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ALESSANDA FERNANDES LOUZADA HOEGEMANN RAMOS
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL EMBRIOTÓXICO DO TACROLIMUS
(FK506) ADMINISTRADO A RATAS WISTAR
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa
de Pós – Graduação em Saúde; Faculdade de
Medicina da Universidade Federal de Juiz de Fora,
como requisito parcial para obtenção do Grau de
Mestre em Saúde – área de concentração Saúde
Brasileira.
ORIENTADORA: Prof
a
. Dra. Vera Maria Peters
CO-ORIENTADORA: Prof
a
. Dra. Martha de Oliveira Guerra
JUIZ DE FORA
2007
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Ramos, Alessanda Fernandes Louzada Hoegemann
Avaliação do potencial embriotóxico do Tacrolimus (Fk506)
administrado a ratas Wistar / Alessanda Fernandes Louzada Hoegemann
Ramos; orientador: Profa. Dra. Vera Maria Peters; co-orientador: Profa.
Dra. Martha de Oliveira Guerra. - 2007.
80 f.
Dissertação (Mestrado em Saúde)-Faculdade de Medicina,
Universidade
Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora, 2007.
1. Embriologia - Toxicologia. 2. Pesquisa com embriões - Animal.
I. Peters, Vera Maria. II. Guerra, Martha de Oliveira. III. Título.
CDU 611-013
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ALESSANDA FERNANDES LOUZADA HOEGEMANN RAMOS
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL EMBRIOTÓXICO DO TACROLIMUS (FK506)
ADMINISTRADO A RATAS WISTAR
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de
Pós – Graduação em Saúde; Faculdade de Medicina da
Universidade Federal de Juiz de Fora, como requisito
parcial para obtenção do Grau de Mestre em Saúde –
área de concentração Saúde Brasileira.
Aprovada em 22 de agosto de 2007.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________
Prof
a
. Dra. Vera Maria Peters (Orientadora)
Universidade Federal de Juiz de Fora
___________________________________
Prof
a
. Dra. Hélady Sanders Pinheiro
Universidade Federal de Juiz de Fora
______________________________________
Prof
a
. Dra.Tânia Toledo de Oliveira
Universidade Federal de Viçosa
JUIZ DE FORA
2007
AGRADECIMENTOS
Agradeço a DEUS por tudo que me proporciona.
Ao meu esposo e ao meu filho, que é a razão da minha vida, meu profundo
reconhecimento pela grandeza com que souberam compreender e incentivar a
minha caminhada.
A minha mãe e irmã por seu amor e apoio incondicional.
À minha Orientadora Dra. Vera Maria Peters, pela paciência, dedicação, incentivo,
apoio durante o desenvolvimento das atividades e pelos ensinamentos durante a
orientação.
À Dra. Martha de Oliveira Guerra, por seu carinho, amizade e por tudo que me
ensinou.
Aos técnicos, Rosemar Rodrigues de Azevedo, Evelise Rocha de Souza e Paulo
Sérgio do Carmo pelo apoio e atenção durante o desenvolvimento das atividades
práticas.
A Nathália Borges pelos ensinamentos durante o desenvolvimento das atividades
práticas.
A Lorena S. Ribeiro e Jhennifer K. Rodrigues pelo companheirismo, amizade,
dedicação e ajuda durante todo o período de realização das atividades.
A Luciana Borges pela atenção e amizade a mim dispensada e pela ajuda na
redação dos artigos e da dissertação.
A Rosana Oliveira, Lúcia Piúma, Eduardo Fernandes e Rafael Pinto pela amizade,
paciência, pela força e encorajamento nas horas mais difíceis do Mestrado.
A todos os estagiários e pesquisadores do Centro de Biologia da Reprodução.
A todos os funcionários do Biotério do Centro de Biologia da Reprodução, pelo
cuidado com os animais de experimentação e pela atenção que me dispensaram.
A Professora Lúcia Cangussu pelo apoio e incentivo nas tardes de estudo.
A FAPEMIG – Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais e pela Rede
Mineira de Ensaios Toxicológicos e Farmacológicos de Produtos Terapêuticos pelo
apoio financeiro.
À Coordenação do Mestrado em Saúde Brasileira.
A todos, muito obrigada.
RESUMO
O tacrolimus é um antibiótico macrolídeo com ação imunossupressora, atuando como
inibidor de calcineurina, que vem sendo utilizado como droga base na maioria dos
transplantes para evitar rejeição. Com o êxito dos transplantes, decorrente principalmente
do uso de imunossupressores, houve uma melhora na qualidade de vida das pacientes
transplantadas. Esta melhora levou ao aumento do número de gestações, mesmo sob o uso
contínuo de imunossupressores. Sabe-se que os imunossupressores atravessam a placenta
podendo levar a alterações no desenvolvimento do embrião. Segundo a literatura, foram
observados desvios da normalidade, como perda de peso, em recém nascidos de mães que
utilizavam o tacrolimus. Entretanto, pouco se sabe sobre a sua atuação no período de pré-
implantação do blastocisto, sendo o objetivo deste trabalho verificar se o tacrolimus interfere
no desenvolvimento do embrião de rata, durante seu trânsito tubário e na fase de
implantação do blastocisto. Ratas Wistar prenhes foram distribuídas aleatoriamente nos
grupos controles C1 e C2 e tratados T1, T2, T3 e T4, T5 e T6. Controle 1 e Tratados 1, 2 e 3
receberam água destilada e 1, 2 e 4 mg/kg/dia de Tacrolimus respectivamente por via
intragástrica do primeiro ao quinto dia de prenhez (período de trânsito tubário) e os grupos
Controle 2 e Tratados 4, 5 e 6 receberam água destilada e 1, 2 e 4 mg/kg/dia de tacrolimus ,
respectivamente, por via intragástrica, do quinto ao sétimo dia (período de implantação). O
acompanhamento de sinais clínicos maternos possibilitou a análise de efeitos tóxicos sobre
a mãe durante o período de gestação. No 15
0
dia, foi coletado sangue para avaliação de
parâmetros bioquímicos e hematológicos, em seguida os animais foram eutanasiados.
Ovários, fígado e rim foram pesados e os corpos lúteos contados. Foram identificados fetos
vivos, reabsorções e fetos mortos. Fetos e placentas foram pesados. Não foram
encontrados indícios clínicos de toxicidade materna. No período de trânsito tubário não
foram observadas alterações significativas no peso corporal, consumo de ração e
parâmetros hematológicos das mães. Na análise bioquímica, o grupo da dose de 4
mg/kg/dia apresentou aumento na concentração de colesterol, de TGO e de uréia. No grupo
com dose de 2mg/kg/dia ocorreu redução de creatinina e no grupo T1 houve uma redução
de TGO. No período de implantação do blastocisto, não foram observadas variações no
peso corporal entre os grupos analisados. Foi observada uma diminuição no consumo de
ração, durante o período de tratamento, que foi restabelecido com o término deste,
apresentando um aumento gradativo do consumo até o final do experimento. O tacrolimus
na concentração de 4mg/Kg/dia apresentou consumo médio superior aos demais grupos. Os
parâmetros hematológicos não apresentaram alterações significativas. Os parâmetros
bioquímicos não apresentaram alterações relevantes entre os grupos experimentais, exceto
os referentes à TGO, que apresentou uma diminuição no grupo T6. Nos estudos realizados
no período de trânsito tubário e no de implantação, observando-se o peso corporal materno
corrigido, os pesos de fígado e rins maternos, peso de ovários, número de corpos lúteos,
fetos vivos e mortos, reabsorções, peso de ninhada e perdas pré e pós-implantação, não
foram encontradas diferenças significativas. Ocorreu aumento no peso placentário dos
animais tratados com tacrolimus na concentração de 4mg/Kg/dia e no grupo tratado com a
concentração de 1mg/Kg/dia, diminuição do número de implantes. Os fetos em ambos os
experimentos não apresentaram malformações externas. Concluiu-se que no modelo
experimental utilizado não foi evidenciado potencial embriotóxico do tacrolimus na fase de
trânsito tubário e na implantação, quando administrado a ratas.
Palavras-chave: Tacrolimus, embriotoxicidade, rato; imunossupressor, gravidez,
implantação.
ABSTRACT
Tacrolimus is a macrolide antibiotic with immunosuppressive action, acting as a calcineurin
inhibitor, that has being used as a standard drug avoiding rejection of most transplants. With
the success of transplantations, which occurred mainly due to the use of immunosuppressive
drugs, there was an improvement in life quality of patients. This fact, led to an increase in the
number of gestations, even under continuous use of immunosuppressants. It is known that
these drugs cross the placenta, leading to changes in embryo development. Body weight
loss in newborns from mothers that used tacrolimus during gestation is described in
literature. However, little is known about its action on blastocyst preimplantation period, being
the aim of this work to assess if tacrolimus interferes with embryo development during tubaric
transit and blastocyst implantation periods. Pregnant Wistar rats were randomly distributed
into control C1 and C2 and treated T1, T2, T3, T4, T5 and T6. Control 1 and Treated 1, 2 and
3 received distilled water and 1, 2 and 4 mg/kg/day of tacrolimus, respectively, via oral
gavage from first to fifth pregnancy day (tubaric transit period) and groups Control 2 and
Treated 4, 5 and 6 received distilled water and 1, 2 and 4 mg/kg/day of tacrolimus
respectively, via oral gavage from fifth to seventh day (implantation period). The clinical signs
of maternal toxicity were analyzed. On 15
th
day, blood was collected for biochemical and
hematological tests assessment, after that animals were killed. Ovaries, liver and kidneys
were weighed and the corpora lutea were counted. Resorptions, live and dead fetuses were
identified. Fetuses and placenta were weighed. Clinical signs of maternal toxicity were not
found. During the period of tubaric transit there were no significant alteration in maternal
body weight, food intake and hematological parameters. In biochemical analysis, the group
treated with 4 mg/kg/day presented an increase in cholesterol, TGO and urea. In the group
treated with 2 mg/kg/day there was creatinine reduction and group T1 (1mg/kg/day) showed
reduction in TGO. In the period of blastocyst implantation it was not observed changes in
body weight among groups. There was a decrease in food intake, during the treatment
period wich was recovered after the drug administration, showing a gradative increase at
food intake until the end of the experiment. An increase in food intake in the group treated
with tacrolimus in the concentration of 4mg/Kg/day was shown. There were no significant
alterations in hematological parameters. In biochemical analysis no alterations were found,
except in the group T6 (4mg/kg/day) that presented a decrease. In the both experiments,
during the period of blastocyst implantation and the tubaric transit, there were no significant
alterations in maternal body, liver, kidney and ovaries weights. Were not observed significant
alterations in the number of corpora lutea, live and dead fetuses, resorptions, fetuses weigh
and lost in pre and pos implantation. In the groups treated with tacrolimus on the
concentrations of 4mg/kg/day and 1mg/kg/day were observed a decrease of the implants
number. The administration of Tacrolimus to pregnant rats during the tubal transit and
implantation periods does not seem to generate any toxic effect on them.
Keywords: Tacrolimus; Embryo; Toxicity; Rat; Immunosuppressor; Pregnancy; Implantation.
LISTA DE FIGURAS E QUADROS
FIGURAS
Fig. 1
Mecanismo de rejeição hiperaguda do enxerto. 20
Fig. 2
Mecanismo de rejeição aguda do enxerto 21
Fig. 3
Mecanismo de rejeição crônica do enxerto. 22
Fig. 4
Estrutura química do tacrolimus. 32
Fig. 5
Mecanismo de ação da ciclosporina (CSA) e do tacrolimus
(FK506).
33
Fig. 6
Peso corporal de ratas tratadas com água destilada (C1) e
Tacrolimus 1,0 mg/kg/dia (T1), 2,0mg/kg/dia (T2) e 4,0mg/kg/dia
(T3), do 1
0
ao 5
0
dia de prenhez
48
Fig. 7
Consumo de ração de ratas tratadas com água destilada (C1) e
Tacrolimus 1,0 mg/kg/dia (T1), 2,0mg/kg/dia (T2) e 4,0mg/kg/dia
(T3), do 1
0
ao 5
0
dia de prenhez.
49
Fig. 8
Peso corporal de ratas tratadas com água destilada (C2) e
Tacrolimus 1,0 mg/kg (T4), 2,0mg/kg (T5) e 4,0mg/kg/dia (T6), do
5
0
ao 7
0
dia de prenhez.
53
Fig. 9
Consumo de ração de ratas tratadas com água destilada e
Tacrolimus do 5
0
ao 7
0
dia de prenhez.
54
QUADRO
Quadro 1
Locais de ação de alguns imunossupressores na ativação dos
linfócitos T.
25
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Parâmetros hematológicos de ratas tratadas com água destilada
(C1) e Tacrolimus 1,0 mg/kg (T1), 2,0mg/kg (T2) e 4,0mg/kg/dia
(T3), do 1
0
ao 5
0
dia de prenhez, e no dia da eutanásia.
50
Tabela 2
Parâmetros bioquímicos de ratas tratadas com água destilada
(C1) e Tacrolimus 1,0 mg/kg/dia (T1), 2,0mg/kg/dia (T2) e
4,0mg/kg/dia (T3), do 1
0
ao 5
0
dia de prenhez, e no dia de
eutanásia.
51
Tabela 3
Peso corporal corrigido e de órgãos maternos em ratas Controles
(C1) e tratadas com Tacrolimus 1,0 mg/kg/dia (T1), 2,0mg/kg/dia
(T2) e 4,0mg/kg/dia (T3), do 1
0
ao 5
0
dia de prenhez.
52
Tabela 4
Parâmetros hematológicos de ratas tratadas com água destilada
(C2) e Tacrolimus 1,0 mg/kg (T4), 2,0mg/kg (T5) e 4,0mg/kg/dia
(T6), do 5
0
ao 7
0
dia de prenhez.
55
Tabela 5
Parâmetros bioquímicos de ratas tratadas com água destilada
(C2) e Tacrolimus 1,0 mg/kg/dia (T4), 2,0mg/kg/dia (T5) e
4,0mg/kg/dia (T6), do 5
0
ao 7
0
dia de prenhez, e no dia de
eutanásia.
56
Tabela 6
Peso de fígado, rins e ovários de ratas tratadas com água
destilada (C2) e Tacrolimus 1,0 mg/kg (T4), 2,0mg/kg (T5) e
4,0mg/kg/dia (T6), do 5
0
ao 7
0
dia de prenhez.
57
Tabela 7
Peso de ovários, número de corpos lúteos, fetos vivos e mortos
em ratas Controles (C1) e tratadas com Tacrolimus 1,0 mg/kg/dia
(T1), 2,0mg/kg/dia (T2) e 4,0mg/kg/dia (T3), do 1
0
ao 5
0
dia de
58
prenhez.
Tabela 8
Reabsorções, peso de ninhada e placenta, número de implantes,
proporção de implantação e de perdas pré-implantação em ratas
Controles (C1) e tratadas com Tacrolimus 1,0 mg/kg/dia (T1),
2,0mg/kg/dia (T2) e 4,0mg/kg/dia (T3), do 1
0
ao 5
0
dia de
prenhez.
59
Tabela 9
Peso de ovários, número de corpos lúteos, fetos vivos e mortos,
reabsorções, peso de ninhada e placenta, número de implantes e
de perdas pós-implantação em ratas Controle (C2) e Tratadas
com Tacrolimus 1,0mg/kg/dia (T4), 2,0mg/kg/dia (T5) e
4,0mg/kg/dia (T6), do 5
0
ao 7
0
dia de prenhez.
60
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS E QUADROS.............................................................................vii
LISTA DE TABELAS....................................................................................................viii
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 13
1.1 HIPÓTESE ..................................................................................................... 15
1.2 OBJETIVOS ................................................................................................... 15
2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 16
2.1 BREVE HISTÓRICO SOBRE O TRANSPLANTE DE ÓRGÃOS ........................ 16
2.2 RESPOSTA IMUNE E REJEIÇÃO NO TRANSPLANTE DE ÓRGÃOS .............. 18
2.2.1 Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) e Antígenos leucocitários
humanos (HLA) ......................................................................................................... 18
2.2.2 O papel dos linfócitos T ................................................................................ 19
2.2.3 Manifestações clínicas da rejeição ............................................................... 20
2.3 AGENTES IMUNOSSUPRESSORES ................................................................ 23
2.3.1 Corticosteróides ............................................................................................... 26
2.3.2 Muromonab – CD3 ........................................................................................... 27
2.3.3 Azatioprina ....................................................................................................... 27
2.3.4. Mofetil Micofenolato......................................................................................... 28
2.3.5. Daclizumab, Basilix ......................................................................................... 28
2.3.6. Sirolimus .......................................................................................................... 29
2.3.7. Ciclosporina ..................................................................................................... 30
2.3.8 Tacrolimus ....................................................................................................... 32
2.4 ASPECTOS GERAIS DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO .................... 40
2.4.1 Alterações do ambiente e suas conseqüências para o desenvolvimento
embrionário. .............................................................................................................. 41
3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 43
3.1 MODELO EXPERIMENTAL ................................................................................ 43
3.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL .................................................................. 43
3.3 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE MATERNA ........................................................ 46
3.4 AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO .................................. 47
3.5 PROCESSAMENTO ESTATÍSTICO .................................................................. 47
4. RESULTADOS ................................................................................................... 49
4.1 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE MATERNA ......................................................... 49
4.2 AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO ................................... 58
5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO ........................................................................... 62
5.1 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DO TACROLIMUS SOBRE O ORGANISMO
MATERNO ................................................................................................................ 62
5.2 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DO TACROLIMUS SOBRE O EMBRIÃO .......... 65
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 68
1. INTRODUÇÃO
A capacidade do organismo de reproduzir-se é essencial à sobrevivência
da espécie, mas a reprodução é um processo extremamente vulnerável aos fatores
do meio externo (MICHAL et al., 1993) e interno (CALDEYRO - BARCIA, 1981).
O desenvolvimento do concepto ocorre em microambientes localizados
na tuba e no útero. Fatores do meio externo e interno, capazes de alterar estes
ambientes, podem provocar lesões, que dependendo da gravidade causam
malformações ou até mesmo a morte do concepto.
Distúrbios relacionados ao meio ambiente causados por gases poluentes
e radiações, ou distúrbios do ambiente materno como os causados por enfermidades
diversas, pela ingestão de alimentos contaminados, drogas de abusos ou fármacos,
são causas conhecidas de malformações fetais (LEMÔNICA, 1996). A ingestão de
fármacos que atravessam a placenta é um dos fatores mais comuns de agressão ao
concepto.
Nos casos de transplantes renais são usadas drogas imunossupressoras
com o objetivo de impedir a rejeição do órgão transplantado. O uso de
imunossupressores deve ser contínuo, para que se previna a rejeição do enxerto, o
que leva à necessidade de que seja feito um aconselhamento às mulheres
transplantadas, em idade fértil, quanto a possíveis complicações na gravidez,
provocadas, em parte, pelos efeitos colaterais das drogas imunossupressoras
(LESSAN-PEZESHKI, 2002).
Entre os imunossupressores mais utilizados encontra-se o tacrolimus um
macrolídeo de ação imunossupressora potente (GOTO et al, 1987; HOOKS,1994;
PARSON; NOLAN; WYVRATT, 1993), que foi introduzido na terapêutica
imunossupressora na década de 80, revolucionando o transplante de órgãos e
diminuindo a rejeição (GARCIA et al, 2004).
O uso clínico do tacrolimus é crescente, sendo considerada, atualmente,
a droga base em mais de 80% dos transplantes hepáticos e 30% dos transplantes
renais (GARCIA et al, 2004).
Mulheres que apresentam insuficiência renal crônica tendem a
apresentar infertilidade relativa que se restabelece com o transplante renal,
melhorando a função endócrina, restabelecendo o ciclo menstrual e a fertilidade.
Com o êxito do transplante renal e com a conseqüente melhora na qualidade de vida
de portadores de doença renal tem-se observado aumento do número de gestações
em pacientes transplantadas (SOUZA, 2002).
O início da gestação, em geral, não é perceptível pela mulher, sendo
detectado apenas quando nota o atraso em sua menstruação. Nesse período o
blastocisto já está implantado e o embrião já ultrapassou toda uma etapa inicial de
desenvolvimento. Durante essa fase inicial do desenvolvimento, o embrião costuma
responder às agressões seguindo a lei do tudo ou nada: morre ou recupera-se, mas
existe a possibilidade de sobreviver com alterações cromossômicas que podem levar
a malformações (BROCAS et al, 1997; MANSON; KANG, 1994). Assim a exposição
materna ao imunossupressor, em fase precoce da gestação pode ter conseqüências
indesejáveis para o embrião.
Na literatura consultada não foram encontradas referências sobre
avaliações do efeito do tacrolimus no início da gestação, portanto, nesse projeto
pretendeu-se avaliar, experimentalmente, o efeito da exposição de ratas ao
tacrolimus, no período inicial da prenhez, de modo a contribuir para a avaliação do
risco reprodutivo do uso do fármaco.
1.1 HIPÓTESE
A exposição de ratas, ao tacrolimus, no início da prenhez interfere com o
desenvolvimento embrionário.
1.2 OBJETIVOS
Verificar se o Tacrolimus administrado a ratas gestantes interfere:
• No desenvolvimento do embrião durante o trânsito tubário;
• Na fase de implantação do blastocisto.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 BREVE HISTÓRICO SOBRE O TRANSPLANTE DE ÓRGÃOS
Segundo Druml (2002), Emerich Ullman foi responsável pela primeira
tentativa de transplante, mas não obtive êxito. Platt e Rubstein (1997), em sua
revisão, descrevem que Floresco, Carrel e Guthrie conseguiram êxito na técnica com
aloenxertos renais, sendo que o melhor resultado foi um transplante renal ortotópico,
que funcionou por cinco dias. Em 1906, Carrel e Guthrie transplantaram os dois rins
de um cão para outro, o aloenxerto funcionou por nove dias. Em 1907, Carrel
executou uma série de transplantes renais (aloenxertos) em gatos; um dos
receptores sobreviveu por trinta e um dias, os demais sobreviveram por apenas
catorze dias ou menos. Contudo, em 1908, Carrel realizou um aloenxerto renal que
manteve a vida do animal por mais de oito meses.
Os experimentos de Floresco, Carrel e Guthrie foram muito importantes,
pois representaram o marco inicial da cirurgia vascular, demonstrando pela primeira
vez que um rim removido de seu ambiente natural e reimplantado cirurgicamente
poderia funcionar, mesmo que temporariamente (PLATT; RUBSTEIN, 1997). Estes
experimentos foram analisados como a primeira demonstração de dois princípios
fundamentais do transplante de tecidos e órgãos íntegros:
(1) que auto-enxertos são quase sempre bem sucedidos, ao passo que
aloenxertos entre indivíduos aleatórios de uma mesma raça como doadores e
receptores, são quase sempre rejeitados;
(2) essa rejeição se desenvolve mais rapidamente que as respostas
imunes convencionais (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Na década de 60, foram realizados os primeiros transplantes com
doadores não-aparentados, devido à utilização da azatioprina, um fármaco
imunossupressor capaz de minimizar os efeitos do transplante (FURMAN et
al.,1999). Já nos anos 80, a sobrevida dos transplantados teve um aumento
substancial devido ao aparecimento da ciclosporina (ARMENTI, 2004).
Ao longo dos últimos anos, houve avanço no êxito de transplantes renais,
com aumento significativo na sobrevida do enxerto e do paciente a curto e em longo
prazo. Vários fatores contribuíram para este resultado, entre eles, o aprimoramento
da técnica cirúrgica, avanço nas técnicas de exames imunológicos para seleção de
doador, conhecimento mais detalhado do mecanismo de rejeição através da biologia
molecular, descoberta de potentes agentes antimicrobianos utilizados nos
tratamentos das infecções e o aparecimento de novas e poderosas drogas
imunossupressoras.
O marco inicial do progresso no resultado dos transplantes se deu na
década de 80, com a liberação do uso de ciclosporina (ARMENTI, 2004). A partir
deste evento, uma série de novos fármacos, imunossupressores vêm sendo
pesquisados, alguns já em uso clínico e outros ainda em fase de estudo
experimental e pré-clínica. Devido ao número de fármacos disponíveis, a
imunossupressão atual é individualizada para cada tipo de transplante, baseando-se
nas variáveis do receptor e do doador de órgãos.
2.2 RESPOSTA IMUNE E REJEIÇÃO NO TRANSPLANTE DE
ÓRGÃOS
2.2.1 Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) e Antígenos
leucocitários humanos (HLA)
O sucesso de qualquer transplante está na capacidade de controlar a
resposta imune, permitindo a adaptação do transplante e evitando a sua rejeição. Os
principais genes responsáveis pelo reconhecimento de antígenos externos, o
complexo principal de histocompatibilidade (MHC), estão localizados no braço curto
do cromossoma 6. Nos seres humanos, estes genes codificam várias proteínas da
superfície da membrana celular. Estes aloantígenos são conhecidos como antígenos
leucocitários humanos (HLA – Human leukocyte antigens) e o seu elevado
polimorfismo permite ao sistema imunológico reconhecer antígenos próprios e não-
próprios. Os genes MHC podem ser divididos em duas classes: o MHC I e MHC II
(KINDT, GOLDSBY, OSBORNE, 2006).
O MHC da classe I (HLA-A, HLA-B e HLA-C) encontra-se em
praticamente todas as superfícies celulares. Esta classe de MHC reconhece
antígenos protéicos externos, incluindo tecidos transplantados e são reconhecidos
por linfócitos T com especificidade antigênica. As moléculas de classe I são
reconhecidas por linfócitos T citotóxicos ou CD8+ (KINDT, GOLDSBY, OSBORNE,
2006).
Por outro lado, o MHC de classe II (HLA-DR, HLA-DP e HLA-DQ)
encontra-se apenas em células que apresentam antígenos (APC – antigen-
presenting cells) como os linfócitos B, macrófagos e células dendríticas. Acredita-se
que o MHC de classe II desempenha o papel predominante na resposta
imunológica inicial a antígenos de tecidos transplantados. Ao entrarem em contato
com um antígeno não-próprio, os HLA de classe II apresentam este antígeno aos
linfócitos Th (helper ou CD4+) que, por sua vez, sofrem uma expansão clonal
através da produção de citocinas reguladoras (KINDT, GOLDSBY, OSBORNE,
2006).
2.2.2 O papel dos linfócitos T
O processo de reconhecimento de antígenos transplantados é conhecido
como alorreconhecimento e poderá ocorrer por duas vias distintas. A via direta
envolve receptores nos linfócitos T do hospedeiro que reconhecem antígenos
ligados nas células do órgão transplantado. A via indireta requer uma célula
apresentadora de antígeno (APC) que processa o antígeno e o apresenta às células
CD4+. A interação entre os linfócitos T e a APC é um processo complexo que resulta
na ativação de vias de sinalização celular. Porém, a apresentação do antígeno por
si só não é suficiente para ativar os linfócitos T. Um segundo sinal, independente do
antígeno, é necessário e poderá ser dado através de várias moléculas acessórias
como a B7 (molécula co-estimuladora), moléculas de adesão intercelular (ICAMs) ou
o ligando ao CD28 (KINDT, GOLDSBY, OSBORNE, 2006).
Uma vez feito o reconhecimento, ocorre uma importante cascata de
eventos ao nível celular. A proteína quinase C é uma enzima responsável pela
fosforilação de várias proteínas, resultando na liberação de cálcio intracelular
ionizado. Este cálcio intracelular vai ligar-se a uma proteína reguladora dependente
de cálcio, a calmodulina, formando um complexo que irá ativar outras fosfatases, em
particular a calcineurina. Esta proteína desempenha um papel importante na
ativação da transcrição do gene da Interleucina 2 e vai desfosforilar o fator nuclear
de linfócitos T ativados (NFAT- nuclear factor of activated T cells). O NFAT
desfosforilado migra do citoplasma para o núcleo e adere a locais promotores,
induzindo a produção de citocinas. Estas citocinas ativam outros linfócitos T,
resultando na destruição do órgão transplantado. Isto resume o processo de rejeição
(KINDT, GOLDSBY, OSBORNE, 2006).
Após a sua estimulação, os linfócitos Th (CD4+) produzem uma citocina
importante, a interleucina–2 (IL-2), que funciona não só como sinalizador de outros
linfócitos T helper e citotóxicos (CD8+), como também vai promover a expansão
clonal de linfócitos T, conduzindo a resposta imune. Outras citocinas como o
interferon – gama, também são produzidas (KINDT, GOLDSBY, OSBORNE, 2006).
2.2.3 Manifestações clínicas da rejeição
A rejeição de um enxerto depende do reconhecimento do mesmo como
estranho pelo organismo do indivíduo receptor, ativando tanto a resposta imune
humoral como a celular (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Podem ocorrer três tipos principais de rejeição: hiperaguda, aguda e
crônica. Independentemente do tipo de rejeição, o que ocorre é a disfunção do
enxerto levando a quadros de febre, hipertensão, edema ou aumento súbito de
peso, mudança no ritmo cardíaco, falta de ar, dor e sensibilidade no local do
transplante. (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Rejeição hiperaguda
Ocorrendo minutos ou dias após o transplante, a rejeição hiperaguda
deve-se à reação dos anticorpos IgG contra a classe I do HLA no órgão
transplantado. A função do órgão perde-se como resultado da deposição de
anticorpos, ativação do complemento e destruição vascular. Os transplantes renais
são muito susceptíveis à rejeição hiperaguda. Atualmente, este tipo de rejeição pode
ser evitada detectando-se o anticorpo com reação cruzada antes do transplante.
(KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Fig. 1. Mecanismo de rejeição hiperaguda do enxerto. Nas rejeições celulares hiperagudas,
os anticorpos formados anteriormente, reagem com os aloantígenos no endotélio vascular
do enxerto, ativam o complemento e desencadeiam uma trombose intravascular e necrose
da parede do vaso. Fonte: Abbas ; Lichtman (2003).
Rejeição aguda
A rejeição aguda é a mais comum, ocorrendo freqüentemente nos
primeiros 6 meses após o transplante. Após seis meses, o corpo adapta-se ao novo
órgão e a rejeição aguda é menos provável. Este tipo de rejeição é mediada por
linfócitos T, que infiltram o enxerto, sofrem expansão clonal e causam destruição de
tecidos. As drogas imunossupressoras são muito eficazes na prevenção deste tipo
de rejeição. (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Fig. 2. Mecanismo de rejeição aguda do enxerto. Neste tipo de rejeição, os linfócitos T CD8
+
reativos com o os aloantígenos das células endoteliais e parenquimatosas do enxerto
causam dano a esses tipos celulares. Os anticorpos alorreativos também podem contribuir
para a lesão vascular. Fonte: Abbas ; Lichtman (2003).
Rejeição crônica
Rejeição crônica é o termo usado quando a função do enxerto se
deteriora lentamente, existindo evidências histológicas de hipertrofia e fibrose. Pode
ocorrer em todos os tipos de transplante de órgãos. (KUMAR; ABBAS; FAUSTO,
2005).
Em todos os órgãos a fisiopatologia é semelhante: hipertrofia
progressiva das artérias pequeno-médias que acaba por levar a fibrose intersticial,
atrofia e eventual falha no transplante. Apesar de a rejeição crônica ocorrer mais
tarde no período pós-tranplante, pode desenvolver-se seis a 12 meses após o
transplante. (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Fig. 3. Mecanismo de rejeição crônica do enxerto. Na rejeição crônica com arteriosclerose
do enxerto, as células T reativas com os aloantígenos do enxerto podem produzir citocinas
que induzem a proliferação das células endoteliais e as células do músculo liso, levando à
oclusão luminal. Fonte: Abbas; Lichtman, 2003.
2.3 AGENTES IMUNOSSUPRESSORES
O transplante de órgãos envolve cinco princípios fundamentais que
contribuem para a minimização da rejeição ao tecido transplantado.
Em primeiro lugar a preparação adequada dos pacientes e a seleção do
melhor doador HLA (antígenos do complexo principal de histocompatibilidade no
humano) e ABO compatível à disposição para doação do órgão (JANEWAY;
WALPORT; SHLOMCHIK, 2002).
Em segundo lugar, é usada uma abordagem multisequencial da terapia
farmacológica imunossupressora. Vários agentes são utilizados ao mesmo tempo,
cada um voltado para um diferente alvo molecular da resposta ao aloenxerto
(Quadro 1) (HONG; KAHAN, 2000).
O terceiro deles é assegurar a implantação imediata do enxerto e/ou
tratar a rejeição já estabelecida com imunossupressão mais intensa do que a
utilizada em longo prazo. Sendo assim, são utilizados protocolos de indução
intensiva e manutenção com doses mais baixas.
O princípio seguinte trata da investigação de cada episódio de disfunção
do transplante, incluindo avaliação para rejeição, efeitos tóxicos de fármacos e
infecção.
O último princípio implica na redução ou interrupção do uso do agente
terapêutico quando seus efeitos tóxicos forem maiores que seu benefício.
Os imunossupressores são agentes que suprimem o sistema imune e por
isso desempenham um importante papel na manutenção de enxertos de órgãos e
tecidos. As principais classes de fármacos usados hoje são: os glicocorticóides, os
inibidores da calcineurina e os agentes antiproliferativos/antimetabólicos. Os
resultados clínicos obtidos por estes fármacos têm sido bastante significativos no
tratamento da rejeição imune aguda de órgãos transplantados. Entretanto, os
imunossupressores devem ser usados por toda a vida e acabam suprimindo
inespecificamente todo o sistema imune, expondo os pacientes a riscos maiores de
infecções e câncer (KRENSKY; STROM; BLUESTONE, 2003).
No Quadro 1, destacam-se os principais imunossupressores utilizados na
terapia de prevenção e/ou resgate da rejeição e seus respectivos mecanismos de
ação:
Quadro 1
Locais de ação de alguns imunossupressores na ativação dos linfócitos T.
FÁRMACO LOCAL DE AÇÃO
Glicocorticóide Elementos de resposta aos glicocorticóides
no DNA (regulação da transcrição dos genes)
Muromonab-CD3
Complexo receptor das células T (bloqueio do
reconhecimento dos antígenos)
Azatioprina Ácido desoxirribonucléico (incorporação de
Nucleotídeos falsos)
Mofetil micofenolato Monofosfato de iosina desidrogenase (inibição
da atividade)
Daclizumab, basiliximab Receptor da Interleucina-2 (bloqueio da ativação das
Células T mediada pela Interleucina-2)
Sirolimus Cinase protéica envolvida na progressão do ciclo
Celular (mTOR) (inibição da atividade)
Ciclosporina Calcineurina (inibição da atividade da fosfatase)
Tacrolimus Calcineurina (inibição da atividade da fosfatase)
Fonte: KRENSKY; STROM; BLUESTONE (2003).
2.3.1 Corticosteróides
Os corticosteróides são agentes antiinflamatórios e têm efeitos a vários
níveis da resposta imunológica. Usados desde o inicio dos anos 60, acredita-se que
bloqueiam a produção de interleucinas 1, 2 e 6 pelas células apresentadoras de
antígenos. Estas drogas são normalmente dadas aos pacientes de transplantes
juntamente com um inibidor mitótico, como por exemplo, a azatioprina, para prevenir
a rejeição aguda. Os efeitos adversos dos corticosteróides incluem a hipertensão,
hiperlipidemia, doença da úlcera, diabetes, obesidade, catarata, osteoporose e
susceptibilidade a infecções. À maioria dos pacientes de transplantes são
administradas doses baixas de corticosteróide na duração de vida do transplante
(TAYLOR, WATSON, BRADLEY, 2005).
2.3.2 Muromonab – CD3
Anticorpo monoclonal anti–CD3 que exerce efeitos imunossupressivos
induzindo a diminuição periférica de células T e modulação do complexo receptor de
células T (CD3/Ti). A imunoglobulina G purificada bioquimicamente é obtida através
da fusão de células do mieloma de ratos com linfócitos oriundos de animais
imunizados para produzir hibridomas que secretam anticorpos específicos para
antígenos T3 (CD3) de linfócitos T de humanos. É frequentemente usado como um
agente imunossupressor em transplantes. (TAYLOR, WATSON, BRADLEY, 2005).
2.3.3 Azatioprina
É um potente inibidor mitótico sendo normalmente administrada
imediatamente antes e depois do transplante, diminuindo a proliferação dos linfócitos
T em resposta aos aloantígenos do transplante. A azatioprina atua na célula durante
a fase S do ciclo celular. É convertida em 6-mercaptopurina dentro das células
inibindo a produção de adenosina monofosfato (AMP) e guanina monofosfato
(GMP), atrasando a proliferação celular (TAYLOR, WATSON, BRADLEY, 2005).
2.3.4. Micofenolato Mofetil
O micofenolato mofetil (MMF) é uma pró-droga éster do imunossupressor
ácido micofenólico (MPA), que age como um inibidor potente e reversível da inosina
monofosfato desidrogenase (IMPDH), enzima chave na síntese de purinas de novo
dos linfócitos T e B em proliferação. O MPA age como um inibidor específico para os
linfócitos humanos cuja proliferação é interrompida na fase S do ciclo celular, já que
outros tipos celulares apresentam vias alternativas para a síntese de purinas e não
bloqueadas pelo MPA (TÖNSHOFF, 1999; TAYLOR, WATSON, BRADLEY, 2005).
2.3.5. Daclizumab, Basiliximab
São anticorpos monoclonais anti-receptores de interleucina 2 (IL-2R), ou
seja, que bloqueiam a fixação da interleucina-2 no receptor do linfócito ativado,
impedindo sua proliferação. Portanto, atuam em sinergismo com as drogas
imunossupressoras inibidoras da calcineurina (VINCENTI et al, 1998; TAYLOR,
WATSON, BRADLEY, 2005).
Estudos multicêntricos mostraram que estes anticorpos, quando
associados a esquema de imunossupressão tríplice com a ciclosporina, a azatioprina
e a prednisona, reduzem em 30% os episódios de rejeição aguda nos seis primeiros
meses de transplante renal. Além disso, diminuem a incidência de rejeições agudas
esteróide-resistentes (KAHAN, RAJAGOPALAN, 1999, TAYLOR, WATSON,
BRADLEY, 2005).
Os anticorpos bloqueadores da interleucina-2 podem ser quiméricos
(humano/murino) como o basiliximab (Simulect
®
), ou humanizados, como o
daclizumab (Zenapax
®
). O anticorpo humanizado tem a vantagem de não induzir à
produção de anticorpo anti idiotipo e ter ação mais prolongada do que o quimérico,
além de não causar reação de hipersensibilidade. São utilizados antes e logo após o
transplante, com ação farmacológica que perdura durante 30 a 45 dias (basiliximab)
ou até 90 dias (daclizumab) (KIRKMAN et al, 1991; TAYLOR; WATSON; BRADLEY;
2005).
2.3.6. Sirolimus
É um antibiótico macrolídeo do fungo Streptomyces higroscopicus
encontrado na ilha Rapa Nui, com potente atividade imunossupressora e anti-
proliferativa. Penetra livremente nas células, unindo-se à mesma imunofilina do
tacrolimus (FKBP12). Este complexo sirolimus-FKBP12 não inibe a calcineurina,
mas bloqueia o sinal de transdução de uma proteína denominada mTOR
(mammalian target of rapamycin), essencial para a proliferação dos linfócitos durante
o ciclo celular. Sua atividade imunossupressora é exercida tardiamente no ciclo
celular quando comparada a ciclosporina e tacrolimus levando a sua interrupção no
final da fase G1, imediatamente antes da entrada na fase S (ETTENGER; GRIMM;
2001; TAYLOR; WATSON; BRADLEY, 2005). Agem como inibidores do sinal de
proliferação de crescimento das células musculares lisas e linhagens
hematopoiéticas. Em modelo pré-clínico o sirolimo foi capaz de reduzir a incidência e
severidade de rejeição aguda quando associado a ciclosporina e tacrolimus, porém
com efeito inesperado no que se refere a função renal, na medida em que pacientes
em uso de sirolimo apresentaram valores maiores de creatinina ao final do
tratamento (OELLERICH et al, 2004; TAYLOR, WATSON, BRADLEY, 2005).
2.3.7. Ciclosporina
A Ciclosporina (CSA), potente imunossupressor, é um decapeptídeo
fúngico originado do Tolypocladium inflatum (BOREL, KIS 2001) e foi introduzido na
década de 70 para provável uso em transplante de órgãos sólidos (SCHUTZ et al,
1998). No entanto, seu uso efetivo ocorreu em 1983 no European Multicenter Trial
Group e, a partir desta data, vem melhorando substancialmente a sobrevida de
doentes, pacientes submetidos a transplantes cardíaco, renal, hepático, pancreático
e pulmonar (MCMILLAN, 1989).
O mecanismo de ação da ciclosporina é muito semelhante ao do
tacrolimus . Ambos formam complexos com suas respectivas imunofilinas (ciclofilina
e FKBP-12) e o complexo droga-receptor inibe a atividade fosfatase da calcineurina,
uma enzima cálcio-calmodulina dependente, levando a redução na produção de
interleucina 2 (IL-2). In vitro, o tacrolimus é 10 a 100 vezes mais potente que a
ciclosporina (DUNN et al, 2001; SCOTT et al, 2003; TAYLOR; WATSON; BRADLEY;
2005).
A ciclosporina e o tacrolimus são extensamente metabolizados pelo
fígado e mucosa intestinal através das isoenzimas do CYP3A4 e da glicoproteína P.
Sendo assim, várias drogas metabolizadas pelo mesmo sistema podem alterar sua
farmacocinética, pela inibição competitiva ou indução. Tal fator é extremamente
importante na prática clínica diária. Por exemplo, drogas bastante empregadas como
os anti-fúngicos, anti-bacterianos, aumentam bastante os níveis dos inibidores de
calcineurina. (DUNN et al, 2001).
Apesar das semelhanças entre ambos, existem algumas diferenças na
incidência de efeitos colaterais. Por exemplo, a ciclosporina associa-se à ocorrência
bastante freqüente de hiperplasia gengival e hipertricose, efeitos colaterais
revertidos com a mudança para tacrolimus, aspecto bastante relevante na população
de adolescentes (DUNN et al, 2001; SCOTT et al, 2003). Também foi observado que
a prevalência de hipertensão e hiperlipidemia é menor com tacrolimus, quando
comparado a ciclosporina.
Estudos publicados na fase inicial de introdução do tacrolimus sugeriam
aumento na incidência dos casos de diabetes mellitus e doença linfo-proliferativa
pós-transplante, provavelmente decorrente da alta exposição inicial do paciente a
droga, então empregada em níveis sanguíneos acima dos níveis atualmente
propostos. De fato, estudos mais recentes randomizados demonstraram incidência
semelhante de diabetes mellitus (TANABE, 2003; TROMPETER, 2002; SCOTT et
al., 2003) e doença linfo-proliferativa entre ambos (DUNN et al., 2001; SCOTT et al.,
2003; TANABE, 2003).
Estudos recentemente publicados indicam ser a imunossupressão com
tacrolimus mais eficaz quando comparada a CSA micro emulsão no que se refere à
sobrevida do enxerto, incidência e severidade de rejeição aguda, função renal ao
longo prazo, bem como rejeições córtico-resistentes (TROMPETER et al., 2002;
NEU et al., 2003; KARI, TROMPETER, 2004). Outra forma de emprego do
tacrolimus, não aplicável à ciclosporina, é na terapia de resgate dos episódios de
rejeição aguda (SCOTT et al., 2003).
2.3.8 Tacrolimus
O tacrolimus foi descoberto em 1987 pelos japoneses T. Goto, T. Kino e
H. Hatanaka, encontrado em fungos presentes em solo japonês e é produzido a
partir de um tipo de bactéria, Streptomyces tsukubaensis. Seu nome é devido a
“Tsukuba macrolide immunosuppressant’ (KINO et al., 1987). É um antibiótico
macrolídio que possui fórmula C
44
H
69
O
12
, massa molecular de 804,018 g/mol (Figura
4), que possui potente atividade imunossupressora e anti-proliferativa (HOOKS,
1994). Não é um antimetabólito, ou seja, análogo estrutural (GOTO et al., 1987).
Produzido pela empresa Astellas Pharma Inc. e foi liberado pelo Food
and Drug Administration (FDA) em 1994 para uso em transplante de fígado, mas é
usado também para transplantes de rim, coração, pâncreas e outros.
É altamente lipofílico e apresenta uma farmacocinética variável. Após
administração oral, sua absorção é pobre e incompleta, embora não seja
influenciada pela bile o que representa uma vantagem particular dessa droga no
transplante hepático. Sua concentração máxima é alcançada em 60 minutos, depois
é distribuído pelo organismo ligado à proteínas plasmáticas e hemácias e
posteriormente, sofre metabolização resultando mais de quinze metabólitos. A meia-
vida de eliminação é de cerca de dez horas, sendo maior em crianças e reduzida na
presença de severa disfunção hepática (HOMBO et al, 1987; HOOKS, 1994).
Fig. 4. Estrutura química do Tacrolimus. Fonte: KRENSKY; STROM; BLUESTONE (2003).
Como já mencionado, o uso clínico do Tacrolimus é crescente, sendo
considerada atualmente a droga base em mais de 80% dos transplantes hepáticos e
30% dos transplantes renais (GARCIA et al., 2004). Hoje também é utilizado para
tratamento de dermatite atópica e do vitiligo entre outros distúrbios dermatológicos
(CALLES; CASADO; PINTO, 2005)..
Embora sua estrutura seja diferente, tem ação semelhante à ciclosporina.
Atua inibindo a ativação das células T, bloqueando a calcineurina (GARCIA et al.,
2004).
Mecanismo de ação
O Tacrolimus (FK506) não atua “intrinsecamente” como
imunossupressor, ele “adquire função” quando se liga a uma proteína intracelular
(FKBP-12), que é uma imunofilina relacionada estruturalmente com a ciclofilina.
Logo em seguida é formado um complexo FBK-12-tacrolimus, cálcio, calmodulina e
calcineurina, como resultado ocorre à inibição da atividade da fosfatase desta última
enzima. A inibição da fosfatase impede a desfosforilação e a translocação nuclear
do NFAT que está envolvido na síntese de interleucinas, como a interleucina 2, pelas
células T ativadas. Com a inibição da fosfatase citoplasmática,ocorre a inibição da
ativação dos linfócitos T (PLOSKER; FOSTER, 2000).
Fig. 5. Mecanismo de ação da ciclosporina (CSA) e do tacrolimus (FK506). A ciclosporina e
o tacrolimus ligam-se às imunofilinas ciclofilina e proteína de ligação do FK506 (FKBP-12 –
fk-binding protein isoenzyme 12), respectivamente, formando um complexo que se liga à
calcineurina fosfatase e inibe a desfosforilação catalisada pela calcineurina (CaN), que é
essencial a transferência do fator nuclear das células T ativadas (NFAT) para dentro do
núcleo. O NFAT é necessário à transcrição da interleucina 2 e outras citocinas associadas
ao crescimento e à diferenciação (linfocinas). NF-Atc – Componente citoplasmático do fator
nuclear de linfócito T ativado; NF-Atn – Componente nuclear do fator nuclear de linfócito T
ativado. Fonte: STEPKOWSKI (2000.)
Estudos multicêntricos têm demonstrado que essa droga, quando
associada à azatioprina e ao micofenolato mofetil, diminui a incidência de rejeição
aguda nos seis primeiros meses de transplante renal (PIRCH et al., 1997; MAYER et
al.,1997; KNOLL; BELL,1997; JONHSON et al., 2000). Sua eficácia tem sido
demonstrada como tratamento de resgate da rejeição aguda resistente ao
tratamento convencional (VICENTI ; JENSI; FILO, 2002).
As doses orais iniciais recomendadas são de 0,2 mg/kg/dia para
pacientes adultos que receberam transplantes renais. Em geral pacientes
pediátricos, comparados com os adultos, necessitam de doses maiores. Estas doses
são administradas por longos períodos para a manutenção do enxerto (SHAPIRO,
1998).
Efeitos colaterais
Os efeitos colaterais são freqüentes, especialmente disfunção renal,
hiperglicemia e distúrbios neurológicos e mentais (VENKATARAMANAN, et al.,
1991).
O risco de ocorrência de infecções bacterianas, virais, fúngicas e por
protozoários está aumentado em relação à população geral. Podem ocorrer novas
infecções, localizadas ou generalizadas, ou infecções em curso podem ser
agravadas após o uso desta droga (STAATZ, et al., 2001).
O tacrolimus altera a hemodinâmica glomerular com redução da filtração,
alteração em características histológicas caracterizadas pela presença de
vacuolização tubular, fibrose intersticial e hialinose e com seu uso contínuo e em
altas doses leva à nefrotoxicidade (BARROS et al., 1987).
Disfunções renais agudas ou crônicas podem se manifestar por
insuficiência renal aguda e crônica, síndrome hemolítico-urêmica, hematúria,
proteinúria, hidronefrose e glomerulopatias diversas (SCOTT, et al., 2003).
Hiperglicemia e diabete insulino-dependente ocorrem em até 30% dos
pacientes. Na maioria dos casos, ocorre melhora com a redução da dose dos
imunossupressores (SCOTT, et al., 2003).
Efeitos sobre o sistema nervoso central são igualmente freqüentes,
especialmente tremores, cefaléia e parestesias. Quase sempre, esses efeitos
limitam pouco as atividades cotidianas e respondem à redução da dose do fármaco.
Convulsões não são raras, especialmente se coexiste infecção no sistema nervoso
central ou se outras drogas neurotóxicas são co-administradas (ganciclovir
eimipenem, principalmente). Pode ocorrer agitação, ansiedade, labilidade emocional,
confusão mental, depressão ou euforia, distúrbios da cognição, pesadelos, insônia,
sonolência, vertigem, enxaquecas, mioclonias, amnésia e neuropatias periféricas
(FRIEMANN, et al., 1998; SCOTT, et al., 2003).
A literatura relata a ocorrência de leucoencefalopatia fatal em uma
mulher de 37 anos com 12 semanas de transplante cardíaco fazendo uso do
tacrolimus. A hipótese é que a neurotoxicidade está associada à diminuição da
barreira hematoencefálica (KACSMARECK et al., 2003).
A hipertensão arterial sistêmica não é rara após o transplante de fígado,
podendo ser desencadeada ou agravada pelo tacrolimus. Alguns casos de
cardiomiopatia hipertrófica, principalmente em crianças, que desaparece com a
interrupção do uso do medicamento, têm sido descritos. Distúrbios do ritmo
cardíaco, infarto agudo do miocárdio, fenômenos tromboembólicos, entre outros,
foram atribuídos ao fármaco, em casos isolados (FRIEMANN, et al., 1998).
Anemia, leucopenia ou leucocitose, plaquetopenia, pancitopenia,
eosinofilia, alargamento dos tempos de protrombina e tromboplastina podem ocorrer.
Tromboses, sangramentos de vísceras e púrpura trombocitopênica trombótica foram
descritos. Síndromes linfoproliferativas podem ocorrer, especialmente em crianças
infectadas pelo vírus Epstein Barr, através do enxerto ou de hemoderivados
administrados durante ou após o transplante (SCOTT, et al., 2003).
Hipercalemia, hipomagnesemia e hiperuricemia são as alterações
hidroeletrolíticas mais freqüentes. Foram relatadas a ocorrência de hipocalemia, hipo
ou hipernatremia, hipo ou hiperfosfatemia, aumento da amilase e da creatina
fosfoquinase e alterações do equilíbrio ácido-base (SCOTT, et al., 2003).
Náuseas, vômitos, diarréia e alterações das enzimas hepáticas também
foram descritos. (ASTELLAS PHARMA US INC. 2005).
Febre, artralgias, mialgias, câimbras, astenia, ginecomastia, alopécia,
prurido, catarata, fotofobia, diplopia, glaucoma, nistagmo e distúrbios da audição
foram relatados (JANSSEN-CILAG FARMACÊITICA LTDA., 2000).
Casos isolados de insuficiência hepática aguda, cirrose e necrose
hepática, pancreatite aguda, fibrose pulmonar eosinofílica, alcalose respiratória,
entre outros efeitos incomuns foram descritos .
Tacrolimus e Reprodução
O Tacrolimus é transferido através da placenta (SATCHELL, et al., 2000),
sendo recomendado seu uso durante a gravidez, somente se o benefício para mãe
justificar o risco potencial ao feto, já que estudos com animais demonstraram que
este fármaco pode ser teratogênico (ALBENGRES; LE LOUET; TILLEMENT, 1997),
levando a alterações no desenvolvimento do embrião (LEMÔNICA, 1996).
Jabiry-Zienniewicz et al. (2006), relataram sucesso em quatro gestações
pós-transplante hepático, onde as pacientes estavam utilizando o tacrolimus. Não
foram observados abortos espontâneos e só houve um episódio de rejeição aguda
em 23 semanas de gestação, mas que foi atribuído ao fato da paciente ter
interrompido o uso do tacrolimus, o que não foi considerado como uma complicação
decorrente da gravidez. A complicação mais comum foi o nascimento prematuro com
baixo peso corporal. Não foram observadas malformações estruturais nos recém-
nascidos.
Estudos semelhantes foram realizados por Gutiérrez et al. (2005) que
observaram 43 gestações em 35 pacientes que haviam sofrido transplante renal e
que apresentavam funcionamento normal dos mesmos. Houve 19 abortos, sendo
nove espontâneos e dez, como indicação terapêutica devido às complicações
maternas apresentadas. No total foram 24 gestações bem sucedidas, das quais
oitogestações resultaram em nascimentos prematuros. A hipertensão arterial
maternal foi a complicação mais observada, a preeclampsia ocorreu em nove
gestações. Nenhum episódio de rejeição aguda foi observado.
Em estudos realizados em ratos e coelhos, foram observados efeitos
adversos, quando foram utilizadas dosagens elevadas que foram tóxicas para as
fêmeas. Foi associado à toxicidade materna quando administrado por via oral em
doses de 0,32 e 1 mg/kg de tacrolimus durante o período de organogênese em
coelhos e ainda ao aumento do número de abortos. Quando administrados a ratas,
durante a organogênese, também na dosagem de 1,0 a 3,2 mg/kg (equivalente a
0,7-1,4 e 2,3-4,6 vezes a faixa de dose clínica recomendada baseada na adequação
para a área da superfície corporal) por via oral, ocasionou toxicidade materna,
aumento na reabsorção tardia, decréscimo no número de nascimentos vivos e
diminuição no peso e na viabilidade dos filhotes (GEWIRTZ; SITARAMAN, 2002).
Não foram encontradas referências sobre os efeitos do tacrolimus no período entre a
fertilização e a etapa de implantação do blastocisto.
2.4 ASPECTOS GERAIS DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO
O desenvolvimento do mamífero tem início na fertilização, que culmina
com a união dos pró núcleos feminino e masculino resultando na formação do
zigoto, que ocorre normalmente na tuba uterina. Durante o percurso pela tuba
uterina em direção ao útero, o zigoto sofre a clivagem sucessiva que origina a
mórula e logo em seguida leva ao desenvolvimento do blastocisto precoce, estrutura
que apresenta espaços entre os blastômeros internos (MOORE; PERSAUD, 2004)
O blastocisto se desenvolve através do aparecimento de cavitação entre
os blastômeros da mórula. A princípio, quando a cavidade é rudimentar, o blastocisto
é denominado de precoce ou inicial, e pode ser encontrado na tuba uterina, próximo
a junção útero tubária, mas freqüentemente se encontra no útero (SOUZA;
GUERRA; PETERS, 1997; MOORE; PERSAUD, 2004). Logo em seguida, a
cavidade existente entre os blastômeros é ampliada dando origem ao blastocisto
expandido, que apresenta estrutura que consta de trofoectoderma – camada celular
externa; blastocele – cavidade interna - e maciço celular interno – aglomerado de
células, agrupadas em um dos pólos. A zona pelúcida desaparece quando da
implantação (MOORE; PERSAUD, 2004).
A fase que antecede a implantação, fase pré-implantação, representa um
período de autonomia relativa do embrião. Nesta fase o embrião não depende
apenas da circulação materna, mas necessita das secreções tubárias para sua
manutenção e desenvolvimento e ainda de secreções autócrinas (O’NEILL, 1998).
Para que o blastocisto se desenvolva passando da fase inicial, ele
precisa implantar-se no útero. Sua implantação é decorrente de uma série de
interações bioquímicas e físicas entre o blastocisto e o útero, onde ocorre um
contato íntimo com o endométrio (ACOSTA, 1994), que permite um intercâmbio de
nutrientes e material de descarte (PARR; PARR, 1989).
No ser humano, a implantação do blastocisto se faz na região posterior e
superior do útero enquanto que no rato, ocorre na região mesometrial do útero
(MAGANHA; PETERS; GUERRA, 2002).
2.4.1 Alterações do ambiente e suas conseqüências para o desenvolvimento
embrionário.
Na fase de pré-implantação, o embrião parece estar mais susceptível à
letalidade do que à teratogenicidade. Segundo a World Health Organization
(WHO,1984), durante a fase de pré-implantação, período entre a concepção e a
implantação, o blastocisto parece ser muito sensível a ações de substâncias
químicas, resultando em nenhum efeito ou em morte do blastocisto.
A resposta decorrente da toxicidade em humanos é o aborto espontâneo,
dos quais cerca de 50% não são percebidos pela mulher (SHAPIRO; BROSS, 1980).
Calcula-se que cerca de 10 a 20% das gestações terminem em aborto
(MANSON; KANG, 1994, MOORE; PERSAUD, 2004), determinando algum tipo de
seleção natural, pois se sabe que mais de 90% dos fetos com malformações são
abortados no início da gestação e que 60% dos abortos que ocorrem no primeiro
trimestre da gestação têm anormalidades cromossômicas (WHO, 1984, BYRNE et
al., 1985 apud HOLMES, 1994).
Outros fatores, que interfiram com a produção hormonal adequada, com
o ambiente químico uterino ou secreção de substâncias tóxicas no ambiente uterino
podem resultar na morte do embrião. Segundo Lemônica (1996), a ingestão de
drogas de abuso, alimentos contaminados ou fármacos, são causas conhecidas de
malformações fetais, como exposto anteriormente.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MODELO EXPERIMENTAL
Foram usadas 120 ratas Wistar (Rattus norvegicus, Berkenhout,1769),
nulíparas, com três meses de idade, pesando entre 190 e 230g, obtidas no Biotério
do Centro de Biologia da Reprodução – Universidade Federal de Juiz de Fora.
As fêmeas foram inseminadas usando-se machos de fertilidade
comprovada. A presença de espermatozóide no esfregaço vaginal realizado na
manhã do dia seguinte ao acasalamento, foi tomada como constatação da
inseminação e considerou-se este, o 1
0
dia de prenhez (TONG et al., 2000, ROUT;
ARMANT, 2002).
3.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
As ratas inseminadas foram mantidas em gaiolas de polipropileno,
providas de camas de maravalha selecionada; com mamadeira para água filtrada e
cocho para ração do tipo peletizada. Para suprir a necessidade energética dos
animais foi disponibilizado, em média, 25g de ração e 50ml de água por dia
(Canadian Council on Animal Care. Guide to the care and use of experimental
animals, 1996).
As gaiolas permaneceram em estantes climatizadas onde são
controladas temperatura e ventilação. A iluminação da sala é mista, natural e
lâmpadas incandescentes, sendo as últimas controladas automaticamente para
acenderem às 6:00 e apagarem às 18:00 horas.
As ratas inseminadas foram distribuídas aleatoriamente em dois grupos
GI e GII contendo 60 animais cada que foram submetidos aos procedimentos do
Experimento I e II, respectivamente:
Experimento I – Avaliação do período de pré-implantação (trânsito tubário)
Os animais do Grupo GI foram subdivididos em 4 grupos, sendo um
controle (C1) e 3 tratados (T1, T2 e T3).
Os animais do grupo Controle (C1) receberam 0,5 ml de água destilada
administrada por via intragástrica, duas vezes ao dia, com intervalo de 12 horas.
Os animais do grupo tratado (T1, T2 e T3) receberam tacrolimus diluído
em 0,5 ml de água destilada nas doses: dose 1 (1mg/Kg/dia), dose 2 (2mg/Kg/dia) e
dose 3 (4mg/kg/dia), pela mesma via e intervalo de tempo. O tratamento foi feito do
primeiro ao quinto dia de prenhez e a eutanásia no 15
0
dia de prenhez.
Experimento II – Avaliação do período de implantação
Os animais do Grupo GII foram subdivididos em quatro grupos. Grupo
controle (C2) e tratados (T4, T5 e T6) com 15 animais cada. Estes animais
receberam o mesmo tratamento feito aos do experimento I, ou seja, o grupo Controle
recebeu água destilada e os Tratados receberam a solução aquosa de tacrolimus
nas mesmas concentrações, vias e intervalo de tempo descritos no experimento I,
variando apenas o período de tratamento que foi realizado do 5
0
ao 7
0
dia de
prenhez. Os animais foram eutanaziados no 15
0
dia de prenhez.
Eutanásia
Realizou-se a eutanásia dos animais dos grupos experimentais I e II, no
15
O
dia de prenhez através de aprofundamento anestésico Ketamina (via
intraperitoneal) e Xilazina (via intramuscular) nas doses de 10mg/kg a 2% e
100mg/kg a 5%, respectivamente. Foram observados os sinais de batimento
cardíaco e respiração para constatação da morte dos mesmos.
Procedência e Dose do Tacrolimus
O Tacrolimus utilizado (Prograf®,- Jansen-Cilag Farmacêutica LTDA.)
corresponde a cápsulas dos lotes 5C5133A, 5C5116B e 5C5131B, apresentadas em
embalagens contendo 50 cápsulas de 5mg.
Para determinação da dose do Tacrolimus, considerou-se a dose
utilizada por Ochiai et al. (1987), que relatam que a dose mínima efetiva necessária,
quando administrado por via oral, para manutenção do transplante em ratos é de
1mg/kg/dia.
Foram administradas três doses distintas de Tacrolimus (FK506 –
PROGRAF®), correspondendo a 1mg/Kg/dia, 2mg/Kg/dia e 4mg/kg/dia.
3.3 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE MATERNA
Durante todo o período do experimento I e II, as fêmeas foram
examinadas para avaliar sinais clínicos indicativos de toxicidade materna, tais como
piloereção, movimentos estereotipados, alteração da motilidade do animal (durante
30 minutos após a administração do fármaco ou água), diarréia, perda de peso,
redução de consumo de alimento, perdas sanguíneas vaginais e mortes.
O consumo de ração foi estimado pela diferença entre a quantidade
colocada no cocho em um dia e o que restou no outro. O peso corporal foi obtido no
primeiro dia de tratamento, ao término do tratamento e na data do sacrifício do
animal.
Durante a anestesia para a eutanásia, amostra de sangue foi obtida por
punção cardíaca, para análise hematológica e bioquímica de colesterol, triglicérides,
TGO, TGP, uréia e creatinina.
Órgãos maternos, como o fígado e rim foram retirados e pesados para se
observar possíveis sinais de toxicidade.
3.4 AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO
Após a eutanásia dos animais nos Experimentos I e II, as ratas foram
laparotomizadas, e foram removidos os cornos uterinos, ovidutos e ovários. Cada
ovário foi pesado individualmente e os corpos lúteos contados em cada ovário Os
cornos uterinos foram secionados longitudinalmente e seu conteúdo examinado para
identificação de fetos vivos (presença de batimentos cardíacos), reabsorções e fetos
mortos.
Fetos e placentas foram pesados, agrupados por ninhada e o peso médio
obtido pela divisão do peso total pelo número de fetos e de placentas.
Após fixação em Bouin por cerca de 60 minutos, os fetos foram
examinados sob microscópio esteroscópico para avaliar a morfogênese da face, dos
membros e fechamento do tubo neural.
3.5 PROCESSAMENTO ESTATÍSTICO
Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística pelo teste
ANOVA, uma via para comparação de dados contínuos, seguidos do teste de
Dunnet ; teste de Kruskall Walis para dados não paramétricos e teste de Chi-
quadrado para computação de dados descontínuos. O nível de significância dos
testes foi α = 0,05.
O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética na
Experimentação Animal-UFJF sob o n
o
035/2005.
4. RESULTADOS
4.1 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE MATERNA
Não foram encontrados indícios clínicos de toxicidade materna, tais
como, piloereção, alteração da motilidade, diarréia, movimentos estereotipados,
perdas sanguíneas vaginais e mortes, nos experimentos I e II.
Experimento I - Período de Trânsito tubário
Os pesos corporais das ratas controles e tratadas com Tacrolimus em
diferentes doses, no primeiro, no quinto e no 15
0
dia de prenhez antes e após a
eutanásia são apresentados na Fig. 6.
0 5 10 15
0
160
180
200
220
240
260
*
C1
T1
T2
T3
Peso corporal (g)
Dias de prenhez
Fig. 6. Peso corporal de ratas tratadas com água destilada (C1) e Tacrolimus 1,0 mg/kg/dia
(T1), 2,0mg/kg/dia (T2) e 4,0mg/kg/dia (T3), do 1
0
ao 5
0
dia de prenhez. *15
0
dia peso
corporal sem trato reprodutor.
Não houve alteração significativa em relação ao peso corporal entre os
grupos.
A Fig. 7 representa a estimativa de consumo de ração pelas mães
tratadas do primeiro ao quinto dia.
5 10 15
0
5
10
15
20
25
30
**
**
**
**
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
C1
T1
T2
T3
Consumo de ração (g)
Dias de prenhez
Fig. 7. Consumo de ração de ratas tratadas com água destilada (C1) e Tacrolimus 1,0
mg/kg/dia (T1), 2,0mg/kg/dia (T2) e 4,0mg/kg/dia (T3), do 1
0
ao 5
0
dia de prenhez.
Observando a Fig. 7 nota-se que os grupos C1, T1 e T2, apresentaram
consumo semelhante durante os cinco primeiros dias, equivalentes aos dias de
tratamento, sendo que os grupos T2 e T3 tiveram um aumento no consumo no
terceiro dia de tratamento. Os grupos C1 e T1 mantiveram um consumo crescente e
com valores semelhantes, durante o experimento. A partir do sexto dia, os grupos T2
e T3 consumiram mais ração do que os grupos controle e T1. Entretanto estas
flutuações não apresentam significado biológico.
Na Tabela 1 encontram-se os parâmetros hematológicos das ratas
tratadas do primeiro ao quinto dia de prenhez, e no dia da eutanásia.
Tabela 1. Parâmetros hematológicos de ratas tratadas com água destilada (C1) e
Tacrolimus 1,0 mg/kg (T1), 2,0mg/kg (T2) e 4,0mg/kg/dia (T3), do 1
0
ao 5
0
dia de prenhez, e
no dia da eutanásia.
Parâmetros
hematológicos
Controle 1
n(15)
Tratado 1
n(15)
Tratado 2
n(15)
Tratado 3
n(15)
Hematimetria
(milhões/mm
3
)
6.26±0,68 5.40±1,56 6,44±5,51 6.44±1,31
Hematócrito (%) 38,60±2,06 38,53±2,50 40,27±3,10 39,47±2,61
Leucócitos totais
(cel/mm
3
)
5873±2890 6440±3634 6324±9399 4966±1486
Linfócitos (%) 62,47±10,24 62,73±7,66 59,33±7,56 62,00±8,43
Segmentados (%) 31,93±8,14 30,60±7,95 33,93±7,63 32,27±8,22
Bastonete (%) 1,87±1,25 2,40±1,24 3,07±1,49 2,73±1,22
Eosinófilo (%) 0,93±1,62 1,33±1,80 1,33±1,11 1,60±1,30
Monócito (%) 2,20±1,97 3,00±2,14 2,33±1,34 1,40±0,91
Hemoglobina
(g/dL)
12,05±0,75
11,61±1,03
11,94±0,57
12,03±0,72
VGM (µ
3
) 63,00±8,67 77,93±29,79 65,20±8,78 62,93±10,05
HGM (mg) 19,73±2,68 23,60±8,45 18,67±1,29 19,07±2,84
CHGM (%) 31,40±2,29 30,60±2,53 29,07±2,52 30,60±2,74
Resultados expressos em média ± desvio padrão (número de casos)
VGM = Volume corpuscular médio; HGM = Hemoglobina corpuscular média; CHGM =
Concentração de hemoglobina corpuscular média.
Não houve diferenças significativas em relação aos parâmetros
hematológicos analisados entre os grupos acima citados.
Na Tabela 2 estão relacionados os parâmetros bioquímicos das ratas
tratadas do primeiro ao quinto dia de prenhez, e no dia da eutanásia.
Tabela 2. Parâmetros bioquímicos de ratas tratadas com água destilada (C1) e Tacrolimus
1,0 mg/kg/dia (T1), 2,0mg/kg/dia (T2) e 4,0mg/kg/dia (T3), do 1
0
ao 5
0
dia de prenhez, e no
dia de eutanásia.
Parâmetros
bioquímicos
Controle 1
n(15)
Tratado 1
n(15)
Tratado 2
n(15)
Tratado 3
n(15)
Colesterol mg/dl
49,65±11,49 69,35±19,88 63,26±26,98 61,41±13,52*
Triglicérides
mg/dl
165,87±59,91 133,07±82,17 148,80±70,24 148,77±105,38
TGO U/L 83,80±44,95 74,80±39,44 46,53±17,43* 48,67±12,49*
TGP U/L 39,93±10,85 42,27±11,93 37,07±7,25 38,33±9,04
Uréia mg/dl 60,67±8,22 54,20±12,62 58,60±9,91 48,33±10,54*
Creatinina mg/dl 0,52±0,14 0,58±0,19 0,45±0,05 0,32±0,09*
Resultados expressos em média ± desvio padrão (número de casos). *p<0,05 em relação
ao grupo controle .
Houve redução de creatinina entre no grupo T3, da concentração
plasmática TGO nos grupos T1, e T3, na concentração de uréia no grupo T3 e de
colesterol no grupo T3.
A Tabela 3 mostra o peso corporal corrigido e de órgãos maternos das
ratas tratadas do primeiro ao quinto dia.
Tabela 3. Peso corporal corrigido e de órgãos maternos em ratas Controles (C1) e tratadas
com Tacrolimus 1,0 mg/kg/dia (T1), 2,0mg/kg/dia (T2) e 4,0mg/kg/dia (T3), do 1
0
ao 5
0
dia de
prenhez.
Peso (g) Controle1 Tratado 1 Tratado 2 Tratado 3
Corporal
Corrigido
204,9±9,84(15)
206,3±9,97(15)
210,4±12,67(15)
210,2±16,07(15)
Fígado 9,2±0,84(15) 8,9±0,62(15) 9,2±1,11(15) 9,2±1,03(15)
Rim D 0,7±,06(15) 0,7±0,07(15) 0,8±0,08(15) 0,8±0,10(15)
Rim E 0,7±0,07(15) 0,7±0,08(15) 0,8±0,07(15) 0,8±0,10(15)
Rins D+E 1,5±0,12(30) 1,5±0,15(30) 1,6±0,15(30) 1,8±0,20(30)
Resultados expressos em média ± desvio padrão (número de casos).
Peso corporal corrigido = peso corporal sem útero, ovários e tubas.
Rim D = rim direito; Rim E = rim esquerdo; Rim (D+E) = rim direito + esquerdo.
Observando-se peso corporal materno corrigido e pesos de órgãos,
verifica-se que não ocorreram diferenças significativas entre os grupos.
Experimento II - Período de implantação do blastocisto
Na Fig. 8 encontram-se relacionados os pesos corporais das ratas
controles (C2) e tratadas (T4, T5 e T6) com Tacrolimus em diferentes doses, no
quinto e no sétimo dia e, ainda, no 15
0
dia de prenhez antes e após a retirada do
trato reprodutor.
0 5 10 15
0
160
180
200
220
240
260
*
C2
T4
T5
T6
Peso corporal (g)
Dias de prenhez
Fig. 8. Peso corporal de ratas tratadas com água destilada (C2) e Tacrolimus 1,0 mg/kg
(T4), 2,0mg/kg (T5) e 4,0mg/kg/dia (T6), do 5
0
ao 7
0
dia de prenhez. *Peso corporal após
remoção do trato reprodutor. *p<0,05.
Não foram observadas variações no peso corporal dos grupos analisados
sendo que todas as ratas ganharam peso entre o início da gestação, o tratamento e
a data da eutanásia.
Na Fig. 9 encontra-se o consumo de ração de ratas tratadas com água
destilada (C2) e Tacrolimus 1,0 mg/kg/dia (T4), 2,0mg/kg/dia (T5) e 4,0mg/kg/dia
(T6), do 5
0
ao 7
0
dia de prenhez.
5 10 15
0
5
10
15
20
25
30
C2
T4
T5
T6
**
*
*
*
*
*
*
Consumo de ração (g)
Dias de prenhez
Fig. 9. Consumo de ração de ratas tratadas com água destilada e Tacrolimus do 5
0
ao 7
0
dia de prenhez. *p<0,05 em relação ao grupo controle .
Nota-se a queda do consumo de ração no dia subseqüente ao tratamento
com água destilada e Tacrolimus em todos os grupos tratados do quinto ao sétimo
dia. Entre o sexto e o oitavo dia o consumo aumentou gradativamente, sendo que do
nono dia até o final do experimento, este consumo foi intensificado, com destaque
para o grupo T6 que apresentou consumo médio superior aos demais grupos.
A Tabela 4 apresenta os dados referentes aos parâmetros hematológicos
de ratas tratadas do 5
°
ao 7
°
dia de prenhez, e no dia da eutanásia.
Tabela 4. Parâmetros hematológicos de ratas tratadas com água destilada (C2) e
Tacrolimus 1,0 mg/kg (T4), 2,0mg/kg (T5) e 4,0mg/kg/dia (T6), do 5
0
ao 7
0
dia de prenhez.
Parâmetros
hematológicos
Controle 2
n(15)
Tratado 4
n(15)
Tratado 5
n(15)
Tratado 6
n(15)
Hematimetria
(milhões/mm
3
)
6,03±0,84
6,31±0,57
6,99±1,17
6,03±1,61
Hematócrito (%) 39,40±3,02 37,87±2,07 38,87±2,07 38,00±3,09
Leucócitos totais
(cel/mm
3
)
6063 ±910
6033±1769
7003±275
4796±1163
Linfócitos (%) 62,60±10,21 62,33±94,81 59,07±6,23 62,93±6,25
Segmentados (%) 31,20±9,81 30,73±8,47 32,13±4,52 31,27±6,28
Bastonete (%) 2,33±1,11 2,87±1,81 2,93±1,28 2,73±1,33
Eosinófilo (%) 1,33±1,40 1,27±1,71 1,47±1,25 0,60±0,91
Monócito (%) 2,53±1,92 2,20±2,27 4,33±1,45 2,40±1,92
Hemoglobina (g/dL) 12,34±0,66 12,32±0,76 12,59±1,10 12,63±1,31
VGM (µ
3
) 64,73±6,54 60,13±4,31 56,80±7,88 59,93±17,77
HGM (mg) 20,27±1,98 20,00±2,59 18,33±2,02 23,00±8,94
CHGM (%) 31,47±3,11 32,80±1,47 32,33±2,35 33,40±4,01
Resultados expressos em média ± desvio padrão (número de casos).
VGM = Volume corpuscular médio; HGM = Hemoglobina corpuscularr média; CHGM =
Concentração de hemoglobina corpuscular média.
Os resultados obtidos não demonstraram alterações significativas entre
os grupos experimentais.
Na Tabela 5 estão descritos os dados referentes aos parâmetros
bioquímicos das ratas tratadas do 5
°
ao 7
°
dia de prenhez, e no dia de eutanásia.
Tabela 5. Parâmetros bioquímicos de ratas tratadas com água destilada (C2) e Tacrolimus
1,0 mg/kg/dia (T4), 2,0mg/kg/dia (T5) e 4,0mg/kg/dia (T6), do 5
0
ao 7
0
dia de prenhez, e no
dia de eutanásia.
Parâmetros
bioquímicos
Controle 2
n(15)
Tratado 4
n(15)
Tratado 5
n(15)
Tratado 6
n(15)
Colesterol mg/dl 67,13±16,14 71,82±24,85 121,17±222,74 58,97±28,43
Triglicérides
mg/dl
168,13±77,14
130,00±47,66 221,73±139,11 146,87±69,20
TGO U/L 67,80±18,92 67,33±12,63 79,80±40,46 44,93±18,59*
TGP U/L 37,07±11,76 37, ±13,92 29,00±11,56 32,20±8,12
Uréia mg/dl 61,27±30,73 61,33±11,81 62,73±9,53 50,20±11,80
Creatinina mg/dl 0,54±0,15 0,55±0,13 0,49±0,10 0,50±0,34
Resultados expressos em média ± desvio padrão
* p<0,05 em relação ao grupo controle
Os parâmetros bioquímicos acima analisados não apresentaram
alterações relevantes entre os grupos experimentais, exceto os resultados referentes
à TGO, reduzido no T6.
Encontram-se descritos na Tabela 6, os valores relativos ao peso de
órgãos maternos das ratas tratadas do quinto ao sétimo dia.
Tabela 6. Peso de fígado, rins e ovários de ratas tratadas com água destilada (C2) e
Tacrolimus 1,0 mg/kg (T4), 2,0mg/kg (T5) e 4,0mg/kg/dia (T6), do 5
0
ao 7
0
dia de prenhez.
Peso de
órgãos
maternos
Controle 2 Tratado 4 Tratado 5 Tratado 6
Corporal
corrigido
(g)
210,69±11,78(15) 204,95±11,00(15) 212,53±14,00(15) 209,72±10,56(15)
Fígado (g) 8,72±0,66(15) 8,62±0,65(15) 8,72±0,75(15) 8,94±0,72(15)
Rim D (g) 0,73±0,00(15) 0,72±0,06(15) 0,77±0,06(15) 0,76±0,09(15)
Rim E (g) 0,71±0,07(15) 0,71±0,05(15) 0,76±0,07(15) 0,75±0,09(15)
Rins D+E (g) 1,45±0,13(30) 1,43±0,11(30) 1,54±0,12(30) 1,51±0,19(30)
Resultados expressos em média ± desvio padrão (número de casos).
Peso corporal corrigido = peso corporal sem útero, ovários e tubas.
Rim D = rim direito; Rim E = rim esquerdo; Rim (D+E) = rim direito + esquerdo.
Não foram observadas diferenças significativas nos pesos dos órgãos
maternos.
4.2 AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO
Experimento I - Período de Trânsito tubário
A Tabela 7 apresenta o número médio de corpos lúteos, implantes, fetos
vivos,reabsorções iniciais e tardias, proporção de implantação e perdas pré-
implantação nos grupos C1, T1, T2 e T3, tratados do primeiro ao quinto dia de
prenhez.
Tabela 7. Peso de ovários, número de corpos lúteos, fetos vivos e mortos em ratas
Controles (C1) e tratadas com Tacrolimus 1,0 mg/kg/dia (T1), 2,0mg/kg/dia (T2) e
4,0mg/kg/dia (T3), do 1
0
ao 5
0
dia de prenhez.
Variáveis Controle1 Tratado 1 Tratado 2 Tratado 3
Ovário D (mg) 37,3±10,93(15) 38,0±13,95(15) 39,0±11,03(15) 41,2±7,97(15)
Ovário E (mg) 38,4±12,26(15) 72,1±84,13(15) 38,3±14,17(15) 33,0±6,70(15)
Ovários D+E (mg) 75,7±9,81(30) 110,1±86,71(30) 77,3±11,55(30) 74,1±9,90(30)
Ovário D (mg) 37,3±10,93(15) 38,0±13,95(15) 39,0±11,03(15) 41,2±7,97(15)
Corpos lúteos 12,27±1,43(15) 12,13±1,81(15) 13,60±1,72(15) 13,73±2,22(15)
Fetos vivos 10,40±0,64 9,47±2,75 11,13±2,32 10,47±2,90
Fetos mortos 0 0 0 0
Resultados expressos em média ± desvio padrão (número de casos).
Os resultados obtidos e expressos na Tabela 7 não demonstraram
diferença significativa entre os grupos.
Na Tabela 8 observam-se os dados referentes a reabsorções iniciais e
tardias,peso de ninhada e de placenta, proporção de implantação, perdas pré-
implantação nos grupos C1, T1, T2 e T3, tratados do primeiro ao quinto dia de
prenhez.
Tabela 8. Reabsorções, peso de ninhada e placenta, número de implantes, proporção de
implantação e de perdas pré-implantação em ratas Controles(C1) e tratadas com
Tacrolimus 1,0 mg/kg/dia (T1), 2,0mg/kg/dia (T2) e 4,0mg/kg/dia (T3), do 1
0
ao 5
0
dia de
prenhez.
Variáveis Controle1 Tratado 1 Tratado 2 Tratado 3
Reabsorções iniciais 0,53±0,74(15) 0,47±0,83(15) 0,73±1,03(15) 0,60±0,63(15)
Reabsorções tardias 0,27±0,60(15) 0(15) 0,13±0,35(15) 0,20±0,41(15)
Peso da ninhada (g) 1,85±0,57(15) 2,18±0,49(15) 1,93±0,53(15) 1,97±0,53(15)
Peso de placenta (g) 1,65±0,40(15) 1,53±0,42(15) 1,76±0,39(15) 1,56±0,40(15)
Implantes 11,73±1,62(15) 10,33±2,77(15) 12,00±2,14(15) 11,27±3,28(15)
Proporção de
implantação (%)*
95,93±9,67(15)
86,27±22,22(15)
88,26±11,13(15)
82,04±20,20(15)
Perdas pré-
implantação(%)**
4,07±9,67(15)
13,73±22,22(15)
11,74±11,13(15)
17,96±20,20(15)
Resultados expressos em média ± desvio padrão (número de casos). *(n
o
de implantes/n
o
de
corpos lúteos) x 100. **(n
o
de corpos lúteos - n
o
de implantes/n
o
de corpos lúteos) x 100.
Os resultados não demonstraram diferença significativa entre as variáveis
avaliadas nos grupos experimentais.
Não foram observadas malformações relativas à face, membros ou
fechamento do tubo neural.
Experimento II - Período de Implantação do blastocisto
A média do número de corpos lúteos totais, de reabsorções iniciais e
tardias e de implantes totais encontram-se na Tabela 9.
Tabela 9. Peso de ovários, número de corpos lúteos, fetos vivos e mortos, reabsorções,
peso de ninhada e placenta, número de implantes e de perdas pós-implantação em ratas
Controle (C2) e Tratadas com Tacrolimus 1,0mg/kg/dia (T4), 2,0mg/kg/dia (T5) e
4,0mg/kg/dia (T6), do 5
0
ao 7
0
dia de prenhez.
Variáveis Controle 2 Tratado 4 Tratado 5 Tratado 6
Ovário D (mg) 41,13±10,40(15) 38,20±8,42(15) 37,33±9,86(15) 41,87±6,91(15)
Ovário E (mg) 57,87±78,42(15) 33,47±11,54(15) 0,40±10,51(15) 36,33±8,88(15)
Ovários D+E (mg) 99,00±75,00(15) 71,67±12,19(15) 72,73±11,72(15)
78,20±7,23(15)
Corpos lúteos 13,0±1,77(15) 12,20±2,37(15) 12,47±1,56(15) 13,27±1,75(15)
Fetos vivos 11,33±2,87 9,67±2,82 10,27±1,39 11,60±1,68
Fetos mortos 0 0 1 0
Reabsorções iniciais 1,07±1,67(15) 0,80±1,8(15) 0,87±0,64(15) 0,33±0,62(15)
Reabsorções tardias 0(15) 0,27±0,80 (15) 0,07±0,26(15) 0,07±0,26(15)
Peso da ninhada (g) 2,15±0,45(15) 1,86±0,56(15) 1,94±029(15) 2,28±0,42(15)
Peso de placenta (g) 1,83±0,36(15) 1,54±0,41(15)* 1,62±0,29(15)* 1,88±0,31(15)
Implantes 12,40±1,99(15) 10,67±1,84(15)* 11,53±1,41(15) 12,00±1,36(15)
Perdas pós-
implantação (%)**
9,25±14,91 8,58±21,68 10,77±7,99 3,52±6,56
Resultados expressos em média ± desvio padrão (número de casos). D= direito; E=
esquerdo.
*p<0,05 em relação ao grupo controle. **(n
o
implantes - n
o
de fetos vivos/n
o
de implantes) x
100.
Notou-se redução do peso da placenta no grupo T4 e T5 e de implantes
no grupo T4, quando comparados com o controle.
Após o exame sob microscópio estereoscópico, não foram identificadas
alterações na morfogênese externa dos fetos.
5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
5.1 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DO TACROLIMUS SOBRE O
ORGANISMO MATERNO
Alterações na homeostasia, nos níveis hormonais ou alterações
comportamentais maternas podem causar alterações no desenvolvimento
embriofetal (KHERA, 1987), havendo demonstrações de correlação de
malformações fetais que ocorrem com baixa freqüência (exencefalia, encefalocele,
micro ou anaftalmia e outras) a redução do peso materno (KHERA, 1985).
Normalmente são considerados indícios de toxicidade materna a diminuição do peso
corporal, do consumo de ração e água, alteração da deambulação na gaiola,
piloereção, diarréia e mortalidade materna (MANSSON, KANG, 1994; CHAHOUD et
al, 1999).
Entre os efeitos colaterais do tacrolimus encontram-se nefrotoxicidade
(BARROS et al., 1987), neurotoxicidade (KACSMAREK, et al., 2003), hipertensão
arterial (FRIEMANN et al., 1998) que caso ocorressem nos animais tratados com
tacrolimus poderiam alterar tanto o comportamento quanto o metabolismo materno.
Entretanto, os indicadores de toxicidade, estresse ou distresse materno não foram
observados, exceto a redução do consumo de ração o que parece indicar que se
houve alguma alteração, ela foi restrita a administração do imunossupressor, mas
não a uma alteração com significado biológico.
Tais observações associadas à ausência de alterações hematológicas
parece sugerir que o imunossupressor não causa toxicidade materna (MENENDEZ,
1985), confirmando os resultados de Fujimura e Ebihara (1994) e Uchida et al.
(1999).
Taylor et al (2005) relatam que o tacrolimus apresenta efeitos adversos
dose-dependente e relacionados com os locais de maior concentração da
calcineurina, como no cérebro e nos rins. O tacrolimus, portanto, estaria associado à
neurotoxicidade e nefrotoxicidade e este é um dos mais importantes efeitos
colaterais após o transplante renal. Foi descrito o aumento das concentrações de
uréia e creatinina em ratas tratadas com tacrolimus (FUJIMURA, EBIHARA, 1994;
UCHIDA et al, 1999), entretanto, no presente trabalho entre os grupos
experimentais, o peso dos rins foi semelhante e o grupo tratado com dose mais
elevada de tacrolimus (4mg/kg/dia) teve redução da concentração de creatinina e
uréia, o que parece contradizer o efeito nefrotóxico.
A hiperlipidemia relatada por Taylor et al. (2005) parece se confirmar
visto que em todos os grupos tratados do primeiro ao quinto dia foi constatado
aumento da concentração de colesterol, embora a diferença significativa com o
grupo controle só tenha aparecido nos animais do grupo tratado com 1mg/Kg/dia
(T1) do fármaco.
Em síntese, os dados obtidos do estudo materno parecem indicar que o
tacrolimus não teve efeito tóxico observável, sobre o organismo materno.
Alterações hormonais maternas podem interferir com o desenvolvimento
embrionário. No modelo experimental utilizado a análise de concentrações
hormonais não foi realizada, mas observações indiretas, como o peso de ovários,
número de corpos lúteos, índices de implantação e de reabsorção, permitem sugerir
que os grupos experimentais foram semelhantes.
Os corpos lúteos de ratas aumentam de volume ao longo da prenhez e
estão intimamente correlacionados com o aumento de secreção de progesterona e
20-hidroxi progesterona (UCHIDA et al.,1970), hormônios necessários para a
manutenção da gestação (KATO et al. 1979) necessária ao êxito da gestação
(KELLER, 2006). Por outro lado, o número de corpos lúteos da gestação pode ser
tomado como um indicativo indireto do número de ovulações. Sendo semelhante
entre os grupos experimentais, indica que o número de ovulações foi semelhante
entre os grupos e os processos hormonais envolvidos com a ovulação foram
semelhantes. Como no presente trabalho não houve diferença estatística
significativa, entre no peso dos ovários e do número de corpos lúteos, pode-se
sugerir que as condições hormonais de todos os grupos foram semelhantes.
Como os corpos lúteos são estruturas mais volumosas do ovário, seu
número e tamanhorespondem pelo peso dos ovários o qual pode ser tomado como
uma indicação indireta da produção hormonal. Tomados em conjunto, os dados
maternos sugerem que o tacrolimus não parece interferir com a homeostase
materna, contrariando as observações de GEWIRTZ; SITARAMAN (2002) que
relataram toxicidade em ratas tratadas com a dose máxima de 3,2mg/kg.
5.2 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DO TACROLIMUS SOBRE O
EMBRIÃO
É conhecido que o tacrolimus cruza a placenta (SATCHELL et al., 2000) e
chega até o feto, podendo causar teratogenicidade (ALBENGRES; LELOUET;
TILLEMENT, 1997), embora estudos em humanos não tenham evidenciado
malformações ou abortos (ZABIRY-ZIENNIEWICZ et al.,2006; GUTIERREZ et al.,
2005). Em ratas e coelhos o tratamento com tacrolimus durante o período de
organogênese causou aborto, perda de peso e mortes (GERWITZ; SITARAMANN,
2002). O período em que se administrou o tacrolimus a ratas, compreende a
fertilização, clivagens iniciais, mórula e blastocisto. De maneira geral, toxicantes que
atuam nessa fase do desenvolvimento induzem a morte do concepto ou produzem
alterações genéticas que podem ou não levar a malformações (CHRISTIAN, 2001).
A morte durante a fase precoce do desenvolvimento pode ser inferida pelo
menor número de implantes no útero ou pelo aumento do índice de perdas
embrionárias que é estimado tomando cada corpo lúteo como indicativo de um
ovócito que, sendo fecundado, geraria um zigoto (KELLER, 2006). A diferença entre
corpos lúteos e implantes nos cornos uterinos indica, aproximadamente, o número
de conceptos que se inviabilizaram (TYL; MARR, 2005). Os dados obtidos no
trabalho mostram que a média de implantes por mãe e o índice de perdas
embrionárias pré-implantação foram semelhantes em todos os grupos estudados do
Experimento I , sugerindo, portanto, que o tacrolimus não altera o desenvolvimento
do concepto na fase de pré-implantação.
Confirmando essa sugestão, a proporção de implantes, que correlaciona
o número de corpos lúteos com o número de implantações no útero (TYL; MARR,
2005) foi semelhante em todos os grupos do Experimento I , o que significa que os
blastocistos encontraram condições adequadas para se implantar e expressar o seu
desenvolvimento. Além disso, o índice de reabsorção, que determina o número de
implantes que não sobreviveram, também não apresentou diferença significativa
entre os grupos do Experimento I.
Embora, no Experimento II, tenha se constatado uma redução
estatisticamente significativa no número de implantes do grupo tratado
com1mg/Kg/dia (T4), o dado pode não ter importância biológica visto que a variação
apresentada encontra-se dentro dos limites históricos da colônia de ratas do Biotério
do Centro de Biologia da Reprodução.
A placenta tem um importante papel no desenvolvimento fetal, pois
fornece os nutrientes necessários para este desenvolvimento, entre outras funções.
Foi demonstrada uma íntima relação entre o peso fetal e placentário em humanos
(THOMPSON et al., 1969), porcos (SANIN et al, 2001), coelhos (BRUCE, ABDUL,
1973) e roedores (GILBERT, LETURQUE, 1982). Foi descrito também que o
crescimento placentário anormal alterou o desenvolvimento fetal de humanos
(ORNOY et al, 1981) e de camundongos (BURGOYNE, TAMS, EVANS, 1983).
Embora o peso placentário tenha sido reduzido nos grupos tratados com tacrolimus
(1,0 e 2,0 mg/kg), isto não se refletiu no peso da ninhada. Os dados encontrados
contrastam com o9s observados por Gewitz; Sitaraman (2002) que tratando ratas no
período de organogênese com 1 a 3,2mg/kg de tacrolimus/ kg peso corporal
encontraram efeito tóxico materno, aumento de mortes embrionárias. A diferença
pode ser devido a época da gestação em que os autores administraram o tacrolimus.
Sabe-se que no período inicial da prenhez o concepto naturalmente morre ou
sobrevive (com ou sem lesões funcionais) enquanto que no período de
organogenese ele é mais susceptível a lesão.
Considerando que no presente modelo experimental as mães foram
expostas ao tacrolimus no período de divisões celulares iniciais, fase de mórula e de
implantação do blastocisto, lesões mais severas poderiam levar à morte do embrião
ou alterações genéticas e, ou, moleculares que poderiam se refletir na morfologia ou
na função de órgãos e sistemas. Sob o ponto de vista morfológico, o feto de 15 dias
não aparentava qualquer alteração externa digna de nota, inclusive quanto ao peso
corporal.
Pode-se concluir que no modelo experimental usado não foram
encontradas alterações sugestivas de efeitos do tacrolimus seja sobre o organismo
materno seja sobre o desenvolvimento do concepto. A redução do peso da placenta
será objeto de novos estudos.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ACOSTA, A. A. Implantación humana del pre-embrión: aspectos básicos clínicos e
investigación futura. Revista latino americana de esterilidad y fertilidad, v. 8, n. 1,
p. 4-20, 1994.
ALBENGRES, E.; LE LOUET, H.; TILLEMENT, J. P. Immunosuppressive drugs and
pregnancy: Experimental clinical data. Transplant Proc, v. 29, p. 2461–2466, 1997.
ARMENTI, V.T. Immunosuppression and teratology: Evolving guidelines. J. Am.
Soc. Nephrol., v. 15, p. 2759-2760, 2004.
BARROS, E. J. et al. Glomerular hemodynamics and hormonal participacion on
cyclosporine nephrotoxicity. Kidney Int., v. 32, n. 1, p. 19-25, 1987.
BOREL, J. F.; KIS, Z. L. The discovery and development of cyclosporine
(Sandimmune). Transplant Proc, v. 23, n. 2, p. 1867-74, 1991.
BROCAS, C. et al. Deleterious action of gossypol on bovine spermatozoa, oocyte,
and embryos. Biol. Reprod., v. 57, p. 901-907, 1997.
BRUCE, N. W; ABDUL, K. Relationships between fetal weight, placental weight and
maternal circulation in the rabbit at different stages of gestation. J Reprod Fertil.,
v.32: p.15-24, 1973.
BURGOYNE, P.; TAM, P.P.L.; EVANS, E. P. Retarded development of conceptuses
during early pregnancy in the mouse. J Reprod Fertil., v.68, p.387–93, 1983.
BYRNE, J. et al. Morphology of the early fetal deaths and their chromosomal
characteristics. Teratology, v. 32, p. 297-315, 1985. apud: HOLMES, L.B.
Developmental toxicology scope of the problem In: KIMMEL, C.A., BUELKE-SAM, J.
Dev. Toxicol., 2 ed. New York: Raven Press, 1994. 312p.
CALDEYRO-BARCIA, R. Prólogo p.xi-xiv. In: MACIÁ, J. M. C. et al. Biologia y
ecologia-fetal. Barcelona: Salvat, 1981. 888p.
CALLES, I P; CASADO, E L A; PINTO, P H et al. Eficacia de Tacrolimus tópico en el
tratamiento del vitíligo. Med Cutan Iber Lat Am., v. 33, n. 4, p. 33-34, 2005.
CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE. Guide to the Care and Use of
Experimental Animals. Ottawa:Canadian Council on Animal Care (CCAC), v.1.
1996.126p.
CASELE, H. L.; LAIFER, S. A. Pregnancy after liver transplantation. Semin
Perinatol, v. 22, p.149-55, 2006.
CLIMAZ, R. et al. Alterations in the immune system of children from mothers treated
with immunosuppressive agents during pregnancy. Toxicol Lett, v.149, p.155-62,
2004.
CUMMINGS, A. M. Toxicological mechanism of implantation failure. Fundamental
and applied toxicology, v. 15, p. 571-579, 1990.
CHAHOUD, I. et al. Correlation between maternal toxicity and embryo/fetal effects.
Reprod Toxicol, v.13, p.375-81, 1999.
CHRISTIAN, M.S. Test Methods for assessing female reproductive and
developmental toxicology. In: HAYS, W. Method of Toxicology. Philadelphia: Taylor
& Francis, 2001. p. 1301-81.
DRUML, W. The beginning of organ transplantation: Eimerich Ullmann (1861-1937).
Wen Klin Wochenschr., v. 114, n. 4, p. 128-137, 2002.
DUNN, C. et al. Cyclosporin: An updated review of pharmacokinetic properties,
clinical efficacy and tolerability of a microemulsion-based formulation (Neoral) in
organ transplantation. Drugs, v. 61, n. 13, p. 1957-2016.
ETTENGER R; GRIMM E. Safety and efficacy of TOR inhibitors in pediatric renal
transplant recipients. Am J Kidney Dis., v. 38, n. 4, p. 22-28.
FRIEMANN, S. et al. Improvement of nephrotoxicity, hypertension, and lipid
metabolism after conversion Kidney transplant recipients from cyclosporine to
tacrolimus. Transplant Proc, v. 30, n. 4, p. 1240-2, 1998.
FUJIMURA A; EBIHARA A. Administration time-dependent toxicity of a new
immunosuppressive agent, Tacrolimus (FK 506). Life Sci, v. 55, p. 485-90, 1994.
FURMAN, B. et al. Multiple pregnancies in women after renal transplantation case
report that rises a management dilemma. European journal of obstetrics &
gynecology and reproductive biology, v. 84, p. 107-110, 1999.
GARCIA S. C. et al. Cyclosporine A and Tacrolimus: a review. Jornal Brasileiro de
Patologia e Medicina Laboratorial, v.40, p.393–401, 2004.
GARCIA-DONAIRE, J.A. et al. Tacrolimus as basic immunosuppression in pregnancy
after renal transplantation: a single center experience. Transplant Proc, v.37, p.
3754-5, 2005.
GEWIRTZ, A. T., SITARAMAN, S. V., Tacrolimus fujisawa. Curr. Opin. Investig.
Drugs, v. 3, p.1307-1311, 2002.
GILBERT, M; LETURQUE, A. Fetal weight and its relationship to placental blood flow
and placental weight in experimental intrauterine growth retardation in the rat. J Dev
Physiol, v.4, p.237–46, 1982.
GOTO, T. et al. Discovery of FFK-506, a novel immunosuppressant isolated from
Streptomyces tsukubaensis. Transplant Proc,. v. 19, p.4-8, 1987.
GUTIERREZ, MJ et al. Pregnancy in renal transplant recipients. Transplant Proc, v.
37, p. 3721-3722, 2005.
HOMBO, T et al. The oral dosage form of FK506. Transplant Proc, v. 19, n.6, p. 17-
22, 1987.
HONG, J.C.; KAHAN, B.D. Immunosuppressive agent in organ transplantation: past,
present and future. Semin. Nephrol., v. 20, p. 108-125, 2000.
HOOKS, M. A. Tacrolimus, a new immunosuppressant – a review of the literature.
The Annals of Pharmacology, v. 28, p. 501-510, 1994.
JABIRY-ZIENIEWICZ, Z. et al. Outcome of four high-risk pregnancies in female liver
transplant recipients on Tacrolimus immunosuppression. Transplant Proc, v.38,
p.255-7, 2006.
JANEWAY, C. A. et al. Imunobiologia: o sistema imune na saúde e na doença. 5.
ed. Porto Alegre: Artmed, 2002. 762p.
JONHSON, C. et al. Randomized trial of tacrolimus (Prograf) in combination with
azathioprine or mycophenolate mefetil versus cyclosporine with micophenolete
mofetil after cadaveric transplantation. Transplant, v. 69 p. 834, 2000.
KACZMAREK, I. et al. Impairment of the blood-brain barrier can result in tacrolimus-
induced reversible leucoencephalopathy following heart transplantation. Clin
Transplant, v. 17, n. 5, p. 469-72, 2003.
KAHAN, B. D.; RAJAGOPALAN, P. R.; Hali, M. For the United States Simulect Renal
Study Group. Reduction of the occurrence of acute celular rejection among renal
allograff recipients treated with basiliximab, a chimeric anti-interleukin 2 receptor
monoclonal antibody. Transplant, v. 67, p. 276, 1999.
KARI, J.A; TROMPETER, R.S. What is the calcineurin inhibitor of choice for pediatric
renal transplatation? Pediatr Transplant , v.8, n.5, p.437-444, 2004.
KATO, H.; MORISHIGE, W. K.; ROTCHIL, D. I. A quantative relationship between
the experimentally determined number of conceptuses and corpus luteuns activity in
pregnant rat. Endocrinology; v. 105, p..846-850, 1979.
KELLER, K.A. Development and reproductive toxicology. In: KELLER, K.A.;
JACOBSON–KRAM, D. (eds.). Toxicological testing handbook. 2nd ed. New York:
Informa Healthcare, p.305–55, 2006.
KHERA, K.S. Maternal toxicity of drugs and metabolic disorders a possible etiologic
factor in the intrauterine death and congenital malformation: a critique on human
data. CRC Crit Rev Toxicol, v.17, p.345-75, 1987.
KHERA; K. S. Maternal toxicity: a possible etiological factor in embryo-fetal deaths
and fetal malformations of rodent-rabbit species. Teratology, v.31, p.129-53, 1985.
KINDT, T. J.; GOLDSBY, R. A; OSBORNE, B. A. Kuby Immunology. 6
th
ed. W. H.
Freeman and Company, 2006. 608p.
KINO, TH. et al. FK506, a novel Immunosuppressant isolated from streptomyces. II.
Immunosuppressive effect of FK506 in vitro. J Antibiot., v. 40, p. 1256-1265, 1987.
KIRKMAN, R.L.; et al. A randomized prospective trial of anti-tac monoclonal antibody
in human renal transplantation. Transplantation, v. 51, p.107, 1991.
KNOLL, G. A., BELL, R. C.Tacrolimus versus cyclosporine immunossupression after
cadaveric renal transplantation: meta analysis of randomised trials. British medical
journal, v. 318, p. 1104, 1997.
KRENSKY, A. M.; STROM, T. B.; BLUESTONE, J. A. Imunomoduladores: Agentes
imunossupressores, tolerógenos e imunoestimulantes. In: GILMAN, A. G. As bases
farmacológicas da terapêutica.10. ed. Rio de Janeiro: McGraw-Hill, 2003. p
11097–1115.
KUMAR, V.; ABBAS, A. K.; FAUSTO, N. Robbins and cotran pathologic basis of
disease. 7
th
ed. Philadelphia: Elselvier Saunders, 2004. 1525p.
LEMÔNICA, I.P. Embriofetotoxicidade. In: OGA, S. Fundamentos de toxicologia.
São Paulo: Atheneu, p. 12-94, 1996.
LESSAN-PEZESHKI, M. Pregnancy after renal transplantatios: points to consider.
Nephrol. Dial. Transplant, v. 17, p. 703 -707, 2002.
MAGANHA, J.; PETERS, V.M., GUERRA, M.O. Fisiologia da implantação do
blastocisto. Bol. Centr. Biol. Reprod., v. 21, p. 5-24, 2002.
MANSON, J.M.; KANG, Y.J. Test methods for assessing female reproductive and
developmental toxicology. In: HAYES, A.W. Principle and methods of Ttoxicology.
3
rd
ed. New York: Raven Press. chap. 28, p. 989-1035, 1994.
MAYER, A. D. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and
cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European
Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation, v. 64, p. 436-443,
1997.
McMILLAN, M. A. Clinical pharmacokinetics of cyclosporin. Pharmac Ther, v. 42, n.
1, p. 135-56, 1989.
MICHAL, F et al. Impact of the environment on reproductive health: executive
summary. Environmental Health Perspectives Supplements, v. 101 (Suppl. 2), p.
159-167, 1993.
MOORE, K. L.; PERSAUD, T.V.N. Embriologia Básica. Tradução por Maria das
Graças Fernandes Sales et al .Rio de Janeiro: Elsevier, 2004. 462p.
NEU, A. M. et al. Tacrolimus versus cyclosporine A as primery immunosuppression
in pediatric renal transplantation: A NAPRTCS study. Pediatr Transplant, v. 7, p.
217 – 222, 2003.
OCHIAI, T et al. Studies of the induction and maintenance of long-term graft
acceptance by treatment with FK506 in heterotopic cardiac allotransplantation in rats.
Transplantation, v. 44, n. 6, p. 734-738, 1987.
O’NEILL, C. Autocrine mediators are required to act on the embryo by the 2-cell
stage to promote normal development and survival of mouse preimplantation
embryos in vitro. Biol. Reprod., v. 58, p. 1303-1309, 1998.
OELLERICH, M. et al. Immunosuppressive drug monitoring of sirolimus and
cyclosporine in pediatric patients. Clin Biochem, v.37, n.6, p. 424-428, 2004.
ORNOY A. et al. Placental findings in spontaneous abortions and stillbirths.
Teratology, v.24, p.243–52, 1981.
PARR, M. B.; PARR, E. L. The implantation reaction. In: WYNN, R.M., JOLLIE, W.P.
Biology of the uterus. 2
nd
. ed. New York: Plenum Medical Book Company, 1989. p.
233-277
PARSON, W. H.; NOLAN, H. S.; WIVRATT, M. J. Discovery of ciclosporin-A, FK-506,
and rapamycin. Ann NY Acad Sci., v. 685, p.22-36, 1993.
PIRSCH, J. D. et al. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for
immunosuppression in cadaveric renal transplantation. FK506 kidney transplant
study group. Transplant, v. 63, n. 7, p. 977-83, 1997.
PLATT, J. L.; RUBSTEIN, P. Mechanisms and characterisits of allograft rejection. In:
SABINSTON, D. C. Textbook of Surgery: The Biological Basis of Modern
Surgical Practice. 15 ed. Philadelphia: W. R. Saunders Company, 1997.
PLOSKER, G.L; FOSTER, R. H.Tacrolimus: a further update of its pharmacology and
therapeutic use in the management of organ transplantation. Drugs, v. 59, p. 323-
389, 2000.
ROUT, U.K.; ARMANT, D.R. Expression of genes for alcohol and aldehyde
metabolizing enzymes in mouse oocytes and preimplantation embryos. Reprod.
Toxicol., v. 16, p. 253-258, 2002.
SANIN, L.H. et al. Relation between birth weight and placental weight. Biol Neonate,
v.80, p.113–117, 2001.
SATCHELL, S. et al. Pregnancy, tacrolimus, and renal transplantation: survival of a
358 – g baby. Nephrol Dial Transplant, v.15, p.2065-2066, 2000.
SCOTT, L. et al. Tacrolimus: A further update of its use in the management of organ
transplantation. Drugs, v. 63, n.12, p. 1247-1297, 2003.
SCHÜTZ, E. et al. Cyclosporine whole blood immunoassays (AXSYM, CEDIA, and
Emit): a critical overview of performance characteristics and comparison with HPLC.
Clin Chem, v. 44, n. 10, p. 2158-64, 1998.
SHAPIRO, R. Tacrolimus in pediatric renal transplantation: a review. Pediatr.
Transplant, v. 2, p. 270-276, 1998.
SHAPIRO, S.; BROSS, D. Risk factors for fetal death in studies of vitalstatistic data
interference and limitation. In: PROTER, I. H.; HOOK, E. B. Human embryonic and
fetal death. New York: Academic Press, 1980. p. 89–127.
SOUZA, C. T. C. B. Gravidez após transplante renal: impacto da gestação na
função do enxerto e da imunossupressão sobre o feto. São Paulo:
UNIFESP/EPM. 2002, 70p. (Dissertação de Mestrado).
SOUZA, E. R.; GUERRA, M.O.; PETERS, V. M. Desenvolvimento de pré-embrião de
ratas Wistar da colônia do biotério do Centro de Biologia da Reprodução – UFJF.
Bol. Centr. Biol. Reprod., v. 16, p. 63-70, 1997.
STEPKOWISKI, S. M. Molecular targets for existing and novel immunosuppressive
drugs. Expert Reviews in Molecular Medicine, v. 2000, p. 1-23, 2000.
TANABE, K. Calcineurin inhibitors in renal transplantation. What is the best option?
Drugs, v. 63, n.15, p.1535-1548, 2003.
TAYLOR, A. L.; WATSON, C. J. E.; BRADLEY, J. A. Immunosuppressive agents in
solid organ transplantation: mechanisms of action and therapeutic efficacy. Crit Rev
Oncol Hematol, v. 56, p.23-46, 2005.
TERATOGENIC effects: Pregnancy category C. Disponível em: <
http://www.fda.gov/cder/foi/label/2003/507775CS006 protopic lb>. Acesso em: 12
mar. 2005.
THOMPSON, A. M; BILLEWICZ, W. Z.; HYTTEN, F. E. The weight of placenta in
relation to birthweigth. Brit J Obstet Gynaecol, v.76, p. 865-872, 1969.
THOMSON, A. W. et al. Immunosuppressive activity of T-cell subset analysis, and
acute toxicity of FK506 in rats. Transplant . Proc., v.21, p.1048-1049, 1989.
TONG, T.Y. et al. Direct effects of varying doses of estradiol on early embryonic
development in in vitro culture of rat’s two-cell embryos. Can J Physiol Pharmacol,
v.78, p.453-6, 2000.
TONSHOFF, B. The current status of mycophenolate mofetil in pediatric renal
transplantation. Pediatr Transplant, v.3, p. 5-9, 1999.
TROMPETER, R. et al. Randomized trial of tacrolimus versus cyclosporin
microemulsion in renal transplantation. Pediatr Nephrol, v. 17, p. 141-149, 2002.
TYL, R. W.; MARR, M.C. Development toxicity testing – Methodology. 2005. In:
HOOD, R. D. (ed.). Developmental and reproductive toxicology - a pratical
approach. 2
nd
. ed. Londres: Taylor & Francis, 2006. p. 201-61.
UCHIDA, K. et al. Relationship between ovarian progestin secretion and corporea
lutea function in pregnant rat. Endocrinol Jpn, v.17, p.499-507, 1970.
UCHIDA, H. et al. Chronopharmacology of Tacrolimus in rats: toxicity and efficacy in
mouse-to-rat intestinal transplant model and its pharmacokinetic profile. Transplant.
Proc., v 31, n. 7, p. 2751-2753, 1999.
VENKATARAMANAN, R et al. Pharmacokinetics of fk506 following oral
administration: a comparison of FK 506 and cyclosporine. Transplant Proc, v. 23, p.
931-933, 1991.
VICENTI, F.; JENSI KS, FILO R .A long-term comparison of tacrolimus (FK 506) and
cyclosporine in kidney transplantation: evidence for improved allograff suvival at five
years. Transplantation, v. 73, p. 775, 2002.
VINCENTI, F. et al. Interleukin-2-Receptor blockade with daclizumab to prevent
acute rejection in renal transplantation . N Engl J Med. v. 388, p. 161-165, 1998
WAYNNFORTH, H. B. Changes in the volume of rat corpus luteum during pregnancy
and after surgical interference with the uterus and placenta. Acta Endocrin, v. 66, p.
296-302, 1971.
WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Principles for evaluating health risks
to progeny associated with exposure to chemicals during pregnancy.
Geneva,1984. (Environmental Health Criteria, 30).
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