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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA
ATIVIDADE DO ÓLEO-RESINA DE Copaifera reticulata Ducke NO CRESCIMENTO
MICELIAL IN VITRO DE FITOPATÓGENOS
CHRISTIAN NERI LAMEIRA
BELÉM
2007
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA
ATIVIDADE DO ÓLEO-RESINA DE Copaifera reticulata Ducke NO CRESCIMENTO
MICELIAL IN VITRO DE FITOPATÓGENOS
CHRISTIAN NERI LAMEIRA
Dissertação apresentada à Universidade Federal Rural
da Amazônia, como parte das exigências do Programa
de Pós-Graduação em Agronomia, área de
concentração Produção Vegetal, para obtenção do título
de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Benedito Gomes dos Santos Filho
BELÉM
2007
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA
ATIVIDADE DO ÓLEO-RESINA DE Copaifera reticulata Ducke NO CRESCIMENTO
MICELIAL IN VITRO DE FITOPATÓGENOS
CHRISTIAN NERI LAMEIRA
Dissertação apresentada à Universidade Federal Rural
da Amazônia, como parte das exigências do Programa
de Pós-Graduação em Agronomia, área de
concentração Produção Vegetal, para obtenção do título
de Mestre.
Aprovado em março de 2007
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________________________
Prof. Dr. Benedito Gomes dos Santos Filho
Orientador
Universidade Federal Rural da Amazônia – UFRA
________________________________________________________________
Dra. Célia Regina Tremacoldi
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA
________________________________________________________________
Prof. Dra. Maria das Graças Bichara Zoghbi
Museu Paraense Emílio Goeldi – MPEG
________________________________________________________________
Prof. Dr. Hugo Alves Pinheiro
Universidade Federal Rural da Amazônia – UFRA
4
A Deus, pela existência do ser.
Aos meus avós, ANTONIO (in memorian) e BENEDITA (in memorian).
Aos meus pais, OSMAR e IRIA.
À minha esposa, KELY.
Aos meus filhos, HENRY e CHRISTINE,
Que com amor e sabedoria contribuíram para a
Conquista deste curso.
DEDICO
Fonte: LAMEIRA, Christian Neri. Atividade do Óleo-Resina de Copaifera reticulata
Ducke no Crescimento Micelial In Vitro de Fitopatógenos. 2007. 36f. Dissertação
(Mestrado em Agronomia) – Universidade Federal Rural da Amazônia, Belém, 2007.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida, família, força e esperança que me impulsionou até o final desta jornada.
Ao pesquisador Dr. Osmar Lameira, pela dedicação e incentivo à realização desta pesquisa.
Aos amigos Dr. Luis Poltronieri, Carmem, Zé Maria, Nonato, “Tia” Regina, Gorette e Dra.
Célia que durante a formulação deste trabalho partilharam comigo das dificuldades e
conquistas.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Benedito Filho, que acreditou no êxito do trabalho.
Ao CNPq, por financiar meu projeto de pesquisa, à Universidade Federal Rural da Amazônia,
pela oportunidade para realização do Mestrado e à Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária, por permitir o uso de suas instalações.
Às instituições e fontes de informações que subsidiaram todo o conteúdo desta pesquisa. Aos
profissionais envolvidos direta ou indiretamente em minha pesquisa que compartilharam
comigo a realidade e alegrias existentes na vida profissional, fazendo-me saber a importância
de acreditar em um futuro melhor.
À minha família e a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a realização
deste trabalho.
Fonte: LAMEIRA, Christian Neri. Atividade do Óleo-Resina de Copaifera reticulata
Ducke no Crescimento Micelial In Vitro de Fitopatógenos. 2007. 36f. Dissertação
(Mestrado em Agronomia) – Universidade Federal Rural da Amazônia, Belém, 2007.
6
Corra, não pare, não pense demais
Repare essas velas no cais
Que a vida é cigana
É caravana ...
(G. Azevedo/ A. Valença)
... Não sei dizer!
As coisas já não são como deviam ser,
Não tente esconder
A realidade todos tem que perceber
Quanto mais eu me pergunto
Há mais questões a responder ...
(B. Marley – Versão: Fauzi Beydoun)
Fonte: LAMEIRA, Christian Neri. Atividade do Óleo-Resina de Copaifera reticulata
Ducke no Crescimento Micelial In Vitro de Fitopatógenos. 2007. 36f. Dissertação
(Mestrado em Agronomia) – Universidade Federal Rural da Amazônia, Belém, 2007.
7
RESUMO
Entre as inúmeras espécies vegetais da flora brasileira com ação medicinal e que apresentam
substâncias químicas biologicamente ativas, cita-se o gênero Copaifera, e onde se encontra a
Copaifera reticulata Ducke, descrita como tendo propriedades fungicidas, entre outras. A
presença de espécies fúngicas patógenas em vegetais é de extrema importância econômica,
pois resulta em indesejável redução na qualidade da produção vegetal. Espécies como
Curvularia sp, Cylindrocladium sp, Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid, Pestalotia sp,
Phytophthora palmivora (Butler) Butler, Rhizoctonia solani Kühn, Sclerotium coffeicola,
Sclerotium rolfsii Sacc e Thielaviopsis sp., causam diversas doenças nos vegetais. Na tentativa
de minimizar a toxidez de agentes químicos sintéticos, se faz necessário encontrar alternativas
para diminuir ou mesmo inibir a ação desses patógenos por meio de controle biológico,
utilizando os compostos químicos extraídos das plantas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a
atividade do óleo-resina de Copaifera reticulata no crescimento micelial in vitro de
fitopatógenos. O óleo-resina de C. reticulata foi incorporado ao meio BDA sintético
previamente autoclavado a 120°C a uma atm por 20 min, nas proporções (v/v) de 0,1%, 0,2%,
0,25%, 0,5% e 0,75% e vertida em placa de petri. A testemunha continha apenas meio BDA
sintético. Após solidificação do meio, foi inserido um disco de 3 mm de diâmetro contendo
micélio dos fitopatógenos no centro da placa e mantidas a 25°C. Mediu-se o diâmetro das
colônias em cm em determinados intervalos de tempo. O óleo-resina de C. reticulata Ducke
foi eficiente na inibição do crescimento micelial dos fitopatógenos dos gêneros estudados. R.
solani, Pestalotia sp, P. palmivora, Curvularia sp, S. rolfsii e S. coffeicola foram os que
apresentaram maior sensibilidade aos efeitos do óleo-resina.
Palavras-chave: Copaifera reticulata Ducke, fitopatógeno, controle biológico.
8
ABSTRACT
Among the countless vegetable species of the Brazilian flora with medicinal action and that
they present chemical substances biologically active, it is the gender Copaifera, where it the
Copaifera reticulata Ducke. Described as tends fungicidal properties. Presence of species
fungycs pathogens in vegetables is of extreme economical importance, because it results in
undesirable reduction in the quality of the vegetable production. Species as Curvularia sp,
Cylindrocladium sp, Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid, Pestalotia sp, Phytophthora
palmivora (Butler) Butler, Rhizoctonia solani Kühn, Sclerotium coffeicola, Sclerotium rolfsii
Sacc and Thielaviopsis sp., they cause several diseases in the vegetables. In the attempt of
minimizing the synthetic chemical agents' toxic, it is done necessary to find alternatives to
decrease or even to inhibit the action of those pathogens through biological control, using the
extracted chemical compositions of the plants. The objective of this work was to evaluate the
activity of the oil-resin of C. reticulata Ducke in the growth phitopatogen in vitro. The C.
reticulata oil-resin was previously incorporated middle synthetic BDA autoclaving to 120°C
to one atm for 20 min, in the proportions of 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,5% and 0,75% and flowed
in petri plate. The witness just contained middle synthetic BDA. After solidifing of the
middle, a disk of 3 mm diameter was inserted containing micelial of the phitopatogen in the
center of the plate and maintained to 25°C. The diameter of the colonies was measured in cm
in certain intervals from days. The oil-resin of C. reticulata was efficient in the inhibition of
the growth micelial of phitopatogen studied. R. solani, Pestalotia sp, P. palmivora,
Curvularia sp, S. rolfsii and S. Coffeicola they were the ones that they presented larger
sensibility to the effects of the oil-resin.
Keywords: Copaifera reticulata Ducke; phitopatogen; biological control
9
SUMÁRIO
P
1
INTRODUÇÃO ..................................................................................................
12
2
REVISÃO DA LITERATURA .........................................................................
15
2.1 ASPECTOS ETNO-BOTÂNICOS DE Copaifera reticulata Ducke ................... 15
2.2 FITOPATÓGENOS COM IMPORTÂNCIA AGRONÔMICA .......................... 16
2.3 INIBIÇÃO MICELIAL DE FITOPATÓGENOS TRATADOS COM
PLANTAS MEDICINAIS ....................................................................................
17
3
MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................
19
3.1 CONDIÇÕES DO EXPERIMENTO ................................................................... 19
3.2 MATERIAL UTILIZADO ................................................................................... 19
3.2.1 Inibição do Crescimento Micelial In Vitro de Fitopatógenos por Óleo-Resina
de C. reticulata Ducke ..........................................................................................
20
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................
22
4.1 INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO MICELIAL IN VITRO DE
FITOPATÓGENOS POR ÓLEO-RESINA DE C. reticulata DUCKE ...............
22
5
CONCLUSÕES....................................................................................................
29
6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................
30
10
LISTA DE TABELAS
P
Tabela 1 Crescimento (cm) micelial in vitro de fitopatógenos em meio de cultura
BDA sintético tratados com óleo-resina de C. reticulata
22
Tabela 2 Inibição do crescimento (%) micelial in vitro de fitopatógenos em meio
de cultura BDA sintético tratados com óleo-resina de C. reticulata
Ducke.
23
Tabela 3 Crescimento (cm) micelial in vitro de fitopatógenos em meio BDA
sintético tratados com óleo-resina de C. reticulata nas concentrações de
0,25 e 0,5%.
23
Tabela 4 Inibição do crescimento (%) micelial in vitro de fitopatógenos em meio
BDA sintético tratados com óleo-resina de C. reticulata nas
concentrações de 0,25 e 0,5%.
24
Tabela 5 Crescimento (cm) micelial in vitro de espécies fúngicas em meio de
cultura BDA sintético tratados com óleo-resina de C. reticulata Ducke
na concentração de 0,5%.
24
Tabela 6 Inibição do crescimento (%) micelial in vitro de espécies fúngicas em
meio de cultura tratado com óleo-resina de C. reticulata na
concentração de 0,5%.
25
11
LISTA DE FIGURAS
P
Figura 1 Óleo-resina de Copaifera reticulata Ducke 19
Figura 2 Crescimento micelial in vitro de S. coffeicola em meio de cultura
BDA sintético tratado com óleo-resina de C. reticulata Ducke nas
concentrações de 0,25 e 0,5%.
26
Figura 3 Crescimento micelial in vitro de Curvularia sp em meio de cultura
BDA sintético tratado com óleo-resina de C. reticulata Ducke nas
concentrações de 0,25 e 0,5%.
26
Figura 4 Crescimento micelial in vitro de P. palmivora em meio de cultura
BDA sintético tratado com óleo-resina de C. reticulata Ducke nas
concentrações de 0,25 e 0,5%.
27
12
1. INTRODUÇÃO
A Amazônia brasileira, com extensão de 4.872.000 Km
2
, ocupa 57% do território
brasileiro e se caracteriza pela presença da floresta pluvial ou Hiléia, ocorrendo, no entanto,
os campos de várzeas, além das florestas não hileianas (FALESI, 1992). Entre as inúmeras
espécies vegetais da flora brasileira com ação medicinal e que apresentam substâncias
químicas biologicamente ativas, cita-se o gênero Copaifera, compreendendo diversas espécies
produtoras de um óleo-resina extraído do tronco das árvores de grande porte, que podem
atingir até 40 m de altura (VEIGA Junior e PINTO, 2002). Dentre as inúmeras espécies que
compõem o gênero Copaifera, esta a Copaifera reticulata Ducke, encontrada principalmente
na Amazônia e na região nordeste do Brasil.
Desde que o homem começou a cultivar plantas para sua alimentação, deu-se
início um processo de desequilíbrio no ambiente de cultivo, que de certa forma favorece o
surgimento de pragas e doenças (INNECCO, 2006). De uma maneira geral, as doenças
causadas por fitopatógenos são provocadas principalmente por fungos, bactérias, nematóides
e vírus, que além de provocarem perdas nas fases de pré e pós-colheita, depreciam a qualidade
dos frutos, prejudicando a sua aparência e/ou alterando suas características físicas e químicas
(JUNQUEIRA et al., 2006).
Fungos como os do gênero Rhizoctonia (Kühn), apresentam ampla gama de
espécies hospedeiras (SNEH et al., 1991), sendo uma das principais causadoras de podridões
radiculares e do tombamento de plântulas em geral, tanto em climas temperados como
tropicais (WEBSTER e GUNELL, 1992). Áreas altamente infestadas por fungos do gênero
Sclerotium podem ficar comprometidas para o cultivo de muitas culturas (PUNJA e
GROGAN, 1981), pois ocasionam podridão do colo em feijoeiro, Phaseolus vulgaris L., por
exemplo (BLUM et al., 2003). O fitopatógeno Macrophomina phaseolina (Tass.) Goid., é
uma espécie de fungo relatado em mais de 500 espécies vegetais, causando prejuízos a
culturas em condições de clima seco e quente (VIVAS e BARROS, 1992), podendo causar a
podridão seca do colmo no sorgo, Sorghum spp (FERREIRA e CASELA, 2003). Fungos do
gênero Cylindrocladium são responsáveis pela formação da pinta-preta em folhas adultas da
erva-mate (KIMATI et al., 1997b) assim como pela mancha foliar em Eucaliptus sp
(KRÜGNER et al., 1990). Fungos do gênero Phytophthora são responsáveis pela gomose-de-
phytophthora (VIANA et al., 2004) e pela podridão das raízes e dos frutos do mamoeiro
(Carica papaya L.), especialmente nas regiões onde ocorrem altas precipitações
13
pluviométricas e solos mal drenados (SILVA E DOIHARA, 2003). O gênero Curvularia
possui espécies importantes que podem causar manchas foliares, podridões de raízes e de
colo, além de murchamento das plantas, conforme a espécie patogênica e o hospedeiro
envolvido (KRUPPA e RUSSOMANNO, 2006). Fitopatógenos do gênero Thielaviopsis
limitam o cultivo de alface, Lactuca sativa L., no verão, pois causa murchadeira na mesma
(SALA et al., 2007). O fitopatógeno do gênero Pestalotia está associado à podridão dos frutos
do mamoeiro pós-colheita (PERES et al., 2000).
A agricultura moderna baseou-se no uso indiscriminado de agentes químicos no
combate de pragas e fungos, colocando em risco o meio ambiente. Os diversos métodos de
controle disponíveis, especialmente o controle químico apresentam problemas quanto à
eficiência, custo e impacto negativo ao meio ambiente (HOOKER, 1980). No entanto, a
grande preocupação com o meio ambiente tem levado inúmeros pesquisadores a buscarem
alternativas viáveis, efetivas e seguras no controle de pragas e doenças que acometem culturas
de plantas de interesse comercial (KIMATI et al., 1997a). Assim, o uso de compostos
químicos extraídos das plantas, caracteriza uma proposta praticamente inofensiva ao meio
ambiente (STANGARLIN et al.,1999).
A produção de substâncias bioativas pelas plantas ocorre através de diferentes vias
metabólicas, gerando grande número de compostos, muitos dos quais somente identificados
em determinados grupos de plantas e em concentrações variáveis (MARCANO et al., 2005).
Souza et al. (2006a), em seus estudos com extrato de cravo da índia, Syzygium aromaticum L.,
em concentrações de 500, 750, 1000, 2000 e 3000 ppm, determinaram que as concentrações
de 2000 e 3000 ppm inibiram em 100% o crescimento micelial dos fitopatógenos testados.
Costa et al. (2006), em suas avaliações in vitro de óleos essenciais de Piper aduncum e Piper
hispidinervium verificaram a inibição do crescimento micelial de Rhizoctonia zeae em
89,88% e 100%, respectivamente.
Das utilidades destinadas à árvore de copaíba destacam-se: o uso de seu tronco
pela indústria madeireira e do óleo-resina para fins medicinais e cosméticos (NELSON, 1987;
CARVALHO, 1994). Sua utilização pela industria madeireira ocorre em função de
características como alta resistência a ataque de fungos xilófagos, baixa permeabilidade, e alta
durabilidade da madeira, que também apresenta superfície lisa e lustrosa, e uma textura média
e uniforme (CARVALHO, 1994).
Foram relacionadas ao óleo-resina de C. reticulata atividades, bactericida,
antiinflamatória, gastroprotetora, antitumoral, tripanossomicida e larvicida, contra Culex
quinquefasciatus Say (CASCON et al., 2000; SILVA et al., 2003), muitas substâncias foram
14
identificadas, onde observa-se na composição química a presença de sesquiterpenos, como
por exemplo β-cariofileno e β-bisaboleno (OLIVEIRA et al, 2006b). segundo Veiga Jr. e
Pinto (2002), o β-bisaboleno possui propriedades antiinflamatória e analgésica e o β-
cariofileno é descrito como anti-endêmico, antiinflamatório, bactericida e insetífugo.
Veiga Jr. e Pinto (2002), avaliando as pesquisas realizadas com óleo-resina de
copaíba, citam seu uso como antimicrobiano, anti-séptico, antifúngico, entre outros, que pode
ser uma alternativa para o controle biológico de fitopatógenos. Estudos com óleo de copaíba,
demonstraram que a mesma apresenta grande potencial antifúngico, pois inibe eficientemente
o crescimento micelial in vitro de fitopatógenos (OLIVEIRA et al., 2006c).
O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade do óleo-resina de C. reticulata
Ducke no crescimento micelial in vitro de fitopatógenos, dos gêneros Cylindrocladium,
Rhizoctonia, Macrophomina, Pestalotia, Phytophthora, Sclerotium, Curvularia e
Thielaviopsis.
15
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. ASPECTOS BOTÂNICOS DE Copaifera reticulata Ducke
O gênero Copaifera pertence à família Leguminosae-Caesalpinoidae, sendo
caracterizado principalmente por árvores de folhas com raque-alado, alternas, compostas,
contendo de dois a seis pares de folíolos, inflorescência espiciforme, frutos tipo legumes
deiscentes com 3,5 a 4,0 cm de diâmetro, ovóides e com uma única semente envolvida por um
arilo amarelo (ALMEIDA, 1998; PINTO et al., 2000).
O óleo-resina é extraído do tronco das árvores de diversas espécies do gênero,
sendo conhecido popularmente como óleo ou bálsamo de copaíba (MACIEL et al., 2002).
Barata (1997) caracterizou o óleo-resina de copaíba como proveniente da decomposição das
paredes das células no interior do tronco da árvore. Os canais secretores acham-se na região
cortical dos caules, porem dispostos de modo que se prolonguem até o lenho, onde existem
em notável abundância, formando bolsas. Os canais de uma zona não possuem comunicação
entre si, levando os extrativistas a coletar o óleo em diversos pontos, tornando-a incapaz de
produzir óleo por longo período (CORRÊA, 1984).
O óleo-resina de copaíba é um líquido translúcido e consistente que difere de cor
conforme a espécie, variando do amarelo-claro ao marrom, sabor amargo e odor aromático,
insolúvel em água e parcialmente solúvel em álcool (DUCKE, 1939). PIO (1931), relatou que
uma única árvore pode gerar até 40 ou 50 litros de óleo por ano, apesar de nem todas as
espécies serem capazes de produzir esta quantidade.
Segundo Lawrence (1980), uma das espécies botânicas do gênero Copaifera mais
freqüentemente usadas na obtenção do óleo-resina de copaíba é a C. reticulata, com 70% de
utilização sobre as demais espécies, podendo seu óleo ser encontrado à venda em feiras livres,
mercados-populares, ervanários e farmácias de produtos naturais de todo país.
A coleta do óleo-resina de C. reticulata ainda é feita de maneira bastante
rudimentar, sem considerar nenhum critério (LAMEIRA et al., 2006). No processo de
extração do óleo-resina não é considerado o período mais apropriado do ano, normalmente o
coletor o faz em qualquer época não levando em consideração fatores climáticos, como à
precipitação pluviométrica, que na Amazônia está diretamente relacionada com a produção de
várias culturas (OLIVEIRA et al., 2006b).
16
2.2. FITOPATÓGENOS COM IMPORTÂNCIA AGRONÔMICA
Segundo Monteiro e Barreto (2002), o fitopatógeno Curvularia andropogonis é o
agente etiológico da queima em capim-limão, Cymbopongo citratus (DC.) Stapf; Curvularia
senegalensis causa mancha foliar em pupunheira, Bactris gasipaes Kunth, e palmeira real,
Archontophoenix sp (SANTOS et al., 2003). Curvularia lunata é o agente responsável pela
queima foliar em Zoysia japonica Steud., grama-esmeralda (NECHET e HALFELD-VIEIRA,
2005).
O fitopatógeno Cylindrocladium pteridis é o agente causador da mancha foliar na
palmeira rabo-de-peixe - Caryota mitis Loureiro (COELHO Netto et al., 2003), e no abricó –
Mammea americana L. (POLTRONIERI et al., 2004), Cylindrocladium floridanum é
responsável pela podridão peduncular no coco, Cocos nucifera L. (POLTRONIERI et al.,
2003) e Cylindrocladium spathulatum pela mancha foliar em Eucaliptus sp (KRÜGNER et
al., 1990).
O fitopatógeno M. phaseolina (Tassi) Gold, é responsável pela podridão cinzenta
em caule de feijão-caupi, Vigna unguiculata (L.) Walp. (BRAGA et al., 2003), podridão em
raízes de milho, Zeae may (FERNANDES et al., 2002), e pela podridão seca do colmo no
sorgo, Sorghum spp (FERREIRA e CASELA, 2003).
O fitopatógeno do gênero Pestalothia está associado à podridão dos frutos do
mamoeiro pós-colheita (PERES et al., 2000), assim como em sementes de mamona
(ZARELA et al., 2004).
Phytophthora palmivora (Butl.) Butler é o agente causal da podridão de frutos do
mamoeiro, Carica papaya L. (TRINDADE e POLTRONIERI, 2002) e na podridão de estipe
de pupunheira, B. gasipaes (SANTOS et al., 2004), assim como podridão-parda em cacaueiro,
Theobroma cacao L. (FALEIRO et al., 2004).
A espécie Rhizoctonia solani causa doença relevante no cultivo de Pinnus spp
(FERREIRA et al., 2005), sendo uma das principais causadoras de podridões radiculares e no
tombamento de plântulas em geral (WEBSTER e GUNELL, 1992). Segundo Nechet e
Halfeld-Vieira (2006), R. solani é o agente etiológico da mela em melancia [Citrullus lanatus
(Thunb.) Matsum & Nakai].
Sclerotium rolfsii (Sacc), causa podridão da região do colo do feijoeiro, Phaseolus
vulgaris L., com formação de um micélio branco de aspecto cotonoso nas regiões atacadas e
na superfície do solo (BLUM et al., 2003; DANTAS et al., 1999), sendo responsável também
pela murcha de esclerócio em pimentão, Capsicum annum L., em regiões tropicais (SERRA e
17
SILVA, 2005). Segundo Ghini et al. (1997), S. rolfsii pode ocasionar mancha e podridão de
raízes em uma diversa gama de hospedeiros, por outro lado Sclerotium coffeicola causa
mancha zonada em graviola, Annona muricata L. (LEDO et al.,1997).
A podridão negra da raiz ocasionada pelo fitopatógeno do gênero Thielaviopsis,
está muito distribuída em diversas culturas como hortaliças, frutíferas e plantas ornamentais,
como também no escurecimento parcial da polpa de cupuaçu. (AGRIOS, 1985;
VENEZUELA, 1999).
2.3. INIBIÇÃO MICELIAL DE FITOPATÓGENOS TRATADOS COM PLANTAS
MEDICINAIS
Trabalhos conduzidos por Souza et al. (2006a), utilizando extrato aquoso da gema
floral do cravo da índia, S. aromaticum (L.) Merr. & Perry, adicionados ao meio BDA
fundente nas concentrações de 2000 e 3000 ppm inibiram em 100% o crescimento micelial de
Colletotrichum gloeosporioides Penz, fungo responsável pela antracnose em coco e varicela
em manga, abacate e mamão (SILVA et al., 2006). Fecury et al. (2006a), testando o óleo
essencial de P. aduncum e Copaifera sp em condições de campo e Fecury et al. (2006b),
analisando o óleo essencial de P. hispidinervium e Copaifera sp, também determinaram à
eficiência na inibição do crescimento micelial do fungo C. gloeosporioides.
Extrato aquoso de folhas e ramos de pitangueira, Eugenia uniflora L., utilizado por
Milanesi et al (2006a), e extrato aquoso de primavera, Bougainvilea spectabilis, usado por
Milanesi et al. (2006b) em concentrações de 3, 5, 7, 10, 15, 20 e 30%, adicionadas ao meio
BDA previamente fundido a 120°C, 1 atm por 20 min e vertidas em placas de petri, reduziram
em 62,9%; 55,4%; 65,3%; 63,6%; 67,8% e 66,2%, respectivamente, o tamanho (cm) das
colônias de Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magn.) Scrib, que segundo Marin et al.
(2003), é agente causal da antracnose do feijoeiro comum.
Estudos realizados por Maia et al. (2006) e Freitas et al. (2006), com o extrato
aquoso de Icthyothere cunabi Mart. em concentrações de 20, 25 e 50% adicionados ao meio
BDA fundente, determinaram sua ação antifúngica para Alternaria cichorii e P. capsici. O
fitopatógeno A. cichorii é o agente da mancha e queima foliar em chicória, Cichorium endivia
(LIMA et al., 2003).
Testes realizados por Marcano et al. (2005), com extrato de Ricinus communis L.,
Ocimum basilicum L. e Allium sativum L. em concentrações de 5 e 30 gL
-1
vertido em meio
18
líquido BD (batata-dextrose) determinaram sua ação fungicida contra Thielaviopsis basicola
(Berk & Broome) Ferraris; fungo causador da murchadeira em alface, Lactuca sativa L.
(SALA et al., 2007).
Cunico et al. (2004), em seus estudos com extrato aquoso das folhas de Ottonia
martiana Miq. em concentrações de 0,102 e 0,204 mg.mL
-1
em meio de cultura BDA
apresentaram inibição do crescimento micelial superior a 50%; Costa et al. (2006), em
análises com P. aduncum e P. hispidinervium, em concentrações de 500 e 1000 ppm
adicionados ao meio BDA apresentaram inibição de 89,88 e 100% do crescimento micelial do
fitopatógeno do gênero Rhizoctonia, observando que as mesmas apresentam potencial
antifúngico sobre o controle do fungo.
O uso de extrato aquoso e do óleo essencial de P. aduncum por Castro et al.
(2006), nas concentrações de 25 e 50% adicionados ao meio BDA previamente fundido,
incubado a 25°C e fotoperíodo de 12h, provocaram redução de 27 e 55% no crescimento
micelial de Phytophthora capsici, fitopatógeno responsável pela requeima do pimentão
(NASCIMENTO et al., 2007).
Na avaliação do óleo essencial de P. aduncum, na concentração de 0,5% vertidos
em meio de cultura BDA fundente, observou-se total inibição do crescimento micelial de
Curvularia lunata, Bastos e Benchimol (2006), concluíram que P. aduncum L. é um potencial
agente alternativo no controle do fungo estudado.
Tratamentos com o óleo de nim, Azadiracta indica Juss., diminuem o poder
germinativo do crescimento de fungos em grãos de soja, Glycine max (L.) Merr., com 14% de
teor de água (RANGEL et al., 2006).
Singh et al. (1980), em seus estudos com óleo de nim, Souza et al. (2006a), com o
extrato do cravo da índia em concentrações de 2000 e 3000 ppm vertidos em meio BDA e
Souza et al. (2006b), em testes realizados com P. aduncum e P. hispidinervium, nas
concentrações de 200 e 1000 ppm adicionados ao meio BDA previamente fundido,
respectivamente, inibiram completamente o crescimento micelial de S. rolfsii.
Trabalhos conduzidos por Oliveira et al. (2006a), em testes in vitro com óleo-
resina de Copaifera sp na concentração de 250 ppm; Dhingra et al. (2004) utilizando óleo
essencial de mostarda na concentração de 50 ppm; Silva et al. (2005), com extrato bruto de
sucupira, Pterodon emarginatus (Vog.) na concentração de 1% de extrato mais o meio BDA
apresentando inibição do crescimento micelial de 62%; Amaral e Bara (2005), com extrato
etanólico de açafrão, Curcuma longa (L.) e Guedes et al. (2006), com extrato aquoso de I.
19
Cunabi Mart. na concentração de 50%, demonstraram a eficiência na inibição do crescimento
micelial de R. solani.
Cunico et al. (2002) em suas avaliações com extrato etanólico de Maytenus
ilicifolia (Mart.) ex Reiss., demonstraram que no bioensaio com CCD (cromatografia de
camada delgada) a presença de frações bem definidas que causaram inibição do
desenvolvimento do fungo do gênero Cylindrocladium.
Schwan-Estrada et al. (1997), demonstraram em testes com Baccharis trimera e
Ruta graveolens, possuem um grande potencial fungicida contra o fungo P. palmivora.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 – CONDIÇÕES DO EXPERIMENTO
O trabalho foi realizado no Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Amazônia
Oriental, Belém, Pará, utilizando espécies fúngicas fitopatógenas cultivadas em meio de
cultura BDA (batata, dextrose e Agar) sintético e óleo-resina de Copaifera reticulata (Ducke),
no período de março a novembro de 2006.
3.2 – MATERIAL UTILIZADO
O óleo-resina de C. reticulata (Ducke) foi coletado no campo experimental da
Embrapa Amazônia Oriental situado no município de Mojú, Pará, no Km 30 da rodovia PA-
150, entre as coordenadas geográficas de 2º08’14” à 2º12’26” de latitude sul e 48º47’34” à
48º14” de longitude a oeste de Grenwich e altitude de 16 m, seguindo as técnicas descritas por
Oliveira et al. (2006b) em seus estudos com extração e coleta do óleo-resina de copaíba,
apresentando as seguintes características: coloração avermelhada, densa, límpida e translúcida
(Figura 1). As espécies fúngicas (Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Macrophomina
phaseolina, Cilyndrocladium sp, Curvularia sp, Pestalotia sp, Phytophtora palmivora,
Sclerotium coffeicola e Thielaviopsis sp) foram obtidas no laboratório de fitopatologia da
Embrapa Amazônia Oriental, Belém, Pará, conservadas pelo método de Castelani e/ ou
provenientes de culturas recentes desprovidas de contaminação.
20
Figura 1. Óleo resina de C. reticulata Ducke
O cultivo dos patógenos deu-se em meio de cultura BDA sintético motivado pela
melhor produção de esporos para fitopatógenos, excetuando-se R. solani que apenas favorece
o crescimento micelial. O meio de cultura utilizado foi fabricado pela empresa japonesa
Daigo®.
Discos de 3 mm dos fungos obtidos a partir de cultivos conservados pelo método
de Castelani e/ou de cultivos recentes desprovidos de contaminação, foram repicados para
placas de petri contendo meio BDA sintético previamente fundido, autoclavado a 120ºC, por
20 minutos e uma atm de pressão. Em seguida cultivados por 07 dias à temperatura de 25ºC.
Após o tempo de cultivo foram retirados discos do micélio do fitopatógeno
contendo 3 mm e inoculados placas contendo meio BDA sintético previamente fundido
contendo as diversas diluições do óleo-resina de C. reticulata. A diluição do óleo-resina de C.
reticulata foi feita após o meio de cultura ser autoclavado a 120ºC por 20 minutos e uma atm
de pressão e espera até a temperatura de 47ºC aproximadamente, para então ser adicionado o
óleo-resina. Nas avaliações do crescimento micelial in vitro foi utilizada régua milimetrada,
onde foi determinado o diâmetro médio (cm) das colônias (média de duas medidas opostas).
As avaliações foram realizadas com três a cinco dias de cultivo in vitro, de acordo com o
crescimento da testemunha em placa, respeitando o comportamento de cada cultura.
3.2.1 – Inibição do Crescimento Micelial In Vitro de Fitopatógenos por Óleo Resina de C.
reticulata Ducke
Os fitopatógenos foram cultivados em placas de petri contendo meio de cultura
previamente fundidos. Após autoclavar o meio de cultura a 120°C por 20 minutos e uma atm,
21
e seguida de resfriamento até a temperatura de 47°C aproximadamente, adicionou-se e
homogeneizou-se o óleo-resina de C. reticulata ao meio de cultura.
A amostra utilizada na verificação da inibição fitopatogênica foi de óleo-resina
puro de C. reticulata em cinco concentrações de 0%, 0,1%, 0,2%, 0,5% e 0,75% (v/v), para os
fitopatógenos R. solani, S. rolfsii, M. phaseolina e testemunha. A amostra do óleo-resina
também foi utilizada em três concentrações de 0%, 0,25% e 0,5% para os fitopatógenos
Cilyndrocladium sp, Curvularia sp, Pestalotia sp, P. palmivora, S. coffeicola, Thielaviopsis
sp e testemunha. Como testemunha foi utilizado apenas 100 mL do meio BDA sintético
contendo disco micelial de 3 mm do fitopatógeno.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado contendo quinze
tratamentos (três espécies fitopatógenas X cinco concentrações do óleo de copaíba) e quatro
repetições, e também contendo dezoito tratamentos (seis espécies fúngicas X três
concentrações do óleo-resina de copaíba) e cinco repetições. A análise estatística foi feita
através da análise de variação, comparando as medidas pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade utilizando o programa estatístico SISVAR.
22
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 – INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO MICELIAL IN VITRO DE FITOPATÓGENOS POR
ÓLEO-RESINA DE C. reticulata DUCKE
Na tabela 1, observa-se que todas as concentrações utilizadas no controle da
inibição micelial do fitopatógeno R.. solani mostraram-se eficientes em relação à testemunha,
como observado também na tabela 2, onde a inibição do crescimento de R.. solani são
superiores a 66%, sendo a concentração de 0,75% a de maior poder inibitório, apresentando
resultado superior a 76%. O fitopatógeno S. rolfsii foi inibido eficientemente somente em
concentrações superiores a 0,2% como observado na tabela 1, e demonstrado na tabela 2,
onde a inibição do fungo é superior 60% na concentração de 0,2% e de 75% na concentração
mais elevada (0,75%). Já para o fungo M. phaseolina nenhuma das concentrações utilizadas
apresentaram resultados na inibição do crescimento micelial superiores a 50%. Os resultados
mostraram, de uma maneira geral, que à medida que se aumentava à concentração do óleo-
resina de C. reticulata a inibição do crescimento micelial in vitro era mais eficiente.
Eficiência semelhante na inibição do crescimento micelial in vitro das mesmas espécies
fúngicas tratadas nesse trabalho, foi obtida por Oliveira et al. (2006c) quando utilizou óleo-
resina da Copaifera duckei.
Tabela 1. Crescimento (cm) micelial in vitro de fitopatógenos em meio de cultura BDA
sintético tratados com óleo-resina de C. reticulata.
Concentração %
Fitopatógenos
0,1 0,2 0,5 0,75
Testemunha 9,00 d 9,00 c 9,00 c 9,00 c
R. solani
3,02 a 2,25 a 2,42 a 2,12 a
S. rolfsii
6,10 b 3,15 a 2,70 a 2,25 a
M. phaseolina
7,62 c 6,87 b 5,57 b 5,25 b
Médias seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey.
23
Tabela 2. Inibição do crescimento (%) micelial in vitro de fitopatógenos em meio de cultura
BDA sintético tratados com óleo-resina de C. reticulata Ducke.
Concentração % Fitopatógenos
0,1 0,2 0,5 0,75
Testemunha 0 d 0 c 0 c 0 c
R. solani
66,44 a 75,00 a 73,11 a 76,44 a
S. rolfsii
32,22 b 65,00 a 70,00 a 75,00 a
M. phaseolina
15,33 c 23,66 b 38,11 b 41,66 b
Médias seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey.
Na tabela 3, observa-se que todas as concentrações utilizadas no controle da
inibição micelial dos fitopatógenos Pestalotia sp, P. palmivora, Curvularia sp e S. coffeicola
mostraram-se eficientes em relação à testemunha, como observado também na tabela 4, onde
a inibição do crescimento dos fitopatógenos Pestalotia sp, P. palmivora, Curvularia sp e S.
coffeicola são superiores a 60%, sendo mais eficiente na inibição de Pestalotia sp, com
inibição superior a 72% e 83% para as concentrações de 0,25 e 0,5%, respectivamente. Os
fungos Cylindrocladium sp e Thielaviopsis sp, nenhuma das concentrações utilizadas
apresentaram resultados na inibição do crescimento micelial superiores a 35%. Os resultados
mostraram que, à medida que se aumentava à concentração do óleo-resina de C. reticulata a
inibição do crescimento micelial in vitro aumentava.
Tabela 3. Crescimento (cm) micelial in vitro de espécies fúngicas em meio BDA sintético
tratados com óleo-resina de C. reticulata nas concentrações de 0,25 e 0,5%.
Concentração % Fitopatógenos
0,25 0,5
Testemunha 9,00 d 9,00 e
Pestalotia sp 2,48 a 1,48 a
P. palmivora
2,64 a 2,08 ab
Curvularia sp 3,38 a 3,12 c
S. coffeicola
3,44 a 2,86 bc
Cylindrocladium sp 6,12 b 6,00 d
Thielaviopsis sp 7,72 c 6,62 d
Médias seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey
24
Tabela 4. Inibição do crescimento (%) micelial in vitro de espécies fúngicas em meio BDA
sintético tratados com óleo-resina de C. reticulata nas concentrações de 0,25 e 0,5%.
Concentração % Fitopatógenos
0,25 0,5
Testemunha 0 d 0 e
Pestalotia sp 72,44 a 83,55 a
P. palmivora
70,66 a 76,88 ab
Curvularia sp 62,44 a 65,33 c
S. coffeicola
61,77 a 68,22 bc
Cylindrocladium sp 32,00 b 33,33 d
Thielaviopsis sp 14,22 c 26,44 d
Médias seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey
Na tabela 5, observa-se que a concentração utilizada foi eficiente no controle da
inibição micelial dos fitopatógenos Pestalotia sp, P. palmivora, R. solani, S. rolfsii, S.
coffeicola e Curvularia sp, com inibição superior a 65% das amostras, como observado na
tabela 6, onde a maior eficiência na inibição foi para o fitopatógeno Pestalotia sp, com
inibição superior a 84%. Já os fungos Cylindrocladium sp, M. phaseolina e Thielaviopsis sp,
apresentaram resposta na inibição inferior a 50%.
Tabela 5. Crescimento (cm) micelial in vitro de espécies fúngicas em meio de cultura BDA
sintético tratados com óleo-resina de C. reticulata na concentração 0,5%.
Concentração
Fitopatógeno
0,5%
Testemunha 9,00 f
Pestalotia sp 1,40 a
P. palmivora
1,82 ab
R. solani
2,42 bc
S. rolfsii
2,45 bc
S. coffeicola
2,65 bc
Curvularia sp 3,10 c
M. phaseolina
5,17 d
Cylindrocladium sp 5,95 de
Thielaviopsis sp 6,40 e
Médias seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey
25
Tabela 6. Inibição do crescimento (%) micelial in vitro de espécies fúngicas em meio de
cultura BDA sintético tratados com óleo-resina de C. reticulata na concentração 0,5%.
Concentração Fitopatógeno
0,5%
Testemunha 0,00 f
Pestalotia sp 84,44 a
P. palmivora
79,77 ab
R. solani
73,11 bc
S. rolfsii
72,77 bc
S. coffeicola
70,55 bc
Curvularia sp 65,55 c
M. phaseolina
42,55 d
Cylindrocladium sp 33,88 de
Thielaviopsis sp 28,88 e
Médias seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey
Trabalhos conduzidos com o fitopatógeno R. solani por Amaral e Bara (2005),
utilizando para controle biológico extrato vegetal de açafrão na concentração de 1% vertido
ao meio BDA, levou a uma inibição superior a 61,1% do fitopatógeno resultado semelhante
ao obtido no trabalho porém utilizando a concentração de 0,1% do óleo-resina de C.
reticulata, demonstrando que óleo-resina possui princípios ativos, sesquiterpenos, que
possuem atividade fungicida; Oliveira et al. (2006c) utilizando óleo-resina de Copaifera sp
demonstra a toxidade do óleo-resina contra R. solani e S. rolfsii, evidenciando que as espécies
do gênero Copaifera, de uma maneira geral podem ser utilizadas no controle de espécies
fúngicas in vitro. Souza et al. (2006a) em testes com o extrato do cravo da índia nas
concentrações de 2000 e 3000 ppm vertidos no meio de cultura BDA fundente, inibiram o
crescimento micelial do fungo em 100%, em que podemos comparar que espécies botânicas
com atividade fungicida, e em altas concentrações tendem a inibir completamente o
crescimento de fitopatógenos, como mostra os resultados obtidos na tabela 2.
O uso do óleo-resina de C. reticulata por Oliveira (2004a), de A. sativum por
Chalfoun e Carvalho (1987) e de C. longa por Singh e Raí, (2000) demonstram que o uso de
plantas consideradas medicinais tem sido eficiente na redução do crescimento micelial e
germinação in vitro de escleródios de M. phaseolina.
26
Testemunha 0,25% 0,5%
Figura 2 – Crescimento micelial in vitro de S. coffeicola em meio de cultura
BDA sintético tratado com óleo-resina de C. reticulata Ducke nas
concentrações de 0,25 e 0,5%.
Figura 3 – Crescimento micelial in vitr de Curvularia sp em meio de cultura
BDA sintético tratado com óleo-resina de C. reticulata Ducke nas
concentrações de 0,25 e 0,5%.
o
27
Figura 4 – Crescimento micelial in vitro de P. palmivora em meio de cultura
BDA sintético tratado com óleo-resina de C. reticulata Ducke nas
concentrações de 0,25 e 0,5%.
Trabalhos conduzidos por Schwan-Estrada et al. (1997), em testes com Baccharis
trimera e Ruta graveolens, por Bastos (1992) utilizando A. sativum, demonstram a mesma
eficiência realizada no ensaio na inibição do crescimento micelial do fitopatógeno
Phytophthora palmivora.
Em estudos realizados por Fecury et al. (2006) com o óleo essencial de nim (A.
indica) na concentração de 1000ppm inibiu em 21,93% o crescimento micelial do fungo do
gênero Curvularia, diferentemente aos resultados obtidos no ensaio, onde concentrações
menores apresentaram resultados mais promissores, já que a inibição foi superior a 60%.
Resultados semelhantes obtiveram Bastos e Benchimol (2006) utilizando o óleo essencial de
P. aduncum na concentração de 0,5% no controle de C. lunata, e de Barros et al. (1995) com
A. sativum, no controle de Curvularia sp.
Trabalhos conduzidos por Oliveira et al. (2006) com o extrato aquoso de I. cunabi
na concentração de 50% em relação a concentração inicial (30%) inibiu o crescimento
micelial em 34,6% do fungo do gênero Cylindrocladium, resultado semelhante ao obtido no
ensaio, mostrando que o fungo do gênero Cylindrocladium não é sensível a extrato e óleos-
resina em baixas concentrações, entretanto resultados diferente foram os obtidos por Bolkhan
e Ribeiro (1981) no uso de extrato de bulbilhos do alho que se mostraram mais eficientes na
inibição do crescimento micelial in vitro de Cylindrocladium sp.
28
Bastos e Benchimol (2006) em seus estudos com o óleo essencial de P. aduncum
em concentrações de 0,1% em meio de cultura BDA, demonstram a atividade inibitória no
crescimento micelial de fungos do gênero Sclerotium, os resultados do ensaio mostram que, o
óleo-resina de C. reticulata na concentração de 0,2% inibe em mais de 60% o crescimento
micelial dos fungos do gênero Sclerotium.
O uso de biofertizante por Castro et al. (1991), e de extratos vegetais por Marcano
et al. (2005) na inibição do crescimento micelial in vitro Thielaviopsis paradoxa, mostrou-se
eficiente na inibição do mesmo, diferente aos resultados obtidos no ensaio, onde o óleo
utilizado não promoveu inibição maior que 30% do crescimento do fungo.
Os testes realizados por Souza et al. (2007), com óleo essencial de citronela,
Cymbopogon nardus, na concentração de 1%, foram diferentes aos obtidos no ensaio, já que
não inibiu nem em 20% o crescimento do fungo, já no ensaio a inibição foi superior a 70% do
fungo Pestalotia sp.
29
5. CONCLUSÕES
As concentrações utilizadas de C. reticulata Ducke na inibição do crescimento
micelial in vitro dos fitopatógenos são mais eficientes que a testemunha.
O fitopatógeno Pestalotia sp, apresenta maior sensibilidade aos efeitos fungicidas
do óleo-resina de C. reticulata.
A inibição do crescimento micelial dos fitopatógenos é diretamente proporcioanl a
concentração do óleo-resina de C. reticulata.
Os resultados obtidos mostram que é possível utilizar o óleo-resina de copaíba,
para controle biológico do crescimento micelial in vitro de fitopatógenos.
30
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