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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ANIMAL
Caracterização genética de Alouatta caraya (Primates, Atelidae)
utilizando marcadores heterólogos do tipo microssatélites
Ana Paula Daltoé Inglêz
Brasília – DF
2006
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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ANIMAL
Caracterização genética de Alouatta caraya (Primates, Atelidae)
utilizando marcadores heterólogos do tipo microssatélites
Ana Paula Daltoé Inglêz
Dissertação apresentada ao
Instituto de Ciências Biológicas
da Universidade de Brasília como
parte dos requisitos para obtenção
do título de Mestre em Biologia
Animal.
Orientadora: Profa. Dra. Silviene Fabiana de Oliveira
Brasília – DF
2006
Alcançou o sucesso
aquele que viveu bem,
riu com freqüência
e amou muito.
DEDICO
Heredograma da família Daltoé Inglez
Alexis Helencia
Carmem
Bruno
Inês Lourdes Luis Carlos Beloni
Vilma
Darci Arvelino
Wanderley
Cinthia
1. Márcia
2. Bruno Jr.
3. Andréia
4. Karin
5. Letícia
1. Dalloan
2. Samya
3. Juliana
4. Luciana
1. Bárbara
2. Matheus
1. Stéfani
1. Priscilla
2. João Victor
3. Wanderley
Manoel Francisco
M ª Lourdes Laurita
Mª Eugênia José
Josélia
Ney Clara
1. Gabriel
2. Giovanna
Conceição
1. Marlon
2. Liliane
3. Elaine
4. Deyvene
René Denise
1. Ana
Cláudia
2. Marcela
Lourice
Cláudio
1. Luis
Cláudio
2. Luis
Felipe
Dirlei
Iracema
João
1. Ana Paula
2. Joice Cristina
3. Thaís Regina
4. Tammy Mayara
2. Alexis
Daltoé
Inglez
Daltoé Inglez
Marise
1. Marcos Paulo
2. Luis Fernando
Dedico esta dissertação à minha família: meus
pais João e Iracema, minhas irmãs queridas
Joice, Thaís e Tammy, pelo amor, apoio,
educação, princípios e felicidade.
Tudo incondicionalmente.
Sem vocês, o mundo não teria tanta graça.
AGRADECIMENTOS
À profa. Dra. Silviene F. Oliveira, que me ensinou, durante quase seis anos de
convivência, o que significa ter respeito, carinho, confiança e espírito pedagógico ao
longo deste processo de aprendizagem. Muito obrigada, Sil!
À profa. Dra. Maria Paula Schneider e ao prof. Dr. Evonnildo Costa
Gonçalves pela oportunidade de trabalhar no Laboratório de Polimorfismos de DNA da
Universidade Federal do Pará (LPDNA – UFPa), sempre de portas abertas e com a mão
estendida, me orientando e apoiando em tudo quanto fosse necessário, e ao prof. Dr.
Artur Silva, em especial, por me acolher em sua casa durante este período com o
coração, bons vinhos, amigos e risadas: tudo isso possibilitou a execução deste trabalho;
Aos membros da banca de avaliação, profa. Dra. Maria Paula Schneider, profa.
Dra. Maria de Nazaré Klautau-Guimarães e profa. Dra. Rosane Collevatti por terem
aceitado o convite e contribuído para a melhor finalização deste trabalho;
Ao Heitor Burlamaqui Bastos que deu continuidade aos experimentos práticos
quando eu não mais pude estar em Belém. Minha gratidão, Heitor!
À Equipe da Pró-Fauna pela disponibilidade e gentileza no fornecimento das
fichas morfométricas dos animais capturados que fizeram parte deste estudo;
À CAPES, ao CNPq e ao Decanato de Pesquisa e Pós-Graduação da UnB,
pelo apoio financeiro;
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal e à Universidade de
Brasília, e aos professores do Instituto de Ciências Biológicas pela orientação
acadêmica e amizade;
Aos funcionários da UnB, especialmente à Nara, Ornil e Elisa pela atenção e
carinho nas atividades burocráticas e do laboratório, no dia a dia;
À Nira e Socorro, as técnicas do LPDNA – UFPa, por terem contribuído
quando da genotipagem das amostras, me acompanhando em chuvas e domingos
laborais;
Aos professores do Laboratório de Genética da Universidade de Brasília (UnB),
Nazaré, César e Zulmira pela atenção e importantes contribuições em minha formação
acadêmica e também pela amizade;
Aos colegas de laboratório do LPDNA – UFPa, pois vocês não somente me
apresentaram o LPDNA, mas também a maravilhosa Belém do Pará!
Aos companheiros e amigos do Laboratório de Genética da Universidade de
Brasília: Gustavo, Neide, Carol, Sílvia, Guilherme, Gegê, Arthur, Gabriel, Mila,
Neide, Rejane, Henry, Daniela, Juliana Ruas, Eduardo, Reginaldo, Ricardo,
Diogo, Penha, Wellington e Leonora que partilharam tantas horas de bancada, dando
apoio e mostrando a sua amizade em todos os momentos.
Aos amigos Beto, Jojô, Bebel, Cláudio, Paulinho, Lorena, Vanessa, Rodrigo,
Samuel, Will, José Roberto e Selma pelas conversas que muito contribuíram para
minha formação como ser humano e bióloga, discutindo teorias e dados e, mais ainda,
pela amizade, apoio e carinho!
Ao Alê, pelos bons momentos, companheirismo, felicidade, alegria e amor!
Muito Obrigada!
RESUMO
Os Alouatta, conhecidos como bugios, estão distribuídos por toda a região
Neotropical ocupando variados tipos de hábitats. No presente trabalho, descrevemos a
caracterização demográfica, a morfológica e a variabilidade genética de uma população
de Alouatta caraya de Porto Primavera, São Paulo, Brasil. Nas análises de
caracterização demográfica, comparamos o número de machos e de fêmeas existentes
na população total (N = 501) e nas diversas classes etárias: Adulto, Subadulto, Jovem e
Infante. Os resultados mostram igualdade no número total de machos e de fêmeas na
população total (χ
2
= 1,7786, GL = 1, p = 0,1823) e na distribuição das diversas classes
etárias, segundo o teste z aplicado. Em relação à morfologia, foram avaliados os
parâmetros peso e comprimento total dos indivíduos, comparando-se as classes etárias.
Os resultados indicam intenso dimorfismo sexual entre machos e fêmeas adultos, menor
dimorfismo entre jovens e ausente dimorfismo entre infantes, corroborando o descrito
na literatura para dimorfismo sexual e tamanho corpóreo da espécie.
A caracterização genética foi realizada utilizando marcadores de DNA do tipo
microssatélites heterólogos desenvolvidos originalmente para Alouatta belzebul. O
DNA genômico de 100 espécimes foi isolado utilizando um protocolo padrão fenol-
clorofórmio e 20 marcadores foram testados e amplificados por reação em cadeia da
polimerase, sendo genotipados em um seqüenciador automático ALFexpress
TM
II. Sete
marcadores apresentaram amplificações positivas: Ab04, Ab06, Ab07, Ab09, Ab10,
Ab17 e Ab12. Destes, os seis primeiros foram analisados para toda a população. A
porcentagem de locos polimórficos foi 66,67% (DP = 0,47) e o número médio de alelos
por loco foi de 7,83 (DP = 6,85). A heterozigose média observada foi 0,52 (DP = 0,38)
e a esperada foi 0,48 (DP = 0,42). Todos os locos encontram-se em desacordo com as
freqüências esperadas no teorema do equilíbrio de Hardy-Weinberg, exceto Ab17 (p =
0,223). Os níveis de variabilidade genética aqui observados, embora menores que os
descritos para A. belzebul, são relativamente elevados quando comparados a outros
primatas Neotropicais e são coerentes com aqueles reportados para espécies com grande
capacidade de dispersão e elevadas densidades populacionais.
ABSTRACT
Alouatta genus, usually known as howler-monkeys, is the most widely dispersed
Neotropical monkeys. In the present work we describe the demographic, morphological
and genetic characterization of an Alouatta caraya population from Porto Primavera,
São Paulo, Brazil. The demographic characterizations were performed by the evaluation
of the distribution of male and female in the entire population (N = 501) and between
different age clusters: Adults, Subadults, Yong and Infants. Our results showed equal
distribution of males and females when total population are considered (χ
2
= 1,7786,
GL = 1, p = 0,1823). The same were observed using test z to compare the distribution
among clusters. We also evaluate body weight and total size between clusters. The body
weight and total body size comparisons corroborate the described in literature: intense
sexual dimorphism between Adults, lower between Young and absent between Infants.
The genetic characterization was performed using heterologous microsatellite
markers originally described to Alouatta belzebul. Genomic DNA of 100 specimens
were isolated by a phenol-chlorophorm protocol and 20 markers were tested and
amplified by PCR and genotyped in an ALFexpress
TM
II automated sequencer. Seven
markers showed positive amplicons – Ab04, Ab06, Ab07, Ab09, Ab10, Ab17 and Ab12
– and were analyzed in Porto Primavera Alouatta caraya population, except Ab12.
66.67% (SD = 0.47) of the analyzed loci presented polymorphism. The number of
alleles ranged between 1 – 17, and the average number of alleles by locus were 7.83
(SD = 6.85). Ab09 and Ab10 presented monomorphic to this population. The average
heterozygosity observed were 0.52 (SD = 0.38) and the expected were 0.48 (SD = 0.42).
All analyzed loci are in Hardy-Weinberg disequilibrium, except for Ab17 (p = 0.223).
The genetic variability levels observed in the present work are relatively higher when
compared to Neotropical primates and are similar to those reported to species with great
dispersion capacity and elevated population densities.
ÍNDICE
I
– INTRODUÇÃO_____________________________________________________ 1
I.1. Ordem Primates e Macacos do Novo Mundo________________________________ 1
I.2. Gênero Alouatta (Primates, Atelidae) ______________________________________ 2
I.3. Alouatta caraya ________________________________________________________ 4
I.4. Marcadores genéticos e variabilidade genética ______________________________ 6
I.5. Variabilidade genética em primatas Neotropicais: o gênero Alouatta____________ 7
I – OBJETIVOS _____________________________________________________ 10
Objetivo geral ___________________________________________________________ 10
Objetivos específicos__________________________________________________________ 10
I
II – MATERIAL E MÉTODOS_________________________________________ 11
III.1. Origem das amostras de Alouatta caraya_________________________________ 11
III.2. Amostragem ________________________________________________________ 12
III.2.1. Demografia e morfometria _________________________________________________ 12
III.2.2. Material biológico: Processamento e Isolamento do DNA _________________________ 12
III.3. Marcadores genéticos, condições de PCR e genotipagem ___________________ 13
III.4. Análise dos dados____________________________________________________ 16
III.4.1. Caracterização Demográfica e Morfológica ____________________________________ 16
III.4.2. Caracterização da variabilidade genética_______________________________________ 18
I
V – RESULTADOS __________________________________________________ 23
IV.1. Caracterização Demográfica e Morfológica de Alouatta caraya de Porto
Primavera_______________________________________________________________ 23
IV.1.1. Dados demográficos ______________________________________________________ 23
IV.1.2. Dados morfológicos ______________________________________________________ 24
IV.2. Variabilidade genética de Alouatta caraya de Porto Primavera ______________ 28
IV.2.1. Teste dos marcadores microssatélites heterológos _______________________________ 28
IV.2.2. Análise Intraespecífica ____________________________________________________ 30
Desequilíbrio de Ligação entre locos _________________________________________ 36
IV.2.3. Análise Interespecífica ____________________________________________________ 37
Análise de Coordenadas Principais (PCA) _____________________________________ 37
V – DISCUSSÃO _____________________________________________________ 39
V.1. Caracterização Demográfica e Morfológica de Alouatta caraya de Porto
Primavera_______________________________________________________________ 39
V. 2. Variabilidade genética de Alouatta caraya de Porto Primavera_______________ 43
Amostragem ________________________________________________________ 43
Variabilidade Genética _______________________________________________ 44
VI – CONCLUSÃO ___________________________________________________ 51
VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS____________________ ___________ 53
VIII – ANEXO ______________________________________________________ 63
LISTA DAS FIGURAS
Figura I.1. Distribuição das espécies de Alouatta, seguindo a classificação
proposta por Groves (2001), de acordo com estimativas de
distribuição a partir de Hill (1962) (Modificado de Cortés-Ortiz
et al., 2003).
______________________________________________________ 3
Figura I.2. Dimorfismo sexual em Alouatta caraya. Os machos adultos são
pretos e as fêmeas douradas.
______________________________________________________ 5
Figura III.1. Localização geográfica da região da Usina Hidrelétrica
Engenheiro Sérgio Motta (quadrado branco), origem das
amostras de Alouatta caraya utilizadas neste estudo. As
estrelas indicam capitais de estados brasileiros. Fonte: IBGE.
____________________________________________________ 11
Figura IV.1. Distribuição por sexo e classes etárias dos 506 espécimes de
Alouatta caraya capturados durante o enchimento do lago
artificial de Porto Primavera – SP (Macho em azul e Fêmea em
rosa).
____________________________________________________ 23
Figura IV.2. Distribuição do peso em quilogramas para as classes etárias
de Macho e de Fêmea na amostra de A. caraya de Porto
Primavera – SP. A: Comparação das classes de Fêmea:
Adulto, Jovem e Infante; B: Comparação das classes de
Macho: Adulto, Subadulto, Jovem e Infante; C: Comparação
entre o peso de Fêmea Adulto versus Macho Adulto; D:
Comparação entre Fêmea Jovem versus Macho Jovem; E:
Comparação entre Fêmea Infante versus Macho Infante.
____________________________________________________ 25
Figura IV.3. Comparação entre o comprimento total dos espécimes que
compuseram a amostra de Alouatta caraya oriunda de Porto
Primavera (SP) utilizando o teste de Mann-Whitney. Acima
valores de p e abaixo valores de U.
____________________________________________________ 27
Figura IV.4. Comparação entre o comprimento total de Adulto e Jovem em
Fêmea (A) e em Macho (B) de A. caraya da população de
Porto Primavera (SP).
____________________________________________________ 27
Figura IV.5. Comparação entre o comprimento total de Fêmea e Macho
Adulto (A) e entre Fêmea e Macho Jovem (B) de Alouatta
caraya da população de Porto Primavera (SP).
____________________________________________________ 27
Figura IV.6. Genotipagem do loco Ab10: os picos em vermelho são do
fragmento amplificado (microssatélite de interesse) em
diferentes amostras. Os picos em verde são os calibradores
internos de tamanho (ladders). Observe como o pico do
microssatélite é separado, uniforme e com tamanho entre 100
e 300 pb.
____________________________________________________ 29
Figura IV.7. Genotipagem do loco Ab16: os picos em vermelho são dos
fragmentos amplificados que podem ou não corresponder ao
microssatélite de interesse. Os picos em verde são os
calibradores internos de tamanho (ladders). Observe como
diversos picos foram selecionados apresentando curva
uniforme e com tamanho entre 100 e 300 pb. Os marcadores
que apresentaram este padrão de bandeamento foram
considerados não confiáveis.
____________________________________________________ 29
Figura IV.8. Distribuição das freqüências alélicas para os quatro
marcadores microssatélites polimórficos analisados: Ab04,
Ab06, Ab07 e Ab17 para a população de Alouatta caraya
de Porto Primavera (SP), evidenciando os alelos mais
freqüentes (tamanhos em pares de base).
____________________________________________________ 35
Figura IV.9. Análise das coordenadas principais (PCA) comparando as
populações de Alouatta caraya de Porto Primavera (SP) com
populações de Alouatta belzebul da hidrelétrica de Tucuruí
(PA).
____________________________________________________ 38
LISTA DAS TABELAS
Tabela III.1. Descrição dos 20 locos microssatélites desenvolvidos para a
espécie Alouatta belzebul e testados para Alouatta caraya no
presente trabalho. O nível de polimorfismo refere-se aos
achados em A. belzebul. Os locos marcados com * foram
publicados por Gonçalves et. al. (2004) e os demais foram
gentilmente cedidos pelo LPDNA-UFPA.
____________________________________________________ 14
Tabela III.2. Temperaturas de pareamento (TA) e número de repetições do
ciclo de PCR utilizadas Alouatta caraya e descritas para
Alouatta belzebul (Gonçalves et al., 2004). Em grifo negrito
as TA propostas para A. caraya no presente trabalho, que
divergiram das descritas para A. belzebul.
____________________________________________________ 16
Tabela IV.1. Distribuição de indivíduos da amostra de Alouatta caraya de
Porto Primavera (SP) por gênero e classe etária e resultado
do teste z das comparações entre os gêneros.
____________________________________________________ 24
Tabela IV.2. Peso corporal na amostra de Alouatta caraya de Porto
Primavera (SP) por gênero em classes etárias.
____________________________________________________ 25
Tabela IV.3. Comprimento total (CT) em indivíduos de uma população de
Alouatta caraya de Porto Primavera, em centímetros,
categorizados por sexo e classe etária.
____________________________________________________ 26
Tabela IV.4. Caracterização dos microssatélites heterólogos descritos por
Gonçalves et al. (2004) e testados em uma população de
Alouatta caraya de Porto Primavera (SP).
____________________________________________________ 31
Tabela IV.5. Distribuição genotípica observada dos marcadores do tipo
microssatélite heterólogos para uma população de Alouatta
caraya de Porto Primavera (SP).
____________________________________________________ 32
Tabela IV.6. Freqüências alélicas dos marcadores do tipo microssatélite
heterólogos para uma população de Alouatta caraya de Porto
Primavera, SP.
____________________________________________________ 34
Tabela IV.7. Teste da aderência ao EHW (teste exato de Guo & Tompson
(1992) utilizando a cadeia de Markov) dos locos analisados
para a população de Alouatta caraya de Porto Primavera.
____________________________________________________ 36
Tabela IV.8. Valores de p ± desvio padrão da análise de desequilíbrio de
ligação entre os marcadores microssatélites analisados para a
população de Alouatta caraya de Porto Primavera (SP).
Valores em grifo negrito correspondem às comparações entre
locos que indicam desequilíbrio de ligação.
____________________________________________________ 37
Tabela VIII.1. Marcadores genéticos (moleculares e protéicos) descritos
para alguns primatas neotropicais. N = tamanho amostral.
_________________________________________________ Anexo
Tabela VIII.2. Dados originais relativos ao peso das fêmeas da espécie
Alouatta caraya capturadas durante a formação do lago
artificial da usina hidrelétrica Engenheiro Sergio Mota,
Porto Primavera (SP) fornecidos pela equipe da Pró-Fauna.
Peso em quilogramas.
_________________________________________________ Anexo
Tabela VIII.3. Dados originais relativos ao peso dos machos da espécie
Alouatta caraya capturados durante a formação do lago
artificial da usina hidrelétrica Engenheiro Sergio Mota, Porto
Primavera (SP) fornecidos pela equipe da Pró-Fauna. Peso
em quilogramas.
_________________________________________________ Anexo
Tabela VIII.4. Dados relativos ao Comprimento Total (CT) de espécimes
de uma população de A. caraya de Porto Primavera (SP)
fornecidos pela equipe da Pró-Fauna (N total = 162).
_________________________________________________ Anexo
Tabela VIII.5. Comparação do tamanho dos fragmentos, número de alelos
por loco e número de indivíduos genotipados para os
microssatélites descritos por Gonçalves et al. (2004) em
populações de Alouatta belzebul (Bastos et al., com.
pessoal) e uma população de Alouatta caraya (presente
trabalho).
_________________________________________________ Anexo
Tabela VIII.6. Freqüência alélica dos marcadores analisados para uma
população de Alouatta caraya de Porto Primavera (PP) e
para cinco populações de Alouatta belzebul da região de
Tucuruí (PA): Ilha de Germoplasma – IG, Ilha de Cornélio
– IC, Ilha da Base 4 – B4, Margem esquerda do rio
Tocantins – ME e Margem direita do rio Tocantins – MD –
Bastos et al. com. pessoal. Nesta análise computamos todos
os alelos descritos para o loco:
+
sinaliza os alelos
exclusivos de A. caraya e • os alelos compartilhados com
A. belzebul.
_________________________________________________ Anexo
INTRODUÇÃO
© Lacèpéde
Introdução
1
I – INTRODUÇÃO
I.1. Ordem Primates e Macacos do Novo Mundo
A Ordem Primates, a qual inclui os lêmures, os macacos e os hominídeos, divergiu a
partir de pequenos mamíferos insetívoros terrestres há aproximadamente 70 milhões de anos
atrás. Esses primeiros primatas – que originaram diversas linhagens – passaram a ocupar as
árvores, o que mudou significativamente o hábito de vida e trouxe mudanças evolutivas
importantes (Nowak, 1999).
Os primatas não-humanos estão distribuídos por quase todo o mundo e são divididos em
dois grandes grupos: as Subordens Strepsirhini e Haplorhini. Os Strepsirhini são lêmures e
lorises, considerados mais próximos dos ancestrais da Ordem Primates. Os Haplorhini são os
macacos típicos e estão agrupados em Platyrrhini – conhecidos como macacos do Novo Mundo e
Catarrhini – do Velho Mundo.
Os macacos do Novo Mundo distribuem-se desde o México até o sul da Argentina e
compreendem a maior fauna de primatas do mundo. Os componentes da Infraordem Platyrrhini
estão agrupados em três famílias – Cebidae, Pitheciidae e Atelidae – segundo a filogenia
proposta por Schneider (2000) que compila dados moleculares de diversos autores (Canavez et
al., 1999; Chaves et al., 1999; Meireles et al., 1999
a
; Porter et al., 1999; von Dormam & Ruvolo,
1999; Porter et al., 1997) e é coerente com a gerada a partir de dados parasitológicos,
morfológicos e moleculares (Hugot, 1998). O clado monofilético Atelidae, do qual Alouatta faz
parte, apresenta outros três gêneros: Ateles, Lagothrix e Brachyteles. Alouatta é considerado o
gênero mais basal do grupo, tendo divergido dos demais Atelidae há cerca de 15 milhões de anos
(Schneider, 2000; Rylands et al., 2000; Rylands & Brandon-Jones, 1998).
Introdução
2
I.2. Gênero Alouatta (Primates, Atelidae)
O gênero Alouatta apresenta a maior distribuição entre os gêneros de Macacos do Novo
Mundo. É encontrado em toda a região Neotropical, desde o México até a Argentina (21°N a
30°S), em ao menos 19 países (Figura I.1, Cortés-Ortiz et al., 2003). São encontrados desde o
nível do mar até altitudes acima de 3.200 m e ocupam variados tipos de hábitats, desde áreas
pouco úmidas, como os sertões, até florestas sempre verdes, inundadas ou de terra firme,
decíduas e não-decíduas, além de matas de galeria (Milton, 1980).
Os Alouatta são conhecidos popularmente como bugios ou guaribas e exibem
características que permitem sua fácil identificação, como a cauda preênsil e o osso hióide
bastante pronunciado, com o qual executam um rugido. São animais de hábitos diurnos,
essencialmente arborícolas e classificados como generalistas herbívoros. Alouatta é considerado
o gênero de primatas mais folívoro do novo mundo, com dieta de baixo conteúdo energético
(Milton, 1998; Crockett, 1998; Calegaro-Marques, 1992; Milton, 1980).
Apesar de ser um dos gêneros mais estudado dentre os macacos do Novo Mundo, a
classificação taxonômica dos Alouatta ainda não foi completamente definida. Dois problemas
permeiam esta indefinição: o número de espécies reconhecidas para o gênero e o relacionamento
filogenético entre elas. Dependendo dos critérios utilizados, são reconhecidas seis (Hill, 1962),
nove (Rylands et al., 1995) ou dez (Groves, 2001) espécies para esse gênero. Neste estudo, foi
aceita a classificação proposta por Groves (2001), que desconsidera as subespécies e reconhece
dez espécies: Alouatta palliata, A. pigra, A. seniculus, A. sara, A. macconelli, A. caraya, A.
belzebul, A. nigerrima, A. guariba e A. coibensis (Gregorin, 2006; Cortés-Ortiz et al., 2003).
Introdução
3
Figura I.1. Distribuição das espécies de Alouatta, seguindo a classificação proposta por Groves
(2001), de acordo com estimativas de distribuição a partir de Hill (1962) (Modificado
de Cortés-Ortiz et al., 2003).
Oceano Pacífico
Oceano Atlântico
Oceano Atlântico
Introdução
4
I.3. Alouatta caraya
A espécie Alouatta caraya apresenta a segunda maior distribuição do gênero ocupando
áreas em pelo menos quatro países – Brasil, Paraguai, Bolívia e Argentina (norte) – sendo
possivelmente encontrada também no Uruguai. Seu habitat é florestal, como florestas secas
sazonais decíduas e semidecíduas, sempre verdes ou não, matas de galeria, áreas sempre secas e
também inundáveis como as do Pantanal. No Brasil, ocupa principalmente dois biomas: o
Cerrado, em matas de galeria, e o Pantanal mato-grossense, em matas próximas a lagoas (Bravo
& Sallenave, 2003; Crockett, 1998; Emmons & Feers, 1997; Hill, 1962). Foram registradas
ocorrências até o norte do estado do Tocantins e também até a bacia do Amazonas, nos rios
Tapajós e Xingu, e à margem esquerda do rio Guaporé (Iwanaga & Ferrari, 2002).
Segundo as definições da IUCN, A.caraya é considerada uma espécie não ameaçada de
extinção. Este diagnóstico deve-se ao grande contingente populacional da espécie (estimada em
100.000 indivíduos) e a sua grande versatilidade e resistência, pois mesmo em hábitats muito
degradados e antropizados encontram-se populações estáveis de A. caraya (Crockett, 1998;
Horwich, 1998). Há uma correlação direta entre densidade da vegetação e tamanho dos grupos
de A. caraya, onde maiores grupos são encontrados em florestas altas/sempre verdes. A maior
densidade reportada para a espécie – 425 ind./km
2
– foi encontrada em florestas do Rio Paraná
na Argentina (Kowalewski & Zunino, 2004; Bravo & Sallenave, 2003; Treves, 2001; Zunino et
al., 2001).
Alouatta caraya apresenta intenso dimorfismo sexual: os infantes são dourados, os
machos adultos são pretos e as fêmeas dourado-oliva (Figura I.2). Os filhotes nascem com
pelagem clara e, à medida que amadurecem sexualmente, ficam mais próximos da coloração dos
adultos. São considerados de médio porte, sendo que o peso médio é de 7,5 kg para machos e 5,7
kg para fêmeas adultos, ocorrendo variações dependendo da população estudada (Milton, 1980).
Um exemplo desta variação foi o reportado para populações da Argentina, com machos pesando
6,42 kg e fêmeas 4,33 kg, em média (Rumiz, 1990). Apresentam 36 dentes: incisivos 2/2,
caninos 1/1, pré-molares 3/3 e molares 3/3 (Hill, 1962) e o padrão cromossomal da espécie é 2n
= 52 e cromossomos sexuais X
1
X
2
/Y
1
Y
2
XX/XY (Mudry et al., 1998).
Os grupos de A. caraya são formados por um número bastante variável de indivíduos.
Foram descritos grupos com tamanho entre três e 20 indivíduos, sendo que a variação típica está
entre cinco e nove (Treves, 2001; Chapman & Balcomb, 1998; Crockett & Eisenberg, 1987).
Introdução
5
Figura I.2. Dimorfismo sexual em Alouatta caraya. Os machos adultos são pretos e as fêmeas
douradas. http://www.honoluluzoo.org/howler_monkey.htm
O tamanho dos grupos depende de diversos fatores e a razão sexual (número de fêmeas
por macho) varia entre 0,5 e 2,02, sendo a média 0,71 (Treves, 2001; Chapman & Balcomb,
1998). Geralmente, os grupos são compostos por um macho alfa (líder) e duas ou três fêmeas
adultas (o que caracteriza a poliginia), além de outros indivíduos que não se reproduzem. O
macho alfa é o único sexualmente ativo, sendo que os demais machos (jovens, subadultos e
adultos com mais de quatro anos de idade), apesar de já estarem fisiologicamente aptos à
atividade sexual, têm seu acesso às fêmeas restringido por sua posição hierárquica no bando, a
qual é comumente definida com utilização de violência. As fêmeas atingem concomitantemente
a maturidade sexual fisiológica e social por volta dos quatro anos de idade (Treves, 2001;
Calegaro-Marques, 1992; Neville et al., 1988) e geralmente dão à luz um único filhote por
parição, com gestação de aproximadamente seis meses.
Todo o bando auxilia no cuidado parental, sendo que os infantes são carregados nas
costas por até dois anos ou uma nova gestação. O cuidado parental é também uma forma de
estabelecimento de hierarquia e aceitação no bando. Fêmeas mais jovens podem ser mantidas ou
expulsas do bando quando atingem a maturidade sexual. Oferecer-se para cuidado da cria de uma
fêmea mais velha não só prepara a subadulta para a maternidade, como também favorece sua
permanência no grupo.
Machos são expulsos do bando quando atingem a maturidade e, geralmente, não desafiam
o macho alfa para embate no momento da exclusão. Os indivíduos excluídos do grupo podem
formar novos grupos ou se unir a outros bandos, onde ocuparão posições de menor prestígio
social. A freqüência com que estes comportamentos ocorrem não foi avaliada na natureza
(Kowalewski & Zunino, 2004; Chapman & Balcomb, 1998; Calegaro-Marques, 1992).
Introdução
6
I.4. Marcadores genéticos e variabilidade genética
São vários os fatores que alteram a variabilidade genética populacional (Pannel &
Charlesworth, 2000): alguns estão associados ao aumento da variabilidade (mutação e fluxo
gênico) e outros à sua diminuição (endocruzamento, reduções populacionais drásticas
(bottlenecks), subestruturação populacional e seleção). Existem diversas formas de avaliar e
mensurar a variabilidade genética. A mais utilizada é a distribuição de alelos de marcadores
genéticos, como o polimorfismo de proteínas, as variações no DNA – tanto nuclear como extra-
nuclear – a composição e estruturação dos genomas, além de algumas características fenotípicas.
Dentre os marcadores genéticos empregados destacam-se os microssatélites. Os
marcadores hipervariáveis do tipo microssatélite ou STR são seqüências repetitivas em tandem
de motivos curtos, que apresentam um número variável de alelos e estão distribuídos por todo o
genoma, seja em regiões codificadoras como não-codificadoras. Os alelos são caracterizados
pelo número de repetições do motivo. Esse tipo de marcador é o que apresenta o maior conteúdo
informativo, sendo utilizado para avaliar a diversidade genética intra- e inter-populacional. A
extensão e o padrão de variação apresentado pelos marcadores hipervariáveis podem fornecer
informações sobre a história evolutiva recente da espécie (ou do grupo) e podem potencialmente
estimar a importância de eventos demográficos (Hedrick, 2001).
Para localização destes marcadores no genoma de um dado organismo são desenvolvidas
bibliotecas gênicas específicas para microssatélites, de onde são selecionados fragmentos de
tamanho aproximado entre 300 e 1000 pb, ricos em resíduos de (GAAA)
n
. Estes fragmentos são
digeridos, clonados e hibridados com sondas com motivos (GAAA)
8
de modo que os fragmentos
mais compatíveis (clones positivos) são selecionados e inseridos em plasmídios para posterior
seqüenciamento. Em seguida, iniciadores específicos são desenhados. Esses iniciadores são
então testados em indivíduos de uma população e os que produzem fragmentos amplificados são
selecionados. Existe uma tendência intrínseca de os fragmentos gerados serem polimórficos, por
terem sido selecionados a partir de uma biblioteca gênica de microssatélites. Após o teste na
população, são verificados os índices de polimorfismo dos marcadores. Tais níveis de
polimorfismo são válidos somente para a população testada, a princípio, mas podem servir de
referência para toda a espécie.
Introdução
7
I.5. Variabilidade genética em primatas Neotropicais: o gênero Alouatta
A importância da variabilidade genética intraespecífica está no potencial de as
populações responderem à seleção natural e se adaptarem a alterações no ambiente. Avaliar esta
variabilidade permite inferir elementos da biologia da espécie e também eventos evolutivos que
marcaram a história das populações. Observa-se que o nível de variabilidade genética varia entre
as diversas espécies de primatas, dependendo da história evolutiva bem como da categoria de
marcadores genéticos utilizados na avaliação (Frankhan et al., 2002).
Para avaliar a variabilidade genética das populações de primatas diversos parâmetros vêm
sendo utilizados, como a porcentagem de locos polimórficos, a heterozigose média observada, a
verificação de alelos exclusivos e a variação existente nas populações e nas espécies.
A avaliação da variabilidade genética de populações de Alouatta foi abordada com a
utilização de marcadores genéticos, em especial proteínas e enzimas, principalmente nas décadas
de 80 e 90 (A.pigra – James et al., 1997; A. seniculus – Sampaio et al., 1996; Bonvicino et al.,
1995; Pope, 1992; Lima et al., 1990; A. belzebul – Schneider et al., 1991; Barroso, 1988;
Armada et al., 1987). Com relação ao polimorfismo de fragmentos de DNA, o número de
estudos ainda é pequeno e em geral com número reduzido de amostras, sendo a grande maioria
gerada como subproduto de estudos de filogenia do gênero (Nascimento et al., 2005; Villalobos
et al., 2004; Cortés-Ortis et al., 2003; Bonvicino et al., 2001; Meireles et al., 1999
b
). A tabela
VIII.1 do Anexo compila diversos marcadores genéticos descritos na literatura para primatas
Neotropicais.
Os poucos estudos populacionais visando a avaliação da variabilidade genética de
Alouatta têm utilizado variados tipos de marcadores como microssatélites, polimorfismos
protéicos e DNA mitocondrial, o que dificulta comparações entre os resultados obtidos. Em se
tratando de microssatélites, o desenvolvimento de iniciadores para A. belzebul (Gonçalves et al.,
2004) e A. palliata (Winkler et al., 2004; Ellsworth & Hoelzer, 1998) são exemplos recentes da
utilização destes marcadores. Estes mesmos iniciadores vêm sendo testados de maneira
heteróloga, contribuindo para a análise da variabilidade genética em espécies congenéricas como
A. seniculus, A. pigra, A. palliata ou ainda de outros gêneros como Ateles geoffroyi, Callimico
goeldii e Cebus apella (Winkler, et al., 2004; Ellsworth & Hoelzer, 1998). Outras regiões com
polimorfismo, a região controladora do mtDNA (5’), isso é, DNA extra-nuclear (Ascunce et al.,
2003) e para os genes ε − globina e IRBP situados no DNA nuclear (Harada et al., 1995), foram
descritas para diversas espécies.
Introdução
8
Populações de Alouatta palliata (N = 80) da ilha de Barro Colorado, América Central,
foram analisadas com relação às enzimas sangüíneas (22 proteínas no total, representando 25
locos), sendo somente três locos polimórficos, com heterozigose média de 0,16. Esta pequena
variabilidade foi explicada por hipóteses associadas a fatores ecológicos e populacionais: a
população era residente em uma ilha, houve um pequeno contingente populacional durante a
colonização da área, foram relatadas epidemias de febre amarela com acentuada mortalidade de
indivíduos além de aspectos próprios da biologia dos Alouatta como seu sistema de composição
de bandos (Froelich & Thorington, 1982).
Populações venezuelanas de Alouatta seniculus (N = 137) foram estudadas com o
objetivo de investigar a influência dos padrões de dispersão e sistemas de acasalamento na
estrutura genética da espécie. Dos 29 locos protéicos analisados, dez (32,7%) apresentaram-se
polimórficos e a heterozigose média foi estimada em 0,099 (heterozigose por loco entre 0,057 e
0,135), com grande variação entre os grupos e um excesso de heterozigotos (Pope, 1992).
Posteriormente, a região controladora do mtDNA de 32 indivíduos destas populações foi
seqüenciada, sendo observados 11 haplótipos no total. Destes, apenas um foi compartilhado entre
as populações estudadas e o F
ST
estimado foi de 0,28 (Pope, 1996).
Alouatta pigra foi avaliada para 36 alozimas (N = 41) verificando-se uma baixa
variabilidade genética: dois locos polimórficos (P = 5,6%) e heterozigose média de 0,021 –
havendo deficiência de heterozigotos para um dos locos. Foi analisado também o polimorfismo
de sítios de clivagem do mtDNA (13 endonucleases testadas) observando-se apenas um sítio
polimórfico em um único indivíduo (P = 0,2%). Estes resultados indicam baixa variabilidade
genética, quando comparados a outros primatas neotropicais e foram associados à ocorrência de
eventos de redução populacional drásticos e recentes, como furacões e contínua deriva genética,
sem que se possa excluir a possibilidade de que a baixa variabilidade encontrada seja
característica da espécie (James et al., 1997). Outra constatação interessante foi a similaridade
genética entre os grupos das populações estudadas.
Em Alouatta guariba do Rio Grande do Sul (Brasil) foi observada alta variabilidade
genética na análise de seqüências da região controladora do mtDNA (5’) e do segmento
hipervariável. Foi verificada a presença de 15 haplótipos distintos em 16 indivíduos
possivelmente de populações diferentes. Dentro deste contexto, diversas hipóteses foram
traçadas buscando explicar esse resultado, incluindo a influência da biologia da espécie na
distribuição desta variabilidade – uma vez que A. guariba apresenta subespécies e separação
geográfica entre populações devido à fragmentação de hábitats (Jerusalinsky, 2001).
Introdução
9
No caso de Alouatta caraya, há escassez na literatura de trabalhos em nível populacional,
o que impossibilita inferências sobre o fluxo gênico, a migração sexo-específico ou os padrões
biogeográficos para a espécie (Nascimento et al., 2005; Szapkievich et al., 2004; Ascunce et al.,
2003; Bonvicino et al., 2001; Salim et al., 2001; Ellsworth & Hoelzer, 1998). Dentre estes, a
análise de regiões do DNA mitocondrial de três indivíduos coletados em resgate de fauna na
formação do lago de duas hidrelétricas – Serra da Mesa (Goiás, Brasil) e Manso (Mato Grosso,
Brasil) – revelou uma variabilidade haplotípica muito baixa para espécie e uma baixa distância
genética (0,008<p<0,010) (Bonvicino et al., 2001).
Nascimento et al. (2005), contudo, reportaram uma variabilidade haplotípica maior do
que a observada por Bonvicino et al. (2001), descrevendo a existência de 11 haplótipos de DNA
mitocondrial em 25 indivíduos resgatados durante a formação do lago da hidrelétrica de Manso
(Mato Grosso, Brasil). Quando avaliada utilizando-se marcadores protéicos e enzimáticos, a
variabilidade genética estimada até o momento para a A. caraya sugere que esta é baixa em
relação aos macacos em geral e semelhante ao observado em outras espécies do gênero Alouatta
(Szapkievich et al., 2004). No maior estudo de marcadores protéicos realizado com esta espécie,
Szapkievich et al. (2004) avaliaram dez sistemas protéicos (14 locos) em 16 indivíduos de
diferentes localidades (populações naturais resgatadas durante o enchimento do lago da represa
Yaciretá (N = 11), de Ayolas, Paraguai (N = 1), Corrientes, Argentina (N = 3) e um indivíduo de
origem desconhecida alocado no Zoológico de Buenos Aires). Dois locos foram polimórficos
(Transferrina e Leucil-Amino Peptidase), apresentando porcentagem de locos polimórficos de
14% e heterozigose observada de 0,0359 – o que é semelhante ao reportado para A. belzebul e A.
seniculus. Em outro estudo, as enzimas sangüíneas Esterase D e Fosfogluconato desidrogenase
apresentaram-se monomórficas em uma população de A. caraya resultante de resgate de fauna
para a formação do lago da usina hidrelétrica de Porto Primavera, São Paulo, Brasil (N = 100)
segundo o reportado por Salim et al. (2001).
Outros estudos genéticos sugerem que A. caraya apresenta menor variabilidade que
outras espécies do grupo como A. seniculus (Pope, 1992) e A. belzebul (Nascimento et al., 2005),
mas variabilidade semelhante ou maior que a observada em outros primatas Neotropicais como
A. palliata, A. palliata, Aotus, Callithrix, Saimiri, Cebus e Chiropotes (Winkler et al., 2004;
Schneider et al., 1995; Meireles et al., 1992; Silva et al., 1993; Schneider, 1988; Froelich &
Thorington, 1982).
OBJETIVOS
Objetivos
10
II – OBJETIVOS
Objetivo geral
Caracterizar geneticamente uma população de Alouatta caraya de Porto Primavera, São
Paulo, Brasil.
Objetivos específicos
1. Caracterizar a população de A. caraya de Porto Primavera (SP) utilizando
informações gerais acerca da demografia e estrutura populacional como a proporção
entre machos e fêmeas e a distribuição dos indivíduos em classes etárias, e caracteres
morfológicos como o peso e comprimento total dos indivíduos;
2. Testar iniciadores heterólogos de marcadores moleculares do tipo microssatélite,
desenvolvidos para a espécie Alouatta belzebul, quanto à amplificação de fragmentos
por PCR, em uma população de A. caraya de Porto Primavera (SP);
3. Estudar a diversidade genética de uma população de A. caraya quanto aos marcadores
heterólogos que produzirem resultados positivos de amplificação, verificando
presença de polimorfismo, número e tamanho dos alelos e distribuição das
freqüências alélicas e estimar índices de variabilidade genética que possibilitem a
comparação com dados da literatura.
MATERIAL E MÉTODOS
© Fundação Zoobotânica do Rio de Janeiro
Material e Métodos
11
III – MATERIAL E MÉTODOS
III.1. Origem das amostras de Alouatta caraya
A coleta de dados morfológicos e amostras biológicas foi realizada durante uma
expedição de salvamento de animais ao longo do processo de inundação do lago da Hidrelétrica
Engenheiro Sérgio Motta. Essa hidrelétrica está situada no sudoeste do estado de São Paulo,
município de Porto Primavera, que fica a leste do estado do Mato Grosso do Sul (Figura III.1). O
reservatório foi formado pelo represamento da água do rio Paraná e conta com uma área
inundada de 2.200Km
2
. O procedimento de coleta foi realizado pela equipe da Pró-Fauna,
entidade responsável pela identificação e posterior soltura dos indivíduos em áreas florestais
próximas. Durante o resgate foram translocados animais de diversas espécies, incluindo cerca de
4.000 indivíduos da espécie Alouatta caraya.
Figura III.1. Localização geográfica da região da Usina Hidrelétrica Engenheiro Sérgio Motta
(quadrado branco), origem das amostras de Alouatta caraya utilizadas neste
estudo. As estrelas indicam capitais de estados brasileiros. Fonte: IBGE.
Oceano Atlântico
Material e Métodos
12
A coleta ocorreu ao longo de 180 km, no curso do rio Paraná, em municípios situados às
suas margens (Anaurilândia, Bataguassu, Bataiporã, Brasilândia e Santa Rita do Pardo em Mato
Grosso do Sul; Rosana, Presidente Epitácio e Porto Primavera em São Paulo) em biomas
pantanosos e florestais cujas altitudes variaram entre 276 e 328m acima do nível do mar
(Labruna et al., 2002). Os animais foram recolhidos principalmente em árvores ilhadas durante o
processo de enchimento no período de junho de 2000 a junho de 2001, o que implica em
variação temporal e espacial no conjunto amostral, além da possibilidade de mais de uma
população ter sido amostrada.
III.2. Amostragem
Devido à dinâmica da operação de resgate de A. caraya em Porto Primavera (SP), a
coleta de informações e de material biológico não foi obrigatoriamente realizada para os mesmos
animais. Portanto, não há compatibilidade entre os dados morfológicos e biológicos.
III.2.1. Demografia e morfometria
Após a captura, os animais foram sedados para a coletada de informações gerais de
saúde, peso, sexo, idade estimada e parâmetros morfológicos como comprimentos total, rostro-
anal, do tórax e da cabeça, entre outros. A idade dos indivíduos foi estimada com base em
evidências comportamentais, na presença de indícios fisiológicos de lactação e/ou filhotes,
dentre outras (Labruna et al., 2002). Para o presente trabalho foram utilizados os dados de
sexagem, idade e peso relativo (N = 506; Tabelas VIII.2 e Tabela VIII.3 do Anexo) e de
comprimento total (N = 162; Tabela VIII.4 do Anexo).
III.2.2. Material biológico: Processamento e Isolamento do DNA
Foram selecionados 105 indivíduos que tiveram material biológico (sangue) coletado. O
sangue foi separado em duas frações: plasma e fração celular (hemácias e fração leucocitária),
por centrifugação (2.000 rpm durante 10 min). À fração celular foi acrescentada solução salina
isotônica (NaCl 0,9%) e a mistura foi homogeneizada e centrifugada a 2000 rpm por 10 minutos.
Em seguida, descartou-se o sobrenadante e repetiu-se o procedimento de lavagem por duas
vezes. À fração celular, na proporção de 1:1, foi acrescentado solução tampão de estocagem
Material e Métodos
13
(citrato de tripotássio, fosfato bibásico de potássio, fosfato monobásico de potássio) com glicerol
a 40% em temperatura ambiente, que em seguida foi homogeneizada. As frações foram
armazenadas em freezer à temperatura -20ºC em microtubos de polipropileno de 1,5 mL novos,
livres de DNA e DNases, devidamente identificados.
O DNA das amostras foi isolado utilizando-se um protocolo fenol-clorofórmio padrão
descrito no Anexo. A quantificação e a qualidade das amostras foram verificadas em géis de
agarose 1% corados com brometo de etídio e visualizados em transluminador UV. Esta etapa foi
realizada no Laboratório de Genética da Universidade de Brasília.
III.3. Marcadores genéticos, condições de PCR e genotipagem
Foram testados 20 pares de iniciadores de amplificação para regiões de marcadores do
tipo microssatélite desenvolvidos pela equipe do Laboratório de Polimorfismos de DNA da
Universidade Federal do Pará (LPDNA-UFPA) para Alouatta belzebul (Gonçalves et al., 2004;
Gonçalves et al. comunicação pessoal), espécie próxima a Alouatta caraya. A seqüência dos
iniciadores específicos e a unidade de repetição dos locos microssatélites testados para A. caraya
estão listados na Tabela III.1. O teste e a genotipagem dos marcadores microssatélites
heterólogos foram realizados no LPDNA-UFPA.
Os marcadores heterólogos do tipo microssatélite foram amplificados para as amostras de
A. caraya utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) seguindo o protocolo apresentado
a seguir, o qual difere parcialmente do proposto por Gonçalves et al. (2004). Todas as reações de
PCR foram realizadas com volume final de reação de 20μL: 1,0μL dos dNTP (0,25mM), 0,8μL
de MgCl
2
(2,0mM), 2,0μL Tampão Tris-HCl em solução de trabalho (1x), 0,1μL de
TaqDNApolimerase Amershan Bioscience® (0,5 U), 0,1μL dos iniciadores a 10pmol (iniciador
direto marcado com Cy5) e 13,6μL de água milli-Q. O ciclo básico utilizado no termociclador
foi: 1) 94
o
C – 5min; 2) 94
o
C – 1min; 3) temperatura de pareamento (TA) específica do marcador
analisado (Tabela III.2) – 1min; 4) 72
o
C – 1min. O número de repetições do ciclo (passos 2, 3 e
4) foi igual ao descrito por Gonçalves et al. (2004) para A. belzebul (Tabela III.2). Após as
repetições, um último passo de elongação para finalização dos fragmentos foi executado a 72
o
C
– 5min. Foram utilizados diferentes termocicladores, todos apresentando o mesmo resultado
quanto ao sucesso de amplificação.
Material e Métodos
14
Tabela III.1. Descrição dos 20 locos microssatélites desenvolvidos para a espécie Alouatta belzebul e testados para Alouatta caraya no
presente trabalho. O nível de polimorfismo refere-se aos achados em A. belzebul. Os locos marcados com * foram
publicados por Gonçalves et. al. (2004) e os demais foram gentilmente cedidos pelo LPDNA-UFPA.
Loco
Seqüência do iniciador (5´→3´)
Unidade de Repetição TF TA (
o
C)
Nível de
Polimorfismo
Ab01
AGAAGTTTGAGGATGCAGAG
GAGGTTGTTTGGAAGACTGG
(A)
18
GAATCAG(AAG)
3
G(AGG)
5
TAAA(GA)
2
268 pb 56 monomórfico
Ab02
AAGACAGGAGGCAGAGG
GGGAGCTTGGGGATT
(AGG)
7
AAGAGGAGA(AGG)
3
(AAG)
4
(AGG)
4
(AAG)
3
200 pb 53 monomórfico
Ab03
ACTCCTCTCCGTGCCATCTT
GCACTCCAACCTGAACAACAG
(GAA)
2
ª(GAA)
2
G(GAA)
3
G(GAA)
4
244 pb 60 polimórfico
Ab04*
AGCGCCTCTCCTGGTTTTTAC
AAAAATTCCCAAACCCCACC
(GA)
2
AA(GA)
12
AG 156 pb 62 polimórfico
Ab05
CCTCTATCCCTTTCCCTGCAGC
TGCTGGCCCAACTTGTTAATCAA
(AC)
5
(AG)
3
(GA)
9
GGGAAG(GA)
8
AG(GA)
7
AG(GA)
4
164 pb 66 monomórfico
Ab06*
GTGATTATTGTGTGGTACTTG
ATGTATTTTTCTGGTTTTACC
(CT)
9
TTT(CT)
11
GTCTGTCTTAT(AC)
16
283 pb 50 polimórfico
Ab07*
ACCCCCATCTCTTAAAACACAC
CCTACTGCCTAAGTCTCCCAAC
(AC)
21
194 pb 60 polimórfico
Ab08
GAATGAGAAAAGGGTAGAAACTGC
AGAGAGCCTTGAAGATGAAAAGAA
(CT)
9
276 pb 60 monomórfico
Ab09*
AATGAAGACAACAAACGAC
TGAAGAACACACCTGAGG
(GAAA)
18
196 pb 53 polimórfico
Ab10*
TATTTTAAAAAGCCTTCCAGGTGA
GCAAGACTCCATCTTAAAAAAAGAAA
(GAAA)
22
257 pb 56 polimórfico
Ab11
GCGGGACTCTGTCTCAAAAAAA
ATTCAGAGAGGAGCTGGAGGG
(GAAA)
20
183 pb 60 polimórfico
Ab12*
AAATCAAGGCCCACAGGG
CAAAGGCAAGAAAGCAAGAAG
(GAAA)
14
231 pb 60 polimórfico
Material e Métodos
15
Loco
Seqüência do iniciador (5´→3´)
Unidade de Repetição TF TA (
o
C)
Nível de
Polimorfismo
Ab13*
CTTCTGGAGGAAAAAAAAA
CCCACCAGGAAGAATACT
(GAAA)
9
GAA(GAAA)
13
A(GAAA)
2
237 pb 52 polimórfico
Ab14
AAACCCCATCCCTATTAAAA
GCACTCCAGAATTTCACAG
(GA)
24
196 pb 55 polimórfico
Ab15
ACCCTGTCTCAACAACAACAA
ATCTCTTCATCTTTTTTGGCC
(GAAA)
3
(GA)
7
(GAAA)
18
AA(GAAA)
5
313 pb 58 polimórfico
Ab16*
AGGAGGTTGAGGCAAGAGAA
ACAAACCAGTACAGCCCAGA
(GAAA)
11
GAAGAAAGAAGGAAAGAA(GAAA)
2
218 pb 58 polimórfico
Ab17*
GGAAACAGTGGAAGACAAAAGGAG
AGATGGCCAAAGATAAAGACATGTAAAA
(GAAA)
2
G(GAAA)
2
GAGAAAAA(GAAA)
14
211 pb 63 polimórfico
Ab18
GAACATGATGCCTCCAG’
GAAGTTCCAGACCAACC
(CTTT)
14
CTT(CTTT)
5
354 pb 54 polimórfico
Ab19
GGTACAAAACAGAAGAAATGG
CTAAACATGAAAACAAACAAG
(AC)
17
105 pb 54 polimórfico
Ab20*
GTGTGGTGGTGGGTGCGC
TTGCTTTTCCCCTTTTGTGTTTGC
(GAAA)
16
266 pb 67 polimórfico
TF = tamanho dos fragmentos; TA = temperatura de pareamento dos iniciadores em A. belzebul.
Material e Métodos
16
Tabela III.2. Temperaturas de pareamento (TA) e número de repetições do ciclo de PCR
utilizadas Alouatta caraya e descritas para Alouatta belzebul (Gonçalves et al.,
2004). Em grifo negrito as TA propostas para A. caraya no presente trabalho, que
divergiram das descritas para A. belzebul.
A. caraya A. belzebul
Loco
TA número repetições do ciclo TA
Ab04
62,0ºC 25 repetições 62,0ºC
Ab06
50,0ºC 25 repetições 50,0ºC
Ab07 63,4ºC
25 repetições 60,0
o
C
Ab09 54,3ºC
25 repetições 53,0
o
C
Ab10
56,0ºC 25 repetições 56,0ºC
Ab12 63,7ºC
30 repetições 60,0
o
C
Ab17
63,0ºC 25 repetições 63,0
o
C
A avaliação dos fragmentos amplificados foi realizada em um seqüenciador semi-
automático AlfExpress ™ II da Amersham Biosciences®, em gel de poliacrilamida 8%, conforme
protocolo sugerido pelo fabricante. A análise dos resultados visando a genotipagem das amostras
foi realizada utilizando o software AlelleLocator versão 1.03, também da Amersham
Biosciences®.
III.4. Análise dos dados
III.4.1. Caracterização Demográfica e Morfológica
A caracterização demográfica da população foi realizada considerando-se as quatro
classes etárias constantes na classificação efetuada no trabalho de campo para machos e fêmeas:
Adulto, Subadulto, Jovem e Infante. Para avaliar se a proporção entre machos e fêmeas era
similar na amostra analisada foi utilizado o teste de qui-quadrado simples com nível de
significância de 5%.
Material e Métodos
17
Para avaliar se a distribuição de indivíduos era similar nas classes etárias observadas foi
utilizado o teste z. A estimativa de z foi realizada segundo a fórmula:
sendo
onde n
1
é o número amostral do conjunto 1 e p
1
a proporção de determinada classe no conjunto
1, n
2
é o número amostral do conjunto 2 e p
2
a proporção de determinada classe em no conjunto
2. Para todos os casos foi considerada como hipótese nula a igualdade entre as proporções e um
nível de significância de 5%. O programa Microsoft Office Excel 2003 foi utilizado na geração
de gráficos e para a realização do teste z.
Para avaliar a distribuição de peso em machos e fêmeas nas diversas classes etárias foi
utilizado o teste de Kruskall-Wallis e os pós-testes de Dunn. O teste de Kruskall-Wallis é um
teste não paramétrico para comparação entre três ou mais grupos não pareados. É semelhante a
ANOVA (Análise de Variância), onde é estimada a variância em um conjunto de amostras. A
resposta do teste reflete a comparação entre as medianas: se os rankings apresentam a mesma
mediana, qual é a chance, randomicamente, de amostrarem-se parâmetros que resultem em
medianas muito distintas? Se o valor de p for muito pequeno, a hipótese nula de que as
diferenças observadas entre as amostras são ao acaso é rejeitada. Este resultado somente é válido
se o N amostral for maior do que sete. O pós-teste de Dunn compara as diferenças nas somas dos
rankings entre duas colunas da amostra com a diferença esperada nas médias. A hipótese nula é
de que todos os dados foram amostrados de populações com distribuição similar, então as
diferenças observadas devem-se ao acaso e o p será maior que 5%. Esta análise se aplica
somente às comparações par a par e não ao conjunto amostral total.
Para a comparação do peso entre machos e fêmeas de uma mesma classe etária foi
utilizado o teste de Mann-Whitney. O teste de Mann-Whitney é um teste não paramétrico que
compara dois grupos. Basicamente, este teste responde à mesma pergunta do teste de Kruskall-
Wallis, só que a comparação é feita somente entre dois grupos da amostra. Se o valor de p é
menor que 5%, a hipótese de que a diferença entre as medianas ocorre ao acaso é rejeitada. Os
testes de Kruskall-Wallis, pós-teste de Dunn e Mann Whitney, assim como a geração de gráficos
p
2
– p
1
z =
√ p
chap
. (1 – p
chap
) . ( 1 + 1 )
n
1
n
2
(n
1
. p
1
) + (n
2
. p
2
)
p
chap
=
(n
1
+ n
2
)
Material e Métodos
18
que compilam as informações mais descritivas como a mediana e a distribuição dos caracteres
avaliados/indivíduos nas classes, foram realizados utilizando o programa GraphPad (Motulsky,
2003).
Na avaliação do comprimento total dos indivíduos, as classes etárias foram agrupadas em
duas: Adulto (associação das classes Adulto e Subadulto) e Jovem (associação das classes Jovem
e Infante). O comprimento total dos indivíduos foi comparado entre as classes utilizando o teste
de Mann-Whitney executado utilizando o programa GraphPad (Motulsky, 2003), tendo a
aproximação do p estimada em curva de Gauss bi-caudada.
III.4.2. Caracterização da variabilidade genética
A variabilidade genética foi caracterizada utilizando avaliações intraespecíficas e
interespecíficas. Os parâmetros intraespecíficos foram as freqüências alélicas, a porcentagem de
locos polimórficos, o número médio e efetivo de alelos observados por loco, o número de
heterozigotos por loco, a heterozigose observada e esperada por loco e a heterozigose média. A
aderência ao teorema do equilíbrio de Hardy-Weinberg, o desequilíbrio de ligação entre locos e o
coeficiente de endogamia foram também estimados. Com relação aos interespecíficos, os dados
foram comparados aos obtidos por Bastos et al. (comunicação pessoal) pela análise das
coordenadas principais (PCA – Principal Coordinate Analysis).
Estatísticas Intraespecíficas
Freqüências Alélicas e Heterozigose
As freqüências alélicas obtidas para cada loco para a população de A. caraya de Porto
Primavera (SP) foram estimadas por contagem direta, utilizando-se o programa GenAlEx6
“Genetic Analysis in Excel” (Peakall & Smouse, 2006). Representando-se o número de
indivíduos que apresentam genótipo A
i
A
j
por N
xy
, a freqüência do alelo x é dada por:
f
x
=
2 N
xx
+ N
xy
2N
Material e Métodos
19
onde N é o número de indivíduos genotipados para o loco, N
xx
é o número de indivíduos
homozigotos para o alelo x e N
xy
é o número de indivíduos heterozigotos portadores do alelo x.
O número médio de alelos por loco foi estimado utilizando o programa GDA “Genetic
Data Analysis” (Lewis & Zaykin, 2001), fazendo-se a somatória do número de alelos observados
em cada um dos locos analisados em uma dada população e dividindo o valor encontrado pelo
número total de locos. A porcentagem de locos polimórficos foi estimada manualmente e é dada
por:
P =
onde n
p
é o número de locos polimórficos e r é o número de locos analisados.
O desvio padrão (DP) do cálculo da porcentagem de locos polimórficos foi estimado por:
O número de heterozigotos observados por loco foi obtido por contagem direta e a média
de heterozigotos por loco foi estimada manualmente por média aritmética, considerando todos os
locos analisados.
O número de alelos efetivos (Ne) foi obtido por:
onde HOo é a homozigose observada para o loco. Esse parâmetro foi estimado utilizando o
programa GenAlEx (Peakall & Smouse, 2006) e é considerado uma medida interessante por
permitir comparações de diversidade alélica entre os locos com distribuição de freqüência alélica
diferente. Esta medida também é útil por estimar o número de alelos mais freqüentes em uma
população ideal com a homozigose equivalente à observada na população em estudo.
A heterozigose esperada (Hs) foi estimada seguindo o proposto por Nei (1978):
onde são computados a freqüência do alelos x no i-ésimo loco em r locos analisados. A Hs
corresponde a 1 menos a homozigose observada (HOo) para o alelo x da população.
n
p
r
1
Ne =
1 – HOo
DP = P(1 - P)
r
r
Hs = 1- x
2
i
. 2n
i=1 (2n-1)
Σ
Material e Métodos
20
A heterozigose média esperada (Hs média) foi estimada, segundo o algoritmo proposto
por Nei (1978):
onde Ho
i
é o valor da heterozigose observada para o i-ésimo loco estudado, em r locos estudados
e os valores da heterozigose observada variam entre zero e um. Para as estimativas de
heterozigose foi utilizado o programa GDA (Lewis & Zaykin, 2001).
Teste de aderência ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg
Para verificar a aderência ao teorema do equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) foi
realizado o teste exato de Guo e Thompson (1992) utilizando o programa Arlequin 3.0 (Excoffier
et al., 2005). Esse teste é análogo ao teste exato de Fisher, com a diferença de podermos utilizar
uma matriz de contingência de tamanho arbitrário e foi desenvolvido para amenizar um
problema comum: a ausência ou baixa freqüência de genótipos na análise de marcadores
multialélicos como os microssatélites. Como a fase gamética não é conhecida no conjunto de
dados, somente foram realizados testes loco a loco, assumindo-se independência entre os locos
utilizados. O teste exato foi feito pelo método da cadeia de Markov (“Markov chain”)
modificado, realizando-se um total de 100.000 permutações, com 1000 passos de
desmemorização (número de passos realizados antes de começar a comparar as tabelas
observada e alternativa da cadeia de Markov e sua respectiva probabilidade. De fato, esta tabela
gerada por randomização é independente da tabela observada no input), obtendo-se, desta
maneira, um erro padrão médio de 0,0037. Neste teste, a hipótese nula é de união aleatória dos
gametas.
Desequilíbrio de Ligação entre locos
Para estimar o desequilíbrio de ligação entre os locos estudados foi utilizado o programa
Arlequin 3.0 (Excoffier et al., 2005). A hipótese nula é de que a distribuição genotípica em um
loco é independente da distribuição em outro loco. Esta análise foi aplicada para verificar
desvios do esperado pela regra de multiplicação entre pares de locos localizados em diferentes
cromossomos. A palavra “ligação” neste caso pode ou não estar relacionada com associação
r
Hs = Ho
i
/ r
i = 1
Σ
Material e Métodos
21
física em um cromossomo, uma vez que a localização exata dos marcadores não foi descrita até o
momento. Como a fase gamética não era conhecida no conjunto de dados, a significância do
desequilíbrio de ligação foi testada pelo método de razão de verossimilhança (“likelihood
ratio”), onde a amostra analisada sob a hipótese de não associação entre locos (equilíbrio de
ligação) é comparada com a amostra realizada assumindo associação (Slatkin & Excoffier,
1996). A significância é obtida computando a distribuição nula desta razão sob a hipótese de
desequilíbrio. Importante ressaltar que o teste de desequilíbrio de ligação assume que o conjunto
de dados encontra-se em aderência ao EHW.
Coeficiente de endogamia
A endogamia, que indica se existe deficiência de heterozigotos em uma dada população,
foi estimada pelo programa GDA (Lewis & Zaykin, 2001), segundo o proposto por Cockerham
(1969, 1973), a partir da variância dos componentes. O GDA estima os índices F de forma
análoga ao proposto por Wright (1959): f = F
IS
e θ = F
ST
(Weir, 1996).
Nesta estimativa, f é calculado a partir do seguinte algoritmo:
onde:
e
σ
2
P
+
σ
2
I
σ
2
P
+ σ
2
I
+ σ
2
G
F =
F –
θ
f =
1 – θ
σ
2
P
.
σ
2
P
+ σ
2
I
+ σ
2
G
θ =
Material e Métodos
22
Estatísticas Interespecíficas
Os parâmetros de variabilidade genética estimados para A. caraya – freqüências alélicas
para cada loco analisado, porcentagem de locos polimórficos e heterozigose média – além da
especificidade de alelos, considerando a amostra utilizada no presente estudo, foram comparados
aos mesmos parâmetros estimados a partir dos dados originais de Bastos et al. (comunicação
pessoal) para populações de A. belzebul considerando os mesmos marcadores do tipo
microssatélite aqui analisados. As amostras de A. belzebul utilizadas por Bastos et al. foram
coletadas durante o enchimento do lago da hidrelétrica de Tucuruí, situada ao nordeste do estado
do Pará, Brasil (comunicação pessoal).
PCA
No intuito de avaliar o padrão de distribuição da variabilidade genética observada para os
marcadores microssatélites estudados nas duas espécies, foi realizada uma análise das
coordenadas principais (PCA – Principal Coordinate Analysis). Uma vez que existiu
compartilhamento de alelos para os marcadores analisados entre A. caraya e A. belzebul, foi
realizada uma análise baseada nas distâncias genéticas entre indivíduos visando observar se
existiria sobreposição ou proximidade entre as espécies. A análise das coordenadas principais
(PCA) é uma técnica que permite determinar e plotar padrões gerais em um conjunto amostral e
é, essencialmente, a localização da variação em um conjunto de dados em dois eixos principais.
As análises de comparação entre populações de A.caraya e A. belzebul foram feitas utilizando o
programa GenAlEx6 (Peakall & Smouse, 2006) utilizando uma matriz de distância genética
como input de dados.
RESULTADOS
© Guto Bertagnolli
Resultados
23
IV – RESULTADOS
IV.1. Caracterização Demográfica e Morfológica de Alouatta caraya de Porto Primavera
IV.1.1. Dados demográficos
A amostra analisada de Alouatta caraya de Porto Primavera (SP) foi composta por 506
indivíduos, sendo 268 fêmeas e 238 machos. A razão sexual foi 1,13, porém não foram
observadas diferenças estatisticamente significantes quanto ao número de indivíduos total entre
os gêneros nessa amostra (χ
2
= 1,7786, GL = 1, p = 0,1823).
A distribuição dos indivíduos em quatro classes etárias – Adulto, Subadulto, Jovem e
Infante – por gênero está apresentada na Figura IV.1. O conjunto que apresenta maior número de
indivíduos é Fêmea Adulto (N = 158) e o que apresenta menor, à exceção de Fêmea Subadulto
(N = 0), é Fêmea Infante (N = 31). O número de indivíduos machos e fêmeas em cada classe
etária (considerando os indivíduos adultos e subadultos como sendo uma classe), não mostrou
diferenças estatisticamente significativas em nenhuma das análises par a par (teste z Tabela
IV.1).
Figura IV.1. Distribuição por sexo e classes etárias dos 506 espécimes de Alouatta caraya
capturados durante o enchimento do lago artificial de Porto Primavera – SP
(Macho em azul e Fêmea em rosa).
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Fêmea Adulto
Macho Adulto
Fêmea Subadulto
Macho Subadulto
Fêmea Jovem
Macho Jovem
Fêmea Infante
Macho Infante
Resultados
24
Tabela IV.1. Distribuição de indivíduos da amostra de Alouatta caraya de Porto Primavera (SP)
por gênero e classe etária e resultado do teste z das comparações entre os gêneros.
Classes Etárias Fêmea Macho Teste z (p)
Adulto e Subadulto
158 140 0,03 (0,9761)
Jovem
79 60 1,07 (0,2846)
Infante
31 38 -1,44 (0,1499)
N
268 238 506
N = número de indivíduos. p em curva bi-caudada.
IV.1.2. Dados morfológicos
Na Tabela IV.2 encontram-se compilados os resultados quanto ao peso dos 506
espécimes amostrados, divididos por gênero e classe etária. Entre os machos, o menor peso
observado foi de 0,2 kg (classe Infante) e o maior foi de 8,9 kg (classe Adulto). Com relação às
fêmeas, o menor peso observado foi 0,1 kg (classe Infante) e o maior de 8,0 kg (classe Adulto).
A distribuição do peso entre as diversas classes etárias de Fêmea (Figura IV.2 – A)
apresentou diferença estatisticamente significativa segundo o teste de Kruskall-Wallis (p<0,001,
KW = 181,5), bem como a comparação entre as medianas (p<0,05). Apesar de haver
sobreposição nos conjuntos amostrais, o pós-teste de Dunn evidenciou diferenças
estatisticamente significativas (p<0,001) entre as classes Adulto versus Jovem, Adulto versus
Infante e Jovem versus Infante.
Com relação ao peso de Macho nas diversas classes etárias (Figura IV.2 – B), também
foram observadas diferenças estatisticamente significativas segundo o teste de Kruskall-Wallis
(p<0,0001; KW = 207,4), bem como a comparação entre as medianas (p<0,05). O pós-teste de
Dunn evidenciou diferenças estatisticamente significativas (p<0,001) entre Adulto versus
Subadulto, Adulto versus Jovem, Adulto versus Infante, Subadulto versus Jovem, Subadulto
versus Infante e Jovem versus Infante.
Quanto a comparação da distribuição de peso na classe etária Adulta entre os gêneros
(Figura IV.2 – C), foram observadas diferenças estatisticamente significativas segundo o teste de
Mann-Whitney (p<0,0001, U = 159). Esta diferença foi inexistente com relação à classe etária
Jovem (Figura IV.2 – D; p = 0,8433, U = 2294) e infante (p = 0,8531, U = 558; Figura IV.2 – E).
Resultados
25
Tabela IV.2. Peso corporal na amostra de Alouatta caraya de Porto Primavera (SP) por gênero
em classes etárias.
Adulto Subadulto Jovem Infante
Parâmetros Fêmea Macho Fêmea Macho Fêmea Macho Fêmea Macho
Peso Médio
4,16 6,94 – 4,77 2,34 2,37 1,04 0,89
DP
0,78 1,03 – 1,10 0,67 0,77 0,82 0,41
Variância
0,61 0,55 – 1,21 0,45 0,59 0,67 0,79
EP
0,06 0,11 – 0,14 0,08 0,05 0,15 0,07
Peso Mínimo
1,50 5,25 – 2,00 1,05 1,00 0,10 0,20
Peso Máximo
8,00 8,90 – 7,25 5,75 4,00 4,00 1,80
Mediana
4,00 7,00 – 4,75 2,25 2,25 1,00 1,00
IC superior
4,28 7,24 – 5,05 2,49 3,00 1,34 0,75
IC inferior
4,04 6,79 – 4,48 2,19 1,75 0,74 1,03
N
158 80 0 60 79 60 31 38
N = número de indivíduos amostrados; DP = Desvio Padrão; EP = Erro padrão; IC = Intervalo de
confiança.
Figura IV.2. Distribuição do peso em quilogramas para as classes etárias de Macho e de Fêmea
na amostra de A. caraya de Porto Primavera – SP. A: Comparação das classes de
Fêmea: Adulto, Jovem e Infante; B: Comparação das classes de Macho: Adulto,
Subadulto, Jovem e Infante; C: Comparação entre o peso de Fêmea Adulto versus
Macho Adulto; D: Comparação entre Fêmea Jovem versus Macho Jovem; E:
Comparação entre Fêmea Infante versus Macho Infante.
Fêmea Jovem Macho Jovem
0
1
2
3
4
5
6
Peso em kg
Fêmea Infante Macho Infante
0
1
2
3
4
5
Peso em kg
Adulto Subadulto Jovem Infante
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Peso em kg
B
D E
Adulta Jovem Infante
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Peso em kg
Fêmea Adulta Macho Adulto
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Peso em kg
C
A
Resultados
26
Os dados relativos ao comprimento total (CT) de Alouatta caraya de Porto Primavera (N
= 162), considerando como classes etárias Adulto (Adulto + Subadulto) e Jovem (Infante +
Jovem), encontram-se na Tabela IV.3 (dados originais completos na Tabela VIII.3 do Anexo).
Todas as comparações entre as medianas do CT, considerando gênero e classe etária, foram
estatisticamente significativas (p<0,05; Figura IV.3). Essa diferença foi noticiada tanto quando
se comparam as classes etárias do mesmo gênero quanto entre os gêneros na mesma classe etária.
Na comparação entre Fêmea Jovem e Adulto quanto ao CT, foi observada sobreposição
entre o comprimento mínimo em Adulto e o máximo em Jovem (Tabela IV.3 e Figura IV.4 – A).
A sobreposição também foi observada na comparação entre Macho Jovem e Adulto (Tabela IV.3
e Figura IV.4 – B) similarmente às fêmeas.
Quando o CT de Macho e de Fêmea Adulto foi comparado, 75% das fêmeas
apresentaram tamanho menor que o mínimo observado em Macho (Figura IV.5 – A). Já em
Jovem foi observada maior similaridade de tamanho corporal entre Macho e Fêmea, sendo que o
tamanho mínimo foi bastante semelhante entre os dois sexos (Figura IV.5 – B). Contudo, o
tamanho máximo de Jovem é bastante diferente entre Macho e Fêmea, sendo o da Fêmea inferior
ao do Macho (16 cm de diferença).
Tabela IV.3. Comprimento total (CT) em indivíduos de uma população de Alouatta caraya de
Porto Primavera, em centímetros, categorizados por sexo e classe etária.
Sexo Fêmea Macho
Parâmetros Adulto Jovem Adulto Jovem
CT Médio
108,00 82,70 119,10 83,71
DP
9,08 18,50 8,96 20,14
Variância
82,39 340,67 80,16 405,43
EP
1,25 3,12 1,45 3,36
CT Mínimo
76,00 42,00 90,00 39,00
CT Máximo
123,00 109,00 131,00 127,00
Mediana
109,00 84,50 121,50 87,25
IC superior
106,00 76,30 122,00 90,52
IC inferior
111,00 89,00 116,10 76,90
N
53 35 38 36
N = número de indivíduos amostrados; DP = Desvio Padrão; EP = Erro padrão; IC = Intervalo de
confiança.
Resultados
27
Figura IV.3. Comparação entre o comprimento total dos espécimes que compuseram a amostra
de Alouatta caraya oriunda de Porto Primavera (SP) utilizando o teste de Mann-
Whitney. Acima valores de p e abaixo valores de U.
Macho Adulto Macho Jovem Fêmea Adulto Fêmea Jovem
Macho Adulto
**** p<0,0001 p<0,0001 *
Macho Jovem
118 **** * p = 0,0440
Fêmea Adulto
140 * **** p<0,0001
Fêmea Jovem
* 635 138 ****
Figura IV.4. Comparação entre o comprimento total de Adulto e Jovem em Fêmea (A) e em
Macho (B) de A. caraya da população de Porto Primavera (SP).
Figura IV.5. Comparação entre o comprimento total de Fêmea e Macho Adulto (A) e entre
Fêmea e Macho Jovem (B) de Alouatta caraya da população de Porto Primavera
(SP).
A B
A B
Fêmea Adulto Macho Adulto
70
80
90
100
110
120
130
tamanho em cm
Macho Adulto Macho Jovem
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
tamanho em cm
Fêmea Adulto Fêmea Jovem
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
tamanho em cm
Fêmea Jovem Macho Jovem
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
tamanho em cm
Resultados
28
IV.2. Variabilidade genética de Alouatta caraya de Porto Primavera
IV.2.1. Teste dos marcadores microssatélites heterológos
Foram testados 10 pares de iniciadores para marcadores microssatélites nucleares
desenvolvidos originalmente para a espécie Alouatta belzebul por Gonçalves et al. (2004) e 10
outros desenvolvidos para a mesma espécie, porém ainda não publicados (Gonçalves et al.
comunicação pessoal). As condições de amplificação foram testadas e padronizadas. Dos 20
pares de iniciadores de amplificação testados, sete – Ab04, Ab06, Ab07, Ab09, Ab10, Ab12 e
Ab17 – resultaram em amplificações confiáveis para a população de A. caraya, isto é, geraram
produtos que forneceram picos de tamanhos de fragmentos de boa qualidade, dentro do tamanho
esperado (100 a 300 pb) e com reprodutibilidade. Os iniciadores Ab13 e Ab16 geraram material
de amplificação, porém foram considerados não confiáveis, pois apresentaram picos de
tamanhos variados – o que impossibilitou a identificação do fragmento do marcador – mesmo
após diversas mudanças nas temperaturas de pareamento e no protocolo de PCR. Os 10
iniciadores não publicados apresentaram resultados negativos para A. caraya. Os resultados de
amplificação de um iniciador considerado confiável (Ab10) e de um não confiável (Ab16) estão
apresentados nas Figuras IV.6 e IV.7.
Os volumes, concentrações dos reagentes e condições de amplificação foram
especialmente padronizados para utilização na análise da espécie A. caraya. As temperaturas de
pareamento (TA) utilizadas para amplificação do DNA das amostras de A. caraya estão descritas
na Tabela III.2 (ver Material e Métodos) bem como as utilizadas para A. belzebul. As
temperaturas padronizadas foram diferentes das descritas para A. belzebul para os locos Ab07,
Ab09 e Ab12, para os quais as TA foram superiores para A. caraya 1,2
o
C, em média. Para os
locos Ab04, Ab06, Ab10 e Ab17 as TA foram iguais as descritas para A. belzebul.
Resultados
29
Figura IV.6. Genotipagem do loco Ab10: os picos em vermelho são do fragmento amplificado
(microssatélite de interesse) em diferentes amostras. Os picos em verde são os
calibradores internos de tamanho (ladders). Observe como o pico do microssatélite
é separado, uniforme e com tamanho entre 100 e 300 pb.
Figura IV.7. Genotipagem do loco Ab16: os picos em vermelho são dos fragmentos
amplificados que podem ou não corresponder ao microssatélite de interesse. Os
picos em verde são os calibradores internos de tamanho (ladders). Observe
como diversos picos foram selecionados apresentando curva uniforme e com
tamanho entre 100 e 300 pb. Os marcadores que apresentaram este padrão de
bandeamento foram considerados não confiáveis.
Resultados
30
No intuito de caracterizar geneticamente a população de Alouatta caraya de Porto
Primavera (SP) foi analisada uma amostra de 105 espécimes. O protocolo utilizado para
extração de DNA resultou em material em boa quantidade e qualidade.
Devido a problemas com o marcador de peso molecular, cerca de 70% das amostras
foram genotipadas em duplicata. Após a primeira genotipagem, que ocorreu no momento de
padronização dos marcadores e na qual o marcador de peso molecular estava com erro de
tamanho, o seqüenciador automático apresentou problemas. A intenção inicial era genotipar duas
vezes o mesmo resultado de PCR, para confirmar o tamanho dos fragmentos. No entanto, houve
demora no conserto do aparelho, o que implicou em perda da fluorescência dos fragmentos e na
realização de nova PCR para a certeza de resultado. Não foram encontrados resultados
significativamente discrepantes entre as duas genotipagens (14 discrepâncias). Quando houve
diferenças, o resultado da segunda genotipagem foi escolhido por apresentar maior
confiabilidade.
IV.2.2. Análise Intraespecífica
A Tabela IV.4 descreve a caracterização dos locos para a população Alouatta caraya de
Porto Primavera (SP). O tamanho dos fragmentos variou entre 138pb e 305pb e foi observado
um total de 53 alelos na análise dos microssatélites com amplificação confiável. Dos sete locos,
cinco apresentaram polimorfismo, isto é, presença de pelo menos dois alelos com freqüências
alélicas superiores a 1%: Ab04, Ab06, Ab07, Ab12, Ab17 (71,4% dos locos analisados, DP =
0,2021). O número de alelos para o marcador Ab12 foi estimado em seis durante a padronização
(N = 15).
Dentre os sete marcadores que apresentaram amplificação confiável, seis foram
analisados para a população de Alouatta caraya de Porto Primavera: Ab04, Ab06, Ab07, Ab09,
Ab10 e Ab17. Os locos Ab10 e Ab09 apresentaram monomorfismo. Portanto, dentre os locos
analisados 66% foram polimórficos (DP = 0,47). Ab06 foi o que apresentou o maior número de
alelos (17) e Ab07, o menor (quatro), quando consideramos somente os locos polimórficos,
sendo que o número de alelos efetivos variou de 1,5 a 9,1. Observou-se uma média de 11,25
alelos por loco polimórfico e de 7,83 (DP = 6,85) alelos por loco considerando-se todos os locos.
As seqüências-motivo não foram averiguadas e a diferença entre os alelos foi considerada
como de dois pares de base (2pb). O marcador Ab04 apresentou a série alélica completa
Resultados
31
enquanto que Ab06, Ab07 e Ab17 não, sendo que em todos os casos a variação entre pelo menos
dois alelos próximos da série é de 2pb. Por exemplo, o marcador Ab07 apresentou os alelos
184pb, 186pb e 192pb, faltando os tamanhos intermediários de alelos como 188pb e 190pb.
Na Tabela IV.5 estão apresentados os genótipos e o número de homozigotos observados
para os locos polimórficos: Ab04, Ab06, Ab07, Ab12 e Ab17. As freqüências alélicas para os
locos analisados na população de A. caraya de Porto Primavera (SP) estão descritas na Tabela
IV.6. A distribuição das freqüências apresentou-se unimodal para o loco Ab07 (alelo modal:
180) e multimodal para os demais. Os alelos modais para o loco Ab04 foram o 159 e o 171, para
o Ab06, alelos 275, 279 e 301, para o Ab17, alelos 236 e 238 (Figura IV.8). Todos os locos
encontram-se em desacordo com as freqüências esperadas no teorema do equilíbrio de Hardy-
Weinberg (EHW) exceto Ab17 (Tabela IV.7).
A diversidade genética total ou heterozigose total observada para todos os locos
analisados foi de 0,52 (DP = 0,38) e a esperada, 0,48 (DP = 0,42). Foi observada deficiência de
heterozigotos e excesso de homozigotos para todos os locos analisados.
Tabela IV.4. Caracterização dos microssatélites heterólogos descritos por Gonçalves et al.
(2004) e testados em uma população de Alouatta caraya de Porto Primavera (SP).
Parâmetros
TF Na Nae N
Loco
Ab04
157–175 10
5,1
84
Ab06
275–305 17
9,1
65
Ab07
180–190 04
1,5
100
Ab09
138 01
1,0
103
Ab10
192 01
1,0
103
Ab12
253– 265 06
4,84
17
Ab17
220–246 14
6,3
100
Média
– 7,8
4,0
95
Desvio Padrão
– 6,9
3,4
–
TF = tamanho dos fragmentos, em pares de base; Na = Número de alelos observados para o loco; Nae =
número de alelos efetivos; N = número de indivíduos genotipados.
Resultados
32
Tabela IV.5. Distribuição genotípica observada dos marcadores do tipo microssatélite heterólogos para uma população de Alouatta caraya
de Porto Primavera (SP).
Ab04 Ab06 Ab07 Ab12 Ab17
Genótipos N HOo Genótipos N HOo Genótipos N HOo Genótipos N HOo Genótipos N HOo
157/157 3 3 261/303 1 180/180 72 72 253/253 1 1 218/238 1 1
157/159 4 263/287 1 180/182 4 253/261 2 218/240 1
157/161 2 263/293 2 180/188 9 253/265 1 220/234 1
157/163 1 263/301 1 180/190 5 257/257 1 1 222/222 1 1
157/167 1 273/273 2 2 182/182 4 4 257/261 1 222/226 1
157/169 2 273/301 2 182/188 2 259/259 2 2 222/226 1
157/171 7 273/303 1 182/190 3 261/263 2 222/228 1
157/175 1 275/275 2 2 188/188 1 1 263/263 2 2 222/230 2
159/159 8 8 275/277 1 265/265 4 4 222/234 1
159/163 2 275/279 1 222/236 3
159/169 2 275/285 4 222/238 3
159/171 10 275/287 1 222/240 1
159/173 1 275/289 6 226/226 1 1
161/161 1 1 275/291 2 226/230 2
161/169 1 275/293 2 226/234 1
161/171 3 275/299 2 226/236 2
161/173 3 275/301 4 226/238 2
163/167 1 275/303 3 228/234 1
163/171 4 277/277 1 1 230/230 2 2
163/173 1 277/289 1 230/234 3
165/165 1 1 277/291 1 230/236 4
165/169 1 277/303 1 230/238 8
165/173 1 279/279 1 1 230/240 2
167/167 1 1 279/287 1 230/242 1
169/169 1 1 279/293 3 232/234 4
169/171 1 279/295 1 232/236 2
Resultados
33
Ab04 Ab06 Ab07 Ab12 Ab17
Genótipos N HOo Genótipos N HOo Genótipos N HOo Genótipos N HOo Genótipos N HOo
171/171 15 15 279/301 3 234/234 3 3
171/173 3 279/303 1 234/236 3
173/173 2 2 279/305 1 234/238 5
281/285 1 234/240 2
285/303 1 236/236 10 10
289/301 2 236/238 7
291/291 1 1 236/240 4
293/293 1 1 236/244 2
293/299 1 238/238 8 8
293/301 1 238/240 1
293/303 1 238/242 1
295/295 1 238/246 2
301/301 2 2
Total 84 32 65 10 100 77 16 10 100 26
HOo = número de homozigotos observados.
Resultados
34
Tabela IV.6. Freqüências alélicas dos marcadores do tipo microssatélite heterólogos para uma população de Alouatta caraya de Porto
Primavera, SP.
Loco Ab04 Ab06 Ab07 Ab09 Ab10 Ab17
Alelo f Alelo f Alelo f Alelo f Alelo f Alelo f
157 0,143 261 0,008 180 0,810 138 1,000 192 1,000 218 0,010
159 0,208 263 0,031 182 0,085 220 0,005
161 0,065 273 0,054 188 0,065 222 0,070
163 0,054 275 0,231 190 0,040 226 0,050
165 0,024 277 0,046 228 0,010
167 0,030 279 0,100 230 0,130
169 0,054 281 0,008 232 0,040
171 0,339 285 0,046 234 0,135
173 0,077 287 0,023 236 0,235
175 0,006 289 0,069 238 0,230
291 0,038 240 0,055
293 0,092 242 0,010
295 0,023 244 0,010
299 0,023 246 0,010
301 0,131
303 0,069
305 0,008
f
T
1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000
N 100 84 65 100 100 100
f = freqüência do alelo na população; f
T
= somatório das freqüências; N = número de indivíduos analisados por loco.
Resultados
35
Figura IV.8. Distribuição das freqüências alélicas para os quatro marcadores microssatélites polimórficos analisados: Ab04, Ab06, Ab07 e
Ab17 para a população de Alouatta caraya de Porto Primavera (SP), evidenciando os alelos mais freqüentes (tamanhos em
pares de base).
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Ab04
Ab06
Ab07
Ab17
1
59
1
71
1
80
236
238
275
301
279
Resultados
36
Tabela IV.7. Teste da aderência ao EHW (teste exato de Guo & Tompson (1992)
utilizando a cadeia de Markov) dos locos analisados para a população de
Alouatta caraya de Porto Primavera.
Loco N
H. Observado H Esperado
p DP
AB04 84 0,631 0,809 0,001 0,000
AB06 65 0,831 0,899 0,012 0,000
AB07 100 0,230 0,341 0,000 0,000
AB09 100 – – – –
AB10 100 – – – –
AB17 100 0,740 0,848 0,223 0,001
N = número de indivíduos utilizados na análise. Observado e Esperado se referem à heterozigose;
DP = Desvio Padrão de p.
Desequilíbrio de Ligação entre locos
Foram observados dois desvios propondo a hipótese de que a distribuição alélica
em um loco é independente da distribuição em outro loco considerando um nível de
significância de 0,05 (Tabela IV.8). Em ambos os casos o loco Ab04 apresentou
desequilíbrio em relação a um outro: Ab04 versus Ab06 e Ab04 versus Ab17. Estes
desvios representam 13% dos testes realizados. Considerando que, efetivamente, somente
os locos polimórficos (quatro) foram avaliados, este desvio representou 33% das
comparações (seis testes).
Resultados
37
Tabela IV.8. Valores de p ± desvio padrão da análise de desequilíbrio de ligação entre os
marcadores microssatélites analisados para a população de Alouatta
caraya de Porto Primavera (SP). Valores em grifo negrito correspondem
às comparações entre locos que indicam desequilíbrio de ligação.
Loco Ab04 Ab06 Ab07 Ab09 Ab10
Ab06 0,0011±0,0003
–
Ab07
0,0982±0,0030 0,8679±0,0036 –
Ab09
* * * –
Ab10
* * * * –
Ab17 0,0043±0,0007
0,7028±0,0046 0,3153±0,0043 * *
* comparações com locos monomórficos
Coeficiente de endogamia
As estimativas de endogamia para a população de Alouatta caraya de Porto
Primavera, São Paulo, indicam a deficiência de heterozigotos na amostra analisada: f =
0,1583 – confirmando o evidenciado pela heterozigose total observada para os locos
analisados = 0,4811 – em relação ao esperado.
IV.2.3. Análise Interespecífica
Análise de Coordenadas Principais (PCA)
A análise das coordenadas principais (PCA) comparando a população de
Alouatta caraya de Porto Primavera (SP) com populações de Alouatta belzebul da
hidrelétrica de Tucuruí, PA (Gonçalves et. al. comunicação pessoal) mostrou que 74,1%
da variação encontrada entre as amostras pode ser descrita em dois eixos (Figura IV.9).
Cerca de 81% de toda a variação encontrada foi descrita nos três primeiros eixos (eixo 1
= 62,96%; eixo 2 = 11,11% e eixo 3 = 7,35%).
Resultados
38
Figura IV.9. Análise das coordenadas principais (PCA) comparando as populações de Alouatta caraya de
Porto Primavera (SP) com populações de Alouatta belzebul da hidrelétrica de Tucuruí (PA).
Coordenada 1
Coordenada 2
A
. belzebu
l
Margem Direita – PA
A
. belzebu
l
Margem Esquerda – PA
A
. belzebu
l
Base 4 – PA
A
. belzebu
l
Ilha de Cornélio – PA
A
. caraya Porto Primavera – SP
A
. belzebu
l
Ilha Germoplasma – PA
DISCUSSÃO
© Roberto Okamura
Discussão
39
V – DISCUSSÃO
V.1. Caracterização Demográfica e Morfológica de Alouatta caraya de Porto Primavera
A razão sexual de Alouatta caraya observada na amostra de Porto Primavera (1,13)
corrobora a poliginia, isto é, mais de uma fêmea por macho, descrita na literatura para os grupos
familiares em populações naturais dessa espécie (Treves, 2001; Chapman & Balcomb, 1998). A
ocorrência de poliginia tem sido reportada sempre associada à habilidade do macho em controlar
os acasalamentos das fêmeas, onde a contribuição masculina para os filhotes é primordialmente
genética, ou ao grande investimento energético de ambos os pais mesmo após o acasalamento, o
que propicia melhores condições de as fêmeas criarem a prole (Ricklefs, 1996). Em Alouatta
observa-se o cuidado parental de ambos os pais (Calegaro-Marques, 1992), sendo que os efeitos
da poliginia na variabilidade genética são desconhecidos (Winkler, et al., 2004; James et al.,
1997; Froelich & Thorington, 1982).
Os grupos familiares de A. caraya são formados por número variável de indivíduos (entre
cinco a nove indivíduos por bando), onde as fêmeas sempre estão em maior número e,
geralmente, ocorre apenas um macho alfa (líder) – o único sexualmente ativo. Os demais machos
não estão reprodutivamente ativos, pois têm seu acesso às fêmeas restringido por sua posição
hierárquica no bando (Treves, 2001; Calegaro-Marques, 1992; Neville et al., 1988). Estes jovens
são expulsos do bando e formam grupos temporários, que não são necessariamente poligínicos, e
que geralmente tendem a se dissolver com o completo amadurecimento dos indivíduos e possível
incorporação a outros grupos mais estáveis. São pouco freqüentes estudos comportamentais em
grupos de machos/fêmeas isolados no momento em que são expulsos do bando, assim como não
foi avaliada a ocorrência deste comportamento na natureza (Kowalewski & Zunino, 2004;
Chapman & Balcomb, 1998; Calegaro-Marques, 1992).
O desvio verificado na proporção de machos em relação às fêmeas observado no presente
estudo, com maior número de fêmeas amostradas especialmente na classe Adulto, corrobora o
descrito na literatura tanto em relação à poliginia como para a razão sexual observada em A.
caraya, uma vez que diversos estudos reportam variação entre 0,5 e 2,2 na razão sexual,
dependendo da população estudada (Chapman & Balcomb, 1998).
Discussão
40
A questão da razão sexual tem sido mais enfocada em análises de composição de grupos
estáveis de Alouatta, sendo traçadas diversas hipóteses para explicar a presença de um maior
número de fêmeas do que machos (Chapman & Balcomb, 1998). Uma dessas hipóteses é a
predação (Treves, 2001), uma vez que os machos seriam responsáveis pela proteção do bando.
Alouatta são essencialmente folívoros e a cobertura vegetal está relacionada a variações
no peso e na capacidade reprodutiva dos indivíduos (Kowalewski & Zunino, 2004), além da
densidade total de indivíduos em determinada área. A comparação do peso dos indivíduos por
sexo e classe etária na população de Alouatta caraya de Porto Primavera revelou o esperado:
intenso dimorfismo sexual entre as classes Adulto e Subadulto de Macho e de Fêmea (Smith &
Cheverud, 2002; Smith & Jungers, 1997), e menor dimorfismo quando comparamos Fêmea e
Macho Jovem e Infante.
A média de peso de Adulto, tanto para Fêmea como para Macho, na população de Porto
Primavera (Fêmea: 4,16 kg e Macho: 7,02 kg), foi próxima ao observado por Rumiz (1990) em
florestas inundadas do nordeste da Argentina (4,33 kg e 6,42 kg para a população do nordeste da
Argentina). Considerando a distribuição do peso nas classes etárias de Fêmea foi observada uma
marcante diferença, mesmo havendo sobreposição entre elas. Com relação ao peso médio,
esperava-se que as fêmeas de Porto Primavera (SP) apresentassem maior média, pois as fêmeas
em atividade reprodutiva não foram excluídas da análise, como no estudo conduzido por Rumiz
(1990). Usualmente as fêmeas em atividade reprodutiva (grávidas ou lactando) são excluídas de
estudos de peso corpóreo, pois o metabolismo reprodutivo induz a um aumento das demandas
energéticas do indivíduo, o que leva a um aumento de massa corporal (Smith & Junger, 1997;
Rumiz, 1990). Em algumas espécies, o aumento de massa corporal total chega a 20% durante a
gravidez e varia ao longo da situação reprodutiva (gestação, recém-parto, lactante, desmame).
Dentre os indivíduos que apresentavam ficha de morfometria mais completa (N = 53),
havia o registro de 20 fêmeas em atividade reprodutiva (ver Tabela VIII.4 do Anexo), o que
representa cerca de 12% da amostra total de fêmeas adultas (N = 158) avaliadas em relação ao
peso. Quando comparamos o peso médio observado neste estudo com o reportado por Rumiz
(1990), que considerava somente as fêmeas sem indícios de atividade reprodutiva, as fêmeas de
Porto Primavera (SP) apresentam menor peso corpóreo. Notadamente, a região de florestas
úmidas da Argentina mostra alta densidade populacional o que indiretamente significa que existe
recurso de alimento disponível em abundância para esta localidade, sendo que há relatos de que a
densidade chega a 425 indivíduos/km
2
em algumas áreas dessas florestas (Kowalewski &
Discussão
41
Zunino, 2004). Por outro lado, os hábitats florestais de Porto Primavera (SP) teoricamente não
seriam restritivos a um maior peso dos indivíduos, uma vez que estes hábitats são semelhantes a
outros descritos na literatura como as florestas inundáveis da Argentina, em um morfoclima um
pouco mais seco (Labruna et al., 2002; Zunino et al., 2001).
A variação na abundância de recursos alimentares – que seria reflexo do morfoclima mais
seco – não pode, portanto, justificar este resultado para Fêmea Adulta, o que é corroborado pelo
observado para Macho Adulto nesta população, uma vez que foi verificado maior peso médio
que o descrito por Rumiz (1990). Outro ponto a ser considerado é que existem diferenças
regionais entre as populações de primatas, além de variações na forma como as amostras são
coletadas, o que pode influenciar nos valores encontrados para machos e fêmeas de diferentes
populações (Smith & Jungers, 1997).
Existe uma dificuldade intrínseca de se classificar os indivíduos quanto a idade,
especialmente em grupos de primatas que atingem a maturidade sexual antes do término do
crescimento. Indivíduos adultos, conceitualmente, são indivíduos que terminaram o período de
crescimento corpóreo, independentemente de terem atingindo a maturidade sexual, que está
relacionada à capacidade reprodutiva do indivíduo (Smith & Jungers, 2001). Em fêmeas de A.
caraya, o principal fator que determina o início da atividade reprodutiva é o amadurecimento
sexual, que acontece junto com o amadurecimento social – independentemente do término do
crescimento. Em muitas espécies existem pressões seletivas que atuam favorecendo a maturidade
sexual precoce (cães e humanos, dentre outros). Dessa forma, a maturação sexual é induzida sem
que o indivíduo tenha atingido seu tamanho corpóreo máximo, isto é, a idade adulta (Smith &
Jungers, 2001).
No banco de dados morfológicos (ver Tabela VIII.4 do Anexo) estão listadas várias
fêmeas com filhotes, dado esse que foi utilizado para classificar tais fêmeas como adultas.
Porém, podemos considerar que parte destas fêmeas estão aptas a reprodução, mas não
totalmente adultas pois ainda devem estar em fase de crescimento. A ausência de amostragem de
fêmeas subadultas reflete uma provável tendência na classificação etária dos indivíduos quando
da captura/translocação, onde as subadultas foram classificadas como adultas. Estes indícios são
corroborados pela distribuição do comprimento total dos indivíduos quando comparamos as
fêmeas adultas e jovens: apesar de a maior parte das amostras não apresentar sobreposição, o
tamanho mínimo amostrado nas fêmeas consideradas adultas (76,0 cm) é muito próximo do
Discussão
42
descrito para fêmeas jovens tanto na mediana (84,5 cm) como na média (82,7 cm, DP = 18,5
cm), para os valores de comprimento total.
Quando comparados os grupos de machos adultos e jovens na amostra de A. caraya de
Porto Primavera (SP) existiu uma diferenciação significativa. Isto indica que a classificação
etária dos machos foi melhor estabelecida que a das fêmeas quando da coleta de informações
morfológicas. Provavelmente este fato está relacionado ao amadurecimento tardio de machos,
uma vez que, além da capacidade fisiológica para a reprodução, é necessário também capacidade
de embate com o macho líder em um sistema de acasalamento poligínico (Treves, 2001;
Calegaro-Marques, 1992; Neville et al., 1988). Machos são expulsos quando atingem a
maturidade e, geralmente, não desafiam o macho alfa para embate no momento da exclusão. Este
fato também está associado à força do indivíduo recém-adulto, que não apresenta força (massa
corpórea) suficiente para uma luta com um macho maior (Kowalewski & Zunino, 2004;
Chapman & Balcomb, 1998; Calegaro-Marques, 1992). Portanto, entre os machos fica clara a
classificação etária e entre as fêmeas esta classificação necessita ser melhor avaliada, uma vez
que o parâmetro relativo à capacidade reprodutiva mostrou-se não adequado na definição de
indivíduos subadultos.
Primatas Neotropicais de maneira geral apresentam grande variação no tamanho corporal
e intenso dimorfismo sexual. Ford (1994) sugere que possíveis causas/elementos correlatos que
contribuem para este dimorfismo sexual intenso podem estar relacionados com estratégias de
sobrevivência e exploração ambiental, à seleção sexual, à hábitos de vida ou simplesmente à
inércia filogenética. Já Weckerly (1998) propôs que existe forte correlação entre dimorfismo
sexual e poliginia observada em vários grupos de mamíferos. No gênero Alouatta, este
dimorfismo parece estar especialmente associado à inércia filogenética uma vez que é observado
em todas as espécies do gênero avaliadas na literatura (Gordon, 2006; Gregorin, 2006; Smith &
Jungers, 1997). Alouatta caraya segue um padrão de seleção sexual positiva entre adultos, onde
machos são maiores que as fêmeas. Tanto os resultados das análises sobre o peso dos indivíduos
nas classes etárias, como os de comprimento total dos indivíduos corroboram o descrito na
literatura para o intenso dimorfismo sexual entre machos e fêmeas adultos/subadultos e pequeno
ou ausente dimorfismo sexual entre os jovens e os infantes.
Discussão
43
V. 2. Variabilidade genética de Alouatta caraya de Porto Primavera
Amostragem
O resgate de fauna, como o procedimento realizado em Porto Primavera, é um tipo de
coleta de amostras bastante comum para diversos grupos animais. Em decorrência da dinâmica
da operação, a amostragem de espécimes de Alouatta caraya utilizada no presente estudo foi
realizada sem o registro do local exato de captura e dos grupos aos quais estes animais
pertenciam, o que implicou em perda de informação relacionada à estrutura populacional e à
estrutura familiar. Outro ponto é que a amostra analisada para morfometria e a utilizada para
avaliação da variabilidade genética não são essencialmente a mesma, o que impossibilita o
cruzamento de informações e inferências mais precisas sobre processos evolutivos que pudessem
ser detectados através da análise conjunta dos caracteres morfológicos e genéticos.
A coleta de amostras por grupo de mamíferos no hábitat natural, especialmente para o
grupo dos primatas Neotropicais, que se organizam em grupos familiares, tem comportamentos
hierárquicos (a maioria dos gêneros, incluindo Alouatta) e hábitos tanto diurnos como noturnos,
apresenta diversos empecilhos e dificuldades. Dentre estas, existe a possibilidade de dispersão da
estrutura familiar durante a coleta, o que aumenta o risco de predação e desestrutura da
hierarquia do grupo como um todo. Com a captura de todo o grupo há a possibilidade da perda
de territórios – influenciando a taxa de sobrevivência dos indivíduos –, entre outros aspectos de
natureza ecológica, quando da devolução dos indivíduos pós-coleta.
No enchimento de lagos artificiais, o resgate de fauna é a alternativa escolhida na
tentativa de minimizar os enormes danos que estão sendo causados ao ambiente, uma vez que a
maior parte dos indivíduos das áreas afetadas não resistiria ao alagamento. Neste contexto, há
uma oportunidade de coleta de amostras biológicas para estudos genéticos, especialmente para os
grupos de difícil acesso como os primatas. Este tipo de coleta torna-se interessante na medida em
que informações genéticas são escassas para a maioria das espécies silvestres sul-americanas.
No caso de A. caraya, dois tipos de amostragem têm sido utilizadas para a geração de
informações genéticas: amostras coletadas de animais em cativeiro ou obtidas por resgate de
fauna, sendo que a maioria pertence à segunda categoria (Nascimento et al., 2005; Szapkievich
et al.,2004; Bonvicino et al., 2001; Salim et al., 2001; Meireles et al., 1999
b
). A amostra
utilizada no presente estudo provavelmente não reflete apenas uma população, uma vez que o
Discussão
44
material biológico foi coletado ao longo dos 180 km de margem do Rio Paraná durante a
formação do lago artificial e, certamente, não é a mais precisa fonte de informações genéticas
associadas à dinâmica populacional e à estruturação em famílias desta espécie, dificultando
análises mais profundas de estrutura populacional, por exemplo.
Considerando estes fatos, pode-se argumentar por outra perspectiva que este é o maior
estudo realizado com uma população natural de A. caraya até o presente momento e que as
informações sobre a variabilidade genética desta espécie são escassas, o que justifica a utilização
destas amostras para a caracterização genética proposta no presente trabalho.
Variabilidade Genética
A importância da variabilidade genética está no representativo potencial de as populações
responderem à seleção natural e se adaptarem a alterações no ambiente (Frankhan et al., 2002).
Avaliar esta variabilidade permite inferir elementos da biologia da espécie e também eventos
evolutivos que marcaram a história das populações. Diversos parâmetros vêm sendo utilizados
para avaliar esta variabilidade. Em estudos com primatas, os principais índices de variabilidade
são a porcentagem de locos polimórficos e a heterozigose média observada. A porcentagem de
locos polimórficos demonstra indiretamente a riqueza de alelos – outra medida comum para
avaliarmos a variabilidade genética geralmente associada à verificação de alelos exclusivos.
No caso de Alouatta caraya, dos 20 pares de iniciadores de amplificação desenvolvidos
para Alouatta belzebul testados, sete resultaram em amplificações confiáveis, isto é, que geraram
produtos que forneciam picos de tamanhos de fragmentos de boa qualidade, dentro do tamanho
esperado (100 a 300 pb). Os tamanhos dos fragmentos amplificados obtidos para A. caraya
foram diferentes dos descritos para A. belzebul por Gonçalves et al. (2004). Na Tabela VIII.5 do
Anexo está apresentada uma comparação entre os tamanhos dos fragmentos dos locos
microssatélites assim como os aqui analisados.
A população de Porto Primavera apresentou menos alelos quanto aos locos
microssatélites analisados (seis) do que os descritos originalmente para A. belzebul: 47 alelos, o
que corresponde a 66% dos alelos já identificados para A. belzebul. Porém, foram observados
alelos exclusivos para a população de A. caraya de Porto Primavera (SP) que não haviam sido
descritos previamente para as populações de A. belzebul de Tucuruí (PA) por Gonçalves et al.
(2004). Os alelos e respectivas freqüências encontrados para os marcadores analisados, tanto
Discussão
45
para A. belzebul como para A. caraya, estão descritos na Tabela VIII.6 do Anexo. Foi observada
ainda uma média de alelos menor em A. caraya (7,83) do que em A. belzebul (11,83). Por outro
lado, quando apenas os locos polimórficos são considerados, a diversidade de alelos é
semelhante para as duas espécies: 11,25 em A. caraya e 11,83 em A. belzebul.
Os níveis de variabilidade encontrados para A. caraya em termos de número de alelos,
apesar de menores que os observados para A. belzebul, estão acima do observado para outros
primatas Neotropicais como A. palliata, A. pigra, A. seniculus, Ateles geofroyii, Cebus apella,
Callimico goeldi (Winkler et al., 2004; Ellsworth & Hoelzer, 1998). Porém, como somente uma
população de A. caraya foi analisada, não é possível afirmar que os alelos descritos no presente
trabalho são os únicos existentes para a espécie, se são exclusivos para esta população ou
compartilhados pela espécie como um todo.
A. caraya e A. belzebul apresentaram alelos compartilhados quanto aos locos Ab04, Ab06
e Ab07. Dos 14 alelos observados para o loco Ab04 considerando as duas espécies, quatro foram
exclusivos para a população de A. caraya de Porto Primavera e seis compartilhados com A.
belzebul. Foram observados 21 alelos para o marcador Ab06 no total, sendo que oito alelos
foram exclusivos e nove compartilhados. Dos 13 alelos descritos para Ab07 não foram
observados alelos exclusivos em A. caraya: todos os quatro alelos encontrados para A. caraya
estão presentes também em A. belzebul. Os locos Ab09 e Ab10 apresentaram-se monomórficos
em A. caraya, sendo que os alelos encontrados são exclusivos das espécies, não compartilhando
os 16 e 23 alelos, respectivamente, descritos para A. belzebul por Gonçalves et al. (2004).
Para o marcador Ab17, nenhum dos 14 alelos descritos para A. caraya foi compartilhado
pelas duas espécies foram observados. No entanto, é digno de nota que a diferença entre os alelos
descritos para A. caraya e A. belzebul é de apenas uma base. Caso essa variação não ocorresse A.
caraya apresentaria somente um alelo exclusivo em relação à A. belzebul. Em todos os sistemas,
exceto Ab04 que apresentou variabilidade similar em termos do número de alelos, foi observado
redução no número total de alelos na população de A. caraya em relação a A. belzebul.
Essa diferença na diversidade de alelos (riqueza alélica) é acentuada pela observação de
monomorfismo para os locos Ab09 e Ab10 em A. caraya, os quais apresentaram com 16 e 22
alelos, respectivamente, em A. belzebul. É possível que o loco Ab12, sem dados populacionais,
apresente um maior número de alelos do que o estimado até o momento. Ab12 é o loco mais
polimórfico para A. belzebul dentre os marcadores testados, o que lança a expectativa de que
também apresente muitos alelos em A. caraya.
Discussão
46
O fenômeno de diminuição do número de alelos parece estar intensamente relacionado
com o tipo de marcador analisado, uma vez que em estudos com enzimas eritrocitárias
Szapkievich et al. (1998) reportaram variabilidade de alelos semelhante para A. caraya em
relação ao descrito para outras espécies. Segundo este autor, à exceção de A. palliata, que
apresenta índices de heterozigose baixos, todas as espécies de Alouatta apresentam valores de
diversidade genética semelhantes ao observado para outros gêneros de primatas Neotropicais
como Aotus (Schneider, 1988), Callithrix (Meireles et al., 1992), Saimiri (Silva et al., 1993) e
Chiropotes (Schneider et al., 1995). Por outro lado, a biologia de A. caraya permite argumentar
que estes macacos não sofreriam reduções em seus tamanhos populacionais, uma das principais
causas da perda de variabilidade genética, devido à alta taxa de fecundidade e à flexibilidade na
dieta.
A diminuição do número de alelos observados ocorre provavelmente pela transposição
dos marcadores de uma espécie para outra, isso porque os genomas podem ter evoluído de
maneira diversa após a separação das espécies. Primmer et al. (1996) relatou que marcadores do
tipo microssatélite isolados em várias espécies apresentam polimorfismo em grupos
filogeneticamente relacionados, porém a riqueza alélica não necessariamente é igual. De fato, o
menor número de alelos em A. caraya pode estar relacionado à especificidade no
desenvolvimento dos marcadores do tipo microssatélite e pode refletir uma subestimativa da
variabilidade real da espécie. Essa subestimativa seria um reflexo da metodologia de
desenvolvimentos dos marcadores, que são espécie-específicos, selecionando fragmentos
polimórficos para indivíduos da espécie estudada e que posteriormente são testados em
populações.
No caso da utilização de marcadores heterológos, existe uma tendência de que os
marcadores sejam também polimórficos nas populações de outras espécies, sempre dependendo
da proximidade filogenética entre elas: quanto mais próximas, maior o compartilhamento da
evolução dos genomas e maior a probabilidade de que fragmentos variáveis semelhantes estejam
presentes (Primmer et al., 1996). Um fator que influencia na amplificação é a temperatura de
pareamento (TA) dos iniciadores: quanto mais baixa a TA, maior a chance de amplificação,
porém maior a chance de amplificação inespecífica. As TA para amplificação de três dos
marcadores – Ab07, Ab09 e Ab12 – para A. caraya foram superiores as descritas para A.
belzebul, por Gonçalves et al. (2004). O fato de a TA ser superior para amplificações em A.
Discussão
47
caraya (aproximadamente 1,2
o
C em média), contribui para inferência da especificidade de
amplificação dos fragmentos.
Ellsworth & Hoelzer (1998) testaram marcadores do tipo microssatélite desenvolvidos
para A. palliata em outras espécies do gênero Alouatta, como A. pigra e A. seniculus, e
verificaram uma diminuição no número de alelos, a exemplo do observado para A. caraya em
relação aos marcadores desenvolvidos para A. belzebul. Mesmo quando consideram-se
marcadores homólogos este fenômeno de diminuição do número de alelos pode ser verificado.
Winkler et al. (2004) descreveram um menor número de alelos em outras populações de A.
palliata quando os marcadores desenvolvidos por Ellsworth & Hoelzer (1998) para esta espécie
foram utilizados. Fato é que A. palliata apresenta diferenças em termos de estruturação
populacional, uma vez que foram descritos eventos de intensa redução populacional (bottleneck)
para esta espécie no último século, como, por exemplo, epidemias de febre amarela na Ilha de
Barro Colorado que dizimaram as populações naturais ali existentes, o que pode ter contribuido
para maiores diferenças entre as populações analisadas para os mesmos marcadores (Crokett,
1998).
Em análises de populações humanas também há uma série de exemplos de diminuição de
alelos na literatura. Por exemplo, Mendes-Júnior (2001) reportou uma baixa variabilidade em
populações indígenas da Amazônia brasileira quanto a marcadores do tipo microssatélites
desenvolvidos para europeus. Apesar de serem populações isoladas e formadas por migrações
recentes (aproximadamente 100.000 anos atrás), a variabilidade encontrada foi menor que o
esperado – foram identificados 31 alelos dos 80 já descritos para os seis microssatélites
analisados. Esta tendência à diminuição de diversidade é confirmada por achados em outras
populações muito diferentes das européias, como asiáticos e outras populações sul-americanas
(Zago et al., 1996; da Silva, et al., 1999).
As freqüências alélicas observadas na população de A. caraya de Porto Primavera
encontram-se em desacordo com o esperado pelo teorema de Equilíbrio de Hardy-Weinberg
(EHW) para todos os locos analisados, exceto Ab17, segundo o teste exato de Guo & Thompson
(1992). O desvio ao EHW ocorre devido a causas diversas como fragmentação populacional,
migração, seleção e endocruzamento ou até mesmo erros de genotipagem (Yonan et al., 2006;
Wigginton et al., 2005; Leal, 2005; Frankhan et al., 2002). Dentre as causas citadas, os erros de
genotipagem provavelmente podem ser descartados, uma vez que alta proporção das amostras foi
Discussão
48
analisada em duplicata. Essa prática diminui a probabilidade de ocorrência de falsos
homozigotos, alelos nulos e erros que ocorrem por excesso de reagentes na PCR.
Uma possível explicação para o desequilíbrio observado no caso da população de A.
caraya de Porto Primavera está na deficiência de heterozigotos verificada para todos os locos
analisados, incluindo o Ab17. Vários autores reportam deficiência de heterozigotos em
populações naturais, sendo que esta deficiência pode estar relacionada com processos ecológicos
que ocorrem para o gênero Alouatta de forma geral, como a organização dos grupos (James et
al., 1997; Winkler et al., 2004). Essencialmente, os grupos de A. caraya implicam que haja
cruzamento de um macho com várias fêmeas. Grupos melhor estabelecidos restringem a entrada
de novos indivíduos, tendendo ao cruzamento entre aparentados (endocruzamento), o que é uma
das principais causas de desvios no EHW, juntamente com pressões evolutivas diversas.
Resultados semelhantes foram encontrados por Bastos et al. (com. pessoal), que analisou 14
locos microssatélites para populações de A. belzebul. Os autores encontraram desvios no EHW
para todas as populações estudadas relacionados à elevada endogamia. Esses resultados apontam
para uma inércia filogenética do grupo Alouatta ou a intensa ocorrência de endocruzamento
associado à poliginia.
Em Alouatta, as fêmeas usualmente permanecem em seus grupos natais e ocasionalmente
dispersam para o estabelecimento de outros grupos ou inclusão à grupos já existentes, sempre em
posições hierárquicas inferiores (Pope, 1992). Dentro deste sistema de estrutura social, espera-se
que seja observado um excesso de heterozigotos e grande diferenciação entre os grupos (Pope,
1992; Chesser, 1991). É interessante lançar hipóteses do por quê A. pigra (James et al., 1997) e
A. caraya (presente estudo) desviam destas expectativas, uma vez que estas espécies tem
biologia um pouco diferenciada em relação aos hábitos reprodutivos de outras espécies de
Alouatta como A. seniculus, especialmente no sentido das fêmeas migrarem para outros grupos
após a maturação sexual. As análises realizadas por James et al. (1997) indicam baixa
variabilidade genética nas populações de A. pigra, quando comparada a outros primatas
Neotropicais. Tais resultados foram associados à ocorrência de eventos de redução populacional
drásticos e recentes, como furacões e contínua deriva genética. Esses eventos poderiam não
afetar diretamente a distribuição de heterozigotos dentro dos grupos estudados, porém levariam
indiretamente ao resultado observado pela diminuição na variabilidade genética como um todo, o
que dificulta as estimativas de endogamia (Nei, 1978).
Discussão
49
O endocruzamento é um desvio relacionado à premissa do teorema do EHW no que tange
ao cruzamento ao acaso dentro das populações, sendo caracterizado pelo acasalamento em
grupos fechados. No caso de A. caraya, não são conhecidos os efeitos do endocruzamento na
freqüência dos alelos (que podem ser as mesmas ou diferentes entre os grupos). Como o presente
estudo não considerou a distribuição dos animais em grupos e sim como uma única população, é
provável que esteja ocorrendo o efeito Wahlund. Isto se reflete na distribuição de homozigotos
como um acréscimo em sua ocorrência e uma deficiência de heterozigotos. A conseqüência
destes sub-agrupamentos populacionais é a diminuição da heterozigose na população total
(Frankham et al., 2002).
Visto que o tamanho populacional total de A. caraya é estimado em 100.000 indivíduos
(Crockett, 1998), o endocruzamento não parece ser grande problema em curto prazo, exceto para
populações isoladas. Nestas o número efetivo é reduzido o que pode torná-las mais suscetíveis
aos efeitos deletérios da homozigose de alelos raros (que tem sua chance aumentada no
endocruzamento) e da deriva genética (Frankham, 2003). A ocorrência de subestruturação
(endogamia) poderá se tornar uma preocupação relevante no futuro no caso da populacção de
Porto Primavera, visto que os animais foram re-introduzidos em áreas próximas e os efeitos
sobre a população em termos de variabilidade genética somente serão conhecidos nas gerações
futuras.
Outro dado que corrobora a hipótese de endocruzamento é o desequilíbrio de ligação
observado em 33% das comparações realizadas entre os seis locos analisados para a população
de A. caraya de Porto Primavera (SP). Segundo Frankham et al. (2002), o desequilíbrio de
ligação ocorre mais freqüentemente em populações com pequeno número de indivíduos e
populações que sofreram reduções populacionais intensas (bottlenecks) – situações essas que
levam ao endocruzamento ou são efeito de mistura entre subpopulações diferenciadas.
Os casos descritos acima como situações que induzem ao desequilíbrio de ligação
possivelmente não explicam o encontrado para a população de A. caraya de Porto Primavera
(SP). As populações desta espécie têm grandes contingentes, sendo que a população de Porto
Primavera (SP) apresenta índices normais ou altos de diversidade genética, como a riqueza
alélica observada, a proporção de locos polimórficos e a heterozigose observada quando
comparada com outras populações de primatas Neotropicais (Ruiz-Garcia, 2005; Bastos et al.,
comunicação pessoal; Szapkievich et al., 1998; James et al., 1997; Pope, 1992). Além disso, não
é possível no momento descartar que o desequilíbrio observado seja decorrente de ligação física
Discussão
50
entre os locos, visto que a localização genômica desses marcadores ainda não é completamente
conhecida e que uma das premissas deste teste é o EHW na população analisada. Dos locos que
apresentaram desequilíbrio, somente um respeita a premissa. Destarte, os resultados acerca do
desequilíbrio de ligação não são conclusivos.
O principal índice que reflete o endocruzamento, a estimativa de F
IS
(coeficiente de
endogamia da população), foi de 0,1583 para a população de A. caraya de Porto Primavera (SP).
Esse valor é semelhante ao observado para a maioria das populações de A. belzebul analisadas
até o momento (Bastos et al., comunicação pessoal). Desvios positivos no F
IS
indicam aumento
no número de homozigotos, deficiência no número de heterozigotos, subdivisão da população,
casamentos preferenciais ou seleção natural (direcionada, disruptiva ou direcionadora). F
IS
menor que ou igual a zero é indicativo de exogamia, casamentos ao acaso na população ou
seleção natural estabilizadora. Os valores aqui observados são considerados níveis intermediários
de endocruzamento, não chegando ao ponto de afetar as populações em termos de baixa na
capacidade reprodutiva ou redução no fitness adaptativo da espécie. A baixa capacidade
reprodutiva devido ao endocruzamento está associada com a diminuição da variabilidade
genética, o que não foi observado na população de A. caraya de Porto Primavera (SP),
diminuição do tamanho médio dos indivíduos, igualmente não observado, e aumento da presença
de alelos deletérios (Frankhan, 2003).
Com relação à diversidade interpopulacional, ocorreu o esperado para a comparação entre
duas espécies. A população de A. caraya diferiu significativamente de todas as populações de A.
belzebul testadas, em todas as matrizes de distância analisadas, e os valores de distância genética
encontrados são compatíveis com o esperado para populações que divergiram há longo tempo,
como o predito na literatura para estas espécies. De acordo com Nascimento et al. (2005), a
divergência entre as espécies ocorreu há cerca de 5,3 milhões de anos atrás enquanto que Cortés-
Ortiz et al. (2003) concluíram que o evento ocorreu há cerca de 4,0 milhões de anos atrás. Esta
divergência também foi explicitada pela PCA, uma vez que, mesmo havendo compartilhamento
de alelos entre as espécies, as amostras de A. caraya ficaram situadas em um quadrante distinto
das de A. belzebul – dado esse que reflete a variabilidade observada considerando que as duas
espécies apresentaram constituições genéticas distintas.
CONCLUSÃO
© Julio Cesar Bicca-Marques
Conclusão
51
VI – CONCLUSÃO
Este foi o primeiro estudo de genética de populações realizado em uma população de
número amostral elevado para primatas Neotropicais, a partir de uma amostra coletada durante a
formação de um lago artificial de uma usina hidrelétrica. Dos dados levantados podemos
concluir que:
1. A população de A. caraya de Porto Primavera (SP) apresenta razão sexual de
1,13 fêmeas por macho (poliginia), semelhante ao descrito na literatura para
outras populações de Alouatta.
2. Tanto os resultados das análises sobre o peso dos indivíduos nas classes
etárias, como os de comprimento total dos indivíduos, corroboram o descrito
na literatura para o intenso dimorfismo sexual entre machos e fêmeas
adultos/subadultos e pequeno ou ausente dimorfismo sexual entre os jovens e
os infantes.
3. A classificação etária dos indivíduos de Porto Primavera entre os machos foi
bastante clara e entre as fêmeas esta classificação necessita ser melhor
avaliada, uma vez que o parâmetro relativo à capacidade reprodutiva mostrou-
se não adequado para definição de indivíduos subadultos.
4. A população de A. caraya de Porto Primavera (SP) apresenta diversidade
genética semelhante à encontrada em outros primatas Neotropicais;
5. Os desvios no EHW observados ainda não afetam diretamente o fitness ou o
sucesso reprodutivo da população, uma vez que o peso e o tamanho dos
indivíduos observados na análise morfológica são considerados normais para
esta espécie;
6. As comparações com populações de uma espécie próxima analisada para os
mesmos marcadores, A. belzebul, mostraram que a população de A. caraya de
Porto Primavera (SP) apresentou índices de variabilidade alélica menores do
que os observados para aquela espécie.
7. No caso da população de Porto Primavera (SP), os valores de diversidade
genética encontrados reportam a uma relativa estabilidade populacional. No
entanto, são necessários maiores estudos para confirmar se os dados de riqueza
Conclusão
52
de alelos, heterozigose observada, tamanho dos fragmentos observados para
esta população podem ser extrapolados para toda a espécie.
Os resultados aqui apresentados, em associação com futuros trabalhos com maiores
amostras, número de populações e número de marcadores, podem servir de referência em
avaliações quanto ao impacto causado pela translocação de indivíduos em termos de estrutura
populacional e variabilidade genética. Complementarmente, podem ainda contribuir para a
descrição dos efeitos da inércia filogenética no gênero Alouatta e para um melhor entendimento
do efeito da poliginia sobre a distribuição dos caracteres hereditários.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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http://www.mapas.ibge.gov.br/ acesso em 30 de julho de 2006
http://www.profauna.com.br, [email protected]
ANEXO
© Honolulu Zoo
Anexo
VIII – Anexo
VIII.1. Isolamento de DNA nuclear
O DNA foi extraído utilizando o protocolo a seguir, gentilmente cedido por Silvanira Barbosa
responsável técnica do LPDNA – UFPA.
PROTOCOLO DAS SOLUÇÕES PARA ISOLAMENTO DE DNA
Tampão de homogeneização –100mL
1mL de Tris 1M pH 8.0
6mL de NaCl 1M
2mL EDTA 0,5M pH 8.0
5g de sacarose
1. Agitar bastante em 80mL de água mili-Q até a sacarose dissolver.
2. Ajustar o volume para 100mL.
3. Autoclavar por 20 minutos.
Tampão de Lise – 500mL
150mL de Tris 1M pH 9.0
10mL de EDTA 0,5M – pode ser o pH 8.0
125mL de Sucrose 20%
62,5mL de SDS 10% pH 7.2
1. Agitar os três primeiros reagentes com de água mili-Q até um volume de 437,5mL.
2. Autoclavar por 20 minutos.
3. Preparar a solução de SDS a partir do pó.
4. Depois de frio, acrescentar o SDS.
Anexo
TE
1mL de Tris 1M pH 8.0
1mL de EDTA 0,1M pH 8.0
1. Ajustar o volume para 100mL com água mili-Q
2. Autoclavar por 20 minutos.
STE
100mL de NaCl 1M
10mL de Tris 1M pH 8.0
10mL de EDTA 10mM
1. Ajustar volume para 1L de água mili-Q.
2. Autoclavar por 20 minutos.
Tamponamento de Fenol
1. Colocar o fenol (1L) para aquecer a 68 graus em banho-maria na própria garrafa até ficar
totalmente líquido.
2. Transferir para um erlenmeyer grande com capacidade para 2L e adicionar igual volume de
Tris 1M pH8.0 (1L) e 1g/L de 8-hidroxyquinolina.
3. Deixar agitando em agitador magnético por aproximadamente 12 horas para que fique
homogêneo.
4. No outro dia tirar da agitação e deixar em repouso até as duas fases se separarem.
5. Aspirar com pipeta a fase superior e desprezar.
6. Adicionar novamente mais 1 L de Tris e fazer o mesmo procedimento acima por mais duas
vezes.
7. Na segunda vez, adicionar 1/10 de Tris 0,1M pH8.0 e 0,2% de beta-mercaptoetanol.
8. Guardar em geladeira em garrafa escura.
Anexo
Isolamento de DNA nuclear através do protocolo rápido em eppendorf de 1,5mL
Material necessário:
1. Amostra:
sangue total, camada de leucócitos ou tecido
2. Reagentes:
1. Tampão de homogeneização
2. Tampão de lise, RNAse 10mg/mL
3. Proteinase K 10mg/mL
4. Fenol – Clorofórmio – Álcool Isoamil na proporção de 25:24:1 (volume)
5. Clorofórmio – Álcool isoamil na proporção 24:1 (volume)
6. Acetato de sódio 3M pH 4,8
7. Álcool isopropílico
8. Etanol 70%
9. Tampão TE.
1. Distribuir em eppendorf de 1,5mL 300µL de sangue total ou 100µL de amostras de leucócitos
ou um pequeno pedaço de tecido
2. Adicionar 300µL de tampão de homogeneização e igual quantidade de tampão de lise.
3. Acrescentar 15µL de Proteinase K (10mg/mL) para sangue ou 30µl para tecido
4. Adicionar 15µl de RNAse (10mg/mL) na mesma proporção
5. Agitar gentilmente por 10 minutos e submetido a incubação de 56
º
C por no mínimo 30
minutos ou deixar de um dia para o outro.
6. Retirar as amostras do bloco e deixar esfriar a temperatura ambiente.
A partir desta etapa a extração segue-se na capela.
7. Adicionar 600µl de Fenol clorofórmio álcoool isoamil.
8. Agitar manualmente por 10 minutos, de modo que o material fique homogêneo
9. Centrifugar por de 10 minutos a 13.000 RPM.
10. Transferir o sobrenadante, cuidadosamente, para um tubo limpo, de modo que a camada de
proteína não seja removida.
Anexo
11. Repetir a extração com um volume de Clorofórmio álcool isoamil, agitar manualmente por
10 minutos.
12. Centrifugar por de 10 minutos a 13.000 RPM.
13. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo.
14. Adicionar 100µL de acetato de sódio 3M pH 4.8 e 500 µL de álcool isopropílico.
15. Agitar gentilmente até a visualização do DNA.
16. Centrifugar por de 2 minutos a 13.000 RPM.
17. Descartar o sobrenadante cuidadosamente para não perder o pellet
18. Adicionar 500 µl de etanol a 70% e centrifugar por de 5 minutos a 13.000 RPM.
19. Descartar o sobrenadante e secar o pellet em estufa a 37
O
C por 15 minutos
20. Diluir o pellet em 100 a 300µl de TE
Em alguns casos não ocorre a visualização do DNA. Nesses casos, deve-se levar as
amostras ao freezer -70
O
C por aproximadamente 15 minutos e posteriormente centrifugar por 10
minutos a 13.000 RPM e seguir o protocolo normal a partir do passo 17. A estas amostras
adicionar 50 µl de TE.
Anexo
Tabela VIII.1. Marcadores genéticos (moleculares e protéicos) descritos para alguns primatas neotropicais. N = tamanho amostral.
Gênero Espécies N Tipo Nome do marcador Descrito por
Alouatta Alouatta caraya 100 DNA nuclear microssatélite heterólogo Ab04, Ab 06, Ab07, Ab09,
Ab10, Ab12 e Ab17
Presente trabalho
10 DNA nuclear microssatélite heterólogo Ap68 e Ap74 Inglez et al. (não publicados)
1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 DNA nuclear seqüência
γ − globina
Meireles et al., 1999ª
6 mtDNA seqüência Citocromo b Bonvicino et al., 2001
28 mtDNA seqüência Citocromo b Nascimento et al., 2005
3 mtDNA seqüência Citocromo b Cortés-Ortis et al., 2003
3 mtDNA seqüência ATP sintase 6 e 8 Cortés-Ortis et al., 2003
3 DNA nuclear seqüência Calmodulina Cortés-Ortis et al., 2003
3 DNA nuclear seqüência Recombination activating
gene 1 RAG – 1
Cortés-Ortis et al., 2003
16 proteína polimorfismo Lactato desidrogenase (LDH) Szapkievich et al., 1998
16 proteína polimorfismo
Esterase α e β
Szapkievich et al., 1998
16 proteína polimorfismo Malato desidrogenase (MDH) Szapkievich et al., 1998
16 proteína polimorfismo Isocitrato desidrogenase
(IDH)
Szapkievich et al., 1998
16 proteína polimorfismo Superóxido dismutase (SOD) Szapkievich et al., 1998
16 proteína polimorfismo Fosfogluconase
desidrogenase (PGD)
Szapkievich et al., 1998
16 proteína polimorfismo Esterase D Szapkievich et al., 1998
16 proteína polimorfismo Leucil amino peptidase
(AMP)
Szapkievich et al., 1998
16 proteína polimorfismo Albumina (ALB) Szapkievich et al., 1998
16 proteína polimorfismo Transferrina (TF) Szapkievich et al., 1998
100 proteína polimorfismo Fosfogluconase
desidrogenase (PGD)
Salim et al., 2001
100 proteína polimorfismo Esterase D Salim et al., 2001
1 mtDNA seqüência CCR – Região de Controle do
mtDNA
Ascunce et al., 2003
Alouatta Alouatta seniculus 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 DNA nuclear seqüência
γ − globina
Meireles et al., 1999ª
1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
2 mtDNA seqüência Citocromo b Bonvicino et al., 2001
Anexo
Gênero Espécies N Tipo Nome do marcador Descrito por
Alouatta Alouatta seniculus 3 DNA nuclear microssatélite heterólogo Ap6, Ap20, Ap40, Ap68 e
Ap74
Ellsworth & Hoelzer, 1998
2 DNA nuclear microssatélite heterólogo D5S111, D5S117, D6S260,
D8S165, D14S151,
D17S804
Ellsworth & Hoelzer, 1998
5 mtDNA Seqüência Citocromo b Cortés-Ortis et al., 2003
5 mtDNA Seqüência ATP sintase 6 e 8 Cortés-Ortis et al., 2003
5 DNA nuclear Seqüência Calmodulina Cortés-Ortis et al., 2003
5 DNA nuclear seqüência Recombination activating
gene 1 RAG – 1
Cortés-Ortis et al., 2003
Alouatta belzebul 1 DNA nuclear Seqüência
γ − globina
Meireles et al., 1999ª
1 DNA nuclear Seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
1 DNA nuclear Seqüência IRBP Harada et al., 1995
7 mtDNA Seqüência Citocromo b Bonvicino et al., 2001
23 mtDNA Seqüência Citocromo b Nascimento et al., 2005
91 DNA nuclear microssatélite Ab04, Ab 06, Ab07, Ab09,
Ab10, Ab12 e Ab17
Gonçalves et al., 2004
9 mtDNA seqüência Citocromo b Cortés-Ortis et al., 2003
9 mtDNA seqüência ATP sintase 6 e 8 Cortés-Ortis et al., 2003
9 DNA nuclear seqüência Calmodulina Cortés-Ortis et al., 2003
9 DNA nuclear seqüência Recombination activating
gene 1 RAG – 1
Cortés-Ortis et al., 2003
2 mtDNA seqüência CCR – Região de Controle do
mtDNA (heterólogo)
Ascunce et al., 2003
Alouatta stramineus 1 mtDNA seqüência Citocromo b Bonvicino et al., 2001
Alouatta maconnelli 2 mtDNA seqüência Citocromo b Bonvicino et al., 2001
3 mtDNA seqüência Citocromo b Cortés-Ortis et al., 2003
3 mtDNA seqüência ATP sintase 6 e 8 Cortés-Ortis et al., 2003
3 DNA nuclear seqüência Calmodulina Cortés-Ortis et al., 2003
3 DNA nuclear seqüência Recombination activating
gene 1 RAG – 1
Cortés-Ortis et al., 2003
Alouatta coibensis 4 mtDNA seqüência Citocromo b Cortés-Ortis et al., 2003
4 mtDNA seqüência ATP sintase 6 e 8 Cortés-Ortis et al., 2003
4 DNA nuclear seqüência Calmodulina Cortés-Ortis et al., 2003
4 DNA nuclear seqüência Recombination activating
gene 1 RAG – 1
Cortés-Ortis et al., 2003
Anexo
Gênero Espécies N Tipo Nome do marcador Descrito por
Alouatta Alouatta fusca 1 mtDNA seqüência Citocromo b Bonvicino et al., 2001
Alouatta pigra 20 DNA nuclear microssatélite heterólogo Ap6, Ap20, Ap40, Ap68 e
Ap74
Ellsworth & Hoelzer, 1998
2 DNA nuclear microssatélite heterólogo D5S111, D5S117, D6S260,
D8S165, D14S151,
D17S804
Ellsworth & Hoelzer, 1998
7 mtDNA seqüência Citocromo b Cortés-Ortis et al., 2003
7 mtDNA seqüência ATP sintase 6 e 8 Cortés-Ortis et al., 2003
7 DNA nuclear seqüência Calmodulina Cortés-Ortis et al., 2003
7 DNA nuclear seqüência Recombination activating
gene 1 RAG – 1
Cortés-Ortis et al., 2003
10 DNA nuclear microssatélite heterólogo D5S111, D5S117, D6S260,
D8S165, D14S151,
D17S804, D16S403,
D7S646, D16S403,
D7S646
Winkler, et al., 2004
Alouatta fusca
clamitans
2 mtDNA seqüência Citocromo b Bonvicino et al., 2001
Alouatta nigerrima 1 mtDNA seqüência Citocromo b Bonvicino et al., 2001
Alouatta palliata 40 DNA nuclear microssatélite Ap6, Ap20, Ap40, Ap68 e
Ap74
Ellsworth & Hoelzer, 1998
10 DNA nuclear microssatélite heterólogo D5S111, D5S117, D6S260,
D8S165, D14S151,
D17S804
Ellsworth & Hoelzer, 1998
15 mtDNA seqüência Citocromo b Cortés-Ortis et al., 2003
15 mtDNA seqüência ATP sintase 6 e 8 Cortés-Ortis et al., 2003
15 DNA nuclear seqüência Calmodulina Cortés-Ortis
et al., 2003
15 DNA nuclear seqüência Recombination activating
gene 1 RAG – 1
Cortés-Ortis et al., 2003
29 DNA nuclear microssatélite heterólogo D5S111, D5S117, D6S260,
D8S165, D14S151,
D17S804, D16S403,
D7S646, D16S403,
D7S646
Winkler, et al., 2004
Anexo
Gênero Espécies N Tipo Nome do marcador Descrito por
29 DNA nuclear microssatélite heterólogo Ap20, Ap40, Ap68 e Ap74 Winkler, et al., 2004
3 mtDNA seqüência CCR – Região de Controle do
mtDNA (heterólogo)
Ascunce et al., 2003
Alouatta Alouatta sara 3 mtDNA seqüência Citocromo b Cortés-Ortis et al., 2003
3 mtDNA seqüência ATP sintase 6 e 8 Cortés-Ortis et al., 2003
3 DNA nuclear seqüência Calmodulina Cortés-Ortis et al., 2003
3 DNA nuclear seqüência Recombination activating
gene 1 RAG – 1
Cortés-Ortis et al., 2003
Aotus Aotus trivirgatus 2 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
Aotus azarae 1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
1 DNA nuclear seqüência IRBP Harada et al., 1995
Aotus nancymai 1 DNA nuclear seqüência
IRBP
Harada et al., 1995
Ateles Ateles fusciceps 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
2 mtDNA seqüência Citocromo b Cortés-Ortis et al., 2003
2 mtDNA seqüência ATP sintase 6 e 8 Cortés-Ortis et al., 2003
2 DNA nuclear seqüência Calmodulina Cortés-Ortis et al., 2003
2 DNA nuclear seqüência Recombination activating
gene 1 RAG – 1
Cortés-Ortis et al., 2003
Ateles geoffroyi 1 DNA nuclear seqüência
γ − globina
Meireles et al., 1999ª
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
3 DNA nuclear microssatélite heterólogo Ap6, Ap20, Ap40, Ap68 e
Ap74
Ellsworth & Hoelzer, 1998
2 DNA nuclear microssatélite heterólogo D5S111, D5S117, D6S260,
D8S165, D14S151,
D17S804
Ellsworth & Hoelzer, 1998
8 mtDNA seqüência Citocromo b Cortés-Ortis et al., 2003
8 mtDNA seqüência ATP sintase 6 e 8 Cortés-Ortis et al., 2003
8 DNA nuclear seqüência Calmodulina Cortés-Ortis et al., 2003
8 DNA nuclear seqüência Recombination activating
gene 1 RAG – 1
Cortés-Ortis et al., 2003
Anexo
Gênero Espécies N Tipo Nome do marcador Descrito por
Ateles paniscus 1 DNA nuclear seqüência
γ − globina
Meireles et al., 1999ª
1 mtDNA seqüência CCR – Região de Controle do
mtDNA (heterólogo)
Ascunce et al., 2003
Ateles Ateles chamek 1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
Ateles belzebuth 1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
1 DNA nuclear seqüência IRBP Harada et al., 1995
Brachyteles Brachyteles
arachnoides
1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 DNA nuclear seqüência
γ − globina
Meireles et al., 1999ª
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
1 DNA nuclear seqüência IRBP Harada et al., 1995
1 mtDNA seqüência Citocromo b Bonvicino et al., 2001
3 mtDNA seqüência Citocromo b Cortés-Ortis et al., 2003
3 mtDNA seqüência ATP sintase 6 e 8 Cortés-Ortis et al., 2003
3 DNA nuclear seqüência Calmodulina Cortés-Ortis et al., 2003
3 DNA nuclear seqüência Recombination activating
gene 1 RAG – 1
Cortés-Ortis et al., 2003
Cacajao Cacajao rubicundus 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
Cacajao calvus 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada
et al., 1995
7 Proteína
sangüínea
polimorfismo ADA – Adenosina deaminase Schneider et al., 1995
7 Proteína
sangüínea
polimorfismo ADA – Adenosina deaminase Schneider et al., 1995
Callicebus Callicebus moloch 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
1 DNA nuclear seqüência IRBP Harada et al., 1995
Anexo
Gênero Espécies N Tipo Nome do marcador Descrito por
Callicebus personatus 1 mtDNA seqüência Citocromo b Bonvicino et al., 2001
Callicebus torquatus 1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
1 DNA nuclear seqüência IRBP Harada et al., 1995
Callimico Callimico goeldii 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
3 DNA nuclear microssatélite heterólogo Ap6, Ap20, Ap40, Ap68 e
Ap74
Ellsworth & Hoelzer, 1998
2 DNA nuclear microssatélite heterólogo D5S111, D5S117, D6S260,
D8S165, D14S151,
D17S804
Ellsworth & Hoelzer, 1998
Callithrix Callithrix jacchus 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Porter et al., 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
1 DNA nuclear seqüência IRBP Harada et al., 1995
Callithrix geoffroyi 1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Porter et al., 1999
Callithrix mauesi 1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
Callithrix argentata 1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Porter et al., 1999
Callithrix humeralifer 1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al.
, 1999
Cebus Cebus albifrons 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
Cebus kaapori 1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
1 DNA nuclear seqüência IRBP Harada et al., 1995
Anexo
Gênero Espécies N Tipo Nome do marcador Descrito por
Cebus olivaceus 1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
Cebus paella 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
Cebus Cebus capucinus 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 mtDNA seqüência Citocromo b Cortés-Ortis et al., 2003
1 mtDNA seqüência ATP sintase 6 e 8 Cortés-Ortis et al., 2003
1 DNA nuclear seqüência Calmodulina Cortés-Ortis et al., 2003
Cebus Cebus capucinus 1 DNA nuclear seqüência Recombination activating
gene 1 RAG – 1
Cortés-Ortis et al., 2003
Cebus apella 12 proteína polimorfismo Lactato desidrogenase (LDH) Szapkievich et al., 1998
12 proteína polimorfismo
Esterase α e β
Szapkievich et al., 1998
12 proteína polimorfismo Malato desidrogenase (MDH) Szapkievich et al., 1998
12 proteína polimorfismo Superóxido dismutase (SOD) Szapkievich et al., 1998
12 proteína polimorfismo Fosfoglutonato desidrogenase
(PGD)
Szapkievich et al., 1998
12 proteína polimorfismo Esterase D Szapkievich et al., 1998
12 proteína polimorfismo Leucil Amino peptidase
(AMP)
Szapkievich et al., 1998
12 proteína polimorfismo Albumina (ALB) Szapkievich et al., 1998
12 proteína polimorfismo Transferrina (TF) Szapkievich et al., 1998
3 DNA nuclear microssatélite heterólogo Ap6, Ap20, Ap40, Ap68 e
Ap74
Ellsworth & Hoelzer, 1998
2 DNA nuclear microssatélite heterólogo D5S111, D5S117, D6S260,
D8S165, D14S151,
D17S804
Ellsworth & Hoelzer, 1998
Cebus nigrivittatus 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
1 DNA nuclear seqüência IRBP Harada et al., 1995
Cebuella Cebuella pygmaea 2 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Porter et al., 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
Chiropotes Chiropotes satanas 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
1 DNA nuclear seqüência IRBP Harada et al., 1995
Anexo
Gênero Espécies N Tipo Nome do marcador Descrito por
12 Proteína
sangüínea
polimorfismo ACP1 – Fosfatase ácida Schneider et al., 1995
12 Proteína
sangüínea
polimorfismo CA1 – Anidrase carbônica Schneider et al., 1995
Lagothrix Lagothrix lagothricha 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 DNA nuclear seqüência
γ − globina
Meireles et al., 1999ª
1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
Lagothrix Lagothrix lagothricha 1 DNA nuclear seqüência IRBP Harada et al., 1995
Leontopithecus Leontopithecus rosalia 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
Pithecia Pithecia pithecia 2 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
Pithecia irrorata 1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
1 DNA nuclear seqüência IRBP Harada et al., 1995
Saguinus Saguinus fuscicollis 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
Saguinus bicolor 1 DNA nuclear seqüência Fator de von Willebrand Chaves et al., 1999
Saguinus midas 1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
Saimiri Saimiri boliviensis 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
1 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
1 DNA nuclear seqüência IRBP Harada et al., 1995
1 mtDNA seqüência CCR – Região de Controle do
mtDNA (heterólogo)
Ascunce et al., 2003
Saimiri oerstedii 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
Saimiri sciureus 1 DNA nuclear seqüência G6PD – introns D e E von Dormam & Ruvolo, 1999
2 DNA nuclear seqüência
ε − globina
Harada et al., 1995
1 DNA nuclear seqüência IRBP Harada et al., 1995
Anexo
Gênero Espécies N Tipo Nome do marcador Descrito por
Observação: muitos nomes científicos de espécies aqui citadas já foram revistos em trabalhos mais recentes. No entanto, estes foram aqui mantidos pela
fidelidade à descrição no trabalho original.
Anexo
Tabela VIII.2. Dados originais relativos ao peso das fêmeas da espécie Alouatta caraya
capturadas durante a formação do lago artificial da usina hidrelétrica Engenheiro
Sergio Mota, Porto Primavera (SP) fornecidos pela equipe da Pró-Fauna. Peso em
quilogramas.
Adulto Jovem Infante
Registro Peso Registro Peso Registro Peso
1 3,50 159 2,75 238 0,90
2 3,75 160 2,50 239 1,50
3 3,75 161 1,25 240 0,50
4 3,75 162 3,00 241 0,50
5 4,00 163 1,50 242 1,25
6 3,00 164 1,75 243 0,75
7 3,50 165 2,00 244 1,50
8 5,50 166 2,50 245 1,00
9 4,00 167 3,00 246 1,00
10 4,00 168 2,00 247 3,50
11 4,00 169 2,50 248 4,00
12 4,25 170 5,75 249 0,50
13 3,50 171 3,00 250 1,00
14 4,70 172 2,25 251 0,70
15 3,75 173 2,00 252 0,75
16 4,00 174 3,50 253 1,00
17 4,00 175 2,20 254 0,50
18 8,00 176 2,00 255 1,00
19 4,30 177 2,25 256 1,00
20 4,00 178 2,50 257 1,00
21 4,00 179 1,75 258 0,50
22 4,00 180 1,50 259 0,25
23 4,00 181 1,75 260 1,00
24 4,00 182 1,75 261 0,45
25 4,00 183 2,25 262 1,25
26 1,50 184 2,00 263 0,25
27 4,50 185 2,25 264 0,70
28 4,00 186 3,00 265 0,10
29 4,50 187 2,20 266 1,25
30 3,00 188 1,50 267 1,50
31 6,00 189 2,00 268 1,25
32 2,00 190 2,00
33 4,00 191 2,25
Anexo
Adulto Jovem Infante
Registro Peso Registro Peso Registro Peso
34 4,00 192 1,75
35 3,80 193 2,10
36 3,75 194 2,25
37 4,00 195 2,25
38 3,75 196 2,25
39 3,75 197 2,25
40 4,25 198 2,25
41 3,00 199 2,00
42 3,75 200 1,75
43 5,00 201 3,25
44 3,75 202 2,00
45 4,25 203 3,00
46 4,00 204 2,25
47 4,25 205 3,25
48 4,00 206 1,75
49 4,00 207 2,25
50 3,25 208 2,00
51 3,00 209 3,00
52 3,50 210 1,75
53 3,75 211 3,25
54 4,00 212 2,90
55 4,75 213 1,05
56 3,75 214 2,00
57 4,50 215 2,50
58 4,00 216 2,25
59 3,25 217 2,00
60 3,00 218 2,75
61 4,00 219 3,00
62 4,75 220 3,00
63 7,50 221 2,00
64 4,00 222 3,25
65 4,25 223 2,00
66 2,25 224 2,50
67 4,00 225 2,00
68 4,50 226 2,75
69 3,00 227 3,25
70 4,00 228 2,00
71 3,50 229 1,50
72 3,50 230 3,30
73 4,75 231 2,75
Anexo
Adulto Jovem Infante
Registro Peso Registro Peso Registro Peso
74 4,50 232 2,60
75 3,25 233 1,90
76 4,00 234 1,75
77 4,00 235 2,75
78 3,75 236 2,50
79 3,70 237 1,50
80 4,25
81 5,00
82 4,00
83 5,00
84 4,25
85 5,25
86 4,00
87 3,75
88 4,60
89 5,00
90 3,75
91 4,50
92 4,25
93 4,25
94 4,00
95 4,25
96 3,05
97 4,20
98 4,50
99 3,50
100 5,00
101 3,50
102 4,25
103 3,75
104 4,50
105 4,50
106 4,50
107 4,75
108 3,75
109 4,50
110 5,00
111 4,50
112 4,00
113 4,00
Anexo
Adulto Jovem Infante
Registro Peso Registro Peso Registro Peso
114 3,00
115 4,75
116 4,25
117 3,50
118 3,50
119 4,00
120 4,75
121 4,75
122 4,75
123 4,75
124 3,75
125 4,75
126 4,75
127 4,75
128 4,75
129 4,75
130 4,00
131 4,75
132 4,50
133 5,00
134 5,50
135 3,50
136 3,75
137 4,50
138 3,50
139 3,90
140 5,50
141 5,00
142 5,00
143 3,60
144 4,00
145 4,50
146 5,00
147 3,90
148 5,00
149 3,75
150 4,50
151 5,00
152 5,70
153 4,75
Anexo
Adulto Jovem Infante
Registro Peso Registro Peso Registro Peso
154 3,50
155 4,25
156 4,00
157 3,60
158 4,75
Tabela VIII.3. Dados originais relativos ao peso dos machos da espécie Alouatta caraya
capturados durante a formação do lago artificial da usina hidrelétrica Engenheiro
Sergio Mota, Porto Primavera (SP) fornecidos pela equipe da Pró-Fauna. Peso em
quilogramas.
Adulto Subadulto Jovem Infante
Registro Peso Registro Peso Registro Peso Registro Peso
269 5,25 349 3,00 409 2,50 469 0,50
270 7,00 350 2,00 410 4,00 470 1,00
271 6,75 351 4,25 411 1,00 471 1,50
272 7,00 352 6,00 412 1,00 472 1,80
273 8,00 353 6,40 413 2,00 473 1,40
274 6,75 354 7,25 414 1,00 474 1,00
275 6,00 355 6,75 415 3,25 475 1,50
276 6,50 356 3,50 416 2,50 476 1,00
277 8
,00 357 4,25 417 2,25 477 1,00
278 7,30 358 3,25 418 4,00 478 1,00
279 7,20 359 2,75 419 2,25 479 1,50
280 6,75 360 4,00 420 1,50 480 0,50
281 8,00 361 4,00 421 2,50 481 1,00
282 7,00 362 3,75 422 1,50 482 1,00
283 6,00 363 4,25 423 2,75 483 1,25
284 6
,00 364 6,00 424 1,75 484 1,00
285 7,25 365 5,25 425 2,25 485 5,75
286 6,50 366 5,00 426 2,00 486 0,50
287 7,50 367 4,75 427 3,00 487 1,25
288 6
,75 368 3,25 428 1,50 488 0,75
289 6,20 369 5,25 429 2,00 489 1,00
290 5,75 370 4,50 430 2,00 490 0,50
291 6,00 371 3,25 431 1,50 491 1,00
292 6,25 372 3,25 432 2,00 492 1,00
Anexo
Adulto Subadulto Jovem Infante
Registro Peso Registro Peso Registro Peso Registro Peso
293 7,00 373 6,05 433 1,75 493 0,50
294 7,00 374 5,00 434 2,00 494 0,75
295 6,00 375 3,50 435 1,50 495 0,25
296 6,75 376 6,00 436 1,75 496 0,50
297 7,20 377 4,00 437 1,75 497 0,75
298 6,70 378 4,75 438 3,25 498 0,75
299 7,50 379 5,75 439 2,00 499 1,25
300 6,00 380 6,00 440 2,25 500 0,25
301 5,75 381 5,02 441 3,00 501 0,90
302 7,50 382 5,00 442 3,00 502 0,90
303 8,00 383 4,00 443 3,75 503 0,25
304 6,00 384 6,00 444 2,25 504 0,20
305 5,25 385 4,75 445 3,75 505 1,50
306 5,50 386 5,75 446 3,00 506 0,25
307 6,25 387 4,75 447 2,00
308 7,00 388 5,50 448 1,75
309 5,75 389 4,50 449 2,50
310 7,00 390 4,25 450 2,50
311 7,75 391 4,75 451 1,25
312 7,50 392 5,00 452 2,75
313 7,00 393 4,75 453 2,00
314 7,75 394 5,75 454 2,00
315 6,75 395 4,25 455 2,00
316 6,25 396 6,00 456 3,00
317 7,00 397 5,25 457 2,75
318 7,75 398 5,00 458 1,50
319 8,00 399 4,50 459 1,50
320 7,75 400 5,50 460 3,00
321 7,00 401 7,00 461 4,00
322 7,50 402 4,50 462 2,90
323 6,50 403 5,50 463 2,90
324 7,75 404 4,00 464 3,00
325 6,75 405 3,00 465 2,50
326 8,00 406 4,25 466 3,50
327 8,00 407 4,75 467 2,75
328 7,00 408 5,75 468 3,00
329 7,25
330 7,25
Anexo
Adulto Subadulto Jovem Infante
Registro Peso Registro Peso Registro Peso Registro Peso
331 6,50
332 7,50
333 6,50
334 6,75
335 6,50
336 7,00
337 6,50
338 7,25
339 7,75
340 7,00
341 7,00
342 6,30
343 6,75
344 7,20
345 8,90
346 7,25
347 8,50
348 7,50
Tabela VIII.4. Dados relativos ao Comprimento Total (CT) de espécimes de uma população de
A. caraya de Porto Primavera (SP) fornecidos pela equipe da Pró-Fauna (N total =
162).
Registro* Sexo Idade Condição Reprodutiva CT
1 F A Lactante c/filhote 76,00
2 F A 79,00
3 F A Lactante 90,00
4 F A 92,00
5 F A 98,50
6 F A 99,00
7 F A 101,00
8 F A Lactante 103,50
9 F A Lactante c/filhote 104,00
10 F A 104,50
11 F A 105,00
12 F A Lactante c/filhote 105,00
13 F A 105,50
14 F A Lactante c/filhote 106,00
15 F A 106,50
Anexo
Registro* Sexo Idade Condição Reprodutiva CT
16 F A Gestante 107,00
17 F A 107,00
18 F A 107,00
19 F A 107,00
20 F A Lactante c/filhote 107,00
21 F A 107,00
22 F A 107,50
23 F A Lactante c/filhote 108,00
24 F A 108,00
25 F A 108,50
26 F A Lactante 109,00
27 F A Lactante c/filhote 109,00
28 F A Lactante c/filhote 109,00
29 F A 110,00
30 F A Lactante c/filhote 110,00
31 F A 110,50
32 F A Lactante c/filhote 110,50
33 F A 111,00
34 F A Lactante c/filhote 111,00
35 F A 112,00
36 F A 112,00
37 F A Lactante c/filhote 112,00
38 F A 112,00
39 F A 112,00
40 F A 113,00
41 F A 113,00
42 F A 113,00
43 F A 115,00
44 F A 115,50
45 F A 116,00
46 F A 116,00
47 F A Lactante c/filhote 119,00
48 F A Gestante 119,50
49 F A Gestante 119,50
50 F A Gestante 119,50
51 F A 120,00
52 F A 123,00
53 F A 123,00
54 F I 42,00
55 F I 43,50
56 F I 44,00
57 F I 53,00
58 F I 58,00
59 F I 66,00
60 F I 69,00
61 F I 71,00
62 F I 71,00
Anexo
Registro* Sexo Idade Condição Reprodutiva CT
63 F I 72,00
64 F I 76,00
65 F I 83,00
66 F I 89,00
67 F J 78,00
68 F J 79,00
69 F J 80,00
70 F J 82,00
71 F J 84,50
72 F J 84,50
73 F J 86,50
74 F J 90,00
75 F J 92,00
76 F J 92,00
77 F J 93,00
78 F J 95,50
79 F J 95,50
80 F J 96,00
81 F J 96,00
82 F J 99,00
83 F J 102,50
84 F J 103,00
85 F J 106,00
86 F J 108,50
87 F J 109,00
88 F J 103,00
89 M A 110,00
90 M A 110,50
91 M A 111,00
92 M A 112,00
93 M A 113,00
94 M A 114,50
95 M A 115,00
96 M A 117,00
97 M A 118,50
98 M A 119,00
99 M A 122,00
100 M A 123,00
101 M A 124,00
102 M A 126,00
103 M A 126,00
104 M A 126,00
105 M A 126,00
106 M A 126,00
107 M A 127,00
108 M A 127,00
109 M A 127,00
Anexo
Registro* Sexo Idade Condição Reprodutiva CT
110 M A 127,00
111 M A 128,00
112 M A 129,00
113 M A 131,00
114 M I 39,00
115 M I 45,00
116 M I 48,50
117 M I 51,00
118 M I 59,50
119 M I 60,00
120 M I 63,00
121 M I 66,00
122 M I 70,00
123 M I 73,50
124 M I 78,50
125 M I 79,00
126 M I 84,00
127 M I 86,50
128 M I 88,00
129 M J 78,00
130 M J 80,00
131 M J 81,00
132 M J 82,00
133 M J 88,00
134 M J 88,00
135 M J 88,50
136 M J 95,00
137 M J 96,00
138 M J 96,50
139 M J 96,50
140 M J 97,00
141 M J 98,00
142 M J 98,50
143 M J 101,00
144 M J 102,00
145 M J 102,00
146 M J 105,00
147 M J 108,00
148 M J 114,00
149 M J 127,00
150 M S 90,00
151 M S 96,00
152 M S 109,00
153 M S 112,00
154 M S 113,00
155 M S 113,00
156 M S 116,50
Anexo
Registro* Sexo Idade Condição Reprodutiva CT
157 M S 119,00
158 M S 121,00
159 M S 124,00
160 M S 125,00
161 M S 125,00
162 M S 126,00
M: macho; F: fêmea; A: indivíduo adulto; S: indivíduo subadulto; J: indivíduo jovem; I: indivíduo
infante; CT: comprimento total.
* Registro independente das Tabelas anteriores
.
Anexo
Tabela VIII.5. Comparação do tamanho dos fragmentos, número de alelos por loco e número de indivíduos genotipados para os
microssatélites descritos por Gonçalves et al. (2004) em populações de Alouatta belzebul (Bastos et al., com. pessoal) e uma
população de Alouatta caraya (presente trabalho).
Espécie
A. caraya A. belzebul
Parâmetros
TF Na N TF Na N
Loco
Ab04
157-175 10 84 147-165 10 87
Ab06
275-305 17 65 265-293 14 87
Ab07
180-190 04 100 182-200 13 87
Ab09
138 01 103 168-200 16 87
Ab10
192 01 103 234-276 22 87
Ab12
253- 265 06 16 225-293 33 87
Ab17
220-246 14 100 193-263 23 87
TF = tamanho dos fragmentos, em pares de base; Na = Número de alelos do loco; N = número de indivíduos genotipados.
Anexo
Tabela VIII.6. Freqüência alélica dos marcadores analisados para uma população de Alouatta caraya de Porto Primavera (PP) e para cinco
populações de Alouatta belzebul da região de Tucuruí (PA): Ilha de Germoplasma – IG, Ilha de Cornélio – IC, Ilha da Base
4 – B4, Margem esquerda do rio Tocantins – ME e Margem direita do rio Tocantins – MD – Bastos et al. com. pessoal.
Nesta análise computamos todos os alelos descritos para o loco:
+
sinaliza os alelos exclusivos de A. caraya e • os alelos
compartilhados com A. belzebul.
Alelo PP IG IC B4 ME MD
Ab04
147
–
0,054
– – – –
149
–
0,107
– – – –
153
–
0,036
– – – –
155
–
0,089
–
0,200
– –
157• 0,143 0,411 0,571 0,333 0,400 0,333
159• 0,208 0,036 0,214 0,433 0,267 0,333
161• 0,065 0,107 0,214 0,033 0,250 0,333
163• 0,054 0,054
– –
0,017
–
165• 0,024 0,089
– –
0,050
–
167• 0,030 0,018
– –
0,017
–
169
+
0,054
– – – – –
171
+
0,339
– – – – –
173
+
0,077
– – – – –
175
+
0,006
– – – – –
Ab06
261
+
0,008
– – – – –
263
+
0,031
– – – – –
265
–
0,034
– – – –
269
–
0,017
– – – –
271
–
0,103
– – – –
Anexo
Alelo PP IG IC B4 ME MD
273
+
0,054
– – – – –
275• 0,231 0,017 0,214
–
0,033
–
277• 0,046 0,034 0,143 0,067 0,033 0,111
279• 0,100 0,069 0,071 0,367 0,183 0,111
281• 0,008 0,259
–
0,100 0,133 0,111
283
–
0,190 0,143 0,033 0,150 0,111
285• 0,046 0,086 0,143 0,033 0,167 0,167
287• 0,023 0,155
–
0,067 0,050 0,056
289• 0,069 0,017 0,214 0,333 0,183
–
291• 0,038 0,017
– –
0,033 0,111
293• 0,092
–
0,071
–
0,033 0,222
295
+
0,023
– – – – –
299
+
0,023
– – – – –
301
+
0,131
– – – – –
303
+
0,069
– – – – –
305
+
0,008
– – – – –
Ab07
178
– – –
0,033
–
0,056
180• 0,810
– – –
0,017
–
182• 0,085
–
0,214 0,033 0,217 0,167
184
–
0,069
–
0,067 0,117 0,389
186
–
0,052 0,071
–
0,350
–
188• 0,065 0,259 0,071 0,200 0,117 0,056
190• 0,040 0,224 0,214 0,200 0,083 0,056
192
–
0,207 0,286 0,100 0,050 0,056
194
–
0,103
– –
0,033
–
196
–
0,052 0,143 0,167
–
0,056
198
–
0,017
–
0,133 0,017
–
200
– – –
0,067
–
0,167
202
–
0,017
– – – –
Anexo
Alelo PP IG IC B4 ME MD
Ab09
138
+
1,000
– – – – –
168
– – – –
0,033
–
174
–
0,034
– – – –
176
–
0,069
–
0,036 0,017 0,056
178
–
0,034
– – –
0,056
180
–
0,052 0,071 0,107 0,067 0,167
182
–
0,069
–
0,250
–
0,056
184
–
0,155 0,071 0,071 0,167 0,111
186
–
0,017 0,071 0,214
–
0,056
188
–
0,103 0,357 0,143 0,267 0,167
190
–
0,069 0,071 0,143
–
0,056
192
–
0,172 0,214
–
0,183 0,111
194
–
0,069
–
0,036
– –
196
–
0,138 0,071
–
0,100 0,111
198
–
0,017
– –
0,050 0,056
200
– – – –
0,117
–
204
– –
0,071
– – –
Ab10
192
+
1,000
– – – – –
228
–
0,074
– – – –
230
–
0,056 0,143
– – –
234
– – – –
0,017
–
236
–
0,037
– –
0,017
–
238
–
0,037
– –
0,033
–
242
–
0,019
–
0,067 0,133 0,050
246
– –
0,214 0,067 0,067 0,100
248
–
0,111
– – – –
250
–
0,167 0,143 0,433 0,183 0,100
252
–
0,037
– – – –
254
–
0,148 0,214 0,100 0,067 0,200
Anexo
Alelo PP IG IC B4 ME MD
256
– – – –
0,033 0,050
258
–
0,148 0,143 0,100 0,117 0,350
260
– – – –
0,033
–
262
–
0,056
–
0,067 0,117 0,100
264
– –
0,143 0,133 0,033
–
266
–
0,037
– –
0,067
–
270
–
0,037
–
0,033 0,017
–
272
–
0,037
– – – –
274
– – – –
0,033
–
276
– – – –
0,033
–
284
– – – – –
0,050
Ab17
193
–
0,017
– – –
0,056
195
– –
0,143 0,033 0,069
–
199
– –
0,071 0,033 0,034
–
203
– – –
0,033
– –
205
– – – –
0,017 0,111
207
– – – –
0,034
–
209
–
0,017 0,143 0,067 0,052
–
213
–
0,103 0,214 0,133 0,069
–
215
–
0,034
– –
0,017
–
217
–
0,034 0,143 0,267 0,086 0,222
218
+
0,010
– – – – –
219
– – – –
0,017
–
220
+
0,005
– – – – –
221
–
0,259 0,071 0,200 0,138 0,222
222
+
0,070
– – – – –
225
–
0,138
–
0,033 0,172 0,167
226
+
0,050
– – – – –
227
–
0,052
– – – –
228
+
0,010
– – – – –
Anexo
Alelo PP IG IC B4 ME MD
229
–
0,103 0,143 0,167 0,138 0,167
230
+
0,130
– – – – –
231
–
0,017
– – – –
232
+
0,040
– – – – –
233
–
0,121
– –
0,069 0,056
234
+
0,135
– – – – –
235
–
0,017
– – – –
236
+
0,235
– – – – –
237
–
0,034
– – – –
238
+
0,230
– – – – –
240
+
0,055
– – – – –
241
– – – –
0,017
–
242
+
0,010
– – – – –
243
–
0,017
– – – –
244
+
0,010
– – – – –
246
+
0,010
– – – – –
255
– –
0,071 0,033 0,069
–
263
–
0,034
– – – –
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