ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Estudo dos óleos voláteis de plantas medicinais da
família Asteraceae do Rio Grande do Sul:
Baccharidastrum triplinervium, Baccharis
pentodonta, Pluchea sagittalis e Eupatorium
buniifolium
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Caroline Ziegler Stüker
Santa Maria, RS, Brasil
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
Estudo dos óleos voláteis de plantas medicinais da família
Asteraceae do Rio Grande do Sul: Baccharidastrum
triplinervium, Baccharis pentodonta, Pluchea sagittalis e
Eupatorium buniifolium
Por
Caroline Ziegler Stüker
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de
Pós-Graduação em Química, Área de Concentração em
Química Orgânica, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS),
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Química.
Orientador: Ademir Farias Morel
Santa Maria, RS, Brasil
2007
ads:
3
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Naturais e Exatas
Programa de Pós-Graduação em Química
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Dissertação de Mestrado
Estudo dos óleos voláteis de plantas medicinais da família
Asteraceae: Baccharidastrum triplinervium, Baccharis
pentodonta, Pluchea sagittalis e Eupatorium buniifolium
elaborada por
Caroline Ziegler Stüker
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Química
Comissão Examinadora:
________________________________________
Prof. Dr. Ademir Farias Morel - UFSM
(Presidente/Orientador)
________________________________________
Profª.
Drª. Ionara Irion Dalcol - UFSM
_______________________________________
Prof. Dr. Eduardo Miranda Ethur – UNIVATES
________________________________________
Profª. Drª. Taís do Canto Dorow - UFSM
(suplente)
Santa Maria, 26 de julho de 2007.
4
Aos meus pais Nilo e Enelita:
Obrigada por todo amor, carinho e
compreensão dedicados nos momentos de
minha ansiedade e por suportarem e não me
criticarem nos momentos mais difíceis e por
torcerem pela minha vitória. Amo vocês!
Ao meu irmão, Felipe que sempre esteve
comigo, agüentando meus dias de mau
humor porque as coisas davam erradas!
Obrigada pela tua paciência e incentivo! Te
amo muito!
A Deus pelo Seu amor, pela
oportunidade desta existência,
pela saúde, pela Sua presença e
proteção em todos os momentos.
5
Ao Prof. Dr. Ademir Farias Morel, pela
orientação, incentivo, compreensão, paciência e
amizade durante todos esses anos de convívio. Muito obrigada!
Prof. Drª. Emilia Carolina Dessoy (in memoriam): como não agradecer a minha
primeira orientadora tão importante e especial na minha vida! Sem ela talvez não
estivesse aqui! Obrigada pela confiança, carinho, amizade, apoio e por ter me ensinado
muitas coisas durante o tempo que passamos juntas. Tu serás sempre para mim um
exemplo de firmeza, perseverança, alegria, afeto e amor à vida! Nunca te esquecerei!
6
AGRADECIMENTOS
À Profª. Drª. Ionara I. Dalcol, pela amizade, incentivo e apoio durante a
realização deste trabalho.
Ao Prof. Ubiratan F. da Silva pela amizade, sugestões e ajuda durante o
desenvolvimento deste trabalho.
Ao Prof. Eduardo M. Ethur pela amizade e contribuições e disposição em fazer
parte da banca examinadora deste trabalho.
A Carla Porto pela realização das análises de massa e pela amizade e ajuda
durante o decorrer deste trabalho e durante minha iniciação científica no Laboratório de
Microbiologia.
Ao Anderson S. Mallmann pelas inúmeras injeções no Cromatógrafo, muito
obrigada.
Aos amigos por compartilhar das alegrias e pelos incentivos nos momentos mais
difíceis.
Ao Alex, pela amizade, amor, dedicação, companheirismo e apoio em todos os
momentos.
Aos colegas e amigos de laboratório de hoje: Graci Maldaner, Juliano, Vini Ilha,
Carol, Lu, Ilaine, Susi, Graci, Marcelo, Cláudia, e que por lá passaram Euclésio, Gilvan,
Sandro, Lari, Wellington (in memoriam), Enrique, Vanessa, Irene, Andréia e Vini
Londero pela amizade, auxílio e companheirismo durante estes anos.
As “vizinhas” Lu e Carla, pelo convívio, amizade e empréstimos.
À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Química da UFSM, em
especial aos funcionários Ademir e Valéria, pela amizade, empenho e atenção prestada.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
Muito obrigada.
Aos órgãos financiadores: CNPq e FAPERGS, pelas concessões de bolsas que
viabilizaram a execução deste trabalho.
7
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Química
Universidade Federal de Santa Maria
Estudo dos óleos voláteis de plantas medicinais da família Asteraceae
do Rio Grande do Sul: Baccharidastrum triplinervium, Baccharis
pentodonta, Pluchea sagittalis e Eupatorium buniifolium
Autora: Caroline Ziegler Stüker
Orientador: Ademir Farias Morel
Data e Local da Defesa: Santa Maria, 26 de julho de 2007.
As espécies selecionadas para este estudo foram: Baccharidastrum
triplinervium, Baccharis pentodonta, Pluchea sagittalis e Eupetorium buniifolium, todas
pertencentes a família Asteraceae. Os óleos essenciais dessas quatro espécies de plantas
medicinais do Rio Grande do Sul foram obtidos por hidrodestilação em Clevenger
modificado e submetidos a análise por CG-EM para determinação de suas composições
químicas.
Foram também submetidos a testes in vitro e in vivo para determinação de suas
atividades antimicrobiana, citotóxica e antioxidante.
Os óleos voláteis das folhas de Baccharidastrum triplinervium coletadas na
primacvera e no verão apresentaram composição sesquiterpênica, assim como as
amostras de folhas de Baccharis pentodonta coletadas na primavera e no inverno. Já os
óleos essencias de flores e folhas desta mesma planta extraídos no verão, tiveram maior
proporção de compostos monoterpênicos. Pluchea sagittalis, também teve maior
proporção de monoterpenos nos óleos essenciais de suas folhas e flores; assim como os
óleos essenciais das folhas de Eupatorium buniifolium que tem como componente
majoritário o α-tujeno nas amostras coletadas no verão e no inverno.
8
As atividades antimicrobianas apresentadas por essas plantas foram analisadas
por métodos de Bioautografia, Difusão em Disco e Microdiluição em Caldo. Todas as
amostras apresentaram atividade frente aos microrganismos testados exceto pelo
método de Difusão em Disco, pelo qual somente B. triplinervium apresentou-se ativa.
O teste de letalidade por Artemia salina que analisou a toxicidade in vivo desses
óleos essencias apresentou média atividade (LC
50
entre 29,63 e 116,44µg/mL) tendo
essas plantas atividade inseticida. A maioria das plantas apresenta atividade
antioxidante pelo método do radical livre DPPH.
Palavras chave: óleos essenciais, Asteraceae, atividades biológicas
9
ABSTRACT
Study of volatile oils of medicinal plants of the Asteraceae family of the
Rio Grande do Sul: Baccharidastrum triplinervium, Baccharis
pentodonta, Pluchea sagittalis and Eupatorium buniifolium
Author: Caroline Ziegler Stüker
Academic advisor: Ademir Farias Morel
In this study four species were studied: Baccharidastrum triplinervium,
Baccharis pentodonta, Pluchea sagittalis and Eupatorium buniifolium, all species
belong to Asteraceae family. The essential oils of these four species of medicinal plants
of the Rio Grande Do Sul were obtained by hydrodestillation in a modified Clevenger
apparatus and submitted to GC-MS analysis for determination of its chemical
compositions.
The essential oils had been submitted to in vitro and in vivo tests to determine its
antimicrobial, cytotoxic and antioxidant activities
The volatile oils from the leaves of Baccharidastrum triplinervium, which were
collected in spring and summer, showed sesquiterpenic composition, as well as
Baccharis pentodonta leaves that were collected in spring and winter. The essential oils
of the flowers and leaves of Baccharis pentodonta, that were extracted on summer,
showed a larger portion of monoterpenics compounds. Pluchea sagittalis also had a
large portion of monoterpenes in the essential oils of its leaves and flowers, as well as
the essential oils of the leaves of Eupatorium buniifolium that has as majority
component α-thujene, on the samples collected in summer and winter.
The antimicrobial activities showed by these plants were analysed by
bioautography test, disc difusion and microdilution in broth. All samples showed
activity against to the tested microorganisms, except by the disc difusion that only
showed activity against B. triplinervium.
10
The in vivo toxicity of these essential oils were tested by the letal test with brine
shrimp, that showed medium insecticide activity (LC
50
between 29,63 e 116,44µg/mL).
The majorority of these plants shows antioxidant activity by the free-radical test DPPH.
Keywords: essential oils, Asteraceae, biological activities
11
ÍNDICE:
AGRADECIMENTOS...................................................................................................iv
RESUMO..........................................................................................................................v
ABSTRACT...................................................................................................................vii
ÍNDICE............................................................................................................................ix
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................1
AS PLANTAS MEDICINAIS E AROMÁTICAS.........................................................1
2. OBJETIVOS................................................................................................................3
3. REVISÃO DE LITERATURA...................................................................................4
3.1 Sistemática Vegetal.................................................................................................4
3.1.1 Família Asteraceae.............................................................................................4
3.1.1.1 Gênero Baccharis........................................................................................5
3.1.1.2 Gênero Baccharidastrum............................................................................7
3.1.1.3 Gênero Pluchea...........................................................................................9
3.1.1.4 Genero Eupatorium...................................................................................11
3.2 Óleos essenciais.................................................................................................... 14
3.2.1 Usos e propriedades dos óleos essenciais........................................................16
3.2.2 Importância econômica dos óleos essenciais...................................................17
3.2.3 Metabolismo secundário..................................................................................17
3.2.3.1 Biogênese...................................................................................................19
3.2.4 Métodos cromatográficos de análise de óleos essenciais................................25
3.2.4.1 Cromatografia em camada delgada (CCD)..............................................25
3.2.4.2 Cromatografia gasosa (CG) e espectrometria de massa...........................25
3.3 Atividade antimicrobiana......................................................................................27
3.3.1 Atividade antimicrobiana e óleos essenciais...................................................29
3.3.2 Microrganismos patogênicos...........................................................................30
3.3.3 Ação antimicrobiana........................................................................................34
3.4 Testes in vitro........................................................................................................38
3.5 Determinação da atividade antimicrobiana in vitro...............................................40
12
3.5.1 Bioautografia...................................................................................................40
3.5.2 Difusão em Disco............................................................................................42
3.5.3 Microdiluição em Caldo (CIM).......................................................................43
3.6 Padrões utilizados nos testes antimicrobianos......................................................43
3.7 Determinação da toxicidade in vivo......................................................................45
3.7.1 Teste de letalidade com Artemia salina..........................................................45
3.8 Determinação da atividade antioxidante...............................................................47
3.8.1 Atividade antioxidante pelo método do radical livre DPPH (2,2-difenil-1-
picrilidrazila)...................................................................................................................49
4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS..............................................................50
4.1 GERAL..................................................................................................................50
4.1.1 Cromatografia Gasosa.....................................................................................50
4.1.2 Espectrometria de Massas...............................................................................50
4.1.3 Cromatografia em camada delgada (CCD).....................................................51
4.1.4 Solventes e reagentes purificados....................................................................51
4.2 Coleta do material vegetal e identificação das plantas..........................................51
4.3 Extração dos óleos voláteis....................................................................................52
4.4 Determinação do índice de retenção de Kovats para os constituintes dos óleos
voláteis.............................................................................................................................53
4.5 Amostras para cromatografia gasosa......................................................................54
4.6 Determinação das propriedades físicas dos óleos voláteis.....................................54
4.6.1 Polarimetria (α)................................................................................................54
4.6.2 Índice de refração (η).......................................................................................55
4.6.3 Densidade (d)...................................................................................................55
4.7 Determinação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais in vitro...............55
4.7.1 Substâncias empregadas como padrões nos ensaios microbiológicos..............56
4.7.2 Meios de cultura empregados...........................................................................57
4.7.3 Manutenção dos microrganismos indicadores..................................................59
4.7.4 Preparo das suspensões microbianas (inóculo)................................................59
4.7.5 Método de Bioautografia..................................................................................59
4.7.6 Método de difusão em discos de papel.............................................................60
4.7.6.1 Inoculação das placas para realização da difusão.......................................60
4.7.6.2 Aplicação de discos a placas de ágar inoculadas........................................61
13
4.7.7 Determinação da CIM pelo método de microdiluição......................................61
4.8 Determinação de toxidade in vivo..........................................................................62
4.8.1 Teste de letalidade com Artemia salina............................................................62
4.9 Teste de atividade antioxidante..............................................................................63
4.9.1 Método do radical livre DPPH.........................................................................63
5. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS...................................64
5.1 Baccharidastrum triplinervium (Less.) Cabrera....................................................64
5.1.1 Estudo do óleo volátil das folhas de Baccharidastrum triplinervium.............64
5.1.2 Determinação das atividades biológicas in vitro dos óleos essenciais de
Baccharidastrum triplinervium.......................................................................................67
5.1.2.1 Bioautografia............................................................................................67
5.1.2.2 Difusão em Disco.....................................................................................69
5.1.2.3 Microdiluição em caldo (CIM).................................................................71
5.1.3 Determinação da toxicidade in vivo dos óleos essenciais de Baccharidastrum
triplinervium....................................................................................................................72
6.1.3.1 Teste de letalidade com Artemia salina....................................................72
6.1.4 Determinação da atividade antioxidante dos óleos essenciais de
Baccharidastrum triplinervium pelo Método do DPPH..................................................73
5.2 Baccharis pentodonta Malme................................................................................74
5.2.1 Estudo do óleo volátil das folhas e flores de Baccharis pentodonta...............74
5.2.2 Determinação das atividades biológicas in vitro dos óleos essenciais de
Baccharis pentodonta......................................................................................................80
5.2.2.1 Bioautografia.............................................................................................80
5.2.2.2 Difusão em Disco......................................................................................82
5.2.2.3 Microdiluição em caldo (CIM)..................................................................83
5.2.3 Determinação da toxicidade in vivo dos óleos essenciais de Baccharis
pendonta..........................................................................................................................84
5.2.3.1 Teste de letalidade com Artemia salina.....................................................84
5.2.4 Determinação da atividade antioxidante dos óleos essenciais de Baccharis
pendonta pelo Método do DPPH.....................................................................................85
5.3 Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera.........................................................................87
5.3.1 Estudo do óleo volátil das folhas e flores de Pluchea sagittalis.....................87
5.3.2 Determinação das atividades biológicas in vitro para os óleos essenciais de
Pluchea sagittalis............................................................................................................90
14
5.3.2.1 Bioautografia.............................................................................................90
5.3.2.2 Difusão em Disco......................................................................................92
5.3.2.3 Microdiluição em caldo (CIM)..................................................................93
5.3.3 Determinação da toxicidade in vivo dos óleos essenciais de Pluchea
sagittalis..........................................................................................................................94
5.3.3.1 Teste de letalidade com Artemia salina....................................................94
5.3.4 Determinação da atividade antioxidante dos óleos essenciais de Pluchea
sagittalis pelo Método do DPPH.....................................................................................95
5.4 Eupatorium buniifolium Hooker et Arnott……………………………….......….96
5.4.1 Estudo do óleo volátil das folhas de Eupatorium buniifolium.........................96
5.4.2 Determinação das atividades biológicas in vitro para os óleos essenciais de
Eupatorium buniifolium................................................................................................100
5.4.2.1 Bioautografia...........................................................................................100
5.4.2.2 Difusão em Disco....................................................................................101
5.4.2.3 Microdiluição em caldo (CIM)................................................................102
5.4.3 Determinação da toxicidade in vivo dos óleos essenciais de Eupatorium
buniifolium.....................................................................................................................103
5.4.3.1 Teste de letalidade com Artemia salina...................................................103
5.4.4 Determinação da atividade antioxidante dos óleos essenciais de Eupatorium
buniifolium pelo Método do DPPH...............................................................................104
6. CONCLUSÕES........................................................................................................105
15
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Propriedades de alguns óleos essenciais.........................................................15
Tabela 2: Dados de toxicidade por Artemia salina........................................................46
Tabela 3: Exsicatas das espécies utilizadas para o estudo dos óleos essenciais.............52
Tabela 4: Microrganismos padrão ATCC utilizados nos testes.....................................56
Tabela 5: Composição das folhas dos óleos voláteis de Baccharidastrum triplinervium
coletadas na primavera e no verão, respectivamente.......................................................66
Tabela 6: Determinação da quantidade de substância ativa dos óleos voláteis de
Baccharidastrum triplinervium pelo método de bioautografia.......................................68
Tabela 7: Resultados obtidos pelo método de difusão em disco para os óleos voláteis de
Baccharidastrum triplinervium.......................................................................................69
Tabela 8: Resultados de CIM, CBM e CFM para os óleos voláteis B. triplinervium....71
Tabela 9: Determinação da concentração letal frente à Artemia salina dos óleos de B.
triplinervium....................................................................................................................72
Tabela 10: Dados físicos dos óleos essenciais de Baccharis pentodonta......................74
Tabela 11: Composição das folhas dos óleos voláteis de Baccharis pentodonta
coletadas no inverno e na primavera...............................................................................76
Tabela 12: Composição dos óleos voláteis de folhas e flores de Baccharis pentodonta
coletadas no verão...........................................................................................................79
Tabela 13: Determinação da quantidade de substância ativa dos óleos voláteis de
Baccharis pentodonta pelo método de bioautografia......................................................81
Tabela 14: Resultados de CIM, CBM e CFM para os óleos voláteis B. pentodonta.....83
Tabela 15: Determinação da concentração letal frente à Artemia salina dos óleos de B.
pentodonta.......................................................................................................................85
Tabela 16: Dados físicos para os óleos essenciais de Pluchea sagittalis.......................87
Tabela 17: Composição dos óleos voláteis de folhas e flores de Pluchea sagittalis
coletadas no verão...........................................................................................................89
16
Tabela 18: Determinação da quantidade de substância ativa dos óleos voláteis de folhas
e flores de Pluchea sagittalis pelo método de bioautografia...........................................91
Tabela 19: Resultados de CIM, CBM e CFM para os óleos voláteis Pluchea
sagittalis...........................................................................................................................93
Tabela 20: Determinação da concentração letal frente à Artemia salina dos óleos de
Pluchea sagittalis............................................................................................................94
Tabela 21: Dados físicos obtidos para os óleos essenciais de Eupatorium
buniifolium.......................................................................................................................96
Tabela 22: Composição dos óleos voláteis das folhas de Eupatorium buniifolium
coletadas no verão e no inverno, respectivamente..........................................................98
Tabela 23: Determinação da quantidade de substância ativa dos óleos voláteis das
folhas de Eupatorium buniifolium coletadas no verão e no inverno, respectivamente,
pelo método de bioautografia........................................................................................100
Tabela 24: Resultados de CIM, CBM e CFM para os óleos voláteis Eupatorium
buniifolium.....................................................................................................................102
Tabela 25: Determinação da concentração letal frente à Artemia salina dos óleos
essenciais das folhas de E. buniifolium, coletadas no verão e no inverno.....................103
17
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Baccharis pentodonta em seu habitat natural...................................................6
Figura 2: Baccharidastrum triplinervium.........................................................................8
Figura 3: Pluchea sagittalis............................................................................................10
Figura 4: Eupatorium buniifolium em seu habitat natural..............................................12
Figura 5: Rotas metabólicas...........................................................................................18
Figura 6: Rota biossintética do mevalonato. (a) rota independente do mevalonato
(deoxixilulose fosfato) (b) para a biossíntese do isopentenil difosfato (IPP) e dimetilalil
difosfato (DMAPP). O fosfato livre é destacado em vermelho e as flechas mais largas
indicam passos que ainda não foram identificados.........................................................24
Figura 7: Localização e mecanismos na célula microbiana que podem ser sítios de ação
dos componentes de óleos voláteis.................................................................................35
Figura 8: Representação esquemática da membrana celular de bactérias gram
positivas...........................................................................................................................36
Figura 9: Representação esquemática da membrana celular de bactérias gram
negativas..........................................................................................................................36
Figura 10: Colocação da CCD na placa de Petri para realização de bioautografia........40
Figura 11: Leitura do teste de difusão em disco. A presença de compostos
antimicrobianos é registrada pela medida do diâmetro dos halos de inibição formados ao
redor dos discos...............................................................................................................42
Figura 12: Cloranfenicol................................................................................................44
Figura 13: Nistatina........................................................................................................45
Figura 14: Aparelho de Clevenger modificado, utilizado na extração dos óleos
essenciais.........................................................................................................................53
Figura 15: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de B. triplinervium coletadas na
primavera (F1). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.........................................................65
Figura 16: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de B.triplinervium coletadas no
verão (F2). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise: T
inicial
=
50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.....................................................................65
18
Figura 17: Teste de bioautografia do óleo volátil de Baccharidastrum triplinervium, F1
e F2 respectivamente, frente à bactéria Escherichia coli................................................68
Figura 18: Teste de difusão em disco do óleo volátil de Baccharidastrum triplinervium
coletada na primavera frente à bactéria Shaphylococcus epidermidis. Foi usado o
revelador TTC para melhor visualização dos resultados.................................................70
Figura 19: Teste de difusão em disco do óleo volátil de Baccharidastrum triplinervium
coletada no verão frente ao fungo Candida dubliniensis. O uso de revelador não foi
necessário.........................................................................................................................70
Figura 20: Resultado do teste de DPPH para o óleo volátil de B. triplinervium coletado
na primavera....................................................................................................................73
Figura 21: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de B. pentodonta coletadas no
inverno (BPF4). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.........................................................75
Figura 22: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de B. pentodonta coletadas na
primavera (BPF5). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.........................................................75
Figura 23: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de B. pentodonta coletadas no
verão (BPF2). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
........................................................78
Figura 24: Perfil cromatográfico do óleo das flores de B. pentodonta coletadas no verão
(BPFl2). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise: T
inicial
= 50
°C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
...........................................................................78
Figura 25: Teste de bioautografia dos óleos voláteis das folhas e flores de Baccharis
pentodonta, coletadas no verão, frente à bactéria Staphylococcus aureus......................82
Figura 26: Teste de difusão em disco do óleo volátil de Baccharis pentodonta coletada
no inverno frente a bactéria Pseudomonas aeruginosa .................................................82
Figura 27: Resultado do teste de DPPH para os óleos voláteis de B. pentodonta
coletados no verão...........................................................................................................86
Figura 28: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de Pluchea sagittalis coletadas no
verão (PSF2). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.........................................................88
Figura 29: Perfil cromatográfico do óleo das flores de Pluchea sagittalis coletadas no
verão (PSFl2). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.........................................................88
19
Figura 30: Teste de bioautografia do óleo volátil de Pluchea sagittalis, folha e flor
respectivamente, frente à bactéria Staphylococcus epidermidis......................................92
Figura 31: Teste de bioautografia do óleo volátil de Pluchea sagittalis, folha e flor
respectivamente, frente à bactéria Pseudomonas aeruginosa.........................................92
Figura 32: Resultado do teste de DPPH para os óleos voláteis de flores e folhas de P.
sagittalis coletadas no verão............................................................................................95
Figura 33: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de E. buniifolium coletadas no
verão (CH1). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise: T
inicial
=
50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
......................................................................97
Figura 34: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de E. buniifolium coletadas no
inverno (CH2). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.........................................................97
Figura 35: Teste de bioautografia do óleo volátil extraído das folhas de E. buniifolium,
coletadas no verão e no inverno, frente à bactéria Bacillus subtilis..............................101
Figura 36: Teste de bioautografia do óleo volátil extraído das folhas de E. buniifolium,
coletadas no verão e no inverno, frente à bactéria Staphylococcus aureus...................101
Figura 37: Resultado do teste de DPPH para o óleo volátil de E. buniifolium coletado
no verão e no inverno. O padrão quercetrina não aparece porque havia outra amostra
abaixo.............................................................................................................................104
20
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1: Biossíntese de isoprenóides e o papel das prenil-transferases em plantas
superiores. IPP: isopentenil difosfato; DMAPP: dimetilalil difosfato; GPP: geranil
difosfato; FPP: farnesil difosfato e GGPP: geranilgeranil difosfato...............................21
Esquema 2: Membros representativos de várias subfamílias de monoterpenos............22
Esquema 3: Reação de redução do TTC, com a formação da formazana......................41
Esquema 4: Mecanismo de ação de antioxidantes primários. Onde: ROO۫ e R۫ – radicais
livres; AH-antioxidante com um átomo de hidrogênio ativo e A۫- radical inerte............48
Esquema 5: Reação do radical livre DPPH com a molécula doadora de H, originando a
forma reduzida DPPH-H.................................................................................................49
21
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Comparação entre as porcentagens dos componentes majoritários
encontrados nas folhas de Baccharidastrum triplinervium coletadas na primavera (F1) e
no verão (F2)...................................................................................................................66
Gráfico 2: Comparação entre os constituintes majoritários dos óleos essenciais das
folhas de Baccharis pentodonta coletadas no inverno (BPF4) e na primavera (BPF5)..77
Gráfico 3: Comparação entre as porcentagens dos componentes majoritários
encontrados nas folhas (BPF2) e flores (BPFl2) de Baccharis pentodonta coletadas no
verão................................................................................................................................80
Gráfico 4: Comparação entre as porcentagens dos componentes majoritários
encontrados nas folhas (PSF2) e flores (PSFl2) de Pluchea sagittalis coletadas no
verão................................................................................................................................90
Gráfico 5: Comparação entre as porcentagens dos componentes majoritários
encontrados nas folhas de Eupatorium buniifolium coletadas no verão (CH1) e no
inverno (CH2)..................................................................................................................99
22
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
OMS Organização Mundial da Saúde
IPP isopentenil difosfato
DMAPP dimetilalil difosfato
GPP geranil difosfato
MVA mevalonato
DXP 1-deoxi-D-xilose-5-fosfato
CG Cromatografia Gasosa
EM Espectrometria de Massas
IE impacto de elétrons
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
CIM Concentração Inibitória Mínima
CBM Concentração Bactericida Mínima
CFM Concentração Fungicida Mínima
CCD Cromatografia em Camada Delgada
UFC Unidades Formadoras de Colônias
DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazila
IK Índice de Kovats
CCSF Coluna Capilar de Sílica Fundida
DIC Detector de Ionização de Chama
ATCC American Type Culture Collection
TCC cloreto de trifenil tetrazólio
DMSO dimetil sulfóxido
Rf Fator de Retenção
23
1. INTRODUÇÃO:
PLANTAS MEDICINAIS:
As plantas medicinais representaram durante séculos, a única fonte de agentes
terapêuticos para o homem. Ainda no século XIX com o advento da Química
Farmacêutica as plantas passaram a representar a primeira fonte de substâncias para o
desenvolvimento de medicamentos
1
, sendo que atualmente aproximadamente 25% dos
fármacos usados nos países industrializados advêm, direta ou indiretamente, de
produtos naturais.
2
O uso dessas plantas medicinais pela população mundial é cada vez mais
significativo, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 80% da população
mundial fez uso de algum tipo de erva na busca do alívio de alguma sintomatologia
dolorosa ou desagradável, sendo 30% por indicação médica.
3
São muitos os fatores que vêm colaborando no desenvolvimento de práticas de
saúde que incluam plantas medicinais, principalmente econômicos e sociais.
3
O elevado potencial das plantas como fonte de novas drogas é ainda pouco
explorado. Estima-se que das 250.000-500.000 espécies existentes somente uma
pequena porcentagem tem sido investigada fitoquimicamente
4
sendo uma fração menor
ainda submetida à screenings biológicos e farmacológicos.
5
O único recurso terapêutico de parcela da população brasileira e de mais de 2/3
da população do planeta, o mercado mundial de fitoterápicos, movimenta cerca de U$$
22 bilhões por ano e vem seduzindo a cada ano mais adeptos nos países desenvolvidos.
Em 2000, o setor faturou bilhões nos EUA e na Europa, sendo a Alemanha o maior
mercado mundial de fitoterápicos. O extrato de Gingko biloba é hoje um dos
1
HOSTETTMANN, K.; QUEIROZ, E. F.; VIEIRA, P. C. A importância das plantas medicinais. In.
Princípios ativos de plantas superiores. São Carlos: UFSCAR, vol. IV, 9-42, 152p, 2003.
2
YUNES, R. A.; FILHO, V. C. Breve análise histórica da química de plantas medicinais: sua importância
na atual concepção do fármaco segundo os paradigmas ocidental e oriental. In. YUNES, R. A;
CALIXTO, J. B. Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna. Chapecó: Argos, 17-44,
532p, 2001.
3
MARTINS, E. R. Plantas Medicinais. Viçosa: Universidade Federal de Viçosa, 220p, 2000.
4
RATES, S. M. K. Plants as source of drugs. Toxicon 39, 603-613, 2001.
5
HAMBURGER, M.; HOSTETTMANN, K. Bioactivity in plants: the link between phytochemistry and
medicine. Phytochemistry 30, 12, 3864-3874, 1991.
24
fitoterápicos mais vendidos no Brasil e no mundo. Nosso país exporta cerca de U$$ 7
milhões em extratos vegetais de alcaçuz, bardana, catuaba, ipeca e quina, porém,
importa uma quantidade considerável de hormônios esteroidais e cosméticos de fonte
natural - um contra-senso para uma nação que possui uma das maiores populações
vegetais do planeta.
6, 7
O panorama para a fitoquímica é muito importante e decisivo para o Brasil, num
futuro próximo, devido sua grande riqueza vegetal ainda sem estudo, e as possibilidades
de desenvolvimento de novos medicamentos tornando-se necessária a implantação de
um programa comprometido, contínuo e eficiente para que se alcance os padrões de
qualidade exigidos pelo mercado internacional
2
, sendo notória a necessidade de
investimentos em pesquisa e desenvolvimento envolvendo plantas medicinais.
8
6
PINTO, A. C.; et al. Produtos Naturais: Atualidades, Desafios e Perspectivas. Química Nova 25, 1, 45-
61, 2002.
7
FERNANDES, L. R.; ANTUNES, A. S. Informações estratégicas sobre plantas medicinais obtidas a
partir de bases de dados em Linha Mimeo. Escola em Química, UFRJ, 2000.
8
MING, L. S. Mesa redonda sobre plantas medicinais no ensino de 3º grau. In. Congresso Sul-brasileiro
de Plantas Medicinais, Maringá- PR, 1, 1999.
25
2. OBJETIVOS:
Os objetivos deste trabalho de acordo com o que foi proposto junto com o
Núcleo de Pesquisa de Produtos Naturais (NPPN) são os seguintes:
Extração de óleos essenciais de diferentes espécies de plantas
pertencentes à família Asteraceae encontradas no Rio Grande do Sul;
Determinação da composição química destes óleos essenciais por
Cromatografia Gasosa e Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas.
Realização de testes de atividade biológica destes óleos tais como
atividade antimicrobiana, citotóxica e antioxidante.
26
3. REVISÃO DE LITERATURA:
3.1 SISTEMÁTICA VEGETAL:
3.1.1 Família Asteraceae:
Apresenta-se como a maior família das Angiospermas, com cerca de 1100
gêneros e 25.000 espécies.
9
São plantas de hábito variado, ervas, arbustos, trepadeiras ou excepcionalmente
árvores. A grande maioria da família é formada por plantas de pequeno porte.
9,10
São
encontradas em todos os tipos de habitats, mas principalmente nas regiões tropicais
montanhosas da América do Sul.
9
As folhas são variadas, inteiras ou fendidas, alternas ou opostas, latescentes ou
não. As flores, radiais ou zigomorfas até bilabiadas, hermafroditas ou de sexo separado
podendo estar na mesma inflorescência ou em plantas dióicas. São pentâmeras com
cálice profundamente modificado transformado em papilho e servindo à disseminação
do fruto.
10
Plantas desta família são extensivamente estudadas quanto a sua composição
química e atividade biológica levando ao desenvolvimento de novos fármacos,
inseticidas, entre outros.
9
Entre as muitas plantas da família Asteraceae utilizadas na medicina popular está
a Artemisia absinthuim, uma erva de sabor amargo conhecida popularmente como
losna, com benéficas funções digestivas, usada na fabricação do absinto.
9,10
A família Asteraceae representa grande importância para a medicina popular no
tratamento e prevenção de várias doenças.
11
9
VERDI, L. G. Gênero Baccharis (ASTERACEAE) aspectos químicos, econômicos e biológicos.
Química Nova 28, 1, 85-94, 2005.
10
JOLY, A. B. Botânica: introdução à taxonomia vegetal. Companhia Ed. Nacional, São Paulo-SP, 777p,
1998.
11
HARBORNE, J. B.; WILLIANS, C. A. Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry 55,
481-504, 2000.
27
Muitos trabalhos científicos vêm sendo realizados com espécies desta família
como o isolamento de uma variedade de metabólitos secundários, dos quais se destacam
os flavonóides como importantes marcadores quimiotaxonômicos.
9,12
Os gêneros Vernonia, Eupatorium, Baccharis, Calea, Stevia, Coniza entre outros
são representantes da família Asteraceae.
9
3.1.1.1 GÊNERO Baccharis:
O gênero Baccharis inclui mais de 500 espécies distribuídas principalmente no
Brasil, Argentina, Colômbia, Chile e México, ocupando regiões mais elevadas.
9
No
Brasil ocorrem cerca de 120 espécies, concentradas na região Sul, sendo o Paraná
considerado o centro de dispersão no país.
13
As espécies deste gênero são geralmente arbustos como a carqueja, a vassoura e
a vassourinha tendo em média 0,5 a 4,0 metros de altura. Propagam-se por sementes e
estaquias a partir de plantas adultas.
14
O gênero Baccharis apresenta elevado valor sócio-econômico
9
,
sendo
potencialmente indicado como fonte de óleo volátil de uso industrial. B.
draccunculifolia L. tem seu óleo usado em perfumaria, B. trimera L. possui óleo de uso
terapêutico sem efeitos tóxicos, B. articulata (Lam.) Pers tem óleo explorado
comercialmente e B. genistelloides Pers, fornece óleo utilizado como droga anti-
reumática.
15
São utilizadas principalmente como chás com indicação para males do
estômago, fígado, anemia, inflamações, diabetes e doenças da próstata.
16,
17,
18
12
EMERENCIANO, V. P; et al. Flavonoids as chemotaxonomic markers for Asteraceae. Biochemical
Systematics and Ecology 29, 947-957, 2001.
13
BARROSO, G. M. Sistemática das angiospermas do Brasil. Imprensa Universitária da UFV, Viçosa-
MG, vol. 3, 326p, 1991.
14
CASTRO, H. G. DE, FERREIRA, F. A. Contribuição ao estudo das plantas
medicinais: carqueja. Viçosa: Suprema, 158p., 2000.
15
SÁ, M. F. A. Estudo anatômico e ensaios fitoquímicos de Baccharis myriochephala D. L. carqueja.
Dissertação de Mestrado, UFRJ, 91p, 1992.
16
KORBES, C. V. Manual de plantas medicinais, Grafit: Francisco Beltrão-PR, 1995.
17
FRANCO, I. J. Ervas e plantas: a medicina dos simples. Imprimar: Chapecó-SC, 1995.
18
CORRÊA, M. P. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Imprensa Nacional,
Rio de Janeiro, vol. I, 74p, 1984.
28
Em sua fitoquímica se destaca a ocorrência de flavonóides, diterpenos e
triterpenos
9
, saponinas e resinas
14
, sendo nitidamente observado maior acúmulo de
flavonas, flavonóis e diterpenos labdanos e clerodanos.
9
Baccharis pentodonta Malme
19
:
Planta distribuída geograficamente de São Paulo até o Rio Grande do Sul. É um
arbusto com xilópio, do qual saem vários caules (Figura 1).
Figura 1: Baccharis pentodonta em seu habitat natural
Folhas sésseis oblongo-cuneiformes, coriáceas, glabras, densamente glanduloso-
pontuadas na página inferior, com margens inteiras, unidenteadas ou de 3-5-7
denteadas, com dentes patentes, com 6-20 mm de comprimento, e 1,5 m de largura.
Os capítulos são sésseis, de 3-6 ordenados em espigas curtas, dispostos na
extremidade de ramos folhosos. Capítulos femininos com invólucro de mais ou menos
5-6 m de altura e 2 m de diâmetro, com 3 séries de brácteas involucrais, com 4-5 flores.
Capítulo masculino com invólucro de mais ou menos 3 m de comprimento, e 3mm de
diâmetro, com 5 flores.
19
BUENO, L. O.; BARROSO, G. M. Compostas 5. SUBTRIBO: BACCHARIDINAE. In: Flora Ilustrada
Catarinense, I Parte As Plantas, Monografia Completa, 304 páginas, Itajaí-SC, 2002.
29
Esta planta florece nos meses de setembro e fevereiro, frutificando logo em
seguida. Aquênios com 10 estrias.
Sinonímias: Baccharis gracillima Heering et Dusén
Baccharis pluridentata Heering
Nomes populares: vassoura
Usos populares: não registrados na literatura examinada.
Não há estudos sobre esta planta nem registro de seu uso.
3.1.1.2 GÊNERO Baccharidastrum:
19
Este gênero recebeu esta denominação devido a grande semelhança das espécies
deste gênero com as espécies do gênero Baccharis.
Ocorrem espécies deste gênero no Brasil, Paraguai, Uruguai e nordeste da
Argentina. No Rio Grande do Sul e em Santa Catarina está representado por duas
espécies muito afins, distintas, principalmente pela forma das folhas B. triplinervium e
B. argutm; a primeira possui folhas ovado-lanceoladas, com 6-8 cm de comprimento e
cerca de 3 cm de largura enquanto a segunda tem folhas linear-lanceoladas, com 6-13
cm de comprimento e cerca de 0,2 a 2 cm de largura.
Representantes do gênero Baccharidastrum apresentam-se como arbustos
glutinosos, com 1-2 m de altura, folhas alternas, trinérveas, de ovado-lanceoladas a
linear-lanceoladas. Flores femininas dispostas em muitas séries. Corola das flores
femininas tubulosas filiformes, membranáceas, de ápice denteado. Estilete longamente
exserto do tubo da corola, dividido em dois ramos curtos. Flores masculinas dispostas
em 2-6, localizadas na porção central do receptáculo. Corola da flor masculina tubulosa,
dividida em lacínios triangulares curtos. Estilete e tubo estaminal ultrapassando um
pouco do comprimento do tubo da corola. Pápus constituído de cerdas finas e longas,
sem espessamento apical.
30
Baccharidastrum triplinervium (Less.) Cabrera:
Baccharidastrum triplinervium ocorre no Brasil, Paraguai, Uruguai e nordeste da
Argentina até o delta e as margens do rio da Plata.
20
No Brasil, preferencialmente no
Rio Grande do Sul, Paraná, Santa Catarina e Minas Gerais.
19
Ocupa áreas de savana (campos naturais), capões e florestas secundárias, sempre
associada com solos rasos. Sua ocorrência parece ser muito esparsa.
19
A spécie estudada
está representada na Figura 2.
Figura 2: Baccharidastrum triplinervium
Sinonímias:
19,20
Baccharis pseudoserrulata I. L. Teodoro;
Baccharis serrulata DC., hom. Illeg;
Baccharis vulneraria Baker;
Conyza triplinervia Less.
Nomes populares: Grandiúva-de-cavalo
20
, erva-santa, erva-de-sant’ana.
19
Usos populares: antisséptico e abortivo.
21
20
LANGOHR, I. M.; GAVA, A.; BARROS, C. S. L. Intoxicação por Baccharidastrum triplinervium
(Asteraceae) em bovinos. Pesquisa Veterinária Brasileira 25, 4, 235-238, 2005
21
REITZ, PR, KLEIN, RM “O reino vegetal do Rio do Sul”, Sellowia – Anais
Botânicos do Herbário
Barbosa Rodrigues 16, 9-118, 1964.
31
Suas inflorescências são procuradas por abelhas nativas e exóticas,
caracterizando grande produtividade de néctar em suas flores.
19
Subarbusto de 1,5 a 2,0 m de altura, pouco ramificado. Folhas alternadas,
trinervadas, ovado-lanceoladas, de 6-8 cm de comprimento por 1,3-4 cm de largura. Os
capítulos são muito numerosos, dispostos em densas cimas corimbiformes. As flores são
dimorfas, sendo as marginais multisseriadas, numerosas, femininas, com corolas
filiformes curtas, e as do disco somente em número de 2-6, masculinas.
19,20
Há relatos de intoxicação causada por esta planta em bovinos do norte do
Paraná.
19,20
3.1.1.3 GÊNERO Pluchea:
O gênero Pluchea apresenta aproximadamente 40-80 espécies, que crescem nas
regiões frias de todo globo.
22
A maioria das plantas deste gênero se distribui no continente Americano e em
partes da África, Ásia e Europa.
23
Ervas perenes ou arbustos, às vezes aromáticas, geralmente pubescentes tendo às
vezes tricomas glandulares. Folhas simples, alternas, inteiras, dentadas ou serradas,
pecioladas ou sésseis com as bases amplexicaules. Flores periféricas pistiladas e corola
filiforme. Brácteas umbricadas frequentemente de cor púrpura, hermafroditas e em
pequena quantidade. Frutos aquênios e cilíndricos.
23
Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera:
Erva originária do continente Americano e muito freqüente nas regiões Sul e
Sudeste do Brasil.
24
Também cresce em regiões úmidas do noroeste Argentino e
Paraguaio.
22
Pluchea sagittalis esta representada na Figura 3.
22
BÜRGER, M. E. Estudo Farmacológico do extrato da Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera (Compositae)
sobre o trato gastrointestinal. Dissertação de Mestrado, UFSM, 1995.
23
VILLASEÑOR, J. L. y VILLARREAL, J. A. El género Pluchea (família Asteraceae, tribu Plucheae)
em México. Revista Mexicana de Biodiversidad 77, 59-65, 2006.
24
LORENZI, H; MATOS, F. J. A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas cultivadas. Instituto
Plantarum, Nova Odessa, São Paulo, SP, 2002
32
Figura 3 Pluchea sagittalis
Subarbusto anual ou perene dependendo das condições, ereto, aromático, de
caule herbáceo, cilíndrico, multialado, pouco ramificado com 30 a 90 cm de altura.
24
Folhas simples, alternas, rígido-pubescentes, com estipulas se estendendo pelo
caule, de 3 a 5 cm de comprimento.
22,24
Flores lilacíneas, em capítulos oblongos reunidos em panículas corimbiformes
terminais
24
, sendo as marginais muito numerosas.
22
Os frutos são do tipo aquênio muito
pequenos.
24
Sinonímias:
22,24
Conyza sagittalis Lam
Baccharis sagittalis
Nomes populares:
22,24
lucera, erva-lucera, lucero, quitoco, madrecravo,
tabacarana
Usos populares: peitoral, carminativa e estomacal, com indicações para o
tratamento caseiro de problemas de digestão, embaraços gástricos, flatulências,
dispepsias nervosas, inflamações do útero, rins e bexiga, reumatismo, bronquite e
resfriado e como estimulante do crescimento capilar.
24
33
Apesar de seu amplo uso popular, existem poucos estudos sobre a composição
química e as propriedades farmacológicas desta planta.
24
Os poucos estudos que
existem, revelaram que a espécie apresenta elevado conteúdo de ácidos cafeoilquinicos,
entre eles os ácidos isoclorogênico, clorogênico e cafêico. Do extrato clorofórmico
foram isolados flavonóides metilados.
22
Nesta espécie também já foram identificados acetilenos, taninos, esteróides,
fitosteróis, saponinas e terpenóides. No óleo essencial foram identificados α-pineno,
canfeno, β-pineno, limoneno, 1,8-cineol, p-cimeno, linalol, cariofileno, α-terpineol e
borneol, entre outros componentes.
22
3.1.1.4 GÊNERO Eupatorium:
O gênero Eupatorium pertence à tribo Eupatorieae, uma das 13 tribos da família
Asteraceae.
25
O gênero vem sendo revisado e deve conter em torno de 45 espécies
taxonômicas distribuídas na América do Norte e Ásia.
25,26
As espécies de Eupatorium
mostram exuberante desenvolvimento, com ação alelopática tendo se tornado uma das
principais ervas daninhas de diversas partes do mundo. O crescimento rápido dos
membros deste gênero está perturbando o ecossistema, se distribuindo nos pastos e até
substituindo as florestas. Adicionalmente, essa enorme quantidade de Eupatorium não é
útil em operações de agricultura e de pecuária animal a não ser que algumas espécies
não conhecidas exibam interações adversas com animais domésticos e seres humanos.
25
Muitos trabalhos de toxicologia e determinação das propriedades medicinais de
extratos de plantas e compostos bioativos do gênero Eupatorium já foram
publicados.
27,28
Muitos metabólitos secundários com interesse farmacológico foram
isolados deste gênero, entre eles, lactonas sesquiterpênicas
29
, terpenos
30
,
25
LORENZO, D. et al. Application of Multidimensional Gás Chromatography to the Enantioselective
Characterisation of the Essential Oil of Eupatorium buniifolium Hooker et Arnott. Phytochemical
Analysis 16, 39-44, 2005.
26
HERZ, W. Chemistry of the Eupatoriinae. Biochemical Systens Ecology, 29, 1115-1137, 2001.
27
BEIER R.C.; NORMAN J.O. The toxic factor in white snakeroot: identity, analysis
and prevention. Veterinary & Human Toxicology 32, 81–88, 1990.
28
SHARMA O. P., et al . A Review of the toxicosis and biological properties of the genus Eupatorium.
Natural Toxins, 6, 1–14, 1998.
29
RÜCKER G, et al Allergenic sesquiterpene lactones from Eupatorium cannabinum L.
and Kaunia rufescens (Lund ex de Candolle). Natural Toxins 5, 223–227, 1997.
30
ZYGADLO, J. A.; MAESTRI, M.; GUZMÁN, C.A Comparative study of the essential oils from three
species of Eupatorium. Journal Flavors and Fragrances 11, 153–155, 1998.
34
flavonóides
31,32,33
, compostos fenólicos e acetilênicos
34
, triterpenos e alcalóides com
atividades citotóxica, anti-tumoral, antimicrobiana, antioxidante e antiinflamatória.
25
Eupatorium buniifolium Hooker et Arnott:
Eupatorium buniifolium é uma espécie da América do Sul que se estende do sul
da Bolívia passando por Brasil, Paraguai e Uruguai até a porção centro-norte da
Argentina. Cresce como uma erva daninha dentro dos campos (Figura 4).
Figura 4: Eupatorium buniifolium em seu habitat natural
31
MUSCHIETTI L.; MARTINO, V.; COUSSIO, J. Compuestos polifenólicos aislados de Eupatorium
buniifolium. An Asoc. Quím Argentina 78, 329–331, 1990.
32
MUSCHIETTI, L. et al. 2′-Oxygenated flavonoids from Eupatorium buniifolium. Planta Med Suppl 59,
A606, 1993.
33
MUSCHIETTI, L. et al. 5,7,5′- Trihydroxy-3,6,2′,4′-tetramethoxyflavone from Eupatorium
buniifolium. Phytochemistry, 36, 1085–1086, 1994.
34
CAULA, S. A.; et al. Polyphenols isolated from Eupatorium buniifolium. Rev Latinoamer Quim 22, 1–
3, 1991.
35
Sinonímias: Acanthostyles saucechicoënse (Hieron) R. M. King & H. Rob.
Eupatorium saucechicoënse Hieron.
Nomes populares:
25
chilca, romerilo, romero, romero colorado.
Usos populares: hepatoprotetora e desinfetante.
35
É empregada na medicina popular na forma de tintura com propriedades
hepatoprotetora e desinfetante.
35
Seu extrato etanólico tem atividade contra o vírus do
herpes simplex I.
36
Outras atividades tais como antimicrobianas
37
, antioxidante
38
,
antiinflamatória
39
, inibição da DNA e RNApolimerase e atividade contra o vírus HIV-
1
40
, além de atividade citotóxica
41
são descritas para os extratos desta planta.
Estudos fitoquímicos da espécie Argentina relatam o isolamento de triterpenos,
6-metoxiflavonóides e 2′ - flavonóides oxigenados
32,33
, ácido hidróxicinamico e seus
derivados
31,33
e diterpenóides do tipo ent-labdanos.
42
35
ZARDINI, E. Etnobotanica de compuestas Argentinas com especial referencia a su
uso farmacologico. Acta Farm Bonaerense 3, 77–95, 1984.
36
CERIATTI, F. S.; et al Search for antiviral activity of certain medicinal plants from Cordoba,
Argentina. Zanon Rev Latinoamer Microbiol 41, 59–62, 1999.
37
PENNA, C. A.; et al. Antibacterialand antifungal activities of some argentinean plants. Fitoterapia 65,
172–174, 1994.
38
PAYA, M.; et al. Inhibitory effects of various extracts of Argentine plant species on free-radical-
mediated reactions and human neutrophil functions. Phytother Res 10, 228–232, 1996
39
MUSCHIETTI, L.; et al Phenolic compounds with antiinflammatory activity from Eupatorium
buniifolium. Planta Méd 67, 743–744, 2001.
40
HNATYSZYN, O.; et al. Argentine plant extracts active against polymeras and ribonuclease H
activities of HIV-1 reverse transcriptase. Phytother Res 13, 206–209, 1999.
41
MONGELLI, E.; et al.. Screening of argentine medicinal plants using the brine
shrimp microwell cytotoxicity assay. Int J Pharmacog 34, 249– 254, 1996
42
CARRERAS, C. R.; et al. Ent-labdanes in eupatorium buniifolium. Phytochemistry, 48, 1931-1934,
1998.
36
3.2 ÓLEOS ESSENCIAIS:
O uso de óleos essenciais como agentes medicinais é conhecido desde a remota
antiguidade.
43
Os óleos essenciais são geralmente produzidos por estruturas secretoras
especializadas localizadas em partes especificas da planta ou em toda planta.
44
São
assim denominados devido sua composição lipofílica que se apresenta quimicamente
diferente da composição glicerídica dos verdadeiros óleos e gorduras.
43
São também chamados óleos voláteis
45
; metabólitos secundários geralmente
formados por unidades do isopreno.
46
São conhecidos aproximadamente 3000 óleos
essenciais, sendo que apenas 10% são comercialmente importantes, destinados
principalmente para o mercado de fragrâncias
45,46,47
e como flavours. Suas propriedades
antimicrobianas
45,46,47,48
também são bem conhecidas e revisadas. Hoje estes compostos
são também reconhecidos por suas propriedades antivirais
47,48,49
, antimicóticas
50
,
antiparasitárias
51,52
, inseticida
47,53
, anti-câncer
49
, antioxidante
47,49,54
e
antiinflamatória
47,48
, entre outras. Algumas propriedades dos óleos essenciais estão na
Tabela 1.
43
SIANI, A. C.; et al Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, 76, 38-43, 2000.
44
SPITZER, V.; SIMÕES, C. M. O. Óleos Voláteis. In SIMOES, C. M. O.; et al. Farmacognosia: da
planta ao medicamento. 5ªed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFC, p467-495,
1102p, 2004.
45
BURT, S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods-a review.
International J. of Food Microbiology 94, 223-253, 2004.
46
COWAN, M. M. Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical Microbiology Reviews, 12, 4, 564-
582, 1999.
47
PRABUSSENIVASAN, S.; et al. In vitro antibacterial activity of some plant essential oils. BMC
Complementary and Alternative Medicine, 6, 39, 1-8, 2006.
48
LEE, S. B. he antimicrobial activity of essential oil from Dracocephalum foetidum against pathogenic
microorganisms. The Journal of Microbiology, 45, 1, 53-57, 2007.
49
EDRIS, A. E. Pharmaceutical and therapeutic potentials of essential oils and their individual volatile
constituents: a review. Phytotherapy Research 21, 4, 308-323, 2007.
50
KOSALEC, I, et al. Antifungal activity of fluid extract ans essential oil from anise fruits (Pimpinella
anisum L., Apiaceae). Acta Pharm. 55, 4, 377-385, 2005.
51
PANDEY, R.; et al. Essential oil compounds as potent source of nematicidal compounds. Journal of
Phytopathology, 148 (7-8), 501-502, 2000.
52
MACDONALD, D. et al. Ascaridole-less infusions of Chenopodium ambrosioides contaim a
nematocide (s) that is (are) not toxic to mammalian smooth muscle. Journal of Ethnopharmacolçogy, 92,
215-221, 2004.
53
ASLAN, I. et al Toxicity of essential oil vapours to two greenhouse pests, Tetranychus urticae Koch
and Bemisia tabaci Genn. Industrial Crops and Products 19, 167-173, 2004
54
VARDAR-ÜNLII, G.; et al. Antimicrobial and Antioxidant Activity of the Essential Oil and Methanol
Extracts of Thymus pectinatus Fisch. Et Mey. Var. pectinatus (Lamiaceae). Journal of Agricultural and
Food Chemistry 51, 63-67, 2003.
37
Tabela 1: Propriedades de alguns óleos essenciais.
Os óleos essenciais são misturas complexas de metabólitos secundários
principalmente constituídos de mono e sesquiterpenos incluindo carboidratos, álcoois,
éteres, aldeídos e cetonas.
48
Várias técnicas podem ser empregadas na extração de óleos essenciais, como a
hidrodestilação, microdestilação por arraste a vapor d’água, extração com solvente
orgânico ou com CO
2
líquido.
57,58
O método de extração deve ser escolhido de acordo com as características da
espécie. O processo mais utilizado nas extrações é o arraste a vapor d’água, que
apresenta bons rendimentos, facilidade de execução e baixo custo.
58
A hidrodestilação também é um método de extração muito comum em pequena
escala, fazendo-se uso do aparelho Clevenger.
57
55
NADKARNI, K. M. Indian Meteria Medica. Popular Prakashan, Bombay, India;
228-231, 1976.
56
RASTOGI, R. P., MEHROTRA, B. N.: Glossary of Indian Medicinal Plants. National Institute of
science communication, New Delhi, India; 2002.
57
SIMIONATTO, E. Estudo dos constituintes químicos de óleos voláteis de plantas medicinais do Rio
Grande do Sul: isolamento, determinação e modificação estrutural e atividade biológica. Tese de
Doutorado, UFSM, 2004
58
CASTRO, D. M. Caracterização isozimática da anatomia foliar, do óleo essencial e germinação de
Lleonuros sibiricus. Dissertação de Mestrado, Universidade Federal de Viçosa (UFV), 1998.
Nome comum Nome botânico
Propriedades
55, 56
Erva-doce
Pimpinella anisum (Umbelliferae)
Carminativa, estimulante, expectorante, condimento e
agente flavorizante.
Cânfora
Cinnamomum camphora (Lauraceae)
Rubescente e agente cosmético.
Citronela
Cymbopogon nardus (Gramineae)
Perfumaria, repelente e agente flavorizante.
Cravo-da-índia
Eugenia caryophyllus (Myrtaceae)
Analgésico dental, carminativo, estimulante e anti-séptico.
Eucalipto
Eucalyptus globulus (Myrtaceae)
Anti-séptico, expectorante e contra tosse e irritação.
Gerânio
Pelargonium graveolens (Geraniaceae)
Agente flavorizante e estimulante.
Lavanda
Lavandula angustifolia (Labiatae)
Estimulante e agente flavorizante.
Limão
Citrus limon (Rutaceae)
Carminativo, estimulante, perfume e agente flavorizante.
Capim limão
Cymbopogon citratus (Graminae)
Agente flavorizante, anti-séptico e desodorante.
Laranja amarga
Citrus aurantium (Rutaceae)
Estomáquico, carminativo e agente flavorizante.
Noz moscada
Myristica fragrans (Myristicaceae)
Estimulante, anti-reumático e carminativo.
Laranja
Citrus sinensis (Rutaceae)
Estomáquico, carminativo e agente flavorizante.
Hortelã
Mentha piperita (Labiatae)
Digestivo, estimulante e tônico.
Alecrim
Rosmarinus officinalis (Labiatae)
Carminativo, estimulante e agente flavorizante.
Alfavaca
Ocimum sanctum (Labiatae)
Antibacteriano, inseticida, estimulante, estomáquico e
diaforético.
Vetiver
Vetiveria zizanioides (Graminae)
Estimulante, refrigerante, agente flavorizante e
estomáquico.
38
A composição do óleo volátil de uma planta é determinada geneticamente sendo
geralmente específica para um determinado órgão e característica para seu estágio de
desenvolvimento, mas as condições ambientais são capazes de levar a significativas
variações. No coentro (Coriandrum sativum) o teor de linalol é 50% maior nos frutos
maduros que nos verdes; na hortelã-pimenta (Mentha x piperita L.) quando cultivada
em períodos de dias longos e noites curtas apresenta um maior rendimento de óleo com
maior teor de mentofurano, enquanto que as noites frias favorecem a formação de
mentol.
44
3.2.1 Usos e propriedades dos óleos essenciais:
Pesquisas do ano de 1992 indicam aumento regular no mercado de produtos
naturais, apresentando média anual de crescimento em torno de 22% nos setores
industriais de perfumaria, aromatizantes para produtos alimentícios e em setores de
processamento de óleos essenciais.
59
O principal uso dos óleos essenciais ocorre como flavorizante em alimentos, nos
perfumes (fragrâncias e pós barba) e na indústria farmacêutica (com propriedades
biológicas) além de representarem pouco mais de 2% do mercado de aromaterapia.
45
Esses óleos possuem uma variedade de efeitos farmacológicos, incluindo a
atividade antimicrobiana
45,47,48
, sem dúvida, sua maior aplicação.
43
Entre outras
atividades farmacológicas específicas
43
deve-se mencionar as atividades inibidoras do
crescimento de células neoplásicas
60
e de alguns vírus, como herpes simplex tipo I
61
,
influenza e HIV
62
, entre outras.
59
VERLET, N. The world herbs and essential oils economy analysis of the médium term development.
Acta Horticultural 306, 474-481, 1992.
60
SAENS, M. T.;et al. Cytostatic activity of some essential oils against HEP-2 cells. Fármaco 51, 539-
540, 1996.
61
SIDDIQUI, Y. M.; et al. Effect of essential oils on the enveloped viruses: antiviral activity of orégano
and clove oils on Herpes simplex vírus type I and New-castle disease vírus. Med. Sc. Res. 24, 185-186,
1996.
62
HAYASHI, K.; et al. Virucidal effects of the steam distillate from Houttuynia cordata and its
components on HSV-1, Influenza vírus and HIV. Planta Medica 61, 237-241, 1994.
39
3.2.2 Importância econômica dos óleos essenciais:
Óleos essenciais são recursos renováveis, e os compostos neles encontrados são
importantes na elaboração de produtos naturais nas indústrias
63
. Sua crescente utilização
nas indústrias alimentícia, cosmética e farmacêutica e o cultivo de espécies aromáticas
para a obtenção de óleos voláteis constituem importantes atividades econômicas.
44
Os países em desenvolvimento tem sido a principal fonte de óleos brutos devido
à existência de políticas de incentivo a diversificação da produção e, também, pelo
incremento do volume de exportações e redução das importações procurando equilibrar
a balança comercial.
64
A produção mundial de óleos essenciais, em 1993, era de
aproximadamente 45.000 toneladas, avaliadas em U$$ 700 milhões. Estima-se que a
produção brasileira correspondia, naquele ano, a 13,15% da produção mundial, em
toneladas.
64
O maior problema no desenvolvimento das indústrias produtoras de óleo é a
grande concorrência com os similares sintéticos.
64
3.2.3 Metabolismo secundário:
65,66,67
Uma das características dos seres vivos é a presença de atividade metabólica. O
metabolismo nada mais é do que o conjunto de reações químicas que ocorrem no
interior das células. No caso das células vegetais, o metabolismo costuma ser dividido
em primário e secundário.
Entende-se por metabolismo primário o conjunto de processos metabólicos que
desempenham uma função essencial no vegetal, tais como a fotossíntese, a respiração e
o transporte de solutos. Os compostos envolvidos no metabolismo primário possuem
63
CHARLES, D. J.; SIMON, J. E.. Comparison of extraction methods for the rapid determination of
essential oil content and composition of basil. Journal of the American Society for Horticultural Science
115, 3, 458-462, 1990.
64
VERLET, N. Overview of the essential oils economy. Acta Horticultural 333, 65-67, 1993.
65
SANTOS, R.I. Metabolismo básico de origem dos metabólitos secundários. In: SIMOES, C. M. O.; et
al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5ª ed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da
UFRGS/Editora da UFC, p 467-495, 1102p, 2004.
66
TAIZ, L.; ZEIGER, E. Plant Physiology. 2 ed. Sinauer Associates, Inc., Publishers,
Sunderland, Massachusetts, 792 p, 1998.
67
PERES, L. E. P. Metabolismo Secundário. Escola Superior de Agricultura Luiz de
Queiroz, USP
40
uma distribuição universal nas plantas. Esse é o caso dos aminoácidos, dos
nucleotídeos, dos lipídios, carboidratos e da clorofila.
Em contrapartida, o metabolismo secundário origina compostos que não
possuem uma distribuição universal, pois não são necessários para todas as plantas.
Embora o metabolismo secundário nem sempre seja necessário para que uma
planta complete seu ciclo de vida, ele desempenha um papel importante na interação das
plantas com o meio ambiente. Produtos secundários possuem um papel contra a
herbivoria, ataque de patógenos, competição entre plantas e atração de organismos
benéficos como polinizadores, dispersores de semente e microorganismos simbiontes.
Contudo, produtos secundários também possuem ação protetora em relação a estresses
abióticos, como aqueles associados com mudanças de temperatura, conteúdo de água,
níveis de luz, exposição a UV e deficiência de nutrientes minerais.
Existem três grandes grupos de metabólitos secundários: terpenos, compostos
fenólicos e compostos nitrogenados. Os terpenos são feitos a partir do ácido mevalônico
(no citoplasma) ou do piruvato e 3-fosfoglicerato (no cloroplasto). Os compostos
fenólicos são derivados do ácido chiquímico ou ácido acético. Por fim, os compostos
nitrogenados como alcalóides são derivados de aminoácidos aromáticos (triptofano,
tirosina), os quais são derivados do ácido chiquímico, e também de aminoácidos
alifáticos (ornitina, lisina)(Figura 5).
Figura 5: Rotas metabólicas
41
3.2.3.1 Biogênese:
Os componentes que se encontram em maior concentração nos óleos essenciais
são importantes na caracterização das propriedades deste óleo tanto quanto os
componentes minoritários os quais também apresentam significativa importância, sendo
normalmente produzidos no final das rotas metabólicas.
68
A maioria dos óleos essenciais se apresenta naturalmente com uma grande
variedade de constituintes que podem ser divididos em duas classes, com base na
biossíntese de origem: (a) derivados dos terpenóides, formados pela via do mevalonato
ou pela via do DPX (1-deoxi-D-xilose-5-fosfato) e (b) fenilpropanóides, compostos
aromáticos formados pela via do ácido chiquímico; sendo os terpenos derivados do
isopreno (unidade ramificada de cinco carbonos) o grupo mais importante.
43
Os terpenóides ou isoprenóides são uma larga e diversa família de produtos
naturais possuindo diversas estruturas moleculares desde lineares a policíclicas, como
hemiterpenos de cinco carbonos à borracha natural, com mais de 1000 unidades
isoprênicas.
69,70
Os terpenóides são sintetizados por condensações de unidades do isopreno
(dimetilalil difosfato e isopentil difosfato) e são classificados pelo número de unidades
isoprênicas que possuem em sua estrutura. Monoterpenos são da classe C
10
dos
isoprenóides e são os constituintes mais freqüentes nos óleos voláteis conferindo aroma
e sabor característico.
70
Os principais terpenóides encontrados nos óleos essenciais podem ser divididos
em mono, di e sesquiterpenos.
Os monoterpenos têm intensa aplicação industrial como flavorizantes, em
perfumes, inseticidas, medicamentos tópicos e como agentes antimicrobianos e
anticarcinogênicos em alimentos. São importantes devido sua baixa toxicidade aos
vertebrados além de serem rapidamente catabolizados por microrganismos e não
persistirem no ambiente.
70
68
WATERMAN, P. G. The chemistry of volatile oils. In: HAY, R. K. M.; WATERMAN, P. G. Volatile
oil crops: their biology, biochemistry and production. Harlow: Congman Scientific, Tchnical, 185p,
1993.
69
DUDAVERA, N. et al. Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiology 135, 1893-1902, 2004.
70
MAHMOUND, S.S.; CROTEAU, R.B. Strategies for transgenic manipulation of
monoterpene biosynthesis in plants. Trends in Plant Science, 8, 1360-1385, 2002.
42
Estes isoprenóides ou seus derivados estão envolvidos em inúmeros processos
biológicos como o transporte de elétrons (ubiquinona), a fotossíntese (plastoquinona,
clorofila, caretenóides), respostas de defesa da planta, regulação hormonal (esteróis) e
fluidez da membrana (esteróis e carotenóis).
71,72
Vários terpenóides tem atraído importante interesse comercial para
farmacêuticos e nutracêuticos. Assim o Paclitaxel (Taxol), um diterpeno está bem
estabelecido como o maior agente citostático do mercado. O licopeno foi recentemente
registrado como preventivo contra câncer.
73
Todos os terpenóides são biossintetizados a partir de dois precursores:
isopentenil difosfato (IPP) e dimetilalil difosfato (DMAPP) (Esquema 1).
70,73
Os terpenos regulares, a maioria, são formados pela adição seqüencial tipo
“cabeça-cauda” do DMAPP e do IPP e os irregulares, minoria, pela associação não
“cabeça-cauda” de unidades construtoras ou pelo rearranjo de estruturas regulares.
70
A adição seqüencial “cabeça-cauda” de unidades de IPP e DMAPP inicialmnte
gera geranil difosfato (GPP, C
10
), farnesil difosfato (FPP, C
15
) e geranilgeranil difosfato
(GGPP, C
20
) os quais são precursores lineares da maioria das classes dos terpenóides.
70
71
BICK, J.A.; LANGE, B.M. Metabolic cross talk between cytosolic and plastidial pathways of
isoprenoid biosynthesis: unidirectional transport of intermediates across the chloroplast envelope
membrane. Archives of Biochemistry and Biophysics, 415, 146-154, 2003.
72
WANKE, M.; TUDEK-S. K.; SWIEZEWSKA, E. Isoprenoid biosynthesis via 1-deoxi-D-xylulose 5-
phosphate/2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (DOXP/MEP) pathway. Acta Biochimica Polonica, 48,
3, 663-671, 2001.
73
EISENREICH, W; ROHDICH, F.; BACHER, A. Deoxyxylulose phosphate pathway to terpenoids.
Trends in Plant Science, 6, 2, 78-84, 2001
43
Esquema 1: Biossíntese de isoprenóides e o papel das prenil-transferases em plantas
superiores. IPP: isopentenil difosfato; DMAPP: dimetilalil difosfato; GPP: geranil
difosfato; FPP: farnesil difosfato e GGPP: geranilgeranil difosfato.
70
Os monoterpenos regulares são exclusivamente derivados do GPP, o qual é
frequentemente ciclizado para produção do esqueleto principal de várias subfamílias de
monoterpenos; relativamente poucos monoterpenos como linalol, geraniol e ocimeno
são acíclicos. Os monoterpenos p-mentano característico nas mentas sai
ciclohexanóides, entretanto, todos os outros grupos maiores como borano, canfeno,
fenchano, careno e tujeno tem esqueletos carbônicos bicíclicos.
Muitos monoterpenos (Esquema 2) são produzidos por modificação de um
composto inicial derivado do GPP.
44
Canfora
O
OH
Isoborneol
O
Fenchona
3-Careno 4-Caranol
OH
5-Carenol
OH
Limoneno
O
Carvona
OH
Mentol
O
-Pineno
-Pineno
Verbenona
-Tujeno Sabineno
Sabineno hidrato
OH
OH
OH
Geraniol
cis-Ocimeno Linalol
Alifaticos
Boranos,
canfanos e
fenchanos
Carenos
P-Mentanos
Pinanos
Tujanos
Tipo estrutural
Exemplos
OPP
GPP
Esquema 2: Membros representativos de várias subfamílias de monoterpenos
Os monoterpenos irregulares são obtidos pela união diferenciada de duas
unidades do isopreno e rearranjos estruturais. Assim, embora DMAPP e IPP sejam
utilizados na biossíntese, o geranil PP e o farnesil PP não parecem estar envolvidos.
74
A biossíntese de monoterpenos pode ser dividida em quatro fases:
69,70,75
(1)
construção de unidades básicas C
5
, IPP e DMAPP; (2) condensação do IPP e DMAPP
via feniltransferases para formar GPP, C
10
; (3) conversão do GPP as estruturas de várias
74
DEWICK, P.M. Medicinal natural products: a biosynthetic approach. England: John Willey & Sons, cap.
5, p. 153-172, 2000.
75
BERTOMEU, J. M.; et al. Up-regulation of 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase enhances
production of essential oils in transgenic Spike Lavander . Plant Physiology 142, 890-900, 2006.
45
subfamílias de monoterpenos, catalisado por terpeno sintases; e (4) transformação da
estrutura básica em seus vários derivados.
Isopentenil difosfato (IPP) e dimetilalil difosfato (DMAPP) são os precursores
universais de importantes produtos naturais, os isoprenóides.
76
Duas distintas rotas biossintéticas para formação de IPP e de DMAPP estão
envolvidas (Figura 6): a clássica rota do mevalonato (MVA), a partir do Acetil Coa, no
citosol, que fornece precursores para biossíntese de sesquiterpenos (C
15
) e triterpenos
(C
30
) e a rota do metileritrol fosfato (MEP) também chamada rota do 1-deoxi-D-xilose-
5-fosfato (DPX)
73
localizada nos plastídeos, que fornece IPP para biossíntese de mono
(C
10
) diterpenos (C
20
) e tetraterpenos (C40).
69,73,75,76
A rota do MEP inicia pela condensação tipo transcetolase de dois carbonos do
piruvato com gliceraldeido-3-fosfato formando 1-deoxi-D-xilose-5-fosfato (DPX),
catalizada por DXP sintase (DXS)
76
, seguido da isomerização e redução do DXP a 2-C-
metil-D-eritrol-4-fosfato, formação do derivado citidil-difosfato, fosforilação do C
2
e
ciclização do 2-C-metil-eritritol-2,4-ciclodifosfato, o qual leva ao 4-hidroxi-DMAPP e
posteriormente ao IPP e DMAPP.
77
Ocorre a condensação do IPP e DMAPP para formação de GPP, FPP e GGPP
precursores de mono, sesqui e diterpenos, respectivamente. As reações são catalisadas
por preniltransferases. A formação de GPP é muito complexa.
A última fase da biossíntese de terpenos voláteis envolve a conversão de vários
prenildifosfatos, DMAPP (C
5
), GPP (C
10
), FPP (C
15
) e GGPP (C
20
) a hemiterpenos
(isopreno e 2-metil-3-buten-2-ol), mono, sesqui e diterpenos, respectivamente. Essas
reações são realizadas por enzimas sintases produzindo representantes de cada esqueleto
carbônico.
69
76
HUNTER, W. Structure ans reactivity in the non-mevalonate pathway of isoprenoid precursor
biosynthesis. JBC Papers in Press, 2007.
77
RODRIGUEZ, M. et al. Genetic evidence of branching in the isoprenoid pathway for the production of
isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate in Escherichia coli. FEBS Letters, 473, 328-332,
2000.
46
S
O
CoA
S
O
CoA
O
S
O
CoA
HO
O
OH
OHHO
O
OH
HO
O
OH
P
OH
O
O
O
OH
P
O
OH
OH
P
O
O
OH
P
OH
OH
O
OH
P
OH
OH
P
citidina
O
OH
P
OH
O
P
citidina
P
P
O
OHOH
P
O
P
HO
O
OH
O
P P
O
O
P P P
(A)
(
B
)
2 X
O
O
Acetil-CoA
Acetoacetil-CoA
HMG-CoA
Mevalonato
Mevalonato-5-fosfato
Mevalonato 5-difosfato
AACT
HMGS
HMGR
MK
PMK
MDC
IPP
Isopentenil difosfato Dimetilalil difosfato
Terpenóides
piruvato
D-gliceraldeído-
3-fosfato
DXPS
1-Deoxi-D-xilulose
5-fosfato
DXR
MCT
2-C-metil-D-eritrito
l-4-fosfato
4-(citidina 5'-difosfo)-
2-C-metil-D-eritritol
2-fosfo-4-(citidina 5'-difosfo)-
2-C-metil-O-eritritol
2-C-metil-D-eritritol-
2,4-ciclodifosfato
CMK
MECPS
Figura 6: Rota biossintética do mevalonato. (a) rota independente do mevalonato
(deoxixilose fosfato) (b) para a biossíntese do isopentenil difosfato (IPP) e dimetilalil
difosfato (DMAPP). O fosfato livre é destacado em vermelho e as flechas mais largas
indicam passos que ainda não foram identificados.
70
P
FOSFATO
AACT, acetil-CoA:acetil-
CoA C-acetiltransferase;
CMK, 4-(citidina-5′-
difosfo)-2-C-metileritritol
quinase;
DXPS, 1-deoxixilulose-5-
fosfato sintase;
DXR, 1-deoxixilulose-5-
fosfato redutoisomerase;
HMGR, 3-hidroxi-3-
metilglutaril-CoA redutase;
HMGS, 3-hidroxi-3-
metilglutaril-CoA sintase;
IPPI, isopentenil difosfato
isomerase;
MCT, 2- C-metileritritol-4-
fosfato citidiltransferase;
MDC, mevalonate-5-
difosfato descarboxilase;
MECPS, 2- C-metileritritol-
2,4-ciclodifosfato sintase;
MK, mevalonato quinase;
PMK, fosfomevalonato
quinase.
47
3.2.4 Métodos cromatográficos de análise de óleos essenciais:
3.2.4.1 Cromatografia em camada delgada (CCD):
44
O perfil cromatográfico é característico para cada óleo e a CCD permite
tenhamos várias informações sobre o óleo essencial em um curto espaço de tempo e
usando pouca amostra (menos de 1µL) e pouco custo.
Geralmente são usadas placas de sílica gel como fase fixa e como fase móvel
uma série de sistemas solvente. A detecção é feita inicialmente em luz ultravioleta e
depois a placa é revelada com reagente adequado para melhor visualização dos
componentes do óleo; o valor do Rf também fornece informações sobre os compostos
do óleo.
É um método cromatográfico que fornece muitas informações analíticas sobre o
óleo sem exigir equipamentos sofisticados. É preconizado pela Farmacopéia.
3.2.4.2 Cromatografia gasosa (CG) e espectrometria de massa (EM):
Esta técnica de separação baseia-se na distribuição dos componentes da amostra
entre a fase estacionária (sólido ou líquido) e uma fase móvel (gás), sendo aplicada a
compostos voláteis ou volatilizáveis. O gás da fase móvel tem a finalidade de
transportar as moléculas a serem separadas através da coluna, sendo por isso conhecido
como gás de arraste. Um detector é conectado na saída da coluna, onde é constatada a
eficiência da separação pelo cromatograma registrado.
Óleos voláteis são, geralmente, constituídos por uma série de componentes,
principalmente de terpenóides voláteis, os quais se apresentam naturalmente como
hidrocarbonetos, álcoois, cetonas, aldeídos, fenóis, ésteres, etc. Devido à importância
desta classe de metabólitos, pesquisadores desta área, procuram por tecnologias mais
efetivas no que diz respeito à separação e identificação destes voláteis.
78
A técnica de impacto de elétrons (IE) é a mais comumente usada em
espectrometria de massas, um espectrômetro de massas bombardeia moléculas na fase
78
BICCHI, C., D’AMARO, A., RUBIOLO, P. Cyclodextrin derivatives as chiral selectors for direct gas
chromatographic separation of enantiomers in the essential oil, aroma and flavours fields. Journal of
Chromatography A, 8, 843-899, 1999.
48
vapor com um feixe de elétrons de alta energia e registra o resultado do impacto dos
elétrons como um espectro de íons separados na base da razão massa/carga (m/z). A
maior parte dos íons formados tem carga unitária. Os espectros de massas são obtidos
rotineiramente com o uso de um feixe eletrônico de energia de 70 eV. A maior parte dos
íons desintegra-se em 10
-10
a 10
-3
s, dando, no caso mais simples, um fragmento
carregado positivamente e um radical. Assim, forma-se certo número de fragmentos
iônicos que podem ser posteriormente decompostos em fragmentos menores.
79
No
espectro de massas por impacto de elétrons, gerado por um computador na forma de um
gráfico de barras, a abundância relativa dos picos é apresentada como percentagem.
79
SILVERSTEIN, R.M.; BASSLER, G.C.; MORRIL, T.C. Identificação espectrométrica de compostos
orgânicos. 5 ed., Rio de Janeiro, Ed. Guanabara Koogan S.A., 387p., 1994.
49
3.3 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
A história do desenvolvimento e uso de substâncias antimicrobianas na prática
médica antecedeu a descoberta de espécies microbianas, uma vez que Hipócrates (460-
337 a.C.) recomendava a lavagem de ferimentos com vinho para impedir o processo
infeccioso.
Documentos de 2500 a 3000 anos atrás relatam o uso de mofo, papa de soja e
correlatos para o tratamento de lesões e processos inflamatórios, por povos chineses e
indianos.
80,81
Desde o princípio das civilizações, os vegetais tem sido utilizados não só como
fonte alimentícia como também medicamentosa. As diversas enfermidades têm sido
tratadas com chás, sucos, tinturas, ungüentos preparados a partir de plantas. Esta
conduta terapêutica remonta aos antigos povos da China, Egito, Ásia e Roma onde
eruditos, com base em seus conhecimentos classificaram numerosas espécies vegetais
com o respectivo uso medicinal. Embora a presença de substâncias antimicrobianas nos
vegetais superiores não seja um fato recente, a busca das mesmas teve grande impulso
após a descoberta da penicilina.
81
As substâncias antimicrobianas ou antibióticas representam talvez o maior
avanço da farmacoterapia nas últimas cinco décadas ou mais, com progressos ilimitados
na terapêutica medicamentosa. Esse grupo medicamentoso condiciona de forma efetiva,
o efeito de espécies microbianas patogênicas e oportunistas responsáveis por diversas
patologias que provocaram e ainda provocam a incapacidade prolongada ou óbito de
seres humanos, sem restrição de faixa etária, situação financeira ou estado de saúde. Os
antimicrobianos constituem um grupo especial de agentes terapêuticos, geralmente
produzidos e obtidos de organismos vivos. São substâncias que, em pequenas
concentrações, devem possuir atividade letal ou inibitória contra muitas espécies
microbianas, prevenir o desenvolvimento de microrganismos resistentes, a ausência de
efeitos indesejáveis ao hospedeiro, estabilidade química, etc.
81
A atividade
antimicrobiana é um item relevante na caracterização de extratos vegetais, dada a
80
SANCHES, A. C. C. estudo farmacognóstico das cascas de Stryphnodendron oblovalum Benth.
atividade antioxidante, antimicrobiana e da ação cicatrizante dos seus extrati. Dissertação de Mestrado.
UNESP, 2004.
81
LIMA, E. O. Plantas e suas propriedades antimicrobianas: uma breve análise histórica. In: YUNES,
R.A.; CALIXTO, J.B. Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna. Chapecó: Argos,
481-501, 532p, 2001.
50
importância e o número bastante grande de doenças infecciosas que acometem o
homem.
46
O conhecimento sobre determinadas espécies vegetais com propriedades
antimicrobianas tem sido revisto e ampliado, devido aos crescentes problemas
associados ao uso de diversos antibióticos. Em um estudo sobre plantas medicinais
foram feitas avaliações sobre atividade antimicrobiana de extratos, óleos essenciais e de
substâncias obtidas de espécies vegetais contra bactérias gram positivas, gram negativas
e fungos. Quanto ao potencial antibiótico destacam-se os resultados obtidos com óleos
essenciais, alcalóides, cumarinas, triterpenos, timol entre outros que, em baixas
concentrações exercem inibição sobre o crescimento de bactérias gram positivas, gram
negativas, micobacterias, leveduras e fungos filamentosos confirmando a grande
importância de tais produtos como perspectiva para produção de novos e eficientes
produtos farmacêuticos usados na terapêutica de processos infecciosos.
81
Vários métodos são utilizados na determinação da atividade antimicrobiana in
vitro, sendo aplicado em estudo preliminar na triagem de novas substâncias ativas. A
técnica de difusão em ágar e métodos de diluição em meio liquido são comumente
utilizadas para avaliação da potencia antimicrobiana de compostos químicos.
Atualmente técnicas de diluição, desenvolvidas em microplacas, possibilitam o
uso de volumes reduzidos na determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de
produtos químicos que são de grande valia quando se tratam de produtos naturais,
especialmente os de origem vegetal, extraídos em pequenas quantidades. Estas técnicas
permitem a analise de vários compostos e de uma ampla variedade de microorganismos
concomitantemente, utilizando pequenos volumes de amostra, com baixo custo, e
apresentando resultados produtivos.
46,82,83
82
DEVIIENNE, K. F.; RADDI, M. S. Screening for antimicrobial activity of natural products using a
microplate photometer. Braz. J. Microbiol 33, 166-168, 2002.
83
ELLOF, J. N.;et al. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory
concentration of plnt extracts for bacteria. Planta Medica 64, 711-713, 1998.
51
3.3.1 Atividade antimicrobiana e óleos essenciais:
Há muito tempo os óleos voláteis são usados com base nas suas propriedades
antimicrobianas. Em particular, a atividade antimicrobiana de óleos voláteis de plantas
tem hoje muitas aplicações, incluindo a preservação de alimentos, em produtos
farmacêuticos, na medicina alternativa e em terapias naturais.
84
A maioria das plantas produz metabólitos secundários antimicrobianos que
fazem parte do crescimento e desenvolvimento da planta atuando como resposta a
patógenos e são alguns desses metabólicos secundários, os óleos essenciais, que podem
acabar reduzindo a proliferação de microrganismos. Os óleos podem também ser usados
como antifúngicos, antioxidantes, anticarcinogênicos e como aditivos naturais de muitos
alimentos.
85
Os óleos voláteis têm atividade inibitória de largo espectro contra
microrganismos presentes em alimentos estragados dependendo da concentração,
método, estado e atividade dos constituintes presentes.
86
Esta atividade é atribuída a um grupo pequeno de terpenóides e compostos
fenólicos, os quais isolados, também demonstram atividade antibacteriana e antifúngica.
Geralmente monoterpenos não oxigenados são significativamente menos ativo que os
oxigenados.
87
84
HAMMER, K.A., CARSON, C.F., RILEY, T.V. Antimicrobial activity of essential oils and other plant
extracts. Journal of Applied Microbiology, 86, 985-990, 1999.
85
SKOCIBUSI´C, M.et al. Phytochemical composition and antimicrobial activities of the essential oils
from Satureja subspicata Vis. growing in Croatia. Food Chemistry 96, 20-28, 2006.
86
SMITH-PALMER, A. et al. The potential application of oplant essential oils as natural food
preservatives in soft cheese. Food Microbiology 18, 463-470, 2001.
87
COX. S. D.; et al. Interactions between components of the essential oil of Melaleuca alternifolia. J.
Applied Microbiology 91, 492-497, 2001.
52
3.3.2 Microrganismos patogênicos:
Microrganismos, ou seja, bactérias, fungos, leveduras, vírus e protozoários são
onipresentes no organismo humano. Desde o nascimento, eles convivem com a
microbiota da biosfera composta por inúmeros microrganismos representados por tipos,
variedades, cepas, gêneros, espécies, etc. Muitas áreas estéreis e grandemente povoadas
são encontradas no organismo assim como áreas pouco povoadas ou que abrigam uma
microbiota temporária.
88
Sabe-se hoje que muitos microrganismos considerados não patogênicos têm a
capacidade de produzir infecções e causar doenças. Esta propriedade não depende
somente dos fatores de virulência, mas também do mecanismo de defesa do hospedeiro.
Pacientes que fazem uso de drogas imunossupressoras, aidéticos, diabéticos e com
câncer são considerados grupo de risco.
89
Esses fatores predispõem a infecção por microrganismos usualmente
considerados inócuos. Qualquer modificação na microbiota original do hospedeiro
implica perturbação dessa população o que, em grande parte, deriva do uso
indiscriminado de antimicrobianos, especialmente antibióticos, havendo a substituição
da biota original por microrganismos resistentes levando a uma infecção secundária.
90
Os fungos nas duas últimas décadas vêm causando um grande aumento na
incidência de infecções em imunodeprimidos, transplantados, neonatos e idosos,
levando grande número de indivíduos acometidos ao óbito.
91
Os fungos implicados
nestas infecções podem ser fungos verdadeiramente patógenos ou oportunistas. Estes
últimos têm baixa virulência e manifestam sua patogenicidade em imunodeprimidos
105
.
Concomitantemente houve um significativo aumento do uso de antifúngicos para
tratamento de infecções micóticas sistêmicas e localizadas e assim, um acelerado
desenvolvimento de resistência manifestado por freqüentes falhas terapêuticas.
92
88
MURRAY, P. R.; et al. Introdução a Microbiologia Médica. In: Microciologia Médica, 4ª ed., Ed.
Guanabara-Koogan S. A., p1-3, 762p, 2004.
89
PELCZAR, JR, M. J.; et al. Interações Parasita-Hospedeiro: Resistência Inespecífica do Hospedeiro.
In: Microbiologia: conceitos e aplicações, vol II, 2ºª ed. São Paulo: MAKRON Books, 41-65, 517p, 1996.
90
SOUZA, C. A. I.; SCARCELLI, E. Agressão por microrganismos da microbiota endógena. Artigo de
Revisão. Arq. Inst. Biol., São Paulo, 67, 2, 275-281, 2000.
91
ZACCHINO, S. Estratégias para a descoberta de novos agentes antifúngicos. In: YUNES, R. A.;
CALIXTO, J. B. Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna, Chapecó: Argos, 435-
479, 523p, 2001.
92
MURRAY, P. R.; et al. Agentes Antifúngicos. In: Microciologia Médica, 4ª ed., Ed. Guanabara-
Koogan S. A., p596-600, 762p, 2004.
53
Em diversas situações de risco, os ensaios in vitro que determinam a menor
concentração capaz de causar a morte do microrganismo são fundamentais. Portanto,
infecções graves requerem, obrigatoriamente, tratamento com base nas concentrações
bactericida e fungicida, encontradas nestes ensaios para a cura total da infecção.
93
Staphylococcus aureus são cocos patógenos primários ou oportunistas que
acometem homens e animais.
94
Tendem a formar grupamentos semelhantes a cachos de
uva. São amplamente distribuídos na natureza e fazem parte da microbiota normal da
pele e mucosas.
95
S. aureus está geralmente envolvido nas infecções humanas tanto de origem
comunitária quanto hospitalar e se encontra em várias partes do corpo como garganta,
fossas nasais, intestinos e pele.
46,95,96
Causa infecções cutâneas como impetigo,
foliculite, furúnculos, infecções em ferimentos, infecções mediadas por toxinas como
intoxicações alimentares e a síndrome do choque tóxico, uma infecção rara, mas
extremamente grave caracterizada por febre alta e vômitos que pode ocasionar o óbito e
outras infecções como pneumonia, endocardite e artrite séptica.
94
Staphylococcus epidermidis são cocos gram positivos, anaeróbios facultativos
imóveis. Habitante normal da pele e mucosa, sendo encontrado em praticamente todos
indivíduos
97
.
As infecções produzidas por S. epidermidis incluem endocardites de válvulas
cardíacas naturais e protéicas, infecções produzidas por cateteres endovenosos
97,98,99
,
bacteremia, osteomielite, infecções de feridas, de enxertos vasculares e mediastinite
97
.
Baccilus subtilis são bacilos grandes e esporulados, vivem no solo como esporos
ou como células vegetativas passando de um estado para outro de acordo com as
93
LOEFFLER, J.; STEVENS , D. A. Antifungal Drug Resistance. Clinical Infections Diseases 36, 31-41,
2003.
94
MURRAY, P. R.; et al. Styaphylococcus e Microrganismos Relacionados. In: Microciologia Médica, 4ª
ed., Ed. Guanabara-Koogan S. A., p188-201, 762p, 2004.
95
TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. icrobiologia, 4ªed, São Paulo: Atheneu, 697p, 2005.
96
MAHADY, G. B. Medicinal plants for the prevention and treatment of bacterial infections. Current
Pharmaceutical Design 11, 19, 2405-2427, 2005.
97
HÖRNER, R. Cocos gram +: estafilococos (catalase+) e microrganismos relacionados. In:
Microbiologia Clinica- Caderno Didático, Farmácia, UFSM, 328p, 2003.
98
TRABULSI, L. R. Staphylococcus ; 4ªed, atheneu, 718p, 2004.
99
ARRECUBIETA, C.; et al. SdrF, a Staphylococcus epidermidis Surface Protein, Binds Type I
Collagen, JBC Papers, in Press, 2007.
54
condições ambientais, ou seja, proliferam quando as condições são favoráveis e
esporulam quando são desfavoráveis.
100
Somente algumas espécies deste gênero são patogênicas para os humanos.
101
B.
subtilis é a espécie do gênero Bacillus mais conhecida e é frequentemente um
contaminante.
100
Esse microrganismo produz o antibiótico bacitracina que é efetivo
contra uma grande variedade de bactérias gram positivas.
102
O gênero Escherichia consiste em cinco espécies das quais a E. coli é a mais
comum e clinicamente importante.
103
Este gênero compreende bacilos gram negativos.
A E. coli é uma bactéria facultativa, considerada um dos habitantes mais comuns do
trato intestinal.
101
A E. coli não é normalmente patogênica, fazendo parte da microbiota
normal, entretanto, esse microrganismo pode estar associado a uma variedade de
doenças incluindo sepse, meningite neonatal, gastrenterite e infecções das vias
urinárias.
101
Salmonella setubal são bacilos gram negativos, aeróbios facultativos,
pertencentes à família Enterobacteriaceae que podem causar infecções intestinais e
extra-intestinais como gastrenterites, bacteremias, febres entéricas como a salmonelose,
e ainda ter colonização assintomática.
101
Quase todos os membros do gênero Salmonella
são potencialmente patogênicos.
101
Os membros do gênero Klebsiella são bacilos gram negativos.
104
São
comumente encontradas no solo e na água.
101
K. pneumoniae é o membro mais isolado deste gênero podendo causar um tipo
grave de pneumonia lobar, sendo mais freqüente em alcoolistas e pessoas com funções
pulmonares comprometidas.
101
Sua implicação em infecções hospitalares chega atingir
29% dos casos. As infecções causadas por K. pneumoniae estão associadas à elevada
morbimortalidade e sua incidência vem aumentando preocupando muitas instituições.
105
100
TRABULSI, L. R. Outras espécies aeróbias e anaeróbias facultativas; 4ªed, atheneu, 718p, 2004.
101
TORTORA, G. J.; et al. Procariotos: Domínios Bactéria e Archaea . In: Microbiologia, 8ªed., Porto
Alegre: Artmed, p 304-333, 893p, 2005.
102
PELCZAR, JR, M. J.; et al. Antibióticos e outros agentes quimioterápicos. In: Microbiologia:
conceitos e aplicações, vol II, 2ºª ed. São Paulo: MAKRON Books, 111-140, 517p, 1996.
103
MURRAY, P. R.; et al. Enterobacteriaceae. In: Microbiologia Médica, 4ª ed., Ed. Guanabara-Koogan
S. A., p 250-264, 762p, 2004.
104
TRABULSI, L. R. Edwarsiella — Citrobacter — Klebsiella — Enterobacter — Hafnia —Serratia —
Proteus — Morganella — Providencia.; 4ªed, atheneu, 718p, 2004.
105
PEREIRA, A. S.;et al. Avaliação da acurácia de testes laboratoriais para detecção de amostras de
Klebsiella pneumoniae produtora de betalactamase de espectro estendido. Jornal Brasileiro de Patoçogia e
Medicina Laboratorial 39, 4, 301-308, 2003.
55
Pseudomonas aeruginosa são bacilos gram negativos retos ou ligeiramente
curvados, aeróbios.
101
A persistência do estado de portador nos seres humanos, como
parte da microbiota normal, é rara, exceto em pacientes hospitalizados, ambulatoriais ou
imunocomprometidos.
106
São microrganismos ubíquos encontrados no solo, na matéria
orgânica em decomposição, na vegetação, na água e em todo ambiente hospitalar. As
infecções por Pseudomonas são basicamente oportunistas.
107
As doenças mais freqüentes causadas por Pseudomonas aeruginosa são
infecções pulmonares (comum em pacientes com fibrose cística), infecções do trato
urinário (principalmente pacientes com catéter), infecções de feridas conseqüentes de
queimaduras entre outras infecções cutâneas e dos tecidos moles, oculares e dos
ouvidos.
107
Candida albicans faz parte da microbiota normal do ser humano, mas
geralmente está implicado em manifestações clinicas, principalmente em
imunodeprimidos, que abrange desde infecções superficiais da pele até infecções
sistêmicas potencialmente fatais.
108
A candidíase ocorre frequentemente em recém-nascidos, pacientes com
imunodeficiência adquirida (AIDS) e indivíduos fazendo uso de antibióticos de amplo
espectro.
109
A Candida dubliniensis é uma espécie similar fenotipicamente, porém,
geneticamente distinta de C. albicans.
110
Reconhecida como o novo patógeno oportunista
111
do gênero Candida a partir
de 1995
112
. Candida dubliniensis foi inicialmente associada à candidíase oral em
pacientes infectados pelo vírus HIV.
113
Hoje, reconhece-se que ela pode ser a causa de
106
MURRAY, P. R.; et al. Pseudomonas e Microrganismos Relacionados. In: Microciologia Médica, 4ª
ed., Ed. Guanabara-Koogan S. A., p 280-286, 762p, 2004.
107
TRABULSI, L. R Pseudomonas.; 4ªed, atheneu, 718p, 2004.
108
MURRAY, P. R.; et al. Micoses Oportunistas. In: Microciologia Médica, 4ª ed., Ed. Guanabara-
Koogan S. A., p 626-634, 762p, 2004.
109
TORTORA, G. J.; et al. Os Eucariotos: Fungos, Algas, Protozoários e Helmintos.. In: Microbiologia,
8ªed., Porto Alegre: Artmed, p 334-375, 893p, 2005.
110
MARIANO, P. L. S.; et al. Candida dubliniensis identification in Brazilian yeast stock collection.
Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 98, 4, 533-538, 2003.
111
KUMAR, C. P. G.; et al, Esterase activity of Candida species isolated from immunocompromised
hosts. Revista Iberoamericana de Micologia, 23, 101-103, 2006.
112
SULLIVAN, D. J.; et al. candida dubliniensis sp nov: phenotipic and molecular characterization of a
novel species associated with oral candidosis in HIV-infected individuals. Microbiology 141, 1507-1521,
1995.
113
ALVES, S. H.; et al. utilização do ágar suco de tomate (ágar V8) na identificação presuntiva de
Candida dubliniensis. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 39, 1, 92-93, 2006.
56
doenças superficiais e sistêmicas mesmo em pacientes HIV negativos.
114
Causa ainda
infecções em pacientes com câncer, fibrose cística e imunocomprometidos por diversas
patologias.
113
Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada que pode infectar
diversos animais. Criptococose é a principal infecção causada pela inalação do C.
neoformans sendo de difícil tratamento em pacientes HIV positivos; fluconazol é a
droga de escolha, porém, seu uso prolongado na terapia das candidíases orais e
esofágicas destes pacientes tem levado à resistência do C. neoformans a esse
medicamento
115
.
C. neoformans ainda é a principal causa de meningite fúngica e um importante
fator na morbimortalidade de pacientes com AIDS
115
e receptores de transplantes. Este
microrganismo pode também provocar doença sistêmica em pacientes que não
apresentam sistema imune deprimido.
Saccharomyces cerevisiae é uma levedura de brotamento, unicelular, não
filamentosa, caracteristicamente esférica ou oval. Amplamente encontrada na natureza,
frequentemente como pó branco cobrindo folhas e frutos
109
.
S. cerevisiae é utilizado para fazer pão, vinho e etanol. Ele também pode ser
usado pela Engenharia Genética na produção de vários tipos de proteínas, incluindo a
vacina contra Hepatite B
109,116
.
É a espécie não patogênica mais comum deste gênero, frequentemente
empregada em ensaios antifúngicos como representativo do reino Fungi
117
.
3.3.3 Ação antimicrobiana:
Quando falamos em propriedades antimicrobianas e mais especificamente de
atividade antimicrobiana de óleos essenciais, devemos considerar o mecanismo de ação
desses componentes que ainda não está bem determinado.
118
114
AL MOSAID, A.; et al. Differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans on Staib Agar
and Caffeic Acid-Ferric Citrate Agar. Journal of Clinical Microbiology 39, 1, 323-327, 2001.
115
SANATI, H.;et al. Multicenter Evaluation of Broth Microdilution Method for Susceptibility Testing of
Cryptococcus neoformans againt Fluconazole. Journal of Clinical Microbiology 34, 5, 1280-1282, 1996.
116
PELCZAR, JR, M. J.; et al. Biotecnologia: A Aplicação Industrial da Microbiologia In:
Microbiologia: conceitos e aplicações, vol II, 2ºª ed. São Paulo: MAKRON Books, 398-422, 517p, 1996.
117
GROLL, A. H.; WALSH, T. J. Uncommon opportunistic fungi: new nosocomial threats. Clin.
Microbiol. Infect. 7, 8-24, 2001.
118
LAMBERT, R.J.W., SKANDAMIS, P.N., COOTE, P., NYCHAS, G.-J.E. A study of the minimum
inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil, thymol and carvacrol. Journal
Applied Microbiology, 91, 453-462, 2001.
57
Uma importante característica dos óleos essenciais e seus constituintes é sua
hidrofobicidade a qual possibilita sua partição entre os lipídeos das membranas
celulares e mitocôndrias das bactérias; assim a distribuição entre as estruturas apresenta
maior permeabilidade.
48,
119
Considerando-se o grande número de diferentes grupos químicos que compõem
os óleos essenciais, é muito provável que a atividade antibacteriana não seja atribuída a
um mecanismo especifico, mas que tenha diversos alvos na célula, alguns deles
representados na Figura 7.
45,120
Todos esses mecanismos não são alvos separados
alguns podem ser afetados em conseqüência de outros alvos. Os locais ou mecanismos
de ação dos óleos essenciais são mostrados abaixo:
Figura 7: Localização e mecanismos na célula microbiana que podem ser sítios de ação
dos componentes de óleos voláteis.
Muitos estudos investigam a ação dos óleos essenciais contra microrganismos
patogênicos e de acordo com eles os óleos são levemente mais ativos contra bactérias
gram positivas (Figura 8) que contra bactérias gram negativas (Figura 9)
121,122
. Que os
microrganismos gram negativos sejam menos suscetíveis a ação dos antibacterianos é
119
SIKKEMA, J., DE BONT, J.A.M., POOLMAN, B. Mechanisms of membrane toxicity of
hydrocarbons. Microbiological Reviews, 59, 2, 201-222, 1995.
120
CARSON, C.F., MEE, B.J., RILEY, T.V. Mechanism of action of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil
on Sthapylococcus aureus determined by time-kill, lysis, leakage and salt tolerance assays and electron
microscopy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 46, 6, 1914-1920, 2002.
121
PINTORE, G.; et al. Chemical composition and antimicrobial activity of Rosmarinus officinalis L. oils
from Sardinia ND Corsica. Flavour and Fragrance Journal 17, 15-19, 2002.
122
HARPAZ, S.; et al. Effects of herbal essential oils used to extend the shelf life of freshwater-reared
Asian sea bass fish (Lates calcarifer). Journal of Food Protection 66, 3, 410-417, 2002.
58
de se esperar, pois possuem uma membrana externa que envolve sua parede, a qual
restringe a difusão dos componentes hidrofóbicos
123
.
Entretanto, nem todos os estudos sobre óleos essenciais têm concluído que
bactérias gram positivas são mais suscetíveis à ação dos antimicrobianos
124
. Isso talvez
possa ser explicado pela membrana externa com superfície hidrofílica que as bactérias
gram positivas possuem
123
. Assim, bactérias gram negativas são frequentemente mais
resistentes a antibióticos hidrofóbicos e outras drogas
125
.
Figura 8: Representação esquemática da Figura 9: Representação esquemática
membrana celular de bactérias da membrana celular de bactérias
gram positivas gram negativas
A estrutura química dos componentes individuais dos óleos essenciais influencia
e coordena seu modo de ação preciso e sua atividade antimicrobiana.
126
A atividade antimicrobiana de alguns constituintes conhecidos presentes nos
óleos essenciais já foi inteiramente discutida por muitos autores.
119,125,127,128
Os
123
VAARA, M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiological Reviews
56, 3, 395-411, 1992.
124
WILKINSON, J. M.; et al Bioactivity of Backhousia citriodora: Antimicrobial and antifungal activity.
Journal of agricultural and Food Chemistry 51, 76-81, 2003.
125
HELANDER, L. M.;et al. Characterization of the action of selectes essential oil components on Gram-
positiva bacteria. Journal of Agricultural and Food Chemistry 46, 9, 3590-3595, 1998.
126
DORMAN, H.J.D., DEANS, S.G. Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plants
volatile oils. Journal of Applied Microbiology, 88, 308-316, 2000.
127
GILL, A. O.; HOLLEY R. A. Mechanisms of bactericidal action of cinnamaldehyde against Listeria
monocytogenes and of eugenol against L. monocytogenes and Lactobacillus sakei. Appl. EnViron.
Microbiol. 70, 5750-5755, 2004.
59
principais componentes ativos dos óleos essenciais são fenóis, terpenos e aldeídos
129
, e
é também bem conhecido que a ação destas substâncias é executada principalmente de
encontro à membrana citoplasmática da célula.
129,130,131,132,133
Entre os constituintes dos
óleos essenciais, os compostos fenólicos são descritos como principais responsáveis
pela atividade antimicrobiana;
45
pois se supõe que a presença do grupo hidroxil está
relacionada a inativação de enzimas microbianas. O mais provável é que este grupo
interaja com a membrana da célula causando o vazamento de componentes celulares,
havendo alteração em ácidos graxos e fosfolipídios, danificando o metabolismo e
influenciando na síntese do material genético.
129
Similarmente aos compostos fenólicos,
o local da ação dos terpenos também é a membrana celular. Eles penetram através das
membranas fazendo com que inchem, inibindo assim as enzimas respiratórias e
causando a dissipação parcial do gradiente do pH e do potencial elétrico.
131
O
cinamaldeído tem a atividade antifúngica mais elevada entre os aldeídos alifáticos
129
,
tendo vantagem no acesso ao periplasma e às partes mais profundas das células não
causando a desintegração da membrana externa como ocorre com o carvacrol e o timol,
por exemplo.
125
128
DI PASQUA, R.; DE FEO, V.; VILLANI, F.; MAURIELLO, G. In Vitro antimicrobial activity of
essential oils from Mediterranean Apiaceae, Verbenaceae and Lamiaceae against pathogens and spoilage
bacteria. Ann. Microbiol. 55, 139-143, 2005.
129
CEYLAN, E.; FUNG, D. Y. C. Antimicrobial activity of spices. J. Rapid Methods Autom. Microbiol.
12, 1-55, 2004.
130
KNOBLOCH, K.; PAULI, A.; IBERL, B. Antibacterial and antifungal properties of essential oils
components. J. Essent. Oil Res. 1, 119-128, 1989.
131
SIKKEMA, J.; WEBER, F. J.; HEIPIEPER, H. J.; DE BONT, J. A. M. Cellular toxicity of lipophilic
compounds: Mechanisms, implications, and adaptations. Biocatalysis 10, 113-122, 1994.
132
ULTEE, A.; KETS, E. P. W.; ALBERDA, M.; HOEKSTRA, F. A.; SMITH, E. J. Adaptation of the
food-borne pathogen Bacillus cereus to carvacrol. Arch. Microbiol. 174, 233-238, 2000.
133
ULTEE, A.; BENNINK, M. H. J.; MOEZELAAR, R. The phenolic hydroxyl group of carvacrol is
essential for action against the food-borne pathogen Bacillus cereus. Appl. EnViron. Microbiol. 68,
1561-1568,2002.
60
3.4 TESTES in vitro:
O ressurgimento do interesse nas terapias naturais e o crescimento da demanda
de consumo por produtos naturais efetivos e seguros requerem mais dados sobre a
atividade antimicrobiana dos óleos voláteis.
134,135,136
O desenvolvimento de métodos in vitro para investigação da atividade
antimicrobiana de óleos essenciais que produzam resultados confiáveis, reprodutíveis e
validados vem tendo grande interesse. Porém, algumas peculiaridades apresentadas
pelos óleos como volatilidade, instabilidade, insolubilidade em água e sua
complexidade vem dificultando essa tarefa devido a significativas interferências nos
resultados.
137
Nesses ensaios in vitro da potência antimicrobiana dos óleos essenciais é
possível verificar uma variedade de metodologias propostas, o que torna a comparação
desses estudos problemática.
84
Os métodos comumente utilizados são difusão, diluição e bioautografia.
45, 138,139
Os resultados obtidos para cada um desses métodos podem diferir devido a
variações entre os testes como crescimento microbiano, exposição de microrganismo ao
óleo, solubilidade do óleo e o uso e a quantidade de agente emulsificante
empregado.
84,118
Os testes de avaliação antimicrobiana são padronizados pelo NCCLS
140
(National Committee for Clinical Laboratory Standars) e desenvolvido para analisar
agentes antimicrobianos convencionais como antibióticos. Nos testes de atividade
antimicrobiana de óleos essenciais, a metodologia proposta pelo NCCLS não deve ser
134
OLIVEIRA, R. A. G.; et al. Estudo da interferência de óleos essenciais sobre a atividade de alguns
antibióticos usados na clinica. Ver. Brás. Farmacogn. 16, 77-82, 2006.
135
OLIVEIRA, F. P., et al. Effectiveness of Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) essential oil in
inhibiting the growth of Staphylococcus aureus strains isolated from clinical material. Ver. Brás.
Farmacogn. 16, 510-516, 2006.
136
LIS-BACHIN, M.; DEANS, S. Y. Bioactivity of selected plant essential oils against Listeria
minocutogenes. J. Appl. Bacteriol. 82, 759-762, 1997.
137
NASCIMENTO, P. F. C.;et al. Atividade antimicrobiana dos óleos essenciais: uma abordagem
multifatorial de métodos. Ver. Brás. Farmacogn. 17, 108-113, 2007.
138
RIOS, J.L., RECIO, M.C., VILLAR, A. “screening” methods for natural antimicrobial products with
antimicrobial activity: a review of the literature. Journal of Ethnopharmacology, 23, 127-149, 1988.
139
NOSTRO, A.; et al. Susceptibility of methicillin resistant staphylococci to orégano essential oil,
carvacrol and thymol. FEMS Microbiol. Lett. 230, 191-195, 2004.
140
NCCLS. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically.
Approved Standard, 5th edition, NCCLS document M7-A5, 2000.
61
seguida a risca devido as propriedades químicas que estes apresentam. Modificações
destes testes são conhecidas e empregadas.
84,137
Nos ensaios com óleos essenciais deve-se considerar que estes são insolúveis em
água, viscosos e complexos podendo inclusive formar suspensões turvas de difícil
visualização. Por isso, acredita-se que os métodos disponíveis não favorecem a
padronização e a conseqüente reprodução dos resultados que efetivamente expressam a
realidade, sendo incapazes de comparar diretamente a verdadeira atividade dos
óleos.
141,142
O screening da ação dos óleos voláteis na atividade antimicrobiana é
frequentemente realizado pelos métodos de difusão em disco e bioautografia.
84,126
Já a
quantificação da atividade antimicrobiana pode ser determinada por métodos de
diluição.
A concentração inibitória mínima (CIM) é citada como sendo um dos principais
métodos de diluição para determinação da atividade antimicrobiana de óleos essenciais.
Cita-se também a concentração bactericida/fungicida mínima (CBM/CFM).
84
Existem
várias técnicas de determinação do ponto final. Os métodos mais atuais para
determinação do CIM de óleos essenciais, usam indicadores de oxi-redução, como sais
de tetrazólio para indicação visual do ponto final.
74
A diluição mostrou ser o método que melhor disponibiliza dados quantitativos,
enquanto a difusão se constitui em um método qualitativo, por isso esses métodos não
são necessariamente comparáveis. Os resultados obtidos por cada um desses métodos
podem diferir devido a fatores intrínsecos aos testes.
137
Para uma melhora da qualidade dos procedimentos com óleos essenciais tornou-
se comum o uso de solventes, detergentes ou agentes emulsificantes como tween
20
84,143
, tween 80
144
, dimetil sulfóxido (DMSO)
145,146
e etanol
144,147
para facilitar a
141
SETZER, W. N.;et al. Antimicrobial activity of Artemisia duglasi leaf essential oil. Fitoterapia 75,
192-200, 2004.
142
SOKMEN, A.; et al. The in vitro antimicrobial and antioxidant activities of the essential oils and
methanol extrcats of endemic Thymus spathulifolius. Food Control 15, 8, 627-634, 2004.
143
MANN, C. M.; MARKHAM, J. L. A new method dor determining the minimun inhibitory
cocentration of essential oils. Journal of Applied Microbiology 84, 538-544, 1998.
144
JUVEN, B. J.; KANNER, J.; SCHUED, F. Factors that interact with the antibacterial action of thyme
essential oil and its active constituents. Journal of Applied Bacteriology 76, 626-631, 1999.
145
FIROUZI, R.; AZADBAKHT, M.; NABINEDJAD, A. Anti-listerial activity os essential oils some
plants. Journal of Applied Animal Research 14, 75-80, 1998.
146
BURT, S.; REINDERS, R. D. Antibacterial activity of selected plant essential oils against Escherichia
coli 0157:H7. Letters in Applied Microbiology 36, 3, 162-167, 2003.
62
dispersão dos mesmos no meio de cultura.
148
As propriedades físicas e químicas destes
agentes são importantes pra auxiliar na visualização do ponto final da atividade
antimicrobiana, no entanto, deve-se saber que a introdução do agente emulsificante
pode levar a interações com a substância teste. Por isso, preconiza-se uma relação
adequada entre óleo e emulsificante.
84
3.5 Determinação da atividade antimicrobiana in vitro:
Os procedimentos utilizados para determinar a atividade antimicrobiana dos
óleos essenciais foram bioautografia, difusão em disco e microdiluição em caldo (CIM).
3.5.1 Bioautografia:
Os ensaios pelo método de bioautografia foram realizados de acordo com
Hamburger e Hostettmann.
5,149
A bioautografia é um método qualitativo que combina cromatografia em camada
delgada (CCD), onde as amostras são aplicadas, com bioensaio in vitro (Figura 10).
5,149
Figura 10: Colocação da CCD na placa de Petri para realização de bioautografia.
147
MARINO, M.; BERSANI, C.; COMI, G. Impedance measurements to study the antimicrobial activity
of the essential oils from Lamiaceae and Compositae. Intermnational Journal of Food Microbiology 67,
187-195, 2001.
148
BAYDAR, H.; et al. Antibacterial activity and composition of essential oils from Oreganum, Thymbra
and satureja species with commercial importance in Turkey. Food Control 15, 169-172, 2004.
149
RAHALISON, L.; et al. A Bioautography Agar Overlay Method for the Detection of Antifungal
Compounds from Higher Plants. Phytochemical Analysis 2, 199-203, 1991.
63
Por esta técnica são obtidas zonas de inibição bem definidas visualizadas por
meio de revelação química que utiliza corantes indicadores de microrganismos vivos.
Os sais de tetrazólio como o TTC (cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio) são
amplamente usados formando espécies coloridas, formazanas, ao serem reduzidos por
componentes da cadeia transportadora de elétrons da mitocôndria do microrganismo
(Esquema 3).
150,74
N
N
N
N
S
N
Cl
N
H
N
N
S
N
N
HCl
+
2 ELÉTRONS
Incolor
Cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio
Púrpura
Formazana
N
N
N
N
S
N
Cl
N
H
N
N
S
N
N
HCl
+
2 ELÉTRONS
N
N
N
N
S
N
Cl
N
H
N
N
S
N
N
HCl
+
2 ELÉTRONS
Incolor
Cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio
Púrpura
Formazana
Esquema 3: Reação de redução do TTC, com a formação da formazana
O princípio deste teste é o mesmo da difusão em ágar (difusão em disco), porém,
as substâncias ativas podem ser identificadas por medidas do fator de retenção (Rf) o
que torna este método de sumo interesse para o monitoramento de substâncias
biologicamente ativas.
151
150
ALTMAN, F. P. Tetrazolium salts ans formazans. Stuttgart, Gustav Fischer Verlag, 56p, 1976.
151
HOSTETTMANN, K.; QUEIROZ, E. F.; VIEIRA, P. C. A procura dos princípios ativos. In:
Princípios ativos de plantas superiores. São Carlos: UFSCAR, vol. IV, 43-58, 152p, 2003.
64
3.5.2 Difusão em Disco:
152,153,154,155
O teste de difusão em disco é baseado na difusão em ágar. É um método
essencialmente qualitativo, aplicado à avaliação da atividade antimicrobiana de misturas
ou substâncias puras.
Este teste é bastante simples e prático. Pequenos discos de papel contendo
quantidades conhecidas da amostra a ser testada são colocados, em ordem crescente de
concentração, sobre a superfície de um meio de cultura inoculado com o microrganismo
indicador. O microrganismo semeado cresce até encontrar um limiar de concentração de
amostra incompatível com o seu desenvolvimento, o qual é caracterizado pela formação
de halo com ausência de crescimento microbiano (halo de inibição) ao redor do disco
(Figura 11).
Figura 11: Leitura do teste de difusão em disco. A presença de compostos
antimicrobianos é registrada pela medida do diâmetro dos halos de inibição formados ao
redor dos discos.
O diâmetro do halo deve ser proporcional a quantidade de amostra aplicada nos
discos e ao coeficiente de difusão das substâncias no meio de cultura utilizado.
152
BAUER, A. W.; et al. Antibiotic suscebility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin.
Patol. 45, 493-496, 1965.
153
FRATINI, M.; et al. Atividade antimicrobiana de óleos essenciais. Caderno Farmácia, 7, suplemento,
1991.
154
SKALTSA, H,; et al. Composition and Antimicrobial Activity of the Essential Oil of Scutellaria
albida ssp albida from Greece. Planta Medica Letters 66, 672-674, 2000.
155
WILKINSON, J.; et al. Bioactivity os Backhousia citriodora: Antibacterial and Antifungal Activity.
Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, 76-81, 2003.
65
3.5.3 Microdiluição em Caldo (CIM):
O método de diluição em caldo consiste na diluição da amostra em meio de
cultura líquido onde será inoculado o microrganismo teste. Este método pode ser
realizado em tubos (macrodiluição) ou em microplacas (microdiluição). A
microdiluição é menos laboriosa e permite a análise de várias amostras e várias espécies
microbianas concomitantemente usando quantidades ínfimas de amostra
83
. É um
método quantitativo que avalia a atividade antimicrobiana de misturas e substâncias
puras.
Esse método permite a definição da concentração inibitória mínima (CIM), a
menor concentração de um determinado composto que inibe o crescimento do
microrganismo em estudo
94,126,143,156
num dado meio de cultura.
O método de microdiluição em caldo, realizado em microplacas de 96
micropoços se dá pela diluição seriada da amostra em meio líquido. No caso de óleos
essenciais se faz necessário o uso de tween 80
144
para auxiliar na dissolução.
Posteriormente os microrganismos são inoculados na solução e as placas são incubadas.
O CIM é determinado visualmente (aparecimento ou não de turvação) e dos poços que
não apresentaram crescimento são retiradas alíquotas que serão inoculadas em meio
sólido para determinação da concentração bactericida ou fungicida mínima
(CBM/CFM), a menor concentração de substância capaz de matar 99,9% das unidades
formadoras de colônia (UFC). O termo concentração letal mínima (CLM) também vem
sendo usado englobando CBM e CFM, mas ainda não está bem estabelecido.
84
3.6 Padrões utilizados nos testes antimicrobianos:
102
Quando realizamos uma análise para determinação da atividade antimicrobiana
seja ela quali ou quantitativa se faz necessário o uso de padrões, geralmente
antibióticos, com ações antimicrobianas conhecidas e comprovadas e de amplo espectro
156
SHEEHAN, D. J.; et al. Antifungal susceptibility testing of yeasts: a brief overview. Clin. Infect. Dis.
17, 2, 494-500, 1993.
66
para que sirvam como parâmetro para comparação com os dados obtidos para as
amostras testadas. São muitos os padrões utilizados, entre eles:
Cloranfenicol: antibiótico produzido pela bactéria Streptomyces venezuelae, mas que
geralmente, por sua simplicidade estrutural e por fatores econômicos, é produzido
sinteticamente (Figura 12).
Figura 12: Cloranfenicol
Possui amplo espectro e na clinica é geralmente usado quando há
desenvolvimento de resistência do microrganismo aos outros antibióticos.
Seu tamanho reativamente pequeno de molécula permite a difusão por diversas
áreas do corpo que são normalmente inacessíveis a muitas outras drogas. Todavia o
cloranfenicol apresenta sérios efeitos colaterais sendo o mais importante à supressão da
atividade da medula óssea, afetando a formação das células sangüíneas.
157
Nistatina: antibiótico também produzido pelo gênero Streptomyces, S. noursei. Foi o
primeiro antibiótico usado no tratamento antifúngico descoberto ainda na década de 50
(Figura 13).
157
TORTORA, G. J.; et al.Drogas antimocrobianas. In: Microbiologia, 8ªed., Porto Alegre: Artmed, p
559-589, 893p, 2005
67
Figura 13: Nistatina
Para humanos, a nistatina é tóxica sendo usada somente no tratamento de
infecções fúngicas de pele e boca.
101
3.7 Determinação da toxicidade in vivo:
3.7.1 Teste de letalidade com Artemia salina:
O ensaio de toxicidade por Artemia salina foi proposto por Michael et al
158
e
mais tarde desenvolvido por Venhaecke et al
159
e Sleet e Brendel.
160,161
Laboratórios de Produtos Naturais tem inserido cada vez mais, em sua rotina,
ensaios biológicos simples. Um deles é o bioensaio de toxicidade frente à Artemia
158
MICHAEL, A. S.; THOMPSON , C. G.; ABRAMOVITZ, M. Artemia salina as a test organism for a
biossay. Science 123, 464, 1956.
159
VENHAECKE, P.; et al. Proposal for a short-term toxicity test with Artemia nauplii. Ecotoxicol Env.
Safety 5, 382-387, 1981.
160
SLLET, R. B.; BRENDEL, K. Improved methods for harvesting and counting synchronous populations
of Artemia nauplli for use in developmental toxicology. Ecotoxicol Env. Safety 7, 435-446, 1983.
161
CARBALLO, J. L. A comparison between two brine ahrimp assays to detect in vitro cytotoxicity in
marine natural products. BMC Biotechnology 2, 17, 1-5, 2002.
68
salina (TAS), um teste simples, rápido, de baixo custo e que não exige técnicas
assépticas
162
, além de demonstrar boa correlação com atividade antitumoral.
163,164
Artemia salina é um micro crustáceo que se desenvolve em habitats marinhos de
alta salinidade. São abundantes em seu habitat natural sendo suscetíveis a poluição e
toxinas do ambiente marinho, consideradas assim indicadoras biológicas de poluição
marinha.
O teste é realizado com a eclosão dos ovos do micro crustáceo em solução
salina. As larvas são colocadas em microplacas e a elas, são adicionadas uma série de
diluições de amostra. A CL
50
é obtida pelo método Probits
165
ou por regressão linear
após 24 horas de análise. A CL
50
é a concentração capaz de matar 50% da população
total de Artemia salina.
As amostras são consideradas ativas quando CL
50
< 250µg.mL
-1
.
166
Este teste
apresenta ainda correlação com as atividades anti-Trypanossoma cruzi
161
e
antimalarial.
167
Na realização deste teste foram usados como padrões a substância dicromato de
potássio
168
, potente oxidante que é altamente tóxico e o sulfato de quinidina
163
, por ser
um padrão derivado de produtos naturais assim como as amostras testadas.
A Tabela 2 abaixo apresenta os resultados esperados para uma alta, média e
baixa atividade citotóxica.
163,166
Tabela 2: Dados de toxicidade por Artemia salina.
LC
50
(µg.mL
-1
)
Altamente tóxicos <80
Moderadamente tóxicos Entre 80 e 250
Não tóxicos ou com baixa toxicidade >250
162
SIQUEIRA, J. M.; et al. Estudo fitoquimico de Unonopsis lindmaii-Annonaceae, biomonitorado pelo
ensaio de toxicidade sobre a Artemia salina Leach. Química Nova 21, 5, 1998
163
MEYER, B. N.; et al. Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituents.
Planta Medica 45, 31-34, 1982.
164
COLMAN-SAUZARBITORIA, T.; et al. Venezenen: a new bioactive Annonaceous acetogenin from
the bark of Xylopia aromatica. J. Nat. Prod. 58, 4, 532-539, 1995.
165
FINNEY, D. J. Probit Analysis: a statistical treatment of the sigmoid response curve. University Press,
Cambridge 55-50, 1974.
166
DOLABELA, M. F. Dissertação de Mestrado, 128p, Universidade Federal de Minas Gerais, 1997.
167
CHENG, S-S., et al. Bioactivity of selected plant essential oils against the yellow fever mosquito
Aedes aegypti larvae. Bioresource Technology, 89, 99-102, 2003.
168
PADMAJA, R.;et al. Brine shrimp lethality bioassay of select Indian medicinal plants. Fitoterapia 73,
508-510, 2002.
69
3.8 Determinação da atividade antioxidante:
Os radicais livres são átomos ou moléculas altamente reativas com numero
ímpar de elétrons na ultima camada eletrônica; justamente este desemparelhamento de
elétrons da ultima camada causa a eles elevada reatividade.
Existem algumas espécies reativas patogênicas que não possuem elétrons
desemparelhados na última camada eletrônica, mas que estão intimamente envolvidos
na formação de radicais livres; são as espécies reativas de nitrogênio e oxigênio.
169
Essas espécies são produzidas durante o metabolismo normal e também em situações
patológicas.
170
Elevados níveis de radicais livres ou de espécies reativas de oxigênio levam ao
stress oxidativo que conduz a uma variedade de lesões bioquímicas e fisiológicas
resultando frequentemente em dano metabólico e morte celular.
171
Fisiologicamente deve haver um equilíbrio entre a produção e a remoção dessas
espécies radicalares no organismo para que haja a manutenção fisiológica das células.
172
Evidências epidemiológicas indicam que o consumo de gêneros alimentícios que
contém fitoquímicos antioxidantes (principalmente flavonóides e outros polifenóis) traz
vantagens à saúde do individuo desde que protejam dos radicais livres e retardem o
progresso de muitas doenças crônicas.
173
Os antioxidantes podem ser classificados em primários, sinergistas, removedores
de oxigênio, agentes quelantes, antioxidantes biológicos e antioxidantes mistos.
174
Os antioxidantes primários, classe que inclui o radical DPPH (2,2-difenil-1-
picrilidrazila) e os polifenóis BHA (t-butil hidróxi anisol) e BHT (t-butil hidróxi
tolueno), entre outros, são compostos fenólicos que provem a remoção ou inativação
dos radicais livres formados durante o inicio ou propagação da reação, pela doação de
hidrogênio a estas moléculas, interrompendo a reação em cadeia.
169
FERREIRA, A. L. A.; MATSUBARA, L. S. Radicais livres: conceitos e doenças relacionadas, sistem
de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associação Medica Brasileira 43, 1, 61-68, 1997.
170
ÇAKIR, A.; et al. Antioxidant activities of the extracts and components of Teucrium orientale L. var.
orientale. Turkey Journal of Chemistry 30, 1-12, 2006.
171
AMES, B. Micronutrients prevent cancer and delay aging. Toxicology Letters 102, 5-18, 1998.
172
ELMASTAS, M.; et al. Radical scavenging activity and antioxidant capacity of bay leaf extracts.
Journal of the Iranian Chemical Society 3, 3, 258-266, 2006.
173
ORDOÑEZ, A. A. L..; et al. Antioxidant activities of Sechium edule (Jacq.) Swartz extracts. Food
Chemistry 97, 452-458, 2006.
174
RAMALHO, V. C.; JORGE, N. Antioxidantes utilizados em óleos, gorduras e alimentos gordurosos.
Química Nova 29, 4, 755-760, 2006.
70
A representação do mecanismo de ação está no Esquema 4:
Esquema 4: Mecanismo de ação de antioxidantes primários. Onde: ROO۫ e R۫ –
radicais livres; AH-antioxidante com um átomo de hidrogênio ativo e A۫- radical inerte.
O átomo de hidrogênio ativo do antioxidante é abstraído pelos radicais livres
(ROO۫ e R۫ ) com maior facilidade que os hidrogênios alílicos das moléculas insaturadas.
Assim formam-se espécies inativas para a reação em cadeia e um radical inerte (A۫ )
procedente do antioxidante. Este radical, estabilizado por ressonância, não tem a
capacidade iniciar ou propagar as reações oxidativas.
174
Antioxidantes sintéticos pertencentes a esse grupo como BHA, BHT e TBQB
(terc-butil-hidroquinona) foram adicionados a alimentos, porém sua toxicidade ainda é
questionada.
173
Os antioxidantes naturais merecem atenção, pois são sintetizados em grande
quantidade pelas plantas e são capazes de captarem radicais livres. Os mecanismos de
ação desses compostos são diversos entre eles a captura de oxigênio singlete, a redução
de radicais peróxidos, entre outros.
151,175
E é justamente por isso que há cada vez mais
um crescente interesse no estudo de antioxidantes provenientes de plantas, sendo que
alguns óleos essenciais podem inclusive ser usados como conservantes de alimentos.
173
3.8.1 Atividade antioxidante pelo método do radical livre DPPH (2,2-difenil-1-
picrilidrazila):
Este método é considerado apenas um screening do potencial antioxidante
apresentado pelos óleos essenciais testados. Usa o radical livre estável DPPH e avalia
175
YEN, G. C.; DUH, P. D. Scavenging effects of methanolic extracts of Peanut hulls on free-radical and
active-oxigen species . Journao of agricultural and Food Chemistry 42, 629- 632, 1994.
71
sua capacidade oxidante e a dos compostos testados como doadores de hidrogênio
(antioxidantes).
176
Este radical livre em solução é borrifado sobre cromatofolhas de sílica gel onde
as amostras haviam sido anteriormente aplicadas. Caso a mostra apresente capacidade
antioxidante o radical irá se reduzir recebendo um átomo de hidrogênio da substância;
os compostos ativos serão visualizados como manchas claras, forma reduzida do DPPH,
permanecendo somente algum resíduo de grupos picril presentes, sob o fundo violeta.
151
A reação está representada no Esquema 5:
N
NO
2
NO
2
O
2
N N N
H
NO
2
NO
2
O
2
N N
difenil picril hidrazila
"
r
a
d
i
c
a
l
l
i
v
r
e
"
difenil picril hidrazina
"
f
o
r
m
a
r
e
d
u
z
i
d
a
"
R H
molécula
doadora
Esquema 5: Reação do radical livre DPPH com a molécula doadora de H, originando a
forma reduzida DPPH-H.
176
MOLYNEUX, P. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazic (DPPH) for estimating
antioxidant activity. Songklanakarin Journal of Science Technology 26, 2, 211-219, 2003.
72
4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
4.1 GERAL:
4.1.1 Cromatografia Gasosa:
As amostras de óleo essencial, armazenadas sob refrigeração ao abrigo da luz,
em frascos de vidro âmbar com tampa rosqueada foram analisadas por meio de
cromatografia em fase gasosa.
Estes experimentos foram realizados em cromatógrafo a gás Varian modelo
3800. Os sinais foram detectados através de detector de ionização de chama (DIC),
utilizando hidrogênio ultrapuro como gás de arraste (fase móvel), operando a uma
pressão de 7 Psi, split 10, temperatura do injetor de 220
o
C e do detector de 280
o
C. As
condições de cada injeção estão indicadas com os respectivos cromatogramas.
Os experimentos foram realizados utilizando-se coluna capilar de sílica fundida
(CCSF) com dimensão 25 m x 0,25 mm, contendo fase estacionária apolar SE-54
(Polimetilfenilsiloxano-5% fenil) utilizando programa de injeção, indicado nos
cromatogramas. Os percentuais dos constituintes dos óleos analisados foram obtidos
pela área do pico, considerando todos os fatores de resposta do detector DIC iguais a
um.
4.1.2 Espectrometria de Massas:
As análises de espectrometria de massa acoplada a cromatografia gasosa foram
realizadas em aparelho Shimadzu QP-2010 equipado com coluna capilar INNOWAX
(PEG), 60 m, 0.32 mm de diâmetro interno e 0,25 um de espessura do filme do Instituto
de Química da UNICAMP disponibilizado pela Profª Anita J. Marsaioli.
Foi utilizado como gás de arraste hélio ultrapuro, sendo a temperatura do injetor
de 250
o
C e a programação de análise com T
inicial
= 40
o
C, T
final
= 260
o
C, rampa de
aquecimento de 1
o
C/min, e com uma pressão de gás de arraste de 7 Psi. Os dados
obtidos foram comparados com os dados da biblioteca Willey de espectros de massas.
As análises das amostras dos óleos voláteis de todas as espécies e a
determinação de seus constituintes foram realizadas por cromatografia gasosa com
73
detecção por ionização de chama (CG-DIC), cromatografia gasosa acoplada a
espectrometria de massas (CG-EM) e determinação do índice de retenção de Kovats
(IK). Após análise dos tempos de retenção, índices de Kovats e espectros de massa das
amostras analisadas compararam-se esses dados com os existentes na literatura e
identificaram-se os constituintes presentes no óleo.
4.1.3 Cromatografia em camada delgada (CCD):
Foram utilizadas cromatofolhas de sílica-gel 60 F
254
, com 0,25 mm de espessura,
sobre alumínio (Merck), como fase estacionária. Como fases móveis foram utilizadas
diversas misturas de solventes com diferentes polaridades. A revelação foi realizada
com luz UV ( = 254 nm) e, através da borrifação de solução etanólica de H
2
SO
4
a
10%, ou através da borrifação de vanilina seguidas de tratamento térmico.
4.1.4 Solventes e reagentes purificados:
Todos os solventes utilizados para a extração dos óleos e para cromatografia de
camada delgada, foram solventes de nível técnico que receberam tratamento para
melhorar suas condições tanto de umidade como de possíveis contaminantes.
Hexano: refluxado e destilado sobre óxido de cálcio.
Acetato de etila: seco sobre CaCl
2
e destilado.
Diclorometano: seco sobre CaCl
2
e destilado.
Éter etílico: destilado em rota evaporador após adição de NaOH.
Os solventes utilizados na preparação de amostras para cromatografia gasosa,
frequentemente hexano, foram solventes de grau cromatográfico.
4.2 Coleta de material vegetal e identificação de plantas:
As espécies selecionadas foram coletadas em Santana do Livramento,
identificadas pela botânica Prof.ª Thaís do Canto Dorow e armazenadas no Herbário da
Universidade Federal de Santa Maria.
74
As coletas foram efetuadas entre janeiro de 2005 e dezembro de 2006,
geralmente no verão e na primavera, período de melhor desenvolvimento das espécies.
O material testemunho das espécies coletadas está armazenado no Herbário da
UFSM sob as exsicatas que estão na Tabela 3, abaixo:
Tabela 3: Exsicatas das espécies utilizadas para o estudo dos óleos essenciais.
Espécie: Número exsicata
Baccharidastrum triplinervium
SMDB 10407
Baccharis pentodonta
SMDB 10408
Eupatorium buiinifolium
SMDB 10410
Pluchea sagittalis
SMDB 10409
4.3 Extração dos óleos voláteis:
Cento e dezoito gramas de folhas de Baccharidastrum triplinervium coletadas na
primavera (F1) foram submetidas à hidrodestilação utilizando aparelho Clevenger
modificado (Figura 14). Da amostra coletada no verão (F2), foram coletadas 257g
também de folhas. O tempo de extração foi de 6 h para cada uma das amostras. O óleo
obtido apresenta cor amarela.
Da espécie Baccharis pentodonta foram coletados 127,4 g de folhas (BPF2) e
118 g de flores (BPFl2) no verão. Na primavera foram coletados 326 g de folhas (BPF5)
e no inverno (BPF4), 282 g. Folhas e flores foram submetidas à hidrodestilação também
em aparelho Clevenger modificado por um período de 5 h.
A espécie Pluchea sagittalis teve 128,6 g de suas folhas (PSF2) e 140 g de suas
flores (PSFl2) coletadas no verão, extraídas em aparelho Clevenger modificado com
tempo de extração de 5 h. Os óleos essenciais obtidos tanto de folhas, quanto de flores,
tinham coloração levemente amarelada.
Da espécie Eupatorium buniifolium foram coletadas somente folhas que foram
submetidas à hidrodestilação, obtendo-se um óleo amarelo. As folhas de E. buniifolium
foram coletadas no verão (CH1) e no inverno (CH2). Quatrocentos e setenta e quatro
75
gramas de folhas coletadas no verão (CH1) e 367 g coletadas no inverno (CH2) foram
extraídas em um tempo de extração de 5 h.
Figura 14: Aparelho de Clevenger modificado, utilizado na extração dos óleos essenciais.
4.4 Determinação do índice de retenção de Kovats para os constituintes dos óleos
voláteis:
Em cromatografia expressar os dados de tempo de retenção não é trivial, porque
estes são muito dependentes de condições operacionais. Vários sistemas foram
desenvolvidos, sendo um dos mais lógicos para generalizar os dados de retenção o de
expressa-los em uma escala de índices de retenção foi proposto pela primeira vez por E.
Kovats em 1958.
Os índices de retenção de Kovats foram determinados através da injeção de uma
mistura de n-alcanos (C
8
a C
26
) com tempo de retenção e ordem de eluição conhecidos,
juntamente com os constituintes que tiveram seus índices calculados. Em condições de
variação linear de temperatura a fórmula utilizada é a seguinte:
Ir
i
= 100 n + 100 n tr
i
- tr
n
tr
m
-tr
n
76
onde:
Ir
i
= índice de retenção de i
n = número de carbonos do alcano que elui antes de i
m = número de carbonos do alcano que elui depois de i
n = número de carbonos do alcano que elui depois de i menos número de carbonos do alcano
que elui antes de i
tr
i
= tempo de retenção de i
tr
n
= tempo de retenão do alcano que elui antes de i
tr
m
= tempo de retenção do alcano que elui depois de i.
Os índices de retenção de Kovats (IK) dos constituintes dos óleos foram
determinados e comparados com os padrões de igual índice de retenção, encontrados na
literatura.
177
4.5 Amostras para cromatografia gasosa:
As amostras para CG foram preparadas utilizando-se alíquotas de 10 L dos
óleos voláteis, dissolvidos em 500 L de hexano para cromatografia. Em cada análise
foram injetados 0,2 L desta solução utilizando seringas Hamilton com capacidade de
10 L.
4.6 Determinação das propriedades físicas dos óleos voláteis:
4.6.1 Polarimetria ():
A rotação ótica dos óleos essenciais foi realizada em polarímetro Perkin Helmer
341 automático com lâmpada de mercúrio com precisão de 0,05 graus, em cubeta de 10
dm de comprimento, utilizando diclorometano como solvente. Os experimentos foram
realizados na Universidade Federal de Santa Maria (UFSM).
177
ADAMS, R. P. Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography/Quadrupole Mass
Spectroscopy. Allured Publishing Corporation, Illinois, 456p., 2001.
77
4.6.2 Índice de refração (η):
O índice de refração foi determinado em refratômetro Schmidt Haensch 20595,
do Lboratório de Ensino de Química Orgânica da Universidade Federal de Santa
Maria (UFSM). Os valores obtidos tiveram correção de -0,0004 unidades/°C para
cada grau de temperatura abaixo de 12°C, que era a temperatura ambiente no
momento da análise.
4.6.3 Densidade (d):
As densidades foram determinadas a partir da relação d=m.V
-1
onde d-
densidade, m-massa e V-volume. Foram pesados 10µL de cada óleo essencial e
calculada a densidade com a ajuda da massa obtida. As amostras foram pesadas
cinco vezes e as densidades são uma média dos valores obtidos.
4.7 Determinação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais “in vitro”.
Para a verificação da atividade antimicrobiana dos óleos foram utilizadas cepas
padrão ATCC (American Type Culture Collection) e uma cepa isolada concedida pelo
Laboratório de Micologia do Departamento de Farmácia da UFSM (Tabela 4).
78
Tabela 4: Microrganismos padrão ATCC utilizados nos testes.
BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS:
Staphylococcus aureus ATCC 6538p
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
Bacillus subtillis ATCC 6633
BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS:
Salmonella setubal ATCC 19796
Escherichia coli ATCC 25792
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
FUNGOS (LEVEDURAS):
Candida albicans
ATCC 10231
Sacharomyces cerevisae ATCC 2601
Candida dubliniensis Isolado clínico SM-26
Cryptococcus neoformans ATCC 28952
4.7.1 Substâncias empregadas como padrões nos ensaios microbiológicos
Os padrões de antibióticos utilizados para verificação da atividade
antimicrobiana foram Cloranfenicol para bactérias e Nistatina para fungos. Padrões
estes preparados conforme FDA.
178
178
FDA: Code of Federal Regulation, 21, 300, 1991.
79
4.7.2 Meios de cultura empregados:
Meio ágar nutriente: meio utilizado para o repique de bactérias.
Fórmula (g L
-1
)
Cloreto de sódio 8,0
Extrato de carne 3,0
Peptona de gelatina 5,0
Ágar bacteriológico 15,0
Meio ágar Müeler Hinton: meio utilizado para bactérias nos ensaios de bioautografia.
Fórmula (g L
-1
)
Amido de batata 1,5
Extrato de carne 2,0
Hidrolisado ácido de caseína 17,5
Ágar 17,0
Meio ágar antibiótico n°1: meio utilizado no teste de difusão
Fórmula (g L
-1
)
Peptona de carne 6,0
Peptona de caseína 4,0
Extrato de levedura 3,0
Extrato de carne 1,5
D (+)- glicose 1,0
80
Meio ágar sabouraud dextrosado: meio utilizado para repiques de fungos e também
nos ensaios de bioautografia.
Fórmula (g L
-1
)
Dextrose 40,0
Peptona de carne 5,0
Peptona de caseína 5,0
Ágar 15,0
Meio caldo caseína de soja: meio utilizado para realização dos ensaios de concentração
inibitória mínima, no cultivo de bactérias.
Fórmula (g L
-1
)
Dextrose 2,5
Cloreto de sódio 5,0
Fosfato dibásico de potássio 2,5
Peptona de caseína 17,0
Peptona de soja 3,0
Meio caldo sabouraud dextrosado: meio utilizado para o cultivo de fungos nos
ensaios de concentração inibitória mínima.
Fórmula (g L
-1
)
Dextrose 40,0
Peptona de carne 5,0
Peptona de caseína 5,0
Todos os meio foram preparados de acordo com as instruções do fabricante em
água recém destilada e esterilizados em autoclave a 121
o
C, 1 atm., por 20 minutos.
81
4.7.3 Manutenção dos microrganismos indicadores:
As cepas dos microrganismos indicadores são armazenadas em tubos de ensaio
(ágar inclinado) contendo 5 mL de ágar nutriente para bactérias ou ágar Sabouraud para
fungos, em geladeira. Os repiques são realizados sempre 24 a 48 hs antes de cada
análise.
4.7.4 Preparo das suspensões microbianas (inóculo)
Com o auxilio de uma alça de platina esterilizada foram transferidas culturas
recentes dos microrganismos indicadores para tubos de ensaio contendo 5mL de solução
salina a 0,8 %. Padronizou-se o inóculo fazendo a comparação deste com o tubo
padronizado 0,5 da escala nefelométrica de McFarland que corresponde a
aproximadamente a 1,5 x 10
8
UFC mL
-1
(Unidades Formadoras de Colônia por mL).
4.7.5 Método de Bioautografia:
A bioautografia é um método qualitativo usado para determinação da atividade
antimicrobiana. Este ensaio foi realizado de acordo com Hamburguer e
Hostettmann.
5,179
As amostras dos óleos voláteis em solução foram aplicadas em cromatofolhas de
sílica gel em uma série de diluições nas concentrações de 100,0; 50,0; 25,0, 12,5, 6,25 e
3,12 µg. Sobre cada cromatofolha, aplicou-se um padrão de antibiótico, cloranfenicol
para bactérias e nistatina para fungos, em concentrações adequadas, de acordo com o
microrganismo a ser testado. Cloranfenicol: aplica-se 2,5 L (0,5 µg) para E. coli e K.
pneumoniae, 3,0 L (0,6 µg) para P. aeruginosa, 3,5 L (0,7 µg) para S.aureus, S.
epidermidis e S. setubal e 4,0 L (0,8 µg) para B. subtillis e Nistatina: aplica-se 3,0 µL
(2,43 µg) para C. albicans e C. neoformans, 4,0 L (3,24 µg) para S. cerevisae e 5,0 µL
(4,05 µg) para C. dubliniensis.
179
HAMBURGUER, A.L., FUCHS, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method
for detecting fungiotoxic substances. Journal of Chromatography, 51, 327-329, 1970
82
Para a realização do teste, foram utilizadas placas de Petri onde foram
depositadas as cromatofolhas com as amostras a serem analisadas. Em seguida, foram
adicionados 10 mL do meio de cultura inoculado com o microrganismo indicador sobre
as cromatofolhas. Após a solidificação do meio, as placas foram incubadas na posição
invertida por 24 horas para bactérias a 35-37 °C e por 48 horas para fungos a 25-27 °C.
Após o período de incubação, as placas foram reveladas com uma solução aquosa de
TTC (5 mg.mL
-1
). Caso houvesse necessidade incubava-se novamente as placas por 1 a
2 horas após adição do TTC para uma melhor visualização dos halos.
4.7.6 Método de difusão em discos de papel:
152,153,154,155
O ensaio de difusão em disco foi realizado em placas de Petri contendo ágar
antibiótico nº 1 para bactérias e ágar Sabourand para fungos, inoculados com
microrganismos indicadores.
Foram usados discos de papel de 6 mm de diâmetro. Cada disco foi impregnado
com 5 L de uma solução do óleo essencial em diclorometano com concentrações
conhecidas (entre 100 g e 6,25 g) e colocados na placa. As placas foram incubadas
invertidas por 24 horas para bactérias a 35-37 °C e por 48-72 horas para fungos a 25-27
°C.
A leitura do teste se dá pela medida do diâmetro das zonas de inibição (halo)
formadas pela amostra e pelo padrão. Os testes foram realizados em triplicata e os
resultados expressos em mm pela média aritmética do diâmetro dos halos de inibição
formado ao redor dos discos nas três repetições.
4.7.6.1 Inoculação das placas para realização da difusão:
Inicialmente preparam-se as placas de Petri com 15 mL de meio estéril ágar
antibiótico n° 1; deixa-se a placa semi-aberta até solidificar o meio (as placas devem ser
armazenadas sob refrigeração caso não sejam feitas no dia da análise);
83
Mergulha-se um swab de algodão estéril (ou cotonete estéril) no inóculo
previamente ajustado. O swab deve ser girado várias vezes e apertado firmemente
contra a parede interna do tubo, acima do nível do líquido. Isso ajudará a retirar
qualquer excesso de inóculo no swab;
A superfície seca da placa de ágar antibiótico n° 1 é inoculada esfregando o
swab em toda a superfície estéril do ágar. O procedimento e repetido em três direções
diferentes, a fim de assegurar a distribuição uniforme do inóculo. Como passo final,
passa-se um swab na margem da placa de ágar. Deixar a placa semeada por 5 minutos
para que o inóculo seja completamente absorvido pelo ágar antes da aplicação dos
discos.
4.7.6.2 Aplicação de discos a placas de ágar inoculadas:
Colocam-se os discos em ordem crescente de concentração na superfície de cada
placa de ágar semeada com o microrganismo indicador. Cada disco deve ser
pressionado de encontro à placa, de maneira a assegurar contato completo com a
superfície de ágar. Uma vez colocado o disco não removê-lo do local, pois a difusão é
imediata.
No centro de cada placa é colocado um disco com o padrão aplicado
(Cloranfenicol ou Nistatina). Cloranfenicol: Aplica-se 2,5 L (0,5 µg) para E. coli e K.
pneumoniae, 3,0 L (0,6 µg) para P. aeruginosa, 3,5 L (0,7 µg) para S.aureus, S.
epidermidis e S. setubal e 4,0 L (0,8 µg) para B. subtillis. Nistatina: Aplica-se 3,0 µL
(2,43 µg) para C. albicans e C. neoformans, 4,0 g (3,24 µg) para S. cerevisae e 5,0 µL
(4,05 µg) para C. dubliniensis.
As placas devem ser invertidas e colocadas na estufa a 35-37 °C para bactérias
por 24 horas e a 25-27 ºC para fungos por até 72 horas para uma melhor visualização
dos halos.
84
4.7.7 Determinação da CIM pelo método de microdiluição
Os ensaios de microdiluição em caldo forma realizados em placas de 96
micropoços utilizando a técnica modificada do NCCLS.
45,84,179
Foram efetuadas uma
série de diluições das amostras em meio caldo caseína de soja e Sabourand, contendo
2% do surfactante Tween 80, iniciando da concentração de 20 mg.mL
-1
de amostra. Os
poços foram então inoculados com a suspensão microbiana e as placas foram incubadas
por 24 horas a 35-37 °C para bactérias e por 48 horas a 25-27 ºC para fungos. Após o
período de incubação, observou-se o crescimento microbiano, indicado pelo
aparecimento de turvação, possibilitando assim, a verificação da CIM.
Dos poços que não apresentaram crescimento foram retiradas alíquotas que
foram usadas para inocular placas de Petri contendo meio ágar estéril e assim se
determinar a CBM ou CFM, consideradas a menor concentração da substância onde não
ocorreu crescimento microbiano.
Os testes foram realizados em triplicata e sempre foi realizada a análise do
padrão (cloranfenicol ou nistatina) simultaneamente. As placas também tinham controle
de branco (CB) e de crescimento microbiano (controle de inóculo, CI).
4.8 Determinação de toxicidade “in vivo”.
4.8.1 Teste de letalidade com Artemia salina:
O teste de letalidade empregado foi adaptado do método descrito por
Colegate e Molyneaux.
180
Os ovos de Artemia foram eclodidos, em um período de 48 a 72 horas,
em aquário utilizando-se água salgada artificial obtida de acordo com as especificações
do fabricante. O sistema foi mantido sob aeração e em temperatura (25 a 28
o
C) e pH
controlados (pH=7,0).
Foram preparadas soluções trabalho das amostras sendo previamente dissolvidas
em DMSO ou álcool metílico e misturadas à água marinha artificial com 2% de
surfactante Tween 80, que auxiliou na solubilização. Oito a 12 crustáceos foram
180
COLEGATE, S.M., MOLYNEUX, R. J. Bioactive Natural Products: detection, isolation and structural
determination. CRC Press, EUA, 507p., 1993.
85
colocados em microplacas de 96 poços, onde logo após, foram aplicadas as soluções de
amostra que apresentaram diluições entre 1000 e 10g.mL
-1
.
As placas foram deixadas ao abrigo da luz, a temperatura ambiente e após 24
horas observaram-se o número total de camarões vivos e mortos, determinando-se CL
50
,
por métodos de regressão linear. As análises foram realizadas em triplicata, obtendo-se
uma média dos resultados.
Juntamente com as amostras procede-se a análise dos padrões dicromato de
potássio e sulfato de quinina, também em triplicata. Fez-se ainda o controle do branco.
4.9 Teste de Atividade Antioxidante
4.9.1 Método do radical livre DPPH
O ensaio empregado foi o do radical estável 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH),
descrito por Hostettmann.
151
As amostras em solução foram aplicadas em cromatofolhas na forma de spots,
em uma série de concentrações entre de 100 e 3,12 g. Como antioxidante padrão foi
utilizada a substância natural quercetrina, que era aplicada com as amostras na
concentração de 2µg. A solução estoque preparada é de 2 mg.mL
-1
.
Após a aplicação das placas preparou-se uma solução metanólica de DPPH (2,2-
difenil-1-picrilidrazila), a qual foi imediatamente borrifada sobre as cromatofolhas,
deixando-as em repouso por cerca de 1 hora. Aos poucos a coloração violácea do DPPH
foi diminuindo, com a formação de manchas com coloração amarela sobre o fundo
violeta.
86
5. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS:
5.1 Baccharidastrum triplinervium (Less.) Cabrera
5.1.1 Estudo do óleo volátil das folhas de Baccharidastrum triplinervium:
As folhas de Baccharidastrum triplinervium coletadas em Santana do
Livramento na primavera (F1) e no verão (F2) foram submetidas à hidrodestilação em
sistema Clevenger modificado. Apresentaram em média 0,2% de rendimento em óleo
essencial.
Foram realizadas extrações na primavera e no verão e a Cromatografia Gasosa
indicou resultados semelhantes para a composição das amostras, havendo pequenas
variações na porcentagem dos componentes majoritários.
Os dados físicos de densidade (d), rotação ótica (α) e índice de refração (η) não
foram determinados para as amostras de Baccharidastrum triplinervium.
A maioria dos constituintes químicos foram identificados e as Figuras 15 e 16
subseqüentes ilustram o perfil cromatográfico dos óleos no período da primavera e do
verão. As respectivas constituições químicas encontram-se na Tabela 5.
87
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
H
H
OH
Me
HO
Me
Me
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
H
H
OH
Me
HO
Me
Me
H
Figura 15: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de B. triplinervium coletadas na
primavera (F1). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
H
H
OH
Me
HO
Me
Me
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
H
H
OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
H
H
OH
Me
HO
Me
Me
H
Figura 16: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de B. triplinervium coletadas no
verão (F2). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.
88
Gráfico 1: Comparação entre as porcentagens dos componentes majoritários
encontrados nas folhas de Baccharidastrum triplinervium coletadas na primavera (F1) e
no verão (F2).
Tabela 5: Composição das folhas dos óleos voláteis de Baccharidastrum triplinervium
coletadas na primavera e no verão, respectivamente.
N.º
Componente
a
IK
b
IK
c
F1 F2
Identificação
Sesquiterpenos hidrocarbonetos
53,74 76,31
01
trans-cariofileno 1409 1412 13,54 17,56 CG-EM, IK
02
α-humuleno 1455 1446 2,09 2,35 CG-EM, IK
03
germacreno D 1485 1475 16,6 22,6 CG-EM, IK
04
biciclogermacreno 1500 1490 20,53 32,4 CG-EM, IK
05
δ-cadineno 1523 1518 0,98 1,4 CG-EM, IK
Sesquiterpenos oxigenados
39,67 20,95
06
álcool cariofilenil 1572 1571 9,1 4,32 CG-EM, IK
07
espatulenol 1578 1576 3,4 2,47 CG-EM, IK
08
widrol 1599 1598 0,98 0,54 CG-EM, IK
09
cubenol 1647 1633 2,29 0,58 CG-EM, IK
10
epi-α-cadinol 1640 1638 1,04 0,59 CG-EM, IK
11
α-cadinol 1654 1651 1,21 0,76 CG-EM, IK
12
α-cinamil acetato 1758 1759 1,3 0,61 CG-EM, IK
13
fitol 1943 1937 1,71 0,92 CG-EM, IK
Diterpeno
18,64 10,16
14
12,14-labdadien-8-ol - 2021 18,64 10,16 RMN
TOTAL 93,42 97,26
a
Componentes listados em ordem de eluição na coluna SE-54;
b
Índice de Kovats da literatura;
c
Índice de
Kovats calculado na coluna SE-54; F1: constituição da amostra coletada na primavera, em %; F2:
constituição da amostra coletada no verão, em %.
F1
F2
trans-cariofileno
germacreno D
biciclogermacreno
12,14-labdadien-8-ol
0
5
10
15
20
25
30
35
89
A Tabela 5 e as Figuras 15 e 16 indicam que o óleo essencial de
Baccharidastrum triplinervium é composto essencialmente de sesquiterpenos, sendo
biciclogermacreno (20,53%), 12,14-labdadien-8-ol (18,64%), germacreno D (16,6%) e
trans-cariofileno (13,5%), os principais componentes na amostra coletada na primavera.
Biciclogermacreno (32,4%), germacreno D (22,6%), trans-cariofileno (17,56%) e
diterpeno 12,14-labdadien-8-ol (10,16%), foram também os principais compostos
encontrados na amostra do verão.
Observa-se uma variação nos teores dos constituintes majoritários com aumento
de biciclogermacreno, germacreno D e trans-cariofileno e diminuição do diterpeno
12,14-labdadien-8-ol na amostra coletada no verão.
5.1.2 Determinação das atividades biológicas in vitro dos óleos essenciais de
Baccharidastrum triplinervium:
5.1.2.1 Bioautografia:
Os testes de bioautografia foram realizados de acordo com Hamburguer e
Hostettmann
5,179
. Foram testados os óleos voláteis F1 (primavera) e F2 (verão).
As amostras foram aplicadas em cromatoplacas com concentrações ente 100 e
3,12 µg, juntamente com o padrão adequado e submetidas ao teste. A análise foi
realizada em duplicata e os resultados médios estão listados na Tabela 6, abaixo:
90
Tabela 6: Determinação da quantidade de substância ativa dos óleos voláteis de
Baccharidastrum triplinervium pelo método de bioautografia.
Microrganismos: F1
1
F2
1
Padrão
2
S. aureus (ATCC 6538p) 12,5 6,25 0,7
S. epidermidis (ATCC 12228) 100 100 0,7
K. pneumoniae (ATCC 10031) 100 100 0,5
E. coli (ATCC 25792) 50 25 0,7
S. setubal (ATCC 19796) 50 50 0,5
P. aeruginosa (ATCC 27853) NA 100 0,8
B. subtilis (ATCC 6633) 50 50 0,6
S. cerevisae (ATCC 2601)
NA NA
3,24
C. albicans (ATCC 10231)
NA NA
2,43
C. dubliniensis (SM-26)
NA
NA 4,05
C. neoformans (ATCC 28952)
NA
NA 2,43
1
em µg;
2
Padrão antibiótico Cloranfenicol para bactérias e Nistatina para fungos em µg; NA = Não ativo;
F1: Baccharidastrum triplinervium coletada na primavera; F2: Baccharidastrum triplinervium coletada
no verão.
Figura 17: Teste de bioautografia do óleo volátil de Baccharidastrum triplinervium, F1
e F2 respectivamente, frente à bactéria Escherichia coli
Conforme os resultados descritos na Tabela 6 acima, as amostras apresentam
baixa atividade antimicrobiana frente às bactérias testadas, sendo a amostra F2 um
pouco mais ativa frente às bactérias Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa
e Escherichia coli quando comparada a F1. Os óleos essenciais tanto coletados na
primavera quanto no verão não apresentaram atividade antifúngica para os fungos e
leveduras testados.
91
5.1.2.2 Difusão em Disco:
Pelo método de difusão em ágar em discos de papel, os óleos voláteis de
Baccharidastrum triplinervium apresentaram-se ativos para as bactérias. A amostra F1
foi novamente inativa para a maioria dos fungos sendo apenas ativa, em alta
concentração, contra Candida albicans. Já a amostra F2 foi ativa em altas concentrações
contra a maioria dos fungos e leveduras testados, exceto contra Sacharomyces
cerevisae.
Os testes foram realizados em duplicata e os resultados expressos pela média
aritmética das duas repetições em ativo ou não ativo nas respectivas concentrações,
onde o halo de inibição foi 6 mm.
Os resultados estão expressos na Tabela 7, abaixo, com os respectivos tamanhos
dos halos obtidos para cada uma das amostras.
Tabela 7: Resultados obtidos pelo método de difusão em disco para os óleos voláteis de
Baccharidastrum triplinervium
Microrganismos
1
F1 F2 Padrão
3
S. aureus
g = 8mm; 25g = 9mm;
50g = 9,5mm; 100g = 10mm
g = 8,5mm; 25g = 9mm;
50g = 9,5mm; 100g = 10mm
0,8g = 14mm
S. epidermidis
25g = 7mm; 50g = 7,5mm;
100g = 8,5mm
25g = 7,5mm; 50g = 8mm;
100g = 8,5mm
0,8g = 14mm
E. coli
g = 6mm; 25g = 7mm;
50g = 7,5mm; 100g = 7,5mm
g = 7mm; 25g = 7,5mm;
50g = 8,5mm; 100g = 9mm
0,8g = 15,5mm
S.setubal
25g = 7mm; 50g = 8mm;
100g = 8,5mm
25g = 7mm; 50g = 8mm;
100g = 8mm
0,8g = 15mm
K. pneumoniae
25g = 6mm; 50g = 6,5mm;
100g = 7,5mm
25g = 7,5mm; 50g = 7,5mm;
100g = 8mm
0,8g = 14mm
B. subtilis
g = 9mm; 25g = 9mm;
50g = 9mm; 100g = 9,5mm
g = 6mm; 25g = 7mm;
50g = 7,5mm; 100g = 8mm
0,8g = 16,5mm
P. aeruginosa
g = 8mm; 25g = 8,5mm;
50g = 8,5mm; 100g = 9mm
25g = 8mm; 50g = 8,5mm;
100g = 8,5mm
0,8g = 13,5mm
S.cerevisae
NA
100g = 8mm g = 14mm
C. albicans
NA
50g = 8mm; 100g = 9mm g = 12mm
C. dubliniensis
2
g = 9mm g = 9mm g = 15mm
C. neoformans NA NA
g = 16mm
1
microrganismos ATCC;
2
isolado clinico SM-26;
3
padrão antibiótico Cloranfenicol para bactérias e
Nistatina para fungos em µg; NA = Não ativo; F1: Baccharidastrum triplinervium coletada na primavera;
F2: Baccharidastrum triplinervium coletada no verão
92
Figura 18: Teste de difusão em disco do óleo volátil de Baccharidastrum triplinervium
coletada na primavera frente à bactéria Staphylococcus epidermidis. Foi usado o
revelador TTC para melhor visualização dos resultados.
Figura 19: Teste de difusão em disco do óleo volátil de Baccharidastrum triplinervium
coletada no verão frente ao fungo Candida dubliniensis. O uso de revelador não foi
necessário.
93
5.1.2.3 Microdiluição em caldo (CIM):
Foram utilizadas as mesmas amostras F1 e F2 para a determinação da
concentração inibitória mínima (CIM). Este método foi realizado a partir da técnica do
NCCLS modificada.
45,84,179
.
É um método quantitativo e confirma os resultados já obtidos anteriormente
pelos métodos de bioautografia e difusão em disco.
Os resultados de CIM e CBM/CFM para os óleos de Baccharidastrum
triplinervium são demonstrados na Tabela 8 abaixo:
Tabela 8: Resultados de CIM, CBM e CFM para os óleos voláteis B. triplinervium
Microrganismos
a
F1 F2 Padrão
c
CIM
b
CBM
b
CIM
b
CBM
b
CIM
b
Staphylococcus aureus 5 >20 5 >20 6,25 x10
-3
Staphylococcus epidermidis 5 >20 5 >20 3,12 x10
-3
Bacillus subtilis 5 >20 5 >20 3,12 x10
-3
Escherichia coli 5 >20 5 >20 6,25 x10
-3
Pseudomonas aeruginosa 5 >20 5 5 6,25 x10
-3
Salmonella setubal 5 >20 5 >20 3,12 x10
-3
Klebsiella pneumoniae 5 >20 5 5 6,25 x10
-3
CIM
b
CFM
b
CIM
b
CFM
b
CIM
b
Saccharomyces cerevisiae 10 >20 10 >20 10,3 x10
-3
Candida albicans >20 - 10 10 10,3 x10
-3
Candida dubliniensis 10 >20 10 >20 10,3 x10
-3
Cryptococcus neoformans 20 >20 20 - 5,15 x10
-3
a
ATCC (American Type Culture Collection);
b
em mg.mL
-1
;
c
Cloranfenicol para bactérias e nistatina
para levedura; F1: Baccharidastrum triplinervium coletada na primavera; F2: Baccharidastrum
triplinervium coletada no verão
A atividade antimicrobiana apresentada pelos óleos de B. triplinervium foi
semelhante apesar da diferença existente na porcentagem dos sesquiterpenos
majoritários que compõem essas amostras.
Os resultados dos CIMs para os óleos testados foram mais significativos para as
bactérias como já havia sido demonstrado nos outros testes qualitativos de bioautografia
e difusão em disco.
Pode-se observar também que a amostra F2 coletada no verão, é
bactericida/fungicida, já que os valores do CIM obtidos coincidem com os do CBM e
CFM, para as bactérias Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae e para a
94
levedura Candida albicans em 5 mg.mL
-1
e 10 mg.mL
-1
. O óleo foi considerado
bacteriostático/fungiostático frente aos demais microrganismos já que os valores do
CIM foram inferiores aos do CBM/CFM .
O mesmo ocorreu com a amostra F1 que se apresentou
bacteriostática/fungiostática frente a todos os microrganismos testados.
5.1.3 Determinação da toxicidade in vivo dos óleos essenciais de Baccharidastrum
triplinervium:
5.1.3.1 Teste de letalidade com Artemia salina:
O teste é realizado submetendo-se ovos recém-eclodidos de Artemia salina a
uma solução contendo a amostra em diversas concentrações. Após um período de 24 h
observa-se o número total de larvas. Determinou-se a CL
50
, concentração letal capaz de
matar 50% da população total de animais, por métodos de regressão linear. As amostras
são consideradas ativas quando CL
50
< 250 g mL
-1
.
Foram testadas as mesmas amostras de óleos voláteis selecionadas para o teste
de CIM, sendo que as análises foram realizadas em triplicata, obtendo-se uma média
dos resultados, conforme a Tabela 9:
Tabela 9: Determinação da concentração letal frente à Artemia salina dos óleos de B.
triplinervium
Amostras
LC
50
(g mL
-1
)
F1 29,63
F2 31,8
Sulfato de quinidina 264
K
2
Cr
2
O
7
15,32
F1: Baccharidastrum triplinervium coletada na primavera; F2: Baccharidastrum triplinervium coletada
no verão
Após comparação com dados da literatura
163,166
pode-se afirmar que as amostras
de B. triplinervium apresentaram alta toxicidade frente a A. salina, com CL
50
de 29,63
e 31,8 g.mL
-1
, respectivamente, o que pode vir a comprovar sua ação tóxica frente a
bovinos, descrita na literatura.
20
Os padrões de toxidez utilizados foram o sulfato de
95
quinidina que é um agente oxidante, citotóxico e dicromato de potássio, sal de metal
pesado usado para monitorar o desempenho do teste.
5.1.4 Determinação da atividade antioxidante dos óleos essenciais de
Baccharidastrum triplinervium pelo Método do DPPH:
As amostras utilizadas foram às mesmas já descritas anteriormente, nas mesmas
concentrações testadas já na bioautografia.
A amostra F1 apresentou atividade antioxidante moderada em 25 g enquanto a
amostra F2 não apresentou atividade antioxidante quando comparada ao padrão
quercetrina (Figura 20).
Figura 20: Resultado do teste de DPPH para o óleo volátil de B. triplinervium coletado
na primavera.
96
5.2 Baccharis pentodonta Malme
5.2.1 Estudo do óleo volátil das folhas e flores de Baccharis pentodonta:
As folhas de Baccharis pentodonta foram coletadas em Santana do Livramento,
no verão (BPF2), na primavera (BPF5) e no inverno (BPF4). As flores, somente no
verão (BPFl2), época de sua floração. Flores e folhas foram submetidas a extração por
hidrodestilação em Clevenger modificado.
Os dados físicos obtidos pra B. pentodonta estão descritos na Tabela 10.
Tabela 10: Dados físicos dos óleos essenciais de Baccharis pentodonta.
Amostra R d α [0,05; CH
2
Cl
2
] η
Folhas – verão (BPF2) 0,23 0,93 -30 1,5057
Flores – verão (BPFl2) 0,43 0,85 -20 1,5025
Folhas – inverno (BPF4) 0,3 0,85 -40 1,4806
Folhas – primavera (BPF5) 0,29 0,86 -60 1,4171
R – rendimento em porcentagem; d - densidade em g.mL
-1
, α - rotação ótica e η - índice de refração.
A análise por Cromatografia Gasosa mostrou diferenças entre as análises
realizadas em diferentes estações do ano.
97
2
3
4
5
8
10
1112
16
17
18
21
22
23
24
30
31
34
35
37
38
H
HHO
2
3
4
5
8
10
1112
16
17
18
21
22
23
24
30
31
34
35
37
38
2
3
4
5
8
10
1112
16
17
18
21
22
23
24
30
31
34
35
37
38
2
3
4
5
8
10
1112
16
17
18
21
22
23
24
30
31
34
35
37
38
H
HHO
Figura 21: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de B. pentodonta coletadas no
inverno (BPF4). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.
1
2
4
6
7
8
9
10
12
13
14
15
18
22
19
20
21
23
25
28
24
27
29
34
36
H
H
H
OH
OH
1
2
4
6
7
8
9
10
12
13
14
15
18
22
19
20
21
23
25
28
24
27
29
34
36
1
2
4
6
7
8
9
10
12
13
14
15
18
22
19
20
21
23
25
28
24
27
29
34
36
1
2
4
6
7
8
9
10
12
13
14
15
18
22
19
20
21
23
25
28
24
27
29
34
36
H
H
H
OH
OH
H
H
H
OH
OH
Figura 22: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de B. pentodonta coletadas na
primavera (BPF5). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.
98
Tabela 11: Composição das folhas dos óleos voláteis de Baccharis pentodonta
coletadas no inverno e na primavera.
N.º
Componente
a
IK
b
IK
c
BPF4 BPF5
Identificação
Monoterpenos hidrocarbonetos 13,43 5,13
01
-tujeno
930 930 - 0,54 CG-EM, IK
02
-pineno
979 972 2,55 2,08 CG-EM, IK
03
óxido linalol 993 995 7,85
CG-EM, IK
04
limoneno 1029 1026 3,03 2,51 CG-EM, IK
Monoterpenos oxigenados 3,44 1,61
05
álcool santolina 1040 1040 3,44 - CG-EM, IK
06
trans óxido carvona 1276 1277 - 1,61 CG-EM, IK
Sesquiterpenos hidrocarbonetos 39,67 40,11
07
α-copaeno 1377 1371 - 1,5 CG-EM, IK
08
trans-cariofileno 1409 1404 1,66 2,97 CG-EM, IK
09
α-gurjuneno 1410 1414 - 4,54 CG-EM, IK
10
β-gurjuneno 1434 1435 0,98 1,23 CG-EM, IK
11
bakerol 1446 1445 5,3 - CG-EM, IK
12
α-humuleno 1455 1450 5,8 1,23 CG-EM, IK
13
aloaromadendreno 1460 1457 - 3,4 CG-EM, IK
14
γ-gurjuneno 1477 1476 - 1,24 CG-EM, IK
15
γ -muuroleno 1480 1480 - 2,22 CG-EM, IK
16
germacreno D 1485 1485 1,1 0,4 CG-EM, IK
17
β-selineno 1490 1487 1,6 0,83 CG-EM, IK
18
viridifloreno 1497 1495 4,12 10,9 CG-EM, IK
19
biciclogermacreno 1500 1501 - 1,18 CG-EM, IK
20
γ-cadineno 1514 1514 1,16 1,28 CG-EM, IK
21
δ-cadineno 1523 1523 3,81 1,53 CG-EM, IK
22
trans-calameneno 1529 1524 14,14 5,66 CG-EM, IK
Sesquiterpenos oxigenados 37,47 42,45
23
elemol 1550 1564 1,1 2,4 CG-EM, IK
24
ledol 1569 1569 3,75 1,24 CG-EM, IK
25
germacreno-D-4-ol 1576 1575 - 4,77 CG-EM, IK
26
espatulenol 1578 1579 - 1,7 CG-EM, IK
27
óxido cariofileno 1583 1581 - 3,63 CG-EM, IK
28
viridiflorol 1593 1589 - 16,4 CG-EM, IK
29
widrol 1599 1599 - 5,9 CG-EM, IK
30
epóxido humuleno II 1608 1609 1,5 - CG-EM, IK
31
epi-cedrol 1619 1620 5,5 - CG-EM, IK
32
epóxido β-cedreno 1623 1624 1,6 - CG-EM, IK
33
Trans isolongifolanona 1627 1627 2,9 - CG-EM, IK
34
epi-α-muurolol 1642 1625 12,25 3,05 CG-EM, IK
35
α-muurolol 1646 1644 3,53 0,63 CG-EM, IK
36
α-cadinol 1654 1652 - 2,73 CG-EM, IK
37
epi-α-bisabolol 1685 1683 3,04 - CG-EM, IK
38
acorenona B 1698 1697 2,3 - CG-EM, IK
TOTAL 94,01 89,3
99
a
Componentes listados em ordem de eluição na coluna SE-54;
b
Índice de Kovats da literatura;
c
Índice de Kovats calculado na coluna SE-54; BPF4: constituição da amostra de folhas de B.
pentodonta coletadas no inverno, em %; BPF5: constituição da amostra de folhas de B.
pentodonta coletadas na primavera, em %.
A amostra da primavera apresenta como principais constituintes viridiflorol
(16,4%), viridifloreno (10,9%), widrol (5,9%) e trans-calameneno (5,66%). Já a
amostra coletada no inverno apresenta como majoritários trans-calameneno (14,14%),
epi-α-muurulol (12,25%), óxido linalol (7,85%) e α-humuleno (5,8%).
Gráfico 2: Comparação entre os constituintes majoritários dos óleos essenciais das
folhas de Baccharis pentodonta coletadas no inverno (BPF4) e na primavera (BPF5).
BPF4
BPF5
α-humuleno
epi-α-muurulol
widrol
viridiflorol
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
α-humuleno
óxido linalol
epi-α-muurulol
trans-calameneno
widrol
viridifloreno
viridiflorol
Foram também comparados separadamente, por apresentar perfis muito
semelhantes, os óleos essenciais extraídos das folhas e flores no período de verão. As
Figuras 23 e 24 e a Tabela 12 ilustram a composição dos óleos coletados no verão.
100
1
2
3
4
5
6
10
7
9
17
16
18
20
13
15
12
8
HO
1
2
3
4
5
6
10
7
9
17
16
18
20
13
15
12
8
HO
1
2
3
4
5
6
10
7
9
17
16
18
20
13
15
12
8
1
2
3
4
5
6
10
7
9
17
16
18
20
13
15
12
8
HO
Figura 23: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de B. pentodonta coletadas no
verão (BPF2). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.
2
3
4
5
6
7
8
9
10 12
13
15
16
17
18
20
HO
2
3
4
5
6
7
8
9
10 12
13
15
16
17
18
20
2
3
4
5
6
7
8
9
10 12
13
15
16
17
18
20
HO
Figura 24: Perfil cromatográfico do óleo das flores de B. pentodonta coletadas no
verão (BPFl2). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.
101
Tabela 12: Composição dos óleos voláteis de folhas e flores de Baccharis pentodonta
coletadas no verão.
N.º
Componente
a
IK
b
IK
c
BPF2 BPFL2
Identificação
Monoterpenos hidrocarbonetos 51,1 56,71
01
-tujeno
930 936 2,54 2,67 CG-EM, IK
02
-pineno
979 971 10,1 12,05 CG-EM, IK
03
-felandreno
1003 1004 22,2 26,9 CG-EM, IK
04
α-terpineno 1017 1015 5,75 5,36 CG-EM, IK
05
-ocimeno
1037 1035 2,01 0,83 CG-EM, IK
06
(E)-β-ocimeno 1050 1048 8,5 8,9 CG-EM, IK
Monoterpenos oxigenados 14,27 8,5
07
acetofenona 1065 1066 4,37 2,6 CG-EM, IK
08
p-cresol 1076 1076 3,6 2,06 CG-EM, IK
09
trans diidro carvona 1201 1202 2,4 1,74 CG-EM, IK
10
aloaromadandreno 1460 1465 3,9 2,1 CG-EM, IK
Sesquiterpenos hidrocarbonetos 4,24 2,97
11
biciclogermacreno 1500 1501 0,31 0,32 CG-EM, IK
12
trans-calameneno 1529 1532 3,93 2,65 CG-EM, IK
Sesquiterpenos oxigenados 21,52 21,98
13
elemol 1550 1548 3,06 4,04 CG-EM, IK
14
ledol 1569 1566 0,43 0,33 CG-EM, IK
15
óxido cariofileno 1583 1577 1,6 3,83 CG-EM, IK
16
α-acorenol 1633 1633 5,15 5,05 CG-EM, IK
17
epi-α-muurolol 1642 1638 1,53 2,65 CG-EM, IK
18
α-muurolol 1646 1638 4,6 1,96 CG-EM, IK
19
α-cadinol 1654 1656 0,71 0,62 CG-EM, IK
20
germacrona 1694 1695 2,53 1,86 CG-EM, IK
21
(E)-γ-atlantona 1707 1708 1,91 1,64 CG-EM, IK
TOTAL 91,13 90,16
a
Componentes listados em ordem de eluição na coluna SE-54;
b
Índice de Kovats da literatura;
c
Índice de Kovats calculado na
coluna SE-54; BPF2: constituição da amostra de folhas de B.
pentodonta coletadas no verão, em %; BPFl2: constituição da
amostra de flores de B. pentodonta coletadas no verão, em %.
α-felandreno (22,2%-26,9%), β-pineno (10,1%-12,05%), (E)-β-ocimeno (8,5%-
8,9%), α-terpineno (5,75%-5,36%) e α-acorenol (5,15%-5,05%) são os componentes
majoritários do óleo essencial extraído das folhas e das flores de B. pentodonta.
102
Gráfico 3: Comparação entre as porcentagens dos componentes majoritários
encontrados nas folhas (BPF2) e flores (BPFl2) de Baccharis pentodonta coletadas no
verão.
BPF2
BPFl2
α-acorenol
α-terpineno
(E)-β-ocimeno
β-pineno
α-felandreno
0
5
10
15
20
25
30
5.2.2 Determinação das atividades biológicas in vitro dos óleos essenciais de
Baccharis pentodonta:
5.2.2.1 Bioautografia:
Os resultados do teste de bioautografia estão representados na Tabela 13,
abaixo.
103
Tabela 13: Determinação da quantidade de substância ativa dos óleos voláteis de
Baccharis pentodonta pelo método de bioautografia.
Microrganismos BPF2
1
BPFl2
1
BPF4
1
BPF5
1
Padrão
2
Staphylococcus aureus (ATCC 6538p) 50 50 100 100 0,7
Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) 50 50 NA 100 0,7
Escherichia coli (ATCC 25792) 25 25 100 100 0,5
Salmonella setubal (ATCC 19796) 25 50 50 100 0,7
Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031) 12,5 6,25 NA 100 0,5
Bacillus subtilis (ATCC 6633) 25 25 100 100 0,8
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) 50 50 100 100 0,6
Sacharomyces cerevisae (ATCC 2601) NA NA NA NA 3,24
Candida albicans (ATCC 10231) NA NA NA NA 2,43
Candida dubliniensis (isolado clínico SM-26) NA NA NA NA 4,05
Cryptococcus neoformans (ATCC 28952) NA NA NA NA 2,43
1
em
g;
2
Padrão antibiótico Cloranfenicol para bactérias e
Nistatina para fungos em
g; NA = Não ativo; BPF2: folhas de
Baccharis pentodonta coletadas no verão; BPFl2: flores de
Baccharis pentodonta coletadas no verão; BPF4: folhas de
Baccharis pentodonta coletadas no inverno e BPF5: folhas de
Baccharis pentodonta coletadas na primavera.
Os resultados apresentados na Tabela 13 demonstram que as amostras coletadas
no verão, tanto folhas como flores, apresentam melhor atividade que as coletadas nas
outras estações do ano; isso pode ter ocorrido devido a maior proporção de
monoterpenos presentes nas amostras de folhas e flores coletadas no verão. É
importante salientar ainda a atividade apresentada por flores e folhas coletadas nesta
estação contra a bactéria Klebsiella pneumoniae (6,25 g e 12,5 g, respectivamente).
Observa-se ainda que a amostra coletada na primavera não apresentou atividade
contra nenhum dos microrganismos testados pelo método de bioautografia.
Nenhuma das amostras apresentou atividade antifúngica.
104
Figura 25: Teste de bioautografia dos óleos voláteis das folhas e flores de Baccharis
pentodonta, coletadas no verão, frente à bactéria Staphylococcus aureus.
5.2.2.2 Difusão em Disco:
Apesar de apresentaram atividade pelo método de bioautografia, as amostras de
óleos voláteis de Baccharis pentodonta não apresentaram atividade antimicrobiana pelo
método de difusão em disco.
105
Figura 26: Teste de difusão em disco do óleo volátil de Baccharis pentodonta coletada
no inverno frente a bactéria Pseudomonas aeruginosa .
5.2.2.3 Microdiluição em caldo (CIM):
Foram utilizadas as mesmas amostras para a determinação da concentração
inibitória mínima (CIM).
Apesar de ser o método de maior confiança por ser quantitativo, as amostras
BPF2 e BPFl2, coletadas no verão não tiveram sua atividade antimicrobiana
determinada por este método.
Os resultados de CIM e CBM/CFM para os óleos de Baccharis pentodonta estão
demonstrados na Tabela 14 abaixo:
Tabela 14: Resultados de CIM, CBM e CFM para os óleos voláteis B. pentodonta.
Microrganismos
a
BPF4 BPF5 Padrão
c
CIM
b
CBM
b
CIM
b
CBM
b
CIM
b
Staphylococcus aureus 5 20 20 >20 3,12 x10
-3
Staphylococcus epidermidis 5 20 >20 - 3,12 x10
-3
Bacillus subtilis 5 >20 20 >20 1,56 x10
-3
Escherichia coli 5 >20 >20 - 3,12 x10
-3
Pseudomonas aeruginosa 5 >20 >20 - 3,12 x10
-3
Salmonella setubal 10 >20 >20 - 3,12 x10
-3
Klebsiella pneumoniae 1,25 5 >20 - 1,56 x10
-3
CIM
b
CFM
b
CIM
b
CFM
b
CIM
b
Saccharomyces cerevisiae 20 20 >20 - 10,3 x10
-3
106
Candida albicans 20 20 20 >20 10,3 x10
-3
Candida dubliniensis 20 20 20 >20 10,3 x10
-3
Cryptococcus neoformans 10 10 20 >20 5,15 x10
-3
a
ATCC (American Type Culture Collection);
b
em mg.mL
-1
;
c
Cloranfenicol para bactérias e nistatina para levedura; BPF4:
folhas de Baccharis pentodonta coletadas no inverno e BPF5:
folhas de Baccharis pentodonta coletadas na primavera.
Após a determinação da concentração inibitória mínima, observa-se grande
diferença entre as atividades apresentadas pela espécie Baccharis pentodonta nas
diferentes coletas realizadas no inverno e na primavera.
A atividade antimicrobiana apresentada pelo óleo essencial da espécie coletada
no inverno é agora ainda mais proeminente (isso já havia sido verificado na
bioautografia).
Esta amostra, BPF4, apresenta melhora considerável em sua atividade
antimicrobiana quando comparada à amostra coletada na primavera (BPF5). Isso se
deve provavelmente a diferença de constituição apresentada por essas duas amostras.
Faz-se referência a atividade apresentada pelo óleo coletado no inverno contra a
bactéria Klebsiella pneumoniae, 1,25 mg.mL
-1
, com ação bactericida já em 5 mg.mL
-1
.
Os resultados dos CIMs para os óleos testados foram mais significativos para as
bactérias como já havia sido demonstrado na bioautografia, porém a partir do CIM
consegue-se observar também a atividade dos fungos/leveduras mesmo que em menor
proporção.
5.2.3 Determinação da toxicidade in vivo dos óleos essenciais de Baccharis
pentodonta:
5.2.3.1 Teste de letalidade com Artemia salina:
O teste de Artemia salina tem seus resultados expressados na tabela abaixo. As
amostras são consideradas ativas quando CL
50
< 250 g mL
-1
.
107
Foram testadas as mesmas amostras de óleos voláteis selecionadas para o teste
de bioautografia, sendo que as análises foram realizadas em triplicata, obtendo-se uma
média dos resultados, conforme a Tabela 15:
Tabela 15: Determinação da concentração letal frente à Artemia salina dos óleos de B.
pentodonta.
Amostras
LC
50
(g mL
-1
)
BPF2 73,6
BPFl2 72,9
BPF4 77,45
BPF5 74,37
Sulfato de quinidina 264
K
2
Cr
2
O
7
15,32
BPF2: folhas de Baccharis pentodonta coletadas no verão;
BPFl2: flores de Baccharis pentodonta coletadas no verão;
BPF4: folhas de Baccharis pentodonta coletadas no inverno e
BPF5: folhas de Baccharis pentodonta coletadas na primavera.
Após comparação com dados da literatura
163,166
pode-se afirmar que as amostras
de B. pentodonta apresentaram alta toxicidade frente A. salina, com CL
50
em torno de
75 g mL
-1
.
.
5.2.4 Determinação da atividade antioxidante dos óleos essenciais de Baccharis
pendonta pelo Método do DPPH:
108
As amostras utilizadas para determinação da atividade antioxidante são as
mesmas usadas para determinação da quantidade de substância ativa pelo método de
bioautografia.
As amostras BPF4 (inverno) e BPF5 (primavera) não apresentaram atividade
antioxidante.
As amostras coletadas no verão (BPF2 e BPFl2) apresentam atividade
antioxidante moderada em 100µg.
Já era esperado que os óleos essenciais de folhas e flores de Baccharis
pentodonta apresentassem atividade antioxidante semelhante, pois as duas amostras em
questão apresentam praticamente a mesma composição química havendo mínima
variação nos teores dos componentes majoritários.
Figura 27: Resultado do teste de DPPH para os óleos voláteis de B. pentodonta
coletados no verão.
109
5.3 Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera
5.3.1 Estudo do óleo volátil das folhas e flores de Pluchea sagittalis:
As folhas (PSF2) e flores (PSFl2) de Pluchea sagittalis foram coletadas no
verão e submetidas, separadamente, à extração por hidrodestilação utilizando
aparelho de “Clevenger” modificado. Após a extração, o óleo foi submetido à análise
cromatográfica, conforme ilustram as Figuras 28 e 29 e a Tabela 17, sendo que a
numeração dos constituintes apresentada nos cromatogramas corresponde à
numeração dos mesmos na tabela.
Os óleos apresentam coloração levemente amarelada e os rendimentos para
folhas e flores, juntamente com os dados físicos obtidos para Pluchea sagittalis estão
descritos na Tabela 16. A rotação ótica não foi calculada para as amostras PSF2 e
PSFl2.
Tabela 16: Dados físicos para os óleos essenciais de Pluchea sagittalis
110
Amostra R d η
Folhas – verão (PSF2) 0,23 0,74 1,4936
Flores – verão (PSFl2) 0,2 0,78 1,4725
R – rendimento em porcentagem; d - densidade em g.mL
-1
, α - rotação ótica e η - índice de refração.
6
7
8
11
12
16
17
9
10
21
25
2418 26
32
27
28
30
33
36
37
6
7
8
11
12
16
17
9
10
21
25
2418 26
32
27
28
30
33
36
37
6
7
8
11
12
16
17
9
10
21
25
2418 26
32
27
28
30
33
36
37
O
OH
OH
H
H
HO
6
7
8
11
12
16
17
9
10
21
25
2418 26
32
27
28
30
33
36
37
6
7
8
11
12
16
17
9
10
21
25
2418 26
32
27
28
30
33
36
37
6
7
8
11
12
16
17
9
10
21
25
2418 26
32
27
28
30
33
36
37
O
OH
OH
H
H
HO
O
OH
OH
H
H
HO
Figura 28: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de Pluchea sagittalis coletadas
no verão (PSF2). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.
111
6
1
2
3
7
8
11
12
10
9
32
33
29
26
24
25
18
16
17
6
1
2
3
7
8
11
12
10
9
32
33
29
26
24
25
18
6
1
2
3
7
8
11
12
10
9
32
33
29
26
24
25
6
1
2
3
7
8
11
12
10
9
32
33
29
26
24
25
18
16
17
O
OH
H
HO
6
1
2
3
7
8
11
12
10
9
32
33
29
26
24
25
18
16
17
6
1
2
3
7
8
11
12
10
9
32
33
29
26
24
25
18
6
1
2
3
7
8
11
12
10
9
32
33
29
26
24
25
6
1
2
3
7
8
11
12
10
9
32
33
29
26
24
25
18
16
17
O
OH
H
HO
Figura 29: Perfil cromatográfico do óleo das flores de Pluchea sagittalis coletadas
no verão (PSFl2). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.
Tabela 17: Composição dos óleos voláteis de folhas e flores de Pluchea sagittalis
coletadas no verão.
N.º
Componente
a
IK
b
IK
c
PSF2 PSFl2
Identificação
Monoterpenos hidrocarbonetos 1,88 5,28
01
-pineno
939 933 0,26 1,5 CG-EM, IK
02
verbeneno 968 970 0,4 2,45 CG-EM, IK
03
sabineno 975 972 0,33 0,92 CG-EM, IK
04
-pineno
979 982 0,36 - CG-EM, IK
05
p-cimeno 1025 1021 0,53 0,41 CG-EM, IK
Monoterpenos oxigenados 36,83 50,21
06
1,8 cineol 1031 1030 23,5 36,5 CG-EM, IK
07
cis-sabineno hidrato 1070 1065 1,67 1,61 CG-EM, IK
08
trans-sabineno hidrato 1098 1097 1,02 0,6 CG-EM, IK
09
óxido -pineno
1159 1160 0,64 1,35 CG-EM, IK
10
cis-diidro-α-terpineol 1165 1165 0,96 2,64 CG-EM, IK
11
pinocanfona 1175 1175 3,58 2,3
12
α-terpineol 1189 1189 3,96 3,8 CG-EM, IK
13
cuminaldeído 1242 1248 0,6 0,21 CG-EM, IK
14
1
trans-sabinil acetato 1291 1281 0,4 0,2 CG-EM, IK
15
mirtenil acetato 1327 1323 0,5 1,0 CG-EM, IK
Sesquiterpenos hidrocarbonetos 4,16 4,01
16
α-copaeno 1377 1371 1,11 0,47 CG-EM, IK
17
β-cubebeno 1388 1387 0,38 0,33 CG-EM, IK
18
trans-cariofileno 1409 1413 0,43 0,98 CG-EM, IK
19
cis-cariofileno 1419 1423 0,2 0,42 CG-EM, IK
20
aromadendreno 1441 1446 0,3 0,62 CG-EM, IK
21
α-humuleno 1455 1455 1,1 0,44 CG-EM, IK
112
22
β-selineno 1490 1487 0,64 0,75 CG-EM, IK
Sesquiterpenos oxigenados 33,02 20,06
23
cubebol 1515 1511 0,62 0,53 CG-EM, IK
24
cis-calameneno 1540 1546 0,52 1,76 CG-EM, IK
25
espatulenol 1578 1576 5,83 1,3 CG-EM, IK
26
óxido cariofileno 1583 1579 2,5 2,02 CG-EM, IK
27
gleenol 1587 1590 1,97 0,93 CG-EM, IK
28
epóxido humuleno II 1608 1603 0,92 0,61 CG-EM, IK
29
β-epóxido cedreno 1623 1622 1,03 2,12 CG-EM, IK
30
cariofila-4(14),8(15)-dien-5-β-ol 1641 1640 1,7 0,41 CG-EM, IK
31
epi-α-murulol 1642 1646 0,43 0,37 CG-EM, IK
32
intermedeol 1667 1660 12,9 7,7 CG-EM, IK
33
14-hidróxi-9-epi-(E)-cariofileno 1670 1666 1,35 1,48 CG-EM, IK
34
epi-α-bisabolol 1685 1683 0,43 0,13 CG-EM, IK
35
melaleucol 1707 1708 0,81 0,32 CG-EM, IK
36
longifolol 1715 1711 1,01 0,16 CG-EM, IK
37
nerolidol acetato 1717 1717 1,11 0,22 CG-EM, IK
TOTAL 75,89 79,56
a
Componentes listados em ordem de eluição na coluna SE-54;
b
Índice de Kovats da literatura;
c
Índice de
Kovats calculado na coluna SE-54; PSF2: constituição da amostra de folhas de Pluchea sagittalis
coletadas no verão, em %; PSFl2: constituição da amostra de flores de Pluchea sagittalis coletadas no
verão, em %.
Os óleos essenciais de flores e folhas de Pluchea sagittalis apresentam
composição química semelhante. As folhas de P. sagittalis têm como constituintes
principais 1,8-cineol (23,5%), intermedeol (12,9%), espatulenol (5,83%) e α-terpineol
(3,96%) e as flores 1,8-cineol (36,5%), intermedeol (7,7%) e α-terpineol (3,8%).
Gráfico 4: Comparação entre as porcentagens dos componentes majoritários
encontrados nas folhas (PSF2) e flores (PSFl2) de Pluchea sagittalis coletadas no verão.
113
PSF2
PSFl2
α-terpineol
espatulenol
intermedeol
1,8-cineol
0
5
10
15
20
25
30
35
40
5.3.2 Determinação das atividades biológicas in vitro para os óleos essenciais de
Pluchea sagittalis:
5.3.2.1 Bioautografia:
Os resultados de bioautografia para as amostras de folhas e flores de Pluchea
sagittalis são descritos na Tabela 18, abaixo.
Tabela 18: Determinação da quantidade de substância ativa dos óleos voláteis de folhas
e flores de Pluchea sagittalis pelo método de bioautografia.
Microrganismos: PSF2
1
PSFl2
1
Padrão
2
S. aureus (ATCC 6538p) 25 12,5 0,7
S. epidermidis (ATCC 12228) 50 25 0,7
K. pneumoniae (ATCC 10031) 12,5 3,12 0,5
E. coli (ATCC 25792) 12,5 12,5 0,7
S. setubal (ATCC 19796) 50 50 0,5
P. aeruginosa (ATCC 27853) 50 25 0,8
B. subtilis (ATCC 6633) 25 25 0,6
S. cerevisae (ATCC 2601)
NA NA
3,24
114
C. albicans (ATCC 10231)
NA NA
2,43
C. dubliniensis (SM-26)
NA
NA 4,05
C. neoformans (ATCC 28952
NA
NA 2,43
1
em
g;
2
Padrão antibiótico Cloranfenicol para bactérias e
Nistatina para fungos em
g; NA = Não ativo; PSF2: folhas de
Pluchea sagittalis coletadas no verão; PSFl2= flores de
Pluchea sagittalis coletadas no verão.
Segundo os resultados obtidos por este método, evidencia-se que a atividade
apresentada pelas flores é um pouco melhor que a apresentada pela folhas.
Na bactéria Klebsiella pneumoniae fica bem evidenciada a melhor ação
bactericida do óleo essencial da flor de Pluchea sagittalis. Essa melhora da atividade
apresentada pela flor, mesmo que pequena, ou inexistente como no caso das bactérias
Bacillus subtilis, Salmonella setubal e Escherichia coli, pode ser atribuída à composição
química deste óleo, que apresenta maior proporção do monoterpeno oxigenado 1,8-
cineol, conhecido por sua atividade antibacteriana.
181
Não foi evidenciada atividade antimicrobiana para os fungos/leveduras testados.
Figura 30: Teste de bioautografia do óleo volátil de Pluchea sagittalis, folha e flor
respectivamente, frente à bactéria Staphylococcus epidermidis.
181
TZAKOU, O., PITAROKILI, D., CHIMOU, I. B., HARVALA, C. Composition and antimicrobial
activity of the essential oil of Salvia ringens. Planta Medica 67, 81-83, 2001.
115
Figura 31: Teste de bioautografia do óleo volátil de Pluchea sagittalis, folha e flor
respectivamente, frente à bactéria Pseudomonas aeruginosa.
5.3.2.2 Difusão em Disco:
Pelo método de difusão em ágar em discos de papel, para os óleos voláteis de
Pluchea sagittalis não foi evidenciada atividade antimicrobiana nas concentrações
testadas (entre 100 e 3,12 µg).
5.3.2.3 Microdiluição em caldo (CIM):
As amostras utilizadas para a determinação do CIM são as mesmas, PSF2 e
PSFl2.
Os resultados de CIM e CBM/CFM para os óleos de Pluchea sagittalis estão
dispostos na Tabela 19, abaixo:
Tabela 19: Resultados de CIM, CBM e CFM para os óleos voláteis Pluchea sagittalis.
Microrganismos
a
PSF2 PSFl2 Padrão
c
CIM
b
CBM
b
CIM
b
CBM
b
CIM
b
Staphylococcus aureus 10 >20 5 >20 6,25 x10
-3
Staphylococcus epidermidis 10 >20 10 >20 3,12 x10
-3
Bacillus subtilis 10 >20 5 >20 3,12 x10
-3
Escherichia coli 10 >20 10 >20 6,25 x10
-3
Pseudomonas aeruginosa 10 >20 5 >20 6,25 x10
-3
Salmonella setubal 10 >20 10 >20 3,12 x10
-3
116
Klebsiella pneumoniae 10 >20 2,5 >20 6,25 x10
-3
CIM
b
CFM
b
CIM
b
CFM
b
CIM
b
Saccharomyces cerevisiae >20 - >20 - 10,3 x10
-3
Candida albicans >20 - >20 - 10,3 x10
-3
Candida dubliniensis >20 - >20 - 10,3 x10
-3
Cryptococcus neoformans >20 - >20 - 5,15 x10
-3
a
ATCC (American Type Culture Collection);
b
em mg.mL
-1
;
c
Cloranfenicol para bactérias e nistatina
para levedura; PSF2: folhas de Pluchea sagittalis coletadas no verão; PSFl2= flores de Pluchea sagittalis
coletadas no verão
A concentração inibitória mínima apresentada pelos óleos voláteis de P.
sagittalis só veio a confirmar o que já havia sido visualizado a partir do método de
bioautografia.
Nota-se uma melhor atividade antibacteriana apresentada pelo óleo extraído das
flores de P. sagittalis e novamente temos a bactéria gram negativa Klebsiella
pneumoniae como já havia ocorrido na bioautografia, como principal alvo
bacteriostático deste óleo essencial.
Os fungos/leveduras novamente não apresentaram atividade antimicrobiana pelo
método de diluição em caldo.
5.3.3 Determinação da toxicidade in vivo dos óleos essenciais de Pluchea sagittalis:
5.3.3.1 Teste de letalidade com Artemia salina:
O teste de letalidade por Artemia salina determinou a CL
50
, concentração letal
capaz de matar 50% da população total de animais, dos óleos essenciais de Pluchea
sagittalis. Quando CL
50
< 250 g.mL
-1
as amostras testadas possuem atividade contra os
microcrustáceos.
Foram testadas as mesmas amostras de óleos voláteis selecionadas para o teste
de CIM, sendo que as análises foram realizadas em triplicata, obtendo-se uma média
dos resultados, conforme a Tabela 20:
117
Tabela 20: Determinação da concentração letal frente à Artemia salina dos óleos de
Pluchea sagittalis.
Amostras
LC
50
(g mL
-1
)
PSF2 113,2
PSFl2 116,44
Sulfato de quinidina 264
K
2
Cr
2
O
7
15,32
PSF2: folhas de Pluchea sagittalis coletadas no verão; PSFl2= flores de Pluchea sagittalis coletadas no
verão
Após comparação com dados da literatura
163,166
pode-se afirmar que as amostras
de P. sagittalis apresentaram uma toxicidade moderada frente A. salina. Os padrões de
toxidez utilizados foram o sulfato de quinidina e o dicromato de potássio.
5.3.4 Determinação da atividade antioxidante dos óleos essenciais de Pluchea
sagittalis pelo Método do DPPH:
As amostras utilizadas foram às mesmas já descritas anteriormente, nas mesmas
concentrações testadas já na bioautografia.
Quando se avalia a atividade antioxidante dos óleos de Pluchea sagittalis
extraídos no verão, observa-se atividade apenas para a amostra das folhas e não para as
flores.
A amostra PSF2 apresentou atividade antioxidante moderada em 50g enquanto
a amostra PSFl2 não apresentou atividade antioxidante quando comparadas ao padrão
quercetrina (Figura 32).
118
Figura 32: Resultado do teste de DPPH para os óleos voláteis de flores e folhas de P.
sagittalis coletadas no verão.
5.4 Eupatorium buniifolium Hooker et Arnott:
5.4.1 Estudo do óleo volátil das folhas de Eupatorium buniifolium:
As folhas de Eupatorium buniifolium foram coletadas em Santana do
Livramento no verão (CH1) e no inverno (CH2) de 2005.
Os dados físicos obtidos para as amostras de óleos essenciais de Eupatorium
buniifolium esta na Tabela 21.
Tabela 21: Dados físicos obtidos para os óleos essenciais de Eupatorium buniifolium.
119
Amostra R d α [0,05; CH
2
Cl
2
] η
Folhas – verão (CH1) 0,23 0,74 +30 1,4866
Folhas – inverno (CH2) 0,2 0,76 +32 1,4836
R – rendimento em porcentagem; d – densidade em g.mL
-1
; α – rotação
ótica e η – índice de refração.
A análise cromatográfica esta representada nas Figuras 33 e 34 abaixo e pela
Tabela 22:
1
2
3
4
5
6 7
9
10
11
12
19
13
14
18
29
24
30
23
25
27
1
2
3
4
5
6 7
9
10
11
12
19
13
14
18
29
24
30
23
25
27
1
2
3
4
5
6 7
9
10
11
12
19
13
14
18
29
24
30
23
25
27
H
H
1
2
3
4
5
6 7
9
10
11
12
19
13
14
18
29
24
30
23
25
27
1
2
3
4
5
6 7
9
10
11
12
19
13
14
18
29
24
30
23
25
27
1
2
3
4
5
6 7
9
10
11
12
19
13
14
18
29
24
30
23
25
27
H
H
H
H
120
Figura 33: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de E. buniifolium coletadas no
verão (CH1). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.
1
2
3
4
5
6
7
8
10
11
12
13
14
15
9
16
17
26
27
25
24
23
22
1
2
3
4
5
6
7
8
10
11
12
13
14
15
9
16
17
26
27
25
24
23
22
1
2
3
4
5
6
7
8
10
11
12
13
14
15
9
16
17
26
27
25
24
23
22
1
2
3
4
5
6
7
8
10
11
12
13
14
15
9
16
17
26
27
25
24
23
22
1
2
3
4
5
6
7
8
10
11
12
13
14
15
9
16
17
26
27
25
24
23
22
1
2
3
4
5
6
7
8
10
11
12
13
14
15
9
16
17
26
27
25
24
23
22
Figura 34: Perfil cromatográfico do óleo das folhas de E. buniifolium coletadas no
inverno (CH2). A coluna utilizada é a SE-54, CCSF de 25 m. Programa de análise:
T
inicial
= 50 °C, T
final
= 250 °C, rampa de 4 °C min
-1
.
Tabela 22: Composição dos óleos voláteis das folhas de Eupatorium buniifolium
coletadas no verão e no inverno, respectivamente.
N.º
Componente
a
IK
b
IK
c
CH1 CH2
Identificação
Monoterpenos 51,67 56,8
01
α- tujeno 930 929 26,01 28,1 CG-EM, IK
02
α- pineno 939 939 1,9 2,43 CG-EM, IK
03
canfeno 954 963 2,95 3,6 CG-EM, IK
04
sabineno 975 966 8,54 9,42 CG-EM, IK
05
-pineno
979 982 2,1 2,0 CG-EM, IK
06
limoneno 1026 1025 5,34 6,8 CG-EM, IK
07
(Z)-β-ocimeno 1045 1039 3,57 2,5 CG-EM, IK
08
(E)-β-ocimeno 1048 1048 - 0,65 CG-EM, IK
09
m-cimeno 1086 1086 0,78 0,7 CG-EM, IK
10
terpinen-4-ol 1177 1167 0,48 0,6 CG-EM, IK
Sesquiterpenos hidrocarbonetos 28,74 16,94
121
11
β-elemeno 1391 1391 4,43 2,71 CG-EM, IK
12
trans-cariofileno 1409 1404 2,56 0,86 CG-EM, IK
13
α-humuleno 1455 1468 0,6 7,8 CG-EM, IK
14
γ-muuroleno 1480 1482 15,2 1,17 CG-EM, IK
15
β-selineno 1490 1490 1,41 1,95 CG-EM, IK
16
α-selineno 1498 1494 1,01 1,21 CG-EM, IK
17
germacreno A 1509 1510 1,33 1,24 CG-EM, IK
18
δ-cadineno 1523 1520 2,2 - CG-EM, IK
Sesquiterpenos oxigenados 9,55 17,35
19
elemol 1550 1541 0,7 0,5 CG-EM, IK
20
espatulenol 1578 1567 - 0,56 CG-EM, IK
21
óxido cariofileno 1583 1592 - 0,6 CG-EM, IK
22
epóxido de humuleno II 1608 1612 - 0,86 CG-EM, IK
23
epi α-cadinol 1640 1633 0,96 1,2 CG-EM, IK
24
epi α-muurolol 1642 1641 0,98 2,6 CG-EM, IK
25
β-eudesmol 1651 1653 1,98 0,75 CG-EM, IK
26
α-cadinol 1654 1660 - 2,17 CG-EM, IK
27
14-hidróxi-9-epi-cariofileno 1670 1671 0,93 4,7 CG-EM, IK
28
β-bisabolol 1675 1675 - 1,61 CG-EM, IK
29
elemol acetato 1681 1682 2,8 1,8 CG-EM, IK
30
α-bisabolol 1686 1686 1,2 - CG-EM, IK
TOTAL 89,96 91,09
a
Componentes listados em ordem de eluição na coluna SE-54;
b
Índice de Kovats da literatura;
c
Índice de
Kovats na coluna SE-54; CH1: constituição da amostra de folhas de Eupatorium buniifolium coletadas no
verão, em %; CH2: constituição da amostra de folhas de Eupatorium buniifolium coletadas no inverno,
em %.
O óleo essencial extraído no verão apresenta como constituintes principais os
monoterpenos α-tujeno (26,0%), sabineno (8,54%) e limoneno (5,34%) e o
sesquiterpeno γ-muuroleno (15,2%). O óleo extraído no inverno apresenta também
como principais constituintes os compostos monoterpênicos α-tujeno (28,1%), sabineno
(9,42%) e limoneno (6,8%) e o composto sesquiterpênico α-humuleno (7,8%), presente
na concentração de 0,6% na amostra coletada no verão.
A composição de ambos é semelhante, havendo diferença apenas na
concentração dos sesquiterpenos γ-muuroleno e α-humuleno, se considerados apenas os
constituintes majoritários de ambas as amostras.
Gráfico 5: Comparação entre as porcentagens dos componentes majoritários
encontrados nas folhas de Eupatorium buniifolium coletadas no verão (CH1) e no
inverno (CH2).
122
CH1
CH2
limoneno
α-humuleno
sabineno
γ-muuroleno
α-tujeno
0
5
10
15
20
25
30
5.4.2 Determinação das atividades biológicas in vitro para os óleos essenciais de
Eupatorium buniifolium:
5.4.2.1 Bioautografia:
Os óleos essenciais testados foram CH1, óleo extraído das folhas de E.
buniifolium, no verão e CH2, óleo extraído das folhas de E. buniifolium, no inverno.
O teste, pelo método de bioautografia, foi realizado em duplicata e os resultados
médios aparecem listados na Tabela 23, abaixo:
Tabela 23: Determinação da quantidade de substância ativa dos óleos voláteis das
folhas de Eupatorium buniifolium coletadas no verão e no inverno, respectivamente,
pelo método de bioautografia.
Microrganismos: CH1
1
CH2
1
Padrão
2
S. aureus (ATCC 6538p) 25 NA 0,7
S. epidermidis (ATCC 12228) 25 50 0,7
K. pneumoniae (ATCC 10031) 25 25 0,5
E. coli (ATCC 25792) 25 50 0,7
S. setubal (ATCC 19796) 25 50 0,5
P. aeruginosa (ATCC 27853) 6,25 12,5 0,8
B. subtilis (ATCC 6633) 25 NA 0,6
S. cerevisae (ATCC 2601)
NA NA
3,24
C. albicans (ATCC 10231)
NA NA
2,43
C. dubliniensis (SM-26) NA NA 4,05
C. neoformans (ATCC 28952 NA NA 2,43
123
1
em
g;
2
Padrão antibiótico Cloranfenicol para bactérias e
Nistatina para fungos em
g; NA = Não ativo; CH1: folhas de
Eupatorium buniifolium coletadas no verão; CH2: folhas de
Eupatorium buniifolium coletadas no inverno.
Para as amostras de Eupatorium buniifolium, conforme apresentado na Tabela
23, verifica-se uma melhor atividade antibacteriana para o óleo coletado no verão.
A bactéria P. aeruginosa de elevado interesse clínico por ser causadora de
contaminação hospitalar, se destaca, sendo inibida em uma concentração de 6,25 g e
12,5 g para as amostras coletadas no verão e no inverno, respectivamente.
Novamente os fungos/leveduras não apresentaram atividade antifúngica nas
concentrações testadas pelo método de bioautografia.
Figura 35: Teste de bioautografia do óleo volátil extraído das folhas de E. buniifolium,
coletadas no verão e no inverno, frente à bactéria Bacillus subtilis.
124
Figura 36: Teste de bioautografia do óleo volátil extraído das folhas de E. buniifolium,
coletadas no verão e no inverno, frente à bactéria Staphylococcus aureus.
5.4.2.2 Difusão em Disco:
Os óleos essenciais de Eupatorium buniifolium não apresentaram atividade
antimicrobiana quando testadas pelo método de difusão em discos de papel.
5.4.2.3 Microdiluição em caldo (CIM):
Os resultados de CIM e CBM/CFM para os óleos de Eupatorium buniifolium
são demonstrados na Tabela 24, abaixo:
Tabela 24: Resultados de CIM, CBM e CFM para os óleos voláteis Eupatorium
buniifolium.
Microrganismos
a
CH1 CH2 Padrão
c
CIM
b
CBM
b
CIM
b
CBM
b
CIM
b
Staphylococcus aureus 20 >20 20 >20 3,12 x10
-3
Staphylococcus epidermidis 10 >20 20 >20 3,12 x10
-3
Bacillus subtilis 20 >20 20 >20 3,12 x10
-3
Escherichia coli 20 >20 20 >20 3,12 x10
-3
125
Pseudomonas aeruginosa 20 >20 10 10 3,12 x10
-3
Salmonella setubal 20 >20 20 >20 1,56 x10
-3
Klebsiella pneumoniae 10 >20 20 >20 6,25 x10
-3
CIM
b
CFM
b
CIM
b
CFM
b
CIM
b
Saccharomyces cerevisiae >20 - >20 - 20,6 x10
-3
Candida albicans >20 - >20 - 10,3 x10
-3
Candida dubliniensis >20 - >20 - 10,3 x10
-3
Cryptococcus neoformans >20 - >20 - 5,15 x10
-3
a
ATCC (American Type Culture Collection);
b
em mg.mL
-1
;
c
Cloranfenicol para bactérias e nistatina para levedura; CH1:
folhas de Eupatorium buniifolium coletadas no verão; CH2:
folhas de Eupatorium buniifolium coletadas no inverno.
Os resultados dos CIMs para os óleos testados foram mais significativos para as
bactérias como já havia sido demonstrado no teste de bioautografia.
As amostras de E. buniifolium coletadas no verão e no inverno apresentaram,
assim como na bioautografia, melhor atividade frente a bactéria Pseudomonas
aeruginosa, sendo que a amostra CH2 também apresenta melhor atividade contra
Klebsiella pneumoniae quando comparada as demais bactérias testadas. Deve-se
salientar que a atividade antimicrobiana apresentada pelos óleos essencias de E.
buniifolium não é de grande importância por ter caráter bacteriostático ou fungiostático
e ser “ativa” apenas em altas concentrações (frequentemente 20 mg.mL
-1
).
O óleo essencial do inverno, apresentou-se bactericida frente a bactéria
Pseudomonas aeruginosa na concentração de 10 mg.mL
-1
.
Os óleos essenciais de E. buniifolium não apresentam atividade antifúngica.
As semelhanças entre as composições químicas das amostras coletadas no verão
e no inverno de Eupatorium buniifolium e a grande porcentagem de compostos
monoterpênicos explicam as atividades antimicrobianas observadas pelo método de
microdiluição em caldo.
5.4.3 Determinação da toxicidade in vivo dos óleos essenciais de Eupatorium
buniifolium:
126
5.4.3.1 Teste de letalidade com Artemia salina:
Foram testadas as mesmas amostras de óleos voláteis selecionadas para o teste
de CIM, sendo que as análises foram realizadas em triplicata, obtendo-se uma média
dos resultados, conforme a Tabela 25:
Tabela 25: Determinação da concentração letal frente à Artemia salina dos óleos
essenciais das folhas de E. buniifolium, coletadas no verão e no inverno.
Amostras
LC
50
(g mL
-1
)
CH1 56,98
CH2 51,6
Sulfato de quinidina 264
K
2
Cr
2
O
7
15,32
CH1: folhas de Eupatorium buniifolium coletadas no verão; CH2: folhas de Eupatorium buniifolium
coletadas no inverno.
As amostras de Eupatorium buniifolium apresentaram uma alta toxicidade frente
A. salina, após comparação dos dados obtidos com dados da literatura.
163,166
5.4.4 Determinação da atividade antioxidante dos óleos essenciais de Eupatorium
buniifolium pelo Método do DPPH:
As amostras utilizadas foram as mesmas já descritas anteriormente, nas mesmas
concentrações testadas já na bioautografia.
As amostras CH1 e CH2 apresentaram atividade antioxidante em 50g quando
comparadas ao padrão quercetrina.
O resultado é melhor evidenciado na Figura 37 a seguir.
127
Figura 37: Resultado do teste de DPPH para o óleo volátil de E. buniifolium coletado
no verão e no inverno. O padrão quercetrina não aparece porque havia outra amostra
abaixo.
128
6. CONCLUSÕES:
A partir dos resultados obtidos pôde–se concluir:
Os óleos essenciais analisados, de maneira geral, apresentam grande número de
constituintes sesquiterpênicos, não sendo estes necessariamente seus constituintes
majoritários.
Os óleos essenciais das folhas de Baccharidastrum triplinervium da primavera e
do verão apresentaram composição sesquiterpênica muito semelhante. Já Baccharis
pentodonta tem em sua amostra coletada na primavera maior teor de sesquiterpenos que
na amostra coletada no inverno. Entretanto, as amostras de óleo essencial de flor e de
folhas, do verão, apresentaram aproximadamente 50% de sua constituição química
composta de monoterpenos, entre os principais, α-felandreno, β-pineno, (E)-β-cimeno e
α-terpineno. Pluchea sagittalis, outra planta da família Asteraceae, que teve as amostras
de óleo coletadas no verão, tem em suas flores principalmente componentes
monoterpênicos, entre eles o 1,8-cineol que auxilia muito em sua atividade
antimicrobiana; o óleo extraído de suas folhas apresenta basicamente a mesma
composição química. Eupatorium buniifolium tem em suas folhas elevada composição
monoterpênica sendo α-tujeno o constituinte majoritário de ambas as amostras coletadas
no verão e no inverno.
Através dos ensaios de atividade antimicrobiana pôde-se observar que os óleos
das espécies estudadas apresentaram resultados positivos contra a maioria dos
microrganismos testados, concordando com o uso popular das espécies da família
Asteraceae.
A espécie Bacchardastrum triplinervium, coletada no verão (F2), mostrou
atividade bactericida frente a Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae na
concentração de 5 mg.mL
-1
e fungicida frente a levedura Candida albicans com CIM
de 10 mg.mL
-1
. O óleo obtido das folhas de Baccharis pentodonta no inverno (BPF4)
foi muito ativo contra a bactéria Klebsiella pneumoniae com CIM de 1,25 mg.ml
-1
e
CBM de 5 mg.mL
-1
; esta amostra ainda apresentou-se fungicida frente a Cryptococcus
neoformans na concentração de 10 mg.mL
-1
. Os óleos essenciais da espécie Pluchea
sagittalis apresentaram-se bacteriostáticos, não apresentando atividade antifúngica
frente aos microrganismos testados. A espécie Eupatorium buniifolium, coletada no
129
inverno, CH2, apresentou atividade bactericida contra a bactéria Pseudomonas
aeruginosa com um CIM de 10 mg.mL
-1
. Os demais óleos essenciais testados
apresentaram atividade bacteriostática e fungiostática frente aos microrganismos
testados.
Os testes de letalidade por Artemia salina revelaram que todas as amostras de
óleos testadas neste trabalho apresentaram atividade citotóxica entre alta e moderada
sendo, portanto consideradas como possuidoras de propriedades citotóxicas, podendo
apresentar ainda atividades antitumoral.
O teste de atividade antioxidante, pelo método de DPPH, revelou que alguns dos
óleos voláteis testados apresentaram atividade antioxidante moderada entre 100 e 25 µg.
Este método de determinação da atividade antioxidante serve apenas como um
screening para estudos futuros. Análises mais detalhadas sobre a atividade antioxidante
destes óleos devem ser realizadas para que se possa determinar o verdadeiro potencial
antioxidante das amostras analisadas.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
