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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Evolução da resistência a antimicrobianos
e caracterização molecular de
Streptococcus pneumoniae isolados em
Porto Alegre, Rio Grande do Sul
CÍCERO ARMÍDIO GOMES DIAS
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes
Rio de Janeiro
2007
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Evolução da resistência a antimicrobianos
e caracterização molecular de
Streptococcus pneumoniae isolados em
Porto Alegre, Rio Grande do Sul
CÍCERO ARMÍDIO GOMES DIAS
Rio de Janeiro
Setembro 2007
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia),
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes (IMPPG), da
Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), como
parte dos requisitos necessários à obtenção do título de
Doutor em Ciências (Microbiologia).
Orientador: Profa. Dra. Lúcia Martins Teixeira
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Evolução da resistência a antimicrobianos e caracterização
molecular de Streptococcus pneumoniae isolados em Porto Alegre,
Rio Grande do Sul
Autor: Cicero Armidio Gomes Dias
Orientador: Lúcia Martins Teixeira
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes (IMPPG), da
Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).
Aprovada por:
-------------------------------------------------------------------------
Presidente, Prof.Sérgio Eduardo Longo Fracalanzza
--------------------------------------------------------
Prof. Vânia Lucia Carreira Merquior
--------------------------------------------------------
Prof. Marise Dutra Asensi
--------------------------------------------------------
Prof. João Ramos Costa Andrade
--------------------------------------------------------
Prof. Angela Christina Dias de Castro
Rio de Janeiro
Setembro 2007
iv
iv
FICHA CATALOGRÁFICA
Dias, Cicero Armidio Gomes
Evolução da resistência a antimicrobianos e caracterização molecular
de Streptococcus pneumoniae isolados em Porto Alegre, Rio Grande do Sul /
Cicero Armidio Gomes Dias. - Rio de Janeiro: UFRJ/ IMPPG, 2007.
xiv, 166 f.: il. ; 31 cm.
Orientador: Lúcia Martins Teixeira
Tese (doutorado) – UFRJ/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/
Programa de Pos-graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia), 2007
Referências Bibliográficas: f. 81 - 109
1. Streptococcus pneumoniae. 2. Caracterização fenotípica. 3. Caracterização
genotípica. 4. Susceptibilidade a antimicrobianos. 5. Sorotipagem. 6.
Epidemiologia molecular. I. Teixeira, Lúcia Martins. II. Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Programa de
Pos-Graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia). III. Título
v
v
O presente trabalho foi desenvolvido junto ao Laboratório de
Apoio Biotecnológico do Departamento de Microbiologia Médica,
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes (IMPPG), Centro de
Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio de
Janeiro (UFRJ), sob a orientação da Profa. Dra. Lúcia Martins
Teixeira.
vi
vi
Dedicatória
Este trabalho é dedicado a Isabel, Olívia e Cecília,
que fazem com que a vida tenha sentido.
vii
vii
Agradecimentos
O autor agradece às seguintes pessoas e instituições:
À Prof. Lúcia Martins Teixeira, orientadora desta tese. Pelo elevado espírito
científico, pela generosidade em propiciar oportunidades para crescimento e
ampliação de horizontes. Um exemplo marcante e um agradecimento especial.
Ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da Universidade Federal do
Rio de Janeiro. À coordenadora de Pós-Graduação, Prof. Thaís Souto-Padrón e aos
demais professores comprometidos com a excelência desta instituição.
À Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre. Esta
instituição permitiu a realização de grande parte deste trabalho. Diversos
funcionários e professores contribuíram, em especial ao professor Pedro d’Azevedo.
Vale também mencionar Grasiela Agnes e Ana Paula Guedes Frazzon.
Ao Hospital Mãe de Deus, Porto Alegre, nas pessoas de Úrsula Silva e Galton
Albuquerque. Também, aos colegas Fabiana Zettler, Leandro Perez e Silvana
Superti.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), à
Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), à Fundação Carlos Chagas Filho de
viii
viii
Amparo e Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), ao Ministério da Ciência
e Tecnologia (MCT/PRONEX), pelo apoio financeiro.
Ao Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Maria da Glória
Siqueira Carvalho deve aqui ser mencionada com destaque. Sua inteligência e
empenho à ciência e à saúde pública trouxeram uma imensa colaboração a este
estudo. Também agradeço a Bernard Beall e Richard Facklam, diretores do
Streptococcus Laboratory do CDC.
À Maria Beatriz Cirne Lima Guedes (FFFCMPA) e Filomena Soares Pereira
da Rocha (IMPPG-UFRJ) pelo apoio técnico.
Aos colegas do laboratório 27 do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes. Destaco aqui a colega Fabíola Cristina Kegele que compartilhou uma parcela
importante desta tese.
À minha família.
ix
ix
Resumo
Evolução da resistência a antimicrobianos e caracterização molecular de
Streptococcus pneumoniae isolados em Porto Alegre, Rio Grande do Sul
Autor: Cícero Armídio Gomes Dias
Orientador: Lúcia Martins Teixeira
Resumo da Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Biológicas (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes (IMPPG), da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).
Streptococcus pneumoniae é um importante patógeno que causa doenças
graves como meningite, pneumonia e bacteremia. O presente estudo teve o objetivo
de avaliar a evolução da resistência aos antimicrobianos entre amostras de S.
pneumoniae isoladas em Porto Alegre, RS, durante um período de dez anos (1995-
2004). Foram estudadas 829 amostras. A resistência à penicilina foi verificada em
25,1% das amostras (17,7% de resistência intermediária e 7,4% de resistência
plena). A resistência à ceftriaxona, ao cloranfenicol, à eritromicina e à tetracicllina foi
de 0,8% (6,2% em casos de meningite), 1,3%, 4,0%, e 10,1%, respectivamente. Um
aumento da resistência plena à penicilina foi evidente (1,46% no período 1995-1999
e 15,4% em 2000-2004). Os sorotipos 14, 6B, 19F, 23F, 3, 6A, 11A e 9V foram os
mais freqüentes e 75,5% e 49,0% dos isolados apresentaram tipos sorológicos
incluídos nas vacinas 23 e 7-valente, respectivamente. Amostras pertencentes a seis
sorotipos (6B, 9V, 14, 19F, 23B e 23F) constituiram 86,1% dos isolados não
suscetíveis à penicilina. Os sorotipos 9V e 14 predominaram entre isolados com
resistência plena à penicilina e, de acordo com a análise dos perfis de fragmentação
do DNA cromossômico através de eletroforese em campo pulsado após macro
restrição, a maioria destas amostras foi incluída em um único complexo clonal
relacionado ao clone internacional Spain
9V
-3. Em amostras do sorotipo 6B, um
complexo clonal principal, com dois subclones altamente relacionados, foi
identificado entre amostras suscetíveis à penicilina e em amostras com resistência
intermediária. Os resultados demonstraram as características da disseminação de
amostras resistentes de S.pneumoniae na região investigada, reforçando a
necessidade de vigilância, em especial para os sorotipos 6B, 9V e 14. Foram
também caracterizadas 4 amostras de S. pneumoniae com fenótipo de resistência à
optoquina (Opt
R
), que constitui uma atipia importante e pouco freqüente. Em todas
foram observadas mutações na seqüência de nucleotídeos que codifica a
x
x
subunidade c da F
0
F
1
ATPase: duas apresentaram mutações nos códons 23
(levando a uma substituição do amino ácido isoleucina ao invés de alanina) e 49
(serina ao invés de fenilalanina, uma substituição ainda não descrita neste códon).
Duas novas mutações foram observadas nas duas amostras restantes, ambas no
códon 45 (leucina ou valina na posição correspondente à fenilalanina). Os resultados
revelaram três alterações descritas pela primeira vez em pneumococos com fenótipo
Opt
R
, não sendo observada relação dessa característica com um sorotipo
específico, perfil de resistência aos antimicrobianos ou grupo clonal. Por fim,
considerando que a definição dos sorotipos de S. pneumoniae é essencial para a
vigilância das infecções causadas por este microrganismo, foi avaliado e adaptado
um dos métodos moleculares que estão sendo introduzidos com a intenção de
contornar os problemas da tipagem convencional. Para tal, um procedimento de
PCR multiplex seqüencial foi testado em uma amostragem de pneumococos
isolados de crianças, resultando na proposta de um sistema alternativo para
aumentar o rendimento na dedução de sorotipos mais freqüentes na América Latina.
O sistema alternativo proposto é composto por seis reações de PCR multiplex,
abrangendo 30 sorotipos/sorogrupos e permitiu a determinação do tipo capsular de
94,6% das amostras testadas.
Palavras-chave: Streptococcus pneumoniae, resistência aos antimicrobianos,
distribuição de sorotipos, caracterização molecular, sorotipo 14, clone Spain
9V
-3,
resistência à optoquina, F
0
F
1
ATPase, PCR multiplex seqüencial.
Rio de Janeiro
Setembro 2007
xi
xi
Abstract
Evolution of antimicrobial resistance and molecular characterization of Streptococcus
pneumoniae isolated in Porto Alegre, Rio Grande do Sul
Author: Cicero Armidio Gomes Dias
Advisor: Lúcia Martins Teixeira
Abstract of the Dissertation presented to the Programa de Pos-graduação em
Ciências Biológicas (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes
(IMPPG), Univesidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), as part of the requirements
to receive the degree of Doctor in Sciences (Microbiology).
Streptococcus pneumoniae is an important pathogen that causes severe life-
threatening illness such as meningitis, pneumonia, and bacteremia. In the present
study, we evaluated trends on antimicrobial resistance and molecular characteristics
of 829 S. pneumoniae isolates from patients living in Porto Alegre, RS, Brazil,
obtained over a ten-year period (1995-2004). Penicillin resistance was present in
25.1% of the strains (17.7% intermediate and 7.36% full resistant). Resistance to
ceftriaxone, chloramphenicol, erythromycin, and tetracycline was verified in 0.8%
(6.2% in case of meningitis), 1.3%, 4.0%, and 10.1% of the strains, respectively. An
increase in full resistance to penicillin was evident (1.46% in the period 1995-1999
and 15.4% in 2000-2004). Serotypes 14, 6B, 19F, 23F, 3, 6A, 11A, and 9V were the
most frequent and 75.5% and 49.0% of the isolates belonged to serotypes included
in the 23-valent and 7-valent pneumococcal vaccines, respectively. Pneumococci of
six serotypes (6B, 9V, 14, 19F, 23B, and 23F) comprised 86.1% of the penicillin non-
susceptible isolates. Serotypes 9V and 14 predominated among isolates exhibiting
full resistance to penicillin and, according to PFGE analysis, most of these isolates
were included in a single clonal complex related to the international clone Spain
9V
-3.
On the other hand, among serotype 6B isolates, a major clonal complex was
observed, with two highly related subclusters including penicillin susceptible and
intermediate resistant pneumococci. The results indicate the dissemination of
resistance among strains of S. pneumoniae in the Southern region of Brazil,
reinforcing the need of surveillance and control of antimicrobial resistance, with
especial emphasis in serotypes 6B, 9V and 14.
We have also identified and characterized 4 S. pneumoniae isolates
presenting optochin resistance (Opt
R
), a rare but important atypical phenotype. All 4
Opt
R
isolates presented mutations in the nucleotide sequence coding for the c
subunit of F
0
F
1
ATPase: two had mutations in codons 23 (leading to the deduced
amino acid substitution isoleucine instead of alanine) and 49 (serine instead of
xii
xii
alanine, a novel type of mutation detected at this position), respectively. Two
additional novel mutations, both located in codon 45, were detected in the two
additional isolates, corresponding to leucine or valine (instead of phenylalanine). The
data indicate that three previously unrecognized alterations were detected in the
atpC gene of S. pneumoniae and that Opt
R
among Brazilian pneumococcal isolates
is not related to a specific pneumococcal serotype, antimicrobial resistance profile, or
clonal group.
Considering that definition of S. pneumoniae serotypes is essential for
surveillance we have evaluated and adapted one of the molecular methods that have
recently been introduced for this purpose and to circumvent eventual problems
related to conventional serotyping. We have applied a multiplex PCR procedure to
determine the serotypes in a collection of Brazilian pneumococcal isolates from
children and have designed a modified scheme to improve the test performance in
the deduction of the most frequent serotypes of S. pneumoniae isolated in Latin
America. The so-called six reactions Latin America scheme comprises 30
serotypes/serogroups and covered 94.6% of the pneumococcal isolates tested.
Key words: Streptococcus pneumoniae, antimicrobial resistance, serotype
distribution, molecular characterization, serotype 14, Spain
9V
-3 clone, optochin
resistance, F
0
F
1
ATPase, sequential multiplex PCR.
Rio de Janeiro
September 2007
xiii
xiii
Sumário
Resumo ix
Abstract xi
Introdução 01
• Importância das infecções pneumocócicas
01
• Patogenicidade e fatores de virulência
02
• Imunoprofilaxia
06
• Sorotipagem e métodos alternativos
09
• Resistência aos antimicrobianos
10
• Resistência aos antimicrobianos no Brasil
15
• Rastreamento de cepas com resistência aos antimicrobianos
18
• Identificação
21
Objetivos 26
Materiais e métodos 27
• Amostras bacterianas
27
• Caracterização fenotípica das amostras
28
• Tipagem sorológica
29
• Detecção de genes associados a fatores de virulência de
Streptococcus pnemoniae
30
• Testes de hibridização com sonda de DNA para a subunidade
16S do rRNA de Streptococcus pneumoniae
33
• Testes de suscetibilidade aos antimicrobianos
33
xiv
xiv
• Detecção e caracterização de genes associados à resistência
aos antimicrobianos
36
• Análise do polimorfismo dos perfis de fragmentação do DNA
cromossômico através eletroforese em campo pulsado (PFGE)
38
• “Multilocus Sequence Typing” (MLST)
40
• PCR multiplex seqüencial para determinação de tipos capsulares
41
Resultados 46
Discussão e conclusões 72
Referências bibliográficas 81
Anexos 110
• Manuscrito 1
115
• Manuscrito 2
149
• Manuscrito 3
158
• Manuscrito 4
162
Introdução
Importância das infecções pneumocócicas
A espécie Streptococcus pneumoniae, comumente denominada de
pneumococo, encontra-se entre as principais causas de doença e morte em seres
humanos. Constitui um dos principais agentes bacterianos de pneumonias
adquiridas na comunidade, sendo uma das causas mais importantes de meningite,
bacteremia, otite média aguda e sinusite (Butler, Dowell & Breiman, 1998). Estima-
se que, nos Estados Unidos da América (EUA), cerca de 3.000 casos de
meningite e de 60.000 casos de bacteremia, a cada ano, sejam devidos a este
microrganismo (CDC, 1997), sendo este a principal causa de meningite de
etiologia bacteriana (1,1 casos/100.000 a cada ano) (Schuchat et al., 1997). A taxa
de mortalidade nas bacteremias pneumocócicas é de aproximadamente 25-30%
(Pallares et al., 1995), sendo estimada entre 30 e 40% em idosos (CDC, 1997).
Aproximadamente 500.000 casos de pneumonia pneumocócica ocorrem
anualmente nos EUA, sendo que o pneumococo é responsável por 25-35% das
pneumonias bacterianas comunitárias em pacientes que necessitam
hospitalização (Jernigan, Cetron & Breimann, 1996). Avalia-se, ainda, a
associação deste microrganismo com a ocorrência anual de aproximadamente 1
milhão de mortes entre crianças com menos de cinco anos, a maioria em países
em desenvolvimento (Hausdorff et al., 2000a).
As meningites pneumocócicas apresentam alto índice de mortalidade,
variando de 20% a 50%, sendo que, entre os sobreviventes, 30% a 60%
2
desenvolvem seqüelas neurológicas e perda de audição (Koedel, Scheld & Pfister,
2002).
À parte infecções invasivas, os pneumococos encontram-se envolvidos em
infecções mais freqüentes, como otites e sinusites. Do total de 24 milhões de
consultas pediátricas devidas a otite média aguda que ocorrem anualmente nos
EUA, 20-50% são causadas pelos pneumococos (CDC, 1997).
Estudos realizados no Brasil apontam os pneumococos entre os principais
agentes de meningites (Bryan et al., 1990; Taunay et al., 1990; Brandileone et al.,
1995; Ko et al., 2000), bem como de infecções respiratórias agudas (Sutmoller et
al., 1995).
Patogenicidade e fatores de virulência
O risco para aquisição de infecções pneumocócicas é nitidamente
relacionada com a idade, sendo maior em crianças menores que dois anos de
idade e em idosos acima de 65 anos (García-Leoni et al., 1993). Há ainda grupos
de indivíduos que, independente da idade, apresentam maior risco para infecção
invasiva pelo pneumococo, particularmente os asplênicos, os portadores de
doenças de base crônicas (cardiovasculares, pulmonares, diabetes, alcoolismo,
cirrose) e os imunocomprometidos. A incidência de bacteremia em indivíduos
infectados pelo vírus da imunodeficiência humana é cerca de 100 a 200 vezes
maior do que a observada na população geral (Redd, Rutherford & Sande, 1990;
García-Leoni et al., 1992).
3
Considerada a importância das infecções pneumocócicas, é necessário que
sejam ressaltados os atributos de virulência do microrganismo. Entre os fatores de
virulência dos pneumococos, destaca-se, por sua ação anti-fagocitária, a cápsula
polissacarídica, sendo conhecidos mais de 90 sorotipos com base nas diferenças
antigênicas (Henrichsen, 1995). Anticorpos dirigidos para os polissacarídeos
capsulares protegem o hospedeiro de infecções pelo sorotipo homólogo com
indução de opsonofagocitose (Bruyn, Zegers & van Furth, 1992).
A distribuição dos sorotipos nas diferentes populações varia com idade,
região e período de tempo. Contudo, dez sorotipos são responsáveis pela maioria
das doenças pediátricas invasivas, sendo que os sorogrupos 1, 6, 14, 19 e 23
estão entre os mais proeminentes (Hausdorff et al., 2000a). Amostras
pertencentes aos sorogrupos 6, 10, e 23 são mais freqüentes como causadoras de
meningites do que de bacteremia, ao passo que o inverso acontece para aquelas
pertencentes aos sorotipos 1, 4 e 14 (Hausdorff et al., 2000b). Em dois estudos
populacionais, a capacidade invasiva dos diferentes sorotipos foi definida pela
freqüência relativa com que cada sorotipo foi encontrado na nasofaringe de
portadores versus a freqüência de isolados em sítios anatômicos normalmente
estéreis. Em ambos os estudos, os sorotipos 1, 4 e 7F foram identificados como
aqueles com mais alto grau de invasividade (Brueggemann et al., 2003; Sandgren
et al., 2004). Existem, por outro lado, sorotipos mais relacionados com o estado de
portador nasofaríngeo (Bogaert, Groot & Hermans, 2004).
4
Estudos realizados com amostras isoladas de infecções pneumocócicas
invasivas no Brasil revelam que alguns sorotipos são encontrados com maior
freqüência, embora possam ser observadas diferenças em suas distribuições.
Todavia, os sorotipos 14, 6B, 1, 5 e 18C aparecem com maior destaque (Mantese
et al., 2003; Di Fabio et al., 2001; Laval et al., 2006; Brandileone et al., 2003).
O papel da cápsula é notório na etapa de colonização da nasofaringe pelo
pneumococo. Porém, outros componentes do microrganismo também atuam nesta
etapa essencial da infecção pneumocócica. A colonização requer aderência ao
epitélio que recobre o trato respiratório, sendo que o pneumococo liga-se
especificamente a carbohidratos (N-acetil-glicosamina) da superfície celular.
Proteínas de superfície do pneumococo, como a adesina de superfície
pneumocócica (PsaA), são responsáveis pela mediação da aderência a estes
açúcares (Swiatlo et al., 2002). A conversão da colonização assintomática para
doença invasiva requer a geração local de fatores inflamatórios (como interleucina
1 e fator de necrose tumoral), como costuma ocorrer nas infecções virais
(Tuonamen, 1997). Uma decorrência destas modificações inflamatórias é a
alteração na quantidade e qualidade dos receptores das células epiteliais alvo e
de células endoteliais. A colina presente na parede celular pneumocócica
apresenta afinidade pelos receptores então gerados, tais como o fator ativador de
plaquetas. A ligação a estes receptores induz a internalização e promove a
migração transcelular pelo epitélio respiratório e pelo endotélio, resultando em
invasão (Cundell et al., 1995).
5
Outros componentes atuam como fatores de virulência, podendo ser
destacados a pneumolisina, a autolisina, o antígeno A de superfície, a proteína A
de superfície pneumocócica, a pululanase e as neuraminidases. (Boulnois, 1992;
Hollingshead & Briles, 2001; Jedrzejas, 2001, 2004).
A pneumolisina atua ligando-se a moléculas de colesterol encontradas na
célula do hospedeiro, o que resulta em seu ingresso nas membranas alvo e
formação de poros. Com a formação de poros o processo lítico das células é
desencadeado (Jedrzejas, 2001). A ação citotóxica ocorre sobre as células
epiteliais brônquicas, o que leva à diminuição dos batimentos ciliares (Rayner,
Jackson & Rutman, 1995). Os efeitos citotóxicos da pneumolisina podem também
inibir diretamente a fagocitose e a ação das células do sistema imune (Berry,
Yother & Briles, 1989).
A autolisina é degradadora do peptideoglicano de parede celular. A ação da
autolisina na patogênese da infecção pneumocócica se dá direta (atividade
inflamatória) e indiretamente (liberação extracelular de proteínas citoplasmáticas,
incluindo a pneumolisina) (Tuomanen, 1997).
Além do já mencionado papel de adesina do antígeno A de superfície
pneumocócica (PsaA), é também reconhecida sua atividade como proteína
transportadora de íons manganês e zinco, sendo a presença destes íons
necessária para o crescimento de S. pneumoniae (Paton, 1998).
6
A proteína SpuA (pululanase A) parece ter um papel na colonização, por
sua capacidade de solubilizar muco ou promover a exposição de glicoconjugados
do hospedeiro para a aderência do pneumococo. O gene responsável por esta
proteína foi designado como spuA (Bogaerts et al., 2000)
As neuraminidases auxiliam no processo de aderência por exercerem uma
ação de clivagem do ácido siálico das glicoproteínas e oligossacarídeos da
membrana celular das células epiteliais do hospedeiro, expondo receptores
específicos. A proteína A de superfície pneumocócica (PspA), que apresenta uma
ampla variabilidade antigênica entre diferentes amostras de pneumococos, ainda
não tem a sua função esclarecida. Já a produção de IgA
1
protease, presente em
vários patógenos respiratórios importantes, parece interferir com os mecanismos
de defesa do hospedeiro ao nível das superfícies mucosas da orofaringe (Velasco
et al., 1995).
Imunoprofilaxia
A natureza complexa e multifatorial da fisiopatogenia das infecções
pneumocócicas faz com que diversos dos fatores de virulência relacionados
venham sendo empregados como alvo de imunoprofilaxia, com a intenção de
diminuir o impacto das infecções causadas por este microrganismo (Michon et al.,
1998; Briles et al., 2000). O papel central da cápsula na patogenia do
microrganismo fez desta estrutura o alvo principal para intervenção por
imunoprofilaxia. Já na década de 30 do século passado, os primeiros resultados
foram alcançados, juntamente com a demonstração da imunogenicidade dos
7
polissacarídeos capsulares (Butler et al., 1993). A bem sucedida instituição do
tratamento antimicrobiano com a penicilina na década de 40 provocou uma
diminuição do interesse por vacinas mais eficientes para prevenção de infecções
pneumocócicas. Entretanto, ainda que a diminuição da mortalidade fosse bastante
expressiva com o uso de antimicrobianos, era evidente que permanecia em níveis
muito altos (Austrian & Gold, 1964). Em 1977, uma vacina polissacarídica 14-
valente (ou seja, contendo antígenos de 14 sorotipos polissacarídicos) foi
licenciada e, em 1983, a inclusão de outros sorotipos permitiu a elaboração de
uma vacina que incluía 23 dos sorotipos mais freqüentes em doenças invasivas
nos EUA e na Europa (Fedson, 1998). Vacinas baseadas nos polissacarídeos
capsulares desencadeam a resposta imune aos polissacarídeos da cápsula, com
conseqüente estímulo de células B para a produção de anticorpos protetores.
Contudo, apresentam baixa atividade imunogênica, especialmente em indivíduos
pertencentes a grupos de alto risco em relação às infecções pneumocócicas,
incluindo crianças com menos de dois anos de idade (pela relativa imaturidade
das células B), pessoas apresentando doenças crônicas como alcoolismo e
cirrose, e pacientes imunodeprimidos (Musher, 1992). A vacina polissacarídica 23-
valente não atua sobre portadores e não tem impacto sobre a prevenção de uma
das manifestações mais freqüentes da doença pneumocócica, a otite média
aguda.
Esforços para obtenção de vacinas mais imunogênicas para prevenção de
doenças pneumocócicas têm sido dirigidos para produtos conjugados com
proteínas. A vacina 7-valente, conjugada com uma proteína (CRM
197
, uma variante
8
não tóxica da toxina diftérica), foi licenciada mais recentemente e contém 7
polissacarídeos (correspondendo aos sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F),
sendo indicada para uso em crianças com menos de 2 anos de idade (Zielen et
al., 2000). Outras formulações, abrangendo até 11 sorotipos estão também sendo
consideradas. Os resultados preliminares de ensaios clínicos foram promissores
para a utilização de vacinas conjugadas 7-valente em crianças de baixo peso e
prematuros (Shinefield et al., 2002), na prevenção da otite média (Eskola et al.,
2001), na redução dos índices de portadores entre crianças freqüentadoras de
creches (Dagan et al., 2002) e na diminuição da ocorrência de infecções
respiratórias e do uso de antimicrobianos em creches (Dagan et al., 2001).
Após a licença para utilização da vacina conjugada 7-valente nos EUA, um
declínio significativo nas doenças pneumocócicas invasivas foi constatado em
estudos populacionais (Whitney et al., 2003; Kaplan et al., 2004). Mais
recentemente, em um estudo envolvendo 782 casos de doença pneumocócica
invasiva e 2512 controles, a efetividade para sorotipos incluídos na vacina foi de
96% para crianças sadias e de 81% entre crianças com agravos co-existentes
(Whitney et al., 2006). Um outro benefício observado após o uso da vacina
conjugada 7-valente foi a diminuição de índices de infecções invasivas causadas
por amostras resistentes aos antimicrobianos em crianças e idosos (Kyaw et al.,
2006). Em um estudo multicêntrico espanhol, foi observado um decréscimo (de
60,4% para 41,2%) na resistência à penicilina em amostras isoladas de crianças
entre 2001 e 2003 (Oteo et al., 2004). A diminuição na resistência foi
9
supostamente atribuída à redução no consumo de antimicrobianos, sendo esta
relacionada ao uso da vacina.
No Brasil, a vacina conjugada 7-valente não é integrante do esquema oficial
de vacinação. O impacto potencial das vacinas 7- e 9-valente para crianças com
infecções invasivas foi estimado em 58,2% e 73%, respectivamente (Brandileone
et al., 2003).
Sorotipagem e métodos alternativos para a determinação dos tipos
capsulares
A determinação sorológica dos diferentes tipos antigênicos de cápsulas
pneumocócicas é essencial para a vigilância das doenças causadas pelo
microrganismo. Da mesma forma, a implantação e a vigilância de programas de
vacinação é dependente do conhecimento dos sorotipos predominantes, sendo o
método de Quellung tradicionalmente usado para este propósito. Neste método, a
presença do antígeno capsular é constatada por reação com anti-soro específico
de cada sorotipo (Henrichsen, 1995). Ainda que seja este o padrão
internacionalmente aceito para sorotipagem de S. pneumoniae, algumas
limitações são conhecidas e incluem o alto custo dos anti-soros, a subjetividade da
interpretação e a necessidade de profissionais bem treinados. Estas limitações,
em conjunto, fazem com que poucos laboratórios reúnam condições para executar
a tipagem sorológica de pneumococos. Mais recentemente, alguns métodos
moleculares foram propostos para a definição dos tipos capsulares
pneumocócicos. A produção da cápsula é controlada por genes que comandam a
10
síntese de polissacarídeos, sendo localizados no locus cps. Este locus,
flanqueado pelos genes dexB e aliA, apresenta regiões bem conservadas em
quase todos os sorotipos, ao passo que a região central dos loci contém os genes
sorotipo-específicos, servindo de base para a tipagem por métodos moleculares
(Pai, Gertz, Beall, 2006). A abordagem molecular, baseada em reação em cadeia
da polimerase (PCR), tem sido empregada em diferentes estudos e pode servir
como ferramenta para que laboratórios com menos recursos especializados
possam realizar a determinação dos tipos sorológicos de pneumococos (Brito,
Ramirez & Lencastre, 2003; Lawrence et al., 2000; 2003; Pai, Gertz & Beall,
2006). Destaca-se aqui, pela abrangência, um estudo que utiliza PCR multiplex
sequencial com a detecção de 28 sorotipos/sorogrupos de pneumococos (Pai,
Gertz & Beall, 2006).
Resistência aos antimicrobianos
O tratamento de infecções pneumocócicas é tradicionalmente feito com
penicilina ou outros β-lactâmicos. Contudo, muitas vezes o tratamento é
estabelecido em bases empíricas, ou seja, sem que se tenha comprovação
etiológica. Deste modo, considerando-se a possibilidade do envolvimento de
outros agentes, outros antimicrobianos são empregados para tratamento de
infecções pneumocócicas (Bartlett et al., 2000).
A emergência de amostras de pneumococos resistentes à penicilina tem
abalado os conceitos para tratamento de infecções pneumocócicas. Os
pneumococos foram universalmente suscetíveis à penicilina até a década de 60,
11
quando, pela primeira vez, foram descritas amostras de pneumococos com
sensibilidade reduzida à penicilina, apresentando concentrações inibitórias
mínimas (CIMs) entre 0,1 e 0,6 µg/ml (Kislak et al., 1965; Hansmann & Bullen,
1967). A preocupação com esta questão aumentou no final da década de 70,
quando foram descritas, na África do Sul, amostras com CIMs >
2,0 µg/ml e que
também apresentavam multirresistência (Appelbaum et al., 1977; Jacobs et al.,
1978). Este fenômeno localizado foi, gradualmente, evoluindo para uma escala
global durante as décadas de 80 e 90 (Klugman, 1990; Crook & Spratt, 1998).
A resistência dos pneumococos aos β−lactâmicos se estabelece por
intermédio de alterações nas proteínas fixadoras de penicilina (PBPs, “Penicilin
Binding Protein”), as quais passam a exibir uma afinidade reduzida para este
grupo de antimicrobianos. Dentre as cinco PBPs dos pneumococos, três delas
(1a, 2b e 2x) estão, quando modificadas, associadas à resistência à penicilina
(Hakenbeck, Tarpay & Tomasz, 1980; Zighelboim & Tomasz, 1980; Smith &
Klugman, 1995), enquanto que, em relação às cefalosporinas, as alterações
significativas são observadas nas PBPs 1a, 1b e 2x (Figueiredo et al., 1992;
Sifaqui, Kitzis & Gutmann, 1996). As alterações nas PBPs se devem,
originalmente, a eventos de recombinações genéticas inter-espécies envolvendo
amostras de S. pneumoniae e S. mitis e/ou S. oralis, resultando em genes em
mosaico. Diferenças de pelo menos 25% são observadas em comparações das
seqüências dos genes das PBPs de amostras resistentes em relação às
suscetíveis (Claverys et al., 2000). Amostras de pneumococos que apresentam
resistência plena à penicilina (CIM ≥2,0 µg/ml) são geralmente resistentes a outros
12
β-lactâmicos, além de freqüentemente apresentarem resistência a antimicrobianos
pertencentes a outras classes (cloranfenicol, eritromicina, sulfametoxazol-
trimetoprima e tetraciclinas) (Tomasz, 1997; Crook & Spratt, 1998; Hsueh et al.,
1999).
A prevalência de resistência dos pneumococos aos macrolídeos é variável,
sendo bastante elevada entre amostras isoladas na Hungria (52%), Tailândia
(82%) e Taiwan (76%) (Marton et al., 1991; Hsueh et al., 1999; Hsueh & Luh,
2002). Dois mecanismos de resistência aos macrolídeos já foram descritos em
pneumococos: modificação do sítio alvo (rRNA 23S, da subunidade 50S) e por
bomba de efluxo (Sutcliffe et al., 1996). A modificação do sítio alvo ocorre pela
ação da rRNA metilase, codificada pelo gene ermB (ou ermAM), ocorrendo
resistência cruzada aos macrolídeos (14, 15 e 16 elementos), aos lincosamídeos e
à estreptogramina B (fenótipo MLSb, de caráter principalmente constitutivo). A
resistência devida à bomba de efluxo é comandada pelo gene mef(E). Quando a
resistência ocorre por este último mecanismo, não ocorre resistência cruzada aos
lincosamídeos e à estreptogramina B, e sim apenas aos macrolídeos de 14 e 15
elementos, o que constitui o fenótipo denominado de “M”. O fenótipo M é
predominante em amostras de pneumococos resistentes aos macrolídeos nos
EUA e no Canadá (Shortridge et al., 1999), ao passo que na Europa predomina o
fenótipo MLSb (Descheemaeker et al., 2000).
A resistência à sulfametoxazol-trimetoprima em pneumococos, tem crescido
significativamente (Widdowson & Klugman, 1999). A resistência a esta
13
combinação de antimicrobianos abrangeu aproximadamente a metade das
amostras procedentes da América Latina, em estudo realizado pelo SENTRY –
Antimicrobial Surveillance Program, em 1998 (Gúsman-Blanco, Casellas & Sader,
2000). Em outro estudo, mais de 90% das amostras resistentes ao co-trimoxazol
também se mostrou resistente à penicilina e ao cloranfenicol (Widdowson &
Klugman, 1999).
Em relação ao cloranfenicol, a resistência ocorre devido a produção de uma
enzima, a cloranfenicol acetiltransferase (CAT), responsável pela conversão do
antimicrobiano em um composto incapaz de ligar-se à sub-unidade 50S do
ribossomo. A enzima CAT é codificada pelo gene cat (Matthews, Baker &
Thornsberry, 1988). Em pneumococos, o gene cat está localizado no transposon
conjugativo, Tn5253. Este transposon também está relacionado à resistência dos
pneumococos à tetraciclina (Ayoubi, Kilic & Vijayakumar, 1991). Os pneumococos
apresentam resistência à tetraciclina por mecanismo de proteção ribossômica,
sendo codificada geralmente pelo gene tetM com localização em transposons
(Tn1545 e Tn5251), e ocasionalmente pelo gene tetO. É possível que ocorra o
desligamento da tetraciclina do seu sítio alvo, pela proteína TetM, o que
provocaria a resistência (Taylor & Chau, 1996).
A resistência de pneumococos às fluorquinolonas já foi constatada e é
motivo de crescente preocupação. A ação das fluorquinolonas ocorre na DNA
girase e na topoisomerase IV, enzimas essenciais no processo de duplicação do
DNA. Cada uma das enzimas é um tetrâmero composto por sub-unidades, no
14
caso da DNA girase, GyrA e GyrB, codificadas pelos genes gyrA e gyrB; na
topoisomerase IV, ParC e ParE, codificadas pelos genes parC e parE. GyrA é
homóloga a ParC, enquanto que GyrB é homóloga a ParE (Wang, 1996). As
quinolonas interagem com o complexo DNA girase, o que resulta em um complexo
estabilizado, que forma uma barreira para a replicação do DNA. A resistência do
pneumococo às fluorquinolonas tem sido descrita como resultado de mutações
pontuais, especialmente em gyrA e parC. Ainda que mutações pontuais não levem
a resistência clínica, as CIMs apresentam-se gradualmente elevadas, o que pode
ser considerada uma forma “silenciosa” de resistência. Bombas de efluxo podem
também estar envolvidas, contudo o papel exato deste mecanismo na resistência
de pneumococos às fluorquinolonas ainda não está bem elucidado (Piddock et al.,
2002).
A resistência de pneumococos à vancomicina ainda não foi descrita, no
entanto, amostras clínicas apresentando tolerância a este antimicrobiano já foram
observadas (Novak et al., 1999), devido à alterações no gene vncS, o qual codifica
uma histidina quinase.
A prevalência da resistência aos antimicrobianos por parte de pneumococos
varia significativamente (Fenoll et al., 1998). A resistência à penicilina é mais
elevada (em torno de ou superior a 50%) na Espanha, França, África do Sul,
Hungria e no Sudeste Asiático (Crook & Spratt, 1998; Hsueh & Luh, 2002).
Contrastando com as prevalências de resistência mais elevadas, em outros
países, como a Alemanha, Bélgica, Dinamarca, Finlândia, Inglaterra, Itália e
15
Suécia, a prevalência de cepas resistentes à penicilina permanece baixa (em torno
de 5%) (Fenoll et al., 1998). Estas diferenças podem ser, ao menos parcialmente,
explicadas por diferenças no padrão de uso de antimicrobianos entre diferentes
países (Bronzwaer et al., 2002). Porém, a disseminação da resistência é um
fenômeno dinâmico e em países nos quais a resistência permaneceu baixa
durante anos, foi observado um aumento na década de 90. A comparação entre
estudos multicêntricos realizados nos EUA pode aqui ser utilizada como exemplo
disto, uma vez que, na década de 80, a prevalência de resistência era de apenas
3,8% (Jorgensen et al., 1990), enquanto que, estudos realizados durante a década
de 90 indicaram uma prevalência de resistência à penicilina de 23,6% (período
1994-1995) (Doern et al., 1996) e de 29,5% (período 1997-1998) (Doern et al.,
1999). Em levantamento compreendendo os anos de 1999-2000, com 1531
amostras de pneumococos, a prevalência de resistência à penicilina foi de 34,2%,
sendo de 21,5% para amostras com CIMs ≥2,0 µg/ml. No referido estudo, as
prevalências de resistência para os macrolídeos, clindamicina, tetraciclina,
cloranfenicol, e sulfametoxazol-trimetoprima foram de 25,2%, 8,9%, 16,3%, 8,3% e
30,3%, respectivamente (Doern et al., 2001).
Resistência aos antimicrobianos no Brasil
Convivemos no Brasil com pneumococos resistentes à penicilina há quase
20 anos. Em 1988 foi publicado o primeiro caso (uma criança com meningite) de
pneumococo com resistência intermediária à penicilina, na cidade de São Paulo
(De Souza Marques et al., 1988). Durante a década de 90 foi observada a
disseminação de pneumococos com resistência aos antimicrobianos no Brasil.
16
Diversos estudos com enfoque de vigilância realizados durante aquele período
mostraram um perfil homogêneo de resistência à penicilina. Em geral, a
resistência intermediária esteve entre 10-15% das amostras, ao passo que a
resistência plena à penicilina (CIM ≥ 2,0 µg/ml) apresentou uma prevalência
inferior a 5% (Sessegolo et al., 1994; Brandileone et al., 1997; Teixeira et al.,
1997a; Ko et al., 2000; Critchley et al., 2001). Estes estudos apresentam uma
padronização metodológica adequada, um número consistente de amostras
analisadas e são, em sua maioria, provenientes de pacientes da região sudeste.
Em conjunto, constituem a base do conhecimento que dispomos sobre esta
questão em nosso país. Resistência aos macrolídeos e às tetraciclinas foi
também observada em alguns destes estudos, com prevalências inferiores a 10%,
não havendo relato de resistência às fluorquinolonas ou à vancomicina.
Especificamente em relação à eritromicina, a resistência verificada em um
abrangente estudo que contou com 931 amostras originárias dos estados do Rio
de Janeiro, São Paulo e Rio Grande do Sul (período 1990-1999) foi de 4,3%,
havendo predomínio de amostras que apresentaram o fenótipo MLSb (92,5% das
amostras resistentes) (Mendonça-Souza et al., 2004). Em relação a amostras
isoladas de portadores, um único estudo realizado neste período enfocou
amostras de crianças sadias, portadoras de pneumococos em Fortaleza, CE,
sendo que a resistência plena à penicilina foi de 3,6%, e a resistência
intermediária foi de 44,9% (Rey et al., 2002).
A resistência de pneumococos aos antimicrobianos permanece sob
investigação no país. Estudos regionais e multicêntricos têm permitido uma visão
17
mais atualizada sobre este problema. Dois estudos regionais, envolvendo
amostras encontradas em infecções pneumocócicas invasivas foram
recentemente publicados: em Salvador, BA, a resistência plena observada entre
70 amostras isoladas de crianças e adolescentes foi de 1,43%, enquanto que
18,6% das amostras apresentaram resistência intermediária (Carvalho et al.,
2003); em Uberlândia, MG, 2,7% das amostras foram caracterizadas com
resistentes e 12,8% com resistência intermediária entre 148 amostras isoladas de
pacientes de diferentes faixas etárias (Mantese et al., 2003).
Estudos multicêntricos permitem uma visão mais ampla sobre a questão da
resistência a antimicrobianos. Foi constado que, entre 497 amostras obtidas entre
1997 e 2001, a resistência à penicilina foi de 3,9% (resistência plena) e 18,0%
(resistência intermediária), sendo inferior à observada em outros países da
América Latina (Castanheira et al., 2004). Neste estudo, resistência à cefuroxima,
ceftriaxona, eritromicina e sulfametoxazol-trimetoprima foi de 6,5%, 1,4%, 11,5% e
50,3%, respectivamente. Contudo, resultados de estudos mais recentes que
apresentam comparações com os obtidos em anos anteriores revelam uma
inequívoca tendência de alta na prevalência de resistência aos beta-lactâmicos.
Foi o que se verificou em estudo que incluiu 315 amostras isoladas entre 2001 e
2002, com predomínio daquelas obtidas de pacientes com infecção respiratória,
residentes em cidades das regiões sul e sudeste, onde se observou o índice de
7,9% de resistência plena (e de 22,2% de resistência intermediária), o qual foi
superior aos índices de 4,2%, no período 1997-1998, e de 2,9% no período 1999-
2000 (Mendes et al., 2004). Esta tendência de aumento da resistência é mais
18
evidente em uma investigação abrangente, conduzida como parte do programa
nacional de vigilância epidemiológica, com um total de 6470 amostras coletadas
de infecções invasivas durante o período 1993-2004. A proporção de resistência
plena e intermediária foi de 1,1% e 9,1%, respectivamente, em 1993, atingindo
5,9% e 22,0% no ano de 2004. A resistência ao sulfametoxazol-trimetoprima,
tetraciclina, cloranfenicol e rifampicina foi de, respectivamente, 65,0%, 14,6%,
6,2%, 1,3% e 0,7%; não sendo observada resistência à vancomicina e à
levofloxacina (Brandileone et al., 2006). Em 2003, a chance de obter-se um
pneumococo resistente à penicilina no Brasil era aproximadamente 4 vezes maior
do que em 1999 (razão de chances=3,99) (Brandileone et al., 2005).
Rastreamento de cepas com resistência aos antimicrobianos
A nasofaringe é o local provável para que ocorra a seleção de cepas de S.
pneumoniae resistentes aos antimicrobianos. Amostras pertencentes aos
sorotipos mais freqüentes na nasofaringe ficariam mais tempo expostas aos
antimicrobianos e, portanto, apresentariam uma maior tendência a desenvolver
resistência. Ainda que não seja absoluta, há uma correlação entre os sorotipos
mais freqüentes na nasofaringe e os de maior prevalência de resistência (6B, 9V,
14, 19F, 23F) (Whitney et al., 2000).
A sorotipagem é o passo inicial para o rastreamento de amostras de S.
pneumoniae que apresentem resistência aos antimicrobianos. Métodos
moleculares contribuem para uma visão mais avançada e permitem um melhor
entendimento sobre a complexa diversidade dos pneumococos. Dentre estes
métodos, encontram-se a análise do perfil eletroforético de isoenzimas envolvidas
19
em vias metabólicas essenciais (MLEE, “Multilocus Enzyme Electrophoresis”), a
eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE, “Pulsed-Field Gel
Electrophoresis”), variantes da técnica de PCR (Box-PCR, pbpPCR-RFLP) e a
tipagem por sequenciamento dos genes que codificam isoenzimas envolvidas em
vias metabólicas essenciais (MLST, “Multilocus Sequence Typing”) (McDougal et
al., 1992; Hall et al., 1996; van Belkum et al., 1996; Moissenet et al., 1997; Enright
& Spratt, 1998). Por intermédio destas técnicas moleculares é possível investigar a
relação clonal entre amostras com fenótipo de resistência aos antimicrobianos. A
epidemiologia molecular permite, portanto, o rastreamento da disseminação da
resistência. Em 1997 foi estabelecido o “Pneumococcal Molecular Epidemiology
Network” (PMEN), sob os auspícios da “International Union of Microbiological
Societies”, com o propósito de caracterizar, padronizar, nomear e classificar
clones de pneumococos resistentes aos agentes antimicrobianos. Mediante
protocolos padronizados para PFGE, BOX-PCR e MLST, atualmente são
reconhecidos pelo PMEN 26 clones internacionais que contribuíram para um
aumento global da resistência (McGee et al., 2001; www.pneumo.com). Os 16
primeiros foram denominados como Spain
23F
-1, Spain
6B
-2, Spain
9V
-3,
Tennessee
23F
-4, Spain
14
-5, Hungary
19A
-6, South Africa
19A
-7, South Africa
6B
-8,
England
14
-9, CSR
14
-10, CSR
19A
-11, Finland
6B
-12, South Africa
19A
-13, Taiwan
19F
-
14, Taiwan
23F
-15 e Poland
23F
-16 (McGee et al., 2001). A disseminação de 5
destes clones (Spain
23F
-1, Spain
6B
-2, Spain
9V
-3, Tennessee
23F
-4 e Taiwan
19F
-14)
foi constatada em estudo de âmbito nacional realizado nos EUA com
pneumococos isolados entre 1994 e 2000. Foi também observado que três outros
clones, não relacionados aos 16 primeiros clones internacionais, aumentaram sua
20
prevalência ao longo do tempo (Richter et al., 2002). A vigilância de genótipos de
S. pneumoniae tem também sido empregada para basear estratégias de controle
da emergência e a expansão de clones pertencentes a sorotipos não integrantes
da vacina conjugada 7-valente (Gertz et al., 2003; Beall et al., 2006).
O rastreamento de clones de S. pneumoniae com resistência aos
antimicrobianos no Brasil está ainda em uma fase preliminar, especialmente se
considerada as dimensões do país. É necessário, no entanto, mencionar alguns
estudos que abordaram esta questão.
Amostras de pneumococos isoladas a partir de pacientes com doenças
invasivas em cinco regiões geográficas brasileiras foram analisadas utilizando-se
PFGE. Foi observada a disseminação de amostras resistentes distribuídas em
quatro grupos clonais predominantes, distintos dos clones internacionais
(Brandileone et al., 1998). É importante ressaltar que, no referido estudo, duas
amostras pertencentes ao sorotipo 14 foram identificadas como variantes do clone
internacional Spain
9V
-3, sendo que este clone é freqüente entre amostras de
pneumococos resistentes isoladas no Uruguai (Camou, Hortal & Tomasz, 1998) e
Argentina (Rossi et al., 1998). É interessante constatar que representantes do
clone Spain
9V
-3 têm circulado no Uruguai na forma de uma variante que apresenta
o sorotipo 14, devido a ocorrência de eventos de recombinação em uma extensa
região do genoma que se estende do início do gene cps até o gene pbp1a (Coffey
et al., 1999). Amostras pertencentes a este clone e exibindo resistência à
cefotaxima foram encontradas no Brasil, Argentina, Chile e Uruguai (Castanheira
21
et al., 2003). A diversidade genética de amostras do sorotipo 14 foi também
investigada em outro estudo realizado no Brasil, em que foram obtidas evidências
de que a resistência à penicilina entre amostras deste sorotipo está relacionada
com poucos clones, de acordo com análise de perfis de PFGE (Teixeira et al.,
1999). Em outra investigação com pneumococos isolados de pacientes com
meningite em Salvador, Bahia, foi verificado um predomínio do sorotipo 14 entre
as amostras resistentes à penicilina (CIMs entre 0,12 a 1,0 µg/ml), apresentando
perfis de BOX-PCR bastante relacionados, sem que tenha sido possível relacioná-
las com amostras pertencentes a clones internacionais (Ko et al., 2000).
A circulação de representantes dos clones internacionais Spain
23F
-1 e
Spain
6B
-2, com resistência à penicilina, foi constatada entre amostras de crianças
procedentes de Fortaleza, CE (Wolf et al., 2000).
Identificação
O gênero Streptococcus é constituído por cocos gram-positivos, catalase
negativos, anaeróbios facultativos (Ruoff, Whiley & Beighton, 1999). O gênero tem
passado por sucessivas modificações taxonômicas, como resultado de aplicação
de técnicas moleculares, tais como reassociação DNA-DNA, seqüenciamento de
genes do rRNA 16S (Facklam, 2002). Tais alterações abrangem até mesmo os
grupos de espécies anteriormente consideradas como de fácil reconhecimento,
tais como S. pneumoniae. Um exemplo é constituído pela descrição recente de
Streptococcus pseudopneumoniae sp. nov., uma nova espécie relacionada com S.
pneumoniae, e da qual é difícil de distinguir (Arbique et al., 2004).
22
A morfologia celular e a colonial representam o primeiro passo para a
identificação de pneumococos nos laboratórios clínicos. Tipicamente, estes
microrganismos apresentam-se como células ovaladas, dispostas em pares ou
cadeias curtas formando colônias que podem ser mucóides, alfa hemolíticas, com
tendência a apresentarem um achatamento central (Ruoff, Whiley & Breighton,
1999).
Os pneumococos são suscetíveis ao cloridratro de etil-hidrocupreína
(optoquina), uma característica que permite diferenciá-los dos outros
estreptococos integrantes do grupo viridans. O teste de suscetibilidade à
optoquina, adaptado ao formato de difusão em ágar, é amplamente utilizado em
laboratórios clínicos. A base de ágar empregada parece influenciar no resultado
do teste, sendo recomendado o ágar Soja Tripticaseína (Gardam & Miller, 1998).
Contudo, a resistência à optoquina já foi descrita entre pneumococos o que pode
levar a problemas na identificação destes microrganismos quando este teste
laboratorial é usado exclusivamente (Borek et al., 1997; Cogné et al., 2000; Tsai et
al., 2000; Pikis et al., 2001). A optoquina inibe especificamente a F
0
F
1
H
+
-ATPase
associada à membrana de S. pneumoniae. Mutantes da espécie S. pneumoniae
com o fenótipo de resitência a optoquina (Opt
R
) apresentam mutações pontuais no
gene atpC, que codifica para a subunidade transmembrana c do complexo F
0
(Muñoz, Garcia & de la Campa, 1996). O gene responsável pela característica de
resistência-suscetibilidade à optoquina foi clonado, seqüenciado e caracterizado
por um grupo de investigadores na Espanha (Fenoll et al., 1994; 1995). Mais
23
recentemente, foram também descritas mutações pontuais no gene que codifica a
subunidade a do complexo F
0
F
1
H
+
-ATPase, levando à resistência à optoquina
(Pikis et al., 2001).
A bile solubilidade é outra característica que permite diferenciar S.
pneumoniae de outras espécies do grupo viridans. O teste laboratorial que explora
esta característica pode ser realizado em tubo ou diretamente sobre colônias
cultivadas em ágar sangue (Ruoff, Whiley & Breighton, 1999). Variantes em que
esta característica não é observada já foram detectadas, havendo associação
entre cepas bile-insolúveis e peculiaridades moleculares no gene lytA (Obregón et
al., 2002). Estudo comparativo entre diferentes métodos para identificação de S.
pneumoniae revelou que o teste de bile-solubilidade não é 100% sensível e
específico (Chandler et al., 2000). Em outro estudo, contudo, o teste da bile
solubilidade foi mais específico do que o da optoquina para a identificação de S.
pneumoniae (Messmer et al., 2004).
Testes baseados em biologia molecular vêm ocupando um maior espaço na
identificação de S. pneumoniae. Uma sonda de DNA, dirigida para a subunidade
16S do rRNA, é empregada para distinção entre amostras de pneumococos e os
demais integrantes do grupo “viridans”. Este produto encontra-se comercialmente
disponível (Accuprobe Streptococcus pneumoniae Culture Identification Test; Gen-
Probe, Inc.) e apresentou 100% de sensibilidade e especificidade na diferenciação
de 172 amostras de pneumococos e 204 amostras de outros microrganismos
(Denys & Carey, 1992). Alguns investigadores utilizam esta sonda de DNA como
24
método de referência em estudos que avaliam métodos fenotípicos de
diferenciação entre S. pneumoniae e integrantes do grupo viridans (Chandler et
al., 2000; Kaijalainem et al., 2002). A sonda de DNA revelou-se ainda
discriminatória na confirmação de variantes atípicas de S. pneumoniae
(resistentes à optoquina e/ou não encapsuladas) (Whatmore et al., 2000).
Contudo, outras espécies de estreptococos orais, tais como Streptococcus oralis
e, especialmente, Streptococcus mitis apresentam relacionamento filogenético
muito próximo com S. pneumoniae (Facklam, 2002), sendo que amostras
pertencentes a estas espécies vêm sendo encontradas em materiais clinicamente
significativos (Whatmore et al., 2000).
Além da sonda de DNA acima mencionada, genes associados a fatores de
virulência também vêm sendo objeto de investigação por intermédio da técnica de
reações de polimerase em cadeia (“Polymerase Chain Reaction”, PCR). Dentre
este genes, destacam-se os da pneumolisina (ply), da autolisina (lytA) e da
adesina de superfície pneumocócica A (psaA). A presença do gene psaA foi
demonstrada por PCR em amostras de 90 diferentes sorotipos do microrganismo,
enquanto que não foi verificada amplificação em 30 espécies e 14 gêneros
heterólogos, indicando um bom potencial diagnóstico para este teste (Morrison et
al., 2000). A presença deste gene, contudo, foi recentemente verificada em
espécies heterólogas (S. mitis, S. oralis e S. anginosus) o que pode comprometer
o potencial uso deste teste na identificação e diagnóstico de doenças
pneumocócicas (Jado et al., 2001). Os genes ply e lytA foram também
encontrados em um grupo de estreptococcos orais atípicos, fenotipicamente e
25
geneticamente associados a S. mitis, isolados de infecções respiratórias
clinicamente relevantes (Whatmore et al., 2000). É, portanto, possível especular
se a presença destes genes pode aumentar o potencial patogêncio destes
microrganismos. Por outro lado, foi demonstrado que amostras de S. pneumoniae
de origem bovina, com potencial patogênico restrito, quando comparado ao que
ocorre com aquelas obtidas de seres humanos, podem não conter os genes ply e
lytA (Whatmore et al., 2000).
Os testes moleculares baseados na detecção de genes de virulência para
identificação de S. pneumoniae são promissores, mas a sua relevância exata
ainda encontra-se por ser definida. Em estudo comparativo que incluiu amostras
típicas e atípicas de S. pneumoniae, bem como amostras de estreptococos do
grupo “viridans”, a acurácia da técnica de PCR para a detecção do gene lytA foi
superior (100%) à observada para as técnicas de PCR para detecção dos genes
psaA e a duas diferentes seqüências iniciadoras para o gene ply (Messmer et al.,
2004). Por outro lado, a técnica de PCR específica para o gene psaA foi
considerada mais adequada para identificar S. pneumoniae (incluindo amostras
resistentes à optoquina) em outro estudo envolvendo quatro técnicas genotípicas
(amplificação dos genes psaA, ply, e lytA e a sonda de DNA) (Verhelst et al.,
2003).
26
Objetivos
Dando continuidade aos estudos realizados em nosso laboratório sobre a
diversidade fenotípica e genética de amostras de S. pneumoniae isoladas no
Brasil, este trabalho teve como objetivo geral o estudo de amostras isoladas em
Porto Alegre, RS, num período de 10 anos, sobretudo em relação a:
1) Determinação dos perfis de susceptibilidade aos antimicrobianos e
avaliação da evolução da resistência no período de estudo.
2) Distribuição dos sorotipos prevalentes.
3) Avaliação da diversidade clonal entre amostras com fenótipos de
resistência mais relevantes.
4) Caracterização de amostras atípicas apresentando resistência à optquina.
5) Validação da técnica de PCR multiplex seqüencial para determinação dos
tipos capsulares e otimização para uso entre amostras isoladas em países
da América Latina.
27
Materiais e Métodos
1. Amostras Bacterianas
Foram estudadas 829 amostras de Streptococcus pneumoniae isoladas a
partir de diversos materiais clínicos coletados de pacientes atendidos em hospitais
localizados na cidade de Porto Alegre, no estado do Rio Grande do Sul, num
período de dez anos (1995 a 2004). Tais amostras foram incorporadas à Coleção
de Amostras do Laboratório de Apoio Biotecnológico do Departamento de
Microbiologia Médica do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da UFRJ.
A amostra de Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 foi utilizada como controle
para os testes de susceptibilidade a antimicrobianos. Amostras representativas
dos principais clones internacionais de S. pneumoniae resistentes a
antimicrobianos (McGee et al., 2001), assim como amostras isoladas em outras
localidades do Brasil, foram incluidas em experimentos de PFGE, para fins
comparativos e estão referidas onde apropriado.
A preservação das amostras foi feita sob a forma de suspensões bacterianas
espessas, em solução contendo 10% de leite em pó desnatado (Skim Milk; Difco
Laboratories, Detroit, Michigan, EUA) e 10% de glicerol (Reagen, Rio de Janeiro,
RJ), as quais foram mantidas em tanques contendo nitrogênio líquido a –
180ºC. As amostras foram recuperadas pela remoção de alíquotas destas
suspensões que foram semeadas em placas contendo o meio TSA (“Trypitic Soy
Ágar”, Difco), acrescido de 5% de sangue desfibrinado de carneiro (TSA-SC) e
incubadas a 35
o
C, durante 18 a 24 h, em atmosfera de CO
2
.
28
2. Caracterização Fenotípica das Amostras
As características morfológicas celulares e coloniais, determinação do tipo
de hemólise, suscetibilidade à optoquina e bile solubilidade serviram de base para
a identificação presuntiva.
2.1. Morfologia colonial e hemólise
Para a verificação da morfologia colonial, as amostras foram semeadas, pela
técnica de esgotamento, em placas contendo o meio TSA-SC e incubadas a 35ºC
durante 24h, em atmosfera de CO
2
.
2.2. Morfologia celular
Para observação da morfologia celular, as amostras foram cultivadas em
placas contendo TSA-SC ou em 2,5 ml de caldo BHI (“Brain Heart Infusion,”
Difco), acrescido de 3 gotas de sangue desfibrinado de carneiro (BHI-SC). A partir
da cultura obtida foram feitos esfregaços, os quais foram corados pelo método de
Gram.
2.3. Identificação fisiológica
A caracterização fisiológica convencional das amostras foi baseada nos
resultados de testes de susceptibilidade à optoquina e da bile solubilidade.
2.3.1. Susceptibilidade à optoquina
29
Para a execução dos testes de susceptibilidade à optoquina, discos de 6
mm contendo 5 µg de cloridrato de etil-hidrocupreína (BBL Microbiology Systems,
Cockeysville, Maryland, EUA) foram aplicados sobre a superfície do meio TSA-SC
previamente inoculado com a amostra a ser testada. As placas foram incubadas
durante 24h a 35ºC em atmosfera de CO
2
. Amostras que apresentaram halos de
inibição >14 mm foram presuntivamente consideradas como S. pneumoniae
(Ruoff, Whiley & Beighton, 1999).
2.3.2. Bile solubilidade
Alíquotas contendo 0,5 ml de uma suspensão em NaCl a 0,9%,
correspondendo a escala 0,5 de McFarland, de cada amostra a ser testada, foram
distribuídas em dois tubos de ensaio (13x100mm). A um dos tubos foi adicionado
um volume de 0,5 ml de uma solução de desoxicolato de sódio a 2% (Sigma
Chemical Corporation, St. Louis, Missouri, EUA), enquanto que ao segundo tubo
foi adicionado igual volume de solução de NaCl a 0,9%. Após incubação a 37ºC,
por duas horas, foi feita a leitura. O clareamento da suspensão presente no tubo
contendo desoxicolato de sódio foi considerado como indicativo de solubilidade na
presença de bile.
3. Tipagem Sorológica
A tipagem sorológica foi efetuada por intermédio das técnicas de aglutinação
pelo látex e de reação de Quellung, utilizando-se anti-soros específicos fornecidos
pelo “Centers for Disease Control and Prevention”, Atlanta, GA, EUA, conforme as
instruções de Facklam & Washington II (1991). O sistema de nomenclatura
30
utilizado para a denominação dos sorotipos foi o dinamarquês. Para tal, as
amostras foram semeadas em TSA-SC e incubadas a 35
0
C, durante 18 a 24 horas
em atmosfera contendo CO
2
a 5%. A partir do crescimento obtido, foram
preparadas suspensões densas em 300 a 500µl de salina tampão fosfato (PBS)
0,01M, pH 7,2. Inicialmente, foram colocados, em lâmina de vidro, 10µl da
suspensão a ser testada e 10µl do reagente contendo anticorpos específicos
adsorvidos a partículas de látex. Após homogeneização dos reagentes, a lâmina
foi mantida em movimentos rotatórios manuais, observando-se a ocorrência ou
não de aglutinação. Para as reações de Quellung, 10µl da suspensão bacteriana
foram depositados sobre uma lâmina de vidro, acrescidos de 5 µl de azul de
metileno a 0,3% e 5 µl de anti-soro específico. Após a homogeneização, a
preparação foi coberta com uma lamínula e observada ao microscópio ótico, com
auxílio de objetiva de imersão. Cada amostra foi testada, inicialmente, frente a um
conjunto de “pools” de anti-soros e, posteriormente, com os respectivos anti-soros
individuais de tipo e, quando aplicável, com os anti-soros para os diferentes
fatores.
4. Detecção de Genes Associados a Fatores de Virulência de S. pneumoniae
Amostras apresentando comportamento atípico em relação ao teste da
optoquina foram avaliadas em relação à presença de genes de virulência ply, lytA
e psaA, através da técnica de PCR.
4.1. Preparo das amostras, incluindo extração de DNA
31
As amostras foram semeadas em TSA-SC e incubadas por 24 horas, a
37
0
C em atmosfera contendo CO
2
a 5%. A partir de cada cultura foi preparada
uma suspensão em 300µl de salina a 0,85% esterilizada. A suspensão foi
centrifugada a 3000 rpm por 5 minutos, sendo o sobrenadante desprezado e o
sedimento, contendo as células, utilizado para extração do DNA.
O procedimento de extração foi baseado naquele proposto por Beall et al.
(1998) com modificações. Em resumo, o sedimento foi ressuspenso em 50µl de
tampão TE [Tris 10 mM (pH 8,0) e EDTA 1 mM ] contendo 9U de mutanolisina, e
as amostras foram incubadas por 10 minutos a 37
o
C. A seguir, foram aquecidas à
100
o
C por 3 minutos e centrifugadas a 3000 rpm por 30 segundos.
4.2. Detecção do gene que codifica a pneumolisina (gene ply)
A pesquisa do gene ply foi realizada através de PCR, de acordo com o
procedimento descrito por Toikka et al. (1999), utilizando-se os iniciadores Ia (ATT
TCT GTA ACA GCT ACC AAC GA) e Ib (GAA TTC CCT GTC TTT TCA AAG TC).
A mistura da reação, num total de 30 µl, foi constituída de 100 ng de cada
um dos iniciadores, 2,0 µl dos deoxiribonucleotídeos trifosfatados (10mM), 10 µl
de MgCl
2
(10mM), 0,5 µl da Taq polimerase (5U/µl) e 10 µl do respectivo tampão
(10x). Um volume de 1µl de DNA molde foi adicionado à reação. A reação de
amplificação foi executada em um termociclador (GeneAmp PCR System 2400,
Perkin Elmer, Branchburg, New Jersey, EUA), obedecendo a seguinte
programação: desnaturação inicial (94ºC, por 5 minutos); 30 ciclos de
desnaturação (94ºC, 1 minuto), anelamento (55ºC, 1 minuto) e extensão (72ºC, 1
minuto); seguindo-se uma extensão final (72ºC, 10 minutos).
32
4.3. Detecção do gene que codifica a autolisina (gene lytA)
A presença do gene lytA foi avaliada por PCR, de acordo com ensaio
previamente publicado por Cherian et al. (1998), com a utilização das seqüências
iniciadoras relacionadas a seguir: Lyt A1 (GTC GGC GTG CAA CCA TAT AGG
CAA) e Lyt A2 (GGA TAA GGG TCA ACG TGG TCT GAG).
A mistura de reação, em um volume total de 30 µl, foi constituída de 0,5 mM
de cada seqüência iniciadora, 0,2 mM de cada deoxinucleotídeo trifosfatado,
tampão de PCR 1X, MgCl
2
a 2,5 mM e 2,5U de Taq polimerase. Um volume de 1µl
de DNA molde foi adicionado à reação. A amplificada foi realizada em
termociclador (GeneAmp PCR System 2400), utilizando-se 30 ciclos de 94
o
C,
55
o
C e 72
o
C por 1 min em cada temperatura, para as etapas de desnaturação,
anelamento e extensão, respectivamente.
4.4. Detecção do gene que codifica o antígeno A de superfície (gene psaA)
Para a pesquisa do gene psaA foi empregado o procedimento descrito por
Morrison et al. (2000). As seqüências iniciadoras utilizadas foram: P1 (CTT TCT
GCA ATC ATT CTT G) e P2 (GCC TTC TTT ACC TTG TTC TGC).
A mistura de PCR (100 µl) continha 100ng de cada seqüência iniciadora (P1
e P2), 2,0 µl de desoxinucleotídeo trifosfatado a 10mM, 10 µl de MgCl
2
a 10mM,
0,5µl de Taq polimerase e 10µl de tampão (10x). Foi acrescentado 1µl de DNA
molde à reação. A mistura foi submetida à amplificação, utilizando as seguintes
condições: 35 ciclos (95
o
C por 30 segundos, 52
o
C por 30 segundos e 72
o
C por 2
33
minutos para desnaturação, anelamento e extensão, respectivamente), com uma
extensão final de 72
o
C por 8 min.
4.5. Detecção dos produtos de amplificação
Os produtos de PCR para os genes associados à virulência foram
observados após eletroforese em gel de agarose (GibcoBRL) a 1,2%, em tampão
TBE (Tris-Borato-EDTA) 0,5X, tendo os géis sido corados com brometo de etídio.
A visualização foi feita em transiluminador UV. Os tamanhos dos produtos de
amplificação esperados para os genes ply, lytA e psaA foram de, respectivamente,
348 pb, 413 pb e 838 pb.
5. Testes de Hibridização com Sonda de DNA para a Subunidade 16S do
rRNA de S. pneumoniae
Amostras atípicas, resistentes à opptoquina, foram submetidas a testes de
hibridização com uma sonda de DNA para a subunidade 16S do rRNA de S.
pneumoniae. Para tal, culturas obtidas em TSA-SC foram testadas com a sonda
“Accuprobe S. pneumoniae Culture Identification Test” (Gen-Probe Inc.; San
Diego, California, EUA), seguindo-se as recomendações do fabricante, os
resultados foram determinados usando-se um luminômetro modelo 2900 (Gen-
Probe, Inc.). Leituras ≤ 1199 PLU (phometric light units) foram consideradas
negativas enquanto que amostras com leituras ≥1500 PLU foram consideradas
positivas. Leituras entre 1200 e 1499 PLU foram consideradas indeterminadas.
6. Testes de Suscetibilidade aos Antimicrobianos
34
6.1.1. Testes de difusão em agar
Foram empregados discos de papel de filtro (Cecon, São Paulo, SP, Brasil)
impregnados com os seguintes antimicrobianos: cloranfenicol, eritromicina,
oxacilina (para avaliar a susceptibilidade à penicilina), tetraciclina e vancomicina.
Os testes foram realizados conforme as recomendações do “Clinical and
Laboratory Standards Institute" (CLSI, 2005). Para tal, as amostras foram
semeadas em placas de TSA-SC e incubadas a 37
0
C, por 18-24 horas em
atmosfera de CO
2
. A partir do crescimento obtido, suspensões com turvação
equivalente a escala 0,5 de McFarland foram preparadas em solução salina 0,85%
esterilizada. Com auxílio de “swabs” esterilizados, as suspensões foram
semeadas em placas contendo àgar Mueller-Hinton (Difco) acrescido de 5% de
sangue desfibrinado de carneiro (MH-SC), de maneira a obter um crescimento
confluente e uniforme. Sobre a superfície dos meios inoculados foram aplicados
os discos contendo os antimicrobianos e as placas foram incubadas a 37
0
C, por
18-24 horas em atmosfera de CO
2
. A leitura e interpretação dos resultados foram
feitas de acordo com as recomendações do CLSI (2005).
6.2. Testes para a determinação das Concentrações Inibitórias Mínimas
(CIMs)
Após a realização dos testes de difusão em agar, as amostras que
apresentavam resistência aos antimicrobianos foram submetidas a testes de
diluição em agar. O procedimento básico foi o recomendado pelo CLSI (2005),
tendo sido acrescentado 5% de sangue de sangue desfibrinado de carneiro para
possibilitar o crescimento de S. pneumoniae. Para o preparo das soluções de
35
antimicrobianos (obtidos da Sigma) foram empregados os solventes e diluentes
preconizados pelo CLSI (2005). Em resumo, para o preparo de cada placa, 17 ml
do meio (ágar Mueller Hinton) foram acrescidos de 2,0 ml de uma determinada
concentração de antimicrobiano e de 1,0 ml de sangue desfibrinado de carneiro.
Foram preparadas placas contendo concentrações duplas seriadas dos seguintes
antimicrobianos: ceftriaxona (0,12 µg/ml a 4,0 µg/ml), cloranfenicol (1,0 µg/ml a 32
µg/ml), eritromicina (0,25 µg/ml a 32,0 µg/ml), penicilina (0,03 µg/ml a 8,0 µg/ml),
tetraciclina (0,5 µg/ml a 16 µg/ml) e vancomicina (0,12 a 0,5 µg/ml). Placas
contendo meio sem antimicrobianos foram utilizadas para controle.
As placas contendo as diferentes concentrações dos antimicrobianos foram
semeadas com auxílio de um replicador do tipo Steers. O inóculo final, depositado
sobre a superfície das placas contendo meio de ágar Mueller Hinton suplementado
com 5% de sangue de carneiro (MH-SC),
foi de aproximadamente 10
4
UFC/ml. As
placas foram incubadas por 24 h, a 35
o
C, em atmosfera de CO
2
. Os resultados
foram interpretados segundo o CLSI (2005).
6.2. Teste para determinação de fenótipos de resistência à eritromicina
As amostras identificadas como resistentes à eritromicina foram
caracterizadas quanto ao seu fenótipo de resistência, através de testes de duplo-
disco, utilizando-se discos contendo 15 µg de eritromicina e 2 µg de clindamicina,
dispostos com uma distância de 15-20 mm entre si, sobre uma placa contendo
agar MH-SC, semeado com uma suspensão da amostra bacteriana a ser testada,
correspondente à escala 0,5 de McFarland, (Sepalla et al., 1993; Trallero et al.,
36
1998). O fenótipo MLSb foi considerado quando da constatação de resistência aos
antimicrobianos testados, podendo ser de caráter constitutivo (caracterizado por
halos de inibição ao redor dos dois discos utilizados) ou indutivo (caracterizado por
halo de inibição ao redor do disco de eritromicina e um halo de sensibilidade ao
redor do disco de clindamicina, apresentando uma redução no seu diâmetro na
proximidade do disco de eritromicina). O fénotipo M foi considerado quando da
observação de resistência apenas à eritromicina.
7. Detecção e Caracterização de Genes Associados à Resistência aos
Antimicrobianos
7.1. Detecção de genes de resistência à eritromicina
As amostras que apresentaram resistência à eritromicina foram submetidas
a técnica da PCR, para detecção dos genes erm(B) e mef(A/E). Para a obtenção
do DNA das amostras foi empregada a metodologia descrita no item 4.1.
Os sobrenadantes contendo o DNA das amostras foram submetidos a
reações de amplificação, em misturas de componentes num volume final de 50µl
para cada uma das reações. A mistura das reações continham 200µM de cada
deoxinucleotídeo trifosfatado, 1,4µM dos iniciadores, 0,5 U de Taq polimerase,
10mM de Tris-HCl (pH 8,3), 1µl de DNA molde e 2mM (para detecção do gene
ermB) ou 4mM (para detecção do gene mef(A/E) de cloreto de magnésio. As
amplificações foram realizadas em termociclador (GeneAmp PCR System 2400)
em um ciclo de 3 min, a 93ºC para desnaturação, seguidos de 35 ciclos a 93ºC por
1min, 1min a 52ºC para anelamento dos iniciadores e 1 min a 72ºC para extensão.
37
Para extensão final foi utilizado um ciclo de 5 min a 72
o
C. Os amplicons obtidos
foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1%, conforme em 4.5. Os
tamanhos dos produtos previstos para erm(B) e mef(A/E), foram de 640 pb e 348
pb, respectivamente. Foram utilizados os seguintes pares de iniciadores (Sutcliffe
et al., 1996): GAAAAGGTACTCAACCAAATA e
AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC [para detecção de erm(B)];
AGTATCATTAATCACTAGTGC e TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG [para detecção
de mef(A/E)].
7.2. Caracterização do gene atpC, associado ao fenótipo de resistência à
optoquina
As amostras que apresentaram resistência à optoquina foram submetidas a
procedimento de seqüenciamento do gene atpC, determinante genético desta
característica.
7.2.1. Amplificação do gene atpC
O gene atpC foi amplificado, utilizando-se os iniciadores 663 (TCG AAA
AGT GGA TCA ACA ACT ATC C) e 1016 (TGG GAA AGA AGA AGT AAC AAA
CTC G), com base nas recomendações de Fenoll et al. (1994).
A extração de DNA foi realizada conforme descrito no item 4.1. As misturas
para as reações de amplificação, num volume final de 100µl, foram compostas de:
5U de DNA polimerase Pfu (Stratagene), tampão de reação 1x, 20 µM de cada um
dos quatro dNTPs e 250 ng de cada iniciador. A amplificação foi realizada em
termociclador (GeneAmp PCR System 2400), empregando-se um período de
38
desnaturação inicial de 2 min (95ºC), seguido de 30 ciclos de 95ºC, 1min; 58ºC, 1
min; 72ºC, 2 min e uma extensão final de 10 min a 72ºC.
7.2.2. Seqüenciamento do gene atpC
Após as reações de amplificação para o gene atpC, os amplicons (6,0 µl)
foram purificados mediante tratamento com as enzimas SAP (1,0 µl) e EXO I (0,5
µl) (Amersham Pharmacia Biotech) durante 30 min a 37ºC e 15 min a 80ºC. A
seguir, as amostras foram submetidas às reações de seqüenciamento
acrescentando-se 12,5 µl do MIX (4µl de Big Dye Terminator, 1 µl do iniciador e
7,5 µl de água purificada) às misturas contidas em tubos, preparadas na etapa
anterior. Foram realizados 30 ciclos da reação de seqüenciamento (96ºC, 30 s;
50ºC, 15 s e 60ºC, 4 min). Após a reação de seqüenciamento, foi realizado
procedimento de purificação acrescentando-se 80 µl de isopropanolol a 20 µl da
reação de seqüenciamento, seguindo-se um período de incubação de 15 min à
temperatura ambiente. A seguir, foi realizada centrifugação por 20 min a 14.000
rpm, obtendo-se um sedimento que foi tratado com 250 µl de etanol 70%. Após 5
min de centrifugação a 1400 rpm, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento
submetido a processo de secagem por 3 min a 95ºC. A cada tubo contendo o
sedimento, foram adicionados 5 µl de formamida e 1 µl do “Loading Buffer”
(Applied Biosystems). Os tubos contendo as misturas foram, então, submetidos a
agitação em vortex e incubados por 3 minutos a 95ºC. Após esta etapa, foi
procedida a eletroforese em gel de poliacrilamida.
39
8. Análise do Polimorfismo dos Perfis de Fragmentação do DNA
Cromossômico através de Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE)
A diversidade genética entre amostras resistentes a penicilina e/ou
resistentes à eritromicina, pertencentes a sorotipos selecionados, foi analisada
através da técnica de PFGE. Tal procedimento também foi aplicado às amostras
com resistência à optoquina. Para estudos comparativos, amostras padrão
pertencentes aos clones aprovados pelo PMEN (McGee et al., 2001;
www.sph.emory.edu/PMEN) foram utilizadas. A metodologia utilizada foi baseada
naquela descrita por Teixeira et al. (1997b).
Na etapa de extração, cada amostra foi cultivada em placa contendo TSA-
SC, e incubada a 35ºC durante 18 a 24h em atmosfera de CO
2
. As células foram
suspensas em 0,6 ml de tampão PIV [NaCl 1 M, Tris HCl 10 mM (pH 7,6)] até a
obtenção de uma suspensão equivalente a da escala 8 de McFarland. A
suspensão celular foi misturada a um volume igual de agarose de baixo ponto de
fusão [NuSieve GTG Agarose; BioWhittaker Molecular Applications (BMA),
Cambrex Corporation, Rockland, Maine, EUA] a 2%, em tampão PIV e distribuída
em moldes para a obtenção de blocos, que foram então resfriados a 4ºC.
Para a lise celular, os blocos foram colocados em 4 ml de solução EC [Tris-
HCl 6 mM (pH 7,6), NaCl 1,0 M, EDTA 100 mM (pH 7,5), 0,5% (p/v) de Brij 58,
desoxicolato de Na a 0,2%, lauril sarcosinato de sódio a 0,5%, 1,0 mg de lisozima
por ml, 5 U de mutanolisina por ml] e incubados durante 18 a 24h a 37ºC, sob
agitação suave. Esta solução foi então substituída por 4 ml de solução ESP [EDTA
0,5 M (pH 8,0), 1% (p/v) de lauril sarcosinato de sódio, 0,1 mg de proteinase K por
ml] e a seguir incubada durante 24h a 50ºC. Antes do tratamento com a enzima de
40
restrição, os blocos foram lavados com tampão TE [Tris-HCL 10 mM (pH 7,6),
EDTA 0,1 mM] por 4 vezes (sendo as duas primeiras vezes durante 1 hora cada e
as duas últimas, 2 h cada) a 37ºC. Os blocos foram então tratados com o tampão
específico da enzima de restrição, durante 1h a 25ºC. A seguir, foi realizado o
tratamento com a enzima de restrição SmaI (Roche Diagnostics Corporation,
Indianapolis, Indiana, EUA), preparada em seu respectivo tampão, durante 24h a
25ºC. Os blocos de agarose foram então fundidos a 72ºC e aplicados em
reservatórios do gel de corrida preparado com agarose a 1,2% (SeaKem GTG
Agarose; BMA) em tampão TBE 0,5X (Tris 0,89 M, EDTA 0,025 M e ácido bórico
0,89 M).
Os fragmentos de restrição foram separados por eletroforese em campo
pulsado empregando-se o equipamento CHEF DR III (Bio-Rad), seguindo os
seguintes parâmetros: tempo de corrida 20h, temperatura 11ºC, gradiente de
voltagem 6 V/cm, pulso inicial de 1s e pulso final de 30s. Os géis foram corados
com brometo de etídio e fotografados sob luz UV. Padrões de peso molecular
(Pulse Marker, 50-1000 Kb; Sigma) foram utilizados para estimar o tamanho dos
fragmentos de DNA. Os perfis eletroforéticos obtidos foram interpretados segundo
critérios previamente publicados (Tenover et al., 1995) e posteriormente
analisados por um sistema computadorizado de análise de imagens (“Image
Analysis System” através do programa “Molecular Analyst Fingerprinting Plus”,
versão 1.6, Bio-Rad), empregando o método UPGMA (Unweighted Pair Group
Method using Arithmetic Averages) para o cálculo dos coeficientes de similaridade.
9. “Multilocus Sequence Typing” (MLST)
41
A técnica de MLST foi utilizada para a caracterização de um conjunto
selecionado de amostras de S. pneumoniae do sorotipo 14. Os aspectos gerais da
técnica, incluindo extração de DNA, condições de amplificação do DNA e análise
comparativa de seqüências, foram realizados de acordo com as recomendações
de Enright & Spratt (1998) e do PMEN (www.sph.emory.edu/PMEN).
Os fragmentos internos dos genes aroE, gdh, gki, recP, spi, xpt e ddl, os
quais codificam para as enzimas shiquimato desidrogenase, glicose-6-fosfato
desidrogenase, glicose quinase, transcetolase, sinal peptidase I, xantina
fosforibosiltransferase e D-alanina-D-alanina ligase, respectivamente, foram
amplificados por PCR utilizando os pares de iniciadores propostos por Enright &
Spratt (1998). Os fragmentos amplificados foram seqüenciados utilizando-se os
mesmos iniciadores usados para a amplificação inicial. As seqüências idênticas
foram alinhadas em uma mesma denominação alélica, enquanto que as
seqüências que diferiram em algum alelo conhecido receberam uma nova
denominação. A comparação das seqüências, determinação dos perfis alélicos e
obtenção do dendrograma foram realizados segundo as recomendações do banco
de dados de MLST (www.mlst.net
). Os alelos de cada um dos sete loci gênicos
permitiram definir um perfil alélico para cada amostra e sua respectiva seqüência
tipo (ST).
10. PCR Multiplex Seqüencial para a Determinação de Tipos Capsulares
10.1. Seqüências iniciadoras
Um conjunto de 29 pares de seqüências iniciadoras previamente descrito
para detectar os sorotipos ou sorogrupos (1, 3, 4, 5, 6A/B, 7F, 7C, 8, 9V, 10A,
42
11A, 12F, 14, 15A, 15B/C, 16F, 17F, 18, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 31, 33, 34, 35B,
35F e 38), bem como seqüências iniciadoras para o gene cpsA, foram utilizados,
conforme as recomendações de Pai, Gertz & Beall (2006). Todas as seqüências
iniciadoras, com seus respectivos números de acesso ao GenBank e o tamanho
do produto formado encontram-se na referência original (Pai, Gertz & Beall, 2006).
Durante a execução deste trabalho, foi detectada a necessidade de modificações
do esquema de tipagem por PCR seqüencial. Estas incluíram a adição de novas
seqüências iniciadoras para o sorotipo 14, com a intenção de evitar reações com
amostras dos sorotipos 15B e 15C. O novo par de seqüências iniciadoras para o
sorotipo 14 (número de acesso ao GenBank CR931662.1) foi o seguinte: 14-F2
(GAA ATG TTA CTT GGC GCA GGT GTC AGA ATT) e 14-R2 (GCC AAT ACT
TCT TAG TCT CTC AGA TGA AT). O produto de amplificação esperado é de 189
pb.
Considerando que o sorotipo 9N tem uma frequência significativa na
América Latina, seqüências iniciadoras para este sorotipo foram incluídas no
esquema de tipagem. As seqüências iniciadoras para o sorotipo 9N (número de
acesso ao GenBank CR931647), as quais também amplificam o sorotipo 9L (de
ocorrência rara), foram as seguintes: 9N/L-F (GAA CTG AAT AAG TCA GAT TTA
ATC AGC) e 9N/L-R (ACC AAG ATC TGA CGG GCT AAT CAA T). O produto de
amplificação esperado é de 516 pb.
As concentrações das seqüências iniciadoras para os sorotipos 14 e 9N/L
foram 1,0 e 0,5 µM, respectivamente.
43
10.2. Esquema da técnica de PCR multiplex
Para o estudo inicial de validação, as seqüências iniciadoras,
correspondendo a 28 sorotipos/sorogrupos, foram agrupadas em sete reações
multiplex, de acordo com o esquema originalmente proposto por Pai, Gertz & Beall
(2006).
Em uma segunda etapa, as seqüências iniciadoras foram agrupadas em um
esquema direcionado aos sorotipos prevalentes em países da América Latina (Di
Fabio et al., 2001; Laval et al., 2006; Brandileone et al., 2003). Nesta etapa,
seqüências iniciadoras correspondentes a 30 sorotipos/sorogrupos foram incluídos
(os sorotipos 5 e 9N foram incluídos nesta fase do estudo) e distribuídos em seis
grupos de PCR multiplex.
Foram incluídos controles para os diferentes sorotipos/sorogrupos
constituídos por amostras de S. pneumoniae pertencentes à coleção do CDC e
um par de seqüências inicadoras para o operon cps (comum a todos os tipos
capsulares conhecidos de pneumococos), como um controle interno positivo.
10.3. Extração de DNA
As amostras foram cultivadas em placas contendo TSA-SC. Suspensões de
células bacterianas foram preparadas em alíquotas de 300 µl de solução salina
estéril (NaCl a 0,85%). As suspensões foram aquecidas a 70ºC por 15 minutos. A
seguir, as amostras foram centrifugadas por dois min e o sobrenadante retirado.
Cada sedimento foi acrescentado de 50 µl de tampão Tris EDTA, 10 µl de solução
44
de mutanolisina (3000U/ml) e 8 µl de hialuronidase (30mg/ml). Após um período
de incubação de 30 min a 37ºC, as suspensões foram aquecidas a 100ºC por 10
min. Os extratos foram armazenados a –20ºC até o uso.
10. 4. PCR
As reações foram realizadas em volumes de 25 µl. Cada reação continha:
tampão 1X [20mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1M dithiothreitol,
0,5% Tween 20, 0.5% Nonidet P-40 (Promega Inc., Madison, Wisconsin, EUA],
200 µM de cada dinucleotídeo trifosfatado (New England Biolabs, Beverly, MA,
EUA), 2,5 mM de MgCl
2
, 2,0 U of Taq DNA polimerase (Promega Inc.), e as
seqüências iniciadoras previamente especificadas (Pai, Gertz & Beall, 2006). Para
o par de seqüências iniciadoras usadas para reconhecimento do sorotipo 9N, a
concentração foi de 0,5 µM. Um volume de 2,5 µl do extrato de DNA de cada
amostra foi usado como molde para a amplificação. Alguns ajustes foram
necessários para o procedimento adaptado aos sorotipos mais freqüentes na
América Latina. Para todas as reações do esquema, que passou a ser
denominado de esquema da América Latina, a concentração de MgCl
2
foi de 3,5
mM. A amplificação foi realizada em equipamento Perkin-Elmer GeneAmp PCR
system 2700 (Applied Biosystems) nas seguintes condições: 94ºC por 4 minutos,
seguido de 30 ciclos de amplificação de 94ºC por 45s, 54ºC por 45s, e 65ºC por 2
min e 30s.
10.5. Detecção dos produtos de PCR
45
Os produtos de PCR foram, analisados por eletroforese em gel a 2% (para
as reações do esquema original e reações 1, 2, 3, 4 e 6 do esquema da América
Latina) e a 3% (para a reação 5 do esquema da América Latina) (NuSieve
agarose, Cambrex Bio Science, Inc., Rockland, ME) em tampão TAE1X (40
mMTris, 20mM de ácido acético glacial, 1mM de EDTA, pH=8,0) a 120V, por 1hora
e 20 minutos. Os géis foram corados com brometo de etídio (0,5 µg/ml) e os
tamanhos dos produtos de amplificação foram determinados por comparação com
padrão de peso molecular (50-bp Ladder; Novagen, Inc.).
46
Resultados
Resistência aos antimicrobianos, distribuição de sorotipos e diversidade
genética
Este estudo compreendeu a análise comparativa de dados relativos a 829
amostras de pneumococos isoladas em Porto Alegre num período de 10 anos
(1995 a 2004). Os resultados obtidos para um total de 351 amostras isoladas no
período de 2000 a 2004 foram comparados àqueles obtidos para 478 amostras
isoladas no período de 1995 a 1999.
Os espécimes clínicos incluíram: fluídos normalmente estéreis (411
amostras), tais como sangue (255 amostras), líquor (85 amostras), líquido pleural
(58 amostras), líquido de ascite (12 amostras) e secreção de osteomielite (1
amostra); e outros materiais (418 amostras) em que foram incluídos espécimes
como secreções respiratórias (342 amostras, comprendendo amostras de escarro,
aspirado traqueal, lavado brônquico e lavado bronco-alveolar), oculares (33
amostras), auriculares (9 amostras) e outras secreções (34 amostras).
A resistência à penicilina foi o marcador de resistência mais freqüente entre
as encontradas no presente estudo, sendo detectado em 25,1% das amostras,
seguido de resistência à tetraciclina (10,1%), eritromicina (4,0%), cloranfenicol
(1,3%) e ceftriaxona (0,8% em casos de infecções outras que não meningite e
6,2% em casos de meningite). Não foi observada resistência à vancomicina. A
47
maioria (17,7%) das amostras não suscetíveis à penicilina foi incluída na categoria
de resistência intermediária (CIM ≥0,12 µg/ml e ≤1,0 µg/ml), enquanto que 7,36%
apresentaram resistência plena (CIM ≥2,0µg/ml). Quando a prevalência de
resistência à penicilina foi comparada considerando-se os dois períodos de
isolamento das amostras, foi observada uma tendência ao aumento. Esta
tendência foi mais evidente entre amostras com resistência plena à penicilina, uma
vez que esta característica foi detectada em 1,46% das amostras obtidas no
período 1995-1999 e em 15,4% daquelas compreendidas no período 2000-2004.
Os resultados de susceptibilidade aos diferentes antimicrobianos testados neste
estudo encontram-se na Tabela 1.
Em amostras provenientes de fluídos normalmente estéreis (invasivas) a
resistência plena à penicilina foi observada em 46/411 amostras (11,2%),
enquanto que entre as amostras provenientes de outros materiais a resistência
plena à penicilina foi constatada em 15/418 amostras (3,59%). A resistência
intermediária à penicilina foi verificada em 69/411 (16,8%) e 78/418 (18,7%) das
amostras originárias de fluídos normalmente estéreis e de outros materiais,
respectivamente.
A distribuição dos sorotipos entre 612 amostras (261 do período 1995-1999
e 351 do período 2000-2004) é apresentada na Tabela 2. Um total de 51
diferentes sorotipos foi encontrado, sendo que os sorotipos 14, 6B, 19F, 23F, 3,
6A, 11A e 9V foram os mais freqüentes nos dois períodos, embora uma tendência
de aumento dos sorotipos 14 e 9V e de diminuição de 6B possa ser verificada. O
48
predomínio do sorotipo 14 foi mais pronunciado entre amostras invasivas, com 77
(18,7%) das amostras, seguido dos sorotipos 6B (7,30%), 19F (5,84%), 3, 23F, 9V
(4,38%, cada), 1 (3,89%), 18C (3,65%) e 6A (2,67%). Entre os demais materiais,
distribuição dos mais freqüentes sorotipos foi: 14 (6,94%), 19F (5,98%), 23F
(5,50%), 6B (5,26%), 11A (4,54%), 6A (3,82%), 3 (3,35%), 13 (3,11%), 23B e 15B
(2,39%, cada).
Uma proporção equivalente a 89,6% das amostras apresentou antígenos
polissacarídicos idênticos (75,7%) ou relacionados (13,9%) aos da vacina
pneumocócica 23-valente. Para a vacina conjugada 7-valente, 49,0% e 8,7% das
amostras pertenciam a antígenos idênticos ou relacionados, respectivamente
(Tabela 2). Considerando-se exclusivamente as 147 amostras procedentes de
crianças de menos de 5 anos, a proporção de amostras com sorotipos idênticos
aos da vacina conjugada 7-valente foi de 66,0% (97 amostras, com 23, 6, 45, 8, 9
e 6 amostras para os sorotipos 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, respectivamente.
Nenhuma amostra do sorotipo 4 foi encontrada neste grupo) e a de sorotipos
relacionados foi de 9,52%, correspondendo a 14 amostras dos sorotipos 6A (4),
9N (1), 18A (1), 19A (4) e 23B (4).
Como representado na Figura 1, a resistência à penicilina foi detectada em
uma variedade de sorotipos, com predomínio dos sorotipos 6B, 9V, 14, 19F, 23B e
23F. O sorotipo 14 foi o mais freqüente entre amostras com CIM à penicilina
≥2,0µg/ml. Esta característica foi também observada em amostras dos sorotipos
9V e 19F no período 2000-2004 e 19A entre 1995-1999. Suscetibilidade diminuída
49
à penicilina foi detectada entre poucas amostras de diversos outros sorotipos,
incluindo 1, 3, 4, 8, 11A, 13, 18F, 19A, 19C, 21, 28A e 34.
A resistência à penicilina foi relacionada com pneumococos pertencentes
aos sorotipos 14 (38,0% de todas as amostras não suscetíveis à penicilina e
74,0% de todas as amostras do sorotipo 14), 6B (38,0% dos não suscetíveis à
penicilina e 75,0% das amostras do sorotipo 6B), 23F (10,1% das não suscetíveis
e 51,2% das amostras deste sorotipo), 9V (6,25% das amostras não suscetíveis e
52,0% de todas as amostras deste sorotipo), 23B (5,8% dos pneumococos não
suscetíveis à penicilina e 92,3% do total de amostras deste sorotipo) e 19F (4,3%
das amostras não suscetíveis à penicilina e 18,4% das amostras pertencentes a
este sorotipo). Estes seis sorotipos em conjunto constituíram 86,1% de todos os
pneumococos não suscetíveis à penicilina e, a exceção do sorotipo 23B, são
componentes da vacina conjugada 7-valente.
Amostras do sorotipo 14 representaram 80,3% do total das amostras com
CIM de penicilina ≥2,0 µg/ml. A emergência de amostras pertencentes ao sorotipo
9V e CIM de penicilina ≥2,0 µg/ml foi evidente durante o segundo período (2000-
2004). Os sorotipos 9V e 14 englobaram 95,1% de todas as amostras com CIM de
penicilina ≥2.0 µg/ml e foram também associados à resistência à ceftriaxona,
sendo encontrados em todas as amostras com resistência a este antimicrobiano
(duas amostras do sorotipo 9V e cinco do 14). Em contraste, amostras de outros
sorotipos relevantes, tais como 1, 3 e 18C tiveram pouca ou nenhuma resistência
à penicilina e a outros agentes.
50
Amostras apresentando resistência ao cloranfenicol foram distribuídas em
diferentes sorotipos, incluindo 6A, 9N, 11A, 13, 14, 15C, 18A, 19F e 34. Entre as
amostras com resistência à eritromicina, a distribuição dos sorotipos foi também
bastante variável: os sorotipos 14 e 23F estiveram entre os de mais frequentes,
seguidos dos sorotipos 6B e 23B (Tabela 3). Contudo, pneumococos pertencentes
aos sorotipos 10A, 11A, 13, 19A, 19C, 19F, 22F e 23A foram também encontrados
entre os que apresentaram resistência à eritromicina. A resistência à tetraciclina
foi mais freqüentemente encontrada em amostras do sorotipo 23F, seguida dos
sorotipos 19F, 14, 6B, 9N, 19A e 6A. Amostras dos sorotipos 5, 7C, 8, 10A, 11A,
12B, 12F, 13, 15C, 23B, 28A, 28F, 34, 35A, 35B e 40 também apresentaram
resistência à tetraciclina.
Levando-se em conta a associação com resistência à penicilina, amostras
dos sorotipos 6B, 9V e 14 foram selecionadas para análise dos perfis de
macrorestrição de DNA cromossômico após eletroforese em campo pulsado
(PFGE).
Amostras do sorotipo 6B com diferentes CIMs de penicilina (≤0,03 µg/ml,
0,06 µg/ml, 0,12 µg/ml e 0,25 µg/ml) foram incluídas na análise por PFGE. A maior
parte delas ficou restrita a um complexo clonal (CC) principal, arbitrariamente
denominado Pen
6B
-B, aparentemente composto de dois subgrupos, como
representado na Figura 2). Perfis de PFGE representativos do complexo clonal
Pen
6B
-B estão ilustrados na Figura 3.
51
Os resultados foram indicativos de pouca diversidade genética entre as
amostras do sorotipo 6B circulantes em Porto Alegre. Não foi observada relação
entre as amostras do CC Pen
6B
-B quando comparadas a cepas-referência de
clones internacionais com resistência à penicilina (Spain
6B
-2, South Africa
6B
-8 e
Finland
6B
-12).
Em relação às amostras do sorotipo 14 com resistência à penicilina, um CC
principal, designado Pen
14
-H, foi encontrado e caracterizado. Amostras
procedentes de outros estados brasileiros foram incluídas na comparação e
ficaram alocadas neste mesmo CC, tendo sido também observada marcante
proximidade genética entre o CC Pen
14
-H e a amostras de referência do clone
internacional Spain
9V
-3 (Figura 4). Um conjunto de 9 amostras do sorotipo 14 ,
integrantes do complexo clonal Pen
14
-H, sendo cinco isoladas em Porto Alegre e
quatro procedentes de outros estados brasileiros apresentaram um único perfil de
MLST (7, 11, 10, 1, 6, 8 e 1), correspondendo ao ST 156, compatível com o clone
internacional Spain
9V
-3. Uma minoria de amostras do sorotipo 14 com resistência
à penicilina foi incluída em CCs distintos, de baixa freqüência (denominados
Pen
14
-A e Pen
14
-I), enquanto que amostras suscetíveis à penicilina apresentaram
considerável diversidade genética (Figura 4).
Devido à emergência do sorotipo 9V entre amostras com CIMs≥2,0 µg/ml à
penicilina no período 2000-2004, amostras deste sorotipo foram submetidas à
52
análise por PFGE. Os perfis obtidos apresentaram alta semelhança genética com
o CC Pen
14
-H e com o clone internacional Spain
9V
-3 (Figura 5).
Um grupo de amostras com resistência à eritromicina e pertencentes aos
sorotipos mais freqüentes com esta característica (6B, 14 e 23F) foi selecionado
para análise genotípica. Dentre as amostras do sorotipo 23F, houve predomínio do
complexo clonal denominado Ery
23F
-B, sendo todas as amostras possuidoras do
gene erm(B). As amostras do sorotipo 14 apresentaram um perfil genotípico mais
diverso, com predomínio de amostras apresentando o gene mef (A/E) (Tabela 4).
53
Caracterização de amostras resistentes à optoquina
A resistência à optoquina foi detectada em quatro amostras (Sp 910, Sp
913, Sp 917 e Sp 1008), sendo duas provenientes de amostras do trato
respiratório (Sp 910 e Sp 913), uma (Sp 917) de sangue e uma de secreção ocular
(Sp 1008). As amostras com fenótipo de resistência à optoquina foram detectadas
entre 478 amostras de pneumococos obtidos no período 1995-1999 de pacientes
residentes em Porto Alegre, RS. As amostras Sp 910, Sp 913 e Sp 917 foram
isoladas em 1995 e a amostra Sp 1008 em 1996.
Nenhuma das quatro amostras com fenótipo de resistência à optoquina
apresentou formação de alguma zona de inibição ao redor do disco. Esta
observação foi consistente quando os testes foram incubados tanto em atmosfera
convencional quanto na presença de tensão aumentada de CO
2
. Exceto pela
resistência à optoquina, as demais características fenotípicas e genotípicas foram
compatíveis com um padrão típico de S. pneumoniae. Todas as amostras foram
solúveis em presença de bile, apresentaram antígeno polissacarídico capsular,
possuíam os genes ply, lytA e psaA e hibridizaram frente à sonda de DNA
empregada.
A comparação com a cepa R6 (suscetível à optoquina) revelou que as
quatro amostras resistentes à optoquina apresentaram mutações pontuais
localizadas no gene atpC que codifica a subunidade c da F
0
F
1
ATPase (Figura 6).
As mutações, no entanto, foram diferentes entre as quatro amostras. As amostras
54
Sp 910 e Sp 913 apresentaram modificações nos códons 23 e 49,
respectivamente. Nas demais amostras (Sp 917 e Sp 1008) foram observadas
mutações no códon 45. As trocas de nucleotídeos corresponderam a duas
diferentes substituições dos aminoácidos deduzidos: ao invés de fenilalanina,
leucina (amostra Sp 917) e valina (amostra Sp 1008) (Tabela 5, Figura 6).
As quatro amostras resistentes à optoquina pertenceram a diferentes
sorotipos (6A, 6B, 10A e 23F) (Tabela 5) e a análise dos perfis de macro restrição
por eletroforese em campo pulsado indicou que as amostras não eram
geneticamente relacionadas. Duas amostras (Sp 913 e Sp 917) apresentaram-se
suscetíveis a todos os antimicrobianos testados, enquanto que a amostra Sp 910
foi resistente ao cloranfenicol e sulfametoxazol-trimetoprim e a amostra Sp 1008
foi resistente à tetraciclina.
As seqüências do gene atpC obtidas para essas quatro amostras foram
depositadas no GenBank sob os seguintes números de acesso: EF464066
(amostra Sp 910), EF464067 (amostra Sp 913), EF464068 (amostra Sp 917) e
EF464069 (amostra Sp 1008).
Na Tabela 5 são apresentadas algumas características gerais das amostras
de pneumococos resistentes à optoquina analisadas neste estudo, tais como os
sorotipos (ou sorogrupos) e os tipos de mutações identificadas no gene atpC. Para
fins de comparação, foram também incluídas as características de amostras
resistentes à optoquina descritas em outros estudos.
55
PCR multiplex seqüencial para a detecção de tipos capsulares
O sistema PCR multiplex seqüencial foi avaliado frente a uma coleção
contendo 147 amostras de Streptococcus pneumoniae obtidas de crianças com
idade inferior a 5 anos, residentes em Porto Alegre, RS. A maior parte (115/147,
78,2%) das amostras foi proveniente de fluídos ou secreções normalmente
estéreis, incluindo sangue (74 amostras), líquor (19 amostras) e líquido pleural (22
amostras). A coleção de 147 amostras foi constituída de representantes de 27
diferentes sorotipos: 14 (45 amostras); 6B (23 amostras); 19F (9 amostras); 18C (8
amostras); 1 e 3 (7 amostras cada), 9V e 23F (6 amostras cada); 5 (5 amostras);
6A, 19A, e 23B (4 amostras cada); 11A (3 amostras); 8 e 16F (2 amostras cada) e
7C, 7F, 9N, 10A, 13, 15B, 18A, 24B, 28A, 29, 31 e 34 (1 amostra cada).
Quando foi empregado o esquema de PCR multiplex seqüencial proposto
por Pai, Gertz e Beall (2006) houve completa concordância com os resultados da
sorologia convencional. O sorotipo ou sorogrupo de 133/147 (90,5%) amostras foi
corretamente reconhecido e as primeiras 4 reações detectaram 81,6% das
amostras. As 14 amostras remanescentes compuseram um grupo em que foram
observados sorotipos não incluídos no esquema: sorotipo 5 (5 amostras), sorotipo
23B (4 amostras) e sorotipos 9N, 13, 24B, 28A e 29 (1 amostra cada).
Ao aplicarmos o esquema de PCR multiplex seqüencial dirigido para os
sorotipos prevalentes na América Latina, observamos que o sorotipo ou sorogrupo
foi corretamente deduzido para 131 amostras (89,1%) com as três primeiras
56
reações. Empregando-se as três reações adicionais, 139 (94,6%) amostras
tiveram cobertura pelo esquema de PCR multiplex seqüencial modificado neste
estudo. As 8 amostras que não foram reconhecidas pelo esquema pertenciam aos
sorotipos 23B (4 amostras) e 13, 24B, 28A e 29 (uma amostra cada). Dentre as
115 amostras obtidas de fluídos normalmente estéreis, 111 (96,5%) tiveram seu
sorotipo corretamente deduzido pelo esquema de PCR multiplex seqüencial
adaptado aos sorotipos prevalentes na América Latina. Para assegurar a
especificidade da PCR para o sorotipo 9N, todas as seis amostras pertencentes
ao sorotipo 9V foram testadas e não produziram amplificação. Os resultados
encontram-se na Tabela 6 e os produtos de amplificação das seis reações do
esquema adaptado à América Latina nas Figuras 7 e 8.
Tabela 1. Suscetibilidade aos antimicrobianos entre 829 amostras de Streptococcus pneumoniae obtidas em Porto Alegre,
RS (1995-2004)
Porcentagem de amostras/período de tempo
Agente antimicrobiano
1995-1999
(478 amostras)
2000-2004
(351 amostras)
Total
(1995-2004)
(829 amostras)
S I R S I R S I R
Ceftriaxona
SPSP
1
SPNSP
2
Total
100
100
100
0
0
0
0
0
0
100
94,0
98,0
0
4,3
1,4
0
1,7
0,6
99,2
0,6
0,2
Ceftriaxona (meningite)
SPSP
SPNSP
Total
100
93,5
98,7
0
6,5
1,3
0
0
0
100
60,7
86,9
0
33,3
11,1
0
6,0
2,0
93,8
5,4
0,8
Cloranfenicol
SPSP
SPNSP
Total
99,5
97,8
99,2
-
-
0
0,5
2,2
0,8
97,4
99,1
98,0
-
-
0
2,6
0,9
2,00
98,7
-
1,3
Eritromicina
SPSP
SPNSP
Total
97,2
87,0
95,8
0
0
0
2,8
13,0
4,2
98,3
92,3
96,3
0,4
1,7
0,9
1,3
6,0
2,8
96,0
0,4
3,6
Penicilina
Total
81,0
17,5
1,5
66,7
17,9
15,4
74,9
17,7
7,4
Tetraciclina
SPSP
SPNSP
Total
92,7
92,4
92,7
0,8
0
0,6
6,5
7,6
6,7
85,0
88,0
86,1
0,9
1,7
1,1
14,1
10,3
12,8
89,9
0,8
9,3
Tabela 1 (continuação)
Vancomicina
SPSP
SPNSP
Total
100
100
100
0
0
0
0
0
0
100
100
100
0
0
0
0
0
0
100
100
100
0
0
1
SPSP, Streptococcus pneumoniae suscetível à penicilina
2
SPNSP, Streptococcus pneumoniae não suscetível à penicilina
.
Tabela 2. Distribuição de sorotipos entre 612 amostras de
Streptococcus pneumoniae de Porto Alegre, RS (1995-2004)
Porcentagem de amostras/Periodo de tempo
Sorotipo
1995-1999
(n=261)
2000-2004
(n=351)
Total
(1995-2004)
(n=612)
Tipos incluídos nas
vacinas
1
a
2,68 3,13 2,94
3
a
6,13 4,56 5,23
4
a b
0,77 1,42 1,14
5
a
2,30 0,28 1,14
6B
a b
12,6 5,41 8,50
7F
a
0 1,99 1,14
8
a
0.38 1.71 1.14
9N
a
0.38 2.85 1.80
9V
a b
1.15 6.27 4.08
10A
a
1.91 0.85 1.31
11A
a
4.21 4.27 4.25
12F
a
0 0.57 0.33
14
a b
14.6 19.4 17.3
15B
a
3.83 0.57 1.96
17F
a
1.53 0 0.65
18C
a b
2.68 3.70 3.27
19A
a
2.68 1.99 2.29
19F
a b
6.90 8.83 8.01
20
a
0.77 0.57 0.65
22F
a
2.68 1.14 1.80
23F
a b
7.28 6.27 6.70
Total 75.5 75.8 75.7
Tipos relacionados às
vacinas
6A
a b
4.21 4.56 4.41
7C
a
1.15 1.14 1.14
15A
a
0.77 1.71 1.31
15C
a
2.70 0.85 1.63
15F
a
0 0.57 0.33
18F
a b
0 1.99 1.14
19C
a b
0.38 0.57 0.49
23B
a b
3.45 1.14 2.12
Outros
c
0.38 1.99 1.31
Total 13.0 14.5 13.9
60
Tabela 2 (continuação)
Tipos não relacionados às
vacinas
13 2.30 2.56 2.45
16F 1.53 1.99 1.80
21 0.77 0 0.33
24F 0 0.85 0.49
28A 2.58 0 1.14
29 0.38 0.28 0.33
31 0 0.57 0.33
34 1.91 0.57 1.14
35B 0.77 0.28 0.49
35F 0 1.13 0.65
Outros
d
0.77 0.57 0.65
Total 11.1 8.83 9.80
Não tipável 0.38 0.85 0.65
Total
100.0
100.0
100.0
a
Sorotipos incluídos (ou relacionados) na vacina 23-valente.
b
Sorotipos incluídos (ou relacionados) na vacina conjugada 7-valente.
C
Incluídos sorotipos 7A, 7B, 10C, 11D, 12B, 18A, 18B e 23A.
d
Incluídos sorotipos 24B, 28F, 35A, e 40.
61
Tabela 3. Distribuiçãio de sorotipos entre amostras de Streptococcus pneumoniae
resistentes à eritromicina, isoladas em Porto Alegre, RS (1995-2004)
Período
Sorotipo
1995-1999 2000-2004
Total
6B 2 2 4
10A 1 0 1
11A 1 0 1
13 1 0 1
14 3 4 7
19A 1 0 1
19C 1 0 1
19F 2 0 2
22F 1 0 1
23A 1 0 1
23B 2 1 3
23F 4 2 6
35A 0 1 1
Total 20 10 30
62
Tabela 4. Características de amostras de Streptococcus pneumoniae resistentes à
eritromicina e pertencentes aos sorotipos 6B, 14 e 23F, isoladas em Porto Alegre
Amostra Sorotipo CIM
a
(µg/ml)
Genótipo de
resistência
Complexo clonal Perfil de
resistência
b
Sp 929 6B >8 erm(B) Pen
6B
-B
eri, pen
Sp 1119 6B >8 erm(B) Ery
6B
-F eri
Sp 2049 6B 8 mef(A/E) ND
c
eri, tet
Sp 2086 6B >8 erm(B) ND eri, tet
Sp 1025 14 2 mef(A/E) Pen-H eri, PEN
Sp 1292 14 4 mef(A/E) * eri, pen
Sp 1293 14 4 mef(A/E) * eri, pen
Sp 1689 14 2 mef(A/E) Pen-H eri, PEN
Sp 1721 14 >8 erm(B) ND eri, tet
Sp 2123 14 4 mef(A/E) Pen-H eri, PEN
Sp 2158 14 4 mef(A/E) Pen-H eri, tet
Sp 957 23F >8 erm(B)
Ery
23F
-E eri, tet
Sp 992 23F >8 erm(B) Ery
23F
-B eri, pen, tet
Sp 1107 23F
>8 erm(B) Ery
23F
-B eri, tet
Sp 1278 23F
>8 erm(B) Ery
23F
-B eri, tet
Sp 1601 23F >8 erm(B) ND eri, pen, tet
Sp 2005 23F
>8 erm(B) ND eri, tet
a
CIM: Concentração inibitória mínima.
*Genótipos menos freqüentes, não relacionados a Pen-H.
b
eri,eritromicina; pen, resistência intermediária à penicilina; PEN, resistência plena
à penicilina; tet, tetraciclina.
c
ND, não determinado
63
Tabela 5. Sorotipos (ou sorogrupos) e mutações no gene atpC que codifica a
subunidade c da F
0
F
1
ATPase em amostras de Streptococcus pneumoniae
resistentes à optoquina
Referência Amostra Sorotipo ou
sorogrupo
Local da mutação: número
do códon (AA R6 Æ AA
amostra)
a
MJ9559 19 49 (AlaÆThr)
MJ455 6 48 (ValÆPhe)
MJ1966 14 50 (PheÆLeu)
de La Campa et al., 1997
MJ4133 NT
b
48 (ValÆPhe)
Cognè et al., 2000 P21 23 14 (GlyÆSer)
310 9V 23 (MetÆIle)
660 14 49 ( AlaÆThr)
Pikis et al., 2001
654 19F 20 (GlyÆSer)
Sp 910 6A 23 (MetÆIle)
Sp 913 23F 49 (AlaÆSer)
Sp 917 6B 45 (PheÆLeu)
Este estudo
Sp 1008 10A 45 (PheÆVal)
a
Aminoácido encontrado na amostra de referência S. pneumoniae R6 (suscetível à
optoquina) Æ Substituição deduzida de aminoácido. Ala, alanina; Gly, glicina; Ile,
isoleucina; Leu, leucina; Met, metionina; Phe, fenilalanina; Ser, serina; Thr, treonina; Val,
valina.
b
NT, não tipável.
64
Tabela 6. Dedução de sorotipos de Streptococcus pneumoniae utilizando dois
diferentes esquemas de PCR multiplex seqüencial (Estados Unidos e América
Latina)
Estados Unidos
(Pai, Gertz & Beall, 2006)
América Latina
(este estudo)
Reação
Sorotipos
em cada
reação
a
N. Cumulativo
(%)
Sorotipos em
cada reação*
N. Cumulativo
(%)
1 3, 6A/6B,
19A,
22F/(22A)
38 38 (25,8) 6A/6B,
9V/(9A), 14,
19F, 23F,
93 93 (63,3)
2 4, 9V/(9A),
12F/(12A),
14
52 90 (61,2) 1, 4, 5,
18C/(18A,
18B, 18F),
19A
25 118 (80,3)
3 7F/(7A),
11A/(11D),
23F,
33F/(33A,37)
10 100 (68,0) 3, 7F/(7A),
9N/9L, 10A,
11A/(11D),
13 131 (89,1)
4 16F,
18C/(18A,
18B, 18F),
19F, 35B
20 120 (81,6) 7C/(7B,40),
12F/(12A),
15B/15C,
17F, 38
2 133 (90,1)
5 8, 15B/15C,
31, 38/(25F)
3 123 (83,7) 8, 20,
22F/(22A),
31, 34,
4 137 (93,2)
6 1, 10A, 34,
35F/(47)
9 132 (89,8) 15A, 16F,
33F/(33A,37),
35F/(47),
35B,
2 139 (94,6)
7 7C/(7B,40),
15A, 17F, 20
1 133 (90,5) NA
b
a
Combinação de sorotipos são indicadas por barras. Sorotipos raros aparecem
em parênteses.
b
NA, Não se aplica
65
Figura 1. Resistência à penicilina entre os 15 sorotipos mais freqüentes de
Streptococcus pneumoniae isolados em Porto Alegre, RS, em dois
períodos (1995-1999, 261 amostras e 2000-2004, 351 amostras)
0
5
10
15
20
1 3 6A 6B 9N 9V 11A 13 14 18C 19A 19F 22F 23B 23F
Suscetível Intermediário Resistente
0
5
10
15
20
1 3 6A 6B 9N 9V 11A 13 14 18C 19A 19F 22F 23B 23F
Suscetível Intermediário Resistente
1995-1999
2000-2004
%
%
66
Figura 2. Perfis de fragmentação do DNA cromossômico de amostras de
Streptococcus pneumoniae do sorotipo 6B, isoladas em Porto Alegre, RS, obtidos
por PFGE após digestão com SmaI
Pen
6B
-B
Sp936
Sp966
Sp1036
Sp986
Sp1029
Sp924
Sp928
Sp929
Sp953
Sp1037
Sp942
Sp1026
Sp927
Sp932
Sp1002
Sp930
Sp955
Sp917
1009080706050
67
Figura 3. Perfis de PFGE representativos do complexo clonal Pen
6B
-B, encontrado
entre amostras de Streptococcus pneumoniae isoladas em Porto Alegre, RS
Pen
6B
-B
MM 1 2 3 4 5 6
Kb
242.5
145.5
48.5
MM: Padrão de massa molecular ; 1-6: Amostras representativas do complexo
clonal
Pen
6B
-B
68
Figura 4. Perfis de fragmentação do DNA cromossômico representativos de
amostras de Streptococcus pneumoniae do sorotipo 14, isoladas em Porto Alegre,
RS, obtidos por PFGE após digestão com SmaI
Pen
14
-H
• Amostras resistentes à penicilina (CIM≥2 µg/ml)
Amostras com CIM=1,0 µg/ml à penicilina
Sp995
Sp996
Sp979
Sp 1101
Sp775
Sp1025
Sp886
Sp933
Sp1022
Sp1010
Sp1001
Sp985
Sp1040
Sp947
Sp997
Sp948
Sp967
Sp1003
•
•
•
•
•
•
•
•
69
Figura 5. A. Perfis de fragmentação de DNA cromossômico (obtidos por PFGE
após digestão com SmaI) de amostras de Streptococcus pneumoniae dos
sorotipos 9N, 9V, e 14, isoladas em Porto Alegre, RS, e comparação com o perfil
de PFGE do clone international Spain
9V
-3. B. Dendrograma resultante da análise
computadorizada dos perfis do painel A
A B
Linhas 1 e 15, Padrão de massa molecular; 2, Sp 1570 (Sorotipo 14, PenR); 3, Sp 1575 (Sorotipo
14, PenS); 4, Sp 1726 (Sorotipo 9N, PenS); 5, Sp 1767 (Sorotipo 9N, PenS); 6, Sp 60 (Sorotipo
9N, PenR); 7, CDC 195 (clone Spain
9V
-3); 8, Sp 1654 (Sorotipo 14, PenR, clone PenH); 9, Sp
1922 (Sorotipo 14, PenR, clone PenH); 10, Sp 1608 (Sorotipo 14, PenR, clone PenH); 11, Sp 858
(Sorotipo 9V, PenR); 12, Sp 1735 (Sorotipo 9V, PenR); 13, Sp 1596 (Sorotipo 9V, PenR); 14, Sp
1883 (Sorotipo 9V, PenS).
A
breviações: PenS (suscetível a penicilina); PenR (resistente a
penicilina)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Sp 1654
Sp 1922
CDC 195
Sp 1596
Sp 1883
Sp 1608
Sp 858
Sp 1735
Sp 1570
Sp 1575
Sp 1726
Sp 1767
Sp 60
100908070605040
Figura 6. Comparação das seqüências de nucleotídeos do gene atpC e os respectivos amino ácidos deduzidos (em itálico)
de amostras de Streptococcus pneumoniae resistentes à optoquina (Sp910, Sp913, Sp917 e Sp1008), isoladas em Porto
Alegre, RS, e a amostra de referência R6 (optoquina suscetível)
5’
Primer 663 →
R6
Sp 910
Sp 913
Sp 917
Sp 1008
ATG AAT TTA ACA TTT TTA GGC TTA TGT ATT GCC TGT ATG GGC GTA TCT GTC GGT GAA GGT TTA TTG ATG AAT GGA
Met Asn Leu The Phe Leu Gly Leu Cys Ile Ala Cys Met Gly Val Ser Val Gly Glu Gly Leu Leu Met Asn Gly
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -T - - - - - -
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ile . .
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
R6
Sp 910
Sp 913
Sp 917
Sp 1008
CTG TTT AAA TCA GTA GCA CGC CAA CCA GAT ATG CTT TCT GAG TTT CGT AGT TTG ATG TTT TTA GGT GTT GCC TTT
Leu Phe Lys Ser Val Ala Arg Gln Pro Asp Met Leu Ser Glu Phe Arg Ser Leu Met Phe Leu Gly Val Ala Phe
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - T - - - - -
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ser .
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - - - - - - -
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . Leu . . . . .
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - - - - - - - - -
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . Val . . . . .
← Primer 1016 3’
71
Figura 7. Abordagem esquemática baseada em PCR Multiplex para tipagem capsular, dirigida para a distribuição de sorotipos de
Streptococcus pneumoniae prevalentes na América Latina
Reação 1
Positivo para o
locus cps e um
dos sorotipos
6A/B, 9V, 14,
19F, 23F
Positivo apenas
para o locus cps
Reação 2
Positivo para o
locus cps e um
dos sorotipos 1, 4,
5, 19A e
sorogrupo 18
Positivo apenas
para o locus cps
Reação 3
Positivo para o
locus cps e um
dos sorotipos 3,
7F, 9N, 10A,
11A
Positivo apenas
para o locus cps
Reação 4
Positivo para o
locus cps e um
dos sorotipos 7C,
12F, 15B/C, 17D,
38
Positivo apenas
para o locus cps
Reação 5
Positivo para o
locus cps e um
dos sorotipos 8,
20, 22F, 31, 34
Positivo apenas
para o locus cps
Reação 6
Positivo para o
locus cps e um
dos sorotipos 15A,
16F, 33F, 35F,
35B
Positivo apenas
para o locus cps
Sorotipagem
convencional
Figura 8. Conjunto de reações para dedução de sorotipos de Streptococcus
pneumoniae pelo esquema PCR multiplex adaptado aos sorotipos prevalentes na
América Latina
8 34 20 22F 31
Reação 5
60
50
15
250
90
bp
35
14 6 19F 23F 9V
Reação 1 Reação 2
1 5 4 19A 18C
33F 15A 35F 35B 16F
Reação 6
7C 12F 15B/C 38 17F
60
50
15
250
90
bp
35
Reação 4
Reação 3
3 11A 9N 10A 7F
cpsA
cpsA
73
Discussão e Conclusões
Streptococcus pneumoniae é um dos principais agentes de otite média
aguda, pneumonia, bacteremia, e meningite. As incidências mais elevadas de
doença pneumocócica acontecem nos primeiros anos de vida e na velhice e a
pneumonia pneumocócica é uma das causas mais relevantes de mortalidade
infantil em países em desenvolvimento (Hausdorff, 2000a). O campo de
investigação sobre pneumococos é amplo e diversificado, incluindo estudos
voltados para a bactéria (genoma, fatores de virulência), interações parasita-
hospedeiro e para a comunidade (portadores, epidemiologia da doença
pneumocócica, patogênese) e o diagnóstico, tratamento e prevenção (métodos de
diagnóstico, estratégias terapêuticas, resistência aos antimicrobianos e relevância
clínica, mecanismos de resistência, resposta imune humoral e vacinas).
Esta tese abordou alguns dos componentes acima mencionados, com
relação a amostras isoladas durante um período de 10 anos e provenientes de um
estado localizado no extremo sul do Brasil, o Rio Grande do Sul. No desenrolar
dos trabalhos, os resultados mais importantes foram organizados no formato de
quatro publicações independentes, ainda que vinculadas entre elas.
A resistência dos pneumococos aos antimicrobianos apresenta
disseminação global, sendo considerado um problema de saúde pública. O
Pneumococcal Molecular Epidemiology Network (PMEN)
74
(www.sph.emory.edu/PMEN/
) reconhece os mais importantes clones responsáveis
pela resistência, uma etapa necessária para basear estratégias de controle da
disseminação. Para que a resistência seja detectada e rastreada, um conjunto de
medidas de vigilância é necessário, tanto local quanto globalmente. Basicamente,
a vigilância inclui testes de suscetibilidade para avaliação da resistência, definição
dos tipos capsulares envolvidos e utilização de métodos moleculares de tipagem
para caracterização de clones.
No presente estudo, 829 amostras de pneumococos isoladas de pacientes
na cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, foram avaliadas, gerando o
manuscrito “Antimicrobial susceptibility, serotype distribution and genetic diversity
of predominant serotypes among Streptococcus pneumoniae isolated in Porto
Alegre city, Brazil, from 1995 to 2004”, que condensa os dados gerais mais
relevantes. Foi possível acompanhar a evolução da resistência a antimicrobianos
durante o período de uma década, destacando-se o aumento da resistência à
penicilina. Quanto a alguns dos demais antimicrobianos testados (eritromicina,
cloranfenicol e tetraciclina) a prevalência de resistência não apresentou alterações
relevantes durante o período.
A resistência plena (CIM ≥2,0µg/ml) à penicilina aumentou
significativamente entre os pneumococos isolados de pacientes de Porto Alegre
durante o período do estudo, passando de 1,46% no período 1995-1999 para
15,4% entre 2000-2004. A sorotipagem das amostras resistentes possibilitou o
reconhecimento de um nítido predomínio do sorotipo 14 entre elas e tornou
75
evidente a emergência do sorotipo 9V durante a segunda etapa do estudo. Ao
aplicarmos a técnica da eletroforese em campo pulsado nas amostras dos
sorotipos 9V e 14 verificamos que o aumento na resistência dos pneumococos à
penicilina devia-se principalmente à disseminação de um único complexo clonal,
relacionado ao clone internacional Spain
9V
-3, o que não havia antes sido descrito
em nosso país. Estudos anteriores já haviam reconhecido a presença deste
complexo clonal, porém em número limitado de amostras (Brandileone et al.,
1998). Por outro lado, a importância do clone Spain
9V
-3 já havia sido reconhecida
em dois países limítrofes ao estado do Rio Grande do Sul: Uruguai (Camou, Hortal
& Tomasz, 1998) e Argentina (Rossi et al., 1998).
O sorotipo 6B também esteve entre os mais freqüentes neste estudo,
apresentando correlação com resistência intermediária à penicilina. Amostras
suscetíveis e intermediárias à penicilina foram incluídas na análise por PFGE, o
que tornou evidente o predomínio de um complexo clonal composto de dois
subclones, independente do comportamento frente à penicilina. Foi, possível,
portanto, constatar a baixa diversidade genética entre amostras pertencentes ao
sorotipo 6B durante extenso período de tempo. Este complexo clonal encontra-se
bem adaptado na região e não parece ser relacionado com os clones
internacionais já descritos. Estudos futuros poderão contribuir para a
caracterização precisa desse complexo clonal e para avaliar a sua possível
ocorrência em outras regiões do Brasil.
76
A distribuição dos sorotipos entre as amostras incluídas neste trabalho foi
também explorada e, dentre as 612 amostras submetidas a sorotipagem, 51
diferentes tipos capsulares foram encontrados. Os sorotipos 14, 6B, 19F, 23F, 3,
6A, 11A e 9V foram os mais freqüentes e, de modo geral, a distribuição dos
sorotipos foi semelhante à observada em estudos brasileiros, tanto em estudos
mais recentes (Mantese et al., 2003; Laval et al., 2006), quanto em estudos que
incluíram amostras isoladas há mais tempo (Brandileone et al., 1997; 1998; 2003;
Sessegolo et al., 1994; Teixeira et al., 1997a). Foi observado um aumento relativo
entre amostras dos sorotipos 9V e 14, ao passo que um decréscimo de amostras
do sorotipo 6B foi constatado, o que é representativo da dinâmica da distribuição
dos sorotipos ao longo do tempo.
De acordo com os dados obtidos em relação aos sorotipos foi possível
constatar que 89,6% dos isolados apresentaram antígenos capsulares idênticos
(75,7%) ou relacionados aos contidos na vacina pneumocócica 23-valente. Em
relação à vacina pneumocócica 7-valente, 49,0% dos isolados apresentaram
antígenos idênticos aos da vacina e 8,56% antígenos relacionados, para um total
de 57,7%. O potencial impacto da vacina conjugada no Brasil foi previamente
avaliado, sendo considerado que a vacina7-valente atingiria 58,2% das amostras
isoladas de crianças com menos de cinco anos de idade (Brandileone et al.,
2003). É necessário ressaltar que nosso estudo utilizou amostras de pacientes de
diferentes faixas etárias, o que diminui a representação das amostras pediátricas.
Uma outra questão paralela a essa, é o impacto que a vacina conjugada 7-valente
teria sobre as amostras resistentes à penicilina. Constatamos que, dentre as
77
amostras com resistência à penicilina, 86,1% foram representadas por apenas
seis sorotipos capsulares (14, 6B, 23F, 9V, 23B e 19F). Exceto pelo sorotipo 23B,
os demais são componentes da vacina conjugada 7-valente. Estes dados
permitem uma visão preliminar do efeito desta vacina sobre amostras de
pneumococos resistentes a penicilina. A experiência prévia em estudo
populacional realizado nos EUA, em que foi avaliado o efeito desta vacina sobre a
resistência de pneumococos, indica uma significativa diminuição da ocorrência de
amostras resistentes (Kyaw et al., 2006). Ressalte-se ainda que a resistência
plena à penicilina, no presente estudo, foi, em grande parte, proveniente de
amostras incluídas em um único complexo clonal que expressa sorotipos 9V ou
14, ambos integrantes da vacina 7-valente.
Conforme demonstrado, a sorotipagem é uma etapa crucial na vigilância da
doença pneumocócica e em particular no rastreamento da resistência aos
antimicrobianos. A definição acurada dos sorotipos é também uma necessidade
para desenvolvimento a avaliação do uso de vacinas. A reação de Quellung é o
método padrão para definição dos tipos capsulares, mas apresenta dificuldades
operacionais que limitam seu uso a poucos laboratórios altamente especializados.
Métodos moleculares, baseados em PCR, têm surgido como alternativa à
sorotipagem convencional e apresentam potencial para tornar mais acessível a
vigilância da doença pneumocócica. Com base nestas considerações e em um
estudo que descreveu um novo método de PCR seqüencial multiplex (Pai, Gertz &
Beall, 2006), desenvolvemos uma avaliação deste sistema frente a amostras
isoladas de crianças no Rio Grande do Sul. Este estudo foi realizado em parceria
78
com o “Centers for Diseases Control and Prevention”, em Atlanta, EUA, resultando
na proposta de um esquema modificado, adaptado para uso em países da
América Latina, conforme apresentado no manuscrito “Sequential Multiplex PCR
Scheme for Determining Capsular Serotypes of Pneumococci Recovered from
Brazilian Children”, recentemente publicado.
Este estudo foi dividido em duas etapas. Na primeira delas, as amostras de
pneumococos foram submetidas ao esquema proposto previamente (Pai, Gertz &
Beall, 2006), com o propósito de validar o método. Os resultados obtidos com o
procedimento de PCR seqüencial multiplex foram de completa concordância com
a tipagem convencional para as 147 amostras avaliadas. Em 133/147 (90,5%), o
sorotipo foi corretamente deduzido, enquanto que as amostras restantes eram de
sorotipos não incluídos no esquema original da técnica.
Na segunda etapa desse estudo, incluímos seqüências iniciadoras para
dois sorotipos, 5 e 9N, que estão entre os prevalentes na América Latina,
ampliando a abrangência do esquema de tipagem para um total de 30 sorotipos.
Além disso, a combinação de seqüências iniciadoras foi modificada para que se
obtivesse resultados conclusivos com o menor número possível de reações. Esta
combinação permitiu que 89,1% (131/147) das amostras tivesse seu sorotipo
deduzido nas primeiras três reações de PCR multiplex, que continham seqüências
iniciadoras referentes a 15 diferentes sorotipos. Com o total das seis reações,
compreendendo 30 sorotipos, 139/147 (94,6%) das amostras tiveram seu sorotipo
deduzido. Ficou, portanto, constatada não apenas a acurácia do sistema, mas
79
também sua versatilidade para ajustes na combinação de seqüências iniciadoras
para a distribuição de sorotipos provenientes de uma região específica.
Os resultados deste estudo apontam o sistema de PCR seqüencial multipex
como de grande potencial como método alternativo para a sorotipagem
convencional de pneumococos, em laboratórios que disponham de recursos
básicos para realização de PCR e eletroforese. O uso deste sistema, na versão
por nós proposta, permitirá que se identifique, com acurácia, os sorotipos
capsulares de mais de 90% das amostras.
Um outro importante componente deste conjunto de estudos, foi aquele que
originou o manuscrito “Diversity of Mutations in the atpC Gene Coding for the c
Subunit of F
0
F
1
ATPase in Clinical Isolates of Optochin-Resistant Streptococcus
pneumoniae from Brazil”, o qual aborda uma questão crucial relacionada a
identificação rotineira do microrganismo. Cepas com fenótipo de resistência à
optoquina, uma substância utilizada na diferenciação de pneumococo em relação
a integrantes do grupo “viridans”, têm recebido atenção no meio científico pelo
potencial de erros de identificação que representam (Borek et al., 1997; Tsai et al.,
2000; Cogné et al., 2000; Pikis et al., 2001), cabendo ressaltar que novas espécies
relacionadas ao pneumococo têm sido descritas (Arbique et al., 2004). Em nosso
estudo descrevemos quatro amostras com fenótipo de resistência à optoquina.
Como a resistência à optoquina é associada ao gene atpC, buscamos, por
intermédio de seqüenciamento, mutações neste gene, considerando os poucos
estudos publicados até o momento que se valeram desta abordagem (de La
80
Campa et al., 1997; Cogné et al., 2000; Pikis et al., 2001). Foi possível detectar
mutações localizadas no gene que codifica a subunidade c da ATPase F
0
F
1
nas
quatro amostras com fenótipo de resistência à optoquina estudadas. Em três das
amostras, as alterações observadas não haviam ainda sido descritas, o que, em
conjunto com os outros estudos antes mencionados, demonstra a natureza
diversa dos mecanismos moleculares que estão associados ao fenótipo de
resistência à optoquina em pneumococos.
Não há estudos sistemáticos para detecção de resistência à optoquina em
pneumococos, o que faz com que a prevalência de resistência seja desconhecida.
Pneumococos resistentes à optoquina podem ser erroneamente identificados
como estreptococos do grupo viridans o que tem implicações significativas na
abordagem clínica. A inclusão de um teste adicional, como o da bile solubilidade,
deve ser adotada por laboratórios clínicos para a identificação acurada de S.
pneumoniae. Por outro lado, testes moleculares, tais como aqueles que detectam
genes relacionados à virulência (ply, lytA e psaA), por nós empregados, podem
ser de auxílio para a identificação precisa de pneumococos resistentes à
optoquina.
Várias observações feitas durante este trabalho de tese expuseram
questões a serem esclarecidas. Uma melhor definição sobre a origem das
amostras de S. pneumoniae com fenótipo de resistência à optoquina, por exemplo,
é algo que poderá ser futuramente desenvolvido. Da mesma forma, a emergência
e a evolução do sorotipo 9V entre as amostras pertencentes ao clone Spain
9V
-3
81
pode ser objeto de um acompanhamento ao longo de mais tempo e de estudos
comparativos com amostras isoladas em outras áreas. Por outro lado,
caracterizamos, detalhadamente, amostras de pneumococos com uma
característica rara, a resistência à optoquina, incluindo a definição de mutações no
gene da subunidade c da F
0
F
1
ATPase, a maioria das quais não havia sido
anteriromente identificada. Com relação à resistência aos antimicrobianos,
definimos o papel preponderante de amostras dos sorotipos 9V e 14, pertencentes
ao clone internacional Spain
9V
-3, na resistência a níveis elevados à penicilina. Foi
também constatada a ocorrência de um complexo clonal de amostras do sorotipo
23F (Ery
23F
-B) com resistência à eritromicina.
Tivemos também oportunidade de adaptar um procedimento de PCR
multiplex seqüencial para melhor utilização entre amostras brasileiras e latino
americanas. Em seu conjunto, esta tese contribuiu para ampliar os conhecimentos
regionais e globais relacionados a S. pneumoniae, envolvendo questões sobre
caracterização de amostras atípicas, resistência aos antimicrobianos e vigilância
laboratorial das infecções pneumocócicas.
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A
A
n
n
e
e
x
x
o
o
s
s
Os resultados obtidos durante o programa de Doutorado deram origem a
trabalhos, assim como a comunicações em congressos ou encontros científicos,
conforme listado a seguir:
• Trabalhos cientificos (cópias em anexo):
1. Dias,
C.A.G.; Carvalho, M.G.S.; Mendonca-Souza, C.R.V;
Kegele, F.C.O.;
d’Azevedo, P.A.; Barros, R.R.; Jackson, D.; McGee, L.; Facklam, R. & Teixeira,
L.M. Antimicrobial susceptibility, serotype distribution and genetic diversity of
predominant serotypes among Streptococcus pneumoniae isolated in Porto Alegre
city, Brazil, from 1995 to 2004. Em fase de revisão.
2. Mendonça-Souza, C.R.V.; Carvalho, M.G.S.; Barros, R.R.; Dias, C.A.; Sampaio,
J.L.M.; Castro, A.C.D.; Facklam, R.R. & Teixeira, L.M. 2004. Occurence and
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3. Dias, C.A.G.; Agnes,
G.;
Frazzon, A.P.G.; Kruger,
F.D.; d'Azevedo, P.A.;
Carvalho, M.G.; Facklam, R.R.; & Teixeira, L.M. 2007. Diversity of mutations in the
atpC gene coding for the c subunit of F
0
F
1
ATPase in clinical isolates of optochin-
resistant Streptococcus pneumoniae from Brazil. J. Clin. Microbiol. 45: 3065-3067.
112
4. Dias, C.A.G.; Teixeira, L.M.; Carvalho, M.G. & Beall, B. 2007. Sequential
multiplex PCR scheme for determining capsular serotypes of pneumococci
recovered from Brazilian children. J. Med. Microbiol. 56: 1185-1188.
• Outras publicações relacionadas:
Zettler, E.W.; Scheibe, R.M.; Dias, C.A.G.; Santafé, P.; Santos, D.S.; Moreira, J.S.
& Fritscher, C.C. 2006. Determination of penicillin resistance in Streptococcus
pneumoniae isolates from southern Brazil by PCR. Intern. J. Infect. Dis. 10:110-
115.
• Outros manuscritos em preparo:
Mendonça-Souza, C.R.V. et al. Molecular characterization of penicillin-resistant
Streptococcus pneumoniae Strains Isolated in Brazil
Kegele, F et al. Molecular characterization of Brazilian isolates of Streptococcus
pneumoniae serotype 14
• Comunicações em congressos ou eventos científicos:
1. DIAS, C. A. G.; AGNES, G.; FRAZZON, A. P.; KRUGER, F.; DAZEVEDO,
P. A.; TEIXEIRA, L. M. 2006. Diversity of mutations in the c subunit of F1/F0
ATPase in clinical isolates of optochin-resistant Streptococcus pneumoniae
from Brazil. In: 106th General Meeting American Society for Microbiology,
2006, Orlando, Florida, EUA. Abstracts of the 106th General Meeting.
113
2. KEGELE, F.; DIAS, C. A. G.; BARROS, R.; DAZEVEDO, P. A.;
MENDONCA-SOUZA, C.; CARVALHO, M. G. S.; FACKLAM, R.; TEIXEIRA,
L. M. 2005. Molecular Characterization of Brazilian Isolates of
Streptococcus pneumoniae Serotype 14. In: 105th General Meeting
American Society for Microbiology, 2005, Atlanta, GA. Abstract Book, p.
202-202.
3. BARROS, R.; KEGELE, F.; ABREU, T. P.; JESSOUROUN, E.; DIAS, C. A.
G.; CARVALHO, M. G. S.; FACKLAM, R. R.; TEIXEIRA, L. M. 2005.
Relação genética entre cepas de Streptococcus pneumoniae pertencentes
aos sorotipos 9N, 9V e 14. In: XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia,
2005, Santos, SP. Anais do XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia,
4. KEGELE, F.; DIAS, C. A. G.; BARROS, R.; MENDONCA-SOUZA, C.;
CARVALHO, M. G. S.; FACKLAM, R. R. ; TEIXEIRA, L. M. 2005.
Diversidade fenotípica e genotípica entre amostras de Streptococcus
pneumoniae sorotipo 14 resistentes à penicilina isoladas no Brasil. In: XXIII
Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2005, Santos, SP. Anais do XXIII
Congresso Brasileiro de Microbiologia.
5. ABREU, T. P.; BARROS, R.; KEGELE, F.; DIAS, C. A. G.; CARVALHO, M.
G. S.; FACKLAM, R. R.; TEIXEIRA, L.M. 2005. Caracterização molecular de
Streptococcus pneumoniae dos sorotipos 9N, e 9V isolados no Brasil. In:
114
XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2005, Santos, SP. Anais do
XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia.
6. DIAS, C. A. G.; CARVALHO, M. G. S.; BUFFON, R.; KADER, I.;
D'AZEVEDO, P. A.; FACKLAM, R.; TEIXEIRA, L. M. 2003. Occurrence and
characteristics of optochin-resistant Streptococcus pneumoniae isolated in
the southern region of Brazil. In: 103rd General Meeting of the American
Society for Microbiology, 2003, Washington, DC, EUA. Abstract Book 103rd
General Meeting American Society for Microbiology. Washington, DC, EUA :
American Society for Microbiology, p. 181-181.
7. MENDONÇA, C. R. V.; BARROS, R.; CARVALHO, M. G.; DIAS, C. A. G.;
D'AVEVEDO, P. A.; SAMPAIO, J. L. M.; MENDES, C.; FACKLAM, R.;
CASTRO, A.; TEIXEIRA, L. M. 2003. Phenotypic and molecular
characterization of macrolide-resistant Streptococcus pneumoniae isolates
from Brazil. In: 103rd General Meeting of the American Society for
Microbiology, 2003, Washington, DC, EUA. Abstract Book 103rd General
Meeting of the American Society for Microbiology. Washington, DC, EUA:
American Society for Microbiology, p. 141-141.
8. RAMOS, C. G.; DIAS, C. A. G. 2003. Suscetibilidade de levofloxacina e
gatifloxacina em amostras de Streptococcus pneumoniae com perfil de
resistência a outros antimicrobianos. In: XXII Congresso Brasileiro de
115
Microbiologia, Florianópolis, SC. Anais do XXII Congresso Brasileiro de
Microiologia.
9. MENDONÇA, C. R. V.; BARROS, R.; DIAS, C. A. G.; D'AVEVEDO, P. A.;
SAMPAIO, J.; MENDES, C.; FACKLAM, R.; CARVALHO, M. G. S.;
CASTRO, A.; TEIXEIRA, L. M. 2003. Caracterização molecular de amostras
de Streptococcus pneumoniae resistentes à penicilina isoladas no Brasil. In:
XXII Congreso Brasileiro de Microbiologia, Florianópolis, SC. Anais do XXII
Congresso Brasileiro de Microbiologia.
116
Manuscrito 1
Antimicrobial susceptibility, serotype distribution and genetic
diversity of predominant serotypes among Streptococcus
pneumoniae isolated in Porto Alegre city, Brazil, from 1995 to
2004
Cícero Armídio Gomes Dias,
1,2
Maria da Glória Siqueira de Carvalho, Claudia R. V.
Mendonca-Souza,
1,3
Fabiola Cristina de Oliveira Kegele ,
1
Pedro Alves d’Azevedo,
2
Rosana Rocha Barros,
1,3
Delois Jackson,
5
Lesley McGee,
4
Richard Facklam,
5
and
Lúcia Martins Teixeira
1
Instituto de Microbiologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,
RJ, Brazil,
1
Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre,
Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil,
2
Universidade Federal Fluminense,
3
Emory
University,
4
Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, USA
5
Running title: Phenotypic and genetic diversity of pneumococci
Corresponding author: Cícero Armídio Gomes Dias. Departmento de
Microbiologia e Parasitologia, Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas
de Porto Alegre. Rua Sarmento Leite, 245, CEP 90050-170, Porto Alegre, RS,
Brazil. Phone 55 051 3224 8822. E mail: [email protected]
117
Abstract
Streptococcus pneumoniae is a major cause of disease and antimicrobial
resistance is spreading. In the present work, 829 S. pneumoniae isolates obtained
from patients living in Porto Alegre, Brazil, during a ten-year period (1995-2004),
were studied. Penicillin resistance was observed in 25.1% of the strains (17.7%
intermediate and 7.4% fully resistant). Resistance to ceftriaxone, chloramphenicol,
erythromycin, and tetracycline was verified in 0.8%, 1.3%, 4.0%, and 10.1% of the
strains, respectively. An increase in full resistance to penicillin was evident (1.46%
in the period 1995-1999 to 15.4% in 2000-2004). Serotypes 14, 6B, 19F, 23F, 3,
6A, 11A, and 9V were the most frequent and 75.5% and 49.0% of the isolates
belonged to serotypes included in the 23-valent and 7-valent pneumococcal
vaccines, respectively. Pneumococci belonging to six serotypes (6B, 9V, 14, 19F,
23B, and 23F) comprised 86.1% of penicillin non-susceptible isolates. Serotypes
9V and 14 predominated among isolates exhibiting full resistance to penicillin and,
according to PFGE analysis, most of these isolates were included in a single clone
related to the international clone Spain
9V
-3. On the other hand, among isolates of
serotype 6B, a major clonal complex was observed with two highly related
subclusters including susceptible and intermediate resistant pneumococci. The
results indicate the dissemination of resistance among strains of S. pneumoniae in
the Southern region of Brazil, reinforcing the need of surveillance and control of
antimicrobial resistance, with especial emphasis in serotypes 6B, 9V and 14.
118
INTRODUCTION
Streptococcus pneumoniae remains as an important human pathogen, and
a leading cause of community-acquired pneumonia, bacteremia, meningitis and
otitis media (Centers for Disease Control and Prevention, 1997), despite the
development and application of treatment and prevention strategies. Although the
introduction of penicillin therapy significantly decreased the usually high morbidity
and mortality rates due to pneumococcal infections, the emergence and
dissemination of resistance to penicillin and to other antimicrobial agents is now a
global problem involving both developed and developing countries (Klugman,
1990; Okeke et al., 2005). In Brazil, the largest country in Latin America, the
occurrence of resistance to penicillin and other antimicrobial agents has been
documented in strains obtained from the Southeast and Northeast regions of the
country. Penicillin resistance rates may vary from 12.9% up to 20.0%, and
serotypes 6B, 14 and 23F were shown to be the most frequent among resistant
isolates in some Brazilian areas investigated (Sessegolo et al., 1994; Brandileone
et al., 1997; Teixeira et al., 1997a; Brandileone et al., 1998; Kertesz et al., 1998;
Ko et al., 2000, Critchley et al., 2001, Reis et al., 2002, Castanheira et al., 2004). A
trend towards increase in penicillin resistance rates (particularly in strains
exhibiting minimal inhibitory concentrations ≥2.0 µg/ml) was recently documented
in Brazil (Mendes et al., 2004; Brandileone et al., 2006).
The use of molecular typing systems has provided a better understanding
about the transmission of resistant clones of S. pneumoniae. About 10 years ago,
the Pneumococcal Molecular Epidemiology Network was established with the aim
119
of characterizing, standardizing, naming, and classifying antimicrobial-resistant
pneumococcal clones, and several international clones have been recognized to
date (McGee et al., 2001; www.sph.emory.edu/PMEN/). Antimicrobial resistant
pneumococcal isolates belonging to a widely disseminated international clone,
named Spain
9V
-3, carrying capsular antigens of serotypes 9 or 14 were already
detected in Latin America countries (Camou et al., 1998; Rossi et al., 1998;
Brandileone et al., 1998), including Brazil. Strains belonging to this clone and
exhibiting resistance to cefotaxime were observed in Brazil and other Latin
America countries (Castanheira et al., 2003). Considering the burden of
pneumococcal infections and the large area and population of the country,
however, studies focusing on the genetic diversity of Brazilian isolates are still very
limited (Brandileone et al., 1998; Ko et al., 2000) and the knowledge on the
transmission of antimicrobial-resistant clones of S. pneumoniae is quite restricted.
The aim of the present study was to investigate the occurrence of
antimicrobial resistance, serotype distribution and predominant genetic profiles
among pneumococcal isolates from Porto Alegre, the capital city of the state of Rio
Grande do Sul, located at the South region of Brazil, over a period of 10 years.
120
MATERIAL AND METHODS
Bacterial strains and identification. Clinical isolates of Streptococcus
pneumoniae (total of 829) obtained from patients living in Porto Alegre city, the
capital of Rio Grande do Sul state, Brazil, during the period between 1995 and
2004 were included in the study. The city of Porto Alegre (approximately 1,200,000
inhabitants) is located in the extreme South of Brazil at a distance of about 400km
from the borders of both Uruguay and Argentina (Figure 1). Identification of the
isolates was based on the observation of colony characteristics on blood agar
plates, Gram staining cellular characteristics, optochin susceptibility, and bile
solubility testing, according to previously described methods (Ruoff at al., 1999).
Pneumococcal isolates from other Brazilian states (referred when appropriate)
belonging to major serotypes (6B, 9V and 14) identified among Penicillin Non-
Susceptible Streptococcus pneumoniae (PNSSP) isolates, as well as reference
strains of several antimicrobial-resistant internationally disseminated clones [ATCC
700670 (Spain
6B
-2), ATCC 700671 (Spain
9V
-3), ATCC 700676 (England
14
-9),
ATCC 700902 (Spain
14
-5), ATCC 700675 (S.Africa
6B
-8), ATCC 700677 (CSR
14
-
10), ATCC (Finland
6B
-12)], were also included in PFGE experiments for
comparative purposes.
Serotyping. Isolates were serotyped on the basis of reactivity with type-
specific pneumococcal antisera (Centers for Disease Control and Prevention,
Atlanta, Ga), expressed by latex agglutination reactions and/or capsular swelling
(Quellung reaction). The Danish system of nomenclature was employed.
121
Antimicrobial susceptibility testing. The isolates obtaines in the period of
1995-1998 were initially screened for antimicrobial resistance by agar diffusion
tests, according to the Clinical Laboratory Standards Institutes (CLSI, 2005)
guidelines. The following antimicrobial agents were tested: chloramphenicol,
erythromycin, oxacillin (for predicting susceptibility to penicillin), tetracycline, and
vancomycin. When resistance to at least one of the agents was observed in the
disk testing, an agar dilution procedure was performed in order to determine
minimal inhibitory concentrations (MICs) for ceftriaxone, chloramphenicol,
erythromycin, penicillin, and tetracycline (CLSI, 2005). Isolates obtained between
1999 and 2004 were all tested by agar dilution to the antimicrobials listed above
and to vancomycin. S. pneumoniae ATCC 49619 was used for quality control of
both agar diffusion and agar dilution assays.,
Analysis of chromosomal DNA restriction patterns by pulsed-field gel
electrophoresis (PFGE). PFGE was used to compare chromosomal DNA
restriction profiles of isolates belonging to the most relevant serotypes according to
a previously described procedure (Mendonça-Souza, 2004) with a few
modifications. Briefly, isolates were grown on plates containing Trypticase Soy
Agar with 5% sheep blood during 14 hours at 35ºC, in CO
2
atmosphere. Cells were
harvested and suspended on 0.6 ml aliquots of PIV buffer (1.0 M NaCl, 10 mM tris-
HCl [pH7.6]) in order to obtain turbidity corresponding to that of an 8 McFarland
standard. Each suspension was mixed with an equal volume of 2.0% low-melting-
temperature agarose (NuSieve GTG Agarose; BioWhittaker Molecular Applications
(BMA), Cambrex Corporation, Rockland, ME) in PIV buffer at 58ºC. The mixtures
122
were then distributed into plug molds. Cell lysis was obtained by placing plugs in
4.0 ml of fresh lysis solution (6 mM Tris hydrochloride [pH7.6], 1.0 NaCl, 100mM
EDTA [pH7.5], 0.5% Brij 58, 0,2% sodium deoxycholate, 0.5% sodium lauroyl
sarcosine, 1mg of lysozyme per ml, 5U of mutanolysin per ml) and incubation for
24 hours at 35ºC, with gentle shaking. After incubation, the solution was replaced
by 4 ml of ESP (0.5 M EDTA [pH8.0], 1% sodium lauroyl sarcosine, 0.1 mg of
proteinase K per ml), and the preparations were incubated overnight at 50ºC with
gentle shaking. Plugs containing DNA were stored in ES (0.5 M EDTA [pH8.0], 1%
sodium lauroyl sarcosine) at 4ºC. Prior to treatment with the restriction enzyme, the
plugs were washed four times (two periods of 1h each and two periods of 2h each)
with TE (10 mM Tris-HCl [pH7.6], 0.1% mM EDTA) at 37ºC, followed by overnight
incubation with the respective restriction enzyme buffer. The DNA was then
restricted with SmaI according to manufacturer’s instructions (Roche Diagnostics
Corporation, Indianapolis, Ind.). The fragments obtained were resolved by PFGE
using 1.2% agarose (SeaKem GTG, BMA) in TBE buffer (0.89M Tris, 0.025 M
EDTA, 0.89M boric acid) in a CHEF DR III system (Bio-Rad). The following
parameters were employed initial pulse time, 1s; final pulse, 30s: running time,
20h; temperature, 11ºC; voltage gradient, 6 V/cm; included angle, 120º. The gels
were stained with ethidium bromide and photographed under UV light. Analysis of
the DNA restriction profiles was done by visual inspection, and interpretation was
based on the criteria suggested by Tenover et al. (1995). Computer-assisted
analysis was also performed by using the Molecular Analyst Fingerprinting Plus
software, version 1.12 of the Image Analyst System (BioRad). The Unweighted
123
Pair Group Method Using Arithmetic Averages (UPGMA) method was applied for
comparison of the banding profiles, using the Dice coefficient of similarity.
Multilocus Sequencing Typing. MLST was carried out as described
previously (Enright & Spratt, 1998). Briefly, internal fragments of the aroE, gdh, gki,
recP, spi, xpt, and
ddl genes were amplified by PCR from chromosomal DNA using
the
primer pairs described by Enright and Spratt (1998). The amplified
fragments
were directly sequenced in each direction using the
primers that were used for the
initial amplification. The sequences
at each of the seven loci were then compared
with the sequences
of all of the known alleles at those loci. Sequences that were
identical to the sequence of a known allele were assigned the
same allele number,
whereas those that differed from the sequence
of any known allele, even at a
single nucleotide site, were assigned
new allele numbers. The assignment of
alleles at each locus was
carried out using the software available at the
pneumococcal MLST
website (http://www.mlst.net). The alleles at each of the
seven
loci define the allelic profile of each isolate as well as their
sequence type.
Allelic profiles were shown as a series of seven
integers which corresponded to the
alleles at each of the loci,
in the order aroE, gdh, gki, recP, spi, xpt, and ddl. The
relatedness
between the isolates was represented as a dendrogram, constructed
by the unweighted pair-group method with arithmetic averages,
from the matrix of
pairwise differences in the allelic profiles.
124
RESULTS AND DISCUSSION
The 829 pneumococcal isolates included in the present study, comprised
478 isolates obtained in the period of 1995 to 1999, and 351 Isolates recovered in
the period of 2000-2004. The clinical sources included: normally sterile fluids (410
isolates), such as blood (255 isolates), spinal fluid (85 isolates), pleural fluid (58
isolates), ascitis fluid (12 isolates); as well as non-sterile fluid or secretions (419
isolates), consisting of respiratory tract secretions (342 isolates), eye (33 isolates),
ear (9 isolates) and other secretions (35 isolates).
Resistance to penicillin was the most frequent antimicrobial resistance
marker among the isolates included in the present study, being detected in 25.1%
of them, followed by resistance to tetracycline (10.1%), erythromycin (3.98%),
chloramphenicol (1.33%), ceftriaxone (0.84%). All isolates were susceptible to
vancomycin (Table 1). Most (17.7%) of the penicillin non-susceptible isolates were
included in the intermediate category (MIC≥0.12 µg/ml and ≤1.0 µg/ml), while
7.36% were fully resistant (MIC≥2.0µg/ml). When rates of antimicrobial resistance
among isolates from the 2 periods of time were compared, a trend toward
increasing incidence of penicillin resistance was noted. This was particularly
noticeable among fully resistant isolates that composed 1.46% of the isolates
obtained in the period of 1995 to 1999 and 15.4% of those recovered in the period
of 2000 to 2004. Such observation is in accordance with reports indicating the
increasing occurrence of penicillin non-susceptible pneumococci among isolates
recovered in other Brazilian locations (Mendes et al., 2004; Brandileone et al.,
2006).
125
The prevalence of resistance to other antimicrobial agents tested in this
study was also comparable to previous observations with Brazilian isolates, except
for tetracycline, which was lower (10.6%) compared to rates of 44.6% and 31.0%
reported for isolates recovered in the Southeast region. (Sessegolo et al., 1994;
Teixeira et al., 1997a) and a rate of 30.2% recently observed for isolates from
different regions in Brazil (Castanheira et al., 2006).
The occurrence of significant rates of decreased susceptibility to penicillin
among pneumococcal isolates in Brazil was documented in previous studies
(Sessegolo et al., 1994; Brandileone et al., 1997; Teixeira et al., 1997a;
Brandileone et al., 1998; Kertesz et al., 1998; Ko et al., 2000; Critchley et al., 2001;
Reis et al., 2002, Mendes et al., 2004; Brandileone et al., 2006). However, Brazil is
a large country and some regions are still underrepresented or not represented at
all in the existing reports. The present study was conducted to obtain information
on antimicrobial susceptibility, especially in relation to penicillin, and serotype
distribution among S. pneumoniae isolates obtained in Porto Alegre, a large city
located in the South of Brazil, a region that has not been submitted to extensive
surveillance. Porto Alegre is one of the major cities in the Southern area of Brazil,
having important trading and cultural connections with other South America
countries, especially Argentina and Uruguay. Isolates obtained over a period of 10
years were compared and the predominant serotypes associated with resistance to
penicillin were evaluated for their genetic diversity by PFGE.
The distribution of serotypes among a total of 612 isolates (261 isolates
recovered in the period of 1995 to 1999, and 351 in the period of 2000 to 2004) is
shown in Table 2. Fifty-one different serotypes were identified. Serotypes 14, 6B,
126
19F, 23F, 3, 6A, 11A, and 9V were the most frequent. They predominated among
isolates obtained in both periods of time, although differences in the prevalence
rates suggest a trend toward increasing occurrence of serotypes 14 and 9V, and
decreasing incidence of serotype 6B. A large proportion (89.6%) of isolates had
polysaccharide-type antigens identical (75.7%) or related (13.9%) to those included
in the 23-valent pneumococcal vaccine and 57.7% had antigens identical (49.0%)
or related (8.66%) to those in the 7-valent pneumococcal vaccine.
As represented in Fig. 2, resistance to penicillin was detected in a variety of
serotypes, with the predominance of serotypes 6B, 9V, 14, 19F, 23B and 23F.
Serotype 14 was the most frequent among isolates with penicillin MICs ≥2.0ug/ml.
High resistance to penicillin was also found among isolates expressing capsular
antigens of serotypes 9V and 19F isolated in the period of 2000 to 2004, and
among serotype 19A isolated in 1997 and 1998. Decreased susceptibility to
penicillin was also detected among a few isolates belonging to several other
serotypes, including 1, 3, 4, 8, 11A, 13, 18F, 19A, 19C, 21, 28A and 34.
Isolates showing resistance to chloramphenicol were distributed in different
serotypes, including 6A, 9N, 11A, 13, 14, 15C, 18A, 19F, and 34. Serotype
distribution among erythromycin-resistant isolates was also highly variable:
serotypes 14 and 23F were the most prevalent, followed by 6B and 23B. Isolates
belonging to serotypes 10A, 11A, 13, 19A, 19C, 19F, 22F and 23A were also
represented among those with erythromycin resistance. Resistance to tetracycline
was most frequently associated with serotype 23F, followed by serotypes 19F, 14,
6B, 9N, 19A and 6A. A few isolates of serotypes 5, 7C, 8, 10A, 11A, 12B, 12F, 13,
15C, 23B, 28A, 28F, 34, 35A, 35B and 40 also presented tetracycline resistance.
127
Geographic and temporal differences have been reported in the distribution
of capsular serotypes of S. pneumoniae. According to a study involving
pneumococcal isolates collected from invasive infections in children from 6 Latin
America countries, serotype 14 was the most prevalent, accounting for 24.4% of
the isolates, although differences in distribution of serotypes were seen among
countries (Kertesz et al., 1998). In Brazil, serotypes 6B, 14, 19A, 19F and 23F
have been found to predominate in different studies, among both penicillin
susceptible (PSSP) and penicillin non-susceptible (PNSSP) S. pneumoniae
isolates (Sessegolo et al., 1994; Brandileone et al., 1997; Teixeira et al,. 1997a;
Brandileone et al., 1998; Kertesz et al., 1998; Ko et al., 2000, Reis et al., 2002).
In the present study, decreased susceptibility to penicillin was closely
related to S. pneumoniae belonging to serotypes 14 (38.0% of PNSSP isolates and
74.3 % of all serotype 14 isolates) 6B (18.8% of PNSSP isolates and 75.0% of all
serotype 6B isolates), 23F (10.1% of PNSSP isolates and 51.2 % of all serotype
23F isolates), 9V (6.25% of PNSSP isolates and 52.0% of all serotype 9V isolates),
23B (5.77% of PNSSP isolates and 92.3% of all serotype 9V isolates), and 19F
(4.32% of PNSSP isolates and 18.4% of all serotype 19F isolates). These 6
serotypes together represented 86.1% of all the PNSSP isolates and, except for
serotype 23B, they are components of the 7-valent vaccine currently available for
children under two years of age. It is predictable that such vaccine would have an
impact in pneumococcal resistance in our population, in agreement with what was
verified by other authors that evaluated the effect of the conjugate vaccine on drug-
resistant pneumococci (Kyaw et al., 2006). Serotype 14 alone represented 80.3%
of the isolates presenting penicillin MICs ≥2.0 µg/ml. The emergence of resistant
128
isolates belonging to serotype 9V and exhibiting MICs ≥2.0 µg/ml to penicillin
during the second period of this study was noteworthy. Isolates of these two
serotypes were responsible by 95.1% of all isolates with penicillin MICs ≥2.0 µg/ml.
Serotype 14 and 9V were also strongly associated with resistance to ceftriaxone,
since these serotypes were detected in all isolates with ceftriaxone MICs ≥2ug/ml
(two and five isolates of serotypes 9V and 14, respectively). In contrast, isolates of
other relevant serotypes, such as 1, 3, and 18C were rarely resistant to penicillin or
other antimicrobial agents.
Considering the overall predominance of serotypes 6B and 14, and their
frequent association with resistance to penicillin, isolates of these two serotypes
were selected for studies of their genetic diversity by analysis of their chromosomal
DNA restriction profiles by PFGE. Also, as serotype 9V isolates expressing high
levels of resistance were found among isolates recovered in a more recent period,
and also taken into account the evidence of clonal relationship among isolates
expressing serotype 14 or serotype 9V (Coffey et al., 1999) isolates of serotype 9V
were also selected for PFGE experiments.
Serotype 6B isolates with different penicillin MICs (0.25 ug/ml , 0.12 ug/ml,
0.06, and <0.03ug/ml) were included in PFGE analysis. Most of them were
included in a major clonal complex (CC), arbitrarily named as Pen
6B
-B, apparently
composed by two subclusters, as represented in Fig 3. Although primarily
composed by penicillin-nonsusceptible isolates (about 86% of the serotype 6B
isolates included in this CC), this clonal complex also contained penicillin-
susceptible isolates. The results indicated the low genetic diversity among serotype
6B pneumococci circulating in Porto Alegre, for a considerable period of time,
129
regardless of penicillin susceptibility. Furthermore, the PFGE profiles found among
isolates composing the CC Pen
6B
-B were not related to the PFGE profiles of the
reference strains of three penicillin-resistant serotype 6B international clones
(Spain
6B
-2, South Africa
6B
-8 and Filand
6B
-12), included for comparative purposes.
Our observations suggest that clonal complex Pen
6B
-B may be endemic in Porto
Alegre city. Additionally, comparative studies with serotype 6B isolates from the
states of Rio de Janeiro and Sao Paulo are currently being performed in our
laboratories, and indicate the frequent occurrence of CC Pen
6B
-B in these other
Brazilian areas. Therefore, Pen
6B
-B may be a highly adapted clonal complex,
disseminated in different Brazilian areas. Brandileone et al.
2
(1998) also described
a CC observed in different Brazilian states, which was characterized by comprising
serotype 6B isolates presenting intermediate resistance to penicillin, recovered
from 1993 to 1996. This clonal group was also considered unique among isolates
from Brazil
2
and may correspond to the CC found in the present work. Studies are
currently in progress for further detailed characterization of CC Pen
6B
-B.
Another major CC, arbitrarily named as Pen
14
-H, was also found among the
serotype 14 isolates studied (Figure 5), being composed by PNSSP isolates.
Penicillin-resistant serotype 14 isolates from other Brazilian states, included for
comparative purposes, were also included in CC Pen
14
-H. PFGE profiles of
isolates composing this CC were also closely related to the PFGE profile of the
international clone Spain
9V
-3 reference strain. A few penicillin-resistant isolates
were included in other distinct CCs of lower frequencies (named as Pen
14
-A and
Pen
14
-I), while penicillin-susceptible serotype 14 isolates showed considerable
genetic diversity.
130
The genetic diversity of PNSSP belonging to serotype 14 isolated in Brazil
has been previously investigated. However, in contrast with our findings, serotype
14 isolates were found to present considerable genetic diversity in a nationwide
study and only 2 isolates with penicillin MIC ≥2.0 ug/ml, both from São Paulo city,
were recognized as belonging to the Spain
9V
-3 international clone (Brandileone et
al., 1998). In another study involving isolates from patients with meningitis in
Salvador, Northeast Brazil, serotype 14 isolates with intermediate resistance to
penicillin were shown to have similar profiles by BOX-PCR (Ko et al., 2000), but
recognition of international clones was not performed.
Our observations have several points in common with those resulting from
studies done with pneumococcal isolates from Argentina (Rossi et al., 1998) and
Uruguay (Camou et al. 1998), two countries located in the neighborhoods of Rio
Grande do Sul state. In both of these studies, isolates showing penicillin resistance
(MICs≥2.0 ug/ml) were included in a single major clone, which was found to be
identical to the Spain
9V
-3 clone. Additionally, in accordance with our results, an
inverse relationship between penicillin resistance and genetic diversity among
serotype 14 pneumococcal isolates was detected.
The occurrence of the Spain
9V
-3 clone, as the originally reported serotype
9V variant or as the serotype 14 variant, has already been documented in several
countries in Europe, Asia, North America and South America
(
www.sph.emory.edu/PMEN/). Considering this and our results indicating a rise in the
occurrence of penicillin-resistant serotype 9V, and especially the emergence of
high level resistance, in the period of 2000-2004, we have also included serotype
9V isolates in PFGE experiments. PFGE profiles of the serotype 9V PNSSP
131
isolates tested were highly related to those of serotype 14 isolates included in CC
Pen
14
-H, indicating that they also belong to the international clone Spain
9V
-3 (Fig.
6). These observations suggest that the Spain
9V
-3 clone was initially introduced in
the Porto Alegre area as a serotype 14 variant, and more recently both variants
(serotype 14 and serotype 9V) are circulating in that area. It is probable that
isolates expressing capsular type 9V have been introduced latter and became well
adapted in the region. Cefotaxime resistant isolates belonging to this clone and
expressing serotype 14, were previously described in Brazil (Castanheira et al.,
2003) and we observed that isolates of both serotypes 9V and 14, related to the
Spain
9V
-3 clone, showed resistance to another third generation cephalosporin,
ceftriaxone.
In order to confirm the identity of CC Pen
14
-H as belonging to the Spain
9V
-3
international clone, MLST experiments were performed with 9 representative
isolates. They all belonged to a single MLST profile (7, 11, 10, 1, 6, 8 e 1),
corresponding to ST 156, confirming the evidence of those isolates as being
related to the internationally spread Spain
9V
-3 clone.
In summary, the emerging and spread of antimicrobial resistance among S.
pneumoniae is a global problem and a matter of major concern, due to the high
morbidity and mortality still attributed to pneumococcal infections. Periodic
surveillance in different regions is important to base more adequate treatment and
prevention measures. In the present report we present data on antimicrobial
susceptibility and serotype distribution among pneumococcal isolates recovered
over a period of 10 years in a large metropolitan area in the South of Brazil. We
have documented the prevalence of 2 major clonal complexes among the
132
predominant serotypes that may be associated with the increasing occurrence of
penicillin resistance among S. pneumoniae in that area. One of these clonal
complexes was detected among serotype 14, and, more recently, also among
serotype 9V PNSSP isolates, and was identified as corresponding to the
international clone Spain
9V
-3. The other was a unique clonal complex, yet to be
further characterized, comprising a large proportion of serotype 6B isolates.
133
ACKNOWLEDGMENTS
This study was supported in part by Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Rio de Janeiro (FAPERJ), and Ministério da Ciência e Tecnologia
(MCT/PRONEX), Brazil. We thank Carlos Ausberto B. de Souza, and Filomena
Soares Pereira da Rocha of the Instituto de Microbiologia, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, for technical assistance. We also thank Alma Ruth Franklin, and
Terry Thompson of the Centers for Disease Control and Prevention for assistance
with serotyping.
134
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Table 1. Antimicrobial susceptibility among Streptococcus pneumoniae isolated in Porto Alegre city, South region of Brazil
(1995-2004).
Percentage of isolates/ Period of time
Antimicrobial agent
1995-1999
2000-2004
Total
(1995-2004)
S I R S I R S I R
Ceftriaxone
PSSP
1
PNSSP
2
Total
100
100
100
0
0
0
0
0
0
100
94.0
98.0
0
4.3
1.4
0
1.7
0.6
99.2
0.6
0.2
Ceftriaxone (meningitis)
PSSP
PNSSP
Total
100
93.5
98.7
0
6.5
1.3
0
0
0
100
60.7
86.9
0
33.3
11.1
0
6.0
2.0
93.8
5.4
0.8
Chloramphenicol
PSSP
PNSP
Total
99.5
97.8
99.2
-
-
0
0.5
2.2
0.8
97.4
99.1
98.0
-
-
0
2.6
0.9
2.00
98.7
-
1.3
Erythromycin
PSSP
PNSSP
Total
97.2
87.0
95.8
0
0
0
2.8
13.0
4.2
98.3
92.3
96.3
0.4
1.7
0.9
1.3
6.0
2.8
96.0
0.4
3.6
Penicillin
Total
81.0
17.5
1.5
66.7
17.9
15.4
74.9
17.7
7.4
Tetracycline
PSSP
92.7
0.8
6.5
85.0
0.9
14.1
141
PNSSP
Total
92.4
92.7
0
0.6
7.6
6.7
88.0
86.1
1.7
1.1
10.3
12.8
89.9
0.8
9.3
Vancomycin
PSSP
PNSSP
Total
100
100
100
0
0
0
0
0
0
100
100
100
0
0
0
0
0
0
100
100
100
0
0
1
PSSP, penicillin-susceptible Streptococcus pneumoniae.
2
PNSSP, penicillin-nonsusceptible Streptococcus pneumoniae.
142
142
Table 2. Distribution of serotypes among Streptococcus pneumoniae isolates
from Porto Alegre city, South region of Brazil (1995-2004)
Percentage of isolates/Period of time
Serotype
1995-1999
2000-2004
Total
(1995-2004)
Vaccine types
1
a
2.68 3.13 2.94
3
a
6.13 4.56 5.23
4
a b
0.77 1.42 1.14
5
a
2.30 0.28 1.14
6B
a b
12.6 5.41 8.50
7F
a
0 1.99 1.14
8
a
0.38 1.71 1.14
9N
a
0.38 2.85 1.80
9V
a b
1.15 6.27 4.08
10A
a
1.91 0.85 1.31
11A
a
4.21 4.27 4.25
12F
a
0 0.57 0.33
14
a b
14.6 19.4 17.3
15B
a
3.83 0.57 1.96
17F
a
1.53 0 0.65
18C
a b
2.68 3.70 3.27
19A
a
2.68 1.99 2.29
19F
a b
6.90 8.83 8.01
20
a
0.77 0.57 0.65
22F
a
2.68 1.14 1.80
23F
a b
7.28 6.27 6.70
Total 75.5 75.8 75.7
Vaccine-related types
6A
a b
4.21 4.56 4.41
7C
a
1.15 1.14 1.14
15A
a
0.77 1.71 1.31
15C
a
2.70 0.85 1.63
15F
a
0 0.57 0.33
18F
a b
0 1.99 1.14
19C
a b
0.38 0.57 0.49
23B
a b
3.45 1.14 2.12
Others
c
0.38 1.99 1.31
Total 13.0 14.5 13.9
143
143
Vaccine-unrelated types
13 2.30 2.56 2.45
16F 1.53 1.99 1.80
21 0.77 0 0.33
24F 0 0.85 0.49
28A 2.58 0 1.14
29 0.38 0.28 0.33
31 0 0.57 0.33
34 1.91 0.57 1.14
35B 0.77 0.28 0.49
35F 0 1.13 0.65
Others
d
0.77 0.57 0.65
Total 11.1 8.83 9.80
Nontypeable 0.38 0.85 0.65
Total
100.0
100.0
100.0
a
Serotypes included in (or related to) the 23- valent vaccine.
b
Serotypes included in (or related to) the 7- valent vaccine.
C
Includes one each of serotypes 7A, 7B, 10C, 11D, 12B, 18A, 18B, and 23A.
d
Includes one of each serotypes 24B, 28F, 35A, and 40.
144
144
Figure 1. Probable events related to the introduction and dissemination of international
clone Spain
9V
-3 in Porto Alegre, RS, Brazil.
Brazil
Argentina
Uruguay
Porto Alegre
Brazil
Argentina
Uruguay
Porto Alegre
1. Introduction of penicillin resistant Spain
9V
-3 clone (as
serotype 14 variant) to Uruguay and Argentina
2. Dissemination of the clone Spain
9V
-3 to the Southern
region of Brazil and increase in penicillin resistance
3. Emergence of 9V variant of the same clone
145
145
Figure 2. Penicillin resistance among the 15 most frequent serotypes of Streptococcus
pneumoniae from Porto Alegre, Brazil, in two periods of time (1995-1999 and 2000-2004).
0
5
10
15
20
1 3 6A 6B 9N 9V 11A 13 14 18C 19A 19F 22F 23B 23F
Susceptible Intermediate Resistant
0
5
10
15
20
1 3 6A 6B 9N 9V 11A 13 14 18C 19A 19F 22F 23B 23F
Susceptible Intermediate Resistant
1995-1999
2000-2004
146
146
Figure 3. PFGE fragmentation profiles obtained after SmaI digestion of chromosomal DNA
of serotype 6B Streptococcus pneumoniae isolates from Porto Alegre, RS, Brazil
Sp936
Sp966
Sp1036
Sp986
Sp1029
Sp924
Sp928
Sp929
Sp953
Sp1037
Sp942
Sp1026
Sp927
Sp932
Sp1002
Sp930
Sp955
Sp917
1009080706050
147
147
Figure 4. PFGE profiles representative of clonal complex Pen
6B
-B, obtained after SmaI
digestion of chromosomal DNA of penicillin-resistant serotype 6B Streptococcus
pneumoniae isolates from Porto Alegre, RS, Brazil.
MM: molecular mass; 1-6: Pen
6B
- B
48.5
145.5
242.5
Kb
MM 1 2 3 4 5 6
Pen
6B
-B
148
148
Figure 5. PFGE fragmentation profiles obtained after SmaI digestion of chromosomal DNA
of serotype 14 Streptococcus pneumoniae isolates from Porto Alegre, RS, Brazil.
Sp995
Sp996
Sp979
Sp 1101
Sp775
Sp1025
Sp886
Sp933
Sp1022
Sp1010
Sp1001
Sp985
Sp1040
Sp947
Sp997
Sp948
Sp967
Sp1003
149
149
Figure 6. A. PFGE fragmentation profiles most frequently found among serotypes 9N, 9V,
and 14 Streptococcus pneumoniae isolates from Porto Alegre, Brazil, and comparison with
PFGE profile of the internationally spread clone Spain
9V
-3.
B. Dendrogram resulting from computer assisted analysis of profiles in panel A.
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Sp 1654
Sp 1922
CDC 19
5
Sp 1596
Sp 1883
Sp 1608
Sp 858
Sp 1735
Sp 1570
Sp 1575
Sp 1726
Sp 1767
Sp 60
100908070605040
Lines 1 and 15, Molecular Mass 100kb; 2, Sp 1570 (St 14, PnR); 3, Sp 1575 (St
14, PnS); 4, Sp 1726 (St 9N, PnS); 5, Sp 1767 (St 9N, PnS); 6, Sp 60 (St 9N,
PnR); 7, CDC 195 (Spain
9V
-3); 8, Sp 1654 (St 14, PnR, clone PenH); 9, Sp 1922
(St 14, PnR, clone PenH); 10, Sp 1608 (St 14, PnR, clone PenH); 11, Sp 858 (St
9V, PnR); 12, Sp 1735 (St 9V, PnR); 13, Sp 1596 (St 9V, PnR); 14, Sp 1883 (St
9V, PnS). Abbreviations: St (serotype); PnS (penicillin susceptible); PnR (penicillin
resistant)
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145.5
242.5
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150
150
Manuscrito 2
Mendonça-Souza, C.R.V.; Carvalho, M.G.S.; Barros, R.R.; Dias, C.A.; Sampaio,
J.L.M.; Castro, A.C.D.; Facklam, R.R. & Teixeira, L.M. 2004. Occurence and
characteristics of erythromycin-resistant Streptococcus pneumoniae strains isolated in
three major Brazilian states. Microbial Drug Resist. 10: 313-320.
151
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157
158
158
159
159
Manuscrito 3
Dias, C.A.G.; Agnes,
G.;
Frazzon, A.P.G.; Kruger,
F.D.; d'Azevedo, P.A.; Carvalho,
M.G.; Facklam, R.R.; & Teixeira, L.M. 2007. Diversity of mutations in the atpC gene
coding for the c subunit of F
0
F
1
ATPase in clinical isolates of optochin-resistant
Streptococcus pneumoniae from Brazil. J. Clin. Microbiol. 45: 3065-3067.
160
160
161
161
162
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163
163
Manuscrito 4
Dias, C.A.G.; Teixeira, L.M.; Carvalho, M.G. & Beall, B. 2007. Sequential multiplex PCR
scheme for determining capsular serotypes of pneumococci recovered from Brazilian
children. J. Med. Microbiol. 56: 1185-1188.
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