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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Psicologia e Educação
Programa de Pós – Graduação em Psicobiologia
“Análise Funcional da Substância Cinzenta Periaquedutal no
Comportamento de Imobilidade Tônica em Cobaias (Cavia
porcellus)”
Eveline Bis Vieira
Ribeirão Preto
- 2007 -
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Psicologia e Educação
Programa de Pós – Graduação em Psicobiologia
“Análise Funcional da Substância Cinzenta Periaquedutal no
Comportamento de Imobilidade Tônica em Cobaias (Cavia
porcellus)”
Eveline Bis Vieira
Dissertação apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto-USP, como parte das exigências
para a obtenção do título de Mestre em
Ciências. Área: Psicobiologia.
Orientadora: Profa. Dra. Christie Ramos Andrade Leite Panissi
Ribeirão Preto
- 2007 -
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AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO
POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS
DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Vieira, Eveline Bis.
Análise funcional da substância cinzenta periaqueduta
l no
comportamento de imobilidade tônica em cobaias (Cavia porcellus).
74 p.: il.: 30cm.
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP –
Área de concentração:
Psicobiologia.
Orientadora: Leite-Panissi, Christie Ramos Andrade.
1. Comportamento defensivo. 2. Imobilidade tônica. 3. Substância
cinzenta periaquedutal. 4. Proteína FOS. 5. Imunocitoquímica.
Todos os dias Deus nos dá um momento em que é
possível mudar tudo que nos deixa infelizes, o
instante mágico é o momento em que um "sim"
ou um "não" pode mudar toda a nossa existência.
(Anônimo)
Aos meus pais, Evaldo e Elaine, pelo constante
incentivo, dedico amorosamente, este trabalho.
AGRADECIMENTOS
A Profa. Dra. Christie Ramos Andrade Leite Panissi, pela contribuição valiosa à minha
formação científica, pela confiança, amizade e dedicação com que me orientou neste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Ricardo Luiz Nunes de Souza, pelo acompanhamento do desenvolvimento
que resultou no aprimoramento deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Wagner Ferreira dos Santos que incentivou os meus primeiros passos na
pesquisa.
A Profa. Dra. Maria José Alves da Rocha pela fundamental colaboração para o
desenvolvimento das etapas experimentais.
Aos Professores da Banca, pela atenção dispensada na leitura desta dissertação.
A Profa. Dra. Elaine Ap. Del Bel Guimarães e a Sra. Célia Ap. da Silva pelos
ensinamentos da técnica imunocitoquímica.
Aos amigos Márcio e Fabiana, pelo tempo dedicado aos estudos que tornaram possível a
realização desta minha etapa de formação.
A Aline Aparecida Ferrarese, pela sua interminável disposição e alegria em cada dia.
Aos amigos, Ana Paula, Alberto, Bruno, Gabriela e Letícia pela amizade e apoio no
desenvolvimento desse trabalho.
A família Bis, pelo apoio, carinho, entusiasmo e encorajamento constantes e que, mesmo
distante, se fez presente em todos os momentos.
Aos funcionários do Biotério I da FORP, Sr. Antônio Sérgio Ap. Mesca e Sr. Antônio
Massaro, pelo cuidado e tratamento constante dos animais experimentais.
A Renata B. Vicentini, secretária do Programa de Pós - Graduação em Psicobiologia da
FFCLRP - USP, pelo auxílio competente.
A CAPES, PROEX e FAPESP (05/00096-1), pelo apoio financeiro.
A Deus.
SUMÁRIO
RESUMO ........................................................................................................................II
ABSTRACT .................................................................................................................. IV
INTRODUÇÃO ...............................................................................................................1
Comportamento Defensivo..............................................................................................2
Imobilidade Tônica..........................................................................................................4
Substância Cinzenta Periaquedutal ................................................................................7
Conexões da Substância Cinzenta Periaquedutal.........................................................11
Núcleo de Edinger-Westphal e Núcleo Oculomotor.....................................................13
Núcleo Dorsal da Rafe ...................................................................................................14
Proteína FOS .................................................................................................................14
OBJETIVOS..................................................................................................................17
MATERIAIS E MÉTODOS..........................................................................................19
2. Equipamentos, soluções e reagentes utilizados. ........................................................20
3. Procedimentos............................................................................................................21
4. Análise de Imagem.....................................................................................................25
5. Análise Estatística......................................................................................................27
RESULTADOS...............................................................................................................28
DISCUSSÃO ..................................................................................................................41
CONCLUSÕES..............................................................................................................51
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................53
APÊNDICES..................................................................................................................69
ii
RESUMO
O comportamento de imobilidade tônica (IT) é uma resposta defensiva inata,
exibida pela presa quando o contato físico com o predador é prolongado e a situação
inescapável, e é caracterizada por profunda inibição motora, emitida em situação de medo
intenso. Pode-se sugerir que o desencadeamento de determinado comportamento defensivo
envolve a ativação de um complexo sistema neural responsável pela detecção do estímulo
ameaçador, e por fim, pela elaboração de um planejamento motor adequado para a
expressão da resposta defensiva escolhida. Dentro desse contexto, a substância cinzenta
periaquedutal (SCP) é intimamente relacionada com a interação somática e autonômica das
reações defensivas, portanto, uma estrutura essencial para a execução dos comportamentos
de defesa. Vários estudos têm sido realizados com o objetivo de evidenciar o substrato
neural envolvido no desencadeamento e na modulação da resposta de IT. No entanto, não
há na literatura abordagens funcionais que demonstrem a ativação de circuitos neuronais
específicos durante a emissão deste comportamento defensivo. Considerando estes
achados, o objetivo do presente trabalho foi avaliar se após a emissão da resposta defensiva
de IT em cobaias ocorre à ativação da proteína FOS nas regiões da SCP, bem como se há
diferenças de ativação entre as distintas colunas funcionais da SCP em diferentes níveis do
eixo rostro-caudal. Para atingir este objetivo, foram utilizadas cobaias machos (n = 39;
Cavia porcellus) dividido em três grupos experimentais. No grupo 1 (n = 13) os animais
foram apenas manipulados, no grupo 2 (n = 12) os animais receberam administração i.p de
salina hipertônica 1,5%, grupo controle positivo da técnica de imunocitoquímica
empregada. No grupo 3 (n = 14) os animais foram submetidos individualmente á indução
do comportamento de IT. A indução á IT foi realizada manualmente por inversão e
contenção postural, sendo que o total do tempo de duração da IT nestes animais foi de pelo
menos 60 minutos. Após 2 horas do início dos experimentos, os animais foram
anestesiados com uma mistura de ketamina e xilasina e perfundidos. Os encéfalos foram
removidos, crioprotegidos e processados pela técnica da imunocitoquímica para a
marcação da proteína FOS. Nossos resultados mostraram que a resposta defensiva de IT
em cobaias é capaz de promover a expressão da proteína FOS em diferentes áreas do
sistema nervoso central (SNC). Em particular, os dados demonstraram a ativação das
diferentes colunas funcionais da SCP pela resposta de IT, sendo que maior marcação foi
encontrada na coluna ventrolateral, no nível do núcleo oculomotor, e nas colunas
ventrolateral e lateral no nível mais caudal. Foi evidenciado ainda aumento da
imunorreatividade à proteína FOS no núcleo dorsal da rafe e no núcleo de Edinger-
iii
Westphal, quando comparado com o grupo controle. Por outro lado, não há alteração
significativa do número de células imunorreativas à FOS no núcleo oculomotor. Estes
dados sugerem que a resposta de IT pode recrutar áreas específicas do SNC, e na SCP
possivelmente ocorre maior recrutamento de células nas colunas ventrolateral (níveis
rostral e caudal) e lateral (nível caudal) para a emissão e modulação deste comportamento
defensivo.
Palavras-chave: Comportamento defensivo; Imobilidade tônica; Substância cinzenta
periaquedutal; Proteína FOS, Imunocitoquímica.
iv
ABSTRACT
Tonic immobility behavior (TI) is an innate response, exhibited by the prey when
the physical contact with the predator is prolonged and the situation inescapable,
characterized by profound motor inhibition, emitted in situation of intense fear. In general,
it can be suggested that the break out certain defensive behavior involves the activation of
a compound system responsible neural for the detection of the stimulate threatening, and
finally, for the elaboration of an appropriate motor planning for the expression of the
chosen defensive response. In this context, the periaqueductal gray matter (PAG) it is
intimately related with the somatic and autonomous interaction of the defensive reactions.
In the literature, there aren’t studies that evaluated the neural circuitry activated during the
TI by functional techniques. The objective of the present work was to evaluate the possible
activation of the different functional columns of PAG in different brain levels; in the
dorsomedial (dm), dorsolateral (dl), lateral (l) and ventrolateral (vl) columns in the PAG;
after the emission of the defensive response of TI in guinea pigs, for the expression of the
FOS protein. In the TI group the animals (n = 14) were submitted to TI response by
inversion postural and physical contention for at least 60 min. As positive control in the
other group the animals receive i.p. administration of NaCl 1.5% (n = 12). In the control
group the animals were only manipulated (n = 13). After 2 h of the beginning of the
experiments, the animals were anesthetized with a mixture of ketamine plus xilasyne and
transcardially perfused. The brains were removed, cryoprotected and processed for FOS
immunohistochemistry. Our results showed that the defensive behavior of TI in guinea
pigs is capable to promote the expression of the FOS protein in different areas of central
nervous system (CNS). The data demonstrated the activation of the different functional
columns of PAG and larger demarcation was found in the vl column, level of the nucleus
oculomotor and in the vl and l columns, level more caudal. In addition, results
demonstrated an increase of immunorreactivity cells of FOS protein (IR-FOS) in the
nucleus dorsal raphe and in the nucleus Edinger-Westphal when compare with the control,
and it didn't happen alteration significant of the number of cells IR-FOS in the nucleus
oculomotor. These data suggest that the defensive behavior of TI in guinea pigs can recruit
areas specify of the CNS, and in the PAG possibly it occur larger involvement of the vl
columns and l in the modulation of this defensive behavior.
Key Words: Defensive behavior; Tonic immobility, Periaquedutal gray matter; FOS
protein; Immunohistochemical.
INTRODUÇÃO
Introdução________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
2
Comportamento Defensivo
A todo o momento, os animais são confrontados com estímulos de extrema
relevância biológica e a detecção destes estímulos é de alta importância para que respostas
comportamentais adequadas possam ser rapidamente elaboradas. Sendo assim, segundo
Plutchik (1980 apud LeDoux, 1998): “O importante é que o cérebro possui um mecanismo
para detectar o perigo e ter uma reação imediata e adequada a este. A atitude específica é
adaptada para cada espécie (fugir correndo, voar, nadar, ficar imóvel, etc.), mas a função
cerebral subjacente à reação é a mesma, proteção contra o perigo que coloca em risco a
sobrevivência ou a integridade do indivíduo”. Evidentemente, correr, nadar e voar
constituem comportamentos diferentes, que envolvem músculos e estratégias diferentes,
mas todos têm o mesmo resultado: a fuga. Isso ocorre porque os sistemas encefálicos
envolvidos na mediação das funções defensivas são semelhantes nas diferentes espécies
(LeDoux, 1998).
Numa situação de perigo, a escolha de uma resposta comportamental de defesa leva
em consideração à distância entre a presa e o predador (Ratner, 1967), bem como o grau de
ameaça oferecido em cada situação (Blanchard e Blanchard, 1988). Fanselow (1994)
propôs uma organização das respostas defensivas em três estágios, considerando o
contexto de uma presa confrontada por um predador. No primeiro estágio estariam as
defesas de pré-encontro, ou seja, quando o animal se encontra em uma área onde
predadores foram encontrados previamente, sendo o grau de ameaça incerto ou potencial,
neste momento o animal irá emitir uma resposta comportamental descrita como exploração
cautelosa (Blanchard e Blanchard, 1988); o segundo estágio é denominado de defesas pós-
encontro, onde as respostas são desencadeadas pela detecção de um predador distante,
caracterizado por focalização da atenção, desaceleração cardíaca sustentada, analgesia não-
opióide e potencialização do reflexo de sobressalto, esta resposta comportamental de
Introdução________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
3
defesa é também conhecida como congelamento; o último estágio dessa organização é o
estágio de ataque, com emissão de comportamentos ativos, como o ataque defensivo, que
ocorre quando há contato físico ou na iminência deste. Em resumo, nesta sistemática
defensiva ocorre a transformação da vigilância a uma ameaça não-específica do pré-
encontro (exploração cautelosa) para o congelamento no pós-encontro e/ou para a
orientação a um predador específico no estágio de ataque, quando o organismo está além
da vigilância e engajado numa ação defensiva vigorosa. Todavia, quando o contato físico é
prolongado e a situação inescapável, algumas espécies exibem o comportamento de
imobilidade tônica (IT) ou “fingir-se de morto” (Klemm, 1971). Esta resposta
comportamental defensiva é uma condição diferente do congelamento, por ser somente
emitida pela presa após esta ter sido capturada pelo predador. Assim, pode-se sugerir que o
desencadeamento de determinado comportamento defensivo envolve a ativação de um
complexo sistema neural responsável inicialmente pela detecção e avaliação do estímulo
ameaçador, e por fim, pela elaboração de um planejamento motor adequado para a
expressão da resposta defensiva escolhida.
É possível que a emoção associada à emissão das respostas defensivas possa ser
descrita como medo inato (incondicionado) ou aprendido (condicionado). O medo é uma
das formas de comportamento emocional que possui longa história evolutiva. Dentro desta
perspectiva, as diferentes espécies possuem suas próprias formas de reagir ao perigo, onde
cada animal é capaz de detectar as situações ameaçadoras específicas e apresentar
comportamentos defensivos adequados. Esses comportamentos podem se expressar sob
várias formas: inibição comportamental e vigilância (Gray, 1982; Coimbra e Brandão,
1993), congelamento (Coimbra e cols., 1989; Zhang e cols., 1990; Fanselow, 1994), fuga
(Panksepp,1990; Coimbra e Brandão, 1993), vocalizações (Hess e Bruger, 1943), e por
último IT (Klemm, 1971; Menescal-de-Oliveira e Hoffmann, 1993).
Introdução________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
4
Imobilidade Tônica
Os primeiros relatos que associam a resposta de IT à situação de medo inato
foram realizados por Gallup e cols. (1971) e Gallup e cols. (1972). Neste último trabalho
foi demonstrado que o choque elétrico nos membros posteriores e anteriores, “exposição
ao barulho” ou ao predador promoveram aumento significativo da duração da resposta de
IT em lagartos (Anolis carolinensis). Esses resultados corroboram a idéia de que a IT seja,
uma resposta de medo inato, ou seja, que a resposta pode ser eliciada sem experiência
prévia. Ainda, estes estudos mostram que estímulos ameaçadores ou nociceptivos
(choques) podem potencializar este comportamento.
Desta maneira, a resposta de IT integra a cadeia de respostas antipredatórias, sendo
considerada como último recurso defensivo utilizado para a manutenção da sobrevivência
do animal, quando o contato físico é prolongado e a situação inescapável. Esta resposta é
emitida por diferentes animais da árvore filogenética, apresentando alto valor adaptativo,
sendo descrita em várias espécies de invertebrados (Crawford, 1977) e vertebrados
(Prestude, 1977; Thompson, 1977). Esta resposta defensiva é caracterizada por um estado
reversível de profunda inatividade física e relativa falta de responsividade ao meio
ambiente, sendo que sua duração pode variar de poucos segundos até algumas horas.
Dentro deste contexto, Sargent e Eberhardt (1975) realizando observações em ambiente
natural propuseram que raposas (Vulpes fulva) cessam os ataques a patos selvagens quando
esses exibem a resposta de IT, aumentando assim, em 50% as suas chances de
sobrevivência. Thompson e cols. (1981) mostraram que o debater da presa atua como um
estímulo positivo para que o predador continue o ataque. De fato, a grande maioria dos
predadores tem preferência por presas vivas. Reforçando a questão do valor adaptativo
dessa resposta, que aumenta as chances de sobrevivência do animal frente a um ataque
predatório, alguns achados evidenciaram que, na vigência do comportamento de IT, o
animal apresenta complexo e contínuo monitoramento do meio ambiente (Klemm, 1971;
Introdução________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
5
Hoffmann e Menescal-de-Oliveira, 1988; Gentle e cols., 1989), sugerindo que durante a
emissão desta resposta defensiva a presa esteja realizando avaliação das condições que
propiciem o êxito de uma eventual fuga.
De acordo com Klemm (1971), a resposta defensiva de IT pode estar associada a
uma rede de interneurônios da formação reticular do tronco encefálico, os quais inibem de
maneira difusa os motoneurônios espinhais responsáveis pela manutenção da postura
habitual do animal (figura 1).
Figura 1: Fotografia de uma cobaia durante um episódio de imobilidade tônica induzido em
laboratório.
Os primeiros trabalhos realizados com o objetivo de evidenciar quais as estruturas
do sistema nervoso central (SNC) que modulam a resposta defensiva de IT foram
realizados por Klemm (1971) e Carli (1971), por meio da utilização de técnicas de
transecção cerebral em vários níveis do SNC de coelhos. Desta maneira, Carli (1971)
demonstrou que a integridade do tronco encefálico é necessária para a emissão do
comportamento de IT. Nesse trabalho, os coelhos com transecções retrocoliculares não
mais emitiam adequadamente a resposta de IT. Em adição, apesar da integridade do tronco
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6
encefálico ser crucial para emissão desta resposta defensiva, alguns trabalhos mostram que
áreas diencefálicas (Oliveira e cols., 1997) e telencefálicas (Woodruff, 1977; Leite-Panissi
e cols., 1999) são importantes para a modulação deste comportamento. Dentro deste
contexto, Leite-Panissi e cols. (1999) demonstraram que a estimulação colinérgica de
diferentes núcleos amigdalóides promoveu redução significativa da duração do
comportamento de IT em cobaias. Ainda, estudos subseqüentes mostraram (Leite-Panissi e
cols., 2003) que a integridade da conexão anatômica e funcional entre o núcleo central da
amígdala (CEA) e a substância cinzenta periaquedutal ventrolateral (SCP
VL
) é essencial
para esta modulação, desde que a exclusão reversível da SCP
VL
bloqueou a redução da IT
obtida com estimulação colinérgica do CEA. Por sua vez, a SCP é intimamente relacionada
com a modulação da resposta de IT em cobaias (Monassi e cols., 1997 e 1999; Monassi e
Menescal-de-Oliveira, 2004). Assim sendo, foi demonstrado que a ativação colinérgica da
SCP dorsolateral ou ventrolateral promoveu redução e aumento, respectivamente, da
duração da resposta de IT em cobaias (Monassi e cols., 1997), sugerindo a complexa
participação desta estrutura na modulação defensiva.
Em resumo, com relação ao substrato neural que participa da emissão e modulação
do comportamento defensivo de IT, vários trabalhos abordam esta questão, utilizando além
das técnicas de transsecção cerebral (Carli, 1971; Klemm, 1971); administração periférica
de drogas ansiogênicas ou ansiolíticas (Olsen e cols., 2002) ou ativação central de
diferentes sistemas de neurotransmissores (Menescal-de-Oliveira e cols., 1990; Leite-
Panissi e cols., 1999; Monassi e Menescal-de-Oliveira, 2004). No entanto, não há na
literatura trabalhos que utilizam técnicas funcionais para avaliar o substrato neural
mobilizado durante a resposta comportamental de IT. Ainda, estudos recentes de
Moskowitz (2004) e de Olsen e cols. (2002) sugerem a possibilidade da resposta de IT em
animais ser um modelo para o estudo da catatonia em humanos, ou ainda um modelo para
avaliar o efeito de drogas ansiolíticas ou ansiogênicas. Desta maneira, faz-se necessário
Introdução________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
7
estabelecer qual o circuito neural efetivamente ativado durante a emissão desta resposta
defensiva.
Substância Cinzenta Periaquedutal
A SCP é uma estrutura mesencefálica que contorna o aqueduto cerebral desde a
porção dorsolateral do tronco encefálico até a comissura posterior onde margeia o terceiro
ventrículo, no diencéfalo. Um dos primeiros trabalhos que demonstraram o envolvimento
da SCP na modulação de respostas defensivas foi realizado por Fernandez-de-Molina e
Hunsperger em 1959. Nesta investigação, a lesão eletrolítica da SCP bloqueou os efeitos
comportamentais obtidos por estimulação elétrica da amígdala ou do hipotálamo. No
entanto, a lesão destas duas últimas estruturas não alterou a resposta defensiva
comportamental eliciada pela estimulação elétrica da SCP em gatos. Desde então, a SCP é
vista como a via final comum das respostas comportamentais de defesa (Bandler e Carrive,
1988). Em apoio a esses resultados, Sandner e cols. (1993) realizaram um mapeamento,
utilizando a imunorreatividade da proteína FOS, nas estruturas encefálicas envolvidas na
modulação dos comportamentos aversivos produzidos por estimulação química ou elétrica
da SCP ou do hipotálamo medial. Seus resultados reforçam o envolvimento da amígdala,
do hipotálamo e da SCP como principais componentes de um circuito neural denominado
de Sistema Cerebral Aversivo, o qual é ativado por situações de medo (Graeff, 1981).
Ainda, Gray (1982) descreveu um segundo sistema encefálico de defesa, do qual a SCP
também teria importante participação, este circuito seria denominado de Sistema de
Inibição Comportamental (SIC), o qual, de maneira similar ao Sistema Cerebral Aversivo
(SCA), é ativado por vários estímulos tais como: novidade, sinais de perigo espécie-
específica e estímulos de medo inato ou aprendido. As estruturas que integram o Sistema
de Inibição Comportamental, segundo Gray (1982) e Gray e McNaughton (2000), são:
córtex pré-frontal, córtex do cíngulo, sistema septo-hipocampal, amígdala, hipotálamo
Introdução________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
8
medial e a SCP; e a ativação destas estruturas ocorre de maneira conjunta, onde cada uma
delas é capaz de influenciar o output de outras estruturas (Gray e McNaughton, 2000). Em
linhas gerais, o objetivo do SIC é avaliar o grau de ameaça durante uma exploração
cautelosa do ambiente, sendo este sistema ativado em situações de conflito, de perigo à
distância, ou não determinado, por outro lado o SCA seria responsável pela elaboração e
coordenação das respostas defensivas no animal observadas em situações de perigo
eminente, ou seja, já determinadas, como se aproximar ou evitar o perigo. Tais sistemas
atuam de modo complementar, regulando estratégias comportamentais distintas de medo
e/ou de ansiedade.
Funcionalmente, a SCP é uma estrutura heterogênea, podendo ser subdividida em 4
colunas longitudinais orientadas ao longo do eixo rostro-caudal: colunas dorsomedial,
dorsolateral, lateral e ventrolateral (Bandler e cols., 1991; Carrive, 1993; figura 2). Ainda,
Lovick (1991) descreve a SCP em apenas duas colunas funcionais, onde a primeira
compreenderia as colunas dorsomedial, dorsolateral e lateral formando a SCP dorsal. E
uma coluna ventrolateral compreendendo a área ventral do aqueduto cerebral e lateral ao
núcleo dorsal da rafe.
Embora possam ser identificadas distintas colunas funcionais na SCP, as mesmas
são interconectadas e, além dos neurônios de eferências há uma rede intrínseca de
conexões envolvidas na ativação e inibição de cada coluna. Vários estudos demonstraram
que a SCP também possui conexões recíprocas com as demais estruturas do sistema
encefálico aversivo, como colículo inferior (Meninger e cols., 1986), o colículo superior
(Beitz e cols., 1986; Redgrave e Dean, 1991; Schenberg e cols., 2002), o hipotálamo
(Shiphey e cols., 1991; Veening e cols., 1991) e o complexo amigdalóide (Rizvi e cols.,
1991; Shipley e cols., 1991; Leite-Panissi e cols., 2003).
Introdução________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
9
Figura 2: Organização colunar da Substância cinzenta periaquedutal (SCP) típica de mamíferos.
DM: coluna dorsomedial, DL: coluna dorsolateral, L: coluna lateral, VL: coluna ventrolateral, Dk:
núcleo de Dark-schewitsch, DR: núcleo dorsal da rafe, EW: núcleo Edinger-Westphal, III: núcleo
oculomotor. (Modificado de Carrive, 1993).
Alguns trabalhos sugerem que a SCP tem importante envolvimento na integração
somática e autonômica das respostas características de reações defensivas. De acordo com
Bandler e Carrive (1988), a reação de defesa é geralmente referida ao padrão
comportamental e às mudanças autonômicas que ocorrem nos animais frente à situação de
medo/ansiedade e a estímulos de estresse. Dessa maneira, é conhecido que SCP controla
grande variedade de funções orgânicas em mamíferos, incluindo a modulação da dor
(Basbaum e Fields, 1984; Behbehani e cols., 1990), respostas autonômicas (Lovick, 1991),
vocalização (Jürgens e Pratt, 1979) e diferentes padrões de comportamentos, tais como
congelamento, fuga, luta (Bandler e Depaulis, 1988), bem como a resposta de imobilidade
tônica em cobaias (Monassi e cols., 1997 e 1999). Ainda, cada padrão comportamental
pode ser eliciado em regiões específicas da SCP por meio de estimulação elétrica ou por
estimulação química com aminoácidos excitatórios (Bandler e Carrive, 1988; Bandler e
Depaulis, 1991; Zhang e cols., 1990; Schenberg e cols., 2002). Por exemplo, forte ou
SCP de
mamíferos
Coluna
Dorsomedial
Coluna
Dorsolateral
Coluna Lateral e
Ventrolateral
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10
moderada imobilidade, caracterizada por um período de profunda inatividade física, é
observado depois da estimulação da parte ventrolateral da SCP de gatos, enquanto a
resposta de fuga é observada depois da estimulação da coluna dorsomedial da SCP (Zhang
e cols., 1990).
Considerando a SCP importante na modulação da resposta defensiva e
motivacional, Comoli e cols. (2003) demonstraram o envolvimento da SCP na modulação
do comportamento da caça predatória, um modelo de ratos caçando baratas (Periplaneta
americana). Similar ao comportamento defensivo de IT, a caça predatória tem sido
considerada como uma resposta comportamental inata, importante para a sobrevivência do
animal (Eisenberg e cols., 1972). Neste trabalho os autores (Comoli e cols., 2003)
examinaram o padrão de expressão da proteína FOS na SCP de ratos que predavam as
baratas, comparando com a expressão da proteína FOS em ratos confrontados com o seu
predador, o gato. Os resultados mostraram padrões da ativação de distintas colunas
funcionais da SCP para os diferentes comportamentos analisados. Nos animais que
caçaram, maior marcação ocorreu na coluna lateral no nível rostral da SCP. Além de
ocorrer intensa imunorreatividade a proteína FOS no núcleo oculomotor (N.III), região
supra-oculomotor e núcleo tegmental laterodorsal. Nos animais expostos ao predador, foi
observado o comportamento de congelamento e maior expressão da proteína FOS na
coluna dorsomedial e dorsolateral da SCP, bem como no núcleo dorsal da rafe.
Vale ressaltar que, diferentes tipos de estímulos aversivos podem geram diferentes
tipos de medo (Blanchard, 1972 e 1997; Graeff, 1990; Handley e cols., 1993). De fato, têm
sido demonstrados que diferentes estímulos aversivos que resultam no comportamento de
congelamento podem ser emitidos pela participação de distintas colunas da SCP. Desta
maneira, por meio de técnicas funcionais, tal com a imunocitoquímica para proteína FOS,
o congelamento associado ao contexto condicionado é relacionado com a SCP ventral, em
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11
contraste a região dorsolateral da SCP é relacionada com o congelamento frente a
estímulos incondicionado (Vianna e cols., 2001).
É interessante notar também que a SCP está relacionada não apenas com a
modulação de comportamentos de defesa, mas também pode ser essencial para a
determinação de outras respostas, tal como o comportamento maternal. Em vista do
exposto, Miranda-Paiva e cols. (2003) demonstraram que a coluna lateral da SCP é
requerida durante a inibição do comportamento maternal induzida pela administração de
morfina. Mais especificamente, é possível que a SCP lateral seja responsável pela escolha
entre o comportamento maternal e o comportamento de predação. Isto porque quando os
animais foram expostos simultaneamente aos filhotes e a uma presa, baratas, o uso da
morfina promoveu aumento da motivação à caça em detrimento ao comportamento
maternal. Em adição, a administração de morfina aumentou o comportamento predatório
em ratos intactos e aumentou o comportamento maternal em ratos com lesão na SCP lateral
(Sukikara e cols., 2006).
Conexões da Substância Cinzenta Periaquedutal
Como acima descrito é possível que a SCP possua entidades funcionais separadas
com distintas conexões ascendentes e descendentes, resultando em envolvimento
diferenciado nas respostas defensivas específicas. A conexão entre as colunas funcionais
da SCP e outras estruturas do SNC não são homogêneas, sugerindo a especialização de
algumas regiões. Esta avaliação anatômica pode indicar funções distintas executadas por
cada subdivisão da SCP. Em resposta ao encontro da presa com o predador, temos a
mobilização de locais específicos da SCP (Canteras e Goto, 1999, Comoli e cols., 2003).
Ainda, é possível que a coluna dorsolateral participe particularmente na integração de
respostas ao estresse de origem psicológica (Bandler e cols., 2001), enquanto que a coluna
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ventrolateral integra respostas condicionadas a estímulos aversivos (Vianna e cols., 2001),
bem como respostas comportamentais que ocorrem na fase recuperativa após uma situação
estressante ou ameaçadora.
Cameron e cols. (1995), compararam as projeções dos neurônios localizados na
porção rostral e caudal da SCP dorsolateral e da SCP ventrolateral, por meio de seus
estudos foi observado que à parte rostral da SCP dorsolateral tem densas projeções para o
núcleo hipotalâmico anterior relacionado à resposta defensiva, enquanto que as outras
regiões da SCP têm moderadas ou poucas projeções para esta mesma área hipotalâmica.
Ainda, a SCP dorsolateral recebe projeções corticais, entre elas da porção dorso-caudal do
córtex pré-límbico, bem como do córtex auditivo primário e córtex visual secundário
(Newman e cols., 1989).
Com relação a SCPvl, esta estrutura possui conexão diretas e recíprocas com o
núcleo central da amígdala (Rizvi e cols., 1991; Leite-Panissi e cols., 2003) e também
recebe projeção aferentes de distintas áreas corticais, tais como a porção rostro-ventral do
córtex pré-límbico, córtex infra-límbico, córtex pré-frontal e córtex motor-primário
(Newman e cols., 1989). Em adição, estudos anatômicos demonstraram que a SCPvl é a
única subdivisão da SCP que emite projeção para o corno ventral da medula espinhal
(Mouton e Holstege, 1994).
Os núcleos da rafe também são áreas de conexão recíprocas com a SCP. Desta
maneira, análises anatômicas demonstraram conexão recíprocas entre a SCPvl e o núcleo
mediano da rafe (Marcinkiewicz e cols., 1989) o núcleo dorsal da rafe (Kálen e cols., 1985;
Vertes, 1991) e o núcleo caudal da rafe (Hermann e cols., 1997). A coluna dorsolateral da
SCP recebe projeção do núcleo dorsal da rafe (Vertes, 1991) e as colunas lateral e
dorsomedial da SCP emitem projeções preferencialmente para o núcleo caudal da rafe.
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Núcleo de Edinger-Westphal e Núcleo Oculomotor
O núcleo de Edinger-Westphal (N.EW) localiza-se no mesencéfalo juntamente com
as porções mais rostrais da SCP. Este núcleo contém neurônios pré-ganglionares
(Weitemier e cols., 2005) que controlam a constrição pupilar e a acomodação das lentes do
cristalino, sendo que os axônios destes neurônios integram III nervo craniano. Tem sido
demonstrado que esta região pode ser ativada em resposta ao estresse, tal como a restrição
física, a administração de lipopolissacarídeos (LPS), bem como devido a mudanças na
temperatura corporal induzida por vários meios e no consumo induzido de etanol (Turek e
cols., 2005). Dentro desta perspectiva, Kozicz (2003) demonstrou que o estresse de
restrição física e a administração de LPS induzem aumento da expressão de c-fos no
N.EW. Turek e cols. (2005) mostraram aumento da expressão de c-fos após a injeção i.p de
etanol (2g/Kg) no N.EW. No entanto, McGregor e cols. (2004) demonstraram que este
núcleo é mais sensível a administração de benzodiapínicos em ratos do que ao estresse
gerado pelo odor de um predador natural, no caso , o gato. Dessa maneira, é possível que a
ativação deste núcleo pelo consumo do etanol possa estar associado ao efeito ansiolítico
proporcionado por este tratamento (Turek e cols., 2005) e não especificamente ao efeito
ansiogênico acarretado pelo odor do predador. Desta maneira, a contribuição do núcleo de
Edinger-Westphal nos estados emocionais que envolvem medo e ansiedade necessita de
maior investigação.
O núcleo oculomotor (N.III), está localizado no mesencéfalo também, mais
especificamente na borda ventrolateral da SCP, em suas porções mais rostrais.
Considerado um núcleo motor extra-ocular que inerva quase todos os músculos
extraoculares, possui ainda função autonômica de constrição pupilar e acomodação das
lentes do cristalino.
Introdução________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
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Núcleo Dorsal da Rafe
A palavra rafe significa “estria” ou “ruga” e refere-se ao fato de que a maioria dos
núcleos da rafe é encontrada dentro ou próxima à linha média do tronco encefálico. O
conjunto de núcleos da rafe é formado por neurônios serotoninérgicos, os quais são
responsáveis pela inervação ascendente e descendente do encéfalo. Estas estruturas têm
sido implicadas na regulação da ansiedade e de diferentes situações que envolvem
estímulos aversivos, analgesia e estresse (Basbaum e Fields, 1984; Amat e cols., 2005;
Maier e Watkins, 2005).
De fato, estudos anatômicos mostraram que a amígdala é um dos
principais sítios de projeção do núcleo dorsal da rafe (NDR) (Azmitia e Segal, 1978; Ma e
cols., 1991; Jacob e Azmitia, 1992;), e alguns achados sugerem que a inibição dos
neurônios serotonérgicos do NDR promove efeito ansiolítico em diferentes testes
comportamentais (Griebel, 1995). É possível que as projeções descendentes da SCP
responsáveis pela modulação dos motoneurônios envolvidos na emissão dos
comportamentos defensivos necessitem de uma estação sináptica nos núcleos da rafe.
Hermann e cols. (1997), utilizando como neurotraçador a coleratoxina (subunidade b) em
ratos, demonstraram eferências das colunas dorsomedial, lateral e ventrolateral da SCP
para o núcleo obscuro da rafe (Holstege e Kuypers, 1987). Em adição, densas projeções
serotoninérgicas do NDR são identificadas na porção ventrolateral da SCP (Vertes, 1991),
bem como na porção dorsolateral, sendo estas projeções possivelmente envolvidas na
modulação de respostas comportamentais defensivas (Lovick, 1994).
Proteína FOS
A proteína FOS, o produto protéico da expressão do gene c-fos, é sintetizada em
neurônios que foram ativados por diferentes formas de estímulos, tais como: estresse,
crises convulsivas, administração de salina hipertônica ou estímulos nociceptivos,
refletindo a ativação de específicos sistemas neuronais (Morgan e Curran, 1995). A
Introdução________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
15
excitação neuronial leva a uma rápida e transiente indução de c-fos. A proteína FOS pode
ser detectada no núcleo neuronial, no período de 15 a 90 minutos após a excitação
neuronial e desaparecer aproximadamente 4 a 16 horas após o término do estímulo
(Morgan e cols., 1987). Considerando que a proteína FOS e o RNAm c-fos são
encontrados em baixas concentrações em quase todos os neurônios, e a sua síntese aumenta
em resposta a vários estímulos extracelulares, a abordagem imunocitoquímica para
proteína FOS tem sido amplamente utilizada como indicador de atividade neuronial em
regiões discretas do sistema nervoso central (Hunt e cols., 1987; Morgan e cols., 1987;
Sagar e cols., 1988).
O produto protéico de resposta imediata, dentre eles o c-fos pertencente à categoria
dos proto-oncogene, a qual em condições fisiológicas está envolvida na regulação do
crescimento e da divisão celular. Por outro lado, quando expressos de forma inadequada,
dão origem aos oncogenes, definidos como elementos genéticos que podem causar
alteração celular patológica (Bishop, 1985; Morgan e Curran, 1991). Assim, os genes
celulares normais, dos quais os oncogenes foram derivados, são referidos como proto-
oncogenes, que representam os progenitores dos oncogenes.
Nas últimas décadas, o estudo do substrato neural envolvido na emissão e
modulação das respostas defensivas comportamentais e emocionais (Canteras e Goto,
1999; Blanchard e cols., 2001; Comoli e cols., 2003) tem tido grande avanço devido ao uso
de técnicas funcionais, tais como a imunocitoquímica para a marcação da proteína FOS.
Em adição, grande número de laboratórios tem se especializado no estudo de situações
comportamentais que envolvem a apresentação do predador ou de pistas associadas ao
predador (tal como o odor) que freqüentemente produzem um estado de vigilância e
ansiedade, caracterizado por comportamentos de congelamento, esquiva e posturas de
exploração cautelosa (Banchard e cols., 1990; Blanchard e cols., 2001; Dielenberg e cols.,
2001). Ainda, estes diferentes modelos etológicos de medo inato, não recrutam sistemas
Introdução________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
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neurais que possam estar envolvidos com memória, como ocorre nos modelos onde são
utilizadas situações de medo condicionado, e desta maneira, tem grande vantagem para o
real estudo do substrato neural envolvido na emissão de respostas de medo inato. No
entanto, vale ressaltar que mesmo nos modelos acima citados não há interação direta entre
presa-predador. Em visto do exposto, a resposta de IT, é considerada um comportamento
de medo inato, em uma situação pós-encontro e com interação física entre presa-predador.
Sendo, portanto, um modelo etológico vantajoso para o estudo do medo inato.
OBJETIVOS
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
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Com base na literatura apresentada, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a
possível ativação neuronal da substância cinzenta periaquedutal após a emissão da resposta
defensiva de imobilidade tônica em cobaias. Desta maneira, este trabalho se propôs à:
1. Avaliar a expressão da proteína FOS nas diferentes colunas funcionais da SCP ao
longo do eixo rostro-caudal do tronco encefálico (SCP dorsomedial, SCP dorsolateral, SCP
lateral e SCP ventrolateral) 2 horas após o início da resposta de IT em cobaias.
2. Avaliar a imunorreatividade á proteína FOS em áreas adjacentes a SCP, tal como
o núcleo de Edinger-Westphal, núcleo oculomotor e núcleo dorsal da rafe para avaliar
possíveis áreas de projeção da SCP, ou áreas que possam estar comprometidas com a
modulação emocional.
Considerando que não há padronização na literatura do uso da técnica da
imunocitoquímica para proteína FOS após a indução da resposta de IT em cobaias,
entendemos que se faz necessário à utilização de um estímulo conhecidamente capaz de
promover o aumento da síntese da proteína FOS. Desta maneira, como controle positivo
realizamos conjuntamente com os animais submetidos a IT um grupo que recebeu a
administração i.p de salina hipertônica (NaCl 1,5%; Sharp e cols.,1991).
A realização deste trabalho poderá auxiliar no estabelecimento de um padrão de
atividade neuronal nas diferentes colunas funcionais da SCP, durante uma resposta de
medo inato, a IT em cobaias.
MATERIAIS E MÉTODOS
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
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1. Animais
Para realização deste trabalho, foram utilizadas cobaias machos (Cavia porcellus; n =
39), pesando entre 400 e 500g, mantidos em caixas acrílicas (56x17x39cm), sendo 5
animais por caixa, forradas com maravalha. Os animais foram mantidos em sala
climatizada a 24º ± 1ºC, com ciclo de claro-escuro de 12 horas (6:00-18:00h), tendo livre
acesso à água e comida durante todo o experimento. A manutenção dos animais e todos os
procedimentos obedeceram a guias éticas internacionais que regulamentam o uso de
animais em laboratório, recomendadas pela Sociedade Brasileira de Neurociências e
Comportamento, e com a aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da
Prefeitura do Campus Administrativo de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo
(Processo nº 05.1.84.53.7).
2. Equipamentos, soluções e reagentes utilizados.
Sala escura com uma luminária acesa sobre a mesa experimental, com barulho de
fundo (ventilador ligado na velocidade máxima) e uma caixa plástica (31cm de
comprimento x 20cm de largura x 13cm de altura) com espuma em “V”, onde foi
induzida a resposta defensiva de imobilidade tônica;
Bomba peristáltica, para realizar a perfusão dos animais;
Criostato (-20ºC ± 1) marca MICROM modelo HM 505E;
Agitador orbital;
Balança;
Micropipetas;
Agitador-aquecedor;
Microscópio ZEISS Axiostar plus, Sistema de imagem: AxionCam MRc.
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
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Cloridrato de ketamina a 10% (ketamina Agener, 30 mg/kg, i.m.) associado à
Xilasina (Dopaser, 4 mg/kg, i.m);
Solução salina tamponada (PBS) 0,9% a 0,01 M com pH 7,4;
Solução fixadora de paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS 0,2 M pH 7,4;
Sacarose 30% tamponada em PB 0,1 M pH 7,4;
Isopentana 99% (C
5
H
12
- Vetec);
Triton X100;
Soro albumina bovina – BSA – 0,1%;
H
2
O
2
30% (Merck);
Anticorpo primário da Santa Cruz (SC-52);
Anti-IgG de coelho, Vectastain, Vector Laboratories;
Solução de Avidina-Biotina-Peroxidase (solução A e B do kit ABC, Vectastain,
Vector Laboratories);
3-3’ diaminobenzidina (DAB) em comprimido (Sigma);
Entellan (Sigma);
Álcoois (75%, 85%, 95%, 100%, 100%);
Xilol Químico;
Etilenoglicol.
3. Procedimentos
Indução à Imobilidade Tônica
Um dia antes do início dos experimentos, os animais foram trazidos do biotério
localizado na Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, e foram colocados na sala de
experimentação na tentativa de reduzir ao máximo o estresse ambiental do animal. As
sessões de IT foram realizadas no período da manhã, em sala escura com uma luminária
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
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acesa sobre a mesa experimental, com barulho de fundo (ventilador ligado na velocidade
máxima). A indução da imobilidade tônica foi realizada por meio de inversão postural e
contenção do animal manualmente até que ele não mais apresentasse resistência a este
procedimento. A duração dos episódios de IT foi registrada até o momento em que o
animal retomasse a sua postura habitual. Foram realizadas 5 manobras de indução à IT, e
apenas os animais que obtiveram a somatória da duração da IT igual ou superior a 60
minutos foram utilizados nos experimentos.
Perfusão e Remoção dos Encéfalos.
Duas horas após o início do protocolo experimental os animais foram
profundamente anestesiados, com cloridrato de ketamina a 10 % (ketamina Agener,
30mg/Kg, i.m.) associado a xilasina (Dopaser, 4 mg/Kg, i.m.). Em seguida, com a
utilização de uma bomba peristáltica, os animais foram perfundidos por via trans-aórtica
inicialmente com 200ml de solução salina tamponada (PBS) 0,9 % a 0,01 M com pH 7,4,
seguida de 200ml de solução fixadora de paraformaldeído (PFA) a 4 %, diluído em tampão
fosfato de sódio (PB) 0,1 M (pH 7,4). O sistema de perfusão utilizado permitiu a realização
simultânea de animais experimentais e controles, não ocasionando, portanto, possíveis
diferenças nos protocolos experimentais do grupo controle e do grupo experimental.
Com o término da perfusão, os encéfalos foram removidos e colocados em tubos
previamente identificados contendo PFA 4% em PB 0,1 M pH 7,4, sendo mantidos nesta
solução por quatro horas a 4°C. Em seguida, foram crioprotegidos com solução de sacarose
30 % tamponada em PB 0,1 M pH 7,4, onde permaneceram por 24 horas a 4 °C, ou até que
o material migrasse para o fundo do frasco, indicando a saturação do tecido encefálico.
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
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Congelamento do Tecido e Obtenção das Secções Encefálicas
O congelamento do tecido foi realizado com isopentana 99 % (C
5
H
12
– Vetec)
mantida em gelo seco a 40 °C negativos. Cada encéfalo foi mantido próximo a isopentana
(no vapor) por 10 segundos, sendo então mergulhado nesta solução por aproximadamente
10 a 12 segundos. Após este procedimento, os encéfalos foram armazenados no freezer a
20 °C negativos, ou então, foram imediatamente colocados no criostato (-20 °C ±1) para
início dos cortes.
Os cortes de tecido foram realizados em criostato na espessura de 30 µm. Secções
adjacentes da substância cinzenta periaquedutal foram colhidas em placas de acrílico
contendo PBS 0,01 M, pH 7,4 para realização da imunocitoquímica para a proteína FOS.
Um conjunto de secções adjacentes foi colhido em placas de acrílico, porém contendo
solução anti-congelante, sendo então, armazenado o material em freezer a 20 °C negativos.
Para determinação das áreas encefálicas foi utilizado como parâmetro o Atlas de Rössner
(1967) para as cobaias, bem como a descrição anátomo-funcional da SCP proposta por
Carrive (1993) e o Atlas de Paxinos e Watson (2005) para ratos.
Detecção Imunocitoquímica da Proteína FOS
O processamento imunocitoquímico para detecção da proteína FOS foi realizado
imediatamente após a realização dos cortes do tecido em criostato. Primeiramente, os
cortes foram enxaguados em solução de lavagem (PBS 0,01 M, pH 7,4) três vezes, de 5
minutos cada. O volume ideal de tampão foi aquele que cobriu totalmente as secções
durante as incubações que foram realizadas em placa de agitação orbital.
Em seguida, foram incubados com PBS 0,01 M contendo peróxido de hidrogênio
1 % (H
2
O
2
1% v:v) durante 10 minutos. A água oxigenada foi utilizada para neutralizar a
atividade de enzimas peroxidases que eventualmente poderiam estar presentes no tecido ou
mesmo em hemácias não lavadas pela perfusão. Os cortes foram novamente enxaguados,
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
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por três vezes, 5 minutos cada com PBS 0,01 M, pH 7,4. Na seqüência os cortes foram
incubados com o anticorpo primário. Foi utilizado o anticorpo primário policlonal de
coelho anti-proteína FOS (SC-52, Santa Cruz Biotechnology). O anticorpo foi diluído
1:2000 em PBS + (ou seja, PBS contendo Triton X100, 0,2 % e soro - albumina bovina –
BSA – 0,1 %). A incubação foi realizada por um período mínimo de 22 horas, à
temperatura ambiente de 22 ºC ± 1ºC, sob agitação constante.
No segundo dia, as secções foram lavadas com PBS 0,01 M pH 7,4 para eliminar
o excesso de anticorpo primário e as ligações inespecíficas. Foi utilizado um anticorpo
secundário, uma anti-IgG de coelho, Vectastain, Vector Laboratories, marcado com uma
molécula de biotina, ligando-se à região constante do anticorpo primário. O anticorpo
secundário foi diluído na proporção de 1:400, em PBS+. Esta solução permaneceu por uma
hora em contato com o tecido sob agitação, à temperatura ambiente. Após este período
foram realizadas novas lavagens (3 vezes, 5 minutos cada) com PBS 0,01 M pH 7,4.
Na próxima etapa foi realizada a incubação com complexo AB (preparo da
solução realizado com 30 minutos de antecedência) correspondente à solução de Avidina-
Biotina-Peroxidase (solução A e B do kit ABC, Vectastain, Vector Laboratories). Esta
solução foi adicionada ao meio, permanecendo por 1 hora e depois foram feitas três
lavagens com PBS 0,01 M pH 7,4 por 5 minutos cada. O complexo AB foi revelado com
3-3’ diaminobenzidina (DAB) e peróxido de hidrogênio (0,04 % de H
2
O
2
30 %), durante
10 minutos. Ao final da reação um composto colorido e insolúvel, marrom escuro,
depositado no interior dos núcleos neuronais se precipita marcando a localização do
anticorpo primário no tecido.
Desidratação e Diafanização do Tecido
Após o término da reação, os cortes foram montados em lâminas gelatinizadas.
Depois de secas foi realizado o processo de desidratação do tecido, onde as lâminas
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25
passaram por uma série de concentrações crescentes de álcoois (75 %, 95 %, 100 %, 100
%). Logo após passaram por solução álcool/ xilol (50 % v:v), e xilol 100 % (2X). Estes
procedimentos têm por objetivo tornar o tecido translúcido, permitindo a visualização
microscópica e posterior análise de imagem. Após a secagem os cortes foram cobertos com
Entellan (Sigma) e lamínula. Cortes adjacentes foram corados pelo método da coloração de
Nissl para servir com referência citoarquitetônica.
Grupos Experimentais
Grupo 1 (n = 13): Grupo controle, os animais foram manipulados, mas não
submetidos à imobilidade tônica, permanecendo nas caixas em situação semelhante aos
animais experimentais, após duas horas os animais foram sacrificados e os seus encéfalos
submetidos aos procedimentos de imunocitoquímica, para determinação da proteína FOS.
Grupo 2 (n = 14): Neste grupo, foi realizado a indução da resposta de imobilidade
tônica e duas horas após o ínicio do protocolo experimental, os animais foram sacrificados
e os seus encéfalos submetidos aos procedimentos de imunocitoquímica para proteína
FOS.
Grupo 3 (n = 12): Neste grupo experimental, foi realizada a administração de
solução de salina hipertônica a 1,5% (2ml/kg) via i.p, e após duas horas, os animais foram
sacrificados e seus encéfalos submetidos aos procedimentos imunocitoquímicos para a
proteína FOS. A realização deste grupo experimental teve como objetivo o controle
positivo da técnica imunocitoquímica para proteína FOS em cobaias.
4. Análise de Imagem
As secções de tecido foram analisadas em microscópio (Axiostar plus) e as imagens
foram capturadas por meio da utilização de um sistema de análise de imagem (Axio Vision
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
26
4 AC). Para análise da densidade de células imunorreativas à proteína FOS foi utilizado o
programa processador de imagem Image J de domínio público inspirado no NIH Image J
para Macintosh. A análise da densidade neuronal positivamente marcada para a proteína
FOS foi obtida por meio da contagem do número de células com marcação positiva na
região determinada do tecido nervoso. As células imunorreativas à proteína FOS (IR-FOS)
foram contadas em uma área pré-fixada que variou de 0,1 a 0,5mm
2
, segundo a estrutura
analisada. Para cada nível rostro-caudal da SCP foram quantificados dois cortes
encefálicos, e então realizada uma média da contagem de cada coluna funcional para cada
animal experimental. Ao final das quantificações, cada valor individual foi padronizado
para uma área constante de 0,2mm
2
(Singewald e cols., 2002). As estruturas quantificadas
neste estudo foram as diferentes colunas funcionais da SCP, ou seja, coluna dorsolateral,
coluna dorsomedial, coluna lateral e coluna ventrolateral. Em adição realizamos a
quantificação de células IR-FOS em áreas adjacentes a SCP, no núcleo Edinger-Westphal e
no núcleo oculomotor, localizados no nível mais rostral e no NDR nos níveis intermediário
e caudal. A figura 3 apresenta um esquema representativo das áreas analisadas neste
estudo.
Os dados são apresentados como média de células imunorreativas para uma área de
0,2mm
2
± erro padrão da média (EPM) para cada área em estudo.
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
27
Figura 3: Esquema representativo dos níveis ao longo do eixo rostro-caudal do tronco encefálico
das áreas analisadas em nosso estudo da Substância Cinzenta Periaquedutal (SCP). Desenhos
modificados do Atlas de Paxinos e Watson (2005). Aq.: Aqueduto cerebral; N.EW: núcleo de
Edinger-Westphal; N.III: núcleo oculomotor; NDR: núcleo dorsal da rafe; SCPdm: coluna
dorsomedial; SCPdl: coluna dorsolateral; SCPl: coluna lateral e SCPvl: coluna ventrolateral.
5. Análise Estatística
Para a análise estatística foi realizada a análise de variância multivariada ANOVA
(Two-way), sendo o fator dependente a IR-FOS e como fatores independentes o
tratamento, e a área encefálica analisada ou o nível do eixo rostro-caudal considerado na
analise. Como teste post-hoc foi utilizado o Newman-Keuls. Os dados foram considerados
significativos quando p < 0,05. Foi utilizado para realização da análise estatística o
Programa Sigma Stat 11.0 versão para Windows.
RESULTADOS
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
29
Os animais utilizados neste estudo que foram submetidos ao comportamento
defensivo de IT tiveram a somatória do tempo de emissão desta resposta de 95,8 minutos
(5747 segundos). Com relação à análise imunocitoquímica, os dados obtidos mostram que
a resposta comportamental de IT em cobaias é capaz de promover a marcação da proteína
FOS em várias estruturas neurais avaliadas, entre elas a SCP e os núcleos Edinger-
Westphal (N.EW) e Dorsal da Rafe (NDR), localizados no tronco encefálico. No núcleo
oculomotor (N.III) não houve aumento significativo da marcação da proteína FOS, após a
emissão da resposta de IT. No grupo onde realizamos a administração i.p de solução salina
hipertônica 1,5%, também observamos aumento da IR-FOS em todas as estruturas neurais
avaliadas.
A Tabela I mostra os valores médios da densidade IR-FOS nas diferentes áreas
quantificadas em nosso estudo, nos diferentes grupos experimentais e com relação aos
distintos níveis do eixo rostro-caudal analisados.
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
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Controle IT Salina Hipertônica
Tronco Encefálico IR-FOS/0,2mm2 IR-FOS/0,2mm2 IR-FOS/0,2mm2
Nível 1: Rostral
SCPdm 10,25 ± 1,50 59,05 ± 4,51 75,76 ± 8,76
SCPdl 10,00 ± 1,90 68,18 ± 6,28 84,13 ± 13,17
SCPl 12,64 ± 2,06 61,63 ± 7,00 77,99 ± 8,86
SCPvl 23,64 ± 3,61 121,11 ± 11,15 146,93 ± 12,45
N. EW 51,38 ± 7,21 161,49 ± 18,63 218,8 ± 28,22
N III 19,93 ± 3,72 38,04 ± 3,49 61,20 ± 7,13
Nível 2: Intermediário
SCPdm 11,26 ± 2,68 65,15 ± 9,01 110,23 ± 8,88
SCPdl 14,82 ± 3,13 66,92 ± 9,83 98,63 ± 14,40
SCPl 12,69 ± 2,41 70,10 ± 8,31 118,65 ± 13,00
SCPvl 15,96 ± 3,41 83,86 ± 10,40 122,92 ± 8,80
NDR 45,26 ± 11,22 144,46 ± 8,98 182,31 ± 18,69
Nível 3: Caudal
SCPdm 10,65 ± 3,88 41,65 ± 8,82 47,12 ± 9,21
SCPl 19,05 ± 2,13 79,37 ± 5,67 175,58 ± 14,08
SCPvl 18,00 ± 3,62 107,29 ± 13,39 157,72 ± 24,35
NDR 50,75 ± 12,74 124,36 ± 14,37 281,50 ± 27,18
Média da Densidade ± EPM do número de células IR-FOS
Tabela I: Valores das densidades médias de células imunorreativas para a proteína FOS (IR-FOS)
nas diferentes áreas do tronco encefálico analisadas, no grupo controle (n = 13); grupo salina
hipertônica 1,5% (n = 12) e no grupo submetido à resposta de imobilidade tônica (n = 14), com
relação aos diferentes níveis do eixo rostro-caudal. N.EW: núcleo de Edinger-Westphal; NIII:
núcleo oculomotor e NDR: núcleo dorsal da rafe. SCP: substância cinzenta periaquedutal; SCPdl:
coluna dorsolateral; SCPdm: coluna dorsomedial; SCPl: coluna lateral e SCPvl: coluna
ventrolateral.
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
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Para análise estatística inicialmente consideramos como fatores independentes o
tratamento e uma coluna funcional específica da SCP, e como fator dependente a
imunorreatividade à proteína Fos (IR-FOS). Nossos dados mostraram que em todas as
colunas funcionais da SCP há diferença significativa (F
2,88
= 61,71; F
2,68
= 37,54; F
2,88
=
119,29; F
2,88
= 85,38; Two-way ANOVA, p < 0,001 para a SCPdm, SCPdl, SCPl e SCPvl
respectivamente) entre o grupo controle e IT e entre o controle e a administração de salina
hipertônica 1,5% (p < 0,05; Newman-Keuls), considerando individualmente os diferentes
níveis do eixo rostro-caudal analisado (figura 4).
Em um segundo momento, realizamos a análise de variância (Two-way ANOVA)
considerando como fatores independentes o tratamento e as diferentes áreas analisadas, em
um mesmo nível do eixo rostro-caudal. Os resultados desta avaliação mostraram no nível
rostral diferença significativa entre a área (F
5,237
= 45,431, p < 0,001) e o tratamento (F
2,237
= 112,553, p < 0,001), bem como interação entre área e tratamento (F
10,237
= 5,528, p <
0,001). O teste post-hoc Newman-Keuls (p < 0,05) evidenciou diferença estatística entre o
aumento da IR-FOS na SCPvl nos grupos IT e salina hipertônica, quando comparado com
o efeito destes mesmos tratamentos nas demais colunas funcionais da SCP (figura 4). A
mesma análise do nível intermediário mostrou diferença apenas com relação ao tratamento
quando comparado as diferentes colunas da SCP no mesmo nível (F
2,153
= 104,855, p <
0,001, Two-way ANOVA), não havendo interação entre área e tratamento neste nível
(F
8,153
= 1,579, p = 0,136). No nível mais caudal analisado, os resultados da Two-way
ANOVA evidenciou diferença entre a área (F
3,82
= 24,462, p < 0,001) e o tratamento (F
2,82
= 73,141, p < 0,001), bem como interação entre área e tratamento (F
6,82
= 4,813, p <
0,001). O teste post-hoc Newman-Keuls (p < 0,05) evidenciou diferença estatística entre o
aumento da IR-FOS localizada na SCPvl e na SCPl nos grupos IT e salina hipertônica,
quando comparadas com o efeito destes mesmos tratamentos na SCPdm (figura 4). Ainda,
não há diferença entre a SCPvl e a SCPl.
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
32
Vale acrescentar que não foi demonstrada diferença com relação a IR-FOS no
grupo controle quando comparamos ao longo do eixo rostro-caudal, bem como entre as
distintas colunas funcionais da SCP em um mesmo nível (p > 0,05, teste de Newman-
Keuls).
Nas figuras 5, 6 e 7 ilustramos a IR-FOS localizada na SCP em animais
representativos do grupo controle e do grupo IT nos diferentes níveis do eixo rostro-caudal
analisado.
A análise ANOVA Two-way para o N.EW evidenciou diferença significativa
(figura 8) quando comparado (p < 0,001, Newman-Keuls) o grupo controle com o grupo IT
e salina hipertônica. Por outro lado, a análise de variância não mostrou diferença
significativa no N.III quando comparado o grupo controle com o grupo IT, e diferença
significativa quando comparado o grupo controle com o grupo de administração de salina
hipertônica (figura 8). Na figura 9 mostramos fotomicrografias da área dos N.EW e do
N.III analisados de um animal representativo do grupo controle e do grupo IT.
Por fim, realizamos análise dos dados obtidos com a quantificação da IR-FOS
localizada no núcleo dorsal da rafe (NDR) nos níveis intermediário e caudal analisados. O
teste post-hoc de Newman-Keuls (p < 0,05) mostrou que há diferença entre o grupo IT e
salina hipertônica quando comparados com o controle (figura 10). Ainda, há diferença
entre o grupo IT e a administração de salina hipertônica. Na figura 11 mostramos
fotomicrografias da área do NDR nos níveis intermediário e caudal de animais do grupo
controle e do grupo submetido a IT.
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
33
SCPdm SCPdl SCPl SCPvl SCPdl SCPdm SCPl SCPvl SCPdm SCPl SCPvl
0
30
60
90
120
150
180
Controle
IT
Nível 01 Nível 03
Nível 02
NaCl 1,5%
a
a
a
a,c
a
a
a
a,b,c
a,b
a,b
a,b a,b
a
a
a
a
a,b,c
a,b,c
a,c
a,c
a
a
Média núm. cels. IR - Fos / 0,2 mm
2
Figura 4: Densidade da imunorreatividade a proteína FOS (IR-FOS) ± EPM em cada nível da
Substância Cinzenta Periaquedutal (SCP) em cada grupo experimental: o grupo controle, o grupo
submetido à indução de IT e o grupo que recebeu administração i.p de salina hipertônica 1,5%.
SCPdm: coluna dorsomedial; SCPdl: coluna dorsolateral; SCPl: coluna lateral e SCPvl: coluna
ventrolateral. No nível 01: Controle, n = 13; IT, n= 14; NaCl 1,5%, n = 12. No nível 02: Controle, n
= 09; IT, n= 11; NaCl 1,5%, n = 10. No nível 03: Controle, n = 06; IT, n = 07; NaCl 1,5%, n = 07.
(a) p < 0,05 quando comparado com seu respectivo controle; (b) p < 0,05 quando comparado com
o grupo submetido a IT; (c) p < 0,05 quando comparado com IT e NaCl 1,5% com as demais
colunas funcionais da SCP no mesmo nível rostro-caudal; pelo teste de Newman-Keuls.
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
34
Figura 5: Fotomicrografias de sessões coronais (30µm) de encéfalos de cobaias que ilustram a
distribuição da imunorreatividade à proteína FOS no nível rostral da Substância Cinzenta
Periaquedutal (SCP) no grupo controle, ou seja, sem a indução do comportamento de imobilidade
tônica, nas figuras, A: parte dorsomedial da SCP; B: parte dorsolateral da SCP; C: parte lateral da
SCP; D: parte ventrolateral da SCP; e no grupo após o comportamento de Imobilidade Tônica, nas
figuras E: parte dorsomedial; F: parte dorsolateral; G: parte lateral e H: parte ventrolateral da SCP.
Barra: 415µm – aumento de 12 X.
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
35
Figura 6: Fotomicrografias de sessões coronais (30µm) de encéfalos de cobaias que ilustram a
distribuição da imunorreatividade à proteína FOS no nível intermediário da Substância Cinzenta
Periaquedutal (SCP) no grupo controle, ou seja, sem a indução do comportamento de imobilidade
tônica (IT), nas figuras A: parte dorsomedial da SCP; B: parte dorsolateral da SCP; C: parte lateral
da SCP; D: parte ventrolateral da SCP; e no grupo após a indução do comportamento de IT, nas
figuras, E: parte dorsomedial da SCP, F: parte dorsolateral da SCP; G: parte lateral da SCP, H:
parte ventrolateral da SCP. Barra: 415µm – aumento de 12 X.
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
36
Figura 7: Fotomicrografias de sessões coronais (30µm) de encéfalos de cobaias que ilustram a
distribuição da imunorreatividade à proteína FOS no nível caudal da Substância Cinzenta
Periaquedutal (SCP) no grupo controle, ou seja, sem a indução do comportamento de imobilidade
tônica (IT), nas figuras A: parte dorsomedial da SCP; B: parte lateral da SCP; C: parte
ventrolateral da SCP; e no grupo após o comportamento de I.T nas figuras, D: parte dorsomedial da
SCP, E: parte lateral da SCP; F: parte ventrolateral da SCP. Barra: 415µm – aumento de 12 X.
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
37
N.III N.EW
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
Controle
IT NaCl 1,5 %
a,b
a
a
Média núm. cels. IR-FOS/ 0,2mm
2
Figura 08: Densidade da imunorreatividade a proteína FOS (IR-FOS) ± EPM no núcleo Edinger-
Westphal (N.EW) e no núcleo oculomotor (N.III) no nível rostral analisado. IR-FOS do grupo
controle (controle, n = 13); no grupo submetido a imobilidade tônica (IT, n = 14) e no grupo que
recebeu administração de salina hipertônica 1,5% (NaCl 1,5%, n = 12).(a): p < 0,05 quando
comparado com seu respectivo controle, pelo teste de Newman-Keuls. (b): p < 0,05 quando
comparado com o grupo submetido a IT, pelo teste de Newman-Keuls.
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
38
Figura 09: Fotomicrografias de sessões coronais (30µm) de encéfalos de cobaias que ilustram a
distribuição da imunorreatividade à proteína FOS no nível rostral analisado no grupo controle, ou
seja, sem a indução do comportamento de imobilidade tônica (IT), nas figuras A e B; e no grupo
após a indução do comportamento de IT, nas figuras C e D. N.EW: Núcleo de Edinger-Westphal,
N.III: Núcleo oculomotor. Barra: 415µm – aumento
de 12 X.
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
39
NDR NDR
0
50
100
150
200
250
300
Controle IT
Nível 02
Nível 03
NaCl 1,5 %
a,b
a,b
a
a
Média do núm. cels. IR-FOS / 0,2 mm
2
Figura 10: Densidade da imunorreatividade a proteína FOS (IR-FOS) ± EPM no núcleo dorsal da
rafe (NDR) analisado nos dois níveis do eixo rostro-caudal, o nível intermediário e o caudal. IR-
FOS do grupo controle (Controle; n = 09, no nível intermediário e n = 06, no nível caudal) no
grupo submetido à imobilidade tônica (IT; n = 11, no nível intermediário e n = 07, no nível caudal)
e no grupo que recebeu administração de salina hipertônica 1,5% (NaCl 1,5%; n = 10, no nível
intermediário e n = 07, no nível caudal) e.(a): p < 0,05 quando comparado com seu respectivo
controle, pelo teste de Newman-Keuls. (b): p < 0,05 quando comparado com o grupo submetido a
IT, pelo teste de Newman-Keuls.
Resultados________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
40
Figura 11: Fotomicrografias de sessões coronais (30µm) de encéfalos de cobaias que ilustram a
distribuição da imunorreatividade à proteína FOS na região do núcleo dorsal da rafe (NDR) no
grupo controle, ou seja, sem a indução do comportamento de imobilidade tônica (IT), nas figuras
A: NDR do nível intermediário, C: NDR, referente ao nível caudal. E animais representativos após
a indução de IT, nas figuras B: NDR, referente ao nível intermediário, e D: NDR, referente ao
nível caudal. Barra: 415µm – aumento de 12 X.
DISCUSSÃO
Discussão_________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
42
Os dados obtidos no presente trabalho demonstram que a emissão do comportamento
defensivo de IT é capaz de promover aumento da expressão da proteína FOS em distintas
colunas da SCP (figuras 5 a 7). Em adição, nossos resultados evidenciaram células
imunorreativas à proteína FOS (IR-FOS) em áreas adjacentes à SCP, no núcleo dorsal da
rafe e no núcleo Edinger-Westphal, sugerindo que estas estruturas estariam também sendo
recrutadas durante a emissão desta resposta defensiva. Em contrapartida, não há aumento
significativo do número de células IR-FOS no núcleo oculomotor, este achado reforça a
hipótese de que a expressão da proteína FOS após a IT ocorreu de forma específica, ou
seja, em áreas mais relacionadas a modulação de respostas de defesa.
Historicamente, a SCP tem sido considerada como a via final comum do repertório
comportamental de defesa (Bandler, 1988; Graeff, 1993), e vários outros achados reforçam
o envolvimento da SCP na emissão e na modulação das respostas de defesa (Canteras e
Goto, 1999; Bittencourt e cols., 2004) e especialmente na IT (Monassi e cols., 1999). Desta
maneira, Bandler e Carrive (1988) demonstraram que a SCP tem envolvimento crucial na
integração somática e autonômica das respostas características de reações defensivas.
Nossos dados corroboram esta hipótese, pois demonstram intensa imunorreatividade à
proteína Fos em todas as colunas funcionais da SCP, sugerindo sua ativação durante a
resposta de IT, um comportamento de defesa inata. Ainda, dando suporte aos nossos
achados, Bittencourt e cols. (2004) mostraram que a estimulação das colunas lateral e
dorsal da SCP produz um conjunto complexo de comportamentos incondicionados
denominados pelos autores de “reação de defesa”. Este conjunto de respostas defensivas é
descrito como: imobilidade tensa, exolftalmia, trote, galope, saltos, micção e defecação.
Com relação a coluna ventrolateral da SCP, é reportado que esta região está associada a
analgesia opióide (Basbum e Fields, 1984), hipotensão e imobilidade, sendo estas respostas
associadas à fase de recuperação pós-defesa (Morgan e Carrive, 2001). No entanto,
considerando em nosso caso a resposta de IT, esta ocorre apenas após o confronto direto
Discussão_________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
43
entre presa e predador na natureza, e possivelmente são necessários ajustes autonômicos,
bem como, alterações no limiar nociceptivo para que o animal possa desempenhar este
comportamento defensivo adequadamente. De fato, a resposta de IT é capaz de
desencadear analgesia do tipo opióide em cobaias, visto que após a emissão desta resposta
há aumento significativo do índice de analgesia avaliado no teste da placa quente (Leite-
Panissi e cols., 2001). Em conjunto estes dados dão suporte aos nossos achados de
aumento do número de células IR-FOS localizadas nas distintas colunas funcionais da
SCP.
Pioneiros na investigação da participação da SCP nas respostas defensivas,
Fernandez de Molina e Hunsperger (1962) propuseram que o sistema defensivo poderia ser
modulado por duas áreas interligadas, a área hipotalâmica e a SCP. No entanto, além do
envolvimento destas duas estruturas, estes mesmos autores demonstraram que a
estimulação elétrica da região do complexo amigdalóide de gatos promove reações de
defesa, incluindo alerta, fuga e ataque defensivo (Fernandez de Molina e Hunsperger,
1959). Com relação ao envolvimento da SCP na modulação da resposta de IT em cobaias,
Monassi e cols (1997, 1999) têm demonstrado que a estimulação colinérgica, opioidérgica
e gabaérgica das colunas ventrolateral e dorsal da SCP podem modular a resposta de IT.
Estes achados corroboram nossos dados obtidos, onde demonstramos que após a emissão
da resposta de IT ocorre intensa IR-FOS, tanto na SCPdm e SCPdl como na SCPvl (figura
04). Estes mesmos autores descrevem a possibilidade de que na SCPvl a modulação da IT
possa ser realizada por um circuito, envolvendo mecanismos opioiérgicos e gabaérgicos,
semelhante ao proposto para a modulação das respostas antinociceptivas (Basbaum e
Fields, 1984). Assim, é possível que para modulação da resposta de IT em cobaias exista
uma via com origem na SCP paralela à via descendente nociceptiva, porém responsável
pela modulação de neurônios localizados no corno ventral da medula espinhal, recrutados
Discussão_________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
44
pelo reflexo de endireitamento, o qual está inibido durante a resposta de IT (Ratner, 1967;
Klemm e cols., 1997).
Dando suporte a esta hipótese, estudos anatômicos de Mouton e Holstege (1994)
evidenciam uma via de projeção direta da SCPvl para neurônios localizados no corno
ventral da medula espinhal de gatos. Em adição, é possível que as demais subdivisões da
SCP enviem projeções indiretas para o corno ventral da medula espinhal, via estação
sináptica em núcleos da rafe, principalmente no núcleo caudal da rafe (Hermann e cols.,
1997). Considerando as projeções descendentes da SCP, trabalhos demonstraram que há
conexões recíprocas entre o núcleo mediano da rafe e a SCPvl, sendo que foi demonstrado
a participação do núcleo mediano da rafe no condicionamento contextual (Avanzi e
Brandão, 2001).
Outra possibilidade do envolvimento da SCP na modulação da IT pode se dar não
apenas por meio de eferências descendentes, porém por meio de projeções ascendentes
recíprocas com áreas envolvidas também com a modulação dos comportamento de defesa.
Considerando esta possibilidade, dados anatômicos descrevem que a SCP pode receber
projeções corticais, via tálamo, especificamente de áreas que recebem, por sua vez,
projeções do sistema defensivo hipotalâmico (Canteras e cols., 1995; Risold e Swanson,
1997). Este sistema hipotalâmico de defesa recebe aferências hipocampais (Risold e
Swanson, 1997) e do núcleo medial da amígdala (Canteras e cols., 1995) que provem
informações olfatórias as quais podem estar relacionadas com a resposta defensiva. Em
adição, é possível que durante o confronto entre presa e predador o acionamento da SCP
ocorra por meio de uma projeção do colículo superior e núcleo cuneifome, estruturas que
seriam responsáveis pelo processamento visual dos estímulos ameaçadores (Redgrave e
Dean, 1991, Brandão e cols., 2003; Macedo e cols., 2006). Vale acrescentar que a SCP
possui conexões recíprocas com diferentes núcleos amigdalóides (Rizvi e cols., 1991;
Paredes e cols., 2000). Em particular, tem sido demonstrado que a participação do núcleo
Discussão_________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
45
central da amígdala na modulação da resposta defensiva de IT é dependente de uma
conexão anatômica e funcional com áreas da SCPvl (Leite-Panissi e cols., 2003). Juntos,
estes achados corroboram a intensa IR-FOS, nas diferentes sub-regiões da SCP e em
especial a coluna ventrolateral, mostrando que a estrutura é recrutada por meio de
diferentes vias anatômicas com a finalidade de modular adequadamente as respostas de
defesa do animal, as quais são essenciais à sobrevivência do mesmo.
Ainda, demonstrando o envolvimento da SCP nas respostas defensivas, trabalho
realizado com ratos que foram submetidos à exposição ao gato, uma situação sugerida
como responsável por desencadear medo inato mostra que ocorreu aumento na IR-FOS
(Canteras e Goto, 1999), bem como nos níveis de nNOS/cGMP (Chiavegatto e cols., 1998)
em todas as colunas funcionais da SCP, porém com maior aumento na região dorsal da
SCP, nos níveis mais rostrais e nas colunas lateral e ventrolateral da SCP mais
caudalmente (Comoli e cols., 2003). Ainda, a exposição ao odor deste predador
(Dielenberg e cols., 2001), induziu marcação semelhante, ou seja, mais rostralmente e
áreas dorsais da SCP e na subdivisão ventrolateral da SCP em nível mais caudal. Em nosso
caso, podemos observar também ativação de todas as colunas funcionais da SCP avaliadas,
no entanto, maior marcação foi observada na coluna ventrolateral, bem como na coluna
lateral no nível mais caudal, de maneira similar ao encontrado por Comoli e cols. (2003)
após a exposição ao predador. É possível enfatizar a possibilidade de que no caso da
resposta de IT a coluna ventrolateral da SCP seja recrutada mais intensamente do que as
demais colunas. Em vista do exposto, podemos aventar a possibilidade de que esta
diferença com relação ao maior recrutamento de colunas distintas da SCP possa estar
relacionada com o tipo de comportamento defensivo emitido pela presa em cada situação.
Embora o congelamento, bem como a resposta de IT, possam ser considerados
comportamentos caracterizados por inibição motora, a situação que desencadeia cada uma
das respostas é distinta. No congelamento a finalidade é passar desapercebido pelo
Discussão_________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
46
predador, não há perda do reflexo de endireitamento, e é reportado por vez analgesia não
opióide, características da ativação mais proeminente da região dorsal da SCP. No caso da
IT, o confronto presa/predador já ocorreu, e a analgesia associada é de origem opioidérgica
(Carli e cols., 1984; Leite-Panissi e cols., 2001). Ainda, estudos mostram que lesões na
SCPvl abolem o comportamento de congelamento observado na presença do predador (De
Oca e cols., 1998). Corroborando nossos resultados, tem sido proposto que a SCP
ventrolateral é provavelmente mobilizada sempre que a inibição comportamental possa ser
considerada como uma resposta adaptativa para enfrentar o estímulo estressante (Carrive e
cols., 1997). Por fim, não podemos descartar a possibilidade de que em nosso estudo, como
consideramos apenas três níveis do eixo rostro-caudal do tronco encefálico tenhamos
quantificado níveis diferentes dos quais foram analisadas nos trabalhos de Comoli e cols.
(2003) e Canteras e Goto (1999) e que mostraram intensa IR-FOS após a exposição do
predador nas regiões dorsais da SCP no nível rostral.
Com relação a imunorreatividade encontrada no núcleo dorsal da rafe, temos na
literatura que esta estrutura tem sido correlacionada com a modulação de respostas
nociceptivas (Basbaum e Fields, 1984; Fields, 1991), bem como em situação que envolvem
estresse emocional (Pezzone e cols., 1993; Turek e cols., 2005), tal como medo
condicinado (Carrive e cols., 1997; Avanzi e Bandão, 2001; Borelli e cols., 2005). Desta
maneira, trabalhos têm demonstrado que o estresse de contenção física (Turek e cols.,
2005) bem como estímulos incondicionados, tal como o choque elétrico nos membros
(Pezzone e cols., 1993), induz marcação imunocitoquímica para proteína FOS nesta
estrutura. É interessante notar que o aumento da IR-FOS no NDR também foi encontrado
após a exposição ao predador (Comoli e cols., 2003). Estes achados reforçam a hipótese da
participação do NDR em situação de estresse inescapável, tal como o modelo de IT em
cobaias. Estes dados dão suporte aos nossos resultados que mostra aumento do número de
células IR-FOS nesta estrutura após a resposta de IT, um estímulo de medo inato. É
Discussão_________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
47
possível que esta estrutura participe da modulação desta resposta defensiva por meio de
suas conexões com a SCP (Beitz e cols., 1983). De fato, o NDR possui densas projeções
para a SCPvl, bem com para a SCPdl (Vertes, 1991). Possivelmente as projeções do NDR
para a SCPdl são responsáveis pela modulação de neurônios envolvidos nas respostas
comportamentais de defesa (Lovick, 1994). Além disso, os núcleos da rafe possuem
projeções para a coluna intermédio-lateral da medula espinhal, onde se localizam
neurônios pré-ganglionares simpáticos (Lowry, 2002), mediando assim, a modulação
autonômica necessária aos ajustes fisiológicos para a emissão dos comportamentos
defensivos.
Outra possibilidade do envolvimento do NDR com a modulação de respostas
comportamentais defensivas seria por meio de conexões ascendentes desta estrutura. Desta
maneira, alguns trabalhos têm demonstrado que esta estrutura, juntamente com o núcleo
basolateral da amígdala, está comprometida com alterações comportamentais em situações
de estresse incontrolável e imprevisível, incluindo alteração da resposta de esquiva em
testes de ansiedade (Amat e cols., 2005; Maier e Watkins, 2005). Considerando as
eferências dos núcleos que compõe a região da rafe, achados descrevem que o sistema
serotoninérgico da rafe está topograficamente organizado e envia projeções para diversas
áreas, entre elas para alvos telencefálicos (Imai e cols., 1986; Lowry, 2002; Insel e cols.,
2003; Abrams e cols., 2005). Desta maneira, podemos sugerir que as células IR-FOS
encontradas em nosso trabalho, possivelmente podem se projetar para a amígdala, (Imai e
cols., 1986; Lowry, 2002; Insel e cols., 2003; Abrams e cols., 2005), mais especificamente
para o seu núcleo basolateral. Trabalho recente de Leite-Panissi e cols. (2006) demonstrou
que a estimulação serotoninérgica do núcleo basolateral da amígdala (BLA) promove
redução da resposta de IT em cobaias, sugerindo, portanto que a ativação das eferências
dos núcleos da rafe, ou seja, do NDR, com conseqüente liberação de serotonina no BLA
pode modular a resposta de IT em cobaias. Por outro lado, é possível que os neurônios do
Discussão_________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
48
NDR IR-FOS possam enviar projeções para áreas envolvidas especificamente com
controle motor, e desta maneira ser importante para a emissão da resposta de IT, já que
estamos avaliando um comportamento motor. Dando suporte a esta hipótese, Van der
Kooy e Hattori (1980) mostraram que neurônios individuais do NDR enviam projeções
para o caudado-putamen, bem como para outras estruturas do tronco encefálico, incluindo
a substância nigra responsáveis pelo controle da função motora.
Em adição, analisando outras áreas no tronco encefálico, não descritas como
integrante do sistema encefálico aversivo (Brandão e cols., 1999) observamos que não
ocorreu alteração significativa da expressão da proteína FOS na região do núcleo
oculomotor, 2 horas após a emissão da IT (Figura 8). Estes dados reforçam a hipótese de
que o comportamento de IT em cobaias é capaz de produzir mobilização de sítios
específicos relacionados com a modulação emocional e comportamental e não uma
marcação generalizada e inespecífica.
Neste mesmo nível do eixo rostro-caudal do núcleo oculomotor, podemos observar
moderada marcação da proteína Fos em células localizadas no núcleo Edinger-Westphal
(Figura 8). Esta estrutura atualmente pode ser caracterizada por duas populações de
neurônios: uma delas constituída de neurônios colinérgicos que se projetam para o gânglio
ciliar e está intimamente relacionada com a função oculomotora; e uma segunda população
não-preganglionar que se projeta para varias regiões encefálicas incluindo o septo lateral,
NDR e medula espinhal, e que pode estar envolvida em funções tais como: regulação da
temperatura; consumo de etanol e estresse (Bittencourt e cols., Weninger e cols., 2000;
1999; Cavani e cols., 2003). Em consideração a esta hipótese, McGregor e cols. (2004),
utilizando um modelo de exposição ao odor de gatos em comparação com a administração
i.p. de midazolam (benzodiazepínico), demonstraram que há aumento a IR-FOS no N.EW,
porém, com maior intensidade após o uso do benzodiazepínico. Em apoio a estes achados,
Turek e cols. (2005) mostraram que a administração de etanol em camundongos é capaz de
Discussão_________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
49
promover aumento da expressão de Fos nesta estrutura. Estes dados corroboram os nossos
achados, demonstrando que o N.EW pode ser ativado durante situações que produzem
alterações emocionais de medo e ansiedade.
Em adição, nossos achados podem também embasar as considerações de que o
sistema autonômico é recrutado durante a emissão da resposta de IT (Thompson, 1981;
Hughes, 1982), desde que esta estrutura pode conter neurônios colinérgicos que se
projetam para o gânglio ciliar, inteparte do sistema nervoso autonômico. Desta maneira,
pode-se sugerir que devido à sua função oculomotora autonômica, esta estrutura possa
estar ativada para auxiliar na monitorização do meio ambiente, buscando o momento ideal
para fuga aumentando as suas chances de sobrevivência.
Correlacionando a relevância de nosso estudo dentro da literatura atual, achados
sugerem que a IT é um estado de catatonia temporária, marcada pela presença de profunda
e reversível inibição motora, supressão da vocalização, mudanças na respiração, músculos
contraídos e pupilas dilatadas (Nash, Gallup e Czech, 1976; Gallup e Rager, 1996). Ainda,
a IT tem sido associado com analgesia ou diminuição de responsividade ao estímulo
doloroso (Carli e cols., 1984; Leite-Panissi e cols., 2001). Esses trabalhos sugerem que a
IT é um componente evolutivo adaptativo e inato para a sobrevivência do animal a
situações inescapáveis. Atualmente, alguns trabalhos estão correlacionando a resposta de
IT com o comportamento emitido por pessoas que sofreram abuso sexual na infância
(Heidt e cols., 2005; Fusé e cols, 2006). Situações estas consideradas de grande estresse.
Desta maneira, a investigação do substrato neural ativado durante a emissão deste
comportamento em animais pode dar suporte às tentativas de correlacionar este
comportamento com estados emocionais em humanos, e assim, entendermos os
mecanismos que são acionados durante situações que envolvam medo e ansiedade, e
grande estresse emocional.
Discussão_________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
50
Em resumo, os dados obtidos demonstram que a resposta de IT em cobaias é capaz
de promover a ativação da proteína FOS, um marcador de atividade neuronial em distintas
estruturas do tronco encefálico, dentre elas a SCP, o NDR e o N.EW. Ainda, podemos
sugerir que ocorre a ativação neuronial diferenciada nas distintas colunas funcionais da
SCP após a emissão da resposta defensiva de IT, ou seja, é possível que a SCPvl e a SCPl
possam estar mais envolvidas na modulação deste comportamento inato.
CONCLUSÕES
Conclusão________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
52
A resposta de imobilidade tônica em cobaias é capaz de promover a ativação
da proteína FOS, um marcador de atividade neuronial, na SCP e nos núcleos
dorsal da rafe e Edinger-Westphal, sendo estes dados pioneiros na literatura.
A SCP é um substrato neural que participa na modulação do comportamento
defensivo de IT em cobaias; sendo a região ventrolateral e lateral da SCP no nível
mais caudal as mais ativadas durante este comportamento defensivo.
Os núcleos de Edinger-Westphal e dorsal da rafe; também podem estar
envolvidos e participar na emissão e modulação deste comportamento, desde que
foi evidenciado aumento da IR-FOS nestas estruturas após a emissão da resposta
de IT.
O núcleo oculomotor não deve participar do comportamento de IT, pois não
ocorreu diferença significativa no número de células IR-FOS nesta região após os
animais serem submetidos ao comportamento de IT do grupo controle.
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APÊNDICES
Apêndices_________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
70
SCPdl SCPdm SCPl SCPvl N.III N.EW
1 7,33 9,94 1,78 8,16 5,13 33,40
2 21,19 8,37 8,13 12,96 18,81 10,28
3 3,26 7,85 12,44 18,73 7,69 23,12
4 6,93 12,04 10,16 28,33 33,34 56,52
5 4,89 18,32 6,35 17,29 39,33 61,66
6 15,89 15,70 27,17 6,24 47,02 66,80
7 4,07 13,09 14,73 48,02 20,52 84,78
8 9,37 18,58 19,30 19,21 25,65 84,78
9 21,19 10,47 9,39 21,61 6,84 64,23
10 4,07 2,62 12,70 36,01 20,52 79,64
11 8,56 4,71 3,05 17,77 5,98 12,85
12 4,07 1,57 22,60 27,37 10,26 35,97
13 19,15 9,94 16,50 45,62 17,95 53,95
Média 10,00 10,25 12,64 23,64 19,93 51,38
EPM 1,90 1,50 2,06 3,61 3,72 7,21
Grupo Controle - Nível Rostral
Densidades das Células IR-FOS
Tabela 01: Valores da densidade média da marcação de células IR-FOS/ 0,2mm
2
de cada animal
do grupo controle no nível rostral. Cálculos feitos da área pela quantidade de expressão da
proteína.
SCPdl SCPdm SCPl SCPvl NDR
1 10,37 14,43 12,86 23,54 30,36
2 10,87 5,85 9,80 4,50 7,59
3 26,67 11,31 29,39 32,19 108,80
4 31,61 25,73 17,76 26,65 88,56
5 18,27 12,48 8,88 7,96 32,89
6 4,94 5,46 12,55 17,65 40,49
7 5,93 1,95 5,20 4,15 18,98
8 7,41 3,51 7,04 8,31 22,77
9 17,29 20,67 10,71 18,69 56,93
Média 14,82 11,26 12,69 15,96 45,27
EPM
3,13 2,68 2,41 3,41 11,22
Densidades das Células IR-FOS
Grupo Controle - Nível Intermediário
Tabela 02: Valores da densidade média da marcação de células IR-FOS / 0,2mm
2
de cada animal
do grupo controle, no nível intermediário. Cálculos feitos da área pela quantidade de expressão da
proteína.
Apêndices_________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
71
SCPdm SCPl SCPvl NDR
1 16,71 20,50 24,68 89,28
2 13,27 13,84 11,11 84,50
3 2,46 26,14 18,20 44,64
4 2,46 12,81 4,63 17,54
5 3,44 17,94 20,67 17,54
6 25,56 23,06 28,70 51,02
Média 10,65 19,05 18,00 50,75
EPM 3,88 2,13 3,62 12,74
Densidades das Células IR-FOS
Grupo Controle - Nível Caudal
Tabela 03: Valores da densidade média da marcação de células IR-FOS / 0,2mm
2
de cada animal
do grupo controle, no nível caudal. Cálculos feitos da área pela quantidade de expressão da
proteína.
SCPdl SCPdm SCPl SCPvl N.III N.EW
1 43,59 35,07 31,49 51,38 24,79 92,49
2 63,97 36,90 77,44 178,63 53,86 166,99
3 79,45 66,47 62,46 143,57 57,28 115,61
4 37,48 79,82 50,53 98,92 32,49 164,42
5 38,30 69,35 92,42 162,78 44,46 120,75
6 85,15 58,88 100,04 152,70 35,05 210,67
7 76,19 69,09 105,37 178,15 55,57 287,74
8 95,74 56,27 44,18 97,00 42,75 318,57
9 61,52 64,90 58,91 102,28 47,88 179,84
10 47,26 40,30 27,42 68,19 41,89 100,19
11 92,48 68,31 82,52 160,38 25,65 131,02
12 72,11 70,92 50,28 90,75 28,21 138,73
13 112,86 80,61 52,05 85,47 14,53 149,01
14 48,48 29,83 27,68 125,33 28,21 84,78
Média 68,19 59,05 61,63 121,11 38,04 161,49
EPM
6,28 4,51 7,00 11,15 3,49 18,63
Densidades das Células IR-FOS
Grupo Imobilidade Tônica - Nível Rostral
Tabela 04: Valores da densidade média da marcação de células IR-FOS / 0,2mm
2
do grupo que foi
submetido ao comportamento de imobilidade tônica, no nível rostral. Cálculos feitos da área pela
quantidade de expressão da proteína.
Apêndices_________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
72
SCPdl SCPdm SCPl SCPvl NDR
1 24,69 22,23 30,92 20,77 135,37
2 95,81 72,14 96,43 124,27 145,49
3 90,38 127,89 69,49 116,31 150,56
4 97,79 86,56 97,65 104,88 216,34
5 99,27 98,65 71,02 109,73 164,47
6 74,08 75,64 109,90 73,04 139,17
7 17,78 22,62 41,63 63,69 142,96
8 70,62 63,95 54,18 115,61 149,29
9 54,33 34,31 31,53 57,81 112,60
10 60,25 79,93 77,75 94,85 132,84
11 31,61 52,25 90,61 41,54 99,95
Média 65,15 66,92 70,10 83,86 144,46
EPM 9,08 9,83 8,31 10,40 8,98
Densidades das Células IR-FOS
Grupo Imobilidade Tônica - Nível Intermediário
Tabela 05: Valores da densidade média da marcação de células IR-FOS / 0,2mm
2
de cada animal
do grupo submetido ao comportamento de imobilidade tônica, nível intermediário. Cálculos feitos
da área pela quantidade de expressão da proteína.
SCPdm SCPl SCPvl NDR
1 56,53 90,20 83,93 113,20
2 87,01 78,42 144,10 157,84
3 22,61 51,25 158,60 178,57
4 39,82 86,62 124,04 146,68
5 35,89 87,64 66,03 92,47
6 28,02 93,28 77,14 110,01
7 21,63 68,17 97,20 71,75
Média 41,65 79,37 107,29 124,36
EPM
8,82 5,67 13,39 14,37
Densidades das Células IR-FOS
Grupo Imobilidade Tônica - Nível Caudal
Tabela 06: Valores da densidade média da marcação de células IR-FOS / 0,2mm
2
de cada animal
do grupo submetido ao comportamento de imobilidade tônica, nível caudal. Cálculos feitos da área
pela quantidade de expressão da proteína.
Apêndices_________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
73
SCPdl SCPdm SCPl SCPvl N.III N.EW
1 126,30 140,80 134,57 230,01 59,85 269,76
2 25,67 49,72 86,08 129,17 45,31 267,19
3 84,74 71,71 76,68 131,09 60,70 385,37
4 79,85 89,50 90,39 121,49 47,02 179,84
5 39,52 58,36 58,65 90,27 30,78 113,04
6 46,45 45,28 48,24 87,39 54,72 69,37
7 67,22 60,72 65,76 162,78 49,59 169,56
8 61,52 73,54 73,89 126,29 114,56 123,32
9
59,48
60,19
50,78
140,69
48,73
210,67
10 119,37 48,68 36,06 172,86 63,27 323,71
11 110,82 125,62 132,80 210,32 106,87 333,98
12 188,64 85,06 82,01 160,86 53,01 179,84
Média 84,13 75,77 77,99 146,94 61,20 218,80
EPM 13,17 8,76 8,86 12,45 7,13 28,22
Densidades das Células IR-FOS
Grupo NACl 1,5% - Nível Rostral
Tabela 07: Valores da densidade média da marcação de células IR-FOS / 0,2mm
2
no grupo dos
animais que receberam injeção i.p. de salina hipertônica 1,5%, nível rostral. Cálculos feitos da área
pela quantidade de expressão da proteína.
SCPdl SCPdm SCPl SCPvl NDR
1 158,04 121,26 183,67 154,73 216,34
2 60,25 103,33 124,29 138,11 226,47
3 187,67 174,68 175,10 153,69 203,69
4 75,07 98,26 60,00 128,08 145,49
5 72,11 91,63 84,49 111,46 86,03
6 62,23 85,00 102,55 89,65 264,42
7 60,75 131,40 128,57 138,46 194,84
8 128,41 106,06 68,57 144,34 221,40
9 109,64 114,64 125,20 84,81 175,86
10 72,11 76,03 134,08 85,85 88,56
Média 98,63 110,23 118,65 122,92 182,31
EPM 14,40 8,88 13,00 8,80 18,69
Densidades das Células IR-FOS
Grupo NaCl 1,5% - Nível Intermediário
Tabela 08: Valores da densidade média da marcação de células IR-FOS / 0,2mm
2
no grupo dos
animais que receberam injeção i.p. de salina hipertônica 1,5%, nível intermediário. Cálculos feitos
da área pela quantidade de expressão da proteína.
Apêndices_________________________________________________________________Eveline Bis Vieira
74
SCPdm SCPl SCPvl NDR
1 30,48 209,62 231,42 267,85
2 25,56 152,22 175,57 294,96
3 46,70 169,65 237,28 207,27
4 45,72 111,22 55,85 119,58
5 25,07 216,28 111,08 119,58
6 63,91 167,59 144,10 277,42
7 92,42 202,45 148,73 239,16
Média 47,12 175,58 157,72 217,97
EPM
9,21
14,08
24,35
27,18
Densidades das Células IR-FOS
Grupo NaCl 1,5% - Nível Caudal
Tabela 09: Valores da densidade média da marcação de células IR-FOS / 0,2mm
2
no grupo dos
animais que receberam injeção i.p. de salina hipertônica 1,5%, nível caudal. Cálculos feitos da área
pela quantidade de expressão da proteína.
Animal Tempo (seg.)
1 1200
2 6480
3 5400
4 6420
5 6180
6 4260
7 6120
8 6120
9 6960
10 6180
11 5880
12 6480
13 6300
14 6480
Média
5747,14
Tabela 10: Resultados individuais do total dos episódios de Imobilidade Tônica (em segundos) dos
animais submetidos a este comportamento.
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