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Vinicius Ricardo Cuña de Souza
CARCINOGÊNESE DE PELE E PULMÃO EM
LINHAGENS DE CAMUNDONGOS SELECIONADAS
SEGUNDO A REATIVIDADE INFLAMATÓRIA
AGUDA
São Paulo
2007
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Vinicius Ricardo Cuña de Souza
CARCINOGÊNESE DE PELE E PULMÃO EM
LINHAGENS DE CAMUNDONGOS SELECIONADAS
SEGUNDO A REATIVIDADE INFLAMATÓRIA
AGUDA
Tese apresentada ao Instituto de
Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para
obtenção do Título de Doutor em
Ciências.
São Paulo
2007
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Vinicius Ricardo Cuña de Souza
CARCINOGÊNESE DE PELE E PULMÃO EM
LINHAGENS DE CAMUNDONGOS SELECIONADAS
SEGUNDO A REATIVIDADE INFLAMATÓRIA
AGUDA
Tese apresentada ao Instituto de
Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para
obtenção do Título de Doutor em
Ciências.
Área de concentração: Imunologia
Orientadora: Dra Olga Célia
Martinez Ibañez
São Paulo
2007
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
© reprodução total
Souza, Vinicius Ricardo Cuña de.
Carcinogênese de pele e pulmão em linhagens de camundongos
selecionados segundo a reatividade inflamatória aguda / Vinicius
Ricardo Cuña de Souza. -- São Paulo, 2007.
Orientador: Olga Célia Martinez Ibañez.
Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências
Biomédicas. Departamento de Imunologia. Área de concentração:
Imunologia. Linha de pesquisa: imunogenética.
Versão do título para o inglês: Skin and lung carcinogenesis in mice
selected for acute inflammatory response (AIR).
Descritores: 1. Imunogenética 2. Carcinógenos Químicos 3.
Inflamação 4. Neoplasias cutâneas e de pulmão 5. Camundongos
6. Hidrocarbonetos aromáticos I. Ibañez, Olga Célia Martinez II.
Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas.
Programa de Pós-Graduação em Biologia da Imunologia. III. Título.
ICB/SBIB149/2007
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
___________________________________________________________________________________________________
Candidato: Vinicius Ricardo Cuña de Souza.
Título da Tese: Carcinogênese de pele e pulmão em linhagens de
camundongos selecionados segundo a reatividade
inflamatória aguda.
Orientadora: Olga Célia Martinez Ibañez.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão
pública realizada a ................./................./................., considerou
( ) Aprovado ( ) Reprovado
Examinador(a): Assinatura: .................................................................................
Nome: ........................................................................................
Instituição: ..................................................................................
Examinador(a): Assinatura: .................................................................................
Nome: ........................................................................................
Instituição: ..................................................................................
Examinador(a): Assinatura: .................................................................................
Nome: ........................................................................................
Instituição: ..................................................................................
Examinador(a): Assinatura: .................................................................................
Nome: ........................................................................................
Instituição: ..................................................................................
Presidente: Assinatura: .................................................................................
Nome: ........................................................................................
Instituição: ..................................................................................
Este trabalho foi desenvolvido no
Laboratório de Imunogenética do
Instituto Butantan com apoio
financeiro da FAPESP sob o processo
n
o
02/10265-7.
DEDICATÓRIA
As pessoas mais importantes da minha vida...
meus pais Ricardo e Hortência,
meus irmãos e sobrinhos,
minha esposa Clarisse,
minha filha Kailani.
Obrigado!
AGRADECIMENTOS
A Dra. Olga Célia Martinez Ibañez pela paciência, incentivo e orientação durante a
condução deste trabalho.
Aos pesquisadores do Laboratório de Imunogenética do Instituto Butantan Orlando
Garcia Ribeiro Filho, Maria Siqueira, Wafa H. K. Cabrera, Marcelo De Franco, Milene T.
De Franco, Nancy Starobinas, Luiza Maria Araújo, José R. Jensen e Solange Massa pela
amizade e ajuda durante o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Prof. José Alexandre Marzagão Barbuto e a Profa. Eva Burger pela
oportunidade de ter participado do programa PAE.
Mais uma vez agradeço ao Prof. J. A. Barbuto bem como aos professores Ises de
Almeida Abrahamsohn, Anna Carla Goldberg e João Gustavo Pessini Amarante Mendes
pela grande ajuda e sugestões durante o exame de qualificação.
Ao pesquisador Durvanei A. Maria pela ajuda nos momentos iniciais desta tese.
Ao Prof. Dr. Jose Luiz Guerra e a Luciana Torres pelo imprescindível suporte na
avaliação histopatológica desta tese.
Aos companheiros pós-graduandos Francisca Vorraro, Andréa Borrego, Adriana e
Patrícia Carneiro, Luciana Peters, Robertinho, Yana, Layra, Ludmila, Alessandra, Andréa
Arruda, Cristiano, Tati, Amaral, Simone e Amanda que me aturaram durante estes anos.
Aos amigos do Laboratório de Imnunogenética Sandra Regina Ottoboni, Neusa
Maria Coração Miranda, Ronaldo Antônio Mateus, Marinalva de Jesus Lima e Tânia Maria
Braga Vieira.
Aos funcionários do biotério do Laboratório de Imunogenética Celso dos Santos,
Joel Faustino de Camargo, Luiz Carlos Hilário, Marinalva dos Santos Silva, Sergio Branco
de Miranda e ao nosso saudoso Pedrinho pela ajuda com os animais.
A Sras. Eva Aparecida S. Oliveira e Maria José Jesus Carvalho, funcionárias da
Biblioteca do ICB, eu agradeço pela pronta ajuda, principalmente quanto à revisão e
correção bibliográfica.
Aos funcionários do departamento de Imunologia do ICB: Jotelma Leite Ribeiro,
Maria Eni do Sacramento Santos e Valéria Santos.
Agradeço sinceramente a todos que contribuíram para minha estadia na
Universidade de Vigo: aos professores Dr. Armando Caballero Rúa, Dr. Emílio Rolán-
Alvarez e Dr. Humberto Quesada e aos meus amigos de poyata Mônica Martínez
Fernandez, Nieves, Jorge Guerra e Paula Conde Padín por suas preciosas ajudas e idéias.
Á minha família da Espanha Elsa, Angélica, Lucy, Teresa e José, aos tios Tito,
Paco, “Carmens” e filhos e a Antônio, Isabel e filhas pelos seis maravilhosos meses de
convívio familiar diário.
A minha irmã Maria e sua filha Flora eu agradeço pela presença constante e carinho
com nossos pais.
Ao meu irmão Alexandre, minha cunhada Lilian e meus sobrinhos Gabriel e
Amanda pela constante presença e amor.
Aos meus pais, sogros, Fabiano e a Conceição pelo apoio dado a distância. A vocês
serei eternamente grato.
Durante os anos que trabalhei nesta tese, Clarisse, minha esposa, me proporcionou
mais ajuda e apoio que ninguém poderia esperar. Além do que, sua ilimitada paciência foi
importantíssima para que pudesse realizar esta tese. A ela e minha filha dedico esta tese.
“Masakatsu agatsu, true victory is victory over oneself”
Morihei Ueshiba
RESUMO
SOUZA, V. R. C. de Carcinogênese de Pele e Pulmão em Linhagens de Camundongos
Selecionados Segundo a Reatividade Inflamatória Aguda 2007. 102 f. Tese (Doutorado
em Ciência) - Instituto de Ciências Biomédicas, Departamento de Imunologia,
Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.
As linhagens de camundongos selecionadas segundo máxima (AIRmax) ou mínima
(AIRmin) resposta inflamatória aguda local (AIR) a partículas de poliacrilamida (Biogel
P
100
), divergem fenotipicamente na habilidade de produzir e recrutar granulócitos para o
sítio inflamatório. Além disso, diferem na susceptibilidade à carcinogênese química de pele
em 2 estágios pela administração epicutânea 7,12-dimetilbenzo[a]antraceno (DMBA)
seguido de repetidas doses de 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) e ao
desenvolvimento de cânceres de pulmão por uretana (etil carbamato) ip. AIRmax são
resistentes e AIRmin susceptíveis, demonstrando o impacto do controle genético da AIR na
predisposição à carcinogênese. Neste trabalho, utilizamos dois carcinógenos do tipo
Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (PAH): 3 metilcolantreno (3-MC) e DMBA.
Aplicamos 3-MCA por via im e entre a 19
a
e 23
a
semanas após o tratamento,
respectivamente, 50% dos AIRmin e AIRmax apresentaram tumor local (≥ 0,5 cm). Ao
final de 45 semanas, cerca de 90% dos animais desenvolveram fibrossarcomas, entretanto,
somente nos AIRmin encontramos múltiplos adenomas e grandes adenocarcinomas
pulmonares. No segundo protocolo aplicamos doses epicutâneas de DMBA por 5 dias
consecutivos. Os AIRmin apresentaram uma reação de dermatite de contacto inicial,
seguida de tumores na pele, enquanto que os AIRmax foram resistentes. Às 48 horas após o
tratamento, verificamos a expressão de genes de citocinas e enzimas do complexo P450 por
qPCR. Os AIRmin tratados com DMBA tinham níveis significantemente elevados de
mRNA para IL-1β (46x), TNF-α (6x), IL-6 (7x) e TGF-β1 (5x) e de CYP1B1 (7x), já os
AIRmax, apresentaram resultados semelhantes aos do controle. Aos 260 dias, apenas os
AIRmin desenvolveram múltiplos tumores de pulmão. O receptor de aril hidrocarbonetos
(AHR) tem um papel importante no metabolismo dos PAHs. Existe polimorfismo no gene
Ahr entre linhagens isogênicas de camundongos que determina a afinidade de ligação do
AHR ao agonista e susceptibilidade ao câncer. Os AIRmax são homozigotos para o alelo
Ahr
d
de baixa afinidade (resistência) e os AIRmin portam o alelo Ahr
b1
de alta afinidade
(susceptibilidade). A segregação alélica nestas 2 linhagens sugere que o Ahr é um marcador
genético envolvido no controle da AIR, hipótese que foi confirmada pelo teste positivo de
co-segregação (linkage) do genótipo parental de Ahr com o grau da resposta inflamatória ao
Biogel em uma população de segregantes F2 (AIRmax x AIRmin). Conclusões:
Camundongos AIRmax são resistentes e AIRmin são susceptíveis à indução de tumores de
pele pela aplicação repetida de DMBA. Os AIRmin são também significantemente mais
susceptíveis do que os AIRmax em desenvolver tumores de pulmão induzidos por DMBA
ou 3-MCA. Os animais AIRmin apresentaram uma reação cutânea ao DMBA, a qual está
relacionada à susceptibilidade ao desenvolvimento tumoral. O perfil de citocinas induzidas
é coerente com o aparecimento da reação de hipersensibilidade de contacto pelo DMBA e o
aumento da enzima CYP1B1 está relacionado com a bioativação do DMBA que depende
da afinidade de ligação do agonista ao AHR. Os resultados indicam mecanismos e fatores
genéticos que contribuem para a diferente susceptibilidade de AIRmax e AIRmin a
substâncias cancerígenas do tipo PAH.
Palavras Chave: Inflamação, Imunogenética, Camundongos selecionados, DMBA,
3-MC, Carcinogênese química.
ABSTRACT
SOUZA, V. R. C. de. Skin and Lung Carcinogenesis in Mice Selected for Acute
Inflammatory Response (AIR) 2007. 102 f. Doctor thesis (Immunology) - Instituto de
Ciências Biomédicas, Departamento de Imunologia, Universidade de São Paulo, São Paulo,
2007.
Two lines of mice were genetically selected for the maximal (AIRmax) or minimal
(AIRmin) local acute inflammatory reactions (AIR) to non immunogenic polyacrilamide
beads (Biogel). These lines greatly differed in susceptibility to two stage skin
carcinogenesis induced by the epicutaneous administration of dimethylbenzo[a]anthracene
and repeated doses of phorbol miristate acetate (DMBA/TPA) and for lung cancer induced
by the ip injection of urethane. AIRmax were resistant and AIRmin susceptible,
demonstrating an association between the predisposition to chemical carcinogenesis and the
genetic control of inflammatory reactivity. In this work, we used two polycyclic aromatic
hydrocarbon (PAH) carcinogenic compounds in these mouse lines: 3-methylcholanthrene
(3-MCA) and DMBA. 3-MCA was injected im and 50% of AIRmin and AIRmax mice
developed local tumor (≥ 0,5 cm) between 19
th
and 23
rd
weeks after treatment,
respectively. However, after 45 weeks, about 90% of all animals developed fibrosarcomas
but at this time, AIRmin mice only, showed multiple lung adenomas and large
adenocarcinomas. DMBA was applied in 5 repeated 50μg epicutaneous doses. AIRmax
mice were resistant but AIRmin mice developed skin reaction, followed by the appearance
of skin and lung tumors. Total RNA was extracted from skin fractions at 48 h after the last
dose and expression levels of cytokines and P450 enzymes mRNA were scored by real-
time PCR In AIRmin mice DMBA induced significantly up regulated levels of IL-1β (46x),
TNF-α (6x), IL-6 (7x), TGF-β1 (5x) and CYP1B1 (7x) mRNA. In AIRmax, the results
were similar to controls. The aryl hydrocarbon receptor (Ahr) plays an important role in
polyaromatic hydrocarbon (PAH) metabolism. Upon binding to agonist this transcription
factor increases the expression of CYP 450 enzymes. An allelic polymorphism was found
in Ahr gene between inbred mouse lines which correlated to a decrease in binding affinity
of the receptor to DMBA and a decrease in carcinogenesis susceptibility. All AIRmax are
homozygous for the Ahr allele encoding the low affinity receptor whereas all AIRmin bear
the high affinity related allele. The allelic segregation in these two lines indicates Ahr as a
genetic marker or a gene target involved in inflammatory response control. This was
confirmed by a linkage analysis or the co-inheritance of Ahr parental genotypes with the
degree of acute inflammation to Biogel in a heterogeneous F2 (AIRmax X AIRmin)
intercross population. Conclusions: AIRmax mice are resistant and AIRmin mice are
susceptible to the induction of skin tumors by continuous application of DMBA. Late after
treatment with DMBA and 3-MCA, AIRmin were also significantly more susceptible than
AIRmax to develop lung tumors. AIRmin mice presented a precocious skin reaction to
DMBA which was correlated to tumor development susceptibility. This reaction was
contemporary to the upregulation of the expression in the skin of cytokine genes such as
IL-1β, IL-6, TNF-α and TGF-β and of cytochrome P450 Cyp1b enzyme. The profile of
cytokines induced in AIRmin mice is coherent with the elicitation of contact
hypersensitivity reaction by DMBA. The increase in Cyp1b1 enzyme correlates with the
cutaneous bioactivation of DMBA which in turn depends on high affinity binding to AHR.
The results point to mechanisms and genetic factors underlying the differential
susceptibility of AIRmax and AIRmin mice to carcinogenesis induced by PAHs.
Keywords: Inflammation, Immunogenetics, Selected mice, DMBA, 3-MC, Chemical
carcinogenesis.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1.
Seleção fenotípica bidirecional de linhagens AIRmax e AIRmin.......................................5
Figura 2.
Herança poligênica de alta e baixa resposta inflamatória aguda e sua relação com a
carcinogênese pulmonar......................................................................................................7
Figura 3.
Fotomicrografia do corte histológico do sarcoma no músculo de camundongo
AIRmin..............................................................................................................................26
Figura 4.
Incidência de sarcomas induzidos pelo 3-MC...................................................................27
Figura 5.
Fotomicrografia do corte histológico de um adenocarcinoma pulmonar induzido por 3-
MC em camundongo AIRmin............................................................................................27
Figura 6.
Aspectos da pele de animais AIRmax e AIRmin, 8 dias após a aplicação por cinco dias
consecutivos de doses epicutâneas dorsais de 50 μg de DMBA dissolvidos em 0,1ml de
acetona...............................................................................................................................30
Figura 7.
Multiplicidade de lesões papilomatosas de pele induzidas pelo DMBA.......................... 30
Figura 8.
Fotomicrografia de cortes histológicos de pulmão de áreas com tumores pulmonares de
camundongos AIRmax e AIRmin induzidos por DMBA................................................. 32
Figura 9 A.
Fotomicrografia de cortes histológicos da pele de animal AIRmax (1) e AIRmin (2)
controle............................................................................................................................. 33
Figura 9 B.
Fotomicrografia de cortes histológicos da pele de animal AIRmax (1) e AIRmin (2) após
tratamento com DMBA.................................................................................................... 33
Figura 9 C.
Fotomicrografia de cortes histológicos da pele de animal AIRmax (1) e AIRmin (2) após
tratamento com TPA......................................................................................................... 34
Figura 10.
Fotomicrografia de cortes histológicos da pele de reações induzidas pelo DMBA e pelo
DNFB na orelha em animais AIRmax e AIRmin............................................................. 37
Figura 11.
Expressão por RT-PCR em Tempo Real do HMBS na pele animais AIRmax e AIRmin
controle e estimulados com DMBA.................................................................................. 38
Figura 12.
Quantificação da expressão de IL-6 por RT-PCR em Tempo Real na pele dos animais
AIRmax e AIRmin estimulados com DMBA................................................................... 39
Figura 13.
Análise da expressão de RNAm para citocinas em amostras de pele de animais AIRmax
e AIRmin 48 horas após o tratamento com DMBA......................................................... 41
Figura 14.
Análise da expressão de RNAm para CD8 e CD4 em amostras de pele de animais
AIRmax e AIRmin 48 horas após o tratamento com DMBA........................................... 43
Figura 15.
Análise da expressão de RNAm para enzimas do citocromo P450 em amostras de pele de
animais AIRmax e AIRmin 48 horas após o tratamento com DMBA............................. 44
Figura 16.
Imagem do gel de eletroforese da análise do polimorfismo do gene Ahr......................... 46
Figura 17.
Análise da reação inflamatória aguda nos segregantes F2 (AIRmax x AIRmin)............. 48
Figura 18.
Distribuição do genótipo Ahr em segregantes F2 (AIRmax X AIRmin) de acordo com
reatividade inflamatória.................................................................................................... 49
Figura 19.
Análise do microssatélite D9Mit248 onde mostramos o padrão de migração do produto
de amplificação por PCR das preparações de DNA das linhagens isogênicas e de 5
AIRmax e 5 AIRmin........................................................................................................ 52
Figura 20.
Análise do microssatélite CYP1A1 onde mostramos o padrão de migração do produto de
amplificação por PCR das preparações de DNA das linhagens isogênicas e de 7 AIRmax
e 8 AIRmin........................................................................................................................ 53
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Relação de seqüências sintéticas (primers) empregados nas reações de PCR em tempo
real.................................................................................................................................................21
Tabela 2.
Marcador tipo microssatélite de CYP1A1 e D9Mit248...............................................................23
Tabela 3.
Análise do aparecimento de adenomas e adenocarcinomas pulmonares em camundongos
AIRmax e AIRmin tratados com 3-MC.......................................................................................28
Tabela 4.
Análise do aparecimento de adenomas e adenocarcinomas pulmonares em camundongos
AIRmax e AIRmin tratados com DMBA.................................................................................... 31
Tabela 5.
Reações de dermatite de contato ao DNFB e ao DMBA nas linhagens AIRmax e
AIRmin........................................................................................................................................ 36
Tabela 6.
Avaliação das variações dos níveis de expressão de RNAm de citocinas e enzimas do citocromo
P450 e por técnica de qPCR na pele de animais AIRmax e AIRmin após tratamento com DMBA
ou TPA.........................................................................................................................................40
Tabela 7.
Alelos do gene Ahr em linhagens de camundongos isogênicas e de AIRmax e
AIRmin.........................................................................................................................................47
Tabela 8.
Genótipo Ahr de camundongos F2 entre AIRmax e AIRmin......................................................49
Tabela 9.
Resposta inflamatória aguda (AIR) ao Biogel de camundongos F2 (AIRmax x AIRmin) de
acordo com o genótipo Ahr.......................................................................................................... 50
Tabela 10.
Definição de alelos de microssatélites em linhagens isogênicas constituintes da F0.................. 52
Tabela 11..
Análise de microssatélitee no cromossomo 9 em camundongos AIRmax e AIRmin................. 53
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
χ
2
Qui-quadrado.
3-MC 3-metilcolantreno
AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism.
AhR
Receptor aril hidrocarboneto.
AHRNT arylhydrocarbon receptor nuclear translocator.
AHRR
aryl hydrocarbon receptor repressor.
APC Célula apresentadora de antígeno, antigen-presenting cells.
B[a] P Benzo[a]pireno.
BPB Azul de bromo Fenol.
CHS Hipersensibilidade de contato, Contact hypersensitivity.
cM CentiMorgan.
CSF
Colony Stimulating Factor.
Ct
Cycle thereshold.
CYP450 Citocromo P450.
DMBA 7,12-dimetil benzoantraceno.
DMH Dimetil hidrazina.
DMSO Dimetil Sulfóxido.
DNFB 2, 4-dinitrofluorobenzeno.
DO Densidade óptica.
EPHX1 Hidrolase epóxida microssômica, Microsomal epoxide hydrolase.
F1 Primeira geração filial de um cruzamento.
F2 Segunda geração filial de um cruzamento.
F3 Terceira geração filial de um cruzamento.
GST
Glutathione S-transferase.
HE Hematoxilina-Eosina.
HMBS Hidroximetil-bilane sintase.
i.m. Intramuscular.
i.p. Intraperitoneal.
IFN
Interferon.
Ig Imunoglobulina.
IL Interleucina.
iNOS NO sintetase induzível.
LRS
Likelyhood ratio statistic.
MHC
Major Histocompatibility Complex.
MMP
Membrane-type Matrix Metalloproteinase.
NF-κβ
Fator nuclear kappa-beta.
NK
Natural Killer.
NO Óxido nítrico.
NQO NAD(P)H: quinone oxidoreductase.
PAH Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos.
PBS Salina tamponada com fosfatos.
PCR
Polimerase Chain Reaction.
PDGF
platelet-derived growth factor.
PMN Polimorfonuclear.
QTL
Quantitative Trait Loci.
RAPD
Randon Amplified Polymorphic DNA.
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism.
s.c. Subcutâneo.
SCAR
Sequence Characterized Amplified Region.
STS
Sequence-Tagged Site.
T.A. Temperatura ambiente.
TAM Macrófagos associados a tumores.
TCDD 2, 3, 7, 8-tetraclorodibenzo-p-dioxina.
TGF-β
Fator de crescimento transformante beta.
Th Linfócito T helper.
TNF Fator de necrose tumoral.
TPA 12-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato.
VNTR
Variable number tanden repeat.
XRE Elementos respondedores a xenobióticos.
H-2 Locus murino de histocompatibilidade 2.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................
01
1.1 Carcinogênese........................................................................................................ 01
1.2 Inflamação e Câncer.............................................................................................. 02
1.3 Seleção Genética Bidirecional de linhagens de camundongos segundo a
intensidade da Resposta Inflamatória Aguda (AIR)................................................ 03
1.3.1 Carcinogênese nas linhagens AIRmax e AIRmin............................................ 06
1.4 Xenobióticos........................................................................................................... 08
1.5 Ahr.......................................................................................................................... 10
1.5.1 Ahr e Inflamação................................................................................................ 13
2 OBJETIVOS............................................................................................................
15
3 MATERIAL E
MÉTODOS......................................................................................
16
3.1 Animais experimentais.......................................................................................... 16
3.2 Histológico.............................................................................................................. 16
3.3 Tratamentos........................................................................................................... 16
3.3.1 3-MC.................................................................................................................... 16
3.3.2 DMBA.................................................................................................................. 16
3.3.3 TPA...................................................................................................................... 17
3.4 Parâmetros de avaliação do crescimento tumoral.............................................. 17
3.5 Indução da reação inflamatória pelo Biogel........................................................ 17
3.6 Extração de DNA genômico (Kit E.Z.N.A.
®
Easy Acid Isolation, Omega Bio-
tek, Inc.).........................................................................................................................
17
3.7 Protocolo de extração de RNA da pele utilizando Trizol................................... 18
3.8 Obtenção do cDNA................................................................................................ 19
3.9 Reações de PCR em Tempo-Real ou quantitativo (qPCR)................................ 19
3.10 Indução das reações de Dermatite de Contato.................................................. 21
3.10.1 DNFB................................................................................................................. 21
3.10.2 DMBA................................................................................................................ 21
3.11 Tipagem do genótipo Ahr (aryl hydrocarbon receptor)..................................... 22
3.12 Análise de polimorfismo de regiões microssatélites de DNA........................... 22
3.13 Análise estatística................................................................................................. 24
4 RESULTADOS.........................................................................................................
25
4.1 Carcinogênese induzida por PAHs....................................................................... 25
4.1.1 Carcinogênese pelo metilcolantreno (MCA).................................................... 25
4.1.2 Carcinogênese pelo DMBA................................................................................ 28
4.2 Dermatite de Contato ao DNFB e ao DMBA...................................................... 35
4.3 Estudo da reação ao DMBA na pele.................................................................... 37
4.3.1 Avaliação da Expressão de Citocinas por RT-PCR em Tempo Real............. 39
4.3.2 Análise da Expressão de CD4 e CD8 por RT-PCR em Tempo Real.............. 42
4.3.3 Detecção da Expressão de CYP1A1 e CYP1B1 por RT-PCR em Tempo
Real................................................................................................................................ 43
4.4 Pesquisa de polimorfismo em gene candidato..................................................... 44
4.4.1 Ensaio de linkage.................................................................................................
47
4.4.2 Análise de Polimorfismo do gene CYP1A1 e do Microssatélite D9Mit 248... 50
5 DISCUSSÃO.............................................................................................................
54
6 CONCLUSÕES.........................................................................................................
66
REFERÊNCIAS.......................................................................................................
67
1 INTRODUÇÃO
1.1 Carcinogênese
A carcinogênese é um processo de múltiplos estágios que envolve eventos
genotóxicos (mutações), bem como expressões genéticas alteradas no momento da
transcrição, tradução e pós-tradução (eventos epigenéticos) e alterações na sobrevivência
celular (proliferação e apoptose) (HANAHAN e WEINBERG, 2000; HERCEG, 2007).
Funcionalmente, o processo de carcinogênese é dividido em três etapas: iniciação,
promoção e progressão. O primeiro estágio, iniciação, é onde ocorre uma ou mais mutações
no DNA promovida pelo agente cancerígeno levando à transformação celular e tornando-a
potencialmente capaz de se multiplicar de modo autônomo. O estágio seguinte, a
promoção, ocorre depois de um período prolongado de tempo de exposição. A promoção é
um processo complexo, que em momentos iniciais é reversível. A progressão tumoral é
considerada irreversível e é caracterizada pelo aumento da instabilidade genômica e
posterior progresso em direção à malignidade e ao crescimento celular autônomo.
Carcinógenos completos possuem atividade iniciadora e promotora e podem atuar em
diferentes estágios no processo carcinogênico, mas a forma de ação varia de acordo com o
produto químico. O conhecimento dos mecanismos de carcinogênese induzida por produtos
químicos tem oferecido base para novas pesquisas na prevenção ao câncer (MILLER e
MILLER, 1981).
O risco de câncer no homem é determinado pela combinação de vários fatores
genéticos e ambientais. Muitos dos genes descobertos ao longo da última década nos
fornecem um elo entre os cânceres que são predeterminados no momento da concepção – as
síndromes cancerosas familiares - e os esporádicos. Nestes, múltiplos genes de baixa
penetrância segregam na população humana e podem ser fatores essenciais que contribuem
à susceptibilidade individual à carcinogênese. A combinação apropriada de alelos que
conferem resistência ou susceptibilidade, modulando os efeitos de exposição a
carcinógenos exógenos ou controlando etapas intrínsecas limitantes do crescimento da
célula neoplásica, determinaria assim o risco individual de desenvolver câncer (BALMAIN
e NAGASE, 1998).
Camundongos expostos a carcinógenos desenvolvem tumores por um processo em
múltiplos estágios, muito semelhante ao que ocorre no homem, sendo um modelo
experimental adequado para a pesquisa de genes de susceptibilidade ou resistência.
Diferentemente das populações humanas, grande número de famílias de camundongos pode
ser analisado em estudos de linkage, o que aumenta a probabilidade estatística de identificar
os vários loci envolvidos nas diferentes etapas do processo de carcinogênese.
Teoricamente, loci que controlam cada um destes subfenótipos podem ser mapeados em
modelos de câncer murinos, desde que existam polimorfismos funcionais nas linhagens
parentais escolhidas para a análise.
Descobertas sobre os fatores genéticos de predisposição ao câncer vêm contribuindo
para o conhecimento mais profundo dos mecanismos da doença e desta maneira
colaborando para o desenvolvimento de novos tratamentos.
1.2 Inflamação e Câncer
Tem sido muito discutida a relação funcional entre inflamação e câncer. Está
bastante claro que um ambiente rico em células inflamatórias, fatores de crescimento,
estroma ativado e agentes promotores de dano ao DNA potenciam e/ou promovem o risco e
transformação neoplásica de células em proliferação. Num quadro normal, em resposta à
injúria tissular, uma rede multifatorial de sinais químicos inicia e mantém uma resposta do
hospedeiro destinada a curar o tecido lesado. Isto envolve ativação e migração dirigida de
leucócitos (neutrófilos, monócitos e eosinófilos) do sistema venoso aos sítios de dano,
associada a um aumento da proliferação celular, enquanto o tecido regenera. A proliferação
e inflamação cedem, quando o agente agressor é removido ou o reparo está completo. Em
contraste, células em proliferação que carregam o dano ao DNA ou a mutação (células
iniciadas) continuam a proliferar em microambientes ricos em células inflamatórias e
fatores de crescimento que suportam seu desenvolvimento.
Embora a relação causal entre inflamação, imunidade inata e desenvolvimento de
tumores seja bem aceita, muitos dos mecanismos celulares e moleculares que medeiam esta
relação permanecem não esclarecidos. O conceito fundamental é que inflamação associada
ao reparo de lesão é usualmente autolimitante, porque a produção de citocinas
antiinflamatórias acompanha a das citocinas pró-inflamatórias; por outro lado, a
persistência de fatores iniciadores, a desregulação ou falha dos mecanismos requeridos para
resolver a resposta inflamatória, podem conduzir a anormalidades como inflamação
crônica, resultando em patogênese. Esta parece ser a situação durante a progressão
neoplásica. De certa forma, tumores podem ser interpretados como lesões que não se
reparam (DVORAK, 1986; COUSSENS e WERB, 2002).
O componente inflamatório de um tumor em desenvolvimento pode incluir uma
população diversificada de células, por exemplo, neutrófilos, células dendríticas,
macrófagos, eosinófilos e mastócitos bem como linfócitos, todos capazes de produzir uma
variedade de citocinas, mediadores citotóxicos, incluindo espécies reativas de oxigênio e
serina ou cisteíno proteases, MMPs e agentes perfurantes de membrana, além de
mediadores de morte celular como TNFα, interleucinas e interferons (BALKWILL e
MANTOVANI, 2001). Células neoplásicas, por sua vez, produzem fatores solúveis como
IL-6 e CSF-1 que dirigem a maturação de precursores mielóides a macrófagos. Macrófagos
associados a tumores (TAM) exercem um papel ambíguo em neoplasias: embora eles
possam matar as células neoplásicas após ativação com IL-2, IFN e IL-12, a infiltração de
macrófagos está intimamente relacionada à angiogênese associada ao tumor, bem como à
disseminação de metástases (SCHOPPMANN et al., 2002).
Neutrófilos PMNs, por sua vez, representam a primeira linha de defesa contra
agressões e são potentes efetores da inflamação. Embora em diferenciação terminal, com
pouca maquinária biossintética, neutrófilos são capazes de produzir considerável
quantidade de citocinas/quimiocinas necessárias para o recrutamento, ativação e resposta de
células efetoras. Estas células fagocíticas iniciam o reparo da lesão, servindo como uma
fonte de citocinas de resposta precoce pro-inflamatórias, como TNFα, IL-1α e IL-1β.
PMNs são envolvidos no inter-relacionamento entre as células imunes e endoteliais que une
a imunidade inata e adaptativa. Recentemente, o potencial anti-tumoral de PMNs e de
outros componentes da resposta inflamatória tem recebido maior atenção como arma
efetiva no combate ao câncer (Di CARLO et al., 2001; ISHIHARA, IJIMA e
MATSUNAGA, 1998).
1.3 Seleção Genética Bidirecional de linhagens de camundongos segundo a intensidade
da Resposta Inflamatória Aguda (AIR)
A caracterização de mecanismos genéticos que regulam a resposta inflamatória e,
por conseguinte, as reações biológicas que este processo desencadeia é tema de estudos de
grande interesse que têm sido desenvolvidos em modelos murinos (STIFFEL et al., 1990;
IBANEZ et al., 1992).
A resposta inflamatória aguda é uma reação complexa cuja intensidade varia de
forma contínua e com distribuição normal numa população heterogênea. A inflamação,
portanto, é uma característica quantitativa e assim submetida a controle poligênico, ou seja,
à regulação pela interação aditiva de vários loci gênicos (QTL para quantitative trait loci)
que segregam independentemente (STIFFEL et al., 1990; SUDBERY, 2004).
Para o estudo genético deste caráter multifatorial, o Laboratório de Imunogenética
do Instituto Butantan produziu duas linhagens de camundongos que foram geneticamente
selecionadas segundo a resposta inflamatória local de máxima (AIRmax) e de mínima
(AIRmin) intensidade a partículas de poliacrilamida (Biogel P100), que é uma substância
não imunogênica e não biodegradável. Foi utilizado o processo de seleção Genética
Bidirecional que é um método poderoso, pois permite concentrar nas linhagens obtidas
muitas variantes alélicas nos diversos loci que estão implicados na variação fenotípica de
interesse.
O processo de seleção iniciou-se a partir de uma população de camundongos
geneticamente heterogênea resultante de cruzamentos entre oito linhagens isogênicas,
conforme esquema a abaixo:
Isogênicas A x DBA/2
P x SWR
SJL x CBA
BALB/c x C57BL/6
Híbridos F1
F1
F1
F1
Segregantes
F2
F2
Segregantes
F3
(População Inicial F0)
A população resultante destes cruzamentos foi denominada de F0, apresentando alta
heterogeneidade genética, onde cada representante continha uma combinação aleatória de
12,5% do conjunto gênico de cada uma das oito linhagens isogênicas originais.
No processo seletivo, o agente flogístico (Biogel P100) foi administrado por via
subcutânea no dorso dos animais e a reação inflamatória produzida foi avaliada 24 horas
após a injeção, considerando o número e a morfologia das células infiltradas, além da
determinação do conteúdo protéico no exsudato inflamatório (FONTAN e FAUVE, 1983;
FAUVE, JUSFORGUES e HEVIN, 1983). A população inicial (F0) analisada apresentou
grande variação fenotípica, obedecendo a uma Distribuição Normal quanto ao caráter
intensidade de resposta inflamatória aguda (STIFFEL, et al., 1990).
A seleção genética foi iniciada pela escolha para acasalamento dos indivíduos que
expressavam os fenótipos extremos e opostos desta curva com características de resposta
máxima e mínima. Evitando cruzamentos consangüíneos, o processo se repetiu por
gerações consecutivas, buscando-se atingir o máximo de separação fenotípica entre as duas
linhagens, denominando-as AIRmax e AIRmin.
Este processo de seleção promoveu uma progressiva divergência entre as linhagens,
com concomitante redução da variância dentro de cada uma quanto à expressão dos
caracteres de interesse. A separação gradativa das linhagens no sentido de alta (AIRmax)
ou baixa (AIRmin) resposta é explicada pelo acúmulo progressivo, em cada uma, de
múltiplos genes exercendo efeitos aditivos sobre o fenótipo selecionado.
Admitiu-se que, a partir da 20ª geração de seleção, as linhagens atingiram o Limite
de Seleção, onde os alelos responsáveis pelo caráter selecionador, naqueles genes que eram
polimorficos na F0, estariam fixados em homozigoze nas respectivas linhagens, mantendo-
se a heterogeneidade do fundo genético. Nesta etapa foi possível estimar o número de loci
envolvidos na AIR, indicando a complexidade da regulação gênica. Para ambos, os
parâmetros considerados chegou-se à estimativa de 7 a 12 loci ou QTL controladores da
AIR (IBAÑEZ et al., 1992; RIBEIRO-FILHO, 2003; BIOZZI et al., 1998).
A diferença fenotípica estabelecida entre AIRmax e AIRmin é, sobretudo, reflexo
do número de leucócitos migrantes ao sítio inflamatório em resposta ao Biogel. Às 24 horas
após a inoculação do Biogel os neutrófilos são as principais células deste infiltrado,
correspondendo a 85%, enquanto que os outros 15% são essencialmente fagócitos
mononucleares (RIBEIRO et al., 2003). Esta diferença foi progressivamente aumentando
ao longo do processo seletivo, atingindo valores de 20 a 30 vezes no número de células
infiltradas e 2,5 vezes na concentração protéica do exsudato, conforme a figura 1:
Figura 1: Seleção fenotípica bidirecional de linhagens AIRmax (azul) e AIRmin (vermelho).
1.3.1 Carcinogênese nas linhagens AIRmax e AIRmin
Embora não tenha sido considerado como caráter de seleção, estes animais
selecionados diferiram significativamente na resistência/ susceptibilidade ao
desenvolvimento de tumores induzidos em diferentes órgãos e por agentes diversos. Os
AIRmax se mostraram resistentes e os AIRmin susceptíveis a protocolos de carcinogênese
de pele em dois estágios induzida pela administração epicutânea de 7,12-dimetil
benzo(a)antraceno, seguida por doses repetidas de 12-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato
(DMBA/TPA) (BIOZZI et al., 1998) e também à carcinogênese de pulmão induzida pela
injeção peritoneal de uretana (etil carbamato) (MARIA et al., 2003), ou pela administração
de dimetil hidrazina (DMH) (DiPACE et al., 2006; RIBEIRO et al., 2005). Os resultados
evidenciam o impacto do controle genético da reatividade inflamatória aguda na
predisposição à carcinogênese química.
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
0
1
2
3
4
5
A
AIRmax
AIRmi n
Gerações
ln 4.22 = 68.02 x 10
6
ml
ln 0.86 = 3.93 x 10
6
ml
ln de células
(x10
-6
/ml
±
EP)
I
I
n
n
f
f
i
i
l
l
t
t
r
r
a
a
d
d
o
o
c
c
e
e
l
l
u
u
l
l
a
a
r
r
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
0
2
4
6
8
10
12
B
Gerações
4.85
2.13
Concentração protéica
(UDO/ml ± EP)
E
E
x
x
t
t
r
r
a
a
v
v
a
a
s
s
a
a
m
m
e
e
n
n
t
t
o
o
p
p
r
r
o
o
t
t
é
é
i
i
c
c
o
o
Foi ainda demonstrada a associação entre os fenótipos de alta resposta inflamatória
aguda e resistência e de baixa resposta e susceptibilidade à carcinogênese de pele (BIOZZI
et al., 1998) e de pulmão (RIBEIRO et al., 2005), em populações de segregantes F2 entre
AIRmax e AIRmin. A co-segregação ou linkage das características de grau de inflamação e
carcinogênese sugere que alguns dos loci que regulam a intensidade da resposta
inflamatória aguda, interferem na susceptibilidade à carcinogênese. (Ensaio de co-
segregação ilustrado na figura 2).
Estes camundongos representam, assim, um modelo original para identificar os loci
genéticos relacionados com a resposta inflamatória e sua possível associação com os de
predisposição ao desenvolvimento tumoral.
(susceptível) AIRmin AIRmax (resistente)
Figura 2: Herança poligênica de alta e baixa resposta inflamatória aguda e sua relação com a
carcinogênese pulmonar. Cruzamento de linhagens de camundongos de alta resposta
inflamatória aguda (AIRmax) e baixa (AIRmin) resulta em uma progênie intercruzada de
F2max
F2min
camundongos (F2) que apresentam níveis variados de resposta dependendo do
agrupamento alélico. Neste exemplo, a herança dos alelos “A” e “B” em dois loci
reguladores da resposta inflamatória aguda confere alta resposta e resistência a tumor de
pulmão e a herança dos alelos “a” e “b” confere baixa resposta inflamatória aguda e
suscetibilidade a tumor de pulmão. A resposta inflamatória e susceptibilidade à
carcinogênese intermediárias são resultantes da composição variada dos heterozigotos.
1.4 Xenobióticos
Os Xenobióticos são substâncias químicas naturais ou artificiais estranhas ao
organismo. Os produtos industriais, como pesticidas, poluentes, alcalóides, metabólitos
secundários de plantas, toxinas produzidas por fungos, plantas e animais são exemplos de
agentes que necessitam de uma destruição endócrina (PARKINSON, 1996). Em seu estado
natural ou biotransformados, os xenobióticos podem afetar a integridade do DNA, levando
ao câncer quando esta exposição persistir. Estudos epidemiológicos demonstram que 80 a
90% dos cânceres estão relacionados a fatores ambientais como o fumo, a exposição
ocupacional e a dieta (DOLL e PETO, 1981).
O metabolismo de fármacos e de substâncias de origem exógena (xenobióticos) é
catalisado por um conjunto de enzimas que também estão envolvidas na metabolização de
substratos endógenos como ácidos biliares, hormônios esteróides e ácidos graxos. Essas
enzimas são amplamente distribuídas pelo organismo, mas são predominantemente
encontradas em tecidos altamente expostos a xenobióticos, como fígado, pulmões,
intestinos e rins. Estudos mostram que a detoxificação celular feita por enzimas está
relacionada com a proteção celular. A inativação de xenobióticos e de toxinas endógenas
possibilita a preservação da integridade celular, além da inibição dos eventos de
citotoxicidade provocados por estas substâncias e que podem ser a causa de algumas
doenças (WILKINSON e CLAPPER, 1997).
A maioria dos agentes carcinogênicos requer ativação metabólica antes de se
ligarem a biomoléculas (DNA, RNA e proteínas), logo, as variações nos processos de
ativação e detoxificação destes compostos desempenham um papel crucial na
carcinogênese química. As enzimas que participam destes processos são classificadas em 2
grupos, baseados em suas propriedades funcionais. As enzimas de Fase I (metabolismo
oxidativo) ativam o xenobiótico, tornando-o mais eletrofílico e desta forma mais reativo.
Em um segundo estágio as de Fase II (enzimas conjugadas) competem com a ativação feita
pelas enzimas de Fase I, inibindo a formação de produtos eletrofílicos, além de catalisarem
a conversão destes em conjugados inativos, tornando-os mais hidrossolúveis e facilitando
sua excreção. Este segundo estágio (metabolismo de Fase II) inclui a conjugação com
grupos acetato, sulfato inorgânico, açúcares ou aminoácidos (WILKINSON e CLAPPER,
1997; HUTZ e FIEGENBAUM, 2004).
As principais enzimas envolvidas no metabolismo de fase I fazem parte da
superfamília das monooxigenases citocromo P450 (CYP450). Em humanos,
aproximadamente 10 isoenzimas CYP450 são responsáveis pela metabolização de grande
parte dos agentes farmacológicos conhecidos. A variação genética nestas enzimas de
biotransformação de Fase I bem como de Fase II vem sendo muito estudada (NEBERT;
INGLEMAN-SUNDERG e DALY, 1999; XIE et al., 2001).
Responsáveis por casos de contaminação ambiental, os hidrocarbonetos policíclicos
aromáticos (PAH, polycyclic aromatic hydrocarbons) pertencem a uma classe de produtos
químicos de origem petrolífera ou formada durante a combustão incompleta ou pirólise de
materiais contendo carbono e hidrogênio. Ela abrange uma variedade grande de produtos
que vão desde a gasolina a alimentos (COLBORN, DUMANOSKI e MEYERS, 1997).
Os PAHs podem exercer ações mutagênicas (genotóxicas) e epigenéticas (não
genotóxicas). Estes compostos exibem um efeito cancerígeno em várias espécies de animais
e são suspeitos de causar câncer também em seres humanos (VASCONSELLOS et al.,
1998). Uma importante característica dos PAH é a de quando convertidos metabolicamente
em intermediários eletrofílicos reativos formam ligação covalente a alvos nucleofílicos no
DNA (principalmente as bases purínicas e pirimidínicas), RNA e proteínas (SIMS e
GROVER, 1974; WILKINSON e CLAPPER, 1997). Desta forma, com a formação de
aductos com o DNA e a indução de mutações e eventual tumores, metabólitos reativos
podem reagir com outros alvos celulares e interferir na transcrição, replicação do DNA e
síntese de proteína. Além disso, certos PAHs podem, após metabolização, induzir um
processo inflamatório (CASALE et al., 1998).
A constante prevalência de doenças alérgicas vem aumentando nos últimos anos
(RYDZYNSKI e PALCZYNSKI, 2004). A exposição a xenobióticos ambientais é descrita
como um dos fatores de risco ao desenvolvimento de atopia e asma (ARRUDA et al.,
2005). A pele, o trato respiratório e digestivo são os primeiros tecidos que entram em
contacto com estes produtos químicos exógenos presentes em escapamentos de automóveis,
fumaça de cigarros, em diversos alimentos e em dejetos industriais. Recentes estudos
sugerem que a inalação de PAHs das partículas oriundas de escapamentos de motores a
diesel e fumaça de cigarros iniciam respostas inflamatórias no trato respiratório, resultando,
em rinite e asma (HEO, SAXON e HANKINSON, 2001; MASTRANGELO et al., 2003;
SAXON et al., 2000; TAKENAKA et al., 1995). A exposição ocupacional aos PAHs ou a
aplicação tópica destes agentes químicos ou drogas que os contêm iniciam doenças
inflamatórias na pele, conhecidas como hipersensibilidade de contacto ou dermatites (WU
et al., 2003; YAMAMOTO e TOKURA, 2003). Apesar de um aumento do número de
informações mostrando a relação entre PAHs e desordens inflamatórias, os precisos
mecanismos moleculares que atuam no desenvolvimento dos estágios patológicos
continuam sendo pesquisados (TAUCHI et al., 2005).
1.5 AHR
O Receptor Aril Hidrocarboneto (AHR) é um fator transcricional ativado por ligante
que regula a diferenciação celular e indução de enzimas de biotransformação com papel na
resposta a tóxicos como a muitos poluentes ambientais do tipo dioxina (2,3,7,8-
tetraclorodibenzo-p-dioxina – TCDD) ou compostos policíclicos aromáticos (PAH). O
AHR é uma proteína básica do tipo hélice-alça-hélice (bHLH) e membro da superfamília
PAS
(SCHMIDT e BRADFIELD 1996). O termo PAS é derivado dos membros fundadores
desta família: Per-Arnt-Sim e em geral a família PAS de proteínas pode ser considerada
como de sensores ambientais, em razão de seus papéis no ritmo circadiano, sinalização por
hipóxia e resposta a contaminantes ambientais.
Após a ligação ao agonista, o AHR é transformado, dissocia-se de um dímero de
proteína de choque térmico (heat shock, HSP90) com o qual ele está ligado no citosol, e
entra no núcleo onde se junta com uma proteína nuclear, o ARNT (AHR translocador). O
complexo agonista-AHR-ARNT interage com seqüências específicas do DNA onde existe
o elemento de resposta a xenobióticos (XRE), localizado nas regiões promotoras ou na
seqüência de genes alvos. O domínio de ligação ao DNA determina a especificidade da
interação do AHR ao DNA. Para regular a função do AHR existe o AHRR (Repressor do
Receptor Aril Hidrocarboneto). O AHRR compete com o AHR e assim regula a expressão
de genes influenciados por AHR (FUJISAWA-SEHARA et al., 1987; LAI, PINEAU e
ESSER, 1996).
Os efeitos carcinogênicos e mutagênicos dos PAHs são bem documentados
(SJÖGREN, EHRENBERG e RANNUG, 1996) e estudos genéticos e bioquímicos indicam
que a maioria destas respostas obtidas pelos PAHs são realizadas através da ligação ao
AHR (MIMURA et al., 1997), visto que os PAHs são importantes indutores da atividade de
AHR (HANKINSON, 1995).
Esta via do AHR promove a expressão de enzimas metabolizantes, incluindo P450-
1A1, P450-1A2, P450-1B1, glutationas-S-transferase GSTM1 e GSTT1, NAD(P)H:
quinona oxidoredutase (NQO), e UDP-glucuronosiltransferase (UDPGT) (RUSHMORE e
KONG, 2002). As substâncias lipofílicas planares, como o B[a] P e o 3-metilcolantreno, o
composto alogenado 2, 3, 7, 8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) e o DMBA são
sabidamente ativadores de AHR (RUSHMORE e KONG, 2002).
Em animais de laboratório, variações genéticas no Ahr levam a diferenças
substanciais na afinidade do agonista ao receptor, com conseqüências na sensibilidade aos
efeitos bioquímicos e tóxicos produzidos pela exposição aos PAHs. As primeiras análises
genéticas do Ahr revelaram que as linhagens de camundongos isogênicos têm uma resposta
idiossincrática após a administração de PAHs baseada na variabilidade de sua indução da
atividade monooxigenase (NEBERT e GELBOIN, 1969). Este gene que codifica o AHR no
camundongo, situa-se no cromossomo 12, a 18 cM, é composto por 11 exons e, no exon 9,
onde há o domínio de ligação do receptor, existe um polimorfismo que resulta na troca de
aminoácidos (alanina por valina na posição 375) na proteína proporcionando diminuição da
afinidade a xenobióticos. Fundamentado na resposta monooxigenase e outras características
bioquímicas, o gene Ahr foi classificado fenotipicamente em 4 alelos: Ahr
d
, Ahr
b1
, Ahr
b2
e
Ahr
b3
(POLAND e GLOVER, 1990; THOMAS et al., 2002). Desta maneira, as linhagens
de camundongos que expressam o alelo Ahr
d
, tendo como protótipo a linhagem DBA/2,
apresentam um receptor com baixa afinidade, e os animais que têm o alelo Ahr
b1
, presente
na linhagem C57BL/6, codificam um receptor com alta afinidade para o agonista.
Ao contrário do que ocorre em modelos animais onde a variação genética do Ahr
apresenta um grande efeito sobre o fenótipo de resposta a PAHs, ainda pouco se sabe sobre
o papel do Ahr humano (cromossomo 7) na susceptibilidade ou resistência ao
desenvolvimento de doenças. Um extenso estudo funcional utilizando-se SNP (single
nucleotide polymorphism) ao longo do gene Ahr humano demonstrou que existe uma
substituição de G por A na posição 1721 no exon 10, o qual causa uma mudança de
arginina para lisina (R554K) na região que codifica a principal porção do domínio de
transativação do receptor, que é o responsável pela expressão de outros genes (HARPER et
al., 2002). Esta substituição foi associada a um aumento significativo de atividade
CYP1A1, embora outros estudos não mostrem esta associação (ANTTILA et al., 2001;
SMART et al., 2000; WONG, OKEY e HARPER, 2001).
A partir do estudo anterior, muitos outros ensaios foram realizados à procura de
uma associação significativa entre polimorfismo do Ahr humano e a incidência de diversas
enfermidades (KOYANO et al., 2005; SASAKI et al., 2006; SMART e DALY, 2000).
Estes estudos epidemiológicos propuseram que outras variantes do Ahr, como por exemplo,
K401R, N487D, I514T, e K17T/R554K na região de codificação (KOYANO et al., 2005;
SASAKI et al, 2006; SMART; DALY, 2000) ou até mesmo a combinação de
polimorfismos (GAMBIER et al., 2006; KIM et al., 2007), poderiam contribuir como um
fator de risco para câncer de mama, pulmão, hipertensão e peso da prole ao nascer de mães
fumantes. Entretanto, estes resultados dependem ainda de uma análise mais apurada, pois
até agora, o impacto desta variação genética no Ahr humano sobre respostas bioquímicas ou
que resulte em alterações na função normal parece ser moderado.
O papel do AHR na regulação de enzimas responsáveis pela biotransformação de
substâncias endógenas já foi descrito. Alguns ligantes endógenos já foram testados em
diferentes modelos e apresentaram-se com fraco poder de ligação ao AHR, tais como,
triptamina, ácido indol acético (AIA), bilirrubina e biliverdina (MILLER, 1997; PHELAN,
et al., 1998).
Estudos mostram que em cultura de células de queratinócitos humanos, de Hepa
1c1c7 e células HeLa há expressão de genes Ahr-dependentes mesmo quando não há adição
de um ligante exógeno (SADEK e ALLEN-HOFFMANN, 1994; SINGH, HORD e
PERDEW, 1996), e, de maneira indireta, existem trabalhos que mostram que as linhagens
de camundongos knockout do Ahr apresentam uma grande variedade de alterações
fenotípicas, tais como, diminuição do tamanho do fígado, hepatite súbita, fibrose portal
bem como comprometimento de sistemas e órgãos importantes, por exemplo, coração,
vasos sangüíneos, estômago, pele e outros. Estes dados sugerem que o AHR pode estar
envolvido em processos fisiológicos como proliferação celular, desenvolvimento, e na
manutenção da homeostasia (FERNANDEZ-SALGUERO et al., 1995; LAHVIS e
BRADFIELD, 1998).
1.5.1 AHR e Inflamação
Apesar de muitas décadas de estudo a respeito das funções e da maneira de agir do
AHR, ainda é muito discutida a sua relação com a resposta inflamatória.
Prostaglandinas têm importante função na resposta inflamatória, tais como, aumento
de permeabilidade capilar e quimiotaxia para macrófagos. Pesquisadores relatam que a via
de transdução do sinal em experimento in vitro do AHR pode ocorrer com a participação de
prostaglandinas, a saber, PGB3, PGD3, PGF3α, PGG2, PGH1 e PGH2 (SEIDEL et al.,
2001). No trabalho, os autores conseguiram estabelecer a capacidade destas prostaglandinas
de produzir uma ligação competitiva com TCDD pelo AHR, o que as credita como ligantes
agonistas a este receptor (SEIDEL et al., 2001).
A lipoxina (LX) é um eicosanóide endógeno gerado a partir dos
fosfolipídeos constituintes de membrana celular com propriedade antiinflamatória e
associada à fase regenerativa do processo inflamatório (SERHAN et al., 1984). Em
um estudo realizado em culturas de células Hepa-1c1c7 (Hepa-1), que contêm o alelo de
alta afinidade Ahr
b1
, ficou demonstrado que um dos possíveis ligantes endógenos do AHR
poderia ser a Lipoxina A
4
(LXA
4
) (SCHALDACH et al., 1999). Estes mediadores
lipídicos bioativados, designados LXA
4
e ATL (aspirin triggered lipoxins) são amplamente
estudados porque possuem importantes ações antiinflamatórias, como interromper a
infiltração de PMNs (SERHAN et al., 2005; SERHAN, 2005) e de auxiliar na resolução do
processo inflamatório ativando monócitos e estimulando fagocitose dos macrófagos contra
PMNs apoptóticos (SERHAN, 2005).
O envolvimento do AHR como modulador de processos alérgicos e inflamatórios é
controverso: existem relatos que a dioxina, um típico ligante do AHR, suprime as respostas
imunes alérgeno-específicas (FUJIMAKI et al., 2002; WALKER et al., 2002;
ANDERSON et al., 1995; DAVILA et al., 1995; YAMAMOTO e TOKURA, 2003). Uma
outra linha de evidência sugere que espécies de oxigênio reativo gerados por PAHs
oxigenados parecem aumentar a resposta alérgica (BONVALLOT et al., 2001; KEPLEY et
al., 2003). Os PAHs também podem estimular um aumento da atividade do NF-κB, o qual
induz a expressão de uma série de genes, provocando a resposta alérgica (PEI et al., 2002).
Estudo com camundongos transgênicos que expressam a forma ativa constitutiva do
AHR em queratinócitos, demonstrou pela primeira vez uma contribuição primária da
ativação transcricional mediada por AHR no desenvolvimento de doença inflamatória.
Mesmo sem o estímulo exógeno estes animais na fase adulta desenvolveram lesões de pele
com inflamação, semelhantes à dermatite atópica. A indução de genes de mediadores
inflamatórios dependentes do AHR seria assim um mecanismo central de doenças
inflamatórias mediadas pelos PAHs, e os autores sugerem a possibilidade de que com o
bloqueio do sinal do AHR se poderia aliviar os sintomas alérgicos, após uma exposição
exacerbada aos xenobióticos nas doenças alérgicas por meio da via deste receptor
(TAUCHI et al., 2005).
Além disso, o desenvolvimento de reações de dermatite de contato a carcinógenos
dependentes da ligação ao AHR tem sido associado à susceptibilidade ou à resistência ao
desenvolvimento de tumores, em modelos experimentais murinos com diferente
constituição genética (ANDERSON et al., 1995). O polimorfismo neste gene em
camundongos e possivelmente em humanos, bem como nos genes que codificam as
enzimas responsáveis pela cadeia de eventos que se sucedem após sua ação, pode ser mais
um fator determinante de sensibilidade individual diferenciada ao desenvolvimento do
câncer induzida por estas substâncias tóxicas.
No modelo de camundongos AIRmax e AIRmin tem-se demonstrado a participação
exercida pelos genes modificadores da resposta inflamatória aguda na
resistência/susceptibilidade à carcinogênese química (MARIA et al., 2001; MARIA et al.,
2003; RIBEIRO et al., 2005; Di PACE et al., 2006). Por este motivo, estes animais
representam um modelo adicional para o mapeamento e identificação de genes de
predisposição à carcinogênese.
2 OBJETIVOS
Neste trabalho, aprofundamos o estudo das inter-relações genéticas da inflamação e
carcinogênese, analisando comparativamente as linhagens AIRmax e AIRmin quanto à
susceptibilidade ao desenvolvimento de tumores de pulmão e de pele induzidos por
carcinógenos do tipo PAH. Avaliamos ainda alguns dos mecanismos celulares e
moleculares responsáveis pela diferença encontrada entre as linhagens que estariam
relacionadas à resposta inflamatória e/ou à imunidade específica e ao polimorfismo de
genes candidatos.
Objetivos específicos:
1- Analisar os fenótipos de resistência e de susceptibilidade dos animais AIRmax e
AIRmin a protocolos variados de indução de tumores por compostos do tipo PAH;
2- Estudar o desenvolvimento de reações alérgicas do tipo dermatite de contato ao
carcinógeno e comparar com a reação produzida por substância alergênica;
3- Estudar o polimorfismo genético entre as linhagens AIRmax e AIRmin, em regiões
cromossômicas que codificam genes responsáveis pela resposta a xenobióticos,
como o Ahr e CYP1A1 ;
4- Realizar ensaio de co-segregação ou linkage do genótipo Ahr com o fenótipo de
resposta inflamatória aguda em população heterogênea de camundongos F2
resultante do intercruzamento (AIRmax x AIRmin).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais experimentais
Camundongos das linhagens AIRmax e AIRmin, a partir da 38
a
geração de
cruzamentos seletivos e segregantes F
2
, provenientes de cruzamentos entre híbridos F
1
(AIRmax X AIRmin) produzidos e mantidos no Laboratório de Imunogenética do Instituto
Butantan, São Paulo. Usamos em todos os experimentos, machos e fêmeas de 4 a 6
semanas de idade. A utilização dos animais foi aprovada pela Comissão de Ética em
Experimentação Animal (CEEA) em 16/12/04, protocolo n
o
115.
3.2. Histológico
Os fragmentos de órgãos dos animais foram retirados e fixados em formol
tamponado 10 % PBS por 24 horas, seguido de desidratação em uma série crescente de
álcoois (70 %, 90 %, 100%), diafanização em xilol e impregnação e inclusão em parafina.
Os cortes foram feitos na espessura de 5μm e corados com Hematoxilina-Eosina (HE). A
avaliação foi feita em microscópio óptico (Leitz-Diaplan) e a aquisição e digitalização das
imagens através do sistema CCD-IRIS (Sony Company).
3.3 Tratamentos:
3.3.1 3-MC
: Grupos de 30 camundongos de cada linhagem receberam injeção
intramuscular no membro posterior esquerdo de 0,3 mg de metilcolantreno (3-MC) (Sigma-
Aldrich) suspensos em 0,1 ml de óleo sésamo. O desenvolvimento do tumor foi avaliado 2
a 3 vezes por semana durante 11 meses. Os camundongos com tumores com 5 mm de
diâmetro contam como positivos. Os camundongos que apresentavam uma massa superior a
20 mm ou que estavam debilitados eram sacrificados. O diagnóstico dos tumores foi feito
pela análise macroscópica e foram retiradas amostras de diferentes órgãos e tecidos para a
análise histológica.
3.3.2 DMBA: Aplicamos por cinco dias consecutivos, doses epicutâneas dorsais de 50 μg
de 7,12-dimetil benzoantraceno (DMBA) (Sigma-Aldrich) dissolvidos em 0,1 ml de
acetona (LI et al, 2002). Os animais foram observados até 250 dias após o tratamento.
3.3.3 TPA: Aplicamos o agente promotor por cinco dias consecutivos, doses epicutâneas
dorsais de 5 µg de 12-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato (TPA) (Sigma-Aldrich) dissolvidos
em 0,1 ml de acetona (LI et al, 2002). Os animais foram observados até 250 dias após o
tratamento.
3.4 Parâmetros de avaliação do crescimento tumoral
Foram considerados: Incidência = (%) de animais positivos; a multiplicidade de
tumores = N (somatória do número de tumores no total dos animais) e o volume total de
tumores = N V (somatória do volume de tumores onde V = 4/3π R
3
em mm
3
; R= raio
médio do tumor).
3.5 Indução da reação inflamatória pelo Biogel
O Biogel P
100
(BIORAD, Tougar e Matingnom, França) é formado por microesferas
de poliacrilamida, cuja porosidade tem limite de exclusão protéica para moléculas acima de
100 kDa. Duas a quatro gramas de Biogel são hidratadas durante uma hora em 300 ml de
PBS previamente aquecido a 90 ºC, e deixadas por uma hora à temperatura ambiente. Após
a hidratação, o gás retido é removido por vácuo e a suspensão é esterilizada por 20 minutos
a 120
o
C. A suspensão é então lavada 3 vezes com salina apirogênica estéril e
ressuspendida na proporção de 1 ml de partículas em 0,5 ml de salina. Essa suspensão final
contém aproximadamente 53 mg/ml de Biogel P100. O diâmetro médio das microesferas
hidratadas é de 131x10
-3
mm (STIFFEL et al, 1990). Os camundongos da população F2
foram previamente depilados na região dorsal onde receberam uma injeção subcutânea de
0,75 ml da suspensão de Biogel P
100
em PBS. O exsudato foi recuperado após 24 horas pela
administração de 1ml de PBS. Após sedimentação das partículas, o número de leucócitos
infiltrados foi determinado por contagem em câmara de Malassez de uma alíquota do
sobrenadante.
3.6 Extração de DNA genômico (Kit E.Z.N.A.
®
Easy Acid Isolation, Omega Bio-tek,
Inc.)
Dois pedaços da cauda de 1 a 2 cm foram cortados e colocados em tubos eppendorf
estéreis (nuclease-free) e adicionados de 180 μl do Buffer TL e 25 μl de O.B. Protease (+
Tris-HCl), misturados (em vortex) e incubados em banho-maria com agitação a 55
o
C até
que a lise esteja completa. (overnight), e foram centrifugadas por 10 minutos a 13.000
r.p.m. à temperatura ambiente (T.A.) (para a formação do pellet de tecidos). O
sobrenadante foi recolhido e transferido para um tubo estéril. Para remover o RNA foram
adicionados 15 μl de RNase A (25 mg/ml) por 2 min à temperatura ambiente.
Foram adicionados em seguida 200µl de Buffer BL com 210µl de etanol absoluto e
misturados vigorosamente (vortex) para que a mistura seja completa.
Toda a amostra foi transferida para a coluna de extração de DNA (2 ml) e
centrifugada a 13.000 r.p.m. por 15 minutos à T.A. O tubo de coleta foi descartado e a
coluna colocada em um segundo tubo eppendorf (tubo de coleta do Kit) de 2 ml, lavada
com 650 µl do Wash Buffer (diluído em etanol) por centrifugação a 10.000 r.p.m. por 1
minuto e o eluato foi descartado. Este procedimento foi repetido uma vez e o material foi
centrifugado em velocidade máxima por 2 minutos para secar a coluna. A coluna foi
colocada em um tubo estéril, adicionados 200µl do Elution Buffer pré-aquecido a 70
o
C por
3 minutos a 70
o
C.
Após centrifugação a 10.000 r.p.m. por 1 minuto para eluir o DNA da coluna, o
primeiro eluato foi passado novamente na coluna e centrifugado.
O DNA de linhagens isogênicas foi adquirido da Jackson Laboratory.
A concentração de todas as amostras de DNA foi determinada em espectrofotômetro
(260/280 nm), a integridade e qualidade das preparações foram verificadas por eletroforese
em gel de agarose 0,8 % em TBE e o material foi estocado a 4
o
C.
3.7 Protocolo de extração de RNA da pele utilizando Trizol
Cerca de 100 mg de fragmentos de pele foram retirados e macerados em 1 ml de
Trizol (Invitrogen). Após a incubação no gelo foram adicionados 0,2 ml de clorofórmio
(MERCK) para cada 1 ml de Trizol. Após o período de agitação e centrifugação, o
sobrenadante (incolor, que contém o RNA) foi transferido para outro tubo eppendorf e o
RNA foi precipitado em 0,5 ml de álcool isopropílico (MERCK) para cada 1 ml de Trizol.
A mistura da solução foi feita por inversão e após a incubação no gelo, a solução foi
centrifugada a 11000 rpm por 10 minutos à 4 °C. O pellet de RNA foi lavado com 1 ml de
etanol 75% gelado para cada 1 ml de Trizol. Após a secagem, para dissolver o pellet foi
adicionado 50 μl de água livre de RNAse. A concentração de RNA total purificado foi
determinada em espectrofotômetro (260/280 nm), a integridade e qualidade das preparações
foram verificadas por eletroforese em gel de agarose 1,5 % em TBE e o material foi
estocado a -70
o
C.
3.8 Obtenção do cDNA
A síntese de cDNA foi feita através de uma reação de transcrição reversa a partir do
RNA total purificado. Para isso, 10 μl contendo 1 μg do RNA foram adicionados a 1 μl de
Oligo(dT)
12-18
, (50 μM) 2 μl de água livre de RNase, 1 μl de oligonucleotídeos dNTP (10
μM); a mistura foi homogenizada e submetida à temperatura de 65 ºC por 5 minutos. Após
este período permaneceu no gelo por 1 minuto. Em seguida adicionamos 4 μl de tampão
específico 5X concentrado (250 mM Tris-HCL pH 8,3, 375 mM KCL e 15 mM MgCl
2
) 1μl
de DTT (0,1M) e 1μl da enzima SuperScript III RNase H-Reverse Transcriptase (200
U/μl) (Invitrogen) e a mistura permaneceu a temperatura ambiente por 5 minutos, seguida
de nova incubação à 50º C por 50 minutos e inativação a 70 ºC por 15 minutos. As reações
foram incubadas em aparelhos termocicladores Eppendorf – Mastercycler Gradient ou MJ
Research PTC 200.
3.9 Reações de PCR em Tempo-Real ou quantitativo (qPCR)
Cada amostra de 1 μl do cDNA (diluição a 1:2) foi adicionada a uma reação
contendo as seqüências sintéticas específicos ou primers (0,5 μl de cada primer) (5 μM);
6,25 μl do Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG (Invitrogen), e água (4,25 μl )
para ajustar o volume final de reação em 12,5 μl por tubo.
As reações foram incubadas no aparelho Chromo 4 (MJ Research), e submetidas a
uma fase inicial de incubação à 50
o
C por 2 minutos, seguido da fase de ativação da enzima
(hot start) 95 ºC por 2 minutos. As seqüências alvo foram então amplificadas durante 40
ciclos constituídos de etapas sucessivas de desnaturação (94
o
C por 20 segundos), de
anelamento (58
o
C por 20 segundos).
A cada amostra foi atribuído um valor de Ct (Cycle Threshold) referente ao número
de ciclos necessários para que a fluorescência incorporada às duplas fitas amplificadas
comece a aumentar acima da fluorescência de fundo, ou seja, no início da fase logarítima
(log) de amplificação, a qual depende diretamente de quantas cópias das seqüências alvos
havia inicialmente em cada amostra.
Após a amplificação, o produto da reação foi submetido a uma fase de dissociação
(Melting) onde a temperatura variou de 60 °C a 95 °C e a fluorescência foi adquirida a cada
1°C, registrando-se a temperatura de dissociação, ou desnaturação da dupla fita do material
amplificado, o que indica o tamanho e, portanto a especificidade do produto amplificado
em cada reação.
Os dados foram adquiridos e analisados pelo programa “Opticon Monitor Analysis
Software 2.03”, conforme indicado. A quantidade de expressão dos genes estudados neste
trabalho em cada amostra foi estimada através do Cycle Threshold (Ct). Para quantificar os
resultados obtidos pelo qPCR alguns métodos são comumente utilizados , entre eles o
Método de Threshold Comparativo (GIULIETTI et al., 2001 e LIVAK et al., 2001). Neste
método fórmulas aritméticas são usadas para calcular níveis de expressão relativos com um
controle, que normalmente é amostra não tratada. Pelos valores do Cycle Threshold (Ct)
calcula-se o Delta Ct (∆Ct) que consiste na diferença entre os Ct do gene de interesse e do
constitutivo. Do valor do ∆Ct do grupo tratado desconta-se o valor do ∆Ct do grupo
controle que é o Delta Delta Ct [∆∆Ct = ∆Ct (amostra) - ∆Ct (controle)]. A diferença de
expressão é dada pela formula 2
-∆∆C
t
e os valores são expressos em log
2
(log
2
2
-∆∆C
t
), uma
vez que a cada ciclo as cópias do cDNA obedecem a uma curva exponencial com base 2.
Esta transformação é necessária para o tratamento estatístico dos resultados.
Devemos lembrar que os valores do Cycle Threshold (Ct) são inversamente
proporcionais às quantidades inicias de mRNA, ou seja, quanto menor for o valor do Ct,
maior será a quantidade inicial da reação.
Descrevemos na tabela 1 as seqüências sintéticas (primers) que foram utilizadas
para amplificar a partir dos cDNA específicos, os RNAm codificantes para algumas
citocinas envolvidas no processo inflamatório como IL-1α, IL-1β, IL-6, TGF-β1, IFN-γ,
IL-18, IL-10 e TNF-α, para os enzimas do citocromo P450: CYP1A1 e CYP1B1 e para os
receptores CD4 e CD8 de linfócitos T. Estes primers foram desenhados para éxons que
flanqueiam íntrons de grande tamanho (1000 pb) evitando assim a amplificação do DNA
genômico.
Tabela 1: Relação de seqüências sintéticas (primers) empregados nas reações de PCR em tempo real.
PRIMER SENSE (3´) ANTISENSE (5´) Tamanho
do
produto
HMBS
AAAGTGCCGTGGGGAAACCAG GAGGCGGGTGAGGTTTC
102 pb
TNF-α
TTGACCTCAGCGCTGAGTTG CCTGTAGCCCACGTCGTAGC
213 pb
IL-1α
CAGTTCTGCCATTGACCATC TCTCACTGAAACTCAGCCGT
219 pb
IL-1β
GAGATTGAGCTGTCTGCTCA AAGGAGAACCAAGCAACGAC
205 pb
IL-6
GTACTCCAGAAGACCAGAGG TGCTGGTGACAACCACGGCC
209 pb
TGF-β1
ACCGCAACAACGCCATCTAT GTAACGCCAGGAATTGTTGC
201 pb
IL-10
TCAAACAAAGGACCAGCTGGACAACATACTG CTGTCTAGGTCCTGGAGTCCAGCAGACTCAA
254 pb
INF-γ
GCTCTGAGACAATGAACGCT AAAGAGATAATCTGGCTCTGC
227 pb
IL-18
GACCCAGAGGATATTGGATC GGAGGAAGTGTGATGTGAC
214 pb
CYP1A1
TGGAGACCTTCCGGCATTC GCCATTCAGACTTGTATCTCTTGTG
77 pb
CYP1B1
TGGCTGCTCATCCTCTTTAC AGGTTGGGCTGGTCACTCAT
113 pb
CD4
AGCAACTCTAAGGTCTCTAACC AGAGTCAGAGTCAGGTTGCC
467 pb
CD8
AGGATGCTCTTGGCTCTTCC TCACAGGCGAAGTCCAATCC
399 pb
AHR
AGAATCCCACATCCGCATGA TGCAAGAAGCCGGAAAACTG
64 pb
EPHX
GGGTCAAAGCCATCAGCCA CCTCCAGAAGGACACCACTTT
186 pb
OBS: HMBS: Hidroximetil-bilane sintase (gene constitutivo)
3. 10 Indução das reações de Dermatite de Contato
3.10.1 DNFB: Vinte e cinco microlitros de uma solução a 0,5% de 2, 4-
dinitrofluorobenzeno (DNFB) em acetona/ óleo de oliva foram aplicados no abdômen,
previamente raspado e 5 dias após a reação foi desencadeada pela aplicação de 10 μl de
uma solução de DNFB a 0,2% nos dois lados da orelha (GRABBE et al., 1996). Na orelha
contra lateral foi aplicado o mesmo volume do veículo. Os animais foram sacrificados após
24 horas e as orelhas foram cortadas com um bisturi circular (punch) com 5 mm de
diâmetro. Duas amostras de cada orelha foram retiradas e pesadas. O valor de reação foi
dado pela porcentagem de aumento entre o peso das amostras de orelha reação e a normal.
Para cada ensaio utilizamos 5 a 10 animais de cada linhagem por experimento e animais
controle, os quais receberam apenas o veículo na fase de sensibilização.
3.10.2 DMBA: os animais receberam 150 μl de uma solução de 7,12-dimetil
benzoantraceno (DMBA) a 100μg/ml dissolvido em solvente acetona mais DMSO (na
proporção de 2:1) no abdômen previamente raspado. O local da aplicação foi protegido por
uma membrana permeável ao oxigênio e ao vapor (BioOcclusive
®
, Johnson & Johnson
Medical Inc., Arlington, TX). Após 5 dias, a orelha esquerda de cada animal recebeu 30 μl
de uma solução a 200μg do DMBA no mesmo solvente. Os animais foram sacrificados
após 72 horas e a análise da reação foi realizada conforme o procedimento anterior.
3.11 Tipagem do genótipo Ahr (aryl hydrocarbon receptor)
Para identificação do polimorfismo do gene Ahr nas linhagens dos camundongos
AIRmax e AIRmin utilizamos a técnica de RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism). Um fragmento de 218 pb contendo o local da mutação no exon 7 do gene
foi amplificado a partir de 100 ηg de DNA genômico com os primers: OL72 (GGT TCG
AAT TTC CAG GAT GG) e OL 111 (CCA CCC CAG GTA CAT GAT GGA ACC),
descritos por Schmidt, 1996. Os produtos do PCR (24 µl) foram submetidos à digestão com
a enzima Eco-47III (5 U/μl) a 37º C por 3 horas. Ao produto da digestão acrescentou-se 8µl
do corante Azul de Bromo Fenol (BPB) preparado com 50% de glicerol, 100mM de EDTA,
1% de SDS e 0,1 g de BPB. Desta mistura 12 µl foram submetidos à eletroforese horizontal
de agarose a 4%, aplicando uma corrente constante de 120 v durante 2 horas. As amostras
foram reveladas pelo brometo de Etídio incorporado ao gel (1,5µg/ml) pela incidência de
luz U.V.
3.12 Análise de polimorfismo de regiões microssatélites de DNA
O método para identificação do polimorfismo nos alelos dos microssatélites
(diferenças no número de repetições) é baseado na técnica de PCR, que amplifica a
seqüência genômica onde estão localizados estes marcadores. Para isso, foram utilizados
vários pares de primers de microssatélites sintetizados pela Gibco BRL.
Para as reações de amplificação foram usados 100 ng de DNA genômico, em uma
mistura de tampão específico para PCR 1x concentrado; dNTP, 25 0μ M (Gibco BRL);
MgCl
2
1,5 mM (Gibco BRL); 2 mM de cada um dos primers (Forward e Reverse, Gibco
BRL); 1U de Taq DNA polimerase (Gibco BRL) em um volume final de 25 μl com H
2
O
deionizada estéril.
As preparações foram submetidas às seguintes temperaturas: 94
o
C por 3 minutos,
seguidos de 35 ciclos de 94
o
C por 30 segundos; 57
o
C por 35 segundos e 72
o
C por 45
segundos cada ciclo e finalmente 2 minutos a 72
o
C, nos aparelhos termocicladores
Eppendorf – Mastercycler Gradient ou MJ Research PTC 200. Foram analisados os
seguintes microssatélites para o cromossomo 9: CYP1A1 (microssatélite dentro do gene) e
D9Mit248 (Tabela 2).
Tabela 2: Marcador tipo microssatélite de CYP1A1 e D9Mit248.
Microssatélite Seqüência de Primers Temperatura de
anelamento
5´ AGCTACTGAATGGAGGAGCC 3´
CYP1A1
60 ºC
5´ TCTGTAATAGGCATTTGATGCC 3’
5´ TCAGAGTTCAGGAGGGCTGT 3´
D9Mit248
55 ºC
5 TCTGAGAGGCCACATGTCTG 3´
Os produtos da PCR foram submetidos a eletroforese vertical em gel de
poliacrilamida em aparelho Hoefer SE 600 (Amersham Biociences, refrigerado com água
corrente), aplicando uma corrente elétrica de 40mA. Ao produto da PCR (24 µl),
acrescentou-se 12 µl de corante SSLP composto de 40% sacarose; 0,25 % de Azul de
Bromo Fenol (BPB) 0,25 % de Xileno Cyanole; 50mM de EDTA e 10µl da mistura foi
aplicado no gel. A coluna de gel foi montada em placas de vidro de 16x18 cm, com
espessura de 0,75 mm. Na corrida utilizamos tampão TBE 10mM. Na preparação do gel
utilizamos acrilamida / bis-acrilamida 37,5: 1 da BioRad, (8 ou 12,5 %) e Tampão TBE
10mM, sendo polimerizado com o catalizador Persulfato de Amônea (APS a 20 %), 1,8
µl/ml da solução de acrilamida, e o polimerizador TEMED, 0,75µl/ml da solução de
acrilamida. O tempo da corrida variou em função do tamanho dos fragmentos amplificados
(tempo médio de 4 horas). A migração foi acompanhada pela visualização da migração dos
corantes Azul de Bromo Fenol, correspondendo a 70 pares de base, e o Oxileno Cyanole,
130 pares de bases.
Para visualização e localização dos fragmentos amplificados de DNA que migraram
no gel, utilizamos uma solução de Nitrato de Prata a 0,1%, conforme esquema a seguir: O
gel foi imerso durante 6 minutos na solução de fixação (10% de Etanol + 0,5% de Acido
acético); seguiu-se então 10 minutos de imersão na solução de coloração (0,1% Nitrato de
Prata), e após um rápido enxágüe com água destilada, Imersão, durante 10 minutos, na
solução reveladora (1,5% de NaOH + 0,07% de formaldeído).
3.13 Análise estatística
O teste exato de Fisher foi aplicado para as análises comparativas entre incidência
dos tumores e de reações de dermatite de contato nos diferentes grupos experimentais.
Teste não paramétrico de Mann-Whitney para as diferenças entre os grupos nos
parâmetros de desenvolvimento tumoral (N e NV) e na intensidade das reações de
dermatite de contato alérgica.
A significância do desequilíbrio de freqüência dos marcadores alélicos nas
linhagens AIRmax e AIRmin é calculada pelo teste de Qui-quadrado (χ
2
).
Os níveis de p ≤ 0,05 foram considerados significantes.
4 RESULTADOS
4.1 Carcinogênese induzida por PAHs
Os animais AIRmax e AIRmin foram tratados com 2 carcinógenos do tipo PAH, por
diferentes vias e esquemas de administração.
O aparecimento de tumores no local da inoculação foi acompanhado em períodos
regulares e em tempos tardios foi analisado o desenvolvimento de tumores em órgãos
internos, em especial nos pulmões.
O objetivo destes experimentos foi o de confirmar a diferente susceptibilidade de
animais selecionados em desenvolver tumores de pele e de pulmão, quando submetidos a
outros protocolos de tratamentos ou de carcinógenos de diferentes composições.
4.1.1 Carcinogênese pelo metilcolantreno (3-MC)
A indução de sarcomas por 3-MC se dá por injeção intramuscular. 31 animais
AIRmax e 30 AIRmin foram tratados com 0,3 mg de 3-MC suspenso em 0,1 ml de óleo de
sésamo no músculo da perna posterior.
A incidência de 50% de animais com tumor local, com diâmetro igual ou superior a
0,5 cm ocorreu na 19
a
e na 23
a
semanas após o tratamento, nos AIRmin e AIRmax,
respectivamente. Não obstante, durante o período de observação de 45 semanas, cerca de
90% de todos os camundongos desenvolveram fibrossarcomas, caracterizados
histologicamente (Figuras 3 e 4).
Um grupo controle (3 machos e 3 fêmeas) de cada linhagem recebeu apenas uma
injeção intramuscular no membro posterior esquerdo de 0,1 ml de óleo de sésamo (Sigma-
Aldrich) que é o diluente utilizado na aplicação do 3-MC. Não houve o aparecimento de
lesões locais por este tratamento.
Figura 3: Fotomicrografia do corte histológico do sarcoma no músculo de camundongo AIRmin.
Tumor no local da aplicação de 0,3 mg de 3-MC diluído em óleo sésamo (aumento de
100 X).
0
20
40
60
80
100
1 5 9 1317212529333741
q
üência de animnais livres de
tumores (%)
Figura 4: Incidência de sarcomas induzidos pelo 3-MC.
Animais AIRmax (azul) e AIRmin (vermelho) receberam uma injeção intramuscular no
membro posterior esquerdo de 0,3 mg de 3-MC suspensos em 0,1 ml de óleo sésamo e
foram observados durante 45 semanas após a aplicação do carcinógeno.
No momento do sacrifício foram encontrados múltiplos adenomas pulmonares e
grandes adenocarcinomas somente nos camundongos AIRmin tratados com 3-MC (Figura
5). Este resultado confirma a maior susceptibilidade dos AIRmin em desenvolver câncer
pulmonar quando comparados aos animais AIRmax (RIBEIRO et al, 2005) (Tabela 3 e
Figura 5).
Figura 5: Fotomicrografia do corte histológico de um adenocarcinoma pulmonar induzido por 3-
MC em camundongo AIRmin.
Os animais receberam injeção intramuscular no membro posterior esquerdo de 0,3 mg de
3-MC suspensos em 0,1 ml de óleo sésamo e necropsiados após 11 meses do início do
tratamento. Aumento de 100 X.
Tabela 3: Análise do aparecimento de adenomas e adenocarcinomas pulmonares em camundongos AIRmax
e AIRmin tratados com 3-MC.
Camundongos
Adenomas Adenocarcinomas
Tratamento Incidência (%) N NV (mm
3
) Incidência (%) N NV (mm
3
)
AIRmax
3-MC + Óleo
17,2 % (5/29)* 14 14,6 3,5 % (1/29) 1 14
Óleo
0 % (0/6) 0 0 0 % (0/6) 0 0
AIRmin 3-MC + Óleo
61,5 % (16/26) * 107 122 19,2 % (5/26) 5 90
Óleo
50 % (3/6) 4 2,1 0 % (0/6) 0 0
Os animais receberam uma injeção intramuscular no membro posterior esquerdo de 0,3 mg de 3-MC suspensos em
0,1 ml de óleo sésamo ou apenas 0,1 ml do veículo. Foram analisados incidência = (%) de animais positivos; a
multiplicidade de tumores = N (somatória do número de tumores no total dos animais positivos) e o volume total de
tumores = N V (somatória do volume de tumores onde V = 4/3π R
3
em mm
3
) às 45 semanas após o tratamento.
2 animais AIRmax e 4 AIRmin morreram no decorrer do tratamento e não foram necropsiados.
* Diferença AIRmax x AIRmin: teste exato de Fisher p<0,001.
4.1.2 Carcinogênese pelo DMBA
O DMBA é um protótipo de PAH que em várias espécies animais tem efeitos
carcinogênicos e imunossupressores (BURCHIEL et al., 1988, 1990; BUTERS et al., 1999,
2003; SHIMADA e FUJII-KURIYAMA, 2004; THURMOND et al., 1987). Devido a
propriedades de fotólise e foto-oxidação este PAH não existe naturalmente no meio
ambiente. Entretanto, estudos prévios com objetivo de entender os mecanismos de
toxicidade imunológica causados pelo DMBA vêm fornecendo importantes pistas sobre as
ações de PAHs dominantes no meio ambiente (GAO et al., 2005).
Em ensaios anteriores, os animais AIRmax foram resistentes e os AIRmin, sensíveis
quando submetidos ao protocolo clássico de carcinogênese de pele em dois estágios que se
dá pela administração epicutânea do carcinógeno DMBA seguida por doses repetidas de
TPA como agente promotor (BIOZZI et al., 1998).
Com o objetivo de se investigar a ação iniciadora e promotora da progressão
tumoral do DMBA em camundongos, empregamos o protocolo descrito por LI et al (2002),
no qual se aplicam 5 doses epicutâneas consecutivas deste agente. De acordo com os
autores, este esquema de tratamento induz o desenvolvimento de carcinomas espino-
celulares, em maior número e em um tempo mais curto, do que quando se aplica o TPA
como promotor, que por sua vez induz o aparecimento de um maior número de lesões
benignas. Foi, portanto, interessante verificar o comportamento das linhagens frente a este
protocolo mais agressivo e assim melhor avaliar a contribuição da resposta inflamatória
aguda no controle da evolução de tumores malignos (CASALE et al., 2000; LI et al.,
2002).
Os camundongos (15 de cada linhagem) receberam por cinco dias consecutivos,
aplicações epicutâneas dorsais de 50 μg de 7,12-dimetil benzoantraceno (DMBA)
dissolvidos em 0,1 ml de acetona.
Observamos inicialmente que todos os camundongos AIRmin desenvolveram uma
acentuada reação na pele, parecida com uma dermatite de contato alérgica, a partir do 7º dia
após a última exposição ao DMBA, enquanto que não houve alteração na pele dos animais
AIRmax (Figura 6). Esta reação poderia ser devida aos efeitos tóxicos diretos da droga ou
a uma reação alérgica específica. Ocorreu regressão gradual da lesão até a completa
cicatrização aos 20 dias após o tratamento. Os animais foram observados semanalmente por
mais 250 dias para o acompanhamento do aparecimento de lesões cutâneas papilomatosas e
carcinomas (Figura 7).
Figura 6: Aspectos da pele de animais AIRmax (A) e AIRmin (B), 8 dias após a aplicação por
cinco dias consecutivos de doses epicutâneas dorsais de 50 μg de DMBA dissolvidos em
0,1 ml de acetona.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
19 35 49 67 81 98 112 140 154 168 182 201 216 236 250
tempo (dias)
multiplicidad
e
Figura 7: Multiplicidade de lesões papilomatosas de pele induzidas pelo DMBA.
Animais AIRmax (azul) e AIRmin (vermelho) foram tratados por 5 dias consecutivos
com 50 μg de DMBA dissolvidos em 0,1 ml de acetona no dorso. O número de tumores
foi observado até 250 dias após o final do tratamento.
Os camundongos AIRmin mostraram-se mais susceptíveis que os AIRmax à
indução de tumores de pele por repetidas aplicações epicutâneas de DMBA, mesmo na
ausência do promotor. Múltiplos papilomas benignos apareceram nos tempos iniciais e
carcinomas espinocelulares se desenvolveram nos animais AIRmin já a partir de 70 dias,
enquanto os AIRmax mostraram-se resistentes. A partir de 200 dias apareceram algumas
lesões papilomatosas nos AIRmax, enquanto neste tempo, as lesões já haviam progredido
para carcinomas nos AIRmin.
Após 250 dias de tratamento os animais foram sacrificados e submetidos a
necropsia. Constatamos o aparecimento de múltiplos tumores pulmonares (adenomas e
adenocarcinomas) em 93% dos camundongos AIRmin. Por outro lado, também sob este
protocolo, os AIRmax foram mais resistentes, e apenas 1 camundongo em 13 apresentou 2
lesões, sendo um pequeno adenoma e um adenocarcinoma no pulmão (Tabela 4).
Tabela 4: Análise do aparecimento de adenomas e adenocarcinomas pulmonares em
camundongos AIRmax e AIRmin tratados com DMBA.
Adenomas Adenocarcinomas
Camundongos
Incidência (%) N NV (mm
3
) Incidência (%) N NV (mm
3
)
AIRmax
7,7 (1/13) * 1 4 7,7 (1/13) 1 14
AIRmin
92,9 (13/14) * 32 112 42,9 (6/14) 12 690
Os camundongos AIRmax e AIRmin receberam doses epicutâneas dorsais de 50 ug de
7,12-dimetil benzoantraceno (DMBA) dissolvidos em 0,1 ml de acetona por 5 dias
consecutivos e 260 dias após o tratamento foram analisados incidência = (%) de animais
positivos; a multiplicidade de tumores = N (somatória do número de tumores no total dos
animais positivos) e o volume total de tumores = N V (somatória do volume de tumores
onde V = 4/3π R
3
em mm
3
).
* diferença AIRmax x AIRmin: teste exato de Fisher p<0,0001.
Na Figura 8 (A e B) mostramos um adenoma pulmonar de camundongo AIRmax
onde as células inflamatórias estão infiltradas no adenoma. Nas figuras 8 C e D
apresentamos um adenocarcinoma pulmonar de animal AIRmin com infiltrado inflamatório
envolvendo as células tumorais.
Figura 8: Fotomicrografia de cortes histológicos de pulmão de áreas com tumores pulmonares de
camundongos AIRmax e AIRmin induzidos por DMBA.
Os animais foram tratados por 5 dias consecutivos com aplicações epicutâneas dorsais de
50 μg de DMBA dissolvidos em 0,1 ml de acetona e foram sacrificados aos 260 dias do
tratamento.
A: adenoma em pulmão de AIRmax (aumento de 100 x);
B: focos inflamatórios intralesionais (indicado pela seta) em animal AIRmax (aumento de
400 x);
C: adenocarcinoma em pulmão de AIRmin (aumento de 100X);
D: infiltrado inflamatório na periferia das células tumorais, mas não na lesão (indicado pela
seta) em camundongo AIRmin (aumento de 400 x).
Como já referido, durante a fase inicial do tratamento com as 5 doses consecutivas
de DMBA, observamos o aparecimento de lesões na pele, semelhantes a uma dermatite de
contato que foi muito mais intensa e duradoura nos animais AIRmin em comparação com
os AIRmax (Figura 6). Um grupo de animais (2 de cada linhagem) foi então tratado com
DMBA e sacrificado 48 horas após a última das 5 aplicações do carcinógeno para a análise
histológica da pele; nos animais controle, aplicamos acetona durante 5 dias e em outro
grupo aplicamos doses consecutivas de TPA para comparação do efeito de um promotor
que é usualmente empregado em protocolos de carcinogênese cutânea.
Os resultados estão apresentados na figuras 9 A, B e C. Observamos um infiltrado
moderado predominante de leucócitos polimorfonucleares na pele de animais AIRmax
tratados com 5 doses de DMBA (Figura 9 B1), enquanto nos AIRmin, ocorre um intenso
infiltrado com células mononucleares e polimorfonucleares (Figura 9 B2). O tratamento
com TPA induziu um quadro inflamatório mais intenso na pele dos animais AIRmax.
1
2
Figura 9A: Fotomicrografia de cortes histológicos da pele de animal AIRmax (1) e AIRmin (2)
controle.
Os animais receberam o tratamento de 5 cinco dias consecutivos de doses epicutâneas
dorsais de 0,1 ml de acetona e foram sacrificados 48 horas depois.
1: AIRmax : Pele normal, ausência de processo inflamatório, preservação de anexos,
epiderme hipoderme normais, sem espessamento (Aumento de 100 X);
2: AIRmin: Tecido normal, ausência de processo inflamatório e com todos os
componentes da pele normais (aumento de 40X).
Figura 9B: Fotomicrografia de cortes histológicos da pele de animal AIRmax (1) e AIRmin (2)
após tratamento com DMBA.
Os camundongos receberam por 5 dias consecutivos doses epicutâneas dorsais de 50 μg
de DMBA dissolvidos em 0,1 ml de acetona e 48 horas após o tratamento foram
sacrificados.
1: AIRmax: Área com discreta hiperplasia da epiderme, discreto infiltrado de
endoderme para epiderme, resposta mais perivascular, predomínio de leucócitos
polimorfonucleares (Aumento de 100 X).
2: AIRmin: Área com hiperplasia da derme e com intenso infiltrado misto com
predominância de polimorfonucleares (Aumento de 100 X).
1
2
Figura 9C: Fotomicrografia de cortes histológicos da pele de animal AIRmax (1) e AIRmin (2)
após tratamento com TPA.
Os camundongos receberam por 5 dias consecutivos doses epicutâneas dorsais de 5 μg
de TPA dissolvidos em 0,1 ml de acetona e 48 horas após o tratamento foram
sacrificados.
1: AIRmax: pele com hiperplasia mais acentuada, espongiose acentuada,
hipergranulose e ortoqueratose (seta) (Aumento de 100 X).
2: AIRmin: Evidente hiperplasia difusa da epiderme, acantose e ortoqueratose (seta),
espongiose multifocal, discreta fibrose, fibrose superficial, infiltrado discreto mais
evidente alteração de epiderme, padrão mononuclear (Aumento de 100 X).
As alterações histopatológicas cutâneas observadas nos AIRmin após o tratamento
com DMBA estariam relacionadas com as particularidades desta linhagem em desenvolver
a reação cutânea inicial.
Está descrito na literatura que a ocorrência de reação específica de dermatite de
contato ao DMBA estaria associada ao grau de susceptibilidade à carcinogenênese. Casale
e colaboradores (2000) avaliaram camundongos susceptíveis que receberam DMBA na
pele, e estes apresentaram um aumento na produção de IFN gama e IL-2 nos gânglios
drenantes, e também maior expressão de IL-1 beta, IL-10, TNF alfa e IL-4 na pele após o
tratamento. Este perfil de citocinas é semelhante ao perfil das reações convencionais que
ocorrem na dermatite de contato, como as induzidas pelo 2, 4-dinitrofluorobenzeno
(DNFB).
Assim, decidimos analisar a capacidade dos animais AIRmax e AIRmin de produzir
reação de dermatite de contato ao DMBA, comparativamente ao protocolo clássico de
indução de reação ao DNFB.
4.2 Dermatite de Contato ao DNFB e ao DMBA
A dermatite de contato é uma inflamação na pele causada pelo contato e exposição
repetida a algum fator ambiental, usualmente uma substância química, que pode ter uma
base imunológica (KRASTEVA et al., 1999a, b).
As mesmas vias enzimáticas que são necessárias para as atividades mutagênicas e
carcinogênicas dos PAHs, como o DMBA, também devem estar completamente funcionais
para que ocorra a sensibilização por contato. Por exemplo, a inibição farmacológica do
metabolismo enzima-dependente do citocromo P450 bloqueia a resposta de dermatite de
contato ao DMBA. Por outro lado, o sensibilizante de contato DNFB é um hapteno que não
requer conversão dependente da enzima P450 (ANDERSON et al., 1995).
Vários experimentos foram realizados com diferentes doses de sensibilização e
diferentes tempos após o desafio, para determinarmos as melhores condições de reação ao
DNFB ou ao DMBA, seguindo o protocolo descrito por Anderson e seus colaboradores,
1995.
Resumindo, os animais receberam as doses epicutâneas sensibilizantes de DNFB
ou de DMBA dissolvidas em veículos apropriados no abdômen e as reações foram
desencadeadas 5 dias após pela aplicação dos mesmos antígenos na orelha (detalhe na
Tabela 5). As reações foram avaliadas pela variação no peso de fragmentos de orelha
tratada em relação ao controle.
Os camundongos AIRmax de ambos os sexos produziram uma reação intensa
específica ao DNFB. Por outro lado, os machos AIRmin não reagiram ou produziram
reações fracas, sendo significantes as diferenças com as fêmeas da mesma linhagem ou com
os AIRmax. Nos animais controle, apenas desafiados, não houve variação de peso das
orelhas ou sinais de irrigação (Tabela 5).
Por outro lado, observamos que 85% (11/13) dos animais AIRmin produziram
reações positivas ao DMBA com aumento significante (>10%) do peso da orelha e sinais
evidentes de aumento de irrigação sangüínea, enquanto que apenas 25% (3 em 12) dos
animais AIRmax produziram reações. Não houve diferença significante na reação ao
DMBA entre machos e fêmeas AIRmin (Tabela 5 e Figura 10).
A baixa resposta dos AIRmax ao DMBA neste protocolo está em concordância
com a ausência de reação de dermatite observada anteriormente após as 5 aplicações de
DMBA. Por outro lado, estes animais são capazes de produzir reações intensas específicas
ao DNFB, situação em que não é necessária a metabolização do agente irritante.
Tabela 5: Reações de dermatite de contato ao DNFB e ao DMBA nas linhagens AIRmax e AIRmin.
DNFB
1
DMBA
2
Positivo/total Média
%aumento±dp
@
P Positivo/total Média
%aumento±dp
@
P
AIRmax
♂
6/6
88,5±26,1
(ep=10,7)*
*<0,001 2/6
16,2±25,83
(ep=10,5)
♀
6/6
77,9±15,9 (ep=6,5)
1/6
8,6±20,98 (ep=8,6)
♂+♀
12/12#
83,15±21,82
(ep = 6,3)
#0,04 3/12
#
12,4±22,8*
(ep=6,6)
*0,01
#0,0048
AIRmin
♂
2/6
17,6±5,5 (ep=2,2)*
6/6
45,0± 26,22
(ep=10,7)
♀
5/6
79,0±42,7
(ep=17,4)
5/7
21,2± 13,02
(ep=4,9)
♂+♀
7/12#
48,3±45,03
(ep=13,0)
11/13
#
32,2±22,9 (ep=6,4)
1
Foram aplicados no abdômen dos animais 25μl de DNFB 0,5% diluído em acetona/ óleo de oliva e 5 dias após a
reação foi desencadeada pela aplicação de 10 μl de uma solução de DNFB a 0,2% na orelha.
2
Foram aplicados no abdômen dos animais 150 μl de uma solução DMBA a 100μg dissolvido em acetona mais
DMSO. Após 5 dias, a orelha esquerda de cada animal recebeu 30 μl de uma solução a 200μg do DMBA no
mesmo solvente. Os animais foram sacrificados após 72 horas e a análise da reação foi realizada conforme o
procedimento anterior.
@ % de aumento de peso da orelha reação em comparação com a orelha controle. Diferenças entre AIRmax e
AIRmin # (Teste exato de Fisher) * (Teste não paramétrico de MannWhitney).
Figura 10: Fotomicrografia de cortes histológicos da pele de reações induzidas pelo DMBA e pelo
DNFB na orelha em animais AIRmax e AIRmin.
Os animais foram sensibilizados com DMBA ou DNFB no abdômen e 5 dias depois
foram desafiados. 48 horas após o desafio os animais foram sacrificados e as orelhas
foram analisadas. Os animais sensíveis ao DNFB (AIRmax) e ao DMBA (AIRmin)
apresentaram hiperplasia da epiderme, edema da derme e um infiltrado inflamatório
perivascular (aumentos de 10 X).
4.3 Estudo da reação ao DMBA na pele
Retornando ao protocolo inicial, avaliamos por técnica de RT- PCR em tempo real a
quantidade de RNA mensageiro de algumas citocinas, de 2 enzimas do citocromo P450 que
metabolizam o DMBA na dependência da ligação com o AHR e de receptores CD4 e CD8
de linfócitos T, na pele de animais AIRmax e AIRmin 48 horas após o último dia de
tratamento repetido com DMBA. Os resultados foram comparados aos de animais tratados
com o agente promotor (TPA), com o veículo (acetona) ou não tratados (LI et al., 2002).
A normalização para um gene constitutivo é comumente o método mais aceitável
para a correção de pequenas variações, devido à diferença na quantidade do RNA total. Um
gene constitutivo ideal deve ser expresso em níveis constantes em diferentes tecidos do
organismo, em todos os estágios do desenvolvimento, e não deve ser afetado pelo
tratamento experimental (GIULIETTI et al., 2001).
Utilizamos como gene constitutivo o HMBS (hydroxymethylbilane synthase), e
obtivemos bons resultados em nossos experimentos. Na figura 11 mostramos os gráficos
de amplificação do HMBS das amostras experimentais e controle bem como as respectivas
curvas de Melting. Podemos observar que nas varias preparações que inclui animais
controle e tratados não houve variação importante no Ct indicando a boa qualidade dos
RNA. As curvas de Melting, em que as amostras apresentaram um único pico de
dissociação, evidenciam que todas as duplas fitas do material analisado separam-se na
mesma temperatura, indicando a amplificação de uma banda específica, de mesmo
tamanho.
Para comparação e ilustração, apresentamos na figura 12 a análise da expressão da
IL-6 nas mesmas amostras, onde observamos variação importante nos Ct e a mesma
temperatura de Melting para todas as amostras.
Nestes experimentos foram analisados 2 ♂ e 2♀ de cada linhagem sem tratamento
ou recebendo 5 aplicações de acetona, representando os grupos controles. Nos grupos
experimentais que receberam as 5 doses de DMBA ou de TPA foram utilizados 3 ♂ e 5 ♀
de cada linhagem.
Figura 11: Expressão por RT-PCR em Tempo Real do HMBS na pele animais AIRmax e AIRmin
controle e estimulados com DMBA. Os gráficos mostram Cycle Threshold (C
T
) (A) e
as curvas de Melting (B) onde o pico de dissociação do branco da reação (sem inclusão
de cDNA) é diferente das demais amostras. Os animais foram tratados com 5 doses de
50 μg de DMBA dissolvidos em 0,1 ml de acetona (LI et al., 2002). A análise foi feita
48 horas após o final do tratamento. Ensaio realizado no Chromo 4 (MJ Research)
utilizando Platinum SYBR Green qPCR Supermix UDG (Invitrogen).
B
Figura 12: Quantificação da expressão de IL-6 por RT-PCR em Tempo Real na pele dos animais
AIRmax e AIRmin estimulados com DMBA. Os gráficos mostram Cycle Threshold
(C
T
) (A) e as curvas de Melting (B) onde o pico de dissociação do branco da reação
(sem inclusão de cDNA) é diferente das demais amostras. Os animais receberam 5
doses de 50 μg de DMBA dissolvidos em 0,1 ml de acetona (LI et al., 2002). A análise
destes foi feita 48 horas após o final do tratamento. Ensaio realizado no Chromo 4 (MJ
Research) utilizando Platinum SYBR Green qPCR Supermix UDG (Invitrogen).
→AIRmax; →AIRmin.
Todos os resultados referem-se a reações realizadas em duplicata e os valores
apresentados são a média das duas determinações. Foi feita a média e desvio padrão das
amostras individuais em cada grupo para análise das significâncias das diferenças de
expressão dos genes entre as linhagens de camundongos quanto ao tratamento (Tabela 7).
4.3.1 Avaliação da Expressão de Citocinas por RT-PCR em Tempo Real
Os níveis de expressão de diferentes citocinas foram determinados pela comparação
entre os grupos tratados com DMBA ou com TPA e os controles, às 48h após o final do
tratamento. A aplicação repetida de acetona não provocou alterações significativas na
expressão das citocinas analisadas em comparação com a pele normal. O grupo de animais
tratados com acetona foi usado como controle para os grupos tratados com DMBA ou TPA.
Os resultados estão apresentados na tabela 6 e figura 13.
A
B
Tabela 6: Avaliação das variações dos níveis de expressão de RNAm de citocinas e enzimas do
citocromo P450 e por técnica de qPCR na pele de animais AIRmax e AIRmin após
tratamento com DMBA ou TPA.
Primers Linhagem Acetona*
log
2
2
-∆∆C
T
DMBA**
log
2
2
-∆∆C
T
p TPA**
log
2
2
-∆∆C
T
p
IL-6
AIRmax -0,71 ± 1,31 1,05 ± 1,77 <0,0001 1,27 ± 1,82 n.s.
AIRmin -0,44 ± 1,27 5,05 ± 1,00 1,43 ± 2,77
TNF-α
AIRmax
-0, 07 ± 0, 46 -0, 02 ± 1, 22
0,0009
1,14 ± 1, 50
n.s.
AIRmin
0, 36 ± 0, 98 2, 07± 0, 70
1,96 ± 2, 47
IL-10
AIRmax
-0, 12 ± 2, 37 1,50 ± 3, 55
n.s.
0,49 ± 1, 97
n.s.
AIRmin
0, 56 ± 1, 58 3,32 ± 0, 94
0,58 ± 2, 08
IFN-γ
AIRmax
0, 83 ± 2, 63 1,04 ± 2, 53
n.s.
1, 12± 2, 82
n.s.
AIRmin
0, 03± 0, 76 2,27 ± 0, 80
0, 28± 3, 89
IL-1 α
AIRmax
0, 69± 1, 08 -1,15 ± 3, 57
n.s.
1,13 ± 0, 88
n.s.
AIRmin
-0, 77± 0, 53 -1,05 ± 2, 54
1,88 ± 2, 64
IL-1-β
AIRmax
-1, 43 ± 2, 29 0, 84 ± 2, 29
0,0002
4, 01 ± 2, 66
n.s.
AIRmin
0, 80 ± 0, 92 5, 16 ± 0, 69
5, 36 ± 3, 91
TGF-β 1
AIRmax 0,13 ± 0,77 -0,84 ± 1,38 <0,0001 0,60 ± 1,09 n.s.
AIRmin 0,53 ± 0,57 2,08 ± 0,49 0, 27 ± 1,09
IL-18
AIRmax
-0, 78 ± 2, 48 0,62 ± 1, 59
n.s.
0, 46 ± 0, 68
n.s.
AIRmin
0, 92 ± 0, 38 0, 37 ± 0, 64
-0, 10 ± 1, 01
CYP1A1
AIRmax
-0, 29± 2, 68 -1, 13 ± 1, 85
n.s.
0, 48 ± 1, 91
n.s.
AIRmin
-0, 01 ± 0, 74 -0, 85± 0, 54
0, 21 ± 1, 74
CYP1B1
AIRmax 0,11 ± 0,69
-0, 49 ± 1, 41
0,0012
-0, 18 ± 0, 82
n.s.
AIRmin 0,97 ± 1,45
1,78 ± 0, 72
0, 12 ± 1, 03
*: Variação em relação à pele normal.
**: Variação em relação ao grupo tratado com acetona.
n.s.: Diferença AIRmax e AIRmin não significante.
Resultados: média ± dp (dp é o desvio padrão).
Tratamento 5 X DMBA (Pele)
-2,00
-1,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Animais
log
2
2-∆∆C
T
Figura 13 Análise da expressão de RNAm para citocinas em amostras de pele de animais AIRmax
(azul) e AIRmin (vermelho) 48 horas após o tratamento por 5 dias consecutivos com 50
μg de DMBA dissolvido em 0,1 ml de acetona no dorso em comparação com animais
tratados com 5 aplicações de 0,1 ml de acetona.
* log
2
2
-ΔΔC
T
: diferença AIRmax X AIRmin significante quando p < 0,05.
Resultados: média ± erro padrão (e.p.) da média = dp√N, onde N é o número de
camundongos testados e dp é o desvio padrão.
Os resultados mostram que 48 horas após a exposição ao carcinógeno os animais
AIRmin expressaram quantidades significativamente maiores de RNAm para as citocinas
IL-1 β, IL-6, TNF-α e TGF-β-1 que os AIRmax, resultados que são coerentes com a maior
susceptibilidade dos AIRmin em desenvolver as reações alérgicas ao DMBA e
posteriormente os tumores de pele. No mesmo material, não encontramos diferenças na
expressão de IL-10, IFN-γ entre as linhagens e não foi verificada a estimulação da
expressão dos genes da IL-1α e da IL-18 (Tabela 6 e Figura 13).
Na pele tratada com o agente promotor TPA, sabidamente inflamatório para ambas
as linhagens e que não requer a metabolização para exercer seu efeito, com exceção da IL-
IFN-γ
IL-1β
IL
-
1α
IL
-
6
IL
-
10
IL
-
18
TGF-
β
1
TNF-α
*
*
*
*
1β, não houve modulação significativa da expressão de nenhum dos genes estudados, não
sendo observadas diferenças interlinhagens (Tabela 6).
4.3.2 Análise da Expressão de CD4 e CD8 por RT-PCR em Tempo Real
Estudos clínicos e em animais experimentais já demonstraram o papel das células T
CD4
+
e CD8
+
na resposta de hipersensibilidade de contacto (KRASTEVA et al., 1999;
CAVANI et al., 2001; GRABBE et al., 1998; WANG et al., 2001), os estudos vem
indicando que: 1) as células Tc1 CD8
+
são células efetoras na resposta de
hipersensibilidade de contacto em camundongos (XU et al., 1997; BOUR et al., 1995;
CAVANI et al., 2001; KEHREN et al., 1999; MARTIN et al., 2000); e em humanos
(CAVANI et al., 2001; CAVANI et al., 1998) e que 2) as células Th2/Treg CD4
+
regulam a
magnitude da resposta de hipersensibilidade de contacto (XU et al., 1997; BOUR et al.,
1995; CAVANI et al, 2001; DESVIGNES et al, 1998; LOPEZ et al, 1998; GORBACHEV
et al., 2001; CAVANI et al., 2000; AKIBA et al., 2002).
Analisamos a expressão dos receptores CD4 e CD8 em 4 animais de cada linhagem
(2 ♂e 2 ♀) e observamos maior expressão do receptor CD4 e também de CD8 na pele de
animais da linhagem AIRmin tratados com DMBA do que nos AIRmax (Figura 14), o que
deve refletir a magnitude do influxo destas células ao local. Esta diferença em CD4 e CD8,
que ocorreu 48 após o fim do tratamento, é uma resposta carcinógeno-específica uma vez
que aconteceu apenas na presença do carcinógeno e não do veículo e nem do agente
promotor (não mostrado).
Figura 14: Análise da expressão de RNAm para CD8 e CD4 em amostras de pele de animais
AIRmax e AIRmin 48 horas após o tratamento por 5 dias consecutivos com 50 μg de
DMBA dissolvido em 0,1 ml de acetona no dorso em comparação com 0,1 ml de
acetona no dorso.
4.3.3 Detecção da Expressão de CYP1A1 e CYP1B1 por RT-PCR em Tempo Real.
Muitos dos carcinógenos químicos que estão no ambiente são quimicamente inertes
e requerem uma ativação metabólica preliminar pelas enzimas do Citocromo P450 para
torná-los metabólicos mais reativos e assim se tornarem capazes de atividade carcinogênica
em animais experimentais e em humanos (CONNEY et al., 1991; GUENGERICH e
SHIMADA, 1991). O Citocromo P450 é um conjunto altamente diversificado (1.500
seqüências conhecidas) de peptídeos e são freqüentemente chamados de hidroxilases que
podem executar amplo espectro de reações.
Discute-se o papel executado por CYP1A1 e CYP1B1 como os responsáveis pela
ativação de PAHs para intermediários epóxidos, que são posteriormente convertidos em
diol-epóxidos mais reativos com o auxílio da epóxido hidrolase EPHX1 (microsomal
epoxide hydrolase, hidrolase epóxida microssômica) (CONNEY et al., 1982; SHIMADA et
al., 1996). (GONZALEZ, 2001). O metabólito DMBA-3,4-diol-1,2-epóxido (DMBA-DE) é
considerado o carcinógeno definitivo que se liga ao DNA e produz toxicidade
(GONZALEZ, 2001; RAMAKRISHNA et al., 1992) (GAO et al., 2005).
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
-ΔΔC
T
AIRmax AIRmin
CD8
CD4
Na epiderme de camundongos, a P4501A1 tem uma expressão constitutiva baixa,
entretanto, pode ser induzida de maneira significativa por meio de agonistas de AHR neste
tecido (SHIMIZU et al., 2000; MARSTON et al., 2001).
Analisamos por este motivo a expressão de RNAm destas duas enzimas na pele de
animais AIRmax e AIRmin normais ou tratados com DMBA ou TPA. Como o observado
para algumas citocinas, ocorreu aumento da expressão de CYP1B1 apenas na pele de
animais AIRmin tratados com DMBA(Figura 15). Não houve alteração na expressão da
enzima pelo tratamento com TPA (que não é metabolizado por esta via) ou acetona (Tabela
6).
Tratamento 5 X DMBA (Pele)
-1,50
-1,00
-0,50
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Animais
log
2
2-∆∆C
T
Figura 15: Análise da expressão de RNAm para enzimas do citocromo P450 em amostras de pele
de animais AIRmax (azul) e AIRmin (vermelho) 48 horas após o tratamento por 5 dias
consecutivos com 0,1 ml de DMBA em acetona no dorso em comparação com amostras
de pele normal.
* log
2
2
-ΔΔC
T
: diferença AIRmax X AIRmin significante quando p < 0,05.
Resultados: média ± erro padrão (e.p.) da média = dp√N, onde N é o número de
camundongos testados e dp é o desvio padrão.
4.4 Pesquisa de polimorfismo em gene candidato
Como já referido, o processo de metabolização do DMBA e de outros PAHs se
inicia pela sua ligação ao receptor de aril hidrocarbonetos (AHR) que é um fator de
transcrição ativado por ligante e que regula a expressão de várias enzimas metabolizantes,
CYP1A1
CYP1B1
*
que os transformam em produtos tóxicos. O receptor AHR exibe considerável variabilidade
estrutural e funcional em linhagens isogênicas de camundongos e este polimorfismo é
resultado da existência de vários alelos no locus Ahr (aryl hidrocarbon receptor) que o
codifica. Estes alelos são definidos por variações nos exons 7 e 9. Todas as linhagens de
camundongos que expressam o alelo Ahr
d
(o alelo que está associado a um receptor de
baixa afinidade e com uma deficiência na capacidade de metabolizar PAHs) falham em
desenvolver a dermatite por contato ao DMBA e são mais resistentes à carcinogênese por
este composto (ELMETS et al., 1998).
A análise molecular do gene Ahr é, portanto uma etapa essencial em nosso estudo
para entender a diferenciação das linhagens nos processos de carcinogênese e os
mecanismos que estão envolvidos na toxicidade dos compostos empregados.
O polimorfismo do exon 9 resulta numa troca de aminoácidos alanina por valina na
posição 375 do sítio de ligação do receptor, com a conseqüente diminuição de afinidade. O
polimorfismo no exon 7 é evidenciado por RFLP, ou seja, a perda do sítio de uma enzima
de restrição Eco47III no nucleotídeo 752 (AGCGCT→AGCACT). Camundongos C57BL/6
apresentam o alelo que é digerível pela enzima neste sítio, enquanto os camundongos
DBA/2 têm o outro alelo.
O método foi inicialmente padronizado com DNA de camundongos C57BL6/J e
DBA2/J provenientes da Jackson Laboratories e em seguida analisamos individualmente
os DNA genômicos extraídos de fragmentos da cauda de 10 camundongos de cada
linhagem (AIRmax e AIRmin).
Conforme mostra a figura 16 da eletroforese no gel, é evidente a fixação do alelo
equivalente ao C57BL6/J, relacionado à alta afinidade do receptor, nos animais AIRmin e
do alelo correspondente aos DBA/2 nos AIRmax.
Figura 16: Imagem do gel de eletroforese da análise do polimorfismo do gene Ahr.
Todos os AIRmax apresentam o mesmo alelo dos DBA/2 (resistente à ação da enzima),
enquanto todos os AIRmin apresentam o alelo dos camundongos C57BL/6, com o
aparecimento de dois fragmentos resultantes da digestão pela enzima de restrição.
OBS: P= peso molecular Ø X174 RF DNA/Hae III Fagments.
ND= não digerido (sem adição da enzima Eco47III)
D= com a adição da enzima
Na tabela 7 estão apresentados os genótipos Ahr das linhagens isogênicas que
constituíram a população inicial F0 do processo de seleção das linhagens AIRmax e
AIRmin. Os dados do exon 9 foram obtidos por sequenciamento e fornecidos pelo Dr.
Tommaso Dragani do Laboratório de Oncologia Experimental do Istituto Nazionale dei
Tumori em Milão, Itália, que é colaborador de nosso laboratório.
Tabela 7: Alelos do gene Ahr em linhagens de camundongos isogênicas e de AIRmax e AIRmin.
Linhagem Polimorfismo no exon 9
A375V
Polimorfismo de nucleotídeo no
exon 7 G752A
Alelo Ahr Fenótipo
C57BL/6J
(Alanina) Guanina
Ahr
b1
Alta afinidade
A/J
(Alanina) Adenina
Ahr
b2
Alta afinidade
BALB/cJ
(Alanina) Adenina
Ahr
b2
Alta afinidade
CBA/J
(Alanina) Adenina
Ahr
b2
Alta afinidade
DBA/2J
(Valina) Adenina
Ahr
d
Baixa afinidade
SJL/J
(Valina) Adenina
Ahr
d
Baixa afinidade
SWR/J
(Valina) Adenina
Ahr
d
Baixa afinidade
P/J
Adenina
AIRmax
(Valina) Adenina
Ahr
d
Baixa afinidade
AIRmin
(Alanina) Guanina
Ahr
b1
Alta afinidade
Estas linhagens de camundongos constituíram a população inicial F0 da seleção AIRmax e AIRmin.
Linhagem isogênica P foi genotipada apenas pelo Laboratório de Imunogenética por RFLP para o exon 7.
Estes genótipos indicam que o Ahr é um fator genético que contribui para a
diferente susceptibilidade das linhagens selecionadas ao câncer induzido pelos PAHs. A
fixação alélica diferencial em AIRmax e AIRmin sugere adicionalmente o Ahr como um
alvo genético possivelmente envolvido no controle da resposta inflamatória. Esta hipótese
se baseia no princípio de que, em decorrência do processo de seleção bidirecional das
linhagens, os alelos dos genes que condicionam fenótipo de resposta inflamatória máxima
ou mínima, segregaram especificamente das 8 linhagens parentais, para as linhagens
AIRmax e AIRmin, respectivamente, conduzindo a uma homozigose em loci modificadores
da AIR, mas mantendo heterogeneidade genética em loci não ligados.
4.4.1 Ensaio de linkage
A contribuição deste locus na regulação da reatividade inflamatória foi então
avaliada pelo ensaio de co-segregação ou linkage dos genótipos Ahr, correspondentes aos
parentais AIRmax e AIRmin, com o fenótipo de intensidade da resposta inflamatória aguda
ao Biogel, em população heterogênea de segregantes F2 entre as duas linhagens. A
população F2 foi produzida a partir de cruzamentos entre F1(AIRmax x AIRmin) X
F1(AIRmax x AIRmin) sendo analisado o perfil de resposta inflamatória ao Biogel destes
animais (número de leucócitos infiltrados) (Figura 17) bem como o genótipo do locus Ahr.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Concentração celular em log
n
(x 10
-5
/ml)
Freqüência (%)
34567
Figura 17: Análise da reação inflamatória aguda nos segregantes F2 (AIRmax x AIRmin).
Foram analisados 117 fêmeas e 64 machos F2. A distribuição dos genótipos de Ahr
na população total aproximou-se de distribuição Mendeliana, com 35 (19,3%) animais
homozigostos Ahr 752A (aa), 96 (53%) heterozigotos Ahr A/G (ab) e 50 (27,6%)
homozigotos Ahr 752G (bb) (Tabela 8).
Observamos que, enquanto os heterozigotos se distribuíram ao longo da curva de
resposta inflamatória, existe uma maior freqüência de camundongos com genótipo Ahr
752A (aa) (dos parentais AIRmax) entre os grupos F2 com resposta inflamatória mais alta e
de camundongos Ahr 752G (bb) (dos parentais AIRmin) entre os animais com resposta
baixa (Figura 18).
Figura 18: Distribuição do genótipo Ahr em segregantes F2 (AIRmax X AIRmin) de acordo com
reatividade inflamatória (aa = homozigoto para baixa afinidade; bb = homozigoto para
alta afinidade).
Para comparação, apresentamos na tabela a distribuição dos genótipos na população
total, e nos extremos de alta e baixa resposta inflamatória (AIR) Como limites
estabelecemos valores de log
n
do número de leucócitos infiltrados maiores ou iguais à
média adicionada de 1desvio padrão (≥ X+1dp) para os F2 de alta AIR e valores ≤ X - 1dp
para os F2 de baixa AIR (Tabela 8).
Tabela 8: Genótipo Ahr de camundongos F2 entre AIRmax e AIRmin.
Genótipo Ahr
População F2 Aa ab bb
F2 total 35 (19,3%) 96 (53%) 50 (27,6%)
F2 alta AIR 10 (41,7%) 12 (50%) 2 (8,3%)
F2 baixa AIR 2 (7,7%) 14 (54%) 10 (38,5%)
Entre F2 alta AIR e F2 baixa AIR: χ
2
= 10,758; p = 0,0046.
bb = homozigoto para alta afinidade; aa = homozigoto para baixa afinidade e ab =
heterozigoto.
Numa outra análise, considerando a população F2 total, observamos que a resposta
inflamatória dos camundongos com genótipo Ahr 752A foi significantemente maior (>2
0
10
20
30
40
50
60
70
4567
ln do numero de células x 10
-5
/ml
Freqüência %
aa
bb
vezes) do que a resposta dos camundongos com genótipo Ahr 752G (Tabela 9). Deve-se
ressaltar que a divergência fenotípica total entre as linhagens AIRmax e AIRmin é de ao
redor de 20 vezes no número de células infiltradas e resulta do efeito aditivo de cerca de 11
QTL.
Tabela 9. Resposta inflamatória aguda (AIR) ao Biogel de camundongos F2 (AIRmax x
AIRmin) de acordo com o genótipo Ahr.
Genótipo Ahr/AIR
População F2 aa ab bb
♂
5,93±0,49 (376) * 5,32±0,90 (204) 4,96±0,89 (143) *
♀
4,67±1,38 (107) 3,96±1,74 (53) 3,91±1,58 (50)
♂ + ♀
5,03±1,32 (153) ** 4,64±1,32 (104) 4,41±1,39 (82) **
AIR: log
n
(número de células infiltradas x 10
5
/ml) ± d.p.
Diferença entre os grupos Ahr aa e Ahr bb *p<0,001 e **0,05>p>0.02.
bb = homozigoto para alta afinidade; aa = homozigoto para baixa afinidade e ab =
heterozigoto.
A completa segregação dos alelos de baixa e de alta afinidade do receptor no locus
Ahr em camundongos AIRmax e AIRmin, respectivamente, é coerente ao fenótipo de
resistência e susceptibilidade à carcinogênese cutânea e de pulmão induzida por PAHs
apresentada pelas linhagens, e indica que o locus Ahr é um provável fator genético que
contribui para esta diferenciação. Além disso, a demonstração do linkage ou co-herança dos
genótipos parentais de Ahr e do nível de inflamação induzido pelo Biogel na população de
segregantes F2 indica que o locus Ahr, ou algum gene próximo pode representar um dos
QTL selecionados (loci reguladores de características quantitativas) que participam da
regulação da reatividade inflamatória aguda.
4.4.2 Análise de Polimorfismo do gene CYP1A1 e do Microssatélite D9Mit 248
Os polimorfismos dos genes de detoxificação que estão relacionados com enzimas
de metabolização/ativação de substâncias genotóxicas, parecem estar envolvidos com o
desenvolvimento do câncer.
Tem sido descrito em camundongos bem como em humanos a existência de
polimorfismo no gene do CYP1A1 que pode estar relacionado à susceptibilidade a cânceres
de pulmão provocados por carcinógenos químicos. Além disso, a região cromossômica que
contém alguns dos genes da família de enzimas do citocromo P450, no cromossomo 9 foi
envolvida, por ensaios de linkage de marcadores polimórficos do tipo microssatélites, na
regulação da sensibilidade a efeitos tóxicos de algumas drogas.
Os microssatélites, ou SSR (Simple Sequence Repeats), ou SSLPs (Simple
Sequence Lenght Polymorphisms) são seqüências simples de 1- 4 bases repetidas, de
localização cromossômica conhecida, amplamente dispersas no genoma, numerosos e
altamente polimórficos, ou seja, com número variável de repetições de pares de base entre
indivíduos (DIETRICH et al., 1994), permitindo a criação de mapas genéticos bastante
detalhados. As seqüências de DNA que flanqueiam as regiões contendo estas repetições
curtas são conservadas dentro de cada espécie, permitindo a seleção de primers que podem
ser utilizados para amplificá-las por PCR. O polimorfismo no tamanho dos fragmentos
obtidos se deve ao número diferente de repetições destas seqüências simples que é
encontrado entre diversas linhagens, entre populações distintas ou mesmo entre indivíduos
de uma população heterogênea. Esse polimorfismo define, portanto os alelos do
microssatélite.
Analisamos assim um microssatélite situado em uma região intrônica do gene
CYP1A1 e o microssatélite D9Mit248 a 31,0 centiMorgan (cM) no cromossomo 9, região
em que se encontra um painel de genes da superfamília do citocromo P-450 (CYPs), dentre
os quais o CYP1A1 e CYP1A2 (DIETRICH et al., 1994). Como ocorreu no lócus Ahr, uma
diferença altamente significante no padrão de distribuição alélica de marcadores desta
região cromossômica poderia indicar a sua participação na regulação do caráter
selecionado, ou seja , da resposta inflamatória (CASLEY et al., 1999; FERNANDEZ-
SALGUERO, 1995).
Para caracterização dos alelos de microssatélites, sempre partimos da análise do
padrão de migração dos produtos de PCR em DNA genômico das 8 linhagens isogênicas
que constituíram a F0 da seleção das linhagens AIRmax e AIRmin O tamanho dos
fragmentos é definido por dados da literatura (Database, Research Genetics) ou por
comparação com o padrão de peso molecular no aparelho Image Master (Amersham
Pharmacia Biotech) (Tabela 10).
Para o microssatélite no gene CYP1A1 na tabela 11 encontramos 3 alelos, sendo o
mais pesado denominado 1 presente na linhagem CBA/J, as linhagens A/J, P/J, SJL/J, e
SWR/J apresentam o alelo 2 e BALB/cJ, DBA/J e C57BL/6 tem o alelo mais leve
denominado 3.
Para o D9Mit248 também encontramos 3 alelos, o mais pesado denominado 1
presente nas linhagens A/J, BALB/c, C57BL/6, P/J e SJL, a linhagem CBA apresentou o
alelo 2 e as linhagens DBA/2 e SWR tem o alelo 3, o mais leve (Tabela 11).
Tabela 10: Definição de alelos de microssatélites em linhagens isogênicas constituintes da F0
Marcador cM* BALB/cJ SJL/J SWR/J A/J C57BL6/J CBA/J DBA/J P/J
CYP1A1 31.0 3 2 2 2 3 1 3 2
D9 Mit 248 31,0 1 1 3 1 1 2 3 1
Produtos das amplificações dos microssatélites nas 8 linhagens isogênicas de camundongos que
compuseram a F0 da Seleção de Inflamação.
As amostras foram amplificadas por PCR e visualizadas em gel de agarose 4% e Gel de poliacrilamida
12,5%.
* centiMorgan (cM): distância do centrômero (Mouse Genome Database, 1998).
Nas figuras 19 e 20 mostramos o padrão de migração dos microssatélites da região
do cromossomo 9 a 31 cM comparativamente nas linhagens AIRmax, AIRmin e nas o
linhagens isogênicas parentais.
Figura 19: Análise do microssatélite D9Mit248 onde mostramos o padrão de migração do produto
de amplificação por PCR das preparações de DNA das linhagens isogênicas e de 5
AIRmax e 5 AIRmin (Seta).
Gel de poliacrilamida 12,5 %.
Peso molecular: Ladder
φX174 RF DNA/Hae III Fragments (72pb a 1353pb).
Figura 20: Análise do microssatélite CYP1A1 onde mostramos o padrão de migração do produto
de amplificação por PCR das preparações de DNA das linhagens isogênicas e de 7
AIRmax e 8 AIRmin (seta).
Gel de poliacrilamida 12,5 %.
Peso molecular: Ladder
φX174 RF DNA/Hae III Fragments (72pb a 1353pb).
Observamos na tabelas 11 que os dois microssatélites analisados apresentaram
desvios de freqüência alélica altamente significantes entre os animais das linhagens
AIRmax e AIRmin (p< 0,0001).
Tabela 11: Análise de microssatélitee no cromossomo 9 em camundongos AIRmax e AIRmin.
Linhagem cM* Marcadores N Genótipos/n
o
de animais Alelos/ n
o
de
cromossomos
p**
11 12 13 22 23 33 1 2 3
AIRmax
10 0 0 0 10 0 0 0
20
0
31.0 D9 Mit 248 p<0,0001
AIRmin
10 10 0 0 0 0 0
20
0 0
AIRmax
15 6 0 2 3 2 2
14
8 8
31.0 CYP1A1 p< 0,0001
AIRmin
17 0 0 0 0 5 12 0 5
29
*centiMorgans (cM): distância do centrômero (Mouse Genome Database, 1998).
p**: calculado pelo teste de Qui-quadrado (χ
2
).
n: número de animais.
5 DISCUSSÃO
O sistema imune adaptativo é capaz de reconhecer e atacar células cancerosas, mas
estas têm a capacidade de evadir de diversas maneiras desta vigilância imunológica. A
resposta inflamatória é, assim, um outro importante componente de controle de neoplasias.
Embora células da imunidade inata reajam contra células cancerosas e provavelmente
tenham a capacidade de retardar a progressão tumoral, a inflamação crônica é também
associada com a promoção de diversos tipos de tumores em vários tecidos como a pele,
próstata, ovário, mucosa gástrica, intestino, fígado e bexiga urinária. Em modelos animais,
mastócitos, neutrófilos e macrófagos são agentes que contribuem para a progressão
tumoral, entretanto, outros estudos demonstram o efeito protetor destas mesmas células.
(COUSSENS e WERB 2001).
O modelo de camundongos AIRmax e AIRmin vem demonstrando a participação do
controle genético da resposta inflamatória aguda como fatores de predisposição ou
resistência à carcinogênese. Em conjunto, todos os resultados nos últimos anos
evidenciaram o papel dos fenômenos exercidos pelo polimorfismo dos genes envolvidos na
resposta inflamatória aguda e suas interações, nas características fenotípicas que distinguem
AIRmax e AIRmin quanto à resistência a processos neoplásicos, bem como a infecções,
autoimunidade e inflamação alérgica (BIOZZI et al., 1998; ARAÚJO et al. 1998, MARIA
et al., 2001; MARIA et al., 2003; RIBEIRO et al., 2005; RIBEIRO FILHO, 2003).
Com base nos resultados anteriores, nós empregamos neste trabalho diferentes
protocolos de carcinogênese química no modelo de linhagens selecionadas segundo a
resposta inflamatória aguda (AIR). Para tal, utilizamos carcinógenos do tipo
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs), que são poluentes ambientais decorrentes
da combustão incompleta de compostos aromáticos que exibem um efeito cancerígeno em
vários animais e são suspeitos de causar câncer também em seres humanos
(VASCONCELLOS et al., 1998; BURCHIEL et al., 2005). Estes PAHs são substâncias
inertes que necessitam de ativação metabólica via sistema enzimático citocromo P450 para
produzir muitas (CONNEY, 1982; DiGIOVANNI, 1992) mas não todas (RUBY;
HALLIDAY e MULLER, 1989; THURMOND et al., 1987) das suas atividades biológicas.
Recentes estudos sugerem que a inalação de PAHs inicia uma resposta inflamatória
no trato respiratório, resultando em rinite e asma (HEO; SAXON e HANKINSON, 2001;
MASTRANGELO et al., 2003; SAXON e DIAZ-SANCHEZ, 2000; TAKENAKA et al.,
1995). A exposição ocupacional aos PAHs ou quando há aplicação tópica de produtos
químicos ou de drogas que contém PAHs são capazes de desencadear doenças inflamatórias
na pele, como hipersensibilidade de contato ou dermatites (WU et al., 2003; YAMAMOTO
e TOKURA, 2003).
Utilizamos dois protótipos de PAHs, o 3-MC e DMBA, os quais foram aplicados
por diferentes vias, objetivando a caracterização dos fenótipos de susceptibilidade e/ou
resistência dos animais AIRmax e AIRmin ao desenvolvimento de tumores. O estudo
baseou-se nas diferenças marcantes encontradas nas linhagens selecionadas quando
submetidos aos protocolos propostos.
Os dois são carcinógenos químicos completos, que executam a função de iniciador e
promotor. A iniciação da carcinogênese envolve uma indução inicial de mudanças
genéticas em células alvo, enquanto que durante a promoção tumoral, as células afetadas
são resgatadas da apoptose e estimuladas à proliferação com acúmulo de mais mutações, as
quais levam ao desenvolvimento de células malignas que formarão o tumor.
O primeiro protocolo proposto foi o de indução de fibrosarcomas em
camundongos AIRmax e AIRmin com 3-MC. O 3-MC é um carcinógeno químico tipo
PAH que tem sido amplamente usado de forma experimental em modelos animais,
principalmente em roedores para o estudo comparativo nestes animais e em seres
humanos. A transformação maligna pelo 3-MC resulta no acúmulo de mutações, por
exemplo, em protoncogenes como o ras ou genes supressores de tumor como o p53
(HALEVY et al., 1991; WATANABE et al., 1999). O 3-MC produz, ainda, mutações
aleatórias e muitas delas podem interferir na integridade celular e desta forma, o 3-MC
leva ao dano tecidual e à transformação maligna em paralelo. A resposta inflamatória
para reparar o tecido lesado é caracterizada pelo influxo precoce de neutrófilos seguida
pelo acúmulo de macrófagos. Nas fases mais tardias, os fibroblastos são o tipo celular
predominante que produzem e depositam a matriz extracelular, levando à fibrose e
cicatrização.
De acordo com a literatura, durante esta resposta de reparo tissular aos danos
induzidos pelo 3-MC, o carcinógeno é encapsulado e persiste por longo tempo em
animais resistentes ao desenvolvimento de tumores. Deste modo, a reação inflamatória
ao corpo estranho seria um mecanismo protetor para o controle da carcinogênese
química (QIN et al., 2002) e por este motivo, achamos interessante testar este protocolo
nas linhagens AIRmax e AIRmin.
No protocolo utilizado, a injeção intramuscular de 3-MC provocou o
aparecimento de tumores locais, sarcomas, nas duas linhagens sendo, entretanto mais
precocemente nos AIRmin (Figuras 3 e 4). Porém, durante o período de observação de
45 semanas, cerca de 90% dos camundongos das duas linhagens desenvolveram tumores
no local de aplicação (Figura 4). Em tempos tardios, entretanto, observamos maior
incidência de tumores de pulmão nos AIRmin (Figura 5 e Tabela 3).
Estes resultados poderiam refletir a capacidade da linhagem AIRmax de manter
restrito o 3-MC no sítio de inoculação. O microambiente inflamatório gerado pelos
animais AIRmax na presença de um agente estranho pode ter contribuído para a maior
resistência ao desenvolvimento da malignidade pulmonar, mantendo o fenótipo
anteriormente observado frente a outros protocolos já estudados (BIOZZI et al., 1998;
RIBEIRO et al., 2001). Os mecanismos envolvidos nesta imunomodulação necessitam
ainda de outras abordagens para a melhor compreensão.
O segundo protocolo de carcinogênese química foi o proposto por Li e
colaboradores, 2002, onde utilizamos cinco aplicações epicutâneas consecutivas do DMBA.
Neste tratamento, o desenvolvimento de carcinomas espinocelulares ocorre em maior
número e em um tempo mais curto, do que com o protocolo clássico de iniciação com
DMBA seguido de várias administrações de TPA na pele como agente promotor, que por
sua vez induz o aparecimento de maior número de lesões benignas.
Quando as linhagens foram submetidas a este protocolo, apenas os animais AIRmin
apresentaram uma reação precoce específica semelhante à dermatite de contato (Figura 6)
que é sabidamente correlacionada ao desenvolvimento de tumores em linhagens de
camundongos susceptíveis (CASALE et al., 2000).
O epitélio da pele é principalmente composto por queratinócitos espalhados entre
células dendríticas, melanócitos, poucos linfócitos T e monócitos e está altamente
comprometido em defender o organismo. Insultos físicos, químicos ou imune-específicos
rapidamente levam a uma resposta epidermal caracterizada por aumento da expressão de
um sistema de mediadores pró-inflamatórios, incluindo fatores quimiotáticos, os quais
iniciam a migração ordenada de distintas subpopulações leucocitárias (PASTORE et al.,
2005). Monócitos ativados, células dendríticas e linfócitos T liberam citocinas em resposta
a microrganismos e outros antígenos e desta forma medeiam e regulam reações imunes e
inflamatórias. Estas atuam sobre as células no local do ambiente que sofreu a injúria dando
início a uma resposta inflamatória, mas também podem, quando produzidas em grandes
quantidades, entrar na circulação e atuar à distância do local de produção (ação endócrina)
(PASPARAKIS et al., 2002; PASTORE et al., 2005).
A indução da imunidade epidermal depende da ativação local de células dendríticas,
para que estas migrem da pele para os nódulos linfáticos locais e assim serem maturadas
como potentes células imunoestimulatórias. As células dendríticas são as mais potentes
células apresentadoras de antígeno derivadas da medula óssea e estão presentes em diversos
tecidos. Na camada da epiderme da pele elas são denominadas de células de Langerhans
(LC) (HALLIDAY e LE, 2001). Esta importante característica deste tipo celular já levou
aos estudos abordando seu possível efeito imunoterapêutico como vacinas contra o câncer
(BARBUTO et al., 2004; NEVES et al., 2005).
Escolhemos o momento de 48 horas após a última exposição ao DMBA para o
estudo da reação observada, porque era a ocasião onde todos os animais AIRmin iniciavam
as manifestações clínicas típicas de resposta de dermatite de contacto, com inquietação e
vermelhidão no local de aplicação do carcinógeno. Em tempos mais tardios, todos os
AIRmin apresentavam já lesões decorrentes da intensa coceira com e escarificação da pele.
Esta reação cutânea foi caracterizada histologicamente e pela análise da expressão
local de genes de citocinas, de receptores CD4 e CD8 de linfócitos T e de enzimas do
citocromo P450. O tratamento induziu aumento significante da expressão de IL-1β, IL-6,
TNFα e TGFβ, bem como de CD4 e CD8 e da enzima CYP1B1 apenas na pele dos
AIRmin, enquanto nos AIRmax os níveis de expressão destes genes não foram alterados
significativamente (Figuras 13, 14 e 15 e Tabela 6).
A hipersensibilidade de contacto (CHS, Contact hypersensitivity) é uma resposta
imune dependente de célula T. No modelo clássico em camundongos para a dermatite de
contacto alérgica em humanos, ela envolve duas fases denominadas de fase de
sensibilização e de desafio (GRABBE e SCHWARZ, 1998). Na fase de sensibilização, o
alérgeno (hapteno) é associado a proteínas da pele e capturado pelas células de Langerhans
da pele (LCs), células dendríticas dermais e macrófagos teciduais. Subseqüentemente, estas
células, sob a ação de citocinas como TNF-α e IL-β, migram para os nódulos linfáticos
adjacentes e maturam em potentes células apresentadoras de antígeno (APCs, antigen
presenting cells) (WANG et al., 2003). Células T naïve são ativadas e diferenciam-se em
células Th1 antígeno específicas e citotóxicas sob a influência de sinais polarizadores, tais
como IL-12 (WANG et al., 2000). Estas células T são então designadas como
“sensibilizadas”. Em paralelo, células B-1 na cavidade peritoneal são estimuladas por
células NKT secretoras de IL-4 a produzir IgM antígeno específica. Além disso, células
NK parecem desempenhar um papel na sensibilização (CAMPOS et al., 2003; O’LEARY
et al., 2006).
Na fase de desafio, iniciada pela re-exposição ao mesmo hapteno, ligação cruzada
de moléculas IgM causa liberação do fator de complemento C5a (TSUJI et al., 2002). Este
atua sobre as plaquetas, mastócitos residentes na pele e macrófagos (TSUJI et al., 2000)
resultando na ativação da microvasculatura (McHALE et al., 1999) permitindo a
penetração da primeira onda de leucócitos (HWANG et al., 2004). Em resposta a
quimiocinas, tais como proteína 10 induzível por IFN-γ (IP-10, ou também nomeada de
CXCL10), células T sensibilizadas entram na derme no sítio de exposição ao hapteno e são
re-estimuladas pelas APCs residentes (DUFOUR et al., 2002). Estas células T então
liberam mediadores pró-inflamatórios, os quais ativam células mielóides residentes a
secretar citocinas como proteína 2 inflamatória de macrófagos (MIP-2, macrophage
inflammatory protein-2, também chamada de CXCL2) e proteína 1 quimo atraente de
monócitos (MCP-1, monocyte chemoattractant protein-1 ou CCL2), conduzindo a uma
forte segunda onda de infiltração leucocitária (WANG et al., 2003).
Em camundongos, as principais citocinas apontadas como responsáveis pela
mobilização e migração de células de Langerhans em resposta à sensibilidade a alérgenos
químicos são a interleucina 1 β (IL-1β), IL-18 e Fator de Necrose Tumoral α (TNF-α)
(CUMBERBATCH e KIMBER, 1995; CUMBERBATCH e DEARMAN, 2001). Todos
são produtos das células epidermais, e em cada caso a expressão é aumentada durante a
sensibilização da pele.
Em modelos animais, a administração de anticorpos que neutralizam a ação de
TNF-α leva a uma redução significativa da magnitude da reação, sugerindo que TNF-α é
importante para iniciar a dermatite de contacto alérgica (PIGUET et al., 1991). Da mesma
forma, o bloqueio da atividade IL-1β durante a sensibilização reduz a magnitude da
resposta inflamatória (ENK et al., 1993).
TNF-α induz a expressão de numerosas citocinas, com atividade de atrair células T
cutâneas e indutoras de resposta em queratinócitos. Algumas destas citocinas estão
envolvidas nas respostas prematuras quando há injúria ou irritação e desordens na pele
mediada por célula T (GILLITZER e GOEBELER, 2001; GIUSTIZIERI et al., 2001) com
controle do recrutamento de monócitos/macrófagos, células dendríticas e células T
(NAKAMURA; WILLIAMS e KUPPER, 1995; CARR et al., 1994; GOEBELER et al.,
2001; GIUSTIZIERI et al., 2001).
Outros autores demonstraram que aplicações tópicas de DMBA, B(a)P e 3-MC
resultam em indução de respostas de hipersensibilidade de contacto, a qual é uma resposta
imune mediada por células T contra os compostos (KLEMME, MUKHTAR e ELMETS,
1987; ANDERSON et al., 1995). A resposta cumpre todos os requerimentos de uma
resposta imune adquirida incluindo a especificidade antigênica e a habilidade para ser uma
resposta imune transferida por meio de suspensão de células oriundas de nódulos linfóides
drenantes (KLEMME, MUKHTAR e ELMETS, 1987). Estas respostas após a exposição a
xenobióticos revelam a contribuição de cada população de células T CD4 e CD8. De
maneira geral, as células T CD8
+
são células efetoras, enquanto que as células T CD4
+
exercem um papel regulatório na resposta (ANDERSON et al., 1995; ELMETS et al.,
2005).
Pelos resultados em nosso modelo pudemos comprovar a ocorrência de reação de
dermatite de contato específica ao DMBA apenas na linhagem AIRmin. Os resultados
sugerem ainda que a baixa reatividade ao DMBA apresentada pelos AIRmax pode ser
decorrente da inabilidade destes animais em metabolizar o DMBA (que será discutido
adiante) e não da deficiência de produzir reações específicas, já que eles responderam
normalmente à imunização com DNFB (Tabela 5 e Figura 10). Esta reação inicial ao
DMBA era resolvida ao redor do 20º dia após o tratamento e em seguida apareceram
múltiplas lesões cutâneas que evoluíram para carcinomas apenas nos animais AIRmin.
Além disso, em tempos tardios foi maior a susceptibilidade dos animais AIRmin em
desenvolver tumores de pulmão.
Com capacidade de provocar mutações e carcinogênese, o DMBA vem sendo
extensamente investigado com o intuito de elucidar os mecanismos pelos quais os PAHs
causam cânceres em tecidos epiteliais (DiGIOVANNI, 1992). Uma observação feita nestes
estudos é que o DMBA produz uma específica transversão A-T no segundo nucleotídeo do
códon 61 do oncogene H-ras (BIZUB, WOOD e SKALKA, 1986; PELLING et al., 1987;
QUINTANILLA et al., 1986). Esta mutação é um importante evento inicial na
carcinogênese epitelial na pele e em outros órgãos (DiGIOVANNI, 1992; PELLING;
SHENG e BETZ, 1995).
Dados da literatura indicam que a exposição ao DMBA é capaz de suprimir as
imunidades humoral e celular e esta imunosupressão persistente promove mecanismos
epigenéticos para crescimento tumoral ou metástases (WARD et al., 1984; WARD et al.,
1986). Suganuma e seus colaboradores (2002) acharam distintos papéis desempenhados por
alguns mediadores pró-inflamatórios (citocinas), em particular, TNF-α, IL-1 (alfa e beta) e
IL-6 produzidos pelo sistema imune na promoção tumoral e transformação celular. Moore
et al. (1999) reportaram que citocinas pró-inflamatórias eram importantes nos primeiros
estágios de promoção tumoral uma vez que camundongos deficientes em TNF-α se
mostraram mais resistentes que os selvagens a protocolos de carcinogênese química de
pele. Por outro lado, a expressão constitutiva de IL-1α na epiderme de camundongos FVB
conferiu a eles resistência a carcinogênese de pele (MURPHY et al., 2003).
A Interleucina 1 compreende uma família de genes intimamente relacionados e duas
proteínas agonísticas principais, a IL-1α e IL-1β, são pleiotrópicas e afetam
primordialmente a inflamação, imunidade e hematopoiese. IL-1α e IL-1β recombinantes se
ligam aos mesmos receptores e induzem mesmas funções biológicas. A IL1 é abundante em
sítios tumorais, onde ela pode afetar o processo de carcinogênese, crescimento e capacidade
de invasão tumoral e também as formas de interação tumor-hospedeiro. Foi, entretanto
descrito que a IL-1β expressa em células malignas, ativa a inflamação promovendo a
invasão e também a supressão imune mediada pelo tumor (APTE et al., 2006). Enquanto é
descrita a ação protetora da IL-1α no processo de carcinogênese química induzida com
PAHs, o papel executado pela IL-1β seria de potencializar a atividade carcinogênica pela
indução de uma resposta inflamatória local com atividade promotora, que possivelmente
contribuiria para o aumento da incidência do desenvolvimento de tumores e aparecimento
de metástases (APTE et al., 2006).
A superfamília do fator de crescimento tumoral beta (TGF-β) desempenha um papel
complexo no processo de carcinogênese cutânea. Numerosos estudos vêm demonstrando a
importância da sinalização exercida pelo TGF-β na progressão de metástases cancerosas.
Em momentos iniciais da formação tumoral, o TGF-β atua como um supressor de tumor
emergente (WIESER, 2001) de fato, a perda da atividade de TGF-β neste momento
promove a formação tumoral. Paradoxalmente, em um momento posterior do processo de
carcinogênese de pele, células tumorais podem produzir e secretar altas quantidades de
TGF-β e este pode atuar de maneira autócrina e parácrina para promover o crescimento
tumoral e a conversão maligna (WIESER, 2001). Assim, diversos trabalhos investigaram os
efeitos do TGF-β no processo de carcinogênese epitelial, mas os resultados são por diversas
vezes contraditórios. Embora alguns estudos enfatizem seus efeitos supressores tumorais,
outros indicam o papel de promoção tumoral do TGF-β. Estudos utilizando camundongos
geneticamente alterados que expressam TGF-β na epiderme, atestam o papel dicotômico do
TGF-β na carcinogênese de pele. Comparados com os animais controle, os alterados
geneticamente são mais resistentes ao aparecimento de papilomas induzidos por
carcinógenos de pele. Entretanto, os papilomas que estes desenvolveram apresentaram uma
evolução para a progressão maligna em direção a carcinoma de células espinhosas (SCCs).
Desta forma, o TGF-β parece ter efeitos de duas fases no processo de carcinogênese
química de pele dependendo do estágio do desenvolvimento tumoral (CUI et al., 1996).
Os queratinócitos são as principais origens de algumas citocinas produzidas na pele
sendo capazes de secretar IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, TGF-β, e o fator de crescimento
derivado de plaquetas (PDGF) (SCHWARZ e LUGER, 1989; ANSEL et al., 1990). A
produção de citocinas pode ser aumentada em resposta a um estímulo ambiental. Por
exemplo, a radiação UVB estimula a produção de IL-6 (KIRNBAUER et al., 1991) e IL-8
(KONDO et al., 1993) por queratinócitos. E também as citocinas pró-inflamatórias, tais
como, IL-1α, IL-1β, e TNFα, aumentam a síntese e liberação de IL-6 nos queratinócitos
(KIRNBAUER et al., 1989; ANSEL, LUGER e GREEN, 1983; PARTRIDGE et al., 1991).
A Interleucina 6 é uma citocina pleiotrópica com numerosas atividades biológicas.
Ela é produzida por constituintes normais da pele, incluindo células epidermais,
fibroblastos e células endoteliais dermais. Ela também é sintetizada por células
inflamatórias que infiltram na pele em variadas condições patológicas. A IL-6 participa da
regulação do crescimento celular, diferenciação e sobrevivência celular (Van SNICK, 1990;
AKIRA; TAGA e KISHIMOTO, 1992; SUI et al., 1999; TOSATO e PIKE, 1988;
IGLESIAS et al., 1995; KAWANO et al., 1989).
A ativação do gene da IL-6 pode ser um passo essencial na carcinogênese de
múltiplos estádios das células epiteliais da pele. A radiação ionizante já foi descrita como
indutora da expressão de IL-6 via a ativação NF-κβ (BEETZ et al., 2000). Nishimura e
colaboradores, 1999 e 2000, no entanto, reportaram que a irradiação com raios ultravioleta
B provocam uma lesão na pele mais extensa em animais knockout de IL-6 do que em
animais tipo selvagens. Murata et al., 2002, também demonstrou o papel protetor exercido
pela IL-6 em animais knockout de IL-6 que apresentava um processo inflamatório causado
por baixas ou altas doses de DMBA. Estes resultados sugerem também que camundongos
knockout de IL-6 têm prejuízo de funções imunes normais e de sua capacidade de defesa do
que os animais tipo selvagem (KOPF et al., 1994).
Desta forma, o estímulo dos genes destas citocinas citadas, evidenciado na pele dos
animais AIRmin tratados com o DMBA, está coerente com o desenvolvimento de resposta
específica de dermatite de contato ao composto e com o posterior aparecimento de lesões
malignas nesta linhagem. Além disso, foi detectada maior expressão do gene da enzima
CYP1B1 na pele dos animais AIRmin, provavelmente relacionada à sua maior capacidade
de promover a biotransformação do DMBA. Nos tempos tardios após este tratamento, bem
como quando utilizamos o 3-MC, os AIRmin mostraram-se significativamente mais
susceptíveis do que os AIRmax em desenvolver tumores de pulmão.
A transformação de 3-MC e de DMBA em subprodutos cancerígenos quando
administrado em animais experimentais depende da sua ligação inicial ao receptor de
hidrocarbonetos aromáticos AHR com a participação de outros fatores. Estudos com
camundongos knockout
do gene Ahr foram realizados para demonstrar que o AHR é
necessário para a maioria, se não para a totalidade, de respostas aos efeitos produzidos por
estas substancias tóxicas. Além disso, as reações podem ser moduladas por variantes
alélicas do gene Ahr que codifica a proteína gerando receptores de baixa afinidade.
Muitos experimentos realizados em diferentes linhagens de camundongos
demonstraram variações na capacidade destas linhagens em desenvolver reações de
hipersensibilidade de contacto ao DMBA. Camundongos com o alelo Ahr
d
(linhagens que
são deficientes em metabolizar PAHs) falham em desenvolver a reação de
hipersensibilidade de contacto ao DMBA e as linhagens que possuem o alelo Ahr
b1
produzem esta resposta (ANDERSON et al., 1995).
Em conformidade aos fenótipos de resistência e susceptibilidade ao
desenvolvimento de reação alérgica e de posterior desenvolvimento tumoral, foi constatada
a presença desta mutação em todos os animais AIRmax analisados, enquanto todos os
AIRmin apresentam o alelo do gene que confere alta afinidade do receptor.
Há evidências na literatura de que, conjuntamente com o locus do receptor do AHR,
proteínas codificadas por genes do complexo principal de histocompatibilidade (CPH)
interagem na indução de resposta imune ao DMBA. Assim, a combinação do polimorfismo
no Ahr e de loci do CPH determinariam a magnitude da resposta cutânea imune celular aos
PAHs (ELMETS et al., 1998). Foi demonstrado que os animais com haplótipos H-2
k
e H-2
a
desenvolvem hipersensibilidade de contacto ao DMBA, enquanto que os camundongos
com H-2
b
, H-2
d
e H-2
s
não desenvolvem a reação.
Em estudos anteriores do laboratório foi evidenciado que os AIRmax são
predominantemente H-2
b
enquanto os AIRmin são H-2
d
ou H-2
k
(VIGAR et al., 2000). Este
fator genético poderia assim contribuir para a resposta diferencial ao DMBA dependente do
AHR observada nestas linhagens.
O papel do AHR na indução da expressão de enzimas do citocromo P450 depois da
exposição a xenobióticos, tem sido estudado (HANKINSON, 1995). A oxidação dos
compostos especialmente por CYP1A1 e CYP1B1 produz tanto os metabólicos inativos,
como leva a ativação metabólica para carcinógenos finais que são capazes de se ligarem ao
DNA causando mutações e iniciando o câncer. Em alguns experimentos que utilizam
DMBA na carcinogênese em camundongos knockout de CYP1A1 e CYP1B1 foi observada
uma diferença quanto à capacidade de resposta em determinados órgãos. Setenta por cento
dos camundongos selvagens (129/Sv), que receberam altos níveis de DMBA oralmente por
meio de gavagem desenvolveram linfomas enquanto apenas 7,5 % dos animais knockout de
CYP1B1 desenvolveram a doença. Os animais knockout também não apresentaram
carcinoma na pele em contraste com o tipo selvagem. Entretanto, 10% dos camundongos
knockout de CYP1B1 desenvolveram adenomas de pulmão em comparação com os animais
tipo selvagem (nenhum desenvolveu) (BUTERS et al., 1999). O risco para desenvolver
papilomas era também aumentado em animais knockout de glutationa S-transferase P1 e P2
tratados com DMBA e TPA (HENDERSON et al., 1998). Alguns estudos indicam que a
oxidação do DMBA para diol epóxido é realizada preferencialmente por CYP1B1 em
comparação com o CYP1A1 (SHIMADA et al., 1996).
É extremamente atraente especular que o polimorfismo dos genes CYP poderia
influenciar a capacidade individual em converter diferentes compostos pré-carcinogênicos
em seus carcinógenos finais e assim ser um fator importante na susceptibilidade individual
para o desenvolvimento do câncer quimicamente induzido. De fato, em populações
humanas tem sido demonstrada associação entre a susceptibilidade ao desenvolvimento de
tumores, principalmente de pulmão, e o polimorfismo genético de várias enzimas
envolvidas na detoxificação e metabolismo de xenobióticos (GRESNER,
GROMADZINSKA e WASCOWICZ, 2007). Estas associações, entretanto, não são ainda
definitivas porque o background genético das populações humanas estudadas é muito
heterogêneo e fatores ambientais diferentes são de grande relevância para as doenças em
questão, tornando muito mais difícil a afirmação de uma correspondência. Isto faz com que
se torne muito mais intricado o estudo da influência de genes polimórficos específicos que
estão relacionados com o câncer e outras doenças (INGELMAN-SUNDBERG, 2001).
Por outro lado, estes fatores são bem controlados em estudos com camundongos. O
polimorfismo no Ahr bem como nos genes que codificam as enzimas responsáveis pela
cadeia de eventos que se sucedem após sua ação, podem ser fatores que interferem na
predisposição individual diferenciada ao desenvolvimento do câncer induzida por estas
substâncias tóxicas do tipo PAHs.
Conforme referido anteriormente, ocorreu a fixação do alelo Ahr
b1
que confere
resistência nos AIRmax e do alelo Ahr
d
relacionado ao receptor AHR de alta afinidade nos
AIRmin. Este genótipo certamente contribui para a diferente susceptibilidade apresentada
pelas linhagens ao desenvolvimento tumoral e, além disso, sugere a participação deste lócus
ou de algum gene próximo, no controle da resposta inflamatória. Esta hipóstese foi
confirmada pelo ensaio positivo de co-segregação ou linkage destes alelos com a
reatividade inflamatória em população intercruzada F2 (AIRmax x AIRmin).
Neste mesmo sentido, foi também detectado desequilíbrio altamente significante
entre as duas linhagens, de alelos do gene do CYP1A1 e de microssatélite próximo no
cromossomo 9 onde se encontra um grupo de genes de enzimas do citocromo P450,
sugerindo a participação desta região na diferenciação fenotípica das duas linhagens.
Este polimorfismo pode, portanto estar relacionado à diferença de sensibilidade das
linhagens aos carcinógenos e também à sua reatividade inflamatória. Apesar de termos
observado desvios de freqüência alélica altamente significantes para estes dois marcadores,
não realizamos o teste funcional, ou seja, de co-segregação em população F2 (AIRmax x
AIRmin) porque não ocorreu fixação total dos alelos do microssatélite CYP1A1 (dentro do
gene CYP1A1) em cada linhagem e as diferenças no padrão de migração do D9Mit248 são
muito pequenas para visualização nos F2.
Como conseqüência do processo seletivo bidirecional, os alelos dos genes
relacionados aos fenótipos de alta e baixa resposta inflamatória aguda segregam
especificamente nas linhagens AIRmax e AIRmin. A análise da herdabilidade do caráter
durante o processo revelou o envolvimento de 7 a 11 loci distintos com efeito aditivo na
determinação da divergência fenotípica entre as duas linhagens (IBAÑEZ et al., 1992).
Os vários QTL selecionados em AIRmax e AIRmin formam um grupo
funcionalmente heterogêneo de genes que devem afetar um amplo espectro de processos
celulares e moleculares para a regulação da intensidade da AIR. São também
funcionalmente heterogêneos os grupos de genes que regulam a susceptibilidade ao câncer.
A carcinogênese é um fenômeno complexo que envolve múltiplos fatores que interferem
em etapas definidas do processo. Estudos indicam que dependendo do tecido alvo, existe
uma expressão diferenciada do tipo de enzima quando aplicado o mesmo carcinógeno.
Achados recentes indicam que existem ainda mecanismos pós-transcricionais envolvidos na
regulação de enzimas metabolizantes do carcinógeno. Desta forma, a combinação de
fatores transcricionais, pós-transcricionais e específicos do metabolismo do tecido pode ser
requerida para regular a expressão diferencial de enzimas em distintos tipos celulares
(McFADYEN et al., 2003).
Assim, uma rede complexa de sinais autônomos da célula transformada e de sinais
não autônomos da célula, mas provenientes do microambiente que a alberga, regula o
desenvolvimento de tumores (DEMANT, 2003).
Estas linhagens geneticamente selecionadas que diferem enormemente quanto ao
grau de resposta inflamatória aguda e à susceptibilidade à carcinogênese química,
representam, assim, uma nova ferramenta para o estudo de fatores genéticos que
influenciam o microambiente inflamatório na predisposição ao câncer.
6 CONCLUSÕES
Os nossos resultados demonstraram que os camundongos AIRmax são resistentes e
os AIRmin são sensíveis a indução de tumores de pele pela aplicação repetida de DMBA.
Após este tratamento, os AIRmin foram também significativamente mais susceptíveis ao
desenvolvimento de cânceres de pulmão, bem como quando receberam o 3-MC.
Os animais AIRmin desenvolveram uma reação de dermatite de contacto ao
carcinógeno DMBA, a qual está relacionada à susceptibilidade ao desenvolvimento
tumoral. Nesta reação inicial foi constatado que ocorreram aumentos da expressão na pele
de genes das citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF-α e TGF-β) e de enzima do
citocromo P450 (Cyp1b1).
O perfil das citocinas induzidas nos AIRmin é coerente com o que determina o
aparecimento da reação de hipersensibilidade de contacto pelo DMBA. O aumento da
enzima CYP1B1 está relacionado com a bioativação cutânea do DMBA que depende da
afinidade de ligação do agonista ao receptor AHR.
A completa segregação dos alelos de alta afinidade (b1) e baixa afinidade (d) no
locus Ahr encontrada em AIRmin e AIRmax, respectivamente, é coerente com o fenótipo
de susceptibilidade e resistência à carcinogênese de pele e pulmão apresentados nas
linhagens, indicando o locus Ahr como um fator genético que pode estar contribuindo com
esta diferenciação.
O linkage genético significante do genótipo do Ahr com grau de inflamação
induzida pelo Biogel foi demonstrado em uma população de segregantes F2, confirmando
que o próprio Ahr ou outro gene ligado representa um QTL controlador da reatividade
inflamatória aguda.
Fatores genéticos ligados ao Ahr e reações imunes específicas contribuem para a
diferente susceptibilidade das linhagens selecionadas à carcinogênese por compostos
policíclicos aromáticos.
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