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Instituto de Biologia da Universidade de Brasília
Departamento de Ciências Fisiológicas
Laboratório de Anatomia Comparativa dos Vertebrados
Pós-graduação em Biologia Animal
OsteOlOgia de Brachycephalus (anura:
Brachycephalidae): desenvOlvimentO e diversidade
mOrfOlógica das placas ósseas,
regiãO auditiva e sua impOrtância para O mOnOfiletismO
dO gênerO
Leandro Ambrósio Campos
Dissertação de Mestrado
Fevereiro de 2007
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Osteologia de Brachycephalus (Anura,
Brachycephalidae): desenvolvimento e diversidade
morfológica das placas ósseas, região auditiva e sua
importância para o monofiletismo do gênero
Leandro Ambrósio Campos
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Biologia Animal do
Instituto de Biologia da Universidade de
Brasília para a obtenção do título de Mestre
em Biologia Animal
Orientador: Dr. Antônio Sebben
Brasília, fevereiro de 2007
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Dedico aos meus pais João (1932-2005) e Corina,
aos meus irmãos, especialmte ao Flávio, pelos sarifí-
cios pela minha formação.
agradecimentOs:
Ao Prof. Dr. Antonio Sebben, pela orientação, e pela amizade e companherismo ao longo de
todo o trabalho.
Ao Dr. Hélio Ricardo da Silva, pela grande contribuição no trabalho, leitura de manuscritos e
busca por dados.
Ao Prof. Dr. Osmindo Rodrigues Pires Jr., por permitir minha participação em suas
expedições de coleta e pela grande ajuda no campo.
À mestra Leonora Tavares Bastos, minha companheira, pela presença e compreensão em os
todos os momentos difíceis, e também pelo auxílio nas técnicas de MEV.
Aos estagiários Andréa Lessa Benedet e Flávio Henrique Corrêa Brandão, pela amizade e
ajuda ao longo de todo o projeto.
À Profª Dra Sônia Nair Bao, pela instrução e permissão de uso do MEV.
Aos técnicos Washington José de Oliveira e Valter Cesar Fernandes Silveira, pelo
companherismo e auxílio ao longo do trabalho.
Ao Dr. Luis Fernando Ribeiro, pela doação de espécimes de Brachycephalus bruneus.
À Reginaldo Machado, pela doação de espécimes de Brachycephalus pernix.
Aos Biólogos Rafael Camilo Laia, Rodrigo Morales e Darlan Aragão, pela amizade e auxílio
no campo.
Aos estagiários Fábio Viegas Caixeta e Natiela Beatriz de Oliveira, pela amizade e auxílios
prestados.
Ao mestre Natan Medeiros Maciel, pela amizade e auxílio ao longo do trabalho.
Ao Biólogo Rubens Hisanari Matsushita, pela ajuda no campo e na preparação das imagens
digitais.
À Dra. Adriene Fernandes e a mestra Mariana Zatz, pela contribuição no trabalho.
À bióloga Édelyn Cristina Nunes Silva, pela preparação de lâminas histológicas.
À Profª Dra. Rosana Tidon Skloz, pela permissão de uso do microscópio de luz.
Ao Prof. Dr. José Roberto Pujol, pela permissão de uso do microscópio de luz e câmera
fotográca.
À Profª Dra Maria Júlia da Silva, pelo empréstimo do estereomicroscópio e equipamento
i
fotográco.
Aos professores Carlos Alberto Schwartz e Elizabeth Ferroni Schwartz, pelos auxílios
prestados ao longo do trabalho.
Aos demais alunos do LACV, Thompson França Tomatieli, Pedro Ivo Molina Pellicano,
Patrícia Sousa Wanderley, Armando Queiroz Teixera Jr, pela amizade e ajuda ao longo do
trabalho.
Ao CNPq, pela bolsa concedida, processo 132528/2005-3. À Universidade de Brasília e ao
Instituto de Biologia, por conceder as instalações necessárias para o desenvolvimento do
projeto. Ao RAN/ IBAMA, pela permissão de coleta e transporte dos espécimes usados no
trabalho (número 0193/05, processo número 02010.003041/05-87). À prefeitura municipal de
Atibaia, pela permissão de visita e coleta no parque municipal da Grota Funda.
ii
Índice
Agradecimentos.................................................................................................................. i
Resumo............................................................................................................................... viii
Abstract.............................................................................................................................. xi
Capítulo 1: Desenvolvimento e diversidade morfológica das placas ósseas no gênero
Brachycephalus..................................................................................................................
1
Introdução....................................................................................................................... 1
Novidades Morfológicas e miniaturização em Brachycephalus.................................
1
Hiperossicação e osteoderme em Brachycephalus..................................................
2
Objetivos ...................................................................................................................... 3
Material e Métodos........................................................................................................ 4
Preparação de esqueletos........................................................................................ 5
Histologia............................................................................................................... 6
Maceração e MEV.................................................................................................. 5
Resultados.................................................................................................................... 7
1.1 Desenvolvimento das placas ósseas craniais, vertebrais e paravertebrais de
Brachycephalus ephippium ...................................................................................
7
Placas craniais.................................................................................................... 6
Ornamentações do frontoparietal....................................................................... 7
Desenvolvimento das placas paróticas............................................................... 9
Ossos do teto do crânio...................................................................................... 15
Placas espinhais e paravertebrais........................................................................ 15
Desenvolvimento das placas espinhais e paravertebrais.................................... 19
Morfologia do crânio de adultos de Brachycephalus ephippium.......................
22
Placa parótica................................................................................................. 22
Demais ossos do crânio.................................................................................. 22
Morfologia das vértebras de adultos de Brachycephalus ephippium...................
24
Placas espinhais e paravertebrais.................................................................. 24
1.2 Diversidade morfológica das placas craniais, vertebrais e paravertebrais no1.2 Diversidade morfológica das placas craniais, vertebrais e paravertebrais no
gênero Brachycephalus.........................................................................................
26
Placa parótica de Brachycephalus vertebralis, Brachycephalus sp2 e
Brachycephalus nodoterga..............................................................................
26
Placa parótica de Brachycephalus sp1............................................................
28
Placas espinhais e para-vertebrais de B. nodoterga, B. vertebralis, e
Brachycephalus sp2.........................................................................................
28
Placas espinhais e para-vertebrais em Brachycephalus sp1............................
30
Discussão............................................................................................................................ 32
iii
Desenvolvimento............................................................................................................ 32
Placa parótica........................................................................................................... 32
Placas espinhais e paravertebrais............................................................................. 32
Formação...................................................................................................................... 34
Placas ósseas de Brachycephalus: osteoderme ou osso ordinário?..............................
35
Variações morfológicas entre as espécies do gênero Brachycephalus........................
37
Capítulo 2: Elementos da região auditiva em Brachycephalus e sua importância para o
monoletismo do gênero....................................................................................................
40
Introdução..................................................................................................................... 40
Materiais e métodos..................................................................................................... 41
Resultados.................................................................................................................... 42
O ouvido médio e externo de Brachycephalus........................................................
41
Discussão...................................................................................................................... 43
O ouvido médio e externo de Anuros...................................................................... 43
Conclusões gerais............................................................................................................... 52
Referências Bibliográcas.................................................................................................. 53
Apêndices........................................................................................................................... 58
Apêndice 1: Espécimes examinados no presente trabalho.............................................. 58
Apêndice 2: Artigo referente ao segundo capítulo desta dissertação.............................. 59
iv
Capítulo 1
Figura 1
Cortes transversais (nível 1 da Fig. 1C) do crânio de Brachycephalus
ephippium evidenciando a placa parótica. A- Espécime de Cotia (CRC=
8,06 mm), tricrômio de Manson, aumento de aproximadamente 100x. B-
Espécime de Cotia (CRC= 9,10mm), tricrômio de Gomori, aumento de
aproximadamente 400x. C- Níveis dos cortes transversais de histologia: Cc-
condrócito; Cp- crista parótica; Ec- estrato compacto; Ee- estrato esponjoso;
Eost- endósteo; Ep- epiderme; Cpost- condro-periósteo; M- matriz óssea;
Ob- osteoblasto; Oc- osteoclasto; Plp- placa parótica ..................................
8
Figura 2
Cortes transversais de jovens de Brachycephalus ephippim evidenciando o
osso frontoparietal (nível 1 da Fig. 1C). A- (CRC= 8,06 mm), tricrômio de
Manson, aumento de aproximadamente 100x; B- (CRC= 9,10 mm), tricrômio
de Gomori, aumento de aproximadamente 400x. Fpari etal- frontoparietal;
Cparótica- crista parótica; Ec- estrato compacto; Esv- espículasverticais;
Ob- osteoblastos ............................................................................................
10
Figura 3
Espécime jovem de Brachycephalus ephippium (CRC = 8,08mm). A - Vista
lateral. B e C- vista dorsal. 1- frontoparietal; 2- osso nasal; 3- placa paótica;
4- esquamosal; 5- exoccipital, 6- cápsula ótica. Barras equivalem a 1mm ..
11
Figura 4
Jovem de Brachycephalus ephippium com CRC= 10,58mm. A - vista lateral.
B e C vista dorsais. 1- Frontoparietal; 2- osso nasal; 3- placa parótica; 4-
esquamosal; 5- exoccipital; 6- cápsula ótica. Barras equivalem a 1mm .......
12
Figura 5
Jovem de Brachycephalus ephippium com CRC= 12,85mm. A - vista lateral.
B e C vista dorsais. 1- Frontoparietal; 2- osso nasal; 3- placa parótica; 4-
esquamosal; 5- exoccipital. Barras equivalem a 1mm .................................. 13
Figura 6
Jovem de Brachycephalus ephippium com CRC= 13,52mm. A- vista latera.
B e C vistas dorsais. 1- Frontoparietais; 2- osso nasal; 3- placa parótica; 4-
esquamosal. Barras equivalem a 1mm .......................................................... 14
Figura 7
Cortes transversais de jovem de Brachycephalus ephippium de Cotia
(CRC= 9,10 mm), evidenciando as placas paravertebrais. A e B tricrômio
de Gomori, aumento de aproximadamente 100x (nível 3 da Fig 1C). Cpost-
condro-periósteo; Ec- estrato compacto da derme; Ep- epiderme; Esv-
espícula vertical; Ppv- placa para-vertebral; Pt IV- processo transverso da
vértebra IV; Pt V- processo transverso da vértebra V ................................... 17
Figura 8 Detalhes da associação entre a placa para-vertebral e os processos transver-
sos. A e B- (mesmo exemplar da gura 7) tricrômio de Gomori, Aumento
de aproximadamente 400x (nível 3 da Fig. 1C) . Cb- condroblasto; Cc-
condrócito; Ec- estrato compacto; Ee- estrato esponjoso; Ep- epiderme;
Cpost- condro-periósteo; M- matriz; Ob- osteoblasto; Oc- osteócito; Osc-
osteoclasto; Ost- osteóide; Pc- pericôndrio; Post- periósteo ........................ 18
Lista de Figuras
v
Figura 9
Região do processo espinhal de Brachycephalus ephippium de Cotia (CRC=
9,10 mm). Corado com tricrômio de Gomori (nível 2 da Fig. 1C). Ec- Es-
trato compacto da derme; Ep- epiderme; Pe- processo espinhal; Ple- placa
espinhal. Aumento de aproximadamente 100x ............................................. 19
Figura 10
Coluna vertebral jovens de Brachycephalus ephippium diafanisados. A e
B- vista dorsal e ventral de jovem de 8, 80mm; C e D- vistas dorsal e ventral
de joven com 10, 52mm. De I à VIII- vértebras pré-sacrais; SC- vértebra
sacral; PPV- placa paravertebral. Barras equivalem a 1mm ......................... 20
Figura 11
Coluna vertebral de jóvens de Brachycephalus ephippium. A e B- vistas
dosal e ventral de exemplar com 12,85mm; C e D- vistas dorsal e ventral de
exemplar com 13, 58mm. De I a VIII- vértebras pré-sacrais; SC- vértebra
sacral; PPV- placa paravertebral; PI à PVIII- placas espinhais I à VIII. Bar-
ras equivalem a 1mm .................................................................................... 21
Figura 12.
Crânios de exemplares adultos. A e B vistas dorsal e lateral de Brachyce-
phalus ephippium de Atibaia SP; C imagem de varredura da vista ventral do
crânio de Brachycephalus ephippium de Cotia SP. 1- frontoparietal; 2- osso
nasal; 3- placa parietal; 4- esquamosal; 5- exoccipital; 7- pré- maxilar; 8-
maxilar; 9- cápsula ótica; 10- paraesfenóide; 11- vômer; 12-esfenetimóide;
13- forâme da veia jugular; 14- fomâme do nervo óptico; 15- forâme do
nervo óculo-motor; 16- forâme do nervo trigêmio; 17- janela oval. Barras
equivalem a 1mm .......................................................................................... 23
Figura 13
Região vertebral de exemplares adultos de Brachycephalus ephippium pro-
cedentes de Atibaia (A e B), Cotia (C e D) e Itamonte (E). A e B- vistas
dorsal e ventral de exemplares diafanisados; C- MEV da vista dorsal das
vértebras ; C e D vistas ventrais da região da placa paravertebral. De I a
VIII- vértebras pré-sacrais; PPV- placa paravertebral; PI à PVIII- placas es-
pinhais I à VIII. Barras equivalem a 1mm .................................................... 25
Figura 14
Morfologia do crânio de adultos de Brachycephaus. A e B- Vistas dorsal e
ventral de Brachycephalus pernix; C e D- vistas dorsal e ventral de exem-
plares de B. cf. vertebralis de Ubatuba, SP. 1- frontoparietal; 2- osso nasal;
3- placa parietal; 4- esquamosal; 5- pré-maxilar, 6- maxilar; 7- quadradofu-
gal; 8- crista pós-orbital. Barras equivalem a 1mm ...................................... 27
Figura 15
Crânios de Brachycephalus sp1 de Nova Friburgo, RJ. A e B- Vistas dorsal
e lataral respectivamente. 1- frontoparietal; 2- osso nasal; 3- placa parietal;
4- esquamosal; 5- exoccipital, 6- crista pós-orbital; 7- pré - maxilar; 8- ma-
xilar. Barras equivalem a 1mm ..................................................................... 28
Figura 16
Região das vértebras de espécies de Brachycephalus. A- MEV do esqueleto
axial de Brachycephalus pernix; B e C diafanização e MEV de exemplares
de B. cf. vertebralis. De I a VIII- vértebras pré-sacrais; SC- vértebra sacral;
PPV- placa paravertebral; PI à PVIII- placas espinhais I à VIII; PSC- placa
espinhal da vértebra sacral. Barras equivalem a 1mm .................................. 29
vi
Figura 17
Região vertebral de Brachycephalus sp1. A- vista dorsal; B- vista ventral.
De I a VIII- vértebras pré-sacrais; SC- vértebra sacral; PPV- placa para-ver-
tebral; PI a PVIII- placas espinhais I a VIII; Psacral- placa espinhal da vér-
tebra sacral. Barras equivalem a 1mm .......................................................... 31
Capítulo 2
Figura 1
A-Vista posterior do crânio de Brachycephalus ephippium, em
posição equivalente ao decúbito dorsal, de exemplar macera-
do: 1- Janela oval; 2- placa parótica; 3- forâme da veia jugular; 4-
côndilo occipital; 5- forâme magno. B- Vista ventral de crânio diafa-
nizado de Brachycephalus pernix: 1- Opérculo; 2- processo posterior;
3- cápsula ótica; 4- esquamosal; 5 quadradojugal; 6- paraesfenóide.
Barras equivalem à 1mm ............................................................................. 41
Figura 2 A e B- Vistas ventrais da região posterior do crânio e cintura escapular de
microdissecção a fresco Brachycephalus ephippium, evidenciando o siste-
ma opérculo, m. escapular e supraescápula (deslocada). B- Vista ventral de
exemplar diafanizado de Barycholos ternetizi: 1- Anel timpánico; 2- janela
oval; 3- columela; 4- esquamosal; 5- exoccipital; 6- atlas ............................ 45
Figura 3
Vista palmar dos pés direito (A) e esquerdo (B) de Brachycephalus hermo-
genesi. Setas indicam falanges não ossicadas no pé esquerdo, cujos corres-
pondentes no pé direito estão completamente ossicadas ........................ 51
vii
resumO
O surgimento de novidades morfológicas e o aumento de tamanho e de complexidade
são eventos evolutivos raros. Por outro lado, a redução de tamanho e a perda de estruturas
e de complexidade talvez sejam os eventos mais comuns no processo evolutivo. No gênero
Brachycephalus, encontramos um mosaico dessas duas tendências: simplicação e novidades
morfológicas. Na diagnose de todas as espécies deste gênero, menciona-se a presença e
ausência de ossicações dérmicas. No entanto, nem todos os trabalhos de descrição usam
métodos apropriados para a descrição de dados osteológicos. As placas ósseas associadas às
vértebras e ao crânio de Brachycephalus ephippium foram classicadas como osteoderme.
Contudo, o desenvolvimento ontogenético dessas estruturas não foi estudado.
O recente trabalho de Frost et al. (2006), propões várias mudanças na taxonomia
e sistemática na maioria das grandes famílias de anfíbios. De acordo com este trabalho,
não existem caracteres morfológicos que suportem a monoletismo do gênero
Brachycephalus. Adicionalmente, este trabalho sugere a proximidade logenética entre os
gêneros Brachycephalus, Euparkerella e Adelophryne, baseada em padrões supostamente
homólogos de redução e perda de falanges. Entretanto, essas hipóteses foram baseadas
apenas em Brachycephalus ephippium, que por décadas foi a única espécie do gênero.
Consequentemente, muito da diversidade osteológica do gênero Brachycephalus não foi
considera nestes estudos prévios. Os objetivos desta dissertação foram: 1) a descrição
da ontogenia das placas ósseas associadas ao crânio e vértebras de Brachycephalus
ephippium; 2) a descrição da diversidade morfológica das placas ósseas entre espécies do
gênero Brachycephalus e 3) avaliar a importância da osteologia do aparato auditivo de
Brachycephalus para o monoletismo do gênero. Adicionalmente, reavaliamos os dados da
literatura sobre redução de falanges no grupo e as conseqüências taxonômicas envolvidas.
Exemplares de Brachycephalus ephippium foram coletados em Atibaia, Cotia, Mogi
das Cruzes e Itamonte. Incluímos também espécimes de B. brunneus, B. hermogenesi,
B. nodoterga, B. pernix, B. cf. vertebralis, B. vertebralis, e duas espécies não descritas
aqui referidas como Brachycephalus sp1 (de Nova Friburgo e Petrópolis) e B. sp2 (Faz.
Capricórnio, Ubatuba). Os espécimes foram mortos por injeção de cloridrato de bupivicaína
0,2% e então submetidos às seguintes preparações: maceração e microscopia eletrônica de
viii
varredura; diafanização e coloração com alizarina e azul de alcian e microscopia de luz.
Nossos resultados indicam que as placas ósseas de B. ephippium são estruturas independentes
aqui classicadas como ossos ordinários e não como osteoderme. Existem três tipos de
placas ósseas: 1) a placa parótica, localizada na porção postero-lateral do crânio; 2) as placas
espinhais, fusionadas aos processos espinhais de todas as vértebras e 3) as placas para-
vertebrais, associadas aos processos transversos das vértebras IV e V. O tipo de ossicação
das placas ósseas é intermembranoso (também conhecido como ossicação dérmica).
Entretanto, a formação das placas não ocorre no tegumento, como mencionado em trabalhos
anteriores. Adicionalmente, encontramos evidências histológicas de que o pericôndrio das
vértebras em crescimento contribui com células que formam a membrana perióstea das placas
paravertebrais e espinhais. A possibilidade de participação de células da derme na formação
do periósteo das placas ósseas não foi descartada. No entanto, estas estruturas não cabem no
termo osteoderme, que até o momento, está denido de forma confusa, agrupando uma série
de estruturas possivelmente não homólogas. Não existem precedentes na literatura de registro
de estruturas semelhantes às placas paróticas. As placas associadas às vértebras, entretanto,
estruturas possivelmente análogas são encontradas em outros gêneros como Dendrobates,
Ceratophrys e Lepdobatrachus. Todavia, serão necessários estudos osteológicos comparativos
para avaliar as semelhanças entre estas estruturas em outros grupos.
A diversidade morfológica das placas ósseas no gênero Brachycephalus sugere que
possa haver grupos monoléticos dentro do gênero, que seriam identicados pelos seguintes
padrões: 1) ausência de placas ósseas e ornamentações (que ocorre em B. brunneus, B.. brunneus, B.
didactilus, B. ferruginus, B. hermogenesi, B. izecksohni, B. pernix e B. pombali); 2) presença
da placa parótica, das placas espinhais e paravertebrais, com diferentes dimensões, graus de
ornamentação e ossicação (presente nas espécies B. ephippium, B. nodoterga, B. vertebralis,B. ephippium, B. nodoterga, B. vertebralis,
B. sp1 e B. sp2). O monoletismo desses grupos só poderá ser testado por uma análiseO monoletismo desses grupos só poderá ser testado por uma análise
logenética.
No aparato auditivo de Brachycephalus estão ausentes o tímpano, anel timpânico,
tuba de Eustáquio e columela. Adicionalmente, encontramos um grupo de caracteres que
podem corroborar o monoletismo de Brachycephalus: 1) re-orientação posterior da janela
oval; 2) opérculo cobrindo praticamente toda a janela oval; 3) presença do processo posterior
no opérculo, onde se dá a origem do músculo opercular; 4)- perda de uma falange do dígito
ix
V. Adicionalmente, concluímos que a morfologia dos dígitos não corrobora a proximidade
logenética entre Brachycephalus e Euparkerella, ou Adelophryne, como sugerido por Frost
et al. (2006). A posição de Brachycephalus em Brachycephalidae permanece por ser avaliada
em trabalhos futuros.
x
aBstract
The rising of morphological novelties, growth of body size and structural complexity
are uncommon evolutionary events. On the order hand, the miniaturization of body size and
morphological simplication may be the most usual tendencies in the evolutionary process.
Incredibly, both morphological novelties and morphological simplication could be observed
in species of Brachycephalus. In the genus Brachycephalus, in all species diagnosis, the
presence and absence of dermal ossications is mentioned. Nevertheless, not all descriptions
use appropriate methods for osteological studies. The plates associated with vertebrae and
skull of B. ephippium were, previously, identied as osteoderm. Though, there are not any
studies on ontogens and development of these structures in Brachycephalus. The recent work
of Frost et al. (2006) proposes taxonomic and systematic changes in most amphibians family
clades. According to this article, there are no currently known morphological characters
that support the monophyly of the genus Brachycephalus. In addition, Frost et al (2006)
corroborate the hypothesis of a close relationship among geni Brachycephalus, Euparkerella
and Adellophryne, based on digital reduction and loss patterns. Though, these considerations
were made using only B. ephippium, and thus, too much osteological diversity among
Brachycephalus species were not evaluated in previous works.
The goals of this dissertation are:1) ontogenetic description of the bony plates present in
vertebrae and skull of B. ephippium; 2) description of morphological variations in this plates
in species of the genus Brachycephalus; 3) evaluate the importance of the auditory region
osteology and falangeal formulae to the monophyly of the genus Brachycephalus. We also
reevaluate the available information on digital reduction and its importance to the systematics
of the taxa involved.
Units of B. ephippium were collected in Atibaia, Cotia, Mogi das Cruzes, Teresópolis
and Itamonte. In addition, we included units of B. brunneus, B. hermogenesi, B. nodoterga,
B. pernix, B. cf. vertebralis, B. vertebralis, and two undescribed species: Brachycephalus
sp1 (from Nova Friburgo and Petrópolis, RJ Brazil) and Brachycephalus sp2 (from Faz.
Capricórnio, in Ubatuba, SP Brazil). The specimens were killed with bupivicaine chloridrate
(0.2%) and submitted at scanning electronic microscopy. Other specimens were xed in
formalin solution (10%), cleared and double stained with alizarin red and alcian blue Juvenile
xi
specimens of B. ephippium were submitted to histological techniques for ontogenetic
description of the bony plates.
We report that the bony plates are new, independent, and ordinary bone structures, that
arise in early development stages. There are three types of bony plates, where named: 1)
parotic plates, found in the postero-lateral portion of skull; 2) spinal plates, fused with spinal
processes of all vertebrae and 3) paravertebral plates, associated with transverse processes
of IV and V vertebrae.The bony plates type of ossication is intermembranous (named also
as dermal ossication). However, its rising does not take place in integument, like proposed
previously in literature. In addition, we found histological evidences that the perichondrial
membrane of the growing vertebrae, releases cells to form a periosteal membrane of the
paravertebral and spinal plates. The possibility of participation of dermal cells in the
formation of precursor tissue of bony plates was not discarded. However, we decided that
these structures are not osteoderms. This term is confused, and possibly enclose many non
homologous structures. That is the rst time that a structure like the parotic plate is being
reported in literature. However, the spinal and paravertebral plates may have analogous
structures in other genus, as Ceratophrys, Lepidobatrachus and Dendrobates. Nevertheless, a
complementary comparative osteological studies will be necessary to analyzed the semblance
among the bony plates in other geni.
The morphological variations of the bony plates in the genus Brachycephalus suggest
that there are monophyletic groups in the genus, that may be recognized by following
patterns:1- absence of bony plates (occurring in B. brunneus, B. didactylus, B. ferruginus, B.
hermogenesi, B. izecksohni, B. pernix and B. pombali); 2- presence of parotical plates and
spinal and paravertebral plates of variable size and degree of ossication and ornamentation
(occurring in B. ephippium, B. nodoterga, B. vertebralis, B. sp1 and B. sp2). Nevertheless, the
monophyly of these groups remind to be tested in a phylogenetic analysis, using data from
different sources.
The auditory apparatus of most anurans is composed of a tympanic membrane, connected
to the stapes. It is connected to the operculum, which conduces the sound vibrations to the
inner ear. In Brachycephalus species the tympanic membrane and the stapes are absent. In
addition, we discovered a new set of characters that may corroborate the monophyly of the
genus: 1) the posterior orientation of the fenestra ovalis; 2) the enlarged operculum that nearly
xii
lls the fenestra ovalis; 3) bears a large process for the attachment of the m. opercularis
and 4) absence of one phalange in digit V. Analyzing the osteology of species that were
recently included in Brachycephalidae, and other miniaturized species among other groups,
we conclude that these characters are unique to Brachycephalus genus, and support its
monophyly. Other important conclusion is that the digital morphology does not corroborate
a close relationship between Brachycephalus and Euparkerella or either Adeloprhyne, as
suggested by Frost et al. (2006). The position of Brachycephalus in the Brachycephalidae
remains to be analyzed in further investigations.
xiii
capÍtulO 1: desenvOlvimentO e diversidade
mOrfOlógica das placas ósseas nO gênerO
Brachycephalus
intrOduçãO
nOvidades mOrfOlógicas e miniaturi�açãO em mOrfOlógicas e miniaturi�açãO em Brachycephalus
Embora o aparecimento de novidades morfológicas seja um evento raro ao longo
da evolução (Futuyma, 1986), os anuros apresentam várias inovações osteológicas em
relação aos Caudata e Gymnophiona, como os ossos pré-nasal, neopalatino, interfrontal,
internasal e outros ossos dérmicos do crânio até então desconhecidos (Trueb, 1993). A
miniaturização, denida como extrema redução do tamanho do corpo em uma linhagem,
constitui uma importante fonte de novidades morfológicas (Hanken e Wake, 1993; Yeh,
2002). O surgimento de Lissamphibia é atribuído à miniaturização a partir de seus ancestrais
Temnospondyli (Bolt, 1977).
Segundo os critérios de Yeh (2002), onde indivíduos com menos que 25mm são
considerados miniaturizados, todas as espécies do gênero Brachycephalus seriam
miniaturizadas. Brachycephalus ditactylus, com 8,6 mm de comprimento rostro-cloacal
(Izeckshon, 1971), é, provavelmente, o menor tretrápode vivente. Sendo a miniaturização uma
tendência tão importante neste grupo, é provável o surgimento de novidades morfológicas,
principalmente na osteologia. Dentre as possíveis novidades morfológicas destacam-se os
escudos ósseos encontrados em B. ephippium, B. vertebralis e B. nodoterga.
McLachan (1943), um dos pioneiros no estudo da osteologia de Brachycephalus,
descreveu, em detalhes, o crânio de adultos de B ephippium, com base em cortes histológicos
seriados. Izecksohn (1971), ao descrever Psyllophryne didactyla, que não possui placas ósseas
no crânio e nas vértebras, revelou um pouco da diversidade osteológica do grupo. Izecksohn
(1988) comparou as falanges dos membros posteriores e anteriores de B. ephippium, B.
didactylus, Euparkerella brasiliensis, E. cochranae, E. robusta e E. tridactyla. Neste trabalho,
1
o autor propõe a proximidade entre Brachycephalus e Euparkerella. Heyer et al. (1990)
atribuíram o status de espécie para B. nodoterga e registraram a presença de “verrugas
ossicadas” na pele do dorso e ancos dessa espécie, com base em observações externas.
Pombal et al. (1998) descreveram B. pernix, e apresentaram dados sobre cintura escapular e
falanges. Kaplan (2002) propôs a sinonimização de Psillophryne a Brachycephalus, com base
em cortes histológicos que revelaram um pequeníssimo omosterno em B. ephippium. Pombal
(2001) descreveu B. vertebralis e registrou a presença de placas associadas às vértebras.
Nas descrições de B. brunneus e B. izecksohni (Ribeiro et al., 2005) e de B. ferruginus e
B. pombali (Alves et al., 2006), espécimes inteiros foram diafanizados. Os autores fazem
comparações da osteologia entre as novas espécies e B. pernix, B. hermogenesi e B.
ephippium.
hiperOssificãO e OsteOderme em Brachycephalus
Os trabalhos acima expõem uma série de diferenças osteológicas entre as espécies
de Brachycephalus. Várias descrições de espécies incluem caracteres osteológicos em suas
diagnoses. Presença e ausência de ossicações dérmicas e co-ossicação são caracteres
presentes em todas as diagnoses de espécies do gênero Brachycephalus. As placas ósseas
encontradas em Brachycephalus são tratadas como resultado de hiperossicação do crânio e
ossicação dérmica (Duellman e Trueb, 1986). Ruibal e Shoemaker (1984) classicaram tais
estruturas como osteoderme, cuja ocorrência foi também registrada em Dendrobates (Trueb,
1973), Ceratophrys e Lepidobatrachus (Duellman e Trueb, 1986). Segundo estes autores,
hiperossicações podem se manifestar das seguintes formas:
1- Ossicações de estruturas cartilaginosas: em pipídeos todas as cartilagens do crânio são
substituídas por tecido ósseo;
2- Fusões de ossos: em pipídeos, e em algumas espécies de Brachycephalus, os ossos da caixa
craniana se fundem completamente, aumentando a rigidez do crânio.
3- Exostose: ossos do crânio emitem projeções em direção à derme, formando ornamentos.
Ocorrem em alguns bufonídeos e em Ceratophrys.
4- Hipertroa de ossos dérmicos: em bufonídeos, é comum que ossos como esquamosal,
frontaparietal e maxilar possuam processos, abas e cristas relativamente bem desenvolvidas.
5- Co-ossicação: comum em bufonídeos e hilídeos. Na co-ossicação, elementos ósseos
2
que se formam na derme durante o desenvolvimento, crescem e se fundem aos ossos. Como
resultado, temos a pele inteiramente fundida aos ossos.
Na maioria dos casos, a hiperossicação está relacionada aos ossos do crânio, mas
também pode ocorrer nas vértebras, como em Brachycephalus e em outros grupos. A presença
de elementos ósseos no tegumento é um fenômeno largamente distribuído entre vários
grupos de Tetrapoda, com exceção de Aves e Caudata (Romer, 1956). Em répteis, anfíbios
e mamíferos, este fenômeno cou conhecido como osteoderme, ou ossos dentro da derme
(Smith, 1960 apud Ruibal e Shoemaker, 1984). A ocorrência de osteoderme em anuros foi
registrada por Ruibal e Shoemaker (1984). Entretanto, o desenvolvimento ontogenético de
osteoderme foi pouco estudado. Alguns dos poucos trabalhos recentes são os de Gilbert et
al. (2001) sobre o desenvolvimento da carapaça dos cágados Trachemys scripta e Chelidra
serpentina, e o de Vickarius e Hall (2006) sobre o desenvolvimento das placas dérmicas
no tatu Dasypus novemcynctus. A presença de osteoderme entre linhagens distantemente
relacionadas sugere que esses elementos ósseos associados à derme não são homólogos.
Dentre os anuros, poucas são as similaridades encontradas entre as várias formas de
ossicação dérmica.
OBjetivOs
Este capítulo tem os seguintes objetivos:
1- Descrever o desenvolvimento das placas ósseas associadas ao crânio e vértebras de
Brachycephalus ephippium.
2- Analisar a ocorrência de placas ósseas em diferentes espécies do gênero
Brachycephalus, e suas eventuais variações de forma, tamanho e relações anatômicas.
material e métOdOs
No presente estudo foram utilizados exemplares jovens e adultos de Brachyphalus
ephippium, procedentes dos municípios de Cotia (n= 24), Atibaia (n= 20) e Mogi das
Cruzes (n= 18) - SP, Itamonte (n= 21) -MG e Teresópolis (n=11) -RJ . Além de espécimes
preservados e tombados na coleção pessoal do Prof. Dr. Antonio Sebben, exemplares recém-
coletados também foram utilizados.
3
Os animais foram eutanasidos por destruição do sistema nervoso central, por meio de
espinhalação ou anestesiados por contato com solução de Cloridrato de Lidocaina a 2%, em
conformidade com procedimentos éticos preconizados pela Americam Médical Veterinary
Association (AVMA).
Exemplares medindo menos que 14 mm de comprimento rostro-cloacal (CRC) foram
considerados jovens ou pré-adultos. Em cada espécime processado foi observada e registrada
a presença, a forma e o tamanho das placas ósseas, bem como sua relação com estruturas
adjacentes. Ossos de ontogenia conhecida para outras espécies também foram analisados para
inferências cronológicas relacionadas ao nível de desenvolvimento. A Tabela 1 apresenta os
exemplares jovens utilizados no estudo e seus respectivos tamanhos.
Exemplares de outras espécies de Brachycephalus, como B. brunneus (n=1), B.
hermogenesi (n=1), B. nodortega (n=1), B. cf. vertebralis (n=6), foram submetidos à
diafanizanização e posterior análise osteológica. Também foram diafanizados e analisados
exemplares de duas espécies não descritas, a saber: Brachycephalus sp 1 (Nova Friburgo
- RJ, n=12; e Petrópolis – RJ, n=2), além de, Brachycephalus sp 2 (Ubatuba – SP, n=5).
Os respectivos números de tombo de todos os exemplares utilizados no presente estudo
encontram-se listados no Apêndice 1.
4
Tabela 1. Espécimes jovens de Brachycephalus ephippium utilizados no trabalho
População n° de tombo CRC (mm) Processamento
Cotia, SP AS00441 8,06 H
AS00440 8,71 D
AS02543 9,10 H
AS00448 10,02 D
AS00447 10,58 D
AS02542 10,85 H
AS00495 12,21 D
AS00494 12,85 D
Atibaia, SP AS02502 8,08 D
AS02505 11,07 D
AS02503 11,48 D
AS02504 12,11 D
AS00509 13,70 D
AS00502 13,72 D
AS00468 13,82 D
Itamonte, MG AS02496 11,37 D
AS02428 13,52 D
Mogi das Cruzes, SP AS02499 10,71 D
AS02500 13,03 D
H- histologia;
D- diafanização
preparaçãO de esqueletOs
Duas técnicas foram empregadas nas preparações dos esqueletos: diafanização, seguida
de coloração com alizarina e azul de alcian, e maceração, seguida de análise em microscopia
eletrônica de varredura (MEV). Exemplares jovens e adultos de quatro populações de B.
ephippium foram diafanizados segundo o protocolo de Taylor e Van Dyke (1985), com
algumas modicações.
Exemplares previamente xados foram desidratados em etanol 100% por 24 horas.
Posteriormente, as amostras foram submetidas à coloração das cartilagens com solução
corante 1 (ácido acético glacial: etanol absoluto, 4:6 v/v, com 200mg/l de azul de alcian),
por cerca de 24 hs. Depois desse período os espécimes foram submersos em solução de
Borato de Sódio (50g/l) para neutralização do pH, por 48 horas. O processo de clareamento
tem início com a submersão na mistura água oxigenada 10 volumes : solução de KOH 0,5%
(1:5 v/v), com as amostras mantidas por 12 horas à luz natural. Em seguida, as amostras
5
foram submetidas a solução digestiva tamponada, composta por tripsina (1g/l) diluída em
solução de Borato de Sódio (1,5g/l) em água destilada. Após a digestão, os exemplares foram
mergulhados em solução de KOH 0,5% contendo 0,1g/l de vermelho de alizarina, para
coloração dos ossos, por período de até 24 hs. Após lavagem em água corrente, as vísceras e a
pele foram removidas. Os espécimes foram, então, submetidos a soluções de glicerol em KOH
0,5%, por períodos de 12 horas, com as seguintes proporções crescentes de glicerol: 4:6 v/v;
1:1 v/v; 7:3 v/v e glicerol 100%, onde os espécimes cam preservados. Para os espécimes
menores que nove milímetros, não foi necessária a digestão enzimática.
histOlOgia
Para as análises histológicas, 3 exemplares jovens de B. ephippium foram eutanaziados
e xados em solução de formaldeído a 10% durante aproximadamente 12 horas. Em
seguida, os exemplares foram descalcicados em solução de ácido nítrico a 0,5% por
aproximadamente duas horas e mantidos em álcool etílico 70°GL. Então, o material foi
desidratado por meio de banhos consecutivos de meia hora de duração cada, em soluções
alcoólicas com concentrações crescentes de 80 e 90%, seguidos de dois banhos de álcool
absoluto. Após esta etapa, o material foi diafanizado em solução de etanol/xileno 1:1 v/v,
seguida por três banhos de meia hora em xileno 100%.
O material foi, então, incluído em parana, após três banhos a 58ºC. Cortes
transversais semi-seriados com 6µm de espessura foram subtidos às seguintes técnica de
coloração: Hematoxilina de Harris e Eosina, Tricrômio de Gomori e Tricrômio de Manson.
maceraçãO e mev
Para maceração, os espécimes adultos foram eutanasiados, dissecados, eviscerados
e submetidos a tratamento com solução diluída de hipoclorito de sódio, imersão em água
oxigenada (5 volumes), lavagem com água destilada e desidratação com etanol 92 GL, e
então mantidos à temperatura ambiente. Alguns exemplares foram submetidos à microscopia
eletrônica de varredura, técnica para qual os ossos foram cobertos com ouro e fotografados no
microscópio JEOL JEM 840A.
6
resultadOs
1.1: desenvOlvimentO das placas ósseas craniais, verteBrais e paraverteBrais
de Brachycephalus ephippium
Placas craniais
Tanto os cortes histológicos quanto as amostras diafanizadas indicam que as placas
craniais são elementos ósseos independentes, não tendo surgido a partir da hipertroa de
algum outro elemento ósseo do crânio, e portanto merecem um nome próprio. As placas
craniais foram aqui denominadas como placas paróticas devido à sua participação na
cobertura da cápsula ótica.
Cortes transversais semi-seriados dos jovens de B. ephippium evidenciam que as
placas paróticas nestes estágios são formadas por tecido ósseo em processo de mineralização,
caracterizado pela matriz ligeiramente avermelhada contendo alguns osteócitos em seu
interior. Em torno da matriz é possível notar a presença de tecido conjuntivo contendo
osteoblastos com núcleos achatados, o que caracteriza um endósteo. Nas extremidades medial
e lateral da placa, este tecido conjuntivo se espessa e os osteoblastos se acumulam, formando
leiras, que, na última, se projetam ventralmente. (Fig. 1 A). As placas paróticas em formação
se localizam abaixo da derme, onde não ocorre contato direto entre a matriz em mineralização
e o estrato compacto da derme (Fig. 1 A e B). No entanto, alguns osteoblastos que circundam
a matriz em mineralização tocam o estrato compacto, e emitem projeções que invadem a
derme, iniciando as formações conhecidas como ornamentos (Fig. 1 A e B).
Ornamentações dO frOntOPariental
Além de outros elementos em formação no crânio, os cortes transversais mostram
ainda o frontopariental em formação (Fig. 2A e B). Exceto pelo grau de mineralização,
o frontoparietal se encontra da mesma forma que a placa parótica, com um endósteo
circundante, constituído de células osteogênicas achatadas, e a matriz mineralizada contendo
alguns osteócitos isolados. Nesse estágio, a matriz já se encontra bastante mineralizada, mas o
osso ainda não está completo. Na gura 2B está evidenciado um par de espículas de
7
Figura 1. Cortes transversais (nível 1 da Fig. 1C) do crânio de Brachycephalus ephippium
evidenciando a placa parótica. A- Espécime de Cotia (CRC= 8,06 mm), tricrômio de Manson,
aumento de aproximadamente 100x. B- Espécime de Cotia (CRC= 9,10mm), tricrômio de
Gomori, aumento de aproximadamente 400x. C- Níveis dos cortes transversais de histologia:
Cc- condrócito; Cp- crista parótica; Ec- estrato compacto; Ee- estrato esponjoso; Eost-
endósteo; Ep- epiderme; Cpost- condro-periósteo; M- matriz óssea; Ob- osteoblasto; Oc-
osteoclasto; Plp- placa parótica.
1
2
3
c
8
matriz calcicada que se projetam em direção à derme. Estas espículas, que darão o aspecto
ornamentado ao crânio no estágio adulto, irão proliferar neste e em outros ossos do crânio.
Desenvolvimento Das placas paróticas
No menor exemplar diafanizado, com CRC = 8, 08mm, as placas paróticas se
resumem a um par de pequenos discos convenxos, localizadas logo acima da extremidade
posterior do ramo ótico (posterior) do esquamosal, sendo ligeiramente mais larga do que alta
(Fig. 3). Neste estágio, nenhum osso apresentou espículas projetadas em direção à derme.
No espécime com CRC = 10,02mm, a placa parótica passa a apresentar duas porções: uma
lateral e outra dorsal. Enquanto a porção dorsal de desenvolve medialmente, a porção lateral
cresce no sentido crânio-caudal. Essas características são evidenciadas no exemplar com
CRC= 10,58mm (Fig. 4). No exemplar com CRC = 11,37mm, a placa parótica está totalmente
ornamentada. A porção dorsal possui expansão crânio-caudal, que contacta o osso proótico.
No exemplar com CRC = 12,21mm, a placa parótica se expande medialmente, sobrepondo-
se ao exoccipital e à porção dorso-lateral do proótico, passando também a fazer um tênue
contato antero-medial com o frontoparietal. A porção dorsal da placa parótica já se encontra
bastante ornamentada, porém, a porção lateral ainda é pouco desenvolvida, como se verica
no exemplar com CRC= 12,85mm (Figura 5). No espécime com CRC = 13,52mm, a margem
interna funde-se inteiramente ao frontoparietal (Fig. 6). A placa parótica possui um alamento
na metade mais medial da porção dorsal, enquanto a extremidade lateral é mais expandida,
passando da linha posterior do crânio. A porção lateral se desenvolve radialmente, mais o eixo
de maior desenvolvimento é crânio-caudal.
9
Figura 2. Cortes transversais de jovens de Brachycephalus ephippim evidenciando o osso
frontoparietal (nível 1 da Fig. 1C). A- (CRC= 8,06 mm), tricrômio de Manson, aumento
de aproximadamente 100x; B- (CRC= 9,10 mm), tricrômio de Gomori, aumento de
aproximadamente 400x. Fpari etal- frontoparietal; Cparótica- crista parótica; Ec- estrato
compacto; Esv- espículasverticais; Ob- osteoblastos.
10
Figura 3. Espécime jovem de Brachycephalus ephippium (CRC = 8,08mm). A - Vista lateral.
B e C- vista dorsal. 1- frontoparietal; 2- osso nasal; 3- placa parótica; 4- esquamosal; 5-
exoccipital, 6- cápsula ótica. Barras equivalem a 1mm.
11
Figura 4. Jovem de Brachycephalus ephippium com CRC= 10,58mm. A - vista lateral. B
e C vista dorsais. 1- Frontoparietal; 2- osso nasal; 3- placa parótica; 4- esquamosal; 5-
exoccipital; 6- cápsula ótica. Barras equivalem a 1mm.
12
Figura 5. Jovem de Brachycephalus ephippium com CRC= 12,85mm. A - vista lateral. B
e C vista dorsais. 1- Frontoparietal; 2- osso nasal; 3- placa parótica; 4- esquamosal; 5-
exoccipital. Barras equivalem a 1mm.
13
Figura 6. Jovem de Brachycephalus ephippium com CRC= 13,52mm. A- vista latera. B e C
vistas dorsais. 1- Frontoparietal; 2- osso nasal; 3- placa parótica; 4- esquamosal; 5- exoccipi-
tais. Barras equivalem a 1mm.
14
ossos Do teto Do crânio
No menor espécime submetido à diafanização (CRC = 8,08 mm) a cápsula nasal
é bastante aberta, praticamente sem nenhuma cobertura óssea dorsal. Os ossos nasais não
fazem contato medial entre si e ventralmente não estão em contato com o osso maxilar.
Os frontoparietais também não fazem contato medial, mas já se contactam com o par de
proóticos, apresentando também um breve contato com exoccipitais (Fig. 3). Tanto em
vista dorsal como em vista lateral, a cápsula ótica praticamente não apresenta nenhuma
cobertura óssea, exceto por uma pequena “aba parietal” do frontoparietal. Os exoccipitais
não possuem contato medial, tanto dorsalmente quanto ventralmente. Alguns poucos pontos
de ornamentação estão presentes no par de frontoparietais nos espécimes com CRC = 10,02
mm. No espécime com CRC = 11,37 mm, as ornamentações se proliferam em toda a extensão
do frontoparietal. No espécime com CRC = 13,52mm, os frontoparietais estão totalmente
ornamentados, com aspecto similar aos adultos dessa espécie. A cobertura óssea da cápsula
nasal permanece incompleta nos exemplares com CRC = 12,21 mm e 12, 85 mm, apesar do
desenvolvimento dos nasais. Nos espécimes com CRC = 13,52 mm ou mais, os nasais se
apresentam fusionados medialmente, cobrindo totalmente a cápsula nasal. No exemplar com
CRC = 12,21 mm, a cápsula ótica está quase totalmente coberta pelos ossos exoccipitais,
frontoparietais, proóticos e pela placa parótica, enquanto no exemplar com CRC = 13,52 mm
essa cobertura é completa.
placas espinhais e paravertebrais
Tanto as análises histológicas quanto dos exemplares de Brachycephalus ephippium
diafanizados evidenciou a existência de dois conjuntos distintos de placas vertebrais, que
embora sejam fundidas em exemplares adultos, surgem de forma independente. Desses
dois conjuntos de placas, um se associa aos processos espinhais das vértebras pré-sacrais,
incluindo o atlas. A esse conjunto reservamos o nome de placas espinhais. O outro tipo de
placa se associa especicamente aos processos transversos das vértebras pré-sacrais IV e V, e
para essas estruturas atribuímos o nome de placas paravertebrais.
Cortes transversais de jovens de B. ephippium revelam que as placas espinhais e para-
vertebrais são formadas por matriz óssea mineralizada, caracterizada pela coloração vermelha
pelo Tricrômio de Gomori. Em meio a matriz mineralizada encontram-se alguns osteócitos
15
isolados (Fig. 7). Ao redor da matriz mineralizada nota-se um tecido conjuntivo contendo
células com núcleos achatados caracterizando um endósteo. A presença de células com
núcleos cubóides sugere que os osteoblastos estão em intensa atividade.
Nos jovens, a ossicação endocondral dos processos transversos ainda não se
completou. Podemos notar a presença de condrócitos arredondados em meio às lacunas de
matriz cartilaginosa, condrócitos mais elípticos nas bordas e o tecido conjuntivo que circunda
a cartilagem (Fig. 7 e 8), que classicamente é constituído de bras de colágeno tipo I e
broblastos (Junqueira e Carneiro, 1999). Nota-se um contínuo de células ligando o processo
transverso da quarta vértebra e o periósteo que envolve a placa para-vertebral. Na gura 8
percebe-se que o pericôndrio do processo transverso e o endósteo da placa para-vertebral
formam um contínuo de células.
Nota-se que, na maior parte de sua extensão, uma camada de osteoblastos separa a
matriz mineralizada do estrato compacto da derme e que as placas para-vertebrais se associam
à derme eclusivamente pelas espículas ósseas projetadas em direção ao tegumento (Fig. 7 e
8), de forma semelhante ao que acontece no osso frontoparietal (Fig. 2). Nota-se a presença
de um contínuo de células entre o processo transverso da quarta vértebra e os osteoblastos que
circundam a placa paravertebral.
16
Figura 7. Cortes transversais de jovem de Brachycephalus ephippium de Cotia (CRC=
9,10 mm), evidenciando as placas paravertebrais. A e B tricrômio de Gomori, aumento de
aproximadamente 100x (nível 3 da Fig 1C). Cpost- condro-periósteo; Ec- estrato compacto
da derme; Ep- epiderme; Esv- espícula vertical; Ppv- placa paravertebral; Pt IV- processo
transverso da vértebra IV; Pt V- processo transverso da vértebra V;
17
Figura 8. Detalhes da associação entre a placa paravertebral e os proces-
sos transversos. A e B- (mesmo exemplar da gura 7) tricrômio de Gomori,
Aumento de aproximadamente 400x (nível 3 da Fig. 1C) . Cb- condroblasto;
Cc- condrócito; Ec- estrato compacto; Ee- estrato esponjoso; Ep- epiderme;
Cpost- condro-periósteo; M- matriz; Ob- osteoblasto; Oc- osteócito; Osc-
osteoclasto; Ost- osteóide; Pc- pericôndrio; Post- periósteo.
18
Figura 9. Região do processo espinhal de Brachycephalus ephippium de Cotia
(CRC= 9,10 mm). Corado com tricrômio de Gomori (nível 2 da Fig. 1C). Ec-
Estrato compacto da derme; Ep- epiderme; Pe- processo espinhal; Ple- placa
espinhal. Aumento de aproximadamente 100x
Desenvolvimento Das placas espinhais e paravertebrais
Nos espécimes com CRC = 8,08 e 10,52 mm, as placas paravertebrais não atingem
o corpo das vértebras medialmente e apresentam poucas espículas ósseas (Fig. 10). Tais
espículas estão fundidas ao tegumento. No espécime com CRC = 11,37 mm, as placas para-
vertebrais, em expansão medial, já atingem o corpo das vértebras IV e V, e apresentam a
mesma extensão crânio caudal, cobrindo os processos transversos destas. Neste estágio,
são evidentes alguns pontos de ornamentação. Nos exemplares com CRC = 12, 21 e 12,85
mm, já estão presentes as placas espinhais associadas aos processos espinhais das vértebras
pré-sacrais I, II, III, IV, V e VI (Fig. 11 A e B). Com exceção da placa espinhal da vértebra
VI, as demais placas espinhais apresentam espículas ósseas fundidas ao tegumento. As
placas espinhais das vértebras IV e V se apresentam fundidas. Neste estágio, as placas para-
vertebrais apresentam grande expansão crânio-caudal em relação aos estágios anteriores,
passando a cobrir totalmente os processos transversos das vértebras IV, V e VI, e parcialmente
o processo transverso da vértebra III. Medialmente atingem o corpo das vértebras e atingem
as placas espinhais das vértebras IV e V, mas não ocorre fusão (Fig. 11A-D). No exemplar
com CRC = 13,58mm, as espículas ósseas, que até estão se projetavam verticalmente em
19
Figura 10. Coluna vertebral jovens de Brachycephalus ephippium diafanizados. A e B- vista
dorsal e ventral de jovem de 8, 80mm; C e D- vistas dorsal e ventral de joven com 10, 52mm.
De I à VIII- vértebras pré-sacrais; SC- vértebra sacral; PPV- placa paravertebral. Barras
equivalem a 1mm.
direção ao tegumento, passam a apresentar crescimento horizontal, formando sulcos e cristas,
dando o aspecto ornamentado das placas espinhais e para-vertebrais típico dos adultos de B.
ephippium (Fig. 12C e D). Neste exemplar, as placas espinhais das vértebras I e II aparecem
fusionadas e bastante expandidas lateralmente. As placas para-vertebrais estão bastante
justapostas às placas espinhais IV e V, mas ainda sem fusão. Cobrem totalmente os processos
transversos das vértebras IV e V, e as extremidades dos processos transversos das vértebras III
e VI.
20
Figura 11. Coluna vertebral de jovens de Brachycephalus ephippium. A e B- vistas dorsal e
ventral de exemplar com 12,85mm; C e D- vistas dorsal e ventral de exemplar com 13,58 mm.
De I a VIII- vértebras pré-sacrais; SC- vértebra sacral; PPV- placa paravertebral; PI à PVIII-
placas espinhais I à VIII. Barras equivalem a 1mm.
21
Morfologia do crânio de adultos de Brachycephalus ephippium
placa parótica
Em adultos de B. ephippium, as placas paróticas cobrem quase toda superfície dorsal
da cápsula ótica, deixando à mostra apenas uma porção do proótico. Sua margem anterior
acompanha as margens do proótico, enquanto a margem posterior tem forma de parábola e
ultrapassa os limites posteriores do crânio. Na face lateral, a placa parótica tem forma elíptica.
Cobre totalmente o ramo posterior do esquamosal e aproximadamente 2/3 da face lateral da
cápsula ótica (Fig. 12 A e B).
Demais ossos Do crânio
Em vista dorsal, notamos a fusão do frontoparietal ao proótico e exocipital. Os nasais
também são fundidos medialmente e cobrem totalmente as cápsulas nasais. Os sulcos
occipitais são totalmente cobertos. As ornamentações ocorrem em toda a superfície dos
frontoparientais e das placas paróticas. Os nasais apresentam a face dorsal parcialmente
ornamentada, enquanto a face lateral possui um trecho de ornamentação formando uma crista
nasal (Fig. 12 A).
Na face ventral do crânio, todos os ossos do neurocrânio são fundidos, e só é possível
visualizar as margens do paraesfenóide. Os demais ossos, esfenetimóide, proótico, e
exoccipitais são indistingüíveis entre si. O neopalatino é ausente. O vômer se funde ao
esfenetimóide (Fig. 12 C).
O esquamosal tem redução acentuada do ramo anterior, enquanto o ramo posterior tem
a área dorsal aumentada por uma lâmina óssea que contacta a placa parótica lateralmente.
Anteriormente, essa lâmina óssea se projeta ventralmente formando um contínuo com o ramo
ventral do esquamosal.
Os ramos posterior e medial do pterigóide se fundem totalmente ao esquamosal, de forma
que não é possível distingüi-los. O ramo anterior é bastante delgado e se projeta em direção ao
maxilar, mas não chega a articular com o mesmo.
22
Figura 12. Crânios de exemplares adultos. A e B vistas dorsal e lateral de Brachycephalus
ephippium de Atibaia SP; C imagem de varredura da vista ventral do crânio de Brachycepha-
lus ephippium de Cotia SP. 1- frontoparietal; 2- osso nasal; 3- placa parietal; 4- esquamosal;1- frontoparietal; 2- osso nasal; 3- placa parietal; 4- esquamosal;
5- exoccipital; 7- pré- maxilar; 8- maxilar; 9- cápsula ótica; 10- paraesfenóide; 11- vômer; 12-
esfenetimóide; 13- forâme da veia jugular; 14- fomâme do nervo óptico; 15- forâme do nervo
óculo-motor; 16- forâme do nervo trigêmio; 17- janela oval. Barras equivalem a 1mm.
23
Morfologia das vértebras de adultos de Brachycephalus ephippium
placas espinhais e para-vertebrais
As placas espinhais estão presentes na vértebra sacral e em todas as vértebras pré-sacrais
de adultos de Brachycephalus ephippium (Fig. 13 A e C). Já, as ornamentações só ocorrem
nas placas espinhais das vértebras de I a VI, inclusive VII e VIII, em alguns exemplares. As
placas espinhais I e II, e VI e V, via de regra, aparecem fundidas.
Em adultos, as placas para-vertebrais fusionam-se às extremidades dos processos
transversos das vértebras IV e V (Fig. 13 B, D e E), em todos os exemplares examinados.
Medialmente, fundem-se às placas espinhais das vértebras IV e V. No eixo crânio-caudal, as
placas para-vertebrais recobrem parcialmente os processos transversos das vértebras III e VII,
enquanto os processos transversos das vértebras IV, V e VI são totalmente recobertos.
24
Figura 13. Região vertebral de exemplares adultos de Brachycephalus ephippium procedentes
de Atibaia (A e B), Cotia (C e D) e Itamonte (E). A e B- vistas dorsal e ventral de exemplares
diafanizados; C- MEV da vista dorsal das vértebras ; C e D vistas ventrais da região da placa
paravertebral. De I a VIII- vértebras pré-sacrais; PPV- placa paravertebral; PI à PVIII- placas
espinhais I à VIII. Barras equivalem a 1mm.
25
1.2: diversidade Morfológica das placas craniais, vertebrais e paravertebrais
no gênero Brachycephalus
Os exemplares de Brachycephalus pernix não apresentam as placas ósseas (Fig. 14
A e B, 16A). O mesmo se aplica para B. hermogenesi e B. brunneus, No entanto, em B.
pernix notam-se projeções ósseas que cobrem a cápsula ótica, ultrapassando sua borda lateral.
As vértebras pré-sacrais dos exemplares de B. hermogenesi, B. brunneus e B. pernix não
possuem placas associadas aos processos espinhais, nem aos processos transversos (Fig.
16A). Também não há registro de ornamentação óssea associada aos processos espinhais das
vértebras.
Exemplares de B. vertebralis, B. cf. vertebralis (Fig. 14 C e D, 16 B e C) e B.
nodoterga, além de B. sp1 e B.sp2, possuem placas paróticas. No entanto, existem diferenças
morfológicas entre as placas ósseas encontradas nessas espécies e em B. ephippium. Nesta
seção descreveremos essas diferenças.
placa parótica De Brachycephalus verteBralis, Brachycephalus sp2 e Brachycephalus
nodoterga
Em Brachycephalus cf. vertebralis (Figura 14 C e D), assim como em Brachycephalus
vertebralis, Brachycephalus sp2 e Brachycephalus nodoterga, a placa parótica não cobre
nenhuma porção da articulação entre o esquamosal e o proótico. A placa ocupa uma
orientação diagonal em relação ao crânio, contactando e se fundindo ao frontopariental
medialmente. No plano dorsal, a placa assume uma forma trapezoidal, onde a margem
medial é mais larga que a margem lateral. Na extremidade antero-medial da placa parótica,
onde esta se fusiona com o frontoparietal, nota-se uma projeção em direção à órbita. Não foi
possível vericar se esse processo orbital se trata de uma expansão do frontoparietal ou da
placa parótica. Na face lateral, a placa parótica se expande radialmente assumindo uma forma
circular, cuja borda posterior ultrapassa o limite posterior do crânio. A borda ventral cobre
uma pequena porção da cápsula auditiva, no entanto, não se sobrepõe ao ramo posterior do
esquamosal.
As superfícies dorsal e lateral da placa parótica são bastante ornamentadas, embora,
em alguns exemplares, a porção mais medial apresente pontos sem ornamentação. Destaca-se,
ainda, nessas espécies, uma robusta ornamentação em toda a superfície dorso-lateral do ramo
ótico do esquamosal (Figura 14 C e D).
26
8
8
Figura 14. Morfologia do crânio de adultos de Brachycephaus. A e B- Vistas dorsal e ventral
de Brachycephalus pernix; C e D- vistas dorsal e ventral de exemplares de B. cf. vertebralis
de Ubatuba, SP. 1- frontoparietal; 2- nasal; 3- placa parietal; 4- esquamosal; 5- pré-maxilar,1- frontoparietal; 2- nasal; 3- placa parietal; 4- esquamosal; 5- pré-maxilar,
6- maxilar; 7- quadradojugal; 8- crista pós-orbital. Barras equivalem a 1mm.
27
Figura 15. Crânios de Brachycephalus sp1 de Nova Friburgo, RJ. A e B- Vistas dorsal e lateral
respectivamente. 1- frontoparietal; 2- osso nasal; 3- placa parietal; 4- esquamosal; 5- exoccipi-1- frontoparietal; 2- osso nasal; 3- placa parietal; 4- esquamosal; 5- exoccipi-
tal, 6- crista pós-orbital; 7- pré - maxilar; 8- maxilar. Barras equivalem a 1mm.
placa parótica De Brachycephalus sp1
Nessa espécie, a placa parótica se assemelha à de Brachycephalus ephippium, exceto
pela face lateral, que é ligeiramente menos arredondada na borda ventral. Além disso, a placa
parótica recobre apenas parte do ramo ótico do esquamosal. Notam-se, ainda, diferenças em
outros ossos do crânio, como a presença de um par de cristas pós-orbitais na região do sulco
occipital (Figura 15).
placas espinhais e paravertebrais De B.nodoterga, B. verteBralis e Brachycephalus sp2
As placas espinhais de Brachycephalus cf. vertebralis, B. vertebralis, Brachycephalus
sp2 e B. nodoterga se apresentam associadas aos processos espinhais de todas as vértebras
pré-sacrais e sacral (Figura 16 B e C), possuindo ornamentações mais desenvolvidas do que
em B. ephippium. As placas espinhais das vértebras I e II se fundem. Em alguns exemplares
existem, esporadicamente, outras fusões, como entre as placas de VII e VIII. Diferentemente
de B. ephippium, nas espécies B. nodoterga, B. vertebralis e Brachycephalus sp2, as placas
espinhais se dilatam pouco e acompanham as formas e tamanhos originais dos processos
espinhais, principalmente nas primeiras três vértebras pré-sacrais. Nas demais, as placas
28
Figura 16. Região das vértebras de espécies de Brachycephalus. A- MEV do esqueleto axial
de Brachycephalus pernix; B e C diafanização e MEV de exemplares de B. cf. vertebralis.
De I a VIII- vértebras pré-sacrais; SC- vértebra sacral; PPV- placa paravertebral; PI a PVIII-
placas espinhais I a VIII; PSC- placa espinhal da vértebra sacral. Barras equivalem a 1mm.
29
assumem formas retangulares (Figura 16 B e C).
As placas para-vertebrais de B. nodoterga, B. cf. vertebralis, B. vertebralis e
Brachycephalus sp2 se fundem, única e exclusivamente, aos processos transversos da vértebra
IV. Nessas espécies, as placas para-vertebrais se desenvolvem pouco, tanto no eixo lateral
quanto no eixo crânio-caudal, cobrindo apenas a porção distal do processo transverso da
vértebra IV (Fig. 16 B e C). Como nas placas espinhais, a ornamentação das placas para-
vertebrais é bem robusta.
placas espinhais e paravertebrais em Brachycephalus sp1
Assim como em Brachycephalus ephippium, em Brachycephalus sp1 as placas
espinhais ocorrem associadas aos processos espinhais das oito vértebras pré-sacrais, e também
da vértebra sacral, sendo que, somente nesta última não ocorre ornamentação (Fig. 17). As
placas espinhais das vértebras I e II são fundidas. Ocorre, ainda, a fusão das placas espinhais
IV, V, VI, VII e VIII.
As placas para-vertebrais de Brachycephalus sp1 são bastante desenvolvidas e
cobrem totalmente os processos transversos das vértebras IV, V, VI, VII e VIII, além de cobrir
parcialmente os processos transversos da vértebra III (Fig. 17). Nos adultos de grande porte,
as margens laterais das placas para-vertebrais emitem dois processos, um anterior e outro
posterior. O processo anterior atinge o nível do processo transverso da vértebra II, enquanto
o posterior pode chegar próximo à diapóse sacral (Fig. 17). Medialmente, as placas para-
vertebrais fusionam-se ao bloco formado pelas placas espinhais de IV a VIII. Ventralmente, os
processos transversos das vértebras IV e V fundem-se às placas para-vertebrais. No entanto,
em alguns espécimes, ocorre fusão das vértebras IV, V, VI, VII e VIII, pelo centrum e entre os
respectivos processos transversos.
30
PPV
Figura 17. Região vertebral de Brachycephalus sp1.
A- vista dorsal; B- vista ventral. De I a VIII- vértebras
pré-sacrais; SC- vértebra sacral; PPV- placa paraverte-
bral; PI à PVIII- placas espinhais I à VIII; Psacral- placa
espinhal da vértebra sacral. Barras equivalem a 1mm.
31
discussãO
desenvOlvimentO
Placa Parótica
McLanchan (1943) já havia descrito a placa parótica em Brachycephalus ephippium
como aba de ossicação dérmica, sem, no entanto, reconhecer sua individualidade. Todavia,
a análise dos crânios dos indivíduos jovens não deixa dúvidas sobre a individualidade
dessa estrutura. O processo de ossicação da placa parótica é intermembranoso (dérmico),
uma vez que não encontramos condrócitos associados às placas durante os estágios de
desenvolvimento observados. Devido à sua localização, na porção postero-lateral do crânio,
a formação placa parótica deve ter maior participação de células da mesoderme paraxial do
crânio, conforme descrito para crânios de Tetrapoda (Thomson, 1993; Gilbert, 2006). No
entanto, é comum que tanto células da mesoderme paraxial quanto da crista neural participem
da formação de um mesmo osso cranial (Hanken e Trorogood, 1993; Gilbert, 2006). Em
resumo, a placa parótica é um novo osso dérmico do crânio, cujo processo de formação é
similar aos demais ossos dérmicos do crânio, como frontoparietal, pré-nasal e inter-nasal.
Provavelmente, a formação da placa parótica sofre alguma inuência da cápsula
ótica. Entre a placa parótica e a crista parótica, não foi possível distinguir o pericôndrio do
periósteo. Segundo Leibel (1976), a cápsula ótica inuencia e até promove a ossicação de
ossos dérmicos em torno de si, como os exoccipitais, e outros.
Placas esPinhais e Paravertebrais
As placas ósseas associadas às vértebras de Brachycephalus ephippium foram
classicadas como osteoderme por Ruibal e Shoemaker (1984). Os autores inferiram que
o centro de ossicação primário dessas estruturas estaria localizado na camada dérmica
conhecida como “ground substance” (GS), localizada entre o estrato compacto e o estrato
esponjoso da derme. No entanto, a análise dos cortes histológicos de espécimes jovens de
B. ephippium demonstram que as placas não se formam na derme e que a associação com a
derme é posterior ao surgimento das placas. Tal interação ocorre pelo crescimento vertical
de espículas ósseas, em direção à epiderme, a partir da matriz mineralizada das placas em
formação, que invadem o estrato compacto até atingir a epiderme. A região mineralizada
32
aparece inteiramente rodeada por tecido conjuntivo, com células achatadas, caracterizando o
endósteo (Fig. 7 e 8) . Este endósteo separa as placas do estrato compacto da derme.
Por sua vez, a individualidade das placas espinhais não é tão óbvia quanto as outras. A
relação com os processos espinhais é extremamente íntima, desde seu surgimento. No entanto,
o exame do material diafanizado e dos cortes histológicos evidencia que o tipo de osssicação
das placas espinhais é intermembranoso. Esse dado, por si só, já permite distinguir as placas
espinhais das vértebras, quanto à ontogênese, uma vez que as últimas são formadas por
ossicação endocondral (Gilbert, 2006). Dessa forma, concluímos que as placas espinhais,
ornamentadas ou não, são formadas por depósito de tecido ósseo adicional, de natureza
intermembranosa, e não por hiper-ossicação da vértebra já formada, como sugerido por
Ruibal & Shoemaker (1984).
Segundo Pombal et al., (1994), exemplares recém eclodidos de B. ephippium medem
pouco mais que 5 mm. Em nossa amostra, os menores espécimes mediram cerca de 8,00 mm
de CRC, e já apresentaram placas paróticas e para-vertebrais em formação, mas não as placas
espinhais. Desta forma, supomos que o centro de ossicação primário das placas paróticas
se origina antes dos jovens atingirem 8,00 mm, provavelmente em algum momento após a
eclosão.
Quanto às placas associadas às vértebras, podemos assumir que as placas espinhais
surgem após o estágio de 11,0 mm, embora sua formação provavelmente se inicie em
indivíduos um pouco menores. Espécimes menores que 11,0 mm não apresentam sequer as
vértebras completamente formadas, especialmente a porção dorsal, de onde se desenvolvem
os processos espinhais.
As placas para-vertebrais, no entanto, surgem bem antes, sendo possível até que
seu centro de ossicação primário apareça antes da eclosão. Elas já são evidenciáveis em
espécimes diafanizados, com cerca de 8,0 mm de CRC, embora ainda não sejam visíveis
externamente nos indivíduos íntegros, uma vez que a interação com o tegumento ainda não se
estabeleceu.
33
fOrmaçãO
As placas ósseas de Testudines se formam por um processo de ossicação
intermembranosa, onde se forma um denso conjunto de células que irão se diferenciar em
osteoblastos (Gilbert, 2001). Segundo esse autor, a partir da cartilagem das costelas, forma-se
uma membrana periósteo-condrogênica que, apesar de se originar de um pericôndrio, possui
atividade osteogênica, promovendo a diferenciação de tecido conjuntivo em tecido ósseo. Na
verdade, pericôndrio e periósteo compartilham componentes muito semelhantes, sendo que a
diferença seria que um contém fribroblastos e, o outro, osteoblastos. Entretanto um broblasto
se assemelha muito a um osteoblasto (Junqueira e Carneiro, 1999). Além disso, o pericôndrio
expressa sua potencialidade osteogênica durante a ossicação endocondral (Bloom e Fawcet,
1977). A capacidade de estruturas cartilaginosas induzirem a formação de ossos dérmicos em
torno de si mesma foi também registrada no processo de formação da mandíbula em torno da
cartilagem de Meckel (Chun et al., 1995).
Para conrmar essas hipóteses seria necessário adotar estratégias experimentais com
o uso de marcadores, que possam evidenciar de forma mais clara as atividades celulares
e extracelulares, e os processos epigênicos que contribuem para formação das placas em
Brachycephalus. Entretanto, nossos dados são evidências anatômicas de que o processo
de formação das placas em Brachycephalus pode ser semelhante ao mecanismo descrito
em Trachemys scripta e Chelida serpentina por Gilbert (2001). Ou seja, as cartilagens dos
processos transversos da quarta e quinta vértebras podem induzir a formação de centros de
ossicação primários da placa para-vertebral. Este mecanismo poderia também ocorrer na
formação das placas espinhais, por indução de ossicação a partir de cartilagens dos processos
espinhais. A gura 5 mostra um aglomerado de células que estão intimamente associadas
ao processo espinhal e que, provavelmente, participam da formação da placa espinhal.
Caso realmente este processo de formação de placas esteja ocorrendo em Brachycephalus,
cada vértebra poderia desenvolver seu par de placas paravertebrais. Isto poderia explicar a
diversidade de tamanho de placas no gênero Brachycephalus, onde diferenças no tamanho
das placas paravertebrais poderiam ser conseqüências do número de vértebras que contribuem
para a formação destas. Em Brachycephalus sp1, que apresenta placas para-vertebrais com
maior extensão, os processos transversos das vértebras IV, V e VI se fundem-se às placas
34
para-vertebrais. Em B. ephippium, apenas os processos transversos de IV e V, e em B.
nodoterga, B. vertebralis, Brachycephalus sp2, apenas o processo transverso da IV vértebra
está associado a uma placa paravertebral.
placas ósseas de Brachycephalus : OsteOderme Ou OssO OrdináriO?
Dentre os vários trabalhos em que menciona-se o termo osteoderme, em nenhum
deles se faz referência correta a respeito da autoria do termo, que por todos é denido como
presença de osso na derme (Hay, 1898; Romer, 1956; Strahm e Schwartz, 1977; Zilberberg
e Wake, 1986; Levrat-Cauviac e Zilberberg, 1990; Scheyer e Sander, 2004; O’Leary et al.
2004). Já em alguns trabalhos, encontramos algumas restrições e comentários a respeito
da denição do termo, com o a de Smith (1960 apud Ruibal e Shoemaker, 1984): escamas
dérmicas de todos os tetrápodes. Romer (1956) arma que a osteoderme de répteis são
novas estruturas que não tem relação com as escamas de peixes. Já Ruibal e Shoemaker
(1984), registram a presença de osteoderme em anuros, armando que tais estruturas são
morfologicamente distintas das escamas de peixes e as de Gymnophyona e não têm relação
histórica com as mesmas. Segundo Ziberberg e Wake (1990) e Zilberberg e Castanet (1985),
osteodermes de anuros e esquamata são tecidos metaplásicos, que se originam de células da
derme. A metaplasia foi denida como a mineralização de tecidos maduros sem a participação
de um periósteo, onde não estão presentes osteócitos e os canais comunicantes entre eles-
canaliculi (Haines e Mohuiddin, 1968). Entretanto, segundo Ruibal e Shoemaker (1984)
a osteoderme de anuros cabe perfeitamente na denição histológica de osso, apresentado
osteócitos e canaliculi.
Apesar dessas considerações o conceito de osteoderme permanece vago e não faz
nenhuma restrição quanto a função e relação com outras estruturas, considerando apenas a
posição em que se encontra no adulto. Possivelmente este termo ainda abriga uma série de
atributos morfológicos não homólogos e seu uso, da forma como está, pode levar a erros de
classicação de estruturas ósseas. Ora, em adultos de B. ephippium, o osso frontoparietal está
incrustado no tegumento, podendo, portanto, ser incluído na denição de osteoderme. Este
engano não aconteceria com os ossos já conhecidos em vários grupos, como o frontoparietal,
mas estamos sujeitos a erros ao classicar estruturas ósseas ainda não conhecidas. A distinção
entre osteoderme e osso ordinário incrustado no tegumento vêm sendo aparentemente
35
arbitrária, principalmente no caso de fósseis. Novos ossos podem surgir ao longo da evolução
e serem descobertos por anatomistas, e o termo osteoderme precisa sofrer restrições, pois
considerar um osso ordinário como osteodeme é subestimar a diversidade osteológica.
As placas ósseas encontradas no gênero Brachycephalus não são apenas elementos
ósseos do tegumento, pois servem como pontos de inserção de músculos, fusionam-se
às vértebras, inuenciando diretamente na mobilidade e sustentação do indivíduo, assim
como outros elementos do esqueleto axial. Adicionalmente, as relações entre as placas
e os músculos se estabelecem ainda no desenvolvimento. Em Cacops aspidephorus
(Temnospondily: Dissorophidade) , um anfíbio primitivo do permiano, encontram-se placas
ósseas fundidas aos processos espinhais (Dilkes e Brown, 2006), de forma semelhante
as placas espinhais de Brachycephalus. Os autores discutem justamente as alterações
biomecânicas de tais placas à movimentação de Cacops, concluindo que as placas
restringiriam exões laterais e permitiriam maior exão vertical. As placas de Cacops, mesmo
estando incrustadas na derme, não podem ser consideradas um mero elemento do tegumento.
Por outro lado, no tegumento de Brachycephalus sp2 encontramos espículas ósseas
isoladas, que não se associam a nenhuma outra estrutura se não o tegumento. Estas espículas
não participam da sustentação e ou locomoção do indivíduo. Este é o mesmo caso das
estruturas ósseas encontradas no gênero Phyllomedusa (conforme descrito por Ruibal e
Shoemaker, 1984).
Com base nas observações de que as placas espinhais e paravertebrais de
Brachycephalus não se originam na derme, não são ossos metaplásicos, e não são um mero
elemento do tegumento, assumimos que tais estruturas não são osteoderme, e sim ossos
ordinários do esqueleto pós-cranial. Deve-se propor renamento do termo osteoderme em
anuros, a m de restringirmos esta denição aos tecidos ósseos incrustados na derme, apenas
como elementos do tegumento, sem contribuir signicativamente como ponto de inserção
de músculos, e sem associação profunda com outros ossos ou cartilagens, principalmente,
se estas associações se estabelecem ainda no desenvolvimento. Tais restrições poderiam ser
adotadas com maior amplitude, desde que se invista em uma profunda revisão da osteologia
de Tetrapoda, o que não seria a pretensão deste trabalho.
36
variações mOrfOlógicas entre as espécies dO gênerO Brachycephalus
Dentre as espécies de Brachycephalus podemos distinguir 2 padrões morfológicos
relacionados às placas ósseas:
1- Placas ósseas ausentes: As placas ósseas estão ausentes em B. pernix, B. bruneus e B.
hermogenesi. Na literatura está registrado a ausência de placas craniais e vertebrais também
em B. alipioi (Pombal e Gasparini, 2006), B. didactylus (Izecksohn, 1998), B. ferruginus
(Alves et al., 2006), B. izecksoni (Ribeiro et al., 2005) e B. pombali (Alves et al., 2006).
2- Placas ósseas presentes:
2.a) placas espinhais bem desenvolvidas e placas paróticas e paravertebrais pouco
desenvolvidas: Este padrão ocorre nas espécies Brachycephalus sp2, Brachycephalus
cf. vertebralis, B. vertebralis e B. nodoterga. No entanto, Miranda-Ribeiro (1920) e
Heyer et al. (1990) armam que B. nodoterga não possui placas, possivelmente porque
essas estruturas aparecem de modo sutil no dorso de exemplares vivos ou preservados.
2.b) placas paróticas, espinhais e para-vertebrais bem desenvolvidas: Este padrão é
encontrado em B. ephippium. As placas paróticas são bem desenvolvidas lateralmente
e cobrem a articulação entre o esquamosal e o proótico. As placas espinhais estão
presentes em todas as vértebras, mas só estão ornamentadas nas 6 ou 7 primeiras
vértebras pré-sacrais. Ocorre a fusão das placas espinhais I e II; IV e V, com fusão
da VI em alguns exemplares. As placas para-vertebrais fusionam-se medialmente às
placas espinhais e, no eixo crânio-caudal, cobrem totalmente os processos transversos
das vértebras IV, V e VI.
2.c) fusão entre as placas espinhais I-II, e IV-V-VI-VII-VII: Este padrão ocorre na
espécie Brachycephalus sp1. As placas para-vertebrais são hiperdesenvolvidas,
cobrindo totalmente os processos transversos das vértebras IV, V, VI, VII e VII. Neste
padrão, destaca-se ainda o desenvolvimento de processos laterais, que posteriormente
atingem o nível da diapóse sacral e anteriormente o nível do processo transverso da
vértebra II.
Analisando a literatura, podemos armar que tanto as placas ósseas quanto fenômenos
de hiperossicação presentes no gênero Brachycephalus, não ocorrem nos gêneros recém
37
incluídos em Brachycephalidae (Frost et al., 2006). Uma vez que escudos ósseos associados
às regiões vertebrais são também encontrados em outros gêneros como Dendrobates (Trueb,
1973), Ceratophrys e Lepidobatrachus (Duellman e Trueb, 1986), não podemos, ainda,
descartar a possibilidade de que o aparecimento das placas ósseas em Brachycephalus seja um
fenômeno de convergência. No entanto, não há precedentes na literatura quanto à presença
de elementos ósseos no crânio que sejam similares às placas paróticas (Lynch, 1971; Lynch,
1973; Trueb, 1973; Duellman e Trueb, 1986, Trueb, 1993). Dessa forma, podemos inferir que
as placas paróticas apareceram pela primeira vez no gênero Brachycephalus. Quanto às placas
espinhais e para-vertebrais, devemos realizar um estudo osteológico comparativo entre os
anuros que apresentam placas ósseas, levando em conta as hipóteses de relações logenéticas
entre esses grupos, para então conrmar ou não a convergência dessas estruturas
Simplicações osteológicas no gênero Brachycephalus vêm sendo documentadas em
vários trabalhos: fusão de elementos da cintura escapular (Izecksonh, 1971, Pombal et al.,
1998; Kaplan, 2002); redução de dígitos (Izeckson, 1998, Alberch, 1980, Albert e Gale, 1985,
Trueb e Alberch, 1985); redução e perda de ossos do crânio (Yeh, 2002; Ribeiro et al., 2005;
Alves et al., 2006). No entanto, as espécies B. ephippium, B. nodoterga, B. cf. vertebralis, B.
vertebralis, Brachycephalus sp1 e Brachycephalus sp2, se diferenciam das demais espécies
do gênero por apresentarem inovações osteológicas, representadas pelas placas paróticas,
espinhais e paravertebrais. Em Brachycephalus, somente nessas espécies ocorrem as
ornamentações no crânio. Esse grupo de espécies pode ser distinguido das demais espécies
do gênero pelas características osteológicas acima mencionadas, para as quais encontramos
evidências de homologia, dentro do gênero, nos dados de desenvolvimento. No entanto,
não podemos comprovar o monoletismo desse grupo sem uma análise logenética. Sendo
assim, este permanece como um grupo fenético que poderia ser conhecido como grupo B.
ephippium. Entre as demais espécies do gênero consideramos que B. bruneus, B. didactylus,
B. ferruginus, B. hermogenesi, B. izechisohni, B. pernix e B. pombali, denitivamente não
apresentam as placas ósseas, tão pouco ornamentações no crânio e, portanto, formariam outro
grupo fenético, que por sua vez poderia ser chamado de “grupo B. didactylus”. Até o presente,
B. alipioi não pode ser alocada em nenhum dos grupos, por ausência de dados osteológicos do
crânio e do esqueleto axial da espécie.
Encontramos variações intra e inter-populacionais entre as diferentes populações
38
de Brachycephalus ephippim. No entanto, não analisamos devidamente estas variações e,
portanto, deixaremos esse assunto para um trabalho futuro. Contudo, as observações da
morfologia das populações amostradas foram sucientes para revelar que as populações de
Nova Friburgo e Petrópolis apresentam uma combinação de caracteres única, e, portanto, uma combinação de caracteres única, e, portanto,
merecem o status de espécie (que neste trabalho foi referida como Brachycephalus sp1). A
população de Teresópolis apresenta um perl osteológico semelhante ao de B. ephippium.
Todavia, acreditamos que esta população seria uma terceira espécie diferente tanto de B.
ephippium quanto de Brachycephalus sp1. Porém, precisaríamos aprofundar as análises para
conrmar o status da população de Teresópolis.
39
capÍtulO 2: elementOs da regiãO auditiva em
Brachycephalus e sua impOrtância para O mOnOfiletismO
dO gênerO
intrOduçãO
Talvez em nenhum outro grupo de tetrápodes a evolução para redução de tamanho
corporal tenha resultado em tantos exemplos de padrões, aparentemente convergentes, de
perda e/ou redução de elementos ósseos como nos anfíbios (Alberch, 1980; Alberch, 1981;
Alberch e Gale, 1985; Trueb e Alberch, 1985; Yeh, 2002). A redução e ausência de estruturas
morfológicas por vezes levam taxonomistas a diferentes opiniões sobre a composição
de grupos de espécies miniaturizadas, graças as diferenças na forma de interpretação da
ausência, seja como convergência ou como perda homóloga. Os menores anuros da América
do Sul (Atelopus, Brachycephalus, Dendrophryniscus, Melanophryniscus, Oreophrynella)
por décadas foram alvos de discussões acerca de suas posições taxonômicas (ver histórico em
McDiarmid, 1971). Nestes debates incluíram-se também os gêneros Euparkerella (Izecksohn,
1998) e Truebella (Graybeal e Cannatella, 1995).
No início dessa década, novas relações entre esses grupos foram propostas com base
em análises que comparam uma grande diversidade de taxa, utilizando dados de seqüência
de DNA (Darst and Cannatella, 2004; Frost et al., 2006), que estariam livres dos efeitos
das convergências morfológicas ligadas à miniaturização. Dentre os vários rearranjos
taxonômicos propostos por estes trabalhos, destacamos o agrupamento de Brachycephalus
com leptodactylideos (Eleutherodatylinae). A hipótese de proximidade logenética entre
os gêneros Brachycephalus e Euparkerella, um gênero miniaturizado de leptodatylidae, já
havia sido proposta por Izecksohn (1971; 1988). Posteriormente, essa hipótese ganhou algum
suporte (Pombal et al., 1998; Giaretta e Sawaya, 1998), até que recentemente foi corroborada
por outros conjuntos de dados (Darst e Cannatella, 2004; Frost et al., 2006).
Caso os resultados de Frost et al. (2006) sejam corroborados por outros conjuntos
de evidências e passem a ser amplamente aceitos, a classicação dos anuros sofrerá um
completo rearranjo, inclusive na família Brachycephalidae, que passaria a abrigar os gêneros
Adelophryne, Atopophrynus, Barycholos, Brachycephalus, Craugastor, Dischidodactylus,
40
Eleutherodactylus, Euhyas, Euparkerella, Geobatrachus, Holoaden, Oreobates, Pelorius,
Phrynopus, Phyllonastes, Phyzelaphryne, e Syrrhophus.
O monoletismo da maioria desses gêneros ainda depende de conrmação, uma
vez que nem todos foram incluídos nas análises de Frost et al. (2006). Por sua vez, o
monoletismo de Brachycephalus é suportado pela ausência de esterno, redução de dígitos,
e ossicação completa da cartilagem epicoracóide e clavículas (Izecksohn, 1971; Ford e
Cannatella, 1993). Um padrão similar de redução de dígitos tem sido usado como evidência
para a hipótese de proximidade logenética entre os gêneros Adeloprhyne, Euparkerella,
e Brachycephalus (Frost et. al., 2006). No entanto, um estudo comparativo dos padrões de
redução de dígitos não foi realizado ainda, e a maioria do que é assumido para todo o gênero
é baseado apenas em B. ephippium. Todas essas hipóteses recentes e rearranjos taxonômicos
aumentam a importância e a necessidade de investigação desse grupo de anuros, a m de
identicar evidências do relacionamento desses grupos.
Durante as investigações sobre a osteologia do crânio de Brachycephalus, descobrimos
um novo grupo de caracteres na região auditiva desse grupo. Embora a morfologia desta
região já tenha sido descrita por McLachlan (1943), sua signicância para a sistemática do
grupo ainda não havia sido considerada, uma vez que à época, o gênero Brachycephalus era
monotípico. O objetivo deste capítulo é descrever a osteologia da região auditiva das espécies
do gênero Brachycephalus, comparando-a com outras espécies miniaturizadas, e avaliamos
sua signicância para a sistemática do grupo. Além disso, analisaremos os dados disponíveis
na literatura acerca da redução de dígitos e re-avaliaremos sua importância para sistemática
dos taxa envolvidos.
materiais e métOdOs
As amostras foram submetidas às técnicas de diafanização e dupla coloração por
Alcian Blue e Alizarina, e maceração, seguindo os mesmos procedimentos descritos no
capítulo 1. Os espécimes analisados neste estudo (Apêndice 1) foram depositados nas
seguintes coleções herpetológicas: Antonio Sebben, Laboratório de Anatomia Comparativa de
Vertebrados, Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade de Brasília (AS); Eugenio
Izecksohn, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (EI); Coleção Herpetológica da
41
Universidade de Brasília, Departamento de Zoologia, Universidade de Brasília (CHUNB) e
Museu Nacional - UFRJ, Departamento de Vertebrados (MNRJ). Utilizamos a nomenclatura
osteológica apresentada em Duellman e Trueb (1986). Para facilitar as comparações, nos
resultados incluímos um resumo da morfologia da região auditiva de anuros, baseado no
texto de Duellman e Trueb (1986) e no estudo de Vorobyeva e Smirnov (1987). Para fórmula
das falanges e contagem de dígitos, assumimos que nas mãos de anuros o dedo I foi perdido
(sensu Alberch e Gale, 1985) e portanto, o dedo mais perto de prepólex é o dedo II.
resultadOs
O OuvidO médiO e externO de Brachycephalus
O teto da cavidade oral de todas as espécies examinadas de Brachycephalus não
apresenta óstio faríngeo. Externamente, nenhum delas apresenta tímpano. Do ouvido médio
estão ausentes também o anel timpânico e a columela. Em Brachycephalus ephippium
de diferentes localidades amostradas, a placa parótica cobre lateralmente a região ótica
(conforme descrito no capítulo 1).
No ouvido médio, na porção posterior da cápsula ótica, próxima à janela oval (Fig.
1A) tem forma circular e está coberta pelo opérculo, que é bastante ossicado (Fig. 1).
Encontramos uma conguração similar em B. bruneus, B. didactylus, B. ephippium (de
várias localidades), B. nodoterga, B. pernix, B. cf. vertebralis e B. vertebralis. Em todas
essas espécies o opérculo apresenta uma forma cônica, apresentando uma projeção medial
ossicada que se estende posteriormente (Fig. 1B). É nesse processo que o músculo opercular
se origina (Fig. 2A e 2B). O grau de coloração por alizarina varia em algumas espécies, o que
indica uma possível variação no grau de ossicação do opérculo.
Destaca-se ainda a posição da cápsula ótica e da crista parótica, que em
Brachycephalus estão reorientadas em um ângulo de aproximadamente 45° em relação plano
sagital do crânio. Como resultado, o ouvido médio (que em Brachycephalus é representado
pelo opérculo e janela oval) é reorientado mais posteriormente do que lateralmente, do que
em outros anuros (Fig. 1 e 2A). Este rearranjo tem como conseqüência um encurtamento da
distância entre a janela oval e o forame da veia jugular (Fig. 1A). Podemos inferir que houve
também um encurtamento relativo da distância entre o opérculo e a supra-escápula, com um
42
conseqüente encurtamento do músculo opercular.
A análise das fórmulas das falanges da mão e pé de B. hermogenesi, B. nodoterga, e
B. vertebralis são apresentadas na Tabela 2, juntamente com os dados compilados de diversos
autores.
Tabela 2- Fórmula das falanges da mão e do pé de espécies de Adelophryne, Brachycephalus
e Euparkerella.
Espécies Fórmula da falange Referências
mão pé
A. adiastola
2-2-3-2 2-2-3-4-3 (da Silva e Meihardt 1999)
B. alipioi
1-2-3-1 0-2-3-4-1 (Pombal e Gasparini, 2006)
B. brunneus
1-2-3-1 0-2-3-4-0
(Ribeiro et al., 2005)
B. didactylus
1-2-3-1 1-2-3-4-1 (Izecksohn 1971)
B. ephippium
1-2-3-1 1-2-3-4-2 (1-2-3-4-1)
+
(Alberch e Gale 1985, Izecksohn
1988)
B. ferruginus*
1-2-3-1 1-2-3-4-1
(Alves et al., 2006)
B. hermogenesi
1-2-3-1 0-2-3-4-2 Presente trabalho
B. izecksohni
1-2-3-1 0-2-3-4-0
(Ribeiro et al., 2005)
B. nodoterga
1-2-3-1 1-2-3-4-1 Presente trabalho
B. pernix
1-2-3-1 1-2-3-4-0
(Pombal et al., 1998)
B. pombali*
1-2-3-1 1-2-3-4-1
(Alves et al., 2006)
B. cf. vertebralis
1-2-3-1 0-2-3-4-1 Presente trabalho
E. brasiliensis
2-2-3-2 2-2-3-4-3 (Lynch 1971; Izecksohn 1988)
E. cochranae,
2-2-3-2 2-2-3-4-3 (Izecksohn 1988)
E. robusta,
2-2-3-2 2-2-3-4-3 (Izecksohn 1988)
E. tridactyla
2-2-3-2 2-2-3-4-2 (Izecksohn 1988)
(*) indicam discrepâncias entre ilustrações e descrições presentes nos artigos e descrições
originais;
(+) indica variações encontradas em algumas populações de B. ephippium.
discussãO
O OuvidO médiO e externO de anurOs
A estrutura do aparato auditivo de anuros, exemplicada na imagem de Barycholos
ternetzi (Fig. 2C), geralmente é composta por uma membrana timpânica que, por sua vez, é
sustentada pelo anel timpânico. Este tem forma de cone e é formado por tecido cartilaginoso.
Internamente, ligam-se ao tímpano um primeiro sistema de condução de som formado pela
extracolumela (pars externa plectri) e columela (pars media plectri). Este sistema conduz as
vibrações sonoras com freqüências superiores á 1000 Hz para a cápsula ótica (Duellman e
Trueb, 1986). A extremidade medial da columela se liga à janela oval (fenestra ovalis), por
43
Figura 1. A-Vista posterior do crânio de Brachycephalus ephippium, em posição equivalente
ao decúbito dorsal, de exemplar macerado: 1- Janela oval; 2- placa parótica; 3- forâme da
veia jugular; 4- côndilo occipital; 5- forâme magno. B- Vista ventral de crânio diafanizado de
Brachycephalus pernix: 1- Opérculo; 2- processo posterior; 3- cápsula ótica; 4- esquamosal; 5
quadradojugal; 6- paraesfenóide.
Barras equivalem à 1mm.
A
B
44
Figura 2. A e B- Vistas ventrais da região posterior do crânio e cintura escapular de Microdis-
secção a fresco Brachycephalus ephippium, evidenciando o sistema opérculo, m. escapular e
supraescápula (deslocada). B- Vista ventral de exemplar diafanizado de Barycholos ternetizi:
1- Anel timpánico; 2- janela oval; 3- columela; 4- esquamosal; 5- exoccipital; 6- atlas.
C
7
A
B
m.opercular
m.opercular
opérculo
I
II
III
supra-escápula
opérculo
supra-escápula
I
II
45
onde as vibrações são conduzidas aos uidos presentes no ouvido interno que, por sua vez,
irão estimular a membrana basilar. Paralelamente a esse sistema de condução de vibrações
aéreas, os anuros apresentam outras estruturas capazes de captar vibrações com freqüências
inferiores a 1000 Hz, provenientes do substrato. Deste sistema participa o opérculo, uma
estrutura geralmente cartilaginosa que ocupa grande parte da janela oval,em posição adjacente
à columela. Em anuros, o opérculo se conecta à supra-escápula através do músculo opercular
(Vorobyeva e Smirnov, 1987). As vibrações sonoras seriam captadas pelos membros
anteriores, conduzidas à supra-escápula, depois ao músculo opercular, e posteriormente para
o opérculo. Do opérculo, as vibrações são transmitidas aos líquidos do ouvido interno, que
estimulam a membrana basilar, exclusiva de anfíbios.
Existe uma relação entre o tamanho do tímpano e o tamanho da janela oval, onde o
tímpano é relativamente maior do que a janela oval. Provavelmente esta diferença de tamanho
é importante para o sistema de pareamento de impedância, que minimiza o efeito da diferença
de impedância entre o ar e os uidos do ouvido interno (Duellman e Trueb, 1986). Este padrão
morfológico é comum à maioria dos anuros. No entanto, alguns poucos grupos apresentam
perda ou redução de elementos do ouvido médio (Trueb e Alberch, 1985; Graybeal e
Cannatella, 1995; Yeh, 2002; Roth et al., 1992), incluindo Brachycephalus (McLachan, 1943).
Adicionalmente, o ouvido médio apresenta ainda um sistema de equalização de
pressão formado pelo tubo de Eustáquio, que conecta o ouvido médio à cavidade oral através
de uma abertura no teto da boca, próximo à glote, conhecido como óstio faríngeo. Este
sistema não está presente em bufonídeos de pequeno porte (McDiarmid, 1971; Graybeal e
Cannatella, 1995), em Brachycephalus (McLachlan, 1943), em microhilídeos (Yeh, 2002) e
em vários outros anuros que não apresentam ouvido médio (ver em Lombard and Straughan,
1974). Curiosamente, alguns pipídeos apresentam um único ostio faríngeo medial (Cannatella
e Trueb, 1988).
Quando comparamos nossas observações da região auditiva das amostras de
Brachycephalus aqui analisadas com as quatro recentes descrições de espécies de
Brachycephalus (Ribeiro et al., 2005; Alves et al., 2006) notamos uma discrepância. Em
ambos os trabalhos os autores mencionam que as espécies lá descritas não possuem nenhum
elemento do aparato auditivo relacionado ao ouvido médio (o que implicaria na ausência do
opérculo). Tivemos a oportunidade de examinar um espécime diafanizado de B. brunneus,
46
e nesse espécime encontramos o opérculo com a forma similar ás observadas nas demais
espécies de Brachycephalus. Assim, decidimos por assumir que a conguração de ouvido
médio que descrevemos nos resultados se aplicariam à todas espécies de Brachycephalus,
e que as observações feitas pelos autores há pouco mencionados estão, possivelmente,
equivocadas.
Funcionalmente, nossas descobertas sugerem que, embora exista o consenso de que
a audição de vibrações conduzidas pelo ar ocorra via sistema tímpano-columela, e que o
opérculo serviria apenas para captação de vibrações de baixa frequência (< 1000Hz), que
se propagam pelo substrato (Duellman e Trueb, 1986; Vorobyeva e Smirnov, 1987), este
não parece ser o caso das espécies de Brachycephalus. Segundo Pombal et al. (1994), B.
ephippium emite vocalizações acima de 4000Hz. Sendo assim, na ausência do sistema
tímpano-columelar, o sistema opérculo-braquial, através do m. opercular deve estar
funcionando para conduzir vibrações de alta freqüência para o ouvido médio. Esta sugestão
por sua vez, poderia indicar que embora tenham perdido quase toda o ouvido médio, as
espécies de Brachycephalus não seriam surdas.
A redução da distância entre o opérculo e a supra-escápula, resultante da rotação da
cápsula ótica e janela oval, pode ser uma maneira de encurtar o caminho que o som deve
percorrer até chegar no ouvido interno. Hetherington et al. (1986), propuseram que o sistema
opercular poderia também funcionar conduzindo o som até o ouvido interno, em anuros que
não possuem columela e tímpano.
A hipótese de audição via sistema opercular em Brachycephalus ainda presisaria
ser testada. Futuramente devemos investigar se estruturas relacionadas ao ouvido interno
de alguns braquicefalídeos apresentam mudanças em relação a outros anuros. Devemos
investigar, ainda, os outros anuros que também não apresentam columela e tímpano,
como alguns bufonídeos (Truebella, Atelopus, Dendrophryniscus, Melanophryniscus,
Oreophrynella), e microilídeos. Se essas espécies realmente vocalizam, podemos usá-las
como modelo para testar essas hipóteses.
A ausência da columela foi positivamente relacionada com a miniaturização (Yeh
2002). Considerando a hipótese logenética e a classicação resultante apresentada por Frost
et al. (2006), na qual a maioria dos taxa com perda e/ou redução de elementos do ouvido
médio estão distantemente relacionados na árvore, somos obrigados a assumir que a perda de
47
elementos do ouvido médio evoluiu independentemente. Note que os grupos irmãos dos taxa
que perderam elementos do ouvido médio, apresentam aparato auditivo completo. A evolução
de tamanhos de corpos pequenos pode limitar o desenvolvimento dessas estruturas (Hanken e
Wake, 1993, Yeh, 2002).
Podemos ainda nos atentar às limitações mecânicas que devem atuar, impondo limites
referentes às relações entre os tamanhos dos componentes do aparato auditivo (Duellman e
Trueb, 1986). À medida que os anuros tornaram-se menores ao longo do processo evolutivo,
estabeleceu-se um limiar de tamanho relativo do corpo, da janela oval, do tímpano e da
columela, que possibilitaria a condução do som com eciência. Portanto, deve haver um
limite de tamanho de corpo, capaz de comportar um sistema tímpano-columelar em condições
de conduzir o som adequadamente. Quando o som percorre meios com diferentes densidades,
no caso o ar e os uidos da cápsula ótica, ocorre perda de energia devido a maior impedância
(resistência à condução do som) do meio líquido. Para compensar essa perda de energia, a
área do tímpano dever ser um tanto maior que a área transversal da columela para que o som
sofra um aumento de amplitude, compensando a perda de amplitude que ocorrerá na cápsula
ótica.
A seleção natural para a eliminação do sistema tímpano-opercular e a interrupção
do desenvolvimento em um ponto no qual apenas o opérculo é formado (o opérculo é
formado em um período bem anterior ao que a columela e tímpano são formados; Vorobyeva
e Smirnov, 1987), podem ter sido mecanismos importantes para a evolução deste tipo de
padrão morfológico do aparato auditivo (Alberch et al., 1979, Yeh, 2002). No entanto, estas
possibilidades devem ser testadas experimentalmente e estatisticamente em um contexto
logenético.
As descobertas desse capítulo têm alguma importância no estabelecimento das
relações de Brachycephalus. Pela primeira vez, desde que o gênero foi criado, um grupo
de caracteres morfológicos, além de redução de falanges (Izecksohn, 1971, Alberch e Gale,
1995) e fusão de elementos da cintura escapular (Izecksohn, 1971), esta sendo apresentado
como corroboração do monoletismo do gênero. Sendo assim, este trabalho propõe que a)
a rotação relativa da cápsula ótica que resulta na orientação posterior da janela oval, e b) o
fechamento completo da janela oval pelo opérculo, e c) a presença de um processo posterior
desenvolvido no opérculo, onde o músculo opercular se origina, são todos caracteres únicos
48
para o gênero Brachycephalus e portanto suportam seu monoletismo.
Baseando-se nas observações das descrições originais das espécies que pertencem ao
gênero Adelophyne, nota-se que todas elas apresentam tímpano e aparato auditivo completo
(Hoogmoed e Lescure, 1984; Hoogmoed et al., 1994). Embora não tenha sido possível acessar
esqueletos de Euparkerella, o exame de espécimes intactos de E. cochrane, E. robusta e E.
tridactyla mostram que estas espécies não apresentam tímpano, nem anel timpânico, ostio
faríngeo, tão pouco tuba de Estáquio. Com base na ilustração do crânio de E. brasiliensis
feita por Lynch (1971: Figura 100) é possível observar que nesta espécie a janela oval
mantém a posição lateral e o opérculo não a cobre completamente. Alguns dos estados
presentes em Euparkerella (perda da maioria dos elementos do ouvido médio) podem servir
como evidência de proximidade logenética entre esses gêneros.
A recente proposta de que Adelophryne e Euparkerella são logeneticamente
próximos à Brachycephalus foi baseada em similaridades do padrão de perda de dígitos
(Frost et al., 2006). A única espécie do gênero Adelophyne cuja descrição osteológica da
mão e do pé estão disponíveis é A. adisotola (da Silva e Meihardt, 1999). Nessa espécie, a
única redução presente de dígitos presentes na mão ocorre no dedo V, com a perda de uma
falange, não havendo perda de falanges no pé. No gênero Euparkerella existem informações
para E. brasiliensis (Linch, 1971; Izeckson, 1988) e E. cochranae, E. robusta, e E. tridatyla,
(Izecksohn, 1988). Todas essas espécies apresentam apenas a perda de uma falange no dedo
V da mão (fórmula 2-2-3-2). E. tridactyla apresenta ainda a perda de uma falange no artelho
V no pé (fórmula 2-2-3-4-2), enquanto as demais espécies desse gênero apresentam a fórmula
2-2-3-4-3 para os artelhos.
A descoberta de novas espécies contribuiu para o aumento do conhecimento sobre a
variabilidade de fórmulas de falanges de dedos e artelhos dentro do gênero Brachycephalus,
no entanto a literatura é um tanto confusa e equivocada. Alguns artigos descrevem
textualmente uma conguração mas apresentam ilustrações com outra. Depois de três anos
debruçando-se na osteologia desse grupo, percebe-se o quanto é fácil cometer erros como
mover acidentalmente uma minúscula falange do dedo ou artelho de um Brachycephalus,
durante as preparações osteológicas. Além disso, houve caso em que falanges terminais de
um apêndice não apareciam, por estar pouco calcicada, enquanto que a equivalente, do outro
apêndice, era plenamente visualizável (Fig. 3). Sendo assim, assumimos que as discrepâncias
49
entre texto e guras encontradas nos artigos de descrição sejam frutos desses tipos de
ocorrências.
A partir do exame direto de espécimes diafanizados e da literatura, incluindo
algumas das descrições originais, notamos que a fórmula das falanges da mão aparenta ser
conservativa dentro do gênero Brachycephalus e diferente das encontradas nos gêneros
Adelophyne e Euparkerella (Tab. 2). Adicionalmente, a perda de uma falange no dígito cinco
parece ser mais uma sinapomora do gênero.
Variações no número de falanges dos dedos, seguem um padrão mais complexo e
podem ser outro indicativo de grupos monoléticos de espécies dentro de Brachycephalus.
Somente uma análise logenética com a inclusão de um grupo de dados maior poderia
elucidar a existência de tais grupos. É importante registrar que a variação encontrada na
morfologia dos dígitos não corrobora a proximidade logenética entre Brachycephalus e
Adelophyne ou Euparkerella como sugerido por Frost et al.(2006). Serão necessárias ainda
novas investigações para elucidar a posição de Brachycephalus dentro de Brachycephalidae.
50
Figura 3. Vista palmar dos pés direito (A) e esquerdo (B) de Brachycephalus hermogenesi.
Setas indicam falanges não ossicadas no pé esquerdo, cujos correspondentes no pé direito
estão completamente ossicadas.
51
cOnclusões gerais
As placas espinhais, paravertebrais e a placa parótica, encontradas no gênero
Brachycephalus são estruturas com desenvolvimento individualizado, para as quais
atribuímos o status de ossos ordinários não metaplásicos. As análises anatômicas fornecem
evidências de que o processo de formação das placas espinhais e para-vertebrais pode ser
análogo aos mecanismos que promovem a formação da carapaça de Testudines. No entanto,
para comprovar essa hipótese deve-se adotar estratégias experimentais, o que não foi possível
neste trabalho.
A rotação relativa da cápsula ótica que resulta na orientação posterior da janela oval,
o fechamento completo da janela oval pelo opérculo, a presença de um processo posterior
medial desenvolvido no opérculo, a fórmula falangeal 1-2-3-1 para a mão e a perda de uma
falange no artelho I do pé são todos caracteres únicos do gênero Brachycephalus e portanto
suportam seu monoletismo.
A morfologia das falanges da mão e do pé não suportam a proximidade logenética
entre Brachycephalus e outros gêneros miniaturizados como Euparkerella e Adelophryne
Os diferentes padrões de tamanho, forma, presença e ausência das placas ósseas, assim
como os diferentes padrões de perda de falanges do gênero Brachycephalus são indícios de
que existem grupos monoléticos dentro do gênero. Somente uma análise logenética, com o
uso de dados de naturezas diferentes, podem comprovar a existência desses grupos.
52
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apêndices
apêndice 1- espécimes examinadOs nO presente traBalhO.
Brachycephalus didactylus– Sacra Família do Tingua, Rio de Janeiro, Brasil: EI 5011-5012.
Brachycephalus ephippium jovens:– Cotia, São Paulo, Brasil: AS00424, AS00440, AS00441,
AS00448, AS00494, AS00495; Atibaia, São Paulo, Brasil: AS00468, AS00502, AS00509,
AS02502-02505
Brachycephalus ephippium adultos: Cotia, São Paulo, Brasil: AS00424, AS00446, AS00452,
AS00466, AS00482, AS00484, AS00485, AS00491, AS00492, AS00496, AS00502, AS00517,
AS00521, AS00524, AS00599, AS00602, AS00603, AS01511, AS01513;
Atibaia, São Paulo, Brasil: AS00455, AS00447, AS00474, AS00510, AS00511; AS02542-
02550;
Itamonte, Minas Gerais, Brasil: AS02428-02437, AS02496,AS02506-02517;
Teresópolis, Rio de Janeiro, Brasil: AS02439-02450;
Mogi das Cruzes, São Paulo, Brasil: AS02451-02458, AS02499, AS02500, AS02518-02527.
Brachycephalus sp1 – Nova Friburgo, Rio de Janeiro, Brasil: AS02417-02427, AS02438;
Brachycephalus hermogenesi – Ubatuba, São Paulo, Brasil: AS02460;
Brachycephalus nodoterga – Biritiba Mirim, São Paulo, Brasil: CHUNB 37676;
Brachycephalus cf. vertebralis – Morro Corcovado, Ubatuba, São Paulo, Brasil: AAG
000841, AAG001572, AAG001616, AAG001620, AAG001918;
Brachycephalus sp2 – Fazenda Capricónio, Ubatuba, São Paulo, Brasil: AAG 001693,
AAG001788, AAG001791, AAG001793, AAG001809, AAG001942, AAG001948,
AAG001950, AAG001952, AAG001957;
Brachycephalus vertebralis – Parati, Rio de Janeiro, Brasil: MNRJ 11102-11105;
Brachycephalus pernix – Quatro Barras, Paraná, Brasil: AS02399, AS02401, AS02459;
Brachycephalus bruneus – Campina Grande do Sul, Paraná, Brasil: AS02462;
Euparkerella brasiliensis – Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil: EI 585, 1195, 4259.
Euparkerella cochranae – Magé, Rio de Janeiro, Brasil: EI 7280, 7699.
Euparkerella robusta – Mimoso do Sul, Espírito Santo, Brasil: EI 1993, 7284.
Euparkerella tridactyla – Santa Tereza, Espírito Santo, Brasil: EI 7254, 7259.
58
Accepted by M. Vences: 26 Jan. 2007; published: 8 Mar. 2007
59
ZOOTAXA
ISSN 1175-5326 (print edition)
ISSN
1175-5334 (online edition)
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Zootaxa 1422: 59–68 (2007)
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The auditory region of Brachycephalus and its bearing on the monophyly of the
genus (Anura: Brachycephalidae)
HÉLIO RICARDO DA SILVA
1
, LEANDRO AMBRÓSIO CAMPOS
2
& ANTONIO SEBBEN
3
1
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Animal, Caixa Postal 74524, Cep
23.851-970, Rio de Janeiro, Brazil. E-mial: helio@ufrrj.br
2
Pós-graduação em Biologia Animal, Instituto de Biologia – Universidade de Brasília –UnB 70910-900 - Brasília, DF, Brazil.
E-mail: leandro.ambrosio@gmail.com
3
Laboratório de Anatomia Comparativa de Vertebrados, Departamento de Ciências Fisiológicas, CFS-IB – UnB 70910-900 -
Brasília, DF, Brazil. E-mail: se[email protected]r
Abstract
We surveyed the morphology of the auditory region of members of the anuran genus Brachycephalus. The sample
included seven of the eleven known species; in addition, Brachycephalus ephippium and B. vertebralis were each repre-
sented by several specimens from different localities. All species lack a tympanum, tympanic annulus, stapes, and Eus-
tachian tube. However, the operculum and the m. opercularis remain. The large operculum bears a robust process for the
m. opercularis and covers most of the fenestra ovalis. The auditory apparatus of Brachycephalus is distinguished by the
large size and the orientation of the fenestra ovalis, which faces posterior, rather than lateral. The morphology of these
structures is compared to those of other minute brachycephalid frogs considered to be close relatives of Brachycephalus,
and the importance of these characters as evidence of the monophyly of the genus is discussed. We also discuss the
importance of other morphological features cited to support close relationships among small-sized brachycephalids, and
consider the role of miniaturization in generating convergent pattern of loss of morphological features.
Key words: digit reduction, middle ear, miniaturization, ostia pharyngea, tympanic annulus, stapes, systematics
Introduction
In perhaps no other group of tetrapods has the evolution of small size resulted in so many apparently conver-
gent losses and/or reductions of osteological elements as has occurred among extant amphibians (Alberch
1980; Alberch and Alberch 1981; Alberch and Gale 1985; Trueb and Alberch 1985; Yeh 2002). In anurans,
the effects of miniaturization (Hanken and Wake 1993) are noticeable in parts of the skull (Trueb and Alberch
1985, Yeh 2002), fingers, and toes (Alberch and Gale 1985, Estrada and Hedges 1996). Occasionally, reduc-
tion and absence of elements have confused anuran systematists; there are different interpretations of relation-
ships of minute species depending upon whether an absence has been treated as a convergent character or
homologous loss. Such is the case of several of the smallest Neotropical anurans—members of the genera
Atelopus, Brachycephalus, Dendrophryniscus, Melanophryniscus, and Oreophrynella—the taxonomic rela-
tionships of which have been debated for decades (e.g., MacDiarmid 1971). More recently, this debate also
grew to include Euparkerella (Izecksohn 1988) and Truebella (Graybeal and Cannatella 1995).
The recent application of DNA-sequence data for large numbers of lissamphibian taxa has produced new
schemes of relationships, which seemingly are independent of the effects of morphological convergences
resulting from the process of miniaturization (Darst and Cannatella 2004; Frost et al. 2006). Among the many
new clades (and proposed taxonomic rearrangements), both analyses revealed Brachycephalus to be nested
SILVA ET AL.
60 · Zootaxa 1422 © 2007 Magnolia Press
within direct-developing leptodactylids. The position of Brachycephalus among anurans has always been con-
troversial (Noble 1931; Griffiths 1963; Izecksohn 1971; McDiarmid 1971; Ananias et al. 2006). However, the
hypothesis that this genus may be closely related to the small leptodactylids of the genus Euparkerella first
was suggested by Izecksohn (1971; 1988) and later supported by Pombal et al. (1998) and Giaretta and
Sawaya (1998); recently, it was corroborated by Darst and Cannatella (2004) and Frost et al. (2006).
If the results of Frost et al. (2006) are corroborated by independent lines of evidence and become widely
accepted, then anuran classification will be profoundly changed. Particularly relevant to this study is their par-
titioning of Leptodactylidae into seven families and the redefinition of Brachycephalidae to include the fol-
lowing genera: Adelophryne, Atopophrynus, Barycholos, Brachycephalus, Craugastor, Dischidodactylus,
Eleutherodactylus, Euhyas, Euparkerella, Geobatrachus, Holoaden, Oreobates, Pelorius, Phrynopus, Phyl-
lonastes, Phyzelaphryne, and Syrrhophus. The monophyly of most of these genera remains to be established,
because many were not included in the analysis of Frost et al. (2006). A monophyletic genus Brachycephalus
is supported by the presence of digital reduction, the absence of a sternum, and the complete ossification of
the epicoracoid cartilages and synostosis with the coracoids and clavicles (Izecksohn 1971; Ford and Canna-
tella 1993). Frost et al. (2006) hypothesized a close relationship among Adelophryne, Euparkerella, and
Brachycephalus based on a similar pattern of digit reduction; however, there are no comparisons of digital
reduction in the literature, and most of what is assumed for the genus is based on B. ephippium, the only
known species for many years. The emergence of these recent hypotheses and taxonomic rearrangements that
may result from them, emphasize the need for more thorough investigation of this group of anurans to resolve
their relationships.
As part of a review of the skeletal morphology of species of Brachycephalus, we discovered a new set of
characters relating to the auditory region of these anurans. Although the morphology of this region of B.
ephippium was thoroughly described by McLachlan (1943), its significance to the systematics of the group
never has been appreciated, possibly because only a single species, the only one known at the time, was
included. Herein we describe the otic region of species of Brachycephalus, compare it to that of other minute
frogs, and evaluate its significance to the systematics of the genus. We also reevaluate the available informa-
tion on digital reduction and its importance to the systematics of the taxa involved.
Material and methods
Observations of bone and cartilage were made on cleared-and-stained whole specimens and dry skeletons.
The specimens examined for this study (Appendix) are deposited the following herpetological collections:
Antonio Sebben, Laboratório de Anatomia Comparativa de Vertebrados, Departamento de Ciências Fisiológi-
cas, Universidade de Brasília (AS); Eugenio Izecksohn, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (EI);
Coleção Herpetológica da Universidade de Brasília, Departamento de Zoologia, Universidade de Brasília
(CHUNB) e Museu Nacional – UFRJ, Departamento de Vertebrados (MNRJ). Osteological nomenclature fol-
lows Duellman and Trueb (1986). For phalangeal formula and digital numbering we assume that on the hand
frogs have lost Finger I (sensu Alberch and Gale 1985); therefore, the finger closest to the prepollex is Finger
II and the remaining are numbered accordingly.
Results
Ostia pharyngea are absent in the roof of the mouth in all species of Brachycephalus examined, and externally,
a tympanum is lacking. A tympanic annulus and stapes are absent from the middle ear. In all individuals of
Brachycephalus ephippium examined from a range of populations across the distribution of this species, an
Zootaxa 1422 © 2007 Magnolia Press · 61
THE AUDITORY REGION OF BRACHYCEPHALUS
ornamented bony shield lies lateral to the otic capsule in the posterolateral portion of the skull (Fig. 1); this
plate shields the otic region, and we refer to it as the parotic plate. The parotic plate covers part of the squa-
mosal and the otic capsule, and is fused to the frontoparietal dorsolaterally, forming the posterolateral margin
of the skull and the posterior edge of the orbit anteriorly. We observed this plate to vary in size in the exem-
plars of B. ephippium from several different localities, B. nodoterga, and B. vertebralis. Evidence that this
plate forms independently comes from examination of a developmental series of B. ephippium (Fig. 1B).
The nearly circular fenestra ovalis of the middle ear lies in the posterior wall of the otic capsule and is
almost completely covered by a relatively large, bony operculum (Figs. 2, 3). We observed a similar condition
of the operculum in B. brunneus, B. didactylus, B. ephippium (from several localities), B. nodoterga, B.
pernix, B. cf. vertebralis, and B. vertebralis. In all these species, the operculum is circular, and bears a medial
projection that extends posteriorly and from which the m. opercularis originates. The degree of staining by
alizarin varies in some specimens, and this seems to indicate difference in the degree of ossification of this
element. In the otic capsule of Brachycephalus, the fenestra ovalis and the operculum are located in the poste-
rior wall of the otic capsule (Figs. 2, 3). As a consequence, these structures are oriented posteriorly, rather
than laterally, as in other frogs. This rearrangement has reduced the distance between the fenestra ovalis and
the jugular foramen (Fig. 3) and perhaps also that between the operculum and the suprascapula, resulting in a
relatively shorter m. opercularis.
FIGURE 1. The parotic plate in Brachycephalus ephippium A) Lateral view of a cleared-and-stained adult skull. B)
Dorsal view the left side of the skull of a juvenile (10.58 mm snout–vent length).
SILVA ET AL.
62 · Zootaxa 1422 © 2007 Magnolia Press
FIGURE 2. Posterior view of the skull of Brachycephalus ephippium showing details of the orientation of the fenestra
ovalis.
Discussion
The Anuran external and middle ear
The auditory apparatus of most anurans (Fig. 4) is composed of a tympanic membrane, which is supported
by a cartilaginous, funnel-shaped tympanic annulus, and connected to the pars externa plectri of the stapes
(pars media plectri), which conducts sound waves in frequencies higher than 1000 Hz to the inner ear within
the otic capsule (Duellman and Trueb 1986). The stylus of the stapes, the pars media plectri, is connected to
the inner ear at the fenestra ovalis by the pars interna plectri, which usually is expanded to form a footplate.
This system conducts airborne sound waves (Duellman and Trueb 1986). The operculum (usually cartilagi-
nous) occupies most of the fenestra ovalis and articulates with the pars interna plectri (Vorobyeva and
Smirnov 1987). In anurans, the operculum is connected to the suprascapula by the m. opercularis (Vorobyeva
and Smirnov 1987). This system transmits vibration lower than 1000 Hz to the inner ear (Duellman and Trueb
1986), thereby allowing anurans to perceive lower frequencies from the ground through the forelimbs.
In most anurans, the tympanum is much larger than the fenestra ovalis. This seems to match the acoustic
impedance of the air to the higher impedance of fluids in the inner ear (Duellman and Trueb 1986). Some anu-
ran taxa, including brachycephalids, lack, or have reduced middle-ear elements (Trueb and Alberch 1985;
Graybeal and Cannatella 1995; Yeh 2002; Roth et al. 1992). The middle ear also acts as a pressure-equalizing
system. The Eustachian tube usually connects the middle ear to the mouth cavity through openings (ostia pha-
ryngea) in the roof of the mouth. Exceptions to this occur in small bufonids (McDiarmid 1971; Graybeal and
Cannatella 1995), brachycephalids (McLachlan 1943; present work), microhylids (Yeh 2002), and several
other frogs that lack middle ears (reviewed by Lombard and Straughan 1974), and in which this pressure-
equalizing system is absent.
The external and middle ear of Brachycephalus
We noted discrepancies between our observations of the auditory regions of Brachycephalus and those of
Ribeiro et al. (2005) and Alves et al. (2006) for four species of Brachycephalus from Southern Brazil. In both
papers, the authors mention that the species being described lack all auditory apparatus related to the middle
ear. We observed that at least in the specimen of B. brunneus (Ribeiro et al. 2005) that we examined, the oper-
Zootaxa 1422 © 2007 Magnolia Press · 63
THE AUDITORY REGION OF BRACHYCEPHALUS
culum is present and resembles the opercula of its congeners. Therefore, we assume that our observations per-
tain to all species of the genus, and that their observations probably are erroneous.
FIGURE 3. A) Ventral view of the posterior portion of the skull of Brachycephalus ephippium showing operculum on
natural position covering the fenestra ovalis. (Note the partially ossified operculum.) B) Ventral view of the posterior
portion of the skull of B. pernix. (Note the completely ossified operculum.)
There is a consensus that airborne hearing in anurans is relayed only via the tympanic–stapes sound-con-
ducting system, and that the operculum serves only to perceive ground vibrations in frequencies under 1000
Hz (Duellman and Trueb 1986; Vorobyeva and Smirnov 1987). However, this seems not to be the case for
SILVA ET AL.
64 · Zootaxa 1422 © 2007 Magnolia Press
Brachycephalus. The species in this genus are known to produce calls with frequencies greater than 4000 Hz
(Pombal et al. 1994). So, in the absence of a tympanic-stapes system, the operculum-brachial system, through
the m. opercularis, may serve to receive and conduct high frequency sounds to the inner ear. This would sug-
gest that, although most of the middle ear is missing in Brachycephalus, they are not deaf. The orientation of
the fenestra ovalis and of the operculum, may serve as a way to shorten the distance between the operculum
and the suprascapula, thereby shortening the m. opercularis. This, in turn, may serve to decrease the distance
the sound has to travel to the internal ear. A similar hypothesis—that the opercular system also may serve to
conduct airborne sounds in anurans lacking stapes and tympanum—was proposed by Hetherington et al.
(1986). Obviously, these hypotheses remain to be tested, and we may learn that structures related to the inter-
nal ear of some brachycephalids may have changed when compared to those of other anurans. Other frogs
have been reported to have a similar configuration of the middle ear, including absence of all the skeletal ele-
ments and of the ostia pharyngea. Examples include the bufonids Truebella (Graybeal and Cannatella 1995),
Atelopus, Dendrophryniscus, Melanophryniscus, Oreophrynella (McDiarmid 1971) and the microhylids
genus Microhyla (Vorobyeva and Smirnov, 1987). If species in these groups indeed produce calls, they would
serve as additional models in which these hypotheses could be investigated.
FIGURE 4. Diagram of the auditory system of a frog, showing all the elements present and subdivision of the ear modi-
fied from Duellman & Trueb (1986).
Absence of the elements of the middle ear may result from losses related to the evolutionary reduction of
body size; therefore, such absences may be convergent among most of these taxa (Yeh 2002). Based on the
phylogenetic hypothesis presented in Frost at al. (2006), in which most of the taxa lacking auditory elements
appear distantly related in the tree, we must assume that the pattern of loss of elements of the middle ear
evolved independently, because each of the sister groups of these taxa has a complete auditory apparatus.
Evolving small size may have limited the development of these structures (Hanken and Wake 1993, Yeh
2002).
Functionality may constrain the lower size limits for the presence of elements of auditory apparatus in
anurans (Duellman and Trueb 1986), as a result, loss of elements may relate to size. There may be functional
connection between body size and auditory function (Duellman and Trueb 1986). Thus, as frogs became
Zootaxa 1422 © 2007 Magnolia Press · 65
THE AUDITORY REGION OF BRACHYCEPHALUS
smaller through evolution, they may reach a size threshold at which the relationship between the size of the
organism and the auditory apparatus (fenestra ovalis, tympanum, and stapes) may preclude the auditory sys-
tem from conducting sounds properly, owing to the physics of the sound transmission. Put another way, there
may be lower size limit beyond which functional hearing via a system involving a tympanum and stapes can
take place. Natural selection for the elimination of this system, and truncation of the development at a larval
stage such that only the operculum is formed (this structure forms early during ontogeny; Vorobyeva and
Smirnov 1987), may have been an important mechanism in the evolution of this system (Alberch et al. 1979,
Yeh 2002). Obviously, this would have to be evaluated experimentally and statistically within a phylogenetic
framework. The great size differences among frog species may well serve this line of research.
Our findings have also some implications in establishing the relationships of Brachycephalus. For the first
time since Brachycephalus was described, a group of characters other than those of phalangeal reduction
(Izecksohn 1971, Alberch and Gale 1985) and fusion of the pectoral girdle elements (Izecksohn 1971) has
been discovered that may corroborate the monophyly of the genus. Therefore, we propose that (1) the poste-
rior orientation of the fenestra ovalis, and (2) the enlarged operculum that nearly fills the fenestra ovalis and
(3) bears a large process for the attachment of the m. opercularis are characters unique to Brachycephalus and
features that support its monophyly.
Other osteological features of Brachycephalus and their bearing on its relationships
The otic plate in Brachycephalus ephippium was first described by McLachlan (1943: p171), who did not
name it, referring to the bone simply as a dermal ossification. Our observations indicate that within
Brachycephalus, the presence of the parotic plate of variable size and degree of ossification and ornamenta-
tion may indicate the monophyly of a group composed of B. ephippium, B. nodoterga, and B. vertebralis.
Based on the original description of the species included in the Adelophryne, members of this genus have tym-
panum and consequently, a complete auditory apparatus (Hoogmoed and Lescure 1984; Hoogmoed et al.
1994). Although we did not have access to skeletons of Euparkerella, examination of whole specimens of E.
cochranae, E. robusta, and E. tridactyla show that they lack the tympanum, tympanic annulus, and the Eusta-
chian tube (ostia pharyngea also absent). Based on the drawing of the skull of E. brasiliensis by Lynch (1971:
Figure 100), it seems that at least in this species, the fenestra ovalis retains its lateral position and that there is
a substantial gap between the anterior margin of the operculum and that of the fenestra ovalis. Some of the
states present in Euparkerella (e.g., lack of most of the middle ear) may serve as evidence of a closer relation-
ship between the two genera.
Given the recent proposal that Adelophryne and Euparkerella may be close to Brachycephalus based on
shared similarities in the pattern of digital loss (Frost at al. 2006), we felt compelled to clarify this by examin-
ing available information on digital morphology for these taxa. The only species of Adelophryne for which
descriptions of the hand and foot skeleton are available is A. adiastola (da Silva and Meihardt 1999). In this
species, Finger V lacks one phalange; there is no digital reduction in the foot. For Euparkerella, there is infor-
mation for E. brasiliensis (Lynch 1971; Izecksohn 1988) and E. cochranae, E. robusta
, and E. tridactyla
(Izecksohn 1988). In each of these species, Finger V lacks one phalangeal element (formula 2-2-3-2). In addi-
tion, in E. tridactyla, Toe V lacks one phalange V (formula 2-2-3-4-2), whereas the remaining species have a
foot phalangeal formula of 2-2-3-4-3 similar to most other anurans.
The discovery of new taxa has increased our knowledge of the variability of phalangeal formulae in
Brachycephalus, but the literature is somewhat confusing and misleading. Some papers describe one thing
and illustrate another and, based on our own experience, we know how easy it is to remove the miniscule pha-
langes of the fingers and toes of Brachycephalus accidentally during skeletal preparation. We assume that
some of the disparities we have noted in the literature may have resulted from observational error.
Based on our examination of cleared-and-stained specimens and information gleaned from the literature
(including some of the original species descriptions), we conclude that the phalangeal formula of the hand is
SILVA ET AL.
66 · Zootaxa 1422 © 2007 Magnolia Press
unique and conservative in Brachycephalus and distinct from that of Adelophryne and Euparkerella (Table 1).
In addition, one phalange is absent on digit V of all examined species, and this may be an additional synapo-
morphy for the genus. On the toes, variation on the number of phalanges is more complex and may be indica-
tive of monophyletic groups of species within Brachycephalus, and therefore, only a phylogenetic analysis
based on the inclusion of a larger set of characters would elucidate the existence of such groups. In this con-
text it is also important to notice that the close relationship between Brachycephalus and either Adelophryne
or Euparkerella, as suggested by Frost et al. (2006), is not corroborated by the observed variation of digital
morphology.
TABLE 1. Phalangeal formulae for fingers and toes of species of Adelophryne, Brachycephalus, and Euparkerella.*
indicates discrepancies between the illustrations presented in the papers and original descriptions; and + indicates varia-
tion found in some populations of B. ephippium.
Acknowledgments
This work was made possible with the acquisition of freshly collected specimens from several new localities.
We are thankful to the administration of the Prefeitura Municipal of Atibaia, São Paulo, for the permission to
visit the Grota Funda Municipal Park. During field work LAC was helped by Rafael Camilo Laia, Darlan
Aragão. Specimens were also made available by Dr. Osmindo Rodrigues Pires Júnior, who allowed LAC to
join his team in expedition throughout the Atlantic rain forest in search of Brachycephalus. Dr. Ariovaldo
Giaretta made specimens under his care available to this study. Dr. Maria Júlia da Silva allowed the use of the
Stereomicroscope Zeiss SV11. LAC received a fellowship for the development of his master degree research
from CNPq (The National Council for Scientific and Technological Development – MCT, Brazil, process
number 132528/2005-3). Joe Mendelson, David Kizirian, and Mary S. Linn kindly reviewed earlier versions
of the manuscript. Linda Trueb, acting as a referee to this journal, made substantial criticism and helped to
improve the readability and clarity of the article.
Species Phalangeal formulae References
Fingers Toes
A. adiastola 2-2-3-2 2-2-3-4-3 (da Silva and Meihardt 1999)
B. alipioi 1-2-3-1 0-2-3-4-1 (Pombal and Gasparini, 2006)
B. brunneus 1-2-3-1 0-2-3-4-0 (Ribeiro et al. 2005)
B. didactyla 1-2-3-1 1-2-3-4-1 (Izecksohn 1971)
B. ephippium 1-2-3-1
1-2-3-4-2 (1-2-3-4-1)
+
(Alberch and Gale 1985, Izecksohn 1988)
B. ferruginus* 1-2-3-1 1-2-3-4-1 (Alves et al. 2006)
B. hermogenesi 1-2-3-1 0-2-3-4-2 Our data
B. izecksohni 1-2-3-1 0-2-3-4-0 (Ribeiro et al. 2005)
B. nodoterga 1-2-3-1 1-2-3-4-1 Our data
B. pernix 1-2-3-1 1-2-3-4-0 (Pombal et al. 1998)
B. pombali* 1-2-3-1 1-2-3-4-1 (Alves et al. 2006)
B. vertebralis 1-2-3-1 0-2-3-4-1 Our data
E. brasiliensis 2-2-3-2 2-2-3-4-3 (Lynch 1971; Izecksohn 1988)
E. cochranae, 2-2-3-2 2-2-3-4-3 (Izecksohn 1988)
E. robusta, 2-2-3-2 2-2-3-4-3 (Izecksohn 1988)
E. tridactyla 2-2-3-2 2-2-3-4-2 (Izecksohn 1988)
Zootaxa 1422 © 2007 Magnolia Press · 67
THE AUDITORY REGION OF BRACHYCEPHALUS
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Appendix. Material examined
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Brachycephalus ephippium – Cotia, São Paulo, Brazil: AS00466, AS 00484, AS 00485, AS 00491, AS 00492, AS
00502, AS 00517, AS 00521, AS 00524, AS 00599, AS 00602, AS 00603, AS 01511 e AS 01513; Atibaia, São
Paulo, Brazil: AS 00455, AS 00447, AS 00468, AS 00474, AS 00509-00511; Itamonte, Minas Gerais, Brazil: AS
02428-2437; Teresópolis, Rio de Janeiro, Brazil: AS 02439-02450; Mogi das Cruzes, São Paulo, Brazil: AS 02451-
02458;
Nova Friburgo, Rio de Janeiro, Brazil: AS02417-02427, 02438;
Brachycephalus hermogenesi – Ubatuba, São Paulo, Brazil: AS 02460;
Brachycephalus nodoterga – Biritiba Mirim, São Paulo, Brazil: CHUNB 37676;
Brachycephalus cf. vertebralis – Ubatuba, São Paulo, Brazil: AAG 000841, 001572, 001616, 001620, 001918;
Brachycephalus vertebralis – Parati, Rio de Janeiro, Brazil: MNRJ 11102-11105;
Brachycephalus pernix – Quatro Barras, Paraná, Brazil: AS2399, AS 2401, AS 2459;
Brachycephalus bruneus – Campina Grande do Sul, Paraná, Brazil: AS 02462;
Euparkerella brasiliensis – Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil: EI 585, 1195, 4259.
Euparkerella cochranae – Magé, Rio de Janeiro, Brazil: EI 7280, 7699.
Euparkerella robusta – Mimoso do Sul, Espírito Santo, Brazil: EI 1993, 7284.
Euparkerella tridactyla – Santa Tereza, Espírito Santo, Brazil: EI 7254, 7259.
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