Download PDF
ads:
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Psicologia e Educação
Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia
Estudo da participação da matéria cinzenta periaquedutal dorsal no
comportamento defensivo de camundongos através do emprego de diferentes
modelos animais de ansiedade: a estimulação química e a exposição ao predador
Eduardo Ferreira de Carvalho Netto
Tese apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutor em Ciências, área de
Psicobiologia
Ribeirão Preto
-2007-
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Psicologia e Educação
Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia
Estudo da participação da matéria cinzenta periaquedutal dorsal no
comportamento defensivo de camundongos através do emprego de diferentes
modelos animais de ansiedade: a estimulação química e a exposição ao predador
Eduardo Ferreira de Carvalho Netto
Tese apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutor em Ciências, área de
Psicobiologia
Ribeirão Preto
-2007-
ads:
AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE
ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Carvalho Netto, Eduardo Ferrreira
Estudo da participação da matéria cinzenta periaquedutal dorsal no
comportamento defensivo de camundongos através do emprego de
diferentes modelos animais de ansiedade: a estimulação química e a
exposição ao predador
105 p. : il. ; 30cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências
e Letras de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Psicobiologia.
Orientador: Nunes de Souza, Ricardo L.
1. Comportamento de defesa. 2. Matéria cinzenta Periaquedutal.
3.Estimulação Química. 4. MDTB. 5. RET
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Psicologia e Educação
Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia
Estudo da participação da matéria cinzenta periaquedutal dorsal no
comportamento defensivo de camundongos através do emprego de diferentes
modelos animais de ansiedade: a estimulação química e a exposição ao predador
Eduardo Ferreira de Carvalho Netto
Tese apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutor em Ciências, área de
Psicobiologia
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Luiz Nunes de Souza
Ribeirão Preto
-2007-
Dedico este trabalho a Gilberto Kasteckas (in memorian)
“
Algumas pessoas que amamos entram em nossas vidas e partem
rapidamente, mas nós não as perdemos, ganhamos a alegria de conviver e
aprender com elas, mesmo que por pouco tempo.”
(Tatiana Kasteckas)
AGRADECIMENTOS
Ao prof. Dr. Ricardo Luiz Nunes de Souza, que contribuiu de maneira presente e
dedicada para a minha formação científica e pessoal desde o início de minha carreira.
Meus sinceros agradecimentos pela sua importante participação nas minhas conquistas,
nestes anos de pós-graduação, e pela sua amizade.
Aos professores da banca examinadora pela atenção dispensada na leitura desta
tese.
Aos professores Dr. Hélio Zangrossi e Dr. Sílvio Morato pela contribuição
científica para o desenvolvimento e aprimoramento deste trabalho.
Aos professores Dr. Francisco Silveira Guimarães, Dr. Marcus Lira Brandão e Dr.
Silvio Morato de Carvalho, que participaram do exame de qualificação, pela leitura
crítica e sugestões que muito contribuíram para aprimorar este trabalho.
Aos Professores Dr. Robert e Dra. Caroline Blanchard pela colaboração e valiosa
contribuição para o desenvolvimento deste trabalho. Agradeço também pela oportunidade
de estágio de doutorado no exterior.
À professora Dra. Cleopatra da Silva Planeta por sempre estar disposta a
colaborar e pela sua amizade
Aos Professores Dra. Maria do Carmo Longo, Dra. Azair Liane Canto de Souza e
Dr. José Francisco Fracasso pela amizade e ótima convivência durante o período do
desenvolvimento deste trabalho
Às técnicas do laboratório de farmacologia da FCFAr/UNESP, Elisabete Zocal
Paro Lepera e Rosana Finoti Pupin Silva pela colaboração técnica e amizade.
À secretária do PANT, Tirene, pela amizade e pela disposição em ajudar sempre.
À secretária Renata B. Vicentini pela competência profissional na secretaria da
Psicobiologia.
À Inês, Denise e Sônia, pela competência nos serviços prestados na secretaria da
CPG.
Aos funcionários da Biblioteca, do Biotério e da Seção de Transportes da FCFAr
da UNESP, em especial para aqueles da Seção de Apoio, Renato, Gilberto, Chico e Geni,
que sempre atenderam minhas solicitações com boa vontade.
Aos meus pais Lafayette e Iolanda, com admiração e carinho, pelo apoio e
confiança incondicional depositados em mim durante toda minha vida. Meus sinceros
agradecimentos a vocês por estarem do meu lado durante as pequenas e grandes
conquistas e durante as dificuldades enfrentadas nesta fase da minha vida
Aos meus queridos irmãos Ivan, Isnard, José Ricardo e Juliana que sempre me
incentivaram e apoiaram. Obrigado por sempre poder contar com vocês.
À minha namorada Tatiana, que entrou na minha vida e encheu meu coração de
amor, esperança e confiança. Obrigado pela sua compreensão e pelo seu incentivo
incondicional em todos os momentos desta fase.
Aos companheiros do laboratório de farmacologia Joyce, Alianda,
Vanessa, Tarciso, Aline, Débora, Ana Cláudia, Kátia, Karina, Fábio, Marcelo,
Paulo, Egberto, Vander, Camila, Rodrigo, Ana Paula e Roberta pela amizade e
boa convivência durante este período.
Aos Companheiros de república e amigos Gustavo (Pedrega), Tarciso,
João Leopoldo, Lauro (Kibe), Juliana, Rodrigo, Camila, Simone, Jean (Kiwi),
Kelly e Marcos pela amizade e apoio.
A todos os amigos da Psicobiologia, especialmente Karina, Lucas, Carlos
Eduardo, Raquel, Júlia, Sueli, Milena, Milena (lab Sílvio) e Aninha pela receptividade,
amizade e ajuda nos momentos que precisei.
À Faculdade de Ciências Farmacêutica da UNESP de Araraquara pelo espaço
físico laboratorial, equipamentos e materiais fornecidos para realização deste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
apoio financeiro durante todo Doutorado e durante o período de estágio de doutorado no
exterior.
SUMÁRIO
1.RESUMO....................................................................................................................... 1
2.ABSTRACT................................................................................................................... 3
3.INTRODUÇÃO
3.1 Medo e Ansiedade....................................................................................................... 5
3.2 Reações de Defesa....................................................................................................... 6
3.3 Diferenças nos comportamentos defensivos de ratos e camundongos........................ 8
3.4 Substrato Neural.........................................................................................................12
3.4.1 Matéria Cinzenta Periaquedutal...............................................................1 5
3.4.2 Glutamato e Óxido Nítrico.......................................................................1 8
3.4.3 Fator Liberador de Corticotropina (CRF)................................................2 1
3.5 Modelos Animais de Ansiedade/medo......................................................................24
3.5.1 Estimulação química da MCPD................................................................2 5
3.5.2 Bateria de Testes de Defesa para Camundongos......................................27
3.5.3 Teste de Exposição ao Rato......................................................................29
4.OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral............................................................................................................3 1
4.2 Objetivos Específicos.................................................................................................31
5.MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Animais......................................................................................................................3 3
5.2 Equipamentos.............................................................................................................3 3
5.3 Cirurgia e administração de drogas na MCPD..........................................................3 4
5.4 Drogas........................................................................................................................3 5
5.5 procedimentos............................................................................................................3 6
5.5.1 Etapa 1. Estimulação Química
5.5.1.1Experimento 1. Avaliação das respostas comportamentais induzidas pelo
DLH em duas situações diferentes: Arena x MDTB........................................................3 6
5.5.1.2Experimento 2. Procedimento padrão no MDTB...................................3 7
5.5.1.3 Experimento 3. Avaliação da capacidade de reação de camundongos a
estímulos ambientais durante o efeito máximo do DLH (fuga explosiva).......................3 9
5.5.2 Etapa 2. Exposição ao Predador
5.5.2.1 Experimento 4. Efeito do NMDA e NPLA intra-MCPD avaliado no
RET...................................................................................................................................3 9
5.5.2.2 Experimento 5. Efeito do ovineCRF intra-MCPD avaliado no MDTB
e no RET...........................................................................................................................4 1
5.6 Histologia...................................................................................................................4 2
5.7 Análise Estatística......................................................................................................4 2
5.8 Ética...........................................................................................................................4 3
6.RESULTADOS
6.1 Estimulação Química (Etapa 1)
6.1.1Experimento 1. Avaliação das respostas comportamentais induzidas pelo
DLH em duas situações diferentes: Arena x MDTB........................................................4 4
6.1.2Experimento 2. Procedimento padrão no MDTB......................................4 8
6.1.3Experimento3. Avaliação da capacidade de reação de camundongos a
estímulos ambientais durante o efeito máximo do DLH (fuga explosiva).......................5 0
6.2 Exposição ao Predador (Etapa 2)
6.2.1Experimento 4. Efeito do NMDA e NPLA intra-MCPD avaliado no
RET...................................................................................................................................5 2
6.2.2Experimento 5. Efeito do ovineCRF intra-MCPD avaliado no MDTB e no
RET...................................................................................................................................5 9
7.DISCUSSÃO
7.1 Estimulação Química..................................................................................................6 5
7.2 Exposição ao Predador................................................................................................7 2
8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................9 1
9. ANEXOS....................................................................................................................10 5
1.RESUMO
1
O medo e a ansiedade são emoções que apresentam claro valor
adaptativo, e que tem suas origens nas reações de defesa que os animais
exibem em resposta a situações de ameaça que podem comprometer sua
integridade física ou sobrevivência. Recentes estudos têm indicado que a
matéria cinzenta periaquedutal dorsal (MCPD) está envolvida na organização
e expressão de comportamentos intempestivos do tipo fuga e luta, os quais são
relacionados ao estado de medo, e também participa, juntamente com
estruturas prosencefálicas (ex. córtex pré-frontal, sistema septo-hipocampal e
amígdala), do controle de comportamentos defensivos mais elaborados e
orientados relacionados à ansiedade. O presente estudo investigou a
participação da MCPD na modulação de diferentes comportamentos
defensivos (p. ex. fuga, esquiva e avaliação de risco) induzidos por métodos
artificial (estimulação química) e naturalístico (exposição ao predador) em
camundongos. Na primeira etapa, investigamos o padrão de resposta
comportamental induzida pela infusão do ácido D,L-homocistéico (DLH,
estímulo aversivo químico) na MCPD em diferentes situações ou ambientes,
com e sem grande disponibilidade de espaço - o Mouse Defense Test Battery
(MDTB) e a Arena (Experimento 1), respectivamente. Além disso, o presente
estudo avaliou a habilidade dos animais de reagirem a estímulos aversivos
(predador) durante o período inicial (nos 60 s iniciais) do efeito do ácido
DLH (fuga explosiva) (Experimento 3), e imediatamente após esse período,
no qual o animal apresente comportamento de congelamento ou imobilidade
(Experimento 2). Nossos resultados indicaram que a fuga desencadeada pela
estimulação química é a resposta predominante de camundongos e que sua
exibição depende da disponibilidade de espaço, uma vez que a maioria dos
saltos observados na arena está intimamente relacionada ao contato tátil do
animal com as paredes do aparato. Esse perfil de respostas de fuga explosiva
e saltos parece não representar o padrão comportamental defensivo natural, tal
como acontece diante de uma ameaça proximal (ex. um predador), uma vez
que durante a estimulação química os camundongos apresentaram um déficit
na estratégia antipredador. A segunda etapa do estudo avaliou os efeitos da
injeção intra-MCPD do agonista glutamatérgico ácido N-metil-D-aspártico
(NMDA), do inibidor da enzima de síntese do óxido nítrico neuronial (NOSn),
2
Nω-propil-L-arginina (NPLA) (Experimento 4), e do agonista não seletivo de
receptores do fator de liberação de corticotrofina (CRF), CRF ovino (oCRF)
(Experimento 5), no comportamento defensivo de camundongos submetidos
ao MDTB e ao teste de exposição ao rato (Rat Exposure Test; RET). Os
resultados da segunda etapa demonstraram que a ativação de receptores
NMDA na MCPD de camundongos intensifica comportamentos relacionados à
esquiva do predador. De maneira interessante, essas alterações produzidas
pelo NMDA foram consistentemente revertidas pelo inibidor da NOSn,
previamente microinjetado no mesmo sítio. Além disso, efeitos intrínsecos do
NPLA atenuaram as respostas de esquiva e de avaliação de risco em
camundongos submetidos ao RET. Por fim, os resultados da segunda etapa
também apontaram para um efeito proaversivo (nas respostas de salto e de
esquiva) do agonista de receptores CRF, indicando uma participação dos
sistemas glutamatérgico, nitrérgico e CRFérgico, localizados na MCPD, na
modulação de diferentes estratégias defensivas (ex. esquiva, avaliação de
risco e saltos) de camundongos submetidos ao confronto com o predador. Em
conjunto, nossos resultados corroboram a hipótese de que a MPCD está
envolvida tanto na organização e expressão de comportamentos intempestivos
do tipo fuga e luta como também no controle de comportamentos defensivos
mais elaborados e orientados, tais como a avaliação de risco e a esquiva.
2. ABSTRACT
3
The midbrain dorsal periaqueductal grey (DPAG) is part of the brain
defensive system involved in active defense reactions to threatening stimuli.
Many lines of evidence suggest that besides fundamentally controlling fear-
like responses (fight and flight) the DPAG also controls responses related to
anxiety, such as avoidance and risk assessment. This study investigated the
role of DPAG on different defensive strategies (i.e. flight, avoidance and risk
assessment) elicited by artificial (chemical stimulation, Experiments 1-3) and
naturalistic (exposure to predator, Experiments 4 and 5) paradigms in mice.
Firstly, D,L-Homocysteic acid (DLH) was infused into the DPAG and
behavioral responses of mice were evaluated in two different situations, a
rectangular novel chamber and a large oval runway, the Mouse Defense Test
Battery (MDTB) apparatus (Exp. 1). We also investigated the ability of mice
to react to a threatening stimulus (ex. a predator) during (Exp. 3) and
immediately after (Exp. 2) the hyperactive responses (ex. jumping and
running) induced by DLH injection. Our results indicated that running as
opposed to jumping is the primary response in mice injected with DLH into
the DPAG when the environment enables flight. However, mice did not react
the predator during the flight reaction induced by chemical stimulation,
suggesting the behavioral profile induced by DLH infusion into the DPAG is
not related to a normal antipredator flight. In the Experiments 4 and 5, we
evaluated the effects of three different compounds, N-methyl-D-Aspartate
(NMDA), a NMDA receptor agonist, Nω-propyl-L-arginine (NPLA), an
neuronal nitric oxide synthase (nNOS) inhibitor as well as ovine CRF (oCRF),
a nonspecific corticotropin-releasing factor (CRF) receptor agonist, injected
into the DPAG of mice, in two predator-stress situations, the Mouse Defense
Test Battery (MDTB), and the Rat Exposure Test (RET). Firstly, our results
demonstrated that NMDA receptor activation into the mouse DPAG enhances
antipredator reactivity (avoidance), an effect that was attenuated by prior
infusion of NPLA into the same site. Moreover, the results from the
Experiment 4 indicated that the NPLA treatment per se induces consistent
anti-aversive effects on defensive behaviors (avoidance and risk assessment)
of mice confronted by predator. Finally, our results pointed out a proaversive
effect (e.g. increased jump escapes and avoidance behaviors) following intra-
DPAG infusion of oCRF, suggesting an important role of glutamatergic,
4
nitrergic and CRFergic systems into the DPAG on the defensive behaviors
(risk assessment, avoidance and jumps) elicited by the confront to the
predator. Taken together, present results are compatible with previous studies
which have emphasized the role of the periaqueductal gray in the modulation
of behavioral responses related to anxiety such as risk assessment and
avoidance besides fundamentally controlling fear-like responses.
3. INTRODUÇÃO
5
3.1 Medo e Ansiedade
O medo e a ansiedade são estados emocionais correlacionados,
qualificados subjetivamente como não prazerosos e desagradáveis
acompanhados por sentimentos de apreensão e insegurança e um conjunto de
alterações comportamentais e psicofisiológicas. Lader (1981) atribui como causa
principal da ansiedade, a expectativa de um perigo iminente e indefinido, porém sem
que uma ameaça real seja identificada ou, quando existente, é considerada pelos
demais como desproporcional à intensidade da emoção. Graeff (1990) cita como uma
das raízes principais da ansiedade o sentimento de medo, por ser encontrado
praticamente em todas as espécies e que tem como função sinalizar e preparar o
organismo para situações de ameaça ou perigo. A diferença entre os dois estados
emocionais pode ser caracterizada em relação aos estímulos e/ou situações que os
desencadeiam, de forma que o medo surgiria diante de situações claras e evidentes de
ameaça e perigo, enquanto a ansiedade seria desencadeada por situações onde o
perigo é apenas potencial, vago e incerto (Blanchard et al., 1990).
Contudo, quando nos referimos à ansiedade e ao medo, podemos também
considerá-los como estados emocionais essenciais dentro do repertório afetivo
humano, uma vez que até determinado grau estas emoções podem favorecer o
desempenho em tarefas de natureza motora e cognitiva. Dentro deste contexto, esses
processos emocionais são vistos como fenômenos que apresentam claro valor
adaptativo. Todavia, quando essas emoções superam níveis considerados de
normalidade, interferindo com o cotidiano do indivíduo, passam a ser consideradas
patologias do sistema de defesa humano. Portanto, numa perspectiva evolutiva, a
investigação do comportamento defensivo em vários mamíferos (como os roedores) é
de crucial importância para a compreensão dos mecanismos neurobiológicos
6
subjacentes aos estados de medo e ansiedade (Gray & McNaughton, 2000; Blanchard
et al., 2001; Graeff & Zangrossi, 2002).
3.2 Reações de Defesa
O estudo do comportamento em várias espécies de animais tem servido de
base para compreensão de algumas emoções humanas. A correlação das emoções
humanas com as respostas comportamentais emitidas pelos animais tem sido feita
com base na proposta evolutiva de Charles Darwin, publicada originalmente em 1872
em seu livro The expression of Emotions in Man and Animals. Segundo Darwin
(1872 apud Graeff, 1990; Panksepp, 1990; Graeff & Zangrossi, 2002), o homem
tendo os animais como seus ancestrais, compartilha com eles não só características
físicas, mas também suas emoções básicas. De acordo com esta perspectiva, o medo e
ansiedade são emoções que apresentam claro valor adaptativo, e que tem suas origens
nas reações de defesa que os animais exibem em resposta a situações de ameaça que
podem comprometer sua integridade física ou sobrevivência.
São várias as fontes de perigo, dentre elas, confrontos com o predador ou com
animais da mesma espécie em competições, estímulos ambientais tais como altura,
iluminação, estímulos dolorosos e ambientes ou objetos desconhecidos. Embora o
comportamento de defesa e a natureza dos sinais de ameaça variem com a espécie ou
gênero, os animais geralmente utilizam uma de quatro estratégias defensivas
comportamentais básicas, conhecidas por fuga, congelamento, ataque defensivo e
submissão (Adams, 1979; Blanchard & Blanchard, 1988). A decisão por uma
particular estratégia leva em conta vários fatores, como as características do ambiente
(rota de fuga ou não), distância do estímulo ameaçador e experiência prévia com o
estímulo ou ambiente.
7
Partindo dessa premissa, Robert e Caroline Blanchard, estudando as respostas
defensivas comportamentais de roedores (ratos e camundongos) em confronto com
predadores (Blanchard & Blanchard, 1988; Blanchard et al., 1997), classificaram o
tipo de estratégia defensiva adotada de acordo com o nível de ameaça, a saber:
potencial ou incerta, distal e proximal. No primeiro nível, as estratégias observadas
são comportamentos exploratórios cautelosos e hesitantes, usando posturas e
movimentos do corpo que possibilitam a aproximação e a investigação da possível
ameaça, denominados de comportamentos de avaliação de risco. O segundo nível de
defesa (distal) está associado aos comportamentos de fuga e congelamento, onde o
animal tenta escapar da situação de confronto com o predador, caso exista uma rota de
saída no ambiente, ou permanece imóvel, no chamado estado de congelamento, caso a
fuga não seja viável e/ou o predador mantenha ainda certa distância. Finalmente, no
caso em que o predador está muito próximo ou em contato direto com o animal, os
comportamentos observados são tentativas descontroladas e não direcionadas de fuga
ou luta defensiva (postura de ameaça e mordidas no predador).
Na tentativa de diferenciar os comportamentos relacionados com ansiedade e
medo, esses pesquisadores sugerem que quando o estímulo ou a situação ameaçadora
é real, como a presença do predador, os comportamentos desencadeados (fuga e luta)
seriam representativos de medo, enquanto os representativos de ansiedade (avaliação
de risco) seriam desencadeados por estímulos ou situações apenas potencialmente
ameaçadoras como o odor do predador (Blanchard et al., 1993). A essa análise
etoexperimental, Gray e McNaughton (2000) adicionaram componentes da teoria da
aprendizagem, incluindo estímulos condicionados que sinalizam punição ou perda de
recompensa (frustração) como eliciadores de ansiedade. Esses autores também
realçam a importância da existência do conflito esquiva-aproximação e da direção da
8
resposta para a distinção entre medo e ansiedade. Assim, quando a situação permite
aproximação ao estímulo aversivo, caracterizando um conflito entre aproximação e
evitação, os comportamentos observados (inibição comportamental e avaliação de
risco) estariam relacionados à ansiedade. Por outro lado, quando a situação oferece
somente as estratégias de defesa do tipo esquiva ativa e fuga, os comportamentos
estariam relacionados com o medo. Ainda, esses autores ressaltam a importância dos
efeitos farmacológicos na diferenciação do medo e da ansiedade, ou seja,
comportamentos relacionados ao estado de medo, tais como fuga e luta, são
insensíveis a compostos ansiolíticos clinicamente testados, enquanto aqueles
relacionados à ansiedade (comportamentos de avaliação risco) são sensíveis a essas
drogas (para uma revisão ver Gray & McNaughton, 2000).
3.3 Diferenças nos comportamentos defensivos de ratos e camundongos
A investigação do comportamento defensivo em vários mamíferos
(principalmente em roedores de laboratório: ratos e camundongos) tem contribuído de
forma significativa para o entendimento das bases neurais relacionadas aos estados
emocionais de medo e ansiedade (Marks, 1987; Blanchard & Blanchard, 1988). As
estratégias defensivas utilizadas por esses roedores em diferentes níveis de ameaça
têm sido relacionadas a diferentes estados emocionais (Gray & McNaughton, 2000;
Graeff & Zangrossi, 2002). De fato, tomando como exemplo, evidências
experimentais oriundas de estudos comportamentais e farmacológicos em roedores
têm sugerido que a resposta de avaliação de risco que esses animais apresentam frente
a uma ameaça potencial e a resposta de fuga que exibem diante de um perigo
proximal podem estar relacionadas ao transtorno de ansiedade generalizada (TAG) e
9
ao transtorno de pânico (TP), respectivamente (para uma revisão ver Gray &
McNaughton, 2000; Graeff & Zangrossi, 2002; Blanchard et al., 2003).
As reações de defesa em ratos e camundongos são avaliadas em situações
laboratoriais controladas, nas quais os roedores podem ser submetidos ao confronto
com um predador natural, exposição a espaços abertos e altura ou confronto direto
co-específico. Embora os padrões de respostas defensivas de ratos e camundongos de
laboratório sejam bastante semelhantes, algumas diferenças comparativas nas
estratégias defensivas entre essas espécies são encontradas (para uma revisão ver
Blanchard et al., 2001; Carvalho-Netto & Nunes-de-Souza, 2004a). Exemplificando,
diante do confronto com o predador, ratos e camundongos de laboratório
demonstraram diferenças relevantes nas respostas defensivas (Blanchard et al., 1997;
1998; 2001). Uma das principais diferenças é o comportamento de avaliação de risco
(orientação e aproximação frente à ameaça), o qual é muito mais freqüentemente
observado em camundongos do que em ratos. De acordo com Blanchard e
colaboradores (1995; 1998; 2001), esse comportamento é usualmente exibido por
camundongos, inclusive em situações altamente ameaçadoras, como na presença
proximal do predador (gato ou rato) ou até mesmo quando perseguido por ele. Tal
comportamento não é tão freqüentemente observado em ratos, sendo mais comum
nessas situações à exibição do comportamento de congelamento. Diante dessas
evidências, em que camundongos apresentam níveis expressivos de exibição do
comportamento de avaliação de risco, o qual tem sido implicado nos processos
ansiosos (Gray & McNaughton, 2000; Blanchard et al., 2001), a escolha pelo uso
dessa espécie pode ser de elevada importância em investigações sobre neurobiologia
da ansiedade.
10
Blanchard e colaboradores argumentam que uma provável explicação para
essas diferenças comportamentais estaria relacionada aos processos de domesticação
dessas espécies (ver discussão em Blanchard et al., 1997; 1998; 2001). Talvez a
maneira de agir do bioterista ou experimentador frente às repostas de defesa dos
roedores possa ter interferido diferentemente no processo de seleção e domesticação
dessas espécies. Por exemplo, devido ao seu reduzido tamanho (em média 10 vezes
menor que o rato), o camundongo é facilmente manipulado pela cauda, o que dificulta
os ataques defensivos (mordidas) por parte desse animal na mão do manipulador.
Além disso, parece certo que esses ataques (mordidas), quando executados com
sucesso por camundongos, causam menor grau de ferimentos no manipulador do que
aqueles de ratos. Assim, por provocarem menor dano e serem de baixa freqüência, as
mordidas do camundongo tornam-se mais bem toleradas pelo manipulador do que
aquelas exibidas por ratos, que por essa razão, na maioria das vezes, são sacrificados
(Blanchard et al., 1997; 1998; 2001). Em outras palavras, ratos que exibem com
menor intensidade e menos freqüência comportamentos defensivos (ratos dóceis)
apresentam maior probabilidade de serem selecionados artificialmente.
Em apoio a essa hipótese, estudos comparativos do comportamento defensivo
entre linhagens de ratos (Long-Evans) e de camundongos (Swiss-Webster) de
laboratórios e seus ancestrais selvagens indicam que os primeiros sofreram maior
influência da domesticação no comportamento defensivo do que os camundongos
(Blanchard et al., 1986; Blanchard, 1997; Blanchard et al., 1998). Exemplificando,
diante da aproximação do predador, ratos selvagens apresentaram consistentes
comportamentos de defesa tais como fuga (quando a rota de fuga é disponível),
congelamento (se a rota não é disponível) e ataques e ameaças defensivas em
situações nas quais a distância entre predador e o rato é proximal (Blanchard et al.,
11
1986; Blanchard, 1997). No entanto, ratos de laboratório apresentam reduzida
freqüência de comportamento de fuga e quase que ausência total de ataques
defensivos (saltos de ataque em direção ao predador e mordidas), quando expostos a
situações semelhantes. Nessas condições, ratos de laboratório apresentaram intenso
comportamento de congelamento (correspondente a 80% dos comportamentos
observados) ao invés da fuga e ataques defensivos. Diante desses fatos, Blanchard e
colaboradores (1998) sugerem que a escolha de alguns comportamentos defensivos
(principalmente ameaça e ataque defensivos) em ratos de laboratórios seja
inapropriada para o estudo de variáveis que controlam estratégias específicas de
defesa.
Embora os comportamentos defensivos de camundongos de laboratório diante
da aproximação do predador, principalmente a fuga e o congelamento, foram
considerados de menor intensidade que os exibidos por camundongos selvagens, essas
diferenças não foram tão expressivas quanto aquelas observadas em ratos em relação
ao seu ancestral (Blanchard et al., 1998). Além disso, comportamentos de ameaça e
ataque defensivos não foram reduzidos em camundongos de laboratório diante do
contato com o predador (Blanchard et al., 1997; 1998; 2001). De acordo com
Blanchard e colaboradores (2001), diante da aproximação, perseguição e contato com
o predador, o comportamento defensivo de camundongos Swiss é semelhante ao de
ratos selvagens. Diante disso, esses autores sugerem que o processo de domesticação
no laboratório teve menor influência sobre o comportamento defensivo de
camundongos do que sobre o de ratos. Em conjunto, esses dados sugerem ser o
camundongo uma espécie adequada para o estudo tanto de comportamentos
defensivos exibidos diante de ameaça proximal (tais como fuga e luta), relacionados
ao estado de medo, como aqueles frente à ameaça potencial (avaliação de risco),
12
relacionados à ansiedade (para uma revisão ver Blanchard et al., 1997; 2001; 2003).
Portanto, estudando-se o substrato neural de tais comportamentos procura-se
desvendar, pelo menos em parte, as bases neurais relacionadas ao medo e a ansiedade.
3.4 Substrato neural
Grande parte do conhecimento atual das estruturas encefálicas relacionadas às
emoções medo e ansiedade provém dos estudos clássicos da neurofisiologia - ablação,
estimulação elétrica e estimulação química de estruturas encefálicas. Os trabalhos
pioneiros de Hess e seus seguidores (Hess & Brugger, 1943; Fernandez de Molina &
Hunsperger, 1959) demonstraram que a estimulação elétrica de um contínuo formado
pela matéria cinzenta que margeia o terceiro ventrículo, no nível do hipotálamo, e se
estende caudalmente à área que circunda o aqueduto do mesencéfalo (matéria cinzenta
periaquedutal - MCP), desencadeia reações de defesa bem estruturadas em gatos, tais
como de ameaça, luta e fuga, acompanhadas de manifestações neurovegetativas, tais
como midríase, piloereção, hiperventilação e aumento da freqüência cardíaca e da
pressão arterial. Verificaram ainda, que a estimulação da amígdala (AM), estrutura
situada sob o córtex temporal e ligada ao hipotálamo por densas vias nervosas,
produzia reações de defesa afetiva, perdurando após a cessação do estímulo.
Diante dessas evidências experimentais, o pesquisador Frederico Graeff
(1981) propôs que o hipotálamo medial, a amígdala e a MCP, um conjunto de
estruturas longitudinalmente organizadas e reciprocamente interconectadas,
representariam o principal substrato neural para expressão de alterações
comportamentais e neurovegetativas em resposta a estímulos aversivos. Esse conjunto
foi denominado de sistema cerebral aversivo (SCA). Posteriormente, foram propostas
as participações do colículo inferior e de camadas profundas do colículo superior
13
nesse sistema, que atualmente recebe o nome de sistema encefálico aversivo (SEA)
(Graeff, 1990; Brandão et al., 1999).
Recentemente, Canteras e colaboradores (1997), utilizando a técnica de
imunorreatividade para proteína Fos, delinearam a participação de sítios
específicos do hipotálamo medial, o circuito formado pelo núcleo
hipotalâmico anterior (AHN), núcleo ventromedial, parte dorsomedial
(VMHdm) e núcleo pré-mamilar dorsal (PMd), na integração das respostas de
defesa de ratos expostos ao predador natural, o gato. Esse conjunto de núcleos
foi denominado de sistema hipotalâmico de defesa (para uma revisão ver
Canteras, 2002). Os integrantes desse circuito recebem densas projeções de várias
estruturas prosencefálicas (p. ex. sistema septo-hipocampal, amígdala e córtex pré-
frontal) e de algumas localizadas no tronco encefálico (matéria cinzenta periaquedutal
e núcleo cuneiforme) (para uma revisão ver Canteras, 2002).
A participação do sistema septo-hipocampal no comportamento defensivo vem
sendo postulada desde os trabalhos iniciais do psicólogo inglês Jeffrey Gray,
publicados no livro intitulado Neuropsychology of Anxiety (1982). De acordo com
Gray, o sistema septo-hipocampal seria o principal substrato do sistema de inibição
comportamental (SIC). Este sistema responderia a sinais condicionados de punição,
estímulos de perigos inatos ou situações novas e sinais de frustração condicionada
através da inibição de qualquer comportamento que estivesse sendo realizado pelo
animal juntamente com aumento do nível de vigilância e da atenção. Posteriormente,
Gray e McNaughton (2000) publicaram a segunda edição do livro Neuropsychology
of Anxiety, procurando integrar o construto do SIC com o do SCA. Algumas
importantes mudanças conceituais foram incluídas nesta última formulação. Dentre
elas, a função principal do sistema septo-hipocampal passou a ser detectar os conflitos
14
entre tendências de aproximação e afastamento da fonte de perigo. Em outras
palavras, dois sistemas em paralelo seriam ativados, o “sistema cerebral de
aproximação” (representado principalmente pelo estriado ventral e núcleo
accumbens), incentivando a busca de satisfação das necessidades biológicas, como
alimento e sexo, e o sistema cerebral de defesa, gerando tendências de esquiva ou
fuga de fontes de perigo inatas ou aprendidas. Nesse caso, o sistema septo-hipocampal
detectaria ambas as tendências (aproximação e esquiva) e os comportamentos por ele
ativados (inibição comportamental e avaliação de risco) seriam relacionados ao estado
de ansiedade. Por outro lado, quando a fonte de ameaça não induz aproximação e
pode ser evitada, as respostas comportamentais (ex. fuga e esquiva ativa),
expressadas para afastar o animal do estímulo, seriam relacionadas ao estado de
medo.
Recentemente, McNaughton e Corr (2004) revisaram e expandiram os
conceitos da teoria de Gray e McNaughton (2000) incluídos no livro
Neuropsychology of Anxiety. Esses pesquisadores propõem que o conjunto de
estruturas encefálicas envolvidas nos sistemas de defesa que modulam
comportamentos relacionados ao medo, os quais buscam evitar ou afastar o animal da
ameaça (fuga e luta), e a ansiedade, os quais visam à aproximação do estímulo
ameaçador (avaliação de risco), são entidades categoricamente distintas inter e intra-
conectadas. Além disso, baseando-se no conceito de distância defensiva (Blanchard
& Blanchard, 1988; Blanchard et al., 1993), postularam que as estruturas que
comandam as reações de defesa implicadas na ansiedade e no medo estão igualmente
organizadas numa hierarquia funcional (do córtex ao tronco encefálico), atuando de
acordo com a distância em que se encontra a fonte de perigo, de modo que todas as
estruturas envolvidas participam da modulação de todos os comportamentos. Dessa
15
forma, por exemplo, os comportamentos defensivos relativos à ansiedade (ex.
avaliação de risco) seriam organizados e expressados principalmente por estruturas
prosencefálicas (ex. córtex pré-frontal, sistema septo-hipocampal e amígdala). No
entanto, as estruturas anatomicamente mais caudais como a MCP e o hipotálamo
também participariam sutilmente do controle de tais comportamentos. De fato,
estudos demonstram que além de controlar fundamentalmente comportamentos
relacionados ao medo, tais como fuga e luta (Misslin, 2003), a MCP participa da
elaboração e expressão de comportamentos relacionados à ansiedade, tais como
esquiva e avaliação de risco (Carobrez et al., 2001; Bertoglio et al., 2005). Dentro do
contexto do presente estudo, abordaremos o envolvimento da MCP na gênese e
modulação de comportamentos defensivos relacionados ao medo e a ansiedade em
camundongos.
3.4.1 Matéria Cinzenta Periaquedutal (MCP)
A MCP é uma estrutura que circunda o aqueduto mesencefálico (também
conhecido como aqueduto de Sylvius), sendo subdividida anatômica e funcionalmente
ao longo do eixo rostrocaudal em quatro colunas, denominadas, de acordo com a
posição em relação ao aqueduto, em dorsomedial, dorsolateral, lateral e ventrolateral
(Carrive, 1993; Bandler e Shipley, 1994).
A localização neuroanatômica e as abundantes conexões aferentes e eferentes
favorecem a participação da MCP em vários sistemas ascendentes e trajetos
descendentes (Manthy, 1982; Beitz,1990), sendo considerada uma estrutura encefálica
de alta complexidade. De fato, a MCP recebe aferências e envia eferências a
diferentes áreas motoras, sensoriais, autonômicas e límbicas (Beitz, 1990; Bandler et
al., 1991; Canteras & Swanson, 1992; Canteras, 2002; Sewards & Sewards, 2002)
16
(ver figura 1). Tal condição sugere que essa estrutura esteja interligada a um grande
número de circuitos neurais responsáveis pela modulação e coordenação de muitas
funções fundamentais para a sobrevivência do organismo, tais como a modulação de
reações de defesa relacionadas ao medo e ansiedade, processamento de informação
dolorosa, controle motor e cardiovascular (para uma revisão ver Behbehani, 1995),
além da participação na coordenação de comportamentos maternal e predatório
(Sukikara et al., 2006). Estudos mais recentes sugerem que estas funções sejam
integradas diferentemente pelas colunas neuroniais longitudinais da MCP ao longo do
seu eixo rostrocaudal (Bandler & Shipley, 1994; Bandler et al., 2000).
Figura 1. Representação das conexões da matéria cinzenta periaquedutal com outras estruturas do
encéfalo (retirado de Borelli, 2006)
No presente estudo o foco de interesse é o papel da porção dorsal, a MCPD,
que compreende as colunas dorsolateral e dorsomedial, na organização do
comportamento defensivo de camundongos. Inicialmente, a participação da MCP na
elaboração foi proposta com os trabalhos pioneiros de Hess e seus seguidores (Hess &
Brueger, 1943; Fernandez de Molina & Hunsperger, 1959). Esses pesquisadores
demonstraram que a estimulação elétrica da MCP de gato desencadeia reações de
17
defesa bem estruturadas, tais como de ameaça, luta e fuga, acompanhadas de
manifestações neurovegetativas. Posteriormente, outros pesquisadores (Olds & Olds,
1962; Valenstein, 1965) demonstraram em ratos que a estimulação da região dorsal
(MCPD) produz comportamentos de congelamento e fuga que são semelhantes às
reações de defesa que esses animais apresentam no seu ambiente natural, quando
estão frente a um predador. Na mesma direção, Cazala e Garrigues (1981), através de
estudos baseados em resposta comportamental operante de auto-estimulação de
estruturas encefálicas, demonstraram que a estimulação da MCPD é aversiva também
para camundongos. Recentemente, estudos conduzidos em nosso laboratório (Miguel
& Nunes-de-Souza, 2006) demonstraram que a estimulação química da MCPD de
camundongos elicia comportamentos como corridas, saltos e congelamento que são
semelhantes àqueles relatados anteriormente em ratos (Bandler et al., 1985).
Por outro lado, alguns estudos têm demonstrado que a lesão da MCP em ratos
inibe as reações de defesa induzidas por estímulos ambientais aversivos, tais como o
confronto com predador (Blanchard et al., 1981), ou pela estimulação elétrica do
hipotálamo medial e da amígdala (Blanchard & Blanchard, 1988). Ainda, evidências
importantes referentes ao envolvimento da MCPD com o medo e ansiedade também
foram obtidas a partir de estudos clínicos com pacientes neurocirúrgicos submetidos à
estimulação elétrica dessa região (Nashold et al.,1969). Tal procedimento produziu
nesses pacientes sentimentos de medo intenso, pânico, desconforto bem como de
manifestações de morte iminente associados a alterações autonômicas tais como
aumento da freqüência cardíaca e respiratória, sudorese e piloereção semelhantes aos
ataques de pânico observados na clínica. Diante dessas evidências, a MCPD tem sido
sugerida como uma estrutura chave na modulação e expressão de comportamentos
18
defensivos do tipo fuga e luta relacionados aos ataques de pânico em humanos
(Graeff, 1990; Jenck et al., 1995).
No entanto, McNaughton e Corr (2004), em recente artigo revisando as vias
neurais que comandam as reações de defesa, argumentam que estruturas
anatomicamente mais caudais, como a MCP e o hipotálamo, além de coordenarem e
expressarem comportamentos intempestivos do tipo fuga e luta relacionados ao
estado de medo, também participam, juntamente com estruturas prosencefálicas (ex.
córtex pré-frontal, sistema septo-hipocampal e amígdala), do controle de
comportamentos defensivos mais elaborados e orientados como a esquiva e a
avaliação de risco, os quais têm sido relacionados à ansiedade. Inserido neste
contexto, vários sistemas de neurotransmissores têm sido propostos como
mediadores ou moduladores das respostas comportamentais organizadas e
expressadas pela MCPD, dentre eles, os sistemas serotoninérgico, gabaérgico,
glutamatérgico, nitrérgico e os neuropeptídeos, tais como o fator liberador de
corticotropina (do inglês, Corticotrophin-Releasing Factor - CRF) (para uma
revisão ver Graeff, 1994; Behbehani, 1995; Guimarães et al., 2005).
3.4.2 Glutamato e Óxido Nítrico
O glutamato é o principal transmissor excitatório do sistema nervoso central
de mamíferos (Collingridge & Lester, 1989), atuando em vários tipos de receptores
classificados como ionotrópicos (ex. NMDA e não NMDA) e metabotrópicos (Ozawa
et al., 1998). Experimentos realizados ao longo dos últimos anos têm comprovado o
seu envolvimento com o desenvolvimento neural, plasticidade sináptica, aprendizado,
memória, dano neuronal pós-isquemia ou hipoglicemia, epilepsia e outras doenças
neurodegenerativas, dependência e tolerância a drogas, dor neuropática, ansiedade e
19
depressão (Meldrum, 2000; Ottersen & Storm-Mathisen, 2000
). No entanto, o
presente estudo enfocará a participação dos receptores de glutamato do subtipo
NMDA no medo e na ansiedade, em especial na modulação de respostas defensivas
organizadas pela MCPD e a relação da sua ativação com a síntese do óxido nítrico.
Diversas evidências têm demonstrado que microinjeções de agonistas de
receptores de glutamato (NMDA e Metabotrópicos) na MCPD produzem reações
explosivas de fuga características de reações de defesa proximal (fuga e saltos) tanto
em ratos como em camundongos (Bandler & Carrive, 1988; Molchanov &
Guimarães, 1999; Miguel & Nunes-de-Souza, 2006), enquanto antagonistas de
receptores de NMDA e não NMDA na mesma região atenuam as reações de defesa
em ratos submetidos ao labirinto em cruz elevado (LCE) (Guimarães et al., 1991;
Matheus & Guimarães, 1997). Além disso, em doses baixas, a microinjeção de
glutamato, agonista ou co-agonista NMDA intra-MCPD de ratos intensifica
comportamentos defensivos no LCE, tais como a esquiva dos braços abertos e a
avaliação de risco (Carobrez et al., 2001; Carobrez, 2003). Existem evidências
sugestivas de que a ação proaversiva dos aminoácidos excitatórios (AAEs- sendo o
glutamato o principal) está relacionada a ativação da síntese de óxido nítrico (NO),
possivelmente induzida quando receptores glutamatérgicos, principalmente NMDA
(Garthwaite et al., 1988), embora também os receptores AMPA, cainato e
metabotrópicos (Southam et.al., 1991; Okada, 1992) são ativados.
O NO é um gás altamente reativo e difusível, que atua como um mensageiro
intercelular no sistema nervoso central (Dawason & Synder, 1994). Sendo
considerado um neurotransmissor atípico devido as suas características físico-
químicas (Gally et al., 1990), atravessa facilmente membranas biológicas, não é
armazenado em vesículas, é produzido quando necessário e rapidamente degradado e
20
sua sinalização não está restrita a uma única sinapse, podendo se propagar por
centenas de micrômetros (Wood & Garthwaite, 1994). Dentro do neurônio, o NO é
produzido principalmente pela atividade de uma isoenzima NOS (do inglês Nitric
oxide synthase) denominada de NOS neuronial (NOSn), dentre três isoformas
existentes. Estudos anatômicos têm demonstrado que neurônios produtores de NO,
que contém a NOS, estão amplamente distribuídos em estruturas encefálicas
envolvidas na modulação de comportamentos defensivos de ratos, tais como
hipotálamo, amígdala e MCPD (Vincent & Kimura, 1992). Corroborando esses
achados, Beijamini e Guimarães (2006) demonstraram que a exposição de ratos a um
predador natural, o gato, provoca ativação de neurônios positivos para a NOS em
várias estruturas encefálicas (dentre elas a MCPD), detectada por meio de imuno-
histoquímica para NADPH-diaforase (co-fator indispensável para NOS). No entanto,
essa ativação é reduzida quando os animais são pré-tratados
intracerebroventricularmente com o antagonista de receptor NMDA, ácido 2-amino 7-
fosfoheptanóico (AP-7), fortalecendo assim, a relação de efeito entre glutamato e NO.
De grande interesse para o presente estudo, são os resultados de Leger e
colaboradores (1998), que indicam a presença substancial de corpos celulares que
expressam a isoenzima NOSn na MCPD de camundongos. Em concordância com
esse dado, recente estudo conduzido em nosso laboratório (Miguel & Nunes-de-
Souza, 2006) demonstrou que a microinjeção do inibidor seletivo da NOSn, NPLA
(N-propil-L-arginina), na MCPD de camundongos, atenua comportamentos
defensivos do tipo fuga e saltos induzidos pela infusão do agonista de receptor
NMDA no mesmo sítio. Cabe ressaltar que a administração intra-MCPD de L-NAME
(Nω-nitro-L-arginina-metil-éster) e L-NOARG (Nω-nitro-L-arginina), inibidores não
seletivos da NOS, também atenuam as reações de defesa tanto em ratos (Guimarães et
21
al., 1994; De Oliveira et al., 1997, 2001) como em camundongos (Cabral et al., 2003)
avaliadas no LCE. Além disso, foi observado que microinjeções de doadores de NO
na MCPD, como o cloreto de 3-morfolinosilnomina (SIN-1) e dietilamina do óxido
nítrico (DEA/NO), provocam reações de fuga em ratos (De Oliveira et al., 2000).
Reforçando ainda mais o envolvimento do NO com as ações glutamatérgicas, injeções
de AP-7 e NBQX, antagonistas de receptores glutamatérgicos NMDA e
AMPA/Cainato, respectivamente, inibem a resposta de fuga eliciada pelo SIN-1 na
MCPD de ratos (Moreira et al, 2004).
Em conjunto, as evidências discutidas acima sugerem que o NO está
envolvido na organização e expressão de respostas defensivas via ativação,
principalmente, de receptores NMDA na MCPD, indicando uma possível
participação desses compostos na regulação dos estados emocionais de medo e
ansiedade. É relevante mencionar que o glutamato e o NO parecem estar também
envolvidos na liberação de outros neurotransmissores, como o GABA (ácido gama-
amino-butírico), acetilcolina, serotonina, noradrenalina, dopamina, histamina,
purinas e neuropeptídeos, como o CRF (Cratty & Birkle, 1999; Prast & Philippu,
2001).
3.4.3 Fator Liberador de Corticotropina (CRF)
É crescente o número de evidências experimentais demonstrando o
envolvimento do fator liberador de corticotropina (mais conhecido pela sigla
em inglês CRF) na gênese dos transtornos de medo e ansiedade (Muller &
Wurst, 2004). O CRF, um neuropeptídeo de 41 aminoácidos, tem sido
considerado um componente importante na coordenação das respostas
endócrinas, autonômicas e comportamentais associadas ao estresse e
22
ansiedade (Dunn & Berridge, 1990; Koob et al., 1993; Arborelius et al.,
1999).
No eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA), o CRF controla a secreção
de ACTH (hormônio adrenocorticotrófico) que, por sua vez, induz a secreção
de glicocorticóides do córtex adrenal (Vale et al., 1981; Rivier et al., 2003).
Além das funções neuroendócrinas, o CRF também é amplamente distribuído
no sistema nervoso central (SNC), agindo como neurotransmissor ou
neuromodulador (Sawchenko et al., 1993; De Souza, 1987, 1995). Enquanto
os neurônios que contém CRF endócrino concentram-se no núcleo
paraventricular do hipotálamo, os demais se distribuem difusamente em
regiões límbicas e neocorticais relacionadas com as emoções (Graeff, 1994).
As respostas fisiológicas e comportamentais coordenadas pelo CRF ocorrem
por meio da ativação de dois subtipos de receptores CRF ligados à proteína G,
conhecidos como CRF1 e CRF2, os quais apresentam especificidade farmacológica e
distribuição regional distintas no SNC (Swanson et al., 1983; Koob & Heinrichs,
1999; Van Pett et al., 2000). Os receptores CRF1 são encontrados predominantemente
nas estruturas neocorticais, cerebelares e límbicas, enquanto a expressão do receptor
CRF2 é geralmente localizada nas estruturas subcorticais, sobretudo no septo lateral e
várias áreas hipotalâmicas (Chalmer et al., 1995).
O estudo do papel funcional de neurônios contendo CRF e de subtipos de
receptores CRF na mediação química do medo e ansiedade vem crescendo
significativamente nos últimos anos. Evidências oriundas de estudos anatômicos têm
indicado a presença de neurônios CRF-érgicos e de subtipos dos receptores de CRF
em várias estruturas encefálicas (Swanson et al., 1983; Van Pett et al., 2000)
intimamente relacionadas ao medo e a ansiedade como os núcleos da amígdala,
23
hipocampo, núcleo intersticial da estria terminal, núcleos da rafe e a matéria cinzenta
periaquedutal (Millan, 2002). De fato, diversos experimentos têm demonstrado que a
injeção intracerebroventricular (i.c.v.) de CRF intensifica comportamentos defensivos
em roedores submetidos a situações aversivas em vários modelos animais de
ansiedade (Baldwin et al., 1991; Radulovic et al., 1999; Griebel, 1999; Arborelius et
al., 1999). Além disso, camundongos transgênicos que expressam elevados níveis de
CRF endógenos apresentam perfil comportamental com características ansiogênicas
(Griegel, 1999). Por outro lado, uma série de evidencias têm sido apresentadas
demonstrando efeito ansiolítico na administração i.c.v. ou intraperitoneal de
antagonistas de receptores CRF1 ou CRF2 em vários modelos animais de ansiedade.
Dentre eles, a bateria de testes de defesa em camundongos (Griebel et al., 1998),
labirinto em cruz elevado (Lundkvist et al., 1996, Griebel et al., 1998, Takahashi et
al., 2001), arena (Takahashi et al., 2001) e sobressalto potencializado pelo medo
(Risbrough et al., 2004).
Visando delinear estruturas encefálicas específicas, nas quais o CRF
possa modular o comportamento defensivo, vários estudos utilizando
microinjeções de CRF ou agonistas de receptores de CRF em sítios
específicos têm sido realizados (para uma revisão ver Griebel, 1999). Esses
estudos indicam a participação da neurotransmissão CRF-érgica em várias
estruturas já conhecidamente envolvidas na modulação de respostas de medo e
ansiedade tais como a amígdala, hipotálamo, locus coeruleus e a MCP.
Inserido no contexto do presente estudo, Martins e colaboradores (1997),
usando o modelo do labirinto em cruz elevado (LCE), demonstraram que a
injeção intra-MCPD de CRF elicia alterações comportamentais sugestivas de
efeito ansiogênico, indicando a participação desse neuropeptídeo na
24
modulação das respostas defensivas elaboradas pela MCPD. Esses
pesquisadores reverteram os efeitos ansiogênicos do CRF exógeno através da
microinjeção local do antagonista não seletivo de receptores de CRF, o CRF
9-
41
α-helical, confirmando assim a participação específica de receptores CRF
nos comportamentos defensivos elaborados pela MCPD (Martins et al., 1997).
Muitas evidências até o momento apontam para a participação mais relevante
dos receptores do subtipo CRF1 na mediação dos comportamentos defensivos
(para uma revisão ver Griebel, 1999; Takahashi, 2001). No entanto, na MCP
tanto de ratos como de camundongos, são expressos RNAs mensageiros para
ambos os subtipos de receptores, CRF1 e CRF2 (Van Pett et al., 2000). Nesse
sentido, é importante a realização de estudos adicionais visando um maior
entendimento da participação dos receptores CRF na modulação das respostas
de medo e ansiedade na MCP .
De maneira geral, é importante ressaltar que as respostas comportamentais de
defesa que os animais exibem frente a estímulos ameaçadores e a manipulação
farmacológica, central ou periférica, são as bases dos modelos animais existentes
usados como ferramentas para investigação de novos fármacos e dos mecanismos
neurais subjacentes aos transtornos de ansiedade (ver Blanchard et al., 2001; Graeff &
Zangrossi, 2002).
3.5 Modelos Animais de Ansiedade/Medo
As últimas décadas têm assistido ao crescente interesse pelo desenvolvimento
e utilização de modelos animais visando o entendimento da neurobiologia dos estados
emocionais de medo e ansiedade. As diferentes estratégias comportamentais
defensivas (ex. fuga, esquiva, avaliação de risco e outras) adotadas pelos animais de
25
laboratório (principalmente roedores) diante de condições ou situações aversivas,
proporcionadas por diferentes tipos de modelos animais de ansiedade, têm sido
relacionadas aos estados de medo/ansiedade (Blanchard et al., 2001; Graeff &
Zangrossi, 2002). Assim, estudando-se o substrato neural de tais comportamentos
pode-se desvendar, pelo menos em parte, as bases neurais relacionadas aos
transtornos de medo e ansiedade. Para essa finalidade, os laboratórios de pesquisa têm
utilizado diversos modelos animais de ansiedade em conjunto com procedimentos de
manipulação do sistema nervoso central (SNC), tais como análise da marcação de
proteína Fos, lesão e injeção de drogas em estruturas encefálicas específicas. Como
foco do presente estudo, descreveremos sucintamente o modelo da estimulação
química da MCPD e os modelos etologicamente fundamentados, a Bateria de testes
de defesa para camundongos (do inglês Mouse Defense test Battery -.MDTB) e o
Teste de Exposição ao Rato (do inglês Rat Exposure Test - RET).
3.5.1 Estimulação Química da MCPD
A estimulação elétrica de estruturas encefálicas subcorticais em animais foi o
primeiro procedimento experimental sugerido para o estudo das reações de defesa
relacionadas ao medo e ansiedade (Hess & Brugger, 1943). Essa técnica
amplamente empregada por vários laboratórios atualmente, possui algumas
desvantagens, como a falta de especificidade e seletividade da região estimulada, uma
vez que tanto os corpos neuroniais como fibras de passagem são atingidas pela
corrente elétrica, impossibilitando a determinação exata da localização da população
de neurônios ativados. Nesse sentido, a técnica de estimulação química com
aminoácidos excitatórios mostra-se mais seletiva e específica, visto que apenas os
corpos celulares e seus dendritos (mas não axônios de passagem) são estimulados
26
(Goodchild et al., 1982). De fato, uma série de estudos usando essa técnica (ver
Bandler & Depaulis, 1991) demonstrou a localização da população de neurônios
responsáveis pelas reações de defesa dentro da MCP.
A estimulação química da MCPD tem sido muito utilizada para o estudo das
reações de defesa, principalmente fuga, e vários pesquisadores têm relacionado essa
resposta aos ataques de pânico em humanos (Graeff, 1994; Graeff &Zangrossi, 2002;
Bittencourt et al., 2005). A microinjeção (estimulação química) com aminoácidos
excitatórios, tais como o D,L-homocistéico (DLH) e o L-glutamato, feita na porção
caudal da MCPD, gera respostas comportamentais defensivas do tipo corrida e saltos
característicos de reações de defesa à ameaça proximal (Bandler et al., 1985; Hilton &
Redfern 1986; Beckett et al., 1992). Essas respostas comportamentais, com curto
período de duração (40-60s após a microinjeção do AAE), são quantificadas através
da duração da corrida ou distância percorrida e números de saltos realizados em uma
arena. No entanto, cabe ressaltar que após a resposta de fuga explosiva inicial
(primeiro minuto), os animais apresentam comportamento que pode ser denominado
de congelamento ou imobilidade que pode perdurar por um período mais longo
(Beckett et al., 1990; Carvalho-Netto & Nunes-de-Souza, 2004b; Miguel & Nunes-de-
Souza, 2006). Entretanto, não está claro se essa última resposta é parte do repertório
induzido pelo AAEs ou é uma resposta inespecífica devido ao cansaço ou desgaste
físico que o animal apresenta após o período inicial de fuga explosiva.
Recentemente, investigando as respostas comportamentais em
camundongos induzidas pela estimulação química da MCPD com o ácido
DLH (Carvalho-Netto & Nunes-de-Souza, 2004b), observamos que os animais
exibiam, além de fuga explosiva com vários saltos pouco orientados, muitas
colisões contra as paredes de uma arena (23 cm de diâmetro) onde eram
27
testados. Os pesquisadores Robert e Caroline Blanchard, da Universidade do
Havaí, após minuciosa análise dos nossos resultados, sugeriram que os
comportamentos eliciados pela estimulação química da MCPD em
camundongos poderiam ser, pelo menos em parte, modulados pelo ambiente
no quais os animais eram testados. Esta hipótese foi investigada no presente
estudo, que teve a colaboração desses pesquisadores. Assim, investigamos as
respostas comportamentais induzidas pela microinjeção intra-MCPD de DLH
em diferentes situações ou ambientes - um com grande disponibilidade de
espaço (o MDTB) e o outro não (como uma arena). Além disso, com base nas
evidências discutidas acima, que sugerem ser a estimulação da MCPD eliciadora de
respostas defensivas semelhantes às reações induzidas por estímulos aversivos
naturais (como o confronto com predador), o presente estudo também avaliou a
habilidade dos animais de reagirem a estímulos aversivos (predador) durante o
período inicial (nos 60s iniciais) do efeito do ácido DLH (fuga explosiva), e
imediatamente após esse período, no qual o animal se mostra quiescente ou imóvel.
3.5.2 Bateria de Testes de Defesa para Camundongos (MDTB)
O comportamento defensivo observado durante o encontro de roedores com o
seu predador natural tem sido amplamente descrito e estudado pelos pesquisadores
Robert e Caroline Blanchard e colaboradores. As características do ambiente no qual
ocorre a exposição e a distância na qual se encontra o predador são determinantes para
a escolha de estratégias comportamentais. Acredita-se que o emprego de estímulos
naturais permite maior confiabilidade na evocação de estados emocionais e
comportamentos defensivos de uma determinada espécie.
28
Nesse sentido, o MDTB é um modelo animal proposto para avaliar diferentes
estratégias comportamentais (ex. esquiva, fuga, congelamento, ameaça e ataque
defensivo) em camundongos diante do confronto direto com o predador (rato). É
importante mencionar que várias evidências da literatura confirmam a condição do
rato como predador natural do camundongo (Rylov, 1985; De Catanzaro, 1988;
Nikulina, 1991; Wuensch, 1992). O procedimento experimental do MDTB é
conduzido numa grande pista oval (4,8 m) e é composto de seguidas etapas
controladas pelo experimentador (segurando um rato anestesiado), que primeiro
aproxima, depois persegue e por fim realiza o contato do predador com a presa.
Vários estudos de validação comportamental, conduzidos com objetivo de delinear
em detalhe os comportamentos defensivos exibidos por camundongos diante do
confronto com o predador (para uma revisão ver Blanchard et al., 2001)
demonstraram consistentes respostas de esquiva e fuga do predador, bem como
vocalização, ameaça e ataques defensivos durante o contato com o rato.
Estudos farmacológicos enfatizam que o MDTB apresenta alta validade de
predição para o estudo das reações de defesa relacionadas com medo/ansiedade,
especificamente ao pânico, pois o tratamento crônico com compostos clinicamente
considerados panicolíticos, como o benzodiazepínico de alta potência alprazolam, e os
antidepressivos imipramina e fluoxetina, reduzem o índice de fuga no modelo. Cabe
ressaltar também, que tanto o alprazolam como esses antidepressivos não exibem
efeitos ou apresentam efeitos aversivos no modelo, respectivamente, quando
administrados agudamente. Por outro lado, compostos considerados panicogênicos
(ver Blanchard et al., 2001; 2003), como a ioimbina, a cocaína e o flumazenil
exacerbam a resposta de fuga de camundongos no modelo, reforçando as analogias do
teste e o TP.
29
Diante dessas evidências, o MDTB é sugerido como um modelo para o estudo
dos mecanismos neurais que comandam as respostas comportamentais frente à
ameaça proximal (fuga e luta) relacionadas às patologias do sistema de defesa humana
como o TP. O modelo também pode ser útil para a investigação e screening de novos
compostos farmacológicos usados para o alívio do transtorno do pânico (Blanchard et
al., 2003). Por essa razão, utilizamos o MDTB, um modelo etologicamente
fundamentado, e algumas ferramentas farmacológicas para investigarmos a
participação da MCPD nessas reações de defesa proximais induzidas pelo confronto
com o predador.
3.5.3 Teste de Exposição ao Rato (RET)
O RET é um novo modelo animal desenvolvido no laboratório de Robert e
Caroline Blanchard, que também visa investigar a interação presa-predador. No
entanto, diferente do MDTB, o modelo permite que a presa (ex. camundongo) escolha
aproximar-se ou afastar-se do predador (ex. rato) (Yang et al., 2004). O RET é
constituído de dois compartimentos interligados por um túnel. O primeiro
compartimento é dividido em duas partes, uma onde se encontra o predador isolado
por uma tela de arame, e outra, chamada de superfície, que permite a aproximação da
presa ao compartimento do predador. O outro compartimento, uma pequena caixa,
está separado da superfície através de um túnel e serve como abrigo (toca) para o
camundongo durante o período de exposição ao rato. O modelo em questão possibilita
a expressão de diferentes comportamentos defensivos, tais como, esquiva, avaliação
de risco, congelamento, comportamento de ocultação defensiva (caracterizado pelo
comportamento do camundongo em colocar maravalhas sobre a entrada do túnel) e
auto-limpeza. Cabe ressaltar que o modelo do RET se destaca por eliciar marcante
30
resposta de avaliação de risco na presa, sendo essa, uma das principais vantagens
desse modelo em relação a outros, tais como o LCE, o de transição claro-escuro e o
MDTB.
Recentes resultados farmacológicos obtidos com o tratamento sistêmico com
os ansiolíticos clássicos, como o agonista benzodiazepínico, diazepam, e o agonista
serotoninérgico 5HT
1A
, buspirona, sugerem que o modelo apresenta boa
previsibilidade farmacológica para o estudo do transtorno de ansiedade, uma vez que
os comportamentos de avaliação de risco e esquiva do predador foram claramente
reduzidos com o tratamento (Blanchard et al., 2004).
Portanto, devido às características do modelo RET, que possibilita uma
consistente mensuração de comportamentos mais sutis e elaborados, como por
exemplo a esquiva e a avaliação de risco, o presente estudo utilizou o aparato
juntamente com ferramentas farmacológicas para investigar a participação da MCPD
na modulação e expressão desses comportamentos em camundongos.
4.OBJETIVOS
31
4.1 OBJETIVO GERAL
Investigar a participação da MCPD na modulação de diferentes
comportamentos defensivos de camundongos induzidos por métodos artificial
(estimulação química) e naturalístico (exposição ao predador).
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Utilizando a estimulação química como principal estímulo aversivo, a primeira
etapa (Etapa 1) do presente estudo teve como propósitos:
- Investigar o padrão de resposta comportamental induzida pela infusão do ácido DLH
na MCPD de camundongos em duas situações diferentes: uma com maior
disponibilidade de espaço, como o MDTB, e a outra com uma menor disponibilidade,
como uma arena.
- Avaliar as reações de defesa de camundongos em confronto com o predador
imediatamente após a resposta de fuga explosiva induzida pela infusão do DLH intra-
MCPD (período de imobilidade).
- Investigar a habilidade dos animais de reagirem a estímulos ambientais
neutros e aversivos, como o predador, durante o período de fuga explosiva
provocado pela infusão do DLH.
Numa segunda etapa (Etapa 2), empregando estímulos naturais na evocação
de estados emocionais e comportamentos defensivos relacionados à espécie, o
presente estudo teve como propósitos:
- Avaliar os efeitos da injeção intra-MCPD do agonista glutamatérgico
NMDA e do inibidor da síntese da NOS neuronial (NOSn), NPLA, no
comportamento defensivo de camundongos submetidos ao RET.
32
-Avaliar os efeitos da injeção intra-MCPD do agonista não seletivo de receptor de
CRF, ovine CRF, em dois modelos animais de ansiedade baseados na interação presa-
predador: o MDTB e o RET.
5. MATERIAIS E MÉTODOS
33
5.1 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss e Swiss-Webster (30-40 g), machos,
provenientes, respectivamente, do biotério central da Universidade Estadual Paulista –
UNESP e da Universidade do Havaí –UH. Os animais foram mantidos em condições
controladas de temperatura (23 ± 1°C), umidade (55 ± 5%) e luz (ciclo 12/12 horas,
luzes acesas às 07:00 h), com livre acesso ao alimento e a água, exceto durante os
curtos intervalos de testes.
5.2 Equipamentos
Para a avaliação das respostas comportamentais induzidas pela estimulação
química em dois ambientes físicos diferentes foram utilizados uma arena retangular
(28 cm x 24 cm x 35 cm), com assoalho constituído de madeira escura com 3 paredes
de plástico escuro e uma com plástico transparente (através da qual podia ser
gravado o experimento) e o aparelho do MDTB. O MDTB (ver figura 2) é uma pista
oval (0,4 m largura, 0,3 m de altura e 4,8m de comprimento total), constituída de dois
segmentos retos (2 m) unidos por dois segmentos curvados (0,4m), separados por uma
parede mediana removível (2 x 0,3 x 0,6m). O aparelho é elevado a 0,8 m do solo,
possibilitando que o experimentador segure o rato anestesiado confortavelmente e
minimize o campo de visão do camundongo em relação ao experimentador. Todo o
aparelho é constituído de plástico escuro e o assoalho é tracejado (dividido) a cada 20
cm para que as medidas da distância percorrida e velocidade sejam calculadas.
O RET (Yang et al., 2004) é uma caixa de plástico transparente (46 x 24 x 12
cm) dividida em dois compartimentos de igual tamanho por uma tela de arame (ver
figura 2). Um dos compartimentos (superfície) é conectado a uma caixa menor (7 x 7
x 12 cm), feita de plástico escuro exceto uma parede lateral que é feita de plástico
transparente (para facilitar a filmagem), através de um túnel de plástico transparente
34
4,4 cm de diâmetro, 13 cm de comprimento e elevado 1,5 cm em relação ao assoalho
das duas outras caixas. A caixa menor é usada como abrigo (toca) para o camundongo
durante o teste. Todos os experimentos foram gravados através de sistema de circuito
fechado de câmera, DVD e televisão.
Figura 2. Visão geral dos modelos MDTB e RET.
5.3 Cirurgia e administração de drogas na MCPD
Os camundongos receberam implantação craniana de cânula-guia (26-gauge)
de 7 mm de comprimento, após anestesia com tiopental sódico (90 mg/kg, i.p.). A
cânula foi fixada no crânio do animal com cimento acrílico. As coordenadas
estereotáxicas para implantação da cânula-guia foram: 4,16 mm posterior ao bregma,
1,32 mm lateral à linha média, 2,23 mm ventral a superfície craniana, ângulo de 26°,
sendo a ponta da cânula-guia posicionada 1 mm dorsal à estrutura alvo. Tais
coordenadas foram baseadas no atlas de Paxinos e Franklin (2001). Ao final da
cirurgia os animais receberam 0,1 ml de pentabiótico via intramuscular.
MDTB
RET
35
No dia do teste, foi inserida uma agulha de injeção (33-gauge) dentro de cada
cânula-guia para a infusão das soluções na MCPD. Com seu tamanho ultrapassando
em comprimento 1 mm a ponta de cada cânula-guia, a agulha de injeção foi
conectada, por meio de um tubo de polietileno (PE-10), a uma microsseringa
Hamilton de 5,0 µl. Uma bomba de infusão (Insight BI 2000 ou Harvard, 2000) foi
programada para injetar 0,1 µl/10 seg ou 0,1 µl/30seg (ver procedimentos), sendo 0,1
µl o volume total injetado em cada animal. Após a microinjeção, a agulha de injeção
permanecia por mais 30 segundos no interior da cânula guia para certificação do
escoamento da solução, exceto para os experimentos da Etapa1. O movimento de uma
pequena bolha de ar no tubo de polietileno durante as injeções foi usado para
confirmar o fluxo da solução.
5.4 Drogas
Foram utilizados os seguintes compostos: ácido D,L-homocistéico (DLH,
Sigma), na dose de 5 nmol, Ácido N-metil-D-aspártico (NMDA, RBI), agonista de
receptores glutamatérgicos tipo NMDA, nas doses de 0,02 e 0,04 nmol, Nω-propil-L-
arginina (NPLA – Tocris Cookson Inc., Ballwin), um inibidor de NOS altamente
seletivo para NOS neuronial (NOSn) (Ki = 57nM), na dose de 0,4 nmol e o fator
liberador de corticotropina, Ovine (oCRF, Anaspec), nas doses de 30 e 100 ng. DLH,
ovine CRF, NMDA e NPLA foram dissolvidos em soro fisiológico (0,9% NaCl) ou
em líquido encéfalo raquidiano. As doses utilizadas dos compostos descritos acima
foram baseadas em estudos anteriores (Beckett et al., 1992; Stiedl et al., 2005; Miguel
& Nunes-de-Souza, 2006).
36
5.5 Procedimentos
5.5.1 Etapa 1. Estimulação Química
5.5.1.1 Experimento 1. Avaliação das respostas comportamentais induzidas pelo
DLH em duas situações diferentes: Arena x MDTB
Após um período de cinco dias de recuperação da cirurgia, os animais foram
conduzidos até a sala experimental, onde permaneceram por um período de
habituação de 1 hora. Os animais foram separados aleatoriamente em 4 grupos (n= 8-
10): dois grupos foram injetados com 5 nmol de DLH (0,1 µl em 10s) ou salina e, em
seguida, cada animal foi colocado na arena teste. Os outros dois grupos receberam o
mesmo tratamento farmacológico, porém, cada animal foi imediatamente colocado no
aparelho do MDTB. Os comportamentos resultantes foram gravados e observados
durante 1 min. Foram eles:
- Saltos (freqüência): caracterizado por pulos direcionados ou não para a borda
do aparelho, nos quais os camundongos tiravam as quatro patas do solo. Para o
grupo tratado com DLH e submetido à arena teste (onde a maioria dos saltos
aconteceu), os dados foram analisados como percentagem de saltos precedidos
ou não por contato de parte da cabeça do animal com as paredes do aparato.
- Galope (tempo): rápida corrida alternando entre as patas anteriores e
posteriores.
- Trote (tempo): Corrida mantendo o padrão de andar.
- Deambulação (tempo): Locomoção.
- Congelamento (tempo): caracterizado por ausência total de movimento,
exceto o de respiração (enquanto o animal assume uma postura tensa).
- Contato facial (freqüência): o animal toca ou choca-se contra uma das
paredes da arena ou MDTB com o focinho ou outra parte da cabeça.
37
- Contato lateral (freqüência): enquanto corre (galope ou trote), o animal
colide ou toca lateralmente nas paredes da arena ou MDTB com o tronco ou as
vibrissas.
- Levantamento (freqüência): número de vezes que o camundongo
permanece na postura bípede, apoiando-se nas paredes da arena com as patas
dianteiras.
A distância percorrida por cada animal na arena ou MDTB foi medida durante
os primeiros 20 segundos.
5.5.1.2 Experimento 2. Procedimento padrão no MDTB.
Imediatamente após o teste inicial (1 mim no MDTB ou arena), todos os
animais, independentemente do tratamento ou condição teste anterior, foram
submetidos ao teste padrão do MDTB. As tarefas avaliadas no procedimento
tradicional estão descritas abaixo, exceto o pré-teste, que por motivo de duração da
resposta da estimulação química, não foi realizado.
Teste de esquiva do predador: Imediatamente após o camundongo ser colocado no
aparelho, um rato anestesiado seguro pelo experimentador foi introduzido dentro da
pista oval e conduzido em direção ao camundongo numa velocidade média
aproximada de 0,5 m/s. A aproximação foi interrompida quando havia o contato ou
quando o camundongo se esquivava da aproximação do rato. Foram registradas a
distância inicial, na qual o camundongo se esquivava do predador, e a freqüência de
esquivas. O procedimento foi repetido por 5 vezes.
Teste de perseguição e fuga: Nesse procedimento, o rato anestesiado foi conduzido
em direção ao camundongo (15 m de perseguição, ~ 3 voltas no aparato) numa
velocidade aproximadamente de 2 m/s. Foram calculadas as velocidades média e
38
máxima de fuga atingidas durante o segmento reto do aparelho. Além disso, foram
registrados os números de parada (interrupções da fuga) e de inversão da rota de fuga
(camundongo para e corre na direção oposta).
Teste do corredor sem saída: Nesse procedimento, a pista oval foi convertida num
corredor sem saída através do fechamento (com portões removíveis) das junções do
segmento reto do aparelho com os curvados. O experimentador mantinha o rato a
uma distância de 60 cm do camundongo, durante três períodos de 30 segundos. Os
comportamentos registrados foram: tempo de congelamento, freqüências de
aproximações e retiradas (camundongo movia-se em direção ao rato percorrendo uma
distância igual ou superior a 20 cm e então retornava), de contato com o predador (o
animal tocava ou quase tocava o predador) e freqüência de saltos visando escapar
(saltos defensivos-SD) do aparelho.
Teste de Contato Forçado: Finalmente, com o corredor reduzido (40 cm), o
experimentador realizava 5 rápidos contatos do predador (rato) com o camundongo,
sendo registradas as freqüências de: mordidas no rato, vocalização, postura de
levantar defensivo (defensive upright) e saltos defensivos. Esse procedimento
(Contato Forçado) foi repetido por 3 vezes.
Pós-teste: Defesa contextual: Imediatamente após o teste do corredor sem saída, o
predador foi removido e os portões foram retirados deixando o animal livre. Nesse
teste, foram registrados os números de (a) cruzamentos das linhas desenhadas no solo
do aparelho, (b) levantamento e (c) saltos de fuga do contexto (SD).
Todos os experimentos foram gravados através de um circuito interno de
câmera-TV-DVD.
39
5.5.1.3 Experimento 3. Avaliação da capacidade de reação de camundongos a
estímulos ambientais durante o efeito máximo do DLH (fuga explosiva).
Com o objetivo de avaliar a habilidade dos camundongos de reagirem a
estímulos naturalmente ameaçadores ou não para a espécie, ambos os grupos
controles do experimento anterior receberam injeção intra-MCPD com a mesma dose
do ácido DLH 24 horas após o Experimento 2. Em seguida, cada animal foi colocado
no aparelho do MDTB. Durante a resposta de fuga (durava em média 40-60s), o
caminho do animal foi bloqueado uma vez pelo fechamento de uma porta no final da
reta do aparelho e três vezes por um rato anestesiado seguro pelo experimentador.
Para avaliar as tentativas de esquiva dos estímulos ambientais, foi realizada uma
contagem quadro-a-quadro (câmera lenta -1/30 quadros) da gravação da resposta em
DVD. Essa contagem teve início no momento que o animal estava a 60 cm do
estímulo (porta ou rato). Uma vez que o assoalho do MDTB é dividido por linhas
perpendiculares dispostas a cada 20 cm, essa contagem foi realizada em três blocos
de 20 cm. O procedimento visou avaliar se o animal seria capaz de diminuir sua
velocidade para evitar o choque ou contato com a porta ou com o predador.
5.5.2 Etapa 2. Exposição ao Predador
5.5.2.1 Experimento 4. Efeito do NMDA e NPLA intra-MCPD avaliado no RET.
Como descrito acima, os animais passaram pelo mesmo procedimento de
recuperação pós-cirúrgica. Posteriormente, cada camundongo foi individualmente
submetido ao procedimento de habituação ao aparelho do RET.
Fase 1. Habituação: Cada camundongo foi colocado na superfície central da
caixa de exposição por um período de 10 min de livre exploração sem a presença do
rato. A maravalha da caixa moradia de cada animal era colocada nos compartimentos
40
superfície e toca para facilitar a habituação. Esse procedimento foi repetido por 3 dias
consecutivos.
No quarto dia (dia do teste) os animais foram alocados em 6 grupos e
submetidos ao procedimento de microinjeção intra-MCPD de salina ou NPLA (0,4
nmol/0,1 µl em 30 segundos) e, após 10 minutos, receberam outra injeção local de
salina ou NMDA (0,02 nmol ou 0,04 nmol/0,1 µl em 30 s). Novamente, dez minutos
após, cada animal foi levado ao aparelho do RET para realização do teste de
exposição ao predador. Em resumo, foram formados seis grupos, a saber:
• Salina como primeira injeção + salina como segunda injeção após os 10
minutos (Salina + Salina).
• Salina + NMDA 0,02 nmol/0,1 µl
• Salina + NMDA 0,04 nmol/0,1 µl
• NPLA 0,4 nmol/0,1 µl + Salina
• NPLA 0,4 nmol/0,1 µl + NMDA 0,02 nmol/0,1 µl
• NPLA 0,4 nmol/0,1 µl + NMDA 0,04 nmol/0,1 µl
Fase 2. Teste de Exposição: No quarto dia, um rato macho Holtzman
pesando 600 g (predador), tratado com apomorfina (3 mg/kg, i.p.) para mantê-lo em
movimento durante o teste de exposição, foi introduzido no compartimento que o
separava do camundongo por uma tela de arame. Em seguida, um camundongo
tratado intra-MCPD com uma das soluções descritas acima foi colocado na superfície
de exposição, compartimento que o separava do rato. A duração da exposição ao rato
foi de 10 min para cada camundongo. Os parâmetros comportamentais registrados
41
foram medidas espaço-temporais e etológicas. As primeiras foram: tempo gasto na
toca, túnel e superfície. Os tempos gastos em contato com a tela de arame (incluindo
escalar a tela arame) foram registrados como tempo total de contato. As medidas
etológicas foram: freqüência e duração de avaliação de risco (AR: animal estica o
corpo sem movimentar as patas traseiras e volta a posição inicial ou movimenta-se
com corpo esticado) na toca, túnel ou na superfície, tempo total de congelamento, de
ocultação defensiva (o camundongo empurra com as patas anteriores a maravalha da
toca em direção ao túnel) e do comportamento de auto-limpeza.
5.5.2.2 Experimento 5. Efeito do ovineCRF intra-MCPD avaliado no MDTB e no
RET.
Como descrito acima, os animais passaram pelo mesmo procedimento de
recuperação pós-cirúrgica e habituação a sala experimental. No dia do teste, os
animais foram alocados em 3 grupos e receberam os seguintes tratamentos intra-
MCPD: ovineCRF 30 ng, 100 ng ou controle (líquido encéfalo-raquidiano-LER) (0,2
µl em 30 s). Após 8 min, os animais foram submetidos ao procedimento padrão no
MDTB como descrito acima (Experimento 2.), exceto pela inclusão da exposição pré-
teste (3 min para um período de adaptação e para o registro da atividade locomotora
caracterizada por: freqüência de cruzamentos das linhas desenhadas no assoalho e
freqüência de levantar).
Após o período de uma semana, todos os animais foram reutilizados para o
RET. Para tal, os procedimentos de habituação ao RET, microinjeção e exposição ao
rato (Long-Evans) foram semelhantes ao Experimento 4, porém os grupos receberam
diferentes doses em relação ao primeiro teste.
42
5.6 Histologia- Após o término dos experimentos, os camundongos foram
profundamente anestesiados com tiopental sódico (80 mg/kg) e receberam
injeção intra-MCPD de uma solução de 1% de azul de metileno (procedimento
semelhante ao descrito acima para a injeção das soluções). Os animais foram
perfundidos com salina e formalina 10% e então decapitados, e seus encéfalos
removidos e acomodados em recipientes contendo solução de formalina (10%)
e sacarose (20%) para, posteriormente, sofrerem secções coronais ao longo do
trajeto da cânula com auxílio de um criostato (Leica CM 1850). As secções
(60 µm) foram inspecionadas com o uso de um microscópio (Leica DMLB) e
a visualização da dispersão do azul de metileno foi usada para indicar o local
da injeção.
5.7 Análise Estatística
Para análise dos dados foi utilizado o programa STATISTICA na
versão 6. Os resultados dos Experimentos 1 e 2 foram analisados pela
ANOVA fatorial 2x2 (tratamento e situação). Nos casos em que foram obtidos
valores significantes no efeito tratamento ou interação (droga x situação), as
análises foram seguidas pelo teste de comparações múltiplas de Newman-
Keuls. Para análise do Experimento 3, foi utilizada a ANOVA para medidas
repetidas.
Todos os resultados dos Experimentos 4 e 5 foram inicialmente submetidos ao
teste de homogeneidade de Levene. Posteriormente, os resultados foram analisados
pela análise de variância (ANOVA) unifatorial, seguida pelo teste de Duncan
(dados paramétricos) ou pela ANOVA não-paramétrica Kruskal-Wallis,
43
seguida pelo teste de Mann-Whitney (não paramétricos). Foram considerados
significativos os valores de P ≤ 0,05.
5.8 Ética
Os experimentos realizados nestes estudos estão em acordo com as normas
do Comitê de Ética da Universidade do Havaí e da Sociedade Brasileira de
Neurociências e Comportamento (SBNeC), que são baseadas nas normas do “US
National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals”.
6.RESULTADOS
44
As ilustrações dos sítios de injeção na MCPD dos experimentos descritos
abaixo se encontram na figura 5 (Experimento 4) e nos artigos em anexo
(Experimentos 1-3 e 5).
6.1 Estimulação Química (Etapa 1)
6.1.1 Experimento 1. Avaliação das respostas comportamentais induzidas
pelo DLH em duas situações diferentes: Arena x MDTB
Como demonstrado nas figuras 3 e 4, a ANOVA fatorial revelou um efeito do
fator tratamento para maioria dos comportamentos [freqüência de saltos: F(1,31)=
25,7 p<0,001; freqüência de contato facial: F(1,31)= 10,3 p<0,05; freqüência de
contato lateral: F(1,31)= 34,9 p<0,001; duração de galope: F(1,31)= 66,8 p<0,001;
duração de trote: F(1,31)= 93,7 p<0,001; duração de deambulação: F(1,31)= 234,6
p<0,001; duração de congelamento: F(1,31)=7,1 p<0,05 (Fig.3); e distância
percorrida: F(1,31)= 185,1 p<0,001 (Fig.4)]. A ANOVA revelou um efeito do fator
situação/aparato para os comportamentos saltos [F=(1,31)=19,6 p<0,001], contato
lateral [F(1,31)=5,1 p<0,05], levantar [F=(1,31)=5,54 p<0,05], duração de galope
[F(1,31)=3,9 p> 0,05] e distância percorrida [F(1,31)= 16,3 p< 0,001].
A ANOVA fatorial também indicou um efeito da interação tratamento x
situação, para saltos [F=(1,31)=19,6 p<0,001], contato lateral [F(1,31)=5,1 p<0,05],
galope [F(1,31)=3,9 p> 0,05], deambular [F(1,31)= 7,1 p= 0,01] (fig. 3) e distância
percorrida [F(1,31)= 15,1 p= 0,0005] (fig. 4). A ANOVA revelou uma tendência de
efeito do contato facial [F(1,31)= 3,1 p= 0,08] na interação tratamento x situação, e
não indicou significância para os comportamentos de levantar, trote e congelar. Para
os animais tratados com DLH e observados na arena, a análise comportamental
demonstrou que 87% dos saltos exibidos foram precedidos de contato de parte do
45
corpo, focinho ou vibrissas dos animais com uma ou mais paredes desse
compartimento.
46
Figura 3. Efeito da injeção intra-MCPD do ácido DLH sobre a freqüência (painel superior) e a duração
(painel inferior) de comportamentos de camundongos avaliados em duas diferentes situações: Arena x
MDTB (n= 9-10). As colunas representam as médias e as barras representam EPM. *p<0,05 em relação
ao respectivo grupo controle e #p< 0,05 em relação ao grupo testado na arena pelo teste de comparações
múltiplas de Newman-Keuls.
0
10
20
30
40
50
Galope Trote Deambulação Congelamento
Duração
*
*
*
*
*
*
#
0
10
20
30
40
50
60
70
Salto Contato Lateral Contato Facial Levantamento
Frequência
c
Salina Arena
DLH Arena
Salina MDTB
DLH MDTB
*
*
*
*
#
#
#
47
Arena MDTB
Distância (m)
0
5
10
15
20
25
Salina
DLH
Figura 4. Efeito do injeção intra-MCPD do ácido DLH sobre a distância percorrida em duas situações
diferentes: Arena x MDTB. (n=9-10). As colunas representam as médias e as barras representam o EPM.
*p<0,05 em relação ao respectivo grupo controle e #p<0,05 em relação ao grupo testado na arena pelo teste
de comparações múltiplas de Newman-Keuls.
* #
*
48
6.1.2 Experimento 2. Procedimento padrão no MDTB.
A tabela 1 ilustra os resultados comportamentais (média ± EPM e valores de
F) de camundongos submetidos ao confronto com o predador no procedimento padrão
do MDTB após os efeitos iniciais (60s iniciais) do ácido DLH intra-MCPD. A
ANOVA fatorial não revelou efeito significante nas tarefas do MDTB para os animais
tratados intra-MCPD com DLH, independente da origem do animal (se proveniente da
arena ou do próprio MDTB), exceto para o comportamento de salto defensivo no teste
do corredor sem saída [F(1,31)=5,9 p< 0,05]. O teste-t para medidas independentes
indicou uma diminuição na freqüência de saltos para os animais tratados com DLH
que tinham sido submetidos no primeiro minuto ao mesmo aparelho, comparado aos
animais controle na mesma situação (t=2,2 df=15, p<0,05). Todos os demais
comportamentos não alcançaram diferenças significativas, sendo a freqüência de
mordidas no teste do contato forçado a que apresentou valor de F mais próximo da
significância (F=3,5, p=0,07).
49
Os valores representam a média ± EPM. *P< 0,05 comparado ao grupo controle.
ARENA MDTB
Comportamento Salina DLH Salina DLH F(1,31)
Esquiva do Predador
Distância esquiva (cm) 60,2 ± 15.2 22,0 ± 10,5 53,2 ± 13,1 46,0 ± 12,5 3,18
Freqüência de esquiva 2,0 ± 0,5 0,6 ± 0,2 1,9 ± 0,4 1,9 ± 0,6 2,22
Fuga do Predador
Vel. média (m/s) 0,51 ± 0,04 0,57 ± 0,07 0,59 ± 0,05 0,62 ± 0,08 0,45
Vel. Máxima (m/s) 0,89 ± 0,05 0,83 ± 0,04 0,96 ± 0,06 0,94 ± 0,12 0,30
Parada (F) 5,4 ± 1,1 2,6 ± 0,6 3,9 ± 1,2 3,2 ± 1,0 2,70
Inversão (F) 5,1 ± 1,1 2,8 ± 0,8 3,4 ± 1,1 3,0 ± 1,4 1,43
Corredor sem saída
Aproximção e Retirada (F)
2,1 ± 0,4 1,9 ± 0,5 2,6 ± 0,3 2,6 ± 0,5 0,23
Contato c/ predador (F) 1,3 ± 0,4 1,4 ± 0,4 1,6 ± 0,6 1,3 ± 0,5 0,97
Salto defensivo (F) 1,1 ± 0,6 0,5 ± 0,1 4,3 ± 0,7 2,1 ± 0,6* 5,92
Congelamento (D) 4,8 ± 1,0 3,7 ± 0,9 2,1 ± 0,8 2,8 ± 1,4 0,54
Contato Forçado
Lev. Defensivo (F) 9,5 ± 1,9 6,4 ± 1,3 5,6 ± 2,1 7,6 ± 1,2 0,13
Vocalização (F) 11,0 ± 1,4 7,7 ± 1,8 11,5 ± 1,8 11,1 ± 0,9 1,45
Mordidas (F) 0,0 ± 0,0 0,8 ± 0,4 0,5 ± 0,3 1,4 ± 0,7 3,54
Salto defensivo (F) 4,7 ± 2,2 7,0 ± 1,4 9,1 ± 2,0 7,6 ± 1,2 0,55
Pos-teste
Cruzamento (F)
196,7 ± 22,1 169,3 ± 31,7 151,2 ± 22,0 162,3 ± 18,0 0,60
Levantamento (F) 32,4 ± 2,9 24,1 ± 4,4 24,1 ± 3,2 28,1 ± 5,0 0,15
Salto defensivo (F) 2,0 ± 0,9 0,7 ± 0,5 3,9 ± 1,2 2,3 ± 1,1 0,02
Tabela 1. Efeito da infusão intra-MCPD do ácido DLH sobre as respostas comportamentais de
camundongos confrontados com o predador no procedimento padrão do MDTB, após o período
inicial da resposta do ácido DLH (minuto inicial na Arena ou no MDTB, ver Material e Métodos
para detalhes).
50
6.1.3 Experimento 3. Avaliação da capacidade de reação de camundongos a
estímulos ambientais durante o efeito máximo do DLH (fuga explosiva).
A tabela 2 mostra que os animais não responderam a nenhum tipo de estímulo
ambiental, seja ele aversivo ou não, durante a resposta de fuga provocada pelo
composto DLH. Na contagem quadro-a-quadro (câmera lenta -1/30) da gravação da
resposta em DVD, a ANOVA para medidas repetidas não indicou qualquer tendência
de aumento do número de quadros contados com a proximidade do estímulo neutro
[Porta F(2,14)=1,0 p>0,05] ou do estimulo aversivo, o rato: [1 tentativa F(2,14)=0,81
p>0,05], [2 tentativa F(2,14)=1,36 p>0,05] e [3 tentativa F(2,14)=1,43 p>0,05],
indicando que os animais não reduziram a velocidade para evitar o choque com o
estímulo ambiental. O número de quadros representa a velocidade na qual o animal
se aproxima do estímulo neutro ou aversivo (4 quadros por segundo = 1,5 m/s ou 8,4
quadros= 0,71m/s).
51
Tabela 2. Demonstra a resposta dos animais sob pico de efeito inicial do ácido DLH
(fuga explosiva) aos estímulos ambientais (porta ou rato).
Estímulo
Nº quadros no
bloco 1
(60 cm do estímulo)
Nº quadros no
bloco 2
(40 cm do estímulo)
Nº quadros no
bloco 3
(20 cm do estímulo)
Percentagem de
contatos
Porta no
MDTB
4.0
4.0
3.9
100
Rato
Tentativa 1
5.8
6.4
5.8
90
Rato
Tentativa 2
6.0
6.1
6.5
90
Rato
Tentativa 3
6.8
7.3
8.4
80
Os valores representam a média do número de quadros da análise em câmera lenta do DVD necessária pra o animal
cruzar cada bloco até alcançar o estímulo. Cada bloco representa 20 cm. Contatos foram considerados quando o
animal tocava ou colidia com a cabeça a porta ou o rato.
52
6.2 Exposição ao predador (Etapa 2)
6.2.1 Experimento 4. Efeitos do NMDA e NPLA intra-MCPD nos
comportamentos avaliados no RET.
A ANOVA unifatorial seguida pelo teste de Duncan (dados paramétricos)
revelou que somente o tratamento intra-MCPD com a dose mais alta do agonista de
receptor NMDA (salina+NMDA 0,04) reduziu o número de cruzamentos entre os
compartimentos toca [F(5,88) = 2,8; P<0,05], túnel [F(5,88)= 3,6; P<0,005] e
superfície [F(5,88)= 4,4; P<0,005] (fig. 6). Em relação ao tempo gasto nesses
compartimentos, o grupo tratado com o inibidor da NOSn (NPLA+salina) teve o
tempo na toca reduzido [F(5,88)= 3,1; P<0,05] e o tempo na superfície aumentado
[F(5,88)= 4,2; P<0,005], enquanto o grupo que recebeu NMDA na dose mais elevada
(salina+NMDA 0,04) tendeu a reduzir o tempo gasto na superfície (Duncan; P=0,09)
em relação ao grupo controle (fig. 6). Cabe ressaltar também que tendências de
redução do tempo na toca (Duncan; P=0,08) e de aumento na superfície (Duncan;
P=0,10) foram observadas para o grupo que recebeu injeções combinadas de NPLA
com NMDA 0,02 (fig. 6). Por fim, a análise estatística não indicou nenhuma diferença
entre os grupos tratados e o grupo controle no tempo de permanência no túnel
[F(5,88)= 0,58; P>0,05].
Para a última medida espaço-temporal, o tempo de contato, a ANOVA
Kruskall-Wallis seguida pelo teste de comparações de Mann-Whitney (dados não
paramétricos) revelou que o tempo de contato com a tela de arame entre o predador e
a presa foi significativamente menor para o grupo que recebeu NMDA 0,04 e maior
para os grupos que foram tratados com NPLA+salina e NPLA+NMDA 0,02 em
relação ao grupo controle (salina+salina) [H(5,94)= 31,3; P < 0,005] (fig. 8).
53
Nas medidas etológicas, a freqüência de avaliação de risco no compartimento
toca foi reduzida para os grupos que receberam NPLA combinado com salina e NPLA
com NMDA 0,02 comparados ao controle [H(5,94)= 18,2; P<0,005] (fig.7). No
compartimento túnel [F(5,88)= 0,79; P>0,05] e superfície [F(5,88)= 0,68; P>0,05],
nenhum tratamento alterou a freqüência de avaliação de risco. Em relação à duração,
o tratamento com NMDA (0,04 nmol) tendeu a aumentar o tempo total de avaliação
de risco no compartimento toca [H(5,94)= 22,7;p<0,005 (Mann Whitney, p=0,09)],
enquanto o NPLA reduziu consistentemente esse comportamento na mesma situação
(fig.7), um efeito que se mostrou próximo da significância quando combinado com a
menor dose de NMDA (0,02 nmol) (Mann Whitney, P=0,06) (fig. 7).
É relevante mencionar que a análise estatística da porcentagem de tempo do
comportamento de avaliação de risco em relação ao tempo total em cada
compartimento é uma medida mais expressiva e confiável das alterações desse
comportamento diante dos tratamentos farmacológicos. Dessa maneira, a ANOVA
Kruskall-Wallis seguida pelo teste de comparações de Mann-Whitney revelou que o
grupo tratado com NPLA teve uma diminuição relativa da avaliação de risco na toca
[H(5,94)= 16,3; p<0,05] e na superfície [H(5,94)= 18,5; p<0,005]. De maneira
interessante, o grupo que recebeu o composto NMDA na dose mais alta após o
tratamento com NPLA (NPLA+NMDA 0,04) teve um claro aumento relativo desse
comportamento no compartimento superfície.
Finalmente, a análise estatística não apontou diferenças no comportamento de
auto-limpeza entre os grupos tratados e grupo controle [F(5,88)= 1,7; P>0,05] (fig. 8).
Em relação ao comportamento de congelar, suas intensificação e redução foram
observadas nos animais que receberam injeção combinada de salina com NMDA 0,04
54
[H(5,94)= 26,6; p<0,005] e NPLA combinado com salina (Mann Whitney p<0,005),
respectivamente.
55
Figura 5. Representação esquemática dos sítios de microinjeção dentro da matéria cinzenta
periaquedutal dorsal (MCPD) de camundongos (Experimento 4). O número de pontos representados na
figura é menor que o número total de camundongos utilizado devido à sobreposição de alguns sítios.
56
Figura 6. Efeitos dos tratamentos combinados intra-MCPD sobre as respostas defensivas de
camundongos (n=15-18) submetidos ao RET (freqüência painel superior e duração no painel
inferior). As colunas representam as médias e as barras representam EPM. *p<0,05
comparado ao grupo controle pelo teste de Duncan ou pelo teste de Mann-Whitney.
0
5
10
15
20
25
30
Frequência
salina+salina Salina+NMDA 0.02 Salina+NMDA 0.04
NPLA 0.4+Salina NPLA 0.4+NMDA 0.02 NPLA 0.4+NMDA 0.04
*
*
*
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Toca Túnel Surperfíce
Duração(s
)
*
*
57
Figura 7. Efeitos dos tratamentos combinados intra-MCPD sobre as respostas defensivas de
camundongos (n=15-18) submetidos ao RET (freqüência no painel superior e duração no
painel inferior). As colunas representam as médias e as barras representam EPM. *p<0,05
comparado ao grupo controle pelo teste de Duncan ou pelo teste de Mann-Whitney. AR:
avaliação de risco.
0
2
4
6
8
10
12
14
Frequência
Salina+Salina Salina+NMDA 0.02 Salina+NMDA 0.04
NPLA 0.4+Salina NPLA 0.4+NMDA 0.02 NPLA 0.4+NMDA 0.04
*
*
0
5
10
15
20
25
30
AR Toca AR Túnel AR Superfíce
Duração (s)
*
58
Figura 8. Efeitos dos tratamentos combinados intra-MCPD nas respostas defensivas de
camundongos submetidos ao RET (duração). As colunas representam as médias e as barras
representam EPM. *p<0,05 comparado ao grupo controle pelo teste de Duncan ou pelo teste de
Mann-Whitney
.
0
30
60
90
120
150
180
210
240
Contato Auto-limpeza Congelamento
Duração (s).
Salina+Salina Salina+NMDA 0,02 Salina+NMDA 0,04
NPLA 0,4+Salina NPLA 0,4+NMDA 0,02 NPLA 0,4+NMDA 0,04
*
*
*
*
*
59
6.2.2 Experimento 5. Efeito ovineCRF intra-MCPD avaliado no MDTB e no
RET.
Todos os efeitos comportamentais da injeção intra-MCPD do agonista não
seletivo de receptores CRF, ovine CRF, avaliados no MDTB estão representados na
tabela 3 (média ± EPM e os valores de F). A ANOVA indicou efeitos do oCRF
apenas nos testes de esquiva ao predador e contato forçado. O teste de post hoc de
Duncan demonstrou que os animais tratados com a dose mais alta de oCRF (100ng)
aumentaram a distância de esquiva. No teste de contato forçado, ambas as doses de
oCRF aumentaram o número de saltos defensivos e diminuíram a freqüência de
levantamentos defensivos.
Por outro lado, a infusão do composto oCRF intensificou a maioria dos
comportamentos defensivos avaliados no RET. Nas medidas espaço-temporais, a
ANOVA unifatorial seguida pelo teste de Duncan mostrou efeitos significativos do
oCRF (30-100 ng) na freqüência [F(2,26)= 10 P< 0,001] e tempo [F(2,26)= 6,0 P<
0,01] na toca, na freqüência [F(2,26)= 7,3 P< 0,01] e tempo [F(2,26)= 4,9 P< 0,01]
de túnel, e na freqüência de superfície [F(2,26)= 5,1 P< 0,01], e tendência de efeito
para o tempo de superfície [F(2,26)= 3,0 P=0.07] (Fig 9). Tendência semelhante foi
revelada pela ANOVA para a freqüência de contato com a tela de arame que separava
o predador da presa [F(2,26)= 2,9 P=0,07], enquanto a análise de variância Kruskall-
Wallis seguida pelo teste de comparações de Mann-Whitney confirmou a
significância para o tempo de contato com a tela [H(
2,26)= 8,18, P<0.01] (Fig. 10).
Nas medidas etológicas, a ANOVA mostrou que a microinjeção do composto
oCRF reduziu a freqüência [F(2,26)= 6,5 P<0,01] e duração [F(2,26)= 6,9 P<0,01] do
comportamento de avaliação de risco no compartimento túnel (fig.10). No entanto, a
análise estatística não revelou diferenças entre os grupos tratados e o grupo controle
60
na porcentagem relativa de avaliação de risco no túnel [F(2,26)= 1,6 P>0,05]. Para o
compartimento toca, nenhum efeito foi observado na freqüência [F(2,26)= 1,8
P>0,05], duração total [F(2,26)= 1,4 P>0,05] (Fig. 10) e duração relativa [F(2,26)=
1,7 P>0,05] da avaliação de risco. Os comportamentos de congelamento [H(2,29)=4,1
P>0,05], ocultação defensiva [F(2,26)= 0,5 P>0,05] e auto-limpeza [F(2,26)=0,3
P>0,05] não foram alterados pelo tratamento com o agonista de CRF (Fig. 11).
61
Tabela 3. Efeitos da infusão intra-MCPD do composto ovineCRF sobre a resposta
comportamental de camundongos confrontados com o rato no MDTB (n=9-11).
Os comportamentos foram avaliados em freqüência (F) e duração (D). Os dados estão representados como
média ± EPM. *p<0,05 relação ao respectivo grupo controle usando o teste de Duncan.
Comportamentos
Controle
oCRF 30 ng
oCRF 100ng
F( 2,28)
Pré-Teste
Cruzamentos (F)
200,4 ± 19,6
187,4 ± 6,6
182,3 ± 15,7
0,39
Levantar (F) 9,5 ± 2,1 9,0 ± 2,1 6,7 ± 2,3 0,47
Esquiva do predador
Dist. de esquiva (cm)
45,7 ± 10,4
44,9 ± 6,9
75,4 ± 8,3
*
3,68
Frequência esquiva 1,4 ± 0,3 2,1 ± 0,4 2,2 ± 0,2 1,90
Fuga do predador
Vel. Média (m/s)
0,51 ± 0,05
0,53 ± 0,05
0,61 ± 0,04
1,11
Vel. Máxima (m/s) 0,84 ± 0,06 0,89 ± 0,07 0,94 ± 0,05 0,52
Parada (F) 2,45 ± 1,1 4,8 ± 1,1 2,89 ± 0,5 1,78
Inversão (F) 5,73 ± 1,3 6,73 ± 1,6 4,33 ± 1,5 0,62
Corredor sem saída
Aprox. e Retirada (F) 1,9 ± 0,2 2,0 ± 0,4 2,3 ± 0,4 0,30
Contato cPredador (F) 1,1 ± 0,3 1,0 ± 0,2 1,3 ± 0,2 0,42
Saltos defensivos (F) 0,8 ± 0,4 1,8 ± 0,5 1,4 ± 0,2 1,08
Congelamento (D) 2,1 ± 0,5 3,7 ± 1,4 1,9 ± 0,6 1,04
Contato forçado
Vocalização (F) 13,6 ± 0,4 13,4 ± 0,8 14,0 ± 0,8 0,13
Lev. defensivo (F) 12,4 ± 1,0 6,9 ± 1,3* 8,1 ± 1,6* 5,50
Saltos defensivos (F) 2,4 ± 1,0 8,2 ± 1,3* 7,0 ± 1,6* 6,03
Mordidas no rato (F) 1,6 ± 0,7 1,4 ± 0,6 0,8 ± 1,0 0,33
Pós-teste
Cruzamentos (F) 179,5 ± 20,9 152,6 ± 13,9 184,3 ± 22,9 0,80
Levantamento (F) 25,2 ± 3,0 28,6 ± 2,4 21,2 ± 4,9 1,16
Saltos defensivos (F) 1,7 ± 0,6 3,7 ± 1,7 1,2 ± 0,6 1,26
62
Frequência
0
5
10
15
20
25
Controle
oCRF 30
oCRF 100
*
*
*
*
*
*
Toca Túnel Superfície
Duração (s)
0
100
200
300
400
500
600
700
*
*
*
*
Fi
g
. 9. Efeito da infusão do oCRF intra-MCPD no comportamento defensivo de
camundongos submetidos ao RET (frequência no painel superior e duração no painel
inferior). As colunas representam as medias e as barras o EPM. *p<0,05 comparado ao
grupo controle
pelo teste de Duncan ou pelo teste de Mann-Whitney.
63
Contato AR Toca AR Túnel
Duração (s)
0
10
20
30
40
50
60
70
*
*
*
*
Fi
g
. 10. Efeito do oCRF intra-MCPD no comportamento defensive de camundongos
submetidos ao RET (frequência no painel superior e duração no painel inferior). As
colunas representam as medias e as barras o EPM. *p<0,05 comparado ao grupo controle
p
elo teste de Duncan ou pelo teste de Mann-Whitney.
Frequência
0
5
10
15
20
25
30
controle
oCRF 30
oCRF 100
*
*
64
Fig. 11. Efeito do oCRF intra-MCPD no comportamento defensivo (medidas etológicas)
de camundongos submetidos ao RET. As colunas representam as medias e as barras
representam o EPM.
Congelar Ocultação Defensiva Auto-limpeza
Duração (s)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
controle
oCRF 30
oCRF 100
7.DISCUSSÃO
65
7. DISCUSSÃO
7.1 Estimulação Química
A primeira etapa do presente estudo teve como propósito investigar se as
características físicas do ambiente no qual o animal é testado interferem com as
respostas comportamentais induzidas pela estimulação química da MCPD em
camundongos. Inicialmente, nossos resultados estão de acordo com estudos
anteriores, que demonstraram que a infusão intra-MCPD do ácido DLH em ratos e
camundongos provoca imediata resposta motora de alta intensidade e que se
caracteriza por corridas (galope e trote) e saltos que perduram por curto período
(cerca de 40-60s), sendo seguidos por cerca de cinco minutos de congelamento ou
imobilidade (Beckett et al., 1990; 1992; Carvalho-Netto & Nunes-de-Souza, 2004b).
No entanto, nossos resultados adicionalmente indicam que essas respostas
comportamentais induzidas pelo DLH são dependentes das características físicas do
ambiente onde os animais são testados. Exemplificando, durante o período de resposta
motora explosiva (60s iniciais) provocada pela injeção intra-MCPD de DLH , os
animais que foram submetidos a uma situação com pouca disponibilidade de espaço, a
arena (onde percorriam um reduzido espaço antes de alcançarem as paredes do
aparato), tiveram como resposta predominante o comportamento de saltos. Por outro
lado, os camundongos tratados e avaliados no aparelho do MDTB (no qual estava
disponível um grande espaço físico: 4,8 m de trajeto oval sem interrupções abruptas),
exibiram principalmente o comportamento de corrida (galope) e uma quantidade
reduzida de saltos. Cabe ressaltar que esse número de saltos foi extremamente
reduzido na situação MDTB, não alcançando níveis de significância em relação aos
animais que receberam salina na mesma situação.
66
Nossos resultados não corroboram recentes dados obtidos com a técnica da
estimulação elétrica da MCPD em ratos testados em ambientes de tamanhos
diferentes. Schenberg e colaboradores (2005) demonstraram que alterações no
tamanho do diâmetro da arena onde os animais são estimulados eletricamente (20 cm
ou 50 cm de diâmetro) não interferem na intensidade da corrente elétrica para eliciar
alguns comportamentos defensivos, incluindo os saltos. De modo interessante, esses
autores mostraram que quando a estimulação ocorria em um compartimento com
menor disponibilidade de espaço (arena 20 cm), os animais tiveram o comportamento
de corrida abolido, e em seu lugar surgiram os comportamentos de rápida rotação e
congelamento. Entretanto, de modo diferente ao demonstrado no presente estudo, em
que o comportamento de saltos teve aumentos substanciais num ambiente com pouca
disponibilidade de espaço, os resultados de Schenberg e colaboradores (2005) não
apontaram para alterações na freqüência dessa resposta. Embora diferentes espécies
de animais (camundongo vs ratos), diferentes métodos (estimulação químicas vs
elétrica) e aparatos (MDTB vs Arena) tenham sido utilizados nesses estudos, a
principal diferença possa ser devida às técnicas empregadas para avaliar os efeitos do
ambiente físico nas respostas induzidas pela estimulação da MCPD. Em outras
palavras, o uso do limiar de intensidade da corrente elétrica para produzir
determinado comportamento pode ser menos sensível para alterações do ambiente do
que a própria expressão da resposta comportamental.
Resultados complementares da primeira etapa do presente estudo sugerem que
as alterações comportamentais, principalmente a predominância de saltos ao invés de
corrida, observadas para os animais tratados com DLH e submetidos à arena, possam
ser moduladas pelo contato tátil. De fato, uma análise detalhada revelou que 87% dos
saltos exibidos na arena foram precedidos de um contato (colisão ou toque) de parte
67
da cabeça do animal com uma ou mais paredes do aparato. Dando apoio a essa
hipótese, os resultados da análise comportamental do Experimento 1 indicaram que os
animais testados na arena sob efeito do ácido DLH apresentaram freqüências de
contatos faciais e laterais significativamente maiores nas paredes do aparato do que
aqueles testados no MDTB. Em parte, esses resultados encontram apoio naqueles
oriundos dos trabalhos de Bandler e Depaulis (1991), que mostraram que ratos
microinjetados intra-MCPD com outro aminoácido excitatório, o ácido caínico, não
exibem comportamentos defensivos frente a aproximação da mão do
experimentador (estímulo visual), contudo, apresentam reações de defesa quando
tocados pelo experimentador (estímulo tátil). Em conjunto, esses resultados sugerem
que a estimulação química de neurônios da MCPD provoca um déficit no
funcionamento normal do sistema visual nos animais estimulados.
O fato das evidências discutidas acima indicarem que o perfil das respostas
comportamentais (ex. saltos ou corrida) induzidas pela estimulação química depende
das características do ambiente, sendo essas moduladas especificamente pelo contato
tátil do animal com as paredes do ambiente, não invalida que a MCPD contém
elementos do sistema de defesa ativados seja por estímulos aversivos naturais (ex
interação presa-predador) ou artificiais, tais como as estimulações química ou elétrica.
Inserido nesse contexto, estudos anteriores têm demonstrado que animais aprendem a
evitar a estimulação elétrica dessa região, reforçando o seu caráter aversivo (Olds &
Olds, 1962; Cazala & Garrigues, 1981; Schenberg et al., 2001). Além disso, os
comportamentos do tipo galope e saltos eliciados pela estimulação dessa região em
animais de laboratório são semelhantes àqueles exibidos em situações de perigo
imediato, como o confronto com o predador (Beckett et al., 1992; Keay & Bandler,
2001; Schenberg et al., 2001; Vianna & Brandão, 2003). Ainda, a estimulação elétrica
68
ou química da MCPD tem sido proposta como um modelo animal para o estudo do
transtorno do pânico em humanos (Vargas & Schenberg, 2001), uma vez que produz
sensações de medo intenso, pavor e de morte iminente em humanos, que se
assemelham a um ataque de pânico (Nashold et al., 1969).
No entanto, os resultados do Experimento 2 demonstraram que os animais
testados no procedimento padrão do MDTB após o minuto inicial de efeito do DLH
(após resposta explosiva) não apresentaram alterações significativas no
comportamento defensivo frente ao predador em relação aos animais controles. Seria
esperado que a ativação de neurônios da MCPD (ex. com DLH), que comandam o
sistema de luta e fuga, provocasse aumento nas respostas defensivas no procedimento
padrão do MDTB, principalmente nos componentes de luta e fuga. Uma possível
explicação para a ausência de efeitos do DLH injetado intra-MCPD sobre as respostas
defensivas de camundongos em confronto com predador seria, em parte, devido ao
perfil do efeito farmacológico do composto DLH (curta duração) (Bandler et al.,
1985; Beckett et al., 1992; Carvalho-Netto & Nunes-de-Souza, 2004b). Embora a
resposta explosiva inicial (saltos e intensa atividade locomotora) provocada pela
infusão do DLH seja de curta duração, o perfil comportamental que a segue
(imobilidade ou congelamento) pode perdurar cinco minutos ou mais (Beckett et al.,
1990; Carvalho-Netto & Nunes-de-Souza, 2004b). Porém, não está claro se essa
última resposta é parte do repertório provocado pela estimulação com DLH ou se é
um sinal de exaustão ou quietez em conseqüência da intensa resposta motora inicial.
Por outro lado, estudos conduzidos por Bandler e DePaulis (1988) demonstraram que
a microinjeção intra-MCPD de doses baixas do ácido caínico intensifica a exibição de
comportamentos defensivos em ratos submetidos ao teste de interação social. Tais
comportamentos foram semelhantes àqueles expressados em situações que o animal
69
sofre um ataque co-específico, porém nesse caso não se observaram ataques co-
específicos por parte do outro animal. Nesse sentido, DePaulis e colaboradores (1989)
sugeriram que o ácido caínico é um composto mais adequado para o estudo do efeito
da ativação neuronial da MCPD no comportamento defensivo em um ambiente
naturalístico, como as interações social e presa-predador. De acordo com esses
pesquisadores, essa droga apresenta um efeito farmacológico de ativação neuronial
mais duradouro (20-30 minutos). Além disso, por alguma razão, esse composto não
elicia respostas comportamentais explosivas (intensa atividade locomotora), mesmo
em doses mais altas (embora elicie alguns saltos orientados), contrastando, assim,
com os efeitos do DLH, que induz intensa atividade motora por um período reduzido
de tempo (Bandler & Depaulis, 1988). Tal efeito torna mais difícil a viabilidade de se
avaliar se essas respostas comportamentais induzidas pelo ácido DLH intra-MCPD
correspondem às reações de defesa frente a uma ameaça real e proximal, como por
exemplo, o confronto com o predador.
Na tentativa de investigar essa hipótese, o Experimento 3 teve como propósito
avaliar se durante essa resposta motora intensa provocada pelo DLH intra-MCPD os
animais responderiam a estímulos neutros e naturalmente aversivos para a espécie,
como um predador. De forma surpreendente, os resultados revelaram que durante o
efeito máximo do ácido DLH, em que se observou intensa atividade locomotora
(corrida ou fuga explosiva), os animais não responderam a qualquer tipo de estímulo,
seja ele neutro (fechamento de uma porta no final do corredor do MDTB) ou aversivo
(colocação de um rato anestesiado bloqueando a passagem). Em outras palavras,
durante a expressão do comportamento de fuga explosiva os animais invariavelmente
colidiam com os estímulos neutro ou aversivo que eram colocados na tentativa de
bloqueio do caminho sem esboçar redução significativa na velocidade de corrida. De
70
maneira interessante, sob efeito do DLH, a maioria dos camundongos não esboçava
qualquer alteração de direção após tocarem ou colidirem contra o estímulo aversivo
(rato), correndo contra o corpo do predador anestesiado, sugerindo uma deficiência
na estratégia defensiva antipredador.
Primeiramente, tal como sugerido para os resultados do Experimento 1,
poderíamos explicar essa deficiência na reposta antipredador devido alterações do
funcionamento normal do sistema visual do animal durante o efeito do aminoácido
excitatório (AAE). Entretanto, Bandler e DePaulis (1991) mostraram que embora o
ácido caínico intra-MCPD também interfira no funcionamento normal do sistema
visual de ratos, não altera com o aumento significativo no comportamento defensivo
durante um encontro com co-específico no teste de interação social (Bandler &
DePaulis, 1988). De acordo com esses pesquisadores, essas respostas defensivas só
foram eliciadas após o contato físico com o outro co-específico, indicando que estes
animais respondem através do sistema tátil a estímulos que possam representar perigo
a espécie.
Diante dessas evidências, é plausível sugerir que a resposta observada em
camundongos após a estimulação com ácido DLH possa refletir um alto nível de
ativação reflexa do sistema locomotor, que se sobrepõe às outras funções da MCPD
como aquelas relacionadas aos componentes de defesa. Argumentando nessa linha, o
presente estudo demonstrou que o DLH levou os camundongos a alcançarem a
velocidade máxima de 1,4 m/s durante a resposta de corrida no aparelho MDTB. De
modo interessante, a mesma espécie de camundongos (Swiss-Webster) exibe a
velocidade máxima de 0,8 m/s quando exposta a uma situação natural de ameaça,
como a que envolve a perseguição pelo predador no mesmo aparelho (Blanchard et
al., 1998). No mesmo procedimento, animais tratados sistemicamente com drogas
71
com potencial ansiogênico, tais como a cocaína e o flumazenil, tiveram potencializada
a fuga do predador, entretanto, com velocidade máxima de 1,1 m/s (Blanchard et al.,
1999). A velocidade de fuga induzida pelo DLH em camundongos de laboratório foi
semelhante àquela exibida por camundongos selvagens quando perseguidos pelo
predador (Blanchard et al., 1998), o que pode ser um indicativo de uma ativação
máxima e fora dos padrões fisiológicos de resposta de fuga normal para esses animais
de laboratório.
Várias evidências têm indicado que a MCP é uma estrutura fundamental
envolvida na elaboração e coordenação de respostas defensivas para perigo proximal
(Bandler & DePaulis, 1991; Graeff, 1994; 2004). De fato, lesões nessa região atenuam
drasticamente as reações de defesa de ratos selvagens em confronto com o predador
(Blanchard et al., 1981). Além disso, recentes estudos têm demonstrado que a
exposição de ratos ao predador (gato) ou ao odor do predador provoca intensa
ativação de proteína Fos na MCPD desses animais (Canteras & Goto, 1999;
Dielenberg et al., 2001). No entanto, no presente estudo os animais não responderam
à presença do predador durante o efeito do ácido DLH. Tal fato não deve ser
interpretado como uma evidência contrária às muitas que ratificam a participação da
MCPD na elaboração e coordenação dos comportamentos defensivos frente a um
perigo proximal (ver Graeff, 1994; 2004). É mais provável que esse perfil de resposta
esteja relacionado à dose do ácido DLH utilizada no presente estudo. Embora dentro
da faixa utilizada em estudos anteriores (Bandler et al., 1985; Beckett et al., 1990;
1992), a dose do presente estudo pode ter provocado uma estimulação intensa e
generalizada dos neurônios da MCPD de camundongos, podendo levar a uma
ativação inespecífica ou exacerbada de outros componentes e sistemas, como o
sensorial e o motor. Dessa forma, o perfil das respostas induzidas pelo DLH parece
72
se distanciar daquele desencadeado por ameaças proximais encontradas na natureza
ou em modelos etologicamente fundamentados.
7.2 Exposição ao Predador
A segunda etapa do presente estudo, empregando um estímulo natural como
principal situação aversiva, investigou o envolvimento da MCPD na modulação de
diferentes estratégias defensivas evocadas pelo confronto de camundongos com o
predador natural, o rato. Primeiramente, inserido no contexto da investigação do
envolvimento dos aminoácidos excitatórios (AAE) nas reações de defesa moduladas
pela MCP, no presente estudo utilizou-se como ferramenta farmacológica doses
baixas de NMDA, agonista de receptor glutamatérgico de mesmo nome, para avaliar
as respostas defensivas de camundongos submetidos ao RET. É importante enfatizar
que a menor dose de NMDA (0,02 nmol) não provocou qualquer alteração
comportamental relevante, apenas um breve aumento da atividade locomotora. Já a
dose de 0,04 nmol levou a moderada ativação locomotora, caracterizada por corrida,
saltos e congelamento, que se iniciou imediatamente após a injeção e teve duração
média de dois minutos (ver Miguel & Nunes-de-Souza, 2006). No entanto, no
presente estudo, os animais só foram testados no RET após um período (10 min)
aparentemente suficiente para que os efeitos imediatos provocados pela infusão do
NMDA (ex. atividade locomotora inicial, imobilidade ou quietez) não prejudicassem
o desempenho dos animais no teste. Cabe ressaltar que esse período foi determinado
com base em evidências sugestivas de que as alterações comportamentais decorrentes
dos efeitos farmacológicos da ativação do receptor glutamatérgico NMDA (p.ex.
formação de NO e ativação de cascata intracelular e liberação de outros
neurotransmissores) são detectadas durante o procedimento experimental (para uma
73
revisão Garthwaite, 1991; Carobrez et al., 2001; Prast & Philippu, 2001; Esplugues,
2002; Carobrez, 2003).
No presente estudo, substituiu-se a ferramenta farmacológica DLH pelo
NMDA, em razão das evidências apontarem ser o primeiro um agonista
glutamatérgico inespecífico, atuando tanto em receptores NMDA como não NMDA e
metabotrópicos (Fagg et al., 1986; Griffiths, 1991). Além disso, é crescente o número
de evidências que indicam um importante envolvimento na MCP do subtipo de
receptor glutamatérgico NMDA na modulação de comportamentos defensivos
relacionados aos estados de medo e ansiedade (para uma revisão ver Carobrez et al.,
2001; Carobrez, 2003; Bergink et al., 2004).
De fato, em concordância com as evidências acima, nossos resultados indicam
que a ativação dos receptores NMDA na MCPD exacerba as respostas defensivas de
camundongos em confronto com o predador no RET. Exemplificando, nas medidas
espaço-temporais, a dose mais alta de NMDA produziu uma tendência em reduzir a
permanência dos sujeitos na superfície de exposição ao rato (P=0,10) e reduziu
significativamente o tempo de contato dos animais com a tela de arame que separa o
predador da superfície, indicando um aumento nas respostas de esquiva ao predador.
Além disso, nas medidas etológicas, os animais tratados com a maior dose do agonista
NMDA exibiram um aumento substancial do comportamento de congelamento e
tenderam a aumentar o tempo total de avaliação de risco no compartimento toca (p=
0,08). No entanto, é importante comentar que para esse último comportamento,
quando analisado em percentagem de tempo em relação à permanência no
compartimento toca (dados não mostrados), tais diferenças em relação ao controle não
se confirmaram (p= 0,13).
74
Os resultados do presente estudo corroboram várias evidências anteriores que
têm indicado um papel ansiogênico do glutamato via ativação do subtipo de receptor
NMDA. Por exemplo, a administração sistêmica do agonista NMDA evoca
comportamentos relacionados à ansiedade em ratos e camundongos testados em
vários modelos animais, tais como o labirinto em cruz elevado, a interação social e o
modelo de vocalização ultra-sônica (Dunn et al., 1989; Vasar et al., 1993; Podhorna &
Brown, 2000). Mais especificamente, nossos resultados estão de acordo com aqueles
oriundos do grupo liderado pelo pesquisador Antonio Carobrez, do Departamento de
Farmacologia da Universidade Federal de Santa Catarina (Carobrez et al., 2001;
Carobrez, 2003). Esses pesquisadores demonstraram que a infusão intra-MCPD de
doses baixas de glutamato ou de NMDA aumentou a esquiva dos braços abertos em
ratos testados no labirinto em cruz elevado (LCE) dez minutos após o tratamento. Na
mesma linha de argumentação, a infusão intra-MCPD dos compostos glicina ou D-
serina, co-agonistas dos receptores glutamatérgico NMDA/Glicina B, também
intensificou a esquiva dos braços abertos e o comportamento de avaliação de risco em
ratos submetidos ao LCE (Schmitt et al., 1995; Teixeira & Carobrez, 1999). Ainda,
fortalecendo as evidências de envolvimento específico do subtipo de receptor NMDA
da MCPD na mediação dos comportamentos defensivos, Guimarães e colaboradores
(1991) demonstraram que injeções locais com o antagonista de receptor NMDA, AP-
7, levaram ratos a explorarem mais braços abertos do LCE, um sugestivo efeito
ansiolítico. Além disso, recentes resultados oriundos do mesmo grupo de pesquisa
(Beijamini & Guimarães, 2006) revelaram que a administração i.c.v. do composto
AP-7 induz um efeito antiaversivo em ratos confrontados com o predador natural, o
gato.
75
Embora vários estudos confirmem a participação do glutamato, via receptor
NMDA, nas respostas de medo e ansiedade, não podemos descartar a possibilidade de
que as alterações comportamentais obtidas no presente estudo estejam vinculadas a
uma alteração motora. Em apoio a essa hipótese, nossos resultados demonstram que
os animais que receberam a maior dose de NMDA tiveram a freqüência de
cruzamentos entre os compartimentos significativamente reduzida em relação ao
grupo controle. Tal fato abre a possibilidade para outras interpretações, como por
exemplo, a de um prejuízo motor induzido pelo NMDA. Assim, a diminuição do
tempo de permanência na superfície e o aumento do tempo de congelamento
induzidos pelo NMDA poderiam, em parte, representar uma diminuição da atividade
locomotora (ex. sedação) nos animais ao invés de um efeito puramente ansiogênico.
No entanto, o próprio perfil da reposta induzida inicialmente pelo agonista NMDA
(ativação locomotora) enfraquece a hipótese de um efeito depressor na atividade
motora (ex. sedação) dos animais. Em concordância com essa linha de raciocínio, tem
sido descrito que a infusão de NMDA na mesma estrutura e em doses similares às
empregadas no presente estudo, não altera a atividade exploratória vertical
(comportamento de levantar) em camundongos (Miguel & Nunes-de-Souza, 2006).
Além disso, é relatado que o bloqueio de receptores NMDA na MCPD, por
antagonistas competitivos como o AP-7, produz perturbação no comportamento motor
(ataxia) de ratos (Molchanov & Guimarães, 2002) e de camundongos (Siegfried &
Nunes-de-Souza, 1989). Além disso, o bloqueio de receptores NMDA no hipotálamo
dorsomedial também induz marcante redução na atividade locomotora de ratos
avaliados no LCE e no campo aberto (Jardim & Guimarães, 2001). Ainda, um corpo
de evidências oriundas de estudos utilizando tratamento sistêmico fortalece os
indícios de prejuízo motor (efeito sedativo, miorrelaxante e ataxia) perante o bloqueio
76
dos receptores NMDA, e não de sua ativação (Lehman et al., 1987; Turski et. al.,
1987; Starr & Starr, 1994; Danysz et al., 1994; Podhorna & Brown, 2000). Diante de
tais evidências, a hipótese de um efeito do NMDA per se na redução da atividade
motora mostra-se enfraquecida.
Por outro lado, com base no que já foi discutido na primeira etapa do presente
estudo, torna-se plausível argumentar que esse possível efeito de redução da atividade
motora seja devido a um estado de exaustão dos animais, uma vez que a infusão intra-
MCPD de 0,04 nmol de NMDA também produziu inicialmente moderada ativação
locomotora em camundongos. Entretanto, é importante enfatizar que no Experimento
4 a exposição ao RET foi conduzida após o período inicial de ativação locomotora e
congelamento (em média dois minutos) induzidos pela droga. Na realidade, os
animais foram mantidos livres de qualquer manipulação ou estímulos por um período
de recuperação de 10 minutos, antes de iniciar a exposição ao predador. Embora o
controle dessa variável não tenha sido registrado de maneira sistemática, pode-se
inferir que esse período de repouso após tratamento intra-MCPD foi suficiente para
uma aparente recuperação do comportamento exploratório normal nos animais, de
maneira que variáveis inespecíficas, como a exaustão ou esgotamento físico,
mostraram-se improváveis.
Além disso, um dado importante quantificado durante o teste no RET sugere
que os animais que receberam NMDA expressaram resposta motora normal. Por
exemplo, a freqüência e a duração do comportamento de avaliação de risco, que é
usualmente expresso diante de uma atividade locomotora normal, no compartimento
túnel e superfície foram estatisticamente semelhantes ao grupo controle. Além disso,
o NMDA tendeu a aumentar a avaliação de risco no compartimento toca, sugerindo
que a redução nos cruzamentos entre compartimentos provocada pelo agonista
77
glutamatérgico possa estar associada aos seus efeitos ansiogênicos e não a uma
eventual alteração locomotora. Considerando-se que a avaliação de risco tem como
função principal buscar informações sobre a fonte de perigo, que nesse caso é o
predador (para uma revisão ver Blanchard et al, 2001), nossos resultados favorecem a
interpretação de um efeito proaversivo específico do agonista NMDA na MCPD sobre
o comportamento defensivo de camundongos submetidos ao confronto com o
predador no RET.
Existem evidências sugestivas de que a ação proaversiva dos aminoácidos
excitatórios (AAEs - sendo o glutamato o principal) está relacionada a ativação da
síntese de óxido nítrico (NO), possivelmente induzida quando são ativados os
receptores glutamatérgicos, principalmente NMDA (Garthwaite et al., 1988), mas
também AMPA, Cainato e metabotrópicos (Southam et.al., 1991; Okada, 1992). De
fato, estudos anteriores têm demonstrado que a ação glutamatérgica resultante da
estimulação do receptor NMDA se dá através de um aumento imediato do
fornecimento de NO (Garthwaite et al., 1989, Garthwaite, 1991). Segundo esses
autores, ao se estimular o receptor NMDA, ocorre rápida ativação da enzima NOS
neuronial (NOSn) cálcio dependente, devido ao imediato influxo de cálcio intracelular
através do canal iônico ativado, aumentando assim, os níveis de NO.
Inserido nesse contexto, os resultados descritos no Experimento 4
corroboram essas evidências, uma vez que a infusão prévia na MCPD do inibidor
seletivo da NOS neuronial, NPLA, reverteu de maneira consistente os efeitos
ansiogênicos provocados pela microinjeção do agonista glutamatérgico NMDA no
mesmo sítio. Em outras palavras, a inibição da formação do NO endógeno reverteu
os efeitos ansiogênicos desencadeados pela ativação de receptores NMDA,
confirmando a hipótese da ação proaversiva do glutamato via ativação da síntese de
78
óxido nítrico. Em concordância com os nossos achados, recente estudo conduzido
em nosso laboratório (Miguel & Nunes-de-Souza, 2006) revelou que a inibição da
síntese do NO com NPLA atenua a exibição de saltos, corridas e congelamento bem
como bloqueia a antinocicepcão induzidos pela injeção intra-MCPD de NMDA em
camundongos. No entanto, recente trabalho conduzido por Aguiar e colaboradores
(2006) contraria os resultados acima que indicam ser o efeito aversivo induzido pela
infusão do agonista de receptor NMDA na MCPD via produção de NO endógeno.
Nesse estudo a resposta de fuga induzida pela infusão intra-MCPD de NMDA de
ratos não foi atenuada pela microinjeção prévia, na mesma estrutura mesencefálica,
dos compostos L-NAME (inibidor na NOS), carboxi-PTIO (seqüestrador do NO) ou
ODQ (inibidor da guanilato ciclase), que conhecidamente interferem com a produção
ou com o mecanismo de ação do NO. Em parte, essas discrepâncias observadas
acima poderiam ser explicadas pelas diferentes espécies animais utilizadas nesses
estudos (camundongos x ratos). Estudos anteriores com outros modelos animais de
ansiedade têm revelado que camundongos apresentam um perfil comportamental
defensivo diferente daquele exibido por ratos (Jardim et al., 1999; Blanchard et al.,
2001; Carvalho-Netto & Nunes-de-Souza, 2004a). Tais diferenças podem estar
também associadas à ativação de distintos mecanismos neurobiológicos. No entanto,
é incontestável que pesquisas adicionais utilizando ferramentas moleculares seriam
importantes na tentativa de elucidar essas discrepâncias .
Por outro lado, vários estudos conduzidos pelo grupo de pesquisa liderado
pelo Professor Francisco Guimarães, do Departamento de Farmacologia da
Universidade de São Paulo, têm reforçado o envolvimento do NO com as ações
glutamatérgicas. Como exemplos, esses pesquisadores demonstraram que injeções
de AP-7 e NBQX, antagonistas de receptores glutamatérgicos NMDA e
79
AMPA/Cainato, respectivamente, inibem a resposta de fuga eliciada pela
microinjeção do doador de NO SIN-1 na MCPD de ratos (Moreira et al., 2004).
Além disso, a exposição de ratos ao seu predador natural, o gato, provoca a ativação
de neurônios NOS positivos (detectado por meio de histoquímica para NADPH-
diaforase - co-fator indispensável para NOS) em algumas estruturas, tais como os
núcleos pré-mamilar dorsal, dorsal da rafe e a MCPD (Beijamini & Guimarães,
2006). Cabe ressaltar também que resultados semelhantes indicando que a exposição
ao predador ativa a produção de NO na MCPD (detectado pelo aumento da citrulina,
um índice indireto da atividade da NOS), foram descritos anteriormente por
Chiavegatto e colaboradores (1998). Adicionalmente, num elegante experimento,
Beijamini e Guimarães (2006) demonstraram que a injeção i.c.v do antagonista
competitivo de receptores NMDA, AP-7, além de produzir uma atenuação das
respostas defensivas induzidas pelo confronto com o predador, reduziu também a
ativação desses neurônios NOS positivos na MCPD. Em outras palavras, a exposição
de ratos ao estímulo aversivo, o predador, induz a ativação da produção de NO na
MCPD (Chiavegatto et al., 1998) e essa ativação é inibida pelo pré-tratamento i.c.v
com AP-7 (Beijamini & Guimarães, 2006). De acordo com esses pesquisadores,
uma possível explicação para esse efeito seria de que o bloqueio dos receptores
NMDA pelo AP-7 prejudicaria a mediação do efeito excitatório do glutamato e,
conseqüentemente, a ativação da NOS.
De modo interessante, esse último estudo citado sugere que os efeitos
ansiogênicos induzidos por estímulos naturalmente aversivos (predador) dependem,
pelo menos em parte, da produção de óxido nítrico na MCP via ativação dos
receptores NMDA pelo glutamato endógeno. De fato, concordando com esses
achados, os resultados do presente estudo demonstram que a infusão intra-MCPD do
80
inibidor seletivo da NOS neuronial produziu, por si só (NPLA+salina), um marcante
efeito ansiolítico em camundongos expostos ao predador natural. Os animais que
tiveram a produção de óxido nítrico na MCPD prejudicada pelo tratamento com
NPLA exibiram marcante redução no comportamento de esquiva ao predador
(aumento no tempo de permanência na superfície e em contato com a tela de arame
onde estava o predador). Fortalecendo esse efeito antiaversivo, esses animais
também tiveram uma redução significativa no congelamento e no tempo total do
comportamento de avaliação de risco exibido no compartimento toca. Cabe
mencionar, que numa análise relativa em relação ao tempo que os animais gastaram
nos compartimentos, o comportamento de avaliação de risco foi atenuado tanto na
toca como na superfície pelo tratamento com NPLA. De maneira consistente, esses
achados confirmam a redução geral do comportamento de avaliação de risco,
favorecendo assim, a interpretação de um efeito antiaversivo do inibidor da NOSn.
Embora existam algumas evidências que relatam que alguns inibidores da NOS em
certas doses causem prejuízo na atividade motora (Del Bel et al., 1998, 2002 e
2004), nossos resultados não apontam para nenhum efeito dessa natureza. Por
exemplo, o grupo de animais tratado com NPLA apresentou freqüência de
cruzamentos entre os compartimentos estatisticamente semelhante ao grupo controle,
o que sugere uma atividade locomotora normal.
Ainda, cabe mencionar que inúmeros estudos com injeções sistêmicas de
inibidores seletivos e não seletivos da NOS em ratos e camundongos submetidos a
modelos de ansiedade sugerem que o NO facilita as reações de defesa (para uma
revisão ver Guimarães et al., 2005). É importante mencionar também que existe um
considerável número de trabalhos que apontam para um papel ansiolítico do óxido
nítrico (para uma revisão ver Guimarães et al., 2005). Entretanto, resultados mais
81
consistentes têm sido relatados a partir de estudos com injeções intra-encefálica de
compostos que alteram a função do NO em estruturas específicas (para uma revisão
ver Guimarães et al., 2005). Recentemente, a região na qual o papel do NO tem
recebido maior atenção é a MCPD. Exemplificando, Guimarães e colaboradores
(1994) observaram um efeito ansiolítico do L-NOARG (L-nitro-arginina) e L-
NAME (L-nitro arginina metil éster), inibidores não seletivos da NOS,
microinjetados na MCPD de ratos submetidos ao LCE. Na tentativa de investigar o
envolvimento do NO na ansiedade induzida pela exposição ao LCE em
camundongos, recentemente foi testado em nosso laboratório os efeitos da
administração intra-MCPD de L-NAME (Cabral et al, 2003). De modo semelhante
ao observado em ratos (Guimarães et al, 1994), a inibição da NOS atenuou os
principais índices de ansiedade (% entradas e de tempo nos braços abertos) sem
afetar a atividade locomotora (entradas nos braços fechados). Além disso, Guimarães
e colaboradores (2005) também relataram que a microinjeção intra-MCPD de um
seqüestrador de NO (carboxi-PTIO) ou de um inibidor da guanilato ciclase sensível
ao NO (ODQ) induziu efeito ansiolítico em animais expostos ao LCE.
Em conjunto, os resultados da segunda etapa do presente estudo e as
expressivas evidências discutidas acima confirmam um compartilhamento de
funções dos sistemas glutamatérgico e nitrérgico nas reações de defesas organizadas
pela MCPD. Em especial, o presente estudo sugere um importante papel do
complexo glutamato/NMDA/NO na MCP na elaboração e expressão de
comportamentos defensivos específicos, como a esquiva e a avaliação de risco,
considerados mais sutis e elaborados (Carobrez et al, 2001; McNaughton & Corr,
2004). Nessa direção, nossos achados fortacelem a teoria de McNaughton e Corr
(2004) das vias neurais que comandam as reações de defesa. De acordo com esses
82
pesquisadores, estruturas anatomicamente mais caudais, como a MCP, além de
coordenarem e expressarem comportamentos intempestivos do tipo fuga e luta
relacionados ao estado de medo, também participam, juntamente com estruturas
prosencefálicas (ex. córtex pré-frontal, sistema septo-hipocampal e amígdala), do
controle de comportamentos defensivos mais elaborados e orientados relacionados à
ansiedade.
No entanto, merece uma breve discussão, no presente estudo, os efeitos do
inibidor seletivo da NOSn per se (NPLA + Salina) na redução do medo e da
ansiedade em camundongos avaliados no RET. De acordo com a vasta maioria das
evidências relatadas até o momento, é plausível admitir que esses efeitos do NPLA
representam uma inibição da formação do NO, por sua vez estimulado por
mecanismos glutamatérgicos endógenos, via ativação de receptores NMDA. De fato,
tem sido sugerido que a ativação do receptor NMDA é a principal condição para
produção de NO no SNC (Esplugues, 2002) e que esses dois sistemas
(glutamatérgico via NMDA e nitrérgico) funcionam por mecanismos regulatórios
recíprocos (Lin et al., 2000), onde ambos controlam a liberação de cada um. Mesmo
assim, não pode ser descartada a hipótese de que os efeitos ansiolíticos do NPLA per
se ocorram, pelo menos em parte, devido à inibição da formação do NO produzido
por uma via distinta daquela do glutamato/NMDA/NO. Apoiando essa hipótese,
alguns estudos têm demonstrado que a formação de NO também ocorre após a
ativação de outros receptores glutamatérgicos ionotrópicos, como os suptipos AMPA
e cainato, e de receptores metabotrópicos (Southam et al., 1991; Okada, 1992). Além
disso, outros neurotransmissores ou neuromoduladores parecem estar envolvidos na
formação de NO, incluindo a serotonina, bradicinina, endotelina, acetilcolina e
noradrenalina (Reiser, 1990a; 1990b). Portanto, alguns estudos adicionais devem ser
83
conduzidos visando contribuir para elucidação dos efeitos do NPLA no presente
estudo. Por exemplo, avaliar os efeitos intra-MCPD de um antagonista NMDA,
como o AP-7, nas mesmas condições (RET) e compará-los com os do NPLA. Assim,
pode ser inferido, caso o perfil das respostas comportamentais seja semelhante, que o
efeito ansiolítico do NPLA por si só no RET ocorre principalmente pela inibição do
NO da via glutamato/NMDA/NO.
Por outro lado, não deve ser rejeitada a hipótese que outros
neurotransmissores estejam participando da modulação dessas respostas defensivas
elaboradas pela MCPD frente ao predador. De fato, vários neurotransmissores têm
sido sugeridos na gênese e controle das reações de defesa na MCP como GABA,
serotonina, colecistoquinina e neuropeptídeos como os opiódes e o fator liberador de
corticotrofina (CRF) (para uma revisão ver Graeff, 1994; Behbehani, 1995). Embora
os resultados do presente estudo indiquem uma consistente participação intrínseca
dos sistemas glutamatérgicos e nitrérgicos, existem evidências que propõem que esse
sistema complementar esteja envolvido no controle e liberação de outros
neurotransmissores. Por exemplo, estudos indicam ser o NO um mensageiro
retrógrado (difunde-se da célula pós-sináptica para a pré-sináptica) que provoca
retro-alimentação positiva na liberação de glutamato, através de um mecanismo
GMPc dependente (Nowicky & Bindman, 1993). Além de sua ação sobre o
glutamato, o NO parece estar também envolvido direta ou indiretamente (via
glutamato) na liberação de outros neurotransmissores, como o GABA (ácido gama-
amino-butírico), acetilcolina, serotonina, noradrenalina, dopamina, histamina,
purinas e neuropeptídeos, como o CRF (Prast & Philippu, 2001). Inserido nesse
contexto, recente estudo in vitro demonstrou que a ativação do receptor NMDA em
culturas de neurônios oriundos da amígdala de ratos provoca liberação do
84
neurotransmissor CRF de maneira dose dependente e que o bloqueio desses
receptores com o antagonista NMDA, AP-5, reverte essa liberação de CRF (Cratty &
Birkle, 1999). Resultado semelhante, utilizando cultura de neurônios hipotalâmicos,
foi descrito anteriormente por Joanny e colaboradores (1997). Com base em estudos
farmacológicos utilizando modelos animais de ansiedade, Cratty e Birkle (1999)
sugeriram que os efeitos ansiolíticos obtidos com uso de antagonistas NMDA,
seriam pelo menos em parte, devido à inibição da liberação de CRF. Dando apoio a
essa hipótese, um recente estudo revelou que os efeitos ansiogênicos induzidos pelo
tratamento sistêmico com NMDA são atenuados pelo bloqueio dos receptores do
subtipo CRF1 na amígdala de ratos expostos ao labirinto em cruz elevado
(Wieronska et al., 2003). Portanto, diante das evidências acima que indicam que a
ativação glutamatérgica provoca a liberação de CRF, é plausível supor que as
respostas defensivas frente ao predador sejam também moduladas pela transmissão
CRFérgica na MCP.
Nesse sentido, como continuidade da segunda etapa, o presente estudo teve
como propósito investigar se o CRF participa das reações de defesa inatas
coordenadas pela MCPD. Para essa finalidade avaliamos os efeitos do peptídeo
ovine CRF (oCRF), microinjetado na MCPD, sobre a respostas defensivas de
camundongos em confronto com o predador no MDTB e no RET. Nossos resultados
demonstraram que este agonista não seletivo de receptores CRF1 e CRF2 alterou
apenas alguns comportamentos defensivos de camundongos no procedimento do
MDTB, porém, o fez de maneira consistente. Por exemplo, a dose mais alta do
composto oCRF aumentou a distância de esquiva de camundongos durante a
aproximação do predador no teste de esquiva ao predador. Ainda, quando os animais
foram submetidos ao contato forçado com o predador, ambas as doses do oCRF
85
produziram aumentos da freqüência de saltos defensivos (visando diminuir o contato
com o predador), enquanto reduziram a postura de levantar defensivo nessa tarefa.
Esse padrão de resposta indica que oCRF intra-MCPD alterou particularmente
alguns comportamentos que visam amenizar o confronto direto ou contato com
predador, ou seja, aqueles relacionados a esquiva.
Embora com um moderado efeito, nossos dados estão em concordância com
uma ampla literatura que mostra que a administração i.c.v de CRF aumenta as
respostas defensivas em vários modelos animais de ansiedade (ex. resposta de
sobressalto potencializada pelo medo, aquisição de medo condicionado e indução de
congelamento por choque) (para uma revisão ver Griebel, 1999). Além disso, a
microinjeção desse peptídeo em estruturas encefálicas específicas, tais como
amígdala, locus coeruleus e hipotálamo paraventricular, favorece a expressão de
comportamentos defensivos relacionados ao medo e ansiedade (para uma revisão ver
Griebel, 1999). Na mesma linha de argumentação, a infusão intra-MCPD de CRF
potencializa as reações de defesa de ratos avaliados no labirinto em cruz elevado
(Martins et al., 1997).
Diferentemente da grande parte dos modelos de medo e ansiedade, o MDTB
envolve confronto direto da presa (camundongo) com o predador (rato anestesiado
seguro pelo experimentador), no qual, inicialmente, o predador é lentamente
aproximado da presa, em seguida levado a persegui-la e por fim a tocá-la. Em tal
procedimento, o qual é composto por várias fases, são remotas as possibilidades da
presa de evitar o predador, de forma que esse elevado nível de ameaça e estresse elicia
respostas defensivas extremamente intensas. Assim, uma possível explicação para
moderado/fraco efeito do composto oCRF avaliado no MDTB seria devido ao próprio
86
teste, que por si só teria eliciado um nível de ameaça/defesa teto onde o efeito do
composto não pôde ser detectado claramente.
Em recente estudo, Yang e colaboradores (2006) mostraram que a infusão
i.c.v. do composto oCRF intensificou de maneira consistente a maioria dos
comportamentos defensivos expressados por camundongos no MDTB. Por exemplo,
durante o procedimento foram caracterizados aumentos nos comportamentos de
avaliação de risco, congelamento, fuga, esquiva e saltos defensivos. Tal resultado
condiz com a viabilidade de uma intensificação das reações de defesa avaliadas no
MDTB. No entanto, os discrepantes resultados relatados entre o presente estudo e
aqueles conduzidos por Yang e colaboradores (2006) podem estar relacionados às
diferentes linhagens de camundongos utilizadas (Swiss-Webster x CD1), diferentes
sítios de injeção (intra-MCPD x i.c.v), bem como a substancial diferença nas faixas de
doses de oCRF utilizadas (30-100ng x 450-950ng). Com relação à faixa de dose,
parece razoável sugerir que doses mais elevadas de oCRF intra-MCPD poderiam
produzir resultados ansiogênicos mais expressivos no MDTB.
Por outro lado, o possível efeito teto sugerido acima para o MDTB é
compatível com os resultados obtidos com o oCRF no RET. O RET (ver Introdução:
Modelos Animais de Ansiedade/Medo), diferentemente do MDTB, permite a presa
(camundongo) escolher aproximar ou esquivar-se do estímulo aversivo, o rato, de
modo que o nível da intensidade da ameaça/estresse é menor que aquela
experimentada pela presa no MDTB. De fato, a injeção intra-MCPD de oCRF
intensificou de maneira consistente a situação ansiogênica do RET. Os animais
tratados aumentaram o tempo gasto na toca e diminuíram o tempo no túnel, na
superfície de exposição e em contato com a tela de arame que separava o camundongo
do predador. Esses achados apontam para um efeito específico na resposta de esquiva
87
ao predador. Vale enfatizar as reduções da freqüência e duração de avaliação de
risco no túnel, indicando também um efeito ansiogênico. No entanto, quando
analisado em porcentagem relativa ao tempo de permanência no túnel, esse
comportamento não foi significativamente (p=0,25) aumentado quando comparado ao
grupo controle, enfraquecendo a hipótese de que a droga tenha alterado esse
comportamento. Embora o oCRF tenha reduzido o número de transições entre os
compartimentos, esse resultado não deve ser considerado como um efeito intrínseco
da droga na atividade motora, uma vez que não foram constatadas alterações da
função locomotora medidas durante o pré-teste do MDTB. Em relação ao
comportamento de congelamento, embora pareça estar aumentado para os animais
que receberam microinjeção de oCRF, não foi significativamente diferente quando
comparado aos animais que receberam salina intra-MCPD.
As alterações provocadas pelo tratamento com oCRF intra-MCPD no RET
sugerem que ativação do sistema CRF nessa estrutura intensifica os comportamentos
antipredador, principalmente aqueles relacionados a esquiva do predador. Esses
resultados corroboram os obtidos com o oCRF no MDTB. Na bateria de teste, os
animais tratados com oCRF aumentaram a distância de esquiva diante da
aproximação do predador. Nossos resultados também corroboram aqueles de Martins
e colaboradores (1997), que demonstraram que a infusão de CRF intra-MCPD
aumenta a esquiva dos braços abertos de ratos testados no LCE. Nesse estudo a
infusão intra-MCPD de CRF reduziu a porcentagem de entrada e tempo gasto nos
braços abertos de ratos submetidos ao LCE (índice de ansiedade), sem alterar o
número de entrada nos braços fechados, uma medida geralmente usada para avaliar
índice geral da atividade locomotora (Rodgers & Jonhson, 1995).
88
Recentemente, D. C. Blanchard, M. Yang e R. J. Blanchard (comunicação
oral, 2004) demonstraram que esses comportamentos antipredador expressos no RET
são alterados pela administração sistêmica de drogas, diazepam e buspirona,
clinicamente comprovados para o tratamento dos transtornos de ansiedade. Nesse
estudo, os compostos com propriedades ansiolíticas atenuaram significativamente as
medidas espaço-temporais e etológicas. Dessa maneira, seria razoável sugerir um
envolvimento do sistema CRF na MCP na organização e expressão de
comportamentos defensivos relacionados à ansiedade. De fato, um envolvimento local
de receptores CRF no estado de ansiedade tem sido confirmado por Martins e
colaboradores (2000). Esses pesquisadores demonstraram que a administração intra-
MCPD do antagonista competitivo de receptores CRF, CRF
(9-41)
α-helical, atenuou as
respostas de ansiedade no LCE em ratos previamente estressados pela imobilização
forçada. Portanto, esses achados indicam uma específica participação da
neurotransmissão CRFérgica na MCPD na modulação de reações de defesa
relacionadas a ansiedade. No entanto, essa participação parece ser de menor
magnitude que aquela observada para o sistema glutamato/NMDA/NO, visto que a
ativação dos receptores CRF na MCPD não alterou significativamente, em nenhum
momento do procedimento do RET, o principal comportamento relacionado à
ansiedade –a avaliação de risco.
Por outro lado, os resultados do presente estudo também apontam para a
participação do sistema CRFérgico em respostas mais intempestivas coordenadas pela
MCPD. Por exemplo, quando confrontados pelo predador no teste do contato forçado,
camundongos tratados aumentaram as tentativas de escape (saltos defensivos). Cabe
salientar que várias evidências da literatura têm proposto que essa estratégia
defensiva, juntamente com a resposta de fuga expressada em situações de perigo
89
proximal, é relacionada ao estado de medo, ou, mais especificamente ao pânico
(Blanchard & Blanchard, 1988; Graeff & Deakin, 1991; Graeff, 1994; Blanchard et
al., 2001; McNaughton & Corr, 2004). Assim, com base nessas evidências poder-se-ia
sugerir também uma modulação CRFérgica na matéria cinzenta periaquedutal para os
comportamentos que são relacionados aos ataques de pânico. Em apoio a essa
hipótese, estudos com modelos animais e clínicos têm sugerido um envolvimento da
transmissão CRFérgica na gênese dos ataques de pânicos (para uma revisão ver
Risbrough & Stein, 2006). Por fim, os resultados do Experimento 5 sugerem a
participação da transmissão CRFérgica na MCPD tanto na modulação de estratégias
defensivas mais intempestivas do tipo fuga e luta (aumento dos saltos defensivos no
MDTB) quanto naquelas mais elaboradas e direcionadas (aumento de esquiva ao
predador) relacionadas a ansiedade.
Considerações finais
Os resultados da primeira etapa do presente estudo indicam que a fuga
desencadeada imediatamente após a infusão do ácido DLH na MCPD é a resposta
predominante de camundongos. Entretanto, esta resposta comportamental depende da
disponibilidade de espaço, sendo que a maioria dos saltos observados na arena está
intimamente relacionada ao contato tátil do animal com as paredes do aparato. Além
disso, essas respostas comportamentais (fuga explosiva e saltos) induzidas pela
estimulação química parecem não representar o padrão natural de respostas adaptadas
ao ambiente, tal como acontece com os animais frente a uma ameaça proximal (como
um predador). De fato, durante o efeito da estimulação química, os camundongos
exibiram um claro déficit na estratégia antipredador. Portanto, o presente estudo
indica a necessidade de análises e interpretações mais rigorosas e cautelosas para a
90
determinação de analogias entre comportamentos eliciados artificialmente pela
estimulação de uma dada estrutura cerebral com aqueles eliciados por estímulos
naturalmente aversivos.
Por outro lado, a segunda etapa do presente estudo, utilizando estímulo
natural na evocação de estados emocionais e comportamentos defensivos
relacionados à espécie, destaca a participação dos sistemas glutamatérgicos,
nitrérgicos e CRFérgico localizados na matéria cinzenta periaquedutal na
modulação de diferentes estratégias defensivas (ex. esquiva, avaliação de risco e
saltos) de camundongos submetidos ao confronto com o predador.
Em conclusão, nossos resultados corroboram a hipótese de que a MPCD,
uma estrutura anatomicamente mais caudal, além de estar envolvida na organização
e expressão de comportamentos intempestivos do tipo fuga e luta, os quais são
relacionados ao estado de medo, também participa, juntamente com estruturas
prosencefálicas (ex. córtex pré-frontal, sistema septo-hipocampal e amígdala), do
controle de comportamentos defensivos mais elaborados e orientados relacionados à
ansiedade (McNaughton & Corr 2004).
8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
91
ADAMS DB. Brain mechanisms for offense, defense, and submission. The
Behavioral and Brain Sciences 2: 201-241, 1979.
AGUIAR DC, MOREIRA FA, GUIMARÃES FS. Flight reactions induced by
injection of glutamate N-methyl-d-aspartate receptor agonist into the rat dorsolateral
periaqueductal gray are not dependent on endogenous nitric oxide. Pharmacol
Biochem Behav 83(2):296-301, 2006.
ARBORELIUS L, OWENS MJ, PLOTSKY PM, NEMEROFF CB. The role of
corticotropin-releasing factor in depression and anxiety disorders. J Endocrinol 60:1-
12, 1999.
BALDWIN HA, RASSNICK S, RIVIER J, KOOB GF, BRITTON KT. CRF
antagonist reverses the "anxiogenic" response to ethanol withdrawal in the rat.
Psychopharmacol (Berl) 103(2):227-32, 1991.
BANDLER R, DEPAULIS A, VERGNES M. Identification of midbrain neurones
mediating defensive behavior in the rat by microinjections of excitatory amino acids.
Behav Brain Res 15: 107–19, 1985.
BANDLER R, DEPAULIS A. Elicitation of intraspecific defence reactions in the rat
from midbrain periaqueductal grey by microinjection of kainic acid, without
neurotoxic effects. Neurosci Letters 88:291-296, 1988.
BANDLER R, CARRIVE P. Integrated defense reaction elicited by excitatory amino
acid in the midbrain periaquedutal gray region of the unrestrained cat. Brain Res 439,
(1-2): 95-106, 1988.
BANDLER R, CARRIVE P, ZHANG SP. Integration of somatic autonomic reactions
within the midbrain periaqueductal gray: Viscerotopic, somatotopic and functional
organization. Prog Brain Res 87:269-305, 1991.
BANDLER R, DEPAULIS A. Midbrain periaqueductal gray control of defensive
behavior in the cat and the rat. In: DEPAULIS A, BANDLER R. The midbrain
periaqueductal gray matter. Plenun Press, New York pp-175-197, 1991.
BANDLER R, SHIPLEY MT. columnar organization in the midbrain periaqueductal
gray: modulates for emotional expression? Trends Neurosci 17:379-389, 1994.
BANDLER R, PRICE JL, KEAY KA. Brain mediation of active and passive
emotional coping. Prog Brain Res
122:333-349, 2000.
92
BECKETT SR, MARSDEN CA, MARSHALL PW. Microinjections of DLH into the
rat periaqueductal gray matter induce a dose-dependent defense response attenuatted
by midazolam. Br J Pharmacol 101: p.585, 1990.
BECKETT SR, LAWRENCE AJ, MARSDEN CA, MARSHALL PW. Attenuation of
chemically induced defence response by 5-HT1 receptor agonists administered into
the periaqueductal gray. Psychopharmacol (Berl) 108(1-2):110-114, 1992.
BEHBEHANI MM. Functional characteristics of the midbrain periaqueductal gray.
Progress Neurobiol. 46:575-605, 1995.
BEITZ AJ. Central Gray. In:Paxinos G. The human nervous system. Academic Press,
New York 1990.
BEIJAMINI V, GUIMARÃES FS. c-Fos expression increase in NADPH-diaphorase
positive neurons after exposure to a live cat. Behav Brain Res 170(1):52-61, 2006.
BERGINK V, VAN MEGEN H J G M, WESTENBERG HGM. Glutamate and
Anxiety. Eur Neuropharmacol 14(3):175-183, 2004.
BERTOGLIO LJ, ANZINI C, LINO-DE-OLIVEIRA C, CAROBREZ AP. Enhanced
dorsolateral periaqueductal gray activity counteracts the anxiolytic response to
midazolam on the elevated plus-maze Trial 2 in rats. Behav brain Res
162(1):99-107,
2005.
BITTENCOURT AS, NAKAMURA-PALACIOS EM, MAUAD H, TUFIK S,
SCHENBERG LC. Organization of electrically and chemically evoked defensive
behaviors within the deeper collicular layers as compared to periaqueductal gray
matter of the rat. Neurosci 133:873-892, 2005.
BLANCHARD DC, WILLIAMS G, LEE EMC, BLANCHARD RJ. Taming wild
Rattus novergicus by lesions of the mesencephalic central gray. Physiol psychol
9:157-63, 1981.
BLANCHARD RJ, FLANNELLY KJ, BLANCHARD DC. Defensive behavior of
laboratory and wild Rattus norvegicus. J Comp Psychol 100(2):101-107, 1986.
BLANCHARD RJ, BLANCHARD DC. Ethoexperimental approaches to the biology
of emotion. Annual Rev of Psychol 39: 43-68, 1988.
93
BLANCHARD DC, BLANCHARD RJ, RODGERS RJ. Pharmacological and neural
control of anti-predator defense in the rat. Aggress Behav 16: 165-176, 1990.
BLANCHARD RJ, YUDKO EB, RODGERS RJ, BLANCHARD DC. Defense
system psychopharmacology: an ethological approach to the pharmacology of fear
and anxiety. Behav Brain Res 58: 155-165, 1993.
BLANCHARD RJ, PARMIGIANI S, BJORNSON C, MASUDA C, WEISS SM,
BLANCHARD DC. Antipredator behavior od Swiss-Webster mice in a visible
burrow system. Agress Behav. 21:123-136, 1995.
BLANCHARD DC. Stimulus and environmental control of defense behaviors. In:
BOUTON M, FANSELOW M. eds. The functional behaviorism of Robert C. Bolles:
Learning, motivation and cognition. Washington, DC: American Psychological
Association p. 283-305, 1997.
BLANCHARD RJ, GRIEBEL G, HENRIE JA, BLANCHARD DC. Differentiation
of anxiolytic and panicolytic drugs by effects on rat and mouse defense test batteries.
Neurosci Biobehav Rev 21: 783-789, 1997.
BLANCHARD RJ, HEBERT MA, FERRARI P, PALANZA P, FIGUEIRA R,
BLANCHARD DC, PARMIGIANI S. Defensive behaviors in wild and laboratory
(Swiss) mice: the mouse defense test battery. Physiol Behav 65(2):201-209, 1998
BLANCHARD RJ, KAAWALOA JN, HEBERT MA, BLANCHARD DC. Cocaine
produces panic-like flight responses in mice in the mouse defense test battery.
Pharmacol Bioch Behav 64(3):523-528, 1999.
BLANCHARD DC, GRIEBEL G, BLANCHARD RJ. Mouse defense behaviors:
pharmacological and behavioral assays for anxiety and panic. Neurosci Biobehav Rev
25:205-218, 2001.
BLANCHARD DC, GRIEBEL G, BLANCHARD RJ. Mouse defense behaviors:
pharmacological and behavioral assays for anxiety and panic. Eur J Pharmacol
463(1-3):97-116, 2003.
BLANCHARD DC, YANG M, MARKHAM C, FARROHKI CF, PENTKOWSKI
NS, BLANCHARD RJ, GRIEBEL G. Diazepam and buspirone effects in c57bl/6j
mice in the rat exposure test (ret) Program No. 784.3. 2004 Abstract Viewer/Itinerary
Planner. Washington, DC: Society for Neuroscience, 2004. Online.
94
BORELLI KG. Distribuição da proteína Fos no encéfalo durante estados aversivos
induzidos pela inibição GABAérgica na substância periaquedutal dorsolateral e no
colículo inferior de ratos [Tese de doutorado]. Ribeirão Preto: Faculdade de Filosofia
Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2006.
BRANDÃO ML, ANSELONI VZ, PANDOSSIO JE, DE ARAUJO JE, CASTILHO
VM. Neurochemical mechanisms of the defensive behavior in the dorsol midbrain.
Neurosci Biobehav Rev 23:863-875, 1999.
CABRAL JCP, CORNÉLIO AM, CARVALHO-NETTO EF, NUNES-DE-SOUZA,
RL. A dor reverte o efeito ansiolítico do L-NAME injetado na Matéria Cinzenta
Periaquedutal (MCP) de camundongos. Apresentado na XVIII Reunião Anual da
Federação de Sociedades de Biologia Experimental – Fesbe, 01.06.062., 2003.
CANTERAS NS, SWANSON LW. The dorsal premammillary nucleus: an unusual
component of the mammillary body. Proc Nalt Acad Sci USA 89:10089-10093, 1992.
CANTERAS NS, CHIAVEGATTO S, RIBEIRO DO VALLE LE, SWANSON LW.
Severe reduction of defensive behavior to predator by discrete hypothalamic chemical
lesions. Brain Res Bull 44:297-305, 1997.
CANTERAS NS, GOTO M. Fos-like imunoreactivity in the periaqueductal gray of
rats exposed to a natural predator, Neuroreport 10:413–418, 1999.
CANTERAS NS. The medial hypothalamic defensive system: hodological
organization and functional implications. Pharmacol Biochem Behav 71:481-491,
2002.
CAROBREZ AP, TEIXEIRA KV, GRAEFF FG. Modulation of defensive behavior
by periaqueductal gray NMDA/glycine-B receptor. Neurosci Biobehav Rev 25(7-
8):697-709, 2001.
CAROBREZ AP. Transmissão pelo glutamato como alvo molecular na ansiedade.
Rev Bras Psiquiatr 25(supl II):52-58, 2003.
CARRIVE P. The periaqueductal gray and defensive behavior: functional significance
and neuronal organization. Behav Brain Res 58:27-47,1993.
CARVALHO NETTO EF, NUNES-DE-SOUZA RL. Use of the elevated T-maze to
study anxiety in mice. Behav Brain Res 148(1-2): 119-132, 2004a.
95
CARVALHO-NETTO EF, NUNES-DE-SOUZA RL. Behavioral responses followed
by chemical stimulation of the midbrain periaqueductal gray in mice. Internat Behav
Neurosci Soc. (Personal communication) 13: 49, 2004b.
CAZALA P, GARRIGUES AM. Differential aversive effects of mesencephalic
central gray stimulation in two inbred strains of mice. Behav Neural Biol. 32(1):114-
120, 1981.
CHALMERS DT, LOVENBERG TW, DE SOUZA EB. Localization of novel
corticotropin-releasing factor receptor (CRF2) mRNA expression to specific
subcortical nuclei in rat brain: comparison with CRF1 receptor mRNA expression. J
Neurosci 15:6340-6350, 1995.
CHIAVEGATTO S, SCAVONE C, CANTERAS NS. Nitric oxide synthase activity
in the dorsal periaqueductal gray of rats expressing innate fear responses. Neuroreport
9 (4):571-576, 1998.
COLLINGRIDGE GL, LESTER RA. Excitatory amino acid receptors in the
vertebrate central nervous system. Pharmacol Rev
41(2):143-210 , 1989
CRATTY MS, BIRKLE DL. N-methyl-D-aspartate (NMDA)-mediated
corticotropin-releasing factor (CRF) release in cultured rat amygdala neurons.
Peptides 20(1):93-100, 1999.
DANYSZ W, ESSMANN U, BRESINK I, WILK R. Glutamate antagonists have
different effects on spontaneous locomotor activity in rats. Pharmacol Biochem Behav
48(1):111-118, 1994.
DAWASON TM, SYNDER SH. Gases as biological messengers: nitric oxide and
carbon monoxide in the brain. J Neurosci 14(9):5147-159, 1994.
DEAKIN JFW, GRAEFF FG. 5HT and mechanisms of defence. J Phychopharmacol
5:305-315, 1991.
DEL BEL EA, SILVA CA, GUIMARÃES FS. Catalepsy induced by nitric oxide
synthase inhibitors. General Pharmacol 30:245-248, 1998.
DEL BEL EA, SOUZA AS, GUIMARÃES FS, SILVA CA, NUCCI-DA-SILVA LP.
Motor effects of acute and chronic inhibition of nitric oxide synthesis in mice.
Psychopharmacol 161:32-37, 2002
96
DEL BEL EA, SILVA CA, GUIMARÃES FS, BERMUDEZ-ECHEVERRY M.
Catalepsy induced by intra-striatal administration of nitric oxide synthase inhibitors in
rats. Eur J Pharmacol 485:175-181, 2004.
DE CATANZARO D. Effect of predator exposure upon early pregnancy in mice.
Physiol Behav 43:691-696, 1988.
DE OLIVEIRA CL, DEL BEL EA, GUIMARÃES FS. Effects of L-NOARG on plus
maze performance in rats. Pharmacol Biochem Behav 56(1):55-59, 1997.
DE OLIVEIRA RW, DEL BEL EA, GUIMARÃES FS. Behavioral and c-fos
expression changes induced by nitric oxide donors microinjected into the dorsal
periaqueductal gray. Brain Res Bull 51(6):457-464, 2000.
DE OLIVEIRA RW, DEL BEL EA, GUIMARÃES FS. Effects of excitatory amino
acids and nitric oxide on flight behavior elicited from the dorsolateral periaquedutal
gray. Neurosci Biobehav Rev 25(1-2):679-685, 2001.
DEPAULIS A, BANDLER R, VERGNES M. Characterization of pretentorial
periaqueductal gray matter neurons mediating intraspecific defensive behaviors in the
rat by microinjections of kainic acid. Brain Res 486:121-132, 1989.
DE SOUZA EB. Corticotropin-releasing factor receptors in the rat central nervous
system: characterization and regional distribution. J Neurosci 7:88-100, 1987.
DE SOUZA EB. Corticotropin-releasing factor receptors: Physiology, pharmacology,
biochemistry and role in central nervous system and immune disorders.
Psychoneuroendocrinol 20:789-819, 1995.
DIELENBERG RA, HUNT GE, MCGREGOR IS. “When a rat smells a cat”: the
distribution of Fos immunoreactivity in rat brain following exposure to a predatory
odor, Neurosci 104:1085–1097, 2001.
DUNN RW, CORBETT R, FIELDING S. Effects of 5-HT1A receptor agonists and
NMDA receptor antagonists in the social interaction test and the elevated plus maze.
Eur. J Pharmacol 169:1–10, 1989.
DUNN AJ, BERRIDGE CW. Physiological and behavioral responses to
corticotropin-releasing factor administration: is CRF a mediator of anxiety or stress
responses? Brain Res Rev 15:71-100, 1990.
97
ESPLUGUES J. NO as a signalling molecule in the nervous system, Br J Pharmacol.
135:1079–1095, 2002.
FAGG GE, FOSTER AC, GANONG AH. Excitatory amino acid synaptic mechanism
and neurological function. Trends Pharmacol Sci 7:357-363, 1986.
FERNANDEZ DE MOLINA A, HUNSPERGER RW. Central representation of
affective reactions in forebrain and brain stem: Electrical stimulation of amygdala,
stria terminalis, and adjacent structures. J Physiol 145(2):251-265, 1959.
GALLY JA, MONTAGUE PR, REEKE GNJR, EDELMAN GM. The NO
hypothesis: possible effects of a short-lived, rapidly diffusible signal in the
development and function of the nervous system. Proc Natl Acad Sci 87:3547-3551,
1990.
GARTHWAITE J, CHARLES SL, CHESS-WILLIAMS R. Endothelium-derived
relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests role as intercellular
messenger in the brain. Nature 336:385-388, 1988.
GARTHWAITE J, GARTHWAITE G, PALMER RM, MONCADA S. NMDA
receptor activation induces nitric oxide synthesis from arginine in rat brain slices. Eur
J Pharmacol 172(4-5):413-416, 1989
GARTHWAITE, J. Glutamate, nitric oxide and cell-cell signalling in the nervous
system. Trends Neurosci 14(2):60-67,1991.
GOODCHILD AK, DAMPNEY RA, BANDLER R. A method for evoking
physiological responses by stimulation of cell bodies, but not axons of passage, within
localized regions of the central nervous system. J Neurosci Methods 6(4):351-363,
1982.
GRAY JA. The neuropsychology of anxiety: an enquiry into the functions of the
septo-hippocampal system. 1th ed. Oxford University Press, London, 1982.
GRAY JA, MCNAUGHTON N. The neuropsychology of anxiety: an enquiry into
the functions of the septo-hippocampal system. 2th ed. Oxford University Press,
London, 2000.
GRAEFF FG. Minor tranquilizers and brain defense system. Braz J Med Biol Res
14:239-265, 1981.
98
GRAEFF FG. Brain defence systems and anxiety. In: Roth, M.; Burrows, G. D.;
Noyes, R. (eds.) Handbook of anxiety, Vol. 3, Elsevier Science Publishers,
Amsterdan, pp. 307-354, 1990.
GRAEFF FG. Neuroanatomy and neurotransmitter regulation of defensive behaviors
and related emotions in mammals. Braz J Med Biol Res 27(4):811-829, 1994.
GRAEFF F G, ZANGROSSI JR H. Animal models of anxiety. In: D’HAENEN.;
DEN BOER, J. A.; WILLER, P. Eds. Biolog Psychiatr. John Wiley & Sons Ltd.
2002. p. 1-15.
GRAEFF FG. Serotonin, the periaqueductal gray and panic. Neurosci Biobehav Rev
28:239-259, 2004.
GRIEBEL G, PERRAULT G, SANGER DJ. Characterization of the behavioral
profile of the non-peptide CRF receptor antagonist CP-154,526 in anxiety models in
rodents. Comparison with diazepam and buspirone. Psychopharmacol 138:55-66,
1998.
GRIEBEL G. Is there a future for neuropeptide receptor ligands in the treatment of
anxiety disorders? Pharmacol Ther 82(1):1-61, 1999.
GRIFFITHS R. Sulphur-containing excitatory amino acids. In:KROGSGAARD-
LARSEN P, HANSEN JJ. (eds.)Excitatory Amino Acid receptor:Design of agonist
and antagonist. Ellis Horwood, London, pp. 163-181, 1991.
GUIMARÃES FS, CAROBREZ AP, DE AGUIAR JC, GRAEFF F.G.. Anxiolytic
effect in the elevated plus maze of NMDA receptor antagonist AP 7 microinjected
into the dorsal periaqueductal gray. Psycopharmacol 103:91-94, 1991.
GUIMARÃES FS, DE AGUIAR JC, DEL-BEL EA, BALLEJO G. Anxiolytic effect
of NO synthase inhibitors microinjected into the dorsal central grey. Neuro Report
5:123-126, 1994.
GUIMARÃES FS, BEIJAMINI V, MOREIRA FA, AGUIAR DC, DE LUCA ACB.
Role of nitric oxide on brain regions related to defensive reactions. Neurosci
Biobehav Rev 29(8):1313-1322, 2005.
HESS WR, BRUGGER M. Das subkorticale Zentrum den affektiven Abwehrrektion,
Acta Helv Phiysiol 1: 33-52, 1943.
99
HILTON SM, REDFERN WS. A search for brainstem cell groups integrating the
defense reaction in the rat. J Physiol 378: 213-228, 1986.
JARDIM MC, NOGUEIRA RL, GRAEFF FG, NUNES-DE-SOUZA RL. Evaluation
of the elevated T-maze as na animal model of anxiety in the mouse. Brain Res Bull
57(1):1-5, 1999.
JARDIM MC, GUIMARÃES FS. GABAergic and glutamatergic modulation of
exploratory behavior in the dorsomedial hypothalamus. Pharmacol Bioch Behav 69(3-
4): 579-584, 2001.
JENCK F, MOREAU JL, MARTIN JR. Dorsal periaqueductal gray-induced aversion
as a simulation of panic anxiety: elements of face and predictive validity. Psychiatry
Res 57(2):181-191,1995.
JOANNY P, STEINBERG J, OLIVER C, GRINO M. Glutamate and N-methyl-D-
aspartate stimulate rat hypothalamic corticotropin-releasing factor secretion in vitro.J
Neuroendrocrinol 9(2):93-7, 1997.
KEAY KA, BANDLER R. Parallel circuits mediating distinct emotional coping
reactions to different types of stress. Neurosci Biobehav Rev 25:669–678, 2001.
KOOB GF, HEINRICHS SC, PICH EM, MENZAGLI F, BALDWIN H, MICZEK K
BRITTON KT. The role of corticotropin-releasing factor in behavioural responses to
stress. Ciba Found Symp 172:277-89, 1993.
KOOB GF, HEINRICHS SC. A role for corticotropin releasing factor and urocortin in
behavioral responses to stressors. Brain Res 848:141-152, 1999.
LADER MH. Clinical anxiety and the benzodiazepines. In: Neuropharmacology of
Central Nervous System and Behavioral Disorders. Palmer GC, ed., Academic Press,
New York, pp. 225-241, 1981.
LEGER L, CHARNAY Y, BURLET S, GAY N, SCHAAD N, BOURAS C,
CESPUGLIO R. Comparative distribution of nitric oxide synthase- and serotonin-
containing neurons in the raphe nuclei of four mammalian species. Histochem cell
biol 110(5):517-525, 1998.
LEHMAN J, SCHNEIDER J, MCPHERSON S, MURPHY DE, BERNARD P, TSAI
C, BENNETT DA, PASTOR G, STEEL DJ, BOEHM C. CPP, a selective N-methyl-
100
-aspartate (NMDA)-type receptor antagonist: characterization in vitro and in vivo. J
Pharmacol Exp Ther 240:737–746, 1987.
LIN HC, KANG BH, WAN FJ, HUANG ST, TSENG CJ. Reciprocal regulation of
nitric oxide and glutamate in the nucleus tractus solitarii of rats. Eur J Pharmacol
407:83–89, 2000.
LUNDKVIST J, CHAI Z, TEHERANIAN R, HASANVAN H, BARTFAI T, JENCK
F, WIDMER U, MOREAU JL. A non peptidic corticotropin releasing factor receptor
antagonist attenuates fever and exhibits anxiolytic-like activity. Eur J Pharmacol
309:195-200, 1996.
MARKS IM. Fears, phobia and rituals: panic, anxiety and their disorders. Oxford
University Press, New York.1987.
MANTHY PH. The midbrain periaqueductal gray in the rat, cat and monkey: a nissl,
weiss and golgi analysis. The J.Comp Neurol 204:146-158, 1982.
MARTINS AP, MARRAS RA, GUIMARÃES FS. Anxiogenic effect of
corticotropin-releasing hormone in the dorsal periaqueductal grey. Neuroreport
8(16):3601-3604, 1997.
MARTINS AP, MARRAS RA, GUIMARÃES FS. Anxiolytic effect of a CRH
receptor antagonist in the dorsal periaqueductal gray. Depress Anxiety 12(2):99-101,
2000.
MATHEUS MG, GUIMARÃES FS. Antagonism of the non-NMDA receptors in the
dorsal periaqueductal gray induces anxiolytic effect in th elevated plus maze.
Psychopharmacol (Berl)132:14-18, 1997.
MCNAUGHTON N, CORR PJ. A two-dimensional neuropsychology of defense:
fear/anxiety and defensive distance. Neurosci Biobehav Rev 28(3):285-305, 2004.
MELDRUM BS. Glutamate as a neurotransmitter in the brain: review of physiology
and pathology. J Nutr 130(4S SUPPL):1007S-10015S, 2000
.
MILLAN MJ. Descending control of pain. Prog Neurobiol 66(6):355-474, 2002.
MISSLIN R. The defense system of fear: behavior and neurocircuitry. Neurophysiol
Clin
33(2):55-66, 2003.
101
MIGUEL TT, NUNES-DE-SOUZA RL. Defensive-like behaviors and
antinociception induced by NMDA injection into the periaqueductal gray of mice
depend on nitric oxide synthesis. Brain Res 1076(1):42-8, 2006.
MOLCHANOV ML, GUIMARÃES FS. Defense reaction induced by a metabotropic
glutamate receptor agonist microinjected into the dorsal periaqueductal gray of rats.
Braz J Med Biol Res 32(12):1533-1571, 1999.
MOLCHANOV ML, GUIMARÃES FS. Anxiolytic-like effects of AP7 injected into
the dorsolateral or ventrolateral columns of the periaqueductal gray of rats.
Psychopharmacol 160(1):30-38, 2002.
MOREIRA FA, MOLCHANOV ML, GUIMARÃES FS. Ionotropic glutamate-
receptor antagonists inhibit the aversive effects of nitric oxide donor injected into the
dorsolateral periaqueductal gray of rats. Psychopharmacol (Berl)171(2):199-203,
2004.
MULLER MB, WURST W. Getting closer to affective disorders: the role of CRH
receptor systems
. Trends Mol Med 10(8):409-415, 2004
NASHOLD BS JR, WILSON WP, SLAUGHTER DG. Sensations evoked by
stimulation in the midbrain of man. J Neurosurg 30(1):14-24, 1969.
NIKULINA EM. Neural control of predatory aggression in wild and domesticated
animals . Neurosci Biobehav Rev 15:545-547, 1991.
NOWICKY AV, BINDMAN LJ. The nitric oxide synthase inhibitor, N-monomethyl-
L-arginine blocks induction of a long-term potentiation-like phenomenon in rat
medial frontal cortical neurons in vitro. J Neurophysiol 70(3):1255-1259, 1993.
OKADA D. Two pathways of cyclic GMP production through glutamate receptor-
mediated nitric oxide synthesis. J Neurochem 59(4):1203-1210, 1992.
OLDS ME, OLDS J. Pharmacological patterns in subcortical reinforcement behavior.
Int J Neuropharmacol 64:309-325, 1962.
OTTERSEN OP, STORM-MATHISEN J. Handbook of chemical neuroanatomy.
Glutamate, vol. 18.Amsterdam:Elsevier, 2000.
OZAWA S, KAMIYA H, SUZUKI K. Glutamate receptors in the mammalian central
nervous system. Prog Neubobiol 54(5):581-618, 1998.
102
PANKSEPP J. The psychoneurology of fear: evolutionary perspective and the role of
animal models in understanding human anxiety. In: Burrows G D, Roth M, Noyes, Jr
R. Handbook of anxiety. The neurobiology of anxiety. Amsterdam: Elsevier Science
Publisher, 1990, v.3, p.3-58.
PAXINOS G, FRANKLIN KBJ. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2rd ed.
Academic Press, California; 2001.
PODHORNA J, BROWN RE. Interactions between n-methyl-
-aspartate and nitric
oxide in the modulation of ultrasonic vocalizations of infant rats. Eur J Pharmacol
408(3): 265-271, 2000.
PRAST, H.; PHILIPPU, A. Nitric oxide as a modulator of neuronal function. Progr
Neurobiol 64:51-59, 2001.
RADULOVIC J, RUHMANN A, LIEPOLD T, SPIESS J. Modulation of learning and
anxiety by corticotropin’releasing factor (CRF) and stress: differential roles of CRF
receptors 1 and 2. J neuroscience 19(12):5016-5025, 1999.
REISER G. Mechanism of stimulation of cyclic-GMP level in a neuronal cell line
mediated by serotonin (5-HT3) receptors. Involvement of nitric oxide, arachidonic-
acid metabolism and cytosolic Ca2+. Eur J Biochem 20;189(3):547-552, 1990a.
REISER G. Endothelin and a Ca2+ ionophore raise cyclic GMP levels in a neuronal
cell line via formation of nitric oxide. Br J Pharmacol 101(3):722-726, 1990b.
RISBROUGH VB, HAUGER RL, ROBERTS AL, VALE WW, GEYER MA.
Corticotropin-releasing factor receptors CRF1 and CRF2 exert both additive and
opposing influences on defensive startle behavior. J Neurosci 24:6545-6552, 2004.
RIVIER CL, GRIGORIADIS DE, RIVIER JE. Role of corticotropin-releasing factor
receptors type 1 and 2 in modulating the rat adrenocorticotropin response to stressors.
Endocrinol 144:2396-2403, 2003.
RODGERS RJ, JOHNSON NJT. Factor analysis of spatiotemporal and ethological
measures in the murine elevated plus-maze test of anxiety. Pharmacol Biochem Behav
52: 297–303, 1995.
RISBROUGH VB, STEIN MB. Role of corticotropin releasing factor in anxiety
disorders: a translational research perspective. Horm Behav 50(4):550-61, 2006.
103
RYLOV AI. Change of predatory intraspecies aggression of males rats under food
deprivation. Zh Vyssh Nervn Deyat im I P Pavlova 35:875-878, 1985.
SAWCHENKO PE, IMAKI T, POTTER E, KOVACS K, IMAKI J, VALE W.
The
functional neuroanatomy of corticotropin-releasing factor. Ciba Found Symp 172 (5-
21):21-29,1993
SCHENBERG LC, BITTENCOURT AS, SUDRÉ ECM, VARGAS LC. Modeling
panic attacks. Neurosci Behav Rev 25:647–659,2001.
SCHENBERG LC, POVOA RMF, COSTA ALP, CALDELLAS AV, TUFIK S,
BITTENCOURT AS. Functional specializations within the tectum defense systems of
the rats. Neurosci Behav Rev 29(8): 1279–1298, 2005.
SCHMITT ML, COELHO W, LOPES-DE-SOUZA AS, GUIMARÃES FS,
CAROBREZ AP. Anxiogenic-like effect of glycine and
-serine microinjected into
dorsal periaqueductal gray matter of rats. Neurosci Lett 189: 93–96, 1995.
SEWARDS TV, SEWARDS MA. Fear and power-dominance drive motivation:
neural representations and pathways mediating sensory and mnemonic inputs, and
outputs to premotor structures. Neurosci Biobehav Rev 26(5):553-79, 2002.
SIEGFRIED B, NUNES-DE-SOUZA RL. NMDA receptor blockade in the
periaqueductal grey prevents stress-induced analgesia in attacked mice. Eur J
Pharmacol 168 (2):239–242, 1989.
SOUTHAM E, EAST SJ, GARTHWAITE J. Excitatory amino acid receptors coupled
to the nitric oxide/cyclic GMP pathway in rat cerebellum during development. J
Neurochem 56(6):2072-2081, 1991.
STARR MS, STARR BS. Do NMDA receptor-mediated changes in motor behaviour
involve nitric oxide? Eur J Pharmacol 272:211–217, 1995.
STIEDL O, MEYER M, JAHN O, OGREN SO, SPIESS J. Corticotropin-releasing
factor receptor 1 and central heart rate regulation in mice during expression of
conditioned fear. J Pharmacol Exp Ther 312(3):905-16, 2005.
SUKIKARA MH, MOTA-ORTIZ SR, BALBO MV, FELÍCIO LF, CANTERAS NS.
A role for the periaqueductal gray in switching adaptive behavioral responses. J
Neurosci
26(9):2583-9, 2006.
104
SWANSON LW, SAWCHENKO PE, RIVIER J, VALE WW. Organization of the
ovine corticotropin-releasing factor immunoreactive cells and fibers in the rat: an
immunohistochemical study. Neuroendocrinol 36:165-186, 1983.
TAKAHASHI LK. Role of CRF(1) and CRF(2) receptors in fear and anxiety.
Neurosci Biobehav Rev 25(7–8): 627–636, 2001.
TEIXEIRA KV, CAROBREZ AP. Effects of glycine or (+/−)-3-amino-1-hydroxy-2-
pyrrolidone microinjections along the rostrocaudal axis of the dorsal periaqueductal
gray matter on rats' performance in the elevated plus-maze task. Behav Neurosci 113
1:196–203, 1999.
TURSKI L, KLOCKGETHER T, SONTAG KH, HERRLING PL, WATKINS JC.
Muscle relaxant and anticonvulsant activity of 3-((±)-2-carboxypiperazin-4-yl)-
propyl-1-phosphonic acid, a novel N-methyl-
-aspartate antagonist, in rodents.
Neurosci Lett 73: 143–148, 1987.
VALENSTEIN ES. Independence of approach and escape reactions to electrical
stimulation of the brain. J Comp Physiol Psychol
60:20-30, 1965.
VALE WW, SPIESS J, RIVIER C, RIVIER J. Characterization of a 41-residue ovine
hypothalamic peptide that stimulates secretion of corticotropin and beta-endorphin.
Science 18:1394-1397, 1981.
VAN PETT K, VIAU V, BITTENCOURT JC, CHAN RK, LI HY, ARIAS C, PRINS
GS, PERRIN M, VALE W, SAWCHENKO PE. Distribution of mRNAs encoding
CRF receptors in brain and pituitary of rat and mouse. J Comp Neurol 428(2):191-
212, 2000.
VARGAS LC, SCHENBERG LC. Long-term effects of clomipramine and fluoxetine
on dorsal periaqueductal grey-evoked innate defensive behaviours of the rat.
Psychopharmacol 155(3):260-268, 2001.
VASAR E, HARRO J, LANG A, SOOSAAR A, OOPIK T, KOKS S, SIHVER S,
VOLKE V. Anti-exploratory effect of N-methyl-
-aspartate in elevated plus-maze.
Involvement of NMDA and CCK receptors. Eur. Neuropsychopharmacol 3:63–73,
1993.
105
VIANNA DM, BRANDÃO ML. Anatomical connections of the periaqueductal gray:
specific neural substrates for different kinds of fear. Braz J Med Biol Res; 36(5):557-
66, 2003 (Review).
VINCENT SR, KIMURA H. Histochemical mapping of the nitric oxide synthase in
the rat brain. Neurosci 46:755-784, 1992.
WIERONSKA JM, SZEWCZYK B, PALUCHA A, BRANSKI P, SMIALOWSKA
M. Involvement of CRF but not NPY in the anxiety regulation via NMDA receptors.
Pol j Pharmacol 55(6):1119-1124, 2003
.
WOOD J, GARTHWAITE J. Models of the diffusional spread of nitric oxide:
implications for neural nitric oxide signalling and its pharmacological properties.
Neuropharmacol 33(11):1235-1244, 1994.
WUENSCH KL. Fostering house mouse onto rats and deer mice: Effects on response
to species odors. Anim Learn Behav 20:253-258, 1992.
YANG M, AUGUSTSSON H, MARKHAM C, HUBBARD DT, WEBSTER D,
WALL PM, BLANCHARD RJ, BLANCHARD DC. The rat exposure test: a model
of mouse defensive behaviors. Physiol Behav 81(3):465-473, 2004.
YANG M, FARROKHI C, VASCONCELLOS A, BLANCHARD RJ,
BLANCHARD DC. Central infusion of ovine CRF (oCRF) potentiates defensive
behaviors in CD-1 mice in the mouse defense test battery (MDTB). Behav Brain Res
171(1):1-8, 2006.
9.ANEXOS
Physical environment modulates the behavioral responses induced by
chemical stimulation of dorsal periaqueductal gray in mice
E.F. Carvalho-Netto
a,b,
⁎
, C. Markham
c
, D.C. Blanchard
d,e
,
R.L. Nunes-de-Souza
b
, R.J. Blanchard
c
a
Psychobiology Graduate Program, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP 14040-901, Brazil
b
Laboratory of Pharmacology, São Paulo State University-UNESP, Araraquara, SP 14801-902, Brazil
c
Department of Psychology, University of Hawaii, Honolulu, HI 96822, USA
d
Pacific Biomedical Research Center, University of Hawaii, Honolulu, HI 96822, USA
e
Department of Genetics and Molecular Biology, John A. Burns School of Medicine, University of Hawaii, Honolulu, HI 96822, USA
Received 6 April 2006; received in revised form 6 July 2006; accepted 18 July 2006
Available online 1 September 2006
Abstract
In order to investigate the relationship between behaviors elicited by chemical stimulation of the dorsal periaqueductal gray (dorsal PAG) and
spontaneous defensive behaviors to a predator, the excitatory amino acid
D,L-homocysteic acid (5 nmol in 0.1 μl), was infused into the dorsal PAG
and behavioral responses of mice were evaluated in two different situations, a rectangular novel chamber or the Mouse Defense Test Battery
(MDTB) apparatus. During a 1-min period following drug infusion, more jumps were made in the chamber than in the MDTB runway but running
time and distance traveled were significantly higher in the runway. Animals were subsequently tested using the standard MDTB procedure (anti-
predator avoidance, chase and defensive threat/attack). No drug effects on these measures were significant. In a further test in the MDTB
apparatus, the pathway of the mouse during peak locomotion response was blocked 3 times by the predator stimulus (anesthetized rat) to
determine if the mouse would avoid contact. Ninety percent of
D,L-homocysteic treated animals made direct contact with the stimulus (rat),
indicating that
D,L-homocysteic-induced running is not guided by relevant (here, threat) stimuli. These results indicate that running as opposed to
jumping is the primary response in mice injected with
D,L-homocysteic into the dorsal PAG when the environment enables flight. However, the
lack of responsivity to the predator during peak locomotion suggests that
D,L-homocysteic-stimulation into the dorsal PAG does not induce normal
antipredator flight.
© 2006 Published by Elsevier Inc.
Keywords: D,L-homocysteic acid; Dorsal periaqueductal gray; Aversion; Mouse Defense Test Battery; Defense reactions; Mice
1. Introduction
The periaqueductal gray (PAG) is a midbrain structure
divided along its rostro-caudal axis into dorsomedial, dorsolat-
eral, lateral and ventrolateral columns (Carrive, 1993). The
dorsal columns of the PAG are proposed to integrate behavioral
and autonomic expression of defensive reactions (for reviews,
see Bandler and Shipley, 1994; Graeff, 1990,1994). In rats,
either electrical or chemical stimulation of these columns in-
duces freezing behavior alte rnating with vigorous flight and
apparently aimless vertical jumps (Di Scala et al., 1984; Bandler
et al., 1985; Aguiar et al., 2006). These behaviors appear to be
similar to escape reactions induced by natural aversive stimuli,
such as exposure to a proximal predator (Blanchard and
Blanchard, 1988). Stimulation of the dorsal PAG in humans
undergoing surgery has produced reports of intense fear asso-
ciated with autonomic reactions (e.g. tachycardia and hyper-
ventilation) reminiscent of a full-blown panic attack (Nashold
et al., 1969 ). Given the striking similarities between the auto-
nomic and behavioral effects of dorsal PAG stimulation and the
symptoms of panic attacks, it has been suggested that this site is
Pharmacology, Biochemistry and Behavior 85 (2006) 140 – 147
www.elsevier.com/locate/pharmbiochembeh
⁎
Corresponding author. Laboratório de Farmacologia, FCF - UNESP, Rod.
Araraquara-Jau, Km 01, Araraquara-SP, 14801-902 Brazil. Tel.: +55 16
33016985; fax: +55 16 33016980.
E-mail address: [email protected] (E.F. Carvalho-Netto).
0091-3057/$ - see front matter © 2006 Published by Elsevier Inc.
doi:10.1016/j.pbb.2006.07.022
involved in the genesis of panic disorder in humans and that
dorsal PAG stimulation can serve as a model of panic attack
(Graeff, 1990; Beckett et al., 1992; Jenck et al., 1995).
Recent ethopharmacological studies suggest that flight
responses of mice to an oncoming threat stimulus are partic-
ularly responsive to propanic and antipanic drugs (Blanchard
et al., 2001). Combining this focus on flight with dorsal PAG
stimulation, Carvalho-Netto and Nunes-de-Souza (2004) re-
ported that infusion of the excitatory amino acid
D,L-Homo-
cysteic into the dorsal PAG of mice produces explosive
behaviors which include running and jumping; behaviors also
previously reported in rats (Beckett et al., 1992). However, the
behavioral responses elicited in that study were evaluated in a
small enclosed apparatus (chamber with 23 cm diameter and
30 height), which may have prevented a clear analysis of the
flight response. In fact, we have observed that mice under drug
effect ran often into the wal ls chamber suggesting that behav-
ioral respon se patterns induced by
D,L-homocysteic infusion
might depend on features of the physical environment (un-
published data). Hence, one of the objectives of the present
work was to investigate the
D,L-homocysteic-induced escape
response in two different apparatuses, a small rectangular novel
chamber and a large oval runway, the Mouse Defense Test
Battery (MDTB) (e.g. Griebel et al., 1996). The first apparatus
permitted only brief forward locomotion before the animal
would encounter a wall. The second was an endless oval run-
way allowing mice to run forward for 2 m before being required
to turn around a curved section of runway into another 2 m
straight alley, ending in another curved section straightening
into the original segm ent.
Following an initial 1-min postdrug period, animals from both
conditions were tested using the standard MDTB procedure,
which is designed to assess the defensive reactions of mice to a
natural predator — the rat. A number of psychoactive drugs have
been evaluated in this test (Blanchard et al., 2001 for review), and
a consistent pattern of results has emerged. Among the various
defensive behaviors, active defenses such as fight and escape
appear to be selectively responsive to panicogenic compounds
such as yohimbine (Blanchard et al., 1993), as well as to chronic
administration of panicolytic compounds such as alprazolam
(Griebel et al., 1995a), imipramine and fluoxetine (Griebel et al.,
1995b). Observation of a selective increase in flight and active
defenses would provide further and specific evidence that stim-
ulation of dorsal PAG produces panic-like effects.
However, it has been well demonstrated that the main
behavioral responses (running and jumping) induced by micro-
injection of
D,L-homocysteic into the dorsal PAG, which have
been considered as proximal defensive responses, remain for a
brief period of 40–60 s following drug administration (Bandler
and DePaulis, 1988; Beckett et al., 1992; Carvalho-Netto and
Nunes-de-Souza, 2004). A further test in the MDTB apparatus
was proposed to determine if the mouse would react to threat
stimuli during this brief postinjection period. To determine if
mice would respond appropriately to the threat, avoiding it by
changing the direction of flight, the pathway of the mouse during
peak behavioral responses (first minute) was blocked 3 times by
the predator stimulus (anesthetized rat).
2. Materials and methods
2.1. Subjects
Subjects were male Swiss–Webster mice, obtained from
Charles River Suppliers (St. Louis, MO). Upon arrival, all mice
were single-housed in opaque polypropylene cages in temperature
controlled room (22± 1 C°) with ad lib access to food and water.
The mice were acclimatized for 4–6 weeks until they reached a
weight range of 30–40 g. All mice were maintained on a 12 h
light/dark cycle (lights on at 07:00 am). Three male Long–Evans
rats were used as predator stimuli during the course of the study.
2.2. Dru gs
D,L-homocysteic acid was obtained from Sigma (St. Louis,
MO) and dissolved in 0.9% sterile physiological saline. The dose
used (5 nmol/0.1 μl) was based on previous studies (Carvalho-
Netto and Nunes-de-Souza, 2004; Beckett et al., 1992).
2.3. Surgery
Mice were implanted unilaterally with 8 mm stainless-steel
guide cannula (26-gauge) under sodium pentobarbital (90 mg/kg,
i.p.) anesthesia. The guide cannula was fixed to the skull using
dental cement and jewelers' screw. Stereotaxic coordinates for
the dorsal PAG were 4.16 mm posterior to the bregma, 1.32 mm
lateral to the midline and 2.23 mm ventral to the skull surface,
with the guide cannula angled 26° to the vertical. A dummy
cannula inserted into the guide cannula at the time of surgery
served to reduce the incidence of occlusion. To prevent accu-
mulation of salivatory and bronchial secretions, 0.01 mg/kg
subcutaneous (s.c.) glycopyrrolate (Luitpold Pharmaceuticals,
Shirley, NY), was administered 15 min before surgery. Upon
removal from the stereotaxic apparatus mice were administered
1 ml 0.9% saline s.c. to prevent dehydration.
2.4. Intracerebral drug administration
Following a 1 week recovery period, mice were transferred
from the main holding area to the laboratory and left
undisturbed for 1 h prior to drug administration. Each mouse
was lightly restrained and a 32-gauge injection cannula (1.0 mm
longer than the guide cannula) was inserted into the guide
cannula, the injector connected via PE-10 polyethylene tubing
to a 10 μl Hamilton microsyringe. Solution administration was
controlled by an infusion pump (Harvard Apparatus, Inc. USA)
programmed to deliver a volume of 0.1 μl over a period of 10 s.
Confirmation of successful infusion was obtained by monitor-
ing the movement of a small air bubble in the PE-10 tubing.
Immediately following drug infusion, each animal was placed
in the experimental chamber or in the MDTB apparatus.
2.5. Apparatus
The behavioral responses induced by dorsal PAG chemical
stimulation were evaluated in a chamber or in the MDTB apparatus.
141E.F. Carvalho-Netto et al. / Pharmacology, Biochemistry and Behavior 85 (2006) 140–147
2.5.1. Chamber
The test chamber was a black Plexiglas box (28×24 ×35 cm)
with one side of transparent Plexiglas, which permitted recording
of the experiment by a vertically mounted camera linked to a
video monitor and DVD.
2.5.2. MDTB apparatus
The Mouse Defense Test battery apparatus (Fig. 1)wasan
oval runway, 0.40 m wide, 0.30 m high, and 4.8 m in total length,
consisting of two 2.0-m straight segments joined by two 0.4-m
curved segments, and separated by a median wall (2.0 m
long× 0.30 m high). The apparatus was elevated to a height of
0.80 m from the floor to minimize the mouse's visual contact
with the experimenter. All parts of the apparatus were made of
black Plexiglas. The floor of the runway was marked with white
lines every 20 cm, to facilitate distance measurement. Activity
was recorded using two ceiling-mounted video cameras.
2.6. Procedure
2.6.1. Experiment 1.
D,L-homocysteic-i nduced explosive motor
response: chamber vs. MDTB apparatus
Mice were randomly assigned to four groups (n =8–10); two
groups were injected with
D,L-homocysteic (5 nmol) or saline
into the dorsal PAG and each animal was immediately placed in
the chamber. The resultant behaviors were observed and video
recorded for 1 min. The other two groups received the same
pharmacological treatment and were immediately placed in the
MDTB apparatus for behavioral recording for 1 min . No further
manipulations or conditions were imposed during this 1-minute
period. The following behavioral responses were recorded
throughout the stimulation trials:
Jumping: Upward leaps directed or not to the border of the
apparatus. For those groups treated with
D,L-homocysteic
and exposed to the chamber situation (where most of the
jumps occurred), the data were presented as percentage of
jumps preceded or not preceded by touch or crash into the
chamber walls with the mouse's body, nose or vibrissae.
Walking: Slow locomotion with elevation of trunk and tail and
out of phase stance and swing movements of contralateral
limbs
Trotting: Fast locomotion with elevation of trunk and tail and
out of phase stance and swing movements of contralateral
limbs
Galloping: Running alternating stance and swing movements
of anterior and posterior limb pairs.
Freezing: Compl ete absence of movement except breathing,
while the animal assumes a characteristic tense posture.
Facial contact: The animal crashes or touches head first into
the wall of the chamber or MDTB
Lateral contact: While galloping or trotting the animal comes
into contact with the chamber or MDTB walls wi th its body
(trunk) or its vibrissae.
Rearing: Standing on hind limbs, with both forelimbs off the
floor. This measure included both unsupported rearing, and
rearing against the wall.
The distance traveled for each mouse was also measured
during the first 20 s after intra-dorsal PAG injection.
2.6.2. Experiment 2. Standard MDTB procedure
Immediately after e xperiment 1 (i.e. 1 min postdrug), ani-
mals from both conditions (cham ber and MDTB) were then
tested using the standard MDTB procedure which is designed to
assess the defensive reactions of mice to a natural predator, the
rat. This procedure is described in detail in Blanchard et al.,
2001, 2003). Briefly, the procedures and measures taken were as
follows:
2.6.2.1. Rea ctions to the predator. When the subject mouse is
at one end of the apparatus, a hand-held anesthetized rat is
introduced into the opposite end of the open runway and brought
up the subject at an approximate speed of 0.5 m/s. Approach was
terminated on contact with, or movement by, the subject. Avoid-
ance distance (the distance from rat to subject at the point of
flight) was recorded. This procedure was repeated five times,
with mean avoidance distance (cm) and number of avoidances
calculated for each subject.
2.6.2.2. Chase. The hand-held rat is brought up to the subject at
a speed of approximately 2.0 m/s. Total flight time (time taken to
travel 15 m when the mouse was running away from the rat) was
recorded. Overall flight speed (m/s) and maximum linear flight
speed (over a 2-m linear segment of the runway) were sub-
sequently calculated. The number of stops (pause in locomotion)
and reversals (subject turned and ran in the opposite direction)
were recorded.
2.6.2.3. Straight alley. Upon closing two doors (80 cm apart),
one runway was converted into a closed straight alley in which
Fig. 1. An overhead view of the MDTB apparatus. The two 2-m straight
segments of the oval runway are joined by two 0.4-m curved segments and
separated by a median wall. The apparatus was elevated 0.8 m.
142 E.F. Carvalho-Netto et al. / Pharmacology, Biochemistry and Behavior 85 (2006) 140–147
the subject was trapped. The threat stimulus (rat) was held at
one end of straight alley. Subjects were given three successive
30 s trials in which both the number of approach—withdrawals
and the number of voluntary contacts with the rat stimulus were
recorded. Measures taken also included immobility (freezing)
time and frequency of jump escapes.
2.6.2.4. Forced contact. With the alley lengt h reduced to
40 cm the hand-held rat quickly approached and contacted the
subject (five contacts). This procedure was repeated three times.
During each trial, the number of vocalizations, defensive
uprights, jump escapes and bites were recorded.
2.6.3. Experiment 3. Evaluating the ability of mice to react to
the threat stimulus during
D,L-homocysteic-induced flight
In order to evaluate the ability of mice to react to envi-
ronmental stimuli following
D,L-homocysteic infusion, the pre-
vious control groups (i.e. saline groups from experiments 1–2)
were injected intra-dorsal PAG with
D,L-homocysteic (5 nmol)
24 h following the initial test. Each animal was immediately
placed in the MDTB apparatus. During the peak running
response induce d by dorsal PAG stimulation (i.e. first 50 s after
injection) the pathway was blocked once by a closed door at the
end of a runway and 3 times by an anesthetized predator
stimulus (rat). To assess changes in the subject's speed and its
response to the intro duced block of its pathway, a frame-by-
frame analysis of the DVD (1/30) was conducted. This analysis
was carried out 60 cm before the animal reached the introduced
block of the runway (either the door or the Rat). The scoring
was divided into three equal squares (20 cm each) of the MD TB
apparatus and then a mean for each animal was calculated. The
procedure evaluated whether the mice would avoid contact with
the interposed stimulus.
2.7. Histology
Mice were sacrificed with an overdose of sodium pentobar-
bital and received an infusion of 10% methylene blue intra-dorsal
PAG, according to the microinjection procedure described above.
The animals were perfused intra-cardially with 10 cc 0.9%
formalin and their brains were removed from the cranial cavity
and stored in 10% formalin/30% sucrose solution for at least 48 h
before histological analysis. Mouse brains were coronally sec-
tioned by cryostat (50 μm) and microscopically verified with
reference to the atlas of Paxinos and Franklin (2001).Datafrom
animals with injection sites outside the dorsal PAG were ex-
cluded from analysis.
2.8. Statistical analyses
The behavioral data from experiments 1 and 2 were analyzed
by factorial analysis of variance (ANOVA) with saline vs.
D,L-
homocysteic treatment and chamber vs. MD TB apparatus as
between-subjects factors. Where significant main effects (drug)
or interactions (drug × apparatus) were obtained, data were
further analyzed by Newman –Keuls multiple comparisons test.
Repeated measures analysis of variance (ANOVA) was used to
analyze the data from experiment 3. A p value ≤ 0.05 was
considered significant.
2.9. Ethics
All procedures were run in accord with protocols approve d
by the University of Hawaii Institutional Animal Care and Use
Committee.
3. Res ults
Histological analysis demonstrated that 36 mice had accurate
cannula placements in the PAG (Fig. 2). Final sample sizes
ranged from n=8–10 animals per group.
3.1. Experiment 1.
D,L-homocysteic-induced explosive motor
response: Chamber × MDTB apparatus
As shown in Figs. 3, 4 and 5 ANOVA revealed a main effect
of drug for most behavioral responses [frequency of jump F
(1,31) = 25.7, p b 0.001; frequency of facial contact F(1,31) =
10.3, p b 0.05; frequency of lateral contact F(1,31) = 34.9,
p b 0.001 (Fig. 3); duration galloping F(1,31)=66.9, p b 0.001;
Fig. 2. Schematic representation of microinfusion sites within the midbrain
periaqueductal gray (PAG) of the mouse. The number of the points in the figure
is less than the total number of mice because of the overlaps.
143E.F. Carvalho-Netto et al. / Pharmacology, Biochemistry and Behavior 85 (2006) 140–147
duration trotting F(1,31) = 93.7, p b 0.001; duration walking F
(1,31) = 234.6 p b 0.001; duration of freezing F(1,31) = 7.13,
p b 0.01(Fig. 4); and distance traveled F(1,31) = 185.1, p b 0.001
(Fig. 5)]. ANOVA for the situation/apparatus factor revealed
significance for frequency of jump [F(1,31) = 19.6, p b 0.001];
lateral contact [F(1,31) = 5.13, p b 0.05]; rearing [F(1,31) = 5.54,
p b 0.05]; duration of galloping [F(1,31) = 3.93, p b 0.05; and
distance traveled [F(1,31) = 16.3, p b 0.001]. ANOVA also
indicated a drug vs. apparatus interaction for jumps [F(1,31)=
19.65, p b 0.001]; lateral contact [F(1,31) = 5.13, p b 0.05]
(Fig. 3); galloping [F(1,31) =3.93, pb 0.05]; walking [F(1,31)=
7.06, pb 0.01] (Fig. 4); and, distance traveled [F(1,31) =15.11,
p b 0.001] (Fig. 5). This interaction was not significant for facial
contact, rearing, trotting, or freezing. For treated mice in the
chamber compartment, 87% of these jumps were preceded by a
contact of the animal's body, nose or vibrissae with one or more
chamber walls.
3.2. Experiment 2. Standard MDTB procedure
All behavioral data (means±S.E.) from the standard MDTB
procedure, evaluated beginning 1 min after drug administration,
are presented in Table 1. The factorial ANOVA did not indicate a
reliable effect of drug for any task evaluated in the standard
MDTB procedure, except jump escapes [ F(1,31) = 5.92,
p
b 0.05]. The t-test for independent samples indicated that
frequency of jumps decreased in the straight alley for the drugged
animals that had been run in the MDTB apparatus during the first
minute after
D,L-homocysteic infusion, compared to controls run
in the same situation (t=2.18, df =15, p b 0.05), but it did not
reveal any significant difference in comparison to animals from
the Chamber situation (t=1.02, df =16, p N 0.05).
3.3. Experiment 3. Evaluating the ability of mice to react to
the threat stimulus during
D,L-homocysteic-induced flight
responses
Table 2 presents the mean number of frames (at 30 fps)
required for animals of each group to pass t hr oug h each of 3,
20-cm squares that were progressively closer to either a closed
door, or an anesthetized rat, placed in the MDTB runway. The
number of frames translates to flight speed, with 4 frames per
second equaling 1.5 m/s, and 8.4 frames (the highest number of
frames required for any group) equaling .71 m/s. ANOVA for
repeated measures did not reveal any trend of increase of the
number of frames required to pass through each square at 60, 40,
or 20 cm while moving toward the closed door [F(2,14)= 1.0
p N 0.05] or the three rat-blocked pathway trials [trial 1 F(2,14)=
Fig. 3. Effect of D,L-homocysteic injected into the dorsal PAG on the behaviors (frequency) of mice evaluated in two different situations: chamber×MDTB (n=8–10).
Each bar represents the mean ±. *p b 0.05 compared to respective control group and # p b 0.05 compared to
D,L-homocysteic Chamber group by Newman–Keuls
multiple comparisons test. Lateral and facial contact behaviors are represented by L contact and F contact, respectively.
Fig. 4. Effect of DLH injected into the dorsal PAG on the behaviors (du ration) o f mice evaluated in two different situations: cham ber × MDTB (n =8–10). Each bar
represents the mean ± S EM. *p b 0.05 compared to control group and # p b 0.05 compared to D,L-homocysteic Chamber group by Newman–Keuls multiple
comparisons test.
144 E.F. Carvalho-Netto et al. / Pharmacology, Biochemistry and Behavior 85 (2006) 140–147
0.81 pN 0.05]; [trial 2 F(2,14)= 1.36 pN 0.05]; [trial 3 F(2.14) =
1,43 p N 0.05], suggesting that the animals did not reduce speed to
avoid contact with either a barrier (door) or an aversive stimulus.
4. Discussion
The present results are in agreement with previous findings
in rats and mice (e.g. Beckett et al., 1992; Carvalho-Netto and
Nunes-de-Souza, 2004) that microinjection of the excitatory
amino acid
D,L-homocysteic into the dorsal PAG produces
explosive motor behaviors characterized by running (galloping
and trotting) and jumping. However, this study further dem-
onstrates that the type of motor response to
D,L-homocysteic
infusion is strongly influenced by features of the envir onment in
which animals are tested. In the chamber compartment, where
animals often ran into the walls, jumping was the overwhelm-
ingly predominant response during a brief period of 40–60 s
following drug administration. In the MDTB, with its endless
oval runway, mice exhibited galloping, rather than jumping, as a
primary response to
D,L-homocysteic. In fact, in the MDTB
apparatus
D,L-homocysteic-treated mice failed to make signif-
icantly more jumps than controls.
These findings contrast with some previous reports that
physical characteristics of the test conditions do not impact
responsivity to dorsal PAG stimulation. Schenberg et al. (2005)
reported that neither test arena size (20 vs. 50 cm diameter) or
the presence or absence of a roof had any effects on the
thresholds of somatic defensive behaviors, including jumping.
Although different animal species (rat vs. mouse) and different
methods (electrical or chemical stimulation) and specifics of the
test arena used in these studies were different, the major dif-
ference may be between measures: thresholds for responses
may be less sensitive to situational characteristics than is the
expression of the responses themselves.
Our results further suggest that the switch from running to
jumping immediately after
D,L-homocysteic stimulation, for
animals run in the chamber compared to the MDTB apparatus,
may be modulated by tactile contact. In the chamber, 87% of
either vertical or horizontal jumps were preceded by a contact
(touch or crash) of the animal's head or vibrissae to the chamber
wall. Consonant with the predominance of jumps in the chamber,
more lateral and facial wall contacts occurred in this situation
than in the MDTB situation. Based on findings that visual stimuli
(i.e., approach of a brush or glove) did not readily evoke
defensive reaction in rats that had been infused with kainic acid
within the dorsal PAG, Bandler and DePaulis (1991) suggested
that chemical stimulation of dorsal PAG induces a deficit in the
rat's visual perception of environmental stimuli. The results of
Experiment 1 suggest that
D,L-homocysteic infusion provoked a
Fig. 5. Effect of DLH injected into the dorsal PAG of mice on the distance
moved either in the chamber or in the MDTB apparatus (n =8–10) following
20 s initial after administration of drug. *pb 0.05 compared to respective control
group and #p b 0.05 compared to chamber group.
Table 1
Effect of DLH acid infusions in the DPAG on behavioral responses of mice
confronted with a rat in the standard MDTB procedure following the initial 1-
min post-drug period (first minute on the chamber or on the MDTB apparatus)
Behaviors Chamber MDTB F(1,31)
Control DLH Control DLH
Reaction to the predator
Avoidance distance
(cm)
60.2± 15.2 22.0 ± 10.5 53.2 ± 13.1 46.0 ± 12.5 3.18
Avoidance
frequency
2.0± 0.5 0.6 ± 0.2 1.9 ± 0.4 1.9± 0.6 2.22
Chase/flight test
Flight speed (m/s) 0.51± 0.04 0.57 ± 0.07 0.59 ± 0.05 0.62 ± 0.08 0.45
Max speed (m/s) 0.89 ±0.05 0.83 ±0.04 0.96 ±0.06 0.94±0.12 0.30
Stops 5.4± 1.1 2.6 ± 0.6 3.9 ± 1.2 3.2± 1.0 2.70
Reversals 5.1 ± 1.1 2.8 ± 0.8 3.4 ± 1.1 3.0 ± 1.4 1.43
Straight alley test
Approaches/
withdrawals
2.1± 0.4 1.9 ± 0.5 2.6 ± 0.3 2.6± 0.5 0.23
Contacts 1.3± 0.4 1.4 ± 0.4 1.6 ± 0.6 1.3± 0.5 0.97
Jump escapes 1.1 ± 0.6 0.5 ± 0.1 4.3 ± 0.7 2.1± 0.6* 5.92
Freezing (s) 4.8±1.0 3.7 ±0.9 2.1 ± 0.8 2.8 ± 1.4 0.54
Forced contact test
Uprights 9.5± 1.9 6.4 ± 1.3 5.6 ± 2.1 7.6± 1.2 0.13
Vocalization 11.0± 1.4 7.7 ±1.8 11.5± 1.8 11.1± 0.9 1.45
Bites 0.0± 0.0 0.8 ± 0.4 0.5 ± 0.3 1.4± 0.7 3.54
Jump escapes 4.7 ± 2.2 7.0 ± 1.4 9.1 ± 2.0 7.6± 1.2 0.55
Values represent means ± S.E.M.
⁎
p b 0.05 compared to control.
Table 2
Response of the animals under DLH-initial effect peak (explosive flight) to
environmental stimuli (door or rat)
Target Frames in the
first square
(60 cm from
target)
Frames in the
second square
(40 cm from
target)
Frames in the
third square
(20 cm from
target)
Percentage of
the contact
Closed door 4.0 ± 0.3 4.0 ±0.3 3.9 ± 0.2 100
Rat block trial 1 5.8 ± 0.6 6.4 ±1.0 5.8 ± 0.6 90
Rat block trial 2 6.0 ± 0.4 6.1 ±0.5 6.5 ± 0.6 90
Rat block trial 3 6.8 ± 0.4 7.3 ±0.4 8.4 ± 1.4 80
The values represent the means of the number of frames required to pass through
each square at 60, 40, or 20 cm while moving toward a closed door or one of
three rat blocked pathway trials. It was tallied to demonstrate differences in
speed based on the location the target. Each square represents a 20 cm block in
the MDTB apparatus. Contact was considered when the subject crashed or
touched its face into the target (door or rat).
145E.F. Carvalho-Netto et al. / Pharmacology, Biochemistry and Behavior 85 (2006) 140–147
similar effect in mice, along with a concomitant increase in the
role of tactile stimuli in modulating the behavioral responses
elicited by
D,L-homocysteic acid infusion into the dorsal PAG.
Previous studies have emphasized that jumping, running, or
galloping induced by dorsal PAG stimulation are related to natural
defensive responses elicited by aversive situations (Beckett et al.,
1992; Keay and Bandler, 2001; Vianna and Brandao, 2003;
Bittencourt et al., 2004; Schenberg et al., 2001), as they are similar
to escape reactions induced by natural aversive stimuli, such as
the exposure to a proximal predator (Blanchard and Blanchard,
1988; Blanchard et al., 2001). They have also been recently
proposed as indices of panic-like behaviors in rats (Vargas and
Schenberg, 2001).
While present results suggest that the choice of running or
jumps after
D,L-homocysteic stimulation is largely based on
environmental stimuli, specifically tactile contact with walls,
these results are not counter to a view that the dorsal PAG contains
elements of defense systems that are normally active when
confronting aversive stimuli. However, in Experiment 2, animals
tested in the MDTB following the initial 1-minute postdrug period
did not show any reliable changes in their defensive reactions to a
predator (rat). The failure of
D,L-homocysteic to enhance any of
these defensive behaviors is likely related to the brevity of effects
observed with intra-PAG injections of this excitatory amino acid
(Beckett et al., 1990; Carvalho-Netto and Nunes-de-Souza,
2004). Even though the initial motor reaction induced by
D,L-
homocysteic has a short duration, another behavioral response,
immobility, may last at least 5 min (Beckett et al., 1990; Carvalho-
Netto and Nunes-de-Souza, 2004). However, it is not clear if such
immobility is part of the behavioral defense repertory or is a sign
of exhaustion or quiescence following the dramatic locomotor
activity burst elicited by
D,L-homocysteic as an initial response.
Bandler and DePaulis (1988) have shown that microinjections of
low doses of another excitatory amino acid, kainic acid, in the
PAG region evoked a significant increase in both defensive and
immobile behaviors in rats tested in a social interaction test
situation. The elicited reactions appeared identical to the rat's
natural reactions to attack by a conspecific. The long duration and
natural appearance of the kainic acid evoked reactions stands in
contrast to the short explosive reactions provoked by injections in
the PAG of the other excitatory amino acids such as
D,L-
homocysteic.
Further contrasting with kainic acid results from Bandler and
DePaulis (1988),these
D,L-homocysteic-stimulated animals did
not show potentiated responsivity to an animated threat stimulus.
The
D,L-homocystei c- indu ced fli ght response was neither
initiated nor guided by the introduction of the predator. It always
began immediately on placement of animals into the MDTB
(Experiment 1) and when a rat was introduced into the path of a
running mouse,
D,L-homocysteic-stimulated mice ran toward it
and typically into it, or to an interposed door, without slowing
(Experiment 3). Although low doses of kainic acid in the PAG
may have degraded visual processing, they nonetheless produced
a significant increase in both defensive and immobile behaviors
in rats in the social interaction test (Bandler and DePaulis, 1988).
According to Bandler and DePaulis (1988), defensive responses
to a conspecific were evoked by contact with another rat during
these social encounters, suggesting that the rats were usually
sensitive to stimuli that might be interpreted as an indicating
threat.
These differences suggest that
D,L-homocysteic stimulation of
the dorsal PAG may reflect high level reflex activation of loco-
motor systems in addition to, or instead of, activation of defen-
siveness or emotionality. It is notable that, in the absence of the
rat, the maximum flight speed induced by
D,L-homocysteic was
1.5 m/s. In the context of the 0.8 m/s maximum flight speed
exhibited by untreated lab mice, or the 1.5 m/s speed of wild
mice, each when chased by a predator (Blanchard et al., 1998),
the speeds attained in this study by lab mice under
D,L-
homocysteic stimulation of the dorsal PAG appear to represent a
maximal running response, and one that was not altered by the
presence of the predator.
It has been firmly established that the PAG is one of the
fundamental brain regions involved in the elaboration and
expression of emergency defense responses (Bandler and
DePaulis, 1991; Graeff, 2004). Large lesions in the area of the
PAG dramatically reduce defensive behaviors to a potential
predator in wild rats (Blanchard et al., 1981), although lesions of
the dorsal PAG have much lesser effects on contextual con-
ditioned fear responses (Leman et al., 2003). A striking c-Fos
activation of the dorsal PAG has been reported in rats exposed to
a predator (cat) or to cat odor (Canteras and Goto, 1999;
Dielenberg et al., 2001), but, interestingly, not to trimethylthiazo-
line, a synthetic fox anal gland odor that is often used to elicit
defensiveness in laboratory studies (Day et al., 2004).
While the present results do no t indicate that the jumping and
running behaviors initially elicited by
D,L-homocysteic stimu-
lation of the dorsal PAG reflect enhancement of defensiveness
to a predator, they should not be taken as counter indicating a
role for the dorsal PAG in defense. The dose given of
D,L-
homocysteic —albeit not outside the range of doses used in
similar studies and far less than many— may have had highly
unphysiological effects on the activity of the area stimulated.
Also, it is by no means certain that
D,L-homocysteic optimally
activates the PAG elements that are normally involved in
defensive behaviors elicited by threa tening stimuli, and even
less certain that such activation is relatively specific to these
systems. What this study does indicate is a necessity for caution
in interpreting jumping and running — or other— behaviors
elicited by regional brain stimulation as direct analogues to the
defensive behaviors that they may somewhat resemble. This
research suggests that the dependence of behaviors on specifics
of the test situation may be a useful feature in determining how
an elicited behavior relates to responses to relevant natural
stimuli. However, such dependence requires sensitive analysis.
Here, differences in type of response (jump vs. run) in the
chamber compared to the MDTB runway were apparently
mediated by the ability of tactile stimuli to elicit jumps; a
relationship that is of much less importance in the normal
running response of animals to threa t stimuli which are more
visually mediated. Conversely, the lack of normal visual control
of behavior in these animals was likely involved in their failure
to slow or stop running into threatening or neutral but unyield-
ing stimuli. These considerations suggest that a fuller analysis
146 E.F. Carvalho-Netto et al. / Pharmacology, Biochemistry and Behavior 85 (2006) 140–147
of behavior, and of the circumstances in which it occurs, should
accompany attempts to determine the brain mechanisms con-
trolling defensive and other natural behavior patterns.
Acknowledgements
We acknowledge Catherine Farrohki and Mu Yang for their
generous help in these studies. This study was supported by
CAPES and FAPESP, Brazil, as well as University of Hawaii,
USA. E.F. Carvalho-Netto was recipient of CAPES and R.L.
Nunes-de-Souza received a CNPq research fellowship.
References
Aguiar DC, Moreira FA, Guimarães FS. Flight reactions induced by injection of
glutamate N-methyl-D-aspartate receptor agonist into the rat dorsolateral
periaqueductal gray are not dependent on endogenous nitric oxide. Pharmacol
Biochem Behav 2006;83:296–301.
Bandler R, DePaulis A. Elicitation of intraspecific defence reactions in the rat
from midbrain periaqueductal gray by microinjection of kainic acid, without
neurotoxic effects. Neurosci Lett 1988;88:291–6.
Bandler R, DePaulis A. Midbrain periaqueductal gray control of defensive
behavior in the cat and the rat. In: Depaulis A, Bandler R, editors. The midbrain
periaqueductal gray matter: functional, anatomical and neurochemical
organization. New York: Plenun Press; 1991. p. 175–97.
Bandler R, Shipley MT. Columnar organization in the midbrain periaqueductal
gray: modulates for emotional expression? Trends Neurosci 1994;17:379–89.
Bandler R, DePaulis A, Vergnes M. Identification of midbrain neurones
mediating defensive behavior in the rat by microinjections of excitatory
amino acids. Behav Brain Res 1985;15:107–19.
Beckett SR, Marsden CA, Marshall PW. Microinjections of DLH into the rat
periaqueductal gray matter induce a dose-dependent defense response
attenuated by midazolam. Br J Pharmacol 1990;101:585.
Beckett SR, Lawrence AJ, Marsden CA, Marshall PW. Attenuation of chemically
induced defence response by 5-HT1 receptor agonists administered into the
periaqueductal gray. Psychopharmacol (Berl) 1992;108(1–2):110–4.
Bittencourt AS, Carobrez LP, Zamprog no LP, Tufik S, Schenberg LC.
Organization of single components of defensive behaviors within distinct
columns of periaqueductal gray matter of the rat: role of N-methyl-
D-aspartic
acid glutamate receptors. Neuroscience 2004;125:71–89.
Blanchard RJ, Blanchard DC. Ethoexperimental approaches to the biology of
emotion. Annu Rev Psychol 1988;39:43–68.
Blanchard DC, Williams G, Lee EMC, Blanchard RJ. Taming wild Rattus
novergicus by lesions of the mesencephalic central gray. Physiol Psychol
1981;9:157–63.
Blanchard RJ, Taukulus H, Rodgers RJ, Magee LK, Blanchard DC. Yohimbine
potentiates active defensive responses to threatening stimuli in Swiss–
Webster mice. Pharmacol Biochem Behav 1993;44:673–81.
Blanchard RJ, Hebert MA, Ferrari P, Palanza P, Figueira R, Blanchard DC, et al.
Defensive behaviors in wild and laboratory (Swiss) mice: the Mouse
Defense Test Battery. Physiol Behav 1998;65(2):201–91.
Blanchard DC, Griebel G, Blanchard RJ. Mouse defense behaviors: pharma-
cological and behavioral assays for anxiety and panic. Neurosci Biobehav
Rev 2001;25:205–18.
Blanchard DC, Griebel G, Blanchard RJ. The Mouse Defense Test Battery:
pharmacological and behavioral assays for anxiety and panic. Eur J Pharmacol
2003;463:97-116.
Canteras NS, Goto M. Fos-like imunoreactivity in the periaqueductal gray of
rats exposed to a natural predator. Neuroreport 1999;10:413–8.
Carrive P. The periaqueductal gra y and defensive behavior: functional
significance and neuronal organization. Behav Brain Res 1993;58:27–47.
Carvalho-Netto EF Nunes-de-Souza RL Behavioral responses followed by
chemical stimulation of the midbrain periaqueductal gray in mice. Internat
Behav Neurosci Soc. (Personal communication) 2004; 13: 49.
Day HE, Masini CV, Campeau S. The pattern of brain c-fos mRNA induced by a
component of fox odor, 2,5-dihydro-2,4,5-trimethylthiazoline (TMT), in
rats, suggests both systemic and processive stress characteristics. Brain Res
2004;1025:139–51.
Dielenberg RA, Hunt GE, McGregor IS. “When a rat smells a cat”: the
distribution of Fos immunoreactivity in rat brain following exposure to a
predatory odor. Neuroscience 2001;104:1085–97.
Di Scala G, Schmitt P, Karli P. Flight induced by infusion of bicuculline
methiodide into periventricular structures. Brain Res 1984;309:199–208.
Graeff FG. Brain defence systems and anxiety. In: Roth M, Burrows GD, Noyes R,
editors. Handbook of anxiety, vol. 3. Amsterdan: Elsevier Science Publishers;
1990.p.307–54.
Graeff FG. Neuroanatomy and neurotransmitter regulation of defensive
behaviors and related emotions in mammals. Braz J Med Biol Res
1994;27(4):811–29.
Graeff FG. Serotonin the periaqueductal gray and panic. Neurosci Biobehav Rev
2004;28:239–59.
Griebel G, Blanchard DC, Jung A, Lee JC, Masuda CK, Blanchard RJ. Further
evidence that the mouse defense test battery is useful for screening
anxiolytic and panicolytic drugs: effects of acute and chronic treatment with
alprazolam. Neuropharmacology 1995a;34(12):1625–33.
Griebel G, Blanchard DC, Agnes RS, Blanchard RJ. Differential modulation of
antipredator defensive behavior in Swiss–Webster mice following acute or
chronic administration of imipramine and fluoxetine. Psychopharmacol
(Berl) 1995b;120(1):57–66.
Griebel G, Blanchard DC, Blanchard RJ. Predator-elicited flight responses in
Swiss–Webster mice: an experimental model of panic attacks. Prog
Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 1996;20(2):185–205.
Jenck F, Moreau JL, Martin JR. Dorsal periaqueductal gray-induced aversion as
a simulation of panic anxiety: elements of face and predictive validity.
Psychol Res 1995;57(2):181–91.
Keay KA, Bandler R. Parallel circuits mediating distinct emotional coping
reactions to different types of stress. Neurosci Biobehav Rev 2001;25:
669–78.
Leman S, Dielenberg RA, Carrive P. Effect of dorsal periaqueductal gray lesion
on cardiovascular and behavioural responses to contextual conditioned fear
in rats. Behav Brain Res 2003;143:169–76.
Nashold BS, Wilson WP, Slaughter DG. Sensations evoked by stimulation in the
midbrain of man. J Neurosurg 1969;30(1):14–24.
Paxinos G, Franklin KBJ. The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed.
California: Academic Press; 2001.
Schenberg LC, Bittencourt AS, Sudré ECM, Vargas LC. Modeling panic
attacks. Neurosci Behav Rev 2001;25:647–59.
Schenberg LC, Povoa RMF, Costa ALP, Caldellas AV, Tufik S, Bittencourt AS.
Functional specializations within the tectum defense systems of the rats.
Neurosci Behav Rev 2005;29(8):1279–98.
Vargas LC, Schenberg LC. Long-term effects of clomipramine and fluoxetine on
dorsal periaqueductal grey-evoked innate defensive behaviours of the rat.
Psychopharmacol (Berl) 2001;155(3):260–8.
Vianna DML, Brandao ML. Anatomical connections of the periaqueductal gray:
specific neural substrate for different kinds of fear. Braz J Med Biol Res
2003;36:557–66.
147E.F. Carvalho-Netto et al. / Pharmacology, Biochemistry and Behavior 85 (2006) 140–147
Behavioural Brain Research 176 (2007) 222–229
Research report
Effects of intra-PAG infusion of ovine CRF on defensive
behaviors in Swiss-Webster mice
Eduardo F. Carvalho-Netto
a,b,∗
, Yoav Litvin
c,e
, Ricardo L. Nunes-de-Souza
b
,
D. Caroline Blanchard
d,e
, Robert J. Blanchard
c
a
Psychobiology Graduate Program, University of S˜ao Paulo, Ribeir˜ao Preto, SP 14040-901, Brazil
b
Laboratory of Pharmacology, S˜ao Paulo State University, Araraquara, SP 14801-902, Brazil
c
Department of Psychology, University of Hawaii, Honolulu, HI 96822, USA
d
Pacific Biomedical Research Center, University of Hawaii, Honolulu, HI 96822, USA
e
Department of Genetics and Molecular Biology, John A. Burns School of Medicine, University of Hawaii, Honolulu, HI 96822, USA
Received 9 August 2006; received in revised form 29 September 2006; accepted 5 October 2006
Available online 13 November 2006
Abstract
The midbrain dorsal periaqueductal gray (DPAG) is part of the brain defensive system involved in active defense reactions to threatening stimuli.
Corticotrophin releasing factor (CRF) is a peptidergic neurotransmitter that has been strongly implicated in the control of both behavioral and
endocrine responses to threat and stress. We investigated the effect of the nonspecific CRF receptor agonist, ovine CRF (oCRF), injected into the
DPAG of mice, in two predator–stress situations, the mouse defense test battery (MDTB), and the rat exposure test (RET). In the MDTB, oCRF
weakly modified defensive behaviors in mice confronted by the predator (rat); e.g. it increased avoidance distance when the rat was approached
and escape attempts (jump escapes) in forced contact. In the RET, drug infusion enhanced duration in the chamber while reduced tunnel and
surface time, and reduced contact with the screen which divides the subject and the predator. oCRF also reduced both frequency and duration of
risk assessment (stretch attend posture: SAP) in the tunnel and tended to increase freezing. These findings suggest that patterns of defensiveness
in response to low intensity threat (RET) are more sensitive to intra-DPAG oCRF than those triggered by high intensity threats (MDTB). Our data
indicate that CRF systems may be functionally involved in unconditioned defenses to a predator, consonant with a role for DPAG CRF systems in
the regulation of emotionality.
© 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: oCRF; DPAG; Defensive behaviors; Mice; MDTB and RET
1. Introduction
It has been consistently established that one of the funda-
mental brain regions responsible for the command of primitive
flight and fight reactions elicited by proximal threat, acute pain
and asphyxia is the midbrain periaqueductal gray (PAG) mat-
ter [6,20]. The dorsal part (DPAG) of this structure has been
implicated as a site of integration and modulation of the behav-
ioral and autonomic expression of defensive reactions [5,20].
Electrical and chemical (e.g. excitatory amino acid) stimulation
∗
Corresponding author at: Laborat
´
orio de Farmacologia, FCF-UNESP, Rod.
Araraquara-Jau, Km 01, Araraquara, SP 14801-902, Brazil.
Tel.: +55 16 33016985; fax: +55 16 33016980.
E-mail address: [email protected] (E.F. Carvalho-Netto).
of the DPAG leads to explosive motor responses characterized
by vigorous running and apparently aimless vertical jumps in
freely moving experimental animals [4,17,19]. These behaviors
are proposed to reflect aversive responses due to their similarly
with escape reactions induced by natural aversive stimuli, such
as the exposure to a proximal predator [9]. Stimulation of the
DPAG has been done in humans undergoing surgery and these
patients reported intense fear along with autonomic reactions
(e.g. tachycardia and hyperventilation) reminiscent of a full-
blown panic attack [35].
Recently, McNaughton and Corr [31] have argued that brain
structures controlling defensive behaviors related to anxiety (e.g.
risk assessment and avoidance) and fear (e.g. flight) are categor-
ically distinct entities, and these form parallel streams that are
represented at all levels of these systems. According to these
researchers behavioral responses related to anxiety would be
0166-4328/$ – see front matter © 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.bbr.2006.10.003
E.F. Carvalho-Netto et al. / Behavioural Brain Research 176 (2007) 222–229 223
mediated mainly by forebrain structures (e.g. pre-frontal cortex,
septo-hippocampal system); however, the PAG and hypothala-
mus would be the lower-level components of this system. In fact,
many lines of evidence suggest that besides fundamentally con-
trolling fear-like responses [22], the DPAG controls responses
related to anxiety, such as avoidance and risk assessment [18,32].
Several neurotransmitters have been implicated as media-
tors or modulators of the behavioral responses elicitable in the
DPAG, including GABA, glutamate, serotonin, cholecystokinin
(CCK) and neuropeptides such as opioid peptides [6,21].A
number of recent studies suggest a role for the neuropeptide
corticotrophin releasing factor (CRF) in anxiety and fear-related
behaviors [3]. CRF is a 41-amino acid peptide that serves as the
main hypothalamic factor stimulating corticotrophin (ACTH)
release from the anterior pituitary and, in turn, glucocorticoids
from the adrenal cortex [46]. The behavioral effects of cen-
tral administration of CRF mimic those seen in response to
stress, such as place aversion, increased locomotor activity, and
decreased sexual activity [41,27,16]. Chronic activation of the
hypothalamic–pituitary–adrenal (HPA) axis may have patho-
logical consequences for the animal. In stressed animals, CRF
administration potentiates these behaviors [15], whereas CRF
antagonists administered intracerebroventricularly or to the cen-
tral amygdala can block the behavioral effects of stress [7,44].
Albeck et al. [1] reported that stress-responsive subordinate rats
and nonresponsive subordinate rats showed an increase in the
CRF mRNA levels in the central amygdala compared to the con-
trol group, whereas responsive subordinate rats exhibited higher
levels than the dominant rats.
CRF and the CRF-like peptide, urocortin, are also widely dis-
tributed in extrahypothalamic portions of the mammalian brain,
as are a number of CRF-responsive receptor subtypes [23,37].
CRF receptor types include CRF1 and CRF2, which are differ-
entially distributed within the brain. In addition, each receptor
has a number of splice variants. Anatomical studies have iden-
tified several neural sites containing CRFergic neurons [43] and
CRF receptors [47] including the basal nuclei of the amygdala,
hippocampus, bed nucleus of stria terminalis, raphe nuclei and
PAG. It is important to note that these areas are involved in
the processing of anxiety and fear states as well as nociceptive
information [33]. Anatomical heterogeneity of CRF1 and CRF2
suggests the existence of functional differences between them
[8,28]. Overall, evidence accumulated so far has been relatively
consistent for a role of CRF1 in the modulation of anxiety-like
behaviors but much less so for that of CRF2 [45].
Experimental evidence has demonstrated that intracere-
broventricular (i.c.v.) administration of CRF increases anxiety
related behaviors in rodents [2,34]. In addition, transgenic mouse
lines overexpressing CRF exhibited behavioral states resem-
bling anxiety [24]. In order to clarify the neural circuitry under-
lying anxiogenic effects of i.c.v CRF, several studies have inves-
tigated the direct infusion of CRF into discrete brain structures
(for review see [24]). In the DPAG infusion of CRF increased
anxiety-like behaviors in the elevated plus-maze test [29] while
the CRF antagonist, ␣-helical CRF, reduced anxiety-related
behaviors in stress-experienced rats [30]. Although CRF1 recep-
tor subtype might represent the primary target involved in the
mediation of the anxiogenic-like effects of CRF [24], in rodents
both CRF1 and CRF2 mRNA expression are found in PAG [47].
Unconditioned threat stimuli such as encounters with a preda-
tor are widely used to provide measures of behavioral responses
to threat and stress [12]. The present study was designed to inves-
tigate the effect of the nonspecific CRF receptor agonist ovine
CRF (oCRF) injected into the DPAG of mice, in two differ-
ent predator or stress situations, the mouse defense test battery
(MDTB), and the rat exposure test (RET). The MDTB involves
direct confrontation of mouse subjects with a hand-held anes-
thetized rat (predator) that first approaches, then chases, and
finally contacts the mouse. This test elicits a number of high
magnitude behavioral defenses and has proved to be respon-
sive to anxiety and panic-related drugs [11]. The RET [49] was
designed to afford a less intense threat situation, in which a wire
mesh prevents the predator (rat) from approaching or contact-
ing the mouse subject, allowing the subject to seek or avoid
the predator stimulus and thus regulate its own exposure to
threat.
2. Materials and methods
2.1. Subjects
Subjects were male Swiss-Webster mice, obtained from Charles Rivers lab-
oratories (St. Louis, MO). Upon arrival, all mice were single-housed in opaque
polypropylene cages in a temperature controlled room (22 ± 1
◦
C) with ad libi-
tum access to food and water. The mice were acclimatized for 4–6 weeks until
they reached a weight range of 30–40 g. All mice were maintained on a 12 h
light/dark cycle (lights on at 07:00 a.m.). A total of five male Long–Evans rats
were used as predator stimuli during the course of the study.
2.2. Drugs
Ovine corticotrophin releasing factor (oCRF) was obtained from Max-
Planck Institute for Experimental Medicine, Gottingen, Germany and dissolved
in cerebrospinal fluid (CSF). The dose used (30 ng and 100 ng/0.2 ␮l) was based
in previous studies [42,50]. The CSF solution was used as the vehicle compound.
d-Amphetamine sulfate (Research Biochemicals, MA) was dissolved in ster-
ile physiological saline and administered i.p. to rats at a single dose of 5.0 mg/kg
15 min prior to placement into the rat exposure chamber. This procedure was
used to facilitate the maintenance of motor activity and interest in the mouse
subject throughout the course of a 10-min trial duration.
2.3. Surgery
Mice were implanted unilaterally with an 8 mm stainless-steel guide cannula
(26-gauge) under sodium pentobarbital (90 mg/kg, i.p.) anesthesia. The guide
cannula was fixed to the skull using dental cement and jewelers’ screw. Stereo-
taxic coordinates for the dorsal PAG were 4.16 mm posterior to the bregma,
1.32 mm lateral to the midline and 2.23 mm ventral to the skull surface, with
the guide cannula angled 26
◦
to the vertical. A dummy cannula inserted into the
guide cannula at the time of surgery, served to reduce the incidence of occlu-
sion. To prevent accumulation of salivatory and bronchial secretions, 0.01 mg/kg
subcutaneous (s.c.) glycopyrrolate (Luitpold Pharmaceuticals, Shirley, NY), was
administered 15 min before surgery. Upon removal from stereotaxic apparatus
mice were administered 1 ml 0.9% saline s.c. in order to prevent dehydration.
2.4. Intracerebral drug administration
Following a 1-week recovery period, mice were transferred from the main
holding area to the laboratory and left undisturbed for 1 h prior to drug admin-
istration. Each mouse was lightly restrained and a 32-gauge injection cannula
224 E.F. Carvalho-Netto et al. / Behavioural Brain Research 176 (2007) 222–229
(1.0 mm longer than the guide cannula) was inserted into the guide cannula, the
injector connected via PE-10 polyethylene tubing to a 10 ␮l Hamilton microsy-
ringe. The solution administration was controlled by infusion pump (Harvard
Apparatus, Inc. USA) programmed to deliver a volume of 0.2 ␮l over a period of
30 s. The injector remained in place for an additional 30 s (before slow removal)
to allow for maximum drug infusion. Confirmation of successful infusion was
obtained by monitoring the movement of small air bubble in the PE-10 tubing.
Immediately following drug infusion, each animal was returned to its home cage,
brought into the testing room and left undisturbed for 8 min prior to behavioral
evaluation.
2.5. Apparatus
Behavioral responses were measured in the mouse defense test battery
(MDTB) and the rat exposure test (RET) apparatus.
2.5.1. MDTB apparatus
The MDTB used in the present experiments was identical to that described
for Griebel et al. [26] (Fig. 1). The mouse defense test battery is an oval run-
way, 0.40 m wide, 0.30 m high, and 4.8 m in total length, consisting of two
2.0-m straight segments joined by two 0.4-m curved segments, and separated
by a median wall (2.0 m long × 0.30 m high). The apparatus was elevated to
a height of 0.80 m from the floor to minimize the mouse’ visual contact with
the experimenter. All parts of the apparatus were made of black Plexiglas. The
floor of the runway was marked with white lines every 20 cm, to facilitate dis-
tance measurement. Activity was recorded using two ceiling-mounted video
cameras.
2.5.2. RET apparatus
The rat exposure test (Fig. 2) was developed and validated by Yang et al.
[49] to facilitate measurement of risk assessment behaviors in mice. Testing
procedures were conducted in a 46 cm × 24 cm × 21 cm clear polycarbonate
Fig. 1. An overhead view of the MDTB apparatus.
Fig. 2. An overhead view of the RET apparatus.
cage (exposure chamber) covered with a metal lid. The exposure chamber was
divided into two equal-sized compartments by a wire mesh screen. The home
cage was a 7 cm × 7cm× 12 cm box made of black Plexiglas on three sides and
clear Plexiglas on the fourth side to facilitate videotaping. The home chamber
was connected to the exposure cage by a clear Plexiglas tube tunnel (4.4 cm in
diameter, 13 cm in length, 1.5 cm elevated the floor of the two chamber). One
vertically mounted camera linked to a video monitor and DVD was used to
record the experiment.
2.6. Procedure
All testings were conducted during the light phase of the light/dark cycle
under illumination of a 100-W red light. Each apparatus was cleaned with 20%
alcohol and dried with paper towels in between trials.
2.6.1. Experiment 1: mouse defense test battery
Seven days after surgery, each mouse was transported to the experimental
room and left undisturbed for 60 min prior to testing. The mouse received an
intra-PAG injection of CSF or oCRF (30 or 100 ng) and, 8 min later, was run in
the MDTB. The Long–Evans rat used as predator was deeply anesthetized with
sodium pentobarbital (80 mg/kg, i.p.) 10 min before the test session begins. The
MDTB consists of the following subtests.
2.6.1.1. Pretest: evaluation of motor response to drug treatment. Subjects were
placed into the MDTB apparatus for a 3-min familiarization period during which
total line crossings and escape attempts (combined wall rears and jumps) were
recorded.
2.6.1.2. Predator avoidance test. To ensure an initial separation of 2 m between
the threatening stimulus and subject, the test began only when the subject was at
one end of the apparatus. Immediately after the pre-test, a hand-held anesthetized
rat was introduced into the opposite end of the open runway and brought up to
the subject at an approximate speed of 0.5 m/s. Approach was initiated only if
the subject was at a standstill with its head oriented toward the rat. Approach was
terminated when contact with subject occurred, or the subject ran away from
the approaching rat. If the subject fled, avoidance distance (the distance from
the rat to the subject at the point of flight) was recorded. This procedure was
repeated five times, with mean avoidance distance (cm) and number of avoidance
calculated for each subject.
2.6.1.3. Chase/flight test. The hand-held rat was brought up to the subject at
a speed of approximately 2.0 m/s. Chase was initiated only when the subject
was at a standstill with its head oriented toward the rat, and completed when
the subject had traveled a distance of 15 m (∼three laps). Total flight time (time
taken to travel 15 m when the mouse was running forward) was recorded. Overall
E.F. Carvalho-Netto et al. / Behavioural Brain Research 176 (2007) 222–229 225
flight speed (m/s) and maximum linear flight speed (over a 2-m linear segment
of the runway) were subsequently calculated for each animal. In addition, the
number of stops (pause in locomotion) and reversals (subject turned and ran in
the opposite direction) were recorded.
2.6.1.4. Closed alley test. Upon closing two doors (80 cm apart), one runway
was converted into a closed straight alley in which the subject was trapped. The
rat was introduced into one end of the straight alley. Trials began only when the
subject faced the rat at a minimum of 60 cm stimulus-subject distance. Subjects
were given three successive 30 s trials. During a trial, the number of approach-
withdrawals (subject moves more than 20 cm from the closed door toward the
rat, and immediately turns to the closed door) as well as voluntary contacts with
the rat stimulus were recorded. Measures scored included freezing time, jump
escape and jump attack frequencies. The results were expressed as means for
each behavior for each animal.
2.6.1.5. Forced contact test. In this situation, the closed alley length was
reduced to 40 cm. The experimenter quickly approached and touched the subject
with a hand-held rat (five rapid contacts directed toward the subjects’ head). This
procedure was repeated three times. During each trial, the number of vocaliza-
tions, defensive uprights, jump escapes and bites were recorded. The total for
each dependent variable was summed over the three trials for each animal.
2.6.1.6. Post-test. Upon completion of the forced contact test, the alley doors
were opened to permit locomotion around the circular runway. The subject’s
activities were recorded for another 3 min during which time the experimenter
and the rat stimulus were out of sight. Line crossings and escape attempts (rearing
and jump escapes) were recorded.
2.6.2. Experiment 2: rat exposure test
One week after the MDTB procedure the subjects were tested in the rat
exposure test (RET). Prior to the start of each trial, home cage bedding of each
subject was placed on the floor of the home chamber as well as on the surface
of the RET. The testing procedure consisted of two phases.
2.6.2.1. Phase 1: habituation. Each subject was allowed one daily habituation
sessions during three consecutive days in the apparatus. The mouse was placed
in the center of the surface and was allowed to explore freely for 10 min with no
rat present.
2.6.2.2. Phase 2: exposure test. When a mouse was placed into the center
of the surface on Day 4, an amphetamine-treated male Long–Evans rat was
immediately introduced behind the wire mesh. The followed behaviors were
recorded during a 10 min trial.
The behavioral parameters comprised spatiotemporal and ethological mea-
sures. The spatiotemporal measures were frequency and time spent in the home
chamber, tunnel, and on the surface. Time spent in contact with (including
climbing) the wire screen barrier was taken as total (barrier) contact time. The
ethological measures were frequency and duration of risk assessment (stretch
attend postures, an exploratory posture in which the body is stretched forward
but the animal’s hind paws remain in position, and stretched approach, in which
the body is stretched while moving forward); freezing (complete cessation of
movement except breathing); defensive burying (digging and/or pushing of the
sawdust); and self-grooming.
2.7. Histology
Mice were sacrificed with an overdose of sodium pentobarbital and received
an infusion of 10% methylene blue intra-DPAG (according to the microinjec-
tion procedure described above). The animals were perfused intra-cardially with
10 cc 0.9% formalin and their brain were removed from the cranial cavity and
stored in 10% formalin/30% sucrose solution for at least 48 h before histolog-
ical analysis. Mouse brain was coronally sectioned by a cryostat (50 ␮m) and
microscopically verified with reference to the atlas of Paxinos and Franklin [38].
Data from animals with injection sites outside the DPAG were excluded from
analysis.
2.8. Statistical analyses
The behavioral data from the MDTB and RET were analyzed by one-way
analysis of variance (ANOVA-vehicle, low dose and high dose as between-
subjects factors) for parametrically distributed data, or Kruskall–Wallis for
non-parametrically distributed data. Post hoc Newman-Keuls tests were con-
ducted for significant treatment effects relative to control means (parametric),
and Mann–Whitney U-tests (non-parametric). A P value ≤0.05 was considered
significant.
2.9. Ethics
All procedures were run in accord with protocols approved by the University
of Hawaii Institutional Animal Care and Use Committee.
3. Results
Histology confirmed that a total of 31 mice had accurate can-
nula placements in the DPAG and 6 had placements outside of
the respective circumscribed area (Fig. 3).
3.1. Experiment 1: mouse defense test battery
All behavioral data (means ± S.E.M. and F value) from the
mouse defense test battery are listed in Table 1. The one-way
ANOVA indicates significant main effects of oCRF injection
on predator avoidance and forced contact tasks. Newman-Keuls
post hoc test shows that the animals treated with oCRF (100 ng)
exhibited higher avoidance distance as the reaction to the preda-
Fig. 3. Schematic representation of microinfusion sites within (filled circle) and
outside (blank circle) the midbrain periaqueductal gray (PAG) of the mouse.
The number of the filled circle in the figure is less than the total number of mice
because of the overlaps.
226 E.F. Carvalho-Netto et al. / Behavioural Brain Research 176 (2007) 222–229
Table 1
Effect of oCRF infusions in the DPAG on behavioral responses of mice confronted with a rat in the mouse defense test battery
Behaviors Control oCRF 30 ng oCRF 100 ng F(2, 28)
Pretest activity
Line crossing 200.4 ± 19.5 187.4 ± 6.6 182.3 ± 15.7 0.39
Escape attempts 9.5 ± 2.1 9.1 ± 2.1 6.7 ± 2.3 0.47
Predator avoidance test
Avoidance distance (cm) 45.7 ± 10.4 44.9 ± 6.7 75.4 ± 8.3
*
3.69
Avoidance frequency 1.4 ± 0.3 2.1 ± 0.4 2.2 ± 0.2 1.89
Chase/flight test
Flight speed (m/s) 0.51 ± 0.05 0.53 ± 0.05 0.61 ± 0.04 1.11
Max speed (m/s) 0.8 4 ± 0.06 0.89 ± 0.07 0.94 ± 0.05 0.52
Stops 2.4 ± 1.0 4.8 ± 1.1 2.9 ± 0.5 1.78
Reversals 5.7 ± 1.3 6.7 ± 1.6 4.3 ± 1.5 0.62
Closed alley test
Approaches/withdrawals 1.9 ± 0.2 2.0 ± 0.4 2.3 ± 0.4 0.30
Contacts 1.0 ± 0.3 1.0 ± 0.2 1.3 ± 0.2 0.42
Jump escapes 0.9 ± 0.4 1.8 ± 0.2 1.3 ± 0.2 1.08
Freezing (s) 2.1 ± 0.5 3.7 ± 1.4 1.9 ± 0.6 1.04
Forced contact test
Uprights 12.4 ± 0.9 6.9 ± 1.3
*
8.1 ± 1.6
*
5.50
Vocalization 13.6 ± 0.4 13.4 ± 0.8 14.0 ± 0.9 0.13
Bites 1.6 ± 0.7 1.4 ± 0.6 1.8 ± 1.0 0.07
Jump escapes 2.4 ± 1.0 8.1 ± 1.3
*
7.0 ± 1.6
*
6.03
Post-test
Line crossing 179.5 ± 20.9 152.6 ± 14.0 184.3 ± 23.0 0.80
Escape attempts 27.0 ± 3.1 32.4 ± 3.7 22.4 ± 5.2 0.47
*
P < 0.05 compared to control by Newman–Keuls test.
tor. In the forced contact test, Newman-Keuls test indicated that
both doses of oCRF had effects on escape attempts (increase
jump escapes) and defensive threats (decrease upright postures).
3.2. Experiment 2: rat exposure test
3.2.1. Spatiotemporal measures
One-way ANOVA revealed significant effects of oCRF
(30–100 ng) infusions on home chamber frequency (F(2,
26) = 9.98, P < 0.001) and duration (F(2, 26) = 6.00, P < 0.01), on
tunnel frequency (F(2, 26) = 7.32, P < 0.01) and duration (F(2,
26) = 4.94, P < 0.01), and on surface frequency (F(2, 26) = 5.09,
P < 0.01) with a borderline effect on surface duration (F(2,
26) = 2.99, P = 0.07) (Fig. 4). ANOVA also revealed a border-
line effect on mesh contact frequency (F(2, 26) = 2.87, P = 0.07),
while the Kruskall–Wallis ANOVA followed by Mann–Whitney
U comparisons showed a significant effect on mesh contact dura-
tion (X
2
(2)
= 8.18, P < 0.01) (Fig. 5).
3.2.2. Ethological measures
Intra-DPAG infusions of oCRF decreased tunnel stretch
attend frequency (F(2, 26) = 6.53, P < 0.01) and duration
(F(2, 26) = 6.96, P < 0.01). No significant treatment effects
were obtained for chamber stretched attend frequency (F(2,
26) = 1.80, P > 0.05) or duration (F(2, 26) = 1.43, P > 0.05)
(Fig. 5); freezing duration (X
2
(2)
= 4.16, P > 0.05); burying dura-
tion (F(2, 26) = 0.51, P > 0.05); or grooming duration (F(2,
26) = 0.24, P > 0.05) (Fig. 6).
4. Discussion
This study evaluated the behavioral effects of the pep-
tide oCRF microinjected into the mouse DPAG in two dif-
ferent predator–stress situations: the mouse defense test bat-
tery (MDTB) and the rat exposure test (RET). In the MDTB,
oCRF weakly but consistently modified defensive behaviors
in mice confronted by the predator, with an apparent empha-
sis on avoidance and escape. In this context only the highest
dose of oCRF increased avoidance distance when the rat was
approached. However, when mice were forced to contact the rat,
both doses of oCRF potentiated escape attempts (jump escapes)
while reduced defensive threats (upright posture). This pattern
suggests a primary effect on escape, with a secondary effect on
defensive threat, in that such threat is very dependent on the dis-
tance between prey and predator [10]: if the prey escapes prior
to proximity/contact with the predator, a proportionate decline
in defensive threat – as was obtained – would be expected.
Thus the reduction in defensive threat is compatible with an
overall enhancement of escape/avoidance following oCRF infu-
sion. Earlier studies have demonstrated that acute peripheral
administration of fluoxetine, imipramine or the benzodiazepine
inverse agonist Ro 19-4603 all produced increases in avoidance
and defensive threat behaviors, whereas chronic administration
of fluoxetine or imipramine reduced these behaviors [25,26].
These avoidance changes are consonant with a view that single
acute administrations of SSRIs or tricyclic antidepressants can
enhance the severity and frequency of some anxiety symptoms
E.F. Carvalho-Netto et al. / Behavioural Brain Research 176 (2007) 222–229 227
Fig. 4. Effect of oCRF injected into the dorsal PAG on the spatiotemporal (fre-
quency upper panel and duration lower panel) defensive responses in the rat
exposure test. Each bar represents the mean ± S.E.M.
*
P < 0.05 compared to
control group.
[25], as does Ro 19-4603 in preclinical models of anxiety [36],
and support an interpretation of enhanced anxiety for the present
finding of oCRF-enhanced avoidance in the MDTB. While these
earlier studies found increased, rather than decreased, defensive
attack (as occurred in the present study), they also failed to find
increased escape in the forced contact test, such that proximity
and contact of the subject with the predator was not reduced in
treated animals; a factor important for the elicitation of attack
toward the predator, and significantly reduced in the present
study.
Our findings corroborate a consistent literature demon-
strating that i.c.v. administration of CRF enhances behavioral
responses in several animal models of anxiety (e.g. potenti-
ated acoustic startle response, facilitated fear conditioning and
enhanced shock-induced freezing and fighting behavior) [24].
Microinjection of CRF directly into specific sites such as the
locus coeruleus, amygdala and hypothalamic paraventricular
nucleus has also been shown to intensify anxiety-related behav-
iors (for a review see [24]). Similarly, intra-DPAG infusion of
CRF has been reported to produce anxiogenic-like behavior in
the rat plus-maze test [29].
In contrast to many of these tests, the MDTB involves direct
confrontation of the prey (mouse) with a hand-held anesthetized
rat (predator) that first approaches, then chases, and finally con-
tacts the mouse. This procedure leaves little escape possibility,
Fig. 5. Effect of oCRF injected into the dorsal PAG on the spatiotemporal
and ethological (frequency upper panel and duration lower panel) defensive
responses in the rat exposure test. Each bar represents the mean ± S.E.M.
*
P < 0.05 compared to control group.
providing a very intense threat and eliciting high levels of defen-
sive responses in mice. Thus the relatively mild oCRF effects
recorded in the present study may have been due to the high
level of threat/stress elicited by the MDTB, which might have
Fig. 6. Effect of oCRF injected into the dorsal PAG on the ethological (dura-
tion) defensive responses in the rat exposure test. Each bar represents the
mean ± S.E.M.
228 E.F. Carvalho-Netto et al. / Behavioural Brain Research 176 (2007) 222–229
increased defensive responses to a level considered to be a ceil-
ing effect.
In a recent MDTB study, Yang et al. [50] showed that i.c.v.
injection of oCRF reliably potentiated most of the defensive
behaviors evaluated in CD-1 strain of mice. oCRF robustly
suppressed exploratory activities and increased risk assess-
ment, freezing, avoidance, flight speed and jump escapes.
These findings indicate that the MDTB can support enhanced
defensiveness. However, these apparent contrasting differences
between present results and those reported by Yang et al. [50]
may be related to the different mouse strains used (Swiss-
Webster × CD-1), injection sites (DPAG × i.c.v.), as well as a
substantial difference in the range of doses of oCRF (30–100 ng
versus 450–950 ng). Regarding the latter issue, it could be argued
that higher doses of oCRF would produce stronger results when
injected into the DPAG.
On the other hand, this view of a partial ceiling effect in the
MDTB is compatible with the RET findings described in the
Experiment 2. In the RET, connections of the mouse “home
chamber” via a tunnel to a “surface area” where the predator is
located allow the subject to seek or avoid the predator stimulus
and thus regulate its own exposure to the threat. oCRF infusion
into the DPAG consistently increased a number of measures
of avoidance of the predator. For instance, both doses of oCRF
increased home chamber time while reduced tunnel time, contact
with the wire mesh and surface time (P = 0.06). This avoidance
effect appears to be relatively specific, i.e. although frequency
and duration of risk assessment (stretch attend posture—SAP)
were reduced in the tunnel compartment, relative frequency of
SAP did not change. Behaviors like burying and grooming,
which were mainly exhibited in the home chamber, were not
different in both control and oCRF groups, thus suggesting that
the drug did not provoke any motoric disruption. Although freez-
ing durations appeared to increase in animals treated with oCRF
this effect failed to reach an acceptable level of statistical sig-
nificance.
Our results from RET confirm an overall enhancement of
avoidance following intra-DPAG infusion of oCRF. These find-
ings are in agreement with the results of Experiment 1, in which
oCRF enhanced the avoidance distance as the reaction to the
predator. These results also corroborate previous findings from
Martins et al. [29] who have demonstrated that intra-DPAG infu-
sion of CRF was able to increase the open arm avoidance in the
EPM in rats. In that study, CRF microinjection reduced the per-
centage of entries and percentage of time spent on open arms of
the EPM (anxiety indices), without significantly changing the
number of enclosed arm entries, a measure usually considered
to be an index of general activity [39].
A role of the DPAG in anxiety and, specifically, in panic
attacks has been previously proposed [20]. The flight behavior
or jumping that follows DPAG stimulation [17,40,48] as well as
the reports from human patients undergoing neurosurgery [35]
give support to this view. Present results with MDTB (Experi-
ment 1) corroborate these evidences since intra-DPAG infusion
of oCRF increased escape trials (jump escapes) during the preda-
tor approaches and contacts in the forced contact test. In front
of this evidence, it could be suggested a CRFergic modula-
tion within this midbrain structure on behaviors that have been
related with panic attacks. In addition, the results from Experi-
ment 2 strongly support previous findings [18] emphasizing the
importance of the dorsal region of PAG in the modulation of a
more subtle defensive behavior, such as risk assessment or threat
avoidance. Taken together, these evidences are compatible with
the McNaughton and Corr hypothesis [31] which suggests that
the periaqueductal gray modulates behavioral responses related
to anxiety such as risk assessment and avoidance besides funda-
mentally controlling fear-like responses [22].
It has been previously shown that antipredator defensive
behaviors elicited in the RET respond to drugs effective against
anxiety disorders such as diazepam and buspirone [13]. In other
words, these drugs significantly reduced the spatiotemporal
(avoidance) and ethological (risk assessment) measures. Hence,
it would be reasonable to suggest a potential role for CRF sys-
tems in the DPAG in the regulation of emotionality. Indeed, an
involvement of local CRF receptors on the emotional state has
been confirmed by Martins et al. [30]. These researchers demon-
strated that the enhancement of anxiety induced by forced immo-
bilization was attenuated by intra-DPAG injection of alpha-
helical-CRF
9–41
, a competitive CRF receptor antagonist, in rats
exposed to the plus-maze test. These findings indicate a specific
involvement of CRF-mediated neurotransmission in the DPAG
on anxiety-related behaviors.
In conclusion, the two different predator–stress situations
used in the present study – the MDTB and the RET – indicated
that the patterns of defensiveness in response to low intensity
threat (RET) are more sensitive to intra-DPAG oCRF than those
triggered by high intensity threats (MDTB). Finally, present
results suggest that CRF systems may be functionally involved
in unconditioned defenses, acting in some of the same brain
sites that have previously been investigated as components of an
antipredator defense system [14].
Acknowledgements
This study was supported by CAPES Brazil and University
of Hawaii-USA. E.F. Carvalho-Netto was recipient of CAPES
and R.L. Nunes-de-Souza received a CNPq research fellowship.
References
[1] Albeck DS, McKittrick CR, Blanchard DC, Blanchard RJ, Nikulina J,
McEwen BS, et al. Chronic social stress alters levels of corticotrophin-
releasing factor and arginine vasopressin mRNA in rat brain. J Neurosci
1997;17:4895–903.
[2] Baldwin HA, Rassnick S, Rivier J, Koob GF, Britton KT. CRF antago-
nist reverses the “anxiogenic” response to ethanol withdrawal in the rat.
Psychopharmacology (Berl) 1991;103(2):227–32.
[3] Bale TL, Vale WW. CRF and CRF receptors: role in stress responsivity and
other behaviors. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2004;44:525–57.
[4] Bandler R, DePaulis A, Vergnes M. Identification of midbrain neurones
mediating defensive behavior in the rat by microinjections of excitatory
amino acids. Behav Brain Res 1985;15:107–19.
[5] Bandler R, DePaulis A. Midbrain periaqueductal gray control of defensive
behavior in the cat and the rat. In: Bandler R, DePaulis A, editors. The
midbrain periaqueductal gray matter. New York: Plenun Press; 1991. p.
175–97.
E.F. Carvalho-Netto et al. / Behavioural Brain Research 176 (2007) 222–229 229
[6] Behbehani MM. Functional characteristics of the midbrain periaqueductal
gray. Prog Neurobiol 1995;46(6):575–605.
[7] Berridge CW, Dunn AJ. A corticotropin-releasing factor antagonist reverses
the stress-induced changes of exploratory behavior in mice. Horm Behav
1987;21:393–401.
[8] Bittencourt JC, Sawchenko PE. Do centrally administered neuropeptides
access cognate receptors? An analysis in the central corticotropin-releasing
factor system. J Neurosci 2000;20(3):1142–56.
[9] Blanchard DC, Willians G, Lee EMC, Blanchard RJ. Taming wild Rattus
novergicus by lesions of the mesencephalic central gray. Physiol Psychol
1988;(9):157–63.
[10] Blanchard RJ, Blanchard DC. Anti-predator defense as models of fear and
anxiety. In: Brain PF, Blanchard RJ, Parmigiani S, editors. Fear and defense.
London: Harwood Academic Publishers; 1990. p. 89–108.
[11] Blanchard DC, Griebel G, Blanchard RJ. Mouse defense behaviors: phar-
macological and behavioral assays for anxiety and panic. Neurosci Biobe-
hav Rev 2001;25:205–18.
[12] Blanchard DC, Griebel G, Blanchard RJ. Conditioning and residual
emotionality effects of predator stimuli: some reflections on stress and
emotion. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2003;27(8):1177–
85.
[13] Blanchard DC, Yang M, Markham C, Farrohki CF, Pentkowski NS, Blan-
chard RJ, et al. Diazepam and buspirone effects in c57bl/6j mice in the
rat exposure test (ret) Program no. 784.3. 2004 abstract viewer/itinerary
planner. Washington, DC: Society for Neuroscience; 2004, online.
[14] Blanchard DC, Canteras NS, Markham C, Pentkowski NS, Blanchard RJ.
Lesions of structures showing FOS expression to cat presentation: effects on
responsivity to a Cat, Cat odor, and nonpredator threat. Neurosci Biobehav
Rev 2005;29(8):1243–53.
[15] Britton DR, Koob GF, Rivier J, Vale W. Intraventricular CRF enhances
behavioral effects of novelty. Life Sci 1982;31:363–7.
[16] Cador M, Ahmed SH, Koob GF, Le Moal M, Stinus L. Corticotropin-
releasing factor induces a place aversion independent of its neuroendocrine
role. Brain Res 1992;597:304–9.
[17] Carvalho-Netto EF, Markham C, Blanchard DC, Nunes-de-Souza RL,
Blanchard RJ. Physical environment modulates the behavioral responses
induced by chemical stimulation of dorsal periaqueductal gray in mice.
Pharmacol Biochem Behav 2006;85(1):140–7.
[18] Carobrez AP, Teixeira KV, Graeff FG. Modulation of defensive behavior
by periaqueductal gray NMDA/glycine-B receptor. Neurosci Biobehav Rev
2001;25(7–8):697–709.
[19] Di Scala G, Schmitt P, Karli P. Flight induced by infusion of bicuculline
methiodide into periventricular structures. Brain Res 1984;309:199–208.
[20] Deakin JFW, Graeff FG. 5-HT and mechanisms of defence. J Psychophar-
macol 1991;5:305–15.
[21] Graeff FG. Neuroanatomy and neurotransmitter regulation of defensive
behaviors and related emotions in mammals. Braz J Med Biol Res
1994;27(4):811–29.
[22] Graeff FG. Serotonin, the periaqueductal gray and panic. Neurosci Biobe-
hav Rev 2004;(28):239–59.
[23] Gray TS, Bingaman EW. The amygdala: corticotropin-releasing factor,
steroids, and stress. Crit Rev Neurobiol 1996;10(2):155–68.
[24] Griebel G. Is there a future for neuropeptide receptor ligands in the treat-
ment of anxiety disorders? Pharmacol Ther 1999;82(1):1–61.
[25] Griebel G, Blanchard DC, Agnes RS, Blanchard RJ. Differential modula-
tion of antipredator defensive behavior in Swiss-Webster mice following
acute or chronic administration of imipramine and fluoxetine. Psychophar-
macology 1995;120:57–66.
[26] Griebel G, Blanchard DC, Jung A, Blanchard RJ. A model of ‘antipredator’
defense in Swiss-Webster mice: effects of benzodiazepine receptor ligands
with different intrinsic activities. Behav Pharmacol 1995;(6):732–45.
[27] Lee EH, Tang YP, Chai CY. Stress and corticotropin-releasing factor poten-
tiate center region activity of mice in an open field. Psychopharmacology
1987;93:320–3.
[28] Li C, Vaughan J, Sawchenko PE, Vale WW. Urocortin III-immunoreactive
projections in rat brain: partial overlap with sites of type 2 corticotrophin-
releasing factor receptor expression. J Neurosci 2002;22(3):991–1001.
[29] Martins AP, Marras RA, Guimaraes FS. Anxiogenic effect of corticotropin-
releasing hormone in the dorsal periaqueductal grey. Neuroreport
1997;8(16):3601–4.
[30] Martins AP, Marras RA, Guimaraes FS. Anxiolytic effect of a CRH
receptor antagonist in the dorsal periaqueductal gray. Depress Anxiety
2000;12(2):99–101.
[31] McNaughton N, Corr PJ. A two-dimensional neuropsychology of
defense: fear/anxiety and defensive distance. Neurosci Biobehav Rev
2004;28(3):285–305.
[32] Mendes-Gomes J, Nunes-de-Souza RL. Concurrent nociceptive stimula-
tion impairs the anxiolytic effect of midazolam injected into the periaque-
ductal gray in mice. Brain Res 2005;1047(1):97–104.
[33] Millan MJ. Descending control of pain. Prog Neurobiol
2002;66(6):355–474.
[34] Momose K, Inui A, Asakawa A, Ueno N, Nakajima M, Fujimiya M,
et al. Intracerebroventricularly administered corticotropin-releasing factor
inhibits food intake and produces anxiety-like behaviour at very low doses
in mice. Diabetes Obes Metab 1999;1(5):281–4.
[35] Nashold Jr BS, Wilson WP, Slaughter DG. Sensations evoked by stimula-
tion in the midbrain of man. J Neurosurg 1969;30(1):14–24.
[36] Nicolas LB, Prinssen EP. Social approach-avoidance behavior of a high-
anxiety strain of rats: effects of benzodiazepine receptor ligands. Psy-
chopharmacology (Berl) 2006;184:65–74.
[37] Olschowka JA, O’donohue TL, Mueller GP, Jacobowitz DM. Hypotha-
lamic and extrahypothalamic distribution of CRF-like immunoreac-
tive neurons in the rat brain. Neuroendocrinology 1982;35(4):305–
8.
[38] Paxinos G, Franklin KBJ. The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd
ed. California: Academic Press; 2001.
[39] Rodgers RJ, Johnson NJT. Factor analysis of spatiotemporal and etholog-
ical measures in the murine elevated plus-maze test of anxiety. Pharmacol
Biochem Behav 1995;52:297–303.
[40] Schenberg LC, Bittencourt AS, Sudr
´
e ECM, Vargas LC. Modeling panic
attacks. Neurosci Behav Rev 2001;25:647–59.
[41] Sirinathsingjhi DJ, Rees LH, Rivier J, Vale W. Corticotropinreleasing fac-
tor is a potent inhibitor of sexual receptivity in the female rat. Nature
1983;305:232–5.
[42] Stiedl O, Meyer M, Jahn O, Ogren SO, Spiess J. Corticotropin-releasing
factor receptor 1 and central heart rate regulation in mice during
expression of conditioned fear. J Pharmacol Exp Ther 2005;312(3):905–
16.
[43] Swanson LW, Sawchenko PE, Rivier J, Vale WW. Organization of
ovine corticotropin-releasing factor immunoreactive cells and fibers
in the rat brain: an immunohistochemical study. Neuroendocrinology
1983;36(3):165–86.
[44] Swiergiel AH, Takahashi LK, Kalin NH. Attenuation of stress
induced behavior by antagonism of corticotropin-releasing factor recep-
tors in the central amygdala in the rat. Brain Res 1993;623:229–
34.
[45] Takahashi LK. Role of CRF(1) and CRF(2) receptors in fear and anxiety.
Neurosci Biobehav Rev 2001;25(7–8):627–36.
[46] Vale WW, Rivier C, Perrin M, Smith M, Rivier J. Pharmacology of
gonadotropin releasing hormone: a model regulatorypeptide. Adv Biochem
Psychopharmacol 1981;28:609–25.
[47] Van Pett K, Viau V, Bittencourt JC, Chan RK, Li HY, Arias C, et al. Dis-
tribution of mRNAs encoding CRF receptors in brain and pituitary of rat
and mouse. J Comp Neurol 2000;428(2):191–212.
[48] Vianna DM, Brandao ML. Anatomical connections of the periaqueductal
gray: specific neural substrates for different kinds of fear. Braz J Med Biol
Res 2003;36(5):557–66 (review).
[49] Yang M, Augustsson H, Markham C, Hubbard DT, Webster D, Wall PM,
et al. The rat exposure test: a model of mouse defensive behaviors. Physiol
Behav 2004;81(3):465–73.
[50] Yang M, Farrokhi C, Vasconcellos A, Blanchard RJ, Blanchard DC. Cen-
tral infusion of ovine CRF (oCRF) potentiates defensive behaviors in
CD-1 mice in the mouse defense test battery (MDTB). Behav Brain Res
2006;171(1):1–8.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo