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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE ISOLADOS DE
Rhizoctonia solani Kuhn.
CARLA VANESSA BORGES CASTRO
Belém-PA
2007
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE ISOLADOS DE
Rhizoctonia solani Kuhn.
CARLA VANESSA BORGES CASTRO
Dissertação, apresentada à Universidade Federal Rural da
Amazônia, como parte das exigências do curso de
Mestrado em Agronomia, área de concentração Biologia
Vegetal Tropical, para obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof
o
Dr. Vicente Savonitti Miranda
Co-Orientadores: Ms. Luis Sebastião Poltronieri
Prof
o
Dr. Paulo Sérgio Torres Brioso
Belém-PA
2007
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Castro, Carla Vanessa Borges Castro
Caracterização morfológica e molecular de isolados de Rhizoctonia
solani Kuhn / Carla Vanessa Borges Castro. – Belém, 2007.
67 f: il.
Dissertação (Mestrado em Agronomia) – Universidade Federal Rural
da Amazônia, Belém, 2007.
1. Rhizoctonia solani 2. Caracterização Morfológica 3. Variabilidade
Genética 4. Marcadores RAPD I. Título
CDD- 589.22
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE ISOLADOS DE
Rhizoctonia solani Kuhn.
CARLA VANESSA BORGES CASTRO
Dissertação, apresentada à Universidade Federal Rural da
Amazônia, como parte das exigências do curso de
Mestrado em Agronomia, área de concentração Biologia
Vegetal Tropical, para obtenção do título de Mestre.
Aprovada em 13 de abril de 2007.
BANCA EXAMINADORA:
_____________________________________________________
Biólogo Prof
o
. Dr. Vicente Savonitti Miranda
(Orientador)
Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA)
_____________________________________________________
Eng
o
Agrônomo Msc. Luiz Sebastião Poltronirei
(Co-Orientador)
Embrapa Amazônia Oriental
_____________________________________________________
Eng
o
Agrônomo Prof
o
. Dr. Paulo Sérgio Torres Brioso
(Co-Orientador)
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ)
_____________________________________________________
Eng
o
. Agrônomo Dr. Rafael Moysés Alves
Embrapa Amazônia Oriental
_____________________________________________________
Eng
o
. Agrônomo PhD. Cléber Novais Bastos
CEPLAC/ ERJOH
_____________________________________________________
Eng
o
. Agrônomo Reitor Dr. Marco Aurélio Leite Nunes
Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA)
i
Agradeço a Deus, pela vida.
Aos meus pais Sandra Borges Castro e Josafá Elias Castro, os grandes
responsáveis pela minha formação, pelo amor e carinho constantes, pela alegria,
compreensão e incentivo durante toda a minha vida.
DEDICO
A minha irmã Rúbia Castro, ao meu querido filho que amo muito, Cauê Vinícius Castro Leite,
pelo apoio, carinho, amor e torcida para o meu sucesso.
OFEREÇO.
ii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos aqueles que tornaram possível a realização deste trabalho e de forma
especial:
À Deus, pela vida e por nos conceder esta oportunidade de avanço, possibilitando o nosso
aprimoramento profissional.
Á Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA), pela oportunidade da realização do
curso.
À Embrapa Amazônia Oriental e Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, pela
estrutura e oportunidade concedida na obtenção de novos conhecimentos.
A CAPES pelo auxílio financeiro, mediante a concessão de bolsa de Mestrado.
Ao Professor Dr.Vicente Savonitti Miranda, pela orientação, por ter me apoiado nos
momentos mais difíceis, pela confiança e pela valiosa amizade.
Ao Professor Dr. Paulo Sérgio Torres Brioso, pelo apoio indispensável no
desenvolvimento desta dissertação, pela atenção e paciência constantes e a quem tenho
profundo agradecimento e admiração.
Ao Ms. Luiz Sebastião Poltronieri, pelas sugestões, apoio e ensinamentos, pelo exemplo
profissional.
Ao Reitor Dr. Marco Aurélio Leite Nunes (UFRA), ao Dr. Cléber Novais Bastos
(CEPLAC), Dr. Rafael Moysés Alves (EMBRAPA) e ao Dr. Paulo Sérgio Albuquerque
(CEPLAC), pelas valiosas considerações feitas nesta dissertação.
Ao Coordenador do curso de Mestrado em Agronomia da UFRA, Professor Dr. Antonio
Rodrigues Fernandes pela sincera dedicação ao curso.
A todos os professores do curso de Pós-graduação da UFRA, pelos valiosos ensinamentos.
A Enia Carvalho, pelo otimismo e ensinamentos em todas as etapas conduzidas no
Laboratório de Fitopatologia da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ).
A pesquisadora, da Embrapa Amazônia Oriental, Dra. Socorro Padilha, pelo fornecimento
dos dados sobre Genética Molecular.
Aos grandes amigos Fernanda Moura, Nadilma Liberato e, em especial Jessivaldo Galvão
pela valiosa amizade, carinho, incentivos dados nos momentos difíceis e valiosas
sugestões e sempre será um amigo importante.
A minha grande amiga de curso Iulla Naiff, pelos incentivos, apoio nos momentos difíceis
e pela agradável convivência na Embrapa Amazônia Oriental.
Á D. Regina Gomes, ex-secretária do curso de Pós-graduação em Agronomia pelo pronto
atendimento e incentivos.
iii
Aos técnicos do Laboratório da Embrapa Amazônia Oriental, em especial a D. Carmem
Costeira, Raimundo Nonato e José Souza, pelo apoio, auxílio e dedicação.
Aos meus amigos estagiários, bolsistas do Laboratório de Fitopatologia e Genética
molecular da EMBRAPA: Ana Carla, Tatiana, Davi e Isaías, pelo companheirismo e
alegrias compartilhadas que resultaram num reforço de nossa amizade.
Em especial, grande amiga de Laboratório de Genética da Embrapa Amazônia Oriental,
Sivaney Ferreira que esteve ao meu lado, principalmente nas interpretações de resultados
e pela valiosa amizade.
A todos os colegas de curso, pela troca de experiência e momentos de descontração.
À minha mãe, minha irmã e Amanda pela acolhida e por terem sido mãe de meu filho
Cauê Vinícius nas horas que não pude estar presente.
À minhas tias e primas: Aninha, Suely, Solange, Dayanna e Danielle, pelos grandes
incentivos e apoio. E ao meu afilhado Ryan pelo carinho.
A todos que contribuíram, direta e indiretamente, para realização deste trabalho.
iv
“Em ti, SENHOR, confio; nunca me deixes
confundido. Livra-me pela tua justiça”.
SL 31:1
v
BIOGRAFIA DO AUTOR
Carla Vanessa Borges Castro, filha de Josafá Elias Castro e Sandra Borges Castro,
nascida na cidade de Belém, estado do Pará no dia 18 de Julho de 1980.
No ano de 2004, recebeu o diploma de Engenheira Agrônoma pala Universidade
Federal Rural da Amazônia.
Em 2005, iniciou o curso de pós-graduação em nível de Mestrado em Agronomia, área
de concentração Biologia Vegetal Tropical para obtenção do título de Mestre.
vi
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS
viii
LISTA DE FIGURAS
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
xi
RESUMO
15
ABSTRACT
16
1- INTRODUÇÃO
17
2- REVISÃO DA LITERATURA
19
2. 1 - Rhizoctonia spp.
19
2. 2 – Sintomatologia
22
2. 2. 1 – Queima de folhas 22
2. 2. 2 – Podridões de Estacas 22
2.2.3 – Tombamento de mudas 22
2. 3- Caracterizações da doença em algumas culturas
2. 3. 1- Pimenta do Reino
2.3.2- Amendoim
2.3.3- Gramíneas
2.3.4- Eucalipto
2.3.4.1– Ocorrência e distribuição geográfica do patógeno
3.3.5- Feijão
2.3 - Métodos de Controle
2.4 - VARIABILIDADE GENÉTICA VIA RAPD (Random Amplified Polymorphic
DNA)
2.5 - MEDIDAS PARA ESTIMAR A DIVERSIDADE
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Material Biológico
3.2- Meios de cultura
3.2.1- Meio Batata Dextrose Agar (BDA)
3.2.2- Meio BD líquido
3.2.3- Cultivo do Fungo
3. 3- Isolamento e Repicagem do patógeno
23
23
23
24
24
24
25
26
27
30
31
31
32
32
32
32
33
3. 4 – Teste de patogenicidade
3.4.1- Isolamento
3. 5- Obtenção do micélio para a extração do DNA genômico
3. 6- Extração do DNA dos isolados fúngicos
3. 7- Quantificação e diluição do DNA genômico
3. 8- Reação de RAPD
3. 9- Amplificação do DNA – RAPD
3.10- Preparo do gel 1,5%
3.11- Aplicação das amostras no gel de agarose
3. 12- Análise dos produtos e Visualização
3. 13- Análise computacional dos dados
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 – Crescimento micelial do patógeno
4.2 – Teste de patogenicidade
4.3 – Variabilidade Genética
5- CONCLUSÕES
6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CONSIDERAÇÕES FINAIS
35
35
36
36
38
38
39
40
40
41
41
42
42
45
48
53
54
66
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Relação dos 13 isolados de R. solani obtidos de diferentes plantas, para
estudos da variabilidade genética por meio de marcadores RAPD.
31
Tabela 2
Composição do meio de cultura BDA (Batata- Destrose – Agar). 32
Tabela 3
Composição do meio de cultura BD líquido. 32
Tabela 4
Relação dos 22 isolados de R. solani de culturas diferentes, para estudos
referentes ao crescimento micelial, patogenicidade, cloração das colônias,
presença e/ou ausência de microescleródios.
33
Tabela 5
Relação dos 13 isolados de R. solani, e 1 isolado de alternaria sp. com
suas respectivas identificações, para as reações RAPD.
37
Tabela 6
Resumo da análise de variância para o crescimento micelial de
Rhizoctonia solani, oriundo de diferentes culturas à 25
0
C por 3 dias.
42
Tabela 7
Crescimento micelial em diâmetro de Rhizoctonia solani oriundo de
diferentes culturas à 25
0
C por 3 dias, representados com seus respectivos
grupos.
43
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Ataque do patógeno causando podridão radicular e ataque nas folhas na
cultura do feijão (Phaseolus vulgaris L.).
25
Figura 2
Repicagem de Rhizoctonia solani em meio de cultura BDA. 34
Figura 3
Folhas destacadas com pequenos ferimentos na superfície foliar, para as
inoculações com os respectivos isolados. A e B - correspondem folhas de
citrus (Citrus sinensis (L.) Osbeck) e Bastão do Imperador (Etlingera
elatior (Jach) R. M. Sim), com discos de 0,5 cm de diâmetro com micélio
do fungo, respectivamente.
35
Figura 4
Folhas destacadas e inoculadas com discos de micélio, colocadas dentro
de sacos plásticos transparentes e umedecidas para formação de uma
câmara úmida.
36
Figura 5
Esquema da reação em cadeia da polimerase (PCR). 39
Figura 6
Aplicações das amostras de DNA no gel de agarose. 40
Figura 7
Crescimento micelial e coloração das colônias de R. solani oriundas de
diferentes culturas à 25
0
C durante 10 dias. A: isolado chama (Cayaponia
espelina (Manso) Cogn), B: isolado bastão do imperador (Etlingera
Elatior (Jach) R. M. Sim) e C: isolado teca (Tectona grandis L. F).
44
Figura 8
Formação de microescleródios de Rhizoctonia solani obtidos em meio de
cultura BDA. Temperatura de 25
0
C e umidade relativa em torno de 80%,
durante 3 a 4 dias.
45
Figura 9
Sintomas típicos de queima foliar induzida por R. solani, observados em
folhas de citrus (Citrus sinensis (L.) Osbeck), após 3 a 4 dias de
inoculação. Temperatura de 24
0
C e umidade relativa em torno de 80%.
46
Figura 10
Período de incubação (dias) nas plantas, até o aparecimento dos sintomas
em folhas destacadas, com ferimentos e sem ferimentos, inoculadas com
Rhizoctonia solani em condições laboratoriais. Temperatura de 24
0
C e
umidade relativa em torno de 80%.
47
Figura 11
Eletroforese em gel de agarose, mostrando o polimorfismo de Rhizoctonia
solani, pela técnica de RAPD com o primers OPA 2. 48
Figura 12
Matriz de similaridade genética estimada pelo índice de Jaccard, para
todos os isolados analisados de Rhizoctonia solani.
49
Figura 13
Dendrograma gerado pelo método de análise UPGMA para o coeficiente
de Jaccard, a partir das 17 bandas polimórficas geradas pelo RAPD, dos
13 isolados de Rhizoctonia solani e 1 isolado de alternaria sp.
51
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
ADE: Água Destilada Esterelizada
BDA: Batata-Destrose-Agar
BD: Batata- Destrose
RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA
PCR: “Polymerase Chain Reaction” análise pela reação em cadeia da polimerase
SJ: Coeficiente de Jaccard
Embrapa: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
OPA: Operon Technologies
UV: Luz ultravioleta
NTSYS: Numerical Taxonomy and Multivariante Analysis System, versão 2, 02
UPGMA: Unweighted Pair Group Mean Average
NaOH: Hipoclorito de Sódio
15
RESUMO
Rhizoctonia solani é um fungo cosmopolita, com vasto número de hospedeiros, e causa
importantes doenças na maioria das plantas cultivadas em todo o mundo. É uma espécie
complexa, com muitos biótipos que diferem quanto à patogenicidade, aos hospedeiros, à
distribuição na natureza e à aparência em meio de cultura. Em virtude da variabilidade
existente nos sintomas produzidos por esse patógeno, o objetivo do presente trabalho foi
caracterizar morfologicamente 22 isolados e geneticamente 13 isolados de Rhizoctonia solani
de diferentes culturas procedentes do Estado do Pará, Japão e Estados Unidos e 1 isolado de
alternaria sp. Os experimentos foram conduzidos no Laboratório Oficial de Diagnóstico
Fitossanitário vinculado a Área de Fitopatologia, do Departamento de Entomologia e
Fitopatologia, do Instituto de Biologia, da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
(UFRRJ) e na Embrapa Amazônia Oriental. Os parâmetros morfológicos analisados foram o
crescimento micelial, presencia e/ou ausência de microescleródios, a patogenicidade e
coloração dos isolados. No estudo para caracterização genética foi utilizado marcadores
moleculares do tipo RAPD. A partir de fragmentos de tecido foliar lesionado foi realizado a
técnica do isolamento indireto em meio de cultura BDA para se obter colônias do fungo. Com
relação ao crescimento micelial entre os isolados houve efeito significativo ao nível de 5% de
probabilidade pelo teste F, entre os 22 isolados, sendo que variaram entre 2,14 e 7,88 cm de
diâmetro a 25
0
C após 3 dias de crescimento. A formação de microescleródios foi somente
observada nos isolados brasileiros, fato não encontrado nos isolados referentes aos do Japão e
Estados Unidos. Os isolados mostraram-se patogênicos quando inoculadas em folhas sadias.
A análise molecular, o DNA extraído dos isolados com o primer OPA2 permitiu visualizar 17
bandas polimórficas com tamanhos que variavam entre 800 a 1800 pb, gerando 100% de
polimorfismo entre os 14 isolados estudados. A similaridade entre as amostras, estimada pelo
coeficiente de jaccard, foi de 21,71%, sendo gerado pelo método UPGMA, um dendrograma
que permitiu agrupar os isolados em 7 grupos principais. Com base nas avaliações realizadas
concluiu-se que há uma grande variabilidade morfológica e genética entre os isolados de R.
solani analisados.
Palavras - chave: Rhizoctonia solani, Características Morfológica, Variabilidade Genética
Marcadores RAPD.
16
ABSTRACT
Rhizoctonia solani is a cosmopolitan fungus, with vast number of hosts, and cause important
diseases in the majority of the plants cultivated in the whole world. It is a complex specie,
with many biotypes that they differ how much to the pathogenicity, the hosts, the distribution
in the nature and the appearance in culture medium. In virtue of the existing variability in the
symptoms produced for this pathogen, the objective of the present work was to characterize
morphologically 22 and genetically 13 Rhizoctonia solani isolates of different cultures from
the State of Pará, Japan and United States and 1 Alternaria sp isolate. The experiments had
been lead in the Official Laboratory of Disease Control Diagnosis entailed to the Fitopatology
Area, of the Entomology and Fitopatology Department, Institute of Biology, Federal
University of Rio de Janeiro (UFRRJ) and in the Embrapa Eastern Amazonia. The analyzed
morphologic parameters had been the micelial growth, presence and/or absence of
microsclerotia, the pathogenicity and coloration of the isolates ones. In the study for genetic
characterization it was used marking molecular RAPD. From fragments of damaged leaf
tissue, the technique of the indirect isolation in BDA culture medium was carried through to
get fungus colonies. With relation to the micelial growth between the isolates it had
significant effect to the level of 5% of probability for test F, between the 22 isolates, being
that they had varied between 2,14 and 7,88 cm of diameter 25
0
C after 3 days of growth. The
formation of microsclerotia only was observed in the Brazilian isolates, fact not found in the
isolates referring to Japan and United States. The DNA extracted from the isolates used in the
RAPD test with the starter OPA2 allowed to visualize 17 polymorphic bands with sizes
between 800 to 1800 pb, generating 100% of polymorphism among the 14 isolates studied.
The similarity among the samples, esteem for the jaccard coefficient, it was of 21,71%, being
it generated for method UPGMA, a dendrogram that allowed to group the isolates in 7 main
groups. On the basis of the carried through evaluations concluded that it has a great
morphologic and genetic variability among the R. solani isolates analyzed.
Keywords: Rhizoctonia solani, morphological characteristic, genetic variability, RAPD
markers.
17
1- INTRODUÇÃO
O Brasil é um dos países mais rico do mundo em diversidade biológica de plantas,
animais e microrganismos, além de possuir invejável acervo de recursos naturais edáficos,
climáticos, hídricos e de revestimento florístico. É verdadeiramente esplendoroso o manancial
de recursos genéticos autóctones existentes no Brasil, capaz de assegurar o uso sustentável do
capital biótico e abiótico de forma vantajosa, com o emprego consciente do capital intelectual
(MORALES; VALOIS, 2000).
Os recursos genéticos são considerados como conjunto de amostras populacionais
de vegetais, animais e microrganismos, com objetivo de tornar disponíveis caracteres
genéticos úteis, com valor atual e potencial (ARAGÓN, 1997).
A demanda na agropecuária por recursos genéticos necessita cada vez mais da
utilização de métodos e processos biotecnológicos para alcançar o seu sucesso (MORALES;
VALOIS, 2000).
De uma maneira geral, a variabilidade genética é obtida de forma mais expressiva
nos centros de origem e de diversidade das espécies, ou mesmo em linhagens preliminares ou
avançadas, ou em cultivares elites ou primitivas. Para a satisfação dessa demanda é
imprescindível que os bancos de germoplasma sejam bem caracterizados e avaliados, tanto
em termos de caracteres qualitativos quanto quantitativos. A caracterização de coleções de
germoplasma pode ser realizada através de marcadores moleculares que permitem a detecção
de polimorfismo em nível de DNA (SAIKI et al., 1988).
Pode-se afirmar que a biotecnologia é uma ferramenta que não somente aumenta a
eficiência nos organismos utilizados, mas, principalmente, oferece novas possibilidades para
uma melhor exploração dos recursos oferecidos pela biodiversidade, transformando-se assim
em alternativas para o desenvolvimento sustentável (MORALES; VALOIS, 2000).
A diversidade biológica ou biodiversidade é freqüentemente relacionada com a
diversidade de espécies, embora apresente um profundo relacionamento ecológico e
evolucionário (FALK, 1990). De fato, biodiversidade é a variabilidade apresentada pelos
organismos vivos, dentro de espécies, entre espécies e ecossistemas (UNEP, 1992).
Conseqüentemente, é a variação que ocorre sob três enfoques: genes, espécies e ecossistemas
(McNEELY et al., 1990). Assim, diversidade genética é o somatório da informação genética
existente nos organismos que constituem a flora, a fauna e a microbiota que, se
adequadamente identificada e capturada, passa a constituir os recursos genéticos, fonte da
variação genética disponível ou variabilidade genética (MORALES; VALOIS, 2000).
18
A variabilidade genética poderá transformar-se em fonte de recursos estratégicos
necessários para o sucesso dos programas de desenvolvimento e com grande demanda
internacional. Entretanto, seu valor apresenta-se aparentemente reprimido pelo
desconhecimento de suas perspectivas socioeconômicas para o agronegócio. Assim, embora
seja imperativo identificar a diversidade genética disponível e amostrá-la com o intuito de
conservá-la, ao mesmo tempo é preciso, caracterizá-la, avaliá-la e torná-la disponível.
(McNEELY et al., 1990).
Técnicas biotecnológicas como Randon Amplified Polimorphic DNA (RAPD), ou
seja, Polimorphic DNA Amplificado Aleatoriamente constituem instrumentos para
caracterizar e avaliar o germoplasma mais rapidamente e com maior eficiência. È considerada
uma das técnicas que vem sendo mais utilizada na caracterização das espécies eucariotas e
procariotas, tendo sido desenvolvida por Williams et al. (1990). Essa técnica é uma das
variantes da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) que utiliza um “único” iniciador
(primer) composto por dez pares de bases de seqüências nucleotídicas arbitrárias, tendo,
portanto, sua seqüência alvo desconhecida (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998), ao
contrário das outras que requerem informações prévias de seqüência de DNA alvo, para a
amplificação.
Sua utilização possibilitou a detecção de vários polimorfismos em diferentes
populações e/ou indivíduos através da presença ou ausência dos produtos de amplificação
(WILLIAMS et al., 1990; FAIRBANKS et al., 1991). Essa técnica devido a sua relativa
simplicidade, rapidez e baixo custo, têm atraído muitos pesquisadores e é considerada a mais
empregada com o intuito de estudar a diversidade genética de vários fungos (FERREIRA e
GRATTAPAGLIA, 1998).
A caracterização por meio de marcadores moleculares, combinada à obtida por
descritores morfológicos e agronômicos, parece mais apropriada para o estudo de diversidade
em bancos e coleções de germoplasma. Mesmo assim, em alguns casos, podem ocorrer
discrepâncias, sugerindo que padrões evolutivos morfológicos e moleculares sejam distintos.
Em coleções de germoplasma, essa técnica quantifica e visualiza a diversidade, identifica
genótipos desejáveis e grupos de similaridade que possam se constituir duplicatas e, ainda,
otimiza seus manejos pela identificação dos caracteres mais informativos para serem
empregados na caracterização e melhoramento genético (CRUZ et al., 2004A).
Análises genômica têm sido muito utilizadas para estudos com fungos, como por
exemplo, em Rhizoctonia solani, com a finalidade de avaliar a variabilidade genética entre e
dentro de populações, de modo a fornecer subsídios aos programas de melhoramento. Esse
19
fungo representa um grupo economicamente importante e geneticamente diverso de
patógenos de solo que ocorrem em várias espécies de plantas em todo o mundo (VILGALYS;
CUBETA, 1994).
Com base no exposto, este trabalho teve como objetivos:
• Caracterizar morfologicamente 22 isolados de Rhizoctonia solani, através do
crescimento micelial in vitro, presencia e/ou ausência de microescleródios, teste de
patogenicidade e coloração dos isolados e;
• Avaliar variabilidade genética de 13 isolados de Rhizoctonia solani e 1 isolado de
alternaria sp., utilizando-se marcadores moleculares RAPD (Random Amplified
Pholymorphic DNA).
2- REVISÃO DA LITERATURA
2.1- Rhizoctonia sp.
O gênero Rhizoctonia foi descrito pela primeira vez pelo micologista francês De
Candolle, em 1815, como sendo um fungo não esporulante que ataca, preferencialmente,
raízes e que produz filamentos de hifas a partir de escleródios (SNEH et al., 1991). O qual é
classificado como Mitosporic Fungi, Hyphomycetes, forma ordem Agonomycetales por não
produzir esporos em sua fase assexuada. Outra classificação considerando Agonomycetes
como forma-classe e Mycelia Sterilia como forma-ordem (PEREIRA, 1997).
O micélio é caracterizado pela ramificação em ângulo reto com septação
imediatamente e após o ramo, constrição na base da ramificação e septo doliporo. A fase
sexuada deste fungo é Thanatephorus cucumeris, classificado no reino Fungi, filo
Basidiomycota, ordem Ceratobasidiales, Ceratobasidiaceae (BUTLER; BOLKAN, 1973,
ANDERSON, 1982; ADAMS, 1988).
Segundo Botellho et al. (2001), Rhizoctonia solani é um fungo cosmopolita, com vasto
número de hospedeiros, e causa importantes doenças na maioria das plantas cultivadas em
todo o mundo. É uma espécie complexa, com muitos biótipos que diferem quanto à
patogenicidade, aos hospedeiros, à distribuição na natureza e à aparência em meio de cultura.
Relatos sobre isolados de Rhizoctonia, fitopatogênicos ou saprofíticos, não descritos em nível
específico, são comuns na literatura devido às dificuldades na identificação impostas por
limitações morfológicas e taxonômicas do gênero, tais como:
20
(i) Ausência de esporos assexuais,
(ii) Instabilidade na morfologia de culturas e escleródios, em função de variações nas
condições de cultivo (PARMETER; WHITNEY, 1970),
(iii) Ampla variabilidade morfológica, sendo que há espécies constituídas por
diferentes grupos de isolados com afinidade para efetuar anastomose de hifas entre si
(OGOSHI, 1987),
(iv) Necessidade de métodos específicos para se induzir estruturas basidiais in vitro
(CARLING; SUMMER, 1992),
(v) Desconhecimentos dos teleomorfos para algumas espécies anamórficas
(STALPERS; ANDERSEN, 1996).
O fungo sobrevive saprofiticamente no solo, infectando plantas nativas, ou em estádio
de dormência, como micélio e escleródios. Esses propágulos são detectados no solo com
relativa facilidade, porém de difícil quantificação. Geralmente, encontram-se nas camadas
superficiais do perfil do solo, principalmente nos primeiros 10 cm, devido à dependência de
oxigênio (CARDOSO, 1994).
Os sintomas apresentados pela espécie de Rhizoctonia solani variam extensamente e
são confundidos facilmente com os sintomas das doenças produzidas por outros patógenos.
Atuam em regiões de temperaturas elevadas e chuvas freqüentes acompanhadas de alta
umidade (95%), que o tornam de primordial importância dentre os fatores limitantes ao
cultivo de várias culturas, cuja maioria são plantas cultivadas, como beterraba, pepino,
cenoura, berinjela, melão, tomate, melancia, repolho, alface, feijão, soja, figo, algodão, feijão-
caupi e arroz, além de plantas nativas (MATZ, 1917, MATZ, 1921, ATKINS e LEWIS 1952,
ZAUMEYER e THOMAZ 1957, Instituto Interamericano de Ciências Agrícolas 1962,
DANIELS 1963, FLENTJE et al. 1963 a, LUKE et al. 1974, Cooperación..1978).
Este fungo representa um grupo economicamente importante e geneticamente diverso
de patógenos de solo que ocorrem em espécies de plantas em todo o mundo (VILGALYS;
CUBETA, 1994).
O critério de classificação de Rhizoctonia spp. está baseado na citomorfologia da hifa,
morfologia da cultura, morfologia do teleomorfo, e o padrão de anastomose ou não de hifas
(SNEH et al., 1991). Embora Rhizoctonia solani seja um organismo muito importante, no
Brasil informações sobre características dos isolados de R. solani associados a várias culturas
são escassas. Caracterizado por ser extremamente polífago e apresentar grande capacidade
saprofítica no solo, podem invadir as raízes das plantas, causando uma podridão levando até a
morte. Os escleródios, abundantemente produzidos na natureza, quando a uma fase de alta
21
umidade segue-se um período seco (NEWMAN LUZ, 1978), e o micélio do fungo constituem
o inóculo primário (GALINDO et al. 1983) que são disseminados localmente pelo vento,
chuva e a movimentação do ser humano, animais e implementos agrícolas (WEBER, 1939;
ONESIROSAN, 1975). Sementes infectadas também são importantes fontes de inóculo
primário (ONESIROSAN, 1975).
O fungo sobrevive como escleródios ou hifas espessadas nas plantas. Os escleródios
são responsáveis, também, por focos secundários de infecção (WEBER 1939;
ONESIROSAN, 1975), ou podem permanecer no solo, servindo de inóculo primário para
culturas subseqüentes (CARDOSO, 1981). Sobrevive de um ano para o outro em plantas e
em restos de cultura. A penetração desse fungo se dá através das paredes celulares da
epiderme da raiz ou hipocótilo com a subseqüente invasão, pelo micélio dos tecidos da planta,
que acabam por serem degradados pela ação de enzimas ou toxinas (KRUGNER, 1980).
A tendência atual para classificação dos diversos isolados do R. solani é através da
reação de anastomose de hifas. Essa reação tem explicações na taxonomia em virtude da
possibilidade de divisões sub-específicas (PARMETER JUNIOR et al., 1969; SHERWOOD,
1969; PARMETER JUNIOR e WHITNEY, 1970).
A taxonomia deste fungo ainda não foi totalmente elucidada, devido à diversidade
ultra-estrutural da espécie, atribuindo-se esta variação a inconsistência na caracterização do
estágio assexuado do fungo, as dificuldades na produção de esporulação sexuada em
condições controladas e á sua detecção na natureza (CARDOSO 1981).
Marcadores moleculares e bioquímicos complementam a identificação e a
caracterização de isolados de Rhizoctonia (HALL, 1973; SNEH et al., 1991; VILGALYS e
CUBETA, 1994). Vários estudos demonstraram o potencial da eletroforese de proteínas e
isoenzimas na caracterização de grupos de anastomose em Rhizoctonia spp. (REYNOLDS et
al., 1983; LIU et al., 1990; LIU & SINCLAIR, 1992; LIU e SINCLAIR, 1993; LIU et al.,
1993).
22
2. 2 - Sintomatologia
2. 2. 1 – Queima de folhas
A queima de folhas em jardim clonal e no campo tem como sintomas uma coloração
cinza nas áreas queimadas, ataque em reboleira, desfolha precoce tendo algumas folhas
dependuradas nas hifas, e morte. Esses sintomas são precedidos pelo desenvolvimento de
micélio epifítico ascendente nas hastes, galhos e ramos. Outro fato importante é que esses
órgãos atacados ficam repletos de escleródios, os quais são as estrutura de resistência do
patógeno (REZENDE e FERREIRA, 1992; FERREIRA, 1991).
2. 2. 2 – Podridões de Estacas
A podridão de tem como sintomas as lesões escuras que geralmente progridem da base
para o ápice da estaca, e em alguns casos podem existir lesões intercalares, ou seja, lesões
delimitadas acima e abaixo por tecidos sadios (FERREIRA, 1989).
2.2.3 – Tombamento de mudas
O tombamento de mudas está mais associado a plantios realizados por sementes do
que por estacas. Comumente essa doença se manifesta em pré e pós-emergência. No
tombamento em pré-emergência, as mudas aparecem mortas com folhagens murchas ou secas,
dependendo do estádio em que são observadas. Outros sintomas são as lesões que anelam a
haste das mudas e possuem coloração variando de marrom-arroxeadas a marrom-escuras. Nas
sementeiras a doença ocorre na forma de reboleira e atinge o nível do coleto. Um sintoma
facilmente observado a olho nú é o anelamento que ocorre na proximidade do coleto,
especialmente nas mudas mais desenvolvidas que possuem lesões mais escuras na haste
(FERREIRA, 1989).
23
2. 3- Caracterizações da doença em algumas culturas
2. 3. 1- Pimenta do Reino
Segundo Duarte e Albuquerque (2005), a doença afeta plantas de pimenteira-do-reino
em viveiros ou jardim clonal. Distingue-se da queima-do-fio por causar sintomas em
reboleiras e por não formar fios de micélio por meio dos quais as folhas se prendem aos
ramos. A doença inicia a partir de lesões diminutas de cor parda envolvidas por um halo de
cor púrpura. Com a evolução parte da folha ou toda a folha torna-se necrosada. Na face
inferior observam-se hifas entrelaçadas formando uma tênue teia. Quando folhas secas se
desprendem, ficam aderidas às folhas sadias pela ação do orvalho ou de chuva, iniciando
novas infecções. Nas hastes causa lesões e queima dos tecidos. Se as inflorescências e espigas
são atingidas ocorre queima e queda de flores e frutos.
2.3.2- Amendoim
Rhizoctonia solani Kuhn causa no amendoim, morte de sementes, damping-off de pré
e pós-emergência, podridões de raízes e de vagens e queima de folhas em plantas adultas. No
Estado de São Paulo tem sido mais frequentemente relatada como damping-off, podridões de
vagens e de ginóforos. Devido a sua alta freqüência e às condições favoráveis em São Paulo,
pode-se afirmar que constitui um dos mais sérios problemas. (BARRETO E SCALOPPI,
1999). Os sintomas são:
• Manifesta-se na forma de damping-off de pré ou pós-emergência, ocasionando o
tombamento.
• As hastes próximas do solo podem ser atacadas pelo fungo, que causa lesões
circulares, marrons e podem matar o ramo.
• R. solani pode infectar ainda os ginóforos, impedindo a formação de vagens.
• Se a infecção é mais tardia, o fungo causa podridão das vagens, evidente só próximo
da colheita.
• Esta podridão se manifesta por uma mancha parda a preta, tomando parcial ou
totalmente a casca da vagem.
• Em muitos casos, a vagem fica chocha ou com sementes mal formadas, menores,
enrugadas e desbotadas (BARRETO E SCALOPPI, 1999).
24
2.3.3- Gramíneas
De acordo com Verzignassi e Fernandes (2001), o Brasil tem nítida vocação para a
pecuária e já conta com cerca de 100 milhões de hectares de pastagens cultivadas compostas,
principalmente, por gramíneas do gênero Brachiaria, especialmente B. decumbens e B.
brizantha. Estes extensos monocultivos representam um risco ao equilíbrio do ecossistema,
facilitando a propagação de pragas e doenças.
Mais recentemente, e em áreas com precipitação anual superior a 1.800 mm (norte de
Mato Grosso, Rondônia e Acre) foram constatados danos severos em Brachiaria spp.
causados por R. solani. No Estado do Pará, em 2001, foi constatada a morte de B. brizantha
cv. Marandu causada pelos fungos Pythium perillum associado a R. solani, atingindo cerca de
60 mil hectares. R. solani foi também detectado causando damping-off em plântulas de
Stylosanthes scabra em Mato Grosso do Sul (VERZIGNASSI E FERNANDES, 2001).
2.3.4- Eucalipto
2.3.4.1– Ocorrência e distribuição geográfica do patógeno
Em Kerella, Índia, Rhizoctonia solani Kühn, foi relatada como um dos principais
patógenos em viveiros florestais (SILVEIRA, 1996). Na maioria das regiões brasileira a
mesma espécie predomina em Eucalyptus spp., causando queima de folhas em jardim clonal e
no campo, mela de estacas e tombamento de mudas (SANTOS et al., 1996; REZENDE e
FERREIRA, 1992; FERREIRA 1991; CARVALHO et al., 1989; ALFENAS et al., 1988).
Embora, outras espécies já tenham sido relatadas (SILVEIRA, 1996; FERREIRA et al.,
1995).
A queima de folhas foi relada pela primeira vez no Brasil por ALFENAS et al. (1988),
em jardim clonal na região de Belo Oriente, Minas Gerais.
Em 1989, CARVALHO et al. (1989) e VITTI et al. (1989), relataram como
Rhizoctonia sendo um dos patógenos mais associados com a queda na porcentagem de
enraizamento de estacas de eucalipto em casas de vegetação, devido à podridão de estacas.
Conforme FERREIRA (1991), houve nesse ano uma severa queima de folhas em
plantas híbridas entre Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, causadas por linhagens
esclerodiais de R. solani em jardim clonal e no campo, na região do Vale do Rio Jari, estado
do Pará.
25
REZENDE e FERREIRA (1992) descreveram a ocorrência de queima de folhas, em
jardim clonal e em plantações comerciais no Sul da Bahia, ocasionando desfolha precoce de
árvores em reboleira de até 0,3 ha, e em algumas árvores a queima atingiu até mais de quatro
metros de altura. Novamente, SANTOS et al. (1996), relataram queima de folhas no
município de Benevides, estado do Pará, em E. urophylla x E. grandis, procedência Jari e
Albas.
Rhizoctonia, mesmo no setor floresta, possui uma ampla gama de hospedeiro, onde é
causadora de podridão de raízes, lesões em hastes, tombamento de mudas, manchas foliares,
mela e queima de folhas (FERREIRA, 1989; CARVALHO et al., 1989; ALFENAS et al.,
1988; CARVALHO et al., 1987).
3.3.5- Feijão
A doença Rizoctoniose e/ou podridão-radicular, mela ou murcha da teia micélica de
Rhizoctonia (Rhizoctonia solani Kühn) em feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) sendo uma das
doenças radiculares mais comuns e de maior nocividade no Brasil (CARDOSO, 1990). Os
danos que a doença causa a planta são: tombamento da cultura, cancro do talo, podridão
radicular (Figura 1A), podridão da vagem, ataque das folhas (Figura 1B) e atraso na
emergência e desenvolvimento da planta.
A B
Figura 1: Ataque do patógeno causando podridão radicular e ataque nas folhas na cultura do
feijão (Phaseolus vulgaris L.).
26
2.3 - Métodos de Controle
O controle inclui o emprego de semente de boa qualidade, o tratamento da semente
com fungicidas e práticas culturais, como a rotação de culturas com espécies resistentes
(gramíneas), a eliminação de restos culturais e a diminuição da profundidade de semeadura
para permitir a emergência mais rápida das plântulas (VIEIRA; RAVA, 2000). É difícil e até
mesmo anti-econômico, inviabilizando por exemplo o plantio da cultura do feijão,
principalmente em áreas sob pivô central. O sistema radicular e a parte aérea da espécie são
atacados pelo fungo, formando lesões que restringem o desenvolvimento das mesmas ou
causam a sua morte (CARDOSO, 1990).
Uma das alternativas de controle para o patógeno seria o aproveitamento da
supressividade natural a esse patógeno que ocorre em alguns solos. O potencial supressivo a
vários patógenos de solo, reduzindo a manifestação de doenças mesmo sob alta densidade de
inóculo e condições propícias ao desenvolvimento da doença, acontece em vários solos
(COOK; BAKER, 1983).
Alguns fatores físico-químicos do solo, como o pH, atuam na supressividade de alguns
solos a certos patógenos radiculares. Porém, quando se trata do mesmo ou de outro patógeno
em solos diferentes, este caráter é modificado (WHIPPS, 1997). O pH é uma característica
química muito variável e que se modifica em função de práticas como a calagem e aplicação
de adubos acidificantes, os quais podem causar a perda ou a diminuição da supressividade
natural de um solo.
Segundo Chet e Baker (1980), ao alterarem o pH inicial de um solo de 8,1 para 5,7 e
6,5, observaram uma menor incidência de tombamento causado por R. solani em plântulas de
alfafa, beterraba e rabanete. Além disso, constataram que o fungo teve um melhor
crescimento em meio de cultura com pH variando de 6,5 a 7,5. Baixos valores de pH também
inibiram a ocorrência do patógeno em trigo e em centeio causado por Gaeumannomyces
graminis, principalmente quando se utilizou uma adubação amoniacal (MARSCHNER,
1986). O controle de diversas doenças causadas por patógenos de solo, tais como Sclerotium
rolfsii, Rhizoctonia solani e Plasmodiophora brassicae tem sido satisfatório com a aplicação
de corretivos (PUNJA, 1989; citado por ZAMBOLIM e VENTURA, 1993). Altos níveis de
alumínio trocável também estão relacionados com a supressividade natural de alguns solos a
R. solani (KOBAYASHI; KO, 1985).
A presença de microrganismos antagônicos e competidores aos patógenos de solo
permitem uma boa sanidade do sistema radicular das plantas ou a manutenção da população
27
destes em níveis não prejudiciais ao hospedeiro, em função de um tamponamento microbiano
(HOMECHIN, 1991). Muitos microrganismos são isolados e relacionados com a
supressividade de alguns solos (WHIPPS, 1997). Contudo, um solo biologicamente
supressivo provavelmente não poderá ser explicado em termos de um único antagonista
(REIS,1991).
2.4 - VARIABILIDADE GENÉTICA VIA RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
A caracterização molecular tem sido realizada com vários objetivos, dentre eles têm-
se a quantificação da diversidade e a determinação da estrutura genômica. A interpretação da
diversidade é feita por meio de uma medida de dissimilaridade, quase sempre visualizada por
métodos de agrupamento. Já os níveis de variação genética podem ser obtidos por vários
procedimentos, como pela análise de variância molecular. Marcadores moleculares permitem
acessar o genótipo e a variabilidade do DNA das plantas e microorganismos, para
identificarem polimorfismo e associar os genes de efeito maior (MILACH, 1998).
Tem-se observado o avanço de várias técnicas que permitem identificar
variabilidade em nível de DNA. Pode-se verificar através do estudo de DNA, a existência de
um grande número de marcadores genéticos polimórficos, os quais são amplamente utilizados
na identificação de paternidade, no mapeamento genético e nos estudos evolucionários
(BECCKMANN, 1989; GIBSON e SMITH, 1989; WILLIAMS et al., 1990).
Após o desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase (PCR) por SAIKI et al.
(1988), muitos estudos ao nível de marcadores moleculares tornaram-se possíveis ou
simplificados. A reação envolve um processo cíclico, no qual a enzima DNA-polimerase
permite que o DNA de uma região selecionada do genoma seja amplificado várias vezes, para
qual são fornecidos os iniciadores (primers – oligonucleotídeos específicos).
Então, o ciclo se repete e em cada ciclo o número de cópias da seqüência alvo é
duplicado, resultando numa amplificação exponencial (LANDDERGREN, 1993; ALBERT,
1997; SOUTO et al., 2000).
A técnica RAPD foi descrita, inicialmente, por dois grupos de pesquisadores:
Williams et al. (1990), que a denominaram de Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
e por Welsh e McClelland (1990), com o nome de Arbitrarily Primed Polymerase Chain
Reaction (AP-PCR) (citados por MILACH, 1998). Embora as versões sejam distintas nos
detalhes técnicos, são iguais no fundamento, pois se baseiam na amplificação de fragmentos
de DNA por PCR (Polymerase Chain Reaction), seguida da separação desses fragmentos por
28
eletroforese em meio semi-sólido e visualização, com o auxílio da coloração em brometo de
etídio e exposição em luz ultravioleta (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998; MILACH,
1998).
Segundo Borém e Miranda (2005), esta técnica (PCR) consiste em extrair o DNA
dos indivíduos a serem analisados e submetê-lo às reações de amplificação, utilizando-se um
iniciador de polimerização do DNA diferente de cada vez. Um produto de amplificação é
gerado para cada região cromossômica flanqueada por um par de sítios de iniciação,
distanciada no máximo 5 kb (quilo bases nucleotídicas) uma da outra e na orientação
apropriada. Indivíduos geneticamente distintos produzem diferentes padrões de fragmentos
amplificados. O processo de amplificação de fragmentos consiste na desnaturação do DNA -
molde, na hibridização do iniciador com a fita simples do DNA, com base na homologia de
seqüência e na polimerização da seqüência complementar ao DNA - molde. Esse ciclo de
separação da fitas da hélice dupla, hibridização e polimerização são repetidos inúmeras vezes
com o objetivo de amplificar a seqüência reconhecida pelos iniciadores no genoma. Após a
amplificação, os fragmentos são separados por eletroforese em gel de agarose. Para
observação das bandas de DNA, o gel é corado com brometo de etídio e elas são visualizadas
sob luz ultravioleta.
No caso do RAPD, o DNA a ser amplificado é desnaturado pelo aquecimento da
amostra (a 94
0
C). Na presença da DNA polimerase e de dNTPs, os iniciadores se hibridizam
(a 55
0
C) com seqüências específicas do DNA- molde, dando início à síntese (a 75
0
C) do
novo DNA. O primeiro ciclo é caracterizado por um produto de comprimento indeterminado,
que se acumula em progressão aritmética. Entretanto, a partir do segundo ciclo são produzidos
segmentos curtos, que se acumulam exponencialmente a cada ciclo sucessivo de amplificação,
resultando em milhões de fragmentos após 20 a 40 ciclos (BORÉM e MIRANDA, 2005).
Diversas técnicas estão disponíveis para a detecção da variabilidade genética na
seqüência do DNA, indicando polimorfismos existentes. GODOY (2005) diz que a utilização
de técnicas moleculares permite a identificação de pontos de referência do DNA,
denominados de marcadores genéticos.
Os distintos tipos de marcadores moleculares hoje disponíveis diferenciam-se pela
tecnologia utilizada para revelar a variabilidade em nível de DNA, e assim variam quanto à
habilidade de detectar diferenças entre indivíduos. (POLASTRE, 2002). Segundo MILACH
(1997), as metodologias para identificar os principais tipos de marcadores moleculares podem
ser classificadas em dois grupos: por hibridização ou por amplificação de DNA.
Entre os identificados por hibridização estão os marcadores RFLP (Polimorfismo de
29
Comprimento dos Fragmentos de Restrição) e Minissatélites ou Locos VNTR (em inglês
“Variable Number of Tandem Repeats"). Dentre os revelados por amplificação incluem o
marcador do tipo: RAPD (Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso), Microssatélites e
AFLP (Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados).
A classe de marcadores identificados por amplificação de DNA com variações na
PCR, em comparação com as técnicas que envolvem a hibridização de DNA, geralmente, é de
custo relativamente menor, mais fácil e de menor tempo para a obtenção dos resultados
(MILACH, 1998; FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998).
Williams et al. (1990) e Welsh e Mcclelland (1990) propuseram uma outra técnica
para obtenção de polimorfismos de DNA, baseada na amplificação de seqüências de DNA ao
acaso pela reação em cadeia de polimerase (PCR) com primers arbitrários, denominada de
RAPD. O polimorfismo é detectado pela presença de um fragmento específico amplificado
em um indivíduo comparado com a ausência do mesmo em outro indivíduo (WILLIAMS et
al., 1990; FAIRKANKS et al., 1991). Como os sítios de ligação do iniciador estão
distribuídos ao acaso pelo genoma, polimorfismos nestes sítios resultam em diferentes
produtos de amplificação (BARDAKCI e SKIBINSKI, 1994).
A natureza molecular do polimorfismo RAPD não é inteiramente conhecida.
Entretanto, evidencias experimentais indicam que diferenças de apenas um par de base
(mutações de ponto) são suficientes para causar a não complementaridade do iniciador
(seqüenciador) de iniciação e assim impedir a amplificação de um segmento com o sítio
(WILLIAMS et al., 1990). Outras fontes de polimorfismo podem incluir deleções de sítios de
iniciação ou inserção que colocam dois sítios de iniciação adjacentes a uma distância acima
daquela que a DNA polimerase é capaz de percorrer. Assim, o polimorfismo genético
detectado pelos marcadores RAPD tem natureza binária, isto é, o segmento amplificado
(banda no gel) está presente ou ausente (POLASTRE, 2002).
Pela técnica de RAPD, a detecção de vários polimorfismos é simples, fácil, rápida e
necessita de pequenas quantidades de DNA genômico (HU e QUIROS, 1991; WILLIAMS et
al., 1990). Essa técnica tornou-se amplamente utilizada para a identificação de marcadores
genéticos associados a determinados fenótipos para estudos de variabilidade genética, assim
como para a identificação de organismos e na resolução de grupos taxonômicos (ROSATO et
al., 2002).
Sua rapidez é uma das vantagens na caracterização de recursos biológicos quando
comparada com as análises de isoenzimas ou RFLP (ANDERSEN e FAIRBANKS, 1991). A
não discriminação dos heterozigotos é uma das desvantagens dessa técnica. Como os
30
marcadores RAPD se comportam como marcadores genéticos dominantes, não são possíveis
distinguir se a presença de uma banda é gerada pela amplificação de um loco homozigoto ou
heterozigoto (WILLIAMS et al., 1990).
A diversidade genética é a porção hereditária de uma variação possível de ser
observada e mensurada (MORALES; VALOIS, 2000). Segundo esses autores, pode ser
empregado como termo alternativo para representar a variação genética, indicando o
somatório da informação genética conhecida e potencial. Logo, quantifica o número de
genótipos possíveis de ser detectado em uma população ou em qualquer hierarquia. Assim
sendo, a caracterização com o uso de marcadores moleculares tem sido útil, em virtude da
diversidade, em nível molecular, ser bem maior que a morfológica (MÜHLEN, 1999).
2.5 - MEDIDAS PARA ESTIMAR A DIVERSIDADE
Há duas maneiras básicas para se inferir a diversidade genética: uma de natureza
quantitativa e outra preditiva (CRUZ e CARNEIRO, 2003). Segundo esses autores, dentre os
métodos quantitativos têm-se as análises dialéticas, mas, a aplicação não é apropriada, por ser
extremamente trabalhosa e de alto custo. Já os métodos preditivos são viáveis e tomam por
base as diferenças morfológicas, agronômicas e moleculares, quantificando-as por alguma
medida de dissimilaridade que expressa o grau de diversidade genética entre os genótipos.
Assim, três medidas de dissimilaridades podem ser aplicadas para representar a diversidade
em coleções de germoplasma, que se diferenciam com o tipo de variável obtida, ou seja, se
quantitativas, binárias ou multicategóricas (CRUZ e CARNEIRO, 2003). Porém,
independente da variável, essas medidas são freqüentemente interpretadas e visualizadas por
técnicas multivariadas.
Para dados moleculares, onde se obtém uma matriz composta por dados binários,
representados pelo número 0 (ausência) e 1 (presença de bandas), aplicam-se vários índices de
similaridades que variam de 0 a 1, sendo as dissimilaridades obtidas de seus complementos
(CRUZ et al., 2004; CRUZ e CARNEIRO, 2003). As propriedades matemáticas e genéticas
dos coeficientes de dissimilaridades, obtidos de freqüências alélicas, e dos de similaridades,
gerados de dados binários, empregados em marcadores moleculares, foram amplamente
discutidas por REIF et al. (2005). Segundo esses autores, quando os dados são obtidos por
marcadores que geram alelos não informativos ou são organizados em uma matriz binária,
eles permitem a análise apenas pelo uso de coeficientes de similaridade e destacaram três
deles como os mais importantes: o de coincidência simples (SSM), o de Jaccard (SJ) e o de
31
Dice (SD), sendo que os dois últimos não contabilizam valores nulos (00). Relataram, ainda,
que complementos aritméticos desses coeficientes representam dissimilaridades (d = 1 - S), as
quais têm propriedades de distâncias e que a dissimilaridade obtida pelo complemento
aritmética do coeficiente de Dice (dD) também pode ser denominada de distância de Nei-Li.
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Material Biológico
O trabalho foi desenvolvido no Laboratório Oficial de Diagnóstico Fitossanitário
vinculado a Área de Fitopatologia, do Departamento de Entomologia e Fitopatologia, do
Instituto de Biologia, da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ) e na
Embrapa Amazônia Oriental (Belém/ PA).
Foram fornecidos pelo Laboratório da UFRRJ 1 isolado de alternaria sp. e 2 isolados
de Rhizoctonia solani do grupo de anastomose: AG4 e AG7, provenientes de solos do Japão e
Estados Unidos, respectivamente e 11 isolados de R. solani, todos provenientes da parte aérea
foliar de diferentes culturas (Tabela 1) pertencentes à micoteca da Embrapa (1º27’21”S e
48º30’16”, com altitude de 10,8m). O clima local, segundo a classificação de Koppen,
corresponde ao tipo quente e úmido (Afi), caracterizado por uma estação chuvosa com
precipitação média de 2.740 mm, temperatura média de 26
0
C e umidade relativa do ar
próxima de 80%.
TABELA 1: Relação dos 13 isolados de R. solani obtidos de diferentes plantas, para estudos
da variabilidade genética por meio de marcadores RAPD.
CULTURAS NOME CIENTÍFICO
ACÁCIA Acácia farnesiana (L.) Willd.
BASTÃO DO IMPERADOR Etlingera elatior (Jach) R. M. Sim
CAFÉ Coffea arábica L.
CITRUS Citrus sinensis (L.) Osbeck
CUPUAÇU Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.)
CHAMA Cayaponia espelina (Manso) Cogn.
MELANCIA Citrullus vulgaris Schrad
MILHO Zea mays L
32
NIM Azadirachta indica A. Juss
PUERÁRIA Puerária phaseoloides (Roxb.) Benth
RÚCULA Euruca sativa (L.) Cav.
AG4
_______
AG7
_______
3.2- Meios de cultura
3.2.1- Meio Batata Dextrose Agar (BDA).
TABELA 2. Composição do meio de cultura BDA (Batata- Destrose - Agar).
Composição do meio de cultura Quantidade
Batata 100 g
Agar 15 g
H
2
O Destilada 200 ml
A batata foi cozida por 30 minutos em 200 mL de água e filtrada em gaze sendo
adicionado o Agar. O pH foi ajustado para 6,8 com NaOH 1 N, seguido de autoclavagem a
120
0
C durante 20 minutos.
3.2.2- Meio BD líquido.
TABELA 3. Composição do meio de cultura BD líquido.
Composição do meio de cultura Quantidade
Batata 100 g
H
2
O Destilada 200 ml
3.2.3- Cultivo do Fungo
Os isolados foram cultivados em meio batata-dextrose-ágar (BDA), a 25
0
C, e
posteriormente repicados para meio líquido (MILLS et al., 1994) e mantidos sob agitação no
escuro, durante 7 dias. Após isto, o micélio de cada isolado foi filtrado sob vácuo e recolhido
para placas de Petri esterilizadas e liofilizados.
33
3. 3- Isolamento e Repicagem do patógeno
Os isolados foram obtidos a partir de folhas com sintomas característicos da doença
(queima foliar) coletadas no estado do Pará, catalogadas e herborizadas no Laboratório de
Fitopatologia da Embrapa Amazônia Oriental (Belém/PA). Após lavagem do material com
água e sabão, foram efetuados pequenos cortes na região de transição da lesão e procedeu-se a
desinfestação superficial em álcool 70% durante 30 segundos e em hipoclorito de sódio a
1,5% por um minuto, sendo em seguida lavados por duas vezes consecutivas em água
destilada esterilizada (ADE). O procedimento foi realizado em câmara de fluxo laminar. O
material foi plaqueado em meio de cultura Batata Dextrose Agar (BDA) com o auxílio de uma
pinça flambada. As placas foram vedadas com papel filme para se obter colônias de
Rhizoctonia solani (Figura 2) visando estudos posteriores.
A Tabela 4 apresenta a relação das 22 isolados de R. solani, para estudos referentes à
caracterização morfológica do respectivo patógeno. Os parâmetros a serem analisados são o
crescimento micelial, patogenicidade, cloração das colônias, presença e/ou ausência de
microescleródios.
TABELA 4- Relação dos 22 isolados de R. solani de culturas diferentes, para estudos
referentes ao crescimento micelial, patogenicidade, cloração das colônias, presença e/ou
ausência de microescleródios.
CULTURAS NOME CIENTÍFICO
ACÁCIA Acácia farnesiana (L.) Willd.
BASTÃO DO IMPERADOR Etlingera elatior (Jach) R. M. Sim
BRACHIARIA Brachiaria brizantha (Hochst. ex A. Rich)
CAFÉ Coffea arábica L.
CAUPI Vigna unguiculata (L.) Walp.
CITRUS Citrus sinensis (L.) Osbeck
CUPUAÇU Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.)
CHAMA Cayaponia espelina (Manso) Cogn.
JAMBU
Spilanthes Oleracea
MARACUJÁ Passiflora incarnata L.
MELANCIA Citrullus vulgaris Schrad
MILHO Zea mays L
34
NIM Azadirachta indica A. Juss
PEPINO Cucumis sativus L.
PUERÁRIA Puerária phaseoloides (Roxb.) Benth
REPOLHO
Brassica oleracea
RÚCULA Euruca sativa (L.) Cav.
SOJA Glycine max (L.) Merr.
SORRISO DE MARIA Astertradescantii L.
TECA Tectona grandis L. F.
URUCUM Bixa orellana L.
PIMENTA DO REINO
Piper nigrum L.
Cada isolado de R. solani foi semeado em 3 placas de Petri contendo meio BDA. As
placas foram mantidas em incubadora a uma temperatura constante de 25
0
C no escuro.
O crescimento micelial foi avaliado em intervalos de 24 horas, pela medição do
diâmetro da colônia em dois sentidos diametralmente opostos, com auxílio de uma régua
milimetrada.
Figura 2: Repicagem de Rhizoctonia solani em meio de cultura BDA. Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro, 2007.
Os dados obtidos, com relação ao crescimento do micélio, foram submetidos à análise
estatística utilizando o programa SISVAR, sendo a média dos tratamentos comparados pelo
teste de Scott-Knot a 5% de probabilidade.
35
3. 4 - Teste de patogenicidade
3.4.1- Isolamento
No teste de patogenicidade dos isolados fitopatogênico, avaliou-se a presença ou
ausência de sintomas. Foram utilizadas folhas sadias destacadas de 22 plantas (Tabela 4),
coletadas no campo e desinfetadas superficialmente com água e sabão.
Placas de Petri com 9 cm de diâmetros contendo meio BDA, foram retirados pequenos
discos de micélio de 0,5 cm de diâmetro, dos diferentes isolados fúngicos, colônias puras e
depositados sobre as folhas, previamente desinfetadas e ferida com auxílio de uma agulha
esterilizada, em pontos eqüidistantes. Para tratamento controle (testemunha) foram utilizados
discos de BDA, porém sem o inoculo, e depositados na superfície foliar conforme ilustra a
Figura 3.
A B
Figura 3: Folhas destacadas com pequenos ferimentos na superfície foliar, para as inoculações
com os respectivos isolados. A e B - correspondem folhas de citrus (Citrus sinensis (L.)
Osbeck) e Bastão do Imperador (Etlingera elatior (Jach) R. M. Sim), com discos de 0,5 cm de
diâmetro com micélio do fungo, respectivamente. Embrapa Amazônia Oriental, Belém – PA,
2007.
Em seguida, as folhas inoculadas e testemunha (Figura 4) foram colocadas em
temperatura de 24
0
C dentro de sacos plásticos transparentes e umedecidas com ADE para
formar uma câmara úmida, para posterior análise. E com a base do pecíolo envolvido por
algodão hidratado com água.
Diariamente foram feitas observações para registrar o período de incubação,
caracterizado pelo espaço de tempo decorrido entre a inoculação e o aparecimento dos
36
sintomas.
Figura 4: Folhas destacadas e inoculadas com discos de micélio, colocadas dentro de sacos
plásticos transparentes e umedecidas para formação de uma câmara úmida. Embrapa
Amazônia Oriental, Belém – PA, 2007.
3. 5- Obtenção do micélio para a extração do DNA genômico
Após 4 dias de crescimento do fungo Rhizoctonia solani em placa de petri, três discos
de micélio, de cada isolado, com aproximadamente 0,5 cm de diâmetro, foram transferidos
para frascos de Erlenmeyers de 250 ml contendo 100 ml do meio líquido BD, a fim de obter-
se o micélio do fungo. Em seguida, os Erlenmeyers foram colocados em um agitador
horizontal com velocidade máxima de 143 rpm a uma temperatura que variava de 24
0
a 27
0
C
por um tempo de 72 horas. Após quatro dias, o micélio foi coletado, coado em papel de filtro
e colocado na bomba a vácuo.
As reações foram desenvolvidas de acordo com protocolo de Williams et. al. (1990).
3. 6- Extração do DNA dos isolados fúngicos
Para extração do DNA dos 14 isolados, conforme apresenta a Tabela 5, sendo que um
isolado de alternaria sp, utilizou-se o produto DNAzol. O DNA genômico foi extraído de 50
mg de micélio, previamente macerado em nitrogênio líquido, utilizando-se o protocolo de
extração de Williams et al. (1990), com pequenas modificações.
37
TABELA 5. Relação dos 13 isolados de R. solani, e 1 isolado de alternaria sp com suas
respectivas identificações, para as reações RAPD.
CULTURAS Identificações dos Isolados/ RAPD
CHAMA R1
RÚCULA R2
BASTÃO DO IMPERADOR R3
CUPUAÇU R4
MELANCIA R5
PUERÁRIA R6
AG7 R7
AG4 R8
NIM R9
CITROS R10
Alternaria sp. A11
MILHO R12
ACÁCIA R13
CAFÉ R14
Após a formação de um pó, foi adicionado 600 µL do produto DNAzol. e o macerado
foi transferido imediatamente para um tudo de eppendorf de 1,5 ml.
Em seguida foi levado ao Fisher Vortex Genie 2, por 5 minutos, e adicionou-se 600
µL de um solvente orgânico CIA (Clorofórmio- Álcool Isoamílico - 24:1), sendo
homogeneizado e centrifugado durante 10 minutos numa velocidade máxima de 12.000 rpm,
para a separação das fases orgânicas e aquosas. E novamente os tubos foram colocados ao
Fisher vortex Genie 2, durante 5 minutos.
A fase aquosa foi transferida cuidadosamente para um novo tubo (500 µL), de modo
que as duas fases formadas não fossem novamente misturadas. O sobrenadante foi transferido,
e o DNA foi precipitado com etanol absoluto gelado a uma temperatura de 4
0
C (450 µL).
Foram agitadas as amostras para formar uma emulsão homogênea, invertendo os tubos de seis
a oito vezes e deixando-os em repouso em temperatura ambiente por cinco minutos.
Os tubos foram novamente centrifugados em uma microcentrífuga com a velocidade
máxima de 12.000 rpm durante cinco minutos, para que o DNA fosse precipitado, formando o
pellet. Posteriormente, fez-se a lavagem dos pellets com o mix concentrado: 1 volume de
38
DNAzol + 0,75 volume de etanol absoluto. Em seguida, adicionou-se 600 µL deste mix nas
amostras e o pellet foi ressuspendido com o auxílio da ponteira. Foi realizada uma última
centrifugação de cinco minutos a 12.000 rpm. Retirou-se cuidadosamente todo o etanol e os
pellets foram colocados para secar por aproximadamente uma hora a 37
0
C em banho maria
(DAIGGER. DRY BATH). Em seguida, foram adicionados 30 µL de água ultra-pura para
posterior quantificação.
As amostras de DNA quantificadas foram armazenadas em um freezer à (-20
0
C) para
uso nas reações de RAPD.
3. 7- Quantificação e diluição do DNA genômico
Os DNAs extraídos foram submetidos à eletroforese horizontal e quantificados em gel
de agarose a 1%, visualizado em luz ultravioleta, a partir da comparação de concentrações
crescentes de DNA lambda (20, 50, 100 e 200 ng/µL). Utilizou-se 5 µL de DNA,
adicionando-se 2 µL de tampão de carregamento e 4 µL de água destilada e autoclavada.
Após a quantificação, os DNAs foram diluídos a partir da amostra total com água
destilada e autoclavada na concentração de trabalho, 5 ng/µL. As alíquotas foram
armazenadas a –20º C.
A diluição do DNA foi realizada considerando-se a fórmula C .V = C1 .V1 , onde:
C = é a concentração lida de DNA na quantificação;
V = é o volume desejado a ser pipetado do DNA concentrado;
C1 = é a concentração de trabalho correspondente a 5 ng/ μL;
V1 = é o volume final correspondente a 500 μL .
3. 8- Reação de RAPD
O protocolo utilizado foi o descrito por Williams et al. (1990) com pequenas
modificações. As reações de amplificação foram realizadas em um volume final de 13 μL
contendo água destilada autoclavada, tampão para PCR (20 mM de Tris HCl pH 8,0 e 50 mM
de KCl), 2 mM de MgCl
2
, 1 mM dNTP, BSA purificada (2,5 ng/ml), primer arbitrário 1,3
mM, 1 U.I. de Taq polimerase e 15 ng de DNA genômico.
39
3. 9- Amplificação do DNA – RAPD
A amplificação foi baseada em método descrito por Williams et al. (1990), usando um
primer de dez pares de bases nucleotídicas, da marca Operon Technologies Inc., Alameda,
CA, EUA (OPA2 e OPA3), em tubos de 0,2 ml.
As amplificações foram realizadas em termociclador PCR Express HyBAID, sendo
executados 40 ciclos de 92
0
C a 1 minuto (desnaturação das fitas de DNA), 36
0
C a 1 minuto
(anelamento do iniciador), 72
0
C a 2 minutos (extensão e polimerização pela enzima Taq
DNA-polimerase), seguido de um ciclo final a 72
0
C por 10 minutos, para a completa extensão
dos produtos amplificados. A Figura 5 ilustra esquematicamente uma reação de PCR utilizada
na obtenção de marcadores RAPD.
Figura 5: Esquema da reação em cadeia da polimerase (PCR).
40
3.10- Preparo do gel 1,5%
Foram utilizados 1,5 g de agarose ultrapura em 100 mL de TAE 1X. Ferveu-se a
suspensão em forno de microondas até que as partículas de agarose em suspensão ficassem
invisíveis (cerca de três a quatro minutos). A completa dissolução de agarose foi alcançada
agitando-se gentilmente o frasco em intervalos regulares durante o processo de fervura. Após
a completa dissolução da agarose, a mistura foi colocada sob água para resfriamento até
atingir uma temperatura entre 40
0
C a 60
0
C e então acrescentado 15 µL de brometo de etídio
(mg/ml).
Após o preparo, a solução foi vertida no suporte de gel, e em seguida, foram colocados
dois pentes (cada um com 8 dentes) sendo um em uma das extremidades e o outro a cerca de
dez centímetros de distância, formando “poços” ou canais onde foram aplicadas as amostras.
3.11- Aplicação das amostras no gel de agarose
As reações amplificadas foram retiradas do termociclador e carregadas com 1,5μL de
tampão de carregamento 6x (azul de bromofenol). Foi aplicada em cada “poço” uma alíquota
de 13 μL de cada amostra e 12 μL de DNA padrão (Ladder).
Após esta etapa o gel foi submerso na solução tampão colocado no tanque de aparato
de eletroforese. O tampão de eletroforese teve a mesma composição do tampão utilizado na
confecção do gel. O tempo de corrida foi estimado em duas horas e trinta minutos até que a
solução corante atingisse a região próxima da borda inferior do gel (Figura 6). Aplicou-se
durante a corrida, uma voltagem constante de 80 V.
Figura 6: Aplicações das amostras de DNA no gel de agarose. Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro, 2007.
41
3. 12- Análise dos produtos e Visualização
Para separação dos produtos amplificados foi utilizada a eletroforese horizontal, em
gel de agarose a 1,5 %, preparado em TAE 1X, corado com 0,5µL
-1
de brometo de etídio para
visualização do DNA sob luz ultravioleta (UV). Onde os produtos de amplificação foram
separados sob uma voltagem constante de 80 Volts durante duas horas e trinta minutos. O
DNA padrão, com fragmentos de tamanhos conhecidos utilizado foi o Ladder 1 kb.
Após a eletroforese, as bandas foram visualizadas, com detecção em luz UV e os
resultados foram fotografados por uma câmera acoplada a um sistema computadorizado
denominado ALPHA INNOTECH CORPORATION/ALFHA DIGI DOCTM, para posterior
análise.
3. 13- Análise computacional dos dados
A análise dos marcadores RAPD polimórficos foi realizada em planilha no programa
Microsoft Excel utilizando a relação indivíduo e primer com suas respectivas massas
moleculares com o intuito de gerar dados para uma matriz de similaridade a qual fornece as
informações necessárias para os resultados finais. Os valores da planilha foram dados de
acordo com a presença e ausência de bandas.
Quando um marcador está presente em um indivíduo, é fornecido ao mesmo, na
planilha, o número 1 (um), caso contrário, ou seja, na ausência da banda, é fornecido o
número zero (0) e no caso de dúvidas em relação ao fragmento fornecemos o número 9
(nove). Em seguida, a matriz foi gerada utilizando o programa NTSYS (Numerical Taxonomy
and Multivariante Analysis System, versão 2.02), desenvolvido por Rohlf (1994).
A similaridade entre as amostras foi analisada através dos coeficientes de Jaccard
(Sneath e Sokal, 1973). Representado na seguinte forma:
Jaccard: Sj = . a .
a+b+c
em que:
a = número de casos em que a banda está presente nos dois genótipos, simultaneamente;
b = número de casos em que a banda está presente somente no genótipo i;
c = número de casos em que a banda está presente somente no genótipo j.
A partir da matriz, os clusters (dendrograma) foram gerados pelo método UPGMA
42
(Unweighted Pair Group Mean Average), que é um método de média aritmética não
ponderada, onde foi expresso na forma de dendrograma.
4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 - Crescimento micelial do patógeno
Houve variação na velocidade do crescimento micelial dos 22 isolados de R. solani,
em função do meio utilizado (BDA) e das próprias características morfológicas.
Os resultados das análises de variância que estão apresentados na Tabela 6, indicam
efeitos significativos ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F, entre os tratamentos em
relação ao crescimento micelial do fungo.
TABELA 6. Resumo da análise de variância para o crescimento micelial de Rhizoctonia
solani, oriundo de diferentes culturas à 25
0
C por 3 dias.
C.V. G.L. S.Q. Q.M. F
Tratamentos 22 178, 6846 7,7689 10,34 *
Resíduo 2 0,1495 0,0747
Total
CV (%)
Média
71
17,11
5,07
213,4109 0,7517
*Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F.
As médias do crescimento micelial permitiu a divisão dos isolados do patógeno em 4
grupos. O grupo 1 estão representados pela letra A, Grupo 2 representados pela letra B, grupo
3 representados pela letra C e grupo 4 representados pela letra D, conforme ilustra a Tabela 7.
Os isolados de R. solani das culturas bastão do imperador, brachiaria, citros, melancia
e rúcula apresentaram maior crescimento micelial, com diâmetros médios de 7,88 cm; 7,39
cm; 7,35 cm; 7,11 cm e 6,97 cm, respectivamente, à temperatura de 25
0
C durante 3 dias de
incubação, os quais não diferiram significativamente entre si, enquanto que os menores
crescimentos foram observados nos isolados de chama, café, e soja, cujos diâmetros médios
do micélio foram respectivamente de 2,93 cm; 2,49 cm e 2,14 cm. Os isolados das demais
culturas estudadas apresentaram crescimento intermediário.
43
Apesar dos isolados sorriso de maria, pertencente a família Asteraceae e bastão do
imperador, da família Zingiberaceae, serem plantas ornamentais, apresentaram crescimento
micelial in vitro diferentes entre si, onde o isolado sorriso de maria apresentou um
crescimento micelial menor com 5,13 cm de diâmetro, que o isolado bastão do imperador com
7,88 cm de diâmetro, fato este que possa ser explicado em função da temperatura (25
0
C)
estabelecida e do período de incubação (3 dias).
No trabalho de Mafia et al. (2005), observou-se tendência de maior crescimento
micelial de Rhizoctonia solani, a 28
0
C, evidenciado pelo maior diâmetro médio das colônias e
pelas maiores taxas de crescimento médio. Nessa temperatura, a colônia teve, em média, 8,4
cm de diâmetro após 72 horas de incubação e, portanto, taxa de crescimento equivalente a 2,8
cm.dia
-1
.
TABELA 7. Crescimento micelial em diâmetro de Rhizoctonia solani oriundo de diferentes
culturas à 25
0
C por 3 dias, representados com seus respectivos grupos.
Tratamentos Diâmetro do micélio (cm)
Bastão do Imperador 7,88 A
Brachiaria 7,39 A
Citros 7,35 A Grupo 1
Melancia 7,11 A
Rúcula 6,97 A
Teca 6,40 B
Puerária 6,17 B
Milho 5,85 B
Caupi 5,78 B Grupo 2
Urucum 5,77 B
Acácia 5,26 B
Sorriso de Maria 5,13 B
Nim 4,55 C
Pimenta do reino 4,31 C
AG4 4,31 C
Cupuaçu 4,27 C Grupo 3
Jambu 4,09 C
Pepino 4,05 C
AG7 3,85 C
Repolho 3,84 C
Maracujá 3,73 C
Chama 2,93 D
Café 2,49 D Grupo 4
Soja 2,14 D
Médias seguidas por letras distintas entre si diferenciam os tratamentos, ao nível de 5% de
probabilidade pelo Teste de Scott-Knott.
44
No estudo de Nechet e Halfeld-Vieira (2006) com Rhizoctonia solani em feijão-caupi,
verificou-se que a taxa de crescimento micelial variou de 2,1 – 5,3 cm.dia
-1
para os isolados
de mata são de 2,7 – 5,8 cm.dia
-1
para os isolados de cerrado.
Com relação à coloração das colônias (Figura 7A, 7B e 7C), observou-se que os
isolados de chama, rúcula, AG7, AG4, puerária, citros, soja, braquiária, feijão - caupi, pepino,
acácia, repolho e jambu, apresentaram colônias de coloração marrom claro (Figura 7 A),
enquanto que a colônia do isolado bastão do imperador apresentou coloração marrom-
alaranjado (Figura 7 B).
Por sua vez, foi observado nos isolados cupuaçu, melancia, nim, urucum, alternária
sp., milho, teca e café, apresentaram colônias de coloração marrom escuro e anéis
concêntricos bem visíveis conforme ilustra a Figura 7 C.
Figura 7. Crescimento micelial e coloração das colônias de R. solani oriundas de diferentes
culturas à 25
0
C durante 10 dias. A: isolado chama (Cayaponia espelina (Manso) Cogn), B:
isolado bastão do imperador (Etlingera Elatior (Jach) R. M. Sim) e C: isolado teca (Tectona
grandis L. F). Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2007.
A formação de microescleródios somente foi observada no período de 3 a 4 dias, numa
temperatura em torno de 25
0
C, nos isolados brasileiros: isolado de melancia, nim, soja,
repolho, jambu e teca, conforme ilustra a Figura 8. Fato não encontrado nos isolados
referentes aos isolados do Japão (AG4) e Estados Unidos (AG7) com relação à mesma
temperatura.
45
Figura 8. Formação de microescleródios de Rhizoctonia solani obtidos em meio de cultura
BDA. Temperatura de 25
0
C e umidade relativa em torno de 80%, durante 3 a 4 dias.
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2007.
Resultado similar foi obtido por Silveira et al. (2000) os quais observaram que
nenhum dos isolados microesclerodiais brasileiros, foi morfologicamente idênticos aos
representantes japoneses de Rhizoctonia solani do grupo de anastomose AG1-IB, e ausentes
de microescleródios.
Por outro lado, no estudo realizado por Nechet e Halfeld-Vieira (2006), foi verificada
a formação de microescleródios em isolados de Rhizoctonia solani em feijão-caupi, fato que
não foi observado neste trabalho com a respectiva cultura.
4.2 - Teste de patogenicidade
Os 22 isolados de Rhizoctonia solani obtidos a partir da parte aérea de plantas de acácia,
bastão do imperador, brachiaria, café, caupi, citrus, cupuaçu, chama, jambu, maracujá,
melancia, milho, nim, pepino, puerária, repolho, rúcula, soja, sorriso de maria, teca, urucum e
pimenta do reino mostraram patogênicos devido à presença de sintomas (queima foliar)
observados num período que variaram entre 3 a 4 dias após a inoculação do fungo em folhas
com ferimentos artificiais.
Inicialmente observaram-se lesões amareladas que evoluíram para manchas de
coloração marrom clara seguido de marrom escuro, conforme ilustra a Figura 9. E
conseqüentemente houve uma redução da área fotossintética com a evolução dos sintomas nas
folhas.
46
Figura 9. Sintomas típicos de queima foliar induzida por R. solani, observados em folhas de
citrus (Citrus sinensis (L.) Osbeck), após 3 a 4 dias de inoculação. Temperatura de 24
0
C e
umidade relativa em torno de 80%. Embrapa Amazônia Oriental, Belém- PA, 2007.
Após 8 dias de inoculação, à uma temperatura de 24
0
C e umidade relativa em torno de
80%, observaram-se a formação de microescleródios na superfície das folhas com ferimentos
artificiais, inoculadas com discos micelial. No entanto, em folhas destacadas na ausência de
ferimento apresentaram os sintomas típicos da doença somente após 10 e 11 dias de
inoculação conforme ilustra a Figura 10.
47
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Período de incubação
(dias)
COM FERIMENTO SEM FERIMENTO
Método de inoculação
Figura 10: Período de incubação (dias) nas plantas, até o aparecimento dos sintomas em
folhas destacadas, com ferimentos e sem ferimentos, inoculadas com Rhizoctonia solani em
condições laboratoriais. Temperatura de 24
0
C e umidade relativa em torno de 80%.
Relatos semelhantes foram obtidos também por Ogoshi (1987); Pascual et al., (2000),
onde R. solani associada a doenças com sintoma de queima foliar em diversas culturas, como
feijão, milho, sorgo, algodão, soja e arroz, podem pertencer ao grupo de anastomose AGI-IA
ou AGI-IB, após 7 dias de inoculação do patógeno.
No Brasil, isolados de Rhizoctonia spp. binucleados já haviam sido relatados
associados a podridão do hipocótilo na soja descrito por Fenille et al., (2002), necrose em
eucalipto estudado por Silveira et al., (2002) e podridão do colo e/ou radicular no feijoeiro
conforme estudos feito por Ceresini e Souza, (1997). Resultado similar também foi obtido por
Silveira et al., (2000), onde eles citaram que o isolado de Rhizoctonia solani (RH-21), é o
causador da mela do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), obtido de Linhares-ES, classificado no
grupo brasileiro de R. solani "AG1-IB similar".
Segundo Mafia et al. (2005), estudando a queima foliar e tombamento de mudas em
plantas medicinais da família Labiatae, causadas por Rhizoctonia solani AG1- 1B confirmou-
se que com a reprodução dos sintomas da doença por inoculação artificial nas mudas e o
reisolamento indireto, em meio de cultura batata dextrose ágar (BDA), do mesmo fungo a
partir de tecidos doentes confirmou-se Rhizoctonia solani, como agente etiológico da doença,
conforme é observado no presente trabalho.
48
4.3 - Variabilidade Genética
O procedimento seguido na execução deste trabalho permitiu detectar que as extrações
de DNA genômico possibilitaram a obtenção de DNA em concentrações que variaram de 10
ng/μL a 50 ng/μL.
Os resultados obtidos podem ser observados na Figura 11 (RAPD). Obteve-se um total
de 17 fragmentos RAPD, com tamanhos variando de 800 a 1800 pb (pares de bases
nucleotídicas), amplificados pelos 2 primers utilizados (OPA2 e OPA3) da Operon, gerando
100% de polimorfismo dos 14 isolados, sendo que o OPA2 amplificou nove (9) bandas e o
OPA3, oito (8) bandas polimórficas.
M R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 A11 R12 R13 R14 R15
Figura 11: Eletroforese em gel de agarose, mostrando o polimorfismo de Rhizoctonia solani,
pela técnica de RAPD com o primers OPA 2. M corresponde ao marcador Ladder 1 kb, e os
genótipos analisados são: R1 - chama (Cayaponia espelina (Manso) Cogn.), R2–rúcula
(Euruca sativa (L.) Cav.), R3- bastão do imperador (Etlingera elatior (Jach) R. M. Sim), R4 –
cupuaçu (Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.), R5– melancia (Citrullus vulgaris
Schrad), R6– puerária (Puerária phaseoloides (Roxb.) Benth), R7- AG7, R8- AG4, R9– nim
(Azadirachta indica A. Juss), R10– citrus (Citrus sinensis (L.) Osbeck, A11– alternária spp,
R12 milho (Zea mays L.), R13– acácia (Acácia farnesiana (L.) Willd.), R14– café (Coffea
arábica L.), R15- controle negativo (sem DNA).
49
As estimativas de similaridade genéticas, entre os isolados, obtidas a partir do
coeficiente de Jaccard estão presentes na Figura 12, onde a similaridade genética média
encontrada entre os isolados de R. solani foi de 21,71%.
A maior similaridade genética foi obtida entre as culturas R7 referente ao isolado de
melancia e R8, isolado nim com índice igual a 1,00. A segunda maior similaridade foi de
75%, entre R5 (isolado de R. solani do grupo de anastomose AG7) e R6 (isolado do grupo de
anastomose AG4).
Grande parte das amostras apresentou pouca ou nenhuma similaridade entre os
isolados.
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14
R1
1,00
R2
0,50 1,00
R3
0,13 0,20 1,00
R4
0,13 0,00 0,00 1,00
R5
0,50 0,50 0,00 0,20 1,00
R6
0,43 0,40 0,00 0,17 0,75 1,00
R7
0,14 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00
R8
0,14 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 1,00
R9
0,00 0,00 0,00 0,17 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00
R10
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00
R11
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00
R12
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 0,00 1,00
R13
0,13 0,00 0,00 0,50 0,20 0,40 0,00 0,00 0,17 0,00 0,00 0,00 1,00
R14
0,20 0,29 0,29 0,00 0,13 0,25 0,00 0,00 0,25 0,00 0,00 0,00 0,13 1,00
Figura 12: Matriz de similaridade genética estimada pelo índice de Jaccard, para todos os
isolados analisados de Rhizoctonia solani.
Na Figura 13, encontra-se o dendrograma gerado pelo método UPGMA, através do
programa NTSYS-pc, 2.02. A partir da média encontrada, a clusterização (Figura 13)
provocou a separação dos isolados em sete (7) grupos principais.
A maior similaridade genética encontrada entre os isolados foi R7 (AG7) e R8 (AG4)
com 100%. A segunda maior similaridade foi R5, isolado melancia e R6, isolado puerária
50
com 75% enquanto R11, isolado de alternária sp. ficou completamente isolado dos demais
isolados com nenhuma de similaridade genética fato explicado por pertencer a um grupo
taxonamente distintos.
Quatro grupos foram formados por duplas, os isolados R10, isolado citrus e R12,
isolado milho com 50% de similaridade, R7 isolado de R. solani do grupo de anastomose
(AG7) e R8 do grupo (AG4) com 100% de similaridade. O isolado R13, isolado acácia e R4
isolado cupuaçu com 50%. E o isolado de R3 isolado bastão do imperador e R14, isolado café
com 29% de similaridade genética, conforme ilustra a Figura 13.
Apenas um grupo apresentou maior número de isolados, sendo constituído por R1
isolado chama, R2 isolado rúcula, R5 isolado melancia e R6 isolado puerária com 46% de
similaridade. E dividiu-se em dois subgrupos, R5 isolado melancia e R6 isolado puerária com
similaridade genética de 75%, e R1 isolado chama e R2 isolado rúcula com 48% de
similaridade genética (Figura 13).
51
Figura 13: Dendrograma gerado pelo método de análise UPGMA para o coeficiente de
Jaccard, a partir das 17 bandas polimórficas geradas pelo RAPD, dos 13 isolados de
Rhizoctonia solani e 1 isolado de alternária sp.
Os isolados brasileiros (R1, R2, R3, R4, R5, R6, R9, R10, R11, R12, R13, R14),
apresentaram diferença no padrão de polimorfismo comparados com isolado japonês (R8) e
isolado procedente aos Estados Unidos (R7), uma explicação para esta diferença seria o fato
do isolamento reprodutivo (origem geográfica) ser mais pronunciado entre populações de R.
solani AG4 e AG7, que é um patógeno estritamente do solo, do que entre populações de R.
solani brasileiro, patógeno proveniente de parte aérea foliar das culturas.
Sartorato, Nechet e Vieira (2006), estudando 23 isolados de Rhizoctonia solani em
feijão caupi, nos ecossistemas de mata e cerrado, através do método RAPD, observaram que
52
os isolados coletados no cerrado são mais divergentes entre si que os isolados coletados no
ecossistema de mata.
A existência da divergência genética entre isolados/populações do fungo Rhizoctonia
solani já foi observada pelos autores LIU e SINCLAIR (1992) e GOMES et al. (2003). Esses
autores afirmaram que o fungo é altamente variável, o que explica a divergência encontrada
entre os isolados conforme mostra este trabalho. Variações quanto às exigências para
crescimento micelial in vitro dos isolados, decorrentes do isolamento, entre os isolados
brasileiros, japonês e dos Estados Unidos, podem explicar as variações obtidas nos padrões de
polimorfismo dos isolados. Literatura precedente também confirma haver abundante
variabilidade genética na população mundial de Rhizoctonia solani do grupo de anastomese
AG1 e AG4 (REYNOLDS et al., 1983; VILGALYS, 1988; LIU e SINCLAIR, 1993;
VILGALYS e GONZALES, 1990).
Desta forma, estes resultados mostram que o uso de marcadores RAPD, pode ser de
grande utilidade para a identificação e diferenciação de importantes fungos fitopatogênicos,
como referido nos trabalhos de SREENIVASAPRASAD et al. (1993, 1994); CORREL et al.
(1993); CROUS et al. (1993); SHERRIFF et al. (1994); VASCONCELOS et al. (1994);
SHERRIFF et al. (1995) e VIEIRA (1996).
53
5- CONCLUSÕES
Com os resultados obtidos no presente trabalho pode-se concluir que:
1. A análise de variância mostrou diferença significativa no crescimento micelial dos
22 isolados estudados.
2. Os isolados de R. solani mostraram-se patogênicos as plantas testadas, causando
sintomas típicos de queima das folhas nas plantas.
3. O uso da técnica RAPD permite determinar a variabilidade genética entre os 13
isolados de R. solani provenientes do Estado do Pará (Brasil), Estados Unidos e Japão.
4. De acordo com o perfil polimórfico dos isolados de R. solani, foi observada a
formação de sete grupos genotípicos.
5. Os parâmetros utilizados para estudos de variabilidade genética de R. solani, como
características morfológicas e molecular podem ser utilizados na diferenciação fisiológica do
fungo.
54
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66
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O aumento do potencial de produtividade da maioria das espécies agronômicas vem
ocorrendo de forma consistente desde o século XX. Recentemente, a diversidade de
procedimentos científicos utilizados no melhoramento de plantas foi expandida com o
desenvolvimento de técnicas de cultura de tecidos, de biologias molecular e celular e da
citogenética. Um dos maiores desafios no melhoramento de plantas é a identificação de
indivíduos ou progênies que contêm a combinação gênica desejável para as características de
interesse.
As genéticas quantitativas e mendeliana forneceram os principais subsídios para o
melhoramento de plantas. A genética quantitativa, entretanto, somente fornece informações
superficiais sobre a estrutura genômica, ao passo que a molecular complementa as genéticas
quantitativas e mendelianas para o entendimento da ação gênica.
Os marcadores moleculares podem ser utilizados para estimar a diversidade genética,
facilitar a seleção genotípica, identificar germoplasma, construir mapas genéticos e obter
informações sobre a estrutura das características quantitativas. Quando o fenótipo de um ou
mais marcadores é conhecido nos dois genitores, é possível determinar a origem de uma
progênie pela análise molecular. A paternidade de um indivíduo pode ser testada, se
conhecido o padrão dos marcadores moleculares do indivíduo e dos possíveis genitores.
A estratégia de utilização de técnicas biotecnológicas assume importância em
programas de seleção e manutenção de germoplasma de Rhizoctonia solani, bem como o
conhecimento da diversidade morfológica e genética do patógeno pode ser de grande valia em
um programa de melhoramento genético, uma vez que pode auxiliar os melhoristas na
identificação de novas fontes de resistência.
O objetivo geral deste trabalho foi analisar a diversidade genética do patógeno e ficou
constatado que Rhizoctonia solani, mesmo sendo a maioria do mesmo local de origem e de
hospedeiros distintos, apresentaram diversidade genética entre todos os isolados.
É necessário chamar atenção para o fato de que, a diversidade genética entre os
isolados demonstra o potencial de seu aproveitamento em programas de melhoramento
genético, uma vez que pode auxiliar os melhoristas na identificação de novas fontes de
resistência.
Embora a estratégia de amostragem empregada neste estudo fosse, provavelmente,
suficiente para maximizar a detecção de diversidade genética, amostragem adicional em áreas
67
maiores é necessária para elucidar a magnitude da clonalidade e/ou da recombinação em
populações locais do patógeno.
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