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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CAMPUS DE MARECHAL CÂNDIDO RONDON
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
NÍVEL MESTRADO
JUCELAINE HAAS BARTH DA COSTA
AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DO FUNGO Beauveria bassiana
(Bals.) Vuill. PARA Gallus domesticus L.
MARECHAL CÂNDIDO RONDON
MARÇO/2007
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JUCELAINE HAAS BARTH DA COSTA
AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DO FUNGO Beauveria bassiana
(Bals.) Vuill. (1912) PARA Gallus domesticus L.
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual do Oeste do Paraná, como parte
das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia - Nível
Mestrado, para obtenção do título de
Mestre.
Orientador: Prof. Doutor Luis Francisco
Angeli Alves
MARECHAL CÂNDIDO RONDON
MARÇO/2007
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AGRADECIMENTOS
À UNIOESTE, por ter cedido espaço físico e material para que esta pesquisa fosse
realizada.
Ao meu orientador, Dr. Luis Francisco Angeli Alves, que me aceitou em seu
laboratório. Orientou-me com muita paciência e amizade, respeitando minha
inexperiência na área e ajudou-me muito neste período. Foi um orientador e um
amigo 100% presente – muito obrigada.
Aos colegas de mestrado Hamilton, Ely e Viviane, pela agradabilíssima
companhia nas viagens (e caronas) para Marechal.
A meus pais, Lenir e Arnildo, por sempre estarem do meu lado, me apoiando em
qualquer decisão que tomei, por terem me dado tanto amor e serem meu exemplo
de como ser em minha vida. Também agradeço pela ajuda durante o experimento
(que foi muita).
Ao amigo mais chato que já tive, Alexandro Oliani, por me emprestar a balança
para pesar meus pintos por um curto período de 6 meses – sem reclamar.
À bióloga Alaxsandra Daros, pela amizade e força durante o experimento, me
ajudando a pesar os frangos e a matá-los.
Aos Mestres Everton e Micheli, que me ajudaram muito durante o mestrado, seja
com dicas, artigos, ajuda no laboratório, com gargalhadas ou madrugadas
estudando juntos para a prova de 8 horas de duração do Luis, sempre no maior
bom humor. Mas principalmente pela confiança e amizade – gosto muito de vocês,
são pessoas as quais eu me orgulho de dizer que são meus amigos.
À bióloga Juliana, que me ensinou a produzir fungo no laboratório, sempre na
maior boa vontade.
Ao pessoal do laboratório: Lupa, Dhiego, Nati, Nina e Jean pela companhia e por
me agüentarem neste período de dois anos. E por ajudar nos experimentos, é
claro.
À Msc. Andréia Bonini, por ter me ajudado no delineamento estatístico do
experimento, além da amizade, e vários quebra-galhos.
Ao meu marido e grande amigo Miro Barth, que além de ter me dado muita força
nesse período, também me ajudou muito durante o experimento. Mesmo odiando
os pintos, sempre cuidava deles quando eu não estava.
À Diplomata, por ceder os frangos para o meu experimento.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 10
2 REVISÃO DE LITERATURA 13
2.1 Insetos-praga: danos e controle 13
2.2 Controle microbiano 14
2.2.1 Fungos entomopatogênicos 16
2.3 Segurança dos agentes de controle microbiano (ACM) 20
3 OBJETIVO 27
4 MATERIAL E MÉTODOS 28
4.1 Organismos utilizados 28
4.1.1 Obtenção do fungo 28
4.1.2 Obtenção das aves 29
4.2 Viabilidade do fungo em ração comercial 30
4.3 Administração do fungo para as aves 31
4.4 Avaliação das fezes 32
4.5 Avaliação nas aves 33
4.5.1 Comportamento, peso e consumo de ração 33
4.5.2 Análise histopatológica 34
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 35
5.1
Viabilidade de B. bassiana em ração comercial
35
5.2
Presença de B. bassiana nas fezes das aves
36
5.3 Avaliação diária das aves 38
5.3.1 Comportamento 38
5.3.2 Avaliação do consumo de ração 40
5.3.3 Avaliação do peso das aves 42
5.4 Análise histopatológica 47
5.6.1 Coração 48
5.6.2 Fígado 50
5.6.3 Pulmão 52
5.6.4 Intestino delgado 54
5.6.5 Rim 56
6 CONCLUSÕES 58
7 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 50
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Área de confinamento das aves utilizadas no experimento
0,80m
2
(1,0×0,8m) e 1,0 de altura 21
FIGURA 2
Consumo de ração por Gallus domesticus em 3
tratamentos, sendo eles: ração + fungo ativo, ração -+ fungo
inativo e tratamento controle (sem adição de conídios à
ração) em 4 semanas de avaliação (temperatura: 25±5ºC;
fotofase: 14 horas) 30
FIGURA 3
Ganho de peso em Gallus domesticus em três tratamentos:
fungo ativo, fungo inativo e controle, ao longo de 4 semanas
de avaliação (temperatura: 25±5ºC; fotofase: 14 horas) 33
FIGURA 4
Fotomicrografias de tecido cardíaco de Gallus domesticus
(A- controle 400X; B- 1000X; C- fungo inativo, 400X; D-
1000X; E- fungo ativo, 400X; F- 1000X 38
FIGURA 5
Fotomicrografias de fígado de Gallus domesticus (A-
controle 400X; B- 1000X; C- fungo inativo, 400X; D- 1000X;
E- fungo ativo, 400X; F- 1000X
41
FIGURA 6
Fotomicrografias de pulmão de Gallus domesticus (A-
controle 200X; B- 400X; C- fungo inativo, 200X; D- 400X; E-
fungo ativo, 200X; F- 400X 43
FIGURA 7
Fotomicrografias de intestino delgado de Gallus domesticus
(A- controle 400X; B- 1000X; C- fungo inativo, 400X; D-
1000X; E- fungo ativo, 400X; F- 1000X 46
FIGURA 8
Fotomicrografias de córtex renal de Gallus domesticus (A-
controle 200X; B- 400X; C- fungo inativo, 200X; D- 400X; E-
fungo ativo, 200X; F- 400X 48
LISTA DE TABELAS
TABELA 1
Germinação de conídios de B. bassiana em ração
comercial para Gallus domesticus ao longo do tempo
em 3 tratamentos. Temperatura: 26ºC, Fotofase: 14
horas 25
TABELA 2
Presença de conídios viáveis nas fezes de G.
domesticus tratados com ACM ativo durante 9 dias de
avaliação (25±5ºC; Fotofase: 14 horas) 27
TABELA 3
Sobrevivência e alterações comportamentais de Gallus
domesticus submetidos à ingesta de B. bassiana em 3
tratamentos : fungo ativo, fungo inativo e controle, ao
longo de 4 semanas (temperatura: 25±5ºC; fotofase:
14 horas) 28
TABELA 4
Média do peso total (g) de Gallus domesticus em 3
tratamentos : fungo ativo, fungo inativo e controle, ao
longo de 4 semanas (temperatura: 25±5ºC; fotofase:
14 horas)
32
TABELA 5
Ganho de peso (g) de Gallus domesticus em três
tratamentos: fungo ativo, fungo inativo e controle, ao
longo de 4 semanas (temperatura: 25±5ºC; fotofase:
14 horas) 35
RESUMO
O fungo Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin (1912) é um agente de controle
microbiano muito utilizado para o controle de pragas agrícolas. Entretanto,
informações sobre sua segurança para vertebrados são escassas e conflitantes.
Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar a segurança de B. bassiana para a
ave Gallus domesticus (L), organismo não alvo das aplicações deste fungo em
campo. Foi utilizado o fungo B. bassiana (isolado Unioeste 4), na concentração de
10
9
conídios/mL e espécimes jovens de G. domesticus, separados em 3 grupos de
tratamentos: (1) grupo teste (fungo viável), (2) grupo controle tratados com fungo
inativado e (3) grupo controle negativo. O fungo foi administrado oralmente por 5
dias consecutivos, as fezes coletadas do 1
º
ao 9
º
dia, e as aves observadas por 28
dias. Semanalmente, foi avaliado o peso médio das aves, assim como qualquer
sinal de intoxicação ou modificação patológica. Ao final do experimento foi
verificado o ganho médio de peso destes indivíduos. Amostras teciduais do
pulmão, fígado, rim, coração e intestino delgado foram retiradas e seguiram rotina
histológica, para verificação de lesões. Houve sobrevivência de 100% das aves
avaliadas, e não houve qualquer alteração comportamental ou lesão externa
durante o experimento. O grupo teste apresentou o maior ganho de peso
(1383,9±54,4g), sendo mais acentuado a partir da segunda semana. Observou-se
a presença de conídios viáveis nas fezes até 24 horas após a ingesta do fungo,
indicando que não houve germinação nas aves. Nenhuma lesão no coração, rim,
fígado, intestino delgado ou pulmão foi verificada, de forma que B. bassiana
mostrou-se seguro para o organismo não-alvo G. domesticus.
Palavras chave: controle biológico, segurança, organismos não-alvo, aves
ABSTRACT
Beauveria bassiana (balsamo) Vuillemin (1912) is a very useful biocontrol agent to
control agricultural pests. Nevertheless, information about its safety to vertebrates is
scarce and conflictive. Thus, this work aimed to evaluate the safety of B. bassiana
to Gallus domesticus (L), non-target organism of this fungus in the field. B. bassiana
(isolate Unioeste 4) was used, in the concentration of 10
9
conidia/mL and young
specimens of G. domesticus, in three groups: (1) test (viable fungus), (2) control
group treated with inactive fungus and (3) negative control group. The fungus was
administrated orally for 5 consecutive days, the feces were collected from the 1
st
to
the 9
th
day, and the birds observed for 28 days. Weekly, it was evaluated the
medium weight of the birds, as well as any sign of intoxication or pathological
modification. At the end of the experiment, the medium gain of weight of these
individuals was assessed. Tissue samples of the lung, liver, kidney, heart and small
intestine were withdrawn to verify lesions with the optic microscope. There was
100% of survival of the birds, and there was no behavior alteration or external
lesion of any kind during the experiment. The test group presented the higher
weight gain (1383,9±54,4g), being more acute after the second week. Viable
conidia were observed in the feces until 24 hours after feeding the fungus,
indicating that there was no multiplication inside the birds. No heart, kidney, liver,
small intestine or lung lesion was verified, in a way that B. bassiana can be
considered safe to the non-target organism G. domesticus.
Key words: biological control, safety, non-target organisms, birds
1. INTRODUÇÃO
O Controle Biológico como estratégia para o controle populacional de
insetos-praga tem sido muito difundido nos últimos anos. Acredita-se que aumente
ainda mais a área tratada com inimigos naturais nos próximos anos, devido à
redução de agroquímicos e aumento da área de plantio de culturas que utilizam
fungos, bactérias, nematóides e vírus para controlar suas pragas.
Jonsson & Maia (1999) relatam que, a exemplo dos produtos químicos,
organismos entomopatogênicos também não devem ser utilizados
indiscriminadamente, mas seguindo princípios ecológicos. Os autores constatam
ainda, que praticamente não existem informações de estudos realizados no que
compete à análise de risco dos entomopatógenos com espécies não-alvo, tanto no
Brasil quanto em outros países. Especificamente em se tratando de estudos
utilizando aves, não há nenhum modelo na literatura nacional.
11
A galinha (Gallus domesticus), recomendada pelo Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (2006), como organismo teste para experimentos de
segurança de biopesticidas, pode entrar em contato com estes microrganismos de
diversas maneiras. Uma delas é ao se alimentar de insetos e grãos contaminados
com fungos entomopatogênicos, ou ainda por contaminação direta quando da
aplicação destes no campo ou pelo contato com o fungo presente em aviários,
sendo que há estudos visando sua utilização no controle do cascudinho-dos-
aviários (Alphitobius diaperinus Panzer, 1979) (GEDEN & STEINKRAUS, 2003;
ALVES et al., 2005).
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Insetos-Praga: danos e controle
Os insetos têm sido uma das maiores causas de danos na produção
mundial de alimentos. Estima-se que cerca de 67.000 espécies de insetos causem
danos a plantações, sendo as regiões tropicais, normalmente as mais pobres do
mundo, as que mais sofrem com a alta incidência de insetos-praga (BOBROWSKI
et al., 2003).
A nível mundial, os produtores perdem bilhões de dólares ao ano devido ao
ataque de insetos e gasta-se muito com defensivos agrícolas necessários para
minimizar os danos. O uso crescente destes produtos, para garantir produção
elevada e de boa qualidade tem gerado danos para a natureza, afetando plantas,
animais e humanos (MOCHI et al., 2005). Este método leva à poluição do solo e de
mananciais de água doce, além de alguns produtos químicos acumularem-se ao
longo da cadeia alimentar (BOBROWSKI et al., 2003).
Além disso, o uso inadequado dos inseticidas fez com que surgissem
populações de insetos resistentes. Desta forma, o uso torna-se cada vez maior e
necessário. Outras desvantagens incluem ressurgência de pragas secundárias e
eliminação de muitos organismos não-alvo (VINCENT et al., 2003; MOCHI et al.,
2005).
13
A busca por métodos alternativos de controle de insetos-praga tem sido
realizada com afinco em todo o mundo, devido à necessidade de uma agricultura
mais sustentável e desenvolvida, preocupada com a preservação do meio
ambiente (BOBROWSKI et al., 2003; PRAÇA et al., 2004).
De acordo com Driesche & Bellows (1996), considerações sobre a origem
das pragas sugerem que a solução está na modificação do sistema agrícola para
conservar os inimigos naturais e na sua reconecção com os herbívoros. Um
método de controle que se encaixa neste perfil é o Controle Biológico, que é um
processo de controle populacional no qual a população de uma espécie controla o
tamanho de outra por meio de mecanismos como predação, parasitismo,
patogenicidade ou competição, levando-a a um nível no qual não haja dano
econômico (DRIESCHE & BELLOWS, 1996; BELLOWS, 2001; DEPIERI et al.,
2005; HUI & ZHU, 2006). Segundo van den Bosch et al. (1982), é um fenômeno
natural, que regula o número de animais e plantas por inimigos naturais e sofre
influência de fatores climáticos, da disponibilidade de alimentos e da competição.
Insetos, ervas daninhas, doenças e vertebrados podem ser o alvo deste método de
controle (DRIESCHE & BELLOWS, 1996; PARRA et al., 2002), que pode ser
natural ou aplicado (DRIESCHE & BELLOWS, 1996; HUI & ZHU, 2006).
2.2 Controle microbiano
Microrganismos entomopatogênicos utilizados no controle biológico
incluem bactérias, vírus, fungos, protozoários e nematóides.
A sua utilização propicia benefícios ambientais, dentre os quais destacam-
se a redução do uso de pesticidas químicos, e conseqüente redução de resíduos
14
dos mesmos nos alimentos, além da manutenção da biodiversidade no ambiente, o
que, por sua vez, permite aumento na atividade dos inimigos naturais. A maioria
destes agentes podem ser, ainda, aplicados com equipamento convencional,
podem ser produzidos com meios artificiais e serem armazenados por longos
períodos de tempo (ALVES, 1998; LACEY et al., 2001).
Como forma de exemplificar a amplitude e o potencial dos microrganismos
entomopatogênicos, podem ser citados alguns programas de controle de pragas já
implantados no Brasil utilizando tais organismos, como o uso de fungos para o
controle da cigarrinha da cana-de-açúcar e das pastagens (ALVES, 1998), da
broca da bananeira, broca-do-café, percevejo-da-renda da seringueira (FARIA &
MAGALHÃES, 2001) e do gorgulho da cana (BACILIERI et al., 2006). Além disso,
Faria et al. (2002) também recomendam o uso de fungos entomopatogênicos para
o controle de gafanhotos. Também é conhecida a utilização de vírus e bactérias no
controle da lagarta-da-soja e da mandioca (ALVES, 1998), e nematóides no
controle da vespa-da-madeira em Pinus (MENDES, 1992, citados por ALVES,
1998; FENILI et al., 2000; IEDE et al., 2000), entre outros. Além disso, o controle
microbiano vem sendo utilizado com sucesso onde inseticidas químicos não são
práticos ou aceitáveis, como em silvicultura (LORD, 2005) e principalmente na
agricultura orgânica.
15
2.2.1 Fungos entomopatogênicos
De acordo com Moino Jr. & Alves (1997) e Feng et al. (2001), a utilização
destes organismos assemelha-se muito ao controle químico quanto à facilidade de
produção, aplicação e eficácia.
As pesquisas no campo do controle microbiano são realizadas com dois
grandes grupos de fungos: os pertencentes à Ordem Entomophthorales, cujo
potencial como agente de controle tem sido pouco explorado em razão da
dificuldade de sua produção e os chamados fungos imperfeitos (Deuteromycota:
Hyphomycetes). Este segundo grupo tem um espectro um pouco mais amplo de
hospedeiros e é de fácil produção em meios artificiais (TAMAI et al., 2002).
Fungos entomopatogênicos são capazes de causar altos níveis de
mortalidade em populações de insetos, destacando-se Beauveria bassiana
(FURLONG & PELL, 2001; SHI & FENG, 2004). Este fungo é de ocorrência
generalizada em todas as regiões, sendo a mais freqüente sobre os insetos e no
solo, onde pode subsistir por longos períodos de tempo em saprogênese. Em
campo ocorre em coleópteros, lepidópteros, hemípteros, dípteros, himenópteros e
ortópteros (ALVES, 1998).
Muitos isolados têm sido estudados em função de seu potencial uso como
biopesticida e B. bassiana tem sido adotado com sucesso para controlar um
grande número de insetos de importância agrícola, tanto no Brasil como no mundo
(LAIRD et al., 1990; ALVES, 1998; MURO et al., 2003). Como exemplos, citam-se
16
algumas pragas das culturas de café, arroz, cana-de-açúcar e banana em áreas de
até milhares de hectares (ALVES, 1998).
Os fungos diferem de outros grupos de patógenos de insetos pela sua
habilidade de invadir um hospedeiro penetrando em sua cutícula (ALVES, 1998;
LACEY et al., 1996, citados por LACEY et al., 2001).
O ciclo de infecção inicia-se a partir do contato do propágulo do fungo com
um hospedeiro potencial. Assim, inicia-se uma série de eventos que pode ou não
levar à infecção, em função da interação entre o fungo e o inseto (ALVES, 1998;
CASTRILLO et al., 2005).
Em uma reação compatível, o reconhecimento e adesão antecedem a
germinação do fungo na cutícula do hospedeiro, seguida de penetração na cutícula
e colonização da hemocele do inseto. A infecção eventualmente culmina na ruptura
da cutícula, o que permite o crescimento externo do fungo e posterior formação de
esporos e dispersão. A morte do inseto geralmente ocorre durante a colonização
da hemocele (ALVES, 1998; CASTRILLO et al., 2005), quando então há disrupção
dos processos fisiológicos do inseto (LAIRD et al., 1990; MURO et al., 2003),
levando à falta de nutrientes, podendo, o hospedeiro, também morrer por inanição
e obstrução interna (ALVES, 1998; CASTRILLO et al., 2005).
A viabilidade destes propágulos pode ser muito afetada por condições do
ambiente, como radiação UV (ALVES, 1998; BRAGA et al., 2001). Com relação à
temperatura, Vassilakos et al. (2006) verificaram que este fungo é mais efetivo a
26ºC, mas os autores não relatam sua inativação por este ou outros fatores.
17
Durante o processo infeccioso, os fungos também produzem metabólitos
secundários derivados de vários intermediários do metabolismo primário. Alguns
deles têm atividade biocida, resultando na morte mais rápida do hospedeiro. B.
bassiana, por exemplo, produz oosporeína, beauvericina e bassianolide (ALVES,
1998). A micotoxina oosporeína é tóxica a pássaros (PEGRAM et al., 1982, citados
por JOHNSON et al., 2002), apesar de nem todos os isolados produzirem esse
metabólito (JOHNSON et al., 2002).
Estudos de patógenos x predadores e parasitóides
Agentes de controle biológico podem ocorrer simultaneamente nos
agroecossistemas atacando o mesmo ou diferentes insetos (ALVES, 1998;
FRANÇA et al., 2006).
Os insetos predadores exploram grandes áreas foliares em busca de suas
presas e podem entrar em contato com conídios dos fungos depositados sobre as
folhas, serem atingidos diretamente com o entomopatógeno no momento da
aplicação, na disseminação do fungo, ou ainda pela ingestão de presas infectadas
(ALVES, 1998; FRANÇA et al., 2006).
De acordo com Alves (1998) os entomopatógenos podem atuar de forma
deletéria sobre os predadores por meio da inviabilização dos ovos, larvas e
adultos, alteração do ciclo de vida e dificuldades para encontrar a presa.
Goettel et al. (1990), citados por Alves (1998) relatam que B. bassiana pode
colonizar pelo menos 16 espécies de predadores, incluindo Chrysoperla carnea.
18
Por outro lado, Pessoa et al. (2005) constataram que apenas as larvas de 3
o
ínstar
deste predador são afetadas negativamente. Além disso, França et al. (2006)
relatam que o mesmo fungo não causa nenhum dano ao percevejo predador
Podisus nigrispinus, ao contrário do fungo M. anisopliae, que pode causar a morte
das ninfas.
Segundo Alves (1998), apesar do efeito observado, é possível integrar a
ação de predadores e fungos para o controle de pragas. Como exemplo, Goettel et
al. (1990), citado por Alves (1998) mencionam a aplicação de B. bassiana para o
controle de Manduca quinquemaculata, Epilachna varivestis e pulgões, sem afetar
predadores sirfídios, crisopídeos e pentatomídeos.
Em se tratando de parasitóides, as interações prejudiciais entre estes e
fungos entomopatogênicos podem acontecer por infecção direta do parasitóide,
produção de toxinas pelo fungo, morte antecipada do hospedeiro, redução na
população do hospedeiro e/ou alterações fisiológicas e nutricionais do mesmo que
prejudiquem o desenvolvimento do parasitóide (ALVES, 1998). Também pode
haver discriminação de um hospedeiro infectado pelo parasitóide, como muitos
estudos com vespas revelaram. Além disso, a larva do parasitóide dentro do
hospedeiro pode induzir imunidade do inseto-alvo à infecção do fungo (MESQUITA
et al., 1999).
Brooks (1993), citado por Furlong (2004) diz que a interação depende do
período comparativo do desenvolvimento do parasitóide e do patógeno e do tempo
que ambos levam para terminar seu ciclo no hospedeiro. Como o ciclo do fungo é
19
mais curto, a infecção do inseto hospedeiro pelo microrganismo resulta na
exclusão do parasitóide.
Estes inimigos naturais podem ser aplicados para atuarem juntos no controle
de pragas dependendo do tempo decorrido da aplicação de cada um. Essa
afirmação é comprovada pela aplicação de M. anisopliae e liberação dos
parasitóides Cotesia flavipes (Hymenoptera), Metagonistylum minense (Diptera) e
Paratheresia claripalpis (Diptera) para o controle da broca da cana-de-açúcar,
Diatraea saccharalis (Lepidoptera) (FOLEGATTI & ALVES, 1987, citados por
ALVES, 1998;). O mesmo é comprovado pelos estudos de Mesquita et al. (2001) e
de Kim et al. (2005), com os fungos Paecilomices fumosoroseus e Lecanicillium
lecanii e os parasitóides de afídios Aphelinus asychis (Hymenoptera) e Aphidius
colemani (Hymenoptera), respectivamente. Também há estudos referentes à
atuação sinergística destes organismos no controle da traça-das-crucíferas
(Plutella xylostella) (FURLONG & PELL, 2001; SANTOS et al., 2006). Potrich et al.
(2006) relataram que B. bassiana mostrou-se inócuo para Trichogramma pretiosum
(Hymenoptera), sendo que o primeiro não causou mortalidade do parasitóide
quando este entrou em contato com ovos tratados com o fungo, assim como não
afetou a taxa de parasitismo dos ovos, a porcentagem de parasitóides emergidos
nem a longevidade do parasitóide em questão.
2.3 Segurança dos Agentes de Controle Microbiano (ACM)
Devido ao fato de que a liberação de um agente pode ter repercussões
ecológicas imprevistas, é importante que os efeitos não-alvo dos ACMs sejam
20
completamente analisados. É de suma importância coletar informações científicas
suficientes para mostrar se um agente não mostra perigo significativo para
organismos não-alvo (SAUNDERS, 2005).
Em decorrência deste fato e do crescente interesse na aplicação dos
agentes microbianos, o destaque destes entomopatógenos no controle de insetos
tem provocado o aumento da preocupação com possíveis problemas decorrentes
do seu uso em relação aos organismos não-alvo, principalmente em relação ao ser
humano e outros vertebrados (JONSSON & MAIA, 1999). Assim, questões
relacionadas à sua segurança devem ser analisadas.
Jonsson & Maia (1999) defendem que não se deve esperar que o controle
biológico com microrganismos entomopatogênicos, por serem de ocorrência
natural e por possuir a tarja de produto biológico, seja sempre totalmente inócuo
aos organismos não-alvo. Assim, pode ser possível que um microrganismo
aplicado como patógeno de um artrópode ou nematóide que também afete
invertebrados benéficos ou vertebrados (COOK et al., 1996).
Os possíveis efeitos adversos dessa alternativa nos compartimentos
ambientais dos ecossistemas não têm sido suficientemente estudados, visto a
capacidade de tais agentes em poder se adaptar, multiplicar, sobreviver e serem
disseminados para outros ambientes com potencial de infectar organismos não-
alvo no mesmo ambiente (JONSSON & GENTHNER, 1997; BARTON, 2004).
É difícil avaliar a interação dos ACMs com todos os organismos de um
determinado ambiente e quais relações patogênicas desconhecidas com
21
organismos não-alvo poderiam ser descobertas após a sua liberação (BRIMNER &
BOLAND, 2003).
Além disso, em determinados meios de cultura, alguns patógenos podem
produzir toxinas desconhecidas ou não produzidas em insetos hospedeiros. Efeitos
prejudiciais podem acontecer, como carcinogênese ou teratogênese, caso essas
toxinas estejam eventualmente presentes nos produtos à base de
entomopatógenos, ou então produzidas em contato com outros organismos que
não seu hospedeiro (LAIRD et al., 1999). Assim, estas substâncias produzidas por
um ACM podem ser tóxicas para plantas, animais marinhos e terrestres, enquanto
trabalhadores que manipulam e/ou aplicam estes agentes estão particularmente
em risco para doenças respiratórias e alergias (BRIMNER & BOLAND, 2003).
Então, organismos acreditados como seguros devem ser testados em todas
as condições possíveis nas quais podem causar qualquer dano (LAIRD et al.,
1999), pois partindo-se do princípio de que estes agentes estão vivos, seu
comportamento, desenvolvimento e disseminação podem ser imprevisíveis
(JONSSON & GENTHNER, 1997).
Especificamente em relação aos fungos entomopatogênicos, tem-se
verificado que a maioria dos trabalhos que envolvem estudos de segurança se
restringe ao ambiente aquático, notadamente embriões do peixe Menidia beryllina
(GENTHNER & MIDDAUGH, 1992, 1995; MIDDAUGH & GENTHNER, 1994;
GENTHNER et al., 1995). Estes autores relatam vários efeitos adversos causados
por B. bassiana e M. anisopliae, como ruptura do córion, anomalias vertebrais e
morte dos embriões.
22
Recentemente, foi realizado um estudo no Brasil com o objetivo de verificar
a segurança de M. anisopliae para juvenis de lambari (Astynax scabripinis) (Pisces:
Characidae), sendo que o fungo esteve presente e viável tanto nas brânquias
quanto estômago dos espécimes estudados. Entretanto, não causou quaisquer
alterações comportamentais ou mortalidade dos mesmos, mostrando-se assim,
seguro para a espécie (OLIVEIRA, 2004).
Outros autores expuseram ratos e coelhos a Lagenidium gianteum, um
fungo parasita de larvas de mosquitos, verificando sua segurança para estes
organismos não-alvo, viabilizando seu uso no controle de mosquitos (SIEGEL &
SHADDUCK, 1987; KERWIN et al., 1990).
Outros autores ainda relatam a infecção de B. bassiana sobre o crocodilo
americano Alligator mississipiensis e em insetos benéficos predadores (JONSSON
& GENTHNER, 1997). O mesmo fungo causou micose pulmonar em um quelônio
de hábito terrestre (KURU, 1932; MACLEOD, 1954, citados por IGNOFFO, 1973).
Apesar de B. bassiana aparentemente não crescer à temperatura do corpo
de mamíferos, ainda houve relatos sobre a morte de ratos alimentados com alta
concentração de esporos de B. bassiana e M. anisopliae, porém não se
observaram danos quando os animais foram submetidos à injeção de conídios dos
mesmos fungos (SCHAERFFENBERG, 1968, citado por IGNOFFO, 1973).
Laird et al. (1990) relatam que ratos expostos a B. bassiana por meio de
injeção de esporos não tiveram nenhuma lesão pulmonar. Em contraste, ratos e
cobaias expostos aos esporos do microrganismo por inalação mostraram sintomas
23
de infecção. A variação nos resultados pode ser explicada mais pela natureza
particular das preparações que pelos fungos propriamente ditos.
Burges (1981) cita que houve diversos relatos de reações alérgicas
moderadas a severas de cientistas trabalhando com o fungo. Na maioria dos
casos, os sintomas eram cansaço ou fraqueza, e estes desapareceram em um
período relativamente curto.
Devido ao fato de as informações existentes sobre a segurança de B.
bassiana para vertebrados serem escassas e conflitantes, vários autores ressaltam
a necessidade de testes adicionais serem conduzidos (IGNOFFO, 1973; BURGES,
1981; PARKER et al., 1997; BRIMNER & BOLAND, 2003).
Em se tratando de aves, há uma grande carência de estudos voltados à
avaliação da segurança de B. bassiana, apesar de sua importância. Neste sentido,
Driesche & Bellows (1996) citam que vertebrados predadores que atacam insetos
são diversos, e incluem pássaros insetívoros entre eles.
Althouse (1997), citado por Johnson et al. (2002), estudando Falco
sparverius, uma espécie de Falconidae norte-americana que ingeriu B. bassiana,
não notou alteração comportamental ou lesão patológica aparente. Além disso,
Hartmann & Wasti (1980), citados por Johnson et al. (2002), encontraram conídios
viáveis do mesmo fungo em fezes de aves. Johnson et al. (2002), estudando
faisões na América do Norte alimentados com gafanhotos infectados com B.
bassiana e M. anisopliae, relatam que há poucas indicações de que estas aves
sejam susceptíveis a agentes entomopatogênicos. Em seu experimento não houve
redução de peso dos indivíduos tratados, nem lesões nos tecidos dos mesmos,
24
mas acreditam que estudos adicionais deveriam ser realizados com outras aves
para uma melhor avaliação.
Contribuindo com os autores acima, observações de campo realizadas pelo
Instituto LUBILOSA (Lutte Biologique contre les Locusts et les Sauteriaux) indicam
que as taxas de predação de gafanhotos infectados por fungo pode ser maior que
de insetos saudáveis da mesma espécie. Além disso, pássaros jovens podem
estar em risco ainda maior se estes tiverem sua alimentação baseada em insetos
com a mobilidade comprometida, devido ao fato de serem mais fáceis de capturar.
Pássaros imaturos no ninho também podem estar expostos, quando pássaros
parentais coletam insetos infectados para alimentar sua prole (LOMER et al.,
2001).
Devido ao crescente uso de microrganismos visando a redução da utilização
de agroquímicos para o controle de insetos-praga, há uma necessidade de avaliar
os possíveis efeitos em organismos não-alvo destes organismos.
O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (2006) corrobora com
esta afirmação, ao estabelecer procedimentos para verificação de sua possível
ação sobre organismos não-alvo. Assim, testes de infectividade, patogenicidade e
toxicidade devem ser realizados antes de se registrar e comercializar tais produtos.
Dentre os organismos não-alvo sugeridos no documento referido acima para
os testes de segurança encontram-se as aves, sendo que anteriormente, Nardo et
al. (1999) sugerem a utilização de codornas (Coturnix coturnix) e de frangos
(Gallus domesticus).
25
G. domesticus é uma ave cosmopolita e de fácil criação, além de organismo
não-alvo de B. bassiana em campo e em aviários, devido ao fato de haver estudos
para viabilizar seu uso no controle de pragas de grãos e de Alphitobius diaperinus
(PANZER, 1979), o cascudinho dos aviários (GEDEN & STEINKRAUS, 2003;
ALVES et al., 2005).
Tendo isso em vista, e à escassez de relatos científicos quanto à segurança
de B. bassiana para vertebrados homeotérmicos, é notada a necessidade da
realização de novos trabalhos com esse enfoque.
.
3. OBJETIVO
O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do fungo Beauveria
bassiana sobre alimentação, comportamento e anatomia de Gallus domesticus.
4. MATERIAL E MÉTODOS
A metodologia proposta neste trabalho seguiu o Protocolo de avaliação de
agentes microbianos de controle de pragas para registro como bioinseticidas,
desenvolvido pela Embrapa (NARDO et al., 1999).
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Zoologia de
Invertebrados/CCBS, Biotério e Laboratório de Histologia e Embriologia da
Universidade Estadual do Oeste do Paraná - Unioeste, Campus Cascavel.
4.1 Organismos utilizados
4.1.1 Obtenção de fungo
Foi utilizado o fungo da espécie Beauveria bassiana isolado UNIOESTE 4,
obtido em cadáveres de cascudinho (Alphitobius diaperinus) de um aviário de
frangos de corte em Cascavel, PR. Tal isolado foi escolhido por ter sido
selecionado previamente com maior potencial uso no controle do cascudinho em
aviários (ROHDE et al., 2006).
O fungo foi multiplicado, a partir do inóculo original, armazenado na forma de
conídios em freezer a -10ºC, em meio de cultura ME + antibiótico tetraciclina e
incubado em câmara de B.O.D. (26ºC e 14 h de fotofase), durante sete dias. A
28
partir destas placas, os conídios foram inoculados em pacotes plásticos com arroz
pré-cozido, conforme o método Biomax®. Os pacotes plásticos foram incubados,
durante sete dias a 10 dias, nas mesmas condições descritas anteriormente.
(ALVES & PEREIRA, 1989).
Após a incubação, o fungo foi separado do arroz por peneiramento e os
conídios obtidos foram armazenados em sacos plásticos em freezer (-10ºC) por 10
dias, até a utilização. Antes do armazenamento foi verificada a viabilidade do
fungo.
O fungo inativo foi obtido por processo de autoclavagem do fungo ativo por
20 minutos, a 1 atmosfera de pressão e temperatura de 121ºC.
4.1.2 Obtenção das aves
Foram utilizados machos de G. domesticus (galinha doméstica) de 11 dias
de idade, fornecidos pela empresa Diplomata Industrial e Comercial Ltda. de
Cascavel, PR. As aves foram mantidas no biotério na temperatura de 25±5ºC e
fotofase de 16h luz durante 3 dias até a instalação do experimento, para
aclimatação das mesmas. Os animais foram alimentados ad libitum com ração
comercial composta de milho, farelo de soja e de cana e aminoácidos, sem
antibiótico, para que não houvesse interferência na viabilidade do fungo.
29
4.2 Viabilidade do fungo em ração comercial
Para se verificar o efeito da ração utilizada sobre o fungo, foi realizado um
teste de viabilidade do fungo na presença da ração de acordo com Alves et al.
(1998).
Assim, foram utilizados 2 tratamentos: ração estéril (autoclavada por 20
minutos, a 1 atmosfera de pressão e temperatura de 121ºC) e ração não-estéril,
secas por 48 horas a 60ºC em estufa. Em seguida, o fungo (73% de viabilidade) foi
adicionado às duas amostras de ração de forma a se obter 10
9
conídios viáveis/g
de ração, sendo misturados em um recipiente plástico com tampa por 2 minutos de
forma que o fungo e a ração formassem uma mistura homogênea.
Em seguida, foram tomadas amostras de 3g das misturas, e transferidas
para tubos de ensaio, sendo 10 para cada tratamento (1- ração estéril + fungo e 2-
ração não-estéril + fungo). A testemunha constou de 0,4g de fungo dividido em 10
tubos de ensaio, para comparação. Os 30 tubos foram incubados a 26ºC e 14
horas de fotofase, em câmara B.O.D.
Diariamente, durante 10 dias, um tubo de cada tratamento foi retirado da
B.O.D. e feita a diluição de 1g da mistura em água com espalhante adesivo 0,1%
(Tween 80®), de forma a se obter suspensão com 10
7
conídios/mL. Desta mistura,
foi retirado 0,1mL que foi inoculado em 3 placas com meio BDA + antibiótico
tetraciclina. As placas foram incubadas a 26ºC e 14 horas de luz em B.O.D. por 16
horas para então verificar a viabilidade do fungo em microscópico óptico.
30
4.3 Administração do fungo para as aves
As aves, já aclimatadas, foram separadas em 3 grupos, que se encontravam
no mesmo ambiente. Os grupos foram cercados e divididos por armações de tela
plástica, confinados em uma área de 1,00×0,8m e altura de 1,0m, sendo a parte
superior móvel para facilitar a manutenção das aves (Figura 1). Os animais foram
identificados utilizando-se anilhas de cores diferentes em seus membros inferiores
para facilitar a avaliação.
Figura 1 – Área de confinamento das aves utilizadas no experimento 0,80m
2
(1,0×0,8m e 1,0m de
altura)
Cada um dos grupos destinou-se a um tratamento, sendo a administração
do patógeno via oral. Os tratamentos são os que seguem:
(1) Grupo teste
Neste grupo foram utilizadas 10 aves, alimentadas com ração contendo
fungo na concentração de 10
9
conídios viáveis/g de ração, conforme a
31
recomendação no Protocolo de avaliação de agentes microbianos de controle de
pragas para registro como bioinseticidas (NARDO et al., 1999), sendo cerca de mil
vezes maior que a utilizada em campo. Previamente, o fungo foi misturado à ração,
e diariamente a mistura foi administrada às aves, por um período de 5 dias, sempre
antecipada por um jejum de até 15 horas.
(2) Grupo Controle tratado com ACM inativado
Foram utilizadas 10 aves, às quais foi administrado o patógeno inativado por
meio de autoclavagem, também misturado à ração na mesma concentração do
grupo teste, sendo também precedido por jejum.
(3) Grupo Testemunha
Neste grupo foram utilizadas 10 aves, às quais não foi administrado nenhum
patógeno, mas estiveram mantidas nas mesmas condições dos outros grupos.
Todos os grupos, após o período de 5 dias voltavam a se alimentar
normalmente apenas com ração.
4.4. Avaliação das fezes
Amostras das fezes das aves do grupo teste (fungo ativo), foram coletadas
da cama de aviário, diariamente e sempre no mesmo horário entre o 1
o
e o 9
o
dias
após o início do experimento, para verificar a presença e viabilidade do fungo após
a passagem pelo trato gastrointestinal dos animais.
As amostras foram diluídas em 9 mL de água destilada + Tween 80®, e 0,1
mL desta diluição foi inoculada na superfície do meio de cultura Aveia + Dodine
para isolamento do fungo. Estas placas foram incubadas em câmara B.O.D. com
32
fotofase de 14 horas por 7 dias a 26ºC (ALVES, 1998) e posteriormente foi
verificada a presença ou ausência de B. bassiana.
4.5. Avaliação nas aves
4.5.1 Comportamento, peso e consumo de ração
Seguindo o Protocolo de avaliação de agentes microbianos de controle de
pragas para registro como bioinseticidas (NARDO et al., 1999), as aves foram
observadas diariamente por um período de 28 dias, à procura de quaisquer sinais
clínicos de efeitos fisiológicos ou patológicos associados ao tratamento, que
incluíram: mudanças no modo de locomoção ou coordenação, anorexia, penas
eriçadas ou queda das mesmas em demasia, fraqueza das aves ou resposta
reduzida à presença do investigador. Quaisquer evidências de desordem intestinal
(vômito ou diarréia) ou mesmo lesões na pele foram igualmente acompanhadas.
Previamente à inoculação do fungo e também semanalmente, o peso médio
das aves foi determinado, pesando-se cada indivíduo separadamente, utilizando
uma balança eletrônica. O peso do alimento fornecido a elas também foi anotado
semanalmente para verificação do consumo. Para tal, antes da reposição da ração,
o resíduo encontrado nos comedouros também foi pesado (Consumo = ração
inicial – ração final).
No caso de morte de animais, seriam anotadas hora e data da ocorrência e
as aves seriam cuidadosamente avaliadas quanto a lesões externas; também
seriam necropsiadas, para verificação de alterações em seus órgãos internos.
33
4.5.2 Análise histopatológica
Todas as aves do experimento foram mortas ao final do período de
avaliação, e três aves de cada grupo foram selecionadas casualmente e
necropsiadas para verificar alterações patológicas internas. Amostras de cerca de
6 cm
3
de do pulmão, coração, fígado e intestino delgado foram também retiradas e
imersas em frascos de vidro contendo álcool 70% por, no mínimo, 48 horas para
fixação. Estas seguiram rotina histológica, com inclusão do material em “paraplast”
(Oxford Labware, USA) e foram analisadas por cortes histológicos, de 7 µm de
espessura. Foi feito uso da coloração HE (Hematoxilina-Eosina),
segundo técnicas
descritas por GANTER & JOLLES (1970) e BEHMER et al. (1976),
para verificação
da presença do fungo e lesões causadas pelos mesmos.
Todo o material histológico foi analisado e documentado fotograficamente
(aumentos de 100, 200, 400 e 1000X) com o uso de um microscópio e
fotomicroscópio “Olympus” modelo BX60S5.
Todos os experimentos foram realizados de acordo com o delineamento
experimental inteiramente casualizado, sendo que cada ave foi considerada uma
repetição.
Os resultados da análise de ganho de peso das aves foram submetidos à
análise de variância pelo teste F e as médias comparadas com aplicação do teste
de Tukey ao nível de 5% de significância. Já a avaliação do peso das aves foi
realizada pelo delineamento de parcelas subdivididas no tempo.
34
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Viabilidade de Beauveria bassiana em ração comercial
Verificou-se que a viabilidade do fungo foi reduzida nos três tratamentos,
sendo que no tratamento com ração não estéril, o fungo perdeu totalmente a
capacidade de germinar no último dia de avaliação (Tabela 1).
Tabela 1 - Germinação de conídios de B. bassiana em ração comercial para
Gallus domesticus ao longo do tempo em 3 tratamentos. Temperatura: 26ºC, Fotofase:
14 horas
Germinação (%)/dia de incubação
Tratamento
1 2 3
Controle 66 57 50
Ração estéril + fungo 75 57 38
Ração não estéril + fungo 74 0 0
Segundo Hong et al. (1997), citados por Alves et al. (2002), a temperatura e
a umidade do local onde estão sendo armazenados os fungos, são os fatores que
mais influenciam a longevidade dos conídios.
Walstad et al. (1970), citado por Silva (2006), relataram que a uma
temperatura de 21ºC, conídios de B. bassiana perderam a viabilidade aos 15 dias,
mas não informam como este fungo foi armazenado. Ainda com relação à
avaliação da viabilidade deste fungo à temperatura ambiente, Prior e Jollands
(1988), também citados por Silva (2006), verificaram que os conídios armazenados
em formulações de óleo de côco e água perderam a viabilidade em 15 dias. Já
Marques e Alves (1996), citados pelo mesmo autor, constataram que a 21ºC, tanto
35
conídios armazenados puros quanto em arroz, mantiveram a viabilidade alta aos
180 dias de armazenamento.
Considerando que os três tratamentos foram incubados nas mesmas
condições de temperatura e umidade, e que se encontraram na faixa adequada
para o fungo (ALVES, 1998), provavelmente estes fatores não foram os
responsáveis pela inativação do fungo. A queda de viabilidade pode ter sido
causada por produtos utilizados no tratamento dos grãos para controle de pragas,
o que poderia afetar a sobrevivência do fungo.
Sendo assim, optou-se por misturar o fungo, previamente acondicionado em
freezer, à ração apenas minutos antes desta ser administrada às aves,
minimizando qualquer alteração na sua viabilidade devido ao tempo de contato
deste com o referido produto.
5.2 Presença de B. bassiana nas fezes das aves
Foram encontrados conídios viáveis do fungo entre o 1
o
ao 6
o
dia, indicando
que os conídios passaram rapidamente pelo trato gastrintestinal, permanecendo
por, no máximo, 24 horas. Este fato também deveu-se pelo fungo ativo ter sido
consumido prontamente e passou pelo trato digestório dos animais ainda com alta
viabilidade (Tabela 2).
36
Tabela 2: Presença de conídios viáveis nas fezes de G. domesticus tratados com
ACM ativo durante 9 dias de avaliação (25±5ºC; Fotofase: 14 horas)
Dias de avaliação
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Presença/
ausência
+ + + + + + - - -
Alves (1998), relata que os fungos só germinam quando encontram
condições favoráveis de umidade, temperatura, pH, oxigênio e nutrição. Sabendo-
se que a temperatura interna de G. domesticus é superior a 40ºC e o pH sofre
grande variação ao longo do trato digestório, além da escassez de oxigênio, fica
claro que B. bassiana passou pelo trato digestório das aves sem germinar.
Furlan & Macari (2002a), corroborando com tais resultados, relatam que em
frangos e perus, quando adicionam-se marcadores ao alimento, estes são
percebidos nas fezes cerca de três horas após a ingesta e após 24 horas, todo o
marcador é recuperado.
Por outro lado, os resultados obtidos nesse experimento diferem dos
observados por Smits et al. (1999), que não observou a presença de Metarhizium
flavoridae nas fezes de faisões que receberam conídios do fungo em sua
alimentação.
Da mesma forma, Johnson et al. (2002), em seu trabalho com faisões, não
encontraram outros fungos que não Mucor e Penicillium quando analisando tanto
fezes quanto o sangue das aves tratadas com B. bassiana e M. anisopliae no
alimento. Mas os autores relatam que, fazendo a mesma avaliação em amostras
da dieta dos faisões, foi encontrado um menor número de conídios viáveis do que o
37
esperado. Assim, concluem que a ausência de conídios de B. bassiana e M.
anisopliae nos fluidos corporais dos animais testados não é conclusiva.
5.3 Avaliação diária das aves
5.3.1 Comportamento
Não houve mortalidade das aves em nenhum dos três tratamentos (Tabela
3). Além disso, nenhum indivíduo apresentou lesões externas visíveis em nenhuma
parte do corpo.
Tabela 3: Sobrevivência e alterações comportamentais de Gallus domesticus
submetidos à ingesta de B. bassiana em 3 tratamentos : fungo ativo, fungo inativo e
controle, ao longo de 4 semanas (temperatura: 25±5ºC; fotofase: 14 horas)
Resposta observada (%)
Tratamentos
Nº de indivíduos/
tratamento
Alteração
comportamental
Nº de indivíduos
mortos
Sobrevivência (%)
Sem fungo
(controle)
9 negativo 0 100a
Com fungo
inativo
10 negativo 0 100a
Com fungo ativo 10 negativo 0 100a
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de
Tukey ao nível de 5%. Concentrações de 10
9
conídios/grama de ração.
Kerwin et al. (1998), injetando uma solução concentrada de Lagenidium
giganteum intraperitonialmente em patos, também não encontraram mortalidade
em nenhum dos grupos, tratado ou controle. Quando da administração oral do
mesmo fungo, apenas um organismo morreu, mas por causa outra que não o
entomopatógeno.
38
Contudo, Burges (1971) relatou que L. giganteum causou 67% de
mortalidade em ratos, quando foram administrados 12×10
5
oósporos em 0,5 mL de
água por instilação traqueal. Alguns animais morreram cerca de quatro minutos
após receberem a dose do fungo; o restante, cerca de 24 horas depois. Estas
mortes resultaram da obstrução das vias aéreas ou de reação inflamatória devido à
grande quantidade de material estranho.
O mesmo autor reportou que a exposição de ratos e cobaias a uma alta
dose de conídios e micélio de B. bassiana por 21 dias causou a mortalidade de
30% do grupo avaliado. Mas a mortalidade foi atribuída como sendo causada pela
maneira como o experimento foi conduzido, e não pela ação do fungo. Ignoffo
(1979) também verificou mortalidade de 30% de ratos alimentados com alta
concentração de esporos de B. bassiana e M. anisopliae durante 3 semanas.
Observando-se as aves diariamente, durante o período de 28 dias, não foi
verificada nenhuma alteração de comportamento dos indivíduos que compunham
os tratamentos alimentados com o fungo, tanto na forma ativa como inativa,
quando comparados com o grupo controle. Todos os indivíduos demonstraram o
mesmo padrão comportamental, mesmo quando deixados em jejum antes da
administração da ração contendo o fungo, ou posteriormente à ingesta (Tabela 2).
Johnson et al. (2002) encontraram resultados semelhantes ao administrar
gafanhotos contaminados com B. bassiana e M. anisopliae a faisões, sendo que
não houve redução da sobrevivência entre os pássaros expostos aos fungos.
Também não foi verificada diferença no comportamento entre os grupos testados,
nem qualquer evidência clínica de infecção ou doença. O mesmo também foi
39
verificado por Althouse (1997), citado por Johnson (2002), testando B. bassiana em
falconídeos americanos da espécie Phasianus colchicus.
Este resultado é explicado por Laird et al. (1990), que relata que estes
entomopatógenos têm relativa especificidade, o que reduz o risco de infecção de
espécies de diferentes classes taxonômicas do organismo alvo, como é o caso das
aves.
Pereira et al. (1998) complementa, afirmando que isso acontece devido à
grande diferença entre os aspectos fisiológicos dos organismos. Um fator limitante
no processo de colonização de fungos entomopatogênicos é a temperatura
corpórea dos homeotérmicos, diferente daquela à qual tais fungos se adaptaram.
No caso específico das aves, esta encontra-se em torno de 40ºC. Além disso, o
sistema imunológico dos homeotérmicos também dificulta a infecção, por ser mais
complexo e eficiente, inviabilizando o crescimento dos fungos, não adaptados a
essas barreiras fisiológicas de vertebrados, como as aves. Alexandre et al. (2006),
avaliando o efeito da temperatura na virulência de B. bassiana, verificou que a
32ºC a germinação foi totalmente inibida. Inglis et al. (1999) relata que tal fungo é
muito sensível a temperaturas flutuantes, sendo que a infectividade diminui
enquanto a amplitude da variação de temperatura aumenta.
5.3.2 Avaliação do consumo de ração
As aves alimentaram-se da ração com fungo ativo e inativo prontamente
durante o período de exposição, possivelmente devido ao fato de estarem em
jejum por um longo período de tempo.
40
Do início até o término da primeira semana de experimento, não houve um
grande aumento no consumo de ração. A partir da segunda semana, o consumo de
ração subiu consideravelmente, acompanhado pelo ganho de peso dos indivíduos.
Já na quarta semana o consumo de ração foi muito semelhante ao da semana
anterior para os 3 tratamentos.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
1 2 3 4
tempo
consumo (g)
fungo ativo
fungo inativo
controle
Figura 2 – Consumo de ração por Gallus domesticus em 3 tratamentos, sendo eles:
ração + fungo ativo, ração -+ fungo inativo e tratamento controle (sem adição de conídios à
ração) em 4 semanas de avaliação (temperatura: 25±5ºC; fotofase: 14 horas)
Considerando-se que as aves dos três tratamentos apresentaram pouca
diferença de consumo, conclui-se que B. bassiana não provocou alteração que
causasse redução da ingesta, e conseqüente alteração no ganho de peso das
aves. Notou-se que as aves que receberam tanto fungo ativo quanto inativo em sua
dieta mostraram consumo um pouco maior que o grupo para o qual foi
administrado apenas ração, mas tal fato não está relacionado com a presença do
patógeno, pois este foi administrado apenas durante a primeira semana de
avaliação, não estando presente no alimento nas semanas posteriores.
41
5.5 Avaliação do peso das aves
Verificou-se que não houve interação entre o uso de B. bassiana e o tempo
de avaliação no aumento de peso, indicando que estes dois fatores atuaram de
forma independente. Além disso, não havia diferença estatística no dia de
implantação do experimento e nas duas semanas seguintes, entre os três grupos,
sendo que na última semana, no tratamento para o qual foi administrado o fungo
ativo, as aves apresentaram maior peso, quando comparado com os dois outros
grupos, o que pode estar diretamente correlacionado com o consumo de ração
mais elevado (Tabela 4).
Tabela 4 – Média do peso total (g) de Gallus domesticus em 3 tratamentos : fungo
ativo, fungo inativo e controle, ao longo de 4 semanas (temperatura: 25±5ºC; fotofase: 14
horas)
Tempo
Tratamento
0 7 14 21 28
Fungo ativo
335,0
(±10,44)
Ad
342,8
(±11,16)
Ad
661,1
(±16,51)
Ac
1093,3
(±30,41)
A b
1718,9
(±58,46)
Aa
Sem fungo
(controle)
323,3
(±9,75)
Ad
335,6
(±8,52)
Ad
578,9
(±11,45)
Ac
1046,7
(±26,93)
ABb
1610,0
(±63,31)
Ba
Fungo inativo
313,3
(±11,79)
Ad
325,6
(±13,78)
Ad
585,6
(±25,87)
Ac
986,1
(±33,02)
B bc
1603,3
(±47,05)
Ba
CV tratamento (%) 12,24
CV tempo (%) 11,37
Médias (±EP) seguidas pela mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem
entre si, pelo teste de Tukey (P<0,05).
42
Em todos os tratamentos verificou-se um aumento exponencial do peso a
partir da segunda semana de avaliação, até a última pesagem dos indivíduos
(Figura 3), indicando que não houve nenhuma alteração fisiológica causada
diretamente pelos conídios, estando estes intactos ou na forma de fragmentos
digeridos ou por suas toxinas, que levasse à redução ou ao não ganho de peso.
De acordo com Gonzáles & Sartori (2002), o que ocorre é um aumento
rápido da massa corpórea dos frangos no início do desenvolvimento, diminuindo
com o passar do tempo até atingir o pleno desenvolvimento do indivíduo. A curva
normal de crescimento em função do tempo é sigmóide, indicando que a taxa de
crescimento não é constante. Esta é modificada pelo balanço entre os processos
anabólicos e catabólicos teciduais. No início, a taxa de anabolismo é maior que a
de catabolismo, havendo crescimento. Com o passar do tempo, esta diferença vai
sendo reduzida até tornar-se nula, e há parada de crescimento.
Os resultados encontrados neste trabalho estão de acordo com o descrito
pelos autores acima. Mas como os animais foram sacrificados antes da parada de
crescimento das aves e posterior consumo da massa corpórea pelas próprias
reações metabólicas dos animais, a curva de crescimento não se mostrou
sigmóide, apresentando apenas a primeira parte da curva de crescimento.
Contrastando os dados obtidos, Ignoffo (1979), testando ratos alimentados
com esporos e micélio de B. bassiana e M. anisopliae, verificou que os indivíduos
que sobreviveram mostraram peso 40% menor que o grupo controle, mas voltaram
ao peso normal três semanas após a retirada dos fungos da dieta.
43
y = 279,28e
0,0633x
R
2
= 0,9544
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 7 14 21 28
peso médio
Fungo ativo
Expon. (Fungo ativo)
Figura 3 – Ganho de peso em Gallus domesticus em três tratamentos: fungo ativo,
fungo inativo e controle, ao longo de 4 semanas de avaliação (temperatura: 25±5ºC;
fotofase: 14 horas)
y = 259,22e
0,0625x
R
2
= 0,9543
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 7 14 21 28
peso médio
Fungo inativo
Expon. (Fungo inativo)
y = 267,45e
0,0621x
R
2
= 0,952
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 7 14 21 28
peso médio
controle
Expon. (controle)
44
Observou-se que o grupo que ingeriu fungo ativo juntamente com a ração
apresentou maior ganho de peso (1383,9±54,4g) (Tabela 5). Tal resultado pode ser
explicado por B. bassiana, de alguma forma, ter estimulado a alimentação destas
aves.
Já o grupo controle e o como fungo inativo, foram os que apresentaram o
menor ganho de peso ao final do experimento (respectivamente 1150,0±64,1 e
1290,0±40,4g) (Tabela 5), evidenciando que B. bassiana não causa efeitos que
prejudiquem a alimentação ou até mesmo a digestão e absorção de nutrientes no
trato digestório das aves.
Tabela 5 – Ganho de peso (g) de Gallus domesticus em três tratamentos: fungo
ativo, fungo inativo e controle, ao longo de 4 semanas (temperatura: 25±5ºC; fotofase: 14
horas)
Tratamentos Média de ganho de peso (g)
Fungo ativo 1383,9±54,4 a
Fungo inativo 1290,0±40,4 a b
Controle 1150,0±64,1 b
CV (%) 12,39
Médias (±EP) seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey
(P<0,05).
Kerwin et al. (1988), testando o efeito de administração oral de L. giganteum
em patos, encontraram pequena redução de peso ao longo dos 28 dias de
experimento, não sendo estatisticamente significativa. Das aves testadas, uma
morreu, mas devido a outros fatores que não a ação do fungo. Da mesma forma,
Johnson et al. (2002) não encontraram evidências de que o consumo de
gafanhotos infectados com M. anisopliae e B. bassiana por faisões machos tenha
afetado o ganho de peso dessas aves, sendo que não houve diferença entre os
45
tratamentos durante o período avaliado, também indicando que estes fungos não
alteram o funcionamento do sistema digestório.
46
5.4 Análise histopatológica
Nenhuma alteração na forma, coloração ou tamanho dos órgãos internos
das aves foi detectada durante a necropsia.
Johnson et al. (2002) relataram que a oosporina, micotoxina produzida por
B. bassiana, é tóxica para pássaros. Mas nem todos os isolados a produzem, e a
maioria dos isolados não cresce na temperatura corpórea das aves, que segundo
Furlan & Macari (2002b) é de 41,1ºC. Desta forma, confirmam-se os resultados
deste trabalho, no qual nenhuma alteração foi encontrada.
Giacomini et al. (2006), avaliando frangos aos quais foi administrada a
toxina aflatoxina, verificaram que o fígado é o principal órgão afetado, levando a
distúrbios metabólicos. Os autores notaram que o fígado das aves apresentou
bordos arredondados, aumentados de tamanho e de coloração amarelo bronzeado,
enquanto baço e rins apresentavam-se aumentados de tamanho e de coloração
pálida.
47
5.6.1 Coração
Não foi verificada nenhuma alteração no miocárdio, a nível de microscopia
óptica, em nenhum dos animais avaliados, dentro dos três tratamentos. Este
resultado indica que, não havendo lesão alguma no tecido, também não houve
comprometimento da função do órgão.
Em se tratando da estrutura do tecido, as fibras cardíacas apresentaram
estriações transversais bem visíveis em aumento de 1000X, em cortes
longitudinais (Figura 4), sendo facilmente identificável o núcleo em posição central
da fibra. Também é possível verificar a presença de anastomoses com as fibras
vizinhas e a presença de capilares sangüíneos responsáveis pela nutrição do
tecido cardíaco, assim como fibras de tecido conjuntivo, tal como descreveram
Banks (1992) e Di Fiore (2000).
Embora tenha sido adotada técnica diferente para inoculação, e em outra
espécie, Smits et al. (1999) relata que esporos de B. bassiana injetados em
musculatura esquelética de ratos provocaram progressiva resposta patológica e
reparo no local da injeção. A lesão mostrou padrão consistente com resposta
inflamatória normal frente à partículas estranhas, porém, não mostrou evidência de
infecção ativa pelo fungo, sendo que três dias após a inoculação já não havia
conídios viáveis no local.
48
Figura 4 – Fotomocrografias de tecido cardíaco de Gallus domesticus (A -
controle
400X; B
-
1000X; C - fungo inativo, 400X; D - 1000X; E - fungo ativo, 400X; F - 1000X
Núcleo de célula muscular estriada cardíaca;
Estrias de célula muscular estriada cardíaca
M
MM
M fibras musculares cardíacas
49
5.4.1 Fígado
O fígado, órgão que corresponde a 2-5% do peso corporal, é uma glândula
tubular composta, cujas diversas funções são desempenhadas pelos hepatócitos e
células de Kupffer. Os primeiros estão envolvidos com estocagem de carboidratos
na forma de glicogênio, gorduras e vitaminas, remoção das hemáceas velhas da
corrente sangüínea e de substâncias tóxicas do sangue. Quanto à função na
digestão, os hepatócitos produzem o suco biliar, armazenado na vesícula biliar e
levado ao duodeno, onde participa da emulsificação das gorduras, facilitando a
ação das lipases pancreáticas (BANKS, 1992; BOLELI et al., 2002). As células de
Kupffer revestem os sinusóides hepáticos associados aos hepatócitos. Estas têm
grande atividade fagocitária (BANKS, 1992).
Comparando o tecido hepático de indivíduos dos três tratamentos, notou-se
que os hepatócitos estavam dispostos em lóbulos hexagonais, delimitados por
delgados elementos de tecido conjuntivo, como relatado por Gartner & Hiatt (2003).
Além disso, não foi evidenciada nenhuma lesão tecidual, indicando que não houve
comprometimento algum de nenhuma das funções do órgão acima descritas
(Figura 5).
50
Figura 05 – Fotomocrografias de fígado de Gallus domesticus (A -
controle
400X; B - 1000X; C
-
fungo inativo, 400X; D - 1000X; E - fungo ativo, 400X; F - 1000X
- núcleo de hepatócito; H
H H
H - hepatócito
51
5.4.2 Pulmão
O sistema respiratório das aves apresenta peculiaridades dentro do grupo
dos vertebrados. As aves não têm diafragma, e os pulmões são rígidos e pouco
flexíveis, quando comparados com os dos mamíferos, tendo pouca
distendibilidade. A parede dos parabrônquios é formada por vesículas aéreas,
revestidas por epitélio pavimentoso simples, sustentado pelo tecido conjuntivo
intersticial. Os sacos aéreos comunicam-se com os brônquios e estão distribuídos
em toda a cavidade tóraco-abdominal (BANKS, 1992; MACARI & GIVISIEZ, 2002).
Avaliando cortes histológicos de pulmão de G. domesticus, não foi verificada
nenhuma alteração que indicasse algum tipo de lesão ou infecção neste órgão.
Também não foi evidenciada a presença de B. bassiana na luz dos parabrônquios,
ou entre as células, apesar das aves possivelmente terem inalado conídios do
fungo ao ingerirem a ração. Nas fotomicrografias são visíveis arteríolas irrigando o
tecido (Figura 6) e as vesículas aéreas dos parabrônquios, onde ocorrem as trocas
gasosas.
Johnson et al. (2002), em seu trabalho com faisões, encontraram diversas
alterações patológicas no tecido pulmonar das aves, mas estas não estavam
associadas a nenhum dos tratamentos em específico. Isto indica que estas
alterações não foram causadas nem por M. anisopliae, nem por B. bassiana,
mesmo os fungos tendo sido administrado às aves por via oral, e possivelmente
tendo sido inalados.
52
Figura 6 – Fotomocrografias de pulmão de Gallus domesticus (A -
controle
200X; B - 400X; C
-
fungo inativo, 200X; D - 400X; E - fungo ativo, 200X; F- 400X
P- vesículas aéreas dos parabrônquio; A
A A
A - arteríola
53
5.4.4 Intestino Delgado
Da região anterior para a posterior, o trato digestório das aves é subdivido
em cavidade oral, esôfago, papo, proventrículo, moela, intestino delgado, cecos e
cólon. O jejuno é a região mais longa do intestino delgado, e encontra-se disposto
em várias alças. Possui muitas dobras microscópicas denominadas vilosidades
intestinais, que aumentam a área de contato entre a parede do intestino e o
alimento, permitindo uma maior área de absorção (BOLELI et al., 2002).
O epitélio de revestimento dos vilos intestinais é formado por dois tipos
principais de células, as absortivas e as caliciformes (Figura 7). Estas últimas têm
por função secretar o muco, que protege o canal alimentar contra a ação das
enzimas digestivas ali presentes e abrasão dos alimentos. A essa secreção viscosa
encontram-se integradas tanto a flora natural do intestino quanto imunoglobulinas.
Assim, o muco intestinal também funciona como barreira contra patógenos
(BOLELI et al., 2002).
Já as células superficiais absortivas, altas e cilíndricas, possuem as
chamadas microvilosidades, inúmeras dobras da membrana plasmática que
aumentam ainda mais a área de absorção destas células (GARTNER & HYATT,
2002). Também é visível a presença de linfócitos (Figura 7), responsáveis pela
defesa do tecido contra possíveis antígenos que tenham sido ingeridos juntamente
com o alimento (GARTNER & HYATT, 2002, 2003).
G. domesticus está sujeito a diversos fatores que podem alterar as
características morfofuncionais de seu trato gastrointestinal, como lesões por
microrganismos e lesões mecânicas. Estas podem alterar a renovação celular da
54
mucosa, o que leva a alterações funcionais, em especial, na absorção dos
nutrientes. A maioria dos patógenos causa uma lesão chamada enterite catarral,
caracterizada pela necrose do tecido e aumento da secreção mucosa pelas células
caliciformes, resultando em diarréia. A ingesta de micotoxinas provoca ulcerações
na moela, espessamento da mucosa intestinal e hemorragias (BOLELI et al.,
2002).
Contudo, não foi verificado acúmulo excessivo de muco na superfície do
intestino delgado. A reposição de células absortivas também se mostrou normal,
assim como evidenciado na figura 7, indicando que não houve comprometimento
do funcionamento deste tecido, seja na produção de muco, defesa ou absorção
dos alimentos.
Johnson et al. (2002) encontraram alterações no proventrículo e ceco dos
faisões, mas estas não estavam restritas a nenhum dos tratamentos com ou sem
B. bassiana e M. anisopliae fungo, indicando que não tinham relação alguma com a
ação dos fungos entomopatogênicos administrados às aves em questão.
Este resultado é ainda reforçado pelo encontrado na avaliação de peso
destas mesmas aves (Tabela 3). Isto porque, como já citado anteriormente, o
grupo ao qual foi administrado fungo ativo apresentou peso significativamente
maior que os dois outros grupos do experimento, confirmando que a absorção dos
alimentos realmente não foi comprometida.
55
Figura 7 – Fotomocrografias de intestino delgado de Gallus domesticus (A-
controle
400X; B
-
1000X; C - fungo inativo, 400X; D - 1000X; E - fungo ativo, 400X; F- 1000X
- linfócito; - célula caliciforme; - célula absortiva; * - microvilosidades; LP –
lâmina
própria; LI – luz intestinal
56
5.4.5 Rim
Nas fotomicrografias realizadas a partir de tecido renal das aves é possível
verificar a presença da Cápsula de Bowman envolvendo o Glomérulo de Malpighi e
também vários túbulos contorcidos proximais e distais, principalmente em corte
transversal (Figura 8).
Não foi verificada nenhuma alteração deste tecido, quando analisado ao
microscópio óptico, indicando que não houve nenhuma lesão renal causada por B.
bassiana. Considerando que o sistema urinário tem como função remover do
sangue subprodutos tóxicos do metabolismo e eliminá-los para o meio externo
(GARTNER & HYATT, 2003). O corpúsculo renal é formado por um tufo de
capilares, o glomérulo, envolvidos pela Cápsula de Bowman (JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 1999), e que os resultados descritos reforçam que este fungo não
causa efeitos deletérios em G. domesticus.
57
Figura 8 – Fotomocrografias de córtex renal de Gallus domesticus (A -
controle
200X; B -
400X;
C - fungo inativo, 200X; D - 400X; E - fungo ativo, 200X; F- 400X
GM – Glomérulo de Malpigui; CB - Cápsula de Bowman; TD – túbulo contorcido distal; TP – túbulo
contorcido proximal; AA – arteríola;
58
6. CONCLUSÕES
B. bassiana esteve presente e viável nas fezes das aves até 24 horas após a
ingesta, indicando que este não se multiplicou dentro do corpo do animal.
Não houve mortalidade em decorrência da ingestão do fungo
As aves não apresentaram nenhuma alteração comportamental, ou algum
tipo de lesão corporal externamente.
Não se observou efeito negativo sobre o ganho de peso das aves.
Nenhuma lesão microscópica foi encontrada no fígado, intestino delgado,
rim, coração e pulmão de nenhuma ave dos três tratamentos.
Nas condições do experimento, conclui-se que B. bassiana não causa
efeitos deletérios sobre a ave G. domesticus, sendo segura para este organismo
não-alvo.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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