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UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO
ALINE ROGÉRIA FREIRE DE CASTILHO
AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS CLÍNICOS, SALIVARES E
MOLECULARES EM PACIENTES COM SÍNDROME DE DOWN
BAURU
2007
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UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO
ALINE ROGÉRIA FREIRE DE CASTILHO
AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS CLÍNICOS, SALIVARES E
MOLECULARES EM PACIENTES COM SÍNDROME DE DOWN
BAURU
2007
Dissertação apresentada à Pró-reitoria de Pesquisa
e Pós-graduação, na Universidade do Sagrado
Coração, como parte integrante dos requisitos para
obtenção do título de mestre no Programa de
Mestrado em Biologia Oral.
Orientador: Prof. Dr. Cássio Vicente Pereira
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Castilho, Aline Rogéria Freire de
C3521d
Avaliação de parâmetros clínicos, salivares e
moleculares em pacientes com síndrome de Down /Aline
Rogéria Freire de Castilho--2007.
61f.
Orientadora: Prof. Dr. Cássio Vicente Pereira
Dissertação de Mestrado (Biologia Oral)-
Universidade do Sagrado Coração - Bauru - SP.
1.Cárie dentária 2.Streptococcus mutans
3.Streptococcus sobrinus 4.Síndrome de Down I.Pereira,
Cássio Vicente II.Título.
3
CASTILHO, Aline Rogéria Freire de.
Avaliação de parâmetros clínicos, salivares e moleculares em pacientes
com síndrome de Down.
Dissertação de Mestrado em Biologia Oral, apresentada à Universidade do Sagrado Coração e
aprovada pela seguinte banca examinadora:
Orientador: Prof. Dr. Cássio Vicente Pereira
Mestrado em Biologia Oral da USC
Prof. Dr. José Francisco Höfling
Pós-Graduação em Odontologia da FOP-UNICAMP
Prof.ª Dr.ª Vanessa Pardi
Mestrado em Biologia Oral da USC
Bauru, 20 de junho de 2007.
4
À Deus, por sempre iluminar meu caminho e me conceder força para continuar sempre
lutando em buscas das conquistas de minha vida.
Aos meus pais, Sebastião de Castilho Cordeiro e Maria de Fátima Freire Castilho, pelo
amor, carinho e, acima de tudo, pelo exemplo e incentivo para a realização dos meus sonhos
em todos os dias de minha vida.
Aos meus irmãos, Ariana Freire de Castilho e Luís Gustavo Freire de Castilho, pela
compreensão e colaboração nos momentos mais difíceis.
Ao meu marido Marcelo Simão Gabriel, pelo verdadeiro amor, cumplicidade infinita e apoio
constante, me estimulando a atingir meus objetivos.
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AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Cássio Vicente Pereira, pelo empenho e dedicação ao transmitir
seus conhecimentos, pela confiança e credibilidade em mim depositada e, acima de tudo, pela
contribuição para o meu crescimento pessoal e profissional.
À Prof.ª Dr.ª Sara Nader Marta, pelo apoio e incentivo em todos os momentos de minha vida
profissional. Sua conduta como docente e exemplo de ser humano são responsáveis pela
ampliação do meu campo de atuação. Além disso, agradeço sua autorização para a execução
da pesquisa nos participantes do PAIPE (Programa de Assistência Integral ao Paciente
Especial).
À Prof.ª Dr.ª Vanessa Pardi, pela atenção e disponibilidade irrestrita em atender minhas
solicitações de ajuda. Sua amizade e dedicação colaboraram de forma decisiva para a
elaboração deste estudo. Agradeço também pela realização das análises estatísticas.
Ao Prof. José Francisco Höfling por aceitar meu convite e colaborar com seus conhecimentos
na banca de defesa desta dissertação.
À FAPESP (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo) pela bolsa de estudo
concedida (#04/12925-0).
À amiga Alessandra Valessa Rocha, funcionária do Convênio Odontológico Véritas, pela
paciência, dedicação e apoio não apenas na seleção e agendamento dos participantes deste
estudo, mas em todos os momentos em que foi solicitada.
6
Ao Wilson Aparecido Orcini, técnico do Laboratório de Biologia Molecular da USC, pela
paciência, disponibilidade e ajuda na realização da fase experimental deste trabalho.
À APAE-Bauru, APAE-Pirajuí e APAE-Dois Córregos, pela autorização da realização da
pesquisa nos pacientes da instituição.
À cirurgiã-dentista Renata de Almeida Pernambuco, responsável pelo atendimento
odontológico na APAE – Bauru, pela colaboração e autorização da realização da pesquisa na
instituição.
Ao Sr. Venícius Tobias, diretor da Sukest Indústria de Alimentos e Farma, pela doação de
goma-base, material essencial para o desenvolvimento deste estudo.
À Reitora da Universidade do Sagrado Coração Profª Drª. Mag. Irmã Elvira Milani por
autorizar a realização deste estudo
Ao Pró-Reitor de Pesquisa e Pós-graduação da Universidade do Sagrado Coração Prof. Dr.
José Jobson de Andrade Arruda pelo apoio.
Ao coordenador do Programa de Mestrado em Biologia Oral da Universidade do Sagrado
Coração Prof. Dr. Sérgio Augusto Catanzaro pelo apoio.
Aos funcionários da Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-graduação da Universidade do Sagrado
Coração Ricardo Borgo, Ângela Moraes, Lylian Rocha, Maria Aparecida Santos, Ana
7
Carolina Brito, Flávia Moraes e Denise Vilela pelo apoio e auxílio em todos os momentos em
que foram solicitados.
Aos colegas de curso, pelo companheirismo a mim dedicado.
Aos voluntários deste estudo, pela participação e por entenderem o quão importante era este
estudo para mim, me dando a certeza mais uma vez de que tudo vale a pena.
A todos aqueles que, direta ou indiretamente, colaboraram com o desenvolvimento e
conclusão deste estudo.
8
RESUMO
Com o intuito de melhor compreender os fatores moduladores da etiologia e desenvolvimento
da cárie em indivíduos com síndrome de Down, o presente estudo propôs-se a determinar a
ocorrência de cárie dentária por meio de análise clínica (CPOD, CPOS, ceo e ceos), o perfil
salivar desses indivíduos pela análise do fluxo e sua capacidade – tampão, o número de
unidades formadoras de colônias de estreptococos do grupo mutans (UFC/mL) na saliva e a
prevalência de Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus através da técnica molecular
da PCR (polimerase chain reaction). O grupo experimental constou de 60 indivíduos com
síndrome de Down, de ambos os sexos com idade entre 01 e 48 anos. Os índices de cárie
CPOD, CPOS, ceod e ceos no grupo de estudo apresentaram valores médios de 4,53; 6,85;
1,55 e 2,55; respectivamente. Dos indivíduos que participaram do estudo, 94,0%
apresentaram velocidade de fluxo salivar acentuadamente diminuída e 6,0% apresentaram
fluxo salivar normal, sendo que, 44,0% tinham capacidade-tampão salivar baixa, 39%
capacidade-tampão nos valores limites e apenas 16,6%, capacidade-tampão normal. Em
complemento, 60,0% dos indivíduos apresentaram contagem acima de 1x10
6
UFC/mL. A
maioria dos indivíduos (69,0%) apresentou colônias de S. mutans, 41,4% de S. sobrinus e
17,3% não possuíam nenhuma dessas espécies. Os dados foram submetidos à análise
estatística, utilizando-se o teste Qui-quadrado e a correlação de Pearson (X= 0,05), para a
determinação da correlação entre todos os parâmetros avaliados. A correlação de Pearson
mostrou valores significativos com p< 0,05 para CPOD x idade (r= 0,80; p< 0,01) e para
CPOS x idade (r= 0,82; p< 0,01). Não houve correlação significativa (p>0,05) entre
CPOD/CPOS x velocidade de fluxo salivar, CPOD/CPOS x capacidade tampão e
CPOD/CPOS x UFC/mL. O teste Qui-quadrado não mostrou associação entre CPOD/CPOS x
presença de S. mutans/S. sobrinus/outros microrganismos. Não houve associação entre os
índices de cárie e o gênero dos indivíduos pelo teste Qui-quadrado (p>0,05). Os dados
mostraram que resultados evidenciaram que os indivíduos com síndrome de Down
apresentaram altos índices de cárie, fluxo salivar acentuadamente diminuído e capacidade-
tampão baixa. Em adição, apresentaram um número elevado de colônias de estreptococos do
grupo mutans e a maioria deles era colonizada por S. mutans e S. sobrinus. Os índices de cárie
aumentaram com a idade dos participantes; porém, o sexo dos indivíduos não influenciou
nesses índices. Os dados mostram que não há associação entre os parâmetros clínicos,
salivares e moleculares em indivíduos com síndrome de Down.
Palavras-chave: Cárie dentária, saliva, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus,
síndrome de Down.
9
ABSTRACT
There is a need for a better understanding of the factors that affect the development of dental
caries in Down syndrome. Thus, the aim of this study was 1) to determine the occurrence of
dental caries using DMFT, DMFS, dmft and dmfs indexes, 2) to evaluate the salivary profile
by flow rate and buffering capacity, 3) to determine the number of colonies forming units of
mutans streptococci (CFU/mL) in saliva, 4) and to assess the prevalence of Streptococcus
mutans and Streptococcus sobrinus by polymerase chain reaction. The experimental group
included 60 individuals with Down syndrome of both genders and aged one to 48 years old.
The mean values of caries indexes were DMFT=4.53, DMFS= 6.85, dmft= 1.55 and dmfs=
2.55. Ninety-four percent of individuals had low flow rate and 6.0% had normal flow rate.
Forty-four percent had low buffering capacity, 39.0% had limited buffering capacity, and
17.0% had normal buffering capacity. Besides, 60.0% had more than 1x10
6
CFU/mL in
saliva. Almost all individuals (69.0%) had S. mutans in saliva, 41.4% had S. sobrinus and
17.3% had no S. mutans or S. sobrinus in the mouth. The data were statistically analyzed by
chi-square and Pearson’s correlation (X= 0.05). There was a significant positive correlation
between DMFT or DMFS and age (r= 0.80; p< 0.01; r= 0.82; p< 0.01, respectively) by
Pearson’s correlation. Nevertheless, caries indexes did not significantly correlate with flow
rate, buffering capacity, and number of colony forming units (p>0.05). A chi-square test
showed no significant association of DMFT, DMFS, dmft and dmfs indexes with the
prevalence of S. mutans and S. sobrinus in the mouth or with gender (p>0.05). These findings
show that there is no association between clinical picture and salivary or molecular
parameters in Down syndrome individuals.
Keywords: Dental caries, saliva, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Down
syndrome.
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
.....................................................................................................
11
2 REVISÃO
DE
LITERATURA
.............................................................................
13
3 OBJETIVOS .....................
.....................................................................................
22
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 23
5 RESULTADOS ..................................................................................................... 32
6 DISCUSSÃO ..........................................................................................................
39
7 CONCLUSÃO ...........................................................
............................................
45
REFERÊNCIAS ....................................................................................................
46
ANEXOS ................................................................................................................
51
11
1 INTRODUÇÃO
A síndrome de Down é uma anomalia congênita causada pela presença de um
cromossomo a mais no par 21 e, por isto, é também denominada de trissomia do cromossomo
21. Esta síndrome é a anormalidade mais prevalente nos seres humanos, com ocorrência em
aproximadamente 1:800 nascimentos vivos (ARESI, 1984; MUSTACCHI, ROZONE, 1990;
BUXTON, HUNTER, 1999).
Muitos fatores podem influenciar potencializando ou amenizando a ocorrência da
cárie; porém, o biofilme bacteriano é imprescindível para a ocorrência da doença (PINTO,
2000).
A baixa prevalência de cárie nos indivíduos com síndrome de Down pode ser atribuída
ao padrão de erupção retardado e composição salivar diferente das crianças normais
(BROWN, CUNNINGHAM, 1961; CREIGHTON, WELLS, 1966; COHEN et al., 1970), à
morfologia dentária com fóssulas e fissuras menos acentuadas e superfície oclusal menos
acidentada devido ao bruxismo (McMILLAN, KASHGARIAN, 1961; MUSTACCHI,
ROZONE, 1990) ou à diferença da composição da microbiota associada ao biofilme
(BARNETT, 1986; COGULU et al., 2006).
A saliva é importante para a manutenção da integridade dos tecidos dentais; pois, além
de contribuir para a remineralização dental pela sua composição mineral, também contém
substâncias antimicrobianas e auxilia o enxágüe fisiológico dos dentes, removendo resíduos
alimentares e bactérias, impedindo a estagnação de alimentos ou o acúmulo exagerado de
biofilme (JORGE, 1998).
O fluxo salivar carrega consigo bactérias e outros microrganismos, controlando a
microbiota, pela sua ação mecânica. Em média, o volume do fluxo salivar em 24 horas é de
1200 mL; sendo que, a capacidade de limpeza depende da velocidade de produção e
viscosidade dos fluidos salivares e indivíduos com baixa secreção salivar tendem a apresentar
maior potencial cariogênico (JORGE, 1998; PINTO, 2000). A capacidade-tampão da saliva,
juntamente com o fluxo salivar, apresenta um papel importante na regulação da microbiota
bucal, pois mantém o pH salivar constante quando se adiciona à mesma um ácido fraco,
impedindo algumas espécies bacterianas patogênicas de colonizar a boca, removendo e
tamponando ácidos produzidos por esses microrganismos da microbiota bucal (JORGE,
1998).
A determinação do número total de colônias de estreptococos do grupo mutans e de
suas espécies mais prevalentes é fundamental para verificar o risco de desenvolvimento de
12
cárie dentária, e, após o isolamento das colônias, a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
tem demonstrado ser uma técnica rápida e precisa na identificação das espécies de
Streptococcus mutans, a partir de regiões especificas do gene da glucosiltranferase
(HOSHINO et al., 2004; SANTOS et al., 2004).
A identificação de espécies como S. mutans e S. sobrinus é importante para verificar a
interação e o papel destes microrganismos na formação de biofilme e sua indução na cárie
dentária (PEREIRA et al., 2006).
Como demonstrado na literatura, várias pesquisas têm apontado para a existência de
variações no ecossistema da cavidade bucal entre indivíduos com síndrome de Down. Esses
pacientes podem apresentar alterações fisiológicas de fluxo e composição salivar que são
fundamentais na colonização microbiana das superfícies dentárias por espécies como os S.
mutans e S. sobrinus, interferindo diretamente na iniciação de processos patológicos
(BROWN, CUNNINGHAM, 1961; CREIGHTON, WELLS, 1966; COHEN et al., 1970;
BARNETT, 1986; COGULU et al., 2006).
A obtenção de dados que incluem a avaliação de parâmetros clínicos, as análises
fisiológicas de fluxo e composição salivar, colonização e identificação molecular de espécies
como S. mutans e S. sobrinus permitirão uma maior compreensão dos mecanismos de
iniciação e desenvolvimento de patologias como a doença cárie nos indivíduos com síndrome
de Down.
13
2 REVISÃO DE LITERATURA
Em 1.866, John Longden Hayden Down, um conceituado médico inglês relatou pela
primeira vez na literatura a síndrome de Down que, devido às semelhanças físicas dos seus
portadores com a raça mongólica foi erroneamente denominada de idiotia mongoliana
(BUXTON, HUNTER, 1999; FISKE, SHAFIK, 2001; OLIVEIRA et al., 2001). Somente em
1959, Lejeune et al., demonstraram que a síndrome de Down resultava da presença de um
cromossomo a mais no par 21, resultante da não disjunção cromossômica, da translocação ou
do mosaicismo durante a meiose (ARESI, 1984; MUSTACCHI, ROZONE, 1990; FISKE,
SHAFIK, 2001). A síndrome foi então denominada de trissomia do 21, trissomia G ou ainda
mongolismo; entretanto, em 1985, devido a discordância da expressão relacionada à raça
mongólica, o termo mongolismo foi excluído das publicações da Organização Mundial de
Saúde (OMS) e atualmente está em desuso (COE et al., 1999).
A síndrome de Down é a anormalidade mais prevalente em seres humanos, ocorrendo
em, aproximadamente, 1:800 nascimentos vivos (BUXTON, HUNTER, 1999); e, talvez por
isso, seja objeto de tantos estudos disponíveis na literatura mundial.
Em se tratando de síndrome de Down, os autores são unânimes em afirmar a baixa
prevalência de cárie e alta prevalência da doença periodontal nestes pacientes, quando
comparada a indivíduos com retardo mental, ou mesmo normais (MUSTACCHI, ROZONE,
1990; BUXTON, HUNTER, 1999; ACERBI et al., 2001; FISKE, SHAFIK, 2001;
OLIVEIRA et al., 2001).
A fim de verificar a experiência de cárie e a de periodontite na síndrome de Down,
Ulseth et al. (1991), realizaram um estudo e encontraram menor prevalência de cárie e maior
prevalência de periodontite nesta população. Embora a prevalência de cárie tenha sido menor
nos indivíduos com a síndrome, os valores dos índices de cárie deste grupo foram altos (12,5
e 18,8 para edêntulos e não edêntulos, respectivamente) e semelhantes aos valores do grupo
controle (18,0 e 20,0). Não houve diferença estatisticamente significante quando
correlacionada à doença cárie entre o grupo com síndrome de Down e o grupo controle.
Pinazo et al. (1998), verificaram menor prevalência de cárie em 121 crianças de sete a
14 anos com síndrome de Down, quando comparados aos indivíduos normais. Os valores
médios do CPOD aumentaram com a idade dos indivíduos e quase 50% dos indivíduos
apresentaram acúmulo severo de biofilme dentário. A menor prevalência de cárie neste grupo
foi atribuída ao retardo na cronologia de erupção dentária e às anodontias múltiplas associadas
à síndrome.
14
No estudo de Moraes et al. (2002), 38 indivíduos com síndrome de Down foram
separados em grupos, de acordo com a idade (3-9, 10-17, 18-28) para determinação da
prevalência de cárie nesta população. Os valores médios dos índices CPOD e ceod para os
grupos descritos foram 0,12 e 2,87; 2,76 e 0,76; 4,78 e 0,55; 2,68 e 1,15; respectivamente.
Embora os autores tenham encontrado baixa prevalência de cárie, observaram que os valores
eram semelhantes àqueles verificados nas crianças normais na mesma faixa etária.
Em trabalhos como o de Bradley, McAlister (2004), onde a condição de saúde bucal
de 71 crianças com síndrome de Down nas idades de cinco, oito, 12 e 15 anos foi avaliada, os
pesquisadores observaram que, em todas as idades, a porcentagem de crianças livres de cárie
com a síndrome foi maior que das crianças com outras necessidades especiais. O valor médio
do ceod aos cinco anos foi de 0,2; mas, somente cinco crianças foram examinadas neste
grupo. Aos oito anos, o ceod foi 1,93 enquanto o CPOD foi 0,13. Já na faixa etária de 12 e 15
anos, o CPOD foi 0,83 e 0,71; respectivamente. Em adição, as crianças apresentaram mais
extrações do que restaurações nos dentes e, aos 15 anos, os indivíduos apresentaram mais
restaurações e nenhum dente havia sido extraído. Os participantes deste estudo visitavam o
dentista regularmente.
Embora outros estudos recentes demonstrados na literatura indiquem a menor
ocorrência de cárie em indivíduos com síndrome de Down (VAZQUEZ et al. 2002; LEE et
al., 2004; FUNG, ALLISON, 2005), o estudo realizado por Araújo, em 2000, mostrou que as
crianças com síndrome de Down são susceptíveis à cárie dentária como qualquer outra criança
e enfatizou a necessidade de acompanhamento odontológico desde o primeiro ano de vida;
uma vez que, a cárie dentária é uma doença infecciosa transmissível de etiologia multifatorial
(THYLSTRUP, FEJERSKOV, 2001) e, portanto, vários fatores podem influenciar
potencializando ou amenizando a ocorrência desta patologia (PINTO, 2000).
Em meados de 1955, foi demonstrada a participação de estreptococos como agente
etiológico da cárie, com a divulgação de trabalhos com ratos gnotobióticos (ORLAND et al.,
1955; FITZGERALD et al., 1960), posteriormente reforçada com as experimentações
empregando “hamsters” convencionais (FITZGERALD, KEYES, 1960), às quais seguiram o
trinômio hospedeiro-sacarose-estreptococos, capaz de explicar a instalação e a progressão do
processo carioso (KEYES, 1960; KEYES, FITZGERALD, 1962; KEYES, FITZGERALD,
1963; FITZGERALD, KEYES, 1963).
Os estreptococos do grupo mutans são colonizadores precoces e aderem ás
glucoproteínas da película salivar formada sobre o esmalte dental por meio de um sistema
15
enzimático, metabolizando a sacarose pela produção de glicosiltransferases e sintetizando
glicanos de alto peso molecular (JORGE, 1998).
As espécies de estreptococos do grupo mutans mais predominantemente isoladas de
amostras salivares têm sido Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus. O grupo mutans
apresenta espécies antigênicas e geneticamente heterogêneas, originando várias linhagens
desses microrganismos, as quais permitiram o conhecimento de diferentes biotipos
envolvendo este grupo de bactérias, sendo que as espécies que se destacam em maior número
de colônias isoladas a partir de amostras salivares são S. mutans e S. sobrinus (CARLSSON,
1968).
O Streptococcus mutans é um microrganismo intimamente associado à cárie dentária,
apresentando a capacidade de sintetizar polissacarídeos extracelulares aderentes, a partir da
sacarose, e polissacarídeos intracelulares a partir de carboidratos fermentáveis (CARLSSON,
1968).
O Streptococcus sobrinus difere do Streptococcus mutans em algumas características
bioquímicas e importantes fatores de virulência, como produção de ácido e capacidade de
adesão (CARLSSON, 1968). De acordo com HIROSE et al. (1993), a prevalência de S.
sobrinus na saliva, está, de certo modo, associada à formação de futuras lesões cariosas,
assegurando o aumento de cárie em superfícies lisas, quando comparado ao S. mutans.
Para identificar biótipos salivares de estreptococos do grupo mutans, Spolidório et al.
(2004), isolaram colônias de 200 crianças e observaram que as espécies mais prevalentes
foram S. mutans (78,0%) e, em seguida, S. sobrinus (11,6%). As espécies S. rattus, S. mutans
V, S. cricettus e S. ferus também foram observadas, entretanto a associação mais freqüente foi
de S. mutans/ S. sobrinus.
A reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) é a amplificação enzimática de uma
seqüência especifica de DNA in vitro, utilizando múltiplos ciclos de desnaturação da dupla
fita de DNA, seguidos de ciclos de anelamento do primer espécie-específico e extensão do
primer para amplificação da seqüência de DNA modelo. A PCR, quando comparada aos
outros métodos tradicionais de cultura para a detecção de microrganismos mostrou vantagens
devido sua rapidez, sua alta especificidade e sensibilidade. Por estas razões, este método tem
sido muito utilizado em Odontologia para detectar fatores envolvidos na etiologia de diversas
doenças provocadas por microrganismos, entre elas, a cárie dentária (SANTOS et al., 2004).
A comprovação de que variações em características bioquímicas, sorológicas e
genéticas entre estreptococos do grupo mutans relacionam-se à espécie animal da qual foi
isolado (BRATTHALL, 1970; COYKENDALL, 1974; PERCH et al., 1974), foi reconhecida
16
pela edição do manual de Bergey (HARDIE, 1986), o qual descreve o grupo mutans de
estreptococos, composto pelas espécies S. cricetus, S. mutans, S. rattus, S. sobrinus, S. ferus e
S. macacae. Whiley et al. (1988), propuseram mais uma espécie, S. downei, sorotipo h,
representando uma espécie distinta pertencente ao grupo mutans. Igarashi et al. (1996)
utilizaram a técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) para detecção de S. mutans
diretamente do biofilme bacteriano humano. A partir de primers específicos para a porção do
gene dextranase (dexA) do S. mutans (sorotipo c) um fragmento de DNA – 172 bp – foi
amplificado possibilitando a detecção específica dessa espécie. Os resultados indicaram que a
técnica de PCR foi satisfatória para a detecção e identificação específica do S. mutans
presente no biofilme. Atualmente, mais uma espécie foi adicionada a esse grupo de
microrganismos sendo denominada Streptococcus orisratti após estudo apresentado por Zhu
et al. (2000).
A diversidade clonal e colonização de S. mutans foram estudadas em 50 dentes de sete
crianças com idade entre três e sete anos e amostras salivares de cinco destas crianças por
Grönroos, Alaluusua (2000). Um total de 598 amostras representativas de S. mutans e S.
sobrinus foram isoladas e submetidas à técnica de AP-PCR (Arbitrarily Primed Polymerase
Chain Reaction) para genotipagem. A contagem total de Streptococcus mutans na saliva das
amostras variou entre 0,09 e 8,2%. A proporção média da contagem total de estreptococos na
cultura positiva das amostras de sítios livres de cárie, da camada superficial das lesões de
cárie e da camada profunda das lesões foi de 1,1%, 14,7% e 10%, respectivamente. Das 598
amostras isoladas, a técnica de AP-PCR apresentou 13 linhagens de S. mutans e duas de S.
sobrinus. Cada criança apresentou de um a quatro tipos diferentes de estreptococos mutans e,
em três das sete crianças, a distribuição dos tipos de espécies difere de acordo com o sítio.
Não houve correlação estatisticamente significante entre o número de tipos detectados pela
AP-PCR de S. mutans e a contagem total de estreptococos.
As diferenças morfológicas, bioquímicas e genéticas (PCR) de S. mutans e S. sobrinus
foram verificadas por autores, que compararam sua ocorrência com a prevalência de cárie
dental em 126 pessoas de Mosuo (WU et al., 2003). Os resultados demonstraram menor
prevalência de cárie nos homens que nas mulheres (11,6 e 86,9%, respectivamente). Não
houve 100% de concordância entre a caracterização morfológica e PCR. Os testes de
fermentação para manitol, sorbitol, rafinose, melibiose, arginina e hidrólise de arginina e
melibiose resultaram em pobre especificidade (35,5%) e baixa concordância (61,5%),
comparados com a técnica da PCR. As espécies S. mutans e S. sobrinus foram observadas em
75,4% e 57,1% dos sujeitos, respectivamente, pela técnica da PCR. Apenas 7,1% dos sujeitos
17
foram negativos para ambas as espécies. O grupo de sujeitos com ambas as espécies
apresentou maior prevalência de cárie que os outros grupos.
Barone et al. (2005), utilizaram a técnica genotípica AP-PCR para verificar a
transmissão e aquisição de linhagens de S. mutans entre cinco pares de mães e filhos, onde as
crianças tinham síndrome de Down, com idade média de dez anos. A saliva dos participantes
foi coletada duas vezes e, na primeira amostra, os resultados confirmaram a presença de S.
mutans em todas as amostras de saliva estudadas, enquanto que S. sobrinus não foram
detectados em nenhuma destas amostras. Na segunda amostra de saliva colhida seis meses
apos a primeira, as crianças com síndrome de Down apresentaram novas colônias de S.
mutans, as quais eram diferentes daquelas identificadas por meio da técnica AP-PCR feita
anteriormente, sugerindo que este tipo de microrganismo é capaz de mudar mais que uma vez
nesta população. As amostras dos pares de mães e filhos não apresentaram nenhum genótipo
idêntico entre elas.
O estudo de Cogulu et al. (2006) demonstrado na literatura, utilizando a mesma
técnica genotípica de AP-PCR, evidenciou a presença de três diferentes tipos de linhagem de
S. mutans na saliva de 60 crianças com síndrome de Down, com idade entre sete e 12 anos,
em comparação com os oito tipos encontrados em indivíduos normais. As espécies de S.
mutans genotipadas no grupo da síndrome tinham o mesmo perfil em 70% das amostras
enquanto que, no grupo controle, 54% eram da mesma linhagem. Além disso, todas as
linhagens detectadas no grupo experimental eram diferentes daquelas observadas no grupo
controle. Houve diferença estatisticamente significante entre os perfis das colônias e a
prevalência de cárie, o que levou a conclusão de que a linhagem de S. mutans presente na
síndrome de Down deve ser a causa da baixa prevalência de cárie.
Com relação ao número de microrganismos presentes na cavidade bucal, um estudo
proposto por Koga-Ito et al. (2004), verificou a correlação entre contagem de estreptococos
do grupo mutans, cárie dental e o anticorpo IgA anti-estreptococos na saliva de 240
indivíduos com idade entre três e 12 anos com cárie, com cárie rampante e livres de cárie e
indivíduos entre 18 e 25 anos, divididos em grupos com cárie e livres de cárie. Os resultados
mostraram que a maior contagem total de microrganismos foi encontrada no grupo de
crianças com cárie, em comparação aos demais grupos de crianças e adultos, com diferença
estatisticamente significante. Os maiores níveis de IgA foram observados no grupo de adultos
jovens sem cárie e no grupo de crianças com cárie rampante, sugerindo a falta de efeito
protetor contra cárie deste anticorpo. As espécies mais prevalentes foram S. mutans (94,53%),
seguida de S. sobrinus (5,47%) nos grupos. Não houve diferença estatisticamente significante
18
com relação ao fluxo salivar, índice de higiene oral simplificado e contagem de
microrganismos com o grupo de adultos jovens; assim como não foi observada correlação
entre a contagem de estreptococos do grupo mutans na saliva e os níveis de IgA anti-
Streptococcus mutans nos grupos estudados.
Em estudo semelhante Lee et al. (2004), compararam o índice de cárie com a
concentração de anticorpo IgA em 19 crianças com síndrome de Down de oito a 17 anos. Os
índices CPOD (4,82) e ceod (6,82) foram significantemente menores nas crianças com a
síndrome do que nas crianças normais (8,35 e 34,81; respectivamente). Também, o grupo de
crianças com a síndrome apresentou maiores concentrações de IgA, serotipo g-s-IgA e
serotipo c-s-IgA na saliva quando comparado ao grupo controle; mas, a concentração de
anticorpos IgA total foi semelhante entre os grupos. Os autores concluíram que a baixa
prevalência de cárie em crianças com síndrome de Down estava associada às maiores
quantidades de anticorpos IgA espécie-específicos contra S. mutans na saliva.
Estudos anteriores já haviam sido feitos para verificar a associação entre cárie dentária
e presença de S. mutans na síndrome de Down, como o de Morinushi et al., em 1995, que
encontrou o CPOD= 15,9 para um grupo de 75 indivíduos com a síndrome, na faixa etária de
dois a dezoito anos. Embora seja um valor elevado, o grupo controle ainda apresentou maior
índice de cárie (CPOD=23,8) que o grupo da síndrome. Ainda neste estudo, os autores
encontraram uma correlação positiva significante entre a prevalência de cárie e a presença de
S. mutans na cavidade bucal destes indivíduos e que, a imunização contra a espécie S. mutans
na síndrome era semelhante aquela observada nas crianças normais. Houve correlação
positiva entre o anticorpo IgM e a severidade da cárie e entre este mesmo anticorpo e a
presença de S. mutans na síndrome; porém, não houve correlação entre cárie e o anticorpo
IgM contra S. mitis. Contudo, este estudo não deixou claro se os anticorpos estudados
protegem contra a doença cárie ou são responsáveis pela sua redução na população com
síndrome de Down.
Cornejo et al. (1996), ao verificar o estado de saúde bucal por meio de exame clinico
intrabucal, analise salivar e microbiológica de 86 sujeitos com síndrome de Down, com idade
entre três e 19 anos, observaram valores mais altos para os índices ceod e ceos no grupo da
síndrome na faixa etária de três a nove anos, enquanto que, os valores de CPOD e CPOS
foram maiores no grupo controle a partir dos dez anos de idade. As crianças com síndrome de
Down apresentaram mais dentes decíduos após os nove anos do que o grupo controle, devido
o atraso na erupção e agenesias. Em adição, as concentraçãos de IgA e cálcio eram mais
elevadas na síndrome e os níveis de tiocianato eram significantemente maiores nestes mesmos
19
indivíduos com idade inferior a 14 anos. As concentrações de proteínas e fosfato, a relação
cálcio/fósforo e a atividade da sialoperoxidase foram similares em ambos os grupos. Os testes
microbiológicos mostraram maior atividade de Lactobacillus e elevado número de colônias de
S. mutans (>10
5
UFC/mL), favorecendo o risco a doença na síndrome, uma vez que houve
correlação entre a alta prevalência de cárie pelos índices CPOS e ceos e o número elevado de
S. mutans nesta síndrome.
A relação entre os fatores presença de cárie dentária, biofilme visível e contagem de
estreptococos do grupo mutans foi verificada por Jesus (2002), em crianças de 12 a 48 meses
de idade,
com e sem a síndrome de Down, onde a prevalência de cárie dentária no grupo da
síndrome foi de 15,38% e o aumento da idade promoveu o aumento da colonização por
estreptococos do grupo mutans nesta população. Além disso, os autores observaram
correlação positiva entre a presença de lesão de cárie e altos níveis de estreptococos do grupo
mutans e entre a presença de lesão e a presença de biofilme dental visível.
Nessa linha de investigação, Hirose et al. (1993), avaliaram a presença de S. mutans na
saliva de 338 crianças entre três e cinco anos de idade e compararam aos índices de cárie
dessas mesmas crianças. Os resultados mostraram que os escolares que possuíam as espécies
S. mutans e S. sobrinus apresentavam índices de cárie significativamente mais elevados que as
crianças colonizadas por apenas uma das espécies, e que o S. sobrinus estava mais
intimamente associados às lesões de superfície lisa, sugerindo uma maior capacidade de
adesão desse microrganismo à estrutura dentária, quando comparada à espécie S. mutans.
Babaahmady et al. (1998), realizaram um estudo correlacionando a presença de S.
mutans, S. sobrinus e Lactobacillus com o processo de iniciação de cáries, a partir de
amostras de biofilme de 64 crianças. Os autores concluíram que não houve relação entre
Lactobacillus e as lesões iniciais de cárie, mas a presença de S. mutans e S. sobrinus juntos,
estava fortemente correlacionada com este processo infeccioso.
Segundo Lindquist, Emilson (1991), o S. mutans é a espécie mais freqüentemente
encontrada na cavidade bucal, seguida pelo S. sobrinus. Neste estudo, os autores chamam a
atenção para o grande número de sítios anatômicos da cavidade oral, onde ambas as espécies
foram detectadas juntas, indicando, dessa forma, uma provável associação entre esses
organismos.
A associação entre S. mutans e S. sobrinus e sua relação com a cárie dentária em
escolares foi verificada por Höfling et al., em 1999. Neste estudo, os autores verificaram que
a maioria das 200 crianças examinadas (51%) apresentou apenas S. mutans na saliva, 17%
tinham S. mutans e S. sobrinus associados e 32% apresentaram outras espécies do grupo
20
mutans individualmente ou em associação, comprovando a predominância de S. mutans na
população e sua associação positiva com o S. sobrinus. Daquelas crianças que apresentaram a
associação S. mutans/S. sobrinus, 76% tinham cárie, sugerindo um alto índice cariogênico
desta associação de microrganismos em relação aos indivíduos que possuíam apenas S.
mutans na saliva.
A associação entre a presença de cárie, contagem de S. mutans e pH salivar na
síndrome de Down apresenta trabalhos na literatura como o de Shapira et al., em 1991. Neste
estudo, os autores observaram que tanto o índice de cárie quanto os níveis de S. mutans foram
baixos no grupo da síndrome composto por 12 sujeitos com idade entre 20 e 48 anos, quando
comparados aos grupos de indivíduos normais e com retardo mental. Os níveis do pH
mensurados no grupo sindrômico (6,6) foram similares aos níveis encontrados nos outros dois
grupos (6,8 e 6,6); porém, o índice de necessidade periodontal teve valor mais elevado para
este grupo (2,1) em comparação aos demais (0,9 e 1,9). Stabholz et al. (1991), fizeram um
estudo semelhante com 32 crianças com síndrome de Down de oito a 13 anos e encontraram
resultados similares, ou seja, menor prevalência de cárie e mais baixa contagem de unidades
formadoras de colônias (UFC/mL), além de níveis de pH semelhantes no grupo da síndrome.
O índice de necessidade de tratamento periodontal foi mais alto na síndrome (0,7) do que nos
pacientes normais (0,5); mas, menor do que naqueles com retardo mental (1,5), sem diferença
estatisticamente significante.
Com relação à comparação entre os parâmetros salivares e a cárie dentária na
síndrome de Down, Yarat et al. (1999), encontrou fluxo salivar e capacidade-tampão baixos
(0,11 e 3,63; respectivamente) e altos níveis de proteínas (3,26) e ácido siálico (0,29) nestes
indivíduos, em comparação ao grupo controle. Essa diferença na concentração de ácido
siálico foi atribuída aos fatores sistêmicos relativos aos indivíduos sindrômicos. Além disso, o
pH observado também foi maior (7,4) do que o do grupo controle (7,3); mas, os índices de
cárie não tiveram diferença estatisticamente significante entre os grupos.
Nessa mesma linha de investigação, o pH e a composição protéica da saliva de 35
crianças, sendo 17 com síndrome de Down e, 18 sem a síndrome, com idade entre seis e dez
anos foram estudados por Siqueira Jr, Nicolau (2002). A concentração de proteínas foi
significantemente maior (36%) na saliva das crianças com síndrome de Down do que nas
amostras do grupo controle; porém, o fluxo salivar, o pH e a atividade da amilase e da
peroxidase foram mais baixas nas crianças com a síndrome, sem diferenças estatísticas.
O estudo da secreção salivar da glândula parótida foi realizado em 39 indivíduos com
síndrome de Down, com idade entre 11 e 69 anos. Tanto os indivíduos jovens quanto os
21
idosos apresentaram velocidade de fluxo menor (0,07 e 0,03; respectivamente) que o grupo
controle (0,28 e 0,07; respectivamente), sendo que, nos idosos, essa redução foi maior que
50% quando comparado aos jovens e de 90% quando comparado aos indivíduos da mesma
idade. Os achados indicaram hipofunção do fluxo salivar estimulado da glândula parótida em
comparação aos indivíduos sem a síndrome e a única variável significantemente relacionada
foi à presença da síndrome nos sujeitos, indicando que esta hipofunção estava associada
principalmente à desordem genética existente (CHAUSHU et al., 2002).
Siqueira et al. (2005), mensuraram o fluxo salivar, pH e capacidade tampão da saliva
de 25 crianças com síndrome de Down, com idade entre dois e cinco anos, e compararam os
resultados com 21 crianças sem a síndrome. Os resultados mostraram que o grupo com
síndrome de Down apresentou maior capacidade tampão nos intervalos de pH 6,9 - 6,0, pH
5,9 - 5,0 e pH 4,9 - 4,0 quando comparados ao grupo controle; porém, o grupo com a
síndrome tinha baixo fluxo salivar.
Com base nos dados da literatura apresentada e em virtude da carência de estudos que
correlacionam a relação cárie-saliva-microrganismo, verifica-se a necessidade de estudos que
melhor elucidem as características ecológicas da cavidade bucal em pacientes com
necessidades especiais, como os que possuem síndrome de Down, os quais naturalmente
podem ou não ter características fisiológicas e microbiológicas especiais.
A identificação e determinação da prevalência de patógenos associados à etiologia de
doenças como a cárie dentária e sua correlação aos parâmetros clínico-salivares desses
indivíduos, os quais apresentam particularidades fisiológicas inerentes à síndrome é de
fundamental importância para o conhecimento da iniciação e desenvolvimento da patologia e
determinação de melhores formas de tratamento e prevenção.
22
3
OBJETIVOS
A fim de verificar a relação entre os parâmetros clínicos, salivares e moleculares em
pacientes com Síndrome de Down, a presente pesquisa visou a:
1. Avaliar a ocorrência de cárie dentária por meio de uma análise clínica (CPOD, CPOS,
ceod e ceos);
2. Determinar o perfil salivar desses indivíduos por meio de análise do fluxo e sua
capacidade – tampão;
3. Determinar a contagem total de estreptococos do grupo mutans na saliva - UFC/mL;
4. Determinar, por meio da reação molecular da PCR (Polimerase Chain Reaction), a
prevalência de Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus.
23
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Grupo experimental
A amostragem envolveu 60 indivíduos com síndrome de Down, regularmente
matriculados no Programa de Atendimento Integral ao Paciente Especial da Universidade do
Sagrado Coração (PAIPE – USC) e APAE – Bauru, APAE – Pirajuí e APAE - Dois Córregos.
A coleta de dados foi feita sob permissão do Comitê de Ética e Pesquisa (anexo A), após
autorização dos respectivos diretores e, posteriormente, dos responsáveis pelos pacientes
(anexo B).
Para o presente estudo, participaram indivíduos de ambos os sexos com idade
variando entre 01 e 48 anos, de acordo com a idade em anos completos no último aniversário,
sem distinção de raça ou cor. Os participantes apresentavam retardo mental leve a moderado.
Os indivíduos foram convocados a participar deste estudo, independente dos hábitos
de higiene bucal ou alimentação. Os únicos critérios relevantes para excluir o participante da
amostra foi a presença de aparelho ortodôntico fixo ou móvel, tratamento com antibiótico
sistêmico e/ou outros medicamentos que pudessem alterar o fluxo salivar, interferindo,
portanto, na apuração dos dados. Em adição, indivíduos que apresentavam deficiência mental
severa também foram excluídos devido à ausência de colaboração no exame clínico e na
coleta salivar. Para detectar tais fatos, foi realizada uma entrevista com os responsáveis/
paciente, visando à obtenção desses dados.
Os participantes da pesquisa ingressaram no Programa de Atendimento Integral ao
Paciente Especial da Universidade do Sagrado Coração para realização de atendimento
odontológico gratuito pela cirurgiã-dentista responsável pela pesquisa, como benefício da sua
participação.
A pesquisa não acarretou riscos aos participantes uma vez que, somente a saliva foi
coletada.
24
4.2 Determinação dos índices de cárie
Exames clínicos foram realizados em 59 participantes antecedendo a coleta da saliva
para análise. Para tais procedimentos, foram utilizados sonda exploradora nº 5 com ponta
romba para remoção dos debris e espelho bucal plano, sob luz artificial, após secagem prévia
do elemento dentário com jato de ar (Figura 1). Nenhuma recomendação foi dada, quanto à
dieta e higienização, previamente ao exame.
Os exames clínicos foram executados exclusivamente por um único examinador
previamente calibrado (k=0,92), objetivando-se obter os índices de cárie CPOD, CPOS, ceod
e ceos segundo a OMS (1997), e as condições dentárias foram anotadas em fichas individuais
(anexo C).
Figura 1: Exame clínico para obtenção dos índices de cárie CPOD, CPOS, ceod, ceos.
O índice CPOD mede o ataque de cárie dental à dentição permanente. Suas iniciais
representam respectivamente: dentes cariados (C), perdidos (P), obturados (O) e a medida de
unidade que é o dente (D). O índice ceod é correspondente ao CPOD em relação à dentição
temporária e inclui somente os dentes cariados (c), com extração indicada (e) e obturados (o).
Exclui os extraídos, levando-se em conta as dificuldades de separar os dentes perdidos devido
à cárie ou pelo processo natural de esfoliação dentária.
25
O CPOD médio e ceod foram obtidos pela divisão de todos os dentes atacados pelo
número de indivíduos examinados (Tabela 1). Os índices de cárie CPOS e ceos são uma
alternativa mais refinada para a avaliação do acometimento de cárie, cuja unidade de medida é
a superfície dental (s), e os critérios de avaliação são similares aos do índice CPOD.
TABELA 1: Valores médios do índice CPOD de acordo com a OMS (1997).
CPOD aos 12 anos CPOD de 35 - 44 anos
<1,2 Muito baixo
1,2 – 2,6 Baixo
2,7 – 4,4 Moderado
> 4,4 Alto
< 5,0 Muito baixo
5,0 – 8,9 Baixo
9,0 – 13,9 Moderado
> 13,9 Alto
4.3 Coleta do material
A coleta da saliva total estimulada foi efetuada no período da manhã, entre 8:00 e 9:00
horas e, eventualmente, no período vespertino, entre 13:30 e 14:30 horas, de acordo com o
agendamento dos pacientes.
4.4 Determinação da velocidade de fluxo salivar (VFS)
Para determinação da velocidade de fluxo salivar (KLOCK, KRASSE, 1977) foi
entregue a cada participante um pedaço de goma-base de aproximadamente 1,5 gramas para
estimular a produção de saliva. Os pacientes foram orientados a mastigar a goma-base pelo
tempo de 30 segundos. A saliva estimulada inicial foi desprezada (deglutida) e, a partir deste
momento, foi marcado o tempo de 3 a 5 minutos e então foi coletada a saliva em tubos de
26
vidro estéril com rosca, até se obter uma quantidade suficiente, aproximadamente de 1,5 mL,
que permitiu as análises salivares e microbiológicas. As amostras coletadas foram
conservadas em gelo durante toda a coleta. O ar expelido foi introduzido nos tubos, sendo os
mesmos fechados e, posteriormente, levados para o Laboratório de Biologia Molecular da
Universidade do Sagrado Coração. O tempo decorrido desde a coleta das amostras até o
processamento não excedeu 2 horas (BENTLEY et al., 1988).
Naqueles indivíduos que não conseguiram cuspir a saliva estimulada ou não
conseguiram mastigar a goma, foi realizada a coleta de saliva não estimulada com Swab
estéril, pesado antes e após a coleta, sendo a diferença encontrada igual ao total de saliva
coletada de cada indivíduo, para a realização da contagem e identificação das espécies.
A Velocidade do Fluxo Salivar foi medida de acordo com Krasse (1988), calculando-
se a razão entre o volume total de saliva produzido e o intervalo de tempo de secreção em
minutos (mL/min.), conforme mostra a Tabela 2.
TABELA 2: Interpretação da Velocidade de Fluxo Salivar
Quantidade de Saliva (mL/min.) Interpretação
Abaixo de 0,1 mL/min. Xerostomia
0,1 ├ 0,7 Acentuadamente Diminuído
0,7 ├ 1,0 Baixo Fluxo Salivar
1,0 ├┤2,0 Fluxo Salivar Normal
Acima de 2,0 mL/min. Alto Fluxo Salivar
Fonte: Bo Krasse (1988)
27
4.5 Determinação do pH salivar e capacidade tampão (CTS)
Em adição aos parâmetros estudados, inicialmente, foi medido o pH salivar antes de se
determinar a capacidade tampão (ERICSSON, 1959). Para tal procedimento, o pH de 1,5 mL
da saliva estimulada foi medido, através de fitas indicadoras (pH-Fix 0-14, MN). A
capacidade tampão da saliva, foi determinada com 0,5 mL de saliva coletada em um tubo de
ensaio, contendo 1,5 mL de HCL 5 mM. O tubo foi agitado por um minuto, aberto para a
remoção de CO
2
e após 5 minutos, foi determinado, novamente, o pH através de fitas
indicadoras e classificados de acordo com a Tabela 3.
TABELA 3: Interpretação dos valores indicadores da capacidade-tampão da saliva.
pH Valores
pH 5 a 7 Capacidade Tampão Normal
pH 4 a 5 Valores Limites
pH < 4 Capacidade Tampão Baixa
Fonte: Bo Krasse (1988)
4.6 Processamento do material para análise microbiológica
4.6.1 Homogeneização e diluição
Os frascos contendo 1,0 mL de saliva foram submetidos a 30 segundos de vibração em
um agitador de tubos (Phoenix – AT 56), obtendo uma suspensão uniforme. Após este
processo, essa saliva foi diluída em séries decimais de 10
-1
a 10
-4
em Tampão Fosfato 0,05 M
pH 7,3. Daqueles pacientes onde a coleta de saliva foi realizada utilizando-se Swab, a saliva
28
foi dispersa em 1mL de água destilada estéril, para que houvesse 1 mL de saliva para a
realização das diluições descritas.
4.6.2 Semeadura do material e contagem de
S. mutans
e
S. sobrinus
Para o cultivo de S. mutans e S. sobrinus, alíquotas de 25 µL de cada diluição foram
inoculadas com pipetas automáticas, em duplicatas em placas de Petri, contendo ágar Mitis
Salivarius Bacitracina (MSB). As placas foram incubadas, em jarras, por 48 horas a 37°C sob
microaerofilia (10% de CO
2
) e submetidas à contagem total de colônias de S. mutans e S.
sobrinus para determinação do número de UFC/mL da saliva dos participantes da pesquisa. A
confirmação de que as colônias eram de S. mutans e S. sobrinus foi feita através de esfregaços
corados pelo método de Gram e da identificação de acordo com as características das colônias
(DAVEY, ROGERS, 1984).
4.7 Identificação das espécies
S. mutans
e
S. sobrinus
4.7.1 Morfologia Colonial
A observação e contagem das colônias com características pertencentes as espécies S.
mutans e S. sobrinus, foi realizada sob luz refletida com o auxílio de um microscópio
estereoscópico (Zeiss), seguindo os padrões descritos para o meio MSB, segundo Van
Palenstein Helderman et al. (1983), Davey, Rogers (1984), Azevedo (1988) e Torres (1991),
como a seguir:
- colônias cor branco-acinzentada ou creme-amarelada, superfície granular semelhante
a vidro moído, podendo apresentar ou não uma gotícula cintilante de polissacáride
extracelular no topo. Tais colônias, algumas vezes mucóides, são geralmente duras,
esmigalhando-se quando tocadas por agulha de platina. Parecem fragmentadas a partir do
29
centro, como se estivessem duas ou três juntas. Algumas vezes, são circundadas por um halo
incolor, visível a olho nu.
- colônias firmes, opacas, não se desintegrando quando tocadas com a agulha de
platina, deslocando-se facilmente, circundadas com um halo branco leitoso e apresentando,
com freqüência, uma gotícula cintilante de polissacáride no topo.
Pelo menos três colônias com tipos morfológicos característicos de S. mutans e S.
sobrinus, foram transferidas separadamente para tubos contendo 4,0 mL de meio BHI (Brain
Heart Infusion) previamente esterilizado a 120° C por 20 minutos. A incubação foi feita a
37°C por 24 horas e, a seguir, os tubos foram conservados em geladeira (0 – 4° C), por um
período máximo de 12 horas, para posterior identificação pela PCR.
4.7.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
As amostras foram inoculadas em frascos com 5mL de BHI e incubadas a 37
o
C, pCO
2
10%, por 24-48 horas. Para obtenção do DNA bacteriano, os meios de cultura foram
centrifugados, os sedimentos obtidos foram transferidos para tubos de microcentrifugação e
lavados com 1mL de solução salina 0,9%. Após a centrifugação, as células foram
ressuspensas em 100µL de tampão de lise (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1% de Triton X-
100, pH 8,0) e fervidas por 10 minutos (OHO et al., 2000). Após centrifugação, os
sobrenadantes tiveram suas concentrações de DNA determinadas por espectofotometria e
armazenadas a –20
o
C.
O DNA de cada bactéria foi amplificado para a confirmação molecular da identidade
do S. mutans e S. sobrinus na presença de um par de “primers” espécie-específicos. Esses
primers foram desenhados por Oho et al. (2000), baseados na seqüência do gene gtfB, (S.
mutans) e amplificam um fragmento de 517-pb. As seqüências são: 5’-
ACTACACTTTCGGGTGGCTTGG e 5’-CAGTATAAGCGCCAGTTTCATC. Já para o S.
30
sobrinus as seqüências foram baseadas no gene gtfF e amplificam um fragmento de 712-pb.
As seqüências são: 5’-GATAACTACCTGACAGCTGACT e 5’-
AAGCTGCCTTAAGGTAATCACT. A amplificação desses fragmentos foi conduzida em
termociclador (modelo: Gene Amp PCR System 2400 – Applied Biosystems), com mistura de
reação (50 µL) contendo 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2
, 200 µM de
cada dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 50 pmol dos “primers”, 2,5 U de Taq DNA polimerase, e 5
µL do DNA bacteriano.
A PCR ocorreu através da desnaturação inicial das fitas de DNA a 95
o
C por 3 minutos,
seguido de ciclos subseqüentes com desnaturação a 95
o
C por 30 segundos, anelamento a
61,5
o
C por 30 segundos para a espécie S. mutans e a 60
o
C para a espécie S. sobrinus e
extensão a 72
o
C por 1 minuto. Após 29 ciclos, um ciclo final de 95
o
C por 30 segundos, 59
o
C
por 30 segundos e 72
o
C por 5 minutos determinou o final da amplificação do DNA das
espécies.
Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1% em
tampão tris-borato-EDTA. Foi incluído em cada gel, um padrão de peso molecular de 250 pb.
Após o término de cada corrida, o gel foi corado com brometo de etídio 0,5µg/mL. Quando
ocorreu uma única banda de 517-pb ou 712-pb, foi confirmada a identidade molecular do S.
mutans e S. sobrinus respectivamente. Foram utilizados como controle positivo S. mutans
(ATCC 25175) e S. sobrinus (ATCC 27607).
4.7.3 Conservação das amostras
As amostras identificadas pela PCR como sendo de estreptococos das espécies S.
mutans e S. sobrinus foram mantidas em meio BHI e incubadas a 37°C por 24 horas. Em
seguida, após o crescimento bacteriano, as células foram centrifugadas e então, ressuspensas
31
em 10% de glicerol em BHI. Os tubos foram estocados em alíquotas de 5,0 mL de BHI e
glicerol 5% e congelados em freezer -20°C (TENOVUO et al., 1992).
4.7.4 Análise estatística
Os dados referentes à caracterização clínica (CPOD e CPOS), fisiológica (velocidade
do fluxo salivar e capacidade tampão) e microbiológica (contagem total de colônias de
estreptococos do grupo mutans e identificação das espécies) dos participantes da pesquisa
foram submetidos à análise estatística, utilizando-se o teste Qui-quadrado e a correlação de
Pearson para a determinação da correlação entre todos os parâmetros estudados (α= 0,05).
32
5 RESULTADOS
5.1 Grupo experimental
A distribuição da amostra de acordo com o sexo, de 60 indivíduos com síndrome de
Down, acha-se expressa na Tabela 4.
Tabela 4 - Distribuição da amostra de acordo com o sexo.
Sexo n %
Masculino
33 55,0
Feminino
27 45,0
Total
60 100,0
5.2 Determinação dos Índices de Cárie
De acordo com os resultados da determinação dos índices de cárie, o grupo
experimental apresentou valores médios de 4,53 e 6,85 para CPOD e CPOS, respectivamente.
Os índices de cárie para dentes temporários ceod e ceos foram iguais a 1,55 e 2,55. Vinte e
um (36,0%) indivíduos eram livres de cárie, sendo 17 (29,0%) crianças de até 12 anos e 04
(7,0%) adultos.
Os valores médios dos índices de cárie CPO-D, CPO-S, ceo-d e ceo-s, de acordo com
a idade dos indivíduos são indicados na Tabela 5.
33
Tabela 5 – Valores médios dos índices CPO-D, CPO-S, ceo-d e ceo-s de acordo
com a idade dos indivíduos.
Idade CPO-D CPO-S ceo-d ceo-s n
1 – 5
6- 10
11- 15
16- 20
21- 27
31- 48
- - 0,44 0,44 09
0,65 0,65 1,85 3,05 20
1,60 1,80 2,14 3,60 10
6,00 8,14 0,00 0,00 07
9,00 11,43 3,00 7,00 07
13,50 26,00 - - 06
5.3 Determinação da velocidade de fluxo salivar e capacidade tampão
A análise dos parâmetros salivares fisiológicos revelou um número de indivíduos
participantes – n= 18 (30,0%) – diferente da análise clínica para determinação dos índices de
cárie (CPOD, CPOS, ceod e ceos), em virtude da dificuldade de coleta salivar proporcionada
pela síndrome – ausência de reflexo mastigatório, de deglutição e não conseguir cuspir.
Entre os indivíduos que colaboraram, 94,0% (n= 17) demonstraram velocidade de
fluxo salivar acentuadamente diminuída e 6,0% (n= 1) apresentaram fluxo salivar normal.
Destes indivíduos, 44,0% (n= 8) tinham capacidade-tampão salivar baixa, 39,0% (n= 7)
capacidade-tampão nos valores limites e apenas 17,0% (n= 3), capacidade-tampão normal
(Tabela 6).
34
Tabela 6 – Análise dos parâmetros salivares da saliva estimulada coletada.
VFS CT
mL/min n %
pH n %
0,1 ├ 0,7
17 94,0
1,0 ├┤2,0 01 6,0
pH 5 a 7 03 17,0
pH 4 a 5 07 39,0
pH < 4 08 44,0
5.4 Contagem de
S. mutans
e
S. sobrinus
A determinação do número de colônias de S. mutans e S. sobrinus foi realizada em 58
(97,0%) participantes, sendo que, 18 (30,0%) são resultantes da saliva estimulada e 40
(70,0%) da saliva não estimulada coletada com Swab. Duas amostras foram excluídas do
estudo por contaminação após processamento laboratorial. Destes 58 indivíduos, 35 (60,0%)
demonstraram valores altos de UFC/mL (>10
6
); enquanto 23 (40,0%) apresentaram valores
baixos de microrganismos (<10
5
), como mostra a Tabela 7.
Tabela 7 – Contagem de S. mutans e S. sobrinus na saliva (UFC/mL).
UFC/mL Saliva estimulada
Saliva não estimulada
Total
n %
n % n %
> 10
6
17 94,0 18 45,0 35 60,0
<10
5
01 6,0 22 55,0 23 40,0
35
5.5 Reação em Cadeia da Polimerase
5.5.1 Identificação de
S. mutans
e
S. sobrinus
nas amostras isoladas
A reação de PCR foi realizada em 329 amostras; pois, 19 (5,8%) das 348 amostras
isoladas apresentaram indícios de contaminação após o congelamento e foram descartadas do
estudo (anexo D).
Do total de 329 amostras isoladas, 117 (35,6%) colônias foram identificadas como S.
mutans, 37 (11,2%) como a espécie S. sobrinus e 175 (53,2%) foram classificadas como
outras espécies do grupo mutans. A identificação das amostras está descrita na Tabela 8.
Tabela 8 - Prevalência de S. mutans, S. sobrinus e outras espécies do grupo
mutans nas amostras isoladas
.
Espécies n %
S. mutans
S. sobrinus
Outras espécies do grupo mutans
Total
117
37
175
329
35,6
11,2
53,2
100,0
5.5.2 Identificação de
S. mutans
e
S. sobrinus
nos indivíduos
Dos 58 indivíduos examinados, 40 (69,0%) apresentaram colônias de S. mutans e 24
(41,4%) de S. sobrinus isoladas ou em associação, respectivamente. A Tabela 9 demonstra
também que, 10 participantes da pesquisa não apresentaram nenhuma das suas colônias
isoladas como sendo dessas espécies, representando 17,3% dos indivíduos, indicando que
36
esses indivíduos foram colonizados por outras espécies do grupo mutans não identificadas
nesse estudo.
Tabela 9 – Prevalência de S. mutans e S. sobrinus nos indivíduos com síndrome de
Down.
Espécies n %
S. mutans 03 5,1
S. sobrinus 01 1,7
S. mutans + S. sobrinus 02 3,4
S. mutans + OEGM
*
21 36,3
S. sobrinus + OEGM
*
07 12,1
S. mutans + S. sobrinus + OEGM
*
14 24,1
OEGM
*
10 17,3
Total 58 100,0
* Outras espécies do grupo mutans
Dos 58 indivíduos, 03 (5,1%) possuíam colônias somente de S. mutans e 01 (1,7%)
indivíduo apenas colônias de S. sobrinus. Em complemento, 21 (36,3%) participantes
apresentaram S. mutans associados a outras espécies do grupo mutans – excetuando-se a
espécie S. sobrinus – e 07 (12,1%) S. sobrinus e outras espécies. Quatorze (24,1%) pacientes
apresentaram as espécies S. mutans e S. sobrinus associadas a outras espécies e 02 (3,4%)
indivíduos apresentaram apenas a associação S. mutans e S. sobrinus.
37
5.6 Análise estatística
Os dados da análise estatística estão descritos na Tabela 10. A correlação de Pearson
entre o índice CPOD e os demais fatores mostrou valores positivos significativos com p< 0,05
quando este índice foi comparado à idade (r= 0,80; p< 0,01). O CPOD não apresentou
correlação significativa à capacidade-tampão, à velocidade do fluxo salivar e ao número de
colônias de estreptococos do grupo mutans – UFC/mL (p>0,05).
Em relação à análise de correlação de Pearson entre o índice CPOS e os mesmos
parâmetros (idade, capacidade-tampão, velocidade de fluxo salivar e contagem de
estreptococos mutans), os resultados demonstraram a correlação positiva somente entre CPOS
x idade (r= 0,82; p< 0,01). Não houve correlação significativa entre CPOS e os demais
parâmetros (p>0,05).
Quando ambos os índices CPOD e CPOS foram associados à presença de S. mutans, S.
sobrinus e outros microrganismos pelo teste Qui-quadrado, não houve diferença
estatisticamente significante com p> 0,05, para ambos os índices.
Os índices ceod e ceos não foram correlacionados ou associados aos demais
parâmetros (p> 0,05).
O teste Qui-quadrado também não demonstrou associação entre os índices de cárie e o
sexo dos indivíduos (p>0,05).
38
Tabela 10: Análise dos parâmetros salivar e microbiológico e fatores idade e sexo em
relação aos índices de cárie.
Parâmetros salivar e microbiológico
Idade e sexo
CPOD CPOS ceod ceos
VFS*
CT*
UFC/mL*
Idade*
p>0,05
p>0,05
p>0,05
r= 0,80; p< 0,01
p>0,05
p>0,05
p>0,05
r= 0,82; p< 0,01
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
S. mutans**
S. sobrinus**
Outros estreptococos do grupo mutans**
Sexo**
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
* Correlação de Pearson (α= 0,05); ** Qui-quadrado (α= 0,05).
39
6 DISCUSSÃO
A literatura disponível relata a baixa prevalência de cárie e alta prevalência da doença
periodontal nos indivíduos com síndrome de Down (MUSTACCHI, ROZONE, 1990;
BUXTON, HUNTER, 1999; ACERBI et al., 2001; FISKE, SHAFIK, 2001; OLIVEIRA et
al., 2001). Essa baixa prevalência de cárie pode ser atribuída a diversos fatores como padrão
eruptivo, morfologia dentária (BROWN, CUNNINGHAM, 1961; CREIGHTON, WELLS,
1966; COHEN et al., 1970; McMILLAN, KASHGARIAN, 1961; MUSTACCHI, ROZONE,
1990) ou ainda devido à composição salivar ou à diferença da composição da microbiota
(BROWN, CUNNINGHAM, 1961; CREIGHTON, WELLS, 1966; COHEN et al., 1970;
BARNETT, 1986; COGULU et al., 2006), como já foi descrito.
Neste estudo, procuramos relacionar possíveis fatores causais da cárie dentária na
síndrome de Down por meio da identificação de parâmetros salivares e microbiológicos que
pudessem interferir na ocorrência desta patologia.
Os índices CPOD e CPOS dos pacientes com síndrome de Down, na presente
pesquisa, foram considerados altos (CPOD= 4,53; CPOS= 6,85) enquanto os índices ceod e
ceos foram baixos (ceod= 1,55; ceos= 2,55). Porém, quando os indivíduos foram separados
em grupos de acordo com as idades (Tabela 4), esses resultados mostram pequena variação
dos valores desses índices quando comparados à tabela da OMS (1997) e aos demonstrados
na literatura, como no estudo realizado por Bradley, McAlister (2004) onde crianças de cinco
anos de idade apresentaram ceod= 0,2; crianças de oito anos ceod= 1,93 e CPOD= 0,13; e aos
12 e 15 anos os valores médios do CPOD foram 0,83 e 0,71; respectivamente. Essa diferença
se deve, possivelmente, à amplitude da amostra, que analisou não somente crianças, mas
também adultos com até 48 anos de idade.
A idade dos participantes influenciou nos resultados, visto que os índices ceod/ceos
foram baixos e aumentaram com a idade em nosso estudo. Bradley, McAlister (2004)
observaram ainda que, os pacientes analisados possuíam mais dentes extraídos e menos dentes
restaurados aos cinco anos de idade enquanto que aos 15 anos, tinham menos extrações e mais
restaurações. Entretanto, não foi verificada a prevalência de cárie pelo índice CPOS, que é
uma alternativa mais refinada para a avaliação do acometimento de cárie e tem como unidade
a superfície do dente, como em nosso estudo, indicando assim, uma justificativa para esses
valores mais elevados indicados na Tabela 4.
Os estudos de Moraes et al. (2002), Vázquez et al. (2002) e Fung, Alllison (2005),
apresentaram valores médios de CPOD= 2,68; 3,96 e 0,10; respectivamente, para os
40
indivíduos com síndrome de Down. Os indivíduos do estudo de Moraes et al. (2002), com
idade entre três e 28 anos, não recebiam atendimento odontológico e isso talvez tenha
influenciado nos valores para dentes restaurados e perdidos. Na pesquisa de Vázquez et al.
(2002), os indivíduos com síndrome de Down pertencentes à faixa etária de 20 a 40 anos,
fizeram uso de benzodiazepínicos, o que pode ter interferido nos valores do índice de cárie
devido à sacarose presente nos medicamentos e a alteração no fluxo salivar provocada pela
medicação. No delineamento experimental apresentado na presente pesquisa, indivíduos que
fizeram uso de medicamentos previamente aos exames foram excluídos, evitando-se
resultados falso-negativos. No trabalho de Fung, Alllison (2005), os autores observaram
apenas dentes cariados e restaurados nos sujeitos com a síndrome, com idade entre quatro e
36 anos, diferentemente dos objetivos da presente pesquisa que incluiu os dentes extraídos.
Com essa análise mais detalhada e de maior número de parâmetros justifica-se a obtenção de
valores mais elevados para esses índices
Rodrigues et al. (1997), observaram em seu estudo que o tipo de dentição interferiu no
CPOD dos indivíduos avaliados; provavelmente, devido ao maior tempo de exposição dos
dentes na boca. Como descrito nos resultados, muitos indivíduos eram adultos e, talvez, os
índices de cárie tenham sido altos em função da idade e também do tempo de exposição aos
fatores locais predisponentes ao desenvolvimento da lesão cariosa na cavidade bucal. Em
complemento, a idade favorece a ocorrência de doença periodontal, que pode ter provocado
perdas dentárias nestes indivíduos, como mostrou o estudo de Ulseth et al. (1991), que
indicou a alta prevalência de periodontite na síndrome de Down em comparação ao grupo
controle. Shapira et al. (1991) e Stabholz et al. (1991), também verificaram a condição
periodontal de indivíduos com a síndrome e observaram maior necessidade de tratamento
periodontal do que naqueles sem a síndrome. Esta necessidade de tratamento foi associada à
higiene oral deficiente, condições ambientais e fatores relacionados à síndrome, como o nível
de retardo mental, que poderiam influenciar na severidade da doença. No entanto, a
ocorrência de doença periodontal não foi verificada neste estudo.
Os índices de cárie podem ainda estar relacionados à concentração de anticorpos
contra S. mutans presentes na saliva. Morinushi et al. (1995), verificaram a relação entre cárie
e anticorpos contra S. mutans na cavidade bucal de crianças de dois a 18 anos com síndrome
de Down e observaram CPOD de 15,9 para a síndrome de Down e 23,8 para o grupo de
crianças sem a síndrome. Houve correlação positiva entre a presença do anticorpo IgM, a
presença de S. mutans e a severidade das cáries mas não houve correlação entre a presença de
IgG, S. mutans e as lesões. Embora não esteja clara a forma como o anticorpo IgM protege
41
contra as cáries, os autores concluíram que ele está intimamente relacionado aos S. mutans e
aos índices de cárie. No estudo de Lee et al. (2004), os autores verificaram a relação entre os
índices de cárie e a concentração do anticorpo IgA na saliva de indivíduos com síndrome de
Down. Os índices CPOS (4,82) e ceos (6,84) na síndrome de Down, mesmo altos, foram
menores que os valores encontrados para o grupo controle (8,35). Em adição, o grupo da
síndrome apresentou maiores níveis de anticorpos contra S. mutans que o grupo controle.
Com isso, os autores concluíram que a baixa prevalência de cárie na síndrome de Down
estava associada às maiores quantidades de IgA na saliva.
Quando analisados os parâmetros salivares, verificamos que a maioria dos
participantes deste estudo apresentou velocidade de fluxo salivar acentuadamente diminuída
(94,0%), como demonstra a Tabela 5. Esses resultados coincidem com os achados de diversos
outros autores que também verificaram que a velocidade de fluxo salivar nestes indivíduos
estava diminuída (YARAT et al., 1999; CHAUSHU et al, 2002; SIQUEIRA JR, NICOLAU,
2002; SIQUEIRA et al., 2005). A diminuição do fluxo salivar sugere o aumento do risco de
cárie dentária, uma vez que a saliva tem papel fundamental na limpeza da cavidade bucal e
remoção de restos alimentares e bactérias (KRASSE, 1988); isto poderia influenciar nos altos
índices de cárie observados nos participantes deste estudo. Contudo, a análise estatística não
mostrou correlação entre fluxo salivar e cárie nesta população e, provavelmente, outros
fatores podem estar relacionados à alta prevalência de cárie observada. No estudo de Chaushu
et al. (2002), a única variável significantemente associada à redução do fluxo salivar foi a
própria síndrome de Down, o que indica que a hipofunção salivar pode estar relacionada a
fatores inerentes a esta desordem genética. Em contrapartida, Siqueira Jr, Nicolau (2002),
verificaram que não apenas a velocidade de fluxo salivar estava diminuída, como também a
atividade das enzimas amilase e peroxidase. A concentração de enzimas na saliva não foi
verificada em nosso estudo.
A maioria dos indivíduos com síndrome de Down avaliados (44,0%) apresentou
capacidade-tampão salivar baixa. Estes resultados contrariam os dados demonstrados nos
estudos de Yarat et al. (1999) e Siqueira et al. (2005), onde havia maior capacidade-tampão
salivar nas faixas etárias de sete e 22 anos e dois e 60 meses, respectivamente, quando
comparados ao grupo de indivíduos sem a síndrome. Entretanto, Yarat et al. (1999) não
encontraram diferença estatisticamente significante entre os grupos de estudo e controle e,
ainda, sugerem a relação entre a baixa prevalência de cárie e a alta concentração de
bicarbonato encontrada em indivíduos com a síndrome. A capacidade-tampão baixa poderia
ser uma das justificativas para a alta prevalência de cárie verificada no grupo experimental
42
deste estudo; entretanto, não houve correlação entre os índices CPOD/CPOS e ceod/ceos e
capacidade-tampão, embora a deficiência no tamponamento salivar estivesse presente. Assim,
sugere-se que a presença ou deficiência de componentes salivares na síndrome de Down não
verificados neste estudo, pode ter influenciado o desenvolvimento ou não das lesões cariosas.
A cárie dentária apresenta íntima associação com estreptococos do grupo mutans;
sendo que Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus são encontrados freqüentemente na
cavidade bucal de indivíduos com alta atividade de cárie (THYSTRUP, FERJERSKOV,
1995). Diversos estudos evidenciaram a correlação entre a alta prevalência de cárie e a
presença de S. mutans na cavidade bucal de indivíduos com a síndrome (SHAPIRA et al.,
1991; STABHOLZ et al., 1991; CORNEJO et al., 1996). No estudo de Shapira et al. (1991),
o índice de cárie CPOS dos indivíduos com síndrome de Down com idade entre 20 e 48 anos
foi menor (15,9) que naqueles sem a síndrome (33,7) ou com retardo mental (29,7); além
disso, o pH foi similar para os grupos e o grupo da síndrome teve o menor número de
UFC/mL. Não houve correlação entre o pH e as cáries, mas o número de UFC/mL foi
correlacionado à atividade da doença.
Stabholz et al. (1991), verificaram menor experiência de cárie (1,2) em crianças com
síndrome de Down de oito a treze anos, que nos grupos controle (14,5 e 15,6), assim como
também foi menor o número de UFC/mL na síndrome de Down (37,2%), enquanto que os
outros grupos apresentaram valores mais elevados de microrganismos na saliva (48,2% e
93,9%). Os autores atribuíram a baixa prevalência de cárie aos níveis salivares de S. mutans.
Cornejo et al. (1996), por sua vez, analisaram a condição de saúde bucal de sujeitos com
síndrome de Down de três a 19 anos e, encontraram valores maiores dos índices CPOS (3,4),
nos indivíduos do grupo etário de 3-6 anos, e ceos (2,4), para o grupo de 7-9 anos, do que o
grupo controle (0,1 e 0,9; respectivamente). Em adição, os autores observaram que as
concentrações de IgA e cálcio eram significantemente maiores no grupo da síndrome e havia
uma grande atividade de S. mutans e Lactobacillus (>10
5
UFC/mL) neste grupo. A
concentração de imunoglobulina e cálcio foi alta na população com síndrome de Down;
contudo, os autores demonstraram a associação apenas entre os valores elevados de
microrganismos na saliva e os altos índices de cárie encontrados.
Embora mais da metade (60,0%) dos participantes deste estudo tenha apresentado
elevado número de UFC/mL de S. mutans e S. sobrinus, este fator pareceu não influenciar nos
índices de cárie dos indivíduos em questão, uma vez que, não houve correlação entre a
contagem de colônias e os índices de cárie observados. Essa ausência de correlação
encontrada entre os índices de cárie e a contagem de colônias de S. mutans e S. sobrinus pode
43
confirmar a multifatoriedade da etiologia da doença cárie como proposto por Jordan e Keyes
(1966), onde os açúcares presentes na dieta do hospedeiro associados às altas contagens
desses microrganismos são fundamentais para o desenvolvimento da patologia.
Höfling et al. (1999), verificaram que 51,0% das crianças analisadas apresentaram
apenas S. mutans na saliva, 17,0% apresentaram a associação S. mutans/S. sobrinus e 32,0%
apresentaram outras espécies do grupo mutans. Segundo os autores, a probabilidade de se
detectar o S. sobrinus associado ao S. mutans é três vezes maior que a de encontrá-lo
isoladamente. Wu et al., (2003), estudou a prevalência de S. mutans e S. sobrinus em crianças
e verificou que 75,4% delas eram colonizadas por S. mutans e 57,1% por S. sobrinus. Tanto
Höfling et al., em 1999, quanto Wu et al., em 2003, observaram em seus estudos a associação
S. mutans/ S. sobrinus e um aumento nos índices de cárie dos indivíduos devido à associação
dessas espécies. No estudo de Spolidório et al. (2004), que teve como finalidade identificar os
biótipos salivares de estreptococos do grupo mutans de escolares de seis a oito anos de idade,
a espécie mais prevalente foi S. mutans (78,0%) seguida de S. sobrinus (11,61%) e S. rattus
(4,69%). Em adição, os autores observaram que a maioria dos indivíduos (59,0%) era
colonizada por S. mutans, seguida de colonização pela associação S. mutans + S. sobrinus
(17,0%) e associação S. mutans + S. rattus (7,5%). A ocorrência da espécie S. mutans em
69.0% dos indivíduos deste estudo pode estar relacionada à sua capacidade em inibir a
formação de biofilme bacteriano por outras espécies e recolonizar a superfície dentária como
mostrou o estudo de Pereira et al., em 2006, o qual comprovou estas atividades. Os resultados
encontrados para a identificação de S. mutans e S. sobrinus coincidem com os estudos citados
e mostraram que estas espécies tiveram alta prevalência tanto nas amostras isoladas quanto
nos indivíduos estudados, como mostraram as Tabelas 7 e 8.
Barone et al. (2005), em estudo para verificar a transmissão e aquisição de S. mutans
entre pares de mães e filhos com síndrome de Down, confirmaram a presença de S. mutans,
por meio da técnica genotípica de AP-PCR, em todas as amostras de saliva, enquanto que S.
sobrinus não foram detectados em nenhuma destas amostras. Após seis meses da coleta
salivar inicial, a saliva foi novamente coletada para confirmação dos resultados e apenas S.
mutans foram identificados nas amostras; porém, as espécies identificadas no segundo exame
tinham genótipos diferentes daquelas anteriormente amplificadas. Os autores concluíram que
a colonização e a linhagem de S. mutans na cavidade bucal das crianças com a síndrome
estava relacionada aos fatores genéticos da própria síndrome ou a alguns fatores ambientais
desconhecidos por eles. O trabalho de Cogulu et al. (2006), também utilizou a técnica AP-
PCR em amostras salivares de crianças com síndrome de Down para identificar o genótipo de
44
S. mutans desta população. Seus resultados demonstraram a presença de três diferentes tipos
de linhagem de S. mutans em crianças com síndrome de Down, em comparação aos oito tipos
encontrados nos indivíduos do grupo controle. O genótipo das colônias foi estatisticamente
significante a ocorrência de cárie e os autores atribuíram os perfis dos microrganismos
identificados à prevalência de lesões cariosas. Embora o estudo da linhagem de S. mutans e S.
sobrinus não tenha sido realizado na presente pesquisa, este pode ser um dos fatores causais
da prevalência de cárie verificada na análise clínica.
Assim, uma vez que o fluxo e a capacidade-tampão salivar e a contagem e a presença
de S. mutans e S. sobrinus não apresentaram relação com a ocorrência de cárie nos indivíduos
com síndrome de Down, outros estudos que investiguem os componentes salivares, como as
imunoglobulinas, e demais fatores relativos à microbiota bucal existente como o estudo da
diversidade clonal de cepas de S. mutans e S. sobrinus, seus mecanismos de virulência e suas
particularidades metabólicas, talvez possam elucidar melhor os mecanismos de etiologia e
desenvolvimento desta patologia nestes indivíduos.
45
7 CONCLUSÃO
Com base nos dados obtidos na presente pesquisa, podemos concluir que os não há
associação entre os parâmetros clínicos, salivares e moleculares em indivíduos com
síndrome de Down, o que induz à necessidade de estudos futuros a fim de identificar os
fatores relacionados à ocorrência de cárie dentária nestes indivíduos.
46
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61, 2000.
51
ANEXOS
52
ANEXO A: PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA (0091/2004)
53
ANEXO B: TERMO DE CONSENTIMENTO ESCLARECIDO
TERMO DE CONSENTIMENTO
• Título do projeto
“Determinação Molecular da Prevalência de Espécies de Estreptococos do Grupo Mutans, Fluxo
Salivar, Capacidade Tampão e Índice de Cárie em Pacientes com Síndrome de Down.”
Pesquisador responsável: Aline Rogéria Freire de Castilho
Local de desenvolvimento da pesquisa: Universidade do Sagrado Coração
• Resumo
Muitos fatores podem influenciar potencializando ou amenizando a ocorrência da cárie; porém, o
biofilme bacteriano é imprescindível para a ocorrência da doença. O trabalho consiste na
realização de índice de cárie, detecção molecular de espécies de Estreptococos do grupo mutans
pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e determinação da velocidade de fluxo salivar e
capacidade tampão em pacientes com síndrome de Down a fim de verificar o risco de
desenvolvimento da doença cárie nestes indivíduos.
• Riscos e benefício
Os participantes da pesquisa ingressarão no Programa de Atendimento Integral ao Paciente
Especial da Universidade do Sagrado Coração e receberão atendimento odontológico gratuito
como benefício da sua participação. A pesquisa não acarretará riscos aos participantes uma vez
que, somente a saliva será coleta.
• Custos e pagamentos
Não existirão encargos adicionais associados à participação do sujeito de pesquisa neste estudo.
• Confidencialidade
Eu, ................................................................. entendo que qualquer informação obtida sobre mim
será confidencial. Eu também entendo que meus registros de pesquisa estão disponíveis para
revisão dos pesquisadores. Esclareceram-me que minha identidade não será revelada em nenhuma
publicação desta pesquisa; por conseguinte, consinto na publicação para propósitos científicos.
• Direito de desistência
Eu entendo que estou livre para recusar minha participação neste estudo ou para desistir a
qualquer momento e que a minha decisão não afetará adversamente meu tratamento na clínica ou
causar perda de benefícios para os quais eu poderei ser indicado.
• Consentimento voluntário
Eu certifico que li ou foi-me lido o texto de consentimento e entendi seu conteúdo. Uma cópia
deste formulário ser-me-á fornecida. Minha assinatura demonstra que concordei livremente em
participar deste estudo.
Assinatura do responsável pelo participante da pesquisa:..............................................
Data:
Eu certifico que expliquei a(o) Sr.(a) ..........................................................................
Acima, a natureza, propósito, benefícios e possíveis riscos associados à sua participação nesta
pesquisa, que respondi todas as questões que me foram feitas e testemunhei assinatura acima.
Assinatura do Pesquisador Responsável:..................................................................
Data:
54
ANEXO C: FICHA CLÍNICA
UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO
Identificação do paciente
Nome: ________________________________________________ Gênero: F M
RG do prontuário: __________ Idade: __anos e ___meses Data do exame:___/___/___
Índice CPOD/ceo-d e CPOS/ceo-s
Codificação Condição/estado
Dentes Dentes
decíduos permanentes
Coroa Coroa
A 0 Hígido
B 1 Cariado
C 2 Restaurado, com cárie
D 3 Restaurado, sem cárie
E 4 Ausente, por motivo de cárie
- 5 Ausente, por outros motivos
F 6 Selante de fissura
G 7 Suporte de prótese, faceta/implante
- 8 Dente não erupcionado
T T Traumatismo (fratura)
- 9 Não registrado
_________________________________________________________________________________________________________________
Tempo: Volume: Velocidade de Fluxo:
pH inicial: pH final: Capacidade Tampão:
55
ANEXO D: FIGURAS
Figura 2 - Identificação de S. mutans nas amostras em gel de agarose 1%: 1- DNA ladder;
2- controle positivo (S. mutans); 3- S. mutans; 4- controle negativo (sem DNA).
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Figura 3 - Identificação de S. mutans nas amostras em gel de agarose 1%: 1- DNA ladder;
2- controle positivo (S. mutans); 3- S. mutans; 4- controle negativo (sem DNA).
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Figura 4 - Identificação de S. mutans nas amostras em gel de agarose 1%: 1- DNA ladder;
2- controle positivo (S. mutans); 3- S. mutans; 4- controle negativo (sem DNA).
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Figura 5 - Identificação de S. mutans nas amostras em gel de agarose 1%: 1- DNA ladder;
2- Controle positivo (S. mutans); 3- S. mutans; 4- controle negativo (sem DNA).
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Figura 6- Identificação de S. sobrinus nas amostras em gel de agarose 1%: 1- DNA ladder;
2- Controle positivo (S. sobrinus); 3- S. sobrinus; 4- controle negativo (sem DNA).
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Figura 7- Identificação de S. sobrinus nas amostras em gel de agarose 1%: 1- DNA ladder;
2- Controle positivo (S. sobrinus); 3- S. sobrinus; 4- controle negativo (sem DNA).
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Figura 8- Identificação de S. sobrinus nas amostras em gel de agarose 1%: 1- DNA ladder;
2-Controle positivo (S. sobrinus); 3- S. sobrinus; 4- controle negativo (sem DNA).
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