ads:
UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
FRANCISCO LINDOVAL DE SOUSA
ESTRUTURA E FUNÇÃO DE MICROPEROXIDASES ASSOCIADAS A
INTERFACES CATIÔNICAS
Mogi das Cruzes SP
2006
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
FRANCISCO LINDOVAL DE SOUSA
ESTRUTURA E FUNÇÃO DE MICROPEROXIDASES ASSOCIADAS A
INTERFACES CATIÔNICAS
Dissertação apresentada ao programa de pós-
graduação em biotecnologia da Universidade de
Mogi das Cruzes, para obtenção do título de
Mestre em Biotecnologia.
Orientador: Prof
a.
. Dr
a.
Iseli Lourenço Nantes
Mogi das Cruzes SP
2006
ads:
FINANCIAMENTO: Fundação de Amparo ao Ensino e Pesquisa –
FAEP/UMC
Ata de Aprovação
Dedicatória
Aos meus pais, pela educação e carinho...
Aos meus amigos, pelo apoio e incentivo...
À minha orientadora, Dra. Iseli , pela oportunidade e estímulo...
À Marta, minha esposa, pela paciência e amor...
Ao meu filho Guilherme, pela felicidade de tê-lo comigo.
"Uma longa viagem começa com um único passo."
Lao-Tsé
RESUMO
Microperoxidase-8 (MP-8) tem sido utilizada como um modelo hidrosolúvel para estudar os
mecanismos típicos da reação das peroxidases com peróxidos, com o envolvimento dos
mesmos intermediários de alta valência do ferro, semelhantes aqueles envolvendo peroxidases
durante as reações com peróxidos. As MP-8 associadas a micelas de brometo de
cetiltrimetilamonio (CTAB) (oferece uma interface alcalina) reage com o peróxido de
hidrogênio e tert-butyl hidroperóxido (t-BuOOH) formando intermediários de alta valência
Composto I e Composto II retornando ao estado nativo para completar o ciclo catalítico
conhecido como ciclo das peroxidases. Neste trabalho, analisamos o mecanismo de reação da
MP-8, associada a micelas de CTAB e vesículas de brometo de dioctadecildimetil amônio
(DODAB), na presença e na ausência de histidina, que atua como sexto ligante exógeno do
ferro hemínico. A presença de histidina no meio contendo MP-8 promoveu alterações
espectrais indicativas da conversão do ferro hemínico da forma alto spin para baixo spin. Em
micelas de CTAB em pH 7.4, a presença de histidina na sexta coordenação do ferro causa um
impedimento estérico para a ligação de peróxidos, fazendo com que ocorra um aumento
significativo de K
M
da enzima para seu substrato. Contudo, a histidina na sexta coordenação
não atua apenas como inibidor competitivo, pois leva concomitantemente à diminuição da
velocidade máxima, o que sugere interferência no mecanismo de reação.Em pH 9.1, a reação
de MP-8/CTAB com t-BuOOH exibiu curva sigmoidal no gráfico de velocidade em função da
concentração de peróxido, no qual também se observou um aumento da velocidade máxima
em comparação com pH 7.4, indicando a presença de duas populações distintas de MP-8, uma
de alta afinidade pelo peróxido e outra de baixa afinidade peloperóxido. Em vesículas de
DODAB, MP-8 também catalisa a clivagem de peróxidos de forma pH-dependente. De forma
similar ao observado para CTAB, o aumento do pH, nestas condições diminuiu a velocidade
da reação por desfavorecer a partição do peróxido ionizado para dentro da bicamada.
Contudo, a análise cinética da reação na presença de histidina mostrou significativo aumento
da velocidade da reação em comparação com micelas de CTAB na presença e na ausência de
histidina. Este resultado sugere que, em vesículas de DODAB, a histidina pode funcionar
como um calisador ácido base. A análise da reação por EPR revelou que o mecanismo de
reação na presença de DODAB é o mesmo identificado em micelas de CTAB, ou seja,
clivagem homolítica dos peróxidos.
Palavras-chave: MP-8. CTAB. DODAB. Peróxidos. Histidina.
ABSTRACT
Microperoxidase-8 (MP-8) it has been used as a soluble model in water to study the
mechanisms of reaction of the peroxidases with peroxides, with the same intermediaries' of
high valence of the iron involvement, similar those involving peroxidases during the reactions
with peroxides. Associated MP-8 the miceles of cetyltrymetylamonium bromide (CTAB)
(that offers an alkaline interface) reacts with the hydrogen peroxide and tert-butyl
hidroperoxide (t-BuOOH) forming intermediaries of high valence Compound I and
Compound II coming back to the native state to complete the cycle known catalytic cycle of
the peroxidases. In this work, we analyzed the mechanism of reaction of MP-8, associated the
miceles of CTAB and vesicles of bromide of dioctadecyldymetyl ammonium (DODAB), in
the presence and in absence the histidine, that acts as sixth ligand of the heminic iron. The
histidine presence in the medium containing MP-8 promoted indicative spectrum alterations
of the conversion of the heminic iron of spin-up for spin-down. In miceles of CTAB in pH
7.4, the histidine presence in the sixth coordination of the iron causes an steric impediment
for the peroxides binding, making with that a significant increase of KM of the enzyme
happens for your substratum. However, the histidine in the sixth coordination doesn't just act
as inhibit competitive, because it takes concomitant to the decrease of the maximum speed,
what suggests interference in the reaction mechanism. In pH 9.1, the reaction of MP-8/CTAB
with t-BuOOH exhibited it curves sigmoidal in the graph of speed in function of the peroxide
concentration, in which an increase of the maximum speed was also observed in comparison
with pH 7.4, indicating the presence of two populations different from MP-8, one of high
likeness for the peroxide and another of low likeness for the peroxide. In vesicles of DODAB,
MP-8 also catalyzes the clivage of peroxides in way dependent pH. In a similar way to the
observed for CTAB, the increase of the pH, in these conditions reduced the speed of the
reaction for the partition of the ionized peroxide inside of the bilayer. However, the kinetic
analysis of the reaction in the histidine presence showed significant increase of the speed of
the reaction in comparison with miceles of CTAB in the presence and abscense of histidine.
This result suggests that, in vesicles of DODAB, the histidine can work as a acid/base
catalyst. The analysis of the reaction for EPR revealed that the reaction mechanism in the
presence of DODAB is the same identified in micele of CTAB, in other words, homolitc
cleavage of the peroxides.
Word-key: MP-8. CTAB. DODAB. Peroxide. Histidine.
Lista de Ilustrações
Páginas
Figura 1
Representação do grupo Heme 11
Figura 2
Ilustração de algumas ligações químicas típicas da formação da lignina 13
Figura 3
Citocromo C de coração de cavalo 19
Figura 4
Representação dos valores de spin do elétron 24
Figura 5
Espectro de EPR do íon Fe
3+
em campo cristalino axial fraco 25
Figura 6
Diagrama de blocos do espectrômetro Bruker Elexsus E580 operando no
modo (CW)
27
Figura 7
Estrutura tridimensional da parte angular da função de onda de um elétron 28
Figura 8
Esquema simplificado do espectro eletromagnético. 30
Figura 9
Espectro de absorbância eletrônica do grupo heme no seu estado reduzido
e oxidado
31
Figura 10
Formação do Composto II seguido de “bleaching” da banda Soret 32
Figura 11
Formação de um agregado micelar 33
Figura 12
Representação esquemática de uma micela aquosa 35
Figura 13
Estrutura de um lipossomo 35
Figura 14
Estrutura química das moléculas de CTAB (A) e DODAB (B) 36
Figura 15
A Espectros de absorbância de MP-8 em diferentes meios 45
B
Espectros de absorbância de 100 μM de MP-8
45
Figura 16
Espectros de EPR da Fe(III)MP-8 em na presença e na ausência de
histidina
46
Figura 17
Espectro UV-visível de 3,6 μM de MP-8 em CTAB 20 mM e histidina 5
mM na presença de t-BuOOH 0.7 mM
47
Figura 18
Constantes de velocidade de primeira ordem para Fe(III)MP-8/CTAB na
presença de histidina
48
Figura 19
Simulação computadorizada e espectro experimental de EPR obtido da
reação de MP-8 com t-BuOOH, associada a micelas de CTAB e na
presença de histidina com diferentes concentrações de DMPO
51
Figura 20
Espectros de MP-8 em lipossomos de DODAB 54
Figura 21
Espectro de MP-8 pentacoordenada e hexacoordenada 55
Figura 22
Espectros de EPR da Fe(III)MP-8 em na presença e na ausência de
histidina
57
Figura 23
A Cinéticas comparativas em pH 7.4. 60
B Cinéticas comparativas em pH 9.1 60
Figura 24
Formação do Composto II 61
Figura 25
Simulação computadorizada e espectro experimental de EPR obtido da
reação de MP-8 com t-BuOOH, associada a vesículas de DODAB e na
presença de histidina com diferentes concentrações de DMPO
62
Lista de tabelas
Tabela 1
Valores dos coeficientes de extinção molar e λ máx da Banda Soret das
microperoxidases em pH 7,00
22
Tabela 2
Possíveis configurações de spin para Fe
2+
e Fe
3+
. 29
Tabela 3
Valores dos λ máximo de MP-8 em diferentes meios.
44
Tabela 4
Parâmetros cinéticos para reação de t-BuOOH com Fe(III)MP-8 48
Tabela 5
Voltametria Cíclica de MP-8. 53
Tabela 6
Determinação do potencial zeta e do diâmetro das vesículas de DODAB e
diferentes meios.
57
Lista de Esquemas
Esquema 1
Formação de radicais fenólicos catalisada pela ação das peroxidases. 12
Esquema 2
Ciclo catalítico das peroxidases 17
Esquema 3
Microperoxidases
21
Esquema 4
Modelos de complexo MP-8/CTAB na ausência (A) e na presença (B) de
histidina.
49
Esquema 5
Reação entre peroxidases e peróxidos 50
Esquema 6
Variações no potencial ζ de DODAB associado a MP-8
59
SUMÁRIO
Páginas
1
Introdução............................................................................................................... 09
1.1 Peroxidases .................................................................................................. 09
1.2 Radicais Livres ............................................................................................ 12
1.3 Horseradish Peroxidase – Peroxidase de Raiz Forte (HRP)........................ 13
1.4 Citocromo C................................................................................................. 16
1.5 Microperoxidases......................................................................................... 17
1.6 Técnicas para estudo das peroxidases ........................................................ 21
1.6.1 Ressonância Paramagnética ........................................................ 21
1.6.2 EPR de onda contínua................................................................... 24
1.6.3
O íon ferro.....................................................................................
25
1.6.4 Espectroscopia de absorbância ultravioleta e visível.................... 27
1.7
Surfactantes, Micelas e Lipossomos...........................................................
31
1.8 Associação de microperoxidase-8 com micelas e lipossomos..................... 34
2
Objetivos................................................................................................................. 36
3 Materiais e metodologia......................................................................................... 37
3.1 Reagentes..................................................................................................... 37
3.2 Preparo de Soluções..................................................................................... 37
3.2.1 Preparação das micelas de CTAB................................................. 37
3.2.2 Preparação das vesículas de DODAB........................................... 38
3.2.3 Preparação da solução estoque de MP-8....................................... 38
3.3
Técnicas analíticas utilizadas
.................................................................
38
4 Resultados e discussão............................................................................................ 42
4.1 Parte 1 - Ciclo Catalítico de Microperoxidase-8 em micelas de CTAB, na
presença de Histidina como sexto ligante axial...........................................
42
4.1.1 Estrutura........................................................................................ 42
4.1.2 Estudo Cinético............................................................................. 45
4.1.3 Mecanismo de Reação.................................................................. 48
4.1.4
Efeito do meio e da presença de ligantes sobre o potencial
de redução de MP-8..............................................................
50
4.2 Parte 2 - Estrutura e função de Microperoxidase-8 com lipossomos
catiônicos de brometo dioctadecilmetilamonium.........................................
52
4.2.1 Estrutura........................................................................................ 52
4.2.2 Estudo Cinético............................................................................. 58
4.2.3 Mecanismo de Reação.................................................................. 59
5
Conclusões.............................................................................................................. 62
6. Referências bibliográficas...................................................................................... 63
11
1. Introdução
Os mecanismos de reação compõem a face mais obscura do mundo das proteínas,
escondendo a forma como estas catalisam as reações que possibilitam a vida. Assim, estudar
um mecanismo de reação é aprofundar nosso conhecimento no nível molecular sobre a vida e
seu funcionamento.
A ciência básica desenvolvida para os estudos estruturais e funcionais das proteínas é
geradora do conhecimento necessário para o desenvolvimento de novos produtos e aplicações
biotecnológicas tão almejadas no mundo moderno.
1.1. Peroxidases
As peroxidases são enzimas presentes em todos os animais e plantas e que possuem,
em comum, grupos prostéticos denominados genericamente como grupo heme.
1
O grupo
heme consiste em uma estrutura molecular em forma de anel, a protoporfirina, ligada a um
único átomo de ferro, no seu estado ferroso (Fe
2+
),
2
cuja especificidade é clivar peróxidos
orgânicos ou o peróxido de hidrogênio
3
.
Figura 1. Representação do grupo Heme (adaptado de: DUNFORD, H.B. Heme peroxidases, Hardcover - ,
1999).
Dentre os importantes papéis atribuídos as peroxidases de plantas, vale salientar sua
participação na síntese da lignina,
4
,5
incorporação de glicoproteínas ricas em hidroxiprolina
12
à parede celular
6
e destruição peroxidativa do ácido indolacético (IAA) e de outros
reguladores de crescimento.
7
A formação da lignina se dá pela polimerização de fenóis, classe de compostos
orgânicos formados pela ligação de uma ou mais hidroxilas em anéis aromáticos, do tipo
AOH, onde A é um grupo benzênico. Estes compostos são produzidos por enzimas presentes
no retículo endoplasmático e armazenados em vesículas devido a sua toxidade. Fenóis que se
mantém no citoplasma apresentam toxidade tanto sobre patógenos como sobre a própria
célula vegetal.
8
As peroxidases catalisam a polimerização das unidades de fenol pela
formação de radicais fenólicos, que polimerizados formam a lignina. O peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) requerido na reação é fornecido por uma reação dependente de NAD(P)H.
9
Esquema 1. Formação de radicais fenólicos catalisada pela ação das peroxidases (DUNFORD,
H.B. Heme peroxidases,
Hardcover - , 1999).
O processo de lignificação é iniciado pela migração de vesículas armazenadoras de
fenóis em direção à parede celular e subseqüente descompartimentalização destes, muitos dos
quais estão na forma glicosilada. No momento da descompartimentalização, através de reação
enzimática, a porção glicosídica é separada da porção fenólica. Os fenóis livres podem sofrer
oxidação, se ligar à parede celular ou podem ser polimerizados. A ação do H
2
O
2
, catalisada
por uma peroxidase, leva a geração de radicais livres e a formação da lignina. Concomitante à
sua formação, alguns fenóis ligam-se à parede celular servindo como uma ponte de ligação
entre a lignina e a parede celular.
4, 5
A lignina é a segunda molécula mais abundante nas plantas e tem a função de conferir
rigidez, impermeabilidade e resistência a ataques microbiológicos e mêcanicos aos tecidos
vegetais. A Figura 2 ilustra alguns motivos estruturais (grupamentos orgânicos) comuns na
13
estrutura da lignina. A proporção entre os diferentes grupos e os tipos de ligação química
formam diferentes tipos de lignina.
Figura 2: Ilustração de algumas ligações químicas típicas da formação da lignina (disponível em
http://academic.scranton.edu/faculty/CANNM1/inorganic/inorganicmodulespan.html)
Em diversas plantas tem sido descrito o aumento dos níveis de peroxidases durante
situações de estresse. As peroxidases fazem parte da primeira linha de defesa da planta e que
aumentam sua atividade em diversas situações de estresse da a planta como a exposição ao
ozônio,
10
poluição,
11,12
radiação UV,
13
desordens nutricionais,
14
lesões cutâneas,
15,16
infecções
15,17
, variações na salinidade
18
e envelhecimento
19
.
14
As peroxidases são também cruciais no catabolismo do fitohormônio IAA nas plantas
superiores, sugerindo sua importância na regulação do crescimento dos organismos
fotossintetizantes das plantas.
20
1.2. Radicais Livres
Os radicais livres são espécies químicas que possuem pelo menos um elétron
desemparelhado, geralmente pouco estáveis, e que têm a capacidade de reagir com um
grande número de compostos, podendo exercer duas funções:
• Receptores de elétrons: funcionando como agentes oxidantes;
• Doadores de elétrons: funcionando como agentes redutores.
Em nosso organismo ocorre a produção de radicais livres durante a redução do
oxigênio molecular que ocorre na cadeia respiratória. Esta redução nem sempre é completa,
ocorrendo à formação de radicais livres de oxigênio ou espécies reativas de oxigênio (EROs).
Os radicais livres ao reagirem com biomoléculas podem causar lesões nas células, o que é
descrito como estresse oxidativo.
21
Este ataque às moléculas orgânicas é indiscriminado, ou
seja, qualquer molécula biológica pode ser atacada pela espécie radical e sofrer danos. Um
exemplo disso é a lipoperoxidação, que acarreta alterações na estrutura e na permeabilidade
das membranas celulares,
22
ocasionando perda da seletividade na troca iônica e liberação do
conteúdo de organelas. Exemplo, a descompartimentização das enzimas hidrolíticas dos
lisossomos e a formação de produtos citotóxicos (como o malonaldeído), culminando com a
morte celular.
23
A lipoperoxidação é uma reação em cadeia e, portanto, catalizada pelas etapas de
iniciação, propagação e terminação. Estas etapas estão apresentadas nas reações seguintes,
onde LH representa a molécula do lipídio:
24
LH + OH• (ou LO•) Î L• + H
2
O (ou LOH) Iniciação
L• + O2 Î LOO• Propagação
LH + LOO• Î L• + LOOH Propagação
LOO• + L• Î LOOL Terminação
LOO• + LOO• Î LOOL + O
2
Terminação
15
Esta reação tem início com a retirada de um hidrogênio do ácido graxo polinsaturado
(LH) da membrana celular. Este hidrogênio pode ser retirado pelo OH• ou pelo LO• (radical
alcoxila), com conseqüente formação do L• (radical lipídico). Na primeira equação de
propagação, o L• reage com o O
2
, resultando em LOO• (radical peroxila), que, por sua vez,
retira um outro hidrogênio do ácido graxo polinsaturado, formando novamente o L• na
segunda equação de propagação. O término da lipoperoxidação ocorre quando, pelo consumo
dos reagentes, aumenta a probabilidade dos radicais (L• e LOO•) produzidos nas etapas
anteriores reagirem entre si.
O DNA também pode sofrer lesões oxidativas, acarretando em várias disfunções
genômicas, incluindo mutações pontuais.
25
Um exemplo destas espécies reativas é o radical superóxido, formado quando o
oxigênio abstrai um único elétron da cadeia respiratória:
Eq.I. O
2
+ e
-
Î O
2
--
•
O radical superóxido é precursor de outros radicais, entre eles o radical hidroxila
(OH•), que reage com a maioria das moléculas orgânicas com constantes reacionais da ordem
de 10
6
– 10
9
mol
-1
s
-1
, sendo potencialmente potente ao causar danos aos sistemas biológicos.
O organismo dispõe de mecanismos naturais de defesa contra as EROs, como a
enzima superóxido dismutase (SOD), que catalisa a reação demonstrada na Equação II:
Eq. II. 2 O
2
--
• + 2 H
+
Î O
2
+ H
2
O
2
O H
2
O
2
gerado pode ser convertido em água e oxigênio pela ação da catalase ou da
glutationa-peroxidase, que utiliza glutationa(GSH) como agente redutor. Em plantas este
papel é desenpenhado principalmente pela ascorbato peroxidase (APX).
1.3. Horseradish Peroxidase – Peroxidase de Raiz Forte (HRP)
Descoberta em 1903, a horseradish peroxidase (HRP), é uma das peroxidases mais
citadas na literatura. HRP é uma enzima estável, em solução por longos períodos em
temperatura ambiente, porém em uma faixa de pH que varia de 5 à 7 (podendo ser de 4 a 11
por períodos curtos de tempo), possui características comuns a outras peroxidases, como por
exemplo, a estrutura protéica e os sítios específicos que contém os resíduos catalíticos
16
essenciais de histidina e arginina nos centros ativos. Devido às semelhanças, esta classe
enzimática foi subdividida em três classes:
26
• Classe I - são enzimas intracelulares, incluindo citocromo c peroxidase e ascorbato
peroxidase de plantas.
• Classe II - inclui a peroxidase de secreção de fungo como a lignina peroxidase (LiP),
enzima que catalisa a reação de hidroxilação.
• Classe III - inclui peroxidases secretoras de plantas, como a HRP, essas peroxidases são
enzimas biossintéticas envolvidas no processo de formação da parede celular e
lignificação.
As peroxidases já estudadas possuem como base um mesmo ciclo catalítico que
consiste de três etapas distintas e irreversíveis: ciclo das peroxidases (Esquema 2).
27
O Composto 0 é detectado em HRP em baixas temperaturas e corresponde a espécie
porfirina ferro-hidroperóxido (PorFe(III)-OOH).
28
Esta espécie precede a formação dos
compostos I e II, os quais são conhecidos como intermediários de alta valência de HRP.
29
Trabalhos da literatura têm mostrado que os prótons, na região distal do sítio ativo do
grupo heme, influenciam a formação das espécies catalíticas reativas, tanto nas peroxidases
como no citocromo P450.
25
Em HRP, a Hist42 age como um catalisador ácido/base que
favorece o desprotonamento do hidroperóxido no sítio ativo da enzima (Composto 0) e sua
subseqüente clivagem heterolítica.
30, ,31 32
Portanto, o desprotonamento do hidroperóxido é
uma etapa crucial no ciclo catalítico das peroxidases e do citocromo P450.
17
His
+
Por
Fe
3+
OOR
H
+
e
-
e
-
His
+
H
+
H
+
O
H
H
Por
Fe
3+
ROOH
His
H
2
O
Por
Fe
3+
OOR
Native form
Forma Nativa
Compound 0
ROH
Fe
4+
O
His
Por
+
Compound I
Composto 0
Composto I
A
Fe
4+
O
His
+
Por
H
+
AH
e
-
O
H
H
Por
Fe
3+
His
Native form
Fe
4+
O
His
Por
+
H
+
AH
e
-
Fe
4+
O
His
+
Por
Compound II
Composto II
A
Forma Nativa
Esquema 2. Ciclo catalítico das peroxidases
O ciclo das peroxidases consiste de três etapas distintas e irreversíveis.
33
A enzima no
estado férrico liga-se de forma reversível a um peróxido ROOH, formando o complexo
conhecido como Composto 0 (PorFe(III)-OOR)
34
, o qual cliva o peróxido em um processo
que envolve transferência de dois elétrons e gera o intermediário conhecido como Composto I
(Por
+ •
Fe(IV)=O). O Composto I pode abstrair um único elétron oxidando uma segunda
18
molécula de peróxido ou qualquer outro agente redutor para formar o Composto II
(PorFe(IV)=O).
12
A reação do Composto II com mais ROOH forma o Composto III, um
complexo entre peroxidase férrica e íon superoxido, conhecido como oxiperoxidase
(PorFe(III)O
2
-
•
↔ PorFe(II)O
2
) (não mostrado). O Composto II também pode receber um
elétron de um outro doador de prótons (AH) e voltar a sua forma nativa (PorFe(III),
completando o chamado ciclo das peroxidases.
1.4. Citocromo c
Citocromo é o termo utilizado para designar uma classe de hemoproteínas que foram
descritas em 1923 por David Keilin (anteriormente já descritas de MacMunn). São três grupos
principais de citocromo designados pelas letras a, b e c, distinguíveis principalmente pelo seu
espectro de absorção que muda conforme os ligantes do ferro hemínico e a estrutura da cadeia
protéica.
O citocromo c especificamente é uma hemoproteína que possui um grupo heme ligado
covalentemente a sua cadeia peptídica por pontes tioeter com um ou dois resíduos de cisteína.
É encontrada ligada na face externa da membrana interna das mitocôndrias e tem uma papel
fundamental na cadeia respiratória e no processo de apoptose celular.
35
O citocromo c (Figura 3) é uma proteína relativamente pequena, sendo composta de
103 à 113 aminoácidos, covalentemente ligada a um grupo heme, podendo apresentar-se
tanto na forma oxidada como reduzida. No estado de oxidação III, o ferro hemínico do
citocromo c apresenta-se hexacoordenado, sendo a quinta e a sexta posição de coordenação,
ocupadas pela histidina 18 e metionina 80, respectivamente. O enxofre da metionina 80 ocupa
a sexta posição na faixa de pH de 3 a 9.
36, 37
19
Figura 3. Citocromo c de coração de cavalo (NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger Principles of
Biochemistry, Sarvier, 2000 – CDROM).
Estudos utilizando Ressonância Paramagnética do Elétron (RPE) com captadores de
spin demonstram que as reações de citocromo c com peróxidos, resultam no aparecimento de
radicais do tipo peroxil, alcoxil e alquil os quais possuem potencial para propagar danos nas
membranas biológicas.
38,39
Sendo assim, os mecanismos pelos quais o citocromo c promove
peroxidações são de fundamental interesse biológico.
A reação de citocromo c com t-butil hidroperóxido (t-BuOOH) leva à progressiva queda de
absorção da banda Soret em 409 nm
33
juntamente com a conversão do estado de spin do
ferro, de baixo spin para alto spin com simetria rômbica. Tem sido observado que a
associação de citocromo c com interfaces carregadas negativamente, favorece sua atividade
oxidase/peroxidase. Um exemplo é a presença de lipossomos aniônicos de dicetil fosfato
(DCP), que leva à conversão do ferro hemínico de baixo para alto spin com simetria axial,
com deslocamento da banda Soret do citocromo c de 409 nm para 405 nm, que em presença
de peróxidos, acelera a queda (bleaching) da banda Soret , levando o ferro hemínico para o
estado de alto spin com simetria rômbica.
40
Estas mudanças podem ser acompanhadas por
EPR e sugerem ser esta forma de citocromo c que catalisa reações subseqüentes com ROOH,
que resultam no “bleaching” (perda do cromóforo do composto).
34
20
1.5. Microperoxidases
A digestão proteolítica da fração protéica do citocromo c de coração de cavalo resulta
em um hemopeptídio com 8 à 11 resíduos de aminoácidos, conhecidos como
microperoxidases (MP). As microperoxidases mantém o grupo heme covalentemente ligado
aos seus resíduos de cisteína (cisteína 14 e 17 no citocromo c), através de pontes tioéster. A
ligação é feita entre os átomos α dos grupos saturados de vinil oriundos das duas metades
pirrólicas e as duas cisteínas.
Quando realizada com pepsina a hidrólise digestiva do citocromo c, resulta como
um produto undecapeptídio, ou seja, o grupo heme ligado a uma cadeia de 11 aminoácidos.
Os resíduos de aminoácidos correspondem à seqüência de aminoácidos de 11 à 21 do
citocromo c (Val – Glu – Lys – Cys – Ala – Gln – Cys- His – Thr – Val – Glu) e são
denominadas como microperoxidase 11 ( MP-11). Já a digestão do citocromo c, realizada
com tripsina, resulta em uma microperoxidase que possui 9 resíduos de aminoácidos
ligados ao grupo heme, os quais correspondem à seqüência de aminoácidos de 13 à 21 do
citocromo c (Lys – Cys – Ala – Gln – Cys- His – Thr – Vla – Glu), sendo esta denominada
microperoxidase 9 (MP-9).
A Microperoxidase 8 (MP-8) possui uma cadeia peptídica que inclui os resíduos de
aminoácidos do citocromo c de 14 à 21 (Cys – Ala – Gln – Cys- His – Thr – Vla – Glu),
sendo resultado da digestão por pepsina, seguida pela digestão com tripsina.
A MP-8 mantém os resíduos de cisteína 14 e 17 que se ligam covalentemente ao
grupo heme e a histidina 18 como ligantes axial do ferro hemínico em pH acima de 3,4.
Devido a sua composição de aminoácidos, as microperoxidases apresentam carga
líquida negativa (pI=4,7). As cargas negativas são fornecidas pelos grupos carboxila
terminal e da cadeia lateral de seu resíduo de glutamato e pelos grupos propionato do
grupo heme. O esquema abaixo mostra a estrutura da microperoxidase:
21
Esquema 3. Microperoxidases
A MP-11 exibe atividade de peroxidase que se assemelha com as peroxidases em
muitas etapas.
41
Devido ao fato de MP-11 agregar-se em soluções aquosas neutras, surge
uma dificuldade na interpretação da interação com ligantes
42
e na reação com peróxido de
hidrogênio.
43
A digestão da MP-11 pela tripsina resulta na formação da MP-8, como já citado, esta
espécie retém a maioria das propriedades da MP-11, incluindo a habilidade de coordenação
com ligantes exógenos na sexta posição
29
e exibição de atividade peroxidase.
44
Comparada
com MP-11, a MP-8 possui uma menor tendência de agregação em soluções aquosas neutras
45
, e tanto o comportamento com ligantes exógenos quanto à reação com peróxido de
hidrogênio são menos complicados. Embora a microperoxidase-8 seja solúvel em diferentes
valores de pH e temperaturas, suas moléculas costumam agregar-se em solução aquosa por
dois mecanismos: (i) coordenação intermolecular dependente de concentração,
25
situação na
qual os amino, grupos livres da cadeia peptídica, competem pela coordenação axial do lado
trans da His-18, e (ii) interações π não covalentes entre as porções distais mais expostas de
dois ou mais hemepeptídeos.
32
Uma alternativa para evitar a agregação de baixas concentrações de MP-8 em solução
aquosa neutra, é a acetilação do resíduo N-terminal de Cys-14
46
. Estudos da Lei de Beer
feitos com MP-8 acetilada, constatam agregação em altas concentrações, alegando a provável
interação intermolecular entre Cyst-14 com α amino grupo da MP-8 vizinha.
26
22
Algumas características importantes sobre as microperoxidases, necessárias para realização de
estudos espectrofotométricos estão listados na tabela abaixo:
TABELA 1: Valores dos coeficientes de extinção molar e λ máx da Banda Soret das microperoxidases
em pH 7,00
*
47
**
38
***
48 49
Espécies de MP
MP-8∗ MP-9∗∗ MP-11∗∗∗
ε ( 10
5
M
-1
cm
-1
)
1,57 ± 0,01 1,58 ± 0,01 1,76 ± 0,01
λ máx Banda Soret (nm)
397 397 395
O fato de o grupo heme ser um cofator ativo em uma variedade de enzimas oxidativas,
e a formação de estruturas de alta valência do grupo heme obtidas por oxidação da porfirina
e/ou átomo de ferro, tornam necessário a existência de modelos hemínicos. Os fatores que
influenciam na estrutura e reatividade dos intermediários podem revelar de que maneira a
proteína controla a função do grupo heme nas respectivas enzimas.
Existem critérios essências para um modelo enzimático hemínico ideal, todos de
difícil adequação. Um modelo ideal de peroxidase, deve ser uma espécie de heme solúvel em
água que seja estável no estado férrico, contendo histidina como quinto ligante e possuindo a
sexta posição livre ou bastante lábil. O modelo deve existir como um monômero em solução
aquosa na ausência de agentes estabilizadores como detergentes ou solventes orgânicos, e não
formar dímeros μ-oxo (Fe-O-Fe). Outro fator importante é que o modelo deve ser solúvel em
uma variedade de solventes em concentrações compatíveis com estudos espectroscópicos.
Nestes quesitos, a microperoxidase se enquadra como um excelente modelo para o estudo de
conformação e atividade peroxidase de hemoproteínas que possuem histidina como ligante
axial. Nesta categoria também se enquadra o citocromo c, já que a perda da sexta coordenação
do ferro hemínico pode ser obtida em determinadas condições, como redução do ferro
hemínico, pH alcalino e associação com membranas lipídicas carregadas negativamente.
50
Devido as suas características estruturais, MP-8 é capaz de converter uma grande
variedade de compostos orgânicos através de reações do tipo peroxidase.
51
Intermediários de
MP-8 de alta valência têm sido detectados durante a reação com peróxidos de hidrogênio, o
que torna este hemoctapeptídeo um bom modelo para Compostos 0, I e II de HRP as quais
23
foram detectadas durante a reação de N
α
-acetil microperoxidase-8 com peróxido de
hidrogênio.
52
Foi demonstrado um efeito competitivo dos prótons na reação de Fe(III) ou
Mn(III)MP-8 com peróxido de hidrogênio, sugerindo que o Composto 0 precede a formação
de intermediários de alta valência de Fe(III) ou Mn(III)MP-8.
53
Na comparação com HRP, o
MP-8 em meio aquoso não exibe um sítio contendo um resíduo distal básico, participando da
desprotonação do peróxido e favorecendo a clivagem da ponte O-O do mesmo. Estas
características poderiam, de algum modo, ser responsáveis pela baixa reatividade da MP-8 em
meio ácido. Em meio aquoso, pH alcalino conduz a desprotonação da água ligada a MP-8, a
qual subseqüentemente, também auxilia a desprotonação do peróxido de hidrogênio e a
coordenação do hidroperóxido ao centro metálico ou é diretamente oxidado pelo peróxido de
hidrogênio.
38
Utilizando MP-8 como modelo de peroxidase foi demonstrado que, na ausência de
histidina, dois fatores poderiam favorecer a reação: o aumento do pH do meio
54
ou a
presença de uma interface carregada positivamente, no caso micelas de brometo de
cetiltrimetilamonio (CTAB)
55,56
. Nesta última condição, foi demonstrado que a associação
de MP-8 ou MP-9 à micelas CTAB, proporcionam à enzima um micro-ambiente com
interface alcalina e um “core” hidrofóbico que dá características especiais a reação de MP-8
com peróxidos (t-BuOOH e peróxido de hidrogênio), quando comparada com a reação em
meio homogêneo. Foram realizados estudos de EPR, usando o captador de spin 5,5-dimetyl-
1-pyrroline N-oxidde (DMPO), para determinar o mecanismo de reação. Pela análise destes
resultados concluiu-se que o radical R• é o primeiro radical gerado pela decomposição do
peróxido, presumidamente por clivagem homolítica das pontes O-O pela Fe(III)MP-8/CTAB.
O EPR do ferro hemínico pode se determinado para avaliar a sua hexacoordenação já que esta
faz com que o ferro hemínico mude de alto para baixo spin .
1.6. Técnicas para estudo das peroxidases
1.6.1. Ressonância Paramagnética
A ressonância paramagnética eletrônica (RPE), EPR em inglês, também conhecida
como ressonância do spin eletrônico (ESR) é o nome dado ao processo de absorção
ressonante de microondas por átomos, íons ou moléculas paramagnéticas (com, ao menos, um
elétron desemparelhado), pela presença de um campo magnético estático. Ela tem uma
ampla gama de aplicações em química, física, biologia e medicina. É usada para mapear a
24
distribuição de um elétron desemparelhado em uma molécula, fornecendo várias informações
sobre os níveis de energia de complexos. Pode fornecer informações sobre reações de
transferência de elétrons, determinação da simetria na qual o sítio paramagnético está
envolvido, indicação de radicais produzidos durante reações de oxi-redução e em mecanismos
de atividades enzimáticas.
57
O spin de um elétron é uma grandeza dada pela orientação de seu giro sobre si mesmo,
dando-lhe uma quantidade intrínseca de movimento angular, caracterizado pelo número
quântico magnético (m
s
).
Figura 4 – Representação dos valores de spin do elétron (disponível em
http://cwx.prenhall.com/petrucci/medialib/media_portfolio/09.html)
Como o elétron possui carga elétrica, o seu movimento gera um campo magnético.
Assim, o elétron que gira em sentido horário (representado pelo vetor voltado para baixo - ↓)
tem o valor de m
s
igual a -1/2, enquanto o elétron que gira em sentido anti-horário (vetor
voltado para cima - ↑) tem o valor de m
s
igual a +1/2.
Os elétrons, pelo princípio de exclusão de Pauli, ocupam cada orbital do átomo com
número máximo de 2, emparelhados, ou seja, com spins de sinais diferentes. Naturalmente os
elétrons ocupam os orbitais com nível de energia mais baixo, passando para os de maior
energia (excitação eletrônica), quando os primeiros já estão ocupados ou quando ocorre um
estímulo que os lance para níveis superiores.
O monitoramento do estado de spin do íon ferro que ocupa o centro do sítio ativo das
peroxidases (comumente chamado de ferro hemínico), pode fornecer informações
importantes sobre estrutura e função do composto.
De maneira geral, a identificação das espécies paramagnéticas é fornecida por um
parâmetro adimensional denominado fator g efetivo, definido como “tensor giromagnético”
25
que é determinado à partir da seguinte fórmula: g=(7,14x10
-7
) • v/H
→
, onde v é freqüência da
microonda empregada e H
→
representa o campo magnético estático presente, sendo o fator
representado entre parênteses calculado através da relação entre a constante de Plank (h =
6,6262 x 10
-27
) e o valor do magneton de Bohr (β = =9,2741 x 10
-21
). Para a determinação
dos valores de g de um íon metálico, utiliza-se como referência, o valor 2,0023,
correspondente ao fator g de um elétron em um meio esfericamente simétrico, isto é,
momento orbital igual a zero. Quando há uma significativa contribuição deste momento
angular orbital ao momento magnético total do elétron desemparelhado, o valor de g poderá
desviar significativamente do fator g para o elétron livre.
Nas hemoproteínas, o espectro típico do íon Fe
3+
quando examinada em baixa
temperatura exibe duas linhas, uma muito intensa em campo baixo (g
┴
= 6) e outra de
pequena intensidade em campo alto (g
//
= 2), característico de uma simetria axial e de campo
cristalino fraco. Mudanças nesse espectro podem ser utilizadas para descrever variações de
simetria e de intensidade de campo cristalino na região onde o íon ferro está inserido na
proteína.
Figura 5: Espectro de RPE do íon Fe
3+
em campo cristalino axial fraco.
58
As medidas efetuadas nesse trabalho foram realizadas em um espectrômetro que opera
nos modos onda contínua (CW) e pulsado, e está equipado com controladores de temperatura
para a faixa 4-300K. Sua operação ocorre na banda X (≈ 9 GHz), com a microonda produzida
por diodo Gunn e amplificada por um amplificador tipo TWT (Travelling Wave Tube), com
potência máxima de saída de 1 kW. O espectrômetro (CW e pulsado) é controlado por um
computador do tipo Workstation Silicon Graphics O
2
, em ambiente UNIX.
Para um melhor entendimento sobre os experimentos de RPE de onda contínua, que
foi utilizada nos experimentos, foi feita uma breve discussão sobre os aspectos básicos do seu
modo de operação.
26
1.6.2. RPE de onda contínua
O principio básico de funcionamento do RPE por onda contínua está esquematizado
em um diagrama de blocos na Figura 6. A fonte de microondas, de freqüência na faixa de 9
GHz (banda X), alimenta os braços: principal e de referência c. No braço principal d, a
microonda segue através de um atenuador e um circulador e até atingir a cavidade f. A
função do atenuador é ajustar a intensidade da microonda incidente na amostra de acordo com
as necessidades do experimento. A radiação emitida da cavidade retorna ao circulador, que a
desvia para o diodo detector g. Este diodo atua como um retificador, transformando a
microonda incidente em um sinal DC. Porém, como a corrente que flui pelo diodo é próxima
de zero, sua detecção não é eficiente nessas condições. Sendo assim, a função do braço de
referência i é deixar passar uma quantidade fixa de potência para obtenção do sinal. É
importante ressaltar que, seja qual for a potência de microondas é necessário que ela esteja em
fase com a potência refletida da cavidade, para evitar efeitos de interferência os quais
distorcem a forma da linha. Esse ajuste é efetuado pela mudança de fase no braço de
referência.
Com o objetivo de diminuir os efeitos das flutuações térmicas da cavidade e impedir
misturas da componente dispersiva no sinal de absorção, é anexado um Controle Automático
de Freqüência (AFC) j, que estabiliza a freqüência da microonda na mesma freqüência de
ressonância da cavidade. Além disso, é adicionado um campo magnético de modulação, que
se situa normalmente na parede externa da cavidade de microondas, para melhorar a
intensidade do sinal e eliminar todo ruído que não é modulado a 100 kHz e aumentar a razão
sinal/ruído. Vale mencionar que, a freqüência da modulação do campo é escolhida a mais alta
possível, geralmente padronizada em 100 kHz, porque a maior parte do ruído presente no
equipamento é do tipo 1/f (ou ruído cor-de-rosa). Todos os outros sinais indesejados são
filtrados por um amplificador “lock-in”, o qual produz um sinal DC. Como qualquer outro
filtro, o lock-in necessita de um tempo para responder às mudanças do sistema denominado
constante de tempo.
59
27
Figura 6: Diagrama de blocos do espectrômetro Bruker Elexsus E580 operando no modo (CW). Os quadros
inferiores indicam os sinais normalmente observados nos pontos indicados.
59
1.6.3. O íon ferro
O ferro é o metal de transição mais abundante da crosta terrestre, e o quarto de
todos os elementos. Abundante também no Universo, sendo encontrados vários meteoritos
que contêm este elemento. O ferro é encontrado em numerosos minerais, destacando-se: a
hematita (Fe2O3), a magnetita (Fe3O4), a limonita (FeO(OH)), a siderita (FeCO3), a pirita
(FeS
2) e a ilmenita (FeTiO3).
É um nutriente encontrado em todos os seres vivos, participando de processo de
trasporte de elétrons para a o metabolismo energético. Este transporte é feito através de íons
ferro que mudam sua valência perdendo ou ganhando elétrons.
Um átomo de ferro possui 26 elétrons, estando 18 em camadas fechadas e 8 na
conformação orbital 3d
6
4s
2
. A camada 3d consiste de cinco orbitais capazes de aceitar a
presença de no máximo 10 elétrons de spins opostos.
28
O íon ferro pode apresentar basicamente três estados de oxidação: Fe
2+
com
configuração eletrônica d
6
(ferroso), Fe
3+
d
5
(férrico) e Fe
4+
d
4
(ferril). A dependência angular
das cinco funções de onda (orbitais) está representada na figura 7.
Figura 7 - Estrutura tridimensional da parte angular da função de onda de um elétron
Os orbitais d não são idênticos entre si, existindo duas séries de orbitais.
60
Os orbitais t
2g
, os
quais estão orientados entre os eixos x, y e z; e os orbitais e
g
que apontam ao longo dos eixos.
Para cada um dos estados do ferro hemínico podem ser possíveis tanto formas de alto
spin como baixo spin, dependendo dos ligantes presentes. Assim, ligantes fortes como o
cianeto (CN
-
), fornecem uma configuração de baixo spin e ligantes fracos, como a água,
fornecem configurações de alto spin. Na tabela 2, podemos observar as configurações
possíveis de spin para o Fe
2+
e para o Fe
3+
:
29
Tabela 2. Possíveis configurações de spin para Fe
2+
e Fe
3+
.
Spin Alto Spin Intermediário Spin Baixo
Fe
3+
S = 5/2
S = 3/2 S = 1/2
Fe
2+
S = 2
S = 1 S = 0
O ferro hemínico pode apresentar-se tanto na forma alto spin com baixo spin,
dependendo dos ligantes axiais presentes.
1.6.4. Espectroscopia de absorbância ultravioleta e visível
A espectrofotometria reúne um conjunto de recursos que permitem analisar a estrutura
de diversos compostos. O espectrofotômetro é um equipamento que permite analisar a
amostra pela diferença entre a radiação transmitida por um material tomado como referência
e a radiação transmitida pela amostra para determinado comprimento de onda.
O espectro eletromagnético é formado por ondas de diferentes comprimentos, sendo
que há diferentes técnicas para os diferentes comprimentos de onda a serem estudados. A
faixa do espectro que compreende a luz visível (a faixa do espectro eletromagnético que
estimulas os pigmentos visuais humanos) está entre os valores de 400 a 700 nm,
correspondendo as cores do vermelho ao violeta. Abaixo de 400 nm temos o ultravioleta e
acima de 700 nm temos o infravermelho (Figura 8).
61
30
Figura 8. Esquema simplificado do espectro eletromagnético. ( disponível em
http://cwx.prenhall.com/petrucci/medialib/media_portfolio/09.html)
A absorção molecular de radiação na região do UV e do visível depende da estrutura
eletrônica da molécula já que a absorção é definida pelo processo de transição eletrônica, na
qual um ou mais elétrons absorvem energia e podem, assim, passar a níveis de energia mais
elevados, entrando assim num estado excitado (excitação eletrônica). O inverso também
ocorre quando um elétron sai do orbital mais energético e retorna ao seu estado fundamental,
liberando energia em forma de calor ou através de emissão de luz, gerando processos de
fluorescência ou fosforescência.
62,63
A espectroscopia no UV/vis é amplamente utilizada para a análise de componentes
biológicos, desde que estes sejam solúveis e apresentem coloração (direta ou por reação com
outros compostos). O grupo químico funcional de uma biomolécula que, ao absorver um
fóton, transmite cor (luz não absorvida), é denominado como cromóforo.
64
Como a energia absorvida é quantizada, o espectro que se origina de uma única
transição eletrônica deveria corresponder a uma linha única e discreta. Esta previsão não se
confirma, uma vez que absorção eletrônica superpõe os subníveis rotacionais e vibracionais
das moléculas. Em moléculas complexas contendo maior número de átomos, a multiplicidade
dos subníveis vibracionais e a proximidade das energias destes subníveis fazem com que as
bandas discretas se juntem, obtendo-se, então, bandas largas de absorção.
56
As características principais de uma banda de absorção são posição e intensidade. A posição
da absorção corresponde ao comprimento de onda da radiação cuja energia é igual aquela
necessária para que ocorra a transição eletrônica. Já a intensidade de absorção depende de
dois fatores: probabilidade de interação entre a energia radiante e o sistema eletrônico, de
31
modo a permitir a passagem do estado fundamental a um estado excitado, e da polaridade do
estado excitado.
56
O espectro da absorção de um composto, apresentado na forma de um
gráfico que relaciona os comprimentos de onda com a respectiva absorção da energia
luminosa, permite a identificação da presença de um composto no meio, assim como, fornece
detalhes sobre sua estrutura.
Quando se aplica a espectroscopia no UV/vis no estudo de proteínas, como neste
estudo, os principais parâmetros a serem considerados são o pico máximo de absorção (λ
max
)
e o coeficiente de absorção molar (ε), os quais foram definidos para uma série de compostos,
podendo assim delatar a presença destes em soluções.
Os compostos que possuem um grupo heme podem ser analisados por
espectrofotometria de UV/vis. O íon ferro, quando no seu estado oxidado Fe(III), possui um
único elétron desemparelhado, o que não ocorre na forma reduzida Fe(II), pois esta não possui
elétrons desemparelhados. No seu estado reduzido, o grupo hemínico geralmente apresenta
três bandas característica de absorção: α entre 550-604 nm (no amarelo), β entre 520-546 nm
(no verde), e γ, mais conhecida como banda Soret, entre 400-450 nm (no violeta distante) . Os
comprimentos de onda não absorvidos dão ao heme sua cor vermelha característica (Figura
9).
Figura 9 – Espectro de absorbância eletrônica do grupo heme no seu estado reduzido e oxidado (disponível em
http://membres.lycos.fr/jjww/cytabc.gif)
32
Na reação de peroxidases com peróxidos há uma mudança nos valores da banda Soret
quando ocorre a formação do Composto II, o que permite acompanhar a reação através da
espectrofotometria (Figura 10A). É marcante também o processo de “bleaching” da banda
Soret, ou seja a perda do cromóforo, devido ao ataque dos radicais formados durante a reação
à estrutura do heme, provocando assim, a queda do pico máximo de absorbância da banda
Soret (Figura 10B).
Figura 10. Formação do Composto II seguido de “bleaching” da banda Soret. Cinética da reação entre MP-8 e
t-BuOOH acompanhada em 415 nm. Observa-se primeiro um deslocamento da banda Soret (A) seguido de uma
intensa perda de sinal, devida ao ataque de radicais ao cromóforo do hemopeptídio.
Uma característica importante do grupo heme, é a existência de elétrons
deslocalizados nos orbitais π do anel porfirínico. A banda Soret (no espectro de absorção)
representa a excitação dos elétrons π deslocalizados para níveis não ocupados de momento
angular similar ao do anel porfirinico. A absorção das bandas α e β provém de uma excitação
comparável, mas de momento angular diferente. A absorção dessas bandas é mais fraca pois
são transições proibidas.
65
A presença da proteína em diferentes meios, bem como quando há interação com
diferentes substratos, promove modificações na sua estrutura quartenária, na distribuição das
cargas elétricas em sua superfície, entre outras modificações, o que pode ser acompanhado no
espectro de absorbância pelas modificações nas diferentes bandas de absorção da mesma. A
perda, deslocamento ou substituição de ligantes coordenados com o ferro hemínico são fatores
que potencialmente definem tais alterações.
33
1.7. Diferentes meios que influenciam a atividade catalítica das microperoxidases
As microperoxidases, diferentemente do citocromo c e de outras peroxidases que
possuem o seu grupo heme de uma cavidade hidrofóbica, formada por sua estrutura protéica,
tem seu grupo heme exposto ao meio. O acoplamento de microperoxidases com estruturas de
micelas ou lipossomos pode mimetizar esta característica, fornecendo um “core” hidrofóbico
que envolve o heme.
Surfactantes, Micelas e Lipossomos
As moléculas de surfactantes são moléculas anfifílicas, ou seja, possuem duas regiões
distintas: uma delas apolar e outra polar ou iônica. Os surfactantes podem ser neutros ou
iônicos. Os iônicos podem ser catiônicos, aniônicos ou, ainda, zwitteriônicos, quando ambas
as cargas estão presente no surfactante. A parte apolar pode diferir no comprimento, conter
ligações insaturadas e/ou possuir duas ou mais cadeias carbônicas.
Após certa concentração (concentração micelar crítica - cmc), as moléculas do
surfactante, na solução, passam a se agregar sob a forma de vesículas, denominadas micelas
(ou de lipossomos como veremos mais adiante), agregados que apresentam um núcleo apolar,
devido as “caudas” hidrofóbicas do surfactante (mantidas afastadas da interfase aquosa) e
uma superfície polar (formada pelos grupos hidrofílicos do surfactante) que interage com as
moléculas de água do meio, como representado na figura 11.
A B
Figura 11. Formação de um agregado micelar. A. Abaixo da CMC: prevalência de monômeros. B. Acima da
CMC: prevalência de micelas.
Em concentrações acima da CMC, as micelas possuem um diâmetro entre 3-6 nm o
que representa de 30-200 monômeros. A CMC depende da estrutura do surfactante (tamanho
da cadeia do hidrocarboneto) e das condições experimentais (força iônica, contra-íons,
temperatura, etc).
As micelas são termodinamicamente estáveis e facilmente reprodutíveis, são
destruídas pela diluição com água quando a concentração do tensoativo ficar abaixo da
34
CMC.
66
O processo de formação dos agregados ocorre num intervalo pequeno de
concentrações, e pode ser detectado pela variação brusca produzida em determinadas
propriedades físico-químicas da solução em função da concentração do tensoativo como a
tensão superficial, pressão osmótica e condutividade (só para tensoativos iônicos).
67
A dissolução de um tensoativo em água provoca o surgimento de interações desfavoráveis
entre sua parte apolar e o solvente, devido a: (i) alta tensão interfacial água/hidrocarboneto,
(ii) estruturação das moléculas de água ao redor da cadeia hidrofóbica e (iii) diminuição
entropia da cadeia hidrofóbica.
68, 69
Os monômeros dos tensoativos tendem a adsorver nas interfaces (líquido-vapor,
líquido-sólido ou líquido-líquido), de modo a reduzir a energia livre total do sistema.
70,71
Nessa adsorção, as cadeias de hidrocarbonetos ficam voltadas para fora da solução e os
grupos hidrofílicos permanecem na interface aquosa.
72
No fenômeno de adsorção, ocorre a substituição de moléculas de água presentes na
interface pelo grupo hidrofóbico do tensoativo. Como as forças intermoleculares de atração
entre uma molécula de água e um grupo apolar são menores do que entre duas moléculas de
água, reduz-se o poder de contração da superfície, ou tensão superficial.
73
O número de monômeros adsorvidos na superfície, determina a extensão do
abaixamento da tensão superficial. Após a saturação na interface solução-ar, aumentando-se
ainda mais a concentração do tensoativo, os monômeros presentes no seio da solução
começam a associar-se em dímeros, trimeros, tetrâmeros, o que elimina uma parte do contato
água/óleo, diminuindo a energia livre do sistema.
O núcleo micelar é semelhante a uma gotícula de hidrocarboneto liquido.
52
O núcleo é
envolvido pela camada de Stern, que contem os grupos iônicos e também 50 a 80% dos
contra-íons, conferindo a micela uma carga residual. A camada de Stern é envolvida por uma
dupla camada elétrica difusa, denominada de dupla camada de Gouy-Chapman e que contém
os restantes dos contra-íons solvatados.
56
Os contra-íons contidos nesta e na camada de Stern,
podem trocar de posição com os íons da solução, pois ambos se encontram em equilíbrio.
74
A
Figura 12 representa esquematicamente uma micela aquosa.
35
Figura 12: Representação esquemática de uma micela aquosa.
61
Vários modelos foram propostos na tentativa de explicar as propriedades e
características das micelas. O modelo mais aceito, é o modelo de Dill e Flory, o qual leva em
consideração a mobilidade das cadeias carbônicas. As características das micelas de acordo
com este modelo, são: (i) em média todos os grupos apolares do tensoativo micelizado estão
no núcleo micelar; (ii) os grupos polares iônicos e a água são quase totalmente excluídos do
núcleo micelar; (iii) os grupos hidrofóbicos apresentam desordem conformacional (no estado
líquido) e preenchem o núcleo micelar com densidade aproximadamente igual a dos n-alcanos
líquidos; (iv) a interface água-grupos hidrofóbicos é fina (alguns Å) e (v) a camada contendo
os grupos polares é pouco rugosa.
75
Lipossomos
Nos lipossomos, as moléculas anfifílicas possuem duas caudas hidrofóbicas, as quais
devido à repulsão da água organizam-se em bicamadas que fecham-se em uma estrutura
esferoidal oca (Figura 13).
Cavidad
aquosa
e
Figura 13. Estrutura de um lipossomo. As bicamadas podem se dobrar e formar o lipossomo, que fica
com uma cavidade interna aquosa e com um domínio hidrofóbico no interior da bicamada.
36
A estrutura de organização dos lipossomos faz com que possua um compartimento
aquoso na sua cavidade interna, sendo que suas caudas apolares formam um domínio
hidrofóbico no interior da bicamada.
1.8. Associação de microperoxidase-8 com micelas e lipossomos.
Como as MP-8 possuem cargas negativas, fornecidas pelos grupos carboxila (terminal
de Glu8), e propionato (do grupo heme), utilizamos dois tipos de interfaces, ambas catiônicas
e, portanto, capazes de fornecer uma interface alcalina: o brometo de cetil-trimetil amônio
(CTAB) e o brometo de dioctadecildimetil amônio (DODAB).
O CTAB, que forma micelas, tem fórmula molecular CH
3
(CH
2
)
15
N
+
(CH
3
)
3
Br
-
e massa
molecular de aproximadamente 363,9 g/mol, ver figura 14-A:
A)
B)
Figura 14: Estrutura química das moléculas de CTAB (A) e DODAB (B)
Esta molécula comporta-se como um surfactante monocaudado catiônico e possui
número de agregação aproximadamente igual a 100 e sua concentração micelar crítica é
próxima de 0,9 mM.
Já o DODAB, que forma lipossomos, tem fórmula molecular C
38
H
80
NBr e massa
molecular de aproximadamente 631 g/mol, ver figura 14-B. Esta molécula é um surfactante
bicaudado catiônico.
Muitas aplicações têm sido descritas para lipossomos catiônicos sintéticos, compostos
de DODAB. Desde que se mostrou que estes se apresentam em vesículas com bicamadas
76
,
foram encontrados para o mesmo uso em diversas áreas
77
. Em particular, destaca-se a
interação destes compostos catiônicos com superfícies negativamente carregadas ou
37
biomoléculas como as que se apresentam em células procariontes ou eucariontes
78
, proteínas
antigênicas
79
, ácidos nucléicos
80
, polímeros sintéticos e látex e superfícies minerais.
Interações eletrostáticas garantem a interação entre MP-8 e micelas de CTAB ou
vesículas de DODAB, somadas as interações hidrofóbicas do grupo heme e da cadeia
oligopeptídica com o núcleo micelar (interior da bicamada).
Neste trabalho, caracterizamos comparativamente a atividade de peroxidase da MP-8
associada a micelas de CTAB e vesículas de DODAB na presença e na ausência de histidina
como sexto ligante do ferro hemínico.
38
2. OBJETIVOS
Neste trabalho pretendemos avaliar a associação das microperoxidases com lipossomos de
DODAB com estruturas micelares de CTAB para investigar a possível criação de um micro-
ambiente favorável a atividade catalítica peroxidásica. Nesta mesma proposta, pretendemos
também descrever o mecanismo de reação de MP-8 em vesícula de CTAB e DODAB em
função da presença de histidina como sexto ligante axial do ferro hemínico.
Especificamente propomos investigar:
• A influência da ligação de histidina com sexto ligante do ferro hemínico na associação
com as interfaces, assim como no mecanismo de reação.
• A influência do pH na atividade catalítica do complexo.
• As alterações estruturais causadas por MP-8 quando associadas as vesículas de DODAB.
• Determinação do mecanismo de reação através de EPR do ferro hemínico e EPR de
radicais livres com uso de captadores de spin.
Este sistema é um interessante modelo para estudos do mecanismo de reação da
peroxidase e suas possíveis aplicações em nanotecnologia.
39
3. MÉTODO
3.1 Reagentes
- Microperoxidase - (MP-8), - PM 1506 g/mol
- tert-butil hidroperóxido - (t-BuOOH))
- Histidina
- N-(2-Hidroxietil)piperazina-N’-(2-ácido etanosulfônico) (Hepes)
- Brometo de cetilmetil amônio - (CTAB)
- Brometo de dioctadecildimetil amônio – (DODAB)
- 5,5-dimetil-1-pirrolina N-óxido - (DMPO)
Os reagentes foram adquiridos da empresa Sigma Chemical Co. (St. Lous, MO, EUA).
3.2. Preparo de Soluções
3.2.1. Preparação das micelas de CTAB
Purificação do CTAB: recristalização
Foi preparada uma solução de 0,28 mols/l de CTAB em acetona/etanol (85% e 15%
em volume, respectivamente). Para obter uma solução translúcida, dissolve-se o CTAB em
acetona, sob aquecimento e agitação, no momento de refluxo, adiciona-se o etanol em
alíquotas. Depois de filtrada a solução ficou em repouso para gradual evaporação do solvente.
O precipitado foi filtrado a vácuo e lavado com acetona. Após ser filtrado novamente o CTAB
estava recristalizado e purificado.
81
Preparação da solução de CTAB
As micelas de CTAB foram preparadas pela diluição de CTAB purificado em tampão
(em diferentes meios tamponados com fosfato ou histidina, ambos em uma concentração de
5mM) à temperatura de 37º C, em pH 7.4 e 9.1. As concentrações de CTAB são descritas
nos respectivos experimentos.
40
3.2.2. Preparação das vesículas de DODAB
As vesícula de DODAB foram preparadas com a dissolução de 2 mM de DODAB em
tampão ( tanto hepes como histidina), sob agitação e a temperatura de 60ºC por 10 minutos,
seguidos de vortex por outros 5 minutos. Foram repetidos três ciclos de aquecimento e
agitação para obtenção da solução final.
77
3.2.3 Preparação da solução estoque de MP-8
A solução foi preparada pela dissolução de MP-8 em água deionizada, sendo que a
concentração de MP-8 foi verificada usando-se o coeficiente de extinção molar ε
397
= 1.57 x
10
5
M
-1
cm
-1
.
3.3. Técnicas analíticas utilizadas
Espectrofotometria
Os espectros foram obtidos por espectrofotômetro Shimadzu, modelo 1501 MultiSpec
(Tóquio, Japão), em cubeta de caminho óptico de 10 mm. As cinéticas foram acompanhadas
durante 600 s, em modo automático, com leituras em intervalos de 1 s.
A velocidade de conversão do Fe(III)MP-8/CTAB a Composto II/CTAB obedece uma
relação exponencial que pode ser ajustada a uma equação de primeira ordem mostrada abaixo,
)
.
1(
t
obs
k
ePP
−
−=
∞
(Eq. 1)
onde P e P
∞
são a concentração em um determinado tempo e em um tempo infinito,
respectivamente, e k
obs
é a constante de velocidade de pseudo-primeira ordem observada na
conversão de Fe(III)MP-8 a Composto II.
A influência da concentração do peróxido na velocidade de conversão do Fe(III)MP-8 a
Composto II, obedece a Equação 2,
][
].[
2
ROOHK
ROOHk
k
app
m
obs
+
=
(Eq. 2)
onde k
obs
é a constante de velocidade de pseudo-primeira ordem de conversão de Fe(III)MP-8
a Composto II, k
2
é a velocidade máxima, [ROOH] é a concentração de peróxido e K
mapp
é a
41
constante de pseudo-primeira ordem ou dinâmica aparente para que ocorra interação entre
Fe(III)MP-8/CTAB e peróxidos.
K
mapp
é definido na Equação 3,
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
+
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
+=
−
+
1
21
]H[
1
k
kk
K
K
a
app
m
(Eq. 3)
onde K
mapp
é a constante de pseudo-primeira ordem de interação entre Fe(III)MP-8/CTAB e
peróxidos, K
a
é a constante de inibição, já que o desprotonamento é uma etapa crucial, k
1
é a
constante de associação do Fe(III)MP-8/CTAB com peróxidos, k
–1
é a constante de
dissociação do Fe(III)MP-8/CTAB com peróxidos, e k
2
a constante de formação do Composto
II.
Ressonância paramagnética
As medidas de ressonância paramagnética (EPR) foram obtidas com 100 μM de
Fe(III)MP-8 , a concentração da solução micelar de CTAB foi de 60 mM e a concentração de
DODAB foi de 2 mM. Os experimentos foram feitos em um equipamento de ressonância
paramagnética eletrônica de onda contínua com banda X da linha Elexsys da Bruker, com
acessório da Oxford para variação de temperatura ( temperatura ambiente até hélio liquido -
270 ºC) sob as seguintes condições: campo 5 x 10
3
T, amplitude de modulação 1.0 mT,
microondas 4 mW, temperatura 11K. Após mistura, as soluções foram rapidamente
introduzidas em um tubo de quartzo especial para EPR, o qual foi previamente resfriado com
nitrogênio liquido. Depois de congelada a amostra foi introduzida na cavidade de microondas,
submetida à baixa temperatura e as medidas de EPR foram então realizadas.
Voltametria cíclica
A técnica da voltametria cíclica consiste em submeter um eletrodo, denominado
eletrodo de trabalho a um potencial elétrico (sinal de excitação). O voltamograma cíclico é
obtido da medida da corrente neste eletrodo durante a varredura de potencial. A corrente pode
ser considerada o sinal de resposta à aplicação deste potencial.
Os equipamentos de voltametria cíclica possuem três eletrodos: o eletrodo de trabalho,
no qual ocorre a reação; um eletrodo de referência (eletrodo de Ag/AgCl), pelo qual passa
uma corrente fixa que serve de parâmetro para comparação com a corrente do eletrodo de
42
trabalho no qual não há fluxo de corrente; e um terceiro eletrodo denominado eletrodo
auxiliar ou contra-eletrodo, normalmente um fio de platina.
Em um voltamograma típico, os principais parâmetros de interesse medidos são os
valores de potencial de pico anôdico e catódico, E
pa
e E
pc
, respectivamente as correntes de
pico anôdico e catódico I
pa
e I
pc
e a diferença entre os potencia de pico ΔEp = E
pa
– E
pc
. O
potencial de pico médio é obtido através da média entre os potenciais de pico: E
m
= (E
pa
+
E
pc
) / 2.
82,83
As medidas de voltametria foram realizadas em equipamento AUTOLAB PGSTAT30,
em temperatura ambiente (25 ± 2ºC).
Foi injetado argônio no sistema MP-8/CTAB para remover o oxigênio da solução na
célula eletroquímica.
Potencial Zeta (
ξ
)
A maioria dos materiais particulados dispersos em água adquire uma carga elétrica na
superfície da partícula. Essa carga pode aparecer de várias maneiras: a dissociação de grupos
ionogênicos na superfície da partícula e a adsorção diferencial de íons da solução na
superfície da partícula.
A carga líquida superficial da partícula afeta a distribuição de íons em torno da
mesma, aumentando a concentração de íons com cargas opostas a da superfície (os contra-
íons), na região proximal. Isso faz com que se forme uma dupla camada elétrica na interface
entre a partícula e o líquido. Essa dupla camada divide-se em duas regiões: uma região interna
que inclui íons fortemente ligados à superfície e uma região exterior onde a distribuição dos
íons é determinada pelo equilíbrio entre forças eletrostáticas e movimento térmico. Dessa
forma, o potencial nessa região decai com o aumento da distancia da superfície até uma
distância suficientemente grande, atingir o potencial da solução. Esse potencial é
convencionado como potencial zero. A diferença de potencial entre as camadas formadas no
plano de cizalhamento entre a partícula e o meio circundante é denominado potencial ξ. O
potencial ξ é dado em função da carga superficial da partícula de qualquer camada adsorvida
na interface com o meio e da natureza e composição do meio que a circunda.
Esse potencial pode ser determinado experimentalmente e, uma vez que reflete a carga
efetiva das partículas, esta correlacionado com a repulsão eletrostática e a estabilidade destas
na suspensão.
43
O potencial ξ e o diâmetro das vesículas de DODAB foram determinados em aparelho
Zeta Plus – Zeta Potencial, da Brookhaven Instruments Corporation.
44
4. Resultados e Discussão
Os resultados são apresentados em duas partes: a primeira relativa aos estudos com
MP-8 hexacoordenada associada a micelas de CTAB e a segunda relativa à interação de MP-8
com lipossomos de DODAB.
4.1. Parte 1 - Ciclo Catalítico de Microperoxidase-8 em micelas de CTAB, na
presença de Histidina como sexto ligante axial.
4.1.1 - Estrutura
A Figura 15A mostra o espectro de 3,6 μM Fe(III)MP-8, na presença e na
ausência de micelas de CTAB e na presença e na ausência de histidina 5mM.
Fe(III)MP-8, quando associada a micelas de CTAB apresenta um espectro
característico do grupo heme em meio apolar
84
e na presença de histidina (com ou
sem CTAB), há um desvio da banda Soret para a região do vermelho e mudança na
posição das bandas Q, indicando que a histidina tornou-se o sexto ligante do ferro
hemínico da MP-8 convertendo-a da forma alto spin para baixo spin. A coordenação
da histidina na sexta posição do ferro hemínico ocorre mesmo em concentrações
maiores de MP-8, como mostra a Figura 15B, na qual se pode comparar o espectro de
MP-8 100 μM, tanto associada a micelas de CTAB 60 mM, como em meio
homogêneo, na presença de histidina 5 mM. Na Tabela 3, são apresentados os valores
para os picos de absorção da banda Soret de MP-8 nos diferentes meios.
Tabela 3. Valores dos λ máximo de MP-8 em diferentes meios.
MP-8 em diferentes meios
λ máx Banda Soret (nm)
Fosfato 397
Histidina 405
CTAB (20 mM), fosfato 400
CTAB (20 mM), histidina 406
45
350 400 450
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
A (Intensidade)
Comprimento de Onda (nm)
450 500 550 600 650
0.00
0.02
0.04
0.06
Figura 15- A. Espectros de absorbância de MP-8 em diferentes meios. Linha pontilhada – MP-8
em tampão fosfato pH 7,4. Linha fina cheia - MP-8 em histidina 5mM e pH 7,4. Linha tracejada –
MP-8 em 20 mM de CTAB, tampão fosfato pH 7,4. Linha grossa cheia – MP-8 em 20 mM de CTAB
em histidina pH 7,4. O espectro na região do visível evidencia a coordenação da histidina com o ferro
hemínico. As condições experimentais foram: 4,0 μM MP-8, tampão fosfato 5,0 mM, pH 7,4, CTAB
20 mM dissolvido em fosfato 5,0 mM pH 7,4, histidina 5,0 mM pH 7,4, CTAB 20 mM dissolvido em
histidina 5,0 mM pH 7,4, temperatura de 30°C. Os experimentos foram feitos em cubeta com caminho
óptico de 1 cm.
350 400 450
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
A (Intensidade)
Comprimento de Onda (nm)
450 500 550 600 650
0.00
0.05
0.10
0.15
Figura 15- B. Espectros de absorbância de 100 μM de MP-8. Linha cheia grossa – MP-8 em 60
mM de CTAB e histidina 5mM. Linha cheia fina - MP-8 em histidina 5mM e pH 7,4. Experimentos
realizados em histidina 5,0 mM, pH 7,4 e temperatura de 30°C.
46
As medidas de EPR efetuadas nas condições acima descritas confirmam que o ferro
hemínico foi convertido da forma alto para baixo spin, após adição de histidina no meio,
como podemos observar na Figura 16, onde fica evidente que a presença de histidina, em
meio homogêneo e heterogêneo, tanto em pH 7,4 como em pH 9,1 leva ao desaparecimento
do sinal do ferro hemínico na forma alto spin com simetria axial (g ~ 6,0) e o aparecimento do
sinal da forma baixo spin (veja indicações na Figura 16). Contudo, em micelas de CTAB na
presença de histidina, o espectro de EPR do ferro hemínico revela que existe uma pequena
população de MP-8 na forma alto spin, ou seja, hemopeptídeos que se associaram às micelas
na chamada forma pentacoordenada (Em forma pentacoordenada, a sexta posição do ferro
hemínico também está ocupada, mas neste caso por um ligante de campo fraco, como uma
molécula de água do meio, o que mantém sua forma alto spin).
0 1000 2000 3000 4000
-2
0
2
4
6
8
10
* - sinal de alto spin
** - sinal de baixo spin
**
**
**
**
*
*
*
e
d
c
b
a
Intensidade (u.a.)
Campo Magnético (mT)
Figura 16. Espectros de EPR da Fe(III)MP-8 em na presença e na ausência de histidina. Linha a:
Fe(III)MP-8 em hepes pH 7.4. Linha b: Fe(III)MP-8 na presença de histidina em pH 9.1. Linha c: Fe(III)MP-8
em histidina pH 7.4. Linha d: Fe(III)MP-8 associada a CTAB e histidina, pH 7.4. Linha e: Fe(III)MP-8
associada a CTAB e histidina em pH 9.1. Experimentos realizados em 100 μM de MP-8, 60 mM de CTAB, 5
mM de hepes e 5 mM de histidina.
47
4.1.2 – Estudo cinético
Uma vez comprovada a coordenação da histidina exógena na sexta posição de
coordenação do ferro hemínico, passamos aos estudos cinéticos destes modelos na presença
de t-BuOOH. Foi feito um estudo comparativo sobre o efeito da histidina na sexta posição do
ferro hemínico sobre as constantes cinéticas da reação com peróxido em meios homogêneos e
heterogêneos. A velocidade de reação entre MP-8 e t-BuOOH muda com a presença de
histidina no meio – Tabela 4. Previamente foi determinado que a reação da MP-8 com o
peróxido na presença de micelas de CTAB em tampão fosfato, é mais lenta do que em meio
homogêneo
13
. Em micelas de CTAB, a adição de histidina torna a reação entre MP-8 (neste
caso, hexacoordenada) e t-BuOOH mais lenta, tanto em pH 7.4 (Tabela 4) como em pH 9.1,
quando comparada com a mesma reação catalisada pelo hemopeptídeo pentacoordenado.
350 400 450
0,0
0,2
0,4
0,6
Tempo (s)
0
30
50
200
600
Abs.
Comprimento de Onda (nm)
500 600
0,02
0,04
0,06
Figura 17. Espectro UV-visível de 3,6 μM de MP-8 em CTAB 20 mM e histidina 5 mM na
presença de t-BuOOH 0.7 mM. Cinética acompanhada em 415 nm (inserto), em pH 7.4 e pH 9.1. O
deslocamento da banda Soret para região do visível é característica da formação de Composto II.
48
TABELA 4: Parâmetros cinéticos para reação de t-BuOOH com Fe(III)MP-8
pH 7.4
Km
mM
K
2
s
-1
K
2
/Km
M
-1
.s
-1
Fe(III)MP-8
CTAB 20 mM
0,17 0,14 808
Fe(III)MP-8
CTAB 20 mM
Histidina 5 mM
0,63 0,0032 5
Provavelmente, neste caso, a histidina como sexto ligante do ferro hemínico,
estabelece um impedimento estérico para o acesso do peróxido ao centro catalítico visto que o
sexto ligante precisa ser desligado para que o peróxido possa formar o Composto 0 (Veja
Esquema 4). De fato, todas as peroxidases conhecidas apresentam o ferro hemínico
pentacoordenado.
Em pH 9.1, o perfil gráfico obtido a partir do plote da velocidade da reação em função
da concentração de peróxido sugere a existência de duas populações de enzima conforme
pode ser observado na Figura 18 (veja linhas cheias grossa e fina para pH 9.1).
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
Δ
A.s
-1
[Peróxido] (mM)
Figura 18. Constantes de velocidade de primeira ordem para Fe(III)MP-8/CTAB na presença de
histidina. Esferas pretas: experimento realizado em pH 7.4. Esferas cinzas: experimentos realizados
em pH 9.1. Os ensaios foram feitos com 3,6 μM de Fe(III)MP-8, CTAB 20 mM e concentrações de t-
BuOOH variando de 0 a 1.2 mM. A temperatura de 25ºC.
49
Uma população apresenta alta afinidade pelo peróxido, enquanto uma segunda
população apresenta baixa afinidade pelo substrato e exibe comportamento cooperativo em
função da concentração de substrato. A existência de duas populações fica evidente nos
espectros de EPR (Figura 14). Na população de moléculas de MP-8 hexacoordenada, uma vez
superada a barreira física proporcionada pela histidina na sexta posição de coordenação do
ferro hemínico, a eficiência catalítica é maior do que em pH 7.4 (velocidade máxima maior).
Isto pode ser devido ao fato de que o pH alcalino favorece a reação porque os prótons
comportam-se como inibidores competitivos do processo, como já evidenciado
53
. Trabalhos
subseqüentes de nosso laboratório demonstraram que em presença de interfaces alcalinas, o
fator limitante da formação de Composto 0, a etapa de desprotonamento da água de
coordenação do ferro hemínico era eliminado. Neste caso, o aumento do pH do meio tinha
efeito inverso ao observado em meio aquoso porque levava ao desprotonamento do peróxido
na interface da micela e diminuía sua partição no núcleo micelar. Na presença de histidina,
estamos observando novamente o favorecimento da reação em pH alcalino, o que nos faz
supor uma estrutura diferente para o agregado MP-8/CTAB/histidina em comparação com o
agregado MP-8/CTAB. Provavelmente no sistema, contendo histidina, não deve existir uma
micela fechada, mas talvez moléculas de CTAB adsorvidas sobre as regiões hidrofóbicas do
hemopeptídeo, que permitem maior exposição do ferro hemínico ao meio aquoso e, portanto,
novamente, susceptível ao efeito inibitório dos prótons do meio. O esquema 4 ilustra o
modelo proposto.
A B
Esquema 4. Modelos de complexo MP-8/CTAB na ausência (A) e na presença (B) de histidina.
Histidina
MP-8
Micelas
Acesso aos
prótons
50
4.1.3 - Mecanismo de Reação
A reação entre peroxidases e peróxidos segue um mecanismo conhecido como ciclo
das peroxidases (Esquema 2).
85,86
Neste sistema, dois mecanismos de reação são possíveis
para a clivagem do peróxido: clivagem heterolítica, gerando o derivado álcool do peróxido (t-
butanol no caso da clivagem de t-BuOOH) e MP-8/CTAB Composto I (Esquema 5- eq. 3), ou
uma clivagem homolítica, gerando um radical t-butiloxil (RO•) e MP-8/CTAB Composto II
(Esquema 5- eq. 4). No mecanismo de clivagem heterolítica, o Composto I reage com uma
molécula redutora que pode ser o próprio peróxido gerando o radical peroxil (Esquema 5- eq.
5), como descrito no esquema 2. Nos dois mecanismos, o Composto II reage com um agente
redutor que pode ser o próprio peróxido e é reconvertido à forma nativa.
Esquema 5. Reação entre peroxidases e peróxidos
PorFe(III)-OH
Por
+
Fe(IV)=O
PorFe(IV)=O
ROOH
ROH
PorFe(III)-OOR
ROO
.
ROOH
(clivagem heterolítica)
(1)
+
+
+
RO
.
(clivagem homolítica)
(2)
Por+Fe(IV)=O
+
PorFe(IV)=O
+
PorFe(III)-OOR
PorFe(III)
-
OOR
+
(3)
(4)
(5)
PorFe(III)-OH
2
PorFe(III)-OH
+
H
+
HOH
Várias são as reações pelas quais podem ser produzidos os radicais alcoxil (RO•) a
partir de radicais peroxil (ROO•) e vice-versa Os diferentes mecanismos propostos no
esquema 5 mostram a produção inicial de radicais RO• gerados pela clivagem homolítica de
peróxidos (Esquema 5- eq. 4) ou ROO• pelo ataque do Composto I ao ROOH (Esquema 5-
eq. 5). Neste caso, o Composto I foi anteriormente formado pela clivagem heterolítica do
peróxido (Esquema 5- eq. 3). As reações subseqüentes do radical produzido inicialmente
podem ser suprimidas pelo aumento da concentração de um captador de radicais livres como
o DMPO, um método já utilizado anteriormente em outros trabalhos para caracterização dos
radicais gerados em sistemas biológicos
38,87
. Os captadores de spin são nitróxidos que reagem
com os radicais livres formando adutos químicos mais estáveis e de mais fácil detecção.
Nestes adutos, o radical livre fica no grupo nitróxido o que estabiliza este radical e permite a
identificação por EPR.
De acordo com este método, quanto maior a concentração de captador de spin presente
no meio, maior a chance de que o radical inicial reaja com o captador antes de sofrer reações
secundárias. Portanto, altas concentrações de captador previnem que o radical inicial reaja
51
com outros tipos de moléculas ou entre si, formando radicais secundários. Contudo, em baixas
concentrações, o captador de spin perde a competição com as reações secundárias e acaba
reagindo com os radicais livres secundários produzidos. Nós utilizamos está estratégia para
determinar que tipo de radical é produzido inicialmente pela reação entre MP-8/CTAB com t-
BuOOH, o radical ROO• ou RO•. Para isso, a contribuição do aduto de DMPO foi testada
em diferentes concentrações de DMPO (Figura 19).
3320 3340 3360 3380 3400 3420
-7000
-6000
-5000
-4000
-3000
-2000
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
N
O
H
OR
N
O
H
R
e
d
c
b
a
Intensidade (u.a.)
Campo Magnético (Gauss)
Figura 19 – Simulação computadorizada e espectro experimental de EPR obtido da reação de
MP-8 com t-BuOOH, associada a micelas de CTAB e na presença de histidina com diferentes
concentrações de DMPO. Linhas a, b e c correspondem aos espectros de 100 μM MP-8 em 60 mM
de CTAB, 5,3 mM de t-BuOOH e 22 mM, 90 mM e 360 mM de DMPO, respectivamente. Linhas d e
e: são as simulações individuais dos sinais de aduto nos espectros a e c, respectivamente. Linha d, é o
espectro simulado para DMPO/•R (alquil): linha com 1.3 G e com forma gaussiana; Linha e, é o
espectro simulado para DMPO/•OR (t-butiloxil): linha com 1.4 G e forma gaussiana. As condições do
espectrofotômetro foram, amplitude de modulação 0,05 mT, microondas 20 mW, temperatura
ambiente, tempo de leitura 2 min, escala de 100 Gauss e ganho de 1.6 x 10
4
.
Entretanto, diferentemente do que ocorre quando citocromo c catalisa a clivagem do t-
BuOOH, o aduto peroxil não foi detectado em baixas concentrações de captador de spin e o
radical observado foi o aduto de um radical carbono, provavelmente
•
CH
3
. O radical alquil
pode ter sido formado pela clivagem do radical t-butiloxil, de acordo com a equação abaixo.
CH
3
CH
3
O
t-BuO
CH
3
.
.
+
52
Nestes experimentos, as concentrações relativas dos radicais adutos representadas por
linhas de campo baixo foram calculadas utilizando simulação computadorizada. As
contribuições relativas dos adutos alquil e alcoxil para os espectros compostos de EPR foram
influenciadas pela concentração de DMPO (linha a, b e c, respectivamente). Os espectros de
EPR registrados para a mistura contendo Fe(III)MP-8/CTAB e t-BuOOH na presença de 22
mM de DMPO revelaram um aduto de DMPO (linha a) e sua correspondente simulação
(linha d) exibiu as seguintes constantes de interação hiperfina: a
N
= 16.00 G a
H
β
= 23.10 G
que podem ser atribuídas ao radical alquil.
Quando o experimento foi realizado na presença de 90 mM de DMPO (linha b), a
contribuição relativa do radical aduto alquil diminuiu, enquanto o radical t-butiloxil
aumentou. Na presença de 360 mM de DMPO, a contribuição do radical aduto alquil,
desapareceu (linha c). A simulação do radical aduto DMPO (linha e) apresentou as constantes
de interação hiperfina: a
N
= 14.96 G a
H
β
= 16.10 G que podem ser atribuídas ao radical t-
butiloxil. Os parâmetros hiperfinos observados a
N
e a
H
β
, são menores que os valores
mostrados na literatura. Na presença de CTAB o desdobramento produzido pelo spin nuclear
do H
γ
(a
H
γ
) não foi observado, mas contribuiu para aumentar a largura da linha (linha com
1,60 G para o radical R• e 1,65 G para o radical RO• comparado com 0,75 G e 0,70 G
respectivamente obtido em meio homogêneo). Isto pode ser atribuído à geração de adutos de
radical livre no micro-ambiente hidrofóbico e viscoso provido pelo núcleo micelar. Estes
resultados foram similares aos previamente observados para MP-8/CTAB na ausência de
histidina .
13
Portanto, a presença de histidina não afetou o mecanismo de reação, ou seja, a
clivagem homolítica de peróxidos também foi o mecanismo predominante para a atividade da
lipoenzima MP-8/CTAB na presença de histidina, desde que o radical peroxil não foi
detectado e o radical alquil pode ser produzido pela quebra do radical alcoxil.
4.1.4 - Efeito do meio e da presença de ligantes sobre o potencial de redução de MP-8
Considerando as diferenças observadas na atividade peroxidásica exibida por MP-8
em micelas de CTAB na presença e na ausência de sexto ligante, tornava-se importante
determinar como estas condições afetavam o potencial de redução deste hemopeptídeo.
A Tabela 2 apresenta os valores de E
1/2
de MP-8 determinados por voltametria cíclica,
tanto na ausência como na presença de CTAB e na ausência e na presença de histidina. Para
53
comparação são dados também os valores obtidos para MP-9 e MP-11, na ausência e na
presença de CTAB.
88
Tabela 5. Voltametria Cíclica de MP-8.
Meio
E
1/2
(mV)
Meio
E
1/2
(mV)
Fosfato -179
Fosfato
-346
CTAB / Fosfato -141
MP-9
CTAB / Fosfato -231
Fosfato
-346
MP-8
CTAB / Histidina -187 MP-11
CTAB/ Fosfato
-276
A presença de micelas de CTAB aumentou o MP-8 E
1/2
de -179 para -141 mV. Na
presença de micelas de CTAB, na ausência ou presença de histidina, o mínimo ΔE
p
obtido
para 10 mV.s
-1
sugere que a reação não é totalmente reversível.
O núcleo hidrofóbico provido pelas micelas de CTAB minimiza o potencial redutor das
microperoxidases, aumentando o poder oxidante das lipoenzimas quando comparado com
microperoxidases em meio homogêneo.
Dados da literatura tem mostrado que, diferentemente de outras,
13
microperoxidases exibem
uma rápida transferência de elétrons na ausência de promotores ou mediadores. Este comportamento
pode ser atribuído a uma conformação distorcida das microperoxidases na qual o grupo heme está
mais exposto ao solvente.
O aumento do potencial redutor observado para MP-8 após a associação com micelas de CTAB
condiz com os resultados previamente obtidos para MP-9. Neste caso, o fato de que histidina tenha
promovido a queda no potencial de redução para valores próximos aos do meio homogêneo está
condizente com o modelo proposto para o agregado MP-8/Histidina/CTAB no qual sugere que maior
abertura da micela com exposição do grupo heme ao meio aquoso (Veja Esquema 4).
54
4.2 Parte 2 - Estrutura e função de Microperoxidase-8 com lipossomos
catiônicos de brometo dioctadecilmetilamonium (DODAB).
4.2.1 - Estrutura
Os resultados que têm sido obtidos com micelas de CTAB
55
e o presente trabalho,
deixam claro que as interfaces catiônicas possuem propriedades que afetam
significativamente a estrutura e a função das microperoxidases. Portanto, a interação de MP-8
com vesículas de DODAB mostrava-se um interessante modelo para um estudo comparativo.
A Figura 20 mostra o espectro de MP-8 (3,66 μM) em meio contendo lipossomos
sintéticos de DODAB (2 mM) em tampão Hepes (5 mM), em diferentes temperaturas.
300 350 400 450
0,0
0,1
0,2
0,3
450 525 600 675
0,000
0,025
0,050
A (Intensidade)
Comprimento de Onda (nm)
Figura 20- Espectros de MP-8 em lipossomos de DODAB. Linha pontilhada: MP-8 em
DODAB/HEPES pH 7.4 e 60ºC. Linha cheia grossa: MP-8 em DODAB/HEPES pH 7.4 e temperatura
ambiente. Linha tracejada: MP-8 em CTAB/HEPES e temperatura ambiente. Foram utilizados 3,66
μM de MP-8, DODAB 2 mM, Hepes 5 mM pH 7.4.
Da mesma forma que acontece em presença de micelas de CTAB, observa-se a temperatura
ambiente, um sutil desvio da
banda Soret para a região do vermelho na presença de DODAB.
Este resultado sugere que o octapeptídio insere-se mais na bicamada lipídica. Como o desvio
55
é mais pronunciado na presença de DODAB pode-se supor que MP-8 enterra-se mais na
bicamada do que no núcleo micelar. Aquecendo-se o meio até 60 ºC, observa-se um retorno
do pico da banda Soret para comprimento de onda próximo (402 nm), ao encontrado em
CTAB (401 nm). Propomos que este deslocamento ocorre devido ao aumento da fluidez da
membrana devido a elevação da temperatura, o que facilita o a exposição do grupo heme de
MP-8 na região aquosa. Podemos observar também grandes mudanças espectrais na região do
visível em função do tipo de surfactante e da temperatura.
Em presença de histidina 5mM, ocorre uma alteração espectral das bandas Q e um
deslocamento da banda de Soret para o vermelho bem como aumento do ε da banda Soret
(Figura 21). Este resultado sugere que a histidina ocupa a sexta posição de coordenação do
ferro hemínico da microperoxidase, levando-a do estado de alto spin para o baixo spin, da
mesma forma como ocorre em meio contendo micelas de CTAB (Figura 21).
350 400 450
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
A (Intensidade)
Comprimento de Onda (nm)
450 500 550 600
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
Figura 21- Espectro de MP-8 pentacoordenada e hexacoordenada. Linha cheia fina: MP-8 em
DODAB/Hepes pH 7.4. Linha cheia grossa: MP-8 em DODAB/Histidina pH 7.4. Condições
experimentais: 3,66 μM de MP-8, 2 mM de DODAB, 5mM de Hepes pH7.4 e 5mM de Histidina pH
7.4.
A elucidação dos estados de spin de MP-8 na presença e na ausência de DODAB e/ou
histidina foi feita pela análise dos espectros de EPR obtidos nas diferentes condições. A
Figura 22 mostra os espectros de EPR de MP-8 na presença e na ausência de histidina em
meio homogêneo (duas linhas superiores) e na presença e na ausência de histidina em
vesículas de DODAB. Em meio homogêneo (tampão HEPES, pH 7.4) observamos pelo
espectro de EPR que existem duas populações de MP-8, uma na forma alto spin com simetria
56
axial, ou seja, com água na sexta posição de coordenação do ferro hemínico e uma população
de baixo spin com simetria rômbica, formada pela coordenação do ferro hemínico de uma
molécula de MP-8 com o amino grupo terminal de outra molécula de MP-8.
89
Como o
espectro foi obtido em pH 7.4, MP-8 está predominantemente na forma alto spin, visto que a
população de moléculas com amino grupo terminal desprotonado é baixa. Quando o tampão
HEPES foi trocado por tampão histidina, que é capaz de coordenar o ferro hemínico por meio
do grupo imidazol de sua cadeia lateral, houve total conversão de MP-8 para a forma baixo
spin, indicando que a histidina do meio ocupou a sexta posição de coordenação do ferro
hemínico. A comparação entre os espectros de EPR de MP-8 baixo spin coordenada com
amino grupo terminal da molécula vizinha e MP-8 coordenada com histidina adicionada ao
meio, revela, como era de se esperar, que a coordenação com histidina diminuiu o grau de
rombicidade do grupo heme evidenciado pela aproximação dos sinais de g
x
e g
y
. MP-8 em
presença de vesículas de DODAB em meio tamponado com HEPES, apresenta-se em duas
populações no espectro de EPR. Neste caso, aproximadamente metade da população encontra-
se na forma alto spin com simetria axial e a outra metade encontra-se na forma baixo spin
com grau de rombicidade similar ao encontrado em meio homogêneo. Sendo assim, o
aumento da população com baixo spin sugere que várias moléculas de MP-8 associam-se a
uma mesma vesícula de DODAB e podem estabelecer coordenação inter-cadeia no interior da
bicamada. Quando as vesículas de DODAB foram tamponadas com histidina, não houve
completo desaparecimento do sinal de alto spin, embora o mesmo tenha caído drasticamente.
Este resultado sugere que uma pequena parcela das moléculas de MP-8 não carregaram
histidina como sexto ligante para dentro da bicamada. O sinal de MP-8 baixo spin também foi
detectado neste caso, contudo com significativa perda de intensidade, possivelmente por
algum tipo de interação entre as moléculas de MP-8 no interior da membrana que tenha
promovido um acoplamento anti-ferromagnético do ferro hemínico.
57
900 1200 1500
3
6
9
12
2000 3000 4000
3
6
9
12
d
c
b
a
Intensidade (u.a.)
Campo Magnético (mT)
* - sinal de alto spin
** - sinal de baixo spin
**
**
**
**
*
*
*
Figura 22. Espectros de EPR da Fe(III)MP-8 em na presença e na ausência de histidina. Linha a:
.: Fe(III)MP-8 na presença de histidina e pH 7.4. Linha b: Fe(III)MP-8 em hepes pH 7.4. Linha c:
Fe(III)MP-8 associada a DODAB, hepes e pH 7.4. Linha d: Fe(III)MP-8 associada a DODAB em
presença de histidina e pH 7.4. Experimentos realizados em 100 μM de MP-8, 2 mM de DODAB, 5
mM de Hepes e 5 mM de Histidina.
A análise do potencial zeta dos lipossomos de DODAB foi realizada com e sem MP-8,
em meio aquoso contendo ou não histidina - Tabela 6.
Tabela 6 - Determinação do potencial zeta e do diâmetro das vesículas de DODAB e diferentes
meios. Condições experimentais: 2mM de DODAB, 2 mM de Histidina e 25 μM de MP-8.
AMOSTRA
DIÂMETRO DA
VESÍCULA (nm)
POTENCIAL ZETA
(mV)
DODAB - H
2
O 408,9 53 ±1
DODAB - H
2
O – MP-8 550,2 38 ±1
DODAB - HISTIDINA 260 70 ±5
DODAB - HISTIDINA - MP-8 450,6 38 ±4
A queda no valor de potencial zeta (de + 53 para + 38 mV) das vesículas de DODAB
em água após a adição de MP-8 reforça a proposição de que este hemopeptídeo está associado
às vesículas de DODAB com a parte hidrofóbica inserida na bicamada, mas com os grupos
58
carboxila expostos na interface. Os grupos carboxi-terminal e γ- carboxila do resíduo de
glutamato do peptídeo mais as duas cadeias de propionato do grupo heme provêm afinidade
eletrostática da MP-8 pela superfície da vesícula catiônica do DODAB, enquanto os grupos
hidrofóbicos presentes no peptídeo propiciam afinidade pela interface da membrana.
Quando as vesículas de DODAB foram feitas em meio tamponado com histidina
houve aumento do potencial ζ de + 53 para + 70 mV (Tabela 3). Este aumento do potencial
ζ pode ser atribuído às moléculas de histidina com o grupo imidazol (cadeia lateral)
protonado que tenham se ligado à superfície da vesícula por meio dos seus grupos α-
carboxila. Considerando que o pKa do imidazol da histidina é 6.0, em pH 7.4 temos
aproximadamente 1/25 das moléculas de histidina ainda com imidazol protonado.
Considerando que a histidina estava na concentração de 2 mM, no meio, temos
aproximadamente 75 μM de histidina com imidazol protonado, o que representa três vezes
mais a concentração de MP-8 adicionada ao meio e portanto fica evidente que em pH 7.4 a
histidina do meio pode contribuir para o aumento do potencial ζ das vesículas de DODAB. A
adição de MP-8 ao meio resultou no mesmo valor de potencial ζ observado na ausência de
histidina, sugerindo que a contribuição da histidina no valor deste potencial foi de alguma
forma anulada. Uma possível explicação pode ser dada pelo fato de que as moléculas de MP-8
carregam as moléculas de histidina com imidazol desprotonado água “bulk” para dentro da
bicamada e assim desloca o equilíbrio na água “bulk” no sentido do desprotonamento das
moléculas de histidina (Esquema 6).
59
Esquema 6. Variações no potencial
ζ
de DODAB associado a MP-8
1- MP-8 coordena com histidina desprotonada. 2- Na forma coordenada carrega a
histidina para a bicamada. Neste caso somente MP-8 afeta o potencial ζ da membrana.
3- A queda na concentração de histidina desprotonada na água bulk desloca o equilíbrio
na direção da forma base conjugada do imidazol. 4- Isto leva ao deslocamento de
histidina protonada da superfície da vesícula para a água bulk e desta forma diminui a
contribuição da histidina para o aumento do potencial ζ da membrana.
60
4.2.2 Estudo cinético
A cinética da reação de MP-8 com t-BuOOH em DODAB na presença de histidina 5mM, foi
comparada a reação em CTAB também na presença de histidina, tanto para pH 7.4 como para
pH 9.1 (Figura 23A e 21B)
0 100 200 300 400 500 600
0.20
0.24
0.28
0.32
0.36
A (Intensidade)
Tempo (s)
FIGURA 23A – Cinéticas comparativas em pH 7.4. Linha Cheia Grossa: MP-8 em DODAB /
Histidina. Linha tracejada: MP-8 e CTAB / Histidina. Experimentos realizados com MP-8 3,66 μM,
DODAB 2mM, CTAB 20mM, pH 7.4, Histidina 5 mM pH 7.4 e t-BuOOH 0.7 mM O espectro da
cinética foi acompanhado em 418 nm.
0 100 200 300 400 500 600
0.24
0.28
0.32
0.36
A (Intensidade)
Tempo (s)
FIGURA 23B – Cinéticas comparativas em pH 9.1. Linha Cheia Grossa: MP-8 em DODAB /
Histidina. Linha tracejada: MP-8 e CTAB / Histidina. Experimentos realizados com MP-8 3,66 μM,
DODAB 2mM, CTAB 20mM, Histidina 5 mM, pH 9.1 e t-BuOOH 0.7 mM. O espectro da cinética
foi acompanhado em 418 nm.
61
Embora, em lipossomos de DODAB, em meio contendo histidina, ocorram mudanças
significativas no espectro de MP-8, sugerindo que, assim como em micelas de CTAB, a
histidina ocupa a sexta coordenação do ferro hemínico, a reação fica significativamente mais
acelerada que a reação com MP-8 pentacoordenada (em tampão hepes). Este aumento na
velocidade da reação indica que, na extensão da bicamada, o sexto ligante do ferro hemínico
pode ser deslocado do centro catalítico da enzima com maior facilidade do que nas micelas de
CTAB, onde a velocidade da reação foi reduzida pelo impedimento estérico causado pela
histidina. Sugerimos que esta relativa facilidade de deslocamento é favorecida pelo maior
espaço disponível na bicamada do lipossomo. Afastada do ferro hemínico a histidina poderia
atuar como doador de prótons para reação, e assim, contribuir para acelerar a velocidade da
reação. Portanto, estes resultados sugerem que a associação de MP-8 com a histidina em
vesículas de DODAB recriam de forma completa uma peroxidase.
4.2.3. Mecanismo de Reação
A análise espectral de MP-8 em DODAB antes e após a adição de t-BuOOH, mostra
um deslocamento da banda Soret para ao vermelho (de 405,5 para 408 nm), sugerindo a
formação do composto II (Figura 24). Esse desvio é sutil, visto que a MP-8 em DODAB já
apresenta a banda Soret com pico em comprimento maior em relação a MP-8 em água.
350 400 450
0.00
0.04
0.08
0.12
A (Intensidade)
Comprimento de Onda (nm)
500 600
0.015
0.030
0.045
Figura 24 – Formação do Composto II. Linha cheia: MP-8 nativa em DODAB. Linha tracejada: MP-8
Composto II em DODAB, após adição do peróxido. Experimento realizado com MP-8 3,66 μM,
DODAB 2 mM, tampão hepes 5 mM e pH 7.4, t-BuOOH 0.7 mM.
62
Nós utilizamos a mesma estratégia já aplicada para o sistema contendo CTAB
(analisando a reação em diferentes concentrações do aduto de DMPO), para determinar que
tipo de radical é produzido inicialmente pela reação. Testamos a reação entre MP-8/DODAB
com t-BuOOH, na presença de histidina , para avaliar qual o radical (peroxil ou o alcoxil),
era produzido, e assim, estabelecer se o mecanismo de clivagem do peróxido é heterolítico ou
homolítico. A análise dos resultados de EPR da reação de Fe(III)MP-8 associada a vesículas
de DODAB com t-BuOOH na presença de histidina como sexto ligante do ferro hemínico,
mostrou que em presença de DODAB, MP-8 também cliva peróxidos por mecanismo
homolítico (Figura 25).
3320 3340 3360 3380 3400 3420
-4000
-2000
0
2000
4000
e
d
c
b
a
Intensidade (u.a.)
Campo Magnético (Gauss)
Figura 25 – Simulação computadorizada e espectro experimental de EPR obtido da reação de
MP-8 com t-BuOOH, associada a vesículas de DODAB e na presença de histidina com diferentes
concentrações de DMPO. Linhas a, b e c correspondem aos espectros de 100 μM MP-8 em 2mM de
DODAB, 5,3 mM de t-BuOOH e 22 mM, 90 mM e 360 mM de DMPO, respectivamente. Linhas d e
e são as simulações individuais dos sinais de aduto nos espectros a e c, respectivamente. Linha d, é o
espectro simulado para DMPO/•R (alquil): linha com 1.3 G e com forma gaussiana; Linha e, é o
espectro simulado para um radical ainda não identificado. As condições do espectrofotômetro foram,
amplitude de modulação 0,05 mT, microondas 20 mW, temperatura ambiente, tempo de leitura 2 min,
escala de 100 Gauss e ganho de 1.6 x 10
4
.
63
Com o aumento da concentração de DMPO na reação entre Fe(III)MP-8/DODAB e t-
BuOOH na presença de histidina (Figura 25 – linha c e d) , da mesma forma que o ocorrido
na presença de micelas CTAB, a simulação computacional apresentou um radical de constate
de interação hiperfina a
N
= 14.94 G e a
H
= 16.32 que pode ser reconhecido como t-butiloxil.
Portanto, o mecanismo de reação entre Fe(III)MP-8/DODAB e t-BuOOH na presença
de histidina é o mesmo encontrado quando a reação ocorre na presença de micelas de CTAB,
ou seja, ocorre a clivagem homolítica de peróxidos.
No entanto, em baixas contrações de DMPO (20 mM), obtivemos as constantes de
interação hiperfina a
N
= 14.68 G e a
H
= 0.62 G (Figura 25 – linha e) que ainda não
conseguimos identificar. Este resultado demonstra que, embora o mecanismo de reação
Fe(III)MP-8 e t-BuOOH, seja o mesmo na presença de micelas de CTAB ou vesículas de
DODAB, na presença e na ausência de histidina, a propagação radicalar encontrada em
vesículas de DODAB é diferente, ou seja, os radicais secundários, gerados a partir do t-
butiloxil não são os mesmos.
64
5. Conclusões
• Microperoxidase-8 é capaz de coordenar com histidina como sexto ligante axial do ferro
hemínico tanto na presença de micelas de CTAB como na presença de vesículas de DODAB.
• A associação de MP-8 com vesículas de DODAB, leva a um desvio para o vermelho da
banda Soret, indicando que MP-8 insere-se na bicamada.
• MP-8 promove a clivagem homolítica de peróxidos, tanto em na presença de micelas de
CTAB como de vesículas de DODAB.
• A interação entre a molécula de histidina e MP-8 faz com que a haja um impedimento
estérico, dificultando o acesso do peróxido ao sítio ativo de MP-8.
• Em presença de DODAB e histidina a MP-8 apresenta duas populações distintas, uma
com ferro hemínico alto spin e outra com ferro hemínico baixo spin.
65
6. Referências bibliográficas
1
DUNFORD, H.B. Heme peroxidases, Hardcover - , 1999.
2
NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry, Sarvier, 2000.
3
GASPAR, T. H.; PENEL, C. L.; THORPE, T.; GREPPIN, H. Peroxidases: a survey of
their biochemical and physiological roles in higher plants. Genève: Université de Genève,
Centre de Botanique, Genève, p.313, 1982.
4
GRISEBACH, H. Lignins. In: CON, E.E.; STUMPF, P.K. (Ed.) The Biochemistry of
plants: a comprehensive treatise. New York: Academic Press, vol.7, cap.15, p. 457-479,
1981.
5
STRACK, D. Phenolic metabolism In: DEY, P.M.; HARBORNE, J.B. Plant
biochemistry. London: Academic Press, cap. 10, p. 387-416, 1997.
6
TENHAKEN, R.; LEVINE, A.; BRISSON, L. F.; DIXON, R. A.; LAMB, C. Function of
the oxidative burst in hypersensitive disease resistance. Proceedings of the National
Academy of Science of the United States of America, v.92, p.4158-63, 1995.
7
BARZ, W.; KÖSTER, J. Turn over and degradation of secondry (natural) products. In:
CON, E. E.; STUMPF, P. K. (Ed.) The Biochemistry of plants: a comprehensive treatise.
New York: Academic Press, vol.7, cap.15, p. 457-479, 1981.
8
HRAZDINA, G. Compatimentation in phenolic metabolism. Acta Horticulture, v.1, n.381,
p. 86-93, 1994.
9
KEVERS, C.; GASPAR, T. Soluble, membrane and wall peroxidases, phenylalanine
ammonia-lyase, and lignin changes in relation to vitrification of carnation tissues
cultured in vitro. - J Plant Physiol, 118,41, 1985.
10
CASTILHO, F.J., GREPPIN, H., Balance between anionic and cationic extracellular
peroxidase activies in sedum album leaves after ozone exposure. Physiol. Plant., 68, 201,
1986.
11
CASTILHO, F.J., GREPPIN, H., Extracellular biochemical markes of photochemical
oxidant air pollution damage to Norway spruce, Experientia, 43, 111, 1987.
66
12
HEATH, R.L., Initial events in injury toplants by air pollutants, Annu. Rev. Plant
Physiol., 31, 395, 1980.
13
FRYLINCK, L., DURBERY, I.A., SCHARBORT, J.C., Biochemical changes involved in
stress response and ripening behaviours of Υ-irradiated mango fruit, Phytochemestry,
26, 681, 1987.
14
LEIDI, E.O., GOMEZ, M., De La GUARDIAN, M.D., Evaluation of catalase and
peroxidase as indicators of Fe and Mn: activity of metalloenzymes, Plant Soil, 99, 139,
1987.
15
LAGRIMINI, L.M., ROTHSTEIN, S. Tissue Specificity of Tobacco Peroxidase Isozymes
and Their Induction by Wounding and Tobacco Mosaic Virus Infection. Plant Physiol.
1987 Jun; 84(2): 438-442.
16
ESPELIE, K.E., FRANCESCHI, V.R., KOLATTUKUDY, P.E. Immunocytochemical
Localization and Time Course of Appearance of an Anionic Peroxidase Associated with
Suberization in Wound-Healing Potato Tuber Tissue. Plant Physiol. 1986 Jun; 81(2): 487-
492.
17
PARENT, J. G., HOGUE, R., ASSELIN, A. Glycoproteins, enzymatic activities, and b
proteins in intercellular fluid extracts from hypersensitive Nicotiana species infected
with tobacco mosaic virus. Can. J. Bot. 63, nº 5, pp. 928-931. 1985.
18
CHANG, H., SIEGEL, B.Z., SIEGEL, S.M. Salinity induced changes in isoperoxidase in
taro, Colocasia esculenta. Phytochemistry, 23,233,1981.
19
HAZELL, P., MURRAY, D.R. Peroxidases isoenzymes and leaf senescence in sunflower
Helianthus annus L., Pflanzenphysiol., 108, 87, 1982.
20
EVERSE, J., GRISHAM, M.B., Peroxidases in chemistry and biology, cap. 3, 28. 2000.
21
SCHANAIDER, A. Radicais Livres: vilões ainda em estudo. Ciência Hoje. Março 200;
(27) 158:60-62.
22
MELLO FILHO AC, HOFFMAN ME, MENEGHINI R. Cell killing and DNA damage by
hydrogen peroxide are mediated by intracellular iron. J. Biochem. 1983; 218: 273-5.
67
23
HERSHKO C. Mechanism of iron toxicity and its possible role in red cell membrane
damage. Semin Hematol 1989; 26: 277-85.
24
GARDÈS-ALBERT M, JORE D, FERRADINI C. Membrane lipid peroxidation: pulse
and γ-radiolysis in oxyradical research. VigoPelfrey C (ed): Membrane lipid oxidation. 1th
ed. Santa Clara, CRC Press, 1991; 2-30.
25
VOET, D. VOET, J. G.; PRATT, C. W. Fundamentos de Bioquímica. Porto Alegre: Artes
Médicas Sul, cap. 17, p.524-526, 2000.
26
HINER, N. P. A.; RUIZ, J. H.; LÓPEZ, J. N. R.; CÁNOVAS, F. G.; BRISSET, N. C.;
SMITH, A. T.; ARNAO, M. B.; ACOSTA, M. Reactions of the Class II Peroxidases,
Lignin Peroxidase and Arthromyces ramosus Peroxidase, with Hydrogen Peroxide. J.
Biol. Chem.., v. 277, n. 30, p. 26879-26885, 2002.
27
DUNFORD, H. B. Peroxidases in Chemistry and Biology (Everse, J. Everse, K. E., and
Grisham, M. B., eds), CRC Press, Boca Raton, FL, p. 1-24
28
BAEK, H. K.; VAN WART, H. E. Elementary steps in the formation of horseradish
peroxidase compound I: direct observation of compound 0, a new intermediate with a
hyperporphyrin spectrum. Biochemistry 1989, 28, 5714-5719.
29
Wang, J. S.; Haesun, K. B.; Van Wart, H. E. High-valent intermediates in the reaction of
N alpha-acetyl microperoxidase-8 with hydrogen peroxide: models for compounds 0, I
and II of horseradish peroxidase. Biochem. Bioys. Res. Comm. 1991, 179, 1320-1324.
30
ORTIZ DE MONTELLANO, P.R. Catalytic sites of hemoprotein peroxidases (review)
Annu. Rev. Farmacol. Toxicol. 1992, 32,89-107.
31
SAVENKOVA, M.I.; KUO, J.M.; ORTIZ DE MONTELLANO, P.R. Improvement of
peroxygenase activity by relocation of a catalytic histidine within the active site of
horseradish peroxidase. Biochemistry 1998, 37, 10828-10836.
32
SMITH, A. T.; VEITCH, N. Substrate binding and catalysis in heme peroxidases. Curr.
Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 269-278.
33
EVERSE, J. EVERSE, K. E., AND GRISHAM, M. B. Peroxidases in Chemistry and
Biology, CRC Press, Boca Raton, FL, p. 1-24
34
BAEK, H. K.; VAN WART, H. E. Elementary steps in the formation of horseradish
peroxidase compound I: direct observation of compound 0, a new intermediate with a
hyperporphyrin spectrum. Biochemistry, v. 28, n. 14, p. 5714-9, julho 1989.
68
35
NICHOLLS, P. Cytochrome c binding to enzymes and membranes. Biochem. Biophys.
Acta. v. 30, n. 346, p. 261-310, dec. 1974.
36
MARGOLIASH, E.; SCHEJTER, A. Cytochrome c (review). Adv. Protein Chem., v. 21,
p. 113-286, 1966.
37
WUTHRICH, K., AVIRAM, I., AND SCHEJTER, A. Structural studies of modified
cytochromes c by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta, v.
253, n. 1, p. 98-101, novembro 1971.
38
BARR, D.P.; MANSON, R.P. Mechanism of radical production from the reaction of
cytochrome c with organic hidroperoxides. An ESR spin trapping investigation. Biol.
Chem. J., v. 270, p. 12709-12716, 1995.
39
NANTES,I.L.; FALJONI-ALÁRIO,A.; NASCIMENTO,O. R.; BANDY, B.; GATTI, R.;
BECHARA, E. J. H., Modifications in heme iron of free and vesicle bound cyt c. Free
Radic. Biol. & Med., v. 28, n. 5, p.786-796, março 2000.
40
ZUCCHI, M.R.; NANTES, I.L.; NASCIMENTO, O.R., FALJONI-ALARIO, A. Effect of
heme iron valence state on the conformation of cytochrome C and its association with
membrane interfaces: a CD and EPR investigation. . Biol. Chem, 10.1074, 2001.
41
PALEUS, S.; EHRENBERG, A. TUPPY, H. Study of a peptide degradation product of
cytochrome c. II Investigation of the linkage between peptide moiety prosthetic group.
Acta Chem. Scand., v.9, p. 365-374, 1955.
42
HARBURY, H. A.; LOACH, P. A. J. Biol. Chem., v. 235, p. 3640-3645, 1960.
43
CLORE, G. M.; HOLLAWAY, M. R.; ORENGO, C. Inorg. Chem. Acta, v. 56, p. 143-
148, 1981.
44
BALDWIN, D. A.; MARQUES, H. M.; PRATT, J. M. Hemes and hemoproteins. 5:
Kinetics of the peroxidatic activity of microperoxidase-8: model for the peroxidase
enzymes. J. Inorg. Biochem., v. 30, n. 3, p. 203-217, julho 1987.
45
URRY, D. W.; PETTEGREW, J. W. J. Am. Chem. Soc., v. 89, p. 5276-5283, 1967.
69
46
WANG, J. S.; VAN WART, H. E. Resonance Raman characterization of the Heme
group in N-Acetyl-microperoxidase-8: A thermal intermediate Spin-High Spin state
mixture. J. Phys. Chem., v. 93, p. 7925-7931, 1989.
47
ARON, J.; BALDWIN, D. A.; MARQUES, H. M.; PRATT, J. M.; ADAMS, P. A. Hemes
and hemoproteins. 1: Preparation and analysis of the heme-containing octapeptide
(microperoxidase-8) and identification of the monomeric form in aqueous solution. J.
Inorg. Biochem., v. 27, n. 4, p. 227-243, agosto 1986.
48
DRAGO, R.S., Physical Methods for Chemists. Mexico: Saunders College Publishing,
1992.
49
WILSON, M. T.; RANSON, R. J.; MASIAKOWSKI, P.; CZARNECKA, E.; BRUNORI,
M. A kinetic study of the pH-dependent properties of the ferric undecapeptide of
cytochrome c (microperoxidase), Eur. J. Biochem., v. 77, p. 193-199, 1977.
50
DICKERSON, R. E.; TAKANO, T.; EISENBERG, D.; KALLAI, O. B.; SAMSON, L.,
COOPER, A.; MARGOLIASH, E. Ferricytochrome c. I. General features of horse and
bonito proteins at 2.8 A resolution. J. Biol. Chem., USA,, v. 246, n. 5, p. 1511-1535, março
1971.
51
DUNFORD, H.B.; STILLMAN, J.S. On the function and mechanism of action of
peroxidases. Coord. Chem. Reviews, v. 19, p. 187-251, 1975.
52
WANG, J. S.; BAEK, H.K.; VAN WART, H.E. High valent intermediates in the
reaction of N alpha acetyl microperoxidase-8 with hydrogen peroxides models for
compounds 0, I an II of horseradish peroxidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., v.179,
n. 3, p. 1320-1324, setembro 1991.
53
PRIMUS, J.L.; GRUNENWALD, S.; HAGEDOORN, P.L.; ALBRECHT-GARY, A.- M.;
MANDON, D.; VEEGER, C The Nature of the Intermediates in the Reactions of Fe(III)-
and Mn(III)-Microperoxidase-8 with H O : a Rapid Kinetics Study
2 2
. J. Am. Chem. Soc.,
v. 124, n. 7, p. 1214-1221, fevereiro 2002.
54
PRIMUS, J.L., GRUNENWALD, S.; HAGEDOORN, P. L.; Albrecht-Gary, A.M.;
Mandon, D.; Veeger, C.J. J. The nature of the intermediates in the reactions of Fe(III)-
and Mn(III)-microperoxidase-8 with H(2)O(2): a rapid kinetics study. Am. Chem. Soc.
2002, 124, 1214-1221.
70
55
PRIETO, T.; NASCIMENTO, O. R.; TERSARIOL, I. L. S.; ALARIO, A. F.; NANTES, I.
L.. J. of Phys. Chem., 2004, 108, p. 11124 – 11132.
56
PRIETO, T., NASCIMENTO, O. R. AND NANTES, I. L. Progr. Colloid Polym. Sci., 2004,
128, 193-198.
57
FEHER,G. Electron Paramagnetic Resonance with Applications to Selected Problems
in Biology. New York: Gordon and Breach, 1969.
58
DRAGO, R.S. Physical Methods for Chemists. Mexico: Saunders College Publishing,
1992.
59
RIBEIRO, R.R. Espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica de Onda
Contínua e Pulsada em Poli(o-metoxianilina). Dissertação (Mestre em Ciências: Física
básica) – Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos. 2002.
60
LEE, J.D. Química Inorgânica: um novo texto conciso. Edgard Blucher, 1980.
61
JEFFERY, G.D., BASSETT, J., MENDHAM, J., DENNEY, R.C. Análise química
quantitativa – vogel, Ed. LTC, 5ª Edição, 1992.
62
CIENFUEGOS, F.; VAITSMAN, D. Análise instrumental. Rio de Janeiro: Interciência, p.
30-35, 2000.
63
TURRO, N. J. Modern molecular photochemistry. University Science Books, Sausalito,
California, p. 1-37, 1991.
64
CAMPBELL, I.D.; DWEK, R.A Biological Spectroscopy. The Benjamin/Cummings
Publishing Company Inc, California, 1984.
65
NELSON, D. L.; COX, M. M.; Lehninger Principles of Biochemistry. 3° ed, N. Y.,
Worth Publishers, 2000, p. 663.
66
PELIZZETTI, E.; PRAMAURO, E.; Anal. Chim. Acta , v. 169, p. 1, 1985.
67
MANIASSO, N. Ambientes micelares em química analítica. Quim. Nova, vol. 24, n. 1, p.
87-93, 2001.
71
68
MOROI, Y. Micelles: Theoretical and applied aspects. 1°ed, Plenum Press, NY, 1992.
69
TANFORD, C. The hydrophobic effect: formation of micelles and biological
membranes. 2° ed, Krieger, Florida, 1991.
70
GAINES, G. L. Insoluble Monolayers at Liquid-Gas Interfaces. Interscience, New York,
1966.
71
TIEN, H. T. Bilayer Lipid Membranes (BLM) Theory and Practice, Marcel Dekker,
New York, 1974.
72
ELWORTHY, P. H.; FLORENCE, A. T.; MACFARLANE, C. B. Solubilization by
surface active agents. Chapman & Hall, London, 1968.
73
ATTWOOD, D.; FLORENCE, A. T. Surfactant Systems: their chemistry pharmacy and
biology. 1° ed, Chapman & Hall, London, 1983.
74
FENDLER, J. H.; FENDLER, E. J. Catalysis in micellar and macromolecular systems.
Academic Press, NY, 1975.
75
GRUEN, D. W. R. Progr. Colloid Polym. Sci, v.70, p. 6, 1985.
76
FENDLER, J.H., Surfactant vesicles as membrane mimetic agents: characterization
and utilization. Acc Chem Res., 1980, 13: 7-13.
77
CARMONA-RIBEIRO, A.M., Synthetic amphiphile vesicles. 1992, 21: 209-214.
78
MARTINS, L.M.S.; MAMIZUKA, E.M.; CARMONA-RIBEIRO, A.M., Cationic vesicles
as bactericides. Lagmuir, 1997, 13: 5583-5587.
79
TSURUTA, L.R., QUINTILIO, W., COSTA, M.H.B., CARMONA-RIBEIRO, A.M.
Interactions between cationic liposomes and an antigenic protein: the physical chemistry
of the immunoadjuvant action. J Lipid Res, 1997, 38: 2003-2011.
80
BEHR, J.P., Synthetic gene-transfer vectors. Acc Chem Res, 1993, 26: 274-278.
72
81
DEARDEN, L.V.; WOOLLEY, E.M. Osmotic coefficient of CTAB in water and in
aqueous sodium bromide solutions at 55°C. J Phys. Chem., v. 91, n. 9, p. 2404-2408, 1987.
82
KISSINGER, P.T.; HEINEMAN, W.R.; J. Chem Educ. 1983, 60, 702.
83
BARD, A.J.; FAULKNER, L.R.; Eletrochemical Methods: Fundamentals and
Applications, John Wiley & Sons, New York, 1980.
84
MAKARSHA, M; RADZKI, ST; LEGENDZIEWICZ, J. Spectroscopic characterization
of the water-soluble cationic porphyrins and their complexes with Cu(II) in various
solvents. J. Alloys and Compounds 2002, 341, 233-238 .
85
KALYANARAMAN, B., MOTTLEY, C, MASON, RP. A direct electron spin resonance
and spin-trapping investigation of peroxyl free radical formation by
hematin/hydroperoxide systems. J. Biol. Chem 1983, 369, 6966-3858.
86
CHAMULITRAT, W., TAKAHASHI, N., MASON, RP. Peroxyl, alkoxyl, and carbon-
centered radical formation from organic hydroperoxides by chloroperoxidase. J. Biol.
Chem., 1989, 264, 7889-7899.
87
ZUCCHI MR, NASCIMENTO OR, FALJONI-ALARIO A, PRIETO T, NANTES IL.
Modulation of cytochrome c spin states by lipid acyl chains: a continuous-wave electron
paramagnetic resonance (CW-EPR) study of haem iron. J. Biochem . 2003 Mar 1;370(Pt
2):67.
88
PRIETO, T.; MARCON, R.O;, PRADO, F.M.; CAÍRES, A.C.F., MASCIO, P.D.;
BROCHSZTAIN,
S., NASCIMENTO, O.R.; NANTES, I.L.. J.Biol.Inorg.Chem. – submetido
para publicação.
89
RIPOSATI A.;, PRIETO, T.; SHIDA, C.S.; NANTES, I.L.; NASCIMENTO, O.R. J. Biol.
Chem - submetido
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
