( PDF ) Estudos dos mecanismos envolvidos na ação antinociceptiva causada pelo disseleneto de difelina em camundongos

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Universidade Federal de Santa Maria

Centro de Ciências Naturais e Exatas

Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica

ESTUDOS DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA

AÇÃO ANTINOCICEPTIVA CAUSADA PELO

DISSELENETO DE DIFENILA EM CAMUNDONGOS

TESE DE DOUTORADO

Lucielli Savegnago

Santa Maria, RS, Brasil

2007

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ESTUDOS DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA AÇÃO

ANTINOCICEPTIVA CAUSADA PELO DISSELENETO DE

DIFENILA EM CAMUNDONGOS

por

Lucielli Savegnago

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica

Toxicológica, Área de Concentração em Bioquímica Toxicológica, da

Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito

parcial para obtenção do grau de

Doutor em Bioquímica Toxicológica.

Orientador: Prof. Dr. Gilson Zeni

Santa Maria, RS, Brasil

2007

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Universidade Federal de Santa Maria

Centro de Ciências Naturais e Exatas

Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica

A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Tese de

Doutorado

ESTUDOS DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA AÇÃO

ANTINOCICEPTIVA CAUSADA PELO DISSELENETO DE DIFENILA

EM CAMUNDONGOS

Elaborada por

Lucielli Savegnago

como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em

Bioquímica Toxicológica

COMISSÃO EXAMINADORA:

_________________________________________

Prof. Dr. Gilson Zeni (Orientador)

_________________________________________

Prof. Dr. Félix Antunes Soares (UFSM)

________________________________________

Prof. Dr. João Batista Teixeira da Rocha (UFSM)

_________________________________________

Prof

. Dr

. Maria Matha Campos (PUC/POA)

_________________________________________

Prof. Dr. Diogo Onofre Gomes de Souza (UFRGS)

Santa Maria, agosto de 2007.

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“ É melhor tentar e falhar,

que preocupar-se e ver a vida passar.

É melhor tentar, ainda em vão,

que sentar-se fazendo nada até o final.

Eu prefiro na chuva caminhar,

que em dias tristes em casa me esconder.

Prefiro ser feliz, embora louco,

que em conformidade viver”

(Martin Luther King)

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iii

AGRADECIMENTOS

A Deus, por sempre me guiar com a sua luz divina.

A minha família, em especial, minha mãe e aos meus irmãos, meus maiores

exemplos, pelo apoio incessante e incentivo constante na busca dos meus objetivos.

Ao Diego (“Schumi”), meu amorzinho, por ser tão especial em minha vida e

me fazer acreditar que amar vale a pena. Te amo muito !!!

Aos meus orientadores Cristina e Gilson, agradeço pela confiança em mim

depositada e pelo exemplo de perseverança incansável ao ensino e a ciência.

Saibam que levarei comigo mais que um aprendizado científico, aprendi em seus

grupos de pesquisa que o companheirismo e a união tornam a nossa trajetória

melhor e com maior número de conquistas. Cris e GZ, muito obrigada!

Ao professor João Batista por todos os ensinamentos que contribuíram para o

meu crescimento pessoal e profissional. Obrigada!

Aos meus queridos IC’s, Cristiano e Larissa, pela ajuda incondicional, pela

dedicação, pela lealdade, pela amizade e por contribuírem muito para a minha

formação profissional. Obrigada, por tornarem tão agradável a realização deste

trabalho. Acredito que não existam palavras para expressar a minha gratidão a

vocês. Adoro vocês!

A minha segunda família, “pessoal do lab”: Marina, Vanessa, Lysandro,

Alexandre, Simone W, Eluza, Cristiane, Fran, Nilda, Ricardo, pela amizade, por um

olhar de apoio, um gesto de compreensão e paciência, um ombro amigo, uma

palavra de incentivo. A todos vocês, que compartilharam dos meus ideais a minha

gratidão e respeito. Obrigada!

Em especial à Marina e a Vanessa, pela amizade, ajuda incondicional,

companheirismo, desabafos e incentivo. Obrigada!

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À Simone P, Gabi, Ethel, César, Carina, Liomara, Raquel, Aninha, Bibi,

Carine, Renata, Marlon, Carmine, pela amizade, e aos vários momentos de

desconcentração. Foi muito bom trabalhar na companhia de vcs!

Ao pessoal do lab. da Química: Schumakinho, Jesus, Maneco, Juliano, Flávia,

Carol, Alison, Zé, Elvis, Benhur, Tuane, Dani, Paty, obrigada pela parceria, festas, e

pela síntese dos compostos. Obrigada!!

Ao pessoal do Lab. do prof. João pelo companherismo. Obrigada!

Aos colegas que tomaram outros rumos, Flávia, Ana Paula Ardais, Dionéia,

Tati, Gisele, Jozi, Márcio, Carlos Eduardo, Eduardo, Dionei, Fabrício e Guilherme,

pelo companheirismo e amizade.

Ao Rinaldo por cuidar tão bem dos animais.

À Angélica e a Márcia, secretárias da Pós-graduação pela paciência e

solicitude com que resolvem todos os nossos problemas.

Aos docentes do curso de pós-graduação em Bioquímica Toxicológica da

UFSM pelos ensinamentos.

Agradeço, enfim, à Universidade Federal de Santa Maria, pela oportunidade,

e ao CNPq pelo auxílio financeiro.

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RESUMO

Tese de Doutorado

Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica

Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil

ESTUDOS DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA AÇÃO ANTINOCICEPTIVA

CAUSADA PELO DISSELENETO DE DIFENILA EM CAMUNDONGOS

AUTORA: Lucielli Savegnago

ORIENTADOR: Gilson Zeni

CO-ORIENTADORA: Cristina Wayne Nogueira

DATA E LOCAL DA DEFESA: Santa Maria, agosto de 2007.

Nos últimos anos, os compostos orgânicos de selênio têm sido alvos de

interesse em síntese orgânica em virtude da descoberta de suas aplicações

sintéticas e de suas propriedades farmacológicas. O disseleneto de difenila é um

composto orgânico de selênio que apresenta baixa toxicidade quando administrado

pela via subcutânea em camundongos, nas doses em que exerce ação

antinociceptiva e antiinflamatória. Assim, a pesquisa dos mecanismos pelos quais

esse composto exerce seus efeitos é importante para a sua aplicação biológica.

Desta forma, no presente trabalho investigou-se a toxicidade aguda induzida pelo

disseleneto de difenila quando administrado pela via oral em camundongos e as

propriedades antinociceptiva e antiinflamatória desse composto, bem como os

possíveis mecanismos envolvidos em tal processo. A administração oral do

disseleneto de difenila causou baixa toxicidade o que foi evidenciado pelo índice de

mortalidade (dose letal > 312 mg/kg). Apesar do disseleneto de difenila não ter

apresentado evidências de toxicidade renal e hepática, o ganho de peso corporal

dos camundongos foi reduzido, o que pode indicar toxicidade sistêmica causada por

esse composto. A administração oral do disseleneto de difenila reduziu o número de

contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, bem como, preveniu a

nocicepção induzida pela injeção intraplantar (i.pl.) de glutamato, capsaicina,

formalina, bradicinina (BK) e acetato de forbol miristato (PMA). A administração oral

do disseleneto de difenila foi capaz de prevenir a nocicepção térmica, no modelo da

imersão da cauda a 55°C. O disseleneto de difenila co-injetado intraplantar com o

glutamato causou redução significante na reposta nociceptiva induzida pelo

glutamato, sendo que esse efeito antinociceptivo local foi bloqueado pelo pré-

tratamento local com a L-arginina e com o ditiotreitol (DTT). Além disso, a

administração oral do disseleneto de difenila preveniu a nocicepção induzida pela

injeção intratecal (i.t.) de glutamato, ácido N-metil-D-aspártico (NMDA), capsaicina,

BK, substância P (SP), fator de necrose alfa (TNF-α) e interleucina 1β (IL-1β), mas

não bloqueou significativamente a nocicepção causada pela injeção i.t. do ácido α-

amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolopropionico (AMPA), cainato e ácido (±)-1-

aminociclopentano-trans-1,3-dicarboxílico (trans-ACPD). A antinocicepção causada

pela administração oral do disseleneto de difenila no teste da formalina foi revertida

pelo pré-tratamento com cloreto de cálcio (CaCl

), N

-nitro-L-arginina (L-NOARG,

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inibidor da enzima óxido nítrico sintase - NOS), 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-

a]quinoxalin-1-ona (ODQ, inibidor da guanilato ciclase), azul de metileno (inibidor

inespecífico da guanilato ciclase), tetraetilamônio (TEA; bloqueador de diferentes

tipos de canais de potássio, inclusive os dependentes de voltagem), apamina

(bloqueador de canais de potássio de baixa condutância ativados por cálcio) e

caribidotoxina (bloqueador de canais de potássio de alta condutância ativados por

cálcio), mas não foi significativamente revertida pelo pré-tratamento dos animais com

glibenclamida (bloqueador de canais de K

dependente de ATP) e com o inativador

da proteína G

i/o

(toxina pertussis). O tratamento oral com disseleneto de difenila

reduziu a alodínia mecânica induzida pela ligadura parcial de nervo ciático (dor

neuropática) e pela injeção i.pl. de FCA (dor inflamatória crônica) e preveniu a

hiperalgesia térmica induzida pela BK, prostaglandina E

(PGE

, glutamato e NMDA.

De acordo com o presente trabalho pode-se sugerir que os mecanismos

responsáveis pela ação antinociceptiva causada pelo disseleneto de difenila em

camundongos envolvem a participação da via do óxido nítrico/ guanosina

monofosfato cíclica (GMPc) /canais Ca

e K

, inibição da PKC e PKA, além da

participação dos sistemas glutamatérgicos, peptidérgicos e vanilóides.

Palavras-chave: disseleneto de difenila, selênio, dor aguda, dor crônica,

nocicepção, inflamação.

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vii

ABSTRACT

Thesis of Doctor’s Degree

Federal University of Santa Maria, RS, Brazil

Studies of mechanisms involved in the antinociceptive action

caused by diphenyl diselenide in mice

AUTHOR: Lucielli Savegnago

ADVISOR: Gilson Zeni

CO-ADVISER: Cristina Wayne Nogueira

DATE AND PLACE OF THE DEFENSE: Santa Maria, august 2007

The interest in organoselenium biochemistry and pharmacology has increased

in the last two decades due to a variety of organoselenium compounds that possess

biological activity. Accordingly, diphenyl diselenide, a simple diaryl diselenide, is

known as a safety drug when administered acutely to mice at doses that have

antiinflammatory and antinociceptive activities. Therefore, the research of the

mechanisms by which this compound exerts its effects is extremely important for the

therapeutic application. Based on the considerations above, the aims of the present

study were to evaluate the acute toxicity induced by diphenyl diselenide in mice using

oral route of administration with the purpose of offering safety in the use of this

compound and to verify the antinociceptive and antiinflammatory activities caused by

diphenyl diselenide as well as its mechanisms of action. Diphenyl diselenide

administered orally produced minor toxicological effects which were evidenced by the

index of mortality (lethal-dose > 312 mg/kg). Although diphenyl diselenide did not

provide evidence for renal or hepatic toxicity, the body weight gain in mice exposed

to this compound was reduced, which might indicate systemic toxicity. The oral

administration (p.o.) of diphenyl diselenide inhibited acetic acid-induced abdominal

constriction as well as capsaicin-, glutamate- bradykinin (BK)- phorbol myristate

acetate (PMA)- and formalin induced nociception and caused a significant increase in

tail-immersion response latency time. In addition, diphenyl diselenide co-injected

intraplantarly (i.pl.) in association with glutamate induced a significant reduction of

the licking and in the paw oedema formation induced by glutamate. The local pre-

treatment of mice with L-arginine and dithiothreitol (DTT; i.pl.) restored local

antinociception caused by diphenyl diselenide when analyzed against glutamate-

induced nociception. Moreover, diphenyl diselenide, given orally, caused significant

inhibition of the biting behavior induced by intrathecal (i.t.) injection of glutamate, N-

methyl-D-aspartate (NMDA), substance P (SP), interleukin 1β (IL-1β), tumor necrosis

factor-α (TNF-α), BK and capsaicin, but completely failed to affect the nociception

induced by α-amino-3-hydroxy-5-mehtyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA), kainate

and (±)-1-aminocyclopentane-trans-1,3-dicarboxylic acid (trans-ACPD). The

antinociceptive effect caused by diphenyl diselenide in the formalin test was reversed

by i.t. injection of several K

channel blockers such as apamin and charybdotoxin

(large- and small-conductance Ca

2+-

activated K

channel inhibitors, respectively),

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viii

tetraethylammonium (TEA, non-selective voltage-dependent K

channel inhibitor),

but not glibenclamide (ATP-sensitive K

channel inhibitor). Injection of mice with

inhibitor of nitric oxide (NO) synthase (N

-nitro-L-arginine; L-NOARG), guanylyl

cyclase inhibitors (1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one - ODQ; and

methylene blue) and calcium chloride (CaCl

) significantly blocked the antinociceptive

effect caused by diphenyl diselenide when assessed on the formalin test. In contrast,

i.t. injection of pertussis toxin, an inactivator of G

i/0

protein, did not antagonize the

antinociceptive action caused by diphenyl diselenide in the formalin test. Diphenyl

diselenide increased nociceptive threshold in mechanical allodynia induced by both

partial sciatic nerve ligation (neuropathic pain) and ACF i.pl. injection (inflammatory

chronic pain) as well as attenuated acute thermal hyperalgesia induced by i.t.

injection of glutamate, NMDA, BK and prostaglandin E

(PGE

). Together these

results suggested the participation of nitric oxide/cyclic GMP/Ca

and K

channel,

pathways, inhibition PKA e PKC, as well as glutamatergic, peptidergic and vanilloid

systems in the antinociceptive action caused by diphenyl diselenide in mice.

Key words: diphenyl diselenide, selenium, acute pain, chronic pain, nociception,

inflammation.

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LISTA DE FIGURAS

Revisão Bibliográfica

Figura 1: Representação esquemática dos diferentes tipos de neurônios

sensoriais primários responsáveis pela condução do sinal nociceptivo da

periferia ao SNC.....................................................................................................

Figura 2: Representação esquemática dos fatores responsáveis pela ativação

de nociceptores periféricos....................................................................................

Figura 3: Representação esquemática demonstrando a transmissão e o

processamento da dor da periferia ao SNC...........................................................

Figura 4: Diagrama esquemático mostrando a localização das lâminas do

corno dorsal da medula espinhal que recebem as informações sensoriais

oriundas dos terminais periféricos de fibras nervosas nociceptivas

aferentes................................................................................................................

Figura 5: Estrutura química do ebselen................................................................

Figura 6: Estrutura química do disseleneto de difenila.........................................

Artigo 1

Figura 1: Effect of diphenyl diselenide administered orally against acetic-acid

induced writhing movements in mice.....................................................................

Figura 2: Effect of diphenyl diselenide administered orally against capsaicin-

induced licking in mice...........................................................................................

Figura 3: Effect of diphenyl diselenide administered orally on the tail-immersion

test in mice.............................................................................................................

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Figura 4: Effect of pre-treatment of animals with L-arginine on the

antinociceptive profiles of diphenyl diselenide and N

-nitro-L-Arginine methyl

ester against the glutamate -induced licking (A) and paw oedema (B) in

mice.......................................................................................................................

Figura 5: Effect of pre-treatment of animals with dithiothreitol on the

antinociceptive profiles of diphenyl diselenide and 5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic

acid) against the glutamate -induced licking (A) and paw oedema (B) in

mice........................................................................................................................

Artigo 2

Figura 1: Effect of diphenyl diselenide administered orally against glutamate

(A), NMDA (B), AMPA (C), kainite (D) or trans-ACPD (E)- induced biting in

mice........................................................................................................................

Figura 2: Effect of diphenyl diselenide administered orally on the nociceptive

behavior induced by substance P (A), IL-1β (B) -or TNF-α

(C)...........................................................................................................................

Figura 3: Effect of diphenyl diselenide on the biting response caused by

injection of BK (A) or capsaicin (B).........................................................................

Artigo 3

Figura 1: Effect of diphenyl diselenide given by oral route on the licking (A, B)

and oedema (C) induced by formalin in mice. The total time spent licking the

hindpaw was measured in the first (0 - 5 min, panel A) and the second (15 - 30

min, panel B) phase after intraplantar injection of formalin. The oedema (panel

C) was measured at the end of second phase of formalin test. The effect of

diphenyl diselenide (10 mg/kg, p.o) given 5 min after the formalin injection in

mice has been demonstrated in panel D................................................................

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Figura 2: Effect of pretreatment of mice with L-NOARG (panels A and B), ODQ

(panels C and D) and methylene blue (panels E and F) 10 min before injection

of diphenyl diselenide against the first and the second phase of formalin-

induced licking in mice ..........................................................................................

Figura 3: Effect of pretreatment of mice with tetraethylammonium (panels A and

B), charybdotoxin (panels C and D), apamin (panels E and F) and glibenclamide

(panels G and H) on the antinociceptive profiles by diphenyl diselenide and

morphine and morphine against formalin-induced nociception in mice..................

Artigo 4

Figura 1: Effect of diphenyl diselenide administered orally on mechanical

allodynia induced by sciatic nerve injury in response to 10 applications of 0.6 g

VFH……………………………………………………………………………………….

101

Figura 2: Effect of diphenyl diselenide administered orally on mechanical

allodynia in response to 10 applications of 0.6 g VFH induced by CFA in

mice………………..................................................................................................

102

Figura 3: Effect of diphenyl diselenide administered orally on the glutamate

(panel A)-, NMDA (panel B)-, PGE

(panel C) or BK (panel D)- induced

nociceptive response in mice.................................................................................

103

Discussão

Figura 7: Possíveis sítios de ação do disseleneto de difenila...............................

114

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xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Effect of diphenyl diselenide, administered orally, on the body weight

gain in mice..............................................................................................................

Tabela 2- Effect of diphenyl diselenide administered orally on biochemical

parameters in mice...................................................................................................

Tabela 3- Effect of diphenyl diselenide administered orally on the licking and

oedema induced by glutamate in mice.....................................................................

Tabela 4- Effect of diphenyl diselenide administered orally on the licking and paw

oedema induced by bradykinin in mice…………………………………………………

Tabela 5- Effect of diphenyl diselenide administered orally on the licking and paw

oedema induced by PMA in mice……………………………………………………….

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xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

µg microgramas

µmol/kg micromol por quilograma

ACF adjuvante complete de Freund

ADP adenosina difosfato

ALT alanina amino transferase

AMPA ácido α-amino-3-hidróxi-5-metil-4-isoxazolopropiônico

AMPc adenosina monofosfato-cíclico

AST aspartato amino transferase

ATP adenosina trifosfato

BK bradicinina

CaCl

cloreto de cálcio

CAL calidina

CCK colecistocinina

CCDVs canais de cálcio dependente de voltagem

CGRP peptídeo relacionado ao gene da calcitonina

COX ciclooxigenase

DAG diacilglicerol

dose que inibe a resposta em 50%

dose que causa 50% de morte

DTNB ácido 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzóico)

DTT ditiotreitol

eNOS sintase do óxido nítrico endotelial

Eros espécies reativas de oxigênio

GC guanilato ciclase

GMPc guanosina monofosfato-3’-5’-cíclico

GTP guanosina trifosfato

i.c.v. intracerebroventricular

GluRs receptores glutamatérgicos ionotrópicos

IL-1β

interleucina-1 beta

IL-6 interleucina-6

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xiv

IL-8 interleucina-8

IM inibição máxima

iNOS sintase do óxido nítrico induzida

i.p. intraperitoneal

inositol trifosfato

i.pl. intraplantar

i.t. intratecal

L-NAME N

-nitro-L-arginina metil éster

L-NOARG N

ω-

nitro-L-arginina

LOX lipoxigenase

m/s metros por segundo

mg/Kg miligramas por quilogramas

MAPKs proteínas quinases ativada por mitógenos

GluRs receptores glutamatérgicos metabotrópicos

mm milimetros

NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

NGF fator de crescimento neuronal

NK neurocinina

NK1 neurocinina 1

NK2 neurocinina 2

NK3 neurocinina 3

NKA neurocinina A

NMDA ácido N-metil-D-aspártico

NO óxido nítrico

NOS sintase do óxido nítrico

nNOS sintase de óxido nítrico neuronal

NPY neuropeptídeo Y

ODQ 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-ona

P2X3 receptor purinérgico ionotrópico 3

PAF fator de agregação plaquetária

PAG substância cinzenta periaquedutal

PG prostaglandina

PGD

prostaglandina D

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PGE

prostaglandina E

PGF

2α

prostaglandina F

2α

PGI

prostaglandina I

PI-3K fosfoinositol 3-quinase

PKA proteína quinase A

PKC proteína quinase C

fosfolipase A

PLC fosfolipase C

PMA acetato forbol miristato

p.o per via oral

PTZ pentilenotetrazol

RVM medula rostroventromedial

s.c. subcutânea

SNC sistema nervoso central

SNP sistema nervosa periférico

SP substância P

TNF-α

fator de necrose tumoral-alfa

trans-ACPD ácido (±)-1-aminociclopentano-trans-1,3-dicarboxílico

TEA Tetraetilamônio

TRPV1 receptor vanilóide transiente do tipo 1

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xvi

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................

2.1 Dor...............................................................................................................

2.1.1Transmissão da dor..............................................................................

2.1.2 Processamento central da dor.............................................................

2.1.3 Mediadores químicos...........................................................................

2.1.3.1 Glutamato....................................................................................

2.1.3.2 Óxido nítrico.................................................................................

2.1.3.3 Substância P ...............................................................................

2.1.3.4 Cininas ........................................................................................

2.1.3.5 Prostaglandinas ..........................................................................

2.2 Dor inflamatória..........................................................................................

2.3 Dor neuropática..........................................................................................

2.4 Selênio.........................................................................................................

2.4.1 Características químicas .....................................................................

2.4.2 Biodisponibilidade do selênio...............................................................

2.4.3 Atividade biológica................................................................................

2.5 Compostos orgânicos de selênio.............................................................

2.5.1.Ebselen................................................................................................

2.5.2 Disseleneto de difenila.........................................................................

2.5.2.1 Propriedades farmacológicas......................................................

2.5.2.2 Propriedades toxicológicas..........................................................

3. OBJETIVOS...........................................................................................................

4. ARTIGOS CIENTÍFICOS........................................................................................

4.1 Propriedades antinociceptivas do diseleneto de difenila: Evidências

de mecanismos de ação..................................................................................

4.1.1 Artigo 1: Antinociceptive properties of diphenyl diselenide:

Evidences for the mechanism of action........................................................

4.2 Mecanismos espinhas na ação antinociceptiva causada pelo

disseleneto de difenila.....................................................................................

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xvii

4.2.1 Artigo 2: Spinal mechanisms of antinociceptive action caused by

diphenyl diselenide........................................................................................

4.3 Envolvimento da via do óxido nítrico/GMP cíclico/canais de Ca

e K

na ação antinociceptiva causada pelo disseleneto de difenila no teste da

formalina...........................................................................................................

4.3.1 Artigo 3: Involvement of nitric oxide/cyclic GMP/ and - channels

pathway in the antinociception caused by diphenyl diselenide in the

formalin test...................................................................................................

4.4 Disseleneto de difenila atenua a hiperalgesia térmica e o

comportamento de dor inflamatória persistente e neuropática em

camundongos...................................................................................................

4.4.1 Artigo 4: Diphenyl diselenide attenuates acute thermal hyperalgesia

and persistent inflammatory and neuropathic pain behavior in

mice..............................................................................................................

5. DISCUSSÃO..........................................................................................................

104

6. CONCLUSÕES......................................................................................................

115

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................

117

8. DEMAIS TRABALHOS REALIZADOS DURANTE O PERÍODO DE

DOUTORAMENTO.....................................................................................................

151

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xviii

APRESENTAÇÃO

Os resultados que fazem parte desta tese estão apresentados sob a forma de

artigos, os quais se encontram no item ARTIGOS CIENTÍFICOS. As seções

Materiais e Métodos, Resultados, Discussão dos Resultados e Referências

Bibliográficas, encontram-se nos próprios artigos e representam na íntegra o

presente estudo.

Os itens, DISCUSSÃO E CONCLUSÕES encontradas no final desta tese

apresentam interpretações e comentários gerais sobre todos os artigos científicos

contidos neste trabalho.

As REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS referem-se somente às citações que

aparecem nos itens INTRODUÇÃO, REVISÃO BIBLIOGRÁFICA e DISCUSSÃO

desta tese.

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1- INTRODUÇÃO

Dentre os diversos sistemas de “vigilância” da homeostase do organismo, a

dor tem papel de destaque por despertar nossa atenção imediatamente. Além de

despertar, retém nossa atenção até que o ponto sensível tenha sido identificado e o

evento que está desencadeando a lesão, ou represente risco, tenha sido afastado

(Wall, 1999). Desse modo, o primeiro propósito da dor aguda é alertar sobre

estímulos que podem provocar lesão tecidual (estímulos nocivos), permitindo que

mecanismos de defesa ou de fuga sejam adotados (Millan, 1999).

Ao contrário destes propósitos claramente protetores, a dor pode se tornar

crônica quando o organismo não é capaz de produzir resolução da lesão ou quando

a plasticidade neuronal que ocorre durante a doença mantém a dor, mesmo após a

resolução da lesão. É o que acontece, por exemplo, em doenças inflamatórias ou

após a lesão nervosa (neuropatias). Nesses quadros patológicos, o processamento

sensorial é anormal (Besson, 1999). Estímulos ambientais que normalmente são

inócuos, tais como leve toque ou pequenas alterações na temperatura ambiente,

produzem a sensação de dor, isto é, alodínia. Estímulos que normalmente são

percebidos como dolorosos produzem percepção exagerada de dor, isto é,

hiperalgesia. A dor crônica difere substancialmente da dor aguda não somente em

relação ao seu caráter persistente, mas principalmente, está associada com

alterações adaptativas, tais como à neuroplasticidade em vários níveis do sistema

nervoso, sendo de difícil tratamento (Besson, 1999; Woolf e Mannion, 1999).

A dor, além de uma sensação, é uma experiência. Sensações possuem vias

neuroanatômicas importantes com receptores específicos que permitem a detecção

e medida de um estímulo. Experiências incorporam os componentes sensoriais com

influências pessoais e ambientais importantes. O componente sensorial da dor é

denominado nocicepção, ou seja, a sensação determinada pela estimulação das

fibras aferentes primárias, sem levar em consideração os aspectos psicológicos que

também influenciam a percepção final da dor (Millan, 1999).

De uma forma geral, o estímulo nociceptivo depende da ação de mediadores

que são comuns ao processo inflamatório, principalmente, em casos de dor crônica

(Ferreira e Nakamura, 1979; Clatworthy et al., 1995; Khasar et al., 1999; Bennett et

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al., 2000; Ji e Strichartz, 2004). Neste contexto, substâncias capazes de diminuir a

condição inflamatória são empregadas no tratamento contra a dor. Na verdade, a

grande maioria dos fármacos presentes no mercado que são utilizados para o

controle da dor, possuem um cunho antiinflamatório (Mendell e Sahenk, 2003).

Estudos farmacológicos, eletrofisiológicos e anatômicos têm contribuído para

o descobrimento de múltiplos mediadores químicos envolvidos na dor, o que facilita

o entendimento dos mecanismos de ação dos neurotransmissores e das drogas

envolvidas na modulação central e periférica da dor (Levine e Taiwo, 1994; Wood e

Docherty, 1997; Millan, 1999). Por isso, muitos esforços têm sido dedicados,

buscando compreender os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na

origem da dor, com o objetivo de encontrar drogas eficazes, com baixos efeitos

colaterais e que possam ser empregadas nestas circunstâncias. De fato, atualmente,

não existe tratamento satisfatório e nem medidas adequadas e específicas para o

controle da dor (Kingery, 1997; Woolf e Mannion, 1999; Mendell e Sahenk, 2003).

Os compostos orgânicos do selênio, os quais possuem síntese simples e

atividades farmacológicas relevantes, têm sido alvo de interesse e estudo (Muller et

al., 1984; Nogueira et al., 2003a, b; Meotti et al., 2004; Nogueira et al., 2004; Zasso

et al., 2005). O ebselen, composto orgânico que contém selênio, é conhecido como

um antioxidante e importante agente capaz de mimetizar a atividade da enzima

glutationa peroxidase (Muller et al., 1984). Além dessas propriedades, o ebselen

possui atividade antinociceptiva e antiinflamatória, as quais podem ser resultanted

da sua capacidade de neutralizar o peroxinitrito e inibir a proteína quinase C (PKC),

a óxido nítrico sintase (NOS) e a 5-lipoxigenase (LOX) (Parnhan e Graf, 1987;

Cotgreave et al., 1989; Schewe, 1995; Walther et al., 1999; Mugesh et al., 2001).

Estudos recentes do nosso grupo de pesquisa demonstraram que o

disseleneto de difenila apresenta maior atividade em mimetizar a enzima glutationa

peroxidase e menor toxicidade quando comparado ao ebselen (Meotti et al., 2004).

Além disso, o disseleneto de difenila, quando administrado pela via subcutânea (s.c)

e intraperitoneal (i.p.) apresenta várias propriedades farmacológicas como:

antinociceptiva, antiinflamatória, antioxidante, anti-úlcera, neuroprotetora

hepatoprotetora, anti-hiperglicemiante e também protege contra a discinesia

orofacial induzida por reserpina e haloperidol (Nogueira et al., 2003a, b, 2004;

Ghisleni et al, 2003, Borges et al., 2005a, 2006; Savegnago et al., 2006; Burger et al,

2004, 2006). Além disso, Rosa et al (2006) demonstraram que o disseleneto de

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difenila administrado em camundongos induz facilitação da formação da memória,

sem causar neurotoxicidade comportamental.

Tendo em vista que até o momento as atividades farmacológicas atribuídas

ao disseleneto de difenila foram obtidas a partir da sua administração pela via

subcutânea ou intraperitonal, tornou-se importante investigar a toxicidade aguda

induzida pelo disseleneto de difenila quando administrado pela via oral, com o

propósito de estender o estudo farmacológico e/ou toxicológico sobre esse

composto. Além disso, no presente estudo, foram investigadas as possíveis ações

antinociceptivas e antiinflamatórias causadas pelo disseleneto de difenila quando

administrado pela via oral, bem como, foram esclarecidos alguns mecanismos pelos

quais esse composto esteja exercendo tal efeito. Para isso, foram avaliados os

efeitos causados pelo disseleneto de difenila em modelos de nocicepção aguda e

crônica (através de modelos de nocicepção neuropática e inflamatória) em

camundongos.

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2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Dor

O organismo possui diversos sistemas responsáveis pelo controle da

homeostasia, dentre eles a dor tem papel de destaque, pois atua como um

mecanismo de alerta do corpo, pois “informa” que algo está ameaçando o bem-estar

e retém a atenção até que a causa tenha sido identificada e afastada (Wall, 1999).

Neste sentido, a dor é um sintoma clinicamente importante para a detecção e

avaliação de muitas doenças. Porém, quando persistente, a dor provoca reações

emocionais negativas, tornando-se debilitante e causadora de sofrimento (Chapman

e Gavrin, 1999; Julius e Basbaum, 2001; Griffis et al., 2006).

A dor foi definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor como

sendo “uma experiência emocional e sensorial desagradável associada com uma

lesão tecidual real ou potencial ou descrita em termos de tal lesão” (Loeser e

Melzack, 1999). Entretanto, sua percepção é complexa e não envolve apenas a

transdução de um estímulo nocivo, mas também processos emocionais e cognitivos

em nosso cérebro (Julius e Basbaum, 2001). Neste sentido, a dor parece ser

influenciada por fatores tanto fisiológicos (sensoriais) quanto psicológicos, e a

nocicepção refere-se apenas a parte fisiológica da dor, sem levar em consideração

os aspectos psicológicos que também influenciam na percepção final da dor. De

fato, o componente sensorial da dor é denominado nocicepção, ou seja, a sensação

determinada pela estimulação das fibras aferentes primárias. Assim, enquanto a dor

envolve a percepção de um estímulo aversivo, a nocicepção refere-se às

manifestações neurofisiológicas geradas pelo estímulo nocivo. Neste sentido, em

animais, a dor é avaliada indiretamente através da observação comportamental

evidenciada, desta maneira, modelos animais de dor são de fato modelos de

nocicepção (Tjølsen e Hole, 1997).

Em termos de duração, uma sensação dolorosa pode ser transitória, aguda

ou crônica. Na dor transitória, a ativação dos nociceptores (receptores responsáveis

em detectar um estímulo doloroso) acontece na ausência de qualquer dano tecidual,

e, neste caso, desempenha função protetora do organismo contra possíveis danos

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teciduais. Em contrapartida, a dor aguda é uma resposta normal causada por uma

lesão de tecido com conseqüente ativação dos nociceptores no local da lesão,

sendo que a dor desaparece até mesmo antes do restabelecimento do tecido

lesado. Este tipo de dor geralmente aparece após cirurgias ou situações traumáticas

e persiste menos que um mês, possuindo também caráter protetor. Por fim, a dor

crônica é causada por uma lesão tecidual ou doença que geralmente ultrapassa o

tempo de recuperação do organismo, ou seja, este tipo de dor não desaparece

mesmo quando o trauma inicial (lesão) foi resolvido, podendo durar meses ou anos,

sendo um importante fator de incapacidade e sofrimento (Lotsch e Geisslinger, 2001;

Loeser e Melzack, 1999).

Não é apenas a duração que distingue a dor aguda da dor crônica, mas a

capacidade do organismo de reparar o sítio da lesão e restaurar os disparos

aferentes e o processamento central normal (Loeser, 2000). Pode-se destacar ainda,

alterações adaptativas como a neuroplasticidade em vários níveis do sistema

nervoso, tais como sensibilização, desinibição dos neurônios inibitórios do corno

dorsal, reorganização do circuito neuronal do corno dorsal e alterações na facilitação

e inibição descendente da dor. Tendo em vista que estes eventos são dependentes

da intensidade e da duração do estímulo, quanto mais persistente for o processo

doloroso, mais difícil se torna o tratamento do quadro patológico (Besson, 1999;

Woolf e Salter, 2000; Zimmermann, 2001; Wang e Wang, 2003).

Tanto a dor aguda quanto a dor crônica estão freqüentemente associadas a

processos inflamatórios, como resultado da lesão tecidual, reatividade imune

anormal ou lesão nervosa (Stein et al., 2003). Na dor crônica, muitos eventos

ocorrem em associação com os eventos básicos da nocicepção, que alteram a

relação entre o estímulo e a resposta nociceptiva e afetam a modulação do estado

doloroso resultante. Além disso, alterações centrais crônicas na neuroquímica da

sinalização da dor produzem hipersensibilidade, aumentando a freqüência e duração

dos impulsos aferentes. Ademais, mudanças estruturais secundárias à lesão

nervosa periférica incluem a perda de interneurônios espinhais, rearranjos não

apropriados de processos neurais aferentes na medula espinhal e a proliferação de

fibras simpáticas no gânglio sensorial. Essas mudanças não são uniformes e

dependem do tipo de lesão tecidual, do envolvimento de tipos específicos de fibras e

da participação do sistema imune (Dray et al., 1994; Perkins e Tracey, 2000; Watkins

e Maier, 2002; Dogrul et al., 2003). Especificamente, ainda não foi esclarecido até

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que ponto os mecanismos envolvidos nestas síndromes diferem daqueles

implicados em processos de dor aguda, no qual reside o ponto crítico para o

desenvolvimento de terapias racionais (Aley et al., 2000).

Quanto a sua origem, existem quatro tipos principais de dor: 1) a “dor

nociceptiva”, que se origina devido à estimulação excessiva dos nociceptores

localizados na pele, vísceras e outros órgãos; 2) a “dor neurogênica”, que reflete o

dano de tecido neuronal na periferia ou no sistema nervoso central (“dor central”); 3)

a “dor neuropática”, que acontece devido a uma disfunção ou dano de um nervo ou

grupo de nervos e 4) a “dor psicogênica”, que não é oriunda de uma fonte somática

identificável e que pode refletir fatores psicológicos (Millan, 1999).

No entanto, quando ocorre um significativo dano tecidual, a dor é geralmente

mais persistente e acompanhada de inflamação. Nestas circunstâncias, pode ocorrer

um quadro de hipersensibilidade causado pela ativação e sensibilização dos

nociceptores periféricos por mediadores químicos produzidos pela lesão tecidual e

pela inflamação (Dray, 1997). Dentre as desordens que comumente ocorrem em

pacientes que apresentam dor com quadros de hipersensibilidade, pode-se citar a

hiperalgesia (resposta aumentada a um estímulo doloroso) e a alodínia (dor

resultante de um estímulo que é normalmente não nocivo) (Millan, 1999). Todavia,

estudos recentes relatam que embora a distinção entre hiperalgesia e alodínia em

humanos possa apresentar valor clínico, a base molecular desta diferença

permanece obscura. Além disso, tem sido sugerido que a utilização do termo

hipernocicepção é mais apropriada quando se trata de resultados obtidos com

técnicas de avaliação da sensibilidade mecânica em animais (Parada et al, 2003).

2.1.1 Transmissão da dor

A percepção do estímulo nociceptivo na periferia se dá por estruturas

específicas localizadas na porção distal dos neurônios aferentes sensoriais,

denominadas nociceptores (ou receptores da dor), os quais são amplamente

distribuídos na pele, vasos, músculos, articulações e vísceras. O tecido que recebe a

maior parte dos estímulos nociceptivos é a pele; é ela que fornece a maioria das

informações nociceptivas (dolorosas, que são resultantes de lesões ou que

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poderiam causar lesões) periféricas ao sistema nervoso central (SNC) (Julius e

Basbaum, 2001).

A sensibilização dos nociceptores se deve a diferentes estímulos, tais como,

mudança de temperatura (estímulo nocivo térmico), diferença osmótica ou distensão

do tecido (estímulo nocivo mecânico), hipóxia ou lesão tecidual seguida de

inflamação (estímulo nocivo químico). Existem ainda os chamados nociceptores

silenciosos (“silent” ou “sleeping”), que são uma pequena proporção das fibras

aferentes, os quais normalmente não são responsivos a estímulos. Entretanto,

quando influenciados por mediadores inflamatórios, ou após a administração de

agentes flogísticos, apresentam atividade espontânea ou tornam-se sensibilizados e

respondem a estímulos sensoriais (Julius e Basbaum, 2001).

A estimulação dos nociceptores periféricos faz com que a informação

nociceptiva seja levada através das fibras aferentes primárias (neurônios de primeira

ordem) ao SNC. Essas fibras são classificadas, de acordo com seu diâmetro,

estrutura e velocidade de condução, essencialmente em três tipos: 1) fibras C: finas

(0,4 a 1,2 mm de diâmetro), não mielinizadas e de condução lenta (0,5 a 2,0 m/s); 2)

fibras Aδ: médias (2 a 6 mm de diâmetro), mielinizadas e de condução intermediária

(12 a 30 m/s) e 3) fibras Aβ: espessas (mais de 10 mm de diâmetro), mielinizadas e

de condução rápida (30 a 100 m/s) (Millan, 1999) (Figura 1). Na pele, a proporção

entre esses três tipos de fibras é de 70, 10 e 20% respectivamente, mas esses

valores podem variar de acordo com a espécie e região do corpo analisada.

As fibras descritas acima respondem de maneira diferente aos estímulos

inócuos e agressivos. As fibras Aβ respondem somente ao toque, vibração, pressão

e outros tipos de estimulação sensorial que não sejam nociceptivos, como estímulos

mecânicos de baixa intensidade (Millan, 1999). No entanto, a estimulação dessas

fibras pode aliviar a dor, é o que ocorre quando elas são ativadas por fricção da pele

pela mão após alguma lesão.

A maioria das fibras C são polimodais, isto é, são ativadas por estímulos

nocivos mecânicos ou térmicos e ainda por estímulos nocivos de origem química

como ácidos e a capsaicina. Algumas fibras do tipo C são insensíveis a estímulos

mecânicos, mas respondem a estímulos térmicos de alta ou baixa intensidade

(Julius e Basbaum, 2001). Essas fibras são classificadas em dois grupos, de acordo

com o seu conteúdo de peptídeos e a localização de seus terminais sinápticos no

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corno dorsal da medula espinhal (Hunt e Rossi, 1985). As fibras C não-peptidérgicas

expressam o receptor purinérgico P

, o receptor para o fator neurotrófico derivado

da glia Ret e sítios de ligação para a isolecitina B

, cujos terminais sinápticos

localizam-se mais internamente na substância gelatinosa da medula espinhal

(especialmente na lâmina II). O outro grupo de fibras C denominadas peptidérgicas

sintetiza peptídeos como a substância P (SP) e o peptídeo relacionado ao gene da

calcitonina (CGRP) e expressa receptores de alta afinidade para o fator de

crescimento do nervo. Essas fibras fazem conexões com neurônios da lâmina mais

externa do corno dorsal da medula (especialmente na lâmina I) (Cuello et al., 1993;

Averil et al., 1995).

Por sua vez, as fibras Aδ, são conhecidas como mecanotermo nociceptores,

ou seja, fibras responsivas às estimulações nociceptivas mecânicas e térmicas.

Além disso, essas fibras podem ser classificadas em fibras Aδ do tipo I, respondem a

estímulos de calor intenso (até 53 °C) e fibras Aδ do tipo II que respondem a

temperaturas menores que 43°C (Shelley e Cross, 1994; Millan, 1999; Julius e

Basbaum, 2001).

Sob circunstâncias normais, apenas as fibras C e Aδ transmitem as

informações nociceptivas da periferia à medula espinhal, porém estudos recentes

utilizando animais transgênicos em conjunto com informações fisiológicas,

farmacológicas e bioquímicas, têm demonstrado o papel das três categorias de

fibras sensoriais nos processos de dor persistente (Dray e Perkins, 1997; Grubb,

1998; Besson, 1999).

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Figura 1: Representação esquemática dos diferentes tipos de neurônio sensoriais

primários responsáveis pela condução do sinal nociceptivo da periferia ao SNC.

Adaptado a partir de Julius e Basbaum, 2001.

Dentro deste contexto, a sensibilização dos nociceptores pode ocorrer em

decorrência de estímulos térmicos, mecânicos e /ou químicos, o que ocasiona na

liberação local de diversos mediadores químicos, que medeiam ou facilitam a

transmissão da informação ao SNC (Figura 2). Esses mediadores podem ser

liberados pelos neurônios sensoriais e simpáticos e por células não neuronais como

plaquetas, células sangüíneas, mastócitos, células endoteliais, fibroblastos e células

de Schwann. Quando é considerado um quadro crônico, também participam da

transmissão nociceptiva mediadores liberados a partir de células inflamatórias

(Besson, 1999).

Diversos mediadores têm sido propostos na gênese e na transmissão da dor,

destacando-se entre eles, os metabólitos derivados do ácido araquidônico

(prostaglandinas e leucotrienos), peptídeos (bradicinina, taquicininas, peptídeo

relacionado ao gene da calcitonina, substância P (SP), colecistocinina, peptídeo

intestinal vasoativo, serotonina, citocinas, óxido nítrico (NO), adenosina trifosfato

(ATP), adenosina difosfato (ADP), prótons, entre outros. Além desse, outros

mediadores químicos, tais como os aminoácidos excitatórios (glutamato, aspartato),

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acetilcolina, e outros, que podem ser produzidos ou liberados após lesão tecidual ou

ainda por irritantes exógenos (formalina, capsaicina, ácido acético), são também

responsáveis pela multiplicidade de eventos que ocorrem durante a transmissão da

dor, tanto no sistema nervoso periférico quanto central. Alguns mediadores atuam

através da interação com receptores acoplados a proteínas G, desencadeando a

formação de segundos mensageiros, como o adenosina monofosfato-cíclico (AMPc),

guanosina monofosfato-cíclico (GMPc), várias classes de proteínas quinase, inositol

trifosfato (IP

), diacilglicerol (DAG), aumento de cálcio intracelular e ativação de

canais iônicos. Estes eventos iniciais induzem a ativação secundária de quinases

intracelulares tais como a proteína quinase A (PKA) e PKC. Outros mediadores da

nocicepção ativam diretamente canais iônicos, os quais são capazes de alterar a

permeabilidade da membrana a íons (Pleuvry e Lauretti, 1996; Millan, 1999; Calixto

et al., 2000; Petersen-Zeitz e Basbaum, 1999; Woolf e Salter, 2000; Julius e

Basbaum, 2001; Parada et al., 2003).

Em processos dolorosos mais persistentes observam-se descargas ectópicas

espontâneas nas fibras aferentes primárias relacionadas a alterações nos canais

iônicos regulados por voltagem, desencadeando dor espontânea de origem nervosa

(Sah et al., 2003; Lai et al., 2003; Lograsso e Mckelvy, 2003). Estes canais estão

localizados na membrana plasmática de axônios lesados ou próximos ao local da

lesão, e/ou no gânglio da raiz dorsal (Holden e Pizzi, 2003; Lograsso e Mckelvy,

2003).

Os canais de sódio ativados por voltagem, os quais produzem um influxo de

íons Na

necessário para a produção de um potencial de ação regenerativo, estão

expressos em neurônios sensoriais primários e são alvos importantes no estudo da

patofisiologia molecular da dor e na procura de novas terapias (Waxman et al., 1999;

Petersen e Rowbothan, 2000; Veneroni et al., 2003).

Atualmente, vem crescendo o interesse pelo esclarecimento da possível

participação dos canais de cálcio nos processos de dor crônica. O íon Ca

entra nas

terminações nervosas através de canais e regula muitas funções, incluindo proteínas

relacionadas ao crescimento. Os canais de cálcio do tipo L e N estão diretamente

implicados na liberação de neurotransmissores e de neuromoduladores, como o

CGRP, nos neurônios sensoriais da medula espinhal. O bloqueio dos canais de

cálcio sensíveis à voltagem do tipo N e P/Q, mas não do tipo L, reduz os sinais

comportamentais da dor de origem neuropática em modelos animais de lesão

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nervosa, porém, a ausência de antagonistas seletivos para os diferentes tipos de

canais de Ca

torna difícil o entendimento de suas ações nos processos de dor

crônica (Matthews e Dickenson, 2001; Sekizawa et al., 2000; Dogrul et al, 2003).

Figura 2: Representação esquemática dos fatores responsáveis pela ativação de nociceptores

periféricos. + significa estimula e – significa inibe. Adaptado a partir de Hill, 2001.

2.1.2 Processamento central da dor

Os mediadores químicos liberados após diferentes estímulos fazem com que

a informação nociceptiva seja levada através das fibras aferentes ao SNC, para que

este a processe e responda adequadamente em cada situação (Figura 3).

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Figura 3 - Representação esquemática demonstrando a transmissão e o

processamento da dor da periferia ao SNC. First order: neurônio de primeira ordem;

dorsa root ganglion: gânglio da raiz dorsal; second order: neurônio de segunda ordem;

third order: neurônio de terceira ordem; thalamus: tálamo. Adaptado de Hill, 2001.

Inicialmente, os impulsos nociceptivos chegam através dos aferentes

primários na medula espinhal, mais precisamente no corno dorsal, área primária de

recebimento da maioria das informações somato-sensoriais (Coggeshall e Carlton,

1997). O corno dorsal da medula (Figura 4) é uma estrutura dividida em lâminas com

base em sua citoarquitetura, sendo que cada lâmina se caracteriza por receber tipos

diferentes de informações. As fibras aferentes primárias C e Aδ têm suas

terminações principalmente nas lâminas superficiais, mas também em lâminas mais

profundas do corno dorsal da medula espinhal, onde liberam diversos

neurotransmissores. Vários estudos mostram que as maiorias das fibras associadas

com a transmissão nociceptiva terminam na lâmina I (zona marginal) e II (substância

gelatinosa). Alguns estímulos somato-sensoriais provenientes da pele, músculos ou

vísceras também são capazes de chegar à medula espinhal através do corno ventral

(Besson e Chaouch, 1987).

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Figura 4 – Diagrama esquemático mostrando a localização das lâminas do corno dorsal da medula

espinhal que recebem as informações sensoriais oriundas dos terminais periféricos de fibras

nervosas nociceptivas aferentes. Adaptado a partir de Craig e Dostrovsky et al., 1999.

A partir da integração dos impulsos no corno dorsal, as vias nociceptivas

aferentes dão origem a diferentes modelos de projeção nas estruturas corticais e

supra-corticais. Neste estágio, os componentes sensoriais; discriminativos e afetivos,

bem como os componentes cognitivos, são atribuídos ao impulso nociceptivo

(Almeida et al., 2004).

Os diferentes feixes ascendentes que se formam devido à interação de

neurônios de primeira ordem com neurônios de segunda ordem no corno dorsal da

medula espinhal dão origem a diversas vias ascendentes que podem ser

classificadas em dois grupos: monossinápticas e polissinápticas (Millan, 1999;

Almeida et al., 2004)

As vias de projeção monossinápticas projetam-se diretamente a estruturas

cerebrais superiores e incluem os feixes: espinotalâmico, espinoreticular,

espinomesencefálico, espinoparabraquio-amigdalóide, espinoparabraquio-

hipotalâmico, espinohipotalâmico e neoespinotalâmico. O outro sistema, o

polissináptico, apresenta uma estação de retransmissão a neurônios de segunda

ordem que conduzem a informação nociceptiva aos centros superiores cerebrais e

consistem nos feixes paleoespinotalâmico, espinocervical e coluna dorsal

polissináptica (Millan, 1999, 2002; Almeida et al., 2004).

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Muitas destas vias ascendentes fazem conexões com neurônios de terceira

ordem no tálamo, que projetam seus axônios pela cápsula interna do córtex

somatosensorial até o giro pós-central, onde a localização do estímulo nociceptivo é

realizada; e giro anterior do cingulado, relacionado à interpretação emocional da dor

(Russo e Brode, 1998).

O organismo também possui mecanismos intrínsecos para o controle da dor,

pois após a estimulação de diferentes núcleos do tálamo, os sinais são transmitidos

para diversas estruturas cerebrais, onde a informação do presente contexto é

integrada com experiências do passado e processada para produzir a percepção da

dor e promover a resposta adequada que é enviada para a medula espinhal através

dos neurônios descendentes (Millan, 1999). Portanto, além de desempenhar

importante papel na interpretação da informação nociceptiva ascendente, as

estruturas supra-espinhais também estão fortemente envolvidas na modulação de

circuitos descendentes que controlam a dor.

Desde a descoberta, por Wall (1967), de que os neurônios presentes nas

lâminas (I, II e IV-VI) da medula espinhal estão sujeitos à modulação por estruturas

supra-espinhais, o entendimento do circuito modulatório descendente da dor tem

progredido drasticamente (Fields e Basbaum, 1999). A modulação e integração

descendente da informação nociceptiva é processada nesse circuito pelas vias

descendentes que se originam no tronco cerebral e outras estruturas como

hipotálamo, córtex, tálamo, núcleo magno da rafe, substância cinzenta periaquedutal

(PAG) e estruturas adjacentes da medula rostroventromedial (RVM) (Millan, 1999,

2002; Vanegas e Schaible, 2004). Os mecanismos descendentes modulam a

resposta nociceptiva por exercer suas ações em nociceptores presentes nas fibras

primárias aferentes, bem como em neurônios do corno dorsal, como interneurônios

excitatórios, interneurônios inibitórios e neurônios de projeção (Millan, 1999, 2002).

Uma das descobertas mais interessantes a respeito do circuito modulatório da

dor é que esse pode tanto facilitar quanto inibir a transmissão nociceptiva

(Liebeskind et al., 1973; Urban e Nagy, 1997; Porreca et al., 2002). Por exemplo, na

medula rostroventromedial estão presentes dois tipos de neurônios, as chamadas

células “liga” (on) e as células “desliga” (off), as quais estão envolvidas na

modulação nociceptiva (Fields e Basbaum, 1999). Postulou-se que as células

“desliga” (off), exercem inibição da nocicepção nas vias descendentes uma vez que

quando sua atividade está aumentada há uma inibição da transmissão nociceptiva.

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Por outro lado, as propriedades das células “liga” (on) tornam-se incompatíveis com

o conceito de sistema inibitório descendente, uma vez que parecem facilitar os

mecanismos nociceptivos no corno dorsal quando estão ativas (Fields e Basbaum,

1999). De maneira geral, a substância cinzenta periaquedutal deve excitar as

células-off e inibir as células-on na medula rostroventromedial (Fields et al., 1991).

Logo, o balanço entre a ativação dessas duas subpopulações de neurônios

determina a resposta a um estímulo nociceptivo periférico. No entanto, cada forma

de lesão induz um tipo diferente de neuroplasticidade sobre o sistema, fenômeno

que acontece, principalmente, em casos de dores persistentes.

Além da modulação descendente da informação nociceptiva envolver uma

série de estruturas cerebrais, como mencionado anteriormente, os sistemas de

neurotransmissores também estão envolvidos nesta conexão, como por exemplo, os

sistemas opióide, neuropeptídérgico, serotoninérgico, noradrenérgico, gabaérgico,

glutamatérgico, além de canabinóides endógenos entre outras substâncias (Millan,

2002).

É importante mencionar que tanto na dor clínica quanto na dor induzida em

modelos experimentais, não há, a princípio, um mediador ou uma via (ascendente

ou descendente) dominante que contribua para a condução e perpetuação do

estímulo nociceptivo. Dependendo do local, tipo e duração do estímulo e levando-se

em consideração componentes afetivos e emocionais, ocorre à ativação de múltiplos

canais sensoriais, que irão convergir e interagir com estruturas supra-espinhais,

promovendo a sensação global de dor (Millan, 1999).

2.1.3 Mediadores químicos

A ação direta ou indireta de mediadores químicos, tais como metabólitos do

ácido araquidônico (prostaglandinas e leucotrienos), aminoácidos ou seus derivados

(glutamato, noradrenalina, serotonina, dopamina e óxido nítrico), peptídeos (cininas,

taquicininas, CGRP, galanina, colecistocinina, peptídeo intestinal vasoativo),

proteínas (citocinas, fator de crescimento do nervo), entre outros, são responsáveis

pela multiplicidade de eventos que ocorrem durante a transmissão da dor, tanto no

sistema nervoso periférico quanto no central (Besson, 1999; Fürst, 1999; Millan,

1999; Calixto et al., 2000). Dentre os vários mediadores químicos da dor e/ou

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inflamação, o glutamato, o óxido nítrico, a substância P, as cininas, as

prostagladinas, desempenham papéis importantes.

2.1.3.1 Glutamato

O glutamato e seus receptores compreendem o sistema de

neurotransmissores excitatórios mais importante do sistema nervoso de mamíferos,

onde participam de diversos eventos fisiológicos e patológicos, como aprendizado,

memória, epilepsia, depressão, lesão cerebral causada por isquemia e outros

(Coderre, 1993; Dingledine e McBain, 1994; Lipton e Rosenberg, 1994; Thomas,

1995; Dickenson, 1997; Hudspith, 1997). As funções do glutamato foram descritas

inicialmente no sistema nervoso central, mas este neurotransmissor também exerce

um papel importante na sinalização de tecidos como ossos, pele, astrócitos, coração,

pâncreas e medula óssea (Skerry e Genever, 2001).

As ações desencadeadas pelo glutamato são mediadas através da ativação de

receptores localizados nas membranas neuronais pré e pós-sinápticas, bem como

nas membranas das células gliais (Meldrum et al., 1999). Os receptores

glutamatérgicos podem ser classificados de acordo com estudos farmacológicos e

moleculares, em duas classes distintas, os receptores glutamatérgicos “ionotrópicos”

(

GluRs) e os receptores glutamatérgicos “metabotrópicos” (

GluRs). Os

GluRs são

acoplados a canais iônicos, podendo ainda ser subdivididos em três tipos distintos

conforme sua permeabilidade a íons e ativação por ligantes, são eles: N-metil-D-

aspartato (NMDA), α-amino-3-hidroxi-5-metil-4- isoxazolpropionato (AMPA) e cainato.

Os receptores NMDA medeiam a transmissão excitatória lenta e são permeáveis

principalmente ao Ca

, com menor condutância ao Na

. Os receptores AMPA

medeiam a neurotransmissão excitatória rápida e são canais com grande

permeabilidade a cátions monovalentes (Na

e K

) e com baixa permeabilidade ao

(Dichter e Wilcox, 1997). Os receptores cainato diferem da maioria dos

receptores AMPA por serem relativamente permeáveis aos íons Ca

(Ozawa et al.,

1998).

Por outro lado, os

GluRs dividem-se em oito subtipos classificados em três

subgrupos de acordo com a sua homologia: o grupo I (

GluR 1 e 5), grupo II (

GluR 2

e 3) e grupo III (

GluR 4, 6, 7 e 8). Os

GluRs pertencem a uma família de receptores

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que estão acoplados às proteínas ligantes de nucleotídeos da guanina (proteínas G),

promovendo então a modulação de efetores intracelulares que por sua vez ativam

e/ou inibem diversos eventos de transdução de sinal (Osawa et al., 1998; Fundytus,

2001).

O glutamato, após ser liberado para o espaço extracelular e realizar sua ação

via seus receptores, é removido da fenda sináptica principalmente por sistemas de

transporte que são dependentes de sódio, localizados nos neurônios e principalmente

nas células gliais (Danbolt, 2001). A atividade de alguns receptores de glutamato, em

especial o receptor ionotrópico do tipo NMDA e alguns mecanismos de captação de

neurotransmissores são regulados pelo seu estado redox (Goslan e Ben-Ari, 1995;

Trotti et al., 1997; Tang e Aizenman, 1993). Um aumento nas concentrações de

glutamato na fenda sináptica leva à estimulação excessiva dos receptores

glutamatérgicos, desencadeando uma cascata de eventos intracelulares que incluem

aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, diminuição nos níveis de

enzimas antioxidantes e maior influxo de cálcio e sódio (Lafon-Cazal et al., 1993;

Reynolds e Hastings, 1995; Singh et al., 2003; Lipton e Rosenberg, 1994). Alguns

estudos têm demonstrado que o tratamento com compostos de selênio restabelece a

atividade de enzimas antioxidantes, reduz a peroxidação de lipídeos e previne a

morte celular em modelos de toxicidade pelo glutamato e seus agonistas (Porciúncula

et al., 2001; Savaskan et al., 2003).

Diversos estudos têm demonstrado que os receptores glutamatérgicos estão

diretamente envolvidos na transmissão nociceptiva aferente primária, tanto no

desenvolvimento quanto na manutenção da resposta nociceptiva (Aanonsen e

Wilcox, 1987, 1990; Mao et al., 1992; Coggeshall e Carlton, 1997). Neste sentido,

dados da literatura demonstram que substâncias capazes de bloquear os receptores

glutamatérgicos, tanto ionotrópicos quanto metabotrópicos, apresentam importante

efeito antinociceptivo em diferentes espécies de mamíferos, inclusive em humanos

(Lutfy et al., 1997; Neugebauer, 2002; Wiech et al., 2004).

Além disso, os antagonistas de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA

inibem tanto a produção como a manutenção do estado de hipersensibilidade

dolorosa em diversos modelos pré-clínicos de dores crônicas, e têm mostrado

eficácia em pacientes com estas patologias. Contudo, o mais potente e eficaz

agente disponível na clínica, a quetamina, produz efeitos colaterais importantes, tais

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como sedação, disforia e alucinação, que limitam sua utilização (Martin e Eisenach,

2001).

2.1.3.2 Óxido nítrico

O óxido nítrico (NO) é um importante mensageiro biológico que está envolvido

na trasmissão sináptica, tanto no sistema nervoso central quanto no periférico

(Ferreira et al., 1999). O NO é sintetizado enzimaticamente a partir do aminoácido L-

arginina através de três isoformas da sintase de óxido nítrico (NOS): a neuronal

(nNOS), a endotelial (eNOS) e a induzida (iNOS). As enzimas nNOS e eNOS são

constitutivas, enquanto a iNOS é induzida por vários estímulos. Contrariamente as

NOS constitutivas, que dependem do Ca

, a atividade da iNOS não depende do

influxo de cálcio na célula e a sua expressão está aumentada por estímulos

inflamatórios (Meller e Gebhar, 1993).

Depois de sintetizado, o NO ativa a enzima guanilato ciclase (GC), tida como

seu receptor fisiológico, que por sua vez converte a guanosina-5’-trifosfato em

guanosina-3’-5’-monofosfato cíclico (GMPc). O GMPc como segundo mensageiro,

pode ativar proteínas quinases, canais iônicos e fosfodiesterases (Moore et al.,

1991).

Por ser uma molécula gasosa pequena, muito reativa e que passa através de

membranas celulares facilmente, o NO é considerado um “transmissor retrógrado”,

isto é, a ativação de algum receptor (NMDA, por exemplo) no neurônio pós-sináptico

induz a produção de NO, que se difunde rapidamente e entra no neurônio pré-

sináptico, para modular sua atividade. O NO pode ser liberado após a estimulação

direta de fibras aferentes primárias de pequeno diâmetro, contribuindo para sua

excitabilidade após o estímulo nociceptivo, além de sensibilizar nociceptores (Moore

et al., 1991; Haley et al., 1992; Babbedge et al., 1993; Meller e Gebhart, 1993;

Yamamoto et al., 1993). Tem sido sugerido o uso de inibidores da síntese de NO em

casos nos qual a dor ou hiperalgesia são mediadas por receptores NMDA, já que o

NO é um dos principais mediadores produzidos após o aumento da concentração de

cálcio intracelular causada pela ativação desse receptor (Malmberg e Yaksh, 1993;

Rivot et al., 1999). Alguns estudos demonstraram que o ebselen e o disselento de

difenila, compostos orgânicos de selênio, inibem a iNOS, isoforma da óxido nítrico

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sintase que se torna ativa nos processos inflamatórios (Hattori et al., 1994; Ghisleni

et al., 2003; Porciúncula et al., 2003).

Uma característica marcante do NO é sua dualidade, ou seja, sua capacidade

de apresentar efeitos antagônicos em estados patológicos diversos, como por

exemplo, na dor. De fato, quando se utiliza ativadores ou inibidores da cascata L-

arginina/NO/GMPc, o NO pode agir como um agente pronociceptivo ou

antinociceptivo tanto em sítios periféricos quanto em supra-espinhais (Aley et al.,

1998). Por exemplo, tanto inibidores da NOS e/ou da guanilato ciclase solúvel (GCs)

quanto substrato da NOS exibem atividade antinociceptiva (Duarte et al., 1990;

Moore et al., 1991; Kawabata et al., 1993; Abacioglu et al., 2000; Souza e Prado,

2001). Contribuindo para a controvérsia sobre a dualidade de efeitos do NO,

diversos estudos demonstram que a administração de um inibidor da NOS e da

guanilato ciclase reduzem o efeito antinociceptivo causado por várias drogas, como

por exemplo, a dipirona, o sildenafil, o diclofenaco, a nimesulida, o meloxican, a

morfina, entre outras, possivelmente esse efeito ocorre por ativar a via do NO/GMPc

(Lorenzetti e Ferreira, 1996; Granados-Soto et al., 1997; Islas-Cadena et al., 1999;

Aguirre-Bañuelos e Granado-Soto, 2000; Jain et al., 2001; Ortiz et al., 2003; 2006).

Por outro lado, existem drogas com atividade antinociceptiva, provavelmente por

inibir a síntese de NO, pois quando é administrado em animais um precursor do NO,

a atividade dessas drogas é revertida (Meotti et al., 2006; Santos et al., 2005).

Uma explicação para esses efeitos contraditórios do NO podem ser devido a

diferenças dos modelos de dor experimental utilizados, pois diferentes tipos de

neurônios sensoriais primários podem estar envolvidos, como também dos níveis de

NO teciduais, o conteúdo intracelular de GMPc, as diferenças de drogas e dosagens

utilizadas e também ao uso de diferentes espécies animais.

2.1.3.3 Substância P

A substância P (SP) é um neuropeptídeo amplamente distribuído no

organismo, onde atua como neurotransmissor e neuromodulador. Recentemente,

receptores da SP (principalmente o subtipo NK

) foram observados não somente em

neurônios e células imunes como também em outras células periféricas, incluindo

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células ósseas (Goto et al., 2007). Porém, é no sistema nervoso central e periférico

que a SP atua como neurotransmissor das mensagens nociceptivas.

Este neuropeptídeo é sintetizado pelos neurônios do gânglio da raiz dorsal e

liberado nas fibras do tipo C em resposta a agressões ou a estimulações intensas

dos nervos periféricos (Basbaum e Jessell, 2000; Goto et al., 2007). Ela atua sobre

os receptores de neurocininas (NK

, NK

e NK

), preferencialmente no subtipo de

receptor NK

, o qual se localiza preferencialmente na lamina I do corno dorsal da

medula espinhal em uma variedade de espécies, incluindo humanos, macacos e

ratos (Regoli et al., 1994; Campos e Calixto, 2000; Harrison e Geppetti, 2001).

Dados da literatura demonstram a interação que existe entre a SP e o

glutamato na medula espinhal, de fato, os receptores NMDA pré-sinápticos

localizados nas terminações de fibras C facilitam e prolongam a transmissão da

mensagem nociceptiva, através da liberação de SP e glutamato (Malcangio et al.,

1998; Benoliel et al., 2000; Sakurada et al., 2002). Além disso, é importante salientar

que antagonistas seletivos de receptores NK1 e NMDA bloqueiam a hiperalgesia e

alodínia, sugerindo que estes receptores contribuem para a alteração da

transmissão nociceptiva (McLeod et al., 1999).

2.1.3.4 Cininas

As cininas, bradicinina (BK) e calidina (CAL) são peptídeos formados em

resposta a estímulos fisiológicos ou durante o processo inflamatório, a partir de

precursores chamados cininogênios, através da ação de enzimas denominadas de

cininogenases. O grupo mais importante de cininogenases é representado pelas

calicreínas, um grupo de proteases encontradas no sangue (calicreína plasmática) e

na maioria das glândulas exócrinas (calicreína tecidual) (Murray et al., 1990;

Beaubien et al., 1991; Okuse, 2007). A ação da calicreína plasmática sobre o

cininogênio resulta na formação do nonapeptídeo bradicinina. A calicreína tecidual

atuando sobre os cininogênios origina o decapeptídeo calidina (Lys-bradicinina)

(Okuse, 2007).

A ativação dos receptores B

e B

estimula a fosfolipase C e conseqüente

formação de IP

e diacilglicerol (DAG). O aumento dos níveis de IP

resulta em

aumento dos níveis intracelulares de cálcio (Lee et al., 1993), enquanto que a

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formação de DAG resulta na ativação de isoformas específicas de PKC (Tippmer et

al., 1994). Por sua vez, a PKC, também promove o aumento da concentração de

cálcio intracelular e ativa a fosfolipase A

(PL

) citosólica, enzima fundamental para

a produção de derivados do ácido araquidônico. A estimulação dos receptores para

cininas pode, ainda, ativar a adenilato ciclase, modular canais de potássio sensíveis

ao cálcio, estimular o transporte de íons cloreto e promover a formação de óxido

nítrico (Burch e Axelrod, 1987; Bhoola et al., 1992; Hall, 1992; Okuse, 2007).

Atuando nos receptores B

e B

, acoplados à proteína G, as cininas estão

implicadas em várias condições fisiopatológicas, especialmente nos processos

inflamatórios e na indução da nocicepção (Calixto et al., 2000; Marceau e Regoli,

2004; Okuse, 2007, Campos et al., 2007). Os receptores B

são considerados

relevantes no estágio crônico da inflamação e na hiperalgesia (Campos et al., 1998;

Calixto et al., 2000) e estão envolvidos nas respostas nociceptivas de origem

inflamatória e neurogênica (Corrêa e Calixto, 1993; Pesquero et al., 2000; Ferreira et

al., 2001; Marceau e Regoli, 2004).

Durante os últimos anos, muitos estudos surgiram na literatura na tentativa de

encontrar antagonistas dos receptores da bradicinina, especialmente antagonista B

para uma possível aplicação terapêutica no tratamento da dor (Wirth et al., 1991;

Sufka e Roach, 1996; Campos et al., 1999; Bock and Longmore, 2000; Fox et al.,

2005; Mattos et al., 2006; Campos et al., 2007).

2.1.3.5 Prostaglandinas

As prostaglandinas, produzidas tanto por células não neuronais quanto por

neurônios aferentes primários, são substâncias geradas a partir do ácido

araquidônico liberado dos fosfolipídeos de membrana pela ação da enzima PL

Uma vez formado, o ácido araquidônico é convertido nos prostanóides:

prostaglandinas e tromboxanos pela via da ciclooxigenase, leucotrienos e ácidos

hidroxieicosatetraenóicos pela via da lipoxigenase ou epóxidos lipídicos e dióis

através da via da epoxigenase (Cashman, 1996; Appleton, 1997; Zeilhofer, 2007).

Os produtos das ciclooxigenases, principalmente as prostaglandinas (PGE

PGD

, PGI

, PGF

), provocam comportamento nocifensivo e alodinia quando

administradas espinhalmente quando geradas após o estímulo nociceptivo têm a

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propriedade de aumentar a sensibilidade dos nociceptores à dor causada por

substâncias como histamina ou bradicinina (Ferreira, 1972; Minami et al., 1994;

Zeilhofer, 2007).

Dentre as prostaglandinas, a PGE

se destaca por ser uma das principais

prostaglandinas pró-nociceptivas liberadas perifericamente (Vanegas e Schaible,

2001). A PGE

exerce suas ações através da interação com receptores de

membrana específicos, que podem ser divididos em quatro subtipos: EP1, EP2, EP3

e EP4 (Coleman et al., 1994). Estes receptores pertencem à superfamília de

receptores acoplados à proteína G e ativam a adenilato ciclase ou a fosfolipase C

(PLC) (Machwate et al., 2001; Zeilhofer, 2007).

Foi demonstrado que a PGE

é liberada espinhalmente nos primeiros minutos

após a injeção intraplantar de formalina em ratos, o que mostra que, além de

sensibilizar neurônios, este prostanóide também pode participar do estabelecimento

da dor aguda (Malmberg e Yaksh, 1995). Nesse mesmo estudo, foi também

elucidado que, ao mesmo tempo em que a PGE

é liberada (0 - 10 min após a

injeção de formalina), ocorre à liberação de diversos aminoácidos excitatórios como

glutamato, aspartato, taurina e glicina e um indicador da produção de NO (citrulina)

que sabidamente estão envolvidos com a transmissão da nocicepção periférica

(Malmberg e Yaksh, 1995).

2.2 Dor inflamatória

Na maioria das situações, o processo inflamatório pode estar relacionado aos

mecanismos que envolvem a nocicepção (Levine e Reichling, 1999).

A inflamação caracteriza-se por um fenômeno complexo multimediado. Ela é

uma resposta desencadeada por traumas, lesões teciduais e invasão por agentes

infecciosos, com a finalidade de eliminar microorganismos ou outros agentes irritantes

e potencializar o reparo tecidual (Sherwood e Toliver-Kinsky, 2004). Os sinais clínicos

da inflamação, eritema, calor, inchaço e dor, foram descritos no início da era clássica

pelos gregos e romanos (Fantone e Ward, 1990). O quinto sinal da inflamação, lesão

aguda dos tecidos, com perda da função dos órgãos foi mencionado mais tarde por

Virchow, no século XIX (Rocha e Silva, 1978).

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Neste contexto, a inflamação pode ser classificada como aguda e crônica, de

acordo com o tempo de duração e características patológicas (Sherwood e Toliver-

kinsky, 2004). A inflamação aguda apresenta curta duração (horas a meses), durante

o processo inflamatório agudo, muitos mediadores como o NO e prostaglandinas,

como a PGI

, PGD

, PGE

e a PGF

2α

promovem principalmente a vasodilatação, um

dos sinais clássicos do processo inflamatório agudo, representado pelo calor e rubor

característicos da reação inflamatória (Sherwood e Toliver-Kinsky, 2004). Outro sinal

precoce da inflamação aguda é a formação do edema, que ocorre devido ao fluxo

transvascular de fluido rico em proteínas (plasma) dos compartimentos

intravasculares para o interstício devido ao aumento de permeabilidade vascular de

capilares e vênulas, como resultado da liberação de histamina, bradicinina,

leucotrienos, fatores do complemento, substância P e fator de agregação plaquetária

(PAF) no sítio inflamatório (Sherwood e Toliver-Kinsky, 2004). A vasodilatação e

formação de exsudato são geralmente acompanhadas da marginação, adesão e

migração de leucócitos, principalmente neutrófilos. Na fase aguda da resposta

inflamatória, ocorre a liberação de vários mediadores em especial componentes do

complemento como os fragmentos C3a e C5a, leucotrienos, quimiocinas como a IL-8

e ainda bioprodutos bacterianos como peptídeos N-formilados, que promovem a

quimiotaxia de leucócitos e outras células fagocíticas para o sítio da reação

inflamatória (Sherwood e Toliver-Kinsky, 2004; Aderem e Smith, 2004). A inflamação

aguda pode ser finalizada com a resolução de todos os eventos característicos da

reação inflamatória e retorno do tecido lesionado à normalidade ou sua substituição

por tecido conjuntivo (Gilroy et al., 2004; Aderem e Smith, 2004). A progressão da

resposta tecidual para inflamação crônica caracteriza-se por infiltração de células

mononucleares, que incluem macrófagos, linfócitos e plasmócitos. Os processos

inflamatórios crônicos são de duração prolongada estendendo-se de semanas a

meses. Durante a inflamação crônica ocorrem simultaneamente: a presença de

processo inflamatório ativo, tentativas de reparo tecidual com conseqüente destruição

do tecido e formação de fibrose (Gilroy et al., 2004; Sherwood e Toliver-Kinsky,

2004).

Tanto a liberação de mediadores primários quanto a síntese de novos

mediadores são responsáveis pela ativação e/ou sensibilização de nociceptores

adjacentes à lesão. A sensibilização dos nociceptores diminui o limiar de ativação e

aumenta a probabilidade de que estes disparem com estímulos de menor

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intensidade (Khasar et al., 1999; Coutaux et al., 2005; Holden e Pizzi, 2003). Desta

forma, estes nociceptores são ativados por estímulos que em condições normais

seriam inócuos (Finnerup e Jensen, 2004; Millan, 1999). Isto é bem evidenciado

através de modelos experimentais, onde a injeção de um agente pró-inflamatório

como o ACF sensibiliza os locais injetados, tornando estes animais responsivos a

estímulos térmicos e mecânicos inócuos a um animal não injetado (Larson et al.,

1986). De fato, a dor é uma característica peculiar da inflamação e a dor inflamatória

é o maior problema clínico em vários distúrbios inflamatórios, como, por exemplo, a

artrite reumatóide (MacMahon et al., 2005).

Portanto, nestas situações encontra-se um quadro de estimulação constante

dos nociceptores, a qual é responsável por alterações plásticas, não somente no

tecido nervoso periférico, mas também em nível central; isto é muito comum em

casos de neuropatia periférica, onde a lesão nervosa gera um processo inflamatório

crônico, com alterações plásticas no SNP e SNC (MacFarlane et al., 1997; Ji e

Woolf, 2001; Woolf e Salter, 2000; Coderre et al., 1993; Ji e Strichartz, 2004). De

fato, do ponto de vista clínico, um dos aspectos mais problemáticos da dor de

origem inflamatória é a possibilidade da progressão de um estado agudo para um

estado prolongado, podendo desta forma, aumentar a susceptibilidade de instalação

de um quadro de dor inflamatória crônica (Woolf e Mannion, 1999; Mendell e

Sahenk, 2003).

Nestas condições, a inflamação perde sua característica de proteção ao

organismo e torna-se uma patologia. A grande preocupação na busca dos

mecanismos que envolvem a inflamação é devido ao seu envolvimento em doenças

crônicas, incluindo câncer, diabetes, doença neurodegenerativas, cardiovasculares e

reumáticas (Kamiya et al., 2003; MacMhon et al., 2005; Garcia, 2005).

2.3 Dor neuropática

A dor neuropática foi definida em 1994 pela Associação internacional para o

do Estudo da Dor como a “dor iniciada ou causada por lesão primária ou disfunção

do sistema nervoso”.

A etiologia da dor neuropática é heterogênea e pode ser ocasionada a um

insulto primário ao sistema nervoso periférico ou central (Zimmermann, 2001).

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As neuropatias originam-se quando ocorre uma lesão nos nervos ou nas

demais estruturas que transmitem a sensação dolorosa e podem resultar de trauma

mecânico, lesão nervosa (amputação ou compressão), efeitos tóxicos de drogas,

doenças como diabetes ou síndrome da imunodeficiência adquirida (HIV/AIDS)

(Mendell e Sahenk, 2003).

A lesão de nervos periféricos é frequentemente acompanhada de inflamação

local transitória, a qual contribui para o início da sensação de dor. Neste sentido,

assim como na dor inflamatória, na dor neuropática estão envolvidos múltiplos

mediadores inflamatórios (Ji e Strichartz, 2004). Corroborando com isso, estudos

mostram que a extensão da hiperalgesia está diretamente relacionada com a

extensão da resposta inflamatória ao sítio da lesão do nervo (Clatworthy et al.,

1995). Além disso, drogas antiinflamatórias aliviam a hiperalgesia em modelos

animais de injúria do nervo (Clatworthy et al., 1995; Bennett et al., 2000).

Os mecanismos exatos da instalação do quadro de dor neuropática ainda não

são inteiramente compreendidos. No entanto, MacFarlane e colaboradores (1997)

sugerem que o desenvolvimento de dor crônica após lesão de nervo ocorra através

de alterações na medula espinhal, como excitabilidade aumentada, inibição

diminuída, restruturação organizacional das células e, eventualmente, mudança no

fenótipo. Estas alterações ocorrem principalmente devido a uma estimulação

excessiva dos nociceptores, uma vez que estes estão com limiar de ativação mais

baixo (hipersensibilidade) (Coutaux et al., 2005).

Na dor neuropática, assim como acontece no processo inflamatório, a ação

dos mediadores sobre seus receptores, tanto em nervos periféricos quanto centrais,

inicia uma cascata de sinalização que culmina na manutenção do potencial de ação.

Por ser um evento crônico, a principal característica desta patologia são mudanças

plásticas causadas por alterações na expressão gênica de receptores, canais

iônicos, proteínas intracelulares, neuromoduladores, mediadores de sinalização

extracelular, entre outros (Woolf e Mannion, 1999; Xiao et al., 2002; Ji e Strichartz,

2004; Quintão et al., 2006).

Assim, os mecanismos patofisiológicos da dor neuropática refletem, em

grande parte, aqueles ocorridos na inflamação, embora, alguns autores relatem que

a lesão de nervo produz, em neurônios aferentes primários, alterações

neuroquímicas ligeiramente distintas daquelas produzidas na inflamação (Woolf e

Mannion, 1999; Yajima et al., 2003).

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2.4 Selênio

2.4.1 Características químicas

O elemento selênio foi descoberto em 1817, pelo químico sueco Jöns Jacob

Berzelius. Esse elemento químico é um calcogênio do grupo 16 da tabela periódica,

que pode se apresentar sob quatro estados de oxidação: selenato (Se

), selenito

(Se

), selênio elementar (Se

) e seleneto (Se

-2

). O Se compartilha propriedades

químicas e físicas com o enxofre (S). Esta similaridade permite que o Se substitua o

S, promovendo interações Se-S nos sistemas biológicos. Por outro lado, as

diferenças nas propriedades físico-químicas entre Se e S constituem a base de seus

papéis biológicos específicos (Stadtman, 1980). Os selenóis (R-SeH) são as formas

correspondentes aos tióis (R-SH), onde ocorre a substituição do átomo de S pelo

átomo de Se (Klayman e Günther,1973).

2.4.2 Biodisponibilidade do selênio

Nos mamíferos, o selênio parece ser rapidamente absorvido no duodeno,

seguido pelo jejuno e íleo. Além do trato gastrintestinal, o selênio pode ser absorvido

por tecidos cutâneos e inalação. Estas duas últimas vias de absorção de selênio

estão relacionadas com a exposição e intoxicação ocupacional por compostos de

selênio (Whanger et al.,1976).

Após a absorção, os maiores níveis de selênio estão localizados nos

eritrócitos, fígado, baço, coração, unha e esmalte de dentes (Martin e Gerlack,

1972). Em animais intoxicados cronicamente, o selênio é depositado principalmente

nos rins e fígado, seguido pelo pâncreas, baço e pulmões (Wilber, 1980). A primeira

evidência de que os compostos de selênio são metabolizados em animais foi

determinada após um longo período de tratamento com selenito de sódio. Os

animais apresentavam odor gárlico característico, que posteriormente demonstrou

ter sido causado pelo seleneto de dimetila (Klayman e Gunther, 1973). Esse

composto pode ser resultado da detoxicação metabólica de muitos compostos de

selênio, a qual envolve uma série de metilações dependentes da S-

adenosilmetionina (Hoffman e McConnell, 1986).

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O selênio pode ser eliminado por três vias excretoras: urina, fezes e ar

expelido. Por ser excretado na urina essa pode ser usada como indicadora em

casos de intoxicações ou de exposição a altos níveis do elemento (Valentine et al.,

1978). Recentemente, foi demonstrado que dentro dos níveis normais de selênio, ou

seja, não tóxicos, a principal forma encontrada na urina é como seleno-açúcar,

entretanto, nos caso de doses tóxicas de selênio, o marcador biológico encontrado

na urina é o trimetilselenônio (Suzuki et al., 2006). A excreção de selênio pelo ar

expirado é realizada basicamente pelo composto volátil seleneto de dimetila e tem

sido detectado na respiração de indivíduos expostos acidentalmente a níveis altos

desse elemento (Mozier et al, 1988).

2.4.3 Atividade biológica

O interesse em relação ao selênio tem crescido nos últimos anos, devido à

descoberta do selênio como um elemento traço essencial (Schwartz e Foltz, 1957)

cuja concentração pode ocasionar deficiência ou toxicidade. De fato, quando a

ingesta diária excede a capacidade corporal de eliminação, algum tipo de

intoxicação e/ou patologia pode surgir.

No ano de 1930, o selênio foi reconhecido como uma substância tóxica

quando cavalos do oeste da China que se alimentaram de plantas com grande

potencial de acumular este elemento apresentaram sintomas de envenenamento,

como perda de cascos, pêlos e anemia (Spallholz, 1993). As patologias mais

comuns associadas à toxicidade do selênio são: a doença alcalina (alkali disease),

uma doença de caráter crônico, e o falso cambalear (blind staggers), uma doença de

caráter agudo que compromete o SNC (Martin e Gerlack, 1972). O homem é

suscetível a intoxicação por selênio, principalmente pelo amplo uso na indústria,

particularmente na síntese de compostos, uma vez que este elemento constitui um

importante intermediário em síntese orgânica (Wilber, 1980). Como não existe um

tratamento adequado para as intoxicações de selênio (selenoses), pode-se utilizar

compostos que reduzam a sua toxicidade, tais como o ácido ascórbico (Svirbely,

1938), o arsênio (capaz de aumentar a excreção biliar); a metionina (administrada

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com a vitamina E, as quais protegem o tecido hepático de necroses causadas por

selenoses crônicas) (Okamoto e Günther, 1972; Wilber, 1980).

Por outro lado, a importância do selênio como elemento traço essencial na

dieta foi reconhecida após a descoberta da doença de Keshan, uma cardiopatia

infantil com alta incidência em algumas regiões da China onde o solo é

extremamente pobre em selênio (Ge e Yang, 1993).

Nos últimos anos, têm sido descrito que baixos níveis de selênio podem levar

à predisposição para o desenvolvimento de algumas doenças, tais como câncer,

esclerose, doença cardiovascular, cirrose e diabetes (Navarro-Alarcón e López-

Martinez, 2000). Outras patologias associadas à deficiência de selênio, encontradas

em humanos são: problemas musculares, alterações digestivas, doenças

cardiovasculares e alterações reumáticas (Neve et al., 1987; Ortuño et al., 1996).

O selênio também exerce influência em patologias associadas aos

transtornos de humor, uma vez que a carência de selênio parece levar a um estado

de humor mais deprimido (Hawkes e Hornbostel, 1996) e o aumento no consumo

deste elemento estabiliza o humor e diminui o estado depressivo e outros sintomas

negativos do humor como ansiedade, confusão e hostilidade (Benton e Cook, 1991,

Finley e Penland, 1998). Neste contexto, a suplementação de dietas com selênio,

tanto para animais quanto para humanos, tem sido aceita pela comunidade

científica. Para humanos, a Junta de Alimentação e Nutrição da Academia de

Ciências dos Estados Unidos propõe uma ingestão diária de 50 - 200 µg, podendo

ser encontrado nos seguintes alimentos: castanha-do-pará, alho, cebola, brócolis,

cogumelos, cereais, pescados, ovos e carnes (Dumont et al., 2006; Reilly, 1996).

Este calcogênio apresenta um grande número de funções biológicas, sendo a

mais importante como antioxidante. Além disso, o Se está presente como resíduo de

selenocisteína no sítio ativo das enzimas glutationa peroxidase (Flohé et al., 1973),

tioredoxina redutase (Holmgren, 1985), 5’-deiodinase (Behne e Kyriakopoulos, 1990)

e selenoproteina P (Ursini et al., 1990), sendo que a atividade redox do Se tem

fundamental importância para o sítio catalítico dessas enzimas.

Portanto, a partir da descoberta do papel essencial do selênio nos sítio ativo

de enzimas e do conceito de que moléculas contendo selênio podem ser melhores

nucleófilos (e, portanto antioxidantes) que os clássicos antioxidantes, (Arteel e Sies,

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2001) se intensificou a síntese e o interesse em compostos orgânicos contendo

selênio.

2.5 Compostos orgânicos de selênio

Nos últimos anos, os compostos orgânicos de selênio têm sido alvos de

interesse em síntese orgânica em virtude da descoberta de suas aplicações

sintéticas de suas propriedades farmacológicas e por apresentar menor toxicidade

em relação às espécies inorgânicas (Parnham e Graf, 1991; Kanda et al., 1999;

Nogueira et al., 2004). Dentre os compostos orgânicos de selênio estudados no

nosso grupo de pesquisa se destacam o ebselen e o disseleneto de difenila.

2.5.1 Ebselen

O ebselen (2-fenil-1,2-benzilsoselenazol-3(2H)-ona) (Figura 5) é um

composto orgânico de selênio que apresenta propriedade antioxidante similar à

selenoenzima glutationa peroxidase (Parnhan e Graf, 1991). Esse composto possui

baixa toxicidade, pois ele não libera selênio de sua molécula (Parnhan e Graff,

1987). De fato, Wendel e colaboradores (1984) demonstraram que em animais

deficientes de selênio, a atividade da enzima glutationa peroxidase não aumentava

pela suplementação com ebselen.

O ebselen apresentou importantes efeitos como antioxidante na redução da

peroxidação lipídica e pelas reações com grupos sulfidrílicos (-SH) em diferentes

tecidos (Sies e Arteel, 2000; Rossato et al., 2002; Davis et al., 2004; Nowak et al.,

2006). Além disso, esse composto apresenta efeitos protetores em diversos

modelos de isquemia tais como: cerebral, cardíaca, hepática e em um modelo in

vitro, pela privação de glicose e oxigênio (Osaki et al., 1997; Tan et al., 1997;

Takasago et al., 1997; Kondoh et al., 1999; Imai et al., 2001; Porciúncula et al.,

2003). Neste contexto, o ebselen causou neuroproteção em pacientes que sofreram

acidente vascular cerebral isquêmico em um ensaio clínico de fase III (Yamaguchi et

al., 1998), e, além disso, quando administrado em humanos, diminuiu os déficits

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neurológicos provocados por hemorragia de aneurisma subaracnóide (Saito et al.,

1998). Devido aos diversos indicativos clínicos de redução de danos cerebrais após

aneurisma, este composto aponta como um promissor agente neuroprotetor (Saito

et al., 1998; Porciúncula et al., 2001; 2003). Em modelos de primatas, o Ebselen

reduz os sintomas da doença de Parkinson induzidos pelo íon 1- metil - 4-

fenilpiridina (MPP

) (Moussaoui et al., 2000).

Além dessas propriedades, o ebselen possui atividades antiinflamatórias, as

quais podem ser devido a sua capacidade de inibir algumas enzimas envolvidas no

processo inflamatório e por reduzir a síntese e a liberação de citocinas pró-

inflamatórias (Parnhan e Graf, 1987; 1991; Haddad et al., 2002; Walther et al.,

1999). O ebselen também inibe a formação de leucotrienos sintetizados pela via da

lipoxigenase 5, e em granulócitos inibe a atividade da PKC e da NADPH oxidase

(Schewe et al., 1995; Cotgreave et al., 1989; Mugesh et al., 2001). Além disso, o

ebselen inibe in vivo e in vitro a enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS),

isoforma da óxido nítrico sintase que se torna ativa nos processos inflamatórios

(Hattori et al., 1994; Porciúncula et al., 2003).

Recentemente, estudos têm investigado a habilidade deste composto na

supressão de enzimas envolvidas no processo apoptótico e vias de sinalização,

colaborando para a elucidação de outros mecanismos que possam estar envolvidos

nas propriedades farmacológicas do ebselen (Yoshizumi et al., 2002, 2004; Xu et al,

2006). Em estudos in vitro com tecidos e células do SNC o ebselen apresentou

efeito protetor contra a excitotoxidade provocada pelo glutamato, bem como

demonstrou alterar alguns parâmetros do sistema glutamatérgico (Porciúncula et al.,

2001, 2004; Nogueira et al., 2002). Além disso, Herin et al (2001) sugeriram que o

efeito neuroprotetor do ebselen em injúrias provocadas pelo glutamato e seus

agonistas, pode ser em parte devido a sua direta interação com o sítio modulatório

redox do receptor de glutamato do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA). No entanto,

este composto quando administrado por infusão direta na região CA1 do hipocampo

prejudica a perfomance dos animais na tarefa de esquiva inibitória, sugerindo que o

ebselen pode prejudicar os processos de aquisição, consolidação e evocação da

memória (Porciúncula et al., 2002).

A toxicidade do ebselen envolve principalmente, a oxidação de grupos–SH de

moléculas biologicamente ativas (Young et al., 1981). De fato, diversos trabalhos

demonstraram que esse composto, inibe a atividade de enzimas sulfidrílicas,

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incluindo, a Na

-ATPase (Borges et al., 2005b), δ-aminolevulinato desidratase

(Nogueira et al., 2003c) e a 5-lipoxigenase (Schewe, 1995).

Figura 6 - Estrutura química do ebselen

2.5.2 Disseleneto de difenila

O disseleneto de difenila (figura 6) é um composto orgânico que contém Se,

portanto um organocalcogênio. Nos últimos anos, na tentativa de buscar novos

fármacos que poderão representar uma nova alternativa terapêutica no combate

e/ou controle de patologias, o nosso grupo de pesquisa tem investigado amplamente

as propriedades farmacológicas e /ou toxicológicas do disseleneto de difenila.

Figura 6 - Estrutura química do disseleneto de difenila

2.5.2.1 Propriedades farmacológicas

O composto disseleneto de difenila é conhecido por ser mais ativo como

mimético da selenoenzima glutationa peroxidase (Meotti et al., 2004) que o ebselen.

De acordo com isso, em diversos trabalhos o disseleneto de difenila tem-se

apresentado como um bom agente antioxidante na redução da peroxidação de

lipídeos provocada por diversos agentes e em diferentes tecidos (Meotti et al., 2004;

Santos et al., 2004; 2005; Posser et al., 2006)

Dados da literatura também indicam que esse composto orgânico de selênio

apresenta várias propriedades farmacológicas, tais como anti-úlcera (Savegnago et

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al., 2006), neuroprotetor (Ghislene et al., 2003), hepatoprotetor (Borges et al., 2005;

2006), anti-hiperglicemiante (Barbosa et al., 2006) e também protege contra a

discinesia orofacial induzida por reserpina e haloperidol (Burger et al., 2004, 2006).

Além disso, Rosa et al (2006) demonstraram que o disseleneto de difenila

administrado em camundongos induz facilitação da formação da memória, sem

causar neurotoxicidade comportamental.

Estudos recentes do nosso grupo relataram que o disseleneto de difenila

quando administrado pela via subcutânea apresenta ação antinociceptiva e

antiinflamatória mais potente que ebselen, em camundongos e ratos (Nogueira et al.,

2003b; Zasso et al., 2005). Sendo que, o possível mecanismo envolvido na ação

antinociceptiva do disseleneto de difenila parece envolver a via serotoninérgica, mas

não os sistemas opióide, dopaminérgico, colinérgico muscarínico e o adrenérgico

(Zasso et al., 2005). Semelhante ao ebselen, o disseleneto de difenila também inibe

a enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS), isoforma da óxido nítrico sintase que

se torna ativa nos processos inflamatórios (Ghisleni et al., 2003).

É importante salientar que nas doses nas quais o disseleneto de difenila

apresenta atividade farmacológica ele não apresenta toxicidade.

2.5.2.2 Propriedades toxicológicas

Além das propriedades farmacológicas, alguns estudos, entretanto, descrevem

que o disseleneto de difenila induz efeitos toxicológicos.

Estudo do nosso laboratório demonstrou que a toxicidade do disseleneto de

difenila depende tanto da via de administração quanto da espécie animal avaliada

(ratos ou camundongos). De fato, quando o disseleneto de difenila foi administrado

em diferentes doses pela via subcutânea (s.c.) em ratos e camundongos, esse

composto não causou nenhum sinal de neurotoxicidade e morte dentro de um

período de observação de 72 horas, isso pode ser atribuído a uma baixa taxa de

absorção e perda de metabolização do composto. A DL

obtida tanto para ratos

quanto para camundongos foi > 500 µmol/Kg (156 mg/Kg). Por outro lado, quando o

disseleneto de difenila foi administrado em diferentes doses pela via intraperitoneal

(i.p.) em ratos e camundongos, os parâmetros toxicológicos foram alterados. Por

exemplo, a administração i.p. desse composto em camundongos alterou os níveis de

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creatinina e induziu morte e convulsão, o que poder ser devido à rápida absorção e

ao metabolismo de primeira passagem no fígado, a DL

obtida foi de 210 µmol/kg

(65 mg/kg). Entretanto, em ratos a administração intraperitoneal do disseleneto de

difenila não alterou os parâmetros hepáticos (aspartato amino transferase - AST; e

alanina amino transferase - ALT) e renais (uréia e creatinina) e a DL

obtida foi de

1200 µmol/kg (374 mg/kg). A partir desses dados, pode-se sugerir que o disseleneto

de difenila é mais tóxico em camundongos que em ratos (Nogueira et al., 2003a).

Neste contexto, é importante mencionar que o disseleneto de difenila é

conhecido por ser menos tóxico que o ebselen. Isso é comprovado, quando ratos

são tratados com esses dois compostos pela via intraperitoneal, o valor da DL

para

o disseleneto de difenila é cerca de três vezes maior que o ebselen (valores da DL

= 1200 e 400 µmol/kg, respectivamente) (Nogueira et al., 2003a; Meotti et al., 2003).

Além disso, o ebselen apresenta potência letal semelhante em ratos e camundongos

quando administrado pela via i.p. (valores da DL

: 400 e 340 µmol/kg,

respectivamente). Por outro lado, quando o ebselen é administrado pela via

subcutânea, ele não induz efeitos tóxicos, tanto para camundongos como para ratos,

semelhante como acontece para o disseleneto de difenila.

Alguns estudos demonstraram que após a exposição crônica ou aguda a altas

doses do disseleneto de difenila em camundongos, este composto ocasiona a

deposição de selênio no fígado, rim e cérebro, demonstrando o potencial tóxico

desse composto (Jacques-Silva et al., 2001; Maciel et al., 2003). Esses resultados

suportam a idéia que o disseleneto de difenila atravessa a barreira cérebro-sangue

sendo o cérebro um dos órgãos alvo de toxicidade desse composto. De acordo com

isso, Brito et al. (2006) demonstraram que a administração do disseleneto de difenila

antes do tratamento com pentilenotetrazol (PTZ; um antagonista GABA

) causa

neurotoxicidade em camundongos, o qual foi verificado pelo aumento na

suscetibilidade para a convulsão química induzida pelo PTZ e pelo aumento da

incidência de morte nestes animais. Além disso, outros estudos relatam que a

administração do disseleneto de difenila causa danos cerebraisl tanto in vitro quanto

in vivo em ratos e camundongos (Maciel et al., 2000; Nogueira et al., 2001)

O composto disseleneto de difenila demonstrou ainda afetar alguns

parâmetros do sistema glutamatérgico em cérebro de ratos in vivo e in vitro

(Nogueira et al., 2001) e em ensaios in vitro com plaquetas humanas (Borges et al.,

2004). Outros estudos relatam que o disseleneto de difenila inibe a atividade de

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enzimas sulfidrílicas, incluindo a δ-aminolevulinato desidratase (Nogueira et al.,

2003c; Maciel et al., 2000) e a Na

-ATPase (Borges et al., 2005b), provavelmente

devido à interação com os grupos -SH da enzima.

Conforme estudos realizados em nosso grupo de pesquisa, o disseleneto de

difenila também altera alguns parâmetros reprodutivos, como por exemplo: causa

mal-formação óssea e outras anomalias em fetos de ratas tratadas com este

composto (Favero et al., 2005); induz alterações no desenvolvimento e em

parâmetros comportamentais nos filhotes de ratas expostas a esse composto no

período lactacional (Favero et al., 2006); e administrações repetidas desse

composto em ratas grávidas no período da organogênese induzem um retardo no

desenvolvimento do esqueleto fetal (Weis et al., 2007). Por outro lado, mais

recentemente, Favero et al (2007) demonstraram que ratos adultos machos

expostos por um período sub-crônico ao disseleneto de difenila não apresentaram

alterações nos fetos de ratas não expostas a esse composto.

Assim, devido às inúmeras propriedades descritas para o disseleneto de

difenila, o nosso objetivo geral foi avaliar o potencial antinociceptivo e biológico do

disseleneto de difenila administrado pela via oral em camundongos, bem como

estender o nosso estudo sobre esse composto orgânico de selênio, uma vez que,

existe uma intensa busca por fármacos que poderão representar uma nova

alternativa terapêutica no combate e/ou controle de patologias.

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3- OBJETIVOS

Considerando que:

- É de fundamental importância estender o nosso estudo sobre o disseleneto de

difenila, uma vez que, este apresenta inúmeras propriedades farmacológicas,

sendo que estas foram obtidas a partir da sua administração pela via s.c. ou i.p.;

- O disseleneto de difenila apresenta atividade antinociceptiva e antiinflamatória

quando administrado pela via s.c. em ratos e camundongos.

Os objetivos do presente estudo foram:

(1) Investigar a toxicidade aguda induzida pelo disseleneto de difenila quando

administrado pela via oral em camundongos com o propósito de oferecer

segurança no uso desse composto, bem como estender o nosso estudo sobre

esse composto orgânico de selênio. Para avaliar a toxicidade foram utilizados

dois parâmetros de estudo: curva dose-resposta, onde se observou o índice de

letalidade dos animais que receberam o composto e também foram realizadas

dosagens bioquímicas, a fim de avaliar a funcionalidade hepática e renal dos

camundongos.

(2) Avaliar a ação do disseleneto de difenila, administrado pela via oral, no controle

da nocicepção aguda e crônica através de estudos farmacológicos “in vivo”,

utilizando diferentes protocolos experimentais de dor em camundongos, assim

como avaliar os possíveis mecanismos de ação envolvidos nesta atividade

antinociceptiva. As ações do disseleneto de difenila sobre a nocicepção aguda

foram investigadas utilizando modelos químicos e térmicos de nocicepção em

camundongos. Por sua vez, os efeitos do disseleneto de difenila sobre a

nocicepção crônica foram avaliados através da administração intraplantar de

ACF (modelo de nocicepção inflamatória crônica) e ligadura parcial do nervo

ciático (modelo de nocicepção neuropática) em camundongos.

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4- ARTIGOS CIENTÍFICOS

Os resultados que fazem parte desta tese estão apresentados sob a forma de

artigos científicos, os quais se encontram aqui organizados. Os itens Materiais e

Métodos, Resultados, Discussão dos Resultados e Referências Bibliográficas,

encontram-se nos próprios artigos.

Os Artigos 1 e 2 estão dispostos da mesma forma que foram publicados na

edição das revistas científicas. O Artigo 3 está submetido e o Artigo 4 recentemente

foi aceito e ainda não se encontra no formato da revista.

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4.1 Propriedades antinociceptivas do diseleneto de difenila: Evidências de

mecanismos de ação

4.1.1 Artigo 1

Antinociceptive properties of diphenyl diselenide: Evidences for the mechanism

of action

Lucielli Savegnago, Larissa G. Pinto, Cristiano R. Jesse, Diego Alves,

Joao B.T. Rocha, Cristina W. Nogueira, Gilson Zeni

European Journal of Pharmacology

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4.2 Mecanismos espinhas na ação antinociceptiva causada pelo disseleneto de

difenila

4.2.1 Artigo 2

Spinal mechanisms of antinociceptive action caused by diphenyl diselenide

Lucielli Savegnago, Larissa G. Pinto, Cristiano R. Jesse, João B. T. Rocha, Cristina W.

Nogueira, Gilson Zeni

Brain research

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4.3 Envolvimento da via do óxido nítrico/GMP cíclico/canais de Ca

e K

ação antinociceptiva causada pelo disseleneto de difenila no teste da

formalina

4.3.1 Artigo 3

Involvement of nitric oxide/cyclic GMP/ Ca

and K

- channels pathway in the

antinociception caused by diphenyl diselenide in the formalin test

Lucielli Savegnago, Cristiano R. Jesse, Larissa G. Pinto, Adair R.S. Santos

João B. T. Rocha, Cristina W. Nogueira, Gilson Zeni*

Submetido a Brain Research

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Involvement of nitric oxide/cyclic GMP/ Ca

and K

- channels

pathway in the antinociception caused by diphenyl diselenide in the

formalin test

Lucielli Savegnago

, Cristiano R. Jesse

, Larissa G. Pinto

, Adair R.S. Santos

João B. T. Rocha

, Cristina W. Nogueira

, Gilson Zeni

Departamento de Química, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade

Federal de Santa Maria, SM, RS, CEP 97105-900 Santa Maria, Brazil

Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Federal de Santa Catarina,

Florianópolis 88040-900, SC, Brazil

Abbreviated title: Diphenyl diselenide exerts antinociceptive properties

- The manuscript whole containing 29 pages

- The manuscript containing 3 figures

*Correspondence should be sent to:

Gilson Zeni

Laboratório de Síntese, Reatividade e Avaliação Farmacológica e Toxicológica de

Organocalcogênios, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de

Santa Maria, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil.

Phone: 55-55-32208140

FAX: 55-55-32208978

E-mail: gzeni@quimica.ufsm.br

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Abstract

Diphenyl diselenide (PhSe)

injected orally (p.o.) into the mouse caused

antinociception against the first and second phase of formalin test, with mean ID

values of 25.55 (9.52 - 68.58) and 6.45 (1.75 - 23.8) mg/kg, respectively. This

compound also significantly inhibited (43 ± 4%) the mice paw oedema induced by

intraplantar injection (i.pl.) of formalin. (PhSe)

(10 mg/kg), given 5 min after the

formalin injection, revealed a significant inhibition (71 ± 6%) in the second phase of

the formalin-induced pain, whereas the prophylactic treatment caused more intense

inhibition (89 ± 3%). The antinociceptive effect caused by (PhSe)

(10 mg/kg, p.o.) in

the formalin test was prevented by intrathecal (i.t.) injection of several K

channels

blockers such as apamin and charybdotoxin (small - and large -conductance Ca

2+-

activated K

channel inhibitors, respectively), tetraethylammonium (TEA, non-

selective voltage-dependent K

channel inhibitor), but not glibenclamide (ATP-

sensitive K

channel inhibitor). The antinociceptive action caused by diphenyl

diselenide (10 mg/kg, p.o.) in the formalin test was also blocked by a nitric oxide (NO)

inhibitor (N

-nitro-L-arginine; L-NOARG) and guanylate cyclase inhibitors (1H-

[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one, ODQ and methylene blue. These results

suggested the participation of nitric oxide/cyclic GMP/Ca

and K

channel pathways

on the antinociceptive effect caused by diphenyl diselenide, but its precise site of

action remains unclear.

Keywords: Diphenyl diselenide, selenium, antinociceptive, nitric oxide system, K

channels

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1. Introduction

Nitric oxide (NO) is an important messenger in the central nervous system. It

has been suggested that NO may be involved in the pathophysiology of Alzheimer’s

disease, cerebral ischemia, alcohol-induced brain damage, long-term potentiation,

learning, memory, wakefulness, circadian rhythm, nociception, olfaction, food intake,

drinking, regulation of neurotransmitter release, and anxiety (Dawson and Dawson,

1996). Some reports have indicated that NO affects many functions such as pain

(Kawabata et al., 1993; Sousa and Prado, 2001; Prado et al., 2002), synaptic

plasticity (Li and Wieraszko, 1994) and neuronal damage (Nara et al., 1999;

Weissman et al., 1992) biphasically. In agreement, there is evidence that L-

arginine/nitric oxide/cGMP pathway may be involved in peripheral and central

nociceptive processing (Duarte et al., 1990; Souza and Prado, 2001). It has been

reported that increased NO production induces hyperalgesia and that NOS-inhibitors

can suppress pain. Paradoxically, results from recent research have also implicated

NO as a mediator or modulator in analgesic drug function (Souza and Prado, 2001).

Selenium compounds display antioxidant, neuroprotective, antihypertensive,

anticancer, antiviral, immunosuppressive, antimicrobial and anti-inflammatory

properties (Sies, 1993; Schewe, 1995; May, 1999; Nogueira et al., 2003; Meotti et al.,

2004; Zasso et al., 2005; Savegnago et al., 2007a, b, c). Because of these, a great

number of novel pharmaceutical agents which are selenium-based or which target

specific aspects of selenium metabolism are under development (May, 1999;

Nogueira et al., 2003; Meotti et al., 2004).

The organic selenium compound, ebselen, is a classical antioxidant and well

known as the most important glutathione peroxidase mimetic agent (Daiber et al.,

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2000). Furthermore to its peroxidase-like activity, ebselen has anti-inflammatory

activity in different models of inflammation (Parnhan and Graf, 1987; Schewe, 1995),

which may be related at least in part to its capability to scavenge peroxynitrite, a

potent inflammatory mediator (Sies and Arteel, 2000). The mechanism(s) underlying

the anti-inflammatory activity of ebselen is still not completely understood but is

linked to inhibition of NADPH-oxidase, protein kinase C, nitric oxide synthase and

lipoxygenases most likely by interacting with critical thiol/disulfide groups in these

enzymes (Cotgreave et al., 1989; Walther et al., 1999; Mugesh et al., 2001).

Similarly, diphenyl diselenide, a simple diaryl diselenide, is known as a drug

which induces minor toxic effects when administered acutely to mice at doses that

has antinociceptive and anti-inflammatory activities when assessed against chemical

and thermal behavioral tests (Nogueira et al., 2003; Zasso et al., 2005; Savegnago et

al., 2007a). We have previously reported that diphenyl diselenide produces

antinociception in several models of pain through a complex mechanism that likely

involves an interaction with the serotoninergic, glutamatergic and nitrergic pathways,

as well as peptidergic and vanilloid systems (Savegnago et al., 2007a, b). More

recently, we demonstrated that diphenyl diselenide also produces systemic anti-

allodynic action in two models of persistent inflammation and neuropathic pain and

attenuates acute hyperalgesia induced by glutamate, NMDA, bradykinin and PGE

mice (Savegnago et al., 2007c).

Nowadays, few drugs are effective in treating pathological (acute and chronic)

pain, and in general, these drugs present low efficacy and numerous side effects

(Woolf and Mannion, 1999; Mendell and Sahenk, 2003). For that reason, the search

for new compounds that could be applied in acute and chronic pain therapy has been

essential.

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Thus, despite the growing amount of experimental data the precise

mechanisms through which diphenyl diselenide causes systemic antinociception in

rodents still remain elusive. Therefore, the goal of the present study was to further

investigate the mechanisms involved in the antinociceptive action caused by diphenyl

diselenide. To this end, we carried out experiments to determine the possible

participation of the nitric oxide/cyclic GMP/ Ca

and K

- channels pathway in the

antinociception induced by diphenyl diselenide in the formalin test.

2. Results

2.1. Effect of diphenyl diselenide on formalin-induced nociception

The result in Fig. 1 (A) show that diphenyl diselenide (10-100 mg/kg, p.o.)

caused a significant inhibition in the first phase (0 - 5 min) of the formalin-induced

licking. Furthermore, diphenyl diselenide administered, p.o., at the doses of 1 -100

mg/kg, elicited significant inhibition in the second (15 - 30 min) phase of formalin test

(Fig. 1B). The calculated mean ID

for these effects were: 25.55 (9.52 - 68.58) for

the first phase and 6.45 (1.75 - 23.8) mg/kg for the second phase, and the

percentage of inhibition observed was 76 ± 3 and 97 ± 1%, respectively.

Furthermore, diphenyl diselenide (0.1 - 100 mg/kg, p.o.) was significantly

effective in inhibiting the mouse paw oedema induced by i.pl. injection of formalin

(percentage of inhibition of 43 ± 4%)(Fig. 1C).

The p.o. administration of the mice with diphenyl diselenide (10 mg/kg), given

5 min after the formalin injection (post-administered diphenyl diselenide), revealed a

significant inhibition (71 ± 6%) in the second (inflammatory nociception) phase of the

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formalin-induced pain, whereas the prophylactic treatment (pre-administered

diphenyl diselenide) caused an inhibition of 89 ± 3% (Fig. 1D).

2.1.1. Antagonism of diphenyl diselenide-induced antinociception by L-NOARG, ODQ

and methylene blue in the formalin test

The i.c.v. administration of an inhibitor of NO synthase, L-NOARG (456

nmol/site), significantly reduced the antinociceptive action induced by diphenyl

diselenide (10 mg/kg, p.o.) in the first (0 - 5 min) and in the second (15 - 30 min)

phases of the formalin test (Figs. 2A and B).

Figs. 2C and D show that the i.c.v. injection of an inhibitor of guanylate

cyclase, ODQ (0.3 nmol/site), inhibited significantly the diphenyl diselenide-induced

antinociceptive effect in the second (but not the first) phase of the formalin test.

Methylene blue (1 mg/kg, i.p.), attenuated significantly the diphenyl diselenide-

induced antinociceptive effect in the second phase of formalin test (Figs. 2E and F).

2.1.2. Involvement of K

channels in the antinociceptive action caused by diphenyl

diselenide in the formalin test

Intrathecal administration of TEA (1 µg/site) (Figs. 3A and B), charybdotoxin

(250 pg/site) (Figs. 3C and D) and apamin (50 ng/site) (Figs. 3E and F), given 15 min

beforehand, prevented the antinociception caused by diphenyl diselenide (10 mg/kg),

in the second (but not the first) phase of formalin test.

Conversely, glibenclamide (100 µg/site) (Figs. 3G and H) failed to affect the

antinociceptive action of diphenyl diselenide (10 mg/kg), against both phases of

formalin test. The treatment with apamin, charybdotoxin, TEA and glibenclamide

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significantly reversed the antinociceptive effect of morphine when assessed against

the first and second phases of the formalin test (Figs. 3A - H).

3. Discussion

The results of the present study demonstrated that diphenyl diselenide

administered orally elicited a significant antinociception action in mice, when

assessed in the formalin model. In fact, this compound produces graded inhibition

against neurogenic (first phase, 0 - 5 min) (76 ± 3) and inflammatory (second phase,

15 - 30 min) (97 ± 1%) pain response caused by formalin injection in mice. Indeed,

diphenyl diselenide also was significantly effective in inhibiting (43 ± 4%) the mouse

paw oedema induced by i.pl. injection of formalin. Thus, these results suggest that

diphenyl diselenide was more effective in the inflammatory pain on the formalin test

and demonstrated that antinociception caused by diphenyl diselenide seems to be

associated with its anti-inflammatory action, as revealed by inhibition of paw oedema

formation in the mice treated with formalin. The reduction in pain sensitivity of the

inflammatory pain (second phase) and paw oedema caused by diphenyl diselenide

could be related to inhibition of prostaglandin synthesis at the level of

cyclooxygenases (COX). In agreement, it has been demonstrated that nociceptive

response caused by the intraplantar injection of formalin together with formation of

oedema has been associated with release of several inflammatory mediators,

including prostaglandins (Tjφlsen et al., 1992). These results are consistent with our

early study in which diphenyl diselenide subcutaneous injected caused an

antinociceptive action using formalin test (Nogueira et al., 2003). Moreover, our

research group has reported that systemic administration (into contra lateral paw)

and local (ipsilateral) of diphenyl diselenide reduced the pain-licking response in the

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second phase of formalin test, thus confirming that it possesses antinociceptive

properties. The systemic effect of diphenyl diselenide suggests the involvement of a

central action in the antinociceptive property of this organoselenium compound

(Zasso et al., 2005).

The formalin test in mice is a valid and reliable model of nociception and is

sensitive for various classes of analgesic drugs. The noxious stimulus is an injection

of dilute formalin under the skin of the surface of the right hindpaw. The response is

the amount of time the animals spend licking the injected paw. Two distinct periods of

high licking activity can be identified, an early phase lasting the first 5 min and a late

phase lasting from 15 to 30 min after the injection of formalin. It is suggested that the

early phase is due to a direct effect on nociceptors and that prostaglandins do not

play an important role during this phase. The late phase seems to be an

inflammatory response with inflammatory pain that can be inhibited by anti-

inflammatory drugs (Hunskaar and Hole, 1987; Tjφlsen et al., 1992). It has been

demonstrated that intraplantar injection of formalin in rodents produces significant

increase in spinal levels of different mediators, such as excitatory amino acids,

prostaglandin E

, substance P (SP), serotonin (5-HT) and histamine, among other

peptides (Tjølsen et al., 1992).

The results of the current study also demonstrated that diphenyl diselenide,

when examined in the formalin test, produced not only prophylactic effect (i.e.

producing pre-emptive antinociception when it was pre-administered), but also

therapeutic (i.e. effective when post-administered) effect. Thus, these findings might

have additional therapeutic implications for the development of a new drug to treat

inflammatory pain.

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Another important objective of the present study was to characterize further

some of the mechanisms through which diphenyl diselenide exerts its antinociceptive

action in the formalin test.

We reported here, for the first time, that Ca

2+-

activated and non-selective

voltage-dependent K

channel inhibitors caused a significant inhibition of the

antinociception induced by systemic administration of diphenyl diselenide when

analyzed in the second phase of the formalin model of pain. However, the opening of

ATP-sensitive K

channels does not appear to play a major role in diphenyl

diselenide-induced antinociception because treatment of animals with glibenclamide

had not effect on diphenyl diselenide action when assessed against either phase of

the formalin test. Our data are in agreement with other authors who have

demonstrated the peripheral antinociceptive effects produced by metamizol,

meloxican and resveratrol were blocked by the administration of Ca

2+-

activated and

non-selective voltage-dependent K

channels inhibitors, but not by the ATP-sensitive

channel blocker, glibenclamide (Granados-Soto et al., 2002; Ortiz et al., 2003a, b,

2005.). Interestingly, analyzing the results obtained here it appears that morphine, a

potent analgesic drug, is much more potent than diphenyl diselenide in this

behavioral of pain. Moreover, we can not discharge the possibility that the observed

effect by diphenyl diselenide could be due to the action on other K

channels. The

fact that tetraethylammonium (TEA, inhibitor non-selective of voltage-dependent K

channels) is also able to block Ca

2+-

activated K

channels (Cook and Quast, 1990)

further suggest the participation of these channels in the mechanism of diphenyl

diselenide action. The opening of K

channels, causing hyperpolarization of the cell

membrane, is a physiological means of decreasing cell excitability. Thus, drugs with

this property have a broad clinical potential. The identification of synthetic molecules

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that evoke physiological responses by opening K

channels has led to a new

direction in the pharmacology of ion channels (Lawson, 2000).

Another notable piece was the results provide pharmacological evidence for

the involvement of nitric oxide/cyclic GMP pathway in the antinociceptive effect

caused by diphenyl diselenide in the formalin test. This assertion is supported by

following evidences. First, the i.c.v. administration of L-NOARG (NO synthesis

inhibitor) significantly reversed the antinociception caused by diphenyl diselenide in

both phases in the formalin test. NO is generated from L-arginine by the catalytic

action of NO synthase (NOS). Physiologically, NO actions are believed to be

mediated by locally produced NO and in most instances by the subsequently

generated second messenger molecule guanosine 3’,5’ cyclic monophosphate

(cGMP). The second piece of evidence is the fact that the pretreatment of mice with

guanylate cyclase inhibitors (methylene blue and ODQ), significantly reversed the

antinociceptive effect induced by diphenyl diselenide (Ferreira et al., 1991; Mixcoatl-

Zecuatl et al., 2000). Although methylene blue (inhibited both NOS and sGC) is

apparently not specific for soluble guanylate cyclase inhibition it has been used as a

pharmacological tool to inhibit this enzyme (Jain et al., 2001; Patil et al., 2004).

Moreover, the data on ODQ reinforce the possible involvement of NO-cGMP pathway

in the antinociceptive action caused by diphenyl diselenide, since ODQ is a highly

NO-sensitive inhibitor of soluble guanylate cyclase (sGC).

Several other studies point to antinociceptive effect, via activation of the L-

arginine/NO/cGMP (Germany et al., 1996). However, studies in the literature indicate

that the NO/cyclic GMP pathway can have pronociceptive rather than antinociceptive

effects (Aley et al., 1998). It discrepancy may be due to the different experimental

pain model used, diverse tissue level and the variant NO and cyclic GMP intracellular

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content (Kawabata et al., 1994; Tegeder et al., 2002). Nevertheless, it is important to

point out that in the rat formalin and the rat paw pressure models, the production of

NO and cyclic GMP in subcutaneous tissue is involved in antinociceptive states

(Duarte et al., 1990; Soares et al., 2000; Soares and Duarte, 2001; Lázaro-Ibánez et

al., 2001; Ortiz et al., 2003 a, b ; Alves et al., 2004).

It is very important mentioned that in this study the effect caused by diphenyl

diselenide in the mice motor coordination was not evaluated. Zasso et al. (2005)

have reported that diphenyl diselenide caused no alteration on locomotion behaviour

in the open field test, suggesting that the antinociceptive action of this compound was

not due to motor disturbances.

Therefore, based on the results we can speculate that diphenyl diselenide

could exert antinociceptive effect due to activate: (a) K

channels at spinal level; (b)

NO/cGMP at supraspinal level and (c) cGMP at systemic level. Thus, collectively

these results suggest a major participation of the NO/cyclic GMP pathway and

channels in the antinociceptive effect caused by diphenyl diselenide in the

formalin test. Although, it precise site of action remains unclear. Thus, the present

results suggest that diphenyl diselenide might be of potential interest in the

development of new clinically relevant drugs for the management of pain.

4. Experimental procedures

4.1. Animals

The behavioral experiments were conducted using male Swiss mice (25 - 35g)

from our own breeding colony. The mice were kept in separate animal rooms, on a

12 h light/dark cycle (with lights on at 6:00 a.m.), at air- temperature room (23 -

25°C), with free access to food and water. Animals were acclimatized to the

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laboratory for at least 1 h before testing and were used only once throughout the

experiments. The experimenters were blinded to the drugs given to mice.In each

experimental condition the number of animals used was of 7-10. At the end of the

experiments, animals were euthanized by cervical displacement.

The animals were used according to the guidelines of the Committee on Care

and Use of Experimental Animal Resources, the Federal University of Santa Maria,

Brazil and the ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious

animals (Zimmermann, 1983). The number of animals and intensities of noxious

stimuli used were minimum necessary to demonstrate the consistent effects of the

drugs treatments.

4.2. Intracerebroventricular (i.c.v) and intrathecal (i.t.) injections

For i.c.v. injections, animals were lightly anaesthetized with ether, and a

volume of 5 µl of sterile saline or the drugs were directly injected into the lateral

ventricle (i.c.v.; coordinates from bregma: 1 mm lateral, 1 mm rostral, 3 mm vertical)

as described previously (Vaz et al., 1996).

The i.t. injections were made in conscious mice using the method described by

Hylden and Wilcox (1980). The animals received, using a microsyringe connected to

polyethylene tubing, a volume of 5 µl of sterile saline (control) or drugs which were

injected directly between the subdural space of the L5-L6 spinal segments. Injections

were given over a period of 5 s (Vaz et al., 1996).

4.3. Effect of diphenyl diselenide on formalin-induced nociception and oedema

The formalin test was carried out as described by Hunskaar and Hole (1987).

Animals received 20 µl of 2.5 % formalin solution (0.92 % of formaldehyde), injected

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intraplantarly (i.pl.) in the ventral right hindpaw. Animals were pretreated with diphenyl

diselenide by oral route (p.o.; 0.1 - 100 mg/kg; 10 ml/kg), 30 min before formalin

injection. Control animals received a similar volume of vehicle (canola oil; 10 ml/kg;

p.o.). After i.pl. injection of formalin, the time spent licking the injected paw was

recorded with a chronometer during the periods of 0 - 5 min (neurogenic phase) and

15 - 30 min (inflammatory phase) and considered as indicative of nociception.

In order to assess whether the antinociceptive activity produced by diphenyl

diselenide in formalin-induced nociception was associated with development of anti-

oedematogenic activity, we measured the paw oedema by comparing the difference

between the weight of the formalin-treated paw and the weight of the contralateral

paw (non-treated paw). For this purpose, animals were sacrificed 30 min after formalin

injection by cervical dislocation, and both paws were cut at the ankle joint and

weighed on an analytical balance. This procedure was similar to that decribed

previously (Beirith et al., 1998).

In a separate series of experiments, we also investigated the possible

antinociceptive effect of diphenyl diselenide given after formalin injection. For this

purpose, mice were intraplantarly injected with formalin, and after 5 minutes they

received diphenyl diselenide (10 mg/kg, p.o.) or vehicle (canola oil, p.o.) for

evaluation against the second phase of the nociception caused by the formalin.

4.4. Analysis of the possible mechanism of action of diphenyl diselenide in the

formalin test

To address some of the mechanisms by which diphenyl diselenide inhibits

formalin-induced nociception, mice were treated with different drugs. The choice of

the doses of each drug was based on previous data the literature. The formalin was

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chosen for this purpose because of the specificity and sensitivity in nociception

transmission that this model provides (Le Bars et al., 2001).

4.4.1. Involvement of nitric oxide/cyclic GMP pathway in the antinociceptive action

caused by diphenyl diselenide in the formalin test

The mice were pre-treated with L-NOARG (NO synthase inhibitor; 456

nmol/site, i.c.v.), ODQ (soluble guanylate cyclase inhibitor; 0.3 nmol/site, i.c.v.) and

methylene blue ((inhibited NO synthase and soluble guanylate cyclase; 1 mg/kg, i.p.)

10 min before of diphenyl diselenide (10 mg/kg, p.o.) injection. Other groups of

animals received only diphenyl diselenide (10 mg/kg, p.o.) or vehicle (canola oil, 10

ml/kg, p.o. or sterile saline 5 µl/site; i.c.v.) 30 min before formalin injection. The

nociceptive response in the first and second phases of the formalin test was recorded

30 min after administration of diphenyl diselenide or vehicle. The dose of methylene

blue was based in study described by Jain et al. (2001) and dose of L-NOARG and

ODQ were based in Ferreira et al. (1999)

4.4.2. Possible involvement of K

channels in the antinociceptive effect of diphenyl

diselenide in the formalin test.

For this purpose, mice were pre-treated with glibenclamide (100 µg/site,

intrathecal,(i.t.); a blocker of ATP-sensitive K

channels), apamin (50 ng/site, i.t.; a

blocker of small (or low)-conductance Ca

-sensitive K

channels), charybdotoxin

(250 pg/site, i.t.; a blocker of large (or fast)-conductance Ca

-sensitive K

channels)

or with tetraethylammonium (TEA; 1 µg/site, i.t.; a non selective blocker of voltage-

sensitive K

channels), and after 15 min they received diphenyl diselenide (10 mg/kg,

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p.o.) or morphine (2.5 mg/kg, subcutaneous route (s.c.)), used as a positive control, or

vehicle. Other groups of animals received saline (5 µl/site) by i.t. route, 15 min prior to

the administration of diphenyl diselenide, morphine or vehicle. The nociceptive

responses to formalin were recorded 30 or 20 min after the administration the

diphenyl diselenide or morphine, respectively. The procedure and doses used was

essentially similar to that described previously (Strong, 1990; Aronson, 1992; Welch

and Dunlow, 1993; Santos et al., 1999).

4.5. Drugs

Diphenyl diselenide (PhSe)

was prepared and characterized in our

laboratory by the method previously described (Paulmier, 1986). Analysis of the

NMR and

C NMR spectra showed analytical and spectroscopic data in full

agreement with its assigned structure. The chemical purity of diphenyl diselenide

(99.9%) was determined by GC/HPLC. Diphenyl diselenide was dissolved in canola

oil. All other chemicals were of analytical grade and obtained from standard

commercial suppliers. All drugs were dissolved in saline, with the exception of ODQ

and glibenclamide, which were dissolved in 10% DMSO (dimethyl sulfoxide). The

final concentration of DMSO did not exceed 0.5 % and had no detectable effect per

se when assessed in control animals.

4.6. Statistical analysis

The results are presented as the mean ± S.E.M., except the ID

values (i.e.

the dose of diphenyl diselenide reducing the pain response by 50% in relation to

control group values) were determined by linear regression from individual

experiments using “GraphPad Software” (GraphPad software, San Diego, CA) and

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are reported as geometric means accompanied by their respective 95% confidence

limits. Maximal inhibition values were calculated at the more effective dose used. The

statistical significance of differences between groups was performed by ANOVA

followed by Newman-Keuls test. Probability values less than 0.05 (P < 0.05) were

considered as statistically significant.

Acknowledgements

The financial support by UFSM (FIPE), FAPERGS, CAPES and CNPq is

gratefully acknowledged. J.B.T.R., L.S., C.R.J., C.W.N., A.R.S.S. and G.Z. are the

recipients of CNPq fellowships.

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Legends

Fig.1. Effect of diphenyl diselenide given by oral route (0.1 - 100 mg/kg, p.o) on the

licking (A, B) and oedema (C) induced by formalin in mice. The total time spent

licking the hindpaw was measured in the first (0 - 5 min, panel A) and the second (15

- 30 min, panel B) phase after intraplantar injection of formalin. The oedema (panel

C) was measured at the end of second phase of formalin test. The effect of diphenyl

diselenide (10 mg/kg, p.o) given 5 min after the formalin injection in mice has been

demonstrated in panel D. To this end, total time spent licking the hindpaw was

measured in the second (15 - 30 min) phase after intraplantar injection of formalin.

Control value indicates the animals injected with vehicle (canola oil). Each column

represents the mean of 7 to 10 animals and vertical lines indicate the S.E.M. Control

value “C” indicates the animals injected with vehicle (canola oil). The asterisks

denote the significance levels when compared to the control group (one-way ANOVA

followed by Newman-Keuls test): * p < 0.05; ** p < 0.01; and *** p < 0.001.

denote

did not significant difference between mice pre-administered with diphenyl diselenide

when compared to post administered.

Fig.2. Effect of pretreatment of mice with L-NOARG (456 nmol/site, i.c.v., panels A

and B), ODQ (0.3 nmol/site, i.c.v., panels C and D) and methylene blue (1mg/kg, i.p.,

panels E and F) 10 min before injection of diphenyl diselenide (10 mg/kg, p.o.)

against the first and the second phase of formalin-induced licking in mice. The total

time spent licking the hindpaw was measured in the first (0 - 5 min, panel A and C)

and in the second phase (15 - 30 min, panel B and D) after intraplantar injection of

formalin. Each column represents the mean of 7 to 10 animals and vertical lines

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indicate the S.E.M. The symbols denote significance levels:

*** p < 0.001 when

compared to the vehicle group;

p < 0.05 compared to diphenyl diselenide alone

(one-way ANOVA followed by Newman-Keuls test).

Fig.3. Effect of pretreatment of mice with tetraethylammonium (TEA; 1 µg/site, i.t.;

panels A and B), charybdotoxin (250 pg/site, i.t., panels C and D), apamin (50

ng/site, i.t.; panels E and F) and glibenclamide (100 µg/site, i.t.; panels G and H) on

the antinociceptive profiles by diphenyl diselenide (10 mg/kg, p.o) and morphine (2.5

mg/kg) against formalin-induced nociception in mice. The total time spent licking the

hindpaw was measured in the first (0 - 5 min) and the second phases (15 - 30 min)

after intraplantar injection of formalin. Each column represents the mean of 7 to 10

animals and vertical lines indicate the S.E.M. The symbols denote significance

levels:

** p < 0.01; and *** p < 0.001 when compared to the vehicle group;

p < 0.05

compared to diphenyl diselenide or morphine alone (one-way ANOVA followed by

Newman-Keuls test).

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Fig.1

C 0.1 0.5 1 10 50 100

100

First phase

Diphenyl diselenide

(mg/Kg, p.o.)

***

Licking (s)

Second phase

C 0.1 0.5 1 10 50 100

100

200

Diphenyl diselenide

(mg/Kg, p.o.)

***

Licking (s)

C 0.1 0.5 1 10 50 100

Diphenyl diselenide

(mg/Kg, p.o.)

***

Oedema (mg)

Control 10 30

100

200

***

post-administered

pre-administered

Time before

second phase (min)

Licking (s)

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Fig 2

100

First phase

***

Vehicle + + + -

L-NOARG - + - +

Diphenyl diselenide - - + +

Licking (s)

Second phase

100

150

200

***

Vehicle + + + -

L-NOARG - + - +

Diphenyl diselenide - - + +

Licking (s)

First phase

100

125

***

Vehicle + + + -

ODQ - + - +

Diphenyl diselenide - - + +

Licking (s)

Second phase

100

150

200

Vehicle + + + -

ODQ - + - +

Diphenyl diselenide - - + +

Licking (s)

***

First phase

Vehicle + + + -

Methylene blue - + - +

Diphenyl diselenide - - + +

Licking (s)

100

200

***

Vehicle + + + -

Methylene blue - + - +

Diphenyl diselenide - - + +

Second phase

Licking (s)

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Fig.3.

100

125

Vehicle + - + - + -

TEA - + - + - +

Morphine - - + + - -

Diphenyl diselenide - - - - + +

***

First phase

Licking (s)

100

200

300

Vehicle + - + - + -

TEA - + - + - +

Morphine - - + + - -

Diphenyl diselenide - - - - + +

***

Second phase

Licking (s)

First phase

100

125

***

Vehicle + - + - + -

Charybdotoxin - + - + - +

Morphine - - + + - -

Diphenyl diselenide - - - - + +

***

Licking (s)

Second phase

100

150

200

250

***

Vehicle + - + - + -

Charybdotoxin - + - + - +

Morphine - - + + - -

Diphenyl diselenide - - - - + +

Licking (s)

100

125

***

Vehicle + - + - + -

Apamin - + - + - +

Morphine - - + + - -

Diphenyl diselenide - - - - + +

First phase

Licking (s)

100

150

200

250

***

Vehicle + - + - + -

Apamin - + - + - +

Morphine - - + + - -

Diphenyl diselenide - - - - + +

Second phase

Licking (s)

100

125

First phase

Vehicle + - + - + -

Glibenclamide - + - + - +

Morphine - - + + - -

Diphenyl diselenide - - - - + +

***

Vehicle + - + - + -

Glibenclamide - + - + - +

Morphine - - + + - -

Diphenyl diselenide - - - - + +

Licking (s)

100

150

Vehicle + - + - + -

Glibenclamide - + - + - +

Morphine - - + + - -

Diphenyl diselenide - - - - + +

***

Second phase

Licking (s)

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4.4 Disseleneto de difenila atenua a hiperalgesia térmica e o comportamento de

dor inflamatória persistente e neuropática em camundongos.

4.4.1 Artigo 4

Diphenyl diselenide attenuates acute thermal hyperalgesia and

persistent inflammatory and neuropathic pain behavior in mice

Lucielli Savegnago, Cristiano R. Jesse, Larissa G. Pinto, Joao B. T. Rocha,

Cristina W. Nogueira*

Aceito na Revista Brain Research

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Diphenyl diselenide attenuates acute thermal hyperalgesia and

persistent inflammatory and neuropathic pain behavior in mice

Lucielli Savegnago, Cristiano R. Jesse, Larissa G. Pinto, Joao B. T. Rocha,

Cristina W. Nogueira*

Laboratório de Síntese, Reatividade e Avaliação Farmacológica e Toxicológica de

Organocalcogênios, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de

Santa Maria, Santa Maria, CEP 97105-900, RS, Brazil

Abbreviated title: Diphenyl diselenide exerts antinociceptive properties

number of text pages: 17

number of figures: 06

number of tables: 00

*Correspondence should be sent to:

Cristina Nogueira

Laboratório de Síntese, Reatividade e Avaliação Farmacológica e Toxicológica de

Organocalcogênios, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de

Santa Maria, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil.

Phone: 55-55-32208140

FAX: 55-55-32208978

E-mail: criswn@quimica.ufsm.br

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Abstract

Experiments were designed to address whether diphenyl diselenide (PhSe)

has antiallodynic and antihyperalgesic properties. The neuropathic pain was caused

by a partial tying (2/3) of sciatic nerve and the inflammatory pain was induced by an

intraplantar (i.pl.) injection of 20 µl of Freund’s Complete Adjuvant (CFA) in mice.

Seven days after sciatic nerve constriction and 24 h after CFA intra-plantar (i.pl.)

injection, mouse pain threshold was evaluated through tactile allodynia, using Von

Frey Hair (VHF) filaments. The acute thermal hyperalgesia was induced by intra-

thecal (i.t.) injection of glutamate, N-methyl-D-aspartate (NMDA), bradykinin (BK) and

prostaglandin E

(PGE

), and the nociceptive response was assessed using hot-plate

test. (PhSe)

administered by oral route (p.o.) (10 mg/kg) decreased the paw

withdrawal response on the ipsilateral side of the partial sciatic nerve ligation 30 min

after drug administration (64 ± 7%) and this effect was kept for 1h after treatment.

(PhSe)

(10 mg/kg, p.o.) produced a reduction in mechanical allodynia induced by

CFA started 30 min after (PhSe)

administration (71 ± 5%) and this effect was

maintained for up 4 hours. (PhSe)

(0.1 – 50 mg/Kg, p.o.) caused a significant

inhibition of glutamate-, NMDA-, BK- (PGE

)- induced acute thermal hyperalgesia in

mice. Together, the present results indicate that (PhSe)

produces systemic anti-

allodynic action when assessed in mechanical stimulus (VHF) in the hindpaw and

also attenuates acute thermal hyperalgesia. Thus, this compound might be

potentially interesting in the development of new clinically relevant drugs for the

management of pain.

Key words: selenium, diphenyl diselenide, neuropathic pain, inflammatory pain,

hyperalgesia

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1. Introduction

Pain is a condition that will affect everyone at some point in their lifetime. For

most of us, the pain has been temporary. However, for patients with pathological

pain, the hurt experience is unending, with little hope for therapeutic relief. On a

coarse scale, four major forms of pain can be distinguished. The nociceptive pain

(physiological pain) requires intense, high-threshold stimulation and is typically

transient, pathological pain (clinical pain), associated with inflammation of peripheral

tissue that arises from the initial damage (inflammatory pain) or from lesions to the

nervous system (neuropathic pain), is often persistent (Woolf and Mannion, 1999;

Zimmermann, 2001; Ji and Strichartz, 2004). Although considerable effort has been

devoted to understanding of the cellular and molecular mechanisms involved in the

genesis of acute and chronic pain syndromes, there is not much improvement

observed. Because of these, there has a global interest to develop safer and more

effective drugs to treat of pain.

Taking this into account, our group of research has reported the powerful

antiinflammatory and antinociceptive activities of diphenyl diselenide, an

organoselenium compound (Nogueira et al., 2003; Savegnago et al., 2007a). We

recent demonstrated that the antinociceptive effect caused by diphenyl diselenide on

the peripheral sites have been mainly attributed to its interaction with redox

modulatory sites of glutamate receptors, nitrergic system and protein kinase C (PKC)

(Savegnago et al., 2007a). Additionally, data from our group have shown that

diphenyl diselenide elicits antiinflammatory effect when assessed in models of

inflammation in rats such as carrageenin-, arachidonic acid-induced paw oedema

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(Nogueira et al., 2003). Interestingly, there are no data reporting the antinociceptive

effect caused by diphenyl diselenide on the central sites.

Moreover, this compound is also known by its antioxidant, neuroprotetive, anti-

hyperglycemic, hepatoprotective, antidepressant-like and anti-ulcer actions (Rossato

et al., 2002; Santos et al., 2006; Borges et al., 2006; Savegnago et al., 2006;

Barbosa et al., 2006, Savegnago et al., 2007b).

Considering the previous findings reporting that diphenyl diselenide has

antiinflammatory and antinociceptive properties, we might suggest this compound as

a good candidate for relieve of neuropathic and inflammatory pain and acute thermal

hyperalgesia. In this concern, the present study was designed to determine whether

diphenyl diselenide has oral anti-allodynic property in two models of persistent pain,

the inflammatory pain caused by Complete Freund’s Adjuvant (CFA) and the

neurophatic pain caused by partial ligation of the sciatic nerve. Additionally, we

evaluated antihyperalgesic effects of diphenyl diselenide in a model of acute thermal

hyperalgesia using hot-plate test.

2. Results

To evaluate the effect caused by diphenyl diselenide on neurophatic pain

model, we made a partial sciatic nerve ligation in mice. This injury produced a

marked development of allodynia on the ipsilateral side seven days after nerve injury

procedure (Fig. 1). The acute treatment with diphenyl diselenide (10 mg/kg, p.o.)

significantly decreased the paw withdrawal response on the ipsilateral side of the

partial sciatic nerve ligation 30 min after drug administration (64 ± 7%) and this effect

was kept for 1 h after diphenyl diselenide treatment (Fig. 1).

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We also investigated the effect caused by diphenyl diselenide on inflammatory

pain model, through immunological reaction induced by i.pl. injection of CFA. The i.pl.

injection of CFA produced a profound mechanical allodynia, which were kept during

all test. The animals that received diphenyl diselenide (10 mg/kg, p.o.) demonstrated

a reduction on mechanical allodynia induced by CFA. This hypersensitivity reduction

started 30 min after diphenyl diselenide administration (71 ± 5%) and was maintained

for up 4 hours (Fig. 2).

The results of fig.3A show that diphenyl diselenide (10 and 50 mg/Kg, p.o.)

caused a significant inhibition of glutamate (100 nmol/site) induced acute thermal

hyperalgesia in mice. The ∆ latency (%) value caused by glutamate was - 43.5 and

mice treated with diphenyl diselenide 10 and 50 mg/Kg by oral route presented

values of ∆ latency (%) of - 13.5 and - 5.0 respectively. The calculated mean ID

value (and its respective 95% confidence limits) was 1.22 (0.3 - 5) mg/kg.

As can be seen in fig. 3B, the acute hyperalgesic effect caused by NMDA

(1ng/site) was significantly inhibited by diphenyl diselenide at the doses of 1, 10 and

50 mg/kg, the mean ID

value (and its respective 95% confidence limits) was 8.35

(2.2 - 31.1) mg/kg. The ∆ latency (%) value of NMDA was - 35.9 and mice treated

with diphenyl diselenide 1, 10 and 50 mg/Kg presented values of ∆ latency (%) of -

17, -7 and - 4, respectively.

In addition, the hyperalgesia induced by intra-techal administration of PGE

(0.3 µg/site) was significantly inhibited by diphenyl diselenide (1 and 10 mg/kg, p.o.)

with a mean ID

value (and its respective 95% confidence limits) was 4.81 (2.0 -

11.4) mg/kg. The ∆ latency (%) value of PGE

was – 38 and mice treated with

diphenyl diselenide 1 and 10 mg/Kg presented values of ∆ latency (%) of - 16 and -

10, respectively (Fig. 3C).

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Moreover, oral administration (by gavage) of diphenyl diselenide (1 and 10

mg/kg, p.o.) significantly reduced the duration of nociceptive response induced by i.t

injection of bradykinin (5 nmol/site), the calculated mean ID

value (and its

respective 95% confidence limits) was 1.39 (0.5 - 3.2) mg/Kg. The ∆ latency (%)

value of bradykinin was - 39 and mice treated with diphenyl diselenide 1 and 10

mg/Kg presented values of ∆ latency (%) of - 11 and - 2, respectively (Fig. 3D).

3. Discussion

This study presents, for the first time, that diphenyl diselenide orally

administered attenuates acute thermal hyperalgesia and inhibits of tactile allodynia

induced by both persistent pain models: sciatic nerve partial constriction and

chemical ACF-induced inflammation in mice.

Peripheral injection of CFA or sciatic nerve partial constriction causes

persistent pain, which leads to the release of multiple inflammatory and nociceptive

mediators. These mediators increase long-lasting discharge of primary sensory fibers

that modifies neuronal, neuro-glial and neuro-immune cell phenotype and function in

the central nervous system. These alterations can occur at translational or post-

translational levels and achieve receptors, ion channels, soluble mediators and

molecules played in cell signalling (Woolf and Mannion, 1999; Ji and Strichartz,

2004; Li et al., 2005). Therefore, we can speculate that effects caused by diphenyl

diselenide on the nerve injury and CFA-induced inflammation are probably

associated to its possible ability to interfere in cell signalling, particularly that related

to PKC and NO. This assertion is supported by the fact that antinociceptive action

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caused by diphenyl diselenide in models of acute pain is related to PKC and L-

arginine -nitric oxide pathways (Savegnago et al., 2007a).

Another interesting finding in the present study is the demonstration that acute

thermal hyperalgesia induced by glutamate, NMDA, bradykinin and PGE

in the hot-

plate test was significant attenuated by oral injection of diphenyl diselenide.

Hyperalgesia is a complex cascade of events, which induces the spinal release of

substance P and glutamate causing activation of spinal neurokinins-1 and NMDA

receptors. The activation of these receptors stimulated spinal phospholipases and

cyclooxygenases activities leading to the synthesis and release of spinal prostanoids

(Esbersberger et al., 1999). Moreover, Meller et al. (1996) have reported that the

acute thermal hyperalgesia is produced by activation of PKC, NMDA and

neuropeptides receptors, and production of NO. In fact, excitatory amino acids and

neuropeptides play a crucial role in the transmission of pain signals in the spinal cord

and their spinal applications elicit behaviors which resemble the hyperalgesia and

allodynia that characterize several states of spinal hyperexcitability (central

sensitization). In this context, recent study of our research group reported that

antinociceptive action caused by diphenyl diselenide in models of acute pain is

related to PKC, L-arginine - nitric oxide pathways and via interaction with redox

modulatory sites of glutamate receptors (Savegnago et al., 2007a). Savegnago and

collaborators (2007c) have also reported that antinociception caused by diphenyl

diselenide at spinal sites involves NMDA receptors, peptidergic or vanilloid systems.

Thus, based on these results, we can strongly suggest that antinociception induced

by diphenyl diselenide may account for an inhibitory effect on the nociceptive

transmission which is related to inflammatory mediators, such as prostaglandins, BK,

excitatory amino acids, PKC and/or NO.

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Collectively, these results support convincing evidence that diphenyl

diselenide, an organoselenium compound, produces systemic anti-allodynic action in

two models of persistent inflammatory (CFA-i.pl. injected) and neuropathic (sciatic

nerve injured) pain, when assessed in mechanical stimulus (VHF) in the hindpaw.

Besides, diphenyl diselenide attenuates acute hyperalgesia induced by glutamate,

NMDA, bradykinin and PGE

in mice. The beneficial effects of diphenyl diselenide

seem to involve molecular mechanisms such as the inhibition of PKC and NO cell

signalling, and inflammatory mediators, such as prostaglandins, bradykinin and

excitatory amino acids. Together, the present results indicate that diphenyl diselenide

might be of potential interest in the development of new clinically relevant drugs for

the management of pain. Additional studies are, however, necessary to confirm this

hypothesis.

4. Experimental procedures

4.1 Animals

Male Swiss mice (25 - 35g) maintained at 22–25°C with free access to water

and food, under a 12:12 h light/dark cycle (lights on at 6:00). The animals were used

according to the guidelines of the Committee on Care and Use of Experimental

Animal Resources, the Federal University of Santa Maria, Brazil and the ethical

guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals

(Zimmermann, 1983). The number of animals and intensities of noxius stimuli used

were minimum necessary to demonstrate the consistent effects of the drug

treatments.

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4.2 Intrathecal (i.t.) injection

I.t. injections were made in conscious mice using the method described by

Hylden and Wilcox (1980). The lumbar puncture was made through the intact skin

between the lumbar 5 and lumbar 6 vertebra, using a 30-gauge needle connected to

a 25-ml Hamilton syringe with polyethylene tubing, and a volume of 5 µl of vehicle

(phosphate buffer saline: PBS; mmol/l: NaCl 137, KCl 2.7 and phosphate buffer 10)

or drugs was injected. Injections were given over a period of 5 s. The accurate

placement of the needle was evidenced by a quick ‘‘flick’’ of the mouse’s tail.

4.3 Mechanical allodynia induced by partial sciatic nerve injury

To evaluate (PhSe)

effects on neurophatic pain model, we made a partial

sciatic nerve ligation in mice. To this end, mice were anaesthetized with 7% chloral

hydrate (6 ml/kg, i.p.). A partial ligation of the sciatic nerve was performed by tying

the distal (2/3) of the sciatic nerve, according to the procedure described for rats

(Seltzer et al, 1990) and adapted to mice (Malmberg and Basbaum, 1998).

The mechanical allodynia was measured as described before (Bortolanza et

al., 2002). Mice were further acclimatized in individual clear Plexiglas boxes (9 × 7 ×

11 cm) on an elevated wire mesh platform to allow access to the ventral surface of

the hind paw. To assess the nerve injury in each animal, basal withdrawal response

frequency of the right hindpaw was measured following 10 applications (duration of 1

s each) of 0.6g von Frey hair Filaments (VFH, Stoelting, Chicago, USA), that

produces a mean withdrawal frequency of about 15%, which is considered to be an

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adequate value for the measurement of mechanical allodynia. The mice that

presented mean withdrawal frequency >15% were excluded of the study. After this

selection, the animals were operated and the development of injury to the sciatic

nerve was verified after seven days of surgery, as the withdrawal response frequency

of the right hindpaw following 10 applications (duration of 1 s each) of 0.6 g von Frey

hairs. The animals that produced a mean withdrawal of the right hindpaw frequency

of about 70% were considered adequate for this experiment. Mice with injured nerve

did not present paw drooping or autotomy. Therefore, mice that presented injury in

the sciatic nerve received vehicle or compound (10 mg/kg; p.o.) and the withdrawal

response frequency was recorded after (0.5, 1, 2, 4, and 6 h) diphenyl diselenide

treatment. In sham-operated mice, the nerve was exposed using the same

procedure, but without ligation. The frequency of withdrawal was determined before

nerve injury (baseline), in order to obtain data purely derived from nerve injury-

induced allodynia.

4.4 CFA-induced inflammation and mechanical allodynia

We also investigated the effect caused by (PhSe)

on inflammatory pain

model, through immunologic reaction induced by intraplantar (i.pl.) injection of CFA-

complete Freund’s adjuvant. Briefly, mice were lightly anaesthetized with ether (by

inhalation) and received 20 µL of CFA (1 mg/ml of heat killed Mycobacterium

tuberculosis in 85% paraffin oil and 15% mannide monoleate) subcutaneously in the

intraplantar surface of the right hind paw.

The mechanical allodynia was measured as described by Bortolanza et al.,

2002 and detailed in 4.3. section. Excepting that, the inflammatory response was

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verified 24 hours after CFA injection in the intraplantar surface of the right hind paw

in mice. Therefore, mice that presented allodynia received vehicle or compound (10

mg/kg; p.o.) and the withdrawal response frequency in VHF was recorded after (0.5,

1, 2, 4, and 6 h) diphenyl diselenide treatment. The frequency of withdrawal was

determined before (baseline) CFA injection, in order to obtain data purely derived

from the treatments in CFA allodynia.

4.5 Acute thermal hyperalgesia

The acute thermal hyperalgesia response was assessed using hot-plate test

(Ugo Basile, model-DS 37) maintained at 50 ± 1º C. Animals were placed in a glass

cylinder of 24-cm diameter on the heated surface, and the time between placement

and shaking or licking of the paws, or jumping, were recorded as the index of

response latency. A cut-off of 45 s was used to prevent paw damage. Each animal

was tested before administration of drugs in order to obtain baseline. Mice received

(PhSe)

(p.o.) (dose range: 0.1 – 50 mg/Kg) 30 min before i.t. injection of 5 µl of

glutamate (an excitatory amino acid, 100 nmol/site), NMDA (a selective agonist of

NMDA-subtype of glutamatergic ionotropic receptors, 1 ng/site), bradykinin (BK; 5

nmol/site) and prostaglandin E

(PGE

0.3 µg/site). Following i.t. injections of each

agonist the nociceptive response was measured at 5, 15, 10 and 15 min after

glutamate, NMDA, BK and PGE

, respectively. Thermal withdrawal latencies are

expressed as a percentage difference from time 0 (pre-drug) according to the

formula:

∆ latency (%)= postdrug – baseline x 100

baseline

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The ∆ latency (%) was estimated for each mouse. The doses of each agonist

used in the hot plate test were based on Ferreira et al. (1999), Menéndez et al (2002)

and Santos et al. (2005).

4.6 Drugs

The following substances were used: L-glutamic acid hydrochloride

(glutamate), N-methyl-D-aspartic acid (NMDA), Freund’s complete adjuvant (CFA),

prostaglandin E

(PGE

) and bradikinin (Sigma, St. Louis, USA).

Diphenyl diselenide, (PhSe)

, was prepared and characterized in our

laboratory by the method previously described (Paulmier, 1986). Analysis of the

NMR and

C NMR spectra showed analytical and spectroscopic data in full

agreement with its assigned structure. The chemical purity of diphenyl diselenide

(99.9%) was determined by GC/HPLC. Diphenyl was dissolved in canola oil and

administered by gavage [oral route (p.o.)]. The mice received diphenyl diselenide in a

constant volume of 10 ml/kg body weight.

4.7 Statistical analysis

The results are presented as mean ± S.E.M., except the ID

values (i.e., the

dose of diphenyl diselenide necessary to reduce the nociceptive response by 50%

relative to the control value), which are reported as geometric means accompanied

by their respective 95% confidence limits. The ID

value was determined by linear

regression from individual experiments using linear regression GraphPad software

(GraphPad software, San Diego, CA, USA). Comparisons between experimental and

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control groups were performed by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by

Newman- Keuls' test when appropriated. P values less than 0.05 (P < 0.05) were

considered as indicative of significance.

Acknowledgements

The financial support by UFSM (FIPE), FAPERGS, CAPES and CNPq is

gratefully acknowledged. J.B.T.R., L.S., C.R.J. and C.W.N. are the recipients of

CNPq fellowships.

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Legends

Fig.1. Effect of diphenyl diselenide administered orally (10 mg/kg) on mechanical

allodynia induced by sciatic nerve injury in response to 10 applications of 0.6 g VFH.

The assessment was carried out in mice sham-operated (♦), operated and treated

with vehicle (▲) operated and treated with diphenyl diselenide (●). The baseline (▀)

was recorded before nerve injury. The results represent the mean ± S.E.M. of eight

animals. The symbols denote significant difference *p < 0.05 between operated mice

plus vehicle and operated mice plus diphenyl diselenide by one-way analysis of

variance (ANOVA), followed by Student-Newman-Keuls test.

Fig.2. Effect of diphenyl diselenide administered orally (10 mg/kg) on mechanical

allodynia in response to 10 applications of 0.6 g VFH induced by CFA in mice. The

animals received vehicle (●) or diphenyl diselenide (∆) 24h after CFA injection. The

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100

baseline (□) was recorded before CFA injection. The measure following was 24 hours

after ACF-injection (0) and (0.5, 1, 2, 4, 6h) subsequent to diphenyl diselenide (10

mg/kg, p.o.) treatment. The results represent the mean ± S.E.M. of eight animals.

The symbols denote significant difference ***p <0.001 and *p <0.05 between vehicle

treated and diphenyl diselenide treated mice by one-way analysis of variance

(ANOVA), followed by Student-Newman-Keuls test.

Fig.3. Effect of diphenyl diselenide administered orally (0.1 - 50 mg/Kg) on the

glutamate (100 nmol/site, panel A)-, NMDA (1ng/site, panel B)-, PGE

(0.3 µg/site,

panel C) or BK (5 nmol/site, panel D)- induced nociceptive response in mice. The

changes in thermal withdrawal latencies are represented on the y-axis as percentage

change calculated by the formula (trial latency – baseline latency)/ (baseline latency)

x 100 expressed as a percentage. Each column represents the mean ± S.E.M. for

six to eight animals. PBS means phosphate buffer saline. Asterisks denote the

significance levels *p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared to the control

group values (C) (one-way ANOVA followed by Newman-Keuls test).

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101

Fig. 1

7B 0 0.5 1 2 4

100

Time after treatment (h)

Response frequence of

VFH stimulation (%)

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102

Fig. 2.

8B 0 0.5 1 2 4 6

100

***

Time after treatment (h)

Response frequency of

VHF stimulation (%)

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103

Fig. 3.

-50

-40

-30

-20

-10

1 10 50

Diphenyl diselenide (mg/kg)

Glutamate (100 nmol/site, i.t.)

PBS C

(A)

∆

latency (%)

-50

-40

-30

-20

-10

PBS C 0.1 1 10 50

Diphenyl diselenide (mg/kg)

NMDA (1ng/ site, i.t.)

(B)

***

∆

latency (%)

-50

-40

-30

-20

-10

PBS C 0.1 1 10

Diphenyl diselenide (mg/kg)

Prostaglandin E

(0.3 µg/site, i.t.)

(C)

∆

latency (%)

-50

-40

-30

-20

-10

PBS C 0.1 1 10

Diphenyl diselenide (mg/kg)

Bradykinin ( 5nmol/ site, i.t.)

(D)

***

∆

latency (%)

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104

5- DISCUSSÃO

O interesse em identificar novos alvos para o tratamento da dor tem

aumentado expressivamente nos últimos anos. Apesar dos avanços recentes

ocorridos na compreensão dos mecanismos envolvidos na gênese e manutenção da

dor, as terapias disponíveis atualmente possuem apenas resultados parciais e a

maior parte das drogas analgésicas apresenta importantes efeitos colaterais, o que

dificulta o uso contínuo. Diante deste contexto, vários modelos de nocicepção em

animais de laboratório têm sido propostos, a fim de avaliar a ação antinociceptiva de

várias drogas. No entanto, de maneira geral, esses modelos possuem

características próprias que devem ser consideradas, tais como sua simplicidade,

reprodutibilidade e validade dos resultados obtidos e principalmente, a possibilidade

de serem correlacionados com estudos clínicos. Deve-se ressaltar ainda, que os

modelos de dor inflamatória e neuropática podem ser extremamente úteis para a

identificação de drogas potentes e efetivas, que possam vir a ser utilizadas na clínica

(Walker et al., 1999).

O presente estudo demonstrou pela primeira vez, que a administração

sistêmica, pela via oral, do disseleneto de difenila apresentou baixa toxicidade e

produziu efeitos antinociceptivos e antiinflamatórios nos diferentes modelos de

nocicepção e inflamação em camundongos.

Os resultados obtidos no ARTIGO 1 indicaram que o disseleneto de difenila

quando administrado pela via oral, pois apresentou mínimos efeitos tóxicológicos e

causou antinocicepção em vários modelos de dor em camundongos. A ausência de

toxicidade do disseleneto de difenila, administrado pela via oral, foi evidenciada pelo

índice de mortalidade, de fato, a DL

obtida foi > 312 mg/Kg (ou 1000 µmol/Kg).

Embora, a administração desse composto, não tenha alterado os parâmetros

hepáticos (AST e ALT) e renais (uréia e creatinina) dos animais, o ganho de peso

dos camundongos foi reduzido, o qual pode indicar toxicidade sistêmica.

Neste estudo, foi demonstrado que a administração oral do disseleneto de

difenila causou uma inibição significativa nas contorções abdominais induzidas pelo

ácido acético em camundongos. O efeito antinociceptivo do disseleneto oral iniciou

30 minutos após sua administração e permaneceu por duas horas (dados não

mostrados). O modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em

camundongos é descrito como um modelo típico de nocicepção inflamatória visceral,

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105

sendo amplamente utilizado como ferramenta para detecção e avaliação de novos

agentes com propriedades analgésicas e antiinflamatórias (Collier et al., 1968). Os

prótons oriundos da dissociação do ácido acético podem ativar diretamente canais

de cátion não seletivos localizados nas fibras aferentes primárias (Julius e Basbaum,

2001). Além disso, a injeção de ácido acético na cavidade peritoneal de

camundongos promove a liberação de diversos mediadores inflamatórios como PG,

BK, SP, TNF-α, IL-1β e IL-8 entre outros (Collier et al., 1968; Vinegar et al., 1979;

Ribeiro et al., 2000; Ikeda et al., 2001), os quais estimulam neurônios aferentes

primários, aumentando a liberação de aspartato e glutamato no fluido

cerebroespinhal (Feng et al., 2003).

Com o intuito de avaliar o efeito do disseleneto de difenila frente a diferentes

estímulos nociceptivos, foi utilizado como modelo de nocicepção térmica, o teste da

imersão da cauda a 55 °C (Tail-immersion). Os nossos dados mostram claramente

que o disseleneto de difenila foi capaz de aumentar a latência dos animais ao

estimulo térmico, mas, esse efeito não foi prevenido pelo naloxona. Isso demonstra

que não há envolvimento do sistema opióide no efeito antinociceptivo causado pelo

disseleneto de difenila no teste da imersão da cauda a 55 °C. Este modelo é

verdadeiramente eficiente para predizer o efeito analgésico em humanos

(Grumbach, 1966).

Outro fato interessante do presente estudo (ARTIGO 1) foi a demonstração

que o disseleneto de difenila administrado pela via oral, causou redução significativa

da nocicepção neurogênica induzida pela ativação de receptores vanilóides por

utilização da capsaicina na pata de camundongos (Caterina e Julius, 2001). A

capsaicina (8-metil-N-vanillil-6-nonenamida) é uma substância álgica obtida da

pimenta vermelha, “chilli pepper”, disponível como ferramenta farmacológica para o

estudo dos subtipos de fibras sensoriais primárias do tipo C e Aδ, incluindo os

nociceptores polimodais e termoceptores (Holzer, 1991; Jancso, 1992). Além disso,

tem sido proposto que a nocicepção induzida pela capsaicina é mediada pela

ativação de seu receptor específico, conhecido como receptor vanilóide (VR)

(TRPV1), um canal catiônico não seletivo ativado por ligante encontrado em

neurônios sensoriais primários e a ativação deste receptor induz a despolarização

da membrana com aumento do influxo de cátions, levando ao estímulo nocivo (Julius

e Basbaum, 2001; Szallasi e Blumberg,1993; Caterina et al., 1997). Estudos têm

demonstrado que a capsaicina libera neuropeptídeos, aminoácidos excitatórios, NO

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106

e outros mediadores pró-inflamatórios a partir das fibras C, transmitindo a

informação nociceptiva aos neurônios do corno dorsal, sendo que a sensilização

central, ocorre, entre outros meios, através da ativação de proteínas quinase A e C

(Calixto et al., 2005). Além disso, inibidores de PKC previnem a fosforilação do

TRPV1, reduzindo a sensibilização deste receptor, tornando-o menos responsivo à

ação do agonista (Prekumar e Ahern, 2000, Ferreira et al., 2004, Calixto et al.,

2005). Corroborando com isso, os resultados do presente estudo também sugerem o

envolvimento da PKC na ação antinociceptiva causada pelo disseleneto de difenila.

Isto se deve ao fato que a administração sistêmica do disseleneto de difenila inibiu

eficientemente a nocicepção e o edema induzido pela administração i.pl. de PMA

(ativador de PKC) e da bradicinina (BK). Estudos prévios sugerem que a BK, ao se

ligar nos seus receptores leva a uma ativação direta da PKC, porém, indireta da

PKA, sendo esta última, ativada após a síntese de prostaglandinas, a qual acontece

em decorrência da ativação de PKC (Ferreira et al., 2004).

Nossos resultados também evidenciaram o envolvimento do sistema

glutamatérgico na antinocicepção causada pelo disseleneto de difenila. De fato, a

administração oral do disseleneto de difenila produziu uma inibição significativa no

tempo de lambida e no edema causado pela injeção intraplantar de glutamato em

camundongos. A nocicepção induzida pelo glutamato parece envolver sítios de ação

periférica, espinhal e supra-espinhal. Além disso, a ação do glutamato sobre seus

receptores aumenta a produção de NO e substâncias relacionadas à ativação deste

mediador (Beirith et al., 2002). Somando-se a isso, a administração local de

disseleneto de difenila induziu antinocicepção e inibiu a formação de edema quando

co-injetado com glutamato na pata de camundongos. De acordo com esses

resultados, nosso grupo anteriormente demonstrou que o disseleneto de difenila

causou efeito antinociceptivo local na segunda fase do teste da formalina (Zasso et

al., 2005) em camundongos.

Outro objetivo do ARTIGO 1 foi demonstrar os mecanismos pelos quais o

disseleneto de difenila exerce antinocicepção local. O presente estudo confirmou

que a via da L-arginina-óxido nítrico está envolvida na ação antinociceptiva local do

disseleneto de difenila. Esta conclusão deriva do fato que o pré-tratamento dos

animais com o substrato para a NOS, a L-arginina, em uma dose na qual não

produziu nenhum efeito per se no modelo do glutamato, mas que reverte

significantemente a antinocicepção causada pelo inibidor da sintase do NO, L-

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107

NAME, também inibiu significativamente a atividade antinociceptiva causada pelo

disseleneto de difenila. Por isso, considerando esses resultados pode-se sugerir que

o disseleneto de difenila exerce seu efeito antinociceptivo local, provavelmente por

inibir a atividade da NOS. Alguns estudos sugerem que o óxido nítrico aumenta a

síntese e/ou a liberação de mediadores pró-inflamatórios como as citocinas, as

EROs e os prostanóides, o que resulta na formação de uma reposta inflamatória.

Além disso, a liberação periférica de NO contribui para o desenvolvimento do edema

e da hiperalgesia no tecido lesado com inflamação (Marcinkiewicz et al., 1995;

Sautebin et al., 1995; Peana et al., 2006).

Além do envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico, a ação antinociceptiva

local causada pelo disseleneto de difenila parece também envolver uma interação

com os sítios redox modulatórios dos receptores glutamatérgicos, principalmente o

receptor NMDA. Essa conclusão deriva do fato de que, o pré-tratamento dos animais

com o DTT, um agente redutor, preveniu significantemente a antinocicepção local

causada pelo DTNB, um agente oxidante, e pelo disseleneto de difenila no teste da

injeção de glutamato na pata de camundongos. Neste contexto, Reynolds et al

(1990) elucidaram que agentes redutores potencializam o aumento de cálcio

induzido pelo receptor NMDA, e esse efeito é bloqueado pelo DTNB. De fato, o a

função do receptor NMDA é altamente regulada por vários sítios incluindo o sítio

redox (Rock e McDonald, 1995; Laughlin et al, 1998). Portanto, esses resultados

indicam que o disseleneto de difenila causou antinocicepção local por atuar

modulando os receptores glutamatérgicos, principalmente NMDA e inibindo a sintase

do óxido nítrico (ARTIGO 1).

Observando os resultados do ARTIGO 1 surgiu a seguinte questão: será que

o disseleneto de difenila pode exercer seu efeito antinociceptivo por interagir com o

sistema nervoso central? Baseando-se nessa hipótese desenvolveu-se o ARTIGO 2.

Segundo os resultados obtidos nesse artigo (ARTIGO 2) a administração oral

do disseleneto de difenila foi capaz de reduzir de forma significativa a resposta

nociceptiva causada pela injeção intratecal de glutamato (agonista não seletivo de

receptores glutamatérgicos) e do NMDA (agonista seletivo de receptores

ionotrópicos glutamatérgicos do subtipo NMDA). Porém, o disseleneto de difenila

não inibiu a nocicepção induzida pelo AMPA e cainato (agonistas seletivos de

receptores ionotrópicos glutamatérgicos do subtipo AMPA e cainato) e pelo trans-

ACPD (agonista de receptores metabotrópicos glutamatérgicos). Esses resultados

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108

confirmam que a atividade antinociceptiva do disseleneto de difenila ocorre em nível

central e mostram que os receptores NMDA, em nível espinhal, estão envolvidos no

efeito antinociceptivo desse composto. Esses resultados estão de acordo com os

obtidos no artigo 1, que demonstram que o disseleneto de difenila induz

antinocicepção local via interação com os sítios modulatórios de receptores

glutamatérgicos, principalmente NMDA. Portanto, tendo em vista os dados obtidos

no ARTIGO 1, em conjunto com o presente resultado, pode-se sugerir fortemente

que a ação antinociceptiva causada pelo disseleneto de difenila depende de sua

seletiva interação com o receptor NMDA. Somando-se a isso, o tratamento prévio

com disseleneto de difenila administrado pela via oral inibiu eficientemente a

nocicepção induzida pela administração i.t. da SP e capsaicina. De fato, a SP,

capsacina e glutamato interagem sinergisticamente durante a ativação de neurônios

sensoriais no corno dorsal da medula para processarem a sensação de dor, a qual

acontece, dentre outros mecanismos, através da produção de NO (Sakurada et al.,

1996; Liu e Sandkuhler , 1997; Caruso et al., 2005).

Outro importante resultado obtido nesse artigo, foi a demonstração que o

disseleneto de difenila reduziu significativamente a resposta nociceptiva causada

pela injeção intratecal da bradicinina. Esses resultados, juntamente com os obtidos

no artigo 1, sugerem a participação da PKC na ação antinociceptiva do disseleneto

de difenila.

No ARTIGO 2, também foi demonstrado que a administração oral do

disseleneto de difenila produziu inibição sobre o comportamento de “biting” causado

pela injeção intratecal de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β e TNF-α). Interessante,

está bem estabelecido que a ligação da IL-1β ao seu receptor IL-1RI ativa a PKC

independentemente de cálcio (Obreja et al., 2002), efeito o que justifica a ação

inibitória do disseleneto de difenila sobre a nocicepção induzida pela IL-1β. O

disseleneto de difenila também inibiu nocicepção induzida pela injeção intratecal de

TNF-α. Schäfers e colaboradores (2003) descrevem que a nocicepção induzida pelo

TNF-α envolve a fosforilação de MAPKs como a p38. De acordo com estes

resultados, o efeito antinociceptivo obtido pelo disseleneto de difenila pode estar

associado a um decréscimo na fosforilação das MAPKs.

Portanto, com base nos resultados obtidos no artigo 2, conclui-se que o

disseleneto de difenila pode exercer sua ação antinociceptiva por interagir com o

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109

sistema nervoso central modulando de forma direta ou indireta o sistema

glutamatérgico, os receptores vanilóides e os peptidérgicos e as citocinas pró-

inflamatórias

Tendo em vista os resultados do ARTIGO 2, no qual o disseleneto de difenila

administrado pela via oral exerce efeito antinociceptivo por modular alguns sistemas

em nível central, sentiu-se a necessidade de investigar outros mecanismos centrais

que podem estar envolvidos no efeito antinociceptivo do disseleneto de difenila.

Dessa forma, desenvolveu-se o ARTIGO 3.

Os resultados obtidos no artigo 3 demonstraram que o disseleneto de difenila,

quando administrado pela via oral, foi capaz de reduzir de forma significativa a

nocicepção de origem neurogênica e inflamatória causada pela injeção i.pl. de

formalina. Porém, o disseleneto de difenila foi mais efetivo em inibir a dor de origem

inflamatória do que a de origem neurogênica. Estas observações estão de acordo

com dados prévios obtidos no nosso laboratório (Nogueira et al., 2003, Zasso et al.,

2005). A dor de origem neurogênica é causada pela ativação direta dos terminais

nervosos nociceptivos, enquanto a dor de origem inflamatória é mediada por uma

combinação de mecanismos periféricos e mecanismos de sensibilização central na

medula espinhal (Hunskaar e Hole, 1987; Tjølsen et al., 1992). Tem sido

demonstrado que a injeção intraplantar de formalina em roedores produz aumento

significativo nos níveis espinais de diferentes mediadores como aminoácidos

excitatórios, taquicininas, PGE

, óxido nítrico, cininas e outros peptídeos (Tjølsen et

al., 1992; Malmberg e Yaksh 1995, Santos e Calixto, 1997). Além disso, a

administração sistêmica, espinhal e supraespinhal de antagonistas dos receptores

NMDA, inibidores da NOS, antagonistas de receptores para as cininas, opióides,

agonistas α

-adrenérgicos e antinflamatórios não-esteroidais foram eficazes em

inibir a nocicepção induzida pela formalina (Tjølsen et al., 1992; Malmberg e Yaksh,

1993, 1995; Moore et al., 1993; Chaplan et al., 1997; Sawamura et al., 1999; Santos

e Calixto, 1997). Adicionalmente, o disseleneto de difenila inibiu o edema causado

pela injeção i.pl, de formalina, confirmando assim que o disseleneto de difenila foi

mais efetivo em inibir a dor de origem inflamatória.

Os resultados do ARTIGO 3 também demonstraram que a disseleneto de

difenila causou não apenas efeito profilático (tratamento antes do estímulo nocivo),

mas também efeito terapêutico (administrada depois da injeção de formalina) neste

modelo de nocicepção. Uma possível explicação para tal efeito vem do fato que, o

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110

disseleneto de difenila por ser lipossolúvel alcança rapidamente o SNC, modulando

assim a dor inflamatória causada pela injeção de formalina via neurônios aferentes

do tipo C. Assim, estes resultados fornecem dados adicionais para uma possível

aplicação do disseleneto de difenila no desenvolvimento de novas drogas para o

tratamento das dores inflamatórias.

O presente artigo também demonstrou que não há participação da proteína

Gi/o na ação antinociceptiva do disseleneto de difenila, isso é confirmado pelo fato

que o pré-tratamento dos animais com toxina pertussis, em dose capaz de inibir a

proteína Gi/o, não foi capaz de reverter o efeito antinociceptivo causado pelo

disseleneto de difenila no modelo da formalina em camundongos. Dados da

literatura mostram claramente que toxina pertussis causa inativação da proteína Gi/o

por ribosilação da sua subunidade catalítica (De Bock et al., 2003; Wen et al., 2003

Savinainen e Laitinen, 2004). A ativação da proteína Gi/o esta associada ao

bloqueio dos canais de cálcio dependente de voltagem e ativação dos canais de

potássio, resultando em hiperpolarização da membrana neuronal (Pertwee, 1999;

Schultz e Gross, 2001).

Nos últimos anos, estudos na literatura têm dado destaque à importância dos

canais de cálcio dependente de voltagem (CCDVs) no controle e transmissão da dor

(Saegusa et al., 2002). Além disso, bloqueadores de diferentes tipos de CCDVs

foram eficazes em inibir a nocicepção em modelos de dor inflamatória e neuropática

(Vanegas e Schaible, 2000; Saegusa et al., 2001; 2002). O influxo de íons Ca

através dos CCVDs, controla inúmeras funções celulares, pois é capaz de converter

sinais elétricos em sinais bioquímicos intracelulares responsáveis pelo controle de

inúmeras atividades neuronais, tais como a liberação de neurotransmissores, a

modulação da excitabilidade da membrana, a ativação de proteínas intracelulares e

expressão gênica (Hofmann et al., 1999; Catterall, 2000; Ward, 2004). Desta forma,

este íon é um dos principais envolvidos na transmissão nociceptiva (Prado, 2001;

Cervero e Laird, 2003) e drogas que evitam essa transmissão possuem efeito

antinociceptivo. Neste sentido, o presente estudo confirmou que os canais de cálcio

estão envolvidos, pelo menos em parte, na ação antinociceptiva induzida pelo

disseleneto de difenila, pois o pré-tratamento dos animais com cloreto de cálcio foi

capaz de prevenir a antinocicepção induzida pelo disseleneto de difenila em ambas

as fases do teste da formalina. Esses dados são fortalecidos com os resultados que

demonstram a ação antinociceptiva causada pelo disseleneto de difenila na

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111

nocicepção induzida pelo TNF-α (artigo 2), uma vez que, o TNF-α causa mobilização

de Ca

em cultura de neurônios sensoriais e substâncias que inibem a nocicepção

induzida pelo TNF-α, pode ser devido a uma inibição dos canais de cálcio (Pollock et

al., 2002). Somando-se a isso, no artigo 3, também foi elucidado a participação dos

canais de K

no efeito antinociceptivo causado pelo disseleneto de difenila. Os

resultados indicaram que o efeito antinociceptivo do disseleneto de difenila na

segunda fase do teste de formalina foi prevenido pela injeção intratecal de TEA

(bloqueador de diferentes tipos de canais de potássio, inclusive os dependentes de

voltagem), de apamina (bloqueador de canais de potássio de baixa condutância

ativados por cálcio) e de caribidotoxina (bloqueador de canais de potássio de alta

condutância ativados por cálcio), mas não foi revertido pela glibenclamida

(bloqueador de canais de K

dependente de ATP). Desta forma, o efeito

antinociceptivo causado pelo do disseleneto de difenila parece envolver abertura de

canais de potássio e bloqueio dos canais de cálcio.

Além disso, os resultados apresentados no artigo 3 demonstraram evidências

farmacológicas do envolvimento da via da L-arginina/óxido nítrico/GMPc no efeito

antinociceptivo do disseleneto de difenila no teste da formalina. De fato, a

administração de L-NOARG (inibidor da NOS), de azul de metileno e de ODQ

(inibidores da guanilato ciclase) significantemente bloquearam a antinocicepção

causada pelo disseleneto de difenila, o que pode ser atribuído a ativação da via L-

arginina/oxido nítrico/GMPc. Esses resultados foram surpreendentes, uma vez que

no ARTIGO 1, a ação antinociceptiva local do disseleneto de difenila foi atribuída a

inibição na formação do NO. Essa divergência pode estar relacionada à diferença no

modelo de dor experimental, como também quanto do nível de NO tecidual, ao

conteúdo intracelular de GMPc, as diferentes vias de administração e dosagens de

drogas. Corroborando com isso, as ações antagônicas do NO em situações

patológicas, como na dor, são atualmente, bem discutidas na literatura. Assim,

coletivamente, os dados do artigo 3 sugerem a participação da via da L-

arginina/óxido nítrico/cGMP e canais de Ca

no efeito antinociceptivo causado

pelo disseleneto de difenila no teste da formalina.

Considerando as atividades até aqui descritas para o disseleneto de difenila,

o último objetivo dessa tese foi investigar uma possível ação deste composto sobre

a nocicepção crônica, uma vez que, esta última, se diferencia substancialmente da

nocicepção aguda em termos de persistência e alterações adaptativas (Besson,

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112

1997; Woolf e Mannion, 1999; Zimmermann, 2001). Além disso, as drogas

disponíveis até o momento com o intuito de aliviar as dores crônicas são efetivas

somente em uma pequena parcela dos pacientes e grande parte delas apresentam

baixa eficácia e muitos efeitos colaterais (Woolf e Mannion, 1999; Mendell e Sahenk,

2003).

O estudo da dor crônica tem sido amplamente investigado através do uso de

animais de laboratório, os quais podem ser submetidos a lesões de nervo, tanto

periférico, quanto central; estes modelos mimetizam a sensibilização e alterações

plásticas ocorridas na dor neuropática (Zimmermann, 2001). Outro modelo de dor

persistente consiste, por exemplo, em um modelo de dor inflamatória induzida pela

administração periférica de agentes indutores de reposta imunológica como o ACF

(Mycobacterium tuberculosis morta e ressuspendida em óleo mineral) (Larson et al.,

1986).

Neste trabalho, a ligadura parcial de nervo ciático e a injeção i.pl. de ACF

tornaram os animais hipersensíveis e responsivos frente a estímulos inócuos aos

animais falso-operados ou não injetados (alodínia) (Seltzer et al., 1990). Apesar

disso, o tratamento com disseleneto de difenila após sete dias da ligadura do nervo

ou vinte quatro horas após a administração de ACF inibiu a alodínia tátil em ambos

os modelos.

A dor persistente, resultante da injeção periférica de ACF ou da constrição

parcial do nervo ciático, resulta em liberação de múltiplos mediadores inflamatórios e

nociceptivos, causando um aumento na duração e intensidade do potencial de ação

em fibras sensoriais primárias. Esta atividade leva a alterações no fenótipo de

células neuronais, neurogliais e neuroimunes no SNC. Estas mudançs podem

ocorrer em nível transcripcional ou pós transcripcional e atingem receptores, canais

iônicos, mediadores solúveis e outras moléculas envolvidas na sinalização celular

(Woolf e Mannion, 1999; Ji e Strichartz, 2004; Li et al., 2005). Além disso, a dor

persistente de origem inflamatória apresenta mecanismos de sensibilização

periférica e central, predominantemente distinto da dor persistente de origem

neuropática (Scholz e Woolf, 2002). Yajima e colaboradores (2003) evidenciaram em

seu estudo, papéis distintos da PKC e PKA na dor de origem inflamatória e

neuropática em camundongos. Em outro trabalho realizado por Zhang et al (2003)

observou-se o aumento na expressão de receptores canabinóides CB2 na medula

espinhal em modelos de lesão nervosa, porém, não em modelos de inflamação

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113

periférica persistente induzida pelo ACF, apontando novamente mecanismos

distintos.

Neste contexto, o efeito causado pelo disseleneto de difenila contra a lesão

do nervo e a inflamação induzida pelo ACF estão, provavelmente, associados à

capacidade deste composto em interferir com a sinalização celular, particularmente,

as vias relacionadas com PKC, PKA, NO, Ca

e K

Nesse estudo foi também elucidado que o disseleneto de difenila atenua a

hiperalgesia térmica induzida pelo glutamato, NMDA e BK. Esses dados estão de

acordo com os artigos 1 e 2 que demonstram um envolvimento do sistema

glutamatérgico e da PKC no efeito antinociceptivo causado pelo disseleneto de

difenila em camundongps. Adicionalmente a esses resultados, pode-se sugerir o

envolvimento da PKA na ação do disseleneto de difenila, uma vez que a

administração sistêmica do disseleneto de difenila inibiu a hiperalgesia térmica

causada pela injeção i.t. de PGE

Em conclusão, o presente trabalho demostra que o disseleneto de difenila

causou atividade antinociceptiva e antiinflamatória quando avaliado em modelos de

nocicepção aguda e crônica e alguns dos mecanismos envolvidos na ação

antinociceptiva e antiinflamatória também foram elucidados e estão demonstrados

na figura 7.

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114

PLC

DAG

⇑ Ca

NOS

PKC

PLA

TRPV

NMDA

PGE

COX

PLC

PKC

IL-1 β

NK-1

PKA

p38

GMPc

citocinas

COX

EROs

TNF-α

GTP

PKA

Figura 7: Prováveis sítios de ação do disseleneto de difenila com conseqüente

redução na nocicepção e inflamação. DD (disseleneto de difenila); IL-1β (receptor

para interleucina 1β); TNF-α (receptor para o fator de necrose tumoral α); NK-1

(receptor para neurocinina 1); K

(canal de potássio); EP (receptor para

prostaglandina E

); TRPV (receptor vanilóide); B

(receptor metabotrópico para a

bradicinina - B

); H

(canal catiônico sensível a ácidos); PLC (fosfolipase C); PLA

(fosfolipase A

); AA (ácido araquidônico); COX (ciclooxigenase); PGE

(prostaglandina

); PKC (proteína quinase C); PKA (proteína quinase A); AMPc (adenosina

monofosfato cíclico); DAG (diacilglicerol); NOS (óxido nítrico sintase); NO (óxido

nítrico); GC (guanilato ciclase); GMP

(guanosina-3’5’-monofosfato cíclico); GTP (

guanosina-5’-trifosfato); EROs (espécies reativas de oxigênio); p38 (proteína quinase

ativadas por mitógenos).

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115

6- CONCLUSÕES

De acordo com os resultados apresentados nesta tese podemos inferir que:

ü A administração oral do disseleneto de difenila apresentou baixa toxicidade

apresentando segurança no uso desse composto em camundongos.

ü A administração oral do disseleneto de difenila causou antinocicepção no modelo

das contorções abdominais induzidas pela injeção i.p. do ácido acético em

camundongos.

ü A administração oral do disseleneto de difenila foi capaz de prevenir a nocicepção

induzida pela injeção i.pl. de capsaicina, glutamato, formalina, PMA e bradicinina;

e a nocicepção induzida pela injeção i.t. de glutamato, NMDA, SP, capsaicina,

bradicinina e citocinas pró-inflamatórias em camundongos.

ü A administração oral do disseleneto de difenila foi capaz de prevenir a nocicepção

térmica, no modelo da imersão da cauda a 55 °C (Tail-immersion) em

camundongos.

ü A administração oral do disseleneto de difenila foi capaz de diminuir o efeito

hiperalgésico induzido pela BK, PGE

, pelo glutamato e NMDA no teste da placa

quente (“Hot plate”) em camundongos.

ü A administração oral do disseleneto de difenila reduziu a alodínia causada pela

ligadura parcial do nervo ciático e pela injeção i.pl. de ACF em camundongos.

ü Os mecanismos de ação envolvidos na ação antinociceptiva do disseleneto de

difenila envolvem: interação com os sistemas glutamatérgicos, peptidérgicos e

vanilóides; inibição da PKC e PKA; modulação da atividade das enzimas óxido

nítrico sintase e guanilato ciclase solúvel; aumento do influxo de K

e alterações

no transporte de Ca

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116

ü Os mecanismos de ação que parecem não estarem relacionados com a atividade

antinociceptiva do disseleneto de difenila incluem o sistema opióide; os

mecanismos dependentes da proteína G

i/o

e receptores glutamatérgicos

metabotrópicos e os ionotrópicos do tipo cainato e AMPA.

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117

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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8- DEMAIS TRABALHOS REALIZADOS DURANTE O PERÍODO DE

DOUTORAMENTO (07/05 – 08/07)

- Savegnago, L., Pinto, L.G., Jesse, C.R., Rocha, J.B.T., Nogueira, C.W., Zeni, G.

Monoaminergic agents modulate antidepressant-like effect caused by diphenyl

diselenide in rats. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry,

31, 1261 - 1269, 2007.

- Savegnago, L., Pinto, L.G., Jesse, C.R., Rocha, J.B.T., Nogueira, C.W., Zeni, G.

Diphenyl Diselenide exerts antidepressant–like and anxiolytic-like effects in

mice: Involvement of L-arginine-nitric oxide-soluble guanylate cyclase pathway

in its antidepressant-like action. Pharmacology, Biochemistry and Behavior,

submetido.

- Jesse, C.R., Savegnago, L., Nogueira, C.W. Role of Nitric Oxide/cyclic GMP/K

Channel Pathways in the Antinociceptive Effect Caused by 2, 3-

Bis(mesitylseleno)propenol” . Life Sciences, submetido.

- Borges, V.C., Rocha, J.B.T., Savegnago. L., Nogueira, C.W.

Repeated

Administration of Diphenyl Ditelluride Induces Hematological Disorders in

Rats. Food and Chem. Toxicol. 45, 1453 - 1458, 2007.

- Savegnago, L., Jesse, Cristiano Ricardo, Moro, Angélica Venturine, Borges,

Vanessa Corralo, Santos, Francielli Weber, Rocha, João Teixeira da, Nogueira,

Cristina Wayne. Bis -Selenide Alkene Derivatives: A Class of Potential

Antioxidant and Antinociceptive Agents. Pharmacology, Biochemistry and

Behavior 83, 221 - 229, 2006.

- Borges, Vanessa C., Dadalt G, Savegnago, L., Moro, Angélica, Rocha, João B. T.,

Nogueira, Cristina W. 1,1,2-Tris-organoselenide alkene derivatives, but not 1,2-

bis-organoselenide alkene derivatives, inhibited delta-aminolevulinate

dehidratase activity from human erythrocytic cells in vitro. Toxicology in Vitro, 3,

387 - 391, 2007.

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152

- Savegnago, L., Borges, Vanessa C., Alves, Diego, Jesse, Cristiano R., ROCHA,

Joao B. T., Nogueira, Cristina W. Evaluation of Antioxidant Activity and Potential

Toxicity of 1-Buthyltelurenyl-2-methylthioheptene. Life Sciences. 79, 1546 -

1552, 2006.

- Stefani, H.A., Oliveira, C.B., Almeida, R.B., Pereira, C.M.P., Braga, R.C., Cella, R.,

Borges, V.C., Savegnago, L., Nogueira, C.W. Dihydropyrimidin-(2H)-ones obtained

by ultrasound irradiation: a new class of potential antioxidant agents. European

Journal of Medical Chemistry. 41, 513 - 518, 2006.

- Prediger, Patrícia, Moro, Angélica V, Nogueira, Cristina W, Savegnago, L., Menezes,

Paulo Henrique, Rocha, João B T, Zeni, Gilson. Palladium-Catalyzed Suzuki Cross-

Coupling of 2-Haloselenophenes: Synthesis of 2-Arylselenophenes, 2,5-

Diarylselenophenes and 2-Arylselenophenyl Ketones. Journal of Organic

Chemistry., 71, 3786 - 3792, 2006.

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