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UNIOESTE
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CAMPUS DE MARECHAL CÂNDIDO RONDON
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
NÍVEL MESTRADO
MICHELE POTRICH
ASSOCIAÇÃO DE VARIEDADES RESISTENTES DE MILHO E
FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS PARA O CONTROLE DE
Sitophilus
spp.
MARECHAL CÂNDIDO RONDON
MARÇO/2006
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MICHELE POTRICH
ASSOCIAÇÃO DE VARIEDADES RESISTENTES DE MILHO E
FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS PARA O CONTROLE DE
Sitophilus
spp.
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual do Oeste do Paraná, como parte
das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia - Nível Mestrado,
para obtenção do título de Mestre.
ORIENTADOR: Prof. Dr. LUIS FRANCISCO
ANGELI ALVES
MARECHAL CÂNDIDO RONDON
MARÇO/2006
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“Não é fácil encontrar a felicidade em nós
mesmos, mas é impossível encontrá-la em
outro lugar.”
Agnes Repplier
Dedico este trabalho aos meus pais,
Ivanete Dezem Potrich e Zeferino Roque
Potrich, por serem o Sol da minha vida.
AGRADECIMENTOS
Agradeço á Deus pela vida e pela coragem de vivê-la.
Agradeço aos meus pais, Ivanete Dezem Potrich e Zeferino Roque Potrich,
e a minha segunda mãe ‘nona’ Maria Dezem, a quem devo cada sorriso. Agradeço
ao carinho (que tanto faz falta) e aos momentos felizes ou não, mas que sempre
estiveram unidos, me apoiando e me incentivando. A vocês o meu eterno Amor.
Ao meu namorado Flávio E. Cechin, pela paciência, compreensão, apoio,
dedicação, amizade e carinho. Pelos sábados, domingos, férias e feriados que
passou me auxiliando no laboratório, e principalmente pelo seu amor. Amo você!
Agradeço à tia Lurdes, ao tio Severino e ao tio Amélio que me ajudaram
muito nesta caminhada, cada um ao seu modo. Muito Obrigada!
Ao amigo Everton R. L. da Silva, pelos incansáveis dias de estudo e
trabalho, pelas viagens, mau-humor, brincadeiras, risadas, bobeiras e acima de tudo
pela amizade.
Ao Ederval Cordeiro, Eder, por todas as conversas, risadas e ‘futilidades’, e
principalmente por ser uma pessoa tão maravilhosa. Muito Obrigada, amigo!
À Carla Frasson pelo companheirismo nesses dois anos e pela paciência.
À Natália Mertz, ‘Nati’, por todas as longas conversas, mesmo sem nexo,
altas gargalhadas de madrugada, e em especial, pela amizade e compreensão.
Aos meus amigos de trabalho que direta e indiretamente me auxiliaram,
Flávio, Sandra, Eduardo, Eliane e Joselba.
As minhas eternas amigas da faculdade, a famosa “turminha trá-lá-lá”, Gisa
e Cris, pelo carinho e dedicação à nossa amizade, mesmo à distância.
Agradeço a ‘turma’ do laboratório: Cris, Nati, Jú, Boni, Nina, Juce, Daian,
Dhyego, Lupa, Rose e Marina, o auxílio de vocês foi muito importante para a
realização deste trabalho, e as festinhas também!
Á Bióloga Andréia Bonini e ao Prof. Dr. Rodolfo, pelos auxílios estatísticos.
À Jucelaine pelo auxílio nas traduções e pelas horas de conversa.
Agradeço a turminha do Mestrado pelos grupos de estudo, conversas,
jantas, churrascos, cervejinhas e caipirinhas: Eder, Everton, Regina, Mary, Laércio,
Jorge e Rodolfo.
Agradeço à Prof
a
Dr
a
Vanda Pietrowski, pelas informações e sugestões para
dissertação e pelo auxílio em trabalhos paralelos, além da dedicação e amizade.
Ao prof. Dr. Pedro M.O.J. Neves por fazer parte da banca.
À Noili Batschke pela dedicação, auxílio, paciência e amizade.
Agradeço à Universidade Estadual do Oeste do Paraná (Unioeste), e ao
corpo docente do curso de Ciências Biológicas e do Mestrado em Agronomia.
À Coodetec, pelo fornecimento dos cultivares de milho.
Finalizo com um agradecimento muito especial ao Prof. Dr. Luis F. A. Alves,
pela orientação singular, pelos ensinamentos e pelos dias de dedicação (quase
exclusiva). Pelos atendimentos fora de hora, de data e com atrasos. Por apesar de
tudo, ter sido muito humano e ter compreendido todas as dificuldades, pela sua
amizade. Obrigada Luis!
ASSOCIAÇÃO DE VARIEDADES RESISTENTES DE MILHO E
FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS PARA O CONTROLE DE
Sitophilus spp.
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo associar estratégias e métodos de controle visando
minimizar os danos provocados por Sitophilus spp., visto que este inseto é
considerado o principal inseto-praga de milho armazenado. Assim, cultivares de
milho resistentes e suscetíveis ao ataque de Sitophilus spp. foram selecionados
através de testes com chance de escolha, para verificar a preferência alimentar, e
sem chance de escolha (confinamento), onde a biologia do inseto foi analisada, bem
como os danos ocasionados nos grãos e a perda de peso. Isolados de fungos
entomopatogênicos foram selecionados através de avaliações de patogenicidade e
comparação da virulência, determinação da concentração letal, crescimento
vegetativo, produção de conídios em placa-de-Petri, produção de conídios em arroz
e produção de conídios em cadáver. O cultivar suscetível e o cultivar resistente
foram associados aos isolados selecionados, sendo que estes foram inoculados nos
cultivares previa e posteriormente à infestação por Sitophilus spp. Verificou-se que o
cultivar CD 3121 apresentou resistência, aumentando a duração do ciclo ovo-adulto,
diminuindo o número de insetos emergidos e diminuindo a perda de peso dos grãos,
e não-preferência para alimentação por Sitophilus spp., enquanto o cultivar CD 307
apresentou suscetibilidade e preferência alimentar para este inseto. Verificou-se que
todos os isolados testados foram patogênicos a Sitophilus spp., no entanto, diferiram
quanto à virulência, sendo que 7 isolados causaram no mínimo 80% de mortalidade
confirmada neste inseto. Dentre estes, os 3 que apresentaram maior mortalidade
acumulada, ao 5
o
dia após a inoculação foram selecionados, sendo Unioeste 4,
Unioeste 39 e Esalq 643, no entanto, apenas os isolados Unioeste 4 e Esalq 643
foram selecionados para associação com os cultivares, pois apresentaram os
melhores resultados nos testes realizados. Analisando a associação entre os
isolados e os cultivares, verificou-se maior controle de Sitophilus spp., independente
da estratégia de tratamento dos grãos, sendo que a associação causou um aumento
na duração do ciclo ovo-adulto, diminuição no número de insetos emergidos,
diminuição na porcentagem de grãos danificados e diminuição na perda de peso,
tanto para o cultivar CD 3121, quanto para o cultivar CD 307, e para ambos isolados.
Contudo, a associação dos isolados com o cultivar CD 3121 destacou-se para
controle de Sitophilus spp., sendo que as médias apresentadas por este cultivar
foram mais expressivas.
Palavras-chave
: Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Zea mays, cultivares
resistentes, gorgulhos.
ASSOCIATION OF RESISTENT VARIETIES OF CORN AND
ENTOMOPATHOGENIC FUNGI FOR CONTROL OF Sitophilus spp.
ABSTRACT
This work’s objective was to associate strategies and control methods, aiming to
minimize the damage caused by Sitophilus spp., in as much as it is considered the
main pest insect in stored corn. Thus, corn cultivars resistant and susceptible to
Sitophilus spp. attack were chosen through tests with chance of choice, to verify the
feeding preference, and without chance of choice (confinement), where the insect’s
biology was analyzed, as well as the damage caused to the grains and the weight
loss. Isolates of entomopathogenic fungi were selected through pathogenicity
evaluations and lethal concentration, vegetative growth, conidia production in petri
dishes, rice and in corpses. The susceptible and resistant C were associated to the
selected isolates, and these were inoculated in the cultivars before and after the
Sitophilus spp. infestation. It was verified that the cultivars CD 3121 presented
resistence, increasing the duration of the egg-adult cicle, diminishing the number of
emerged insects and diminishing the weight loss of the grains, and showed non-
preference to feeding by Sitophilus spp., while cultivar CD 307 presented
susceptibility and feeding preference to this insect. It was verified that all tested
isolates were pathogenic to Sitophilus spp. Nevertheless, they differed about
virulence, when 7 isolates caused at least 80% of confirmed mortality of this insect.
Among these, the 3 that presented higher accumulated mortality at the 5
th
day after
inoculation were selected: Unioeste 4, Unioeste 39 and Esalq 643. However, just
isolates Unioeste 4 and Esalq 643 were selected to be associated to the cultivars,
because they presented the best results on the realized tests. Analising the
association between the isolates and the cultivars, higher control of Sitophilus spp.
was verified, independent of the grain treatment strategy. The association caused an
increase in the duration of the duration of the egg-adult duration, decrease of the
number of emerged insects, decrese of damaged grains percentage and decrese of
weight loss, for both cultivars CD 3121 and CD 307, and for both isolates. On the
other hand, the isolates association with cultivars CD 3121 standed out for the control
of Sitophilus spp., and the averages presented by this cultivar were more expressive.
Keywords: Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Zea mays, resistent
cultivar, weevil.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1
Criação de Sitophilus spp. em frascos de vidro vedados com tecido
fino, contendo arroz polido .......................................................................45
FIGURA 2
Bandeja com recipientes para disposição dos cultivares de milho para
experimento com chance de escolha. O ponto central indica o local de
liberação dos insetos. ..............................................................................49
FIGURA 3 Experimento de estratégia de aplicação (Inoculação pré e pós
Infestação) e integração dos métodos. ....................................................58
FIGURA 4
Cultivar CD 307, à esquerda grãos sadios e à direita grãos danificados
por Sitophilus spp. ....................................................................................71
FIGURA 5
Cultivar CD 3121, à esquerda grãos sadios e à direita grãos
danificados por Sitophilus spp..................................................................71
FIGURA 6 Eficiência de diferentes isolados de B. bassiana e M. anisopliae na
mortalidade confirmada de adultos de Sitophilus spp. (26±1°C, 14
horas de fotofase).....................................................................................76
FIGURA 7 Mortalidade confirmada acumulada de adultos de Sitophilus spp. por
fungos entomopatogênicos.......................................................................78
FIGURA 8
Porcentagem de mortalidade confirmada diária de adultos de Sitophilus
spp. por isolados de B. bassiana (26±1°C, 14 horas de fotofase)............79
FIGURA 9 Porcentagem média de mortalidade de Sitophilus spp., submetidos a
diferentes concentrações de conídios de isolados de Beauveria
bassiana, 10 dias após incubação (26±1°C, 14 horas de fotofase)..........84
FIGURA 10 Colônia de B. bassiana, A) isolado Unioeste 4, B) isolado Esalq 643 e
C) isolado Unioeste 39, cultivado em M.E, 8 dias após incubação
(26±1°C, 14 horas de fotofase).................................................................87
FIGURA 11 Crescimento vegetativo e produção de conídios em meio de cultura
de isolados de fungos entomopatogênicos (26±1°C, 14 horas de
fotofase)....................................................................................................90
FIGURA 12
Conidiogênese de B. bassiana sobre Cadáveres de Sitophilus spp.,
10 dias após inoculação (26 ± 1°C, 14 horas de fotofase). ......................94
LISTA DE TABELAS
TABELA 1
Relação de cultivares de milho comercial, utilizados no experimento e
suas respectivas características físicas. ................................................44
TABELA 2
Isolados de fungos entomopatogênicos utilizados no bioensaio e
respectiva origem. .................................................................................47
TABELA 3 Tratamentos realizados na 3
a
fase, compondo as estratégias de
aplicação e integração dos métodos, controle biológico e variedades
resistentes, para controle de Sitophilus spp...........................................60
TABELA 4
Porcentagem média (±EP)
de atratividade de Sitophilus spp. para os
diferentes cultivares de milho, em teste com chance de escolha,
após 24 horas de exposição. .................................................................61
TABELA 5
Duração média do ciclo biológico, número e peso de adultos de
Sitophilus spp. emergidos das variedades de milho, em teste sem
chance de escolha.................................................................................66
TABELA 6
Porcentagem média de grãos danificados, porcentagem média de
perda total de peso dos grãos de milho e perda média total (g),
causados por Sitophilus spp., em teste sem chance de escolha...........70
TABELA 7
Porcentagem média de mortalidade confirmada de adultos de
Sitophilus spp. por diferentes isolados de B. bassiana e M. anisopliae
após 10 dias de incubação (26
±
1
°
C, 14 horas de fotofase).. ................75
TABELA 8 Porcentagem média de mortalidade (± EP) de adultos Sitophilus spp.
submetidos a diferentes concentrações de conídios de isolados de
Beauveria bassiana ao 5
o
e ao 10
o
dia após inoculação (26±1°C, 14
horas de fotofase)..................................................................................82
TABELA 9
Diâmetro médio e produção média de conídios em colônias (± EP) de
diferentes isolados de B. bassiana em meio de cultura, 8 dias após
incubação (26±1°C, 14 horas de fotofase).............................................88
TABELA 10
Número médio de conídios produzidos em arroz e em cadáveres (
±
EP) de Sitophilus spp. (26±1°C, 14 horas de fotofase)..........................93
TABELA 11 Efeito da associação dos cultivares CD 3121 e CD 307 com os
isolados de Beauveria bassiana, Unioeste 4 e Esalq 643, sobre a
duração média do ciclo biológico (± EP) de Sitophilus spp., quando a
infestação ocorreu previa ou posteriormente a inoculação dos
isolados..................................................................................................96
TABELA 12
Efeito da associação dos cultivares CD 3121 e CD 307 com os
isolados de Beauveria bassiana, Unioeste 4 e Esalq 643, sobre o
número de Sitophilus spp. emergidos (± EP) dos grãos de milho,
quando a infestação ocorreu previa ou posteriormente a inoculação
dos isolados...........................................................................................99
TABELA 13 Efeito da associação dos cultivares CD 3121 e CD 307 com os
isolados de Beauveria bassiana, Unioeste 4 e Esalq 643, sobre o
peso médio (± EP) dos insetos de Sitophilus spp., quando a
infestação ocorreu previa ou posteriormente a inoculação dos
isolados................................................................................................101
TABELA 14 Efeito da associação dos cultivares CD 3121 e CD 307 com os
isolados de Beauveria bassiana, Unioeste 4 e Esalq 643, sobre a
porcentagem média (± EP) de grãos de milho danificados por
Sitophilus spp., quando a infestação ocorreu previa ou
posteriormente a inoculação dos isolados. ..........................................103
TABELA 15
Efeito da associação dos cultivares CD 3121 e CD 307 com os
isolados de Beauveria bassiana, Unioeste 4 e Esalq 643, sobre a
perda de peso (± EP) dos grãos de milho provocado por Sitophilus
spp., quando a infestação ocorreu previa ou posteriormente a
inoculação dos isolados.......................................................................106
TABELA 16
Efeito da associação dos cultivares CD 3121 e CD 307 com os
isolados de Beauveria bassiana, Unioeste 4 e Esalq 643, sobre a
porcentagem média de perda de peso (± EP) dos grãos de milho,
provocado por Sitophilus spp., quando a infestação ocorreu previa
ou posteriormente a inoculação dos isolados. .....................................107
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................13
2 REVISÃO DE LITERATURA
................................................................................15
2.1 MILHO (Zea mays L.) .........................................................................................15
2.2 GORGULHO-DO-MILHO (Sitophilus zeamais Mots., 1855) e GORGULHO-DO-
ARROZ (Sitophilus oryzae L., 1763) (Coleoptera: Curculionidae) .......................17
2.2.1 Caracterização e Biologia.................................................................................17
2.2.2 Danos ..............................................................................................................19
2.3 MÉTODOS DE CONTROLE ..............................................................................21
2.3.1 Controle Químico ............................................................................................22
2.3.1.1 Inseticidas .....................................................................................................23
2.3.2 Terra de Diatomáceas .....................................................................................24
2.3.3 Controle Biológico e Controle Microbiano .......................................................26
2.3.4 Variedades Resistentes ...................................................................................31
2.3.4.1 Nutrientes e Substâncias Atrativas ...............................................................33
2.3.4.2 Dureza ..........................................................................................................34
2.4 ASSOCIAÇÃO DE CONTROLE BIOLÓGICO E OUTROS MÉTODOS DE
CONTROLE DE INSETOS-PRAGA ....................................................................36
2.4.1 Associação de Controle Biológico e Variedades Resistentes ..........................36
2.4.2 Associação de Controle Biológico com Controle Químico ou Pós Inertes ......39
3 OBJETIVOS
..........................................................................................................43
4 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................44
4.1 SELEÇÃO DOS CULTIVARES DE MILHO.........................................................48
4.1.1 Teste com chance de escolha..........................................................................48
4.1.2 Teste sem chance de escolha (confinamento) ................................................50
4.2 SELEÇÃO DE ISOLADOS DE FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS .................51
4.2.1 Avaliação da Patogenicidade ...........................................................................51
4.2.2 Comparação dos Isolados ...............................................................................53
4.2.2.1 Comparação da Virulência ...........................................................................53
4.2.2.2 Determinação da Concentração Letal (CL
50
) ................................................53
4.2.2.3 Crescimento Vegetativo ...............................................................................54
4.2.2.4 Produção de Conídios em placa-de-Petri .....................................................55
4.2.2.5 Produção de Conídios em Arroz ..................................................................55
4.2.2.6 Produção de Conídios em Cadáver de Insetos Adultos ................................56
4.3 ASSOCIAÇÃO DAS VARIEDADES RESISTENTES E FUNGO
ENTOMOPATOGÊNICO .....................................................................................57
4.3.1 Inoculação pré-infestação ...............................................................................58
4.3.2 Inoculação pós-infestação ...............................................................................59
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
.............................................................................61
5.1 SELEÇÃO DOS CULTIVARES DE MILHO ........................................................61
5.1.1 Teste com chance de escolha .........................................................................61
5.1.2 Teste sem chance de escolha (confinamento) ................................................65
5.2 SELEÇÃO DE ISOLADOS DE FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS .................74
5.2.1 Avaliação da Patogenicidade ..........................................................................74
5.2.2 Comparação dos Isolados ...............................................................................77
5.2.2.1 Comparação da Virulência ...........................................................................77
5.2.2.2 Determinação da Concentração Letal (CL
50
) ................................................80
5.2.2.3 Crescimento Vegetativo ...............................................................................86
5.2.2.4 Produção de Conídios em placa-de-Petri .....................................................89
5.2.2.5 Produção de Conídios em Arroz ..................................................................92
5.2.2.6 Produção de Conídios em Cadáver de Insetos Adultos ................................93
5.3 ASSOCIAÇÃO DAS VARIEDADES RESISTENTES E FUNGO
ENTOMOPATOGÊNICO .....................................................................................95
6 CONCLUSÕES ................................................................................................... 109
REFERÊNCIAS
......................................................................................................110
1 INTRODUÇÃO
O milho (Zea mays) é considerado uma das mais importantes culturas no
mundo, sendo que o Brasil está entre os maiores produtores, e o Paraná vem sendo
o estado destaque em produção nos últimos anos. No entanto, o milho sofre graves
perdas que estão relacionadas ao mau armazenamento dos grãos, predispondo o
produto ao ataque de microrganismos, roedores e insetos-praga.
Dentre os insetos-praga, os de maior importância no milho armazenado e,
responsáveis pelos maiores danos e prejuízos na sua qualidade são Sitophilus
oryzae e S. zeamais. Estes insetos são pequenos besouros, medindo cerca de 3mm,
conhecidos como gorgulho-do-arroz e gorgulho-do-milho, respectivamente.
O ataque desses insetos torna o milho impróprio para a industrialização e
para o consumo humano, devido à perda da qualidade nutritiva, perda de higiene e
contaminações. O produto final, destinado a alimentação animal, também é afetado,
pois além destes fatores, ainda ocorre perda em peso.
Os métodos de controle mais utilizados para estes insetos ainda são os
produtos químicos, como o expurgo com fosfina (fosfeto de alumínio ou fosfeto de
magnésio), no entanto os estudos demonstram a persistência desses produtos nos
alimentos e no meio ambiente, além de serem tóxicos aos aplicadores e
selecionarem populações de insetos resistentes.
A demanda mundial por alimentos cada vez mais saudáveis, exige que a
qualidade do grão colhido na lavoura seja mantida, e com o mínimo possível de
perdas, além da racionalização quanto à utilização dos produtos químicos. Ressalta-
se, dessa forma, a importância do controle microbiano em relação ao controle
químico, visto que em países em desenvolvimento, os movimentos da agricultura
orgânica e anti-química tendem a oferecer maiores oportunidades ao controle
microbiano. No caso específico de Sitophilus spp., os fungos entomopatogênicos,
Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae, mostraram-se promissores como
agentes de controle microbiano.
A utilização de cultivares de milho, resistentes a Sitophilus spp., também é
uma prática utilizada, principalmente, nos Estados Unidos, tendo como vantagens a
facilidade do emprego e de associação com outros métodos de controle.
A associação de métodos de controle para a supressão de insetos-praga
vem sendo estudada e realizada com sucesso em outras culturas, no entanto, não
se tem relato da associação de cultivares de milho resistente e fungos
entomopatogênicos para o controle de Sitophilus spp., justificando com isso a
integração destes métodos, visando maior controle destes insetos, reduzindo a
contaminação do alimento e impacto ao ambiente.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 MILHO (Zea mays L.)
O milho é uma das mais importantes culturas no mundo, sendo que em
2004 a produção mundial chegou a 600 milhões de toneladas. No Brasil, esta cultura
também é considerada uma das mais importantes, possuindo extensas áreas
cultivadas. Segundo dados da CONAB (Companhia Nacional de Abastecimento), a
área total de milho no Brasil, nas safras 2005/06 foi de 12.490.800 ha. O estado do
Paraná tem ficado em primeiro lugar nos últimos 15 anos, e nessa safra chegou a
4.362.200 ha, o que corresponde a 35% da área nacional cultivada com milho
(Brasil, 2005 e 2006).
O milho depois de colhido é armazenado em granel, em sacaria ou em
espigas com palha. Porém, quando armazenado sem os devidos cuidados, sofre
grandes perdas causadas por insetos-praga (Santos, 1993; Toscano et al., 1999;
Gallo et al., 2002), sendo considerado o produto com piores condições de
armazenamento (Santos, 1993).
Este problema tem origem, segundo Lorini (1999), em diversos fatores,
dentre os quais destaca-se a inadequada estrutura armazenadora, em geral,
grandes armazéns graneleiros, com sistema deficiente ou inexistente de controle de
temperatura e ausência ou deficiência no sistema de aeração. Os grãos são
depositados nesses armazéns, onde permanecem até a retirada para o consumo,
não havendo monitoramento de temperatura, de umidade e de presença de insetos,
determinando uma perda quanti e qualitativa.
Ainda segundo este autor, os principais cuidados de armazenamento estão
relacionados com a limpeza e higiene no local onde o produto será armazenado e de
todas as demais estruturas envolvidas neste armazenamento, eliminando resíduos
de grãos e pós. Esses resíduos devem ser queimados para que não haja a
proliferação de insetos que possam vir a reinfestar as unidades armazenadoras.
Conforme os cuidados tomados no armazenamento, pode-se aumentar ou
não a predisposição do produto à deterioração. Essa deterioração depende de
vários fatores, dentre eles os agentes biológicos, que englobam bactérias, ácaros,
fungos, insetos e roedores. Em grande parte do Brasil, os insetos são considerados
as principais pragas destes produtos armazenados, uma vez que a massa de grãos
constitui um ambiente ideal para o seu desenvolvimento (Guedes, 1990/1991).
O armazenamento do milho em espigas não é muito utilizado, mesmo
sabendo-se que o bom empalhamento atua como proteção natural dos grãos contra
os insetos-praga. Essa não utilização desse método de armazenagem deve-se entre
outras coisas a maior dificuldade para o controle dos insetos, pelo fato destes
penetrarem a espiga em local que os produtos não conseguem atingi-los (Santos,
1993).
2.2 GORGULHO-DO-MILHO (Sitophilus zeamais Mots., 1855) e GORGULHO-DO-
ARROZ (Sitophilus oryzae L., 1763) (Coleoptera: Curculionidae)
2.2.1 Caracterização e Biologia
Sitophilus zeamais e S. oryzae são considerados as principais pragas de
produtos armazenados no Brasil, principalmente do milho e do arroz,
respectivamente. São importantes por serem pragas primárias, pelo seu alto
potencial biótico, infestações cruzadas, fácil deslocamento através da massa de
grãos, elevado número de hospedeiros e por causarem dano tanto na fase larval
quanto na adulta. Embora as duas espécies sejam normalmente encontradas juntas
em uma mesma massa de grãos, o mais comum em milho é S. zeamais (Ramalho et
al., 1976; Vendramim et al., 1992; Santos, 1993; Lorini, 1998 e Lorini, 1999 e Gallo
et al., 2002). Este fato também foi relatado por Oduor et al. (2000), que encontrou
esta espécie em elevadas proporções nos armazéns de zonas agroecológicas do
Kenya, ocorrendo entre 77,7% a 94,7% dos insetos coletados.
Estes insetos atacam diversos grãos armazenados como o trigo, milho,
arroz, sorgo, cevada, triticale, feijão e alimentos beneficiados como macarrão, frutas
secas e chocolate (Bianco, 1991; Vendramim et al., 1992; Lorini, 1999 e Gallo et al.,
2002). Além destes produtos, Botton et al. (2005) verificaram a ocorrência de S.
zeamais na cultura da videira no Rio Grande do Sul, atacando as bagas em fase de
maturação, observaram também, que todos os parreirais onde foram constatados os
danos do inseto, eram próximos a silos ou paióis de milho, que não possuíam o
controle desses.
Adultos de Sitophilus são pequenos besouros, castanhos-escuros, com
manchas avermelhadas nos élitros (visíveis logo após a emergência) que são
densamente estriados. As espécies do gênero Sitophilus spp. são muito
semelhantes em caracteres morfológicos e podem ser distinguidas por pontuações
no pronoto ou somente pelo estudo da genitália. Medem em torno de 3mm de
comprimento e possuem a cabeça projetada à frente em forma de rostro
(característica da família Curculionidae), sendo nas fêmeas mais longo e afilado e
nos machos mais curto e grosso. O aparelho bucal é do tipo mastigador, possuindo
mandíbulas fortes o suficiente para romperem a dureza dos grãos armazenados
(Bianco, 1991; Santos, 1993; Lorini, 1998; Lorini, 1999 e Gallo et al., 2002).
O período de ovo a emergência dos adultos dura, em média, 34 dias, sendo
a longevidade dos adultos cerca de 140 dias. O ciclo reprodutivo começa quando a
fêmea, utilizando as mandíbulas, perfura um orifício no grão, geralmente na região
do embrião, depositando, em seguida, um ovo. A eclosão do ovo se dá após um
período médio de quatro dias e tem coloração amarelo-clara, com a cabeça mais
escura. Alimentam-se das partes internas do grão, desenvolvem-se, passando por
quatro instares larvais e transformam-se dentro do grão em pupa de coloração
branca. Em seguida, o inseto atinge a fase adulta que perfura um orifício de forma
irregular para sair do grão, acasalando dois a três dias após a saída (Santos &
Foster, 1981b; Vendramim et al., 1992; Santos; 1993; Lorini, 1998 e Gallo et al.,
2002).
O período para completar o ciclo biológico depende da temperatura,
umidade relativa do ar e de características físico-químicas do grão, como umidade,
dureza e disposição de nutrientes. Em temperaturas mais elevadas (30ºC), com
umidade do ar de 70% e grãos dentados e macios, com 13,5% de umidade, o ciclo
biológico pode ser até 10 dias mais curto em relação ao ciclo deste mesmo inseto,
mas em condições não tão favoráveis ao seu desenvolvimento (Vendramim et al.,
1992 e Santos, 1993).
2.2.2 Danos
Os gorgulhos são classificados como pragas primárias internas, que são
aquelas capazes de romper o grão intacto para atingir o endosperma, onde se
alimentam. Além disso, o seu desenvolvimento ocorre no interior dos grãos o que
possibilita a instalação de outros agentes de deterioração (Matioli & Almeida, 1979a;
Guedes, 1990/1991; Santos, 1993 e Lorini, 1999).
O milho atacado por estes insetos é comumente classificado como milho
carunchado, que segundo a Abimilho (2002) (Associação Brasileira das Indústrias
Moageiras de Milho), grãos carunchados são furados, broqueados e com túneis,
denotando dano característico causado por insetos de grãos armazenados.
As perdas causadas por estes insetos podem equivaler, ou mesmo superar,
aquelas provocadas pelos insetos-praga que atacam a cultura no campo, sendo que
os danos sofridos pela planta em desenvolvimento podem ser compensados, em
parte, por uma recuperação da própria planta danificada, ou pelo aumento da
produção das plantas não atacadas, mas os danos sofridos pelos grãos
armazenados são definitivos e irrecuperáveis (Santos, 1993).
Os insetos, de maneira geral, são classificados por Lorini (1999) como os
maiores causadores de perdas físicas de grãos e subprodutos, além da perda de
qualidade. Os danos causados por Sitophilus spp., no milho a granel ou em
sacarias, pode chegar a 60% em 6 meses, sendo que neste mesmo período a perda
em peso pode ultrapassar 15% (Ramalho et al., 1976 e Matioli & Almeida, 1979a e
Embrapa, s.d.).
No caso do milho armazenado, se for encontrado um inseto vivo em um lote
de grãos, o produto é desclassificado para a comercialização destinada à
alimentação humana, sendo designado para a produção de ração animal (Santos,
1993 e Lorini, 2002b). O grau de tolerância à infestação dos grãos está muito
relacionado ao poder aquisitivo da sociedade consumidora, sendo que nos Estados
Unidos, Austrália e países europeus, não se tolera a presença de um único inseto na
massa de grãos. Já no Brasil, o baixo poder aquisitivo da população, faz com que
não se consiga pagar o custo dos métodos de controle que garantam alimentos
livres de qualquer inseto e sem resíduos tóxicos, sendo freqüente o encontro destes
em cereais comercializados (Santos, 1993).
Os produtos infestados sofrem desvalorização pela perda na qualidade
sanitária decorrente da presença dos insetos, pela contaminação por fezes, odores,
insetos mortos ou fragmentos destes, e mesmo pelo apodrecimento dos grãos. Os
subprodutos também sofrem perdas na qualidade, principalmente a fabricação de
farinhas (Vendramim et al., 1992; Lorini, 1999 e Lorini, 2002b). Pelo fato da larva e
do adulto do gorgulho se alimentarem dos grãos, a perda em peso é elevada, e
quando a perda chega a 25%, compromete significativamente a qualidade nutricional
do produto, sendo que o seu valor nutritivo passa a ser considerado praticamente
nulo (Ramalho et al., 1976 e Matioli & Almeida, 1979a).
Segundo Matioli & Almeida (1979b), a percentagem de óleo (substâncias
graxas e lipídios) perdida no milho pelo ataque do gorgulho difere de acordo com os
cultivares. Esta diminuição na quantidade de óleo dos grãos está relacionada à
necessidade e a importância das gorduras na fisiologia dos insetos. Estes autores
também verificaram que o índice de acidez do óleo aumentou com o aumento da
população de S. oryzae, relacionando este fato com a quantidade de excrementos
produzidos. Este aumento prejudica a industrialização do produto, visto que ele
necessita de um refinamento mais complexo, elevando os custos de produção, e
mesmo assim, prejudicando a qualidade final do óleo que chega ao consumidor.
Em relação às proteínas, o consumo feito por S. oryzae é baixo, isso se
explica, pelo fato de os insetos a sintetizarem no próprio organismo (Matioli &
Almeida, 1979c).
Segundo este mesmo autor, são grandes as perdas dos grãos em relação
aos carboidratos, explicando a preferência dos gorgulhos pelo endosperma da
semente, uma região rica nesses nutrientes, pois essas moléculas são importantes
como fonte de energia para os insetos. Assim, depois de rompido o tegumento, o
teor de glicídios é que passa a determinar a suscetibilidade dos cultivares a S.
oryzae.
Com o aumento da infestação de S. zeamais e S. oryzae, ocorrem danos
irreversíveis, e com a redução na qualidade, o milho passa a sofrer graves quedas
na sua classificação comercial (Caneppele et al., 2003).
2.3 MÉTODOS DE CONTROLE
Os principais métodos de controle de insetos-praga de grãos armazenados
são os métodos físicos, que são divididos em temperatura, umidade relativa do ar,
atmosfera controlada, pós-inertes, remoção física, radiação, luz e som (Lorini, 1999).
Destaca também os métodos químicos de controle, que ainda são os mais
empregados, enfatizando o tratamento preventivo e curativo de grãos.
No caso dos grãos armazenados, a estratégia preventiva assume maior
importância, pela própria dificuldade no estabelecimento de níveis de ação e de
metodologias eficientes de amostragem. No entanto, Guedes (1990/91) ressalta que
a estratégia preventiva é muitas vezes confundida com controle químico. Estes
últimos constituem a base de todo o controle de insetos-praga de grãos
armazenados, sendo que poucas táticas diferem desta e poucos lugares vêm
realizando controle alternativo, quando então muda-se a base dos produtos
utilizados.
Desta forma, além de inseticidas químicos utilizados para o controle de
Sitophilus spp., as estratégias alternativas empregadas são o controle microbiano e
cultivares resistentes, além da associação de métodos de controle.
2.3.1 Controle Químico
Os produtos químicos apresentam vantagens, como o amplo espectro de
ação, rapidez de controle, persistência no meio, facilidades de emprego, que não
requerem maiores informações sobre a origem das pragas, e em alguns casos, não
se verificam resíduos presentes nos alimentos (Van Driesche & Bellows Júnior, 1996
e Sgarbiero et al., 2003). Porém, estes produtos causam impactos ambientais, como
contaminações dos solos, alimentos, águas superficiais e subterrâneas, colocando
em risco a saúde dos consumidores e dos próprios agricultores, dos animais
domésticos e desequilibra os ecossistemas (Azevedo, 1998; Lacey et al., 2001 e
Spadotto, 2002).
2.3.1.1 Inseticidas
Para o controle de Sitophilus spp., os produtos químicos ainda são
eficientes (Santos & Foster, 1981a), tendo início na década de 50 com o uso do DDT
(diclorodifeniltricloretano) em pó para o combate das pragas de milho em espiga.
Seu uso foi, no entanto, proibido devido à sua persistência no meio ambiente e ao
seu acúmulo no tecido gorduroso animal. Além de causar graves impactos
ambientais, muitos relatos surgiram com a preocupação em relação à resistência de
insetos-pragas a este produto (Santos, 1993; Kogan & Bajwa, 1999 e Cruz, 2002).
Comprovou-se a resistência de populações de S. oryzae, de diferentes
estados do Brasil, ao Malathion, Pirimifós Metílico, Fenitrotion e Fosfina, e de S.
zeamais à Fosfina e Deltametrina (Guedes, 1990/91; Ceruti & Lazzari, 2003). Plazas
et al. (2003) verificaram a resistência de populações de Sitophilus spp. ao
Fenitrotion.
Conforme Santos (1993), o melhor método empregado para se controlar os
insetos, tanto a granel como em sacaria, é o expurgo com Fosfina, sendo um
método eficiente e barato, no entanto, deve ser realizado por pessoas habilitadas, de
acordo com as normas de segurança, para que não ocorra o vazamento de gás
durante o processo, o que pode prejudicar a saúde dos aplicadores e contaminar o
ambiente.
Hoje, na operação de expurgo, emprega-se a Fosfina (fosfeto de alumínio
ou fosfeto de magnésio) em pastilha, no entanto, se não aplicada na concentração
recomendada, pode deixar resíduos nos grãos, inutilizando-os para a alimentação
(Gallo et al., 2002 e Andrade Júnior et al., 2003).
Vários problemas são ocasionados pelo uso indiscriminado dos produtos
químicos, como a seleção de populações resistentes e o surgimento de novos
insetos-praga. Paralelamente, surgiu uma grande preocupação por parte da
população com a qualidade dos alimentos consumidos, o que pressionou a procura
por novas técnicas de controle visando o Manejo Integrado de Pragas (MIP).
Dessa forma, estudos com o uso de inseticidas de origem vegetal, pós
inertes e inimigos naturais vêm sendo realizados, visando o controle de Sitophilus
spp. (Van Driesche & Bellows Júnior, 1996 e Lacey et al., 2001; Procópio et al., 2003
e Tavares & Vendramim, 2005).
2.3.2 Terra de Diatomáceas
A terra de diatomáceas é um pó inerte proveniente de algas diatomáceas
fossilizadas, possuindo dióxido de sílica como seu principal elemento. A sílica
provoca desidratação nos insetos, matando-os de um a sete dias. É um produto
seguro para o operador e para o consumidor, com ação inseticida duradoura e não
perde seu efeito ao longo do tempo. Para o tratamento de milho armazenado, é
utilizada na concentração de 1Kg/ton. de grãos (Korunic, 1998; Lorini et al., 2001 e
Lorini, 2002a)
A comparação realizada por Lorini et al. (2001) entre terra de diatomáceas e
Fosfina para tratamento de grãos de milho, demonstrou a superioridade no uso de
terra de diatomáceas já no primeiro ano de utilização. Segundo estes autores, na
concentração recomendada, não é prejudicial ao aplicador e ao consumidor e nem
aos outros seres vivos, não compromete o meio ambiente, pois não produz resíduos
tóxicos, sendo considerado um produto não-químico. Existem produtos comerciais à
base de terra de diatomáceas já registrados no Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento.
O contato de S. granarius com terra de diatomáceas provoca a perda de
peso nesses insetos, além de causar alta mortalidade quando em baixa umidade
relativa, sendo que com o aumento da umidade relativa diminui significativamente a
mortalidade (Mewis & Ulrichs, 2001).
Arthur & Throne (2003) verificaram a eficácia de terra de diatomáceas em S.
oryzae e S. zeamais, e observaram que tanto as fases internas (larvas e pupas)
destes insetos como os adultos emergidos, são suscetíveis a este tratamento,
também observaram a redução no número de insetos da geração seguinte. Stathers
et al. (2004) também avaliaram a eficácia e persistência de produtos comerciais à
base de terra de diatomáceas contra S. zeamais, observando que os produtos
causaram mortalidade nos adultos e reduziram a progênie.
Três formulações de terra de diatomáceas foram avaliadas por Athanassiou
et al. (2004) para controle de S. oryzae em grãos de aveia, centeio e triticale, sendo
que todas foram efetivas no controle do inseto, chegando a quase 100% de controle,
ao 7
o
dia após aplicação. Resultados semelhantes foram encontrados por
Athanassiou et al. (2005) para controle de S. oryzae em trigo e cevada, além da
redução significativa da progênie. Após 270 dias, a persistência dos produtos
reduziu, ocorrendo uma diminuição na mortalidade e conseqüente aumento da
geração seguinte.
A comparação entre os produtos convencionais e os entomopatógenos é
sempre em relação à eficácia e ao custo. Entretanto, o uso do controle microbiano
inclui a segurança dos seres humanos e outros organismos, redução de resíduos
químicos nos alimentos, preservação de outros inimigos naturais e manutenção da
biodiversidade no ecossistema, nem sempre considerados e, desta forma, o controle
biológico também serve como alternativa (Lacey et al., 2001).
2.3.3 Controle Biológico e Controle Microbiano
O controle biológico é um fenômeno natural que pode proporcionar uma
permanente, harmoniosa e econômica solução. É considerado um fenômeno
dinâmico, que sofre a influência dos fatores climáticos, da disponibilidade de
alimentos e da associação de diferentes e interdependentes espécies (van den
Bosch et al., 1982; Van Driesche & Bellows Júnior, 1996 e Parra et al., 2002a).
Dentre os inimigos naturais, os entomopatógenos têm destaque no controle
de insetos-praga de grãos armazenados (Moino Júnior & Alves, 1997; Hidalgo, 1998;
Moino Júnior & Alves, 1998; Moino Júnior et al., 1998; Rice & Cogburn, 1999; Padín
et al., 2002 e Batta, 2004).
O controle biológico com o emprego de entomopatógenos é chamado
controle biológico microbiano ou controle microbiano. As vantagens desse controle
estão na especificidade e seletividade, sendo que estes mantêm as populações de
parasitóides, predadores e polinizadores, ao contrário do que ocorre quando se
emprega a maioria dos inseticidas químicos. Os patógenos também possuem a
capacidade de multiplicação e dispersão no ambiente, isto ocorre pois estes podem
permanecer na área, no solo ou nos cadáveres (Alves, 1998a; Nardo & Capalbo,
1998; Lacey et al., 2001 e Castrillo et al., 2005).
Os entomopatógenos também podem ser empregados juntamente com
inseticidas seletivos e outros métodos de controle, e em geral não selecionam
populações resistentes, além de não ocorrer a ressurgência de insetos-praga
secundários e terciários como ocorre com a utilização de produtos químicos. A
aplicação destes não causa poluição ao ambiente e não são tóxicos para o ser
humano e outros animais. Com isso, os produtos tratados com produtos biológicos
podem ser mais valorizados comercialmente (Alves, 1998a).
No entanto, algumas desvantagens também são associadas ao controle
microbiano, sendo uma delas o espectro de ação, pois muitas vezes o
entomopatógeno é tão especifico que mata apenas uma espécie de praga. Além
disso, a ação dos entomopatógenos é mais lenta e a maioria necessita de condições
adequadas de temperatura, umidade, luminosidade e radiação para serem
eficientes, devendo contar também, com uma aplicação correta e um
armazenamento adequado, para manter sua viabilidade e patogenicidade (Alves,
1998a; Simon, 1999 e Lord, 2005).
Dentre os entomopatógenos, os fungos são os organismos que apresentam
maior potencial de uso no controle de Sitophilus spp., pois seu modo de ação é
baseado, principalmente, no contato do inseto com os conídios, ao contrário dos
vírus e bactérias que atuam após a ingestão. Além disso, exigem menor umidade no
ambiente se comparados aos nematóides entomopatogênicos (Alves & Lecuona,
1998 e Azevedo, 1998). Os conídios e os esporos dos fungos, têm alta capacidade
de dispersão horizontal, sendo transportados por vários agentes a grandes
distâncias (Alves, 1998b; Castrillo et al., 2005).
No Brasil já ocorre a produção massal de fungos entomopatogênicos para o
controle de diversos insetos. Esta produção é realizada com o emprego de arroz
cozido como substrato. Após a colonização do arroz pelo fungo, a mistura é triturada
e comercializada na forma de pó-molhavel e/ou suspensão oleosa. A estimativa de
vendas das quatro maiores empresas deste setor no Brasil, até 2001, foram
equivalentes a 108 mil
hectares de área tratada, além das produções de pequenas
empresas e empresas que produzem para a própria utilização, como usinas de
cana-de-açúcar (Faria & Magalhães, 2001).
Dada a grande variabilidade genética apresentada pelos fungos
entomopatogênicos, Alves (1998b) e Dal Bello et al. (2001) destacam a importância
da realização de técnicas de bioensaios para a seleção de isolados altamente
virulentos, persistentes e com boa capacidade de reprodução. Estas técnicas
contribuem para que os fungos entomopatogênicos possam ser utilizados como
inseticidas microbiológicos, de maneira eficiente, em concentrações mais baixas e,
aplicados também em larga escala, com menor custo. Para S. zeamais e S. oryzae,
os autores Moino Júnior & Alves (1997), Moino Júnior et al. (1998) e Dal Bello et al.
(2001), observaram que isolados do mesmo fungo tem diferença na infectividade.
O amplo sucesso dos fungos entomopatogênicos nos programas de
controle biológico pode estar associado à essa grande variabilidade genética, sendo
considerados como agentes potenciais no controle de insetos-praga (Alves, 1998b e
Castrillo et al., 2005).
Os fungos entomopatogênicos com maior potencial para o controle de
insetos-praga de grãos armazenados são Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e
Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. Apesar de existirem suspeitas com relação
à sua segurança, ambos não possuem relatos confirmados de contaminação em
seres humanos, sendo considerados seguros para seus aplicadores ou mesmo para
os demais organismos vivos, apesar de não serem muito específicos (Pereira et al.,
1998a).
Em avaliações realizadas em armazéns no Kenya, foi observada a
incidência de insetos de grãos armazenados e de entomopatógenos. O único
entomopatógeno encontrado foi B. bassiana, sendo presente em menos de 1,0%
dos insetos amostrados. Dentre estes, 89,7% eram S. zeamais. O fungo teve
ocorrências esparsas, sendo encontrado em maiores quantidades na estação seca
(Oduor et al., 2000).
Conforme Moino Júnior et al. (1998), isolados de B. bassiana causam maior
mortalidade em S. zeamais quando comparados a isolados de M. anisopliae. Eles
verificaram que os isolados de M. anisopliae não causaram mais que 60% de
mortalidade neste inseto. Em contrapartida, 57,4% dos isolados de B. bassiana
testados causaram mais de 60% de mortalidade.
Da mesma forma, a utilização apenas de M. anisopliae para o controle de
gorgulhos em trigo armazenado não se mostrou eficiente, causando o máximo de
26,7% de mortalidade (Dal Bello et al., 2001).
Os danos causados por S. oryzae em trigo tratado e não-tratado com B.
bassiana, foram observados por Padín et al. (2002), que constataram que o trigo
sem o tratamento teve um dano significativamente maior do que os grãos tratados
(perda de peso de 38,3% contra 7,1%, respectivamente).
Além da mortalidade provocada, outra característica importante dos fungos
é a conidiogênese sobre os cadáveres, sendo este fator analisado em experimentos
realizados por De La Rosa et al. (1997) com a broca-do-café, Hypothenemus
hampei; Luz & Fargues (1998) com Rhodnius prolixus; Luz et al. (1999) com bicho-
barbeiro, Triatoma infestans; Sosa-Gómez & Alves (2000) com a broca-da-cana-de-
açúcar, Diatraea saccharalis; Neves & Hirose (2005) com H. hampei, Alexandre et al.
(2006) e Rohde et al. (2006) com cascudinho-de-aviário, Alphitobius diaperinus.
O número de conídios produzidos é importante para transmissão de fungos
para outros insetos, para isto a influência da temperatura e do processo de
inoculação usado têm efeito na esporulação, assim como o isolado utilizado (Luz et
al., 1999). Além disso, a produção de conídios sobre cadáver é um dos fatores mais
importantes em campo, por serem focos de disseminação, sendo necessário que o
fungo selecionado tenha boas qualidades em todos os fatores analisados, como
esporulação, crescimento vegetativo, produção de conídios em cadáver e produção
de conídios em arroz (Neves & Hirose, 2005).
A eficiência dos entomopatógenos e o volume de áreas tratadas têm
aumentado sua credibilidade, porém sua eficiência ainda é colocada em dúvida por
muitos produtores (Lacey et al., 2001 e Parra et al., 2002b). Contudo, o
melhoramento dos entomopatógenos, através de estudos genéticos e bioquímicos,
sua produção, formulação, o melhor entendimento de como eles se mantêm em
sistemas integrados e suas interações com o desenvolvimento de outros
componentes do MIP, farão com que todas as suas vantagens (eficácia, seletividade
e segurança) e não simplesmente sua comparação com os inseticidas químicos,
sejam evidenciadas, sendo aceito de forma mais ampla.
2.3.4 Variedades Resistentes
Em países como os Estados Unidos, onde o gorgulho é considerado um dos
insetos-praga mais importantes do milho, há relatos da utilização de cultivares
resistentes desde a década de 90. A utilização destes cultivares chegou a reduzir a
infestação, em alguns casos em mais de 40% (Vendramim et al., 1992).
As plantas resistentes a insetos são consideradas um método ideal de
controle, pois possuindo a resistência incorporada ao seu genoma possibilita a
manutenção da praga em níveis inferiores aos níveis de dano, não causa impactos
ambientais, evita qualquer forma de contaminação, não tem custo adicional e pode
ser empregado com qualquer outro método de controle. É considerada uma prática
excelente para pragas nocivas em plantações de ciclo curto, tendo muitos casos de
sucesso já relatados (Lara, 1991 e Gallo et al., 2002). Visando o controle de
Sitophilus spp. em grãos armazenados, muitos autores realizaram trabalhos
selecionando e/ou identificando cultivares de milho resistentes a este inseto.
A resistência do grão de milho a Sitophilus spp. resulta de uma ação
conjunta dos mecanismos antibiose e antixenose, e a fonte de alimento na fase
adulta é um fator importante para a reprodução deste inseto em relação àquela
durante a fase jovem (Santos & Foster, 1983).
Santos & Foster (1981a) avaliaram a resistência do tipo preferência
alimentar. Para isto, S. zeamais foi liberado em uma mistura de grãos resistentes e
suscetíveis, previamente selecionados e marcados. Observaram que o inseto foi
capaz de distinguir os diferentes grãos, escolhendo o cultivar suscetível para sua
alimentação.
A preferência alimentar de Sitophilus spp., nos experimentos com livre
chance de escolha, indica efeito atrativo para todos os cultivares, porém, com
diferenças significativas no percentual de insetos encontrados em cada material.
Verificando dessa forma a existência de repelência para a alimentação em alguns
cultivares de milho (Santos & Foster, 1981b; Toscano et al., 1999 e Guzzo et al.,
2002).
Com o objetivo de analisar os danos provocados por S. oryzae em milho,
Matioli (1981) realizou testes de confinamento, e observou que os danos causados
pelo inseto em diferentes cultivares de milho apresentaram diferença significativa.
No cultivar suscetível, o período de armazenamento e os níveis de infestação
contribuíram para o aumento no número de grãos perfurados, para a perda de peso
na massa de grãos e para o percentual de resíduos produzidos. A perda de peso
dos grãos atacados é um fator muito importante, pois além do aspecto econômico,
também indica um fator de resistência. Essas diferenças em relação aos cultivares
também foram observadas com S. zeamais por Boiça Júnior et al., (1997) e Toscano
et al. (1999).
Para a análise da biologia de Sitophilus spp. em diferentes cultivares de
milho, também são realizados testes de confinamento. Assim, Ramalho et al. (1977)
afirmam que existe uma relação entre duração do ciclo ovo-adulto e o número de
adultos de Sitophilus spp. emergidos, de forma que quanto mais suscetível o milho,
maior é o número de insetos emergidos e menor é o tempo que demoram a emergir.
Neste teste procura-se confirmar a hipótese de que o menos preferido no
teste com chance de escolha não é adequado para o desenvolvimento de S.
zeamais, e para isso, avalia-se a emergência e o desenvolvimento dos insetos.
Desta forma, Santos & Foster (1981b) verificaram que os cultivares menos
preferidos tiveram menor emergência de Sitophilus spp., sendo portanto, resistentes
a estes. Por outro lado, os mais preferidos apresentaram uma emergência maior,
sendo também os mais suscetíveis ao inseto, confirmando a hipótese anterior. No
entanto, Boiça Júnior (1997) e Guzzo et al. (2002) observaram que não houve
diferença quanto ao ciclo de vida de S. zeamais, quando confinados nos cultivares
que apresentaram ou não apresentaram preferência alimentar.
Lara (1991) e Toscano et al. (1999) atribuíram à resistência de um cultivar
diversas características físicas, químicas e morfológicas que podem atuar de forma
agrupada, ou mesmo isoladamente, atraindo ou repelindo o gorgulho.
Observa-se desta forma, que os fatores que determinam a resistência ou a
suscetibilidade dos cultivares de milho ainda não são bem definidos, mas os estudos
se baseiam principalmente nos nutrientes e substâncias atrativas e, na dureza dos
grãos.
2.3.4.1 Nutrientes e Substâncias Atrativas
A ausência ou o desequilíbrio de nutrientes essenciais ou não, pode
interferir na adequabilidade do alimento para os insetos. A vantagem de procurar
cultivares resistentes está no fato destes reduzirem a taxa de oviposição, o
desenvolvimento e em alguns casos provocarem mortalidade (Guedes, 1990/91).
Tipping et al. (1987) ao realizar um experimento para avaliar a capacidade
atrativa de extratos de diferentes materiais de milho, verificaram que não houve
interferência na atratividade de S. zeamais, nem relação entre atração e oviposição.
Ao contrário destes, Boiça Júnior et al. (1997) descrevem que os grãos
possivelmente apresentam algum fator de resistência para a não-preferência, ou
mesmo a liberação de alguma substância atrativa para a preferência à oviposição e
à alimentação dos insetos, como odor e sabor, explicando assim a atratividade por
alguns dos materiais. Também Toscano et al. (1999) descrevem que os cultivares
podem apresentar uma possível substância alimentar que interfere ou estimula a
alimentação destes insetos.
Verificou-se que o conteúdo de proteínas e de carboidratos não influencia a
resistência dos cultivares ao ataque de S. zeamais, no entanto, os lipídios, seguidos
das unidades inibidoras de amilase, são os que mais influenciam. Estes apresentam
relação positiva com o ciclo biológico da praga, de forma que o aumento no
conteúdo destes compostos nos grãos ocasiona o aumento na duração do ciclo
biológico da praga, conseqüentemente, menor número de gerações (Marsaro Júnior
et al., 2005b).
2.3.4.2 Dureza
Analisando fatores que pudessem estar ligados à resistência ou
suscetibilidade de alguns cultivares, a dureza não foi atribuída como fonte de
resistência do milho, conforme Ramalho et al. (1976). Pois, como descrito por eles,
quando empalhados podem ser considerados resistentes, pois só expõem a parte
costal que é dura. Porém, quando este mesmo material encontra-se debulhado,
todas as partes estão expostas, sendo a região do embrião a mais mole e,
conseqüentemente, a preferível para a alimentação e oviposição do gorgulho, neste
caso, não sendo mais considerada resistente, pois passa a conferir uma preferência
alimentar ao inseto.
Em contrapartida, Tipping et al. (1987) ressaltam que as prováveis causas
da não-preferência estão associadas à dureza do grão, constituindo dessa forma
uma barreira mecânica, sendo que a natureza química ou física do pericarpo seria
um dos fatores responsáveis pelas diferenças na alimentação e oviposição.
A resistência de ‘Tripsacorn’ (um híbrido desenvolvido a partir de teosinte e
um cultivar primitivo de milho) também é atribuída à sua dureza, o que é considerado
um mecanismo primitivo de defesa contra insetos e outras pragas. Desta forma,
existe a proposta de se procurar estes genes de resistência para a transferência
para o milho (Throne & Eubanks, 2002).
Verifica-se que muito tem-se procurado para a identificação e seleção de
cultivares de milho resistentes, assim como o desenvolvimento dessas, afim de
efetivar um completo controle de Sitophilus spp. (Vendramim, 2002).
Vale ressaltar que cultivares resistentes não estão incluídos dentro do
conceito de controle biológico, pois este é um processo de nível populacional (Garcia
et al., 1988). No entanto, podem favorecê-lo, e com base nisso, muitos
pesquisadores desenvolveram trabalhos com a integração de métodos de controle.
Segundo Lorini (2002a), a integração de diferentes métodos de controle é uma
prática essencial para se obter sucesso na supressão de insetos-praga de grãos
armazenados.
2.4 ASSOCIAÇÃO DE CONTROLE BIOLÓGICO E OUTROS MÉTODOS DE
CONTROLE DE INSETOS-PRAGA
Dentre os métodos, visando o controle de Sitophilus spp., passíveis de
associação com controle biológico, incluem-se variedades resistentes, controle
químico e pós-inertes.
2.4.1 Associação de Controle Biológico e Variedades Resistentes
Segundo Lara (1991) e Gallo et al. (2002), os métodos mais adequados
para a associação com cultivares resistentes são o controle cultural, o biológico e o
químico, porém, no contexto deste trabalho, maior ênfase é dada à associação dos
cultivares resistentes e o controle biológico, sendo que segundo Kogan (1988)
1
citado por Guedes (1990/91), uma estratégia de controle ideal seria aquela
embasada em medidas preventivas, como resistência de plantas e controle
biológico, que assegurariam um equilíbrio favorável ao meio ambiente. Além disso,
Lacey et al. (2001) afirmaram que o sinergismo dos agentes de controle microbiano
em associação com técnicas de controle, como a resistência de plantas, são práticas
importantes para a redução ainda maior de resíduos químicos nos produtos.
Em trabalhos com insetos-praga de produtos armazenados, Rice & Cogburn
(1999) misturaram conídios de B. bassiana nas variedades de arroz marrom e
selvagem, e verificaram a redução na emergência da progênie de S. oryzae, em
83% e 98%, respectivamente, nas maiores concentrações, quando comparados às
suas testemunhas. Assim, a virulência do fungo foi maior no arroz selvagem do que
1
KOGAN, M. Integrated pest management: theory and pratice. Entomol. exp. appl., v.49, p.59-70, 1988.
no arroz marrom, sendo que no primeiro caso, 7 dias após a inoculação, a
mortalidade chegou a 94,1%, e no segundo caso chegou a 75%. Os autores também
ressaltam que B. bassiana é efetivo no tratamento de pragas de grãos
armazenados, principalmente em produtos que já tenham uma certa barreira à
procriação destes, sendo então, um método alternativo de controle de pragas de
produtos armazenados.
Utilizando-se um genótipo resistente de tomateiro e a associação com B.
bassiana para o controle de Tuta absoluta (traça-do-tomateiro), observou-se
aumento na mortalidade do inseto quando comparado a ambos os tratamentos
utilizados isoladamente. Em alguns casos, a mortalidade causada pela associação
dos fatores foi maior que a soma das mortalidades causadas pelos fatores genótipo
e B. bassiana isoladamente, ocorrendo, nesse caso, sinergismo dos fatores
(Giustolin et al., 2001a).
A redução na população do inseto-praga através da associação de fungos
entomopatogênicos e variedades resistentes, também foi observada por Hatting et
al. (2004). Estes autores associaram B. bassiana com variedades resistentes de
trigo sob condições de campo e observaram redução de 65% na população do
pulgão Diuraphis noxia quando comparado à testemunha, sendo que esta
constatação foi feita no primeiro e no segundo ano da cultura.
Em experimentos integrando Bacillus thuringiensis e genótipos de tomate
resistentes, observou-se que a duração da fase larval de T. absoluta foi prolongada
e a sobrevivência reduzida, aumentando a eficiência no controle deste inseto, o que
também indica a ocorrência de sinergismo entre os fatores. O experimento
demonstrou que a eficiência do entomopatógeno pode ser aumentada se as lagartas
forem alimentadas por longo período em plantas resistentes (Giustolin et al., 2001b).
Em alguns casos, as variedades favorecem o desenvolvimento do inseto,
diminuindo a sua suscetibilidade ao entomopatógeno, como ocorre com o bicho-da-
seda, Bombyx mori, que quando alimentado com as amoreiras das variedades Miura
e Calabreza não atingem 50% de mortalidade se expostos ao vírus da poliedrose
nuclear de Bombyx mori (Sosa-Gómez et al., 1991).
Os efeitos da aplicação de entomopatógenos associados com outros
métodos de controle podem ser divididos, segundo Sosa-Gómez et al. (1998), em
três classes:
1. Diminuição do substrato ou do hospedeiro: causa a diminuição da população da
praga pelo entomopatógeno, no entanto, afeta os níveis populacionais de outros
agentes de controle;
2. Antagonismo: é a ação direta dos entomopatógenos sobre outros agentes que
podem estar presentes ao mesmo tempo no hospedeiro infectado ou ocorrendo
de outra forma, ou seja, esses organismos competem entre si pelo mesmo
hospedeiro, sendo que um acaba por inibir o outro;
3. Sinergismo ou Efeito Aditivo: é quando um patógeno se beneficia da presença de
outro agente de controle biológico ou cria condições no hospedeiro para um
melhor desenvolvimento de outro agente biológico.
Além dos trabalhos envolvendo a associação entre entomopatógenos e
variedades resistentes, também são realizados trabalhos com a associação de
predadores e parasitóide com essas plantas.
Na associação de genótipos resistentes de sorgo e o predador Cycloneda
sanguinea (Coleoptera: Cocinelidae), verificou-se que a integração destes métodos
no manejo do pulgão Schizaphis graminum é compatível e viável, pois o genótipo
resistente afeta negativamente a biologia do pulgão (Santos et al., 2003). Em
experimento semelhante, Figueira et al. (2003) conduzindo com o predador
Chrysoperla externa (Neuroptera: Crysopidae), obtiveram igual sucesso, com
redução de 83% nos danos do pulgão quando realizada a associação dos dois
métodos de controle.
Ambos autores atribuem às plantas resistentes a presença de fatores que
afetam a biologia dos insetos, prolongando o seu desenvolvimento, reduzindo seu
peso e alterando o crescimento populacional. Com isso se tornam mais suscetíveis
ao ataque por parte de seus inimigos naturais, por ficarem mais tempo expostos.
No entanto, em experimentos conduzidos por Wanderley et al. (2003)
observou-se que fêmeas do parasitóide Catolaccus grandis (Hymenoptera:
Pteromalidae) conseguiram diferenciar larvas da broca da batata-doce, Euscepes
postfasciatus (Coleoptera: Curculionidae), criadas em cultivares resistentes e
suscetíveis, preferindo parasitar as brocas que se desenvolveram no cultivar
suscetível, pois estas apresentaram maior quantidade de nutrientes.
Em relação à interação entre a resistência de plantas e o controle biológico,
pode-se inferir que o impacto destes cultivares no agroecossistema pode variar
desde efeitos antagônicos até complementares (Waquil et al., 2002).
2.4.2 Associação de Controle Biológico com Controle Químico ou Pós Inertes
Segundo Lorini (1999), o controle biológico deve ser entendido como
estratégia de controle de pragas durante o armazenamento. Dal Bello et al. (2001)
também propõem que o controle biológico seja um método alternativo de controle de
insetos de grãos armazenados, podendo dessa forma ser empregado com outros
métodos. Dentre estes, o autor propõe a associação dos fungos, M. anisopliae e B.
bassiana, ou destes com inseticidas químicos, podendo ter como vantagens o
controle de muitas espécies de insetos, ser mais consistente e até mesmo ter um
controle maior sob diversas variações ambientais.
Testando formulações do fungo B. bassiana na concentração de 1,0
×
10
9
conídios/g com talco em pó, em 5 e 20g/Kg de grãos de milho, Hidalgo et al. (1998)
verificaram, respectivamente, 77,5% e 90% de mortalidade em S. zeamais.
Assim como Dal Bello et al. (2001), Padín et al. (2002) sugerem a utilização
de fungos entomopatogênicos juntamente com inseticidas de fumigação, para a
redução das concentrações destes produtos, amenizando os resíduos nos
alimentos.
A associação de formulações de M. anisopliae em carvão vegetal e em
cinzas causou uma mortalidade de 73,3% e 80%, respectivamente, em S. oryzae
quando aplicados antes da infestação, não apresentando diferenças para aplicações
posteriores. Neste caso, os efeitos são sinergistas, causando maior mortalidade do
que quando são utilizados isoladamente. Observou-se também que estes dois
tratamentos reduziram os danos causados nos grãos de trigo, além de aumentarem
o ciclo de desenvolvimento dos insetos (Batta, 2004).
Em experimentos associando B. bassiana e terra de diatomáceas, visando o
controle de insetos-praga de grãos armazenados, Rhyzopertha dominica,
Oryzaephilus surinamensis e Cryptolestes ferruginensis, verificou-se efeito sinérgico
(Lord, 2001).
Da mesma forma, avaliando o aumento na eficácia do fungo B. bassiana
para o controle de Tribolium castaneum, Akbar et al. (2004) realizaram um
experimento associando terra de diatomáceas ao fungo, e observaram que não
houve aumento na mortalidade na fase adulta. No entanto, na fase larval ocorreu
aumento na mortalidade quando se compara a mistura com o fungo isoladamente,
observando um efeito aditivo nesta associação, que é explicada pelo fato da terra de
diatomáceas danificar a cutícula do inseto, permitindo desta forma uma facilidade
para o fungo penetrar no corpo do inseto, além de proporcionar nutrientes viáveis
para sua a germinação.
A utilização do controle natural de pragas, causa muitas vezes a diminuição
drástica do número de aplicações de inseticidas químicos, o que traz benefícios para
o meio ambiente, para os produtos obtidos, para a qualidade de vida e saúde dos
agricultores.
O controle integrado é uma técnica dentro do Manejo Integrado de Pragas
(MIP), que é uma estratégia de controle que utiliza táticas em harmonia com o
ambiente, sendo que o objetivo é manter os insetos a níveis populacionais que não
afetem economicamente a cultura e que reduzam o uso excessivo de inseticidas
químicos, atenuando o impacto dos insetos-praga. Sua aplicação prática é ainda
restrita, variando grandemente de acordo com a região, a cultura e do apoio do
governo em relação aos estímulos dados a adoção desta medida de controle. Além
destes fatores, outra resistência quanto ao MIP é a necessidade de um grande
número de informações (Nardo & Capalbo, 1998; Pereira et al., 1998b; Kogan &
Bajwa, 1999 e Vendramim, 2002).
A integração de diferentes métodos de controle é uma prática essencial
para se obter sucesso na supressão de insetos-praga de produtos armazenados.
Ressalta-se ainda, que a resistência destes insetos a inseticidas, exige o uso
integrado de controles, sendo esses métodos passíveis de cada unidade (Lorini,
1998 e Parra et al., 2002b).
A associação destes métodos pode resultar em um controle mais efetivo, já
que pode ocorrer sinergismo, sendo que até pouco tempo eram escassos os
trabalhos com esta interação, restringindo-se apenas a cultivares resistentes ou ao
controle biológico, e não aos dois no mesmo manejo.
A variação no efeito resultante do uso associado se deve ao fato de que
além dos efeitos independentes provocados por esses dois métodos, existem
aqueles resultantes das interações tritróficas, envolvendo a planta, o inseto-praga e
o inimigo natural (Vendramim, 2002). Ressalta-se que a influência da cultivar
resistente sobre Sitophilus spp., em geral, provoca uma alteração biológica negativa,
podendo torná-lo mais suscetível ao ataque dos fungos entomopatogênicos.
Baseando-se nos fatores citados, associando ao grande potencial agrícola
do Brasil e sabendo, que um cultivar resistente de milho integrado a um fungo
entomopatogênico pode influenciar na melhoria do controle de Sitophilus spp.
justifica-se a integração desses dois fatores ainda não testados. Sendo que o
emprego de cultivares resistentes, sob o ponto de vista fitossanitário, é
provavelmente uma das chaves para o controle de pragas.
3 OBJETIVOS
Avaliar diferentes cultivares de milho quanto à resistência ao ataque de
Sitophilus spp.
Selecionar isolados dos fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana e
Metarhizium anisopliae virulentos a Sitophilus spp.
Avaliar a eficiência do controle associado de variedades resistentes de
milho e controle microbiano para controle de Sitophilus spp. em grãos armazenados.
4 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Zoologia de
Invertebrados da Universidade Estadual do Oeste do Paraná (Unioeste), Campus de
Cascavel. Para isto, foram utilizadas sementes de milho produzidas na safra
2004/2005, não submetidas a qualquer tratamento fitossanitário, visando controlar
insetos e/ou fungos, estas foram fornecidas pela COODETEC – Cooperativa Central
Agrícola, Cascavel, PR (Tabela 1).
Tabela 1. Relação de cultivares de milho comercial, utilizados no experimento e suas
respectivas características físicas.
Cultivar
1
Tipo de híbrido Tipo de grão Cor do grão
OC 705 Duplo Semi-duro Alaranjado
CD 3121 Simples Semi-dentado Amarelo
CD 304 Triplo Duro Alaranjado
CD 306 Triplo Semi-duro Alaranjado
CD 307 Simples Semi-dentado Amarelo
CD 308 Duplo Semi-duro Alaranjado
Fonte: Coodetec (2005)
1
A citação dos materiais não implica em endosso por parte dos autores
As sementes foram previamente inspecionadas, eliminando-se impurezas
ou grãos imperfeitos que pudessem comprometer o experimento. Em seguida, foram
45
armazenadas por 10 dias em freezer a -10ºC, para eliminar os insetos nas diferentes
fases de desenvolvimento, evetualmente presentes na massa de grãos. Após este
período, as sementes foram secadas pelo método de estufa e a umidade final ficou
em torno de 13%.
Adultos de Sitophilus spp., utilizados em todas as fases do experimento
foram provenientes da criação do próprio laboratório, com idade entre 30 e 60 dias,
não sexados, alimentados com grãos de arroz polido, para que não apresentassem
condicionamento pré-imaginal por um determinado cultivar de milho (Figura 1).
Figura 1. Criação de Sitophilus spp. em frascos de vidro vedados com tecido fino,
contendo arroz polido.
Dezesseis isolados dos fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana e
dois de Metarhizium anisopliae provenientes do banco de patógenos do Laboratório
46
de Zoologia da Unioeste – Campus Cascavel (Tabela 2), foram reativados em larvas
de cascudinho-de-aviário (Alphitobius diaperinus). O procedimento foi realizado pela
inoculação de insetos sadios em suspensões dos isolados, e após a conidiogênese
sobre o inseto, cada isolado foi cultivado em M.E. (meio de esporulação) (Alves et
al., 1998) e os conídios recolhidos e armazenados em freezer a -10ºC. Essa
padronização foi realizada para a reativação dos fungos e teve como objetivo
incrementar a virulência e diminuir o tempo médio de mortalidade dos insetos, como
foi observado por González et al. (1993).
47
Tabela 2: Isolados de fungos entomopatogênicos utilizados no bioensaio e
respectiva origem
Isolados Hospedeiro original ou
substrato
Local de origem
Unioeste 1* Astylus variegatus Cascavel, PR
Unioeste 3* Alphitobius diaperinus Cascavel, PR
Unioeste 4* A. diaperinus Cascavel, PR
Unioeste 5* A. diaperinus Cascavel, PR
Unioeste 22** Solo, Plantação de erva-mate Cascavel, PR
Unioeste 25* Solo, Plantação de erva-mate Cascavel, PR
Unioeste 26* Solo, Plantação de erva-mate Cascavel, PR
Unioeste 36* Coleoptera: Chrysomelidae Cascavel, PR
Unioeste 37* Bombyx mori Arapongas,PR
Unioeste 38* B. mori Ibaiti,PR
Unioeste 39* Cosmopolites sordidus São Miguel do Iguaçu, PR
Unioeste 40* Coleoptera: Curculionidae Cascavel, PR
Unioeste 41* Astylus variegatus Cascavel, PR
Unioeste 42* Coleoptera: Erotylidae Cascavel, PR
Unioeste 43** Hymenoptera: Formicidae São Miguel do Iguaçu, PR
Unioeste 44* Hemiptera: Pentatomidae Toledo, PR
Unioeste 45* A. variegatus Marechal Cândido Rondon, PR
Esalq 643*
Solo Lavras, MG
*Beauveria bassiana
**Metarhizium anisopliae
48
Além destes, foi utilizado o isolado de B. bassiana Esalq 643, proveniente
do Laboratório de Patologia de Insetos da Escola Superior de Agricultura Luiz de
Queiroz (Esalq/USP), selecionado por Moino Júnior et al. (1998) e testado
posteriormente por Moino Júnior & Alves (1998), servindo como isolado padrão.
4.1 SELEÇÃO DOS CULTIVARES DE MILHO
Para a verificação de resistência ou suscetibilidade dos cultivares de milho,
estes foram submetidos aos testes com chance de escolha, para determinar
preferência e não-preferência a Sitophilus spp. e sem chance de escolha ou
confinamento, para verificar a influência dos cultivares na biologia do inseto.
4.1.1 Teste com chance de escolha
Neste teste, foram utilizadas bacias translúcidas com 35cm de diâmetro por
15cm de altura. A 5cm do fundo das bacias foram montados suportes com isopor,
onde se encaixaram 6 recipientes plásticos com 2,5cm de diâmetro por 2cm de
altura, que foram dispostos radialmente, ficando todos com a abertura no mesmo
nível que o suporte de isopor (Figura 2). Em seguida, cada recipiente recebeu 20g
de sementes de cada um dos cultivares de milho, sendo esta quantidade suficiente
para preencher totalmente os recipientes. Na seqüência, foram liberados 120
insetos, adultos e não sexados, no centro do suporte de isopor. Uma outra bacia
49
igual foi colocada sobre esta de forma contrária e com auxílio de fita crepe foram
vedadas.
Figura 2. Bandeja com recipientes para disposição dos cultivares de milho para
experimento com chance de escolha. O ponto central indica o local de liberação dos
insetos.
As bacias foram deixadas em sala com fotoperíodo de 12 horas e
temperatura média de 27±1ºC. Após 24 horas, foram realizadas contagens para
verificar o número de insetos presentes em cada recipiente com os diferentes
cultivares. Este procedimento foi realizado por 5 vezes, sendo considerado cada um
como uma repetição.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, sendo os dados
analisados estatisticamente com a aplicação do teste F e as médias comparadas
50
pelo teste de Tukey, ambos a 5% de significância, utilizando-se o programa
estatístico Sisvar® (Ferreira, 2006), sendo os dados previamente transformados em
arcseno x/100 , com auxílio do programa Microsoft Excel®. As transformações de
todos os dados, quando necessárias, foram feitas segundo o teste de F máximo de
Hartley.
4.1.2 Teste sem chance de escolha (confinamento)
O teste foi realizado com os cultivares que apresentaram, respectivamente,
a maior e a menor preferência no teste anterior. Para cada cultivar foram realizadas
10 repetições, sendo que cada repetição foi disposta em um recipiente transparente
de vidro com 6cm de diâmetro por 6cm de altura, fechado com um tecido fino. Para
cada cultivar foram ainda preparadas 10 repetições com 20g de material não
contendo insetos, sendo consideradas testemunhas.
Os recipientes foram mantidos durante sete dias, para que houvesse a
infestação dos grãos, em sala com fotoperíodo de 12 horas, temperatura média de
27±2ºC e U.R. de 55%. Posteriormente, os insetos foram retirados, e após 15 dias
foram iniciadas as observações diárias, para acompanhar a emergência dos adultos.
Os insetos emergidos foram retirados, contados e deixados em outro recipiente por
24 horas nas mesmas condições, e pesados em seguida, sendo este procedimento
repetido por 70 dias, tempo suficiente para todos os insetos emergirem.
Foram avaliados, o número de insetos emergidos, o peso dos insetos
adultos, a duração do ciclo ovo-adulto, o número de grãos danificados e peso dos
mesmos. Para verificar os danos causados às sementes, como perfuração e perda
51
de peso, os grãos danificados foram separados, contados e pesados. A perda de
peso da matéria seca dos grãos foi determinada pela diferença entre o peso da
matéria seca final da testemunha e o peso da matéria seca final dos tratamentos,
segundo metodologia descrita por Toscano et al. (1999).
A média de duração do ciclo ovo-adulto foi calculada através da média
ponderada com auxílio do programa Microsoft Excel®. Quando necessário, os dados
foram transformados em arcseno x/100 ,
x
ou
x
+ 1, sendo posteriormente
submetidos a análise estatística com a aplicação do teste F e as médias
comparadas pelo teste de Tukey, ambos a 5% de significância, utilizando-se o
programa estatístico Sisvar® e Microsoft Excel®.
4.2 SELEÇÃO DE ISOLADOS DE FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS
Foram realizados testes de avaliação de patogenicidade e comparação dos
isolados, realizando os experimentos de concentração letal média, crescimento
vegetativo, produção de conídios em placa, produção de conídios em arroz e
produção de conídios em cadáver de Sitophilus spp.
4.2.1 Avaliação da Patogenicidade
As técnicas de laboratório utilizadas, bem como os meios de cultura
produzidos são embasados nas metodologias descritas por Alves et al. (1998). Os
isolados foram multiplicados em placas de Petri contendo M.E. (Meio de
52
Esporulação), durante 8 dias, incubados em 26±1ºC e 14 horas de fotofase. Em
seguida, os conídios foram coletados, raspando-se a superfície do meio e
armazenados em frascos de vidro esterilizados, mantidos em freezer a -10ºC, até a
utilização nos bioensaios, por um tempo que não ultrapassou 15 dias.
As suspensões de conídios foram preparadas com água destilada contendo
espalhante adesivo Tween® 80 (0,01%), posteriormente foram quantificadas em
câmara de Neubauer e padronizadas na concentração de 1,0×10
9
conídios/mL,
conforme concentração aproximada, utilizada nos experimentos de Moino Júnior et
al. (1998).
Para a determinação da patogenicidade dos isolados, quinze adultos de
Sitophilus spp. foram imersos em 1mL de suspensão de fungo sob agitação manual,
durante 10 segundos.
Posteriormente, estes insetos foram retirados e acondicionados em placas-
de-petri contendo papel filtro e arroz polido. Para cada isolado foram realizadas
quatro repetições, cada uma com quinze insetos. As placas foram mantidas no
interior de potes plásticos com espuma umedecida e incubados em 26±1ºC e
fotofase de 14 horas.
O experimento foi avaliado diariamente, como descrito nos experimentos
realizados por Moino Júnior & Alves (1997), por um período de 10 dias, sendo os
insetos mortos mergulhados em álcool 70% e em água destilada para a
desinfectação superficial. Em seguida, foram acondicionados, individualmente, em
placas de polietileno contendo papel filtro estéril e umedecido (câmara úmida) e
estas foram colocadas no interior de um recipiente plástico com espuma umedecida
ao fundo, para confirmação da mortalidade pelo patógeno. Os dados foram
analisados graficamente pelo programa Microsoft Excel® e os isolados que
53
apresentaram mortalidade confirmada mínima de 80% foram selecionados para os
testes da fase seguinte.
4.2.2 Comparação dos Isolados
Os isolados selecionados foram comparados quanto a sua virulência,
concentração letal, crescimento vegetativo, produção de conídios em placa,
produção de conídios em arroz e produção de conídios em cadáver.
4.2.2.1 Comparação da Virulência
Os isolados pré-selecionados foram novamente testados, e destes, os que
apresentaram maior mortalidade acumulada ao 5
o
dia foram selecionados para
serem analisados quanto aos testes descritos.
Os dados foram analisados graficamente pelo programa Microsoft Excel® e
os isolados que apresentaram maior mortalidade confirmada acumulada ao 5
o
dia
após inoculação foram selecionados para os testes seguintes.
4.2.2.2 Determinação da Concentração Letal (CL
50
)
Os isolados foram multiplicados conforme metodologia já descrita, e foram
preparadas suspensões de conídios nas concentrações de 1,0
×
10
4
, 1,0
×
10
5
,
54
1,0×10
6
, 1,0×10
7
, 1,0×10
8
e 1,0×10
9
conídios/mL, utilizando-se o mesmo
procedimento experimental adotado no experimento de avaliação de patogenicidade
citado anteriormente. A mortalidade foi avaliada diariamente num período de 10 dias,
padronizando para análise o 5
o
e o 10
o
dia, e posteriormente foi verificada a
mortalidade confirmada conforme descrito anteriormente. Experimentos
semelhantes, para verificar CL
50
de isolados de fungos entomopatogênicos contra
insetos-praga, foram conduzidos por Moino Jr. & Alves (1997), Neves & Hirose
(2005) e Rohde et al. (2006).
Os dados foram transformados em arcseno
x/100
e submetidos à análise
de variância (Teste F) e as médias comparadas entre si pelo teste de Tukey, ambos
a 5% de significância, segundo o delineamento experimental inteiramente
casualizado, utilizando-se os programas estatísticos Sisvar® e Microsoft Excel®.
4.2.2.3 Crescimento Vegetativo
Foram realizadas inoculações dos isolados selecionados em dois pontos na
superfície do meio de cultura (M.E.) em placas de Petri, que foram incubadas em
26±1°C e 14 horas de fotofase, durante 8 dias. Após esse período, foram realizadas
duas medições perpendiculares do diâmetro das colônias formadas, para obtenção
do diâmetro médio. Para cada um dos isolados foram preparadas quatro placas,
sendo cada colônia considerada uma repetição.
Os dados foram transformados em
x
e submetidos à análise de variância
(Teste F) e as médias comparadas entre si pelo teste de Tukey, ambos a 5% de
55
significância, segundo o delineamento experimental inteiramente casualizado,
utilizando-se o programa estatístico Sisvar®.
4.2.2.4 Produção de Conídios em placa-de-Petri
As colônias obtidas no experimento anterior foram recortadas do meio de
cultura na linha terminal do halo da colônia e individualizadas em tubos de vidro de
fundo chato e armazenadas em freezer a -10ºC. Para a avaliação, as colônias foram
imersas em 10mL de solução de água destilada com espalhante adesivo Tween® 80
(0,01%) e agitadas em vórtex por um minuto, e quando necessário os conídios foram
removidos com o auxílio de um pincel, sendo a quantificação feita em câmara de
Neubauer. Os dados foram transformados em
x
e submetidos à análise descrita
para o experimento de avaliação de crescimento vegetativo.
4.2.2.5 Produção de Conídios em Arroz
A produção de conídios em arroz seguiu a metodologia descrita por Leite et
al. (2003). Inicialmente, produziu-se inóculo multiplicando-se os fungos em placas-
de-petri contendo M.E a 26±1°C e 14 horas de fotofase, por 10 dias. Em seguida,
coletaram-se os conídios, com os quais prepararam-se suspensões para inoculação
em arroz a fim de se obter as matrizes.
A inoculação foi realizada em arroz pré-cozido, autoclavado e resfriado com
5mL da suspensão fúngica em cada frasco, sendo este procedimento realizado em
56
câmara de fluxo laminar. Os frascos foram fechados e incubados em 26±1°C e 14
horas de fotofase, até o crescimento e conidiogênese, que ocorreu,
aproximadamente, no 10
o
dia.
Após este período, sacos de polipropileno contendo 150g de arroz pré-
cozido, autoclavado e resfriado, foram inoculados com, aproximadamente, 15g do
substrato produzido nas matrizes. Os sacos foram fechados e incubados nas
mesmas condições anteriores, durante sete dias. Para cada isolado foram
preparados dez sacos com arroz, sendo cada um considerado uma repetição.
Decorrido este tempo, os sacos foram abertos e seu conteúdo exposto a um fluxo de
ar durante o período de 24 horas. Após este período, o arroz foi espalhado em
bandejas de plástico e mantido em 25±2ºC.
Após três dias, o arroz foi recolhido das bandejas e foi realizada a avaliação
da produção de conídios. Assim, três amostras de 1g do arroz foram tomadas de
cada repetição e armazenadas a -10ºC. Posteriormente foram suspensas em água
destilada + espalhante adesivo Tween® 80 (0,01%) e agitadas em vórtex para
serem submetidas à contagem em câmara de Neubauer. O delineamento
experimental e a análise estatística adotada foram os mesmos descritos no
experimento de avaliação de crescimento vegetativo.
4.2.2.6 Produção de Conídios em Cadáver de Insetos Adultos
A multiplicação dos fungos, bem como a suspensão, inoculação e a
incubação dos insetos foram realizadas conforme metodologia descrita no teste de
57
avaliação de patogenicidade, num total de sete repetições por isolado. Os insetos
mortos foram submetidos à câmara úmida, conforme também descrito neste teste.
Sete insetos de cada uma das repetições foram selecionados, sendo que o
critério de seleção foi a plena conidiogênese, conforme metodologia realizada por
Neves & Hirose (2005) e Rohde et al. (2006), e acondicionados em frascos de fundo
chato armazenados em freezer a -10ºC até a realização da contagem, sendo cada
tubo considerado uma repetição.
Para a avaliação, os conídios da superfície dos insetos foram removidos
imergindo os mesmos em 10mL de água destilada com espalhante adesivo Tween®
80 (0,01%). A suspensão foi agitada em vórtex durante um minuto e quantificada
utilizando-se a câmara de Neubauer. A análise dos dados foi executada com base
nos procedimentos descritos para o experimento de avaliação do crescimento
vegetativo.
4.3 ASSOCIAÇÃO DAS VARIEDADES RESISTENTES E FUNGO
ENTOMOPATOGÊNICO
Após a seleção dos cultivares e dos isolados de fungos, foram realizados
testes de estratégias de aplicação, sendo que estes isolados foram misturados no
cultivar resistente e no suscetível, previa e posteriormente a infestação por Sitophilus
spp. (Figura 3), seguindo metodologia descrita por Moino Júnior & Alves (1998).
58
Figura 3. Experimento de estratégia de aplicação (Inoculação pré e pós Infestação)
e integração dos métodos.
4.3.1 Inoculação pré-infestação
Foram utilizados recipientes transparentes de vidro, com 6cm de diâmetro
por 6cm de altura, fechados com um tecido fino. Os recipientes foram divididos em
dois grupos, sendo que em 14 destes recipientes foram colocadas 20g do cultivar
CD 3121 e nos outros 14 recipientes 20g do cultivar CD 307, selecionados na 2
a
fase do experimento no teste de confinamento .
Em seguida, foi misturado em 7 recipientes de CD 3121 e 7 recipientes de
CD 307, sendo cada recipiente considerado um repetição, o fungo B. bassiana
(isolado Unioeste 4), na concentração de 0,27g/100g de grãos (aproximadamente
59
2,0 × 10
7
conídios/100g de grãos). Assim sendo, cada recipiente recebeu 0,05g de
fungo (aproximadamente 0,5 × 10
7
conídios) e o mesmo procedimento foi realizado
com o fungo B. bassiana (isolado Esalq 643), na concentração de 0,2g, sendo que
os conídios foram misturados com amido de milho para maior dispersão. Estes
isolados foram selecionados na 1
a
fase do experimento.
Posteriormente, foram colocados 20 adultos não sexados de Sitophilus spp.
em cada recipiente, e estes foram armazenados em ambiente com temperatura
média de 25±2ºC, fotofase de 12 horas e U.R. média de 55%. Oito dias após a
infestação, os insetos foram retirados e os recipientes voltaram para o mesmo
ambiente. Avaliações, transformação de dados e análises estatísticas foram
realizadas conforme descrito no teste sem chance de escolha ou de confinamento.
4.3.2 Inoculação pós-infestação
Este teste seguiu a metodologia descrita no teste de inoculação pré-
infestação, para isto, insetos, recipientes, cultivares e isolados foram os mesmos
descritos anteriormente e nos mesmos padrões de concentração e inoculação,
assim como as condições de incubação. No entanto, para este teste, a aplicação do
fungo nos recipientes foi realizada oito dias após a infestação, logo após a retirada
dos insetos. Os métodos utilizados para as avaliações, transformações de dados e
análises estatísticas foram os mesmos realizados para o experimento de testes sem
chance de escolha.
60
Para os dois métodos de inoculação foi utilizada uma testemunha sem
infestação e sem fungo, constando de apenas 7 frascos de cada cultivar, contendo
20g de grãos.
Os tratamentos da 3
a
fase, bem como as estratégias de inoculação, estão
representados na Tabela 3.
Tabela 3. Tratamentos realizados na 3
a
fase, compondo as estratégias de aplicação
e integração dos métodos, controle biológico e variedades resistentes, para controle
de Sitophilus spp.
Infestação Isolado Cultivar
-- 307 Testemunha
3121
Unioeste 4 307
3121
Esalq 643 307
Pré-infestação
3121
Unioeste 4 307
3121
Esalq 643 307
Pós-infestação
3121
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 SELEÇÃO DOS CULTIVARES DE MILHO
5.1.1 Teste com chance de escolha
Observou-se que os insetos foram atraídos por todos os cultivares
analisados, no entanto ocorreram diferenças significativas no percentual de insetos
atraídos por cada um dos cultivares (Tabela 4).
Tabela 4. Porcentagem média (±EP)
de atratividade de Sitophilus spp. para os
diferentes cultivares de milho, em teste com chance de escolha, após 24 horas de
exposição.
Variedades Atratividade (%)**
CD 304 19,3 ± 4,50 AB
CD 306 4,0 ± 1,10 B
CD 307 40,7 ± 7,38 A
CD 308 6,3 ± 1,41 B
CD 3121 8,2 ± 3,00 B
OC 705 15,0 ± 3,47 AB
CV (%) 44,76
**Dados originais apresentados, para análise estatística os dados foram transformados em
arcseno
x/100
.
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
62
A existência de diferença significativa na atratividade, indica uma provável
existência de resistência e corroboram as observações de Santos & Foster (1981b),
Boiça Júnior et al. (1997), Toscano et al. (1999), Guzzo et al. (2002) e Santos et al.
(2005), em experimentos com Sitophilus spp. testados contra diversos cultivares de
milho.
O cultivar CD 307 foi o que apresentou, significativamente, maior
atratividade a Sitophilus spp. (40,7%), enquanto os que apresentaram a menor
atratividade foram os cultivares CD 306 (4% de atratividade), CD 308 (6,3%), e CD
3121 (8,2%). Assim, os menos atrativos nas condições analisadas, segundo Lara
(1991), apresentam uma resistência do tipo não-preferência ou antixenose para
alimentação.
Em experimentos realizados para verificar a atratividade de S. zeamais por
diferentes cultivares de milho, Santos & Foster (1981b) observaram que o cultivar
mais atrativo atraiu 19,6% do total de insetos, enquanto que no cultivar menos
atrativo foram atraídos 0,7% dos insetos. Estes autores também destacam que os
cultivares menos atrativos indicam a não-preferência do inseto.
Em testes semelhantes, Toscano et al. (1999) verificaram a atratividade de
S. zeamais para 10 diferentes cultivares de milho, sendo que nos cultivares mais
atrativos observaram 24,7% dos insetos, contra 3,1% nos menos atrativos. Segundo
estes autores, os cultivares podem apresentar substâncias alimentares que
interferem ou estimulam a alimentação dos insetos, assim, os materiais que atraem
um menor número de insetos, possivelmente, apresentam um fator de repelência.
Nos experimentos realizados por Guzzo et al. (2002) observou-se que o
cultivar de milho mais atrativo para S. zeamais apresentou 20,2% de insetos, e o
menos atrativo apresentou 8,9%, destacando, para este, uma provável fonte de
63
resistência do tipo não-preferência para a oviposição ou alimentação. O cultivar CD
3121 também foi avaliado pelos autores citados, mas ao contrário dos resultados
aqui obtidos, este cultivar apresentou uma grande atratividade a S. zeamais,
representando 18,98% do total de insetos atraídos, estando entre os três cultivares
mais preferidos. Isto pode ter ocorrido pelo fato dos cultivares aqui testados, em
conjunto com o cultivar CD 3121, serem mais atrativos quando comparados aos
cultivares testados no outro trabalho, anulando assim a atratividade do cultivar CD
3121.
Comparando-se os resultados aqui obtidos, nos cultivares mais atrativos,
com os resultados obtidos nos trabalhos citados, verifica-se que, em geral, são
menores. Contudo, Santos et al. (2005), obteve números mais expressivos de
atratividade de Sitophilus spp., sendo que o cultivar de milho mais atrativo
apresentou 50,9% dos insetos, enquanto o menos atrativo teve uma média de
19,6%, e atribuíram a não-preferência de Sitophilus spp. a substâncias na
composição de determinados cultivares que possam causar a repelência destes, e
conseqüente atração por outros.
Verifica-se que para a maioria dos autores citados, a atratividade ou
repelência de insetos por determinados cultivares de milho, podem estar
relacionadas com substâncias presentes ou liberadas pelos grãos, assim também
destacado por Boiça Júnior et al. (1997), relacionando ao odor e ao sabor dos grãos
a atratividade de S. zeamais.
Contudo, Tipping et al. (1987), em experimentos realizados com extratos de
diferentes cultivares de milho visando relacionar a atração química e a resistência a
S. zeamais, observaram que substâncias aleloquímicas não estão relacionadas com
a não-preferência à alimentação. Tipping et al. (1988), por outro lado, descreveram
64
que a composição do pericarpo, bem como a dureza do grão, são fatores
determinantes, como também observado em ‘Tripsacorn’ por Throne & Eubanks
(2002), sendo que este material, quando o pericarpo estava intacto, não sofreu o
ataque de gorgulhos.
Grãos mais duros, mais escuros e mais pesados, segundo Miranda et al.
(1995), apresentam menor preferência a S. zeamais, contudo, estes mesmos
autores destacam que estas características não são relevantes na explicação da
preferência, uma vez que estas correlações não foram significativas em seus
experimentos.
Considerando que os cultivares aqui analisados, que apresentaram não-
preferência são do tipo semi-duro e alaranjado (CD 306 e CD 308) e semi-dentado e
amarelo (CD 3121), enquanto o cultivar mais preferido é do tipo semi-dentado e
amarelo (CD 307), conclui-se também que a dureza e a cor do grão não interferem
na preferência alimentar do inseto, já que cultivares apresentando o mesmo tipo de
dureza e cor estão classificados como o mais e o menos preferido para alimentação
de Sitophilus spp. Desta forma, dureza e cor nem sempre podem ser associadas ao
tipo de resistência não-preferência (Ramalho et al., 1976 e Gudrups et al., 2001).
Assim, pode-se observar que não há um consenso quanto ao que realmente
interfere na preferência alimentar de Sitophilus spp. Mas, foi verificado que os
cultivares altamente preferidos atraem uma grande proporção de insetos,
conseqüentemente, restam poucos para infestar os demais cultivares, ou seja, estes
podem ter escapado a infestação, podendo assim, não ter um fator de repelência em
potencial (Santos & Foster, 1981).
Para complemento deste teste, foi realizado o teste sem chance de escolha
ou de confinamento, e para isto foi selecionado o cultivar mais preferido, CD 307, e
65
dentre os que apresentaram não-preferência à alimentação, foi selecionado o CD
3121.
5.1.2 Teste sem chance de escolha (confinamento)
Neste teste, procurou-se observar se os cultivares analisados apresentavam
algum efeito na biologia de Sitophilus spp. e constatou-se que houve diferença
significativa entre os dois cultivares, quanto à duração do ciclo, número de adultos
emergidos, peso dos adultos e perda total de peso dos grãos.
Verificou-se que o cultivar que apresentou não-preferência para a
alimentação no primeiro teste, CD 3121, também foi o mesmo onde os insetos
tiveram maior duração no ciclo ovo-adulto, com média de 52,5 dias, o que
representa menor número de gerações, sendo portanto considerado um cultivar
resistente. Já no cultivar CD 307, que demonstrou maior preferência para
alimentação, os insetos apresentaram menor duração no ciclo, 47,5 dias,
representando um cultivar suscetível quando comparado ao CD 3121 (Tabela 5).
66
Tabela 5. Duração média do ciclo biológico, número e peso de adultos de Sitophilus
spp. emergidos das variedades de milho, em teste sem chance de escolha.
Variedades Duração do ciclo
(dias)
Número de adultos
emergidos*
Peso dos adultos
(mg)*
CD 307 47,5 ± 0,72B 37,7 ± 5,43A 2,4 ± 0,02B
CD 3121 52,5 ± 0,91A 14,0 ± 1,26B 2,5 ± 0,05A
CV (%) 2,33 26,66 1,66
*Dados originais apresentados, para análise estatística os dados foram transformados em
x
.
Médias (± EP) seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey
(P<0,05).
Nos experimentos de confinamento, com grãos debulhados, Ramalho et al.
(1977) observaram duração média do ciclo variando entre 44,8 a 53,9 dias,
considerando, que os cultivares nos quais a duração média foi menor, são
suscetíveis, pois favorecem o desenvolvimento de S. zeamais, tal como aqui
apresentados.
Da mesma forma, Bortoli (1987) obteve para o cultivar considerado
suscetível, média de 44,4 dias e, o cultivar resistente 48,4 dias de duração média do
ciclo de desenvolvimento (ovo-adulto).
Contudo, Boiça Júnior et al. (1997) obtiveram uma variação semelhante
quanto ao ciclo biológico de S. zeamais em grãos de diferentes cultivares de milho,
variando de 41,2 a 51,4 dias, sem no entanto, haver diferença significativa na
duração do ciclo do inseto pelos cultivares, corroborando os experimentos realizados
por Toscano et al. (1999) e Guzzo et al. (2002).
Nos cultivares suscetíveis, avaliados por Marsaro Júnior et al. (2005a), o
ciclo biológico de S. zeamais foi menor que 41 dias, enquanto nos resistentes foi
67
superior a 44 dias, ou seja, a variação se deu no intervalo de 38,87 a 46,62 dias.
Contudo, testando outros cultivares de milho, verificaram que a variação do ciclo
biológico de S. zeamais foi de 51,5 a 58,4 dias (Marsaro Júnior et al., 2005b).
Ressalta-se que Guzzo et al. (2002) obtiveram, para S. zeamais
provenientes do cultivar CD 3121, média do ciclo ovo-adulto de 49,85 dias, porém,
Marsaro Júnior et al. (2005b) observou para este mesmo cultivar uma média do ciclo
do inseto de 55,6 dias. Considerando que no presente trabalho a média foi de 52,5
dias, intermediária em relação aos demais, essas variações podem ser explicadas
por diferenças nas condições em que o experimento foi mantido, sendo a
temperatura um fator que pode acelerar ou retardar o desenvolvimento dos insetos.
Neste sentido, sabe-se que o limite de variação de temperatura para S. oryzae é de
15º a 34,1ºC, acima ou abaixo desse intervalo o inseto não se reproduz (Guedes,
1990/1991), sendo que o ciclo ovo-adulto de S. zeamais em milho, a 28ºC e 60%
U.R., é em média 34 dias (Pacheco & Paula, 1995).
Além do ciclo biológico, o número de insetos emergidos também é um fator
a se considerar, pois segundo Guzzo et al. (2002), um dos mais importantes
indicadores de antibiose é a morte larval, que pode ser expressa pelo baixo número
de insetos emergidos, sendo que para os cultivares resistentes, os autores
obtiveram 12 a 15 insetos, e nos mais suscetíveis a média alcançou 49 indivíduos.
Os cultivares aqui analisados apresentaram diferenças significativas quanto
ao número de insetos emergidos, sendo que o cultivar CD 307 apresentou média de
37,7 insetos emergidos, enquanto que para o cultivar CD 3121 obteve-se média de
14 insetos.
De forma contrastante, no cultivar CD 3121, Guzzo et al. (2002) verificaram
emergência média de 49 insetos, contudo dados semelhantes aos aqui obtidos
68
foram registrados por Marsaro Júnior et al. (2005b), segundo os quais, o número de
insetos emergidos no cultivar CD 3121 esteve entre os menores.
Segundo Ramalho et al. (1977), existe uma relação entre duração do ciclo e
o número de adultos emergidos, determinando assim que quanto mais suscetível é o
milho, maior é o número de insetos emergidos e menor é o tempo que demoram a
emergir, como observado por Guzzo et al. (2002) para o cultivar CD 3121, e aqui
observado para o cultivar CD 307.
Santos & Foster (1981b) observaram que a maioria dos cultivares que se
mostraram como mais resistentes para a emergência e postura dos ovos, nos testes
de confinamento, também foram os menos preferidos no teste de livre escolha.
Ressalta-se assim, que a “não-preferencia” e “antibiose” são mecanismos de
resistência do grão de milho ao gorgulho, e que os dois testes se completam neste
quesito, pois os mais suscetíveis também se apresentaram como os mais preferidos.
Ao contrário destes, Boiça Júnior et al. (1997) observaram que o cultivar
com uma das maiores emergências foi o menos preferido no teste de livre escolha.
Associaram este fato a alguma causa química, como a liberação pelos grãos de
substâncias atrativas aos gorgulhos para oviposição e/ou alimentação. Mesmo
atraindo poucos insetos no teste de livre escolha, mas apresentando uma grande
emergência, são classificados como suscetíveis.
Quanto ao peso dos adultos emergidos, apesar da diferença ser de apenas
0,1 mg, foi estatisticamente significativa, sendo que os adultos que emergiram do
cultivar CD 3121 apresentaram peso de 2,5mg enquanto os insetos emergidos do
cultivar CD 307 apresentaram um peso médio de 2,4mg. Isso pode ser explicado
pela menor competição dos insetos no cultivar CD 3121, ocasionando insetos com
peso maior, ou mesmo pela maior disponibilidade de nutrientes, fazendo com que se
69
alimentassem menos, tendo, mesmo assim, ganho de peso, por este cultivar possuir
uma quantidade suficiente de nutrientes.
Toscano et al. (1999) obtiveram diferença quanto ao peso dos adultos
emergidos em função dos milhos, onde o peso variou de 2,15mg a 2,79mg,
atribuindo esta diferença a algum fator de antibiose e/ou não-preferência para a
alimentação. O peso de adultos de Sitophilus spp. não diferiu entre os cultivares
analisados por diversos autores, como Vowotor et al. (1995), Guzzo et al. (2002),
Marsaro Júnior et al. (2005a e (005b).
Nos testes realizados por Marsaro Júnior et al. (2005b) conclui-se que os
híbridos analisados possuíam requerimentos de aminoácidos básicos para o
desenvolvimento de S. zeamais, explicando a igualdade no peso dos adultos nos
diferentes híbridos. No entanto, todos estes autores, com exceção de Guzzo et al.
(2002), observaram que o desenvolvimento dos insetos foi afetado em relação aos
cultivares.
Em relação aos danos provocados por Sitophilus spp. nos cultivares
analisados, verificou-se que houve uma diferença significativa quanto à perda total
de peso dos grãos e porcentagem de perda total do peso dos grãos, não ocorrendo
diferença significativa quanto à porcentagem de grãos danificados (Tabela 6).
70
Tabela 6. Porcentagem média de grãos danificados, porcentagem média de perda
total de peso dos grãos de milho e perda média total (g), causados por Sitophilus
spp., em teste sem chance de escolha.
Variedades Grãos danificados (%)* Perda total (g)
1
**
Perda total (%)
1
*
CD 307 44,8 ± 4,59A 0,9 ± 0,12A 4,5 ± 0,61A
CD 3121 40,3 ± 1,86A 0,3 ± 0,09B 1,7 ± 0,44B
CV (%) 17,82 11,38 36,88
1
Valores comparados às respectivas testemunhas.
*Dados originais apresentados, para análise estatística os dados foram transformados em arcseno
x/100
.
**Dados originais apresentados, para análise estatística os dados foram transformados em
x
+ 1.
Médias (
±
EP) seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey
(P<0,05).
Apesar de não haver diferença quanto à porcentagem de grãos danificados
entre os cultivares (Figura 4 e 5), ocorreu diferença em relação à perda de peso
total. Este fato pode estar relacionado à presença de substâncias atrativas presentes
no cultivar CD 307, fazendo com que os insetos se alimentem mais desse cultivar.
Também pode estar relacionado à menor disponibilidade de nutrientes, de forma que
os insetos se alimentem mais, a fim de suprir suas necessidades.
71
Figura 4. Cultivar CD 307, à esquerda grãos sadios e à direita grãos danificados por
Sitophilus spp.
Figura 5. Cultivar CD 3121, à esquerda grãos sadios e à direita grãos danificados
por Sitophilus spp.
72
A perda total do peso dos grãos foi significativamente diferente, sendo que o
cultivar CD 307 apresentou uma maior perda 0,9g (4,5%) enquanto o cultivar CD
3121 apresentou 0,3g (1,7%). Podendo também estar relacionado ao maior número
de insetos emergidos, e pela própria preferência alimentar apresentada no teste com
chance de escolha. Segundo Kim & Kossou (2003), existe uma relação entre o
número de insetos emergidos e o nível de dano provocado.
Conforme Matioli (1981), a perda de peso dos grãos atacados é um fator
muito importante, pois além do aspecto econômico, também indica um fator de
resistência. Como também observado por Faleiro et al. (1995), onde o cultivar
considerado resistente foi o que apresentou menor perda de peso, sendo apenas
0,1%.
Boiça Júnior et al. (1997) verificaram a variação do peso dos grãos
consumidos por S. zeamais de 0,1 a 0,6g, sugerindo que os cultivares que
apresentaram uma redução de 0,1g são menos adequados ao consumo alimentar
deste inseto.
Toscano et al. (1999) observaram que a perda média de peso dos grãos
infestados com S. zeamais variou de um cultivar para outro, onde relatou a variação
de 0,04g a 0,70g, indicando uma possível substância alimentar ou um fator que
interferiu ou estimulou a alimentação destes.
De forma contrastante, Guzzo et al. (2002) verificaram que o cultivar CD
3121 foi o mais suscetível ao ataque de S. zeamais, pois apresentou maior
porcentagem e maior valor de peso de grãos danificados, foi um dos mais atrativos,
apresentando maior número de insetos emergidos e maior perda total.
Marsaro Júnior et al. (2005b) verificaram que a perda de peso variou de 2,4
a 8,6g, para 100g de grãos, sendo que o cultivar CD 3121 apresentou, tal como aqui
73
observado, a menor perda. Estes relataram que cultivares com maior teor de
unidades inibidoras de amilase retardam o desenvolvimento das larvas, sofrendo
menores perdas e aumentando a resistência desses. Ainda segundo estes autores,
o cultivar CD 3121 apresentou um dos índices mais elevados de unidades inibidoras
de amilase, provocando uma menor alimentação dos insetos e conseqüente,
menores perdas nos grãos. Sendo este cultivar classificado pelos autores citados,
como um dos cultivares mais resistentes, apresentando menores perdas de peso de
matéria seca dos grãos, e conseqüentemente, menores números de insetos. Foi
considerado resistente, uma vez que afetou negativamente o comportamento de
oviposição e/ou desenvolvimento das larvas.
Com estes resultados, verifica-se que o cultivar CD 3121, quando
comparado ao cultivar CD 307, é resistente ao ataque de Sitophilus spp., pois
apresenta uma maior duração do ciclo, número menor de insetos emergidos e menor
perda total, podendo ser consideradas resistências do tipo não-preferência e
antibiose.
Segundo Lara (1991) e Gallo et al. (2002), antibiose é quando o inseto se
alimenta normalmente do cultivar e esse interfere negativamente na sua biologia,
como ocorreu com o cultivar CD 3121, quanto à duração do ciclo. Já a resistência do
tipo não-preferência (antixenose) provoca uma resposta negativa no inseto durante o
processo de seleção, que deixa de utilizá-lo para alimentação, oviposição ou abrigo,
em relação aos outros cultivares, como também verificado para este cultivar nos
testes realizados.
Gudrups et al. (2001) verificaram que o tamanho dos grãos é determinante
na resistência dos cultivares ao ataque de S. zeamais, sendo que os grãos grandes
apresentaram maior resistência que os menores. Isto também foi verificado no
74
presente experimento, sendo que os grãos do cultivar CD 3121 são maiores em
relação aos do cultivar CD 307.
Assim sendo a resistência é relativa, devendo sempre ser comparada com
outros cultivares, pois pode ser resistente a uma praga e suscetível a outras. Em
relação aos insetos, a constatação de resistência pode ser verificada por diferenças
no comportamento, biologia, duração do ciclo, peso, dentre outros fatores, sendo os
testes aqui realizados, considerados parâmetros para esta verificação. Estes são
realizados, pois muitas vezes um cultivar menos preferido, em condições de livre
escolha, torna-se suscetível e apresenta danos elevados quando o inseto não tem
outro cultivar alternativo. A verificação em plantas pode ser feita pela intensidade do
dano ocasionado, perda de peso e outros fatores (Lara, 1991 e Gallo et al., 2002).
5.2 SELEÇÃO DE ISOLADOS DE FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS
5.2.1 Avaliação da Patogenicidade
Verificou-se que todos os isolados analisados apresentaram ação
patogênica a Sitophilus spp., sendo que o isolado Esalq 643 (98,3%) foi o que
apresentou maior mortalidade confirmada, seguido pelo Unioeste 4 (95%), ambos da
espécie B. bassiana (Tabela 7, Figura 6).
75
Tabela 7. Porcentagem média de mortalidade confirmada de adultos de Sitophilus
spp. por diferentes isolados de B. bassiana e M. anisopliae após 10 dias de
incubação (26±1°C, 14 horas de fotofase).
Isolados Mortalidade (%)
Beauveria bassiana
Unioeste 1
45,0
Unioeste 3 8,3
Unioeste 4 95,0
Unioeste 5 71,7
Unioeste 25 28,3
Unioeste 26
71,7
Unioeste 36
80,0
Unioeste 37
78,3
Unioeste 38
35,0
Unioeste 39
83,3
Unioeste 40
70,0
Unioeste 41
86,7
Unioeste 42
43,3
Unioeste 44
91,7
Unioeste 45
90,0
Esalq 643
98,3
Metarhizium anisopliae
Unioeste 22
65,0
Unioeste 43
33,3
76
M. anisopliae B. bassiana
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
U
N
I
O
E
S
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0
1
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0
3
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0
4
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0
5
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2
2
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2
5
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2
6
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S
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3
6
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O
E
S
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3
7
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S
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3
8
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I
O
E
S
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E
3
9
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O
E
S
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E
4
0
U
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E
S
T
E
4
1
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I
O
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S
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4
2
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S
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4
3
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S
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E
4
4
U
N
I
O
E
S
T
E
4
5
E
S
A
L
Q
6
4
3
Isolados
Mortalidade confirmada (%)
Figura 6. Eficiência de diferentes isolados de B. bassiana e M. anisopliae na
mortalidade confirmada de adultos de Sitophilus spp. (26±1°C, 14 horas de fotofase).
Moino Júnior et al. (1998) obtiveram resultados semelhantes, verificando
que isolados de B. bassiana causaram a maior porcentagem média de mortalidade
para S. zeamais (56,7 a 100%) e para S. oryzae (33,3 a 100%). Ressaltaram que o
isolado Esalq 643 foi o segundo melhor, dentre 72 isolados analisados,
apresentando mortalidade média de 86,7% para S. zeamais e 96,7% para S. oryzae.
Ainda que em número reduzido (apenas 2), o fungo M. anisopliae,
aparentemente, apresenta menor eficiência contra Sitophilus spp. Neste sentido,
dados semelhantes foram igualmente observados por Moino Júnior et al. (1998) que
constataram que o fungo B. bassiana é melhor adaptado para infectar S. zeamais e
77
S. oryzae quando comparado a M. anisopliae, pois os isolados de M. anisopliae não
causaram mais que 60% de mortalidade neste inseto, e em contrapartida, mais da
metade dos isolados de B. bassiana causaram mais de 60% de mortalidade.
Assim, dentre os isolados avaliados, Unioeste 4, Unioeste 36, Unioeste 39,
Unioeste 41, Unioeste 44, Unioeste 45 e Esalq 643, foram os selecionados pois
causaram mortalidade confirmada em Sitophilus spp. mínima de 80%, sendo todos
isolados do fungo B. bassiana,.
5.2.2 Comparação dos Isolados
5.2.2.1 Comparação da Virulência
Dos isolados que selecionados anteriormente, foi realizada uma nova
comparação, selecionando-se os três isolados que apresentaram maior mortalidade
confirmada acumulada ao 5
o
dia após a inoculação, sendo eles os isolados Unioeste
4 (78,3%), Unioeste 39 (71,7%) e Esalq 643 (63,3%) (Figura 7 e 8).
78
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
DIAS
MORTALIDADE
CONFIRMADA (%)
UNIOESTE 04 UNIOESTE 36 UNIOESTE 39 UNIOESTE 41
UNIOESTE 44 UNIOESTE 45 ESALQ 643
Figura 7. Mortalidade confirmada acumulada de adultos de Sitophilus spp. por
isolados de B. bassiana (26±1°C, 14 horas de fotofase).
0
10
20
30
40
50
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
DIAS
MORTALIDADE CONFIRMADA (%)
UNIOESTE 04 UNIOESTE 36 UNIOESTE 39 UNIOESTE 41 UNIOESTE 44 UNIOESTE 45 ESALQ 643
Figura 8. Porcentagem de mortalidade confirmada diária de adultos de Sitophilus spp. por isolados de B. bassiana
(26±1°C, 14 horas de fotofase).
80
Segundo Neves & Hirose (2005), a escolha da mortalidade confirmada
como parâmetro de seleção, baseia-se no fato de que os fungos diferem dos
agroquímicos quanto ao modo de ação, comprovando desta forma a mortalidade do
inseto pelo entomopatógeno.
Dentre os isolados selecionados, dois foram obtidos a partir de insetos da
ordem Coleoptera, Unioeste 4 e Unioeste 39, sendo o último coletado de um inseto
da família Curculionidae, já o isolado Esalq 643 foi coletado de solo. Segundo Xu
(1988), citado por De La Rosa et al. (1997), geralmente os isolados de B. bassiana
apresentam um alto nível de virulência para o hospedeiro ao qual ele foi isolado ou
para espécies próximas, dentro da mesma ordem, tal como foi observado por Rohde
et al. (2006), que verificaram que dentre os isolados mais efetivos no controle de A.
diaperinus, encontraram-se aqueles obtidos a partir de cadáveres do próprio inseto.
No entanto, ressalta-se que isto não é uma regra, podendo ser mais
agressivo a insetos filogeneticamente distintos do hospedeiro original, como
observado para o isolado Esalq 643, neste experimento. Badilla & Alves (1991)
relatam que a virulência é uma característica própria da linhagem utilizada, sendo
necessária técnicas especiais para se determinar a sua virulência.
5.2.2.2 Determinação da Concentração Letal Média (CL
50
)
Os dados obtidos neste experimento não se adequaram ao modelo de
Probit, optando-se assim, pela comparação de médias de mortalidade por meio da
análise de variância e teste de Tukey. Alguns isolados selecionados por Neves &
Hirose (2005) para controle de H. hampei também não se adequaram na análise de
81
Probit, e os isolados que se ajustaram ao modelo não demonstraram diferenças
significativas entre as CL
50
. Assim, estes autores optaram por uma análise de
variância com teste de comparação de médias das mortalidades em cada
concentração, com regressão polinomial para determinar a equação de
concentração/resposta dos diferentes isolados e calcular as CL
50
.
Assim, também Rohde et al. (2006) nos experimentos de seleção de
isolados de fungos entomopatogênicos para controle de A. diaperinus, obtiveram
dados que não se ajustaram no modelo de Probit, e para isso optaram pela
comparação de médias no 5
o
e no 10
o
dia após inoculação, complementando o
estudo comparativo com análise de outros parâmetros biológicos.
Segundo Haddad (1998), a análise de DL, CL e TL
50
com a utilização do
Probit,
em testes envolvendo entomopatógenos, nem sempre é possível, pois os
bioensaios não são do tipo estímulo-resposta, por isso muitas vezes os dados não
se enquadram ao modelo.
Neste experimento, verificou-se que todos os isolados apresentaram
diferença significativa na mortalidade confirmada conforme a variação da
concentração de conídios, sendo que com o aumento da concentração ocorreu
aumento na mortalidade (Tabela 8).
Tabela 8: Porcentagem média de mortalidade confirmada (± EP) de adultos Sitophilus spp. submetidos a diferentes concentrações
de conídios de B. bassiana ao 5
o
e ao 10
o
dia após inoculação (26±1°C, 14 horas de fotofase).
Isolados Concentrações
de conídios/mL
Unioeste
4
Unioeste
39
Esalq 643
5
o
10
o
5
o
10
o
5
o
10
o
1
×
10
4
1,7±O,42Ba
5,0±0,42Ca
n.s.
1,7±0,48Ca
6,7±0,42Ca
n.s.
3,3±0,48Ba
5,0±0,42Ca
n.s.
1×10
5
1,7±0,42Ba
3,3±0,48Ca
n.s.
1,7±0,42Ca
5,0±0,80Ca
n.s.
5,0±0,80Ba
10,0±0,48Ca
n.s.
1
×
10
6
5,0±0,80Ba
11,7±1,85Ca
n.s.
5,0±0,80BCa
10,0±1,98Ca
n.s.
5,0±1,25Ba
5,0±1,25Ca
n.s.
1×10
7
3,3±0,48Ba
10,0±0,48Ca
n.s.
3,3±0,48Ca
11,7±1,05Ca
n.s.
3,3±0,48Ba
16,7±0,48BCa*
1
×
10
8
18,3±1,85Aa
48,3±2,67Ba
n.s.
21,7±1,42Ba
45,0±1,58Ba
n.s.
18,3±1,25Ba
45,0±0,42ABa*
1×10
9
61,7±1,25Aa
95,1±0,78Aa
n.s.
76,7±2,21
Aa
91,7±1,58Aa
n.s.
50,0±3,54Aa
78,3±2,29Aa
n.s.
CV (%) 41,21
Dados originais apresentados, para análise estatística os dados foram transformados em arcseno
x/100
.
Médias (
±
EP) seguidas pela mesma letra MAIÚSCULA na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
MINÚSCULA na linha nos dias correspondentes, não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
* Médias com diferença para o mesmo isolado entre os dois dias de avaliação, pelo teste de Tukey (P<0,05).
n.s.
Dentro do mesmo isolado, na linha, não diferem entre si
83
A mortalidade ao 5
o
dia apresentada pelo Unioeste 4 variou de 1,7% nas
menores concentrações a 61,7% na concentração de 1,0 × 10
9
conídios/mL, sendo
que esta concentração não diferiu significativamente da concentração de 1,0 × 10
8
.
No 10
o
dia a variação esteve entre 3,3% (1,0
×
10
5
) e 95,1% (1,0
×
10
9
), sendo que
esta última se destacou entre as demais.
O isolado Unioeste 39 apresentou uma variação na mortalidade ao 5
o
dia de
1,7% (1,0 × 10
4
e 1,0 × 10
5
) a 76,7% (1,0 × 10
9
), sendo esta última concentração
superior às demais estatisticamente. A variação na mortalidade apresentada no 10
o
dia variou entre 5,0% (1,0 × 10
5
) e 91,7% (1,0 × 10
9
), havendo diferença significativa
apenas na última concentração.
O isolado Esalq 643 apresentou 3,3% de mortalidade na concentração de
1,0
×
10
4
e 1,0
×
10
7
ao 5
o
dia, e da mesma forma que o anterior, as concentrações
diferiram significativamente apenas da concentração de 1,0 × 10
9
,
com 50,0% de
mortalidade. Ao 10
o
dia a mortalidade esteve entre 5,0% (1,0 × 10
4
e 1,0 × 10
6
) e
78,3% (1,0 × 10
9
) sendo esta concentração diferente estatisticamente das demais.
Verificou-se que Sitophilus spp. apresentou baixa mortalidade quando
inoculado com isolados de B. bassiana nas concentrações 1,0 × 10
4
, 1,0 × 10
5
, 1,0 ×
10
6
e 1,0 × 10
7
conídios/mL. Pode-se observar desta forma, que concentrações
inferiores a 1,0
×
10
8
, para os isolados aqui testados, não são recomendadas para
ensaios de seleção de fungos para este inseto (Figura 9).
84
0
20
40
60
80
100
10^4 10^5 10^6 10^7 10^8 10^9
CONCENTRAÇÃO
MORTALIDADE
CONFIRMADA (%)
UNIOESTE 04 UNIOESTE 39 ESALQ 643
Figura 9: Porcentagem média de mortalidade de Sitophilus spp., submetidos a
diferentes concentrações de conídios de isolados de Beauveria bassiana, após 10
dias de incubação (26±1°C, 14 horas de fotofase).
Apesar do Unioeste 39 apresentar mortalidade média de 76,7% ao 5
o
dia,
sendo a maior mortalidade verificada, não diferiu significativamente do Unioeste 4
(61,7%) e do Esalq 643 (50,0%). Pode-se observar também, que dentro do mesmo
dia e da mesma concentração, a mortalidade não diferiu significativamente entre os
isolados testados, portanto, todos apresentam potencial para utilização em
programas de controle biológico de Sitophilus spp.
Avaliando a CL
50
de dois isolados de B. bassiana para controle de S.
zeamais e S. oryzae, Moino Júnior & Alves (1997) utilizaram inoculações em pó, nas
concentrações de 0,001; 0,005; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 e 1,0g de conídios/100g de grãos
de arroz. Os autores verificaram que para S. oryzae não houve diferença entre os
85
isolados dentro da mesma concentração, sendo que a CL
50
para este inseto foi de
0,1g de conídios/100g de grãos. Contudo, na avaliação da CL
50
dos isolados para
controle de S. zeamais, estes diferiram entre si, sendo que o isolado 604 apresentou
menor CL
50
(0,01g de conídios/100g) comparado ao isolado 476 (0,05g de
conídios/100g de grãos). Porém, são dados de difícil comparação, pois não
apresentam a concentração de conídios/mL ou conídios/g.
No entanto, Kassa et al. (2002), avaliando a CL
50
de isolados de B. bassiana
e M. anisopliae para controle de S. zeamais, utilizaram inoculações líquidas,
verificando que o isolado de M. anisopliae apresentou a menor CL
50
(2,0 × 10
5
conídios/mL) em relação aos isolados de B. bassiana (2,0
×
10
6
conídios/mL),
demonstrando, ao contrário dos resultados aqui obtidos, maior potencialidade.
Entretanto, também verificaram diferenças entre a CL
50
apresentada por dois dos
isolados de B. bassiana testados.
Assim como os autores citados, Neves & Hirose (2005) obtiveram
diferenças na mortalidade de H. hampei, entre os isolados testados, dentro da
mesma concentração. Assim também foi observado por Rohde et al. (2006) com A.
diaperinus, que além deste fator, observaram a variação da mortalidade entre os
diferentes isolados, considerando o mesmo dia de avaliação.
Comparando-se a mortalidade de Sitophilus spp. ao 5
o
e ao 10
o
dia após a
inoculação, dentro de cada concentração, para cada isolado, apenas Esalq 643
mostrou diferença significativa entre os dois dias para as concentrações de 1,0 × 10
7
conídios/mL
(3,3% para o 5
o
dia e 16,7% para o 10
o
dia) e 1,0 × 10
8
(18,3% para o
5
o
dia e 45,0% para o 10
o
dia), os demais isolados e as demais concentrações não
diferiram significativamente entre si.
86
5.2.2.3 Crescimento Vegetativo
Em relação ao crescimento vegetativo o isolado Esalq 643 apresentou o
maior diâmetro médio de colônia, 4,5cm, quando comparado ao Unioeste 4, com
3,4cm e ao Unioeste 39 com 3,3cm (Figura 10, Tabela 9).
87
Figura 10. Colônia de B. bassiana, A) isolado Unioeste 4, B) isolado Esalq 643 e C)
isolado Unioeste 39, cultivado em M.E, 8 dias após a incubação (26
±
1
°
C, 14 horas
de fotofase).
9cm
A
B
C
88
Tabela 9. Diâmetro médio e produção média de conídios em colônias (± EP) de
diferentes isolados de B. bassiana em meio de cultura, após 8 dias de incubação
(26
±
1
°
C, 14 horas de fotofase).
Isolados Diâmetro médio
das colônias (cm)
Produção média de
conídios/colônia*
Produção média de
conídios/cm
2
**
Unioeste 4 3,4 ± 0,08B 1,6 ± 0,25B 1,6± 0,21A
Unioeste 39 3,3 ± 0,11B 1,3 ± 0,25B 1,7 ± 0,33A
Esalq 643 4,5 ± 0,03A 4,8 ± 0,74A 3,0 ± 0,46A
CV (%) 2,32 16,51 22,29
*número médio de conídios por colônia × 10
8
**número médio de conídios por cm
2
× 10
7
Dados originais apresentados, para análise estatística os dados foram transformados em
x
.
Médias (
±
EP) seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey
(P<0,05).
Valores discrepantes aos aqui apresentados foram verificados por Diodato &
Santos (1992/1993) que obtiveram diâmetro médio micelial de 1,3 a 1,83cm para o
fungo B. bassiana, extraído da vespa-da-madeira, Sirex noctilio.
Batista Filho et al. (2001) obtiveram 4,3 cm de diâmetro médio de colônia
após 14 dias de incubação, sendo este resultado semelhante ao aqui apresentado
para o isolado Esalq 643. O diâmetro de colônia de B. bassiana obtido por Hirose et
al. (2001) foi de 3,1cm após 8 dias de incubação, sendo semelhante ao obtido no
presente trabalho para o isolado Unioeste 39. Para o fungo B. bassiana extraído de
H. hampei, após 6 dias de incubação, Depieri et al. (2005) verificaram variação no
diâmetro de colônia de 2,09 a 3,25cm.
Ao contrário dos valores aqui obtidos, Alexandre et al. (2006) verificaram
média de 1,35cm no diâmetro das colônias de isolados de B. bassiana após 10 dias
de incubação a 26ºC, sendo valores inferiores aos do presente trabalho.
89
No entanto, valores semelhantes aos aqui apresentados, foram verificados
por Rohde et al. (2006), sendo que o isolado que apresentou maior diâmetro de
colônia mediu 4,3cm, após 10 dias de incubação. Estes autores também testaram o
isolado Unioeste 4, que apresentou diâmetro médio de colônia de 3,8cm, sendo
apenas 0,4cm maior do diâmetro aqui obtido.
Pode-se verificar que, em geral, não há grandes variações em relação ao
diâmetro médio das colônias dentro da mesma espécie de fungo e em relação ao
mesmo isolado. As pequenas variações podem ser ocasionadas pelo fotoperíodo,
temperatura e umidade relativa, que normalmente são padronizadas, além das
variações no tempo de incubação, no tipo e na espessura do meio de cultura
utilizado e no tempo de armazenamento do isolado. Também leva-se em conta a
quantidade de conídios presentes na alça de inoculação no ato da repicagem e a
genética dos isolados, que pode diferir dentro da mesma espécie e também dentro
do mesmo isolado.
5.2.2.4 Produção de conídios em placa-de-Petri
Com relação à produção média de conídios por colônia, o isolado Esalq 643
diferiu significativamente dos demais, apresentando concentração média de 4,8
×
10
8
conídios/colônia, contra 1,6×10
8
conídios/colônia do isolado Unioeste 4 e 1,3×10
8
conídios/colônia do isolado Unioeste 39. No entanto, em relação à produção média
de conídios/cm
2
, este isolado não diferiu dos demais (Tabela 09, Figura 11).
90
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
UNIOESTE 4 UNIOESTE 39 ESALQ 643
ISOLADOS
DIÂMETRO DA
COLÔNIA
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
CONÍDIOS/cm2
Diâmetro (cm) Conídios (nx10^7)
Figura 11. Crescimento vegetativo e produção de conídios em meio de cultura de
isolados de fungos entomopatogênicos (26±1°C, 14 horas de fotofase).
Valores superiores aos obtidos neste trabalho foram apresentados por
Batista Filho et al. (2001), que obtiveram produção de 9,8
×
10
8
conídios/colônia para
B. bassiana e por Rohde et al. (2006) com variação de 3,8 × 10
8
a 4,0 × 10
9
conídios/colônia. Sendo que este último dado é referente ao isolado Unioeste 4, que
no presente trabalho apresentou a média de 1,6 × 10
8
, o que representa uma
produção 20 vezes menor. Como citado anteriormente, são vários os fatores que
podem afetar a produção, no entanto, observações posteriores demonstraram a
diminuição gradativa na produção e esporulação deste isolado (dados não
publicados).
No entanto, Alexandre et al. (2006) obtiveram valores de produção de
conídios/colônia inferiores aos aqui apresentados, sendo que seus dados estiveram
91
no intervalo 0,2 × 10
8
a 0,7 × 10
8
conídios/colônia. Essa diferença pode estar
relacionada com o menor diâmetro de colônia verificado por estes autores.
Em relação à produção de conídios/cm
2
, Liu et al. (2003) obtiveram dados
contrários aos aqui apresentados, onde observaram diferenças significativas na
produção de conídios/cm
2
entre os diferentes isolados de B. bassiana com variação
de 1,6 × 10
6
a 1,6 × 10
7
conidios/cm
2
a 20ºC, em meio Ágar Dextrose Sabouraud. O
valor superior obtido por este autor é semelhante aos valores aqui obtidos com os
isolados Unioeste 4 (1,6×10
7
) e Unioeste 39 (1,7×10
7
).
O isolado Unioeste 4, no trabalho realizado por Rohde et al (2006),
apresentou produção de 3,2 × 10
8
conídios/cm
2
, representando 11 vezes a produção
obtida neste experimento.
Verificou-se que ocorreu uma relação positiva entre o diâmetro médio das
colônias e a produção média de conídios/colônia, sendo o isolado Esalq 643
superior em relação aos demais. No entanto, relacionando estes valores com a
produção média de conídios/cm
2
, observou-se que não há relação, desta forma,
pode-se concluir que o isolado que apresenta maior diâmetro de colônia nem
sempre irá apresentar uma maior produção de conídios.
No entanto, Rohde et al. (2006) não verificaram relação entre diâmetro de
colônia e produção média de conídios/colônia, como verificado no presente trabalho.
Porém, comparando-se o diâmetro de colônia com a produção média de
conídios/cm
2
, os dados aqui apresentados corroboram os dados apresentados por
estes autores, verificando que não há relação entre diâmetro de colônia e produção
de conídios.
92
5.2.2.5 Produção de conídios em arroz
O isolado Esalq 643 apresentou 10,4 × 10
7
conídios/g de arroz e o isolado
Unioeste 4 apresentou 7,8
×
10
7
conídios/g de arroz, sendo estes isolados
significativamente superiores ao isolado Unioeste 39 (4,3×10
7
conídios/g) (Tabela
10). Comparando-se a produção dos isolados Esalq 643 e Unioeste 4 com produção
de conídios de B. bassiana em arroz, Leite et al. (2003) obtiveram 6,0
×
10
9
conídios/g
de arroz. Da mesma forma, Alves & Pereira (1998) citam que a produção de B.
bassiana em arroz pode alcançar 10
10
a 10
11
conídios/g.
Tabela 10. Número médio de conídios em arroz e em cadáveres (± EP) de Sitophilus
spp. (26±1°C, 14 horas de fotofase)
Isolados Produção média de
conídios/arroz/g*
Produção média de
conídios/cadáver**
Unioeste 4 7,8 ± 0,69ª 1,5 ± 0,12B
Unioeste 39 4,3 ± 0,24B 1,6 ± 0,20B
Esalq 643 10,4 ± 1,15ª 2,6 ± 0,27A
CV (%) 15,25 8,49
* número médio de conídios por grama de arroz × 10
7
**número médio de conídios por cadáver × 10
7
Dados originais apresentados, para análise estatística os dados foram transformados em
x
.
Médias (
±
EP) seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey
(P<0,05).
Rohde et al. (2006) verificaram que a produção do isolado Unioeste 4 foi
maior em relação aos demais isolados, apresentando uma média de 8,3 x 10
8
conídios/g de arroz. Apesar do isolado Unioeste 4 obter uma das maiores produções
93
no presente trabalho, o valor resultante corresponde a uma produção cerca de 10
vezes menor do que a obtida por Rohde et al. (2006).
Esta diferença pode estar relacionada a fatores que envolvem o método de
produção empregado, como o tempo de pré-cozimento do arroz, teor de umidade,
tempo e condições de incubação, bem como a quantidade de substrato dentro de
cada recipiente e a quantidade de inóculo aplicado. Além desses fatores, a
qualidade do arroz utilizado no experimento e a qualidade do inóculo empregado,
são essenciais para a boa produção.
5.2.2.6 Produção de conídios em cadáver de insetos adultos
Todos os isolados apresentaram conidiogênese sobre os cadáveres de
Sitophilus spp. (Figura 12), no entanto, o isolado Esalq 643 mostrou novamente
superioridade em relação aos demais, apresentando produção média de 2,6
×
10
7
conídios/cadáver (Tabela 10).
94
Figura 12. Conidiogênese de B. bassiana sobre cadáveres de Sitophilus spp., após
10 dias da inoculação (26
±
1
°
C, 14 horas de fotofase).
Avaliando a conidiogênese sobre cadáveres adultos de Rhodnius prolixus
(Hemíptera: Reduviidae), Luz & Fargues (1998) observaram variações na
esporulação média em 5 e 10 dias de incubação.
No caso de adultos de Triatoma infestans, inoculados com B. bassiana, Luz
et al. (1999) observaram que houve variação na produção de conídios entre os
diferentes isolados testados, como também observado no presente trabalho. Neves
& Hirose (2005) também obtiveram variações na produção média de
conídios/cadáver em H. hampei, para os diferentes isolados de B. bassiana
analisados.
Da mesma forma, Rohde et al. (2006) e Alexandre et al. (2006) observaram
variações na produção de conídios/cadáver para A. diaperinus, em relação aos
diferentes isolados testados. Alexandre et al. (2006) verificaram que a produção de
95
conídios/cadáver de A. diaperinus também está relacionada à temperatura do
ambiente em que estes se encontram. Desta forma, observa-se que a conidiogênese
está condicionada, principalmente, à temperatura em que os insetos estão mantidos
e ao isolado empregado.
Baseando-se nos dados apresentados pelo teste de seleção de isolados,
verificou-se que o isolado Esalq 643 destacou-se na maioria das análises,
comprovando sua eficácia, assim como observado por Moino Júnior et al. (1998),
sendo selecionado para a etapa seguinte. No entanto, o isolado Unioeste 4 também
se mostrou eficaz, principalmente quanto à porcentagem de mortalidade, além de
apresentar boa produção de conídios/g de arroz, também sendo selecionado para as
análises da fase seguinte.
5.3 ASSOCIAÇÃO DAS VARIEDADES RESISTENTES E FUNGO
ENTOMOPATOGÊNICO
Verificou-se que houve diferença significativa entre os cultivares CD 3121 e
CD 307 quanto à duração do ciclo de Sitophilus spp. quando tratados com o isolado
Esalq 643 pré-infestação, sendo que com o cultivar CD 3121 obteve-se média de
66,7 dias, enquanto no cultivar CD 307 a média foi de 50,5 dias. Quando este
isolado foi inoculado após a infestação, também verificou-se diferença significativa
entre o cultivar CD 3121 (61,8 dias) e o cultivar CD 307 (50,1 dias).
Para o isolado Unioeste 4 também ocorreram diferenças, no entanto,
apenas para o tratamento após a infestação, sendo que no cultivar CD 3121 a média
foi de 62,2 dias e no cultivar CD 307 50,2 dias (Tabela 11).
Tabela 11. Duração média do ciclo biológico (± EP) de Sitophilus spp. emergidos nos cultivares CD 3121 e CD 307 tratados pré e
pós-inestação dos insetos, com conídios de B. bassiana (isolados Unioeste 4 e Esalq 643).
CD 3121 CD 307
Pré-infestação Pós-infestação Pré-infestação Pós-infestação
Unioeste 4 55,3 ± 3,77Ba 62,2 ± 1,58Aa* 50,5 ± 0,75Aa 50,2 ± 0,35Ab
n.s.
Esalq 643 66,7 ± 4,18Aa
61,8 ± 0,50Aa
n.s.
50,5 ± 1,56Ab 50,1 ± 1,42Ab
n.s.
CV (%) = 3,89
Dados originais apresentados, para análise estatística os dados foram transformados em
x
.
Médias seguidas pela mesma letra MAIÚSCULA na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
Médias seguidas pela mesma letra MINÚSCULA na linha nos tratamentos correspondentes, não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
* Médias com diferença significativa dentro do mesmo isolado e na mesma linha, pelo teste de Tukey (P<0,05).
n.s.
Dentro do mesmo isolado, na linha, não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
97
Esta diferença no ciclo biológico do inseto também foi verificada no teste de
confinamento (item 5.1.2), contudo as médias foram inferiores às apresentadas
neste experimento, sendo para o cultivar CD 3121 a média de 52,5 dias, enquanto
para o cultivar CD 307 foi 47,5 dias.
Em relação à duração do ciclo, o cultivar CD 3121, inoculado com Unioeste
4 pré-infestação, não apresentou diferença significativa com o cultivar CD 307. Para
o cultivar CD 307, as inoculações pré e pós-infestação de ambos isolados não
diferiram estatisticamente, no entanto, para o cultivar CD 3121 houve diferença
significativa na estratégia de inoculação, mas apenas para o isolado Unioeste 4, que
aplicado previamente à infestação, apresentou média de ciclo do inseto de 55,3 dias
e aplicado pós-infestação apresentou média de 62,2 dias.
Dados semelhantes foram obtidos por Moino Júnior & Alves (1998) para S.
zeamais, verificando redução no ciclo ovo-adulto quando os isolados foram
aplicados pré-infestação (41 dias para o isolado Esalq 643 e 39,6 dias para o isolado
Esalq 604), atribuíram este fato a uma possível seleção, onde os adultos que
sobreviveram eram mais vigorosos e deram origem a indivíduos também mais
vigorosos, conseqüentemente, tendo menor ciclo.
Contudo, Batta (2004) verificou um aumento no ciclo de desenvolvimento de
S. oryzae quando a infestação ocorreu em grãos de trigo tratados previamente com
a associação de formulações de M. anisopliae em carvão vegetal e em cinzas, como
observado no presente trabalho para inoculação do isolado Esalq 643 pré-infestação
no cultivar CD 3121.
Os isolados também apresentaram diferenças significativas entre si no
parâmetro duração do ciclo, porém, apenas quando inoculados pré-infestação e no
98
cultivar CD 3121, sendo que o isolado Unioeste 4 apresentou duração média de 55,3
dias e o isolado Esalq 643, 66,7 dias.
Em relação ao número de insetos emergidos, não houve diferença
significativa na integração entre os cultivares, isolados e estratégias de aplicação
(Tabela 12). No entanto, em todos os resultados o número de insetos emergidos foi
baixo, não ultrapassando a média de 8 insetos por tratamento, quando comparado
ao experimento de teste sem chance de escolha (item 5.1.2), que apresentou o
menor valor médio para o cultivar CD 3121 (14 insetos).
Tabela 12. Número de adultos de Sitophilus spp. emergidos (± EP) nos cultivares CD 3121 e CD 307 tratados pré e pós-inestação
dos insetos, com conídios de B. bassiana (isolados Unioeste 4 e Esalq 643).
CD 3121 CD 307
Pré-infestação Pós-infestação Pré-infestação Pós-infestação
Unioeste 4 3,3 ± 1,66Aa 7,7 ± 3,63Aa
n.s.
3,6 ± 1,04Aa
3,4 ± 1,00Aa
n.s.
Esalq 643 1,6 ± 0,57Aa
5,0 ± 1,38Aa
n.s.
2,6 ± 1,31Aa
3,3 ± 1,46Aa
n.s.
CV (%) = 43,04
Dados originais apresentados, para análise estatística os dados foram transformados em
x
+1.
Médias seguidas pela mesma letra MAIÚSCULA na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
Médias seguidas pela mesma letra MINÚSCULA na linha nos tratamentos correspondentes, não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
n.s.
Dentro do mesmo isolado, no cultivar, não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
100
Moino Júnior & Alves (1998) observaram que o número de insetos
emergidos, após 60 dias, nos tratamentos pré-infestação, foi menor do que os
emergidos nos tratamentos após a infestação, sendo que o isolado Esalq 643,
testado por estes autores, apresentou média de 3,93 insetos quando aplicado
previamente, e 8,07 quando aplicado posteriormente. Estas médias são
semelhantes às obtidas com o isolado Unioeste 4, sendo que o isolado Esalq 643
aplicado pré-infestação apresentou média de 1,6 insetos, e aplicado pós-infestação
apresentou média de 5 insetos.
Em experimentos misturando conídios de B. bassiana com variedades de
arroz, Rice & Cogburn (1999) verificaram que houve uma redução de 98% na
emergência da progênie de S. oryzae, quando a associação ocorreu com a
variedade de arroz selvagem e 83% de redução na progênie quando a associação
ocorreu com arroz marrom.
Avaliando o peso médio dos adultos emergidos de Sitophilus spp., verificou-
se diferença significativa entre os cultivares, quando inoculados com o isolado
Unioeste 4 pré-infestação (Tabela 13). Assim, os adultos apresentaram maior peso
médio no cultivar CD 3121 (2,8mg), que também foi o que apresentou maior ciclo de
desenvolvimento, confirmando assim a teoria de Moino Júnior & Alves (1998), sobre
a seleção de insetos mais vigorosos. Podendo também ser ressaltada a maior
disponibilidade de nutrientes essenciais para o inseto neste cultivar, pois segundo
Parra (1991), os diferentes alimentos interferem no crescimento, desenvolvimento e
reprodução nos insetos. Assim, a quantidade e qualidade do alimento consumido, na
fase larval, afetam a taxa de crescimento, o tempo de desenvolvimento, peso do
corpo, sobrevivência, fecundidade, longevidade, movimentação e capacidade de
competição dos adultos.
Tabela 13. Peso médio (± EP) de Sitophilus spp. emergidos nos cultivares CD 3121 e CD 307 tratados pré e pós-inestação dos
insetos, com conídios de B. bassiana (isolados Unioeste 4 e Esalq 643).
CD 3121 CD 307
Pré-infestação Pós-infestação Pré-infestação Pós-infestação
Unioeste 4 2,8 ± 0,11Aa 2,6 ± 0,07Aa
n.s.
2,4 ± 0,05Ab
2,4 ± 0,10Aa
n.s.
Esalq 643 2,4 ± 0,04Ba 2,7 ± 0,06Aa* 2,4 ± 0,23Aa
2,5 ± 0,09Aa
n.s.
CV (%) = 4,36
Dados originais apresentados, para análise estatística os dados foram transformados em
x
.
Médias seguidas pela mesma letra MAIÚSCULA na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
Médias seguidas pela mesma letra MINÚSCULA na linha nos tratamentos correspondentes, não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
* Médias com diferença significativa dentro do mesmo isolado e na mesma linha, pelo teste de Tukey (P<0,05).
n.s.
Dentro do mesmo isolado, na linha, não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05)
102
Observou-se também, diferença significativa entre as estratégias de
inoculação do isolado Esalq 643 no cultivar CD 3121. Neste caso, quando a
inoculação foi pré-infestação os insetos apresentaram um menor peso, podendo ser
atribuído à presença deste inóculo na superfície do grão, que entrando em contato
com o inseto, poderia provocar uma disfunção no seu metabolismo, diminuindo
desta forma, a absorção de nutrientes necessários pelo organismo, acarretando num
menor peso.
Analisando a porcentagem média de grãos de milho danificados, observou-
se que não houve diferença significativa quanto aos isolados utilizados e as
estratégias de aplicação adotadas. Porém, houve diferença significativa quanto ao
cultivar avaliado, sendo que o cultivar CD 3121, apresentou a menor porcentagem
de grãos de milho danificados por Sitophilus spp., para as inoculações pré e pós-
infestação, em relação ao cultivar CD 307. Para a inoculação pós-infestação a
diferença ocorreu apenas em relação ao isolado Esalq 643 (Tabela 14).
Tabela 14. Porcentagem média (± EP) de grãos de milho danificados por Sitophilus spp. nos cultivares CD 3121 e CD 307 tratados
pré e pós-inestação dos insetos, com conídios de B. bassiana (isolados Unioeste 4 e Esalq 643).
CD 3121 CD 307
Pré-infestação Pós-infestação Pré-infestação Pós-infestação
Unioeste 4 12,3 ± 1,11Ab 16,2 ± 1,57Aa
n.s.
24,9 ± 1,93Aa
23,4 ± 3,18Aa
n.s.
Esalq 643 7,6 ± 0,90Ab 12,7 ± 1,55Ab
n.s.
29,1 ± 5,18Aa
25,1 ± 3,23Aa
n.s.
CV (%) = 19,26
Dados originais apresentados, para análise estatística os dados foram transformados em arcseno
x/100
.
Médias seguidas pela mesma letra MAIÚSCULA na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
Médias seguidas pela mesma letra MINÚSCULA na linha nos tratamentos correspondentes, não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
n.s.
Dentro do mesmo isolado, na linha, não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
104
A diferença entre os cultivares em relação à porcentagem de grãos
danificados por Sitophilus spp. não havia sido observada no teste de confinamento,
onde ambos materiais apresentaram, estatisticamente, igualdade na porcentagem. A
diferença aqui apresentada, pode estar relacionada com a repelência provável do
fungo, que fez com que não ocorressem muitos testes de prova pelos insetos,
danificando uma menor porcentagem de grãos, enquanto no tratamento pós-
infestação, o inóculo pode ter interferido no desenvolvimento e metabolismo do
inseto. Além disso, associaram-se dois fatores, o cultivar considerado resistente e
menos preferível para alimentação e o inóculo, sendo que as interferências
provocadas por ambos na biologia e desenvolvimento do inseto, foram verificadas no
presente trabalho.
Da mesma forma, Figueira et al. (2003) associando o predador C. externa
com genótipos de sorgo resistentes ao pulgão S. graminum, verificaram redução de
67,7% nos danos ocasionados pelo inseto em relação aos genótipos suscetíveis.
Assim também Batta (2004) verificou redução nos danos provocados por S.
oryzae em grãos de trigo, quando estes foram tratados previamente com a
associação de formulações de M. anisopliae em carvão vegetal e em cinzas.
Em relação à perda de peso dos grãos de milho (em gramas ou
porcentagem) não houve variação entre os isolados testados e estratégias
utilizadas, sendo que ambos foram inferiores ao que se obteve no teste de
confinamento para ambos os cultivares (Tabela 15 e 16). Ressalta-se que houve
diferença significativa em relação a perda de peso em gramas, entre o cultivar CD
3121 e CD 307, quando inoculados após a infestação com o isolado Unioeste 4. O
cultivar CD 3121 apresentou 0,08g de perda quando comparado a testemunha
(Tabela 15). Apesar deste tratamento não apresentar diferença significativa em
105
relação à porcentagem de grãos danificados, apresentou menor perda de peso,
como também ocorreu no teste de confinamento, visto que este cultivar é tido como
resistente a Sitophilus spp.
Tabela 15. Perda de peso
1
(± EP) dos grãos de milho provocado por Sitophilus spp. nos cultivares CD 3121 e CD 307 tratados pré
e pós-inestação dos insetos, com conídios de B. bassiana (isolados Unioeste 4 e Esalq 643).
CD 3121 CD 307
Pré-infestação Pós-infestação Pré-infestação Pós-infestação
Unioeste 4 0,10 ± 0,04Aa 0,08 ± 0,02Ab
n.s.
0,31 ± 0,14Aa
0,37 ± 0,20Aa
n.s.
Esalq 643 0,03 ± 0,02Aa 0,11 ± 0,03Aa
n.s.
0,17 ± 0,05Aa
0,21 ± 0,03Aa
n.s.
CV (%) = 8,89
1
Valores comparados às respectivas testemunhas.
Dados originais apresentados, para análise estatística os dados foram transformados em
x
+1.
Médias seguidas pela mesma letra MAIÚSCULA na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
Médias seguidas pela mesma letra MINÚSCULA na linha nos tratamentos correspondentes, não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
n.s.
Dentro do mesmo isolado, na linha, não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
Tabela 16. Porcentagem média de perda de peso
1
(± EP) dos grãos de milho provocado por Sitophilus spp. nos cultivares CD 3121
e CD 307 tratados pré e pós-inestação dos insetos, com conídios de B. bassiana (isolados Unioeste 4 e Esalq 643).
CD 3121 CD 307
Pré-infestação Pós-infestação Pré-infestação Pós-infestação
Unioeste 4 0,51 ± 0,17Aa 0,39 ± 0,10Aa
n.s.
1,56 ± 0,67Aa 1,82 ± 1,00Aa
n.s.
Esalq 643 0,13 ± 0,08Aa 0,55 ± 0,17Aa
n.s.
0,86 ± 0,27Aa 0,96 ± 0,14Aa
n.s.
CV (%) = 69,42
1
Valores comparados às respectivas testemunhas.
Dados originais apresentados, para análise estatística os dados foram transformados em arcseno
x/100
.
Médias seguidas pela mesma letra MAIÚSCULA na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
Médias seguidas pela mesma letra MINÚSCULA na linha nos tratamentos correspondentes, não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
n.s.
Dentro do mesmo isolado, na linha, não diferem entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
108
Avaliando a perda de peso provocada por S. oryzae em grãos de trigo
tratados (25g da formulação fungo-arroz/500g de grãos de trigo) e não tratados com
B. bassiana, Padín et al. (2002) observaram diferenças significativas, sendo que os
grãos tratados apresentaram 7,1% de perda de peso e os não tratados 38,3%,
demonstrando a suscetibilidade de S. oryzae a B. bassiana
Observou-se que com a integração dos métodos de controle houve, de
forma geral, um aumento na duração do ciclo ovo-adulto, redução no número de
insetos emergidos, diminuição na porcentagem de grãos danificados e diminuição na
perda de peso. Verificou-se também que o cultivar CD 3121, que foi considerado
resistente no teste de confinamento, mas não havia diferido quanto à porcentagem
de grãos danificados, com a inoculação do entomopatógeno demonstrou diferença
significativa em relação ao cultivar CD 307.
Verificou-se com estes experimentos que a associação dos métodos indica
um potencial de utilização, recomendando-se a realização de testes para confirmar a
eficiência dos tratamentos e também a realização em maior escala, sendo também
indicada a associação com outros métodos de controle, como pós inertes.
Ainda que os dados sugiram um provável efeito do fungo sobre os insetos
no tratamento pós-infestação, atingindo-os no interior dos grãos, existe uma
dificuldade em explicar tal fato. Além disso, foi verificado um baixo número de
insetos emergidos em todos os tratamentos, restringindo o número de repetições e
interferindo na análise estatística.
Novos estudos de associação de métodos são necessários, integrando
cultivares resistentes com Terra de Diatomáceas, Cinzas e outros pós inertes que
venham a controlar este inseto.
6 CONCLUSÕES
Os cultivares de milho tratados diferem entre si quanto à preferência
alimentar e resistência a Sitophilus spp., sendo que o cultivar CD 3121 foi
considerado resistente e o cultivar CD 307 foi considerado suscetível.
Os isolados de Beauveria bassiana Unioeste 4, Unioeste 39 e Esalq 643
foram os isolados que provocaram maior mortalidade confirmada para Sitophilus
spp., sendo que Esalq 643 se destacou na comparação dos isolados.
A associação entre os isolados e os cultivares indica eficiência no controle
de Sitophilus spp.
110
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v.32, n.1, p.139-143, jan./mar., 2003.
WAQUIL, J.M.; VIANA, P.A.; CRUZ, I. Cultivo do Milho: Manejo Integrado de Pragas
(MIP).
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, n.50. Ministério da Agricultura Pecuária e
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