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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO
“ESTRUTURA GENÉTICA E SOCIOGENÉTICA DAS POPULAÇÕES E NINHOS
DE EUGLOSSINI (HYMENOPTERA: APIDAE) DETERMINADAS POR MEIO DE
MICROSSATÉLITES”.
ROGÉRIO OLIVEIRA SOUZA
SÃO CARLOS - SP
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO
“ESTRUTURA GENÉTICA E SOCIOGENÉTICA DAS POPULAÇÕES E NINHOS
DE EUGLOSSINI (HYMENOPTERA: APIDAE) DETERMINADAS POR MEIO DE
MICROSSATÉLITES ”.
ROGÉRIO OLIVEIRA SOUZA
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Genética e Evolução, do Centro de
Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade
Federal de São Carlos, como parte dos requisitos
para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Área de concentração: Genética e Evolução
SÃO CARLOS - SP
2007
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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária/UFSCar
S729eg
Souza, Rogério Oliveira.
Estrutura genética e sociogenética das populações e
ninhos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae) determinadas
por meio de microssatélites / Rogério Oliveira Souza. -- São
Carlos : UFSCar, 2007.
78 f.
Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos,
2007.
1. Genética de populações. 2. Machos diplóides. 3.
Análise de ninhos. 4. Ecologia populacional. I. Título.
CDD: 575.15 (20
a
)
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
I CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO
i
I
I
I
I
I
I
"ESTRUTURA GENÉTICA E SOCIOGENÉTICA DAS POPULAÇÕES E
NINHOS DE EUGLOSSINI (HYMENOPTERA: APIDAE)
DETERMINADAS POR MEIO DE MICROSSA TÉLlTES".
Tese de Doutorado de Rogério Oliveira Souza
Banca Examinadora
Praf. Dr. I\\'arcoAntonio Dei Lama
Prat. Dr. Ci{lrlosAlberto Garótalo
Prot. Dr. Celso Feitosa Martins
Prota. Ora.Maria José de Oliveira Campos
Prota. Ora. Isabel Alves dos Santos
~
'!
SÃO CARLOS - SP
2007
L
Orientador: Marco Antonio Del Lama
Onde estudar quero plantar árvores,
Em minha casa flores,
Na vida amores e amizades.
As sementes só mostrarão suas
reais qualidades quando forem
postas à prova.
É tempo de semear.
"Ní féidir capall rása a dhéanamh d'asal"
Todos têm seu tempo e seu ritmo.
“Porque, onde estiver o vosso tesouro,
ali estará também o vosso coração.”
Lucas 12, 34.
Aos meus Pais, Irmãos e
Amigos dedico.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelas inúmeras bênçãos concedidas, ainda que o merecimento de quem as
recebeu seja completamente questionável, mas que por ser infinitamente bom, Deus ainda as
deu.
Aos meus muitíssimos amados pais Gilberto e Valmira, que repletos de amor e
carinho têm lutado com todas as forças para que seus filhos se tornem pessoas corretas e
tementes a Deus, respeitando e compreendendo as diferenças entre as pessoas e aprendendo a
amá-las como são, assim como têm feito comigo.
Aos meus incríveis e muito amados irmãos Sergio, Luciana, Rosana, Gilberto Filho e
Gustavo, cuja convivência é sempre uma dádiva e que, se em mim existem qualidades, se
deve ao fato de neles serem de tamanha abundância, que sobraram até para mim.
Ao Professor Marco Antonio Del Lama, meu Amigo, Orientador, Exemplo
Profissional que ama seus alunos e o seu trabalho e o faz com tanto respeito e dedicação. Um
“Pai”, nos instruindo muito além da genética e biologia, mas nos dando exemplos de justiça
evidenciando, que muito mais do que bons profissionais, o mundo carece de pessoas boas e
verdadeiras. Peço a Deus que o senhor possa iluminar os caminhos de muitos mais, e saiba
que seus alunos o amam.
To Prof. Robert J. Paxton for his friendship, receptivity and disposition in receive and
treat me in an incredible way, giving me a remarkable experience of life, as well an
opportunity of professional and personal growth.
Às minhas amigas de longa data do laboratório Isabel Cristina de Godoy, Kátia Maria
Ferreira, Margarita Maria López-Uribe, Mariana Marchi Santoni e Thaís Collet, que tanto me
ensinaram durante todo esse tempo de convivência muito prazerosa, e aos que chegaram mais
recentemente, nessa escala quase que evolutiva de laboratório, Amanda P. Ucci, Camilla
OBRIGADO!!
Helena da Silva, Cíntia Akemi Oi, Érika Molina, Juliano Costa de Almeida, Keize Nagamati
Jr., Luci Shibata, Natália Cerantola, Otávio Lino e Silva, Pricilla De Paula Loiola e Vanessa
Domingues Ramalho.
À Professora Sílvia N. Del Lama por sua amizade, carinho e preocupação “quase que
materna” durante todos esses anos, bem como meus amigos sobre sua tutela, Carolina I.
Miño, Erika Ramos, Iara F. Lopes, Juliana Rossi, Luíza Helena S. Avelar, Mateus Henrique
dos Santos e Rafael R. Canevarolo.
Aos amigos de São Carlos Elisângela S. O. Dantas, Liano e Silvana Centofante,
Marcelo Ricardo Vicari, Patricke, Talita e Sumaia Gaspar, Raquel, Tatiana Rochel e Paula
Coelho Xavier pela amizade durante todos esses anos.
Aos amigos de peladas Sadao, Luciano DW, Alexandre Broxa, Alê Jaca, Douglas, Zé
Pedro, Fernando, Felipe, Felipe Plack, Cervini, Léo Souza, Thori, Fábio Hanashiro, Leandro
Takao, Julianos, Alce e outros tantos, cujos anos na universidade têm propiciado aumento não
na habilidade ou velocidade em jogar bola, mas aumento nos números dos uniformes.
To my friends Antonella Soro, David Kelly, Elaine O'Mahony, Emma Seale, Ian, Julia
Klee, Lesya, Loise, Maria Hughes, Marion Zobel, Paulo Prodöhl, Sandra Mustafá, Stephen
Walker, Stuart Bearhop, Tomás Murray and Ulrich Ernst and Queen’s University of Belfast
members, whose friendship made my time at QUB something special to really remember.
Aos professores da Pós-Graduação em Genética e Evolução da UFSCar, Norma
Mortari, Gilberto Moraes, Flávio Henrique da Silva, Luciana Regitano, Maurício de Alencar,
Orlando M. Filho, Luís A. C. Bertollo, Pedro Galetti e Reinaldo Brito por desempenharem e
participarem de um momento de tamanha importância na minha formação.
Aos amigos do DGE e Federal Ive, Luís Inoue, Luciana, Timba, Araceli, Rodrigo,
Andréa, César, Luís, Viviane, Regina, Fernanda, Samanta, Alessandra, Pedro, Ana Karina,
Wellington, Iderval, Pedro, Fernanda, Andréa, Douglas e a todos dos laboratórios de
OBRIGADO!!
Imunogenética, Imunogenética/DNA, Bioquímica Adaptativa, Biologia Molecular,
Citogenética, Genética de Populações e Evolução, Evolução Molecular, Genoma, Genética de
Aves e Genética Evolutiva de Himenópteros.
Aos amigos e funcionários da Universidade Federal de São Carlos do DGE e PPGEV:
Dona Rita, Luiz Henrique da Silva (Piau), Antonio D. A. da Silva (Toninho), Jorge I. da Silva
(Jorjão), Cláudio A. F. Vargas, Tatiane R. Landgraf, Rodrigo Henrique Cabrera, Greissi G.
Oliveira, Rosemeire A. T. Curilla (Rose), Regiane Ribeiro e Tatiane T. Calligari, que tanto
me auxiliaram neste trabalho.
À Daniele, Mirele, Graciele, Alexandre, Célio e Noely Boraschi e parentes, pelo amor,
amizade, força, carinho, compreensão, compartilhando de uma forma muito especial suas
vidas comigo e todos os amigos que fiz em Americana.
À Maria Carolina, João Paulo, Zenilda e Romoaldo Donatoni e parentes, pelo amor e
amizade recebendo-me de maneira muito especial em suas vidas.
À Camilla Helena da Silva que veio participar da minha vida de uma forma muito
tranqüila, refletindo sua personalidade calma, por vezes “introspectiva”, de riso fácil e um
tanto sonoro. Sua felicidade e paz têm preenchido meus dias e me feito sorrir mais, se é que
isto é possível.
Aos incríveis amigos da comunidade Irlando-Brasileira José Areias, Shila, Neuza,
Edineide, Antônio e Antônia; Suzel Reily, Toninho e Samira; Marina; Marcos Luciano
Bruschi, Michelli e Gabriel; Hugo Leonardo Ribeiro, Agatha e Pedro; Fernando Colantuono e
Camila El Dashe; Greg e Cléa; Márcio e família; João Paulo de Holanda Neto, Javier Perez
De La Cruz, Rosivaldo de Sousa e Massimo Piantá.
À família Ua Bruadair, pais do Diarmaid e Cormack; de modo muito especial à família
Ua Bruadair de Sousa, Diarmaid, Alvina, Lára Emília e Alana (as três princesinhas do
Diarmaid) por terem me “adotado”, fazendo com que a saudade de casa fosse só um pequeno
OBRIGADO!!
detalhe, constituindo as pessoas das quais me orgulho de ter conhecido e que estão associadas
às minhas melhores lembranças da Irlanda.
À CAPES, pelo apoio financeiro durante o estágio na Irlanda, em especial aos técnicos
Marta Elias Ribeiro de Oliveira e Marcos Antônio Borges Trajano pelo acompanhamento
seguro no decorrer do trabalho e ao CNPq pelo apoio financeiro durante três anos.
Ao IBAMA, pela concessão da licença de coleta e transporte do material, e em
especial à técnica responsável Dra. Helena K. Boscolo.
À EMBRAPA Pecuária Sudeste e aos Funcionários do Canil Municipal de São Carlos,
por permitirem a coleta de material em suas áreas.
Ao Parque Ecológico de São Carlos, pela concessão de coleta de material em sua área.
OBRIGADO!!
RESUMO
As abelhas Euglossini são polinizadores importantes de várias espécies
Neotropicais e, particularmente, para as orquídeas, onde a relação espécie-específica
abelha-flor pode ser decisiva no sucesso reprodutivo destas plantas. Os machos são os
polinizadores efetivos das orquídeas, cujos compostos atrativos produzidos por estas
foram isolados e têm sido utilizados em diversos estudos envolvendo os machos de
Euglossini. Os marcadores alozímicos, mais comumente utilizados nos estudos do
grupo, apresentam em geral, um baixo polimorfismo, o que limita de certa forma as
análises populacionais. Visando analisar de uma maneira mais acurada a genética das
populações e de ninhos destas espécies de abelhas foram desenhados primers
flanqueando locos de microssatélites em Eulaema nigrita e Euglossa cordata (13
locos cada). O emprego destes marcadores em 483 machos de 23 espécies de
Euglossini dos gêneros Euglossa, Eufriesea, Eulaema e Exaerete provenientes de
diversas regiões do Brasil revelou a presença somente de dois machos diplóides, um
em Euglossa annectans e outro em Euglossa mandibularis. Estes achados reforçam a
proposição de que os machos diplóides (geralmente inviáveis ou estéreis) não são
freqüentes em populações destas abelhas do Brasil, corroborando dados prévios
obtidos por meio de análise alozímica. O emprego dessa metodologia na avaliação da
estrutura nidal revelou ainda que em Eulaema nigrita (oito ninhos) ocorre o
compartilhamento do ninho entre fêmeas não aparentadas. Para as espécies Euglossa
cordata e Euglossa townsendi (11 e sete ninhos, respectivamente) os ninhos, via de
regra, são formados por uma fêmea acasalada com um único macho, embora para E.
townsendi também tenha sido observado o compartilhamento de ninho por fêmeas não
aparentadas. Os dados aqui apresentados lançam um novo olhar sobre a genética das
populações e a estrutura sociogenética nidal de Euglossini, sendo, certamente, uma
contribuição importante para o avanço do conhecimento a respeito da biologia e
genética deste grupo de abelhas.
PALAVRAS-CHAVE: Abelhas Euglossine, machos diplóides, estrutura nidal,
locos microssatéelite.
ABSTRACT
Euglossine bees are important pollinators of many Neotropical plant species,
particularly orchids which could present a species-specific bee-flower relationship,
essential to the reproductive success of these plants. Orchids produce chemical
compounds to attract males of Euglossine bees (the effective pollinators of the
orchids), and these compounds were isolated and are being used to study the biology
of the euglossine males. Allozymes markers, although their low polymorphism
content, were widely applied in population analyses. In order to provide a powerful
tool to be applied to nest and population genetics research, primers flanking
microsatellite loci were developed for Eulaema nigrita and Euglossa cordata (13 loci
each). The use of these markers in 483 euglossine males of Euglossa, Eufriesea,
Eulaema and Exaerete species, sampled in several Brazilian biomes and areas,
evidenced the presence of only two diploid males, one in Euglossa annectans and
other in Euglossa mandibularis. These findings support the hypothesis that diploid
males (usually unviable or sterile individuals) occur in low frequencies in Brazilian
Euglossine bee populations, a fact that is according to previous studies using
allozymes. The application of these markers to nest structure analyses revealed nest
sharing among unrelated females of Eulaema nigrita (eight nests). For Euglossa
cordata and Euglossa townsendi nests (11 and seven nests, respectively), analysis
demonstrated that monogamy (one female mated with a single male) is the rule,
although nest sharing among unrelated females could also occur in E. townsendi.
These results give a new focus on the research about population genetics and nest
sociogenetic structure of Euglossine bees, opening new insights on the Euglossini
biology and genetics.
KEYWORDS: Euglossine bees, diploid males, nest structure, microsatellite loci.
Lista de Figuras
Pg
Figura 1. Fêmea adulta do gênero Pepsis (Pompilidae).............................................
01
Figura 2. Macho de Aglae caerulae.............................................................................
03
Figura 3. Macho de Eufriesea violacea.......................................................................
03
Figura 4. À esquerda, Euglossa mandibularis (macho), e à direita Euglossa cordata
(fêmea)..........................................................................................................................
04
Figura 5. À esquerda, Eulaema nigrita e à direita Eulaema meriana (machos)..........
04
Figura 6. Machos de Exaerete smaragdina (a) e Exaerete frontalis (b)......................
05
Figura 7. Machos de Euglossa truncata (a), sua tíbia posterior com destaque para a
área da franja (b) e de Eulaema mocsaryi (c). Polinários de orquídeas aderidos ao
dorso de machos (a) e (c)..............................................................................................
06
Figura 8. Esquema representando os conjuntos cromossômicos do sistema genético
da haplodiploidia arrenótoca.........................................................................................
08
Figura 9. Esquema representando as possíveis rotas evolutivas para a
eussocialidade nos himenópteros..................................................................................
09
Figura 10. Ninho de Eulaema nigrita retirado do interior de um bloco de
construção. As células foram construídas utilizando barro, excremento e resina.........
10
Figura 11. Ninho ocupado por várias fêmeas de Euglossa townsendi construído
com utilização de resinas em uma secção de bambu, onde foi observada reutilização
das células. Destaque para arquitetura das células (direita).........................................
11
i
Pg
Figura 12. Corbícula de Euglossa cordata (a) e segmento modificado em Exaerete
smaragdina, uma espécie cleptoparasita (b).................................................................
12
Figura 13. Padrões filogenéticos entre os grupos de abelhas corbiculadas. Árvore
filogenética obtida pela análise de caracteres morfológicos (a). Filogenia obtida pela
análise de seqüências de DNA para múltiplos genes (b). [Retirado de Cameron
2004].............................................................................................................................
13
Figura 14. Hipóteses das relações filogenéticas entre os gêneros de Euglossini.
Relações traçadas com uso de morfologia (a, b, c); relações traçadas utilizando
morfologia e dados fósseis (d); filogenia proposta com base em seqüências de
quatro genes e morfologia (e). [Retirado de Cameron 2004]........................................
14
Figura 15. Esquema representando os conjuntos cromossômicos do sistema
genético da haplodiploidia arrenótoca, com destaque para homozigose no loco
sexual levando à formação dos machos diplóides.........................................................
16
Figura 1. Ninho de Eulaema nigrita observado no interior de um bloco de
construção. As células foram feitas com a utilização de barro, excremento e resina...
69
Figura 2. Ninho de Euglossa cordata construído em secção de bambu. As células,
feitas com resina, apresentam coloração bastante variável...........................................
69
Figura 3. Entrada de um ninho de Euglossa cordata construído em um toco de
Eucalyptus sp. anteriormente ocupado por Xylocopa sp...............................................
69
ii
Lista de Tabelas
Pg
Table 1. Details of the 20 microsatellite loci developed for Eulaema nigrita (Eln)
and Euglossa cordata (Egc) from Brazil (one population of each species), with 23
E. nigrita females (diploid) and 134 E. cordata individuals (67 haploid males and
67 diploid females) analyzed…………………………………………………………
30
Table 2. Results of cross-species amplification using microsatellite primers
designed for Euglossa cordata (9 loci, Egc) and Eulaema nigrita (11 loci, Eln) in 23
species of euglossine bees…………………………………………………………….
32
Table 1. Microsatellite loci developed for Euglossa cordata and Eulaema nigrita
(Souza et al. 2007) used to analyse euglossine bee species and marker variability
(expected intralocus heterozygosity).………………………………….……………...
51
Table 2. Species name, collection sites, number of males sampled (n), range of
expected intralocus heterozygosity (Hi), expected mean heterozygosity (Hexp),
probability of detecting a heterozygous male if diploid (Phet), observed number of
2N males and expected maximum frequency of 2N males (for n ≥ 19) in samples of
euglossine bees..………………………………………………………………………
53
Tabela 1. Razão sexual e taxa de emergência para oito ninhos de Eulaema nigrita
coletados no interior de blocos de construção no Campus da UFSCar em São Carlos
(SP)................................................................................................................................
67
Tabela 2. Razão sexual e taxa de emergência para onze ninhos de Eg. cordata e
sete ninhos de Eg. townsendi coletados em ninhos armadilhas e em ramo de
Bougainville sp. nas cidades de Araras, Rifaina e São Carlos (SP)..............................
68
iii
SUMÁRIO
Lista de Figuras...........................................................................................................
i
Lista de Tabelas...........................................................................................................
iii
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................
01
HYMENOPTERA..............................................................................................
01
EUGLOSSINI – Aspectos gerais......................................................................
02
Euglossíneos e as Orquídeas.............................................................................
05
Partenogênese e Haplodiploidia.......................................................................
07
Comportamento Social.....................................................................................
08
Filogenia.............................................................................................................
12
Estudos Genéticos Realizados..........................................................................
15
2. PROPOSIÇÃO E JUSTIFICATIVA....................................................................
17
3. OBJETIVOS............................................................................................................
19
4. DELINEAMENTO E APRESENTAÇÃO............................................................
20
iv
5. Capítulo I – “Microsatellite loci for euglossine bees (Hymenoptera: Apidae)”
22
6. Capítulo II – “Microsatellite analysis demonstrates that diploid males are
uncommon in euglossine bee populations from Brazil”..........................................
35
Abstract.............................................................................................................. 36
Introduction....................................................................................................... 37
Materials and Methods..................................................................................... 39
Results................................................................................................................ 40
Discussion........................................................................................................... 42
References.......................................................................................................... 48
7. Capítulo III – “Determinação da estrutura sociogenética de ninhos de
Euglossini com o uso de DNA microssatélite.”.........................................................
54
Resumo............................................................................................................... 55
Introdução.......................................................................................................... 56
Material e Métodos........................................................................................... 57
Resultados.......................................................................................................... 58
Discussão............................................................................................................ 62
Conclusões.......................................................................................................... 64
Referências......................................................................................................... 65
8. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS....................................................................
70
9. REFERÊNCIAS......................................................................................................
73
v
1. Introdução
1. INTRODUÇÃO
HYMENOPTERA
A Ordem Hymenoptera é a terceira maior ordem de insetos vivos. Usualmente
associada apenas às abelhas, vespas e formigas, esta Ordem engloba também grupos mais
primitivos, como Symphyta e Parasitica. Somente para as abelhas foram descritos 425
gêneros, que agrupam mais de 16.300 espécies do mundo todo (MICHENER, 2000).
Apresentando tamanho bastante variável, seus representantes podem ter desde frações de
milímetros até cerca de 7 cm, como em alguns Pompilidae pertencentes ao gênero Pepsis
(Figura 1).
Figura 1. Fêmea adulta do gênero Pepsis (Pompilidae).
Os Himenópteros, especialmente as abelhas, são muito importantes na polinização de
diversas espécies de plantas e, em muitos casos, são os polinizadores exclusivos de algumas
espécies, desempenhando, portanto, um papel fundamental na manutenção da biodiversidade
da flora, além do benefício econômico gerado pela polinização dos cultivares (NEFF &
SIMPSON, 1993). Algumas espécies podem ser nocivas ao homem, como as saúvas, que são
uma das principais pragas agrícolas do Brasil (GALLO et al., 2002).
Há indícios que o surgimento dos insetos polinizadores, particularmente as abelhas,
tenha se iniciado pouco depois do aparecimento das fanerógamas no início do Cretáceo cerca
1
1. Introdução
de 140 a 135 milhões de anos (CRANE et al., 1995), pois a abelha fóssil mais antiga
(Melittosphex burmensis) data do início do Cretáceo (POINAR & DANFORTH, 2006).
Provavelmente, como diversos outros grupos, as abelhas devem ter tido seu ápice de radiação
no médio Cretáceo, quando ocorreu também a explosão diversificadora das angiospermas
(ENGEL, 2000). Segundo DIETZ (1982), o crescimento da oferta de néctar e pólen foi o
fator mais provável para a mudança de um hábito predatório, presente nos ancestrais e ainda
hoje nas vespas, para o de coleta de pólen.
EUGLOSSINI - Aspectos gerais
As abelhas da tribo Euglossini (eu = verdadeiro, glossa = língua) têm como
característica principal a presença de uma glossa bastante longa, e muitos de seus
representantes possuem um tegumento metálico (KIMSEY, 1980). A subfamília Apinae, em
especial o grupo dos corbiculados, é composta pelas tribos Apini, Bombini, Euglossini,
Meliponini, Electrapini, Electrobombini e Melikertini, sendo que as três últimas são fósseis
(ENGEL, 2005).
A distribuição das abelhas Euglossini é restrita à região Neotropical, ocorrendo entre
os paralelos 29º Norte e 32º Sul (BÚRQUEZ, 1997).
A tribo está constituída de cinco gêneros - Aglae, Eufriesea, Euglossa, Eulaema e
Exaerete (DODSON et al., 1969), e mais de 200 espécies, conforme descrito em RAMÍREZ
et al. (2002).
Aglae caerulae (Lepeletier & Serville, 1825) é a única representante do gênero (Figura
2), com distribuição considerada restrita à Bacia Amazônica. Recentemente, espécimes foram
coletados na Chapada dos Guimarães, próximo a Cuiabá no estado do Mato Grosso (DOS
ANJOS-SILVA et al., 2006). A. caerulae é uma espécie cleptoparasita de Eulaema.
2
1. Introdução
Figura 2. Macho de Aglae caerulae.
O gênero Eufriesea (Cockerell, 1909) é constituído de 60 espécies (RAMÍREZ et al.,
2002), em sua maioria sazonal (Figura 3). Os adultos aparecem durante dois ou três meses
(nas estações chuvosas) e possuem coloração vistosa.
Figura 3. Macho de Eufriesea violacea.
As abelhas do gênero Euglossa (Latreille, 1802), por apresentarem poucos pelos,
expõem seu tegumento metálico-brilhante; sua coloração pode ser verde, azul, bronze e, por
vezes, marrom (Figura 4). Este gênero agrupa o maior número de espécies (103 sp. -
RAMÍREZ et al., 2002).
3
1. Introdução
Figura 4. À esquerda, Euglossa mandibularis (macho), e à direita Euglossa cordata
(fêmea).
Eulaema (Lepeletier, 1841) exibe ampla distribuição, sendo observado em todos os
locais de ocorrência da tribo (KIMSEY & DRESSLER, 1986). Segundo RAMÍREZ et al.
(2002) o gênero é constituído de 15 espécies (Figura 5).
Figura 5. À esquerda, Eulaema nigrita e à direita Eulaema meriana (machos).
Nas Figuras 6a e 6b temos dois representantes de Exaerete (Hoffmannsegg, 1817),
gênero que agrupa 7 espécies cleptoparasitas de Eufriesea e Eulaema (DOS ANJOS-SILVA
& ENGEL, no prelo). Chaves de identificação para este grupo foram propostas por MOURE
(1964) e DOS ANJOS-SILVA & ENGEL, no prelo).
4
1. Introdução
abab
Figura 6. Machos de Exaerete smaragdina (a) e Exaerete frontalis (b).
Euglossíneos e as Orquídeas
Os Euglossíneos são conhecidos também pelo nome de abelhas das orquídeas (Figura
7a,c), principalmente pela relação que os machos dessas abelhas têm com orquídeas
Catasetinae (Catasetum, Cycnoches e Mormodes) e Stanhopeinae (Acineta, Coeliopsis,
Coryanthes, Gongora e Stanhopea, entre outros gêneros desta subfamília). Atualmente, são
conhecidas cerca de 650 espécies de orquídeas polinizadas exclusivamente por machos de
Euglossini (ACKERMAN, 1983; DRESSLER, 1968). Dentre as fanerógamas, as orquídeas
representam cerca de 10% das espécies (revisão em CAMERON, 2004).
A polinização cruzada promovida por esses machos parece ter sido um fator evolutivo
crucial no que se refere à especialização das orquídeas na oferta de fragrâncias aos machos.
Este estreito relacionamento (machos-orquídeas) tem sido atualmente descrito como síndrome
dos polinizadores, sendo relatadas para diversas espécies características da coevolução entre
elas. Nestas flores (e em outras fontes), os machos coletam substâncias aromáticas que são
armazenadas no órgão tibial (CRUZ-LANDIM et al., 1965), cavidade presente no terceiro
par de pernas desses machos (Figura 7b).
5
1. Introdução
abcabc
Figura 7. Machos de Euglossa truncata (a), sua tíbia posterior com destaque para a
área da franja (b) e de Eulaema mocsaryi (c). Polinários de orquídeas aderidos ao dorso de
machos (a) e (c).
Este hábito de coleta de fragrâncias, a identificação dos compostos atrativos aos
machos (isolamento e síntese) e posterior uso destes compostos como iscas, foram fatores
importantes na descrição de muitas espécies (DODSON et al., 1969), fato que contou com a
enorme colaboração dos orquidologistas.
Estudos de habitats com diferentes níveis de impactação antrópica (OTERO &
SANDINO, 2003); estimativa de ocorrência de espécies em áreas de Mata Atlântica
(NEMÉSIO & SILVEIRA, 2004), ou cerrado (DOS ANJOS-SILVA, 2006; NEMÉSIO &
FARIA JR, 2004), distância de incursão em monoculturas para coleta de fragrâncias
(MILET-PINHEIRO & SCHLINDWEIN, 2005), e estimativa de machos diplóides em
populações de Euglossini (ROUBIK et al., 1996; TAKAHASHI et al., 2001) estão entre
algumas das perguntas em que a técnica de amostragem empregada foi a utilização desses
compostos atrativos.
Hipóteses têm relacionado o aumento da complexidade dos compostos armazenados
nas tíbias dos machos e seu fitness. A manipulação dessas fragrâncias, algumas das quais são
tóxicas, poderia sinalizar para as fêmeas uma maior robustez e sobrevivência dos possíveis
parceiros de acasalamento. Um exemplo extremo foi observado em Eufriesea pupurata, onde
6
1. Introdução
os machos coletavam DDT e estocavam em suas tíbias, sem aparentar qualquer efeito
negativo da manipulação dessa substância tóxica (ROBERTS et al., 1982).
Estudos mais recentes com eletroantenogramas têm demonstrado os efeitos de
diferentes compostos nos sistemas sensoriais de várias espécies (ELTZ et al., 2006; ELTZ &
LUNAU, 2005), reforçando a idéia de que tais compostos seriam armazenados na tíbia
posterior, metabolizados e exalados de forma a atrair as fêmeas para cópula. (ELTZ et al.,
2006) observaram ainda respostas espécie-específicas para uma série desses substratos
voláteis.
A maior parte dos trabalhos já realizados em Euglossini fez uso da amostragem por
meio de iscas odores devido à facilidade de captura dos machos quando comparada às buscas
ativas com redes entomológicas ou similares.
Partenogênese e Haplodiploidia
Partenogênese é o processo pelo qual indivíduos adultos se desenvolvem a partir de
ovos não fecundados. Nos himenópteros são observados três tipos de partenogênese:
1 arrenótoca: ovos fecundados dão origem a fêmeas e ovos não-fecundados originam
machos (grande maioria das espécies);
2 deuterótoca: ovos não-fecundados podem originar machos ou fêmeas, dependendo
de fatores ambientais (os mecanismos responsáveis por esse evento ainda não são
muito claros);
3 telítoca: fêmeas diplóides originam outras fêmeas por meio de processos
assexuados.
Somente algumas espécies são conhecidas como pertencentes a essas duas últimas
categorias, valendo frisar que a deuterotoquia não é bem entendida, uma vez que casos de
7
1. Introdução
telitoquia podem ser considerados, sob determinadas circunstâncias, deuterotoquia (ESKAFI
& LEGNER, 1974; WHITE, 1973).
Estima-se que a haplodiploidia arrenótoca (Figura 8) ocorra em aproximadamente
20% das espécies do reino animal (COWAN & STAHLHUT, 2004).
Figura 8. Esquema representando os conjuntos cromossômicos do sistema genético da
haplodiploidia arrenótoca.
Comportamento Social
Com relação ao comportamento social, podemos encontrar em Euglossini (Figura 9),
de acordo com a classificação tradicional (MICHENER, 1974; WILSON, 1971), espécies:
(1) solitárias (fêmeas nidificam sozinhas, aprovisionando de forma massal seus ninhos e não
interagem com sua prole); (2) comunais (fêmeas de mesma idade nidificam em local comum,
porém cada uma constrói suas células para oviposição); (3) quasissociais (fêmeas de mesma
idade nidificam em local comum, todas elas cooperam na construção e aprovisionamento das
células de cria e todas as fêmeas ovipositam); (4) semi-sociais (fêmeas de mesma idade
nidificam em local comum, porém uma ou poucas monopolizam o trabalho reprodutivo,
enquanto que outras cuidam da manutenção do ninho). A categoria chamada de parassocial
tem como característica a interação de fêmeas de uma mesma geração dentro do ninho. Esta
8
1. Introdução
engloba, portanto, os comunais, quasissociais e semissociais.
A rota conhecida como subsocial seria caracterizada pela presença de uma única
fêmea construindo seu ninho e permanecendo dentro ou próximo a ele para cuidar da prole.
Num estágio posterior, a fêmea viveria o bastante para interagir com a prole adulta, que
auxiliaria na criação das futuras gerações.
Embora estejam presentes representantes para esse amplo espectro comportamental, a
maioria das espécies de Euglossini apresenta baixa sociabilidade. Ainda assim, a diversidade
de sistemas sociais observados no grupo tem despertado grande interesse, pois tamanha
variedade pode fornecer bons indícios sobre possíveis mecanismos envolvidos no
estabelecimento do comportamento social. A análise conjunta da filogenia e da organização
dos sistemas sociais pode ser ferramenta valiosa no esclarecimento dos mecanismos
facilitadores de sistemas sociais.
Figura 9. Esquema representando as possíveis rotas evolutivas para a eussocialidade
nos himenópteros.
Um exemplo de sistema social bem definido foi descrito em Eulaema nigrita
(PEREIRA-MARTINS, 1991; PEREIRA-MARTINS & KERR, 1991; SANTOS &
GARÓFALO, 1994; ZUCCHI et al., 1969). Os padrões de comportamento observados
nesta espécie foram do tipo comunal (compreendido pela rota parassocial), sendo observado
desta forma, várias fêmeas vivendo juntas e cuidando de suas células de modo independente,
9
1. Introdução
um comportamento mais avançado com a construção de células em um mesmo favo e
utilização comum do material de construção e defesa dos ninhos contra inimigos comuns,
utilizando materiais que não despertavam a atenção de possíveis predadores.
Figura 10. Ninho de Eulaema nigrita retirado do interior de um bloco de construção.
As células foram construídas utilizando barro, excremento e resina.
Colônias comunais foram descritas em Euglossa imperialis, uma grande e bela abelha
esverdeada, em que o número de células construídas e aprovisionadas era, por vezes, menor
que o de fêmeas forrageadoras. Esta observação sugere indícios de atividade cooperativa, pois
todas as fêmeas apresentavam seus ovaríolos dilatados (ROBERTS & DODSON, 1967).
GARÓFALO (1992) observou em Euglossa cordata que somente uma fêmea era a
responsável pela postura e aprovisionamento de cada ninho, e que as fêmeas permaneciam no
ninho até o momento da emergência da prole. Para os treze ninhos amostrados, foram
observados 24 machos e 28 fêmeas (total), variando de seis à 10 indivíduos por ninho,
considerando os ninhos que apresentaram condições de desenvolvimento completo.
10
1. Introdução
Figura 11. Ninho ocupado por várias fêmeas de Euglossa townsendi construído com
utilização de resinas em uma secção de bambu, onde foi observada reutilização das células.
Destaque para arquitetura das células (direita).
AUGUSTO & GARÓFALO (1998) observaram em Euglossa fimbriata a utilização
de uma caixa usada para atrair Meliponini. Estes autores observaram que as fêmeas ali
nidificantes estavam divididas em forrageadoras e poedeiras, e somente poedeiras. Essa
segunda classe realizava oofagia, sendo, portanto, as responsáveis pela progênie da colônia
Um comportamento primitivamente social também foi observado em Euglossa
championi e Euglossa hyacinthina por EBERHARD (1988), que constatou a atividade de
fêmeas construindo, aprovisionando e ovipositando em células de um mesmo ninho.
Um ninho contendo mais de trezentas células foi reportado por BENNETT (1965) em
Eulaema terminata, o qual, segundo o autor, tinha a manutenção/ construção das células
mantida por pelo menos sete fêmeas, sendo uma delas capturada durante a remoção do ninho,
enquanto que as demais escaparam. A presença de uma fêmea mais velha morta no ninho;
captura de uma fêmea dias antes da remoção do ninho; presença de uma fêmea no interior do
ninho e de outras nas proximidades no momento da remoção deste; detecção de, pelo menos,
três células parcialmente aprovisionadas; diferença de tempo na emergência de adultos;
progênie somente de machos, e ocorrência de células mais velhas vazias fornecem indícios
muito fortes sobre a existência de um sistema social primitivo nesta espécie, segundo este
11
1. Introdução
autor.
MYERS & LOVELESS (1976), estudando Euplusia (Eufriesea) surinamensis
sugeriram que a vantagem de uma vida em agregados estaria na reutilização de ninhos velhos
e na possibilidade de reutilizar ninhos parcialmente aprovisionados, após a morte ou
desaparecimento dos antigos usuários. Os autores sugeriram ainda que a vida em agregados
apresente uma menor pressão de predação e parasitismo, não sendo verificada, contudo, tal
hipótese nesta espécie.
Filogenia
Os Euglossini estão inseridos no grupo das abelhas que apresentam corbícula, uma
alteração no último par de pernas das fêmeas (Figura 12a). A tíbia desse par de pernas foi
modificada de forma que uma depressão é utilizada para estocar o material coletado em
campo, seja ele provisões (pólen ou açúcares) para as crias ou material para a construção do
ninho (barro, excrementos, resinas). Contrastando com este fato, nos Euglossini onde o
cleptoparasitismo é observado (Aglae e Exaerete), as fêmeas não apresentam corbícula
(Figura 12b).
a
b
a
b
Figura 12. Corbícula de Euglossa cordata (a) e segmento modificado em Exaerete
smaragdina, uma espécie cleptoparasita (b).
12
1. Introdução
Embora seja um aspecto interessante do comportamento, a origem única ou múltipla
do cleptoparasitismo nos Euglossini ainda é uma questão aberta (revisão de CAMERON,
2004).
O grupo dos corbiculados (representantes vivos) é composto ainda por Apini, Bombini
e Meliponini (Figura 13a,b), e mesmo considerando a grande importância do grupo de abelhas
corbiculadas, a filogenia do grupo ainda apresenta divergências considerando os caracteres
utilizados (CAMERON, 2004).
Figura 13. Padrões filogenéticos entre os grupos de abelhas corbiculadas. Árvore
filogenética obtida pela análise de caracteres morfológicos (a). Filogenia obtida pela análise
de seqüências de DNA para múltiplos genes (b). [Retirado de CAMERON, 2004].
De forma semelhante, a filogenia envolvendo os gêneros de Euglossini não está
esclarecida. A análise topológica das árvores não se repete entre as várias hipóteses propostas,
embora dicotomias antes existentes pareçam ter sido resolvidas (Figura 14).
13
1. Introdução
Figura 14. Hipóteses das relações filogenéticas entre os gêneros de Euglossini.
Relações traçadas com uso de morfologia (a, b, c); relações traçadas utilizando morfologia e
dados fósseis (d); filogenia proposta com base em seqüências de quatro genes e morfologia
(e). [Retirado de CAMERON, 2004].
Conclui-se que um longo trabalho é necessário até que uma filogenia consistente entre
os gêneros de Euglossini seja alcançada, visto que as cinco hipóteses levantadas na literatura
são sustentadas por diferentes topologias obtidas pelo uso de diferentes dados.
14
1. Introdução
Estudos Genéticos Realizados
Embora estejam disponíveis na literatura relatos a respeito da caracterização de novas
espécies de Euglossini por meio de caracteres morfológicos e comportamentais, pouco se
conhece sobre a genética das populações desta tribo, bem como a estrutura sociogenética de
seus ninhos.
Estudos genéticos em Euglossini podem fornecer informações valiosas para a
compreensão dos fatores que levam ao surgimento de sistemas sociais avançados em Apidae
(lato sensu), além de auxiliar no entendimento de dados biológicos e comportamentais dessas
abelhas. Os estudos genéticos podem ainda subsidiar, preferencialmente, comparações entre
grupos filogeneticamente próximos com distintos sistemas sociais.
Os primeiros trabalhos enfocaram a análise cariotípica, com ênfase na determinação
do número haplóide de cromossomos em espécies como Eufriesea violacea (GOMES et al.,
1998; KERR, 1952; TARELHO, 1973), Eulaema nigrita (POMPOLO et al., 1986),
Euglossa hyacinthina e Euglossa cyanaspis (ELTZ et al., 1997), Euglossa townsendi e
Eufriesea violacea (GOMES et al., 1996; GOMES et al., 1997).
Uma segunda linha de pesquisa sobre as abelhas Euglossini tem sido a determinação
de relações filogenéticas no grupo e sua relação com o surgimento de sistemas sociais em
Apidae (stricto sensu), como abordado anteriormente.
Uma terceira linha de pesquisa tem investigado a ocorrência de machos diplóides em
Euglossini (Figura 15). A explicação para ocorrência de tais machos nas espécies de
Himenópteros panmíticos foi proposta por WHITING (1943). O modelo do sl-CSD (single
locus - Complementary Sex Determination) consiste em que a hemizigose ou homozigose no
loco sexual leva à formação de machos haplóides (n) e diplóides (2n), respectivamente,
enquanto que as fêmeas (2n) são heterozigotas para alelos deste loco. A heterozigose neste
loco leva a uma complementação gênica que ativa, na seqüência, os genes responsáveis pela
15
1. Introdução
determinação do sexo em fêmeas.
Figura 15. Esquema representando os conjuntos cromossômicos do sistema genético
da haplodiploidia arrenótoca, com destaque para homozigose no loco sexual levando à
formação dos machos diplóides.
Os custos para o grupo da existência de machos diplóides são altos, pois o “fitness”
(vantagem ou capacidade reprodutiva) dos mesmos é quase zero, por serem completamente
estéreis ou por apresentarem progênie triplóide, cuja descendência é numericamente pequena
(GARÓFALO & KERR, 1975). Somente três exemplos sobre a viabilidade desses machos
são conhecidos; um na vespa Diadromus pulchellus (ELAGOZE et al., 1994); o segundo em
Euodynerus foraminatus, uma vespa solitária (COWAN & STAHLHUT, 2004), e o terceiro
na abelha Bombus terrestris (AYABE et al., 2004).
Altas freqüências desses machos foram relatadas por ROUBIK et al. (1996), ZAYED
et al. (2004) e LÓPEZ-URIBE et al. (2007). Estes autores relataram machos diplóides com
freqüências entre 12-100%, 13-56% e 8-32%, respectivamente. Entretanto, DEL LAMA et al.
(1998), PERUQUETTI (1998), TAKAHASHI et al. (2001) e SILVA (2002) detectaram
apenas a presença de um macho diplóide em amostras de Euglossini de 23 espécies do Brasil,
num total de 866 indivíduos analisados.
16
2. Proposição e Justificativa
2. PROPOSIÇÃO E JUSTIFICATIVA
O trabalho ora realizado teve como proposição estudar alguns aspectos relevantes
da biologia dos Euglossini, com ênfase nos seguintes pontos:
Qual a real freqüência de machos diplóides na natureza?
A ocorrência de machos diplóides nos himenópteros tem sido verificada em espécies
onde o sistema de determinação sexual envolve a partenogênese arrenótoca, e em especial
grupos que apresentam sl-CSD (single locus- Complementary Sex Determination).
Os zangões diplóides são em geral mais pesados e maiores do que os haplóides.
Possuem testículos pequenos, que podem ter apenas 1/10 do volume testicular de um
haplóide, com poucos e curtos túbulos seminíferos em comparação com os machos haplóides.
Portanto, é de se esperar que não devam ser encontrados em altas proporções nas populações
naturais de abelhas em função da baixa viabilidade e fertilidade dos mesmos e dos custos do
investimento parental em sua produção.
Os estudos onde altas freqüências desses machos diplóides foram observados geraram
especulações por parte dos autores sobre os custos de produção de machos diplóides, como
provável causa da ausência da eussocialidade nos euglossíneos. Diante do exposto, estudos
desta natureza apresentam grande relevância, uma vez que o estabelecimento das razões pelas
quais muitos grupos de himenópteros não atingiram o estágio eussocial é fundamental para o
entendimento da origem e evolução da eussocialidade.
Trabalhos prévios deste laboratório demonstraram que a elevada ocorrência de machos
diplóides em Euglossini não parece ser um fenômeno generalizado, e que a freqüência
máxima esperada a partir do número de machos analisados e da heterozigosidade observada
deve ser baixa nas populações amostradas.
17
2. Proposição e Justificativa
Como se estruturam sociogeneticamente as colônias de Euglossini?
Ainda que se conheça em 20% das espécies de Euglossini o comportamento de
nidificação, número de fêmeas responsáveis pela formação de ninhos, taxas de natalidade, e
outros aspectos biológicos envolvendo indivíduos de um mesmo ninho (RAMÍREZ et al.,
2002), não há dados sobre a estrutura genética intranidal. A análise genética de ninhos
permite esclarecer questões como parentesco entre fêmeas que ovipositam em um mesmo
ninho, número de machos que acasalaram com as fêmeas e parentesco intranidal.
Com relação aos aspectos sociogenéticos, estudos prévios têm demonstrado que
algumas espécies de Euglossini apresentam estágios intermediários entre a vida solitária e a
eussocialidade. Entretanto, não há dados sobre o nível de organização social e sua relação
com acasalamento múltiplo das fêmeas e ao grau de parentesco entre os indivíduos da colônia.
Como espécies diferentes de Euglossini apresentam estágios distintos, pode ser verificado se
há relação entre nível de parentesco intracolonial e o estágio social alcançado.
18
3. Objetivos
3. OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivo a investigação de aspectos da biologia e genética dos
Euglossini, buscando obter dados que permitissem esclarecer as seguintes questões:
- A ocorrência de machos diplóides é um fato generalizado entre as populações de
Euglossini? As causas apontadas na literatura como principais fatores desencadeadores para
ocorrência de machos diplóides são observadas nas populações aqui estudadas e indicam
alguma tendência?
- Qual o parentesco genético intracolonial? O grau de parentesco genético tem alguma
relação com o estágio social alcançado pelas diferentes espécies?
19
4. Delineamento e Apresentação
4. DELINEAMENTO E APRESENTAÇÃO
A ferramenta mais utilizada nos trabalhos de estimativa da freqüência de machos
diplóides nos Euglossini foi a análise aloenzimática, através de eletroforese horizontal em gel
de amido. Pelo fato de constituírem locos traduzidos, muitas das possíveis variantes são
eliminadas de forma mais eficiente nos organismos haplodiplóides que nos diplodiplóides,
visto que alterações que comprometam a funcionalidade de uma enzima codificada por um
dado alelo num organismo haplóide não apresentam o benefício da dominância nos diplóides.
A este evento é atribuída a baixa variação observada nos himenópteros quando comparados
aos grupos de insetos diplodiplóides.
O uso de marcadores moleculares com maior grau de polimorfismo, não codificantes,
representa uma ferramenta mais poderosa para o estudo de populações. Considerando então
tais fatos, tem-se que os microssatélites do DNA nuclear constituem uma ferramenta de alto
poder de resolução para essas perguntas, sendo muito provavelmente, a ferramenta mais
apropriada para permitir o enfoque e a profundidade desejada no esclarecimento das questões
aqui levantadas.
Os microssatélites constituem seqüências de 2-6 pares de base repetidos em tandem,
têm como característica um alto grau de polimorfismo, apresentam-se distribuídos por todo o
genoma e seus ´alelos´ têm ação codominante (ESTOUP et al., 1993).
20
4. Delineamento e Apresentação
Portanto, visando responder as questões aqui levantadas sobre a biologia e genética de
populações de Euglossini, esta tese é composta pelos seguintes capítulos:
Capítulo I – “Microsatellite loci for euglossine bees (Hymenoptera: Apidae)”.
Neste capítulo, constam o número de locos e as estratégias utilizadas para buscar marcadores
do tipo microssatélites nas espécies Euglossa cordata e Eulaema nigrita, além de testes
realizados em outras espécies de Euglossini;
Capítulo II – “Microsatellite analysis demonstrates that diploid males are
uncommon in euglossine bee populations from Brazil”. Neste capítulo, com a utilização
dos primers de microssatélites anteriormente desenvolvidos foi estimada a freqüência de
machos diplóides em 23 espécies de Euglossini, bem como as causas e conseqüências da
ocorrência desses machos frente aos dados da literatura;
Capítulo III – “Determinação da estrutura sociogenética de ninhos de Euglossini
com o uso de DNA microssatélite”. Neste capítulo foi abordada a estrutura nidal de
Euglossa cordata, Euglossa townsendi e Eulaema nigrita, relacionando a biologia dos ninhos
e o parentesco intranidal.
21
5. Microsatellite for euglossine bees
MOLECULAR ECOLOGY NOTES – 1
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doi: 10.1111/j.1471-8286.2007.01878.x
Microsatellite loci for euglossine bees (Hymenoptera: Apidae)
Souza, R.O.*, Cervini, M.
#
, Del Lama, M.A.* and Paxton, R.J.
¥
* Laboratório de Genética Evolutiva de Himenópteros and
#
Laboratório de
Imunogenética - DNA, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal
de São Carlos, CEP 13565-905, São Carlos, São Paulo, Brazil.
¥
School of Biological Sciences, Queen's University Belfast, 97 Lisburn Road, Belfast
BT9 7BL, UK.
Keywords: Trinucleotide, SSR locus, orchid bee, Euglossini, population genetics
Running title: Microsatellites for orchid bees
Corresponding Author: Rogério O. Souza, Laboratório de Genética Evolutiva de
Himenópteros, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São
Carlos, CEP 13565-905, São Carlos, São Paulo, Brazil.
23
24
Email:
[email protected]
Fax: (55) 16 3351-8377
22
5. Microsatellite for euglossine bees
Abstract 1
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The Neotropical Euglossini (Hymenoptera: Apidae) are important pollinators of many
flowering plants, particularly orchids. Lack of highly polymorphic genetic markers for
euglossine species has limited study of their social organisation and inbreeding. We
therefore developed microsatellite markers for two species, Eulaema nigrita (11 loci)
and Euglossa cordata (9 loci), most of which were highly polymorphic in the source
species and in a range of related euglossine bees.
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5. Microsatellite for euglossine bees
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The Euglossini are corbiculate bees that occur in the Neotropics from 29º North to
32º South (Búrquez 1997). They are known as orchid bees due to the behaviour of
their males in collecting fragrances from the flowers of orchids (e.g. Roubik & Hanson
2004).
Population genetic studies benefit from molecular markers with high levels of
heterozygosity. To date, however, studies of the intracolonial sociogenetic structure,
population genetic structure and inbreeding in euglossine bees have been limited to
the use of allozymes of low variability (Roubik et al. 1996, Takahashi et al. 2001). We
therefore developed primers flanking microsatellite repeat motifs for two
characteristic euglossine species, Euglossa cordata and Eulaema nigrita, both with a
wide distributional range in Brazil. In brief, total DNA was extracted from a single
male thorax (one per species) preserved in alcohol using phenol/chloroform. Two
300 – 800bp partial genomic libraries were constructed, one for E. cordata and one
for E. nigrita, following Piertney et al.’s (1998) microsatellite enrichment protocol,
enriching for CTT/GAA repeat motifs. Selected fragments were ligated into the
plasmid vector pUC19/BamHI (Q-Biogene), then plasmids were cloned into XL-2
Blue MRF’ Ultracompetent Cells (Stratagene).
Clones were screened with DIG-end labelled (GAA)
10
or (CTT)
10
(Estoup & Turgeon
1996) and positive clones were sequenced using BigDye terminator chemistry
(Applied Biosystems) on an ABI 3130 automatic sequencer. Primers were designed
using the program Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi),
resulting in 26 microsatellite loci, 13 for E. nigrita and 13 for E. cordata.
24
5. Microsatellite for euglossine bees
Samples for PCR tests were extracted from male and female legs following a high-
salt protocol (Paxton et al. 1996). Fluorescently end-labelled PCR products were
generated in an Eppendorf Mastercycler using 250 µM of each dNTP, 2.5 mM of
MgCl
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2
, 1.0 µM of each primer, 1.0 X Invitrogen Buffer, 1.0 U of Platinum Taq DNA
polymerase (Invitrogen) in a 10.0 µL final volume. All PCR profiles comprised 30
cycles of 30 s at 94
o
C for denaturation, 20 s at 56
o
C for annealing, 1 min at 72
o
C
for extension, and a final extension step of 10 min at 72
o
C. Products were resolved
in a MegaBACE – 750 (GE - Applied BioSystems) fragment analyser. All statistical
analyses were performed using FSTAT 2.9.3.2 (Goudet 1995).
From the 26 loci, two of 13 in E. nigrita (EF451839, EF451840) and four of 13 in E.
cordata (EF451850, EF451851, EF451852, EF451853) were monomorphic. The
other 11 loci in E. nigrita and nine loci in E. cordata showed high levels of
polymorphism and expected heterozygosity (Table 1). We found one GCCA (E.
nigrita) and one CT (E. cordata) microsatellite repeat motif; others containing the
expected repeat motif, GAA/CTT (Table 1). Loci did not exhibit linkage disequilibrium
and no significant departures from Hardy Weinberg equilibrium were observed when
the loci were used to amplify DNA from the source species for which they had been
developed. All individuals generated at least one allele at each locus and therefore
there was no evidence of null alleles in that non-amplifying individuals, potential null
allele homozygotes (females) or hemizygotes (males) were not detected. Loci were
also useful in amplifying DNA of other euglossine species (Table 2).
The microsatellite loci we have designed will be a useful tool to answer topical
questions in euglossine biology such as effective population size in species with
25
5. Microsatellite for euglossine bees
complementary sex determination (Zayed 2004), diploid male production and the
decline of pollinators (Takahashi et al. 2001, Zayed et al. 2003), the loss of genetic
variation and its relation with foraging specialisation versus generalisation (Packer et
al. 2005).
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5. Microsatellite for euglossine bees
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We thank J.C. Serrano and E.J. dos Anjos Silva for species identification;
M.M. López-Uribe, C.A. Oi and C.F. Martins for help in sampling; EMBRAPA
Pecuária Sudeste, Parque Ecológico de São Carlos and Canil Municipal de São
Carlos for permission to sample bees in their areas; special thanks to IBAMA (Dr.
Helena K. Boscolo) for the licence to collect and transport the material; to the
members of Universidade Federal de São Carlos and Queen’s University Belfast for
support; to CNPq (Edital Universal 475935/04-7); and to CNPq (n
o
142131/03-2) and
CAPES (BEX- 218204/1) for a scholarship to ROS.
27
5. Microsatellite for euglossine bees
References 1
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Takahashi NC, Peruquetti RC, Del Lama MA, Campos LAO (2001) A reanalysis of
diploid male frequencies in euglossine bees (Hymenoptera: Apidae).
Evolution, 55, 1897-1899.
Zayed A (2004) Effective population size in Hymenoptera with complementary sex
determination. Heredity, 93, 627-630.
Zayed A, Roubik DW, Packer L (2003) Use of diploid male frequency data as an
indicator of pollinator decline. Proceedings of the Royal Society of London B ,
271, S9-S12.
29
5. Microsatellite for euglossine bees
Table 1. Details of the 20 microsatellite loci developed for Eulaema nigrita (Eln) and Euglossa cordata (Egc) from Brazil
(one population of each species), with 23 E. nigrita females (diploid) and 134 E. cordata individuals (67 haploid males and
67 diploid females) analyzed.
Locus
Fluorophore
Repeat
motif in
clone and
length (bp)
Primer sequence
Range
(bp)
N
A
H
O
H
E
GenBank
Number
Eln 1 (GAA)
8
F 5’- GGGGTATGGAACGAGACAAA -3’ 204 - 226 8 0.76 0.81 EF451828
FAM 210 R 5’- GATGGCGAGCACGATAATCT -3’
Eln 12a (GAA)
6
F 5’- AGGCATGTTCCTTCTTCTGGT -3’ 286 - 303 7 0.68 0.78 EF451829
TET 298 R 5’- AACGAGTGACGGAGAACGAG-3’
Eln 12b (GCCA)
10
F 5’- GGCAAGCACAAGCAAGTAAG -3’ 189 - 209 5 0.68 0.64 EF451830
HEX 209 R 5’- GGCAGCGGTGTAACAGAAG -3’
Eln 13 (CTT)
8
F 5’- CTGCGCCATTTCGTCTCT -3’ 142 - 170 9 0.77 0.82 EF451831
FAM 150 R 5’- GCATTACTGTAACGGGAACCA -3’
Eln 2J (CTT)
7
F 5’- CAAGCGTCGCGATTGTTAT -3’ 179 - 217 8 0.73 0.78 EF451832
TET 186 R 5’- TCAGGAGTCACGTTCCATCA-3’
Eln 5J (GAA)
8
F 5’- TCTTCCACTCTCGACCTCGT -3’ 131 - 179 10 0.62 0.72 EF451833
HEX 155 R 5’- TGCCTCGGATGGACTAGTTT-3’
Eln 7J (CTT)
12
F 5’- TCCTTCGGTCCCGTATTAAA -3’ 136 - 166 9 0.68 0.79 EF451834
FAM 158 R 5’- CCGAGTGAAATCGAATGGAG -3’
Eln 10J (CTT)
8
F 5’- ATTCTCTGCTCCCCCTTTGT -3’ 227 - 269 11 0.86 0.92 EF451835
FAM 249 R 5’- TACCTACGCGAGACGAGACA -3’
Eln 12J (GAA)
6
F 5’- AACGGGCAACGTAACCATAG -3’ 173 - 254 11 0.67 0.85 EF451836
HEX 243 R 5’- GCTCGTTCACCATCTTCGTT -3’
Eln 18J (CTT)
9
F 5’- GCTTTTCCCTTTCGCTCTCT -3’ 178 - 193 5 0.76 0.70 EF451837
FAM 186 R 5’- AACGGGAGGCGATAAAAACT -3’
Eln 19J (GAA)
14
F 5’- ATAAAGCTACGACGCGAGGA -3’ 154 - 208 17 0.82 0.92 EF451838
TET 169 R 5’- CCTGGCATTCGGTTAGGTTA -3’
30
5. Microsatellite for euglossine bees
Egc 17 (GAA)
11
F 5’- AGAGGAGGGTCCAGGAAAGA -3’ 199 - 246 16 0.73 0.83 EF451841
FAM 228 R 5’- ACCAGGCGTTCTCATCAAGT -3’
Egc 18 (GAA)
9
F 5’- TGATACAGGTCGGCGTAAAA -3’ 158 - 197 18 0.83 0.92 EF451842
FAM 166 R 5’- GGTAACTCCGTCGCGAACTA -3’
Egc 24 (GAA)
6
F 5’- AGGAGAACCGAACAGCGATA -3’ 192 - 210 11 0.45 0.65 EF451843
FAM 210 R 5’- CCGAGCTTTTTCTTCCCTCT -3’
Egc 26 (CTT)
5
F 5’- GCCGAACAAACATCTCGTCT -3’ 160 - 188 21 0.70 0.82 EF451844
HEX 163 R 5’- CGGAACTTTGATATCGTCGAG -3’
Egc 30a (GAA)
7
F 5’- ATGCCAAGCAAAGTTTCCAA -3’ 123 - 166 7 0.94 0.85 EF451845
FAM 151 R 5’- GAAAATTTCTCAGCCATTTCAA -3’
Egc 30b (CT)
12
F 5’- CGAATCTTGAAATGGCTGAGA -3’ 87 - 152 35 0.86 0.89 EF451846
HEX 116 R 5’- ACACCGCGAGAGCGAGAG -3’
Egc 35 (GAA)
7
F 5’- GATCACGAAACGGTGTAAAGTC -3’ 156 - 174 6 0.80 0.87 EF451847
TET 172 R 5’- CTTTCTTCGGATTCGGACTG -3’
Egc 37 (CTT)
6
F 5’- ATCCTCCTCTTCGTGGTCCT -3’ 145 - 223 24 0.48 0.51 EF451848
TET 176 R 5’- GGCAAAACTTCCGCTTGATA -3’
Egc 51 (CTT)
6
F 5’- GGAATGGGATTCATTCAGCA -3’ 192 - 232 10 0.49 0.54 EF451849
HEX 220 R 5’- CGAAAGGTCGACAAACCAAT -3’
F and R forward and reverse primers, respectively (F was fluorescently labelled); N
A
, number of alleles;
H
O
, observed heterozygosity; H
E
, expected heterozygosity; E. cordata H
O
and H
E
estimates used females only.
31
5. Microsatellite for euglossine bees
Table 2. Results of cross-species amplification using microsatellite primers designed for Euglossa cordata (9 loci, Egc)
and Eulaema nigrita (11 loci, Eln) in 23 species of euglossine bees.
Number of alleles per locus, expected heterozygosity
[allele range in bp]
Sp
N
Egc 17 Egc 18 Egc 24 Egc 26 Egc 30a Egc 30b Egc 35 Egc 37 Egc 51
1
17m
5 - 0.80 4 - 0.65 3 - 0.65 1 1 - 2 - 0.23 7 - 0.62 2 - 0.32
[214-235] [176-185] [208-211] [172] [157] - [168-171] [176-216] [223-226]
2
19m
6 - 0.56 9 - 0.72 1 2 - 0.39 1 - 5 - 0.38 5 - 0.72 3 - 0.56
[205-226] [183-213] [190] [172-175] [160] - [168-171] [157-170] [215-223]
3
1m
1 1 1 1 1 1 1 1 1
[218] [179] [210] [173] [126] [116] [174] [170] [220]
4
see
Table 1
5
7m
4 - 0.69 5 - 0.78 4 - 0.61 4 - 0.61 - 7 - 0.86 2 - 0.25 3 - 0.24 2 - 0.25
[220-237] [182-194] [201-207] [167-176] - [89-129] [168-171] [148-163] [223-226]
6
30m
6 - 0.75 11 - 0.81 1 2 - 0.46 - - 5 - 0.74 6 - 0.77 2 - 0.50
[202-220] [180-215] [190] [172-175] - - [168-180] [151-166] [208-215]
7
1m
1 1 1 1 - - - 1 1
[209] [181] [190] [175] - - - [157] [225]
8
95m
11 - 0.86 8 - 0.66 2 - 0.67 1 - - - 10 - 0.77 1
[203-234] [197-224] [173-179] [165] - - - [143-186] [236]
9
8m
6 - 0.81 5 - 0.78 6 - 0.78 3 - 0.41 3 - 0.63 8 - 0.88 2 - 0.32 5 - 0.78 3 - 0.57
[220-240] [198-217] [192-204] [164-168] [154-166] [91-112] [171-174] [154-166] [223-229]
10
3m
2 - 0.44 1 1 1 2 - 0.44 3 - 0.67 2 - 0.44 2 - 0.44 1
[218-224] [168] [210] [174] [129-160] [112-127] [174-177] [160-166] [220]
11
1m
1 1 1 1 - - 1 1 1
[220] [187] [189] [173] - - [171] [156] [219]
12
4m
3 - 0.63 3 - 0.63 2 - 0.38 3 - 0.63 4 - 0.63 4 - 0.75 3 - 0.63 4 - 0.75 3 – 0.63
[211-223] [162-183] [196-204] [164-173] [144-150] [88-119] [159-168] [179-210] [220-226]
13
8m
3 - 0.66 6 - 0.63 3 - 0.59 2 - 0.38 3 - 0.67 7 - 0.86 2 - 0.22 5 - 0.75 2 - 0.47
[217-223] [182-205] [200-207] [170-173] [130-151] [85-134] [168-171] [148-223] [223-226]
14
4m
3 - 0.63 4 - 0.75 2 - 0.50 3 - 0.63 1 2 - 0.50 2 - 0.38 3 - 0.63 3 - 0.63
2f
[217-229] [182-199] [190-204] [170-182] [163] [120-121] [168-171] [147-163] [220-226]
32
5. Microsatellite for euglossine bees
15
10m
6 - 0.78 5 - 0.74 3 - 0.58 6 - 0.76 - 1 2 - 0.42 5 - 0.78 3 - 0.34
[214-232] [180-198] [190-204] [170-185] - [104] [168-171] [151-176] [220-226]
16
1m
1 1 1 1 1 1 1 1 1
[231] [184] [199] [179] [161] [120] [174] [163] [230]
17
2m
1 1 - - 1 - 1 1 -
[224] [183] - - [155] - [226] [155] -
18
2m
1 1 - - 1 - 1 2 - 0.50 -
[224] [183] - - [153] - [226] [149-153] -
19
2m
1 1 - - 1 - 1 1 -
[209] [181] - - [153] - [226] [153] -
20
2m
2 - 0.50 1 1 - 1 - 1 1 -
[224-241] [182] [195] - [153] - [226] [153] -
21
53m
10 - 0.85 11 - 0.83 - - - - - 1 2 - 0.29
[215-256] [215-256] - - - - - [144] [230-233]
22
8m
5 - 0.83 1 - - - - - 1 -
[229-241] [215] - - - - - [156] -
23
51m
10 - 0.83 1 - - - - - 1 1
3f
[203-238] [215] - - - - - [156] [205]
Sp
N
Eln 1 Eln 12a Eln 12b Eln 13 Eln 2J Eln 5J Eln 7J Eln 10J Eln 12J Eln 18J Eln 19J
1
2m
- 1 - 1 1 - 1 - - 1 1
- [250] - [139] [194] - [177] - - [279] [177]
2
2m
- 1 - 1 1 - 2 - 0.50 1 - 1 1
- [252] - [139] [186] - [182-188] [252] - [273] [206]
3
1m
- 1 - 1 1 - 1 1 - 1 1
- [250] - [139] [190] - [220] [249] - [279] [220]
4
2m
- 2 - 0.50 - 1 2 - 0.50 - 2 - 0.50 1 - 1 2 - 0.50
- [244-247] - [139] [194-197] - [175-178] [247] - [279] [175-178]
5
2m
- 1 - 1 1 - 1 - - 1 1
- [244] - [139] [190] - [191] - - [279] [170]
6
2m
- 1 1 1 - - 1 - 1 1 -
- [186] [252] [139] - - [200] - [213] [272] -
7
1m
- 1 - 1 1 - 1 - - 1 1
- [246] - [139] [194] - [205] - - [268] [205]
8
95m
- 1 2 - 0.15 2 - 0.52 - - 1 - - 6 - 0.60 15 - 0.89
- [246] [190-198] [139-148] - - [184] - - [274-292] [170-207]
33
5. Microsatellite for euglossine bees
9
2m
- 1 - 1 - - 1 - - 1 1
- [246] - [139] - - [184] - - [278] [170]
10
2m
- 1 - 1 1 - 1 - - 1 2 - 0.50
- [249] - [139] [190] - [202] - - [280] [199-202]
11
1m
1 1 - 1 1 - 1 1 - - 1
[229] [294] - [151] [205] - [203] [244] - - [171]
12
2m
- 1 - 1 1 - 1 - - 1 2 - 0.50
- [247] - [139] [193] - [213] - - [279] [173-178]
13
2m
- 1 - 1 1 - 1 - - 1 1
- [244] - [139] [190] - [187] - - [279] [173]
14
2m
- 1 - 1 1 - 1 - - - -
- [250] - [139] [190] - [187] - - - -
15
2m
- 1 - 1 1 - 1 - - 1 1
- [244] - [139] [190] - [184] - - [279] [184]
16
1m
- 1 - - 1 - 1 1 - 1 1
- [244] - - [190] - [184] [244] - [279] [220]
17
21m
3 - 0.67 7 - 0.88 5 - 0.72 3 - 0.68 10 - 0.88 7 - 0.89 9 - 0.90 10 - 0.91 6 - 0.67 14 - 0.93 8 - 0.90
[207-220] [269-295] [202-234] [157-163] [194-231] [132-200] [164-187] [225-262] [229-259] [186-238] [178-203]
18
8m
6 - 0.81 5 - 0.75 4 - 0.66 1 5 - 0.69 2 - 0.47 - 3 - 0.53 1 1 2 - 0.47
[205-226] [288-295] [202-222] [151] [218-242] [171-174] - [237-243] [229] [205] [171-174]
19
26m
1 6 - 0.74 7 - 0.74 3 - 0.27 6 - 0.75 2 - 0.50 8 - 0.80 4 - 0.67 7 - 0.78 8 - 0.90 7 - 0.79
[207] [274-283] [206-234] [156-160] [194-222] [185-191] [170-192] [226-235] [245-259] [202-265] [171-206]
20
see
Tabl e 1
21
53m
- 7 - 0.65 3 - 0.50 1 3 - 0.48 - 4 - 0.56 5 - 0.68 5 - 0.56 4 - 0.42 4 - 0.37
- [276-294] [199-207] [154] [200-211] - [160-172] [228-249] [249-263] [217-229] [216-228]
22
8m
- - 3 - 0.65 1 1 1 - - - - 5 - 0.78
- - [211-219] [138] [193] [190] - - - - [222-261]
23
51m
- - 9 - 0.81 1 1 1 1 - - - 8 - 0.79
3f
- - [194-215] [138] [194] [190] [156] - - - [216-264]
-, no resolvable product; m, haploid males; f, diploid females. Expected heterozygosity only given for >1 allele per locus.
Species: 1 Euglossa annectans; 2 Eg. chalybeata; 3 Eg. cognata; 4 Eg. cordata; 5 Eg. fimbriata; 6 Eg. imperialis; 7 Eg.
intersecta; 8 Eg. mandibularis; 9 Eg. melanotricha; 10 Eg. mixta; 11 Eg. moure; 12 Eg. pleosticta; 13 Eg. securigera; 14
Eg. townsendi; 15 Eg. truncata; 16 Eg. viridis; 17 Eulaema bombiformis; 18 El. cingulata; 19 El. meriana; 20 El. nigrita; 21
Eufriesea violacea; 22 Exaerete frontalis; 23 Ex. smaragdina.
34
6. Diploid Males Production
MICROSATELLITE ANALYSIS DEMONSTRATES THAT DIPLOID
MALES ARE UNCOMMON IN EUGLOSSINE BEE POPULATIONS
FROM BRAZIL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Souza, R.O.*, Cervini, M.
#
, Mortari, N.
#
, Paxton, R.J.
¥
and Del Lama, M.A.*
* Laboratório de Genética Evolutiva de Himenópteros and
#
Laboratório de
Imunogenética - DNA, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal
de São Carlos, C.P. 676, CEP 13565-905, São Carlos, São Paulo, Brazil.
¥
School of Biological Sciences, Queen's University Belfast, 97 Lisburn Road, Belfast
BT9 7BL, UK.
Keywords: Diploid Males, Euglossine bees, Hymenoptera, Microsatellites.
Corresponding Author: Rogério O. Souza, Laboratório de Genética Evolutiva de
Himenópteros, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São
Carlos, CEP 13565-905, São Carlos, São Paulo, Brazil.
Email:
[email protected]19
20 Fax: (55) 16 3351-8377
35
6. Diploid Males Production
ABSTRACT 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Diploid (2N) males can be observed in haplodiploid Hymenopteran species with
complementary sex determination (CSD) as a consequence of homozygosity at the sex
locus/loci that drives a diploid zygote to develop to male instead of female. The
frequency of 2N males may therefore be a readily measurable indicator of the genetic
health of these economically and ecologically important insects. Past allozyme-based
studies of 2N male frequencies in one group of Hymenopterans, the Neotropical
‘orchid’ or euglossine bees, have been contradictory whilst recent allozyme-based
analysis of one orchid bee species from Panama has suggested that it suffers from
extremely high 2N frequencies associated with high Fst and low Ne (Zayed et al.
2004). Using highly polymorphic microsatellite loci to reveal ploidy, we detected only
two diploid males (one in each of Euglossa annectans and Euglossa mandibularis) of
483 males belonging to 23 euglossine bee species sampled in Brazil and Colombia.
Despite analysis of species occupying different and often highly fragmented habitat
types, we believe that South American euglossine bee populations are not subjected to
high levels of inbreeding and show genetic health incompatible with the idea of
bottlenecking and consequential inbreeding.
36
6. Diploid Males Production
INTRODUCTION 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Arrhenotokous haplodiploidy is a common reproductive system in nearly 20%
of animal species (Cowan and Stahlhut, 2004), where males developed from
unfertilized eggs and females from fertilized ones. Its advantages include the ability of
females to control the sex ratio and invest in the sex that promotes higher fitness for a
given investment.
At the genic level, the mechanism of sex determination of the majority of
haplodiploid Hymenoptera (ants, bees and wasps) is believed to be single-locus
complementary sex determination (sl-CSD; van Wilgenburg et al. 2006), a
mechanism first proposed by Whiting (1943). According to the sl-CSD model,
females are heterozygous and males are hemizygous (haploid) or homozygous
(diploid) at the sex locus. Other sex determination mechanisms have been proposed
such as multilocus-CSD (Snell, 1935), especially for parasitic or inbreeding wasp
species (Cook, 1993), genic balance (Cunha and Kerr, 1957), and genetic imprinting
(Dobson and Tanouye, 1998), though these models either have poor theoretical
grounding, have little empirical support or have a limited taxonomic distribution
within the Hymenoptera (van Wilgenburg et al. 2006).
Diploid males in sl-CSD Hymenopteran species are usually considered
infertile due to a non-reduction from diploidy of their sex cells during meiosis.
Consequently, they father triploid progeny, increasing the genetic load to their parents
(Cook and Crozier, 1995). The occurrence and cost of diploid males is reduced by
various strategies such as inbreeding avoidance and polyandry respectively; the latter
reduces the variance in 2N male production by a female (Cook and Crozier, 1995). In
Apis cerana diploid males are eaten on hatching (Hoshiba et al., 1981; Woyke, 1979),
and in Apis mellifera diploid males are killed up to their third day of larval life
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(Woyke, 1979), reducing their load on these eusocial honey bees. Male diploidy may,
however, be useful in biological control (Stouthamer et al., 1992). Few examples of
functionally reproductive 2N males have been reported, namely in the wasp
Diadromus pulchellus (Elagoze et al., 1994) where 1% of the 2N males were fertile
and in the highly inbred solitary mason wasp Euodynerus foraminatus (Cowan and
Stahlhut, 2004), in Bombus terrestris bee (Ayabe et al., 2004) and in paper wasps
Polistes chinensis antennalis (Tsuchida et al., 2002) and Polistes dominulus (Liebert
et al., 2005). However, only in E. foraminatus is there evidence that 2N males can
produce haploid sperm and fertile grandchildren (Cowan and Stahlhut, 2004).
It has recently been argued that sl-CSD may lead to a decrease in effective
population size as a consequence of diploid male production, and that diploid males
may therefore be used as sensitive indicators of population viability (Zayed et al.,
2004; Zayed and Packer, 2005; Zayed and Packer, 2001). In support of this view,
diploid male frequencies from 8-100% have been reported by Roubik et al. (1996),
Zayed et al. (2004) and López-Uribe et al. (2007) in orchid bee species from Panama
and Colombia, assessed using allozyme markers. This contrasts with the allozyme-
based findings of Takahashi et al. (2001), in which a single individual out of 542
orchid bees from Brazil was diploid. Controversy over these differences arises due to
the low resolving power (low polymorphism) and difficulty in scoring allozymes and
due to idiosyncrasies of the biology of the species employed in each study (Roubik,
2001).
For the first time we examined diploid male frequencies among 23 euglossine
bee species from various areas of Brazil and Colombia using novel, highly variable
microsatellite loci designed for Euglossa cordata (nine loci) and Eulaema nigrita
(eleven loci) (Souza et al. 2007; see Table 1) to determine ploidy of males. This
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approach overcomes the pitfalls that arise from allozyme-based analyses such as
genetic non-detection of 2N males and allele mis-scoring. In addition, our analysis of
23 species (ca. 10% of the world’s orchid bee fauna, see Roubik and Hanson, 2004)
ensures coverage of a range of species with differing population biologies, habitat
preferences and therefore with differing exposure to habitat fragmentation.
MATERIALS AND METHODS
Adult males of 23 euglossine bee species (n = 483) were collected in six states
of Brazil (Amazonas – AM; Minas Gerais – MG; Mato Grosso – MT; Paraíba – PB;
Rio de Janeiro – RJ; and São Paulo – SP) and Villavicencio, Colombia, using
chemical bait compounds (cineole, skatole and vanillin). Females (n = 93) of four
species were simultaneously collected in flowers. After collection, samples were kept
at – 20°C until analysis.
Total DNA was extracted from legs of males following a high-salt protocol
(Paxton et al., 1996). PCRs were performed using fluorescently labeled primers
described in Table 1 (Souza et al., 2007) in a Eppendorf Mastercycler, with 250 µM
of each dNTP, 2.5 mM of MgCl
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, 1.0 µM of each primer, 1.0 X Buffer, 1.0 U of
Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen) and 1.0 µL of extracted DNA in a 10 µL
final volume. PCR profiles were: 30 cycles of 30 seconds at 94
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C for denaturing; 20
seconds at 56
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C for annealing; 1 minute at 72
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C for extension; and a final step of 10
minutes at 72
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C. PCR products were diluted and resolved in a MegaBACE – 750 (GE
- Applied BioSystems) sequencer.
Primers designed for Euglossa cordata and Eulaema nigrita were in Hardy
Weinberg equilibrium and not in linkage disequilibrium for the species from which
they had been developed (Souza et al. 2007). The Eg. cordata loci were used to
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6. Diploid Males Production
analyse 16 Euglossa spp. and the El. nigrita loci were used to analyse 4 Eulaema
species (Table 1). For Eufriesea violacea, Exaerete frontalis and Exaerete
smaragdina, all primers with a clear amplification product were employed. For Eg.
mandibularis, loci of El. nigrita were also used due to the low number of alleles or
lack of amplification using loci developed for Eg. cordata.
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Males with a diploid pattern for any locus were re-amplified and, if diploid
again, the DNA of another leg of the same individual was extracted and then
reanalysed as described above. Diploidy was detected in 2 males at 2 loci each; every
extraction and amplification gave the same diploid pattern. Diploid male frequencies
were estimated using (Owen and Packer, 1994) ML algorithm, assuming sl-CSD.
Allele frequencies, population differentiation and Fst were estimated using
GENEPOP (http://wbiomed.curtin.edu.au/genepop/) v 3.4 (Raymond and Rousset,
1995) and FSTAT v. 2.9.3.2 (Goudet, 1995) assuming males with only one allele at
all loci to be haploid, and mean expected heterozygosity across loci was calculated by
hand. Linkage disequilibrium was also tested in all populations with more than 17
males (Table 2) using FSTAT. Female samples (Eg. cordata, n = 66; and El. nigrita n
= 22) were used to estimate effective population size (Ne) using OneSamp software
(Tallmon et al. 2004), whilst population differentiation (including Eg. cordata and Ef.
violacea males) and deviation from Hardy-Weinberg equilibrium of females were
tested with FSTAT.
RESULTS
The number of loci used per species ranged from 6 to 13, and on average 7.68
loci were polymorphic (Table 1). Assuming H-W equilibrium, the expected intralocus
heterozygosity ranged from 0.15 in
Eg. mandibularis (Locus Egc 26) to 0.94 in Eg.
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6. Diploid Males Production
cordata (Locus Egc 30b), and the expected mean heterozygosity ranged from 0.24 in
Ex. smaragdina to 0.82 in El. bombiformis. The chance to detect a heterozygous male,
if diploid, at least at one locus was greater than 94% in all species (Table 2) and
usually >99%, demonstrating the high variability of the loci and their utility to assign
ploidy to an individual.
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Two diploid males out of 483 males sampled were observed across the 23
species analyzed (Table 2), one male in Euglossa annectans (5.8%) and the second in
Euglossa mandibularis (1.0%); the 2N male in this latter species had formerly been
identified as diploid on the basis of allozyme loci by Takahashi et al. (2001).
Considering that the probability of detection a diploid male is close to one for almost
all analyzed species, the expected maximum frequency of 2N males was ≤ 5% of
males for all 8 species with more than 18 males analysed. This means that, if diploid
males are captured depending only on their frequency and disregarding any other
parameter which could affect their sampling, the expected maximum frequency of 2N
males did not reach 6% using these markers and in this way, 20 individuals will be
sufficient for a good estimate of 2N males frequency, if they are truly random
sampled.
No population differentiation (São Carlos vs. Viçosa) was observed for Ef.
violacea males across 11 loci (Fst = -0.024, CI 95% -0.031 – -0.018). On the other
hand results for Eg. cordata males demonstrated a subtle yet significant difference
(Caraguatatuba vs. São Carlos) across 9 loci (Fst x = 0.015, CI 95% -0.008 – 0.032).
No significant departures from Hardy-Weinberg equilibrium were detected in Eg.
cordata or El. nigrita female populations. Eg. cordata males collected in a forest
fragment nearby and females sampled when visiting Thevetia peruviana flowers
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inside the city of São Carlos showed no significant population differentiation (Fst =
0.016, 95% CI 0.012 – 0.036).
An Ne of 78.4 (CI 95% 71.4 – 87.5) and 23.4 (CI 95% 21.5 – 25.9) was found
for Eg. cordata and El. nigrita females, a very close value of their respective sample
size. Several runs of this Bayesian software using subsets (randomly chosen) of 17
individuals of El. nigrita from the original data set, showed results close to sample
size used (usually 17) reflecting a good repeatability of data subsets.
DISCUSSION
Among 483 males sampled, 340 males from 10 new species (comparing to
Takahashi et al., 2001) (Exaerete 1; Eulaema 2; Euglossa 7) were analysed for the
first time and 143 males were previously analysed by Takahashi et al. (2001). The Eg.
mandibularis 2N male was the same reported by them and even expanding from 19 to
95 males analyzed only this occurred in the new sample. Microsatellite analysis
identified one 2N male in the Eg. annectans sample that was not identified by the
previous allozymes analysis. As the misscoring was less than 1% between the two
analyses we prefer to extend our analyses to new samples from other geographical
origins, than to submit the entire Takahashi et al. (2001) sample to reanalysis.
As expected, microsatellite analysis was a very powerful way to detect 2N
males due to their high intraloci heterozygosities. All Euglossini species studied
showed a chance to detect a heterozygous male, if diploid, for at least one locus
greater than 94%. But, if we compare the previous study with allozyme markers
(Takahashi et al. 2001) and the present results, the scenario is the same – diploid
males are uncommon in all Brazilian populations analyzed. Considering that the
results are similar, pooling together the data from Takahashi et al. (2001) and our
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findings, 883 males of 26 species of four of the five genera of this tribe were analyzed
and only two diploid males were found.
Even in a cleptoparasitic species like Exaerete, which is expected to have a
lower population size than others Euglossini species, 2N males were not found. This
is a good indication that its usurpation behaviour is not contributing to a Ne reduction
and inbreeding.
Our samples came from the Northeast and Southeast coast line where Atlantic
forest is the original vegetation, from the Center region where cerrado is the
predominant vegetation and from Amazon basin (Amazon forest), with its complex
fauna and flora. All these environments are under different kinds of human activities
like wood exploration, crops, cattle ranching and many other extractive activities.
Even in highly disturbed areas as the surroundings of São Carlos city, where a
reduction of the original vegetation was estimated as 94.4% in favour to sugar-cane
monoculture (Soares et al., 2003), a single 2N male (Eg. annectans) was found among
94 males from 9 species.
Female analysis provided a partial picture of genetic structure and state of health
of El. nigrita and Eg. cordata populations. The absence of significant departures of
Hardy-Weinberg equilibrium indicates low inbreeding levels. Mark and recapture
studies and genetical analysis through mitochondrial and allozymes markers in these
two species inside urban areas (López-Uribe, 2006) showed a low dispersion of
females among patches of trees and different dispersion patterns for females
(phylopatric) and males (dispersive sex) collected in flowers from different sampling
sites. Considering these different behaviours (philopatry vs. dispersion), male
mobility is certain an important key to keep outbreeding at levels that avoid 2N male
production.
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As the foraging areas and flight for mating are not necessarily overlapped events
is not a surprise that even with a small estimated Ne, especially in El. nigrita (Ne =
23.4), no diploid male was found. As Ne was estimated using females, this number
just reflects the dispersion pattern in urban areas mentioned above. By the way, close
value between number of females analysed and Ne estimates for El. nigrita and Eg.
cordata means that the real Ne is higher considering a conservative model used
(Tallmon et al. 2004) and specially the strategy used to collecting females inside
flowers (more phylopatric sex according López-Uribe . 2006).
The Fst values provided evidence of high gene flow levels in Ef. violacea (two
populations 530 km apart), but not in Eg. cordata (populations 300 km apart).
Although being expected a higher flight ability of the bigger bees, these Fst values
should be analysed carefully, because only Eg. cordata value was estimated with
species-specific microsatellite loci, and the accuracy of the estimate should be smaller
in Ef. violacea population (heterologous primers).
No linkage disequilibrium was found in male samples involving all 10 tested
species (Eg. annectans, Eg. chalybeata, Eg. cordata, Eg. imperialis, Eg.
mandibularis, El. bombiformis, El. meriana, El. nigrita, Ef. violacea and Ex.
smaragdina). This result indicates that our data have no familial structure, and it is a
strong evidence that the males of different species we have caught are truly random
samples.
According to the sl-CSD model, diploid males will be generated if a matched
mating occurs, and this is proportional to the number of sex alleles in a given
population (Cook and Crozier, 1995). Assuming that sex alleles have similar
frequencies in a population (they are maintained by frequency-dependent selection),
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the expected number of these alleles in Euglossa mandibularis and Euglossa
annectans are 95 and 17 alleles, respectively.
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The low number of 2N males detected in our samples does not mean that they
are not produced, but our results make evident that they are uncommon among adult
males collected through chemical baits. Analyses of El. nigrita (n = 8), Eg. cordata (n
= 11) and Eg. townsendi (n = 7) nests revealed no diploid males in 234 males found
inside these nests, and no differential mortality was observed in pupa or adult phases
between sexes (Souza et al. unpublished).
Diploid male production is a population property. In a random-mating species,
high diploid male production indicates small effective population size (Zayed et al.
2004), and it would not be warranted to assume that all populations of a certain
species will have similarly small sizes and similar DMP levels.
For example, El.
meriana and Eg. imperialis samples from Panama showed high frequency of males
that are diploid (Roubik et al. 1996), but none was observed in our Brazilian samples.
Mark and recapture data showed some euglossine bees have long-distance
dispersal abilities, being able to return to their nest from distances ranging from 14 to
23 kilometres as observed in Euplusia (Eufriesea) surinamensis (Janzen 1971).
Phylogeographical data (Dick et al. 2004) also support the view that euglossine bees
have long-distance dispersion capacity, being this an important feature for population
maintenance of euglossine bees, because it may function as a mechanism to avoid
inbreeding.
Although DMP is a population parameter, some species could be more
vulnerable to this condition. Species differ in their susceptibility to isolation by habitat
fragmentation, since euglossine bee species appear to have differences in their flight
capacities over open areas. Moreover, a high seasonal and limited distribution make
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some species more susceptible to environmental changes and habitat fragmentation.
According to Packer et al. (2005), the more specific the needs of a species, the greater
the impact on its survivor.
Euglossine bees are on the main focus about deforestation and loss of habitat
due to the strong mutualistic relationships between their males and orchid flowers.
Diploid male occurrence in euglossine bees as an indicative of pollinator decreases
and as diagnostic toll for environmental conservation was recently proposed by Zayed
et al. (2004). These authors considered that even in areas relatively preserved with
over 10,000 ha, populations are feeling the impacts of resource decreases. However,
we detected only one diploid male in areas neighbouring São Carlos city where 95%
of the original vegetation has been substituted by a sugar-cane monoculture (Soares et
al. 2003).
Diploid male production is still an open question, and certainly a special
attention must be given for those species which suffer with environment alteration.
Diploid male production must not be a general condition for euglossine bee
populations, but the result of a particular combination of biological (dispersion
pattern, foraging and mating behaviour) and demographical (population size and
distribution) of each species, added to the effect of the reduction of habitat and
connectivity among available fragments over them. Knowledge of the factors that
could explain the drastic differences on DMP among Panamanian and Colombian vs.
Brazilian populations will be crucial to propose effective bee conservation programs
in order to minimize the decline of these important pollinators.
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We thank JC Serrano and EJ dos Anjos Silva for species identification; MM López-
Uribe and CA Oi for help in sampling; EMBRAPA Pecuária Sudeste, Parque
Ecológico de São Carlos and Canil Municipal de São Carlos for permission to sample
bees in their areas. Our special thanks go to IBAMA (Dr. Helena K. Boscolo) for the
licence to collect and transport the material; to the members of Universidade Federal
de São Carlos and Queen’s University Belfast for all support, and CNPq (Edital
Universal 475935/04-7), CNPq (n
o
142131/03-2) and CAPES (BEX- 218204/1) for a
scholarship to ROS.
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6. Diploid Males Production
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50
6. Diploid Males Production
Table 1. Microsatellite loci developed for Euglossa cordata and Eulaema nigrita (Souza et al. 2007) used to analyse euglossine bee
species and marker variability (expected intralocus heterozygosity).
Expected intralocus heterozygosity (males only)
Species N Egc 17 Egc 18 Egc 24 Egc 26 Egc 30a Egc 30b Egc 35 Egc 37 Egc 51
N pol.
loci
Euglossa annectans 17m
+ # # 0 0 + + +
6
0.80 0.65 0.65 - 0.23 0.62 0.32
Eg. chalybeata 19m
+ + 0 + 0 + + +
6
0.56 0.72 0.39 - 0.38 0.72 0.56
Eg. cognata 1m
Eg. cordata 67m
+ + + + + + + + +
9
66f
0.87 0.88 0.70 0.83 0.56 0.94 0.58 0.91 0.47
Eg. fimbriata 7m
+ + + + + + + +
8
0.69 0.78 0.61 0.61 - 0.86 0.25 0.24 0.25
Eg. imperialis 30m +
+ 0 + + + +
6
0.75 0.81 0.46 - - 0.74 0.77 0.50
E. intersecta 1m
Eg. mandibularis 95m
+ + # 0 + 0
4
0.86 0.66 0.67 - - - 0.77
Eg. melanotricha 8m
+ + + + + + + + +
9
0.81 0.78 0.78 0.41 0.63 0.88 0.32 0.78 0.57
Eg. moure 1m
Eg. mixta 3m
+ 0 0 0 + + + + 0
5
0.44 0.44 0.67 0.44 0.44
Eg. pleosticta 4m
+ + + + + + + + +
9
0.63 0.63 0.38 0.63 0.63 0.75 0.63 0.75 0.63
51
6. Diploid Males Production
Eg. securigera 8m
+ + + + + + + + +
9
0.66 0.63 0.59 0.38 0.67 0.86 0.22 0.75 0.47
Eg. townsendi 4m
+ + + + + 0 + + +
8
2f
0.63 0.75 0.50 0.63 0.38 0.63 0.63
Eg. truncata 10m +
+ + + + + + +
8
0.78 0.74 0.58 0.76 - 0.42 0.78 0.34
Eg. viridis 1m
Eufriesea violacea 53m
+ + 0 +
3
0.85 0.83 - - - - - 0.29
Exaerete frontalis 8m
+ 0 0
1
0.83 - - - - - -
Ex. smaragdina 51m + 0 0 0
1
3f
0.83 - - - - -
Species
N
Eln 1 Eln 12a Eln 12b Eln 13 Eln 2J Eln 5J Eln 7J Eln 10J Eln 12J Eln 18J Eln 19J
Eg. mandibularis 95m 0 + + 0 + # 4
- 0.15 0.52 - - - - 0.60 0.89
Eulaema bombiformis 21m + + + + + + + + + + + 11
0.67 0.88 0.72 0.68 0.88 0.89 0.90 0.91 0.67 0.93 0.90
El. cingulata 8m + + + 0 + + + 0 0 + 7
0.81 0.75 0.66 0.69 0.47 - 0.53 0.47
El. meriana 26m 0 + + + + + + + + + + 10
0.74 0.74 0.27 0.75 0.50 0.80 0.67 0.78 0.90 0.79
El. nigrita 40m + + + + + + + + + + + 11
22f
0.81 0.83 0.67 0.85 0.82 0.86 0.85 0.82 0.78 0.62 0.90
Eufriesea violacea 53m + + 0 + + + + + + 8
- 0.65 0.50 0.48 - 0.56 0.68 0.56 0.42 0.37
Exaerete frontalis 8m + 0 0 0 + 2
- - 0.65 - - - - 0.78
Ex. smaragdina 51m + 0 0 0 0 + 2
3f
- - 0.81 - - - 0.79
0 = monomorphic; + = polymorphic; # = one 2N male detected; - no PCR product
52
6. Diploid Males Production
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Table 2. Species name, collection sites, number of males sampled (n), range of expected intralocus
heterozygosity (Hi), expected mean heterozygosity (Hexp), probability of detecting a heterozygous male if
diploid (Phet), observed number of 2N males and expected maximum frequency of 2N males (for n ≥ 19) in
samples of euglossine bees.
Species name Collection Site n
Hi
Hexp
Phet
2N
males
2N males
Max
Euglossa annectans São Carlos - SP (Br) 17 * 0.23 – 0.80 0.41 0.995 1*
Eg. chalybeata Manaus - AM (Br) 19 0.28 – 0.77 0.45 0.998 0 0.05
Eg. cognata Villavicencio - (Co) 1 0
Eg. cordata Caraguatatuba - SP (Br) 37 * 0.47 – 0.94 0.75 0.999 0 0.01
São Carlos - SP (Br) 30 *
Eg. fimbriata São Carlos - SP (Br) 7 * 0.25 – 0.86 0.56 0.999 0
Eg. imperialis Manaus - AM (Br) 30 0.46 – 0.81 0.58 0.999 0 0.03
Eg. intersecta Manaus - AM (Br) 1 0
Eg. mandibularis Viçosa - MG (Br) 95 *
a
0.15 – 0.89 0.43 0.999 1*
Eg. melanotricha Analândia - SP (Br) 8 * 0.32 – 0.88 0.66 0.999 0
Eg. mixta Villavicencio - (Co) 3 0.44 – 0.67 0.27 0.942 0
Eg. moure Manaus - AM (Br) 1 0
Eg. pleosticta São Carlos - SP (Br) 4 * 0.38 – 0.75 0.63 0.999 0
Camburí - SP (Br) 2
Eg. securigera Rifaina - SP (Br) 3 0.22 – 0.86 0.60 0.999 0
São Carlos - SP (Br) 3 *
Eg. townsendi Araras - SP (Br) 3 0.28 – 0.78 0.56 0.999 0
Rifaina - SP (Br) 1
Eg. truncata São Carlos - SP (Br) 10 * 0.34 – 0.78 0.49 0.999 0
Eg. viridis Villavicencio - (Co) 1 0
Eulaema bombiformis Manaus - AM (Br) 21 0.67 – 0.93 0.82 0.999 0 0.05
El. cingulata Manaus - AM (Br) 8 0.47 – 0.81 0.44 0.999 0
El. meriana Manaus - AM (Br) 26 0.27 – 0.90 0.63 0.999 0 0.04
Cuiabá - MT (Br) 4
Manaus - AM (Br) 4
Marliéria - MG (Br) 5
Mimoso - MG (Br) 4
El. nigrita Poconé - MT (Br) 3 * 0.61 – 0.91 0.80 0.999 0 0.03
Rifaina - SP (Br) 5
S. J. Campos - SP (Br) 5
São Carlos - SP (Br) 5 *
Viçosa - MG (Br) 5
Eufriesea violacea São Carlos - SP (Br) 17 0.29 – 0.85 0.48 0.999 0 0.02
Viçosa - MG (Br) 36
Exaerete frontalis João Pessoa - PB (Br) 8 0.65 – 0.78 0.28 0.983 0
Ex. smaragdina João Pessoa - PB (Br) 50 0.79 – 0.83 0.24 0.993 0 0.02
São Carlos - SP (Br) 1
TOTAL 483 0.15 – 0.94 0.53 0.995 2*
* same samples as analyzed by Takahashi et al. (2001);
a
n = 76 new samples added in addition to those of Takahashi et al. (2001)
7. Estrutura sociogenética de ninhos
Determinação da estrutura sociogenética de ninhos de Euglossini com o uso de
DNA microssatélite.
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Souza, R.O.*, Mortari, N.
#
, Paxton, R.J.
¥
and Del Lama, M.A.*
* Laboratório de Genética Evolutiva de Himenópteros and
#
Laboratório de
Imunogenética - DNA, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal
de São Carlos, CEP 13565-905, São Carlos, São Paulo, Brazil.
¥
School of Biological Sciences, Queen's University Belfast, 97 Lisburn Road, Belfast
BT9 7BL, UK.
Palavras-chave: estrutura sociogenética nidal, Abelhas Euglossini, locos
microssatélites,
Autor para correspondência: Rogério O. Souza, Laboratório de Genética Evolutiva
de Himenópteros, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de
São Carlos, CEP 13565-905, São Carlos, São Paulo, Brazil.
Email:
[email protected]20
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Fax: (55) 16 3351-8377
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7. Estrutura sociogenética de ninhos
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Indivíduos emergidos de ninhos de Eulaema nigrita (n = 8), Euglossa cordata (n =
11) e Euglossa townsendi (n = 7), coletados nas cidades de Araras, Rifaina e São
Carlos, tiveram seu DNA total extraído e foram analisados para locos microssatélites
para determinação da estrutura sociogenética nidal. Os resultados revelaram que os
ninhos de El. nigrita são inicialmente formados por uma única fêmea e,
posteriormente, compartilhados por fêmeas não aparentadas. Diferentemente, os
ninhos de Eg. cordata e Eg. townsendi foram, em geral, formados por uma única
fêmea, aparentemente acasalada com um só macho, embora na segunda espécie
também tenha sido observado o compartilhamento do ninho por fêmeas não
aparentadas em um dos sete ninhos estudados.
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7. Estrutura sociogenética de ninhos
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INTRODUÇÃO
As euglossíneas ou abelhas das orquídeas fazem parte do grupo de abelhas
corbiculadas, sendo algumas popularmente conhecidas como mamangavas.
Apresentam distribuição tipicamente neotropical (Búrquez 1997) e uma gama de
comportamentos que varia do solitário ao primitivamente social. O hábito dos machos
de coletar fragrâncias em flores de orquídeas foi inicialmente observado por
orquidologistas. Estes compostos foram posteriormente isolados e utilizados para
capturar machos possibilitando a descrição de novas espécies, além de permitir o
estudo de fatores como sazonalidade e preferência destes pelas fragrâncias, genética
de populações e ocorrência de machos diplóides, estimativas de tamanho populacional
em experimentos de marcação e recaptura, entre outros temas (Dressler 1968; Dodson
et al. 1969; Braga 1976; Janzen 1981a; Janzen 1981b; Folsom 1985; Powell & Powell
1987; Roubik & Ackerman 1987; Campos et al. 1989; Ackerman 1989; Wittmann et
al. 1989). Embora o conhecimento da biologia dos machos tenha avançado de forma
significativa, estudos envolvendo o comportamento de fêmeas são mais esparsos.
Sendo um grupo onde também estão presentes estágios intermediários no que
se refere à evolução do comportamento social, este pode fornecer informações
relevantes para a compreensão dos mecanismos que atuam no estabelecimento de
sistemas sociais. Os ninhos neste grupo são comumente construídos em cavidades de
árvores ou galhos, paredes de construções, segmentos de bambu, ninhos de cupins,
folhas fixas, e uma gama de outros ambientes. Embora estejam descritas mais de 200
espécies de Euglossini, somente para 38 delas se conhece a estrutura dos ninhos
(Ramírez et al. 2002).
Estudos com ninhos armadilhas e ninhos naturais mantidos em caixas de
observação promoveram de maneira bastante expressiva o entendimento das relações
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7. Estrutura sociogenética de ninhos
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entre os indivíduos ocupantes de um mesmo ninho (Sakagami & Michener 1965;
Myers & Loveless 1976; Garófalo 1992; Santos & Garófalo 1994; Arriaga et al.
1996). Escolhido o local, a fêmea dá início à coleta de material utilizado na
construção das células, seja barro, excrementos ou resinas. Após construir uma célula
e tendo aprovisionado-a com alimento, geralmente uma mistura de pólen e néctar, ela
deposita o ovo. Em alguns casos, pode ocorrer o compartilhamento do ninho por mais
de uma fêmea durante processos de reativação destes (Garófalo 1985; Augusto &
Garófalo 2004).
O objetivo deste estudo foi averiguar a estrutura sociogenética dos ninhos de
Eulaema nigrita (Lepeletier, 1841), Euglossa cordata (Linnaeus, 1758) e Euglossa
townsendi (Cocherell, 1904). Especial atenção foi dada ao parentesco intranidal, de
forma a estimar, por meio de locos microssatélites, o número de fêmeas e machos
responsáveis pela cria. Além disso, as relações entre o comportamento social e de
nidificação foram contrapostos aos padrões genéticos observados.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram coletados 8 ninhos (N1 - N8) de El. nigrita na área do Campus da
Universidade Federal de São Carlos, construídos no interior de blocos de concreto
(Figura 1). Onze ninhos de Eg. cordata (9 em secções de bambu, 1 em tronco de
eucalipto e um em galho de Bougainville sp.) e 7 ninhos de Eg. townsendi (todos
fundados em secções de bambu), foram coletados na área urbana da cidade de São
Carlos e área rural de Rifaina, e nos Campi da UFSCar de Araras e São Carlos, sendo
mantidos no laboratório à temperatura ambiente até a emergência das crias. As
secções de bambu utilizadas apresentavam comprimento e diâmetro variáveis (Figura
2), e os ninhos construídos em tronco de eucalipto e no galho de Bougainville sp
57
7. Estrutura sociogenética de ninhos
haviam sido anteriormente ocupados por Xylocopa sp. como locais de nidificação
(Figura 3). Ao emergirem, os adultos foram sexados, pesados e congelados à –20ºC
ou mantidos em álcool absoluto. Após a última emergência natural em cada ninho,
aguardou-se um prazo mínimo de dois meses; decorrido este período, as células
fechadas foram abertas com utilização de pinça para verificação do conteúdo.
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DNA total foi extraído a partir de uma das pernas desses indivíduos utilizando
ou extração salina / álcool para indivíduos de emergência natural (Paxton et al. 1996)
ou extração por Chelex 100 (Walsh et al. 1991) para indivíduos mortos. Amplificação
por PCR de locos microssatélites foi realizada utilizando-se primers de El. nigrita e
Eg. cordata marcados com fluorescência (Souza et al., 2007). Os fragmentos gerados
foram analisados em seqüenciador MegaBACE – 750 (GE - Applied BioSystems) de
acordo com o padrão de picos gerado para cada loco.
RESULTADOS
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Biologia de Nidificação
A entrada dos ninhos de El. nigrita apresentou cerca de 1,5 cm de diâmetro,
sendo revestida de barro, formando um pequeno tubo que se iniciava no interior dos
blocos de construção, prolongando-se por cerca de 2,0cm para o exterior, não
excedendo 5,0 cm de comprimento total. O número de células produzidas por ninho
de El. nigrita variou de 1 a 90 (Tabela 1). Nos ninhos onde o número de células
formadas foi muito baixo (N6 e N8), a morte ou o abandono do ninho pela(s) fêmea(s)
deve ser a causa mais provável, pois nestes ninhos foi observada uma célula apical
aberta.
58
7. Estrutura sociogenética de ninhos
Em dois desses blocos contendo ninhos de El. nigrita foram coletadas fêmeas
mortas em seu interior (antes da operculação das células). As análises revelaram que
estas eram as prováveis responsáveis por parte da postura.
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A mortalidade total foi de 65, 19, 22 e 20% nos ninhos N2, N3, N4 e N5,
respectivamente. A alta taxa de mortalidade, em especial para o ninho N2, deveu-se à
entrada de água no interior do bloco, visto que apresentava uma grande rachadura. A
Tabela 1 mostra que não foi observada mortalidade diferencial entre os sexos (p<5%)
. Os níveis de mortalidade em adultos não eclodidos foi de 24, 13, 9 e 9% (ninhos N2,
N3, N4 e N5, respectivamente), de 3% na fase de larva (N4), 2% em fase de pupa
(N5), e a fração restante da mortalidade foi observada em estágio de ovo.
Nos ninhos N1, N2 e N3 observou-se a presença da espécie cleptoparasita
Exaerete smaragdina (Guérin-Méneville, 1845), estando esses indivíduos presentes
nas células mais basais do ninho.
Em dois ninhos (N2 e N3) foi observada ainda a presença de Lasioderme sp.
(Coleoptera: Amobiidae) em algumas células. Este pequeno coleóptero (2 a 3 mm) é
um consumidor de matéria orgânica, sendo um dos principais problemas para os
apreciadores de charutos. Não foi observado, contudo, qualquer dano causado a El.
nigrita.
O início da construção dos ninhos de Eg. cordata e Eg. townsendi foi
verificado pela observação da atividade das fêmeas ingressando nos ninhos ou pela
presença de resina no interior destes. O término das atividades de campo (fêmeas) foi
estimado pela construção da parede de fechamento sem que houvesse ruptura desta
por alguns dias, o que poderia indicar que a fêmea trabalhava em seu interior ou
também abandono/morte da fêmea que construia o ninho.
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7. Estrutura sociogenética de ninhos
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O número de células construídas por ninho e de indivíduos que emergiram
variou de 1 a 14 para os onze 11 ninhos de Eg. cordata e de 1 a 32 emergidos em Eg.
townsendi. Nesta última espécie, um dos ninhos (32 crias) tinha 77 células, ou seja,
mais da metade da postura ali feita já havia emergido quando o ninho foi coletado. A
taxa de mortalidade não foi significativamente diferente entre os sexos nestas
espécies, e a mortalidade nas fases de ovo ou larva foi estimada somente em Eg.
cordata (Tabela 2). Foi observada uma razão sexual de 35 fêmeas: 26 machos (1:1) e
39 fêmeas: 19 machos (2:1) em Eg. cordata e Eg. townsendi, respectivamente. A
mortalidade foi de 1 fêmea, 1 larva e quatro ovos, e 4 fêmeas e 3 machos para Eg.
cordata e Eg. townsendi, respectivamente no total de ninhos (Tabela 2).
Reaproveitamento de ninho foi evidenciado no ninho do qual emergiram os 32
indivíduos referidos anteriormente. O reaproveitamento foi inferido a partir da
diferença de coloração da resina utilizada e do estado das células. Nos demais ninhos,
por se tratarem de bambus e tocos dispostos mais recentemente, não houve indícios de
reaproveitamento de células.
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Genética Intranidal
A análise dos ninhos utilizando marcadores microssatélites revelou a presença
de mais de uma fêmea ovipositando nos ninhos de Eg. nigrita, com exceção de N8
(com apenas duas células), cuja análise revelou se tratar de postura de uma única
fêmea acasalada aparentemente com um só macho.
Considerando o número de alelos e os haplótipos observados nos ninhos, a
análise de cada progênie evidenciou a presença de, pelo menos, 3 (N1), 2 (N2), 8
(N3), 6 (N4) e 7 (N5) fêmeas responsáveis pela postura. Esses números foram
estimados com base nos alelos presentes nos machos em cada um dos locos. Para
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exemplificar, se em um determinado ninho 15 alelos de um certo loco foram
observados nos machos, como estes são produzidos pelas fêmeas e estas podem ter,
no máximo, dois alelos distintos por loco, tem-se que seriam necessárias pelo menos 8
fêmeas para justificar tal resultado.
Com relação aos indivíduos de Ex. smaragdina nascidos dos ninhos N2 e N3,
estes foram também analisados através dos marcadores microssatélites e os resultados
revelaram que estas fêmeas eram provavelmente irmãs completas.
Para os ninhos de Eg. cordata e Eg. townsendi, a análise genética revelou que
a prole deve ser resultante do acasalamento único (monândrico) de uma única fêmea
em 15 dos 18 ninhos analisados. Em um ninho de Eg. cordata e outro de Eg.
townsendi, não foi possível atribuir a maternidade à fêmea que ocupava o ninho no
momento da coleta, e nestes dois ninhos, o número de células formadas foi igual a
dois.
Em relação ao ninho de Eg. townsendi contendo 77 células, a disposição
destas no bambu era em pequenos grupos de células, levemente distantes uns dos
outros e não de forma contínua. Os marcadores microssatélites indicaram uma
tendência de fêmeas diferentes ovipositando cada um destes grupos de células;
contudo, a dificuldade em delimitá-los e de identificar a origem de cada um dos
indivíduos emergidos não nos possibilitou afirmações mais conclusivas. O número
mínimo de fêmeas responsáveis pela postura dos 32 adultos emergidos foi igual a 3,
segundo o número de alelos observados nos machos.
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DISCUSSÃO
Os resultados sobre a biologia de nidificação (arquitetura dos ninhos) aqui
reportados são semelhantes aos descritos por Garófalo (1994) relativos à nidificação
em El. nigrita.
Não foi observada uma causa aparente (exceto água no bloco onde foi
encontrado o ninho N2) que pudesse justificar a alta mortalidade em El. nigrita no
estágio de ovo, ainda que, em muitos tenham sido encontrados fungos no interior
destas células. Embora os ovos não tenham sido diretamente observados, é de se supor
que a postura tenha sido realizada em células aprovisionadas e fechadas. Uma maior
mortalidade foi observada também na fase de ovo por Santos & Garófalo (1994).
A presença de Ex. smaragdina nas primeiras células construídas nos ninhos
N1, N2 e N3 indica que as fêmeas dessa espécie cleptoparasita aproveitam os
momentos iniciais da construção do ninho para estabelecer sua prole, evitando assim,
conflitos diretos com El. nigrita, as quais iniciam os ninhos de forma solitária, mas
podem posteriormente exibir um comportamento comunal (Pereira-Martins 1991).
Diferentemente, Garófalo & Rozen (2001) relataram ataques do parasita Ex.
smaragdina de uma forma contínua a ninhos de El. nigrita, estando presente posturas
tanto nas células mais basais como nas superiores. Esses autores observaram que as
fêmeas de Ex. smaragdina faziam vôos de aproximação de modo a sondar a presença
de fêmeas da espécie hospedeira.Caso não detectassem a presença de El. nigrita, elas
adentravam no ninho para realizar suas posturas; se porventura houvesse alguma
fêmea remanescente, rapidamente Ex. smaragdina deixava o ninho para evitar
confronto. O parasitismo ocorreu mesmo em ninhos onde até cinco fêmeas de El.
nigrita estavam presentes.
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Embora em números absolutos não tenha ocorrido diferença no número de
parasitas nos ninhos N2 e N3 (dois parasitas cada), onde a postura foi feita por n ≥ 2
fêmeas e por n ≥ 8 fêmeas de El. nigrita, respectivamente, o parasitismo foi
relativamente menor em N3.
A maior defensividade do ninho contra predadores e parasitas é suposta como
mecanismo de pressão seletiva que pode ter resultado na mudança de um hábito
solitário para uma vida comunal. Essa maior defensividade não foi observada por
Santos & Garófalo (1994) envolvendo o besouro da espécie Meloetyphlus fuscatus,
um parasita de ninhos de El. nigrita. Esses autores consideraram que a estratégia do
besouro foi a de aumentar a postura de acordo com o maior número de fêmeas nos
ninhos e a reutilização destes.
Os ninhos de El. nigrita analisados parecem apresentar maior defensividade
com o aumento do número de fêmeas no ninho, e o aparente reaproveitamento em N5
(ninho mais antigo) não resultou em incremento na taxa de parasitismo.
O reaproveitamento de ninhos foi observado também em Eg. cordata
(Garófalo 1985) e Eg. townsendi (Augusto & Garófalo 2004), onde um dos aspectos
comuns nessas espécies foi a redistribuição das tarefas do ninho (postura e
forrageamento), sendo que, usualmente a fêmea fundadora desempenhava o papel de
dominante (ovipositora), e quando do desaparecimento da fundadora, tinha início a
disputa pelo papel de ovipositora, geralmente desempenhado pela fêmea mais antiga.
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CONCLUSÕES
Os resultados da análise dos microssatélites corroboram os relatos da literatura
sobre o comportamento social destas espécies. El. nigrita é inicialmente solitária na
fundação de seus ninhos e, posteriormente, novas fêmeas podem se agregar. O
diferencial aqui observado é que o parentesco entre as fêmeas não parece ser fator
determinante para formação e manutenção a longo prazo dessa estrutura nidal (ninhos
novos – N3 e N4 vs. ninhos velhos – N5). Entretanto, são necessárias informações
sobre os demais comportamentos como usurpação de células, divisão de trabalho,
interações agonísticas entre as fêmeas dentro dos ninhos, para que se possa
compreender mais claramente, como esses comportamentos estão relacionados aos
níveis de parentesco observados nos ninhos e prováveis fatores que contribuem na
evolução do comportamento nesta espécie parassocial. O acasalamento único parece
ser a regra em El. nigrita, como observado mais facilmente nos ninhos pequenos,
embora um acompanhamento mais refinado, principalmente envolvendo grandes
posturas, deva ser feito para que tal questão seja totalmente esclarecida.
É interessante notar que em Eg. cordata e Eg. townsendi, o hábito solitário e a
monandria são eventos comuns. Contudo, parece que a segunda espécie se comporta
de forma mais flexível, assemelhando-se ao observado em El. nigrita, ou seja, fêmeas
não aparentadas podem compartilhar o ninho. As pressões e oportunidades de divisão
de ninho podem ter contribuído para estabelecimento dos sistemas sociais e os estudos
envolvendo esse grupo de grande variação comportamental, segundo classificação de
Wilson (1971) e Michener (1974), podem fornecer indícios importantes de como
esses sistemas foram formados.
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7. Estrutura sociogenética de ninhos
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7. Estrutura sociogenética de ninhos
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Tabela 1. Razão sexual e taxa de emergência para oito ninhos de Eulaema
nigrita coletados no interior de blocos de construção no Campus da UFSCar em São
Carlos (SP).
Ninho Espécie Sexo Mortos Total
N1 El. nigrita Macho 8
El. nigrita Fêmea 8
Ex. smaragdina Fêmea 1
N2 El. nigrita Macho 3 7
El. nigrita Fêmea 1 3
Ex. smaragdina Fêmea 2 2
Ovo 7 7
N3 El. nigrita Macho 7 49
El. nigrita Fêmea 1 10
Ex. smaragdina Fêmea 2
Ovo 4 4
N4 El. nigrita Macho 6 55
El. nigrita Fêmea 7
El. nigrita Larva 2 2
Ovo 7 7
N5 El. nigrita Macho 6 69
El. nigrita Fêmea 2 9
El. nigrita Pupas 2 2
Ovo 10 10
N6 El. nigrita Abandonado 1
N7 El. nigrita Não determinado 7
N8 El. nigrita Fêmea 2
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7. Estrutura sociogenética de ninhos
Tabela 2. Razão sexual e taxa de emergência para onze ninhos de Eg. cordata
e sete ninhos de Eg. townsendi coletados em ninhos armadilhas e em ramo de
Bougainville sp. nas cidades de Araras, Rifaina e São Carlos (SP).
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Ninho Espécie Sexo Mortos Total
1288 Eg. cordata Macho 7
* Fêmea 2
T1 Eg. cordata Macho 2
* Fêmea 9
B2 Eg. cordata Macho 5
* Fêmea 1 9
RB1 Eg. cordata Macho 3
Fêmea 3
Larva 1 1
Ovo 1 1
RB2 Eg. cordata Ovo 3 3
RB3 Eg. cordata Fêmea 2
RB4 Eg. cordata Macho 1
Fêmea 1
RB5
Eg. cordata
Fêmea 1
1271
Eg. cordata
Fêmea 1
1570
Eg. cordata
Macho 3
*
Fêmea 5
DMP
Eg. cordata
Macho 3
*
Fêmea 2
849
Eg. cordata
Macho 2
*
486 Eg. townsendi Macho 1 2
Fêmea 1 4
957 Eg. townsendi Macho 1
* Fêmea 2 4
B1 Eg. townsendi Macho 2 8
Fêmea 1 24
1253 Eg. townsendi Macho 1
* Fêmea 1
551 Eg. townsendi Macho 4
* Fêmea 1
935 Eg. townsendi Macho 2
Fêmea 4
919 Eg. townsendi Macho 1
Fêmea 1
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7. Estrutura sociogenética de ninhos
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Figura 1. Ninho de Eulaema nigrita observado no interior de um bloco de
construção. As células foram feitas com a utilização de barro, excremento e resina.
5
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Figura 2. Ninho de Euglossa cordata construído em secção de bambu. As
células, feitas com resina, apresentam coloração bastante variável.
9
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11
Figura 3. Entrada de um ninho de Euglossa cordata construído em um toco de
Eucalyptus sp. anteriormente ocupado por Xylocopa sp.
69
8. Conclusões e Perspectivas
8. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Os marcadores de DNA microssatélites desenvolvidos a partir de amostras de
Eg. cordata e El. nigrita permitiram o estudo populacional em espécies de quatro dos
cinco gêneros de Euglossini (Euglossa, Eulaema, Eufriesea e Exaerete), constituindo
dessa forma, um novo conjunto de marcadores genéticos que permitirá a obtenção de
valiosas informações sobre a estrutura genética das populações e ninhos deste grupo
de abelhas. Estes novos achados, somados aos dados de comportamento, morfologia e
fisiologia, permitirão um amplo conhecimento da biologia e evolução das abelhas
euglossíneas.
Os dados aqui apresentados sobre a presença de machos diplóides nos abelhas
euglossíneas reforçam a idéia de que esses machos não são comuns em populações de
diferentes espécies coletadas em distintas regiões do Brasil, contrastando com as altas
freqüências descritas em outros estudos. A presença desses machos diplóides,
usualmente estéreis, se deve à homozigose do loco sexual. O aumento da ocorrência
desses machos (estéreis) reduz o número efetivo da população, o que leva à
diminuição do número de alelos sexuais, tendo como resultante desse processo
retroalimentado, a extinção da espécie.
A fragmentação ambiental é considerada o principal evento desencadeador
desse processo, onde devido à perda da capacidade de uma dada área em fornecer
suporte adequado, como alimento e locais para nidificação para uma população
grande, são formadas subpopulações, cujo isolamento pode vir a promover
acasalamentos endogâmicos, aumentando assim a freqüência desses machos. O estudo
ora realizado com populações provenientes de uma gama considerável de distintos
ambientes (Floresta Amazônica, Mata Atlântica, Cerrado e áreas urbanas) muitos dos
quais, provenientes de áreas fragmentadas pela ação humana, não corrobora tal
70
8. Conclusões e Perspectivas
proposição, mesmo nas espécies cleptoparasitas Exaerete frontalis e Ex. smaragdina.
A análise genética dos ninhos revelou um baixo parentesco entre as fêmeas
responsáveis pela oviposição na espécie parassocial El. nigrita, permitindo concluir
que um alto nível de parentesco não é fator crucial para o estabelecimento e
funcionamento desses ninhos. Em Eg. cordata e Eg. townsendi, o comportamento
solitário e a monogamia parecem ser pontos comuns entre estas espécies na formação
dos ninhos; porém, na segunda espécie foi observada uma maior flexibilidade, pois o
compartilhamento de ninho por fêmeas não aparentadas (irmãs completas) também foi
observado.
A utilização de locos microssatélites nos estudos populacionais em Euglossini
permitirá verificar, de forma mais acurada, mudanças nos níveis de variação das
espécies ao longo de intervalos de tempo mais curtos, podendo fornecer pistas mais
precisas de como e quanto a fragmentação ambiental tem afetado estas populações.
Sua utilização complementará ainda o conjunto de marcadores genéticos, fornecendo
um número maior de variantes quando comparado às variantes alozímicas.
Ao submeter a nova análise a freqüência na natureza de machos diplóides, os
dados sustentam que a ocorrência destes não é um evento comum. Analisando em
conjunto os dados deste trabalho e os de Takahashi et al. (2001), tem-se que dos 883
indivíduos analisados, no total de 26 espécies, pertencentes a quatro dos cinco gêneros
da tribo, somente dois machos diplóides foram observados. É difícil justificar a
existência de um ambiente ou fatores que, combinados, possam promover os índices
de machos diplóides relatados nas populações do Panamá. Novas populações de
Euglossini de diferentes procedências devem ser analisadas e, caso os altos índices
sejam confirmados, faz-se necessário propor medidas que possam promover a
manutenção de um ambiente propício à preservação e conservação dessas espécies.
71
8. Conclusões e Perspectivas
O comportamento intranidal, fêmeas ovipositoras vs. forrageadoras,
comportamentos agonísticos, cooperação entre fêmeas, monandria vs. poliandria e
relações com a evolução do comportamento social, podem agora ser analisados sob a
luz do parentesco intranidal, o que permitirá explorar melhor os modelos de evolução
do comportamento vs. parentesco nas abelhas.
72
9. Referências
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