforilação de quase todos os componentes tirosina-fosforilados associados com o

complexo de sinalização do receptor do antígeno após ativação do mesmo. Conseqüentemente,

células T expostas transitoriamente à Yersinia foram incapazes de promover o influxo de cálcio e

produzir citocinas. Da mesma maneira, células B expostas transitoriamente a Yersinia, foram

incapazes de regular positivamente a molécula co-estimuladora B7.2, em resposta à estimulação

antigênica. Como resultado, uma grande variedade de respostas imunes mediadas por células T

ou B pode ser profundamente afetada durante a infecção. Ao estudar a influência das Yops sobre

a ativação policlonal dos linfócitos B de camundongos, Crespo et al. (2002) mostraram que

existem diferenças na capacidade imunomoduladora entre as Yops secretadas por Y.

pseudotuberculosis e Y.enterocolitica. Enquanto as Yops secretadas por Y. enterocolitica

sorotipo O:3, de baixa virulência para camundongos, provocaram forte ativação, as Yops

secretadas por Y. pseudotuberculosis não provocaram ativação policlonal dos linfócitos B.

Portanto, o contato dos linfócitos B com as Yops de Y. pseudotuberculosis impede a ativação

destas células e, conseqüentemente, a produção aumentada de imunoglobulinas policlonais

(MEDEIROS et al., 2003).

Estas observações sugerem uma nova maneira pela qual Yersinia pode incapacitar a

resposta imune adaptativa do hospedeiro. Assim, Yersinia parece ter evoluído no que diz respeito

à produção de fatores de virulência que são dirigidos especificamente contra os diferentes tipos

celulares que a bactéria encontra no curso de uma infecção.

Um balanço entre as citocinas Th1 e Th2 pode influenciar o curso da infecção por

Yersinia, principalmente na fase inicial da resposta imune do hospedeiro (ZHAO et al., 2000).

As subpopulações Th1 e Th2 têm sido relacionados à regulação de muitas respostas

imunes. As citocinas tipo Th1, como interferon-γ – (IFN-γ) e fator de necrose tumoral (TNF-α)

são necessárias para uma efetiva resposta imune celular contra bactérias intracelulares,

enquanto células Th2 (IL-4 e IL-5) são responsáveis pela indução da resposta humoral. Deste

modo, as respostas Th1 são essenciais para a eliminação da bactéria, enquanto as Th2 estão

associadas com a suscetibilidade e disseminação da infecção (HERMANN-MÄRHER &

HÖKLER, 1998; YIN et al., 1997).

O IFN-γ, também envolvido na resposta contra Yersinia, é a principal citocina ativadora

de macrófago, promovendo funções críticas tanto na imunidade inata quanto na adaptativa

mediada por células. Produzido por células NK, células CD4

Th1 e linfócitos T CD8

, constitui

a principal citocina do perfil Th1. Na resposta imune adaptativa, o IFN-γ é produzido por LT em

resposta ao reconhecimento do antígeno, e suas principais funções são aumentar a função

microbicida dos macrófagos, por estimular a síntese de reativos intermediários do oxigênio e

óxido nítrico, e estimular a expressão de moléculas do MHC de classe I e II; além de promover a

diferenciação dos linfócitos em CD4

Th1, dentre outras funções. O TNF-α atua em sinergismo

com o IFN-γ na ativação macrofágica (ABBAS & LICHTMAN, 2003). Camundongos BALB/c

são maus produtores de IFN-γ, enquanto camundongos C57BL/6 são bons produtores dessa

citocina. A administração de IFN-γ, IL-12, ou anticorpos anti-IL-4 tornam os camundongos

BALB/c resistentes à Yersinia. Estes resultados sugerem que IL-4, produzida por células T

CD4

, deve estar envolvida na promoção da suscetibilidade de camundongos BALB/c à Yersinia.

Além disso, foi demonstrado que os níveis elevados de IFN-γ, predominantemente dependentes

de IL-12, produzidos por células T CD4

e células NK de camundongos C57BL/6,

correlacionam-se com resistência contra Yersinia. De acordo com estes resultados, a proteção

mediada por IL-12 dos camundongos BALB/c foi parcialmente eliminada através de

administração de anticorpos anti-IFN-γ (BOHN & AUTENRIETH, 1996).

Enquanto o IFN-γ se apresenta como a principal citocina do perfil Th1, a IL-4 constitui

a principal do perfil Th2, possuindo funções tanto indutoras como efetoras. As maiores fontes

de IL-4 são os LT CD4

do perfil Th2 e os mastócitos e basófilos ativados (SEDER & PAUL,

1994). As ações biológicas mais importantes desta citocina são: estimular a mudança das

cadeias pesadas das imunoglobulinas para o isotipo IgE e estimular o desenvolvimento de

células Th2 a partir dos LT CD4; além de funcionar como um fator de crescimento autócrino

para estas células (ABBAS & LICHTMAN, 2003).

O papel das citocinas Th2 tais como IL-4 ou IL-10 na infecção por Yersinia precisa ser

melhor investigado (HEIN et al., 2000).

A resposta inflamatória é eventualmente abolida por citocinas antiinflamatórias,

especialmente a IL-10. Esse processo natural de regulação assegura a homeostase no interior do

hospedeiro e previne o choque séptico (TATO & HUNTER, 2002; VASSELON & DETMERS,

2002). Um estudo mostrou que o antígeno V (LcrV) de Y. pestis regula negativamente o

processo inflamatório durante a rápida e letal peste, por estimular a produção de IL-10

(BRUBAKER, 2003). A IL-10 é induzida pela IL-12, porém inibe a produção e os efeitos

mediados pela mesma (MORRIS et al., 1994). A IL-10 parece agir de forma antagônica à IL-12

durante yersiniose em camundongos BALB/c, de modo que a adição de IL-10 às culturas de

esplenócitos diminui a produção de IFN-γ induzida por Yersinia, enquanto que a adição de

anticorpos anti-IL-10 aumenta a produção do mesmo. (BOHN & AUTENRIETH, 1996). Ao

estudar a expressão de mRNA, Bohn et al. (1994), demonstraram que camundongos C57BL/6

produzem mais IL-10 do que os BALB/c.

Especula-se que o TGF-β seja crítico para se obter uma ótima resposta imune contra

Yersinia, já que, talvez, ele possa ser o responsável pelo balanço tanto das atividades tóxicas

quanto das protetoras mediadas pela IL-12 (BOHN et al., 1998). A principal ação do TGF-β no

sistema imune é inibir a proliferação e ativação de linfócitos e outros leucócitos. Ele é secretado

por LT estimulados, fagócitos mononucleares ativados por LPS e muitos outros tipos celulares.

Alguns LT reguladores produzem TGF-β e IL-10, que também possui atividade

imunossupressora (ABBAS & LICHTMAN, 2003). Os LT reguladores induzidos por

administração de antígenos pela via oral e cuja ação supressora é exercida por meio da produção

de TGF-β pertencem a um subgrupo chamado Th3 (WEINER, 2001). O efeito imunossupressor

do TGF-β parece ser causado por inibição da produção de IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-2 e IL-12

(ESPEVIK et al., 1987, RANGES et al., 1987, HUNTER et al., 1995). Na infecção experimental

por Yersinia, a administração de TGF-β aumentou a resistência contra a bactéria em

camundongos resistentes, mas não teve impacto no curso da infecção em camundongos BALB/c.

A administração de IL-12 mais TGF-β tornou os camundongos C57BL/6 mais resistentes à

infecção pela Yersinia e aboliu os efeitos tóxicos da IL-12 (BOHN et al., 1998). Entretanto, o

papel imunorregulador do TGF-β ainda não está claro. Encontram-se relatos contraditórios sobre

as respostas Th1 mediadas por TGF-β, indicando que esta citocina estimula (FARGEAS et al.,

1992; NAGELKERKEN et al., 1993; SWAIN et al., 1991) ou regula negativamente o

desenvolvimento de células Th1 (HOHEN et al., 1995; WU et al., 1994).

O papel do TGF-β também apresenta-se contraditório durante a infecção com outros

patógenos. O TGF-β promove infecção por L. braziliensis (BARRAL et al., 1993) e T. gondii

(HUNTER et al., 1995) em correlação com a regulação negativa de IL-4 e IL-10 (BARRAL et

al., 1993). Por outro lado, TGF-β exerce um papel benéfico na resistência contra C. albicans

(SPACCAPELO et al., 1995) e L. monocytogenes (NAKANE et al., 1996), regulando

positivamente a produção de IL-4 e IL-10 (SPACCAPELO et al., 1995), regulando

negativamente IFN-γ e TNF-α, e induzindo a produção de IL-6 (NAKANE et al., 1996).

Frente a tantas controvérsias e incertezas no que diz respeito ao balanço entre as citocinas

pró-inflamatórias e reguladoras durante as infecções por Yersinia, torna-se bastante evidente a

importância e necessidade de estudá-las.

Estudos realizados pelo nosso grupo sugeriram que enquanto as Yops secretadas por Y.

pseudotuberculosis, principalmente a YopE e a YopH, possuem efeitos supressores sobre a

produção de IL-12, TNF-α e NO (MONNAZZI et al., 2004), o extrato celular e as Yops de Y.

enterocolitica estimulam a produção de TNF-α, embora bem menos que o LPS (CARLOS et al.,

2004).

O papel das células T CD4

na eliminação da infecção por Yersinia, embora parece ser

ambíguo. As células T CD4

promovem eliminação de Y. enterocolitica em camundongos

C57BL/6, ao mesmo tempo em que promovem exacerbação da infecção em camundongos

BALB/c (BOHN & AUTENRIETH, 1996). Já a depleção de células NK ou células T CD8

não

tiveram impacto na eliminação da infecção por Yersinia em camundongos BALB/c. Entretanto,

tanto células T CD8

quanto células NK são cruciais na eliminação de infecção por Yersinia em

camundongos BALB/c depletados de células T CD4

, sugerindo que células T CD4

podem

inibir as células T CD8

e NK no que se refere à sua potencial capacidade de eliminar Yersinia

(BOHN et al., 1998).

O grupo de proteínas pertencentes à família NF-κB de fatores de transcrição é muito

importante no que diz respeito à regulação do sistema imune, principalmente por estar envolvido

na expressão de genes de citocinas. Os cinco membros da família NF-κB incluem NF-κB1 (p50),

NF-κB2 (p52), RelA (p65), RelB e c-Rel. A invasão do hospedeiro por um patógeno está

freqüentemente associada com a ativação do NF-κB, o qual coordena vários aspectos da função

imune necessários para a resistência à infecção. No entanto, alguns microrganismos conseguem

interferir com a ativação do NF-κB evadindo-se da resposta imune do hospedeiro (TATO &

HUNTER, 2002) e sobrevivendo no interior do mesmo. Yersinia enterocolitica prejudica a

ativação do NF-κB em macrófagos peritoneais murinos e células da linhagem J774.1 e também

nas células HeLa epiteliais humanas (RUCKDESCHEL et al., 1998).

A ativação do NF-κB fornece proteção contra a morte por apoptose (BAICHWAL &

BAEUERTE, 1997). De forma análoga, a ativação do NF-κB é essencial para a autodefesa e

sobrevivência dos macrófagos quando do encontro com bactéria ou LPS (ALIPRANTIS et al.,

2000; KITAMURA, 1999; RUCKDESCHEL et al., 1998). A YopP de Yersinia enterocolitica é

capaz de, simultaneamente, bloquear a via do NF-κB e desencadear a apoptose em macrófagos

(RUCKDESCHEL et al., 2001b). Ruckdeschel et al. (2001a) demonstraram que a arginina-143

da YopP de Y. enterocolitica é crucial na supressão do NF-κB e na indução de apoptose em

macrófagos. A YopJ de Y. pseudotuberculosis também causa inibição da ativação do NF-κB e da

expressão de genes de citocinas (SCHESSER et al., 1998).

Alguns vírus, como por exemplo o HIV, manipulam a ativação do fator NF-κB no

sentido de promover a inibição da resposta imune (AKARI et al., 2001; BOUR et al., 2001).

O desenvolvimento de estratégias para interferir com a ativação do NF-κB fornece, sem

dúvida, vantagens aos microrganismos invasores, mas algumas vezes torna-se obscuro se a

ativação deste fator, em resposta à infecção, beneficia mais ao hospedeiro ou ao patógeno

(TATO & HUNTER, 2002).

Tendo conhecimento da importância dos perfis Th1 e Th2 durante a infecção por

bactérias do gênero Yersinia, objetivou-se neste trabalho verificar a influência das proteínas

Yops secretadas por Y. pseudotuberculosis, codificadas por plasmídeo, sobre a síntese, in vivo,

das citocinas do perfil Th1 (IFN-γ, IL-2 e TNF-α), do perfil Th2 (IL-4 e IL-10) e TGF-β; e

também sobre a ativação do fator de transcrição NF-κB. Ainda com o intuito de estudar mais a

fundo as maneiras pelas quais esta bactéria influencia a resposta imune adaptativa do hospedeiro

e, ao mesmo tempo, como este responde, foi analisada a influência das Yops sobre as

subpopulações de linfócitos T predominantes durante a infecção e sobre a função citotóxica dos

LT CD8.

II - OBJETIVOS

1. Determinar a cinética de infecção da amostra selvagem de Y. pseudotuberculosis e das

amostras mutantes para a secreção das Yops, no baço e fígado dos animais infectados por

via intravenosa .

2. Quantificar as subpopulações de linfócitos T CD4 e CD8 no decorrer da infecção com as

diferentes amostras bacterianas.

3. Verificar o papel das Yops E, H e M na determinação do padrão de citocinas Th1 e Th2

durante infecção de camundongos BALB/c.

4. Verificar o papel das Yops E, H e M na ativação do fator de transcrição NF-κB.

5. Avaliar a atividade citotóxica dos linfócitos T CD8 obtidos de camundongos infectados.

III – MATERIAIS E MÉTODOS

1 - Fluxograma de trabalho:

Sacrifício dos animais no 5°, 7°, 14° e 21° dia após a infecção

Obtenção das células esplênicas

Marcação dos

antígenos de

superfície

(CD3, CD4 e CD8)

Marcação dos antígenos

de superfície (CD3,

CD8) e das citocinas n

compartimento

intracelular

Obtenção dos

extratos nucleares

Purificação dos LT-

CD8 e cocultura

com MØs

infectados “in vitro”

Análise fenotípica

Detecção

intracelular das

citocinas

Determinação da

ativação do NF-κB

Ensaio de

citotoxicidade

Metodologia: Citometria de fluxo

Metodologia:

ELISA

Metodologia:

Dosagem de LDH

Amostras bacterianas:

YpIIIpIB102 – WT

YpIIIpIB522 – YopE

YpIIIpIB29 – YopH

YpIIIpIB143 – YopM

YpIII – pYV

Reativação através de

passagem em animal

Determinação

da dose

infectante

Preparo do

inóculo

Infecção dos animais

(iv)

2 – Animais de experimentação:

Camundongos BALB/c, fêmeas, SPF (specific pathogen free), com seis a oito semanas

de idade, fornecidos pelo Centro de Bioterismo da Universidade Estadual de Campinas

(CEMIB - UNICAMP). Os animais foram transportados em mini-isoladores até a Faculdade de

Ciências Farmacêuticas (UNESP – Câmpus Araraquara) onde ficaram alojados no Biotério do

Departamento de Ciências Biológicas. Os animais permaneceram em isoladores durante todo o

tempo dos experimentos, para garantir sua condição SPF. A ração, a água e a serragem

fornecidas aos animais foram previamente esterilizadas em autoclave a 120°C por 15 minutos.

3 - Amostras bacterianas:

• Yersinia pseudotuberculosis YpIIIpIB102 (WT): amostra selvagem, portadora do

plasmídeo de virulência e, portanto, capaz de secretar todas as Yops.

• Yersinia pseudotuberculosis YpIIIpIB522 (yopE

): amostra mutante defectiva na

secreção da YopE.

• Yersinia pseudotuberculosis YpIIIpIB29 (yopH

): amostra mutante defectiva na

secreção da YopH.

• Yersinia pseudotuberculosis YpIIIpIB143 (yopM

): amostra mutante defectiva na

secreção da YopM.

• Yersinia pseudotuberculosis YpIIIpIB232 (yopJ

): amostra mutante defectiva na

secreção da YopJ.

• Yersinia pseudotuberculosis YpIII: amostra curada do plasmídeo de virulência e,

portanto, incapaz de secretar todas as Yops.

Essas amostras foram gentilmente cedidas pelo Dr. Hans Wolf-Watz, do Departamento

de Biologia Celular e Molecular da Universidade de Umea, Suécia.

4 - Infecção experimental dos animais com as amostras de Yersinia pseudotuberculosis

YpIII .

4.1 - Reativação das amostras de Yersinia:

As amostras foram enviadas em pequenos pedaços de filtro de nitrocelulose e foram

recuperadas colocando-se os filtros em placas de Luria Agar (GibcoBRL) contendo 50 µg/mL

de kanamicina, uma vez que todas as amostras são kanamicina resistentes. Os crescimentos

bacterianos conseguidos nas placas de Luria foram semeados em caldos tripticase soja (TSB)

(Acumedia), também contendo 50 µg/mL de kanamicina, e a partir dos crescimentos obtidos

nestes caldos é que foram preparados os respectivos estoques glicerinados; os quais foram

mantidos a -80°C. Antes de serem utilizadas, as bactérias foram reativadas através de passagem

em camundongos. Para tal, dois camundongos foram inoculados por via intravenosa com 0,2

mL de uma suspensão do microrganismo contendo cerca de 10

unidades formadoras de

colônias (UFC)/mL, a qual foi preparada a partir de uma suspensão contendo 10

UFC/mL,

padronizada pela escala 3 de Mac Farland e apresentando leitura de densidade óptica, a 550nm,

igual a 0,36 (Du

530 Life Science UV/Vis Spectrophotometer – Beckman). Após 24 horas,

esses animais foram sacrificados e os respectivos baços retirados e macerados em solução

salina estéril. Uma alíquota deste macerado (aproximadamente 0,2 mL) foi semeada em placas

contendo meio ágar base de sangue (BAB) (Bio-Rad), as quais foram incubadas a 25

C por 48

horas. A partir deste crescimento foi preparado o inóculo utilizado para infectar os animais.

4.2 - Determinação da dose infectante:

O crescimento bacteriano obtido no meio de cultura BAB, devidamente reativado, foi

ressuspendido em salina 0,85% estéril e padronizado em espectrofotômetro a 550nm, conforme

já descrito no item 3.1. A partir da suspensão contendo 10

UFC/mL foram feitas várias

diluições do inóculo a fim de se ajustar o número de UFC/mL a serem inoculadas. Grupos de 5

camundongos foram inoculados com cada uma das diluições a serem testadas (três diluições de

cada amostra), e observados diariamente por um período de 30 dias. O número de mortes

dentro deste intervalo foi devidamente anotado.

4.3 - Preparo do inóculo:

Após reativação e determinação da dose infectante, foi preparado o inóculo bacteriano

utilizado na infecção dos animais. Este inóculo foi também preparado com a amostra reativada

e de acordo com a metodologia anteriormente descrita (item 3.1). A concentração da dose

inoculada foi sempre confirmada através da semeadura da suspensão contendo 10

UFC/mL

(0,1 mL) em meio de cultura BAB.

4.4 - Esquema de infecção:

Lotes de 24 animais foram infectados com as diferentes amostras de Y.

pseudotuberculosis, mantendo-se um lote com o mesmo número de animais não infectados

como controle. A inoculação se deu pela via intravenosa, através da veia da cauda, e o volume

inoculado foi sempre de 0,2 mL por camundongo. Grupos de animais infectados e controles

foram sacrificados, os baços retirados (em condições assépticas) no 5

, 7º, 14º e 21º dias após a

infecção (pi) e as respectivas suspensões de células esplênicas preparadas de acordo com os

ensaios aos quais se destinavam.

5 - Cinética de Infecção:

Para estudar a cinética de infecção das diferentes amostras, lotes de 20 animais foram

infectados como descrito acima e grupos de 4 animais foram sacrificados no 2º, 5º, 7º, 14º e 21º

dias pi. O baço e o fígado de cada animal foram removidos assepticamente e homogeneizados

em salina 0,85%. A partir destes macerados foram preparadas as diluições 1/10 e 1/100.

Alíquotas de 0,1mL de cada uma das diluições foram semeadas em duplicata em placas de

BAB. As UFC foram contadas após um período de incubação de 48 horas a 25 ºC em estufa

BOD. As colônias de Yersinia foram confirmadas através do teste de aglutinação com soro

específico anti-Y. pseudotuberculosis produzido em coelho.

Concomitante ao experimento de cinética de infecção, realizou-se a pesagem do baço e

fígado dos animais infectados e de animais não infectados, para comparação dos resultados.

6 - Análise histológica de cortes de baço e fígado de animais infectados com a amostra

selvagem

O baço e o fígado de animais infectados com a amostra WT e de animais não infectados

foram obtidos no 14° dia pi. Em seguida, estes órgãos foram fixados em formalina e embebidos

em parafina. Cortes de 5µm foram diafanizados em xilol e corados com hematoxilina e eosina

(H/E). Na análise histológica descritiva foram avaliadas as alterações morfológicas e a presença

de reação inflamatória no tecido esplênico e hepático em decorrência da infecção. As imagens

foram obtidas através de microscópio óptico (Leica), com câmera de vídeo acoplada e

microcomputador, com um programa analisador de imagens (DC Viewer) conectado.

7 - Quantificação das subpopulações de linfócitos T e determinação do padrão de citocinas

Th1 e Th2 através do método de citometria de fluxo (Morita et al., 1998).

7.1 – Obtenção das células esplênicas:

Os camundongos do grupo controle e infectados foram sacrificados em câmara de CO

os baços retirados em condições assépticas e macerados em 5 mL de tampão salina-fosfato

(PBS - pH 7,2) gelado. A suspensão de células assim obtida foi transferida para tubos cônicos

de polietileno e centrifugada a 358 g (Centrífuga Fanem Excelsa II 206MP). Após a

centrifugação, as células foram lavadas em meio PBS (pH 7,2) por mais duas vezes. Antes da

terceira lavagem, as células foram incubadas por 5 minutos à temperatura ambiente em uma

solução de cloreto de amônio 0,83% e soro fetal (3:1) para que ocorresse a lise das hemácias.

Realizou-se nova centrifugação e, ao término da mesma, as células foram lavadas com 5 mL de

RPMI-1640 (Sigma) suplementado com L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U/mL),

estreptomicina (100 ug/mL) e 10% de soro fetal bovino. Em seguida as células foram

ressuspendidas em 1 mL RPMI, igualmente suplementado, para contagem do número de

linfócitos viáveis.

7.2 - Viabilidade das células esplênicas:

O número de células mononucleares viáveis presente no baço de cada camundongo foi

avaliado através da técnica de exclusão do Azul Trypan (Mishell & Shiigi, 1980). Para isso as

células foram diluídas 1:100 no respectivo corante e contadas em Câmara de Neubauer.

7.3 - Análise fenotípica dos linfócitos esplênicos:

Para cada animal foi preparada uma suspensão contendo 2 x 10

células esplênicas/mL

em meio RPMI-1640 suplementado com 5% de soro fetal, 2 mM de L-glutamina, 5 x 10

-5

M de

2-mercaptoetanol, 10 µg/mL de estreptomicina e 100 U/mL de penicilina (RPMI-c). Esta

suspensão de células foi usada tanto para realização da análise fenotípica dos linfócitos quanto

para a detecção intracitoplasmática das citocinas. Uma parte desta suspensão, que foi destinada à

tripla coloração com anticorpos monoclonais contra marcadores de superfície celular, foi

transferida para um outro tubo cônico e centrifugada a 358 g por 5 minutos. O sedimento celular

foi solubilizado em solução de PBS contendo 1% de BSA e a solução Mouse FcBlock (BD

PharMingen) foi adicionada a cada tubo. Após incubação de 20 minutos a 4°C iniciou-se a

marcação dos antígenos CD3, CD4 e CD8. Para isso, as células foram incubadas por 30 minutos

a 4°C com quantidades saturantes dos anticorpos anti-CD3 conjugado ao isotiocianato de

fluoresceína (FITC), anti-CD4 conjugado à ficoeritrina (PE) e anti-CD8 conjugado ao “spectral

red” (SPRD) (todos da marca Southern Biotech). Ao término desta incubação, as células foram

lavadas duas vezes com PBS contendo 1% de BSA (358 g / 5 minutos) e ressuspendidas em PBS

contendo 1% de formol.

As células permaneceram na solução de PBS 1% de formol, a 4°C e no escuro até o

momento da análise no citômetro de fluxo FACSCanto (BD). Os linfócitos foram

especificamente analisados por “gating” seletivo baseado nos parâmetros de tamanho e

granulosidade celulares. As imunoglobulinas isotipo-específicas, não reagentes, marcadas com

os mesmos fluorocromos (Caltag), foram utilizadas como controles (isotipo controle). Para

análise dos dados foi utilizado o programa FACSDiva (BD).

7.4 - Detecção intracelular das citocinas IL-2, IL-4, IL-10, IF-γ

γγ

γ, TF-α e TGF-β

ββ

β:

O restante da suspensão de células esplênicas a 2 x 10

células/mL, destinada à detecção

intracitoplasmática das citocinas, foi distribuída em uma placa de 24 cavidades. Parte destas

células foram estimuladas com 25 ng/mL de forbol miristato acetato (PMA) (Sigma) e 1 µg/mL

de ionomicina (Sigma), e a outra parte não recebeu estímulo. As células foram incubadas por

37°C, em atmosfera úmida contendo 5% de CO

, por 4 horas. Em seguida, foi adicionado 10

µg/mL de brefeldina A (Sigma) a todas as cavidades e a placa foi incubada, nas mesmas

condições de temperatura e tensão de CO

, por mais duas horas. A brefeldina A foi utilizada

para melhorar a análise das citocinas intracelulares devido ao seu efeito inibitório na secreção de

proteínas, o que permite um acúmulo das citocinas no complexo de Golgi e conseqüentemente

um aumento do sinal, que poderá ser detectado pelo citômetro de fluxo. Ao final do período total

de seis horas de incubação, as suspensões de células, tanto estimuladas “in vitro” quanto não

estimuladas, foram transferidas das cavidades da placa para respectivos tubos cônicos e

centrifugadas a 358 g por 5 minutos. Em seguida as células foram lavadas uma vez com PBS 1%

de BSA (358 g / 5 minutos) e ressuspendidas igualmente em PBS 1% de BSA. Adicionou-se às

suspensões celulares a solução Mouse FcBlock (BD PharMingen) e as células foram incubadas

a 4°C por 20 minutos. Terminada esta incubação, as células foram distribuídas nos respectivos

tubos de citometria e iniciou-se a marcação das moléculas de superfície CD3 e CD8; uma vez

que a produção de citocinas foi analisada nas subpopulações CD4 e CD8 de linfócitos T. Para

isto, foram adicionados os anticorpos anti-CD3 (FITC) e anti-CD8 (SPRD) e realizou-se uma

incubação por 30 minutos, a 4°C e ao abrigo da luz. Em seguida as células foram lavadas duas

vezes com PBS 1% BSA (358 g / 5 minutos) e ressuspendidas na solução CytoFix / CytoPerm

(BD PharMingen) a fim de proporcionar a fixação e permeabilização das células. Após

incubação de 20 minutos a 4°C e ao abrigo da luz, as células foram lavadas mais duas vezes com

o tampão Perm Wash (BD PharMingen). As células foram ressuspendidas em 50L de Perm

Wash e então foram adicionados, cada um ao seu respectivo tubo para citometria, os anticorpos

monoclonais citocina-específicos e anticorpos monoclonais isotipo-controles, todos conjugados

com PE; exceto o anticorpo anti-TGF-β que era biotinilado. Seguiu-se nova incubação a 4°C e ao

abrigo da luz por um período de 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com Perm

Wash e todos os tubos, com exceção daqueles destinados à marcação do TGF- β, foram

adicionados de PBS 1% de formol e acondicionados a 4°C e ao abrigo da luz até o momento da

análise no citômetro de fluxo. Aos tubos contendo as células incubadas com o anticorpo anti-

TGF-β biotinilado acrescentou-se a estreptavidina conjugada à PE (BD PharMingen) e os

mesmos foram incubados por mais 30 minutos a 4°C e ao abrigo da luz. Terminado este período,

estas células também foram lavadas mais duas vezes com o tampão Perm Wash e adicionadas de

PBS 1% de formol. Assim como os demais, estes tubos foram acondicionados a 4°C e ao abrigo

da luz até o momento da análise no citômetro de fluxo.

A análise dos dados foi feita no citômetro FACSCanto usando o programa FACSDiva

(BD). As citocinas produzidas pelos linfócitos T CD4

foram analisadas indiretamente através da

separação e análise da população de linfócitos CD3

CD8

, visto que a estimulação com forbol

ésteres diminui a expressão de CD4 (SOLBACH, 1982).

8 – Determinação da ativação do F-κ

κκ

κB nos linfócitos esplênicos (Viboud et al., 2003):

A ativação do NF-κB foi avaliada no 5º, 7º, 14º e 21º dia após a infecção com a amostra

selvagem da Y. pseudotuberculosis, com a amostra curada do plasmídeo de virulência e com as

amostras mutantes defectivas na secreção das Yops J, E, H e M, utilizando-se o kit TransAM

(ActiveMotif). Para tanto, foi necessário obter os extratos nucleares dos linfócitos provenientes

dos animais infectados com as diferentes amostras bacterianas de interesse e dos animais

controles. Foram sacrificados seis animais para cada dia de experimento

8.1 - Obtenção do extrato nuclear (Schreiber et al., 1989):

Os linfócitos esplênicos dos animais foram obtidos assepticamente, conforme já descrito

anteriormente, e o número de células ajustado em 2 x 10

células/mL em TBS (pH 7,2). Foi

transferido 1mL dessa suspensão para microtubos de 1,5 mL e as células foram sedimentadas por

“spinning” durante 1 minuto. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas

em 400 µL de Tampão A (10 mM Hepes pH 7,9, 10 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1

mM DTT, 0,5 mM PMSF). Os tubos foram gentilmente homogeneizados e incubados por 15

minutos em banho de gelo. Após o período de incubação, foram adicionados 25 µL da solução

de Nonidet P-40 10% (NP-40) e os microtubos foram agitados vigorosamente durante 10

segundos. As células foram centrifugadas durante 1 minuto a 13000 g, ressuspendidas em 50 µL

de Tampão C (20 mM Hepes pH 7,9, 0,4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1

mM PMSF) e, em seguida, colocadas em plataforma de agitação a 4ºC, por 15 minutos. Após

esse período de agitação o extrato nuclear foi centrifugado a 13000 g, durante 5 minutos, a 4ºC e

o sobrenadante obtido foi coletado e acondicionado a –80ºC. Uma pequena alíquota destes

extratos foi usada para dosagem de proteínas pelo método de Lowry (LOWRY et al., 1951).

8.2 - Ensaio de ativação do fator de transcrição F-κ

κκ

κB:

Este ensaio foi realizado conforme o protocolo do kit TransAM NF-κB (Active Motif) e

usando-se os tampões e soluções que acompanhavam o mesmo.

Foram adicionados às cavidades da placa, sobre as quais já se encontravam aderidos

oligonucleotídeos com sítios de ligação do DNA do NF-κB (5’ - GGGACTTTCC - 3’), 30 µL do

“tampão de ligação”. Em seguida foram colocados 20 µL/cavidade de cada amostra (extratos

nucleares), já diluídas 1/100 em “tampão de lise”. As amostras foram diluídas cem vezes a fim

de se alcançar a concentração de 2 a 20 µg de extrato nuclear, sugerida pelo fabricante. A placa

foi incubada por 1 hora, à temperatura ambiente e com agitação suave (aproximadamente 100

rpm, sobre plataforma de agitação). Durante esta incubação, foi proporcionada a ligação

específica da forma ativa do NF-κB, contida nos extratos nucleares, aos oligonucleotídeos

imobilizados nas cavidades da placa. Terminado o período de incubação, as cavidades foram

lavadas três vezes com 200 µL/cavidade de “tampão de lavagem”. Foram adicionados então 100

µL do anticorpo primário contra o NF-κB por cavidade. Seguiu-se nova incubação por 1 hora, à

temperatura ambiente, porém não mais sob agitação. Estes anticorpos usados para detectar o NF-

κB reconhecem um epítopo nas subunidades p65 ou p50 que se torna acessível apenas quando

este fator nuclear encontra-se ativado e ligado ao seu DNA alvo. Após a incubação com o

anticorpo primário, as cavidades foram novamente lavadas três vezes com o “tampão de

lavagem” (200 µL/cavidade) e o anticorpo secundário conjugado à peroxidase (HRP) foi

adicionado (100 µL/cavidade). Mais uma incubação de 1 hora, à temperatura ambiente e ao

abrigo da luz foi realizada e, ao término desta, foram executadas as devidas lavagens da mesma

forma como já descrito acima. Como última etapa do ensaio, foram adicionados às cavidades

100 µL da “solução de substrato” e a placa foi incubada por 10 minutos, à temperatura ambiente

e ao abrigo da luz. A reação foi paralisada pela adição de igual volume da “solução de parada” e,

logo em seguida, foi feita a leitura em espectrofotômetro de microplacas (BioRad 550) usando-se

o filtro de 450 nm.

Como controle positivo para a ativação do NF-κB foram usados extratos nucleares de

células Jurkat (2,5 µg/cavidade) estimuladas com TNF-α, fornecidos pelo kit.

9 – Avaliação da atividade citotóxica dos linfócitos esplênicos.

9.1 – Obtenção das células do exsudato peritoneal:

Os camundongos destinados à obtenção de células do exsudato peritoneal foram

previamente inoculados com 3,0 mL de Tioglicolato 3% (Difco) pela via intraperitoneal a fim

de estimular os macrófagos desta cavidade. Após 3 dias de estímulo, os animais foram

sacrificados e a cavidade peritoneal exposta. Foram inoculados nesta cavidade 5,0 mL de PBS

estéril gelado e através de massagem do peritôneo as células foram desprendidas e coletadas.

As células foram então lavadas de 2 a 3 vezes por centrifugação a 358 g (Centrífuga Fanem

Excelsa II 206MP) durante 5 minutos em PBS estéril e, em seguida, ressuspendidas em 1mL de

RPMI-1640 para contagem em câmara de Neubauer.

9.2 – Infecção dos macrófagos “in vitro”:

Os macrófagos peritoneais de camundongos, obtidos como descrito acima foram

infectados com a amostra selvagem da bactéria. Para isso, uma suspensão de macrófagos

ajustada em 5 x 10

células/mL foi distribuída em uma placa de microcultivo, no volume de

100 µL por cavidade. Sobre estas células foram adicionados 100 µL de uma suspensão

bacteriana, preparada com a amostra selvagem da Y. pseudotuberculosis, na concentração de 5

x 10

UFC/mL; fornecendo uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1:10. A placa foi

centrifugada a 250 g por 5 minutos e incubada durante 1 hora a 37ºC, 5% CO

. Terminada esta

incubação, as células foram lavadas duas vezes com RPMI-1640 a fim de se remover as

bactérias não internalizadas e, em seguida, incubadas por igual período e nas mesmas condições

de temperatura e tensão de CO

com 100 µL por cavidade de uma solução de gentamicina 100

µg/mL. Ao final deste período, os macrófagos devidamente infectados foram lavados mais duas

vezes com o meio RPMI-1640.

9.3 – Obtenção dos linfócitos T CD8 (LT-CD8):

No 5º, 7º, 14º e 21º dia pi foram obtidas as células esplênicas, conforme descrito no item

6.1, de três animais por dia. Foi feito um “pool” com estas células. Os LT-CD8 presentes neste

“pool” foram selecionados através de passagem em coluna de enriquecimento para LT-CD8

(R&D MCD8C-1000), a concentração foi ajustada em 2 x 10

células/mL e, então, estes LT-

CD8 foram cocultivados, em placas de 96 cavidades, com os macrófagos infectados.

9.4 - Ensaio de Citotoxicidade (Dube et al., 2004):

Um ensaio de citotoxicidade não radioativo foi realizado utilizando-se o kit CYTO-TOX

96 (Promega). Os macrófagos peritoneais de camundongos, obtidos e infectados como descrito

anteriormente, serviram como células apresentadoras de antígenos (CAA), que são as células-

alvo da reação. As CAAs foram incubadas durante 4 horas a 37 ºC e 5% CO

com os LT-CD8 (2

x 10

células/mL) provenientes dos animais infectados com as respectivas amostras bacterianas

ou dos animais controles. Após esta incubação a placa foi centrifugada a 250 g, 4ºC por 5

minutos e os sobrenadantes foram transferidos para uma nova placa de 96 cavidades (50

µL/cavidade). Foram adicionados aos sobrenadantes iguais volumes da solução substrato

(fornecida pelo kit) e a placa foi novamente incubada por 30 minutos, à temperatura ambiente e

ao abrigo da luz. Ao término deste período a reação foi interrompida através da adição de 50

µL/cavidade de uma solução de ácido acético 1 M (solução de parada fornecida pelo kit). A

citotoxicidade foi determinada espectrofotometricamente (490 nm) através da análise da

liberação de lactato dehidrogenase (LDH) resultante da lise das CAAs pela ação dos LT-CD8. A

lise específica foi calculada da seguinte forma: % de citotoxicidade = (A

- B-C) / (D - C) x 100,

onde A é o valor de lise obtido a partir da incubação das CAAs com os linfócitos T CD8 dos

animais infectados ou dos animais controles (Lise Experimental), B constitui a lise espontânea

dos LT-CD8, C corresponde à liberação espontânea de LDH pelos macrófagos e D à liberação

máxima de LDH pelos macrófagos .

10 - Análise Estatística:

Os dados foram apresentados como média ± SD e a comparação entre os grupos de

animais infectados e controles foi realizada através do teste t de Student, utilizando-se o

programa Origin 5.0. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.

IV – RESULTADOS

1 – Determinação da dose infectante para as amostras de Yersinia pseudotuberculosis:

Para determinar a dose infectante de cada amostra bacteriana usada neste trabalho, grupos

de cinco camundongos foram inoculados com três suspensões de diferentes concentrações de

cada uma delas e observados por um período de trinta dias. Os resultados estão apresentados na

Tabela 2.

Para a amostra selvagem de Y. pseudotuberculosis foram testadas as concentrações de

200, 20 e 1

UFC. Após o período de observação, foi possível escolher a concentração de 1 UFC

para inoculação dos lotes experimentais visto que, com esta dose, os animais não foram a óbito

durante o período de interesse.

Para a determinação da dose infectante da amostra YopE

os camundongos foram

inoculados com suspensões bacterianas cujas concentrações variaram de 2 x 10

a 2 x 10

UFC.

Verificamos que nas concentrações 2 x 10

e 2 x 10

ocorreram mortes de animais durante o

período observado. Portanto, foi escolhida a concentração de 2 x 10

UFC para a inoculação do

lote.

Para a amostra mutante YopH

os camundongos foram inoculados com suspensões

bacterianas cujas concentrações foram de 2 x 10

, 2 x 10

e 2 x 10

UFC. Verificamos a

ocorrência de óbitos para as concentrações de 2 x 10

e 2 x 10

UFC. Desta forma, a

concentração escolhida para a inoculação do lote foi de 2 x 10

UFC.

A fim de determinar a dose infectante da amostra YopM

foram inoculadas suspensões

bacterianas com concentrações iguais a 2 x 10

, 2 x 10

2 x 10

UFC. Nos grupos de animais

inoculados com as concentrações de 2 x 10

e 2 x 10

UFC ocorreram óbitos, o que nos levou a

escolher a concentração de 2 x 10

UFC para a inoculação do lote.

A dose infectante da amostra YpIII correspondeu a 0,1 vez a DL

, cujo valor já havia

sido anteriormente determinado (MEDEIROS et al., 2006).

Tabela 2: Doses das amostras bacterianas usadas para infecção dos lotes experimentais:

Amostra bacteriana Dose infectante (UFC)

YpIIIpIB102 (wt) 1

YpIIIpIB522 (yopE

) 2 x 10

YpIIIpIB29 (yopH

) 2 x 10

YpIIIpI141 (yopM

) 2 x 10

YpIII (pIB1

) 2 x 10

2 – Determinação da cinética de infecção no baço e fígado:

O estudo da cinética de infecção foi feito para avaliar a capacidade que cada uma das

amostras bacterianas possui de colonizar e persistir no baço e no fígado dos animais, após

inoculação intravenosa.

Os índices de colonização bacteriana, durante a infecção com a amostra selvagem,

aumentaram de forma gradativa até o 14° dia pós-infecção (pi). Pôde-se verificar, desde o 2º dia

pi, um número bastante elevado de UFC em ambos os órgãos; algo que não ocorreu durante a

infecção com as demais amostras. No 2° e 14º dia pi o número de UFC observado no baço foi

maior do que no fígado. A partir do 7° dia pi os animais já apresentaram sinais físicos de

infecção bastante evidentes e começavam a morrer. Poucos animais sobreviviam até o 21° dia pi,

e entre os sobreviventes não foi possível recuperar a bactéria a partir de nenhum dos órgãos, os

quais se apresentavam bastante atrofiados.

Durante o experimento com a amostra YopE

o pico da colonização bacteriana também

ocorreu no 14

dia pi, em ambos os órgãos. Tanto a colonização quanto a persistência desta

bactéria foi maior no fígado do que no baço. Embora em pequena quantidade no 2° dia pi, a

amostra YopE

colonizou o fígado em todos os dias analisados. Por outro lado, o baço foi

colonizado apenas do 5° ao 14° dia pi.

A amostra YopH

colonizou o baço e o fígado dos animais infectados de maneira

bastante parecida e persistiu em ambos durante o mesmo período de tempo. A colonização foi

detectada do 5° ao 14° dia pi, sendo que os maiores valores de UFC no baço e no fígado

ocorreram, respectivamente, no 14° e 7° dia pi. Esta amostra foi a que apresentou os maiores

índices de colonização, no que diz respeito ao número de UFC. A ausência de UFC observada

no 21° dia pi provavelmente se deve à eliminação da infecção pelos animais, uma vez que esta

amostra foi a que apresentou menor virulência.

O processo de colonização promovido pela amostra YopM

também começou a ser

observado a partir do 5° dia pi nos dois órgãos estudados. Assim como aconteceu na maioria

dos dias com as outras amostras, a taxa de colonização no fígado também foi um pouco maior

do que no baço, principalmente no 7° dia pi. Embora o maior número de UFC no fígado tenha

sido observado no 21° dia pi, do 7° ao 21° dia pi a variação observada foi muito pequena. Já no

caso do baço, o número de UFC aumentou gradativamente ao longo da cinética e, por isso, o

maior deles ocorreu no 21° dia pi.

A amostra YpIII, curada do plasmídeo de virulência, colonizou o baço dos animais desde

o 2° até o 14° dia pi, sendo que os maiores níveis de colonização ocorreram no 7° dia pi. No

fígado, foi possível observar UFC apenas no 2° dia pi e ainda assim em quantidade um pouco

menor do que a observada no baço.

Os valores médios do número de UFC por órgão estão representados na Figura 2 (A e

B) e Tabela 3.

Figura 2 -

Cinética de infecção no baço (A) e fígado (B) de camundongos BALB/c infectados pela via

intravenosa com as amostras WT, YopE

, YopH

, YopM

e YpIII de Y. pseudotuberculosis

. No 2°, 5°, 7°,

14° e 21° dia pós-

infecção os animais foram sacrificados, o baço e o fígado foram retirados,

homogeneizados em salina 0,85% e alíquotas de 0,1 mL, de duas diluições seriadas (1/10 e 1/100),

foram

semeadas em placas de BAB. Após 48 h de incubação a 26°C, o número de UFC por órgão foi

determinado. Os valores apresentados correspondem às medias de 4 animais por dia.

O desvio padrão foi

sempre menor que 25% dos valores observados.

Tabela 3 – Número de UFC (log) no baço e fígado dos animais no decorrer da infecção com a

amostra selvagem de Y. pseudotuberculosis, as respectivas mutantes e a amostra curada do

plasmídeo de virulência (valores representam médias + SD de 4 animais por dia):

Amostra bacteriana

Dias pós-infecção Baço Fígado

2º 3,7 + 0,3 3,4 + 0,7

5º 3,8 + 0,3 4,0 + 0,2

7º 4,3 + 0,1 4,6 + 0,4

14º 5,1 + 0,3 4,8 + 0,3

21º 0,0 + 0,0 0,0 + 0,0

2º 0,0 + 0,0 2,7 + 0,4

5º 2,7 + 0,0 4,6 + 0,3

7º 3,5 + 0,4 4,0 + 0,3

14º 4,5 + 0,4 5,0 + 0,5

YopE

21º 0,0 + 0,0 4,1 + 0,5

2º 0,0 + 0,0 0,0 + 0,0

5º 3,6 + 0,9 3,4 + 0,5

7º 5,7 + 0,9 6,8 + 0,4

14º 6,1 + 1,2 5,4 + 1,3

YopH

21º 0,0 + 0,0 0,0 + 0,0

2º 0,0 + 0,0 0,0 + 0,0

5º 3,6 + 0,5 3,7 + 0,6

7º 3,2 + 0,5 5,2 + 0,4

14º 5,0 + 0,4 5,3 + 0,6

YopM

21º 5,4 + 0,5 5,5 + 0,1

2º 3,8 + 0,3 3,6 + 0,5

5º 4,5 + 0,6 0,0 + 0,0

7º 5,1 + 0,1 0,0 + 0,0

14º 3,8 + 0,6 0,0 + 0,0

YpIII

21º 0,0 +

0,0 0,0 + 0,0

3 – Verificação do peso do baço e do fígado no decorrer da cinética de infecção:

Concomitante ao experimento de contagem do número de UFCs no 2°, 5°, 7°, 14° e 21°

dia pi, realizou-se também a pesagem do baço e do fígado para avaliar possíveis alterações

decorrentes da infecção (média e desvio padrão dos resultados estão apresentados na Figura 3

(A e B) e Tabela 4).

Todas as amostras estudadas, com exceção da WT no caso do fígado (2° dia pi) e da

YopH

no que diz respeito ao peso do baço (2° e 5° dias pi), causaram um decréscimo no peso

de ambos os órgãos no decorrer da cinética.

A amostra selvagem promoveu uma redução significativa no peso do baço dos animais

em todos os dias avaliados, embora o menor valor tenha sido observado no 14° dia pi (3,5

vezes menor do que o peso do baço dos animais não infectados). Já o fígado destes animais

apresentou um aumento significativo em seu peso logo no 2° dia pi e em seguida, a partir do 5°

dia, uma redução gradativa, cujo menor valor foi observado no 21° dia pi (cerca de 2 vezes

menor do que o valor apresentado pelos animais controles).

Da mesma forma que a amostra WT, a amostra YopE

promoveu uma redução

significativa no peso do baço em todos os dias e o menor valor foi observado no 14° dia pi (2,8

vezes menor que os controles). O peso do fígado começou a apresentar valores menores do que

os animais controles a partir do 7° dia pi, mas foi também no 14° dia pi que ocorreu a maior

redução (2,4 vezes).

Os animais infectados com a amostra YopH

apresentaram um aumento no peso do

baço, em relação aos animais não infectados, logo no 2° e 5° dias pi (respectivamente 1,2 e 1,4

vezes). A partir do 7° dia pi, o peso do baço destes animais permaneceu constante e

relativamente igual ao peso apresentado pelos animais controles. A única alteração significativa

no peso do fígado dos animais infectados com esta amostra ocorreu no 14° dia pi, quando se

observou uma pequena diminuição em relação aos controles.

A infecção com a amostra YopM

ocasionou um decréscimo gradativo no peso do baço

dos animais a partir do 7° dia pi, desta forma o menor valor foi observado no 21° dia pi (3,5

vezes menor do que o apresentado pelos animais controles). Já o peso do fígado sofreu redução

apenas no 7° e 14° dia pi (1,3 e 1,5 vezes, respectivamente).

Embora de maneira menos evidente que as amostras WT, YopE

e YopM

, a amostra

YpIII também causou diminuição no peso do baço dos animais no decorrer da infecção. O peso

do fígado, por sua vez, não sofreu alteração significativa em relação ao apresentado pelos

animais não infectados.

Figura 3 - Peso do baço (A) e fígado (B) de camundongos BALB/c no 2°, 5°, 7°, 14° e 21° dia pós

infecção pela via intravenosa com as amostras WT, YopE

, YopH

, YopM

e YpIII de

pseudotuberculosis

. Os animais foram sacrificados, o baço e o fígado foram retirados, homogeneizados

em salina 0,85% e alíquotas de 0,1 mL, de duas diluições seriadas (1/10 e 1/100), foram semeadas em

placas de BAB. Após 48 h de incubação a 26°C, o núme

ro de UFC por órgão foi determinado. Os

valores apresentados correspondem às medias dos pesos (em gramas) de, no mínimo, 4 animais por dia

+ SD.

C - Média dos valores obtidos com os animais controles durante todo o experimento.

* Significativo em relação ao grupo controle (p < 0,05)

Dias pós

infecção

Tabela 4 – Peso, em gramas, do baço e do fígado dos animais durante a cinética de infecção

(valores representam médias de, no mínimo, 4 animais por dia + desvio padrão):

Órgão

Amostra

bacteriana

Dia pós-infecção

2º 5º 7º 14º 21º Controle

0,09 + 0,02*

0,07 + 0,01*

0,05 + 0,01*

0,04 + 0,01*

0,05 + 0,01*

0,14 + 0,01

Yop E

0,10 + 0,02*

0,10 + 0,04*

0,07 + 0,02*

0,05 + 0,01*

0,10 + 0,03*

Yop H

0,17 + 0,03*

0,20 + 0,05*

0,16 + 0,04 0,11 + 0,02 0,13 + 0,04

Yop M

0,13 + 0,02 0,13 + 0,04 0,10 + 0,03*

0,06 + 0,01*

0,04 + 0,0*

Baço

YpIII

0,12 + 0,0* 0,10 + 0,02*

0,11 + 0,02*

0,10 + 0,02*

0,09 + 0,03*

1,56 + 0,11*

1,22 + 0,07*

1,08 + 0,21*

0,89 + 0,08*

0,64 + 0,05*

1,33 + 0,08

Yop E

1,40 + 0,05 1,22 + 0,06 0,87 + 0,05*

0,56 + 0,18*

1,00 + 0,15*

Yop H

1,40 + 0,04 1,28 + 0,14 1,18 + 0,16 1,20 + 0,07*

1,38 + 0,08

Yop M

1,25 + 0,13 1,34 + 0,18 1,00 + 0,26*

0,86 + 0,23*

1,13 + 0,18

Fígado

YpIII

1,40 + 0,13 1,27 + 0,12 1,20 + 0,16 1,30 + 0,03 1,33 + 0,08

* Significativo em relação ao grupo controle (p < 0,05).

4 - Alterações patológicas macroscópicas no fígado e no baço:

Algumas alterações patológicas foram observadas no baço e fígado dos animais

infectados, principalmente com as amostras mais virulentas.

Alterações macroscópicas nos órgãos dos animais infectados com a amostra WT foram

vistas desde o 5º dia pi, quando já foi possível observar pequenas lesões granulomatosas no

baço, até o 21º dia, quando, além destas lesões, também se observou a ausência de coloração

característica nos dois órgãos. Para as amostras mutantes YopE

e YopM

, também pôde-se

notar, logo a partir do 7º, embora em maior grau a partir do 14°dia pi, a presença de pequenas

lesões granulomatosas e coloração desbotada dos órgãos. Alguns animais infectados com a

amostra YopM

também apresentaram, no 21° dia pi, exsudato peritoneal opalescente. Vale

também registrar que os animais infectados com as amostras WT, YopE

e YopM

tinham muita

dificuldade em sobreviver até o 21° dia de infecção, e quando o faziam era com o estado físico

bastante debilitado. Por outro lado, os animais infectados com a amostra YopH

ou com a

amostra YpIII sobreviveram com tranqüilidade durante o período de estudo e muito raramente

apresentaram alterações patológicas macroscópicas no baço ou fígado.

5 - Análise histológica do baço e fígado:

Cortes histológicos do baço e fígado de animais infectados com a amostra WT e de

animais não infectados (controles) foram preparados a fim de caracterizar a natureza da lesão

causada pela infecção. Esta amostra bacteriana foi escolhida para a realização desta análise por

ser a mais virulenta e, portanto, ter induzido as mais relevantes alterações patológicas

macroscópicas e no peso destes órgãos. Como estas alterações foram mais significativas, com

todas as amostras, no 14° dia pi, escolheu-se este dia para fazer este experimento.

Os cortes do baço dos animais controles revelaram tecido esplênico circundado por

delgado epitélio pavimentoso simples e por uma cápsula de tecido conjuntivo rico em fibras de

colágeno. O tecido estava perfeitamente subdividido em polpa branca, composta por agregados

de células linfóides dispostas como uma bainha cilíndrica e envolvendo a artéria esplênica, e

polpa vermelha, composta por numerosos sinusóides vasculares de parede fina, separados pelos

cordões esplênicos. Estes cordões apresentaram aspecto esponjoso e constituíam-se

principalmente por macrófagos. Já os cortes dos animais infectados revelaram congestão da

polpa vermelha com destruição total ou parcial dos folículos linfóides, formação de áreas

necróticas e presença de neutrófilos e plasmócitos por toda a polpa branca e vermelha. As

células linfocitárias da polpa branca, muitas vezes indistintas, estavam total ou parcialmente

substituídas por células neutrofílicas e tanto a polpa branca quanto a vermelha apresentavam-se

mais fibrosas (Figura 4).

Microscopicamente, os fígados dos animais do grupo controle apresentaram aspecto de

normalidade, sendo compostos por placas de hepatócitos entremeados por sinusóides que

representam os capilares sanguíneos de luz ampla. As placas de hepatócitos e sinusóides se

estenderam a partir do espaço porta (representado por artéria). Os ductos biliares foram

reconhecidos pelo epitélio que variou de cúbico a cilíndrico. Após a infecção o arcabouço

hepático apresentou áreas desestruturadas, com intenso desarranjo lobular. As placas de

hepatócitos e sinusóides não mais se estenderam a partir do espaço porta, mas formaram

aglomerados celulares sem orientação definida. Os hepatócitos se apresentaram muitas vezes

tumefeitos e com citoplasma granuloso e menos basófilo. Observou-se também escassas e

pequenas áreas compostas por células leucocitárias e restos celulares, o que denota pequenos

abscessos próximos ao sistema portal, além de vasos sangüíneos dilatados e congestos (Figura

5).

Infectado Controle

Figura 4 - Análise histológica de baço após infecção intravenosa com amostra selvagem (WT) de

pseudotuberculosis

. Os órgãos foram retirados de camundongos BALB/c infectados e não infectados no 14° dia

pós-infecção. Os cortes (5 µm) foram corados com hematoxilina e eosina (HE

). As figuras mostradas representam

os aumentos de 100x (A e B), 200x (C e D) e 400x (E e F).

Infectado Controle

Figura 5 - Análise histológica de fígado após infecção intravenosa com amostra selvagem (WT) de

pseudotuberculosis

. Os órgãos foram retirados de camundongos BALB/c

infectados e não infectados no 14°

dia pós-infecção. Os cortes (5

µm) foram corados com hematoxilina e eosina (HE). As figuras mostradas

representam os aumentos de 100x (A e B), 200x (C e D) e 400x (E e F).

6 – Análise fenotípica das subpopulações de linfócitos T esplênicos:

As populações de LT, CD3

CD4

e CD3

CD8

, foram quantificadas no 5°, 7°, 14° e 21°

dias após a infecção com a amostra selvagem de Y. pseudotuberculosis (WT), com as respectivas

mutantes defectivas na secreção da YopE, YopH e YopM e com a amostra curada do plasmídeo

de virulência. As mesmas populações de linfócitos, porém provenientes de animais não

infectados, também foram quantificadas e os valores obtidos serviram como controles. Os

resultados apresentados correspondem aos números absolutos de LT x 10

por baço (Figura 6 /

Tabela 5).

Todas as amostras, com exceção da YopH

, causaram diminuição de uma ou mais

populações linfocitárias estudadas. A amostra YopH

foi a única a promover aumento

significativo no número de linfócitos.

Durante a infecção com a amostra WT observou-se uma diminuição no número dos LT-

CD3

em todos os dias estudados e esta diminuição se refletiu tanto na população CD3

CD4

quanto na população CD3

CD8

. Os menores valores ocorreram no 14° dia pi para ambas as

populações (diminuição de 7,4 vezes na população CD3

CD4

e de 7,1 vezes na população

CD3

CD8

, em relação aos valores apresentados pelos animais não infectados).

A amostra YopE

foi capaz de diminuir o número de LT-CD3

apenas no 14° e 21° dia pi.

A população de LT CD3

CD4

sofreu redução significativa apenas no 14° dia pi (13,4 vezes

menor que os controles) enquanto que a população CD3

CD8

foi reduzida tanto no 14° quanto

no 21° dia pi, sendo novamente os menores valores observados no 14° dia pi (12,6 vezes menor).

O número de LT-CD3

dos animais infectados com a amostra YopM

foi reduzindo

gradativamente a partir do 7° dia pi e, portanto, alcançou os menores valores no 21° dia pi. Vale

ressaltar que os valores obtidos neste dia foram os menores observados dentre todas as amostras

estudadas e em todos os dias avaliados. A população CD3

CD4

começou a reduzir logo no 7°

dia pi e a população CD3

CD8

somente a partir do 14° dia pi. No 21° dia pi estas populações

apresentavam, respectivamente, valores 50,3 e 56,5 vezes menores que os valores apresentados

pelos animais controles.

A infecção com a amostra YopH

revelou um resultado completamente oposto aos

apresentados pelas outras amostras bacterianas. Durante a infecção com esta amostra houve um

aumento no número dos LT-CD3

em todos os dias do experimento. Este aumento se refletiu na

população CD3

CD4

apenas no 5° (1,2 vezes maior) e no 7° (1,3 vezes maior) dia pi, e na

população CD3

CD8

em todos os dias (maior aumento ocorreu no 5° dia pi: 1,4 vezes em

relação aos controles).

Os animais infectados com a amostra YpIII também apresentaram redução no número de

LT-CD3

esplênicos no 5°, 7° e 21° dia pi, porém esta redução, além de mais branda, refletiu-se

apenas na subpopulação CD3

CD4

A população de LT-CD4 foi predominante sobre a população de LT-CD8 durante todo

período de infecção observado, com as cinco amostras estudadas. O mesmo ocorreu com as

células dos animais não infectados.

Dias pós-infecção

Figura 6 - Quantificação dos linfócitos T (LT) (A) e subpopulações, LT-CD4 (B) e LT-

CD8 (C), durante

infecção com as amostras WT, YopE

, YopH

, YopM

e YpIII de Y. pseudotuberculosis

. Camundongos

BALB/c foram sacrificados no 5°, 7°, 14° e 21° dia após a infecção e os LT esplênic

os e suas subpopulações

quantificadas através da metodologia de citometria de fluxo. Os resultados apresentados correspondem às

médias + SD do número absoluto de linfócitos (x 10

) por baço (n = 6 animais por dia).

C - Média dos valores obtidos com os animais controles durante todo o experimento.

* Significativo em relação aos animais controles (p < 0,05)

Tabela 5 - Número absoluto de linfócitos T e das subpopulações CD3

CD4

e CD3

CD8

, por

baço, no decorrer da infecção com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis (os valores

mostrados representam médias + desvio padrão de 6 animais para cada dia):

° de linfócitos / baço (x 10

)

Amostra

bacteriana

População

linfocitária

Dias pós-infecção

5° 7° 14° 21° Controles

WT CD3

16,2 + 1,4*

14,0 + 1,3*

5,2 + 0,5* 5,8 + 1,0* 34,5 + 3,4

CD4

9,2 + 1,1* 7,2 + 0,9* 2,7 + 0,5* 2,9 + 0,7* 20,1 + 2,4

CD8

5,5 + 0,6* 5,1 + 0,4* 1,6 + 0,3* 2,1 + 0,5* 11,3 + 1,3

YopE

CD3

35,4 + 3,0 37,4 + 2,3 2,9 + 0,5* 29,2 + 3,2*

CD4

19,6 + 1,8 21,4 + 2,5 1,5 + 0,5* 19,0 + 4,6

CD8

11,7 + 1,2 11,7 + 1,5 0,9 + 0,1* 8,8 + 0,05*

YopH

CD3

46,8 + 6,8*

46,2 + 3,1*

41,7 + 6,6* 38,9 + 3,2*

CD4

24,2 + 4,3*

26,1 + 4,0*

22,9 + 3,0 20,9 + 2,5

CD8

16,1 + 1,4*

15,1 + 2,2*

13,8 + 1,6* 13,8 + 1,8*

YopM

CD3

38,3 + 3,4 28,6 + 3,1*

2,6 + 0,3* 0,7 + 0,2*

CD4

21,7 + 3,2 15,0 + 4,1*

1,4 + 0,3* 0,4 + 0,2*

CD8

11,4 + 1,5 12,7 + 2,0 0,7 + 0,3* 0,2 + 0,05*

YpIII CD3

27,5 + 2,9*

29,9 + 1,8*

35,2 + 1,5 28,1 + 2,1*

CD4

13,6 + 2,0*

15,0 + 1,6*

17,9 + 2,0 15,4 + 1,5*

CD8

9,8 + 1,1 11,2 + 0,8 13,3 + 0,1 10,1 + 1,2

* Significativo em relação ao grupo controle (p < 0,05).

7 - Detecção intracelular das citocinas IL-2, IL-4, IL-10, IF-γ, TF-α e TGF-β:

Os resultados descritos a seguir referem-se às medianas das intensidades de fluorescência

das respectivas citocinas obtidas a partir de linfócitos esplênicos dos animais infectados com as

diferentes amostras bacterianas e dos animais não infectados (controles), ambos estimulados in

vitro com PMA e ionomicina.

Durante a infecção com todas as amostras, a maioria quase absoluta das alterações

significativas na produção das citocinas pelos LT-CD4 referiu-se à diminuição da produção e as

alterações significativas na produção das citocinas pelos LT-CD8 referiram-se ao aumento da

produção.

As quantidades de IL-2 produzidas pelos LT-CD4 não sofreram alterações durante a

infecção com as amostras YopE

, YopM

e YpIII. Durante a infecção com a amostra WT

observou-se diminuição na produção desta citocina tanto no 14° quanto no 21° dia pi, sendo que

a menor produção ocorreu no 14° dia pi (1,3 vezes menor que a produção apresentada pelos

animais não infectados). Já a infecção com a amostra YopH

proporcionou uma redução na

produção de IL-2 pelos LT-CD4 apenas no 7° dia pi (1,2 vezes menor que os controles). Os LT-

CD8 produziram quantidades aumentadas de IL-2 durante infecção com todas as amostras,

exceto com a WT, cuja infecção não resultou em alterações significativas. Enquanto a infecção

com a amostra YopH

promoveu aumento na produção da IL-2 em todos os dias estudados, a

amostra YopE

o fez a partir do 7° dia pi, a amostra YopM

a partir do 14° dia pi e a amostra

YpIII somente no 21° dia pi. Os maiores valores foram observados no 7° dia pi com a amostra

YopH

e no 14° dia pi com a amostra YopE

(aumentos de, respectivamente, 3,5 e 2,7 vezes).

A produção de IL-4 pelos LT-CD4 provenientes dos animais infectados com as amostras

WT, YopH

, YopM

e YpIII, foi semelhante àquela apresentada pelos animais não infectados. No

entanto, aumentos significativos na produção de IL-4 pelos LT-CD4 aconteceram durante a

infecção com a amostra YopE

no 5° e 21° dia pi (maior aumento no 5° dia pi: 1,4 vezes). Esta

produção aumentada de IL-4 pelos LT-CD4 representa a única situação em que se observou LT-

CD4 de animal infectado produzindo mais citocina do que os animais controles. Avaliando a

produção de IL-4 pelos LT-CD8 verificou-se que enquanto a infecção com a amostra WT não

ocasionou alteração alguma nos níveis desta citocina, quando comparado aos animais controles,

a infecção com a amostra YopH

levou a um aumento na produção da mesma desde o 5° até o

21° dia pi (com maior produção no 5° dia pi: 3,3 vezes maior que os controles). As amostras

YopE

e YopM

também induziram aumento na produção de IL-4 pelos LT-CD8

respectivamente a partir do 7° e do 14° dia pi. A amostra YpIII, por sua vez, alterou a produção

da IL-4 apenas no 14° dia pi (aumento de 2 vezes em relação aos controles).

As infecções causadas por todas as amostras bacterianas estudadas foram capazes de

reduzir significativamente a produção de IL-10 pelos LT-CD4. As amostras WT, YopM

e YpIII

suprimiram a produção em todos os dias avaliados. As amostras YopE

e YopH

também

provocaram redução na produção de IL-10, porém somente no 7° e 21° dia pi no caso da amostra

YopH

, e no 5°, 7° e 21° dia pi no caso da amostra YopE

. As menores produções de IL-10 pelos

LT-CD4 foram observadas no 5° e 7° dias pi com a amostra WT e no 7° dia pi com a amostra

YopH

(valores 1,4 vezes menores que os apresentados pelos animais controles). A produção de

IL-10 pelos LT-CD8 não sofreu alterações durante a infecção com as amostras WT, YopE

YpIII. Já durante a infecção com a amostra YopH

, a produção desta citocina apresentou-se

aumentada em todos os dias do experimento e alcançou seu maior nível no 5° dia pi (aumento de

2,7 vezes). A infecção com a amostra YopM

também propiciou o aumento na produção da IL-10

pelos LT-CD8, mas, neste caso, apenas no 14° e 21° dia pi.

Os resultados obtidos com a citocina IFN-γ reforçaram mais uma vez, e de maneira

bastante evidente, que a infecção com todas as (cinco diferentes) amostras bacterianas ao mesmo

tempo em que suprime a produção da citocina por parte dos LT-CD4, induz os LT-CD8 a

produzi-la em maior quantidade. A produção de IFN-γ pelos LT-CD4 apresentou-se diminuída

em todos os dias pi com todas as amostras estudadas. As reduções mais significativas

aconteceram entre 5° e o 7° dia pi com as amostras portadoras do plasmídeo de virulência, e

estes valores foram cerca de duas vezes menores do que aqueles apresentados pelos animais não

infectados. Os LT-CD8 obtidos dos animais infectados com as amostras YopH

, YopM

e YpIII

produziram mais IFN-γ que os animais controles em todos os dias e, mais uma vez, a maior

produção foi observada durante a infecção com a amostra YopH

, no 14° dia pi (2,2 vezes maior

que os controles). A infecção causada pelas amostras WT e YopE

resultou em aumentos

significativos na produção de IFN-γ pelos LT-CD8 do 5° ao 14° dia pi (quando verificou-se

praticamente o dobro da produção apresentada pelos animais controles).

Ao analisar os resultados da produção de TNF-α pelos LT-CD4 obtidos dos animais

infectados com as amostras WT, YopE

, YopH

e YopM

, foi possível constatar que todas elas

induziram a uma supressão. E, embora esta supressão tenha sido observada nos mais variados

dias, ficou claro que as mais relevantes se dão entre o 5° e 7° dia pi. A amostra YpIII não

provocou alterações significativas na produção desta citocina pelos LT-CD4. Com relação à

produção de TNF-α pelos LT-CD8, observou-se que a infecção com todas as amostras, com

exceção da WT, cuja infecção não alterou a produção de TNF-α, resultou em produção

aumentada da citocina em questão. O aumento na produção de TNF-α provocado pela infecção

com as amostras YopE

e YopH

pôde ser observado em todos os dias, sendo que os maiores

valores, para ambas amostras, ocorreram no 14° dia pi. A infecção com a amostra YopM

aumentou significativamente os níveis de TNF-α, em relação ao grupo controle, apenas no 21°

dia pi e a infecção com a amostra YpIII o fez do 7° dia pi em diante. A maior produção de TNF-

α aconteceu no 14° dia pi com a amostra YopH

(2,6 vezes maior que a produção pelos LT-CD8

dos animais controles).

A produção da citocina TGF-β pelos LT-CD4 não se alterou significativamente durante a

infecção com as amostras YopE

, YopM

e YpIII. Enquanto a infecção com a amostra WT

resultou em diminuição da produção do TGF-β pelos LT-CD4 no 7°, 14° e 21° dia pi, a infecção

com a amostra YopH

suprimiu a produção da mesma apenas no 21° dia pi. Embora

significativas, as reduções nas quantidades de TGF-β produzidas pelos LT-CD4 foram bastante

pequenas em relação à produção apresentada pelos animais não infectados (1,1 vezes menor). Ao

avaliar a produção de TGF-β pelos LT-CD8 verificou-se a ocorrência de aumentos significativos

durante as infecções com as amostras WT, YopH

e YopM

. Os maiores valores nestes casos

foram observados entre o 7° e 14° dia pi. A infecção com as amostras YopE

e YpIII não

acarretou alterações significativas na produção de TGF-β pelos LT-CD8

Os valores médios das medianas das intensidades de fluorescência de todas as citocinas

analisadas, durante a infecção com as diferentes amostras bacterianas estudadas e produzidas

pelas duas subpopulações linfocitárias de interesse estão apresentados nas Figuras 7 e 8, e

Tabelas 6, 7, 8, 9, 10 e 11.

Dias pós-infecção

Figura 7 - Cinética da produção de citocinas pelos LT-

CD4 esplênicos após infecção intravenosa com as

amostras WT, YopE

, YopH

, YopM

e YpIII de Y. pseudotuberculosis

. Camundongos BALB/c foram

sacrificados no 5°, 7°, 14° e 21° dia após a infecção e as citocinas IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ, TNF-α e TGF-

detectadas e quantificadas intracelularmente através da metodologia de citometria de fluxo. Os resultados

apresentados referem-se aos valores médios das medianas das intensidades de fluorescência (MIF) +

obtidas com os linfócitos estimulados em cultura com PMA + Ionomicina (n = 6 animais por dia).

C - Média dos valores obtidos com os animais controles durante todo o experimento.

* Significativo em relação aos animais controles (p < 0,05)

Figura 8 - Cinética da produção de citocinas pelos LT-CD8 esplênicos após infec

ção intravenosa com as

amostras WT, YopE

, YopH

, YopM

e YpIII de Y. pseudotuberculosis

. Camundongos BALB/c foram

sacrificados no 5°, 7°, 14° e 21° dia após a infecção e as citocinas IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ, TNF-α e TGF-

detectadas e quantificadas intracelularmente através da metodologia de citometria de fluxo. Os resultados

apresentados referem-se aos valores médios das medianas das intensidades de fluorescência (MIF) +

obtidas com os linfócitos estimulados em cultura com PMA + Ionomicina (n = 6 animais por dia).

C - Média dos valores obtidos com os animais controles durante todo o experimento.

* Significativo em relação aos animais controles (p < 0,05)

Dias pós-infecção

Figura 9 - Histogramas representativos dos aumentos mais significativos na produção das citocinas IL-2, IL

4, IL-10 e IFN-γ pelos LT-

CD8, em relação aos animais controles, durante infecção com as diferentes

amostras de Y. pseudotuberculosis

. Os valores apresentados nos quadrantes dos histogramas correspondem

aos valores médios das medianas das intensidades de fluorescência de seis animais por dia.

Figura 10 - Histogramas representativos dos aumentos mais significativos na produção das citocinas TNF-

e TGF-β pelos LT-CD8, em relação aos animais controles, durante infecção com as diferentes amostras de

pseudotuberculosis

. Os valores apresentados nos quadrantes dos histogramas correspondem aos valores

médios das medianas das intensidades de fluorescência de seis animais por dia.

Tabela 6 - Detecção intracelular da citocina IL-2 nos LT-CD4 e CD8 esplênicos de

camundongos BALB/c infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os

resultados mostrados representam os valores médios das medianas das intensidades de

fluorescência

+ desvio padrão de 6 animais para cada dia:

Dias pós-infecção

Amostra

Linfócito

5º Dia 7º Dia 14º Dia 21º Dia Controle

CD4

1292 + 108 1375 + 179 1115 + 82* 1227 + 103* 1452 + 163

CD8

1570 + 308 1305 + 146 1488 + 247 1520 + 338 1295 + 71

CD4

1314 + 253 1375 + 207 1381 + 274 1416 + 85

YopE

CD8

1370 + 119 1633 + 233* 3507 + 22* 1654 + 286*

CD4

1380 + 234 1221 + 103* 1470 + 159 1288 + 70

YopH

CD8

3238 + 334* 4525 + 260* 2519 + 391* 1632 + 180*

CD4

1290 + 82 1475 + 217 1455 + 197 1349 + 113

YopM

CD8

1225 + 50 1269 + 34 1716 + 211* 1670 + 269*

CD4

1669 + 269 1346 + 113 1402 + 143 1589 + 11

YpIII

CD8

1386 + 163 1210 + 141 1424 + 277 1669 + 264*

* Significativo em relação ao grupo controle (p < 0,05)

Tabela 7 - Detecção intracelular da citocina IL-4 nos LT-CD4 e CD8 esplênicos de

camundongos BALB/c infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os

resultados mostrados representam os valores médios das medianas das intensidades de

fluorescência

+ desvio padrão de 6 animais para cada dia:

Dias pós-infecção

Amostra

Linfócito

5º Dia 7º Dia 14º Dia 21º Dia Controle

CD4

1082 + 255 1044 + 47 1236 + 189 988 + 128 1131 + 122

CD8

1258 + 288 1290 + 175 1428 + 200 1488 + 177 1324 + 174

CD4

1555 + 117* 1196 + 58 1376 + 240 1420 + 53*

YopE

CD8

1339 + 55 1634 + 94* 1743 + 244* 1690 + 181*

CD4

1295 + 173 1122 + 44 1283 + 346 1178 + 129

YopH

CD8

4308 + 351* 3417 + 334* 2829 + 470* 2410 + 251*

CD4

1219 + 68 1453 + 294 1367 + 167 1212 + 222

YopM

CD8

1257 + 39 1286 + 44 2439 + 454* 2199 + 390*

CD4

1420 + 233 1245 + 156 1435 + 237 1220 + 124

YpIII

CD8

1291 + 75 1250 + 162 2594 + 156* 1238 + 142

* Significativo em relação ao grupo controle (p < 0,05)

Tabela 8 - Detecção intracelular da citocina IL-10 nos LT-CD4 e CD8 esplênicos de

camundongos BALB/c infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os

resultados mostrados representam os valores médios das medianas das intensidades de

fluorescência

+ desvio padrão de 6 animais para cada dia:

Dias pós-infecção

Amostra

Linfócito

5º Dia 7º Dia 14º Dia 21º Dia Controle

CD4

1099 + 156* 1107 + 88* 1278 + 107* 1245 + 57* 1518 + 136

CD8

1659 + 360 1315 + 106 1421 + 182 1263 + 158 1359 + 157

CD4

1324 + 66* 1197 + 38* 1480 + 120 1290 + 91*

YopE

CD8

1390 + 129 1533 + 174 1460 + 307 1414 + 171

CD4

1270 + 203 1096 + 35* 1344 + 236 1238 + 119*

YopH

CD8

3718 + 381* 3334 + 340* 3199 + 215* 2282 + 136*

CD4

1227 + 69* 1346 + 99* 1265 + 122* 1349 + 255

YopM

CD8

1391 + 207 1301 + 30 1820 + 287* 1707 + 222*

CD4

1206 + 99* 1191 + 100* 1258 + 80* 1145 + 79*

YpIII

CD8

1205 + 86 1263 + 135 1336 + 247 1255 + 77

* Significativo em relação ao grupo controle (p < 0,05)

Tabela 9 - Detecção intracelular da citocina IFN-γ nos LT-CD4 e CD8 esplênicos de

camundongos BALB/c infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os

resultados mostrados representam os valores médios das medianas das intensidades de

fluorescência

+ desvio padrão de 6 animais para cada dia:

Dias pós-infecção

Amostra

Linfócito

5º Dia 7º Dia 14º Dia 21º Dia Controle

CD4

1553 + 250* 1370 + 210* 1484 + 247* 1780 + 102* 2598 + 356

CD8

2694 + 439* 1786 + 225* 2362 + 218* 1548 + 30 1432 + 84

CD4

1722 + 259* 1418 + 198* 1548 + 186* 1648 + 244*

YopE

CD8

3037 + 228* 2677 + 21* 2362 + 320* 1574 + 169

CD4

1434 + 108* 1520 + 362* 1488 + 127* 1566 + 268*

YopH

CD8

2279 + 247* 2408 + 309* 3120 + 564* 2829 + 487*

CD4

1441 + 207* 1579 + 218* 1555 + 180* 1652 + 335*

YopM

CD8

2376 + 187* 2954 + 283* 2566 + 270* 2501 + 306*

CD4

1678 + 254* 1600 + 312* 1619 + 237* 1620 + 167*

YpIII

CD8

2492 + 10* 3440 + 413* 2308 + 169* 2524 + 257*

* Significativo em relação ao grupo controle (p < 0,05)

Tabela 10 - Detecção intracelular da citocina TNF-α nos LT-CD4 e CD8 esplênicos de

camundongos BALB/c infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os

resultados mostrados representam os valores médios das medianas das intensidades de

fluorescência

+ desvio padrão de 6 animais para cada dia:

Dias pós-infecção

Amostra

Linfócito

5º Dia 7º Dia 14º Dia 21º Dia Controle

CD4

1302 + 86* 1310 + 119* 1321 + 146* 1580 + 137 1515 + 132

CD8

1534 + 238 1418 + 312 1349 + 122 1286 + 150 1302 + 34

CD4

1372 + 98 1301 + 64* 1443 + 156 1360 + 177

YopE

CD8

1580 + 197* 1652 + 203* 2879 + 94* 1518 + 167*

CD4

1288 + 53* 1197 + 77* 1374 + 112 1330 + 5,6

YopH

CD8

1651 + 153* 2686 + 354* 3416 + 250* 1584 + 184*

CD4

1253 + 72* 1399 + 147 1414 + 109 1612 + 129

YopM

CD8

1436 + 310 1324 + 184 1550 + 360 2838 + 365*

CD4

1408 + 143 1481 + 90 1355 + 57 1395 + 80

YpIII

CD8

1331 + 107 3343 + 452* 1668 + 181* 1677 + 220*

* Significativo em relação ao grupo controle (p < 0,05)

Tabela 11 - Detecção intracelular da citocina TGF-β nos LT-CD4 e CD8 esplênicos de

camundongos BALB/c infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os

resultados mostrados representam os valores médios das medianas das intensidades de

fluorescência

+ desvio padrão de 6 animais para cada dia:

Dias pós-infecção

Amostra

Linfócito

5º Dia 7º Dia 14º Dia 21º Dia Controle

CD4

1177 + 106 1110 + 37* 1091 + 68* 1104 + 16* 1225 + 46

CD8

1382 + 266 1709 + 179 3717 + 107* 2589 + 340* 1387 + 322

CD4

1103 + 85 1202 + 154 1292 + 164 1254 + 173

YopE

CD8

1267 + 136 1403 + 267 1523 + 290 1503 + 125

CD4

1114 + 31 1189 + 158 1218 + 138 1100 + 72*

YopH

CD8

2422 + 322* 3159 + 165* 2716 + 172* 1508 + 335

CD4

1248 + 198 1213 + 93 1246 + 80 1127 + 109

YopM

CD8

1501 + 164 1510 + 218 3852 + 103* 3157 + 95*

CD4

1185 + 11 1183 + 70 1253 + 60 1193 + 107

YpIII

CD8

1442 + 162 1497 + 248 1390 + 301 1347 + 132

* Significativo em relação ao grupo controle (p < 0,05)

8 – Avaliação da ativação do fator nuclear κB (F- κB) nos linfócitos esplênicos:

A ativação do NF-κB foi avaliada nos extratos nucleares dos linfócitos esplênicos obtidos

de animais infectados com as amostras WT, YopE

, YopH

, YopM

, YpIII e YopJ

. Extratos

nucleares de animais não infectados também foram obtidos e os resultados conseguidos a partir

deles serviram como controles (Figura 11).

Devido à já conhecida função inibitória da YopJ sobre o NF-κB (SCHESSER et al,

1998), decidiu-se inocular um lote de animais com a amostra que não a secreta (YopJ

). Caso a

YopJ fosse a única responsável pela inibição do NF-κB, haveria ativação significativa deste fator

nuclear durante a infecção com a amostra YopJ

(a qual secreta todas as outras Yops). Mas não

foi isso que aconteceu, ao contrário, a infecção com a amostra YopJ

causou diminuição

significativa na ativação do NF-κB em todos os dias avaliados e de forma muito parecida com

aquela causada pela infecção com a amostra WT (valores de ativação cerca de duas vezes

menores que os valores apresentados pelos animais controles). De acordo com estes resultados

ficou claro que, embora a Yop J sabidamente iniba a ativação do NF-κB, provavelmente alguma

das outras Yops também possua esta função inibidora.

Durante a infecção com as amostras YopE

, YopH

e YopM

também verificou-se

diminuição significativa na ativação do NF-κB em todos os dias do experimento. Porém, as

menores inibições observadas durante as infecções com estas amostras se deram no 7° dia pi com

a amostra YopE

e no 21° dia pi com a amostra YopH

. Isto pode sugerir que estas Yops atuem

de forma sinérgica entre si e com a YopJ

no sentido de inibir a ativação do NF-κB.

Curiosamente, a infecção com a amostra que não secreta Yops (YpIII) também inibiu a

ativação do NF-κB no 5° dia pi e a tornou praticamente nula do 7° dia pi em diante. Este

resultado evidenciou que não apenas os fatores de virulência codificados pelo plasmídeo, mas

também fatores cromossomais contribuem para a inibição do NF-κB.

Figura 11 – Influência da infecção com a amostra selvagem (WT), com a amostra curada

do plasmídeo de

virulência e com as amostras mutantes YopJ

, YopE

, YopH

e YopM

de Y. pseudotuberculosis

na ativação do

fator de transcrição nuclear

κB. Quatro grupos de seis camundongos BALB/c foram infectados via intravenosa

com as amostras acima citadas. Extratos nucleares dos linfócitos destes animais foram obtidos no 5°, 7°, 14° e

21° dias após a infecção com as respectivas amostras e o estado de ativação do NF-κB foi avaliado usando-

se o

kit TransAM. Os resultados mostrados representam as médias de dois experimentos feitos em triplicata +

desvio

padrão.

C - Média dos valores obtidos com os animais controles durante todo o experimento.

C+ - Controle positivo da reação (extratos nucleares de células Jurkat estimuladas com TNF-α).

* Significativo em relação aos animais controles (p < 0,05).

9 - Avaliação da atividade citotóxica dos LT-CD8:

A citotoxicidade dos LT-CD8 foi avaliada no 5º, 7º, 14º e 21º dia pi com a amostra

selvagem de Y. pseudotuberculosis, com a amostra curada do plasmídeo de virulência e com as

amostras mutantes defectivas na secreção das Yops E, H e M.

Os LT-CD8 provenientes dos animais infectados com as amostras WT, YopE

e YopM

apresentaram atividade citotóxica muito baixa e, praticamente, apenas no 5° dia pi. Os LT-CD8

obtidos dos animais infectados com a amostra YopH

e YpIII diferiram dos demais uma vez

que, logo no 5º dia pós infecção, apresentaram uma atividade citotóxica relativamente alta em

comparação com as demais amostras (respectivamente 3,7 e 4,6 vezes maior que a

citotoxicidade apresentada pelos LT-CD8 obtidos dos animais infectados com a amostra WT).

Comparando os resultados obtidos no 5° dia pi, já que neste dia todas as amostras

apresentaram valores de citotoxicidade, fica evidente a participação da YopH na supressão da

atividade citotóxica, pois na sua ausência esta atividade foi bem maior. O fato da amostra que

não secreta Yops (YpIII) ter apresentado uma resposta citotóxica muita parecida com a resposta

da amostra YopH

reforça ainda mais a hipótese de uma possível ação supressora exercida pelas

Yops, em especial pela YopH, sobre a citotoxicidade dos LT-CD8. No entanto, os valores de

citotoxicidade observados no 5° dia pi com a amostra WT foram menores do que aqueles

observados, neste mesmo dia, com a amostra YopM

; que também secreta a YopH. Isto sugere

que alguma das outras Yops, talvez a YopM, atue de forma conjunta com a YopH no que diz

respeito à supressão da atividade citotóxica dos LT-CD8.

Os LT-CD8 obtidos dos animais controles não apresentaram atividade citotóxica

alguma, como já era de se esperar.

As médias das porcentagens de citotoxicidade, obtidas a partir de dois ensaios feitos em

triplicata, estão apresentadas na Figura 12 e Tabela 12.

Tabela 12 – Valores de citotoxicidade (%) apresentados pelos linfócitos T CD8

obtidos de

animais infectados com a amostra selvagem, com a amostra curada do plasmídeo de virulência

e com as mutantes de Y. pseudotuberculosis, nos diferentes dias após a infecção:

% Citotoxicidade

(dias pós-infecção)

Amostra

bacteriana

5º 7º 14º 21º Controle

1,6 0,4 0,0 1,9 0,0

YopE

1,2 0,8 0,0 0,0

YopH

5,9 0,0 0,0 0,0

YopM

2,8 0,0 0,0 0,0

YpIII

7,4 0,0 0,0 6,9

Figura 12 - Ensaio de citotoxicidade: LT-

CD8 esplênicos foram obtidos de camundongos BALB/c no 5°, 7°,

14° e 21° dia pós-

infecção intravenosa com a amostra selvagem (WT), com a curada do plasmídeo de

virulência (YpIII) e com as amostras mutantes de Y. pseudotuberculosis. Os LT-CD8 (10

células) foram

cocultivados por 4 horas com os macrófagos (10

células) infectados com a amostra WT (MOI de 10). A

citotoxicidade foi determinada através da detecção da enzima LDH no sobrenadante da cocultu

ra usando o kit

CytoTox 96 (Promega). Camundongos não infectados serviram como controles. Para cada dia do experimento

foram usados “pools” de LT-

CD8 obtidos de três animais. Os resultados representam a média de dois ensaios

feitos em triplicata.

V - DISCUSSÃO

Bactérias enteropatogênicas possuem múltiplas estratégias para iniciar sua disseminação

e isto independe da rota de infecção utilizada (BARNES et al., 2006). A bactéria gram-negativa

Yersinia constitui um protótipo para estudar a interação entre bactéria e célula do hospedeiro

(HENTSCHKE et al., 2007). As Yops de Yersinia estão envolvidas em vários processos

bioquímicos que prejudicam a resposta imune celular do hospedeiro, e por isso são importantes

para o estabelecimento de uma doença sistêmica (CORNELIS et al., 1998). A importância destas

Yops para a virulência das espécies patogênicas de Yersinia tem sido estudada em diferentes

modelos animais e por diferentes vias de infecção (GRABENSTEIN et al., 2004; GROSDENT et

al., 2002). Cepas mutantes de Yersinia incapazes de secretar Yops, principalmente a YopE,

YopO, YopM e YopJ, apresentam-se atenuadas em pelo menos uma rota de infecção com as

várias espécies de Yersinia (LEUNG et al., 1990; MONACK et al., 1998; LOGSDON &

MECSAS, 2003; TRULZSCH et al., 2004). Tendo conhecimento da capacidade

imunomoduladora das Yops sobre a resposta imune do hospedeiro, objetivou-se no presente

trabalho avaliar o papel das Yops E, H e M sobre a resposta imune celular de camundongos

BALB/c inoculados pela via intravenosa. Para tanto, verificou-se a influência destas Yops sobre

as quantidades de LT (CD4 e CD8) no decorrer da infecção e sobre a produção das principais

citocinas dos perfis Th1/Th2, e do TGF-β, por estas mesmas células. Além disso, avaliou-se

também o papel das Yops E, H e M sobre a ativação do fator nuclear NF-κB e sobre a atividade

citotóxica dos LT-CD8.

O primeiro experimento realizado destinou-se a determinar qual seria a dose sub-letal de

cada amostra bacteriana necessária para infectar camundongos BALB/c, pela via intravenosa.

Sabe-se que tanto Y. pseudotuberculosis quanto Y. enterocolitica são capazes de causar doenças

altamente infecciosas após introdução no baço e fígado de camundongos pela via intravenosa

(BRUBAKER, 2003). Os nossos resultados deixaram claro que a amostra YopH

é a amostra

menos virulenta, uma vez que a dose infectante para esta amostra foi 20.000 vezes maior que a

dose infectante da amostra WT. Estudos de dose letal mediana (DL

) com amostras de Y. pestis

que não secretam a YopH, inoculadas em camundongos pela via intravenosa, mostraram que

estas podiam ser inoculadas em concentrações 3.400.000 vezes maiores do que as amostras que

secretam a YopH (KERSCHEN et al., 2004). Já amostras de Y. enterocolitica e Y.

pseudotuberculosis mutantes para o gene yopH apresentaram resultados de DL

, após infecção

intraperitoneal, 1000 vezes maiores que as amostras secretoras de YopH (GREEN et al., 1995;

PERSSON et al., 1999). Fisher et al. (2007) mostraram que a inoculação intranasal da amostra

mutante YopH

de Y. pseudotuberculosis elevou a DL

20 a 30 vezes em relação à amostra WT.

Por outro lado, a amostra mutante que consideramos mais virulenta foi a YopM

, cuja dose

infectante foi 200 vezes maior que a dose da WT. É bastante compreensível que esta amostra

seja mais virulenta que as demais, pois ela secreta a YopH e também a YopE que, de acordo com

os resultados obtidos nos outros ensaios e com dados apresentados na literatura, atua

sinergicamente com a YopH em vários aspectos, potencializando sua virulência. A YopM e a

YopE também foram consideradas importantes durante infecção intravenosa de camundongos

com Y. pestis (LEUNG et al., 1990). Amostras de Y. pestis defectivas na secreção da YopE ou da

YopM apresentaram-se, respectivamente, 10.625 e 100.000 vezes menos virulentas do que a

amostra selvagem, após inoculação intravenosa em camundongos (PERRY & FETHERSTON,

1997; KERSCHEN et al., 2004). Não podemos esquecer também que outros fatores de virulência

presentes nas amostras por nós estudadas, assim como outras Yops que não fizeram parte do

objetivo deste estudo, podem ter influenciado estes nossos resultados. Além das Yops e do

sistema de secreção do tipo III, Yersinia possui outros fatores de virulência como PhoP, invasina

e YadA, os quais são considerados importantes durante a infecção de camundongos

(HERMANN et al., 1993). PhoP desenvolve um papel crucial na replicação da Y.

pseudotuberculosis dentro dos macrófagos e experimentos com amostras mutantes para o gene

phopP mostraram que a DL

destas amostras aumentava 75 vezes em camundongos inoculados

pela via intravenosa (GRABENSTEIN et al., 2004). A deleção no gene yadA resultou em

aumento de cerca de 10 vezes na DL

de camundongos infectados intraperitonealmente (HAN

& MILLER, 1997). Amostras de Y. pseudotuberculosis incapazes de secretar YopJ, quando

inoculadas pela via intragástrica, apresentaram-se cerca de 64 vezes menos virulentas que a

amostra selvagem, e esta diminuição foi atribuída à reduzida capacidade de causar infecção

sistêmica (MONACK et al., 1998). A atividade serina-treonina quinase da YpkA é importante

para que Y. pseudotuberculosis estabeleça uma infecção sistêmica em camundongos (WILEY et

al., 2006).

Contudo, comparar os resultados de virulência das diferentes amostras de Yersinia,

obtidos por diferentes grupos de pesquisa, através de modelos murinos de infecção, é muito

difícil, uma vez que os experimentos são realizados com diferentes espécies de Yersinia,

diferentes linhagens de camundongos, diferentes doses e vias de administração.

Estando padronizadas as doses infectantes das amostras de interesse, realizou-se o

experimento de cinética de infecção, a fim de avaliar a capacidade de colonização e persistência

destas amostras no baço e fígado dos animais. Para isto, o número de unidades formadoras de

colônias nos respectivos órgãos foi determinado no 2°, 5°, 7°, 14° e 21° dia pós-infecção (pi). A

princípio nosso objetivo era avaliar até o 28° dia pi, mas isto tornou-se inviável devido ao fato de

que a maioria dos animais infectados com as amostras mais virulentas não sobrevivia até este dia

e naqueles infectados com as amostras menos virulentas não era possível recuperar a bactéria dos

órgãos a partir do 21° dia pi. Os resultados deste experimento também foram importantes para

nos ajudar a escolher quais seriam os melhores dias para realização dos ensaios de avaliação da

resposta imune celular. Estudos anteriores revelaram que amostras de Yersinia

pseudotuberculosis mutantes para o gene yop possuem a virulência atenuada após inoculação

pelas vias intragástrica, intraperitoneal ou intravenosa (LEUNG et al., 1990; GALYOV et al.,

1994; MONACK et al., 1998), e que muitas delas são deficientes no que diz respeito à

colonização do intestino e tecidos linfóides de camundongos (LOGSDON & MECSAS, 2003;

MONACK et al., 1998). Porém, na maioria dos estudos já realizados, os camundongos foram

observados por um período curto e, para atribuir um papel para as Yops na colonização dos

órgãos linfóides após infecção pela via hematogênica, é necessário realizar infecções por

períodos mais longos. No presente trabalho, a influência das Yops E, H e M na capacidade de

colonização e persistência da Y. pseudotuberculosis no baço e fígado de camundongos BALB/c,

inoculados pela via intravenosa, foi avaliada por um período de três semanas.

A colonização do baço e do fígado dos animais infectados com a amostra WT aumentou

gradativamente desde o 2° até o 14° dia pi. Diferentemente do que aconteceu durante a infecção

com as outras amostras, com a WT, já no 2° dia pi o número de UFC no baço e no fígado foi

bastante elevado. Eram muito poucos os animais infectados com a amostra WT que conseguiam

sobreviver até o 21° dia pi, e daqueles que conseguiam não foi possível recuperar a bactéria de

nenhum dos órgãos estudados. Neste dia os órgãos destes animais apresentavam características

morfológicas muito distintas das características dos órgãos dos animais normais, estando

bastante atrofiados (o que ficou bem evidente com os resultados da pesagem dos órgãos) e

apresentavam alterações de coloração. Isto pode sugerir que a bactéria WT, após extensa

multiplicação e considerável destruição destes órgãos, não mais os consideraram como locais

favoráveis à sua permanência. A amostra YopE

colonizou os órgãos principalmente do 5° ao

14° dia pi e a amostra YopH

os colonizou somente do 5° ao 14° dia pi. Esta maior demora para

iniciar a colonização e maior rapidez na eliminação das bactérias que não secretam a YopE ou a

YopH nos permite sugerir que ambas são importantes no que diz respeito à capacidade de

colonizar e persistir no baço e no fígado de camundongos BALB/c após inoculação intravenosa.

Esta hipótese foi ainda mais reforçada ao verificarmos que durante a infecção com a amostra

YopM

, que secreta a YopE e a YopH, a bactéria foi capaz de persistir em ambos os órgãos até o

21° dia pi. A YopE é um importante fator de virulência das espécies patogênicas de Yersinia em

modelos de infecção murina (VIBOUD & BLISKA, 2005). Foi recentemente descrito que a

YopE é importante na colonização do baço de camundongos após quatro dias de infecção oral, e

que a YopT pode assumir este papel na ausência da YopE. As Yops E e T possuem funções

redundantes durante a infecção com Y. pseudotuberculosis, por isso a YopT torna-se dispensável

quando da utilização de modelo murino (VIBOUD et al., 2006). No entanto, vale ressaltar que as

cepas de Y. pseudotuberculosis do sorotipo O:3 (usadas no presente trabalho), não expressam

YopT (VIBOUD & BLISKA, 2005). De qualquer forma é interessante observar a redundância

nas funções de diferentes Yops e como isto pode favorecer o sucesso da infecção causada por

Yersinia. Estudo com Y. enterocolitica sorotipo O:8 mostrou que a YopE é importante na

colonização do baço e fígado de camundongos (TRULZSCH et al., 2004). Logsdon & Mecsas

(2003) sugeriram que duas ou mais Yops possuem funções redundantes na colonização de

órgãos. Eles demonstraram que deleções dos genes yopH e yopE geralmente causam índices

menores de colonização no intestino e tecidos linfóides no 2° dia pi e maiores no 5° dia pi. Isto

está de acordo com os resultados que obtivemos com as amostras YopE

e YopH

, porém no baço

e no fígado. Estudos com linfonodos mesentéricos mostraram que cepas defectivas na secreção

de apenas YopH, YopJ ou YopE têm capacidade 5 a 10 vezes menor de colonizá-los

(LOGSDON & MECSAS, 2003; MONACK et al., 1998). A YopH é necessária para causar

infecção após a inoculação da bactéria por diferentes vias (IVANOV et al., 2005; LOGSDON &

MECSAS, 2003 ; TRULZSCH et al., 2004) e para a sobrevivência da mesma em vários tecidos

(FISHER et al., 2007). A infecção orogástrica com Y. pseudotuberculosis deficiente na secreção

da tirosina fosfatase YopH resulta em menores índices de colonização dos linfonodos

mesentéricos e baço comparado àqueles apresentados pela amostra WT (LOGSDON &

MECSAS, 2003). Resultados similares também foram descritos com amostra de Y. enterocolitica

mutante para a secreção da YopH (TRULZSCH et al., 2004). Pouco se sabe a respeito do papel

da YopM na colonização dos tecidos linfóides, no entanto vários estudos têm elucidado a

importância dessa Yop quando em sinergia com outra ou como uma Yop com funções

redundantes. A influência de outras Yops não avaliadas em nosso trabalho devem ser

consideradas ao discutir o papel destas proteínas na capacidade de colonização da Y.

pseudotuberculosis. A contribuição da YopJ para a virulência parece depender da espécie de

Yersinia e rota de entrada. O papel da YopJ na infecção por Y. pseudotuberculosis tem sido

muito estudado pela via oral, mas os resultados publicados são conflitantes (GALYOV et al.,

1994 ; MONACK et al., 1998). Amostras de Y. pseudotuberculosis que não secretam YopJ não

apresentaram diferenças significativas nos índices de colonização do baço e fígado de

camundongos C57BL/6 após inoculação pela via intraperitoneal (AUERBUCH & ISBERG,

2007). Estudos da colonização dos pulmões reveleram um importante papel para a YopJ, quando

as Yops E, H, O e M estão ausentes, e também para as Yops B e H (FISHER et al., 2007). Por

outro lado, YopJ e YopM não influenciaram a colonização do intestino após infecção oral de

camundongos BALB/c. Amostras mutantes de Y. pseudotuberculosis que não secretam a YpkA

são deficientes na colonização do baço durante infecção orogástrica (LOGSDON & MECSAS,

2003).

A eficiente capacidade de colonização que nós observamos com a amostra WT já era

esperada, uma vez que ela expressa todos os fatores de virulência tanto cromossomais quanto

plasmideais. Trabalhos com camundongos C57BL/6, infectados intraperitonealmente com a

amostra WT de Y. pseudotuberculosis, mostraram um rápido e expressivo aumento no número de

UFC no baço entre 48 e 72 horas após a inoculação (AUERBUCH & ISBERG, 2007).

Os resultados que obtivemos com a amostra YpIII evidenciaram a importância de outros

fatores de virulência, que não as Yops, na capacidade de colonização e persistência da Y.

pseudotuberculosis, principalmente no baço. Talvez os fatores de virulência cromossomais, na

ausência total das Yops, possam, por si só, garantir a colonização e persistência da bactéria no

baço e fígado dos animais; embora no 21° dia pi esta amostra tenha sido completamente

eliminada de ambos os órgãos (o que não se observa na presença concomitante da YopE e

YopH). Trabalhos que avaliaram a influência do plasmídeo na colonização do baço ou na

sobrevivência no soro após inoculação intravenosa, mostraram que a amostra de Y.

pseudotuberculosis sem plasmídeo demorou mais para ser eliminada destes locais do que

amostras de Y. pestis e Y. enterocolitica (UNE & BRUBAKER, 1984). Amostras de Y.

enterocolitica e Y. pseudotuberculosis curadas do plasmídeo de virulência conseguiram se

replicar nos tecidos murinos apenas transitoriamente, pois logo foram contidas dentro de

granulomas e eliminadas pelo hospedeiro (ZHANG & BLISKA, 2005). Balada-Llsat & Mecsas

(2006) relataram que fatores de virulência cromossomais são suficientes para promover a

colonização de linfonodos mesentéricos após inoculação intragástrica.

A idéia de verificar o peso do baço e do fígado dos animais infectados com as diferentes

amostras de Y. pseudotuberculosis em estudo surgiu ao percebermos que os tamanhos, assim

como as características morfológicas destes órgãos, alteravam-se visivelmente no decorrer da

infecção. Desta forma, os resultados obtidos nos serviram como mais um indicador da severidade

e progressão da doença. Durante a infecção com as amostras WT, YopE

e YopM

observou-se

diminuição no peso dos órgãos no decorrer da infecção. A infecção com a amostra YopM

foi

responsável pela maior diminuição no peso do baço dos animais, a qual pôde ser observada no

21° dia pi. Já no caso do fígado, foi durante a infecção com a amostra YopE

que o seu menor

peso foi alcançado (no 14° dia pi). A amostra YopH

não causou diminuição no peso dos órgãos,

ao contrário, promoveu um aumento no peso do baço logo no 2° e 5° dia pi. Comparando estes

resultados com os resultados do experimento de determinação da dose infectante, que tornou

evidente que a amostra YopH

é a menos virulenta, e com o experimento de cinética de infecção,

que mostrou que a YopH

não foi capaz de colonizar os órgãos no 2° dia pi e que no 21° dia pi já

havia sido completamente eliminada, pode-se deduzir que este aumento seja resultado de uma

proliferação das células esplênicas (especialmente dos linfócitos) com o intuito de conter e

eliminar esta infecção (dedução que mais tarde seria confirmada com o experimento de

quantificação dos LT e suas subpopulações). O peso do fígado dos animais infectados com a

amostra YpIII não sofreu alterações em relação ao peso deste mesmo órgão dos animais

controles, mas o peso do baço diminuiu no decorrer da infecção. Estes resultados também

parecem coerentes se relacionados com o fato desta amostra ter sido mais eficiente na

colonização do baço do que do fígado. De uma maneira geral, pudemos observar que a

diminuição no peso dos órgãos está diretamente relacionada com a severidade da infecção e por

isso foi mais significativa durante a infecção com as amostras mais virulentas (WT, YopE

YopM

). Ao contrário do que observamos com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis,

estudos realizados com amostras de Y. enterocolitica revelaram que o peso de vários órgãos

linfóides, obtidos de diferentes linhagens de camundongos, aumentam após a infecção

(AUTENRIETH et al., 1994; HANDLEY et al., 2004). Auerbuch & Isberg (2007) também

relataram diminuição no peso do baço e fígado de camundongos infectados intraperitonealmente

com Y. pseudotuberculosis e aumento no peso destes órgãos em camundongos infectados pela

mesma via com Y. enterocolitica.

Alterações macroscópicas, principalmente na forma de lesões granulomatosas e coloração

desbotada dos órgãos, puderam ser observadas nos órgãos dos animais infectados com as

amostras WT, YopE

e YopM

. Porém, foi durante a infecção com a amostra WT que estas

alterações apareceram mais precocemente (desde o 5° dia pi). Na ausência do plasmídeo de

virulência e da YopH os órgãos não apresentaram estas lesões nem alteração na sua coloração

característica. A presença e o grau destas alterações estão intimamente relacionados com a

virulência da amostra.

A análise histológica do baço e do fígado dos animais nos permitiu visualizar

microscopicamente as alterações provocadas pela infecção intravenosa com Yersinia, assim

como as principais células envolvidas. Os órgãos dos animais infectados com a amostra WT

apresentaram diferenças bastante evidentes e significativas em relação aos órgãos dos animais

não infectados. Tanto o baço quanto o fígado apresentaram desestruturação em seu arcabouço

normal e presença de infiltrados inflamatórios. No caso do baço, observou-se desestruturação

tanto da polpa branca quanto da polpa vermelha, formação de áreas necróticas e aspecto mais

fibroso. O fígado apresentou intenso desarranjo lobular com presença de aglomerados celulares

sem orientação definida e pequenos abscessos próximos ao sistema portal. Além disso, os vasos

sangüíneos se apresentaram extremamente dilatados e congestos. Análises histológicas de

linfonodos mesentéricos, após infecção intragástrica de camundongos BALB/c com uma

amostra selvagem de Y. pseudotuberculosis sorotipo O:3, revelaram várias áreas de necrose na

borda, próximo aos centros germinativos e no paracortex (BALADA-LLASAT & MECSAS,

2006). Logsdon & Mecsas (2003) realizaram análises histológicas de placas de Peyer e

linfonodos mesentéricos de camundongos BALB/c infectados oralmente com uma amostra

selvagem de Y. pseudotuberculosis ou com amostras mutantes para os genes yopH, yopE e

yopO. Os resultados que eles obtiveram, tanto com amostra selvagem quanto com as mutantes,

evidenciaram comprometimento da estrutura e influxo de macrófagos e neutrófilos nas placas

de Peyer, e presença de abscessos e células apoptóticas nos linfonodos mesentéricos. Zhang &

Bliska (2005) também evidenciaram apoptose de macrófagos nos órgãos linfóides de

camundongos infectados com Y. pseudotuberculosis. Infecção intragástrica com Y.

enterocolitica causou alterações histológicas nas placas de Peyer, nos linfonodos mesentéricos

e no baço. Nas placas de Peyer estas alterações foram caracterizadas pela presença de células

mortas, colônias bacterianas, granulócitos e macrófagos, e nos linfonodos mesentéricos e baço

pela presença de lesões semelhantes aos granulomas (HANDLEY et al., 2004). Macrófagos e

neutrófilos que são recrutados aos órgãos infectados parecem ser importantes na diminuição do

número de bactérias, nos estágios iniciais da doença, após infecção intravenosa (BURNETT et

al., 2004; CONLAN, 1997). Outro grupo de pesquisa verificou que cerca de quatro dias após

inoculação intranasal com Y. pseudotuberculosis, os pulmões de camundongos BALB/c

apresentavam arquitetura bastante comprometida, além de várias lesões supurativas e necróticas

e espaços alveolares fibrinados (FISHER et al., 2007).

Para que um patógeno consiga estabelecer uma infecção ele precisa ser capaz de resistir

aos mecanismos de defesa do hospedeiro. Embora existam muitas informações a respeito dos

mecanismos usados pelas bactérias patogênicas para evadir das defesas do sistema imune inato

dos hospedeiros, pouco se sabe sobre como elas atuam sobre a resposta imune adaptativa. No

entanto, é claro que as respostas desenvolvidas pelas células T são essenciais para eliminar

patógenos bacterianos, inclusive os do gênero Yersinia. Nosso trabalho, ao avaliar o papel das

Yops E, H e M de Y. pseudotuberculosis sobre as populações de linfócitos T esplênicos,

constatou que as quantidades destas células diminuíram durante a infecção com todas as

amostras estudadas, exceto durante a infecção com a amostra YopH

. A infecção com a amostra

WT causou diminuição tanto da população de CD3

CD4

quanto de CD3

CD8

em todos os

dias do experimento. A amostra YopE

suprimiu a produção de LT CD3

CD4

apenas no 14°

dia pi e de CD3

CD8

no 14° e 21° dia pi. A amostra que não secreta a YopM, mas que secreta

a YopE e a YopH, também provocou diminuição de ambas populações de linfócitos a partir do

7° dia pi. Os animais infectados com a amostra YpIII apresentaram redução apenas no número

dos LT CD3

CD4

. Se levarmos em conta que os LT-CD4 possuem um papel central na

ativação de células B, células T e outras células que participam da resposta imune e, portanto,

possuem um papel primordial na resposta imune como um todo, fica mais fácil compreender

que a Yersinia se valha de outros fatores de virulência, que não os plasmideais, para tentar

contê-los. Diferentemente do observado com as demais amostras, durante a infecção com a

amostra YopH

ocorreu um aumento no número de ambas as subpopulações de linfócitos e em

todos os dias analisados. Frente aos resultados obtidos com os animais infectados com a

amostra YopH

tornou-se claro que a YopH é responsável pela diminuição no número dos LT

esplênicos, em resposta à infecção intravenosa por Y. pseudotuberculosis. O efeito inibitório in

vitro da YopH sobre a ativação de LT, mediado através do receptor de células T (TCR), já foi

descrito anteriormente (YAO et al., 1999). Sauvonnet et al. (2002a) também atribuíram à YopH

papel inibidor sobre a proliferação de LT induzida pela IL-2, e relacionaram este papel da

YopH com sua capacidade de inativar a via do fosfatidilinositol-3 quinase. Não podemos

excluir a possibilidade da YopH afetar a proliferação de LT devido sua ação sobre o

citoesqueleto, uma vez que o citoesqueleto tem sido implicado em vários passos da ativação e

proliferação dos LT (ACUTO & CANTRELL, 2000). Lembrando também que os maiores

índices de supressão nas subpopulações de LT ocorreram na presença da YopE e da YopH

(durante infecção com a amostra YopM

), deve-se considerar que a YopE atue em conjunto e

de forma importante com a YopH no que diz respeito à inibição da resposta proliferativa dos

LT esplênicos. A possibilidade da Yersinia atuar inibindo as células apresentadoras de

antígenos e, conseqüentemente, prejudicar a ativação dos LT também está sendo estudada,

principalmente porque já se sabe que muitas outras bactérias e vírus patogênicos atuam desta

forma (HORNEF et al., 2002). Kramer & Wiedig (2005) demonstraram que a interação da Y.

enterocolitica com células dendríticas teve um efeito negativo sobre a habilidade destas células

em estimular a proliferação de LT, e que a YopP (que é análoga à YopJ da Y.

pseudotuberculosis) pode estar envolvida neste processo. Outros experimentos também

mostraram que a incubação de células

dendríticas com Yersinia, viva ou morta, causa

diminuição da expressão de moléculas do MHC de classe II e, portanto, reduzem a habilidade

destas células em estimular a proliferação de LT-CD4 e LT-CD8 (SCHOPPET et al., 2000;

SCHOPPET & HUPPERTZ, 2001). Como este efeito pode ser causado por bactéria morta,

talvez não haja conexão entre eles e os resultados descritos em nosso trabalho. Recentemente

atribuiu-se às Yops E e H importantes propriedades anti-fagocíticas sobre as células

dendríticas, e isto pode, conseqüentemente, afetar a capacidade destas células de estimular os

LT (ADKINS et al., 2007). Durante infecção com Yersinia, uma grande variedade de respostas

mediadas por células T pode ser afetada. Um experimento in vitro revelou que mesmo quando a

proporção de Y. pseudotuberculosis por LT é pequena (MOI baixo) a YopH secretada é

suficiente para atuar sobre moléculas adaptadoras dos LT (LAT e SLP-76), as quais são

fosforiladas em resposta à estimulação do TCR e por isso essenciais à ativação destas células.

Além disso, este mesmo trabalho descreveu que quando os LT estão expostos a MOIs mais

altos, a YopH atua sobre outras proteínas como, por exemplo, Lck. Desta forma, sugeriu-se que

a especificidade da YopH é influenciada por sua concentração (GERKE et al., 2005). Outro

experimento in vitro, porém usando YopH de Y. pestis, mostrou que esta Yop é capaz de

paralisar completamente os LT através da desfosforilação de Lck na posição Tyr-394, e

portanto, é capaz de prevenir o desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa (ALONSO

et al., 2004).

Os nossos resultados referentes à imunofenotipagem das subpopulações de LT

revelaram um predomínio de LT-CD4 sobre os LT-CD8 durante a infecção com todas as

amostras analisadas. Handley et al. (2004) também observaram predomínio de LT-CD4 ao

imunofenotipar LT de camundongos BALB/cj, e o oposto, ou seja, predomínio de LT-CD8, em

camundongos C57BL/6j, ambos infectados com Y. enterocolitica.

Atualmente já é sabido que as Yops interferem na produção de citocinas pró-

inflamatórias durante a infecção com Yersinia. Este conceito foi ainda mais fundamentado a

partir de um trabalho de Brubaker (2003) que demonstrou que os níveis de IFN-γ e TNF-α nos

órgãos linfóides de camundongos infectados com uma amostra de Y. pestis portadora do

plasmídeo de virulência eram bem menores do que os níveis apresentados pelos órgãos dos

animais infectados com a amostra curada do plasmídeo. No entanto, o mecanismo usado pelas

Yops para interferir com a produção das citocinas é multifatorial e complexo.

A análise da produção das principais citocinas do perfil Th1, Th2 e TGF-β, ainda no

compartimento intracelular, pelos LT-CD4 e LT-CD8, nos permitiu concluir que, em geral, as

Yops E, H e M de Y. pseudotuberculosis suprimem a produção das citocinas pelos LT-CD4 e

impedem que os LT-CD8 as produzam em quantidades elevadas. Talvez este efeito sobre os LT-

CD8 seja uma conseqüência da ação supressora das Yops sobre os LT-CD4, que, uma vez não

sendo capazes de desenvolver suas habilidades eficientemente, também falhariam na ativação

dos LT-CD8. Agindo desta forma as Yops impedem que uma resposta imune mais eficiente seja

elaborada e, portanto, favorecem a permanência da bactéria no interior do hospedeiro. Wiedig et

al. (2005) sugeriram que Y. enterocolitica inibe as respostas por LT-CD4.

A supressão na produção de IL-2 pelos LT-CD4 se deve provavelmente à ação das Yops,

uma vez que durante a infecção com a amostra YpIII não se observou alteração na sua produção.

As Yops que devem estar envolvidas nesta ação supressora são a YopE e a YopM, pois na

ausência delas a produção de IL-2 foi igual à apresentada pela amostra YpIII e pelos animais

controles. No caso da produção de IL-2 pelos LT-CD8, a presença das Yops parece manter seus

níveis iguais aos dos animais controles e isto ficou claro ao observar que apenas durante a

infecção com a amostra WT, que secreta todas as Yops, não houve aumento na sua produção.

Não é possível atribuir a uma única Yop esta ação, já que na ausência de qualquer uma delas

ocorreu aumento na produção de IL-2, porém se considerarmos que foi na ausência da YopH e

da YopE que estes aumentos foram detectados com maior freqüência e em maior intensidade,

podemos sugerir que a ação conjunta de ambas seja relevante para impedir o aumento da

produção de IL-2. A atividade GAP da YopE foi descrita como importante, quando em conjunto

com outras Yops, na inibição da produção de citocinas pró-inflamatórias por células epiteliais

infectadas com Y. pseudotuberculosis (VIBOUD et al., 2003). A YopH de Y. pestis diminuiu

dramaticamente a atividade de ERK e a produção de IL-2 induzida pela estimulação do TCR

(LIANG et al., 2003).

A produção de IL-4 pelos LT-CD4 não sofreu alterações em função da infecção com as

amostras WT, YopH

, YopM

e YpIII. Mas, curiosamente, a infecção com a amostra YopE

resultou em aumento na produção da IL-4 por esta subpopulação linfocitária, e isto nos leva a

atribuir à YopE um importante papel na regulação da produção de IL-4 pelos LT-CD4. Este foi o

único caso em que se observou aumento na produção de citocina pelos LT-CD4. Já foi descrito

que LT-CD4 de camundongos BALB/c produzem quantidades maiores de IL-4 do que os LT-

CD4 de camundongos C57BL6, e que esta habilidade é genética e não está sob controle dos

genes do MHC (NISHIMURA et al., 1997). Da mesma forma que a produção de IL-2, a

produção de IL-4 pelos LT-CD8 só não aumentou durante a infecção com a amostra WT, ou

seja, todas as Yops devem ser responsáveis pela manutenção dos níveis basais de IL-4. Também

neste caso merecem destaque as Yops E e H, pois foi na ausência delas que o aumento na

produção de IL-4 aconteceu com maior freqüência (em três dos quatro dias analisados no caso da

YopE

e em todos os dias no caso da YopH

). A YopE tem tanto funções individuais como

redundantes e atua sinergicamente com outras Yops durante o complexo ciclo de infecção da

Yersinia (AEPFELBACHER, 2004). Considerando que a IL-4 é responsável pela mudança de

classe para IgG1, a produção aumentada que observamos durante infecção com a amostra YopH

está de acordo com os valores aumentados de células secretoras de IgG1 observados

anteriormente pelo nosso grupo, após infecção intravenosa de camundongos Swiss com esta

mesma amostra (MAIA, 2004). Fatores de virulência não plasmideais também devem atuar,

impedindo a produção aumentada de IL-2 e IL-4 pelos LT-CD8, mas de forma muito menos

relevante, já que durante a infecção com a amostra YpIII só foram observadas alterações

significativas na produção destas citocinas em um dos dias avaliados.

Ao quantificar a produção de IL-10 pelos LT-CD4 pudemos constatar uma supressão

durante a infecção com todas as amostras estudadas e em todos os dia pi com as amostras WT,

YopM

e YpIII. O fato da amostra curada do plasmídeo também ter suprimido a produção de IL-

10 pelos LT-CD4 em todos os dias, torna evidente que esta supressão não se deve apenas à ação

das Yops. No entanto, como durante a infecção com a amostra YopH

esta supressão só foi

observada em dois dias de experimento, pode-se dizer que, dentre as Yops estudadas, a YopH

seja a mais envolvida neste processo. Recentemente foi descrito que a YopJ contribui para inibir

a expressão de IL-10 por macrófagos infectados com Y. pseudotuberculsosis, e que esta função

deve estar relacionada com a capacidade que a YopJ tem de inibir a via das MAPKs

(AUERBUCH & ISBERG, 2007). Com respeito à produção de IL-10 pelos LT-CD8 não se

verificou alterações significativas durante a infecção com as amostras WT, YopE

e YpIII. Na

ausência da YopH e da YopM observou-se aumento na produção de IL-10, o que confere a

ambas um importante papel controlador da produção desta citocina pelos LT-CD8. Mais uma

vez a YopH parece ser mais atuante, pois na sua ausência houve aumento da produção de IL-10

em todos os dias analisados. O antígeno LcrV, que, assim como as Yops, é secretado pelo

sistema de secreção do tipo III, pode estar envolvido neste aumento da produção de IL-10, pois

já foi demonstrado que ele atua através do receptor “toll-like” 2 (TLR2), estimulando a produção

de IL-10 pelos macrófagos (BRUBAKER, 2003). O aumento dos níveis de IL-10 pode ser

favorável à permanência da bactéria no hospedeiro devido às suas propriedades

antiinflamatórias.

Avaliando a produção da citocina mais importante do perfil Th1, o IFN-γ, pode-se dizer

que a infecção por Y. pseudotuberculosis ao mesmo tempo em que suprime sua produção pelos

LT-CD4, não é capaz de impedir que os LT-CD8 o produzam em quantidades aumentadas.

Tanto a ação supressora sobre os LT-CD4 quanto a produção aumentada de IFN-γ pelos LT-CD8

não puderam ser atribuídas à presença ou ausência de nenhuma Yop, uma vez que estas

alterações foram observadas durante a infecção com todas as amostras em questão e, inclusive,

com a amostra que não secreta Yops. Conhecendo a importância do IFN-γ na ativação das mais

diversas células do sistema imune e sabendo que camundongos BALB/c são maus produtores do

mesmo, fica mais fácil compreender que a bactéria Y. pseudotuberculosis se empenhe em

impedir que os LT-CD4 o produzam e que, talvez, as quantidades aumentadas produzidas pelos

LT-CD8 ainda sejam pequenas e insuficientes para eliminar a infecção. Kerschen et al. (2004)

mostraram que a YopM de Y. pestis causa depleção de células NK após infecção intravenosa, e

que a depleção destas células estava associada com a produção diminuída de várias citocinas

pró-inflamatórias, inclusive IFN-γ. Variação na suscetibilidade de camundongos à infecção por

Yersinia parece ser dependente da produção de IFN-γ (AUTENRIETH et al., 1994).

Camundongos BALB/c infectados com amostra de Y. pseudotuberculosis mutante para o gene

yopE são mais suscetíveis às respostas reguladas por IFN-γ, isto quer dizer que a YopE protege a

Y. pseudotuberculosis das respostas mediadas por IFN-γ (LOGSDON & MECSAS, 2006).

A supressão que observamos na produção da citocina TNF-α pelos LT-CD4

provavelmente se deve a fatores de virulência plasmideais (Yops), pois durante a infecção com a

amostra YpIII não se observou alterações significativas na produção desta citocina. Como na

ausência da YopE e da YopM a supressão na produção de TNF-α pelos LT-CD4 aconteceu em

apenas um dos dias analisados, pode-se deduzir que elas estejam envolvidas neste processo.

Outra observação interessante foi que a supressão causada pelas diferentes amostras de Y.

pseudotuberculosis sobre a produção de TNF-α pelos LT-CD4 ocorreu principalmente entre o 5°

e o 7° dia pi. Sabendo que o TNF-α é uma citocina que participa desde a resposta imune inata até

a adaptativa, é coerente que a Y. pseudotuberculosis atue impedindo sua produção o quanto

antes. O fato da infecção com a amostra WT não ter alterado os níveis de produção do TNF-α

pelos LT-CD8 aliado ao aumento na produção do mesmo observado durante a infecção com

todas as outras amostras, inclusive com a YpIII, significa que a manutenção dos níveis basais

desta citocina depende da ação das Yops. Embora não seja possível assegurar ao certo qual das

Yops é responsável por isso, é claro que as Yops E e H atuam em conjunto, uma vez que na

ausência de uma delas pôde-se observar aumento na produção do TNF-α em todos os dias do

experimento, e na presença de ambas (durante infecção com YopM

), em apenas um. Já se sabe a

algum tempo que a YopJ suprime a produção de TNF-α por macrófagos (BOLAND &

CORNELIS, 1998; PALMER et al., 1998; RUCKDESCHEL et al., 1998). O papel inibidor que a

YopP de Y. enterocolitica tem sobre o NF-κB pode contribuir para a produção diminuída de

TNF-α (RUCKDESCHEL et al., 2001b; ERFURTH, et al., 2004). Sing et al. (2002) descreveram

que macrófagos de camundongos infectados com Y. enterocolitica produzem quantidades

menores de TNF-α e que isto está correlacionado com o aumento na produção de IL-10 induzido

pelo LcrV. O uso de YopB recombinante inibiu significativamente a produção de TNF-α por

macrófagos estimulados com LPS (SHARMA et al., 2004).

O TNF-α e o IFN-γ são cruciais em limitar a severidade da infecção por Yersinia, sendo

que a inibição delas aumenta a habilidade da Yersinia em se multiplicar no hospedeiro

(AUTENRIETH & HEESEMANN, 1992; NAKAJIMA & BRUBAKER, 1993). Handley et al.

(2004) confirmaram que um ambiente Th1, com altos níveis de IFN-γ, predomina durante

infecção com Y. enterocolitica. O antígeno LcrV inibe, direta ou indiretamente, a expressão de

IFN-γ e TNF-α (NAKAJIMA & BRUBAKER, 1993; NAKAJIMA et al., 1995).

O TGF-β é uma citocina que está envolvida na regulação da resposta inflamatória. Há

relatos de que a administração de altas concentrações de TGF-β1 fornece proteção limitada para

camundongos C57BL/6 infectados com Y. enterocolitica (AUTENRIETH et al., 1996). Nossos

resultados mostraram que a produção do TGF-β pelos LT-CD4 foi alterada apenas durante a

infecção com a amostra WT, quando se observou supressão na sua produção do 7° dia pi em

diante. Embora significativas, as reduções nas quantidades de TGF-β produzido pelos LT-CD4

foram bastante pequenas em relação à produção apresentada por estas mesmas células obtidas

dos animais não infectados. As Yops provavelmente atuam nesta supressão, visto que a amostra

que não as secreta não alterou a produção de TGF-β, porém qual ou quais delas seriam mais

importantes não se pode deduzir, pois na ausência de qualquer uma das três praticamente não

houve alteração. A produção aumentada de TGF-β pelos LT-CD8 obtidos dos animais infectados

com a amostra WT, que secreta todas as Yops, não nos permite atribuir a estas proteínas um

papel modulador da produção da citocina em questão por esta subpopulação linfocitária.

Comparando os resultados obtidos com os LT-CD4, os quais apresentaram, embora significativa,

uma redução muito pequena na produção do TGF-β em relação aos animais controles, com os

resultados obtidos com os LT-CD8, que mostraram que mesmo na presença de todas as Yops a

produção de TGF-β aumentou, podemos vislumbrar que esta citocina seja talvez a única, dentre

as analisadas, cuja produção não é afetada pela infecção intravenosa por Y. pseudotuberculosis.

Esta hipótese está de acordo com os resultados do Bohn et al. (1998) que constataram que a

administração de TGF-β não causou qualquer diferença na infecção de camundongos BALB/c

com Yersinia.

O estudo da invasina de Y. enterocolitica como adjuvante na vacinação mostrou que esta

proteína é capaz de promover a diferenciação dos LT-CD4 Th0 em ambos os subtipos: Th1 e

Th2 (BÜHLER et al., 2006). Dados como este ajudam a fundamentar os resultados que

observamos com a amostra YpIII durante a dosagem das citocinas (pois mostram que outros

fatores de virulência, além das Yops, interferem na produção e secreção das citocinas), além de

evidenciar a não polarização da resposta para nenhum dos perfis (Th1 ou Th2) durante infecção

com Yersinia; o que nós também observamos.

A ativação do NF-κB em resposta a estímulos microbianos está normalmente associada

com o início da resposta imune, uma vez que ele controla a síntese de citocinas, proteínas de fase

aguda e moléculas de adesão (HATADA et al., 2000). No entanto, alguns patógenos tiram

proveito do NF-κB a fim de melhorar sua replicação, sobrevivência e disseminação dentro do

hospedeiro. A YopJ de Y. pseudotuberculosis inibe a ativação do NF-κB, prejudicando a

produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α e IL-8 (SCHESSER et al, 1998). Os nossos

resultados nos permitem afirmar que outra Yop, além da YopJ, também é capaz de inibir a

ativação do NF-κB. Isto ficou claro a partir dos resultados apresentados pelos animais infectados

com a amostra que não secreta a YopJ (YopJ

). No entanto, o fato das amostras usadas neste

trabalho constituírem mutantes “single”, ou seja, mutantes incapazes de secretar apenas uma

Yop, não nos possibilitou eliminar a influência da YopJ durante a infecção com as amostras

YopE

, YopH

e YopM

; o que talvez justifique os baixos valores de ativação apresentados por

todas elas. Mas, se considerarmos que as menores inibições foram observadas durante a infecção

com a amostra YopE

(no 7° dia pi) e com a amostra YopH

(no 21° dia pi), podemos indicar que

a YopE, ou a YopH, ou ambas inibam o NF-κB na ausência da YopJ ou até mesmo sinergizem

com esta, caso todas estejam presentes (como, por exemplo, durante a infecção com a amostra

WT). Uma publicação recente de Viboud et al. (2006) relata o papel da YopE na inibição da

ativação de JNK, ERK e NF-κB. Antes disso já havia sido descrito o papel inibitório da YopE

sobre a produção de IL-1β por macrófagos infectados com Y. enterocolitica (SCHOTTE et al.,

2004). Considerando que a expressão do gene desta citocina é dependente da via do NF-κB,

pode-se considerar que estes resultados já constituíam indícios da provável ação inibitória da

YopE sobre o NF-κB. Dados também atuais indicam que a YopJ pode inibir a sinalização pelo

NF-κB em reposta a diversos estímulos e que esta inibição depende de sua atividade de protease

desubiquitinizante (ZHOU et al., 2005).

A inibição na ativação do NF-κB observada durante a infecção com a amostra YpIII

revelou que outros fatores de virulência, além das Yops, também são capazes de inibí-lo. Várias

observações sugerem que os fatores de Yersinia que podem induzir resposta inflamatória

dependente da ativação do NF-κB são muito redundantes. Viboud et al. (2003) demonstraram

que a YopB de Y. pseudotuberculosis pode induzir a produção de IL-8 graças à ativação do NF-

κB . Schmid et al. (2004) indicaram que a YadA também é capaz de fazer o mesmo que a YopB.

Se levarmos em conta que para ativar o NF-κB Yersinia se vale de vários fatores de virulência

com funções redundantes, podemos imaginar que para inibí-lo ela faça o mesmo.

A fim de confirmar o papel inibitório da YopE e da YopH e analisar o possível papel da

YopM, iremos realizar este mesmo ensaio, porém utilizando extratos nucleares provenientes de

animais infectados com as amostras duplos mutantes YopE

, YopH

e YopM

. Desta forma

eliminaremos a influência da YopJ de nossos resultados.

A eliminação da infecção por Yersinia envolve a ativação da resposta imune adaptativa

incluindo os linfócitos T CD4 e CD8 do perfil Th1 (AUTENRIETH et al., 1992; AUTENRIETH

et al., 1993a; BOHN & AUTENRIETH, 1996; FALGARONE et al., 1999). A liberação de

antígenos heterólogos através do sistema de secreção do tipo III pode induzir tanto a resposta de

linfócitos T CD4 quanto de LT-CD8 em camundongos (IGWE et al., 1999). O sistema de

secreção do tipo III de amostras atenuadas de Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis (criadas

através do rompimento de genes associados à virulência) pode ser responsável por fazer com que

antígenos sejam apresentados pela molécula MHC de classe-I (MHC-I) e, conseqüentemente,

induzam resposta de LT-CD8 (WIEDIG et al., 2005). Recentemente foi descrita a participação

do proteassomo na degradação da YopE e na apresentação desta proteína pelo MHC-I; uma vez

que o proteassomo é responsável pela geração de peptídeos bacterianos que são apresentados

pelo MHC-I. A YopE degradada e apresentada pelo MHC-I seria então reconhecida pelos LT-

CD8 e mediaria a resposta protetora contra Yersinia desenvolvida por esta subpopulação

linfocitária (RUCKDESCHEL et al., 2006). Embora as Yops que tenham acesso ao citoplasma

possam ser apresentadas aos LT-CD8 pelo MHC-I (STARNBACH & BEVAN, 1994), pouco se

sabe a respeito do papel destas proteínas durante a resposta citotóxica dos LT-CD8. Nosso

trabalho teve como um dos objetivos verificar a influência das Yops E, H e M de Y.

pseudotuberculosis sobre a citotoxicidade dos LT-CD8. De acordo com o modelo experimental

utilizado (LT-CD8 obtidos de camundongos BALB/c infectados pela via intravenosa e

cocultivados com macrófagos infectados in vitro, os quais serviram como células apresentadoras

de antígenos), detectou-se uma atividade citotóxica muito baixa e até mesmo nula em alguns dias

pi. No entanto, comparando os resultados obtidos no 5° dia pi, que foram os mais expressivos,

pudemos conferir às Yops função inibidora da atividade citotóxica dos LT-CD8, uma vez que

durante a infecção com a amostra YpIII esta atividade foi alta em relação às observadas com as

amostras WT, YopE

e YopM

. Como durante a infecção com a amostra YopH

observou-se

valores de citotoxicidade muito parecidos com aqueles obtidos durante infecção com a amostra

YpIII, pode-se pensar que a YopH seja responsável pela inibição da atividade citotóxica dos LT-

CD8 de camundongos BALB/c, após inoculação intravenosa de Y. pseudotuberculosis. Outros

trabalhos também relacionaram as Yops com supressão dos LT-CD8. Já foi mostrado que a

YopP de Y. enterocolitica inibe o desenvolvimento de uma resposta efetiva por parte dos LT-

CD8 em camundongos oralmente infectados, e que esta inibição deve estar relacionada com a

ação da YopP sobre as células dendríticas (ERFURTH et al., 2004). Um estudo in vitro

demonstrou que a YopP inibe a apresentação de antígeno pelo MHC-I por induzir morte celular

programada e inibir a maturação de células dendríticas (TRULZSCH et al., 2005). Mais

recentemente relacionou-se esta ação da YopP sobre os LT-CD8 com sua capacidade de induzir

morte celular semelhante a necrose em células dendríticas (GRÖBNER et al., 2006). Amostras

atenuadas de Y. enterocolitica, mutantes para a secreção das Yops H, E, M e O, não foram

capazes de induzir uma resposta de LT-CD8 contra o antígeno listeriolisina O, in vivo

(TRULZSCH et al., 2005). Starnbach & Bevan (1994) descreveram que células infectadas com

Yersinia apresentam um epítopo da YopH aos LT-CD8 de maneira restrita ao MHC de classe I, e

que o fazem independentemente do fato de que estes microrganismos sejam, na maioria das

vezes, encontrados extracelularmente e quando no compartimento intracelular, permaneçam

totalmente dentro de vacúolos. Algum tempo depois, Falgarone et al. (1999), ao estudarem ratos

infectados com Y. pseudotuberculosis, mostraram que nem a YopH, nem a YpkA ou a YopJ

estão implicadas nesta apresentação, e que os antígenos apresentados aos LT-CD8 no contexto

da classe I são desconhecidos. Células T CD8 citotóxicas que reconhecem antígenos derivados

de Yersinia apresentados de forma restrita ao MHC-I foram obtidas a partir das articulações de

pacientes com artrite reativa. No entanto, não há evidências diretas de que estas células T tenham

sido exatamente geradas em resposta à infecção por Yersinia (HERMANN et al., 1993;

UGRINOVIC et al., 1997). Talvez o papel supressivo da YopH sugerido em nosso trabalho

possa também ser atribuído à já conhecida função inibidora da YopH sobre a ativação dos LT e

LB (YAO et al., 1999).

Muitas questões permanecem sobre a razão pela qual Yersinia, que é um patógeno

predominantemente extracelular, inibiria o desenvolvimento dos LT-CD8 do hospedeiro.

Considerando que os LT-CD8 produzem IFN-γ, e que esta citocina aumenta a capacidade

bactericida dos macrófagos, que são células importantes no combate às infecções por Yersinia,

os LT-CD8 teriam atividade bactericida indireta contra Yersinia (TRULZSCH et al., 2005), e por

isso também seriam alvos de seus fatores de virulência. Porém, sabe-se que alguns sorotipos de

Y. pseudotuberculosis são capazes de se replicar no interior dos macrófagos nos estágios iniciais

da infecção (PUJOL & BLISKA, 2003).

Os mecanismos de virulência da Yersinia, a forma como eles atuam e interferem com os

mecanismos de defesa do hospedeiro e também como o hospedeiro responde no sentido de

eliminar a infecção constituem alvos de muitos estudos. As ferramentas que Yersinia dispõe e

que permitem que ela module desde a resposta imune inata até a resposta imune adaptativa,

incluindo até mesmo a expressão de genes, a tornam um excelente modelo de estudo.

Considerando que bactérias enteropatogênicas compartilham muitas propriedades, inclusive no

que diz respeito a mecanismos de evasão da resposta imune do hospedeiro, descobertas feitas

com as espécies enteropatogênicas de Yersinia podem, muitas vezes, contribuir para o estudo das

outras enterobactérias. O uso de amostras atenuadas de Yersinia como vacinas vivas tem sido

muito estudado graças à capacidade que elas têm, através da secreção de antígenos heterólogos

pelo sistema de secreção do tipo III, de induzir resposta tanto de LT quanto de LB em

camundongos. Aplicações como estas revelam a importância do estudo com Yersinia, e do

modelo que ela representa, também com enfoque terapêutico.

Fazendo uma análise geral de todos os resultados do nosso trabalho, podemos dizer que

as amostras de Y. pseudotuberculosis estudadas suprimem a resposta imune celular de

camundongos BALB/c, infectados pela via intravenosa. É importante sempre ressaltar a

linhagem de camundongos utilizada e a via de inoculação do antígeno, pois há muitas evidências

de que as respostas imunes se alteram em função destes fatores. Dentre as Yops estudadas, a

YopH, muitas vezes atuando só e em outras em conjunto com a YopE, foi a que esteve mais

diretamente envolvida nas alterações observadas. A relevância da YopH para a virulência da

bactéria ficou bem evidente logo no primeiro experimento realizado para determinar a dose

infectante, quando percebeu-se que na ausência da YopH, a bactéria devia ser inoculada em

concentrações muito mais altas para promover infecção. No experimento da cinética de infecção

e pesagem dos órgãos foi possível perceber que na ausência da YopH a bactéria demorou mais

para colonizar o fígado e o baço, foi mais rapidamente eliminada de ambos, não provocou

alterações patológicas macroscópicas nos órgãos nem sintomas físicos de doença e tampouco

promoveu redução significativa no peso dos órgãos. O experimento feito para quantificar as

subpopulações de LT esplênicos mostrou que a única infecção que não resultou em supressão da

produção dos LT CD4 e CD8 foi a provocada pela amostra YopH

, e que as maiores reduções

nos números destas células se deu quando YopH e YopE estavam presentes. Já a quantificação

das citocinas não nos possibilitou diferenciar qual dos padrões, Th1 ou Th2, seria predominante

durante a infecção intravenosa de camundongos BALB/c com as respectivas amostras de Y.

pseudotuberculosis, nem atribuir a exatamente uma Yop, mas sim à ação conjunta das três, o

papel supressor ou controlador da produção das citocinas. No entanto, pudemos notar que as

maiores quantidades de citocinas produzidas por LT-CD8 ocorreram sempre durante a infecção

com amostra YopH

. A avaliação da ativação do NF-κB, embora suscitando dúvidas devido à

utilização de amostras mutantes que sempre secretavam YopJ, também nos permitiu sugerir as

Yops E e H como potenciais inibidoras do mesmo. Ao avaliar a atividade citotóxica dos LT-CD8

pudemos, mais uma vez, verificar que foi durante a infecção com a amostra YopH

que se

observou a maior atividade citotóxica.

Certamente as outras Yops não estudadas neste trabalho e os fatores de virulência não

plasmideais, ambos presentes nas amostras avaliadas, também influenciam em todos os

resultados acima discutidos e a atuação concomitante de todas elas, como acontece na infecção

com a amostra selvagem, constitui a forma mais eficiente de evasão da bactéria da resposta

imune do hospedeiro.

Mais experimentos in vivo focados em decifrar o papel das Yops e as ações redundantes

entre elas irão ajudar a responder muitas questões sobre a virulência da Yersinia e permitir o

promissor uso terapêutico destas proteínas.

Yops

Resposta

Imune

Celular

Parâmetros

avaliados

Quantidade de LT e subpopulações

(CD4 e CD8)

Produção de citocinas Th1, Th2 e TGF-β

pelas subpopulações linfocitárias

Ativação do NF-κB

Citotoxicidade dos LT-CD8

Resultados

observados

Diminuição na

quantidade de LT

(tanto CD4

quanto CD8)

Supressão da

produção das

citocinas pelos

LT-CD4

Manutenção da

produção das

citocinas pelos

LT-CD8 em

níveis basais

Inibição da

atividade

citotóxica

dos

LT-CD8

Inibição da ativação

κB

Principais

Yops

envolvidas

YopE

YopM

YopE

YopH

YopE

YopH

Particip

ação de fatores de virulência não plasmideais

Figura 13 – Esq

uema representativo dos parâmetros avaliados no presente trabalho, dos respectivos resultados obtidos e

das principais Yops envolvidas em cada uma das alterações decorrentes da infecção intravenosa de camundongos

BALB/c com Y. pseudotuberculosis.

VI - COCLUSÕES:

• A YopH é o fator de virulência mais importante entre as proteínas efetoras analisadas.

• A presença da YopH contribui para a colonização e persistência da bactéria no baço e

fígado dos animais, quando infectados pela via intravenosa.

• A YopE e a YopH são as principais responsáveis pela diminuição na quantidade de

linfócitos T no decorrer da infecção.

• As Yops E, H e M são responsáveis pela supressão da produção de citocinas pelos LT-

CD4.

• A YopH é importante na modulação da produção de citocinas pelos LT-CD8.

• Não ocorre uma polarização para o perfil Th1 nem Th2 durante infecção intravenosa de

camundongos BALB/c com as amostras de Y. pseudotuberculosis estudadas.

• As Yops E e H parecem estar envolvidas na inibição do fator nuclear NF-κB.

• A YopH suprime a atividade citotóxica dos LT-CD8.

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