( PDF ) Avaliação do uso do ácido linoléico conjugado e da vitamina e na progressão da aterosclerose em camundongos knockout para o receptor de LDL

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ANGÉLICA HERINGER DE REZENDE

AVALIAÇÃO DO USO DO ÁCIDO LINOLÉICO CONJUGADO E

DA VITAMINA E NA PROGRESSÃO DA ATEROSCLEROSE EM

CAMUNDONGOS KNOCKOUT PARA O RECEPTOR DE LDL

VIÇOSA

MINAS GERAIS – BRASIL

2007

Dissertação apresentada à

Universidade Federal de Viçosa,

como parte das exigências do

Programa de Pós-Graduação em

Ciência da Nutrição, para obtenção

do título de Magister Scientiae.

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ANGÉLICA HERINGER DE REZENDE

AVALIAÇÃO DO USO DO ÁCIDO LINOLÉICO CONJUGADO E

DA VITAMINA E NA PROGRESSÃO DA ATEROSCLEROSE EM

CAMUNDONGOS KNOCKOUT PARA O RECEPTOR DE LDL

Aprovada: 20 de julho de 2007

Profª. Maria do Carmo Gouveia Peluzio

(Co-orientadora)

Prof. Sérgio Oliveira de Paula

(Co-orientador)

Profª. Maria Beatriz Abreu Glória

Prof. Clóvis Andrade Neves

_______________________________________

Profª. Céphora Maria Sabarense

Dissertação apresentada à

Universidade Federal de Viçosa,

como parte das exigências do

Programa de Pós-Graduação em

Ciência da Nutrição, para obtenção

do título de Magister Scientiae.

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À minha mãe, exemplo de força.

iii

AGRADECIMENTOS

A Deus, por tornar tudo possível.

À Universidade Federal de Viçosa, especialmente aos professores e funcionários do

Departamento de Nutrição e Saúde.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência da Nutrição.

À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos.

À Profª. Céphora, por acreditar e confiar em mim, até mais que eu mesma. O seu

incentivo e amizade foram fundamentais em todas as etapas do meu aprendizado.

À Profª. Carminha, pelas inestimáveis contribuições na realização deste trabalho e no

meu crescimento profissional.

Ao Prof. Sérgio, pela atenção e pelos conhecimentos compartilhados.

Ao Prof. Clóvis, pela disponibilidade e pela contribuição valiosa nas análises

histológicas e morfométricas.

Aos colegas dos Laboratórios de Bioquímica Nutricional, Análise de Alimentos,

Nutrição Experimental e Análise de Vitaminas: Maria Carol, Nilma, Vanessa, Luiza,

Luiz Fernando, Luana, Fernanda, Mariane, Vânia, Monise, Pollyanna, Michele Netto,

Paloma e Rodrigo, pelas contribuições e pela convivência.

À Déborah, Júlia e Tatiana, pela dedicação nas horas “oficiais” de trabalho e nas

inúmeras horas extras. Obrigada por me ajudarem a concretizar este trabalho.

À Solange, minha mãe de Viçosa, pelos momentos de descontração, pelos conselhos e

pela amizade.

Ao Arnaldo, Clarice, Aline, Marina Maria, Damiana, Poliana e Tati Coura, com os

quais eu sempre pude contar. Sem vocês seria muito mais difícil chegar até aqui.

À minha mãe, Eugenia, e às minhas irmãs, Lígia e Larissa, pelo amor e pela dedicação.

A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho.

BIOGRAFIA

Angélica Heringer de Rezende, filha de Roberto da Silva Rezende e de Eugenia

Inez Heringer Rezende, nasceu em 05 de fevereiro de 1980, na cidade de Caratinga,

Minas Gerais.

Em abril de 2001 iniciou o Curso de Graduação em Nutrição, na Universidade

Federal de Viçosa, concluindo-o em julho de 2005.

Em agosto de 2005, iniciou o curso de mestrado, no Programa de Pós-Graduação

em Ciência da Nutrição, do Departamento de Nutrição e Saúde, concluindo-o em julho

de 2007.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS .......................................................................................... viii

LISTA DE QUADROS E TABELAS ................................................................. ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .......................................................... x

RESUMO ............................................................................................................. xii

ABSTRACT ......................................................................................................... xiii

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 1

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................... 3

2.1 Aterosclerose ......................................................................................... 3

2.2 Camundongos knockout para o receptor de LDL como modelo

experimental ..........................................................................................

2.3 Ácido linoléico conjugado .................................................................... 7

2.3.1 Definição e fontes dietéticas ..................................................... 7

2.3.2 Consumo ................................................................................... 9

2.3.3 Efeitos do CLA na aterosclerose ............................................... 10

2.4 Vitamina E ............................................................................................ 12

2.4.1 Definição e fontes dietéticas ..................................................... 12

2.4.2 Efeitos da vitamina E na aterosclerose ......................................

3 OBJETIVOS ..................................................................................................... 16

3.1 Objetivo Geral ....................................................................................... 16

3.2 Objetivos Específicos ............................................................................ 16

4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 17

4.1 Animais ................................................................................................. 17

4.2. Delineamento Experimental ................................................................. 17

4.3 Dietas .................................................................................................... 19

4.4 Análise dos Lipídios ..............................................................................

4.4.1 Extração dos Lipídios ................................................................

4.4.2 Identificação dos ésteres metílicos dos ácidos graxos ........... 20

4.5 Determinação do colesterol sérico, hepático e fecal ............................. 21

4.6 Avaliação da peroxidação lipídica ........................................................ 21

4.7 Determinação do α-tocoferol ................................................................ 22

4.8 Análise morfométrica ............................................................................ 23

4.9 Análise estatística .................................................................................. 23

5 ARTIGO DE REVISÃO: Os isômeros do CLA são agentes antiaterogênicos?

Evidências sobre o desenvolvimento e regressão das lesões ............................

5.1 Introdução ............................................................................................. 25

5.2 Isômeros do CLA e aterogênese ........................................................... 26

5.3 Isômeros do CLA e regressão da aterosclerose .....................................

5.4 Mecanismos bioquímicos prováveis ..................................................... 28

5.5 Os isômeros do CLA podem ser considerados agentes

antiaterogênicos?.................................................................................

6 ARTIGO ORIGINAL I: Vitamina E, mas não o ácido linoléico conjugado,

reduz a progressão da aterosclerose em camundongos LDLR -/- com lesão

pré-estabelecida .................................................................................................

6.1 Introdução ............................................................................................. 34

6.2 Materiais e Métodos............................................................................... 35

6.2.1 Animais e dietas ........................................................................ 35

6.2.2 Concentração dos lipídios séricos ............................................. 37

6.2.3 Concentração do colesterol hepático e fecal ............................. 37

6.2.4 Determinação do α-tocoferol .................................................... 37

6.2.5 Análise Morfométrica ............................................................... 38

6.2.6 Análise estatística ...................................................................... 38

6.3 Resultados e Discussão ......................................................................... 39

6.3.1 Peso dos animais ....................................................................... 39

6.3.2 Colesterol .................................................................................. 39

6.3.3 Concentrações de α-tocoferol ....................................................

6.3.4 Aterogênese ............................................................................... 45

6.4 Conclusões ............................................................................................ 53

7 ARTIGO ORIGINAL II: Perfil de ácidos graxos teciduais não é alterado

pelo consumo de 10t,12c-CLA e/ou de vitamina E em camundongos LDLR -/-

7.1 Introdução ............................................................................................. 55

7.2 Materiais e Métodos............................................................................... 56

7.2.1 Animais e dietas ........................................................................ 56

7.2.2 Avaliação da peroxidação lipídica ............................................ 57

7.2.3 Análise dos lipídios ................................................................... 57

7.2.3.1 Extração dos lipídios ..................................................... 57

7.2.3.2 Identificação dos ésteres metílicos dos ácidos graxos .. 57

vii

7.2.4 Análise estatística ...................................................................... 58

7.3 Resultados e Discussão ......................................................................... 58

7.3.1 Ganho de peso e consumo alimentar .........................................

7.3.2 Hidroperóxidos hepáticos ......................................................... 60

7.3.3 Perfil de ácidos graxos teciduais ............................................... 61

7.3.3.1 Perfil de ácidos graxos do fígado .................................. 66

7.3.3.2 Perfil de ácidos graxos do tecido adiposo peri-renal .... 68

7.3.3.3 Perfil de ácidos graxos do intestino……....................... 70

7.4 Conclusões ............................................................................................ 73

8 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS................................................................ 73

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 74

viii

LISTA DE FIGURAS

Pag.

Figura 2.1 –

Estruturas das ligações duplas dieno-conjugadas e metileno

interrompidas.........................................................................

Figura 2.2 –

Representação do ácido linoléico e de três dos seus

isômeros conjugados..............................................................

Figura 2.3 –

Estrutura química do α-tocoferol........................................... 12

Figura 4.1 –

Desenho experimental............................................................

Figura 6.1 –

Concentrações hepáticas de colesterol dos grupos controles

e experimentais......................................................................

Figura 6.2 –

Concentrações de α-tocoferol hepático dos grupos controles

e experimentais......................................................................

Figura 6.3 –

Concentração fecal de α-tocoferol, nas fases de indução e

de tratamento, dos grupos controles e experimentais............

Figura 6.4 –

Avaliação morfométrica da maior lesão aterosclerótica de

camundongos LDLR -/-.........................................................

Figura 6.5 –

Perce

ntual de obstrução da aorta de camundongos LDLR

-/- ...........................................................................................

Figura 6.6 –

Histologia da aorta proximal de camundongos LDLR -/-......

Figura 6.7 –

Aspecto histológico da aorta proximal de camundongos

LDLR -/- ...............................................................................

Figura 6.8 –

Histologia da aorta proximal de camundongos LDLR -/-,

após oito semanas de tratamento com CLA e/ou com

vitamina E..............................................................................

Figura 7.1 –

Evolução do peso dos animais dos grupos controles e

experimentais.........................................................................

Figura 7.2 –

Concentração hepática de hidroperóxidos lipídicos dos

grupos controles e experimentais...........................................

Figura 7.3 –

Proporção de ácidos graxos saturados (AGS),

monoinsaturados (AGMI) e poliinsaturados (AGPI) em

diferentes órgãos e tecidos.....................................................

LISTA DE QUADROS E TABELAS

Pag.

Quadro 5.1 –

Efeitos dos isômeros do CLA na aterosclerose

experimental..........................................................................

Tabela 4.1 –

Composição das dietas experimentais (%) ........................... 19

Tabela 6.1 –

Composição da dieta controle (semipurificada).................... 36

Tabela 6.2 –

Composição da dieta de indução (aterogênica)..................... 36

Tabela 6.3 –

Peso corporal (g) e perfil de lipídios séricos (mg/gdL) dos

animais dos grupos controles e experimentais......................

Tabela 6.4 –

Concentração de colesterol fecal (mg/g) dos grupos

controles e experimentais, nas fases de indução (FI) e de

tratamento (FT)...................................................................

Tabela 7.1 –

Peso corporal e consumo alimentar dos animais dos grupos

controles e experimentais......................................................

Tabela 7.2 –

Perfil de ácidos graxos das dietas controles e

experimentais.........................................................................

Tabela 7.3 –

Perfil de ácidos graxos do fígado dos grupos controles e

experimentais.......................................................................

Tabela 7.4 –

Perfil de ácidos graxos do tecido adiposo dos grupos

controles e experimentais......................................................

Tabela 7.5 –

Perfil de ácidos graxos do intestino dos grupos controles e

experimentais.........................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

∑ Somatório

AG Ácido graxo

AGMI Ácido graxo monoinsaturado

AGPI Ácido graxo poliinsaturado

AGS Ácido graxo saturado

Ag+-HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, utilizando coluna

impregnada com nitrato de prata.

ApoB-100 Apolipoproteína B-100

ApoE -/- Deficiência de apolipoproteína E

BHT Butil Hidroxitolueno

CEA Coeficiente de Eficácia Alimentar

CEA

Coeficiente de Eficácia Alimentar aparente dos lipídios

CG Cromatografia gasosa

CLA Ácido linoléico conjugado

COX Ciclooxigenase

HDL Lipoproteína de alta densidade

HepG2 Células de carcinoma hepatocelular, Homo sapiens.

HOO

•

Radical perhidroxil

HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

ICAM-1 Molécula-1 de adesão intercelular

IFN Interferon

IL Interleucina

iNOS Óxido nítrico sintase indutível

LDL Lipoproteína de baixa densidade

LDL-MM LDL minimamente oxidada

LDL-OX LDL oxidada

LDLR -/- Deficiência de receptores de LDL

MCP-1 Proteína-1 quimiotática para monócitos

M-CSF Fator estimulador de colônia de macrófagos

NF-κB Fator nuclear κB

PAF Fator ativador de plaquetas

PBS Solução salina tamponada com fosfato

PGE Prostaglandina E

PPAR Peroxissome Proliferator-Activated Receptor

TNF Fator de necrose tumoral

VCAM-1 Molécula-1 de adesão da célula vascular

VLDL Lipoproteína de muito baixa densidade

xii

RESUMO

REZENDE, Angélica Heringer. M.Sc. Universidade Federal de Viçosa, julho de 2007.

Avaliação do uso do ácido linoléico conjugado e da vitamina E na progressão

da aterosclerose em camundongos knockout para o receptor de LDL.

Orientadora: Céphora Maria Sabarense. Co-orientadores: Maria do Carmo Gouveia

Peluzio, Sérgio Oliveira de Paula e Cristina Maria Ganns Chaves Dias.

Este estudo teve o objetivo de avaliar os efeitos da suplementação com CLA e/ou

com vitamina E na progressão da aterosclerose e no perfil de ácidos graxos teciduais de

camundongos LDLR -/-, um modelo para hipercolesterolemia familiar. Os animais

foram alimentados com dieta semipurificada (CT) ou com dieta aterogênica (AT),

durante seis semanas. Após este período, um grupo sofreu eutanásia para avaliação do

grau de desenvolvimento da aterosclerose e os outros animais foram alimentados por

oito semanas com dieta semipurificada suplementada com 1% de vitamina E (TOC), 1%

de 10t,12c-CLA (CLA) ou com 1% de vitamina E + 1% de 10t,12c-CLA (CLA/TOC).

O peso dos animais foi monitorado semanalmente e o consumo alimentar diariamente.

O perfil de lipídios séricos foi determinado, bem como as concentrações de α-tocoferol

e de colesterol no fígado e nas fezes. A peroxidação lipídica no fígado foi determinada

pela análise de hidroperóxidos. Os perfis de ácidos graxos do fígado, tecido adiposo e

intestino delgado foram analisados por cromatografia gasosa. Avaliou-se a área total da

lesão aterosclerótica e o percentual de obstrução da aorta dos diferentes grupos

experimentais. As concentrações séricas de colesterol total, de LDL e de triacilgliceróis

foram menores nos grupos suplementados com vitamina E. Nestes grupos, a excreção

de colesterol foi maior que nos demais e também foram observadas as maiores

concentrações hepáticas de α-tocoferol. Por outro lado, no grupo suplementado com

vitamina E foi encontrado o maior grau de peroxidação dos lipídios hepáticos. Os perfis

de ácidos graxos dos tecidos refletiram a composição de ácidos graxos das dietas.

Entretanto, em nenhum dos tecidos analisados foi possível identificar a incorporação do

10t,12c-CLA. Aparentemente, o CLA não foi detectado em função da sua rápida

metabolização. Em todos os grupos experimentais, os percentuais de ácidos graxos

poliinsaturados no tecido adiposo e no intestino, foram maiores em relação ao grupo

CT. A utilização isolada do isômero 10t,12c-CLA não impediu o desenvolvimento de

lesões ateroscleróticas na aorta. Por outro lado, a suplementação dietética com vitamina

E, assim como a associação de vitamina E e 10t,12c-CLA, reduziram significantemente

a área total da lesão e o percentual de obstrução da aorta. Demonstrando, assim, a

melhor ação da vitamina E que do 10t,12c-CLA em reduzir a progressão da

aterosclerose, a despeito da sua ação antioxidante.

xiii

ABSTRACT

REZENDE, Angélica Heringer. M.Sc. Universidade Federal de Viçosa, July, 2007.

Assessment of use of conjugated linoleic acid and vitamin E in the

atherosclerosis progression in LDL-receptor knockout mice. Adviser: Céphora

Maria Sabarense. Co-advisers: Maria do Carmo Gouveia Peluzio, Sérgio Oliveira de

Paula and Cristina Maria Ganns Chaves Dias.

This study aimed to evaluate the effects of CLA and/or vitamin E supplementation

in the progression of atherosclerosis and in the fatty acids profile of tissues of LDLR -/-

mice, a model for familial hypercholesterolemia. The animals were fed with a semi

purified diet (CT) or with an atherogenic diet (AT), during six weeks. After this period,

in order to evaluating the atherosclerosis development degree, a group of animals was

euthanized. The other animals were fed during eight weeks later with a semi purified

diet supplemented with 1% of vitamin E (TOC), 1% of 10t,12c-CLA (CLA) or with 1%

of vitamin E + 1% of 10t,12c-CLA (CLA/TOC). The weight and the diet consumption

were monitored weekly and daily, respectively. Fatty acid serum profile was

determined, as well as liver and feces concentrations of α-tocopherol and cholesterol.

Peroxidation in liver was evaluated by hydroperoxides analysis. The fatty acids profiles

of the liver, adipose tissue and small intestine were analyzed by gas chromatography.

The total area of the atherosclerotic lesion and the aorta obstruction percentile were

estimated. Serum lipids profile showed total cholesterol, LDL and triacylglycerols

smaller concentrations in the supplemented with vitamin E groups. In these groups the

cholesterol excretion and the hepatic α-tocopherol concentrations were larger than in

others. However, in the group that received with vitamin E only, was found the biggest

degree of hepatic lipids peroxidation. The fatty acids profiles of tissues reflected the

dietary fatty acids composition. Althought, in none tissues analyzed was possible to

identify the incorporation of 10t,12c-CLA. Probably the CLA was not detected due to

its rapidly metabolization. In all of the experimental groups, the polyunsaturated fatty

acids percentage in the adipose tissue and intestine was larger than in CT group. The

use of 10t,12c-CLA isomer individually did not impede the atherosclerotic lesions

development in the aorta. On the other hand, the dietary supplementation with vitamin

E, as well as the vitamin E and 10t,12c-CLA association significantly reduced the total

area of the atherosclerotic lesion and the aorta obstruction percentile. Showing the better

action of vitamin E than 10t,12c-CLA in reduce the atherosclerosis progression, despite

their antioxidant effect.

Introdução

1 INTRODUÇÃO

As doenças cardiovasculares secundárias à aterosclerose têm elevado

substancialmente as taxas de morbidade e mortalidade, principalmente nos países em

desenvolvimento, como o Brasil (DEPARTAMENTO DE ATEROSCLEROSE DA

SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2007).

Alguns componentes do estilo de vida, particularmente a dieta, têm mostrado

relação direta com os fatores de risco cardiovasculares (HAMER e STEPTOE, 2006). A

promoção do consumo de nutrientes específicos, provenientes de fontes naturais ou de

suplementos, tem recebido considerável atenção. Neste sentido, têm-se relacionado os

benefícios de alguns compostos como, por exemplo, determinados ácidos graxos e

antioxidantes da dieta, nos fatores de risco cardiovasculares.

Estudos sobre o consumo de ácidos graxos monoinsaturados e poliinsaturados,

particularmente, do ácido oléico (ODA et al., 2005), dos ácidos graxos da família

ômega-3 (ODA et al., 2005; ERKKILÄ et al., 2006) e dos ácidos linoléicos conjugados

(LOCK et al., 2005; VALEILLE et al., 2006), têm demonstrado o efeito protetor destes

nutrientes no desenvolvimento das doenças cardiovasculares, uma vez que a fonte e a

natureza dos ácidos graxos são importantes determinantes dos seus efeitos sobre a

saúde. Estes ácidos graxos são capazes de formar lipoproteínas com menor

suscetibilidade à oxidação.

Por outro lado, a utilização de flavonóides (KAPLAN et al., 2001) e de

compostos vitamínicos (ZUREIK et al., 2004), como o β-caroteno (LEVY et al., 2000),

o ácido ascórbico (WANNAMETHEE et al., 2006) e o α-tocoferol (IANNUZZI et al.,

2002; OTERO et al., 2005), também tem se mostrado eficaz em melhorar a saúde

cardiovascular, devido à sua capacidade antioxidante.

Dentre os agentes antioxidantes, os resultados da ação do α-tocoferol ainda são

controversos, o que sugere a necessidade de se ter um consenso quanto à quantidade

deste composto a ser suplementada, considerando a elevada perda pelas fezes e a

possibilidade de haver uma relação inversamente proporcional entre a quantidade

consumida e o percentual absorvido (LOSOWSKY et al., 1972), que seja capaz de atuar

beneficamente sobre os fatores de risco das doenças cardiovasculares.

O interesse pelo consumo de alimentos de origem animal, com alto conteúdo de

gorduras saturadas, tem diminuído devido às recomendações de redução da ingestão

destes nutrientes, como forma de prevenir o desenvolvimento das doenças

Introdução

cardiovasculares. Neste cenário de redução do consumo da gordura de origem animal,

os resultados de vários estudos experimentais têm divulgado o papel dos ácidos

linoléicos conjugados como potentes agentes antiaterogênicos. Desta forma, surge uma

grande expectativa de estimular o consumo dos produtos derivados de ruminantes, já

que estes são fontes naturais destes ácidos graxos (BESSA et al., 2000).

Revisão da Literatura

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Aterosclerose

A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica de origem multifatorial que

ocorre em resposta à agressão endotelial (SOCIEDADE BRASILEIRA DE

CARDIOLOGIA, 2007). Ela se manifesta clinicamente através das doenças

cardiovasculares, que compreendem as doenças cardíacas e as doenças

cerebrovasculares.

As duas principais hipóteses sobre o início do processo aterogênico são a

hipótese da resposta à injúria e a hipótese oxidativa. Segundo a hipótese da resposta a

injúria, proposta por ROSS e GLOMSET (1973), a interrupção da função endotelial

estimula uma série de eventos celulares e vasculares que levam a resposta inflamatória e

finalmente à lesão aterosclerótica.

Já a hipótese oxidativa sugere que o processo aterosclerótico possa ser iniciado

por danos no endotélio vascular, produzidos por modificações oxidativas das partículas

de LDL, o que aumenta sua captação por macrófagos da parede arterial (STEINBERG

et al., 1989).

Estas hipóteses divergem sobre qual seria o evento primário na gênese da

aterosclerose, porém consideram a ocorrência concomitante de reações oxidativas e

inflamatórias no desenvolvimento desta doença.

Antes de serem completamente oxidadas, as partículas de LDL precisam sofrer

algumas modificações. Inicialmente, as LDL nativas contêm apoB-100 e são ricas em

ácidos graxos poliinsaturados e antioxidantes. Quando se tornam minimamente

oxidadas (LDL-MM), estas partículas apresentam os fosfolipídios oxidados na sua

superfície (PARTHASARATHY et al., 1999).

Nesta fase, metade das moléculas de apoB-100 ainda estão intactas, mas as LDL

já perderam ácidos graxos poliinsaturados e compostos antioxidantes. Desta forma, as

LDL não são reconhecidas pelos receptores scavengers dos macrófagos, embora elas

ainda sejam reconhecidas pelos receptores de LDL nativa (MASHIMA et al., 2001).

As LDL-MM podem induzir a expressão de MCP-1 e de M-CSF pelas células

endoteliais e iniciar o recrutamento de monócitos para a parede arterial, promovendo a

diferenciação dos monócitos em macrófagos (VILLA-COLINAYO et al., 2000).

A oxidação adicional das LDL-MM, leva a modificações nas moléculas de

apoB-100, gerando produtos do catabolismo dos peróxidos lipídicos, como os aldeídos.

Revisão da Literatura

Estes produtos interagem com os resíduos de lisina das apoB-100, tornando-as

negativamente carregadas, o que resulta em uma menor afinidade pelos receptores de

LDL nativas e em um aumento da afinidade pelos receptores scavengers (BROWN e

GOLDSTEIN, 1983).

As partículas de LDL completamente oxidadas (LDL-OX) ativam as células

endoteliais, que respondem com a expressão de moléculas de adesão, como a VCAM-1

e ICAM-1, além de MCP-1, que acentua a já iniciada entrada de monócitos na parede

arterial e sua diferenciação em macrófagos pela ação do M-CSF (TAKEI et al., 2001).

As LDL-OX são reconhecidas por receptores scavengers, cuja expressão é

regulada pelo aumento da concentração de colesterol nos macrófagos. A interação de

LDL-OX com os receptores scavengers resulta na rápida captação da lipoproteína pelas

células musculares lisas e macrófagos. A LDL-OX é degradada intracelularmente, o

colesterol livre é esterificado e em seguida armazenado, conferindo às células o aspecto

de espuma (HAKALA et al., 2003; OSTERUD e BJORKLID, 2003).

O acúmulo de lipídios na parede arterial induzirá a liberação de citocinas pró-

inflamatórias pelos macrófagos. Estas citocinas irão promover o recrutamento de

monócitos e o acúmulo de células espumosas (foam cells), que são os tipos celulares

mais comuns nas estrias gordurosas (OSTERUD e BJORKLID, 2003). Este círculo

vicioso de oxidação, modificação das lipoproteínas e inflamação é mantido pela

presença de LDL-OX nas artérias.

A formação e acúmulo de células espumosas caracterizam a estria gordurosa, e

contribuem ainda para o aumento do tamanho da lesão, que pode progredir para uma

lesão intermediária e finalmente para uma lesão complexa (FERREIRA et al., 2007).

Em resumo, a mudança da lesão precoce ou estria gordurosa para a lesão

avançada envolve três processos celulares fundamentais (LUSIS, 2000):

1) entrada contínua de monócitos/macrófagos para o espaço subendotelial e

proliferação de macrófagos, células musculares lisas e possivelmente linfócitos;

2) formação de uma extensa matriz de tecido conjuntivo fibroso e o acúmulo

de células musculares lisas e

3) acúmulo de lipídeos, principalmente na forma de colesterol livre e, em

menor proporção, colesterol esterificado, dentro dos macrófagos e células musculares

lisas.

Revisão da Literatura

Tais processos apresentam características morfológicas específicas, que

diferenciam os estágios de desenvolvimento das lesões.

Baseados nas descrições morfológicas, VIRMANI et al. (2000), propuseram

uma classificação simplificada do desenvolvimento das lesões ateroscleróticas. As

etapas do desenvolvimento dessa lesão seriam representadas em sete categorias:

1) espessamento intimal, descrito como acúmulo normal de células

musculares lisas na íntima com ausência de lipídeos ou células espumosas;

2) xantoma intimal ou estria gordurosa, ocorrendo acúmulo de células

espumosas sem um centro necrótico ou capa fibrosa;

3) espesssamento intimal patológico, lesão aterosclerótica progressiva, com

células musculares lisas em uma matriz rica em proteoglicanas, com área de acúmulo de

lipídeos, sem necrose;

4) ateroma com capa fibrosa, com centro necrótico bem formado e delineado

por uma capa fibrosa. Pode ocorrer trombose luminal, sem nenhuma comunicação do

centro necrótico com o trombo;

5) ateroma com capa fibrosa estreita, infiltrado por macrófagos e linfócitos

com raras células musculares lisas e um centro necrótico;

6) nódulo calcificado, com calcificação nodular eruptiva e placa

fibrocalcificada;

7) placa fibrocalcificada, rica em colágeno com significante estenose;

normalmente contém uma grande área de calcificação e poucas células inflamatórias.

Determinados fatores se associam ao desenvolvimento mais precoce e acelerado

da aterogênese. Segundo SCOTT (2004), dentre estes, estão as dislipidemias, que

constituem fatores de risco modificáveis para a aterosclerose.

As dislipidemias são etiologicamente classificadas em primárias, cuja origem é

genética; e secundárias, que são causadas por outras doenças ou pelo uso de

medicamentos.

As dislipidemias primárias são caracterizadas por um perfil genético de alto

risco (BROWN e GOLDSTEIN, 1986; RAMACHANDRAN et al., 2005), no qual o

fenótipo do perfil lipídico é determinado pela interação entre os fatores genéticos e os

ambientais, incluindo a dieta.

Revisão da Literatura

A hipercolesterolemia familiar, um tipo de dislipidemia primária, é caracterizada

pelo elevado nível de LDL no plasma, pela presença de xantomas e história familiar de

doença arterial coronariana prematura (PUNZALAN et al., 2005). Esta desordem

metabólica hereditária é relativamente comum, com uma incidência de 1/500, sendo

causada por mutações no gene do receptor de LDL (SMILDE et al., 2001). Essas

mutações podem reduzir o número ou prejudicar a função dos receptores de LDL na

superfície das células hepáticas, levando à diminuição do catabolismo das partículas de

LDL, o que resulta na elevação dos níveis plasmáticos dessa lipoproteína (PUNZALAN

et al., 2005).

2.2 Camundongos knockout para o receptor de LDL como modelo experimental

Em camundongos knockout para o receptor de LDL (LDLR -/-) o

desenvolvimento de aterosclerose é similar à hipercolesterolemia familiar humana

(STAPRANS et al., 2000).

Os camundongos são os modelos animais mais utilizados para o estudo dos

lipídios e da aterosclerose. No entanto, nestes animais, as lesões ateroscleróticas

induzidas por dietas extremamente hipercolesterolêmicas são limitadas em tamanho,

complexidade e distribuição. Isto pode ser modificado com o desenvolvimento de

camundongos transgênicos e knockout para determinados genes, os quais podem

produzir efeitos notáveis nas lipoproteínas plasmáticas e nas lesões arteriais até mesmo

na ausência de manipulações dietéticas (FAZIO & LINTON, 2001).

O desenvolvimento dos camundongos LDLR -/- foi descrito por ISHIBASHI et

al. (1993). Estes modelos animais são levemente hipercolesterolêmicos devido à

ausência de receptores de LDL no fígado, o que prolonga a meia vida das partículas de

LDL e VLDL no plasma. Quando consomem dietas potencialmente aterogênicas,

tornam-se gravemente hipercolesterolêmicos, desenvolvem lesões ateroscleróticas ao

longo da aorta e xantomas subcutâneos. As lesões ateroscleróticas, tanto precoces como

tardias, ainda não foram completamente caracterizadas neste modelo animal

(KOWALA et al., 2000). Entretanto, pode ser um modelo particularmente satisfatório

para a investigação dos mecanismos da aterosclerose, bem como para estudos de

intervenção antiaterogênicos (TANGIRALA et al., 1995).

Revisão da Literatura

2.3 Ácido linoléico conjugado

2.3.1 Definição e fontes dietéticas

Ácido linoléico conjugado (CLA) é o termo que designa todos os isômeros

geométricos e de posição do ácido linoléico (PARIZA e HARGREAVES, 1985;

PARODI, 1999).

Ao contrário dos demais ácidos graxos poliinsaturados, que possuem as ligações

duplas separadas por um carbono metilênico, estes ácidos graxos são caracterizados pela

presença de uma estrutura dieno-conjugada (Figura 2.1), na qual as ligações duplas

estão separadas por uma ligação simples carbono-carbono (ARBONÉS-MAINAR et al.,

2006).

Nos ácidos graxos conjugados, cada uma das ligações duplas pode estar na

configuração cis ou trans, ou nas distintas combinações moleculares cis-trans (ROCHE

et al., 2001). Daí a variedade de isômeros conjugados destes ácidos graxos.

Figura 2.1 – Estruturas das ligações duplas dieno-conjugadas (I) e metileno-

interrompidas (II).

As principais formas isoméricas de CLA são o 9c,11t-CLA e o 10t,12c-CLA

(Figura 2.2). O 9c,11t-CLA, ou ácido rumênico, é a forma natural mais abundante de

CLA (PARODI, 1977). Este isômero é formado durante a biohidrogenação ruminal do

ácido linoléico ou, em menor proporção, pela ação da enzima ∆-9 dessaturase sobre o

ácido trans-vacênico (C18:1 11t), no tecido mamário de várias espécies (GRIINARI et

al, 2000), incluindo o homem (TURPEINEN et al., 2002). Portanto, as principais fontes

de CLA na nossa alimentação são os produtos derivados de animais ruminantes, como

as carnes e os produtos lácteos (WAHLE et al., 2004).

Revisão da Literatura

Já o 10t,12c-CLA é encontrado em quantidades menores nas fontes naturais de

CLA, mas em quantidades substanciais nas preparações comerciais (BAUMAN e

GRIINARI, 2001).

Figura 2.2 – Representação do ácido linoléico e de três dos seus isômeros conjugados.

De acordo com JIANG et al. (1996), há uma variação do conteúdo de CLA no

leite, de 2,5 a 17,7 mg/g de gordura. Observa-se que esta variação é sazonal e tem sido

associada a vários fatores, contudo, a dieta é o principal deles, encontrando-se as mais

altas concentrações de CLA quando o animal se alimenta de pastagens frescas e ricas

em ácidos graxos poliinsaturados (BAUMAN e GRIINARI, 2000; COLLOMB et al.,

2002; ADDIS et al., 2005; NUDDA et al., 2005).

Em outros produtos derivados do leite, a concentração de CLA é menor e varia

de 2,5 a 7,0 mg/g de lipídio. Já em sobremesas e iogurtes com teor reduzido de gordura,

o conteúdo de CLA é relativamente baixo, de 0,5 a 1,7 mg/g de lipídio (CHIN et al.,

1992).

O teor de CLA nestes produtos é dependente do seu conteúdo no leite, sendo que

o tipo de processamento parece ter pouco ou nenhum efeito na sua concentração final,

Revisão da Literatura

exceto quando há uma grande redução do teor de gordura. Esta estabilidade do CLA

durante o processamento pode ser decorrente da sua ligação à lactoalbumina ou à

lactoglobulina, que o protegem da isomerização e da oxidação (BANNI e MARTIN,

1998).

2.3.2 Consumo

Devido à conversão endógena do ácido trans-vacênico a 9c,11t-CLA, pela ∆-9

dessaturase, provavelmente a ingestão média de CLA não reflete todo o conteúdo

disponível destes ácidos graxos na dieta de um indivíduo. Estima-se que

aproximadamente 20% do ácido trans-vacênico consumidos sejam convertidos a 9c,11t-

CLA por esta via metabólica (TURPEINEN et al., 2002).

Existem poucas estimativas disponíveis sobre o consumo de CLA (JIANG et al.,

1999; ENS et al., 2001; RITZENTHALER et al., 2001). Além disto, os instrumentos

utilizados na avaliação da ingestão são variáveis entre os estudos, tornando as

comparações mais difíceis.

JIANG et al. (1999), estudando uma população de homens idosos na Suécia,

encontraram um consumo médio de 160,00 mg de CLA por dia. Por outro lado, no

Canadá, em um estudo com um pequeno grupo de jovens, a ingestão média de 9c,11t-

CLA foi estimada em 94,90 ± 40,60 mg/dia, variando entre 15,00 e 174,00 mg/dia (ENS

et al., 2001).

Nos EUA, o consumo total de CLA é estimado em 151,00 ± 14,00 mg/dia para

mulheres e em 212,00 ± 14,00 mg/dia para homens. Quando avaliada somente a

ingestão de ácido rumênico, a estimativa é de 140,00 ± 13,00 mg/dia e 193,00 ± 14,00

mg/dia para mulheres e homens, respectivamente (RITZENTHALER et al., 2001).

A atividade funcional atribuída ao CLA tem incitado o seu consumo. Porém,

devido à variação sazonal do conteúdo de CLA nas suas fontes naturais, a quantidade

habitualmente consumida também é variável.

Uma maior ingestão diária poderia ser conseguida das seguintes formas:

1 – aumentando o consumo de alimentos derivados de animais ruminantes;

2 – aumentando o conteúdo de CLA nestes alimentos;

3 – enriquecendo outros produtos alimentares com CLA;

Revisão da Literatura

4 – utilizando suplementos de CLA na forma de cápsulas.

Com o objetivo de elevar o valor nutritivo e terapêutico dos alimentos derivados

de ruminantes, várias pesquisas vêm sendo conduzidas com o intuito de aumentar o teor

de ácido trans-vacênico e/ou de ácido rumênico destes alimentos (DHIMAN et al.,

1999; ADDIS et al., 2005). Além de prática e viável, esta tem se mostrado a melhor

alternativa para aumentar o consumo de CLA, por prover uma forma natural de

consumo, não interferir na quantidade de alimentos habitualmente consumida pelos

indivíduos e evitar o consumo excessivo destes compostos na forma de suplementos, já

que suas recomendações de ingestão diária ainda não foram estabelecidas.

2.3.3 Efeitos do CLA na aterosclerose

O ácido linoléico conjugado tem sido investigado pelos seus efeitos benéficos na

prevenção e tratamento de uma diversidade de doenças, incluindo a obesidade

(GAULLIER et al., 2007), o diabetes (MOLONEY et al., 2007), o câncer (LEE et al.,

2006; BOCCA et al., 2007) e as doenças cardiovasculares (TOOMEY et al., 2006).

A estes ácidos graxos também têm sido atribuídas atividades anti-inflamatórias,

bem como ações regulatórias sobre o sistema imune (SNEDDON et al., 2006), o

metabolismo lipídico (MITCHELL et al., 2005) e de eicosanóides (IWAKIRI et al.,

2002; URQUHART et al., 2002), a produção de citocinas (LUONGO et al., 2003) e a

expressão de determinados genes (BELURY et al., 2002).

Embora seus mecanismos de ação ainda não estejam totalmente esclarecidos,

sabe-se que as atividades do CLA são mediadas diretamente pelos seus isômeros ou por

meio da ligação destes isômeros a fatores de transcrição específicos, envolvidos em

muitos dos processos metabólicos afetados por eles (WAHLE et al., 2004).

Dentre os numerosos efeitos benéficos relatados sobre o CLA, as suas

propriedades anti-carcinogênicas e anti-obesogênicas têm sido extensivamente

estudadas e, somente nos últimos anos, as propriedades anti-aterogênicas destes ácidos

graxos têm ganhado maior notoriedade.

Os estudos de LEE et al. (1994) e NICOLOSI et al. (1997) foram os primeiros a

relacionar o papel protetor do CLA na formação de lesões ateroscleróticas precoces em

modelos animais. Desde então, vários pesquisadores já demonstraram os efeitos do

Revisão da Literatura

CLA no desenvolvimento e regressão da aterosclerose (KRITCHEVSKY et al., 2004;

VALEILLE et al., 2005; TOOMEY et al., 2006).

Os estudos com animais vêm demonstrando as interferências mais relevantes do

CLA na aterosclerose; entretanto, estes efeitos são variáveis dependendo das espécies

estudadas.

TOOMEY et al. (2006) demonstraram a regressão quase completa da

aterosclerose, em camundongos apo E -/-, após a suplementação com CLA. Em outro

estudo, a suplementação com 9c,11t-CLA impediu, enquanto o isômero 10t,12c-CLA

promoveu o desenvolvimento da aterosclerose neste modelo animal (ARBONÉS-

MAINAR, 2006).

Em coelhos, o CLA também reduz a gravidade das lesões ateroscleróticas, em

diferentes níveis de suplementação (KRITCHEVSKY et al., 2002), entretanto, na

concentração de 1 % da dieta, é capaz de regredir lesões bem estabelecidas na aorta

(KRITCHEVSKY et al., 2000; KRITCHEVSKY et al., 2004), não havendo diferenças

nas ações dos dois principais isômeros (KRITCHEVSKY et al., 2004).

Vários estudos também demonstraram que a suplementação com CLA leva à

redução do desenvolvimento da aterosclerose em hamsters (WILSON et al., 2000;

MITCHELL et al., 2005; VALEILLE et al., 2005).

Estudos in vitro descrevem alguns efeitos importantes do CLA nos mecanismos

moleculares envolvidos na aterogênese. Tem sido demonstrado que o tratamento com

CLA suprime a adesão endotelial de monócitos (SNEDDON et al., 2006) e diminui a

produção de prostaglandinas (IWAKIRI et al., 2002; YU et al., 2002) e outros produtos

pró-inflamatórios, como TNFα, IL-1β e IL-6, nos macrófagos (YU et al., 2002).

Além disto, existem relatos de efeitos seletivos dos principais isômeros do CLA

em determinados mecanismos moleculares, como o aumento da transcrição do gene do

receptor de LDL (RINGSEIS et al., 2006) e a redução da secreção de apolipoproteína B

(STORKSON et al., 2005), em cultura de células HepG2, após tratamento com 10t,12c-

CLA.

De maneira geral, os estudos com seres humanos tentam relacionar o consumo

de CLA com o metabolismo das lipoproteínas, no entanto, seus resultados são bastante

controversos.

Revisão da Literatura

O consumo de CLA tem sido associado com modificações benéficas no perfil de

lipídios séricos (BLANKSON et al., 2000; NOONE et al., 2002). Contudo, alguns

trabalhos não mostram associação (NAUMANN et al., 2006) ou relatam efeitos

divergentes dos principais isômeros do CLA no metabolismo das lipoproteínas

(TRICON et al., 2004).

2.4 Vitamina E

2.4.1 Definição e fontes dietéticas

Vitamina E é o termo utilizado para indicar um grupo de compostos

lipossolúveis intimamente relacionados (tocoferóis e tocotrienóis), cujas moléculas são

constituídas por duas regiões distintas: um núcleo contendo um grupo hidroxil e uma

longa cadeia hidrofóbica (Figura 2.3). Estas peculiaridades estruturais são responsáveis

por suas propriedades físico-químicas e, conseqüentemente, pelo seu papel biológico

(BONGIORNO et al., 2006).

No plasma humano, o α-tocoferol é a principal forma circulante de vitamina E.

Este composto é um potente antioxidante das partículas de LDL e possui a capacidade

de atuar como scavenger dos radicais peroxil, assim como, na quebra da reação em

cadeia associada com a peroxidação lipídica (BURTON e INGOLD, 1989; van AALST,

2004).

Os compostos com atividade de vitamina E são sintetizados apenas pelas

plantas, mas são componentes essenciais da dieta dos animais. Desta forma, eles são

encontrados principalmente nos produtos de origem vegetal e suas principais fontes são

o germe de trigo e os óleos vegetais. Com exceção da gema de ovo, do fígado e do

tecido adiposo, os alimentos de origem animal não são boas fontes da vitamina (BALL,

1998).

Figura 2.3 – Estrutura química do α-tocoferol.

Revisão da Literatura

2.4.2 Efeitos da vitamina E na aterosclerose

De acordo com a hipótese oxidativa, a oxidação das partículas de LDL constitui

o evento primário na patogênese da aterosclerose (STEINBERG et al., 1989). Desta

forma, a LDL-OX tem sido foco de um grande número de investigações devido ao papel

fundamental que esta partícula desempenha na iniciação e progressão das lesões

ateroscleróticas (van AALST, 2004).

Os antioxidantes presentes na dieta, além de proteger a LDL da oxidação, podem

aumentar a capacidade oxidativa das células vasculares e do sistema imune, reduzir o

estresse oxidativo e a resposta inflamatória associada à hipercolesterolemia, reduzindo

desta maneira, o risco de aterosclerose (KOGA et al., 2004).

Ainda que existam controvérsias sobre a utilidade das estratégias antioxidantes

na prevenção das doenças cardiovasculares, o efeito potencial de diferentes

antioxidantes da dieta na prevenção do desenvolvimento e progressão da aterosclerose

tem sido demonstrado em certos modelos experimentais (STEINBERG e WITZTUM,

2002; RODRÍGUEZ et al., 2005).

Assim, existe um grande interesse na busca por agentes antioxidantes capazes de

reduzir o impacto das reações oxidativas na aterosclerose (PELUZIO et al., 2003),

estando a ingestão de alimentos ricos em vitamina E entre os fatores que têm

contribuído para retardar o desenvolvimento desta doença (ÖZER et al., 2006).

Muitos estudos com modelos animais (OTERO et al., 2005; HASTY et al.,

2007) e ensaios clínicos (HODIS et al., 2002; ZUREIK et al., 2004) têm sido

conduzidos para avaliar o papel antioxidante da vitamina E na redução do risco de

desenvolvimento da aterosclerose e, consequentemente, das doenças cardiovasculares.

Em estudos experimentais, a suplementação com vitamina E tem se mostrado

eficaz em reduzir a suscetibilidade das partículas de LDL à oxidação (KHALIL e

MILOCHEVITCH, 2005), em inibir a proliferação de células musculares lisas e

diminuir a captação das LDL-OX na parede arterial (ÖZER et al., 2006), em inibir a

liberação de citocinas pró-inflamatórias (DEVARAJ & JIALAL, 2005) e a agregação

plaquetária (MUROHARA et al., 2004).

Além desses efeitos, de acordo com CYRUS et al. (2001), a vitamina E induz

uma redução significante da aterogênese precoce em modelos animais para

aterosclerose. Em camundongos LDLR -/-, a suplementação com vitamina E reduziu a

progressão das lesões ateroscleróticas, suprimindo reações inflamatórias e oxidativas e

Revisão da Literatura

aumentando os níveis de óxido nítrico. A efetividade da suplementação com vitamina E

neste modelo animal é vista tanto na fase inicial da aterogênese como depois da doença

estabelecida (CYRUS et al., 2003).

No entanto, estudos epidemiológicos com seres humanos não associam

(BUIJSSE et al., 2005) ou associam inversamente (RIMM et al., 1993; STAMPFER et

al., 1993) a ingestão de vitamina E com as doenças cardiovasculares. Já os ensaios do

tipo randomizado e controlado são contraditórios nesta questão e mostram efeitos

benéficos (CARRERO et al., 2005), efeitos mistos (HODIS et al., 2002;

MICHELETTA et al., 2004) e até mesmo a ineficiência da vitamina E nas doenças

cardiovasculares (TÖRNWALL et al., 2004; ZUREIK et al., 2004).

O efeito variável da suplementação com vitamina E na aterosclerose

experimental tem sido objeto de muitos questionamentos. Segundo WEINBERG

(2005), os estudos com animais podem ser mais bem controlados e podem utilizar

medidas mais rigorosas de progressão das lesões ateroscleróticas. Isto poderia explicar,

pelo menos em parte, os efeitos contraditórios relatados em estudos epidemiológicos e

ensaios clínicos, em relação aos estudos que utilizam animais.

Contudo, de acordo com SUARNA et al. (2006), o α-tocoferol tem um impacto

modesto na aterosclerose experimental e seus efeitos são observados somente sob

condições de deficiência grave de vitamina E. Se comparados aos resultados obtidos em

estudos com seres humanos, estes resultados podem explicar porque, muitas vezes, a

suplementação com vitamina E falha em melhorar a saúde cardiovascular quando não

existe deficiência da vitamina.

Por outro lado, de acordo com HASTY et al. (2007), é possível que, em

humanos, o tratamento com vitamina E tenha valor terapêutico somente em indivíduos

com níveis elevados de estresse oxidativo. Assim, sugere-se que as incoerências

encontradas nestes tipos de estudo seriam decorrentes de critérios inconsistentes na

seleção de candidatos ao uso de terapias antioxidantes (VIOLI et al., 2004).

Objetivos

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Avaliar os efeitos da suplementação alimentar com ácido linoléico conjugado

(CLA) e com vitamina E na progressão da aterosclerose em camundongos LDLR-/-,

com lesão precoce instalada.

3.2 Objetivos Específicos

 Identificar a presença e dimensão das lesões ateroscleróticas na raiz da aorta.

 Comparar os efeitos do consumo de CLA e de vitamina E na evolução da lesão

aterosclerótica precoce.

 Avaliar o efeito da associação de CLA e vitamina E na evolução da lesão

aterosclerótica precoce.

 Verificar os efeitos decorrentes da suplementação com CLA e/ou com vitamina E no

perfil dos lipídios séricos.

 Identificar alterações no perfil de ácidos graxos do intestino, do tecido hepático e do

tecido adiposo, decorrentes da suplementação com CLA e com vitamina E.

 Observar o nível de peroxidação lipídica hepática em animais suplementados com

CLA e com vitamina E.

Materiais e Métodos

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Animais

Foram utilizados camundongos LDLR -/-, machos e fêmeas, com seis semanas

de idade, procedentes do biotério do Laboratório de Bioquímica Nutricional (LABIN),

do Departamento de Bioquímica e Imunologia, da Universidade Federal de Minas

Gerais (UFMG). Os animais, com peso médio de 14,2 ± 1,9 g, foram mantidos em

gaiolas individuais de aço inoxidável, em ambiente com temperatura controlada (21 °C

± 1 °C) e fotoperíodo de 12 horas.

4.2 Delineamento experimental

O ensaio biológico foi realizado em duas etapas e teve duração de 14 semanas.

A primeira etapa, ou fase de indução, teve o objetivo de promover o

desenvolvimento de lesões ateroscleróticas precoces nos animais. Nesta etapa, com

duração de seis semanas, os animais foram divididos em dois grupos:

 Grupo CT: dieta semipurificada;

 Grupo AT: dieta aterogênica.

Ao final do período de indução, 10 animais do grupo AT, que constituíram o

grupo AT1, sofreram eutanásia para avaliação do estágio de desenvolvimento das lesões

ateroscleróticas na aorta.

Na segunda etapa, ou fase de tratamento, com duração de oito semanas, os

animais do grupo CT continuaram recebendo dieta semipurificada e os animais do

grupo AT foram divididos em outros cinco grupos:

 Grupo AT2: dieta aterogênica;

 Grupo CLA: dieta semipurificada + 1% de 10t,12c-CLA;

 Grupo TOC: dieta semipurificada + 1% de acetato de vitamina E;

 Grupo CLA/TOC: dieta semipurificada + 1% de 10t,12c-CLA + 1% de acetato

de vitamina E;

 Grupo AT/SP: dieta semipurificada.

Materiais e Métodos

As fezes foram coletadas no início e no final de ambas as etapas do experimento

e armazenadas a – 20 °C até análise.

O consumo das dietas foi monitorado diariamente e a evolução do peso,

semanalmente, para o cálculo do coeficiente de eficácia alimentar (ABDULLAH e

OTHMAN, 2000). Durante todo o período experimental (Figura 4.1), os animais

receberam água e dieta ad libitum, exceto no período de 12 horas anteriores à eutanásia,

quando foram colocados em jejum.

Figura 4.1 – Desenho experimental.

Grupo CT – dieta semipurificada / Grupo AT (AT1 e AT2) – dieta aterogênica/ Grupo CLA – dieta

semipurificada + 1% de 10t,12c-CLA/ Grupo TOC – dieta semipurificada + 1% de acetato de vitamina

E/ Grupo CLA/TOC – dieta semipurificada + 1% de 10t,12c-CLA + 1% de acetato de vitamina E/

Grupo AT/SP – dieta aterogênica (fase de indução) e dieta semipurificada (fase de tratamento).

O tecido adiposo peri-renal, o fígado e o intestino foram removidos, lavados em

PBS, congelados em nitrogênio líquido e mantidos a – 80 °C. Os corações foram

retirados em bloco com a raiz da aorta, perfundidos em solução salina fisiológica e, em

seguida, fixados em solução de formol em PBS (10%).

Materiais e Métodos

O sangue foi coletado por punção na aorta abdominal e centrifugado a 3500 rpm,

por 10 minutos, para obtenção do soro. O soro foi congelado em nitrogênio líquido e

mantido a – 80 °C, até análise.

O experimento seguiu as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação

Animal – COBEA (1991).

4.3 Dietas

A composição das dietas experimentais (Tabela 4.1) foi baseada na dieta

proposta pela Association of Official Analytical Chemistry (A.O.A.C., 1989). Foram

confeccionadas manualmente, congeladas e protegidas da luz até o momento da

utilização. Com exceção da dieta aterogênica, as demais foram isoenergéticas. O CLA

foi obtido na forma de cápsulas que continham, em média, 62,70 ± 2,60 mg de 10t,12c-

CLA/100 mg de óleo.

Tabela 4.1 – Composição das dietas experimentais (%).

Dietas

Ingredientes

Semipurificada

Aterogênica

CLA TOC CLA/TOC

Amido de milho 68 - 68 68 68

Sacarose - 55 - - -

Caseína 20 20 20 20 20

Celulose 1 1 1 1 1

Óleo de soja 5 1 5 5 5

Colesterol - 1 - - -

GVH

- 15 - - -

Mistura vitamínica 1 1 1 1 1

Mistura mineral 5 5 5 5 5

Bitartarato de colina - 1 - - -

CLA

- - 1 - 1

Acetato de vitamina E - - - 1 1

Fonte: AOAC (1989).

Gordura vegetal hidrogenada.

Ácido linoléico conjugado (10t,12c-CLA). Gentilmente cedido por: Rainha Laboratório Nutracêutico

Ltda.

A composição centesimal aproximada das dietas foi determinada utilizando-se as

técnicas descritas pela AOAC (1980) para umidade, extrato etéreo e cinzas. O

nitrogênio total foi determinado pelo método de Kjeldhal. Os glicídios e a fibra

Materiais e Métodos

alimentar foram calculados por diferença, compondo juntos a fração NIFEXT

(Nitrogen-free extract).

4.4 Análise dos lipídios

4.4.1 Extração dos lipídios

Os lipídios dos órgãos e tecidos, bem como das dietas, foram extraídos pelo

método de FOLCH et al. (1957). Os extratos lipídicos foram esterificados para obtenção

dos ésteres metílicos dos ácidos graxos, utilizando o método CBA (Combined base- and

acid-catalyzed methylation method), de acordo com YU et al. (2003).

Neste método, a amostra lipídica foi homogeneizada com 1 mL de NaOH-

MeOH (0,5N) e reagiu em temperatura ambiente. Após 5 minutos, foram adicionados 2

mL de HCl-MeOH (4%) e a reação foi conduzida por mais 5 minutos. A reação foi

interrompida pela adição de 3 mL de água destilada e seus produtos extraídos com 5 mL

de isooctano. O extrato dissolvido em isooctano foi filtrado em funil com sulfato de

sódio anidro, concentrado em atmosfera de nitrogênio e armazenado em frasco âmbar a

– 20 °C até análise cromatográfica.

4.4.2 Identificação dos ésteres metílicos dos ácidos graxos

A identificação dos ésteres metílicos dos ácidos graxos foi realizada por

cromatografia gasosa, comparando-se os tempos de retenção dos ésteres presentes nas

amostras com os dos padrões: FAME mix (Supelco

, EUA), 10t,12c-CLA, 9c,11t-CLA

e 9t,11t-CLA (Matreya

, EUA). O ácido tridecanóico (Sigma-Aldrich

, EUA) foi

utilizado como padrão interno.

Utilizou-se cromatógrafo a gás GC-17A Shimadzu/Class GC, equipado com

detector de ionização de chamas e com coluna cromatográfica de sílica fundida SP-2560

(Biscyanopropil polysiloxane) de 100 m de comprimento e 0,25 mm de diâmetro

interno.

Foram adotadas as seguintes condições de programação:

- Temperatura do detector: 240 °C

- Temperatura do injetor: 240 °C

Materiais e Métodos

- Temperatura da coluna: início a 70 °C, permanecendo nesta temperatura por 4

minutos; aquecimento até 100 °C, a uma taxa de 5 ºC por minuto; aquecimento até 175

°C, a uma taxa de 10 °C por minuto, permanecendo nesta temperatura por 20 minutos;

aquecimento até 225 °C, a uma taxa de 5 °C por minuto, permanecendo nesta

temperatura por 27,5 minutos.

O gás de arraste foi o nitrogênio, com fluxo da coluna de 1,47 mL/minuto,

velocidade linear de 22,96 cm/segundo, split de 1:20, fluxo total de 35 mL/minuto e

pressão da coluna de 257 Kpa.

4.5 Determinação do colesterol sérico, hepático e fecal

O colesterol total foi quantificado por método enzimático (ALLAIN et al., 1974)

e sua concentração sérica foi determinada a partir da absorbância do padrão de

colesterol (200 mg/dL). A dosagem de colesterol hepático e fecal foi feita a partir dos

seus respectivos extratos lipídicos retomados em 1,5 mL de álcool isopropílico.

A concentração de triacilgliceróis foi determinada enzimaticamente, sendo que

os valores encontrados foram divididos por quatro, para obtenção das concentrações da

fração VLDL. A fração HDL foi obtida por determinação direta (WARNICK et al.,

2001) e a fração LDL, por diferença entre as concentrações de colesterol total e as de

HDL e VLDL.

Foram utilizados kits comerciais (Bioclin

, Brasil), gentilmente cedidos pela

empresa Quibasa Química Básica Ltda.

4.6 Avaliação da Peroxidação lipídica

A medida do grau de peroxidação lipídica foi realizada pelo método FOX-2

(NOUROOZ-ZADEH et al., 1994) e incluiu a realização de dois ensaios.

No primeiro ensaio, uma alíquota de 45 µL de homogenato do tecido hepático

reagiu durante 30 minutos com solução de trifenilfosfina em metanol. Em seguida,

foram adicionados 450 µL do reagente FOX-2 e a reação prosseguiu por mais 30

minutos em temperatura ambiente. No segundo ensaio, uma alíquota de 50 µL do

homegenato reagiu durante 30 minutos com 450 µL do reagente FOX-2.

Materiais e Métodos

O reagente FOX-2 foi preparado imediatamente antes da sua utilização,

adicionando-se nove partes de solução de BHT em metanol (1%), a uma parte de

solução de alaranjado de xilenol e sulfato ferroso amoniacal em ácido sulfúrico.

Após as reações, as amostras foram centrifugadas a 12000 rpm, durante 5

minutos e os sobrenadantes foram lidos em leitor de placa de ELISA, a 560 nm, contra

um branco contendo tampão PBS.

Considerou-se um Coeficiente de Extinção Aparente igual a 4,3 x 10

-1

o cálculo da concentração de hidroperóxidos foi realizado utilizando a seguinte fórmula:

[Hidroperóxidos] = Absorbância = [ ] nmol

(4,3 x 10

) x 10

Para a quantificação dos hidroperóxidos lipídicos, subtraíram-se os valores

encontrados no segundo ensaio pelos encontrados no primeiro.

4.7 Determinação do α-tocoferol

A extração do α-tocoferol das amostras de fígado e fezes foi realizada baseando-

se no método de UEDA e IGARASHI (1990). A determinação da concentração de α-

tocoferol foi feita por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), com detector

espectrofotométrico UV-visível de arranjo de diodos (Shimadzu), utilizando a coluna

Lichrospher, RP-18 (4,0 x 250 mm, 5 µm). A fase móvel consistiu de uma solução de

acetonitrila, metanol e hexano na proporção de 3:95:2, com fluxo de 1 mL/minuto e

tempo total de corrida de 10 minutos. O comprimento de onda no detector, 295 nm, foi

o correspondente à absorbância máxima do α-tocoferol.

O padrão vitamínico foi preparado dissolvendo-se 10 mg de α-tocoferol (Sigma-

Aldrich

, EUA) em etanol a 96%, resultando em uma solução estoque com

concentração de 10 µg/mL. Procedeu-se a varredura para confirmação do espectro de

absorção da solução padrão na faixa ultravioleta, utilizando os comprimentos de onda

de 190 a 350 nm. O cálculo da concentração real da solução padrão foi feito utilizando-

se o coeficiente de absortividade molar (E1%1cm) = 70,8.

Materiais e Métodos

As concentrações de α-tocoferol das amostras de fígado e fezes foram expressas

em µg/100g e calculadas a partir da curva padrão do α-tocoferol, obtida por regressão

linear.

4.8 Análise morfométrica

Foram utilizados cinco animais de cada grupo experimental, escolhidos ao

acaso. O coração foi separado da aorta torácica e abdominal, fixado em formol

tamponado 10% e processado para inclusão em parafina. Foram feitos cortes

consecutivos de 10 µm de espessura na região da válvula aórtica e montadas de seis a

oito lâminas por animal, contendo em média 25 seções de aorta em cada lâmina. As

lâminas foram codificadas e coradas por hematoxilina e eosina (H/E).

O tamanho da lesão aterosclerótica e a avaliação do percentual de obstrução da

aorta foram avaliados em dez cortes, tomando sempre como referência a presença da

válvula aórtica.

A partir da identificação da válvula aórtica, a cada 30 µm era selecionado um

corte. Assim, foi percorrida uma extensão média de 300 µm e os cortes analisados

foram sempre intercalados por dois cortes consecutivos, de acordo com a técnica de

PAIGEN et al. (1987) modificada por PORTUGAL et al., (2004).

O cálculo do tamanho da lesão aterosclerótica de cada animal foi feito pela soma

das áreas dos dez cortes selecionados. O percentual de obstrução da aorta foi calculado

pela fórmula: [(∑ áreas das lesões / ∑ áreas da aorta) x 100].

A captura das imagens foi feita em microscópio Olympus, acoplado a vídeo-

câmera (Objetivas: 4x e 20x / Bin = 1). Para medida das áreas das seções da aorta

utilizou-se o software Image Pro Plus

, versão 4.5.

4.9 Análise Estatística

Foi utilizado o software SigmaStat

, versão 3.0 para a análise estatística. O teste

de normalidade utilizado foi o de Kolmogorov-Smirnov.

Para as comparações entre três ou mais grupos independentes, foi utilizada a

análise de variância (ANOVA), complementada pelo teste de comparações múltiplas de

Materiais e Métodos

Tukey e quando os dados não apresentaram distribuição normal, utilizou-se o teste de

Kruskal-Wallis, complementado pelo teste de Dunn’s.

Na análise morfométrica, além dos testes citados, foi utilizado o teste t, para

comparação entre dois grupos independentes e o teste t pareado, para avaliação da

evolução das lesões entre os grupos AT1 e AT2.

O nível de significância utilizado foi de 95 %, com o valor de p < 0,05. Os

resultados foram expressos como média ± desvio-padrão.

Artigo de Revisão

5 ARTIGO DE REVISÃO:

Os isômeros do CLA são agentes antiaterogênicos?

Evidências sobre o desenvolvimento e regressão das lesões.

Resumo

Ácido linoléico conjugado (CLA) é o termo que designa todos os isômeros geométricos

e de posição do ácido linoléico. A estes compostos têm sido atribuídos efeitos

importantes no desenvolvimento e na regressão da aterosclerose. A maioria dos estudos

nesta área era conduzida utilizando misturas com quantidades iguais dos seus dois

principais isômeros, 9c,11t-CLA e 10t,12c-CLA. Contudo, a necessidade de se conhecer

qual a participação de cada um destes ácidos graxos no tratamento e/ou prevenção da

aterosclerose, tem incentivado pesquisas com estes isômeros na forma isolada, o que

tem contribuído para o esclarecimento de muitas das discrepâncias encontradas nos

estudos que utilizaram misturas isoméricas. Evidências encontradas nos estudos mais

recentes sugerem que ambos os isômeros exercem atividades biológicas importantes na

aterosclerose, entretanto, seus mecanismos de ação ainda não foram totalmente

elucidados.

Palavras-chave: ácido linoléico conjugado, aterogênese, regressão da aterosclerose,

aterosclerose experimental.

Artigo de Revisão

5.1 Introdução

O termo ácido linoléico conjugado (CLA) é utilizado para designar todos os

isômeros geométricos e de posição do ácido octadecadienóico (PARIZA e

HARGREAVES, 1985; PARODI, 1999). São caracterizados por possuírem as ligações

duplas separadas por uma ligação simples carbono-carbono, produzindo uma estrutura

dieno-conjugada (ARBONÉS-MAINAR et al., 2006).

A forma natural mais abundante de CLA é o 9c,11t-CLA (PARODI, 1977),

também chamado de ácido rumênico, que é formado no rúmen durante a

biohidrogenação incompleta do ácido linoléico. Pode ser formado também pela ação da

∆-9 dessaturase sobre o ácido trans-vacênico no tecido mamário de várias espécies,

incluindo o homem (GRIINARI et al, 2000). Desta forma, os alimentos derivados de

animais ruminantes (carnes e produtos lácteos) são as principais fontes de CLA da dieta

(WAHLE et al., 2004).

O 10t,12c-CLA é encontrado em quantidades menores nos produtos derivados

de ruminantes, entretanto, as preparações comerciais contêm quantidades substanciais

deste isômero. O 9c,11t-CLA e o 10t,12c-CLA são, quantitativamente, as principais

formas isoméricas do CLA (BAUMAN e GRIINARI, 2001).

Vários efeitos biológicos importantes foram atribuídos ao CLA, incluindo

controle da composição corporal e metabolismo energético (GAULLIER et al., 2004),

modulação da resposta imune (SNEDDON et al., 2006), efeitos anti-carcinogênicos

(PARODI, 1999; BOCCA et al., 2007) e anti-aterogênicos (VALEILLE et al., 2006).

Entretanto, como o CLA não é uma substância única, esta variedade de atividades

biológicas provavelmente não é resultado da ação de um único isômero, já que

potencialmente cada um deles possui propriedades distintas (PARIZA et al., 2000).

Com a disponibilidade dos principais isômeros do CLA na forma purificada e a

um preço razoável, é possível determinar se os efeitos na aterosclerose podem ser

atribuídos a um isômero específico ou se ambos exercem efeitos antiaterogênicos

(KRITCHEVSKY et al., 2002). A utilização destas formas isoméricas isoladas tornou-

se uma área em expansão na pesquisa científica.

Evidências têm sugerido que ambos os isômeros exercem atividades biológicas

importantes e que estes não são biologicamente equivalentes. Em particular, o interesse

sobre a ação desses compostos na aterosclerose tem recebido considerável atenção. Esta

Artigo de Revisão

revisão considera observações nesta área, limitando-se aos resultados relacionados aos

dois principais isômeros do CLA.

5.2 Isômeros do CLA e aterogênese

Os relatos sobre os efeitos potenciais do CLA na aterogênese são relativamente

recentes. Os estudos de LEE et al. (1994) e NICOLOSI et al. (1997) foram uns dos

primeiros a relacionar o papel protetor do CLA na formação de lesões ateroscleróticas

precoces. Embora MUNDAY et al. (1999) tenham demonstrado a formação de estrias

gordurosas após a suplementação com CLA, posteriormente, outros pesquisadores

mostraram que níveis destes compostos, tão baixos como 0,05 %, já exercem alguma

ação inibitória no desenvolvimento experimental da aterosclerose (KRITCHEVSKY et

al., 2002).

Efeitos específicos de isômeros do CLA também têm sido demonstrados em

camundongos (TOOMEY et al., 2003; ARBONÉS-MAINAR et al., 2006; NESTEL et

al., 2006), coelhos (KRITCHEVSKY et al., 2004) e hamsters (MITCHELL et al., 2005;

VALEILLE et al., 2005).

Em camundongos apoE -/-, os principais isômeros do CLA apresentaram efeitos

divergentes nos componentes celulares e moleculares envolvidos no desenvolvimento e

estabilidade das lesões. O 10t,12c-CLA induziu a manifestação de determinadas

características, como a presença de menor conteúdo de colágeno e células musculares

lisas, que estão presentes em lesões mais vulneráveis à formação de trombos. Além

disso, este isômero promoveu o desenvolvimento de um maior número de focos de

lesões na aorta, exercendo um efeito pró-aterogênico acentuado. Já o 9c11t-CLA

impediu o desenvolvimento da aterosclerose (ARBONÉS-MAINAR et al., 2006).

KRITCHEVSKY et al. (2004) confirmaram o efeito das misturas isoméricas do

CLA em reduzir o desenvolvimento da aterosclerose experimental em coelhos e

verificaram que tanto o isômero 9c,11t-CLA, como o 10t,12c-CLA, exercem efeitos

similares, com reduções de 48 % a 62 % na gravidade das lesões.

Quando comparado ao ácido linoléico, cada isômero individual do CLA exerceu

efeitos protetores na aterosclerose, reduzindo substancialmente a freqüência de lesões

em hamsters; no entanto, este efeito não se correlacionou com modificações benéficas

no perfil das lipoproteínas plasmáticas (MITCHELL et al., 2005).

Artigo de Revisão

Contudo, WILSON et al. (2006) estudando o acúmulo de colesterol na aorta de

hamsters hipercolesterolêmicos, verificaram a tendência do isômero 10t,12c-CLA em

aumentar o depósito de colesterol no arco aórtico, enquanto o 9c,11t-CLA e o ácido

linoléico reduziram o acúmulo de colesterol. Diminuir a deposição de colesterol na

aorta pode contribuir para a redução do desenvolvimento da aterosclerose.

5.3 Isômeros do CLA e regressão da aterosclerose

O primeiro relato de regressão substancial de lesões ateroscleróticas, atribuída

exclusivamente à dieta, foi feita por KRITCHEVSKY et al. (2000). Eles demonstraram

que após o estabelecimento da aterosclerose em coelhos, a isenção de colesterol da dieta

e a suplementação com 1 % de CLA levava à redução de 31 % das lesões no arco

aórtico e de 30 % na aorta torácica.

Em 2006, TOOMEY et al. relataram a regressão quase completa da aterosclerose

em camundongos apoE -/- que receberam dietas suplementadas com 1 % de CLA. Este

estudo utilizou misturas dos principais isômeros do CLA e, embora tenha utilizado uma

maior proporção (80 %) de 9c,11t-CLA, não esclareceram a contribuição de cada

isômero, individualmente, na regressão das lesões ateroscleróticas.

Ainda existem poucos estudos sobre a ação de isômeros específicos do CLA na

regressão da aterosclerose. Além disto, os efeitos até hoje descritos são variáveis de

acordo com as espécies estudadas. Apesar dos relatos sobre a atuação de isômeros

específicos do CLA no desenvolvimento da aterosclerose em hamsters, do nosso

conhecimento, nenhum estudo até o momento foi capaz de confirmar a ação destes

isômeros na regressão da aterosclerose neste modelo animal.

Além disto, os estudos que

demonstraram tal efeito restringem-se àqueles que utilizam coelhos ou camundongos

apoE -/- como modelo experimental.

No estudo de KRITCHEVSKY et al. (2004), os isômeros 9c,11t-CLA e 10t,12c-

CLA promoveram 59 % e 65 %, respectivamente, de regressão de lesões pré-

estabelecidas na aorta. Os resultados demonstraram que, em coelhos e no nível de

suplementação de 1 % da dieta, os efeitos dos dois principais isômeros do CLA foram

similares na regressão da aterosclerose.

Além de retardar a formação de novas lesões, a administração de 9c,11t-CLA

(1 %) em camundongos apoE -/- induziu significativamente a regressão de lesões pré-

estabelecidas na aorta (TOOMEY et al., 2003). Já em camundongos apoE -/- diabéticos,

Artigo de Revisão

a suplementação com 0,9 % de 9c,11t-CLA não foi capaz de reduzir a gravidade das

lesões (NESTEL et al., 2006). Outros processos patológicos podem afetar a progressão

das placas ateroscleróticas (ARBONÉS-MAINAR et al., 2006) e, nestas condições,

pode ser necessário um nível de suplementação mais elevado para obtenção de

resultados semelhantes na regressão da aterosclerose.

5.4 Mecanismos bioquímicos prováveis

Várias hipóteses têm sido testadas para determinar os mecanismos pelos quais os

isômeros do CLA podem alterar a progressão da aterosclerose. No entanto, algumas

proposições são insuficientes para explicar os efeitos múltiplos e complexos do CLA na

homeostase vascular (ARBONÉS-MAINAR et al., 2006). Talvez, a dificuldade em

propor um mecanismo único seja devido aos efeitos diferentes produzidos pelos seus

principais isômeros, e à falta de dados que comprovem algum efeito sinérgico ou

antagônico entre eles.

Durante algum tempo, acreditou-se que a ação antiaterogênica do CLA fosse

devido ao seu papel como agente antioxidante. No entanto, cada vez mais estudos vêm

confirmando que o CLA não possui esta habilidade (FLINTOFF-DYE e OMAYE,

2005), apesar de alguns autores afirmarem o contrário (YU, 1991; YU et al., 2002a).

Os mecanismos de ação do CLA ainda são passíveis de muitas discussões e

pesquisas, no entanto também não parecem envolver modificações no perfil de

lipoproteínas plasmáticas e efeitos na peroxidação lipídica. Fundamentalmente, estes

efeitos dos isômeros do CLA têm sido associados à sua ação anti-inflamatória (YU et

al., 2002b; MÜLLER et al., 2005), que está relacionada com o papel regulatório destes

compostos na expressão de determinados genes (UAUY et al., 2000).

Alguns dos mecanismos moleculares envolvidos na atividade antiaterogênica do

CLA têm sido relatados; tais como a redução da síntese de eicosanóides (IWAKIRI et

al., 2002) e a ativação de PPARα (MOYA-CAMARENA et al., 1999; TOOMEY et al.,

2006) e de PPARγ (SCHLESER et al., 2006; TOOMEY et al., 2006), fatores de

transcrição que induzem a diminuição da expressão de citocinas pró-inflamatórias, por

exercerem ações antagônicas ao NF-κB (CHENG et al., 2004).

A superprodução de certos eicosanóides, como as PGE

, derivadas do ácido

araquidônico, está associada com distúrbios na homeostase vascular (GERRITSEN,

1996). A inibição da síntese desta prostaglandina pelo CLA envolve a redução da

Artigo de Revisão

conversão de ácido araquidônico a PGE

mediada principalmente pela supressão da

transcrição da COX-2 (IWAKIRI et al., 2002).

O promotor da COX-2 contém vários elementos de resposta, incluindo uma

proteína de ligação ao NF-κB, e sua expressão é induzida nos sítios de inflamação em

resposta a citocinas e fatores de crescimento (von KNETHEN et al., 1999). Contudo,

segundo TOOMEY et al. (2003), a inibição seletiva da COX-1, mas não da COX-2,

pelo CLA inibe o desenvolvimento da aterosclerose, mas não tem efeito na regressão de

lesões pré-estabelecidas.

Em outro estudo, após a suplementação com CLA houve aumento da expressão

de PPARα e de PPARγ na aorta, entretanto, os CLA não inibiram a geração de

prostaglandinas mediada pelas COX (TOOMEY et al., 2006).

Já no estudo de YU et al. (2002b), o CLA diminuiu a expressão de COX-2,

iNOS e TNFα e, conseqüentemente, a produção de PGE

, TNFα e óxido nítrico em

células RAW (RAW264.7 mouse macrophage cells) tratadas com INFγ. Além disto,

outras citocinas pró-inflamatórias como as interleucinas IL-1β e IL-6 tiveram sua

expressão reduzida após o tratamento com CLA.

A indução do NF-κB é uma etapa crítica para a expressão de moléculas de

adesão e de outros marcadores inflamatórios (COLLINS et al., 1995). Sua atividade é

regulada negativamente pelo PPARγ, desta forma, os ligantes deste receptor exercem

seus efeitos anti-inflamatórios reduzindo a expressão de moléculas de adesão, a adesão

de monócitos e a liberação de citocinas (DUVAL et al., 2002).

Os ácidos graxos de cadeia longa, incluindo o ácido linoléico e o ácido

araquidônico, são conhecidos ligantes e ativadores dos PPAR (KLIEWER et al., 1997),

e os isômeros do CLA compartilham com esses ácidos graxos esta similaridade

funcional (MOYA-CAMARENA et al., 1999; YU et al., 2002b).

De acordo com SNEDDON et al. (2006), o PAF desempenha um papel central

na adesão de monócitos ao endotélio. Estes autores demonstraram que a ação anti-

inflamatória do CLA, representada pela supressão da interação entre os monócitos e as

células endoteliais, é mediada através da menor presença de fosfolipídios pró-

inflamatórios, como o PAF, nas membranas das células endoteliais. Neste estudo, o

CLA inibiu a ligação dos monócitos às células endoteliais em 40 %, sendo que o

isômero 10t,12c-CLA suprimiu a adesão entre estas células em uma resposta dose-

dependente.

Artigo de Revisão

Ao contrário, outro estudo demonstrou que o tratamento com isômeros do CLA

em células HAEC (human aortic endothelial cells) não modulou a expressão induzida

por citocinas, de ICAM-1, VCAM-1 e selectina-E, bem como a adesão de monócitos

U937 e a secreção de MCP-1. Além disto, os isômeros do CLA aumentaram a atividade

do PPARγ, mas não alteraram a atividade de ligação ao NF-κB neste modelo celular de

experimentação (SCHLESER et al., 2006).

5.5 Os isômeros do CLA podem ser considerados agentes antiaterogênicos?

Os estudos que utilizaram isômeros isolados do CLA (Quadro 5.1) podem

explicar algumas das discrepâncias encontradas na literatura, visto que aqueles estudos

que utilizaram misturas de isômeros, não elucidaram qual destas moléculas foi

responsável pelos efeitos observados na aterosclerose.

Os principais isômeros do CLA têm sido relacionados com modificações

benéficas no desenvolvimento da aterosclerose, entretanto, algumas observações

relatadas nos estudos experimentais ainda são controvertidas. Além disto, a quantidade

de CLA necessária para impedir a aterogênese e suprimir estrias gordurosas na aorta,

talvez seja variável em função das espécies estudadas e da concentração de colesterol

das dietas (KRITCHEVSKY et al., 2004).

Um aspecto importante é que diversas metodologias têm sido empregadas para

avaliar as lesões ateroscleróticas na aorta, incluindo a classificação visual das lesões, a

coloração dos lipídios en face e a morfometria de seções histológicas da aorta, o que

dificulta a comparação entre os estudos.

No caso de estudos com seres humanos, além das questões éticas envolvidas,

existe também a dificuldade técnica em se avaliar o desenvolvimento da aterosclerose,

tendo como parâmetro somente as análises bioquímicas. Outro fator a ser considerado é

que a quantidade de CLA disponível na alimentação humana está normalmente muito

aquém dos níveis de suplementação utilizados nos estudos experimentais com animais.

Apesar dos avanços alcançados nos últimos anos em relação ao papel dos

principais isômeros do CLA na patogênese e no tratamento da aterosclerose, ainda

existem muitas pesquisas a serem desenvolvidas para se avaliar os resultados em longo

prazo e estabelecer níveis seguros de suplementação para seres humanos. Desta forma,

ainda não é possível afirmar que os isômeros do CLA sejam antiaterogênicos ou mesmo

que, ao contrário de muitas evidências até hoje encontradas, sejam agentes aterogênicos.

Artigo de Revisão

Deve-se ter bastante cuidado ao se recomendar o uso de determinado composto

ou substância. As evidências experimentais são pouco conclusivas em se tratando dos

mecanismos moleculares e não existe uma padronização de protocolo para que haja

correlação. Além disso, os modelos estudos nem sempre são passíveis de comparação

com os seres humanos em relação à formação e evolução das lesões.

Artigo de Revisão

Quadro 5.1 – Efeitos dos isômeros do CLA na aterosclerose experimental.

Modelos animais Objetivo

Parâmetro de

avaliação

Período de

suplementação

Tipo de CLA Resultados Referências

Camundongos apoE -/-

Regressão da

aterosclerose

Área das seções da aorta 16 semanas 1 % 9c,11t-CLA;

9c,11t-CLA retardou o

desenvolvimento e

induziu a regressão das

lesões na aorta.

TOOMEY et al

2003.

Camundongos apoE -/-

Desenvolvimento da

aterosclerose

Área das seções da aorta 12 semanas

Quantidades equivalentes

dos 2 isômeros (± 0,85 %)

9c,11t-CLA impediu e

10t,12c-CLA promoveu

o desenvolvimento da

aterosclerose.

ARBONÉS-

MAINAR et al,

2006.

Camundongos apoE -/-

diabéticos

Desenvolvimento da

aterosclerose

Método en face 20 semanas 0,9 % 9c,11t-CLA

O 9c,11t-CLA não

reduziu a gravidade das

lesões na aorta.

NESTEL et al,

2006

Camundongos apoE -/-

Regressão da

aterosclerose

Área das seções da

aorta/ método en face

16 semanas

1% CLA (80 % 9c,11t-CLA

e 20 % 10t,12c-CLA)

Regressão quase

completa (> 90 %) das

lesões.

TOOMEY et al,

2006.

Coelhos

(New Zealand)

Avaliar progressão e

regressão da

aterosclerose

Escala visual (0-4)

Estudo de progressão: 12

semanas

Estudo de regressão: 12

semanas

0,5 % 9c,11t-CLA;

0,5 % 10t,12c-CLA;

0,5 % Mistura de isômeros

Efeitos iguais dos

isômeros em inibir a

evolução e em

promover a regressão

da aterosclerose.

KRITCHEVSKY

et al, 2004.

Hamsters

(Syrian Golden)

Desenvolvimento da

aterosclerose

Área das seções da aorta 12 semanas

1 % 9c,11t-CLA;

1 % 10t,12c-CLA ou

1 % ácido linoléico

Efeitos iguais dos

isômeros com menor

formação de estrias

gordurosas. *

MITCHELL et al.,

2005.

Hamsters

(Syrian Golden)

Acúmulo de colesterol

na aorta

Concentração de

colesterol na aorta

12 semanas 0,37 % 9c,11t-CLA

Atenuação de sinais de

aterosclerose precoce

VALEILLE et al.,

2005.

Hamsters

(Syrian Golden)

Acúmulo de colesterol

na aorta

Concentração de

colesterol na aorta

12 semanas

0,5 % 9c,11t-CLA;

0,5 % 10t,12c-CLA ou

0,5 % ácido linoléico

9c,11t-CLA e ácido

linoléico reduziram e

10t,12c-CLA aumentou

o acúmulo de colesterol

na aorta *

WILSON et al.,

2006.

* Diferença não significante.

Artigo Original I

6 ARTIGO ORIGINAL I

Vitamina E, mas não o 10t,12c-CLA, reduz a progressão da

aterosclerose em camundongos LDLR -/- com lesão pré-estabelecida

Resumo

Introdução: Evidências comprovam a ocorrência de reações inflamatórias e oxidativas

na aterosclerose. O ácido linoléico conjugado, um conjunto de isômeros geométricos e

de posição do ácido octadecadienóico, tem sido relacionado com a redução da

progressão da aterosclerose, devido à sua ação antiinflamatória. Por outro lado, a ação

antioxidante da vitamina E também tem revelado efeitos benéficos importantes na

aterosclerose. Objetivo: Avaliar os efeitos da suplementação com CLA e/ou com

vitamina E na progressão da aterosclerose experimental. Materiais e métodos:

Camundongos LDLR -/- foram alimentados com dieta semipurificada ou aterogênica,

durante seis semanas. Após este período, um grupo sofreu eutanásia para constatação do

desenvolvimento da aterosclerose e os outros animais foram alimentados por oito

semanas com dieta semipurificada suplementada com 1 % de vitamina E, 1 % de

10t,12c-CLA ou com 1 % de vitamina E + 1 % de 10t,12c-CLA. Foram avaliados a área

total da lesão aterosclerótica e o percentual de obstrução da aorta, além de parâmetros

relacionados ao metabolismo do colesterol e do α-tocoferol. Resultados: A utilização

isolada do isômero 10t,12c-CLA não impediu o desenvolvimento de lesões

ateroscleróticas na aorta. No entanto, a suplementação dietética com vitamina E, assim

como a associação de vitamina E e 10t,12c-CLA, reduziram significantemente a área

total da lesão e o percentual de obstrução da aorta. Conclusão: Os resultados

demonstraram que, em camundongos LDLR -/-, a suplementação da vitamina E

isoladamente ou em associação com o isômero 10t,12c-CLA reduz a progressão de

lesões ateroscleróticas pré-estabelecidas na aorta.

Palavras-chave: ácido linoléico conjugado, α-tocoferol, aterosclerose, camundongos

LDLR-/-

Introdução

6.1 Introdução

Nos países em desenvolvimento, incluindo o Brasil, as doenças cardiovasculares

secundárias à aterosclerose têm elevado substancialmente as taxas de morbidade e

mortalidade. A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica de origem multifatorial

que ocorre em resposta à agressão endotelial (DEPARTAMENTO DE

ATEROSCLEROSE DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2007).

Dentre os vários fatores envolvidos no seu desenvolvimento, destaca-se a

ocorrência de reações inflamatórias (HANSSON, 2005) e oxidativas (STOCKER e

KEANEY JR, 2003). Algumas medidas empregadas na prevenção da aterosclerose

incluem a utilização de compostos da dieta com propriedades específicas, que visam

minimizar o impacto destas reações no seu desenvolvimento.

Neste sentido, os lipídios e os compostos antioxidantes da dieta têm sido

importantes objetos de pesquisa em saúde e nutrição; existindo um grande interesse nos

potenciais efeitos benéficos destes compostos, especialmente na prevenção e no

tratamento das doenças cardiovasculares.

Ácido linoléico conjugado (CLA) é o termo que engloba todos os isômeros

geométricos e de posição do ácido octadecadienóico (PARIZA e HARGREAVES,

1985; PARODI, 1999).

Estes ácidos graxos têm sido relacionados com a diminuição da extensão da

aterosclerose em diversos modelos animais (KRITCHEVSKY et al., 2004; MITCHELL

et al., 2005; TOOMEY et al., 2006). Fundamentalmente, os efeitos dos isômeros do

CLA na aterosclerose têm sido atribuídos à sua ação anti-inflamatória (YU et al., 2002;

MÜLLER et al., 2005), apesar de os mecanismos envolvidos nestas ações ainda serem

desconhecidos.

Por outro lado, estratégias utilizadas no tratamento experimental da aterosclerose

compreendem a utilização de suplementos de vitaminas antioxidantes, como a vitamina

E. Esta vitamina também está relacionada à redução do desenvolvimento da

aterosclerose em animais experimentais (PELUZIO et al., 2003; CYRUS et al., 2003;

OTERO et al., 2005).

Resultados e Discussão

Evidências de estudos in vivo (ROSENBLAT e AVIRAM, 2002) e in vitro

(ARROL et al., 2000) indicam que a vitamina E exerce seu papel antiaterogênico por

incorporar-se às partículas de LDL, tornando-as menos suscetíveis à oxidação.

O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos individuais e associados do isômero

10t,12c-CLA e da vitamina E na aterosclerose induzida por dieta hiperlipídica e

colesterol, em um modelo para hipercolesterolemia familiar humana.

6.2 Materiais e Métodos

6.2.1 Animais e dietas

Foram utilizados 77 camundongos LDLR -/-, machos e fêmeas, com seis

semanas de vida, procedentes do biotério do Laboratório de Bioquímica Nutricional, do

Departamento de Bioquímica e Imunologia, da Universidade Federal de Minas Gerais

(UFMG).

Os animais foram mantidos em gaiolas individuais de aço inoxidável, em

ambiente com temperatura controlada (21 °C ± 1 °C) e fotoperíodo de 12 horas. Durante

todo o período experimental, os animais receberam água e dieta ad libitum. Também

foram monitorados o consumo alimentar e o ganho de peso.

O ensaio biológico foi realizado em duas etapas e teve duração total de 14

semanas.

Na fase de indução da aterogênese, os animais foram alimentados com dieta

controle (semipurificada) ou com dieta de indução (aterogênica), durante seis semanas

(Tabelas 6.1 e 6.2). Ao final deste período, um grupo (grupo AT1; n = 10) sofreu

eutanásia para avaliação do grau de desenvolvimento da aterosclerose.

Na fase de tratamento os animais do grupo controle continuaram recebendo

dieta semipurificada e os animais que receberam dieta aterogênica foram divididos em

outros cinco grupos:

1 – Grupo AT2: dieta aterogênica;

2 – Grupo CLA: dieta semipurificada + 1% de 10t,12c-CLA;

3 – Grupo TOC: dieta semipurificada + 1% de acetato de vitamina E;

4 – Grupo CLA/TOC: dieta semipurificada + 1% de 10t,12c-CLA + 1% de

acetato de vitamina E;

Resultados e Discussão

5 – Grupo AT/SP: dieta semipurificada.

As cápsulas de CLA foram gentilmente cedidas pela empresa Rainha

Laboratório Nutracêutico Ltda. e continham, em média, 62,70 ± 2,60 mg de 10t,12c-

CLA/100 mg de óleo.

Tabela 6.1 – Composição da dieta controle (semipurificada).

Ingredientes %

Amido de milho 68

Caseína 20

Celulose 1

Óleo de soja 5

Mistura vitamínica 1

Mistura mineral 5

Fonte: AOAC (1989).

Tabela 6.2 – Composição da dieta de indução (aterogênica).

Ingredientes %

Sacarose 55

Caseína 20

Celulose 1

Óleo de soja 1

Colesterol 1

Gordura vegetal hidrogenada 15

Mistura vitamínica 1

Mistura mineral 5

Bitartarato de colina 1

Fonte: AOAC (1989).

As fezes foram coletadas no início e no final de ambas as etapas do experimento

e armazenadas a – 20 °C até análise.

Ao término do período experimental, os animais foram colocados em jejum por

12 horas e sofreram eutanásia.

Os corações foram retirados em bloco, com a raiz da aorta, perfundidos em

solução salina fisiológica e, em seguida, fixados em solução de formol em PBS (10%).

O sangue foi coletado por punção na aorta abdominal e centrifugado a 3500 rpm,

por 10 minutos, para obtenção do soro. O soro foi congelado em nitrogênio líquido e

mantido a – 80 °C, até análise.

Resultados e Discussão

Este trabalho foi realizado segundo as normas do Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal – COBEA (1991).

6.2.2 Concentração dos lipídios séricos

O colesterol total foi quantificado por método enzimático (ALLAIN et al., 1974)

e sua concentração sérica foi determinada a partir da absorbância do padrão de

colesterol (200 mg/dL).

A concentração de triacilgliceróis foi determinada enzimaticamente por kit

bioquímico, sendo que os valores encontrados foram divididos por quatro, para

obtenção das concentrações da fração VLDL. A fração HDL foi obtida por

determinação direta (WARNICK et al., 2001) e a fração LDL, por diferença entre as

concentrações de colesterol total e as de HDL e VLDL.

Foram utilizados kits comerciais (Bioclin

, Brasil), gentilmente cedidos pela

empresa Quibasa Química Básica Ltda.

6.2.3 Concentração do colesterol hepático e fecal

A dosagem de colesterol hepático e fecal foi feita a partir dos seus respectivos

extratos lipídicos retomados em 1,5 mL de álcool isopropílico.

As concentrações de colesterol foram determinadas enzimaticamente, utilizando

kit comercial (Bioclin

, Brasil).

6.2.4 Determinação do α-tocoferol

A extração do α-tocoferol das amostras de fígado e fezes foi realizada pelo

método de UEDA e IGARASHI (1990). A determinação da concentração de α-tocoferol

foi feita por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), com detector

espectrofotométrico UV-visível de arranjo de diodos (Shimadzu), utilizando a coluna

Lichrospher, RP-18 (4,0 x 250 mm, 5 µm). A fase móvel consistiu de uma solução de

acetonitrila, metanol e hexano na proporção de 3:95:2, com fluxo de 1 mL/minuto e

tempo total de corrida de 10 minutos. O comprimento de onda no detector, 295 nm, foi

o correspondente à absorbância máxima do α-tocoferol.

Resultados e Discussão

O padrão vitamínico foi preparado dissolvendo-se 10 mg de α-tocoferol (Sigma-

Aldrich

, EUA) em etanol a 96%, resultando em uma solução estoque com

concentração de 10 µg/mL. Procedeu-se a varredura para confirmação do espectro de

absorção da solução padrão na faixa ultravioleta, utilizando os comprimentos de onda

de 190 a 350 nm. O cálculo da concentração real da solução padrão foi feito utilizando-

se o coeficiente de absortividade molar (E1%1cm) = 70,8.

6.2.5 Análise morfométrica