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ATIVIDADE FUNCIONAL DA Na
+
K
+
-ATPase SENSÍVEL À OUABAÍNA EM
AORTA DE RATAS COM E SEM SINAIS DE INSUFICIÊNCIA CARDÍACA
APÓS INFARTO DO MIOCÁRDIO
Fernanda Moura Vargas Dias
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
(FISIOLOGIA CARDIOVASCULAR)
Programa de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, junho de 2007
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ATIVIDADE FUNCIONAL DA Na
+
K
+
-ATPase SENSÍVEL À OUABAÍNA EM
AORTA DE RATAS COM E SEM SINAIS DE INSUFICIÊNCIA CARDÍACA
APÓS INFARTO DO MIOCÁRDIO
FERNANDA MOURA VARGAS DIAS
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito
parcial para obtenção do grau de mestre em Ciências Fisiológicas
APROVADA EM ___/____/____ POR:
_____________________________________________
Prof
a.
Dr
a.
Ivanita Stefanon – Orientadora, UFES
_____________________________________________
Prof
a.
Dr
a.
Luciana Venturini Rossoni – Co-orientadora, USP
_____________________________________________
Prof. Dr. Dalton Valentim Vassallo, UFES
COORDENADOR DO CURSO PPGCF:
____________________________________________
Prof. Dr. José Geraldo Mill
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, Junho de 2007
ads:
FERNANDA MOURA VARGAS DIAS
ATIVIDADE FUNCIONAL DA Na
+
K
+
-ATPase SENSÍVEL À OUABAÍNA EM
AORTA DE RATAS COM E SEM SINAIS DE INSUFICIÊNCIA CARDÍACA
APÓS INFARTO DO MIOCÁRDIO
ORIENTADORA
Prof
a.
Dr
a.
Ivanita Stefanon
CO-ORIENTADORA
Prof
a.
Dr
a.
Luciana Venturini Rossoni
Programa de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, junho de 2007
Dissertação submetida ao programa de Pós-
graduação em Ciências F
isiológicas da
Universidade Federal do Espírito Santo como
requisito parcial para obtenção do grau de
mestre em Ciências Fisiológicas.
Dedico este trabalho a uma família que sonhou unida.
Que construiu toda a minha base como ser humano.
Dedico este aos que eu mais amo, aos que me amam
incondicionalmente, aos que me apóiam sempre, àqueles
a quem eu devo tudo o que sou e tudo o que acredito.
Mãe (Edna), Pai (Ricardo), Irmãos (Jú e Cau) e ao grande
amor da minha vida (Fabiano). Todos eles constituem o
meu grande tesouro.”Porque onde estiver o vosso
coração, aí estará também o vosso tesouro” (Mt. 6:21).
AGRADECIMENTOS
A Deus que sempre iluminou meus caminhos e abençoou a minha vida.
Ao meu marido querido, Fabiano Moura Dias, companheiro, amigo e amor, pelo
apoio nos momentos em que eu pensava que não conseguiria. Pela doçura,
carinho e felicidade que preenchem a minha vida.
À minha família por me conduzir até aqui. Por me apoiarem em todas as
minhas decisões. Pelo imenso amor, carinho e amizade. Pai, Mãe, Jú e Cau.
À minha sogra Laura, pelo exemplo de perseverança e coragem, pela
sabedoria e por todo apoio.
À minha orientadora querida, Ivanita Stefanon, por ter aberto as portas do seu
laboratório e do seu coração para que eu pudesse aprender um pouco mais.
Pelo carinho, paciência, incentivo e dedicação ao meu trabalho.
À minha co-orientadora Luciana Venturini Rossoni por ter me recebido de
braços abertos em sua casa e seu laboratório. Pelo carinho, por todos os
ensinamentos e por suas sábias ponderações.
Ao querido chefe, Dalton Valentim Vassallo, por ser um exemplo de mestre, por
sua sabedoria e por tornar agradáveis todos os locais por onde passa.
À minha amiga Wanize de Almeida Rocha por ter despertado em mim à
vontade de pesquisar e por ter acreditado que eu era capaz. Além disso, pela
paciência, força de vontade, coragem e pelo grande incentivo.
Às amigas queridas Edna e Aurélia por todo apoio, amizade e companheirismo.
Por ouvirem meus desabafos, me apoiarem e me fazerem sorrir nos dias
tristes.
Ao Patrik, meu companheirão de aorta, por sua dedicação, presteza e
inteligência.
A todos os amigos do LEMC: Ju (gravidinha), Vivi querida, Lu, Nelson, Altemar
(Alti), Núbia, Mírian, Lorena, Fabiana, Eduardo, Keli, Karina, Taís, Gabriel,
Evandro, Saulo, Guilherme, Rogério, Alessandra e Cleci.
À Carmen e Raquel, pela ajuda e incentivo ao meu trabalho.
A todos os amigos do laboratório de reatividade vascular da USP. À Ana Paula
e Gisele pela paciência para me ensinarem. Pelos capuccinos nas tardes frias
de SP e por enfrentarem as baratas na hora da revelação.
As amigas Alice e Alana, pela compreensão e por terem me dado duas
mãozinhas.
À amiga Flávia Marini Paro pelo exemplo, incentivo e apoio.
“Feliz aquele que rejeita maus
conselhos, segue o exemplo da
sabedoria. Este homem é como a árvore
que cresce à beira do riacho. Dá bons
frutos no tempo certo e suas folhas não
murcham. E tudo o que este homem faz
dá certo”.
Salmo 1 – 41.
LISTA DE ABREVIAÇÕES
1, 4, 5 - inositol trifosfato (IP
3
)
3 - isobutil-l-metilxantina (IBMX –inibidor da fosfodiesterase)
3, 5 - monofosfato cíclico de guanosina (GMPc)
5 - trifosfato de guanosina (GTP)
3,5 - monofosfato cíclico, 8 - bromoadenosina (8-brcamp – análogo do AMPc)
Acetilcolina (ACh)
Arginina vasopressina (AVP)
Concentração intracelular de Ca
+2
([Ca
+2
]
cit
)
Concentração intracelular de Na
+
([Na
+
]
cit
).
de Adenosina difosfato (ADP)
de Adenosina trifosfato (ATP)
Diacilglicerol (DAG)
Endotélio íntegro (E
+
)
Endotélio removido mecanicamente (E
-
)
Enzima conversora de angiotensina (ACE)
Espécies reativas do oxigênio (EROS)
Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)
Fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF)
Fator natriurético atrial (FAN)
Fator natriurético cerebral (FNC)
Flavina adenina de nucleotídeo (FAD)
Flavina mononucleotídeo (FMN)
Freqüência cardíaca (FC)
Grupo cirurgia fictícia (Sham)
Grupo infartadas (Inf)
Grupo infartadas que desenvolveram sinais de insuficiência cardíaca (Icc)
Hipertensão arterial sistêmica (HAS)
Infarto do miocárdio (INF)
Inibidor “não-seletivo” da sintase do óxido nítrico (NOS) N
(W)
-nitro-L-arginina
metil éster (L-NAME)
Insuficiência cardíaca (ICC)
Monofosfato cíclico de adenosina (AMPc)
Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH)
Ouabaína (OUA)
Óxido nítrico (NO)
Prostaciclina (PGI
2
)
Prostaglandina A1 (PGA
1
)
Prostaglandina E
2
(PGE
2
)
Prostaglandina F
2α
(PGF
2α
)
Prostaglandina H
2
(PGH
2
)
Proteína cinase A (PKA)
Proteína cinase C (PKC)
Proteína cinase G (PKG)
Razão entre o peso dos pulmões e o peso corporal (PP/PC)
Razão entre o ventrículo direito e o peso corporal (VD/PC)
Razão entre o ventrículo esquerdo e o peso corporal (VE/PC)
Resistência vascular periférica (RVP)
Retículo sarcoplasmático (RS)
Serotonina (5-HT)
Sintase de óxido nítrico endotelial (eNOS)
Sintase de óxido nítrico (NOS)
Sistema nervoso central (SNC)
Sistema nervoso simpático (SNS)
Sistema renina-angiotensina (SRA)
Sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA)
Tetrahidrobiopterina (BH
4
)
Tromboxano A
2
(TXA
2
)
Ventrículo esquerdo (VE)
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Dados ponderais dos animais 30 dias após o infarto...................... 56
LISTA DE FIGURAS
Figura 1:
Organograma da divisão dos grupos experimentais 30 dias
após o infarto do miocárdio......................................................
46
Figura 2:
Procedimento para a oclusão da artéria coronária
descendente anterior esquerda................................................
47
Figura 3: Avaliação dos dados ponderais -
Coração e pulmões
removidos para pesagem.........................................................
48
Figura 4: Avaliação da área de infarto em papel milimetrado.................
49
Figura 5:
Preparação dos anéis isolados de aorta para avaliação da
reatividade vascular “in vitro
”. Sistema de aquisição de
dados Biopac Systems.............................................................
50
Figura 6:
R
egistro com curvas representando o teste da viabilidade do
músculo liso vascular com KCl e avaliação da inte
gridade
funcional do endotélio..............................................................
51
Figura 7:
Registro com curvas representando a a
valiação da atividade
funcional da Na
+
K
+-
ATPase sensível à ouabaína em aortas
de ratas com e sem sinais de insuficiência cardía
ca após o
infarto do miocárdio..................................................................
52
Figura 8: Dados ponderais
dos animais Sham, Infarto (Inf) e Infarto
com sinais de insuficiência cardíaca (Icc), 30 dias após o
infarto.......................................................................................
57
Figura 9: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica
com endotélio intacto (E+) obtidas de ratas Sham...................
59
Figura 10:
Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica
de ratas Sham sem endotélio (E-
) e comparação entre os
grupos com endotélio intacto (E+) e E-....................................
61
Figura 11:
Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica
de ratas Sham L-
NAME. Anéis com endotélio intacto (E+),
incubados por 30 minutos com L-NAME (100 µM)..................
63
Figura 12: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica
de ratas Sham, 30 dias após o infarto. A) Comparação entre
os grupos Sham E+ com Sham L-NAME. B) Comparação
entre os grupos Sham E- e Sham L-NAME.............................
64
Figura 13: Curva
de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica
com endotélio intacto (E+) provenientes de ratas Infartadas,
sem sinais de insuficiência cardíac
a (Inf), 30 dias após o
infarto.......................................................................................
65
Figura 14:
Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica
sem endotélio (E-
) de ratas Infartadas, sem sinais de
insuficiência cardíaca (Inf), 30 dias após o infarto e
comparação entre Inf E- e Inf endotélio intacto (E+)................
67
Figura 15:
Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica
de ratas Inf, 30 dias após o infarto. Anéis com endotélio
intacto (E+), incubados por 30 minutos com L-
NAME (100
µM)...........................................................................................
69
Figura 16:
Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica
de ratas Inf, 30 dias após o infarto. A)
Comparação entre os
grupos Inf com endotélio intacto (E+) e Inf L-NAME B)
Comparação entre os grupo
s Inf com endotélio removido
mecanicamente (E-) e Inf L-NAME..........................................
70
Figura 17:
Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica
com endotélio intacto (E+), de ratas Infartadas que
apresentaram sinais de
insuficiência cardíaca (Icc), 30 dias
após o infarto............................................................................
71
Figura 18:
Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta de ratas
Infartadas que desenvolveram sinais de insuficiên
cia
cardíaca (Icc), 30 dias após o infarto. A) Anéis com endotélio
removido (E-
) provenientes de animais Icc. B) Comparação
entre os grupos Icc com endotélio intacto (E+) e Icc E-...........
73
Figura 19: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em ao
rta torácica
com endotélio intacto (E+) de ratas infartadas que
apresentaram sinais de insuficiência cardíaca (Icc), 30 dias
após o infarto. Anéis E+, incubados por 30 minutos com L-
NAME (100 µM)........................................................................
74
Figura 20:
Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta de ratas
Infartadas, com sinais de insuficiência cardíaca (Icc), 30 dias
após o infarto. A) Comparação entre os grupos Icc com
endotélio intacto (E+) e Icc L-NAME. B) Comparaç
ão entre
os grupos Icc com endotélio removido mecânicamente (E-
) e
Icc L-NAME..............................................................................
76
Figura 21:
Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta de ratas
com endotélio íntegro
(E+), 30 dias após o infarto. A) Grupo
Sham E+ vs. Inf E+. B) Grupo Sham E+ vs.
Icc E+. C) Grupo
Inf E+ vs. Icc E+.......................................................................
78
Figura 22: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta d
e ratas
sem endotélio (E-), 30 dias após o infarto. A) Grupo Sham E-
vs. Inf E-. B) Grupo Sham E- vs. Icc E-. C) Grupo Inf E- vs
.
Icc E-........................................................................................
80
Figura 23: Curva de re
laxamento induzido pelo KCl, em aorta com
endotélio intacto (E+), incubadas com L-
NAME, proveniente
de ratas, 30 dias após o infarto. A) Grupo Sham L-NAME vs.
Inf L-NAME. B) Grupo Sham L-NAME vs. Icc L-
NAME. C)
Grupo Inf L-NAME vs. Icc L-NAME..........................................
82
Figura 24: Diagrama com principais resultados e hipótese da pesquisa..
95
SUMÁRIO
1. INFARTO DO MIOCÁRDIO ........................................................................ 18
2. INSUFICIÊNCIA CARDÍACA CONGESTIVA PÓS-INFARTO DO
MIOCÁRDIO ................................................................................................... 21
2.1 REMODELAMENTO CARDÍACO ............................................................. 21
2.2 ATIVAÇÃO NEUROHUMORAL ................................................................ 22
2.3 REATIVIDADE VASCULAR E DISFUNÇÃO ENDOTELIAL...................... 25
3. Na
+
K
+
-ATPase............................................................................................ 30
3.1 AS SUBUNIDADES DA Na
+
K
+
-ATPase .................................................... 31
3.1.1 Subunidade catalítica α ....................................................................... 31
3.1.2 A subunidade glicosilada β................................................................. 32
3.1.3 A subunidade regulatória γ ................................................................. 33
3.2 MECANISMOS DE REGULAÇÃO DA Na
+
K
+
-ATPase.............................. 34
3.2.1 Eventos que envolvem a sinalização das ações hormonais ............ 34
3.2.2 Regulação da Na
+
K
+
-ATPase através da concentração dos
substratos...................................................................................................... 35
3.2.3 Hormônios na regulação da Na
+
K
+
-ATPase....................................... 37
3.2.4 Fatores vasoativos derivados do endotélio na regulação da Na
+
K
+
-
ATPase ........................................................................................................... 38
3.2.5 Regulação da Na
+
K
+
-ATPase através dos seus inibidores
endógenos ..................................................................................................... 41
4. OBJETIVOS................................................................................................ 44
4.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................... 44
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................... 44
5. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................... 45
5.1 ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS.................................................. 45
5.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS........................................................... 46
5.2.1 Infarto agudo do miocárdio................................................................. 46
5.2.2 Avaliação dos dados ponderais.......................................................... 47
5.2.3 Preparação dos anéis isolados de aorta e avaliação da reatividade
vascular “in vitro” ......................................................................................... 49
5.2.3.1 Estudo da atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à
ouabaína em aortas de ratas com e sem sinais de insuficiência cardíaca
após o infarto do miocárdio ......................................................................... 52
5.2.3.1.1 Modulação do endotélio sobre a resposta de relaxamento ao KCl
e sobre a capacidade da ouabaína de inibir a atividade funciona da Na
+
K
+
-ATPase.......................................................................................................... 53
5.2.3.1.2 Efeito do bloqueio com L-NAME sobre a atividade funcional da
Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína............................................................. 53
5.3 EXPRESSÃO DOS DADOS E ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................... 54
5.4 FÁRMACOS E REAGENTES.................................................................... 55
6. RESULTADOS............................................................................................ 56
6.1 DADOS PONDERAIS................................................................................ 56
6.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FUNCIONAL DA Na
+
K
+
-ATPase SENSÍVEL À
OUABAÍNA 30 DIAS APÓS O INFARTO........................................................ 58
6.2.1 Estudo da atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína,
em aortas de ratas Sham.............................................................................. 59
6.2.1.1 Modulação do endotélio sobre a atividade funcional da Na
+
K
+
-
ATPase sensível à ouabaína
em aorta de ratas Sham ............................... 60
6.2.1.2 Participação do NO sobre a atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase
sensível à ouabaína
em aorta de ratas Sham ............................................. 62
6.2.2 Estudo da atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína
em aortas de ratas infartadas....................................................................... 65
6.2.2.1 Modulação do endotélio sobre a atividade funcional da Na
+
K
+
-
ATPase sensível à ouabaína
em aortas de ratas infartadas ...................... 66
6.2.2.2 Participação do NO na modulação endotelial sobre a atividade
funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína em aortas de ratas
infartadas ....................................................................................................... 68
6.2.3 Estudo da atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase
em aortas de ratas
infartadas que apresentaram sinais de insuficiência cardíaca................ 71
6.2.3.1 Modulação do endotélio sobre a atividade funcional da Na
+
K
+
-
ATPase
em aortas de ratas infartadas que apresentaram sinais de
insuficiência cardíaca ................................................................................... 72
6.2.3.2 Participação do NO na modulação da atividade funcional da Na
+
K
+
-
ATPase
em aortas de ratas infartadas que apresentaram sinais de
insuficiência cardíaca ................................................................................... 74
6.2.4 Comparação da atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase, em aortas
com endotélio intacto, proveniente de ratas Sham, Inf e Icc .................... 77
6.2.5 Comparação da modulação do endotélio sobre a atividade funcional
da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína nos anéis de aorta provenientes
dos grupos Sham, Inf e Icc............................................................................ 79
6.2.6 Diferença na participação do NO na modulação endotelial sobre a
atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína nos anéis de
aorta provenientes dos grupos Sham, Inf e Icc.......................................... 81
7. DISCUSSÃO............................................................................................... 83
8. CONCLUSÃO............................................................................................. 96
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................... 97
RESUMO
A identificação de dois grupos experimentais distintos quando se induz ao infarto (INF)
em ratos (Inf - sem sinais de ICC e Icc - com sinais de ICC), apresentando a mesma
área de cicatriz (AI), poderia explicar, pelo menos em parte, alguns dos resultados
contraditórios da função cardiovascular descritos na literatura. Sabe-se que a atividade
da Na
+
K
+
-ATPase é importante para a homeostase vascular e o controle do tônus. Ela
é influenciada por fatores vasoativos derivados do endotélio, glicosídios cardíacos,
hormônios, concentração iônica e até o shear stress, que freqüentemente estão
alterados após o INF. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a atividade
funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína (OUA) em anéis de aorta de ratas
após o INF, com mesma AI, com e sem sinais de ICC. Ratas Wistar (220 ± 8 g) foram
distribuídas em Sham (n= 13), INF sem sinais de ICC (Inf n= 11) e INF com sinais ICC
(Icc n= 7). O INF foi induzido cirurgicamente através da oclusão da artéria coronariana
descendente anterior esquerda. Após 30 dias, as ratas foram anestesiadas para
retirada de anéis de aorta que foram perfundidos com solução de Krebs e gaseificados
com mistura carbogênica em banho para estudo da reatividade em anéis com
endotélio íntegro (E+), sem endotélio (E-) e com L-NAME . A avaliação da atividade
funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à OUA foi realizada pela técnica de relaxamento
ao potássio. Não houve diferença entre a AI (Inf: 30,2 ± 1,6; Icc: 35,6 ± 2,8), o peso
corporal (Sham: 236 ± 4 g; Inf: 236 ± 5 g; Icc: 235 ± 5 g) e a razão VE/PC (Sham: 2,12
± 0,05; Inf: 2,24 ± 0,06; Icc: 2,21 ± 0,07). Verificou-se, porém, diferença entre as
razões VD/PC (Sham: 0,6 ± 0,02; Inf: 0,6 ± 0,03; Icc: 1,4 ± 0,1*
P<0,01) e PP/PC
(Sham: 5,7 ± 0,3; Inf: 6,1 ± 0,3; Icc: 13,6 ± 1,0* P<0,01). No grupo Inf o relaxamento ao
KCl apresentou-se diminuído, apesar da modulação basal nitrérgica do endotélio estar
preservada. Por outro lado, a capacidade da OUA de inibir a Na
+
K
+
-ATPase mostrou-
se aumentada nestes animais não apresentando modulação endotelial como visto nos
grupos Sham e Icc. Em conclusão, a liberação de NO estimulada pela OUA esta
prejudicada no grupo Inf, mas preservada no grupo Icc, Portanto, estes resultados
demonstram, pela primeira vez na literatura, a participação da Na
+
K
+
-ATPase nas
mudanças de reatividade vascular após o INF, propondo que há diferenças nos
mecanismos envolvidos na reatividade vascular após o INF, em animais com mesma
AI, com e sem sinais de ICC.
ABSTRACT
The identification of two distinct experimental groups (Icc – with, and Inf - without
signals of heart failure (HF) folowing myocardial infarction in rats, presenting the same
infarct area (IA), could explain, at least in part, the contradictory cardiovascular results
in experimental models of HF. Recent research demonstrates the function of the
Na
+
K
+
-ATPase in the vascular homostasis in the control of tonus. The activity of the
Na
+
K
+
-ATPase is influenced by vasoativos factors endothelium-derivatives, cardiac
glycosides, hormones, ionic concentration and shear stress, frequently altered after
INF and HF. The objective of this research was to study the ouabain-sensitive Na
+
K
+
-
ATPase functional activity in aortic rings of INF rats, with same IA, presenting or not
signals of ICC. Female Wistar rats (220 ± 8 g), were distributed in: Sham (n= 13),
Infarct without signals of ICC (Inf N = 11) and Infarct with signals of HF (Icc n= 7). MI
was surgically induced by occluding left coronary artery. After 30 days the rats were
anaesthetized, and the aortic rings was superfused with Krebs solution gasified with
95% O
2
- 5% CO
2
mixture to study rings with intact endothelium (E+), denuded
endothelium (E -) and with L-NAME. The ouabain-sensitive Na
+
K
+
-ATPase functional
activity was analized using the potassium relaxation technique. No differences was
observed in IA (Inf: 30,2 ± 1,6; Icc: 35,6 ± 2,8), body weight (Sham: 236 ± 4 g; Inf: 236
± 5 g; Icc: 235 ± 5 g) and VE/PC (Sham: 2,12 ± 0,05; Inf: 2,24 ± 0,06; Icc: 2,21 ± 0,07).
However, the signals of HF appeared only in the Icc groups VD/PC (Sham: 0,6 ± 0,02;
Inf: 0,6 ± 0,03; Icc: 1,4 ± 0,1* P<0.05) and PP/PC (Sham: 5,7 ± 0,3; Inf: 6,1 ± 0,3; Icc:
13,6 ± 1,0* P<0.05). The main results of this study are that in the Inf animals the KCl-
induced relaxation was diminished and the endotelial modulation of this relaxation, for
nitric oxide, was present. However, the capacity of the OUA to inhibit the Na
+
K
+
-
ATPase was increased in these animals and it did not present endotelial modulation as
seen in the groups Sham and Icc. These results demonstrate that OUA-dependent NO
release is absent in the Inf group, but preserved in the Icc. Therefore, the results
demonstrate for the first time in literature the participation of the Na
+
K
+
-ATPase in the
changes of vascular reactivity following myocardial infarction in female rats. Moreover
there are differences in the mechanisms involved in the aortic reactivity following
myocardial infarction in female rats with same IA, presenting or not signals of HF.
1. INFARTO DO MIOCÁRDIO
A cardiopatia isquêmica pode ser considerada uma conseqüência do
desequilíbrio entre o suprimento e a demanda de sangue oxigenado no
coração. Uma isquemia miocárdica pode resultar da formação de placa de
aterosclerose, do desenvolvimento de trombose e da vasoconstrição excessiva
de origem patológica (Sharpe, 1993). A oclusão de uma das artérias coronárias
pode levar à necrose das células do miocárdio, conhecida como infarto do
miocárdio (INF). Os locais mais comuns de oclusão das coronárias por placas
de aterosclerose são: 1) no ramo descendente anterior da artéria coronária
esquerda; 2) na artéria coronária direita; e 3) no ramo circunflexo da artéria
coronária esquerda (Lee et al., 1996).
Dentre as possibilidades relacionadas com o tempo de evolução, o miocárdio
sofre progressiva agressão representada pelas áreas de isquemia, lesão e
necrose, sucessivamente. Na primeira, predominam os distúrbios eletrolíticos,
na segunda, as alterações morfológicas reversíveis e na última, danos
definitivos. Da mesma forma, essas etapas se correlacionam com as várias
formas de apresentação clínica que podem ocasionar desde a angina instável e
infarto sem supradesnivelamento, até infarto com supra-desnivelamento do
segmento ST. É por isso que o manejo atual do paciente com INF é baseado
no rápido diagnóstico, na desobstrução imediata da coronária responsável pela
manutenção do fluxo, na profilaxia da embolização distal e na reversão de suas
complicações potencialmente fatais (arritmias, falência cardíaca e distúrbios
mecânicos) (Pesaro, 2004).
O reparo cardíaco é um complexo processo envolvendo repostas
neuroendócrinas, diversos componentes pró-inflamatórios e o remodelamento
da matriz extracelular.
A ativação neuroendócrina após o infarto do miocárdio envolve basicamente
três sistemas: o sistema nervoso simpático (SNS); a ativação da produção e
liberação do fator natriurético atrial (FAN); e a ativação do sistema renina-
angiotensina-aldosterona (SRAA) (Mill et al., 1990).
A ativação do SNS ocasiona um aumento de descarga nervosa nos
troncos simpáticos periféricos dirigidos para os rins, coração, vasos e,
particularmente, para a supra-renal. Há, portanto, um aumento da
concentração circulante de adrenalina, proveniente da supra-renal, como
também, há uma elevação da noradrenalina, proveniente do aumento da
atividade dos nervos simpáticos. O FAN é um hormônio peptídico liberado
pelos miócitos atriais submetidos ao estiramento. Muitos estudos relacionam a
elevação persistente do FAN aos casos que evoluem para insuficiência
cardíaca (ICC). A ativação do SRAA resulta, em grande parte, no aumento da
produção e liberação de renina pelos rins, e parácrina no coração. Como
conseqüência da produção e liberação de renina pelo aparelho justaglomerular,
aumenta a concentração plasmática de angiotensina II e de aldosterona. Os
principais efeitos fisiológicos desta elevação no plasma estariam relacionados a
uma tentativa de aumento da volemia, a fim de manter uma perfusão do tecido
miocárdico adequada em situações de baixo débito (Mill et al.,1990). Após o
INF e a perda de tecido contrátil na área da cicatriz, o coração passa a usar,
primeiramente, sua reserva sistólica (representada pelo aumento da atividade
contrátil do miocárdio) a fim de manter a perfusão sistêmica. Isso ocorre
basicamente pelo aumento da atividade simpática. Secundariamente, a
manutenção do débito cardíaco depende da reserva diastólica, ou seja, do
aumento da eficiência sistólica através da ativação do mecanismo de Frank-
Starling.
À medida que o infarto se consolida, uma dilatação ventricular seria
indispensável para manter o débito cardíaco em valores compatíveis com a
vida. A necrose dos miócitos e o aumento da sobrecarga ventricular disparam
uma cascata de sinalização bioquímica intracelular capaz de promover
hipertrofia, dilatação e formação de cicatriz de colágeno. Inicialmente, a
hipertrofia ventricular é uma resposta adaptativa benéfica à sobrecarga
hemodinâmica por estabilizar a função contrátil, mas sua evolução colabora
para a disfunção ventricular progressiva (Spann et al., 1967). O enrijecimento
da parede ventricular, secundário à instalação da hipertrofia causa elevação do
estresse sistólico e diastólico de parede (Pfeffer & Braunwald, 1990). Essa
hipertrofia pode ter um efeito benéfico do ponto de vista energético, já que,
segundo a relação de Laplace o estresse gerado na parede ventricular
depende da pressão multiplicada pelo raio dividido pelo dobro da espessura da
parede da cavidade. Assim, um dado aumento da pressão ventricular pode ser
compensado pelo aumento da hipertrofia concêntrica, normalizando o estresse
de parede.
Por outro lado, o estresse diastólico final na sobrecarga de volume
dispara a replicação dos sarcômeros em série, que resulta em alongamento
individual dos miócitos. Este aumento do comprimento celular causa um
aumento no volume ventricular total resultando em hipertrofia excêntrica
(Carabello, 2002). A deterioração progressiva dos ventrículos e a disfunção
sistólica e diastólica instaladas pelo contínuo processo de remodelamento
levam a diminuição da fração de ejeção, prejuízo no mecanismo de Frank-
Starling e descompensação do estresse sistólico, anteriormente evitado de
acordo com a Lei de Laplace. O aumento da pós-carga deixa efetivamente de
resultar no aumento da pré-carga e o coração despenderá de alto consumo
energético para realizar sua performance de bomba o que resultará em falência
da bomba cardíaca (Gerdes, 2002).
Além da hipertrofia após o INF, ocorre aumento na deposição de colágeno na
matriz extracelular, o que contribui para alterar o desempenho sistólico e
reduzir a complacência da câmara, dificultando o enchimento do ventrículo (Mill
et al., 1990; Mill & Vassallo, 2001).
O tecido hipertrofiado não possui as mesmas características funcionais do
tecido do miocárdio normal. A densidade capilar cai proporcionalmente à
hipertrofia e a reserva do fluxo coronariano é reduzida (Marcus et al., 1983).
As reservas de substratos de alta energia, como a fosfocreatina, reduzem-se,
principalmente no subendocárdio. Assim, a hipertrofia predispõe a crises
recorrentes de isquemia, INF e, conseqüentemente, leva a um quadro crônico
de mecanismos compensatórios que se tornam um ciclo vicioso, resultando na
insuficiência cardíaca (Mill et al., 1990; Olivetti et al., 1991; Mill & Vassallo,
2001).
O tratamento após o INF é diferente de acordo com o estágio da doença. A
escolha do tipo de intervenção varia de forma dependente do tempo
transcorrido do episódio do infarto. O infarto do miocárdio lidera as causas de
insuficiência cardíaca em todos os países. Portanto, reconhecê-lo
precocemente é uma oportunidade de modificar os fatores que promovem o
desenvolvimento de mudanças irreversíveis na função cardíaca (Sharpe, 1993;
Francis et al., 2001).
2. INSUFICIÊNCIA CARDÍACA CONGESTIVA PÓS-INFARTO DO
MIOCÁRDIO
A insuficiência cardíaca congestiva é classicamente definida como uma
síndrome clínica complexa em que há incapacidade do coração em bombear o
sangue com suficiente pressão e volume para garantir a demanda dos tecidos
(Hirsch et al., 1991; National Heart, Lung and Blood Institute, 2003; Davidoff et
al., 2004). É uma desordem multissistêmica caracterizada por uma elevação da
ativação neuro-humoral que se inicia com alteração da função e dilatação da
câmara cardíaca esquerda (VE), o que ocasiona a necessidade de um
aumento na pressão de enchimento para sustentar o débito cardíaco adequado
(Francis et al., 2001; National Heart, Lung and Blood Institute, 2003).
A progressão da ICC, como uma síndrome de baixo débito, gera o
desenvolvimento de mecanismos compensatórios responsáveis pela
manutenção da pressão arterial e da adequada perfusão dos órgãos vitais,
como a retenção de sódio e água, bem como a vasoconstrição periférica. O
remodelamento cardíaco, a ativação neurohumoral e pró-inflamatória e a
disfunção endotelial constituem uma ajuste de curto prazo. Em longo prazo,
estes mecanismos podem tornar-se um ciclo vicioso, apresentando-se
clinicamente como ICC (Nasa et al., 1996; Braunwald & Bristow, 2000). Em
seguida estes mecanismos são descritos sucintamente.
2.1 REMODELAMENTO CARDÍACO
Remodelamento é um termo utilizado para descrever os processos de reparo
das câmaras cardíacas que resultam na alteração da geometria ventricular e
diminuição da função cardíaca (Dorn, 2002). Após o INF, o remodelamento
ventricular é o principal fator causador da ICC (Gaballa & Goldman, 2002).
Segundo Sutton & Sharpe (2000), o INF pode ser dividido em duas fases: 1)
fase precoce (dentro de 72 horas após o INF); 2) fase tardia (após 72 horas de
INF). A fase tardia pode se estender enquanto persistam os estímulos
bioquímicos que dependem do tamanho, local e transmuralidade do infarto
(Sutton & Sharpe, 2000). Com a progressão do remodelamento os mecanismos
compensatórios estruturais iniciais tornam-se prejudiciais e levam à
deterioração da função cardíaca contribuindo para o desenvolvimento da ICC
(Pfeffer, 2002).
2.2 ATIVAÇÃO NEUROHUMORAL
A ativação neurohumoral caracteriza um estado em que os sistemas
neural e hormonal são ativados para manter a perfusão adequada dos órgãos
vitais (como por exemplo, a circulação cerebral e coronariana) que poderiam
sofrer com as conseqüências de uma disfunção cardíaca (Middlekauff & Mark,
1998). Esta ativação inclui o SNS, o SRAA, a arginina vasopressina (AVP), e o
FAN.
A ativação do SNS é um aspecto presente nos estágios mais recentes
da disfunção ventricular e está envolvida na progressão e no aumento da
mortalidade na ICC (Francis et al., 1993). Em estudos com animais, com
disfunção do VE, mesmo antes da constatação da ICC, a concentração
plasmática de norepinefrina já estava elevada (Stevens, 1995). Os mesmos
resultados foram encontrados por Francis et al. (1990) quando foram
estudados seres humanos com disfunção ventricular e sem sintomas de ICC.
Utilizando uma técnica de registros através da microneurografia para avaliar a
atividade do sistema nervoso simpático no nervo peroneal em humanos, Grassi
et al. (1995), observaram que a atividade do SNS para os vasos sanguíneos
dos músculos estava aumentada em pacientes com ICC secundária a
disfunção do VE e Benedict et al. (1993) não encontraram os mesmos
resultados quando avaliaram pacientes com ICC secundária à disfunção do
VD. Contudo, estes achados indicam que a excitação do SNS mais do que a
clínica da ICC reflete uma disfunção do VE. Em pacientes com ICC a atividade
do SNS no coração está aumentada três vezes mais que o normal, sendo ele o
primeiro órgão alvo desta ativação. Além disso, os rins e a circulação muscular
são também precocemente envolvidos (Rundqvist et al., 1997).
A contínua e prolongada atividade adrenérgica, bem como a
vasoconstrição periférica leva a um aumento da pós-carga, diminuição do
débito cardíaco e da perfusão renal, contribuindo para o aumento da retenção
de água e sódio. Ao mesmo tempo, aumenta a freqüência cardíaca (FC) e o
gasto energético do miocárdio, podendo ocasionar hipertrofia, isquemia,
taquiarritmias e danos aos miócitos (Middlekauff & Mark, 1998; Braunwald &
Bristow, 2000).
Embora seja conhecida a ativação do SNS durante a ICC, as vias
envolvidas neste processo ainda não estão completamente claras. Os
possíveis mecanismos envolvidos são: atenuação da sensibilidade dos
mecanorreceptores arteriais e cardíacos; alteração pressórica na artéria e no
capilar pulmonar; exacerbação do quimiorreflexo periférico e central; ativação
das aferências simpáticas cardíacas que estão relacionadas à sensação de dor
cardíaca durante a isquemia coronariana; ativação dos aferentes renais
sensíveis a estímulos mecânicos ou químicos; ativação do SRA, atenuação da
resposta inibitória para o SNC; ativação da resposta excitatória para o sistema
nervoso central (SNC); e mudanças nos fatores humorais e locais do cérebro
afetando a regulação neural simpática central (Middlekauff & Mark, 1998; De
Angelis, et al., 2004).
O aumento do tônus adrenérgico resulta no aumento da resistência
vascular periférica (RVP) que acontece tanto por estimulação direta, quanto
indireta, da contração do músculo liso. A liberação aumentada não só de
catecolaminas, mas também de endotelinas, e indiretamente, a ativação do
SRAA, contribuem para restaurar a pressão e a volemia (Ledoux et al., 2003).
Na ICC há um aumento na quantidade de angiotensina II tecidual e
circulante que aumenta a pré-carga e a pós-carga, causando remodelamento
cardíaco e vascular. A angiotensina II estimula a liberação de endotelina-1, um
potente vasoconstritor, bem como de aldosterona, que estimula a reabsorção
de sódio. Outras ações importantes da angiotensina II são a facilitação da
ativação do músculo liso vascular pelas catecolaminas, bem como a redução
da sua recaptação pelos terminais pré-sinápticos e a ativação central do SNS
(Falkenhahn et al., 1994; Griendling et al., 1997)
Uma importante função da angiotensina II refere-se ao seu envolvimento na
modulação da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO) por meio do estímulo à
produção de ânion superóxido. Há evidências de que o ânion superóxido
inativa o NO, alterando a função endotelial. A inibição da síntese de superóxido
ou o uso de "varredores" de radicais livres pode melhorar a função endotelial. A
diminuição do NO é encontrada em várias doenças que cursam com disfunção
endotelial como a hipertensão arterial (Panza et al., 1990; Drexler, 1998), a
hipercolesterolemia (Creager et al., 1990), a ICC (Lopez & Casado, 2001) e o
diabetes (Vallance, 1992). A diminuição da biodisponibilidade do NO durante a
ICC pode ocorrer por dois motivos: acentuada diminuição da expressão da
sintase do óxido nítrico endotelial (eNOS); e aumento da liberação vascular de
ânion superóxido (Schafer et al., 2004). Além disso, o tratamento de pacientes
com ICC através da utilização dos inibidores da enzima conversora de
angiotensina (ECA) altera favoravelmente a hemodinâmica e auxilia na melhora
dos sintomas. Porém, recentes estudos com captopril (inibidor da ECA)
demonstraram que o mesmo falhou na supressão da contração induzida pela
angiotensina II em artérias aorta de ratos, enquanto o Irbesartan (antagonista
da angiotensina II) conseguiu inibir completamente a contração (Ledox et al.,
2003). Estes estudos confirmam a hipótese de que há mecanismos
independentes da ECA para a formação de angiotensina II que estão ativados
nos casos de ICC e podem parcialmente contribuir para a falha dos inibidores
da ECA em suprimirem, cronicamente, os efeitos da angiotensina II (Schafer et
al., 2004). Segundo Urata (2000) esta via alternativa de produção da
angiotensina II, independente da ECA, assumiu nos últimos anos um papel
importante e contribuiu para explicar o aumento da concentração de
angiotensina II plasmática após o INF. Este mecanismo de produção de
angiotensina II envolve a quimase, uma potente enzima, liberada pelo
miocárdio, rins, células musculares, endotélio e células mesenquimais (Urata,
2000).
Outros hormônios que também se apresentam em elevadas
concentrações em pacientes com ICC são os peptídeos natriuréticos. O fator
natriurético atrial e o fator natriurético cerebral (FNC) são secretados pelo
coração em resposta ao estiramento do átrio desencadeado pelo aumento da
pressão de enchimento ventricular. Suas ações sobre o músculo liso vascular
(MLV), sobre os rins e supra-renais causam, respectivamente, vasodilatação,
diminuição da secreção de renina, bem como diminuição da liberação de
aldosterona e natriurese (Braunwald & Bristow, 2000; Nakayama, 2005).
Quando Francis et al., (2001) avaliaram a progressão da ICC após 8 semanas
do infarto em rato, foi demonstrado que o FAN aumentou logo na primeira
semana e manteve este aumento constante até o fim do experimento. Assim,
segundo estes pesquisadores, há uma correlação entre FAN e a progressão
temporal do INF para ICC.
Sintetizada pelo hipotálamo, armazenada e liberada pela neuro-hipófise,
a AVP, também denominada hormônio antidiurético, tem a função de manter a
volemia e a osmolaridade plasmática. Sua secreção é regulada pelo
estiramento atrial, osmolaridade plasmática, concentrações plasmáticas de
angiotensina II e de norepinefrina. Sua concentração está aumentada em
pacientes com ICC, nos quais atua diretamente no músculo liso aumentando a
contração muscular e produzindo vasoconstrição (via receptores V
1
, sendo que
o papel dos receptores V
2
também já foi sugerido) (Schrier & Abraham, 1999),
bem como retenção de água e hiponatremia dilucional (Goldsmith &
Gheorghiade, 2005).
A concentração de endotelina circulante também é um importante
marcador prognóstico da ICC (Selvais et al., 2000; Vidal et al., 2002). Em
pacientes com ICC, a concentração plasmática de endotelina encontra-se
aumentada, o que promove a formação de um ciclo vicioso para a liberação de
angiotensina II. Além disso, a angiotensina II também estimula a liberação de
endotelina (Shubeita et al., 1990).
Além dos fatores humorais alterados na ICC, há também a superexpressão das
citocinas pró-inflamatórias. Elas compõem um grupo heterogêneo de proteínas
com peso molecular relativamente pequeno que se caracterizam por exercer
seus efeitos a curtas distâncias de forma parácrina ou endócrina. No entanto,
não são hormônios, pois não atuam pela via humoral. Duas classes de
citocinas foram relacionadas ao desenvolvimento da ICC: 1) citocinas
vasoconstritoras e inotrópicas positivas; e 2) citocinas pró-inflamatórias
vasodilatadoras. As citocinas pró-inflamatórias como a Fator de necrose
tumoral alfa (TNF-α), e interleucina-1β enquadram-se na segunda classe. Elas
desempenham papel expressivo na patogênese da ICC por diminuírem as
reservas intracelulares de anti-oxidantes e promoverem a formação de
espécies reativas de oxigênio. Além dos efeitos desses mediadores pró-
inflamatórios na estrutura e na função cardíaca após o infarto do miocárdio, são
crescentes as evidências que de que existe contribuição das citocinas na
disfunção endotelial. O TNF-α, encontrado no soro dos pacientes com ICC, já
foi demonstrado por sua capacidade de modular a função endotelial, através da
indução de apoptose das células endoteliais e diminuição da expressão eNOS
da veia umbilical humana (Braunwald & Bristow, 2000; Douglas, 2002; Nian et
al., 2004).
2.3 REATIVIDADE VASCULAR E DISFUNÇÃO ENDOTELIAL
Sabe-se que a alteração da reatividade vascular é uma conseqüência da ICC.
Porém, a causa da disfunção vascular possui várias hipóteses e diversos
fatores para sua explicação. Não há um consenso sobre o exato papel da
função vascular na ICC devido à heterogeneidade das alterações na
reatividade vascular que dependem da duração da doença e do tipo de artéria
estudada e do gênero (Stassen et al., 1997; Baggia et al., 1997; Palacios et al.,
2004).
Os mecanismos neuro-humorais compensatórios ativados na ICC, como o
SNS, SRAA, peptídeos natriuréticos e AVP contribuem para a alteração da
reatividade vascular, como descrito nos ítens anteriores. Porém, estes
mecanismos não são os únicos a participar da homeostase circulatória, sendo
o endotélio um importante modulador do tônus vascular (Furchgott & Zawadzk,
1980).
Substâncias locais derivadas do endotélio são importantes moduladores do
tônus vascular. Os principais fatores vasoconstritores são: tromboxano A
2
(TXA
2
), prostaglandina H
2
(PGH
2
), angiotensina II, endotelina-1 e espécies
reativas do oxigênio (EROS). Os principais fatores vasodilatadores são: NO,
prostaciclina (PGI
2
), fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF). Os
principais mediadores pró-inflamatórios são as citocinas liberadas localmente
pelo endotélio, terminações nervosas, plaquetas e leucócitos (Fang & Marwick,
2002; Ledoux et al., 2003).
Em condições basais, estas substâncias vasodilatadoras e vasoconstritoras
são liberadas pelo endotélio promovendo a regulação e os ajustes finos para
manutenção do tônus vasomotor. Um desequilíbrio entre a liberação, ou na
síntese, de fatores vasoconstritores e vasodilatadores pode resultar em um
processo denominado disfunção endotelial e assim, contribuir para o
densenvolvimento e/ou manutenção de doenças como a ICC (Lopez & Casado,
2001), hipertensão arterial sistêmica (HAS) (Drexler, 1998), diabetes (Davel et
al., 2000), insuficiência renal crônica (Dierck & Schiffrin, 2004) e doença arterial
coronariana (Behrendt & Ganz, 2002).
Felder et al. (2003) relataram em seu trabalho que os fatores derivados do
endotélio apresentam um feedback com os centros cerebrais e hipotalâmicos
que são responsáveis por estimular o tônus simpático e que também são
considerados participantes do processo de desenvolvimento de remodelamento
vascular induzido em doenças como a ICC.
A disfunção endotelial já está bem documentada e descrita em estudos com
humanos (Fischer et al., 2005) e em modelos de animais com ICC (Behrendt &
Ganz, 2002). Porém, as causas e as conseqüências da disfunção endotelial na
ICC não estão completamente esclarecidas.
A insuficiência cardíaca é caracterizada pela diminuição do débito cardíaco e
aumento da resistência vascular periférica que pode ocorrer por causa do
relaxamento anormal dependente do endotélio. Tanto a condutância quanto a
resistência nos vasos sanguíneos de animais com ICC estão prejudicadas
(Drexler, 1998; Endemann & Schiffrin, 2004). A vasodilatação dependente do
endotélio tem-se mostrado prejudicada tanto em humanos quanto em animais
com função cardíaca comprometida (Kubo et al., 1991; Drexler et al., 1992;
Bauersachs et al., 1999). O prejuízo funcional do endotélio é caracterizado por
uma vasodilatação reduzida, ou por uma vasoconstrição aumentada. A
vasodilatação mediada pelo endotélio, quando prejudicada na ICC, pode ser
ocasionada pela diminuição da produção de NO, aumento da sua degradação
ou diminuição da resposta do MLV aos fatores vasodilatadores (Teerlink et al.,
1993; Teerlink et al., 1994; Didion et al., 1997; Stassen et al., 1997; Bauersachs
et al., 1999; Indik et al., 2001).
A diminuição da produção de NO pode ser atribuída ao prejuízo na
biodisponibilidade de L-arginina (precursor do NO), a diminuição da expressão
da eNOS e ao prejuízo no receptor que medeia a liberação de NO em resposta
a estímulos farmacológico e mecânico (Drexler, 1998; Teerlink et al., 1993;
Behrendt & Ganz, 2002).
O aumento da degradação de NO pode ocorrer devido ao aumento das EROS
produzidas pelas células endoteliais e do MLV (Lopez & Casado, 2001). A
produção de EROS está aumentada no coração e na circulação após a ICC
estando relacionada à sobrecarga cardíaca e à isquemia do miocárdio, ao
aumento das citocinas semelhantes ao TNF-α, ao aumento da produção de
catecolaminas circulantes e de angiotensina II (Fang & Marwick, 2002; Ledoux
et al., 2003).
Taddei et al. (2000) propuseram uma redução da sensibilidade do MLV ao NO
devido à produção aumentada de endotelina-1 na ICC. A endotelina-1, ao
interagir com os receptores ET
A
encontrados no MLV, causa vasoconstrição.
Entretanto, ao interagir com os receptores ET
B
endoteliais, a endotelina-1
promove a liberação de substâncias vasodilatadoras, como o NO e a
prostaciclina (PGI
2
). Alguns receptores ET
B
, farmacologicamente diferentes dos
ET
B
endoteliais, podem localizar-se no MLV, onde causam uma vasoconstrição
ao serem estimulados (Kuc et al., 2000).
Se por um lado à capacidade vasodilatadora pode estar prejudicada na ICC,
por outro lado, a vasoconstrição pode estar aumentada. Gschwend et al. (2003)
demonstraram pela primeira vez, um aumento da responsividade do MLV em
artérias de resistência de animais insuficientes, abrindo um novo horizonte de
perspectivas em relação à função vascular na ICC.
Bianchi et al. (2006) verificaram um aumento na reatividade a fenilefrina em
aortas de ratas, 60 dias após o INF, que era dependente do endotélio e estava
relacionada à diminuição da biodisponibilidade de NO. Neste mesmo estudo,
embora a biodisponibilidade do NO estivesse diminuída, o relaxamento
induzido pela acetilcolina (ACh) estava preservado. Pereira et al. (2005)
demonstraram também que a reatividade vascular no leito arterial caudal de
ratos 30 dias após o INF, com mesma área de cicatriz, dependia do fato destes
animais apresentarem ou não sinais de ICC. Da mesma maneira, nos
trabalhos de Giuberti et al. (2007) e Fernandes (2006), a função cardíaca de
ratos infartados também estava relacionada com a presença ou não de ICC.
Um aspecto relevante do estudo de Pereira et al. (2005) foi à demonstração,
pela primeira vez na literatura, de que a reatividade vascular do leito caudal,
em resposta a fenilefrina, estava aumentada em animais que apresentaram
infarto sem sinais de ICC, enquanto, nos animais com sinais de ICC, a
reatividade vascular estava diminuída. A identificação de dois grupos
experimentais distintos quando se induziu o infarto agudo do miocárdio em
ratos, apresentando a mesma área de cicatriz, poderia explicar, pelo menos em
parte, a variedade de resultados, muitas vezes com conclusões contraditórias,
obtidos em modelos experimentais de ICC descritos na literatura. Assim, seria
possível que diferentes fatores estivessem envolvidos nas alterações da
reatividade vascular após o infarto do miocárdio em animais dependendo da
presença ou não de ICC. Os resultados demonstrados por Pereira et al. (2005)
sugeriram a existência de algum mecanismo que envolvesse também o
acoplamento excitação-contração do MLV nessas diferentes respostas. Como
a Na
+
K
+
-ATPase participa dos processos de manutenção do potencial de
membrana, dos mecanismos envolvidos na despolarização e repolarização,
bem como na manutenção da concentração iônica celular, sua função é
fundamental durante a contração do MLV. Então, ela poderia estar relacionada
a alterações da reatividade vascular durante o desenvolvimento das doenças.
Vários estudos demonstram a função da Na
+
K
+
-ATPase na homeostase
vascular e no controle do tônus (Therien & Blostein, 2000; Skou, 2003). A
atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase é influenciada por fatores vasoativos
derivados do endotélio, glicosídios cardíacos circulantes, hormônios,
concentração iônica (alteração no balanço sal e água) e até o shear stress, os
quais, frequentemente, estão alterados após o INF e ICC.
Considerando que têm sido descrito na literatura a participação da Na
+
K
+
-
ATPase nas alterações da reatividade vascular durante o desenvolvimento de
doenças do sistema cardiovascular, como a hipertensão arterial e o diabetes
(Rose & Valdes, 1994; Davel et al., 2000; Rossoni et al., 2002; Xavier et al.,
2004; Callera et al., 2004), seria possível que as alterações na reatividade
vascular após infarto descritas por Pereira et al. (2005) também envolvessem
esta enzima.
3. Na
+
K
+
-ATPase
O prêmio Nobel de química, em 1997, foi dado ao investigador dinamarquês
Jens C. Skou por sua identificação da Na
+
K
+
-ATPase. Embora a existência da
"bomba de sódio" já fosse previamente idealizada, Skou foi o primeiro a
postular, em 1957, a relação entre o transporte de Na
+
e K
+
através da
membrana e a ativação enzimática da Na
+
K
+
-ATPase (Skou, 1957; Therien &
Blostein, 2000; Skou, 2003).
A Na
+
K
+
-ATPase, conhecida como bomba de Na
+
ou bomba de Na
+
K
+
é uma
proteína integral de membrana da família das P-ATPase, caracterizada por um
número específico de seqüências relacionadas a sua função hidrolítica e a
presença de vários domínios hidrofóbicos necessários para a formação das α-
hélices transmembrana (Horisberger, 2004).
Ela é encontrada na maioria das células eucariotas e participa da regulação da
concentração intracelular de Na
+
, que é de grande importância para o controle
da homeostase celular. Sua função básica é manter elevados gradientes de
Na
+
e K
+
através da membrana plasmática que são utilizados como fonte de
energia para a manutenção do potencial de membrana, para os eventos da
despolarização e repolarização, bem como para a regulação da composição
iônica citoplasmática. A Na
+
K
+
-ATPase também possui importante papel na
regulação do volume celular, do tônus vascular, do crescimento e diferenciação
celular, do pH e da concentração de Ca
+2
, além de influenciar inúmeros
transportes secundários como o transporte de glicose dependente de Na
+
,
transporte de aminoácidos e transporte trans-epitelial (Vassalle, 1987; Skou &
Esmann, 1992; Rose & Valdes, 1994; Therien & Blostein, 2000; Frasen, 2005).
O mecanismo de funcionamento da Na
+
K
+
-ATPase acontece pelo transporte de
3 íons sódio do meio intra para o meio extracelular e 2 íons potássio do meio
extra para o meio intracelular, utilizando a energia liberada da hidrólise de uma
molécula de adenosina trifosfato (ATP) (Blaustein, 1977). A Na
+
K
+
-ATPase
possui estados conformacionais denominados E1 e E2, que diferem, por
instantes, em relação à afinidade por Na
+
, K
+
, adenosina difosfato (ADP) e
ATP. Esta transição conformacional cíclica é resultado da fosforilação da
enzima pelo ATP em presença de íons magnésio e Na
+
e, pela desfosforilação
na presença dos íons K
+
. Assim, ela se liga aos íons, os transporta e também
assume o estado ocluído, onde os dois portões da proteína estão fechados
(Sen & Tobin, 1969; Skou & Esmann, 1992; Horisberger, 2004).
3.1 AS SUBUNIDADES DA Na
+
K
+
-ATPase
A Na
+
K
+
-ATPase é uma proteína heterodimérica, um tetrâmero,
constituído por dois dímeros compostos por uma subunidade alfa (α, peso
molecular ≈ 100 kDa) e uma subunidade beta (β, peso molecular ≈ 55 kDa).
Além disso, uma pequena subunidade (γ, peso molecular 14 kDa) foi
identificada e várias hipóteses sobre sua atividade funcional, têm sido
recentemente postuladas (Forbush et al., 1978; Sweadner, 1979; Rose &
Valdes, 1994; Lopina, 2000; Therien & Blostein, 2000; Cortes et al., 2006).
3.1.1 Subunidade catalítica α
A subunidade catalítica α possui aproximadamente 8 domínios transmembrana
e 4 isoformas: α1, α2, α3 e α4. Ela contém sítios de ligação para Na
+
e K
+
,
ATP e compostos digitálicos (como por exemplo, a ouabaína) que são ligantes
conhecidos por estimular ou inibir a Na
+
K
+
-ATPase (Sweadner, 1969; Rose &
Valdes, 1994; Shamraj & Lingrel, 1994; Dostanic-Larson et al., 2006).
Muitos estudos propõem que a apresentação das isoformas da Na
+
K
+
-ATPase
varia com a espécie e é tecido específica, indicando que cada isoforma exibe
uma função particular associada com o tecido no qual é expressada (Orlowski
& Lingrel, 1988; Gick et al., 1993; Juhaszova & Blaustein, 1997). Além disso,
recentes pesquisas demonstram que a distribuição e o local de expressão das
isoformas da Na
+
K
+
-ATPase pode variar, inclusive, no interior de uma mesma
célula. Por exemplo, a isoforma α1, que se distribui uniformemente na
membrana plasmática dos neurônios, astrócitos e miócitos arteriais da
mesentérica. Ao contrário da α3 (presente em neurônios e miócitos arteriais) e
α2 (presente em astrócitos, miócito arterial) que parecem estar confinadas a
microdomínios na membrana plasmática, adjacentes a elementos periféricos ou
juncionais do retículo sarcoplasmático, como trocador Na
+
/Ca
+2
, canais de K
+
e
canais operados por estoque (Juhaszova & Blaustein, 1997; Arnon et al.,
2000).
Sobre a isoforma α1, sabe-se que ela é predominantemente encontrada nos
rins, mas pode ser expressa em quase todos os tecidos. Enquanto a isoforma
α2 pode ser encontrada no músculo esquelético, coração, cérebro, adipócitos e
olhos, bem como em inúmeros outros tecidos. Em relação à isoforma α3,
estudos demonstram que ela é encontrada abundantemente nos neurônios e
ovários, mas também nas células sanguíneas e coração de muitas espécies,
inclusive em humanos (Shamray et al., 1991; Stengelin & Hoffman, 1997;
Dostanic-Larson et al., 2006). Já a isoforma α4 é expressa nos
espermatozóides, e desempenha um papel fundamental na motilidade destas
células. Ela é especificamente sintetizada durante a espermatogênese, no
processo de divisão celular (meiose) das espermatogonias (Shamray & Lingrel,
1994; Woo et al., 2000).
As isoformas α da Na
+
K
+
-ATPase
apresentam diferentes afinidades em relação
aos íons Na
+
, K
+
e Ca
+2
, bem como aos glicosídeos cardíacos. Este fato é
fisiologicamente importante, pois permite compreender a influência da Na
+
K
+
-
ATPase
na regulação da concentração iônica e sua participação em processos
como a manutenção do tônus vascular. No MLV da artéria aorta são expressas
três isoformas α: α1, α2, e α3 (Herrera et al., 1988; Sahin-Erdemli et al., 1994).
Porém, Rossoni et al. (2002) não conseguiram detectar α3 nestas artérias.
Estes pesquisadores explicaram o prejuízo na detecção de α3, pela pequena
quantidade dessa isoforma no MLV de aorta, e pela utilização de um anticorpo
de baixa sensibilidade, que poderia causar reação cruzada com α2. As
isoformas α2, e α3 são as que possuem maior afinidade à ouabaína e menor
afinidade ao Na
+
. Enquanto a isoforma α1 possui alta afinidade ao Na
+
, ao K
+
e
baixa à ouabaína. A isoforma α2 possui maior afinidade ao Ca
+2
que as outras
duas isoformas (Herrera et al., 1988; Arnon et al., 2000).
3.1.2 A subunidade glicosilada β
A subunidade β foi identificada por Brotherus et al., (1983) em preparações
experimentais nas quais se realizava purificação enzimática da Na
+
K
+
-ATPase.
Ela possui um pequeno domínio N-terminal citoplasmático, um segmento único
que atravessa a membrana e um grande domínio extracelular C-terminal. O
domínio transmembrana é hidrofóbico, altamente glicosilado e possui 3 anéis
de bissulfeto que se ancoram na superfície da membrana (Farley et al., 1986;
Chow & Forte, 1995). Também são encontrados sítios para ligação com o K
+
na porção extracelular desta subunidade. Assim, Hiatt et al. (1984) postularam
que ela serviria para orientar e estabilizar a subunidade alfa na membrana,
facilitando o seu ancoramento e participaria também, na mudança
conformacional da Na
+
K
+
-ATPase dependente da ligação com o K
+
. Assim,
quando os íons K
+
ligam-se aos sítios da subunidade β, há uma mudança
conformacional da Na
+
K
+
-ATPase do estado E1 para o E2, sendo que este
último estado, seria considerado a conformação mais estável da Na
+
K
+
-
ATPase, visto que os anéis de bissulfeto estariam mais fortemente ligados à
membrana. Além disso, a Na
+
K
+
-ATPase no estado conformacional E2
apresenta-se desfosforilada, e a subunidade β seria a responsável pela
oclusão à passagem de K
+
(McDonough et al., 1990; Chow et al., 1992; Chow
& Forte, 1995; Pontiggia & Gloor, 1997).
Três isoformas da subunidade β são descritas: β1, β2, β3 (Horisberger et al.,
1991; Rose & Valdes, 1994; Chow & Forte, 1995). A isoforma β1 é detectada
em muitos tecidos de vertebrados, mas é encontrada principalmente nos rins.
β2 pode ser encontrada no cérebro, músculo esquelético e glândula pineal.
Enquanto a isoforma β3 está presente nas células da retina, testículos, fígado e
pulmões (Shyjan et al., 1990; Hundal et al., 1993; Blanco & Mecer, 1998).
3.1.3 A subunidade regulatória γ
Para compreender um dos papéis funcionais propostos para a subunidade γ,
em relação à atividade da Na
+
K
+
-ATPase, deve-se considerar o estudo de Aw
& Jones (1985). Eles observaram, pelo método de captação de rubídio, em
hepatócitos que há relação entre a hipóxia e a diminuição da atividade da
Na
+
K
+
-ATPase. Estudos recentes mostraram também que mesmo em
organismos normais, livres de doença, ao menos um tecido, como o da medula
renal, deve funcionar sob as circunstâncias próximo a hipóxia (Brezis & Rosen,
1995). Um exemplo é o caso da maioria dos segmentos do néfron, onde a
reabsorção da água e a secreção de soluto, estão sob o controle da Na
+
K
+
-
ATPase. Como a contínua atividade desta enzima é crucial para a função
apropriada dos rins, a existência de um regulador reversível da afinidade do
ATP à Na
+
K
+
-ATPase, como a isoforma γ, permitiria o ajuste fino da atividade
da Na
+
K
+
-ATPase sob circunstâncias onde o ATP estivesse esgotado (Therien
& Blostein, 2000; Cortes et al., 2006).
3.2 MECANISMOS DE REGULAÇÃO DA Na
+
K
+
-ATPase
3.2.1 Eventos que envolvem a sinalização das ações hormonais
A regulação da atividade da Na
+
K
+
-ATPase ocorre por diferentes mecanismos
celulares e pode realizar-se pela modulação de um número de enzimas
presentes na membrana plasmática, ou por influenciar diretamente a atividade
da Na
+
K
+
-ATPase na superfície da célula (Blanco & Mecer, 1998).
Um conjunto de enzimas na membrana celular pode ser modificada por uma
mudança na taxa de síntese ou degradação de polipeptídeos da Na
+
K
+
-
ATPase, bem como pela mobilização de moléculas desta proteína de
membrana dos estoques endosomais da célula, exemplificando uma forma de
modulação da Na
+
K
+
-ATPase (Ewart & Klip, 1995).
Outras evidências sugerem que os mensageiros intracelulares podem também
afetar a atividade da Na
+
K
+
-ATPase através de um mecanismo importante de
regulação chamado de fosforilação. Assim, muitos hormônios que regulam a
atividade da Na
+
K
+
-ATPase o fazem através de mecanismos que modulam a
atividade de um grupo de cinases, fosfolipases e fosfatases (Frasen, 2005).
Dependendo do tecido, a ativação de cinases pode induzir um aumento ou uma
diminuição na atividade da Na
+
K
+
-ATPase. Os agentes que aumentam o 3`, 5`-
monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) intracelular conduzem à inibição
Na
+
K
+
-ATPase em MLV de artéria aorta (Borin, 1995; Therien & Blostein,
2000). A pesquisa de Borin (1995) forneceu diversas evidências de que, células
de MLV de aorta de ratos, estimuladas por diferentes agentes que aumentam o
AMPc, como 3,5 - monofosfato cíclico, 8 - bromoadenosina (8-BrcAMP –
análogo do AMPc), a combinação do forskolin (estimulador do AMPc) e do 3 -
isobutil-l-metilxantina (IBMX –inibidor da fosfodiesterase), e o isoproterenol,
causam um aumento do Na
+
intracelular mediado pela inibição da Na
+
K
+
-
ATPase. Assim, o aumento de AMPc ativa a proteína cinase A (PKA) , que por
sua vez, pode fosforilar a subunidade α da Na
+
K
+
-ATPase,
inibindo-a de forma
direta, ou estimular a fosfolipase A
2
e aumentar a liberação de produtos da via
do ácido araquidônico, como a Prostaglandina E
2
(PGE
2
), que também podem
inibir a atividade da Na
+
K
+
-ATPase. Funcionalmente, a inibição da Na
+
K
+
-
ATPase pode levar a uma aumento da resposta a agentes vasoconstrictores e
a um aumento do tônus vascular (Satoh et al., 1993; Borin, 1995; Blanco &
Mecer, 1998; Therien & Blostein, 2000; Chen et al., 2005).
A fosforilação da subunidade α da Na
+
K
+
-ATPase é reversível. Isto sugere que
um evento de fosforilação/desfosforilação pode dinamicamente regular a
atividade da Na
+
K
+
-ATPase (Therien & Blostein, 2000).
Além disso, a proteína cinase C (PKC) também regula a atividade da Na
+
K
+
-
ATPase, embora sua participação neste processo ainda seja controversa. Os
resultados das pesquisas demonstram informações contraditórias, mas sabe-se
que a função da PKC depende da isoforma estudada, da concentração de Ca
+2
e da espécie do animal. Contudo, Chen et al., (2005) verificaram que a PKC
inibe a atividade da Na
+
K
+
-ATPase no MLV de aortas de ratos, enquanto
Lahaye et al., (1998) observaram que no mesmo tecido e animal, a PKC
aumentava a atividade da Na
+
K
+
-ATPase através da fosforilação da
subunidade α (Beguin et al., 1994; Therien & Blostein, 2000). Além disso,
Beguin et al., (1996) mostraram em seus estudos, que em a PKC era capaz de
fosforilar a isoforma α2 e, de forma menos intensa, a isoforma α1, em tecidos
de rato.
Uma outra importante via de regulação da Na
+
K
+
-ATPase é a proteína cinase G
(PKG) que é conhecida, por exemplo, por estimular a Na
+
K
+
-ATPase nos rins e
no MLV, através do aumento do 3`, 5`- monofosfato cíclico de guanosina
(GMPc) (Therien & Blostein, 2000).
Por estas vias descritas anteriormente, muitos estímulos fisiológicos e
patológicos desencadeiam aumento ou diminuição da atividade da Na
+
K
+
-
ATPase. Portanto, mudanças nas condições do meio celular, como a
concentração iônica dos substratos (Na
+
, K
+
e ATP) e a secreção de
hormônios, podem alterar o transporte transmembrana e modular a atividade
da Na
+
K
+
-ATPase.
3.2.2 Regulação da Na
+
K
+
-ATPase através da concentração dos
substratos
Um importante regulador da atividade da Na
+
K
+
-ATPase é o íon Na
+
, que se
liga aos sítios intracelulares desta proteína. Pequenas mudanças na
concentração citoplasmática de Na
+
secundárias a ativação de vários
transportadores ou canais para Na
+
possuem um efeito intenso sobre a
atividade da Na
+
K
+
-ATPase. Muitos hormônios alteram a atividade desta
proteína através da mudança na sua afinidade ao Na
+
. Além dos efeitos diretos
sobre a Na
+
K
+
-ATPase, também são atribuídos aos íons Na
+
, mecanismos de
super-expressão e aumento da densidade destas proteínas na membrana
(Therien & Blostein, 2000; Aperia, 2001). Um exemplo pode ser observado nos
estudos de Liu & Songu-Mize (1998), onde uma elevação da concentração de
Na
+
intracelular, aumentou a expressão das isoformas α1 e α2, e foi
responsável pelo aumento da atividade da Na
+
K
+
-ATPase em cultura de MLV
de aorta.
Quanto aos íons K
+
, já em 1978, Webb & Bohr demonstraram que, após uma
contração induzida pela norepinefrina, em uma solução livre de K
+
, a Na
+
K
+
-
ATPase do MLV de artérias caudais aumentava sua atividade conforme KCl
era adicionado ao banho. Assim, eles sugeriram que o relaxamento do MLV,
derivado do aumento da atividade da Na
+
K
+
-ATPase, era resultante do
aumento do transporte eletrogênico de Na
+
e K
+
, e conseqüentemente, da
hiperpolarização. Então, este estudo propôs que o relaxamento induzido pelo
KCl poderia ser utilizado para avaliação da atividade funcional da Na
+
K
+
-
ATPase no MLV, tornando-se uma técnica amplamente utilizada. Outros
estudos demonstraram também que uma dieta rica em K
+
, em animais
espontaneamente hipertensos (SHR), associava-se com o aumento da
atividade da Na
+
K
+
-ATPase vascular e com a redução da pressão arterial (Lee
et al., 1992; Dolson et al., 1995).
Em relação ao ATP, sabe-se que variações na concentração e na afinidade da
Na
+
K
+
-ATPase a este nucleotídeo pode constituir um relevante mecanismo de
regulação da atividade desta proteína, principalmente em tecidos que
trabalham sob condições hipóxicas, como a medula renal (Therien & Blostein,
2000; Cortes et al., 2006).
Se por um lado a Na
+
K
+
-ATPase pode ser influenciada pela concentração dos
substratos descritos acima, por outro lado, sua regulação pode ocorrer também
a curto prazo (efeitos diretos sobre o seu comportamento e cinética) por uma
variedade de hormônios (Therien & Blostein, 2000). A aldosterona, as
catecolaminas (dopamina e norepinefrina) e a insulina são alguns dos
exemplos de hormônios reguladores. Os fatores derivados do endotélio, como
por exemplo, óxido nítrico, endotelina-1, angiotensina II e prostaglandinas
também são importantes moduladores da atividade da Na
+
K
+
-ATPase.
3.2.3 Hormônios na regulação da Na
+
K
+
-ATPase
A aldosterona, produzida pelo córtex da supra renal, possui efeitos genômicos
e não-genômicos sobre a Na
+
K
+
-ATPase. A curto prazo (efeitos não
genômicos), Alzamora et al. (2003), demonstraram que a aldosterona possui
um efeito transiente inibitório sobre a atividade desta enzima. Quando células
de MLV de aorta foram estimuladas pela aldosterona, nos primeiros 20
minutos, houve uma diminuição da atividade da Na
+
K
+
-ATPase, que foi inibida
por bloqueadores da PKC e não foi afetada quando bloqueadores da
transcrição ou translação foram utilizados. Sugerindo assim, que os efeitos
não-genômicos da aldosterona sobre a Na
+
K
+
-ATPase incluiriam o aumento do
Ca
+2
intracelular, a via do 1, 4, 5 – inositol trifosfato (IP
3
) e da PKC, além de
mecanismos envolvendo o sistema de microtúbulos. Um dos efeitos, a longo
prazo (genômicos), da aldosterona sobre a Na
+
K
+
-ATPase é o aumento da sua
expressão em MLV de aorta. Oguchi et al. (1993) foram os primeiros a
demonstrar, por exemplo, que α1, mas não α2 e α3, está super-expressada em
cultura de MLV de aortas estimulada pela aldosterona (Oguchi et al., 1993;
Michea et al., 1998; Therien & Blostein, 2000).
Ao contrário, a dopamina, uma catecolamina sintetizada nos túbulos proximais
dos rins, inibe a atividade da Na
+
K
+
-ATPase
no MLV de artérias aorta (Rashed
& Songu-Mize, 1996) e da cauda de ratos (Rashed & Songu-Mize, 1995). Nos
rins, ela representa um importante mecanismo fisiológico de regulação da
reabsorção de sal durante o aumento da ingestão de Na
+
e envolve vias
dependentes de PKC (Therien & Blostein, 2000).
Já as catecolaminas adrenérgicas, como a norepinefrina, possuem ações
contraditórias e dependentes do tecido estudado. Sabe-se contudo, que atuam
por dois mecanismos: efeito direto sobre a Na
+
K
+
-ATPase; efeito via
estimulação α e β-adrenérgica, através de receptores na membrana celular.
Nos vasos sanguíneos, já em 1984, Vanhoutte & Lorenz descreveram o efeito
inibidor da norepinefrina sobre a Na
+
K
+
-ATPase
e seu papel na contratilidade
vascular.
A insulina é um hormônio peptídico que regula os estoques de glicose e possui
uma importante ação na homeostase do K
+
, através da modulação da Na
+
K
+
-
ATPase. Ela é capaz de ativar a Na
+
K
+
-ATPase em aorta de coelhos, de forma
independente do NO derivado do endotélio e provavelmente, esta ativação é
mediada pelo aumento da atividade da PKC (Gupta et al., 1996; Therien &
Blostein, 2000). Davel et al. (2000) estudaram a atividade funcional da Na
+
K
+
-
ATPase
no leito caudal da ratos diabéticos e verificaram que a diminuição da
insulina diminui a atividade desta proteína, o que leva a um aumento da
reatividade vascular e da pressão arterial.
Além destes hormônios envolvidos na regulação da função da Na
+
K
+
-ATPase,
os fatores vasoativos derivados do endotélio, como descrito a seguir, também
assumem um importante papel na modulação da atividade funcional da Na
+
K
+
-
ATPase.
3.2.4 Fatores vasoativos derivados do endotélio na regulação da Na
+
K
+
-
ATPase
Sabe-se que o óxido nítrico (NO) é um fator de relaxamento do MLV, com
meia-vida curta, produzido por muitas células a partir do aminoácido L-arginina
que é metabolizado em NO e L-citrulina. A enzima óxido nítrico sintase cataliza
esta reação e possui co-fatores como a nicotinamida adenina dinucleotídeo
fosfato (forma reduzida da NADPH), tetrahidrobiopterina (BH
4
), flavina adenina
de nucleotídeo (FAD) e a flavina mononucleotídeo (FMN) (Furchgott &
Zawadzki, 1980; Palmer et al., 1987; Angus & Cocks, 1989; Moncada et al.,
1991; Behrendt & Ganz, 2002). Vários estímulos são capazes de induzir a
liberação de NO pelo endotélio. Dentre eles, podem ser citados, por exemplo, o
estresse de cisalhamento promovido pelo atrito entre o fluxo sanguíneo e a
parede vascular (“shear stress”), estiramento vascular, agregação plaquetária,
serotonina (5-HT), ACh, bradicinina, trombina, substância P, ADP, endotelina-1
e angiotensina II (Moncada et al., 1991; Songu-Mize et al., 2001; Behrendt &
Ganz, 2002). Ele se difunde para o MLV e ativa a enzima guanilato ciclase
solúvel, que catalisa a reação de transformação do 5`-trifosfato de guanosina
(GTP) em GMPc. O aumento de GMPc ativa a PKG que é responsável pela
fosforilação de várias proteínas e pelo relaxamento do MLV, através da
diminuição da concentração intracelular de Ca
+2
(Rapopport & Murad, 1984;
Ignarro & Kadowitz, 1985). Sabe-se que a remoção do endotélio inibe a
atividade da Na
+
K
+
-ATPase. Além disso, o papel do endotélio intacto na
manutenção da atividade basal da Na
+
K
+
-ATPase
é inibido por um inibidor
“não-seletivo” da NOS (L-NAME) (Rossoni et al., 2003; Dos Santos et al., 2003;
Chen et al., 2005). Portanto, o NO é considerado um estimulador da atividade
da Na
+
K
+
-ATPase. Um dos mecanismos propostos para o NO ativar a Na
+
K
+
-
ATPase e promover o relaxamento do MLV é o aumento dos níveis
intracelulares de GMPc (Rapoport et al., 1985). Porém, Gupta et al., (1994)
propuseram que o mecanismo de ativação da Na
+
K
+
-ATPase
ocorreria por uma
independente do aumento do GMPc. Como no MLV, a atividade da Na
+
K
+
-
ATPase é estimulada por agonistas que aumentam a concentração intracelular
de Na
+
, o trocador Na
+
H
+
, o principal responsável pelo influxo de Na
+
nos vasos
sanguíneos, poderia participar da regulação da atividade da Na
+
K
+
-ATPase.
Assim, as hipóteses para o mecanismo de ativação da Na
+
K
+
-ATPase seria o
próprio NO ativá-la, ou a
estimulação do trocador Na
+
H
+
pelo NO, o que
aumenta a concentração intracelular de Na
+
, ativando a Na
+
K
+
-ATPase,
promovendo assim, relaxamento vascular (Ando et al., 1991; Gupta et al.,
1994).
Dentre os fatores derivados do endotélio, a endotelina é um polipeptídeo,
sintetizado pelas células endoteliais que possui, principalmente, ação
vasoconstritora. Além disso, a endotelina promove retenção de sódio e água,
ativação do SNS e do SRAA, exerce estímulo proliferativo sobre os músculos
lisos, miócitos e fibroblastos. Sob condições fisiológicas, sua concentração
plasmática é baixa (Yanagisawa et al., 1988; Attina, 2005). Sua liberação é
estimulada por muitos fatores, tais como o “shear stress”, hipóxia, epinefrina,
Angiotensina II, cortisol, trombina, citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1 e IL-
2) e o fatores de crescimento (Haynes & Webb, 1998). Três isopeptídeos da
endotelina já foram identificados, a endotelina-1, -2, -3. Suas ações são
realizadas através da interação com receptores ET
A
e ET
B
. A estimulação
destes receptores aumenta a concentração de cálcio intracelular, produzindo
vasoconstrição. A endotelina-1 liga-se aos receptores ET
A
que são
expressados preferencialmente nos MLV produzindo contração. Já os
receptores ET
B,
podem se ligar a endotelina-1, -2, e -3. Eles são expressados
no endotélio vascular, e quando ativados, estimulam a liberação de NO e
prostaciclinas pelo endotélio (Masaki & Vane, 1994; Pinet, 2004). Os
receptores de endotelina estão acoplados à fosfolipase C, via proteína G
regulatória, e quando ativados, aumentam a formação de 2º mensageiros como
IP
3
e diacilglicerol (DAG), e ativam a PKC (Takuwa et al., 1990). Então, Gupta
et al. (1991) observaram em seus experimentos que a endotelina estimula a
atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína em aorta de coelhos.
Sugerindo que esta estimulação era resultado do aumento da atividade do
trocador Na
+
H
+
e do co-transporte Na
+
K
+
Cl
-
, mediada pela PKC.
A angiotensina II é um octapeptídeo, biologicamente ativo, integrante do SRAA,
produzido por uma série de reações químicas ocorridas na circulação. Seu
efeito vasoconstritor é possível via os receptores AT
1
e AT
2
, presentes no MLV.
As alterações da permeabilidade ao Na
+
parecem estar envolvidas na
vasoconstrição induzida pela angiotensina II. O aumento da concentração de
Na
+
no banho, com anéis de aorta, potencializa a contração induzida pela
angiotensina II nestes vasos. E a diminuição da concentração de Na
+
no banho
que perfunde artérias caudais, diminui a contração induzida pela angiotensina II
(Moore & Khairallah, 1979). Já em 1982, Brock et al. relatavam que havia um
aumento da permeabilidade ao Na
+
e um aumento da atividade funcional da
Na
+
K
+
-ATPase, em cultura de MLV de aorta estimulada por angiotensina II.
Mas os mecanismos implicados na ação da angiotensina II sobre o MLV ainda
não podiam ser elucidados. Em 2004, Isenovic et al. propuseram que a
angiotensina II, estimula a atividade da Na
+
K
+
-ATPase do MLV, através dos
receptores AT
1
/AT
2
, via sinalização do IP3 e da proteína cinase serina/treonina
(p42/44MAPK), possibilitando uma “up-regulation” da transcrição do gene da
subunidade catalítica α1 da Na
+
K
+
-ATPase. Além disso, propuseram que a
sustentação do efeito constritor da Angiotensina II sobre o MLV via Na
+
K
+
-
ATPase, envolveria o trocador Na
+
/H
+
. Como a angiotensina II é um fator
tecidual com produção autócrina/parácrina, que pode ter seus níveis alterados
na presença de diversas doenças, a regulação da Na
+
K
+
-ATPase pela
angiotensina II assume um importância fisiológica na manutenção da
homeostase, por exemplo através do controle do tônus vascular (Brock et al.,
1982; Isenovic et al., 2004).
As prostaglandinas, derivadas do endotélio, também participam da regulação
da atividade da Na
+
K
+
-ATPase. Elas podem induzir a um aumento ou a uma
diminuição da atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase, de acordo com o tecido, a
espécie animal estudada e o tipo de prostaglandina. PGE
2
, por exemplo, age
estimulando a atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase e induzindo um aumento
no relaxamento em artérias coronárias de grande e pequeno calibre em porcos
(Fukuda et al., 1992). Lockette et al. já em 1980 demonstraram que a
vasodilatação induzida pelas prostaglandinas era causada pela ativação da
Na
+
K
+
-ATPase. Então, em suas pesquisas com anéis de artéria caudal, em
solução livre de K
+
, eles observaram que a prostaglandina A
1
(PGA
1
), PGE
2
e
prostaglandina F
2α
(PGF
2α
) aumentavam a magnitude do relaxamento do MLV.
O relaxamento do MLV induzido pela PGE
2
foi inibido quando adicionou-se
ouabaína ao banho e a indometacina reduziu o relaxamento 30% em relação
ao grupo controle (Lockette et al., 1980). Ao contrário, Satoh & Karaki em 1988,
sugeriram que a contração da aorta induzida pela ouabaína e pela solução livre
de K
+
, não se devia somente a despolarização da membrana e ao trocador
Na
+
/Ca
+2
, mas também à liberação de prostaglandinas.
3.2.5 Regulação da Na
+
K
+
-ATPase através dos seus inibidores endógenos
Os glicosídios digitálicos são estudados a mais de dois séculos para o
tratamento da ICC. Sua função clássica é a inibição da Na
+
K
+
-ATPase que
afeta vários tipos de células e regula diversos processos fisiológicos e
patológicos (Blaustein, 1993; Schoner, 2002). Os bufodienolídeos,
cardenolídeos e a ouabaína (OUA) são exemplos de glicosídeos cardiotônicos
sintetizados por plantas e utilizados, por egípcios, chineses, romanos e
algumas tribos africanas para o controle de pragas, envenenamentos e
propostas terapêuticas. Nas décadas de 60, 70 e 80 várias pesquisas foram
realizadas com o objetivo de estudar a ação e a origem de uma substância,
semelhante a OUA, presente no plasma sanguíneo de animais submetidos à
expansão aguda de volume, que ao ser colocada em contato com o plasma de
animais normotensos, reduzia a atividade da Na
+
K
+
-ATPase nos mesmos
(Buckalew et al., 1970; Overbeck et al., 1976; Hamlyn et al., 1982). Mais tarde,
foi demonstrado que o fator endógeno digitalis-like, presente no plasma de
humanos, possuía características bioquímicas, imunológicas e fisiológicas
semelhantes as da OUA (Ludens et al., 1991; Mathews et al., 1991; Bova et al.,
1991). A OUA desde então é descrita como uma substância endógena
presente no plasma de vários mamíferos, inclusive em humanos, produzida
pelo córtex da supra-renal, pela região hipotalâmica e pela região anteroventral
do terceiro ventrículo (Pamnani et al., 1981; Songu-Mize et al., 1982; Morgan et
al., 1985; Hamlyn et al., 1991; Schoner, 2000).
A OUA é descrita por inibir a atividade da Na
+
K
+
-ATPase (Skou & Esmann,
1992; Schoner, 2002) e assim, aumentar o tônus vascular. Logo, é importante
saber os mecanismos pelos quais a OUA interfere no funcionamento da Na
+
K
+
-
ATPase. No MLV, a ouabaína plasmática liga-se à subunidade α da Na
+
K
+
-
ATPase inibindo sua atividade (Fedorova & Bagrov, 1997), elevando a
concentração intracelular de Na
+
([Na
+
]
cit
). Logo, a membrana é despolarizada e
o trocador Na
+
/Ca
+2
reduz sua atividade, aumentando a concentração de Ca
+2
no citosol ([Ca
+2
]
cit
) (Blaustein, 1977; Blaustein, 1993; Nishimura, 2006). O
retículo sarcoplasmático (RS) então, seqüestra rapidamente boa parte deste
Ca
+2
, permitindo que uma maior quantidade da Ca
+2
seja estocada e possa ser
mobilizada para a contração da célula. Estas etapas são verificadas nas
concentrações de ouabaína de 1-1000 µM e induzem a contração do MLV e
aumento da reatividade vascular (Blaustein, 1993; Arnon et al.; 2000). Porém,
um grande enigma é que em concentrações nanomolares de ouabaína (1-100
nM) também há aumento da contração do MLV (Weiss et al., 1993; Vassallo et
al., 1997), indução à hipertensão (Rossoni et al.; 2001) em ratos e outros
efeitos, mas com pequena ou nenhuma modificação da ([Na
+
]
cit
(Levi et al.,
1994). Recentes trabalhos têm contribuído para esclarecer este processo. Por
exemplo, foram demostradas regiões na membrana plasmática, próximas ao
retículo sarcoplasmático (RS) e ao trocador Na
+
/Ca
+2
, que apresentavam alta
afinidade à OUA. Os chamados “microdomínios da membrana plasmática”,
descritos no MLV de artérias de ratos (Juhaszova & Blaustein, 1997) e em
outros tipos de células. Eles poderiam mediar os efeitos cardiotônicos das
baixas concentrações de OUA (Han et al., 2006). Nestes microdomínios, foram
encontradas, em grande quantidade, as subunidades α2 e α3 da Na
+
K
+
-
ATPase, que possuem alta afinidade à OUA (Juhaszova & Blaustein, 1997).
Além disso, verificou-se que no pequeno compartimento entre a membrana
plasmática e a membrana do RS juncional uma elevada concentração de Na
+
não correspondia a uma elevação da [Na
+
]
cit
(Wendt-Gallitelli et al., 1993).
Varias evidências também foram demonstradas de que a entrada e a saída de
Ca
+2
, bem como a modulação dos estoques do RS, era realizada nesta região
(Van Breemen et al., 1995). Estas unidades funcionais seriam análogas às
tríades e as diades do músculo esquelético e cardíaco, e foram chamadas de
plasmerosomes (Blaustein & Lederer, 1999). Contudo, a hipótese mais aceita é
que doses nanomolares de OUA, inibiriam as subunidades α2 e α3 da Na
+
K
+
-
ATPase e, conseqüentemente, aumentariam concentração de Na
+
nos
plasmerosomes, sem ocorrer aumento da [Na
+
]
cit
. Assim, a extrusão de Ca
+2
pelo trocador Na
+
/Ca
+2
estaria inibida, aumentando a concentração de Ca
+2
local. O aumento de Ca
+2
nos plasmerosomes, poderia aumentar a
concentração de Ca
+2
global através da sensibilização dos receptores IP
3
ou
pelo aumento do conteúdo de Ca
+2
no RS (Arnon et al., 2000). Portanto, a
ouabaína tanto em baixas quanto em elevadas concentrações, pode regular a
atividade da Na
+
K
+
-ATPase e auxiliar no controle da concentração iônica de
Na
+
e Ca
+2
, participando do aumento da resistência periférica, do controle do
tônus vascular e do fluxo sanguíneo (Juhaszova & Blaustein, 1997; Arnon et
al., 2000).
Trabalhos demonstram que a OUA pode aumentar o tônus simpático ou
sensibilizar o leito vascular, aumentando a sua responsividade a substâncias
vasoconstritoras como a noradrenalina, angiotensina II e fenilefrina (Marin et
al., 1988; Vassallo et al., 1997; Schoner, 2002). Assim, ela pode estar
associada ao desenvolvimento de doenças como HAS, INF e ICC, que cursam
com a alteração da concentração plasmática destas substâncias. Além disso,
são considerados como principais estímulos para a liberação de OUA: 1)
aumento da concentração plasmática de Na
+
; e a 2) expansão de volume
extracelular (Blaustein, 1993; Schoner, 2002), sendo que ambos, são
facilmente encontrados nos pacientes com ICC. Portanto, não pode ser
considerado surpresa o fato de Gottlieb et al. (1992) terem encontrado
concentração elevada de OUA no plasma de humanos com ICC. A função da
ouabaína nos indivíduos com ICC pode ser entendida com o objetivo de: 1)
manter o estado inotrópico do miocárdio, através da inibição da Na
+
K
+
-ATPase
do miócito; 2) promover a natriurese, através da inibição da Na
+
K
+
-ATPase nos
túbulos renais; 3) promover vasoconstrição, mantendo ou aumentando a PA,
através da inibição da Na
+
K
+
-ATPase
no MLV. Estas possíveis conseqüências
da inibição da Na
+
K
+
-ATPase explicam a importância dos glicosídios cardíacos
em pacientes com ICC e sugerem que a deficiência de ouabaína endógena
pode exacerbar a doença (Gottieb et al., 1992).
A OUA é descrita como um hormônio capaz de inibir a atividade da Na
+
K
+
-
ATPase (Blaustein, 1993). Considerando que alterações na atividade funcional
da Na
+
K
+
-ATPase envolvidas com a modificação da reatividade vascular têm
sido descritas na literatura em doenças do sistema cardiovascular, como a
hipertensão arterial e o diabetes (Rose & Valdes, 1994; Davel et al., 2000;
Rossoni et al. 2002; Xavier et al., 2004; Callera et al., 2004), é possível, que as
alterações na reatividade vascular após INF descritas por Pereira et al. (2005)
também envolvam esta enzima. Porém, nenhum estudo avaliou a participação
da Na
+
K
+
-ATPase na alteração da reatividade vascular em aortas de animais
infartados. Então, o propósito deste estudo foi realizar uma análise comparativa
entre ratas com e sem insuficiência cardíaca, após trinta dias de infarto do
miocárdio, em relação à atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase.
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GERAL
Estudar a atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína em
anéis de aorta de ratas após o infarto do miocárdio, com mesma área de
cicatriz, com e sem sinais de insuficiência cardíaca.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar as diferenças nos dados ponderais das ratas com mesma área
de cicatriz, com e sem sinais de insuficiência cardíaca, decorridos 30 dias
do infarto do miocárdio;
Verificar a atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína nas
mudanças de reatividade vascular após o infarto do miocárdio;
Comparar a atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína em
ratas, com área de infarto semelhante, com e sem sinais de insuficiência
cardíaca;
Verificar a participação do endotélio vascular sobre a atividade funcional da
Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína nas artérias aorta de ratas com e sem
sinais insuficiência cardíaca, após o infarto do miocárdio;
Analisar a participação do NO sobre a atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase
sensível à ouabaína nas artérias aorta de ratas com e sem sinais
insuficiência cardíaca, após o infarto do miocárdio.
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS
Foram utilizadas ratas Wistar, de 8 ± 1 semanas de idade, pesando
entre 220 e 240 g, cedidas pelo biotério da Universidade Federal do Espírito
Santo – UFES, mantidas em caixas de polipropileno, com controle de
claro/escuro (12/12 horas), com livre acesso à água e à ração.
Trinta dias após o INF, os animais foram distribuídos em 3 grupos:
Cirurgia fictícia de Infarto (Sham), n= 13
Infartadas (Inf), n= 11
Infartadas que desenvolveram sinais de insuficiência cardíaca (Icc), n= 7
Todos os animais foram necropsiados, tendo seus corações e pulmões
coletados para análise ponderal. As ratas com trinta dias após o infarto do
miocárdio foram consideradas integrantes do grupo com insuficiência cardíaca
considerando 2 critérios: 1) a razão entre o peso dos pulmões e o peso
corporal dos animais Icc apresentar-se maior que a mesma razão dos animais
Sham, mais duas vezes o desvio padrão (Icc= PP/PC
Icc
> PP/PC
Sham
+ 2DP)
(Francis et al., 2001), sugerindo aumento do volume de fluido na vasculatura
pulmonar; 2) à razão entre o ventrículo direito e o peso corporal apresentar-se
maior que a mesma razão nos animais Sham, mais duas vezes o desvio
padrão (ICC= VD/PC
ICC
> VD/PC
Sham
+ 2DP) (Davidoff et al., 2004).
Em cada grupo foram realizados experimentos com anéis de aorta com
endotélio íntegro (E
+
), com endotélio removido mecanicamente (E
-
) e com
endotélio íntegro mais adição de um inibidor “não-seletivo” da sintase do óxido
nítrico (NOS) N
(W)
-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME= 100 µM). A distribuição
dos grupos pode ser observada no organograma a seguir (Figura 1):
30 dias após o
INF
Sham Infartadas
E+
E-
L-NAME
Inf Icc
E+
E-
L-NAME
E+
E-
L-NAME
Figura 1: Organograma da divisão dos grupos experimentais trinta dias após o
infarto do miocárdio. Cirurgia fictícia de infarto do miocárdio (Sham) – cor
branca; Ratas infartadas sem sinais de insuficiência (Inf) - cor vermelha; Ratas
infartadas com sinais de insuficiência (Icc) – cor laranja;
anéis de aorta com
endotélio íntegro (E+); com endotélio removido mecanicamente (E-); e com
endotélio íntegro mais adição de um inibidor “não-seletivo” da sintase do óxido
nítrico (NOS) N(
W
)-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME= 100 µM).
5.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
5.2.1 Infarto agudo do miocárdio
Para indução do infarto, os animais foram anestesiados e mantidos sob
anestesia com éter etílico. Em seguida foi realizada uma toracotomia do lado
esquerdo entre o terceiro e quarto espaço intercostal. O músculo peitoral foi
separado e as costelas expostas. O coração foi gentilmente exteriorizado e a
artéria coronariana descendente anterior esquerda ligada aproximadamente a 3
mm distal à sua origem, utilizando fio mononylon 6.0 (Pfeffer et al., 1979)
(Figura 2 A e B). Após o coração ter sido colocado no lugar e o tórax fechado,
os animais retornavam à respiração normal. O procedimento cirúrgico do
infarto, após abertura do tórax, durou no máximo 40 segundos. Através de tal
procedimento visamos obter infartos do miocárdio transmurais, caracterizados
por necrose isquêmica envolvendo toda ou quase toda a espessura da parede
ventricular.
A)
Figura 2: Procedimento para a oclusão da artéria coronária descendente
anterior esquerda. A) Toracotomia entre o 3º e 4º espaços intercostais; B)
Exteriorização do coração e amarradura da artéria coronária descendente
anterior esquerda.
5.2.2 Avaliação dos dados ponderais
Trinta dias após o infarto, as ratas foram pesadas, anestesiadas com uretana
na dose de 1,2 g/Kg, i. p., e em seguida, eutanaziadas com exanguinação. A
aorta torácica descendente foi gentilmente retirada para realização do protocolo
de reatividade vascular que será descrito no tópico 3.2.3. O coração e os
pulmões foram removidos (Figura 3) e imersos em solução salina (NaCl, 0,9 %)
para limpeza tecidual.
B)
Figura 3: Avaliação dos dados ponderais - Coração e pulmões removidos para
pesagem. Órgãos dispostos do lado esquerdo da figura referem-se a animal
trinta dias após a cirurgia fictícia para indução ao infarto do miocárdio (Sham).
Órgãos do lado direito, representam animal trinta dias após cirurgia para
indução ao infarto do miocárdio (Inf).
Após secagem em papel de filtro, foi realizada a mensuração do peso total dos
pulmões e este valor foi normalizado pelo peso corporal do animal. Para
avaliação da área de infarto e hipertrofia cardíaca, a presença do infarto foi
inicialmente determinada pela observação grosseira do coração. Após sua
remoção, os ventrículos foram separados e pesados e seus pesos úmidos
eram normalizados pelo respectivo peso corporal para estimar a hipertrofia
cardíaca. O tecido infartado foi dissecado do músculo remanescente sob
visualização macroscópica. Os contornos de cada fatia foram delineados sobre
papel milimetrado e as áreas medidas por contagem de pontos, para avaliação
da área correspondente em mm
2
(Mill et al., 1990) (Figura 4). A borda do infarto
é claramente delineada uma vez que o infarto transmural resulta em um tecido
fino e fibroso (Kim et al., 2002). A área de infarto foi expressa como
porcentagem da área do ventrículo esquerdo remanescente. O septo
interventricular foi sempre considerado parte do ventrículo esquerdo. Corações
com área de infarto menores que 20% foram descartados do estudo.
25 mm
2
Figura 4: Avaliação da área de infarto em papel milimetrado. I representa a
área de infarto e VE representa o tecido do miocárdio remanescente. As bordas
das fatias eram contornadas em papel milimetrado e as medidas realizadas por
contagem de pontos, com área calculada em mm
2
. Cada quadrado pequeno
equivale a 1 mm
2
e cada quadrado grande delimita uma área de 25 mm
2
.
5.2.3 Preparação dos anéis isolados de aorta e avaliação da reatividade
vascular “in vitro”
Trinta dias após a cirurgia de infarto, a aorta torácica descendente foi
gentilmente retirada e rapidamente colocada em uma placa de Petri imersa em
solução de Krebs-Henseleit (composição em mmol/L: NaCl 118; KCl 4,7; CaCl
2
.2H
2
O 2,5; MgSO
4
.7H
2
O 1,2; KH
2
PO
4
1,17; NaHCO
3
25; EDTA 0,01 e glicose
11), gaseificada com mistura carbogênica contendo 5% de CO
2
e 95% de O
2
,
pH = 7,4 e temperatura de 36,5 ºC . Então, foi removido o tecido conjuntivo e
adiposo adjacente à artéria e o vaso foi cortado em anéis de 4 a 5 mm de
comprimento. Para a obtenção do registro de tensão isométrica, cada anel
vascular foi colocado em um banho, de acordo com o método descrito por
Marin et al. (1998). As cubas continham 5 mL de solução de Krebs-Henseleit,
aquecida a 36,5º C, continuamente gaseificada com mistura carbogênica,
mantendo o pH estável em 7,4. Os anéis isolados foram montados em uma
preparação com suportes de acrílico fixadas em cubas de vidro. Uma haste de
aço inoxidável estava conectada ao suporte de acrílico, preso ao banho, e a
outra haste conectada verticalmente ao transdutor de tensão, os anéis foram
montados de forma que as duas hastes metálicas estivessem paralelas na luz
do vaso, sendo assim, qualquer alteração do diâmetro do vaso era captada
pelo transdutor de força (modelo FT 03, Grass Instrument Co) acoplado a um
sistema de aquisição de dados (MP 100, Biopac Systems, Inc. AS) (Figura 5).
Figura 5: Preparação dos anéis isolados de aorta para avaliação da
reatividade vascular “in vitro”. Sistema de aquisição de dados Biopac Systems.
Uma tensão de repouso de 1 g foi aplicada aos anéis, eles foram lavados
quatro vezes e a tensão foi ajustada caso necessário a cada 15 minutos,
durante um período de 45 minutos de estabilização (Figura 6A).
Após a estabilização, foi adicionado cloreto de potássio (KCl) 75 mM ao banho
para verificar a atividade contrátil do músculo liso vascular induzida por
despolarização e assim, avaliar a viabilidade das artérias. Após atingirem uma
variação de 1 grama de força, os anéis foram lavados três vezes com solução
Krebs. Os anéis que não contraíram um grama foram descartados. 30 minutos
após a lavagem, uma nova concentração de KCl 75 mM foi adicionada ao
banho e aguardados aproximadamente 30 minutos até que se atingisse um
platô no registro da contração. Após o platô, os anéis foram novamente lavados
três vezes e submetidos a um período de 30 minutos de estabilização, caso a
tensão do anel não retornasse ao basal, ele era submetido a uma nova
lavagem. Foi realizada então, uma avaliação da integridade funcional do
Transdutor de força
Haste metálica
Haste metálica fixa
Suporte de acrílico
Cuba de vidro
Anel de aorta
Computador
Biopac Systems
Amplificador
endotélio. Os anéis foram pré-contraídos com fenilefrina (Fe) 10
-4
M
ou o
quanto fosse necessário para se atingir 50-75% da contração máxima ao
segundo KCl. Ao final da contração, quando o platô fosse atingido, uma dose
única de acetilcolina (ACh) 10
-3
M era adicionada (Figura 6, B, C, D, E, F, G, H,
I, J, L). Os anéis que relaxavam menos que 90% do platô eram descartados.
Os anéis sem endotélio relaxaram no máximo 10% ou até contraíram.
Figura 6: Registro com curvas representando o teste da viabilidade do
músculo liso vascular com KCl e avaliação da integridade funcional do
endotélio. Avaliação da viabilidade do músculo liso vascular com KCl: A)
Período de estabilização inicial (45 min permanecendo na tensão de 1g); B)
Adição de KCl (75 mM) ao banho; C) Lavagem dos anéis com solução Krebs-
Henseleit; D) Período de estabilização (30 min); E) Adição de KCl (75 mM) ao
banho; F) Platô da contração induzida pelo KCl (75 mM); G) Lavagem dos
anéis com solução Krebs-Henseleit; H) Período de estabilização (30 min).
Avaliação da integridade funcional do endotélio: I) Pré-contração com
fenilefrina (Fe) 10
-4
M; J) Platô da contração induzida pela Fe; L) Adição de
acetilcolina (ACh) 10
-3
M. O tempo foi registrado em minutos, eixo horizontal
(intervalo de 80 min) e a força em gramas (g), eixo vertical.
A
B
C
D
E
F
G
I
H
J
L
5.2.3.1 Estudo da atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à
ouabaína em aortas de ratas com e sem sinais de insuficiência cardíaca
após o infarto do miocárdio
Para a realização da avaliação funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à
ouabaína foi utilizada a técnica de relaxamento induzido pelo potássio,
previamente descrita por Webb & Bohr (1978). Após o teste do endotélio
descrito no item 5.2.3, a preparação foi perfundida por 30 minutos com solução
Krebs sem potássio (para a obtenção da solução livre de potássio, o KH
2
PO
4
foi substituído por NaH
2
PO
4
). Em seguida foi realizada uma pré-contração com
fenilefrina (10
-4
M). Quando o platô foi atingido, KCl (1, 2, 5 e 10 mM) foi
adicionado em intervalos de dois minutos e meio. Foi analisada a resposta de
relaxamento do vaso em presença das concentrações crescentes e
cumulativas de potássio, sendo que este relaxamento é atribuído à ativação da
Na
+
K
+
-ATPase. Em seguida, as preparações foram incubadas agudamente
com solução livre de potássio e com ouabaína (OUA) 10
-4
M por 30 minutos.
Novamente foi repetida a adição KCl (1, 2, 5 e 10 mM) ao banho, com o
objetivo de avaliar a resposta de relaxamento do vaso ao KCl na presença de
um inibidor da Na
+
K
+
-ATPase (Figura 7, A, B, C, D, E, F, G, H, I).
Figura 7: Registro com curvas representando avaliação da atividade funcional
da Na
+
K
+-
ATPase sensível à OUA em aortas de ratas com e sem sinais de
insuficiência cardíaca após o infarto do miocárdio. A) Perfusão por 30 minutos
com solução Krebs sem potássio; B) Pré-contração com fenilefrina (Fe) 10
-4
M;
C) Platô da contração induzida pela Fe; D) Primeira curva de KCl (adição de 1,
A
B
C
D
F
E
G
H
I
2, 5 e 10 mM ao banho em intervalos de 2' 30''); E) Lavagem com solução
Krebs sem potássio; F) Adição de OUA 10
-4
M e estabilização por 30 minutos;
G) Pré-contração com Fe 10
-4
M; H) Platô da contração induzida pela Fe; I)
Segunda curva de KCl (adição de 1, 2, 5 e 10 mM ao banho em intervalos de 2'
30''). O tempo foi registrado em minutos, eixo horizontal (intervalo de 80 min) e
a força em gramas (g), eixo vertical.
5.2.3.1.1 Modulação do endotélio sobre a resposta de relaxamento ao KCl
e sobre a capacidade da ouabaína de inibir a atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase
Com a finalidade de avaliar a capacidade do endotélio de modular a resposta
de relaxamento vascular induzida pelo KCl foram utilizados nos protocolos
experimentais anéis de aorta com endotélio íntegro e sem endotélio. As células
endoteliais foram removidas mecanicamente através do uso de fios metálicos.
Estes foram inseridos na luz do vaso e friccionados à sua íntima, ocasionando
lesão do endotélio.
5.2.3.1.2 Efeito do bloqueio com L-NAME sobre a atividade
funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína
Com a finalidade de estudar a participação do óxido nítrico na
modulação endotelial da atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à
ouabaína, os anéis foram incubados com L-NAME (100 µM).
Após o período de estabilização em solução normal de Krebs-Henseleit,
a preparação foi perfundida por mais 30 minutos com solução Krebs sem
potássio e L-NAME (100 µM). Em seguida foi realizada uma pré-contração com
fenilefrina (10
-4
M) em solução livre de potássio. Quando o platô foi atingido,
KCl (1, 2, 5 e 10 mM) foi adicionado em intervalos de dois minutos e meio. Em
seguida, as preparações foram incubadas agudamente com solução livre de
potássio, com ouabaína 10
-4
M e com L-NAME (100 µM) por 30 minutos e,
novamente repetida a curva ao KCl, como descrita anteriormente.
5.3 EXPRESSÃO DOS DADOS E ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média (média
± EPM). O n corresponde ao número de animais utilizados. A resposta de
relaxamento ao KCl dos anéis vasculares foram expressas como a
porcentagem de contração residual à fenilefrina. As curvas de relaxamento ao
KCl foram construídas através da análise de regressão não-linear das curvas
concentração-resposta obtidas. Para tal foi utilizado o programa GraphPad
Prism Software (San Diego, CA, USA).
Para comparar a atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína
entre os grupos estudados foi realizada ANOVA duas vias, com post hoc de
Bonferroni, entre as curvas de relaxamento induzido pelo KCl. Assim, analisou-
se tanto o relaxamento induzido por doses cumulativas de KCl (1, 2, 5, 10 mM),
quanto a capacidade da ouabaína de inibir este relaxamento. A análise
estatística dos demais dados foi realizada por análise de variância, ANOVA
uma via, seguida de post hoc de Tukey. O teste t não pareado também foi
utilizado. Os valores foram considerados significantes quando o P< 0,05 era
obtido.
5.4 FÁRMACOS E REAGENTES
Acetilcolina, cloridrato (Sigma)
Bicarbonato de sódio (Merck)
Cloreto de cálcio (Merck)
Cloreto de potássio (Merck)
Cloreto de sódio (Merck)
EDTA (Hoescht)
Éter etílico (Reagen)
Fosfato de potássio (Merck)
Fosfato de sódio (Merck)
Glicose (Reagen)
L-Fenilefrina, hidrocloridrato (Sigma)
N
(W)
-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), dicloridrato (Sigma)
Ouabaína, octahidrato (Sigma)
Sulfato de magnésio heptahidratado (Merck)
Uretana (Sigma)
Todas as soluções foram preparadas com água deionizada e mantidas no
congelador a -20º C.
6. RESULTADOS
6.1 DADOS PONDERAIS
Trinta dias após a oclusão coronariana, 39% (N= 7) das ratas desenvolveram
sinais de ICC. A área de infarto e a razão entre o ventrículo esquerdo e o peso
corporal (VE/PC) não foram diferentes entre os grupos de ratas Inf e Icc
quando foi realizado Teste t Student`s não pareado (Figura 8 – B, E; Tabela 1).
Entretanto, as razões entre o VD/PC, bem como o PP/PC estavam aumentadas
no grupo Icc quando o mesmo foi comparado com os grupos Sham e Inf
(Figura 8 C, D; Tabela 1). Não houve diferença significante no peso corporal
entre os grupos estudados (Figura 8 A; Tabela 1).
Tabela 1: Dados ponderais dos animais 30 dias após o infarto.
Sham
(n= 13)
Inf
(n= 11)
Icc
(n= 7)
PC (g) 236 ± 4 236 ± 5 235 ± 5
VE/PC (mg/g) 2,12 ± 0,05 2,24 ± 0,06 2,21 ± 0,07
VD/PC (mg/g) 0,56 ± 0,01 0,64 ± 0,03 1,42 ± 0,12*
+
PP/PC (mg/g) 5,70 ± 0,21 6,14 ± 0,29 13,63 ± 1,01*
+
AI (% do VE) ----
30,2 ± 1,6 35,6 ± 2,8
Valores de peso corporal (PC); Razão entre o peso do ventrículo esquerdo e o
peso corporal (VE/PC); Razão entre o peso do ventrículo direito e o peso
corporal (VD/PC); Razão entre o peso dos pulmões e o peso corporal (PP/PC);
Porcentagem da área de infarto (AI). Os resultados foram expressos como
média ± EPM, considerando significantes as diferenças para P< 0,05. ANOVA
uma via com post hoc de Tukey: *P< 0,05 vs. Sham;
+
P< 0,05 vs. Inf. O Teste t
Student`s não pareado foi utilizado para avaliar a diferença da AI entre os
grupos Inf e Icc, com P= 0,088.
Sham Inf Icc
0
100
200
300
A)
Peso corporal (g)
Sham Inf Icc
0
1
2
3
B)
Razão VE/PC (mg/g)
Sham Inf Icc
0
1
2
C)
*
+
Razão VD/PC (mg/g)
Sham Inf Icc
0
5
10
15
D)
*
+
Razão PP/PC (mg/g)
Inf
Icc
0
30
60
E)
Área de infarto (%)
Figura 8: Dados ponderais dos animais Sham, Infarto (Inf) e Infarto com sinais
de insuficiência cardíaca (Icc), 30 dias após o infarto: A) Peso corporal (PC); B)
Razão entre o peso do ventrículo esquerdo e o peso corporal (VE/PC); C)
Razão entre o peso do ventrículo direito e o peso corporal (VD/PC); D) Razão
entre o peso dos pulmões e o peso corporal (PP/PC); E) Porcentagem da área
de infarto. Os resultados foram expressos como média ± EPM, considerando
significantes as diferenças para P< 0,05. ANOVA uma via, pos hoc de Tukey:
*P< 0,05 vs. Sham;
+
P< 0,001 vs. Inf. O Teste t Student`s pareado foi utilizado
para avaliar a área de infarto entre os grupos Inf e Icc e o resultado encontrado
foi P= 0,088.
6.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FUNCIONAL DA Na
+
K
+
-ATPase SENSÍVEL À
OUABAÍNA 30 DIAS APÓS O INFARTO
A atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína foi avaliada
através da curva de relaxamento induzido pelo cloreto de potássio (Webb &
Bohr, 1978). Como será observado nas curvas a seguir, a adição de KCl ao
meio, de modo concentração-dependente (1, 2, 5, 10 mM), após 30 minutos de
incubação dos anéis vasculares em solução sem potássio, diminuiu a
contração induzida pela fenilefrina (10
-4
M) em todos os grupos estudados,
promovendo relaxamento dos vasos. A incubação dos anéis em um banho
contendo ouabaína (10
-4
M) reduziu o relaxamento induzido pelo KCl em todos
os grupos.
Para a descrição dos resultados, primeiramente, serão apresentadas as
diferenças dentro de um mesmo grupo e, posteriormente, serão apresentadas
as comparações entre os grupos Sham, Inf e Icc.
6.2.1 Estudo da atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína,
em aortas de ratas Sham
Como observado na figura 9, nas aortas com endotélio intacto, provenientes
das ratas Sham, houve um relaxamento induzido pela adição de concentrações
crescentes de KCl ao banho, sendo este significativamente reduzido após a
incubação dos anéis com OUA (10
-4
M) por 30 minutos.
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Sham E+ (n= 8)
Sham E+/OUA (n=8)
*
*
*
*
KCl (mM)
Contração (%)
Figura 9: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica com
endotélio intacto (E+) obtidas de ratas Sham. Sham E+, antes (linha contínua,
quadrado cheio, azul), e Sham E+/OUA, após a incubação com OUA (10
-4
M)
durante 30 minutos (linha pontilhada, quadrado vazio, azul). Resposta de
relaxamento ao KCl foi expressa como a porcentagem de contração residual à
fenilefrina. Os resultados foram expressos como média ± EPM. ANOVA duas
vias, post hoc de Bonferroni.
*P< 0,05, Sham E+/OUA vs. Sham E+.
6.2.1.1 Modulação do endotélio sobre a atividade funcional da Na
+
K
+
-
ATPase sensível à ouabaína
em aorta de ratas Sham
A capacidade do endotélio em modular a resposta de relaxamento
vascular induzida pelo KCl foi avaliada através da remoção mecânica das
células endoteliais com uma haste metálica. Nas aortas sem endotélio,
provenientes de ratas Sham, também observou-se um relaxamento, induzido
pelo KCl, o qual foi reduzido significativamente após a incubação dos anéis
com OUA (10
-4
M) por 30 minutos (Figura 10 A).
Quando os grupos com E+ e sem E- foram comparados, os resultados
demonstraram que a remoção do endotélio diminuiu o relaxamento vascular
induzido pelo KCl (
#
P< 0,05, nas concentrações de 2, 5 e 10 mM de KCl). Além
disso, houve um aumento significativo da capacidade da OUA de inibir o
relaxamento induzido pelo KCl (
+
P< 0,05, nas concentrações de 5 e 10 mM de
KCl) (Figura 10 B).
Figura 10: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica de ratas
Sham sem endotélio (E-) e comparação entre os grupos com endotélio intacto
(E+) e E-. A) Curva de relaxamento nos anéis E-, antes (linha contínua,
triângulo cheio, vermelho), e Sham E-/OUA, após a incubação com OUA (10
-4
M) durante 30 minutos (linha pontilhada, triângulo vazio, vermelho). B)
Comparação entre os grupos com E+ e sem E- endotélio, antes e após a
incubação com OUA (10
-4
M) durante 30 minutos. Resposta de relaxamento ao
KCl foi expressa como a porcentagem de contração residual à fenilefrina. Os
resultados foram expressos como média ± EPM. ANOVA duas vias, post hoc
de Bonferroni.
*P< 0,05, Sham E-/OUA vs. Sham E-;
#
P< 0,05, Sham E- vs. Sham E+;
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
*
*
*
*
Sham E- (n= 11)
Sham E-/OUA (n= 11)
A)
KCl (mM)
Contração (%)
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Sham E+ (n= 8)
Sham E+/OUA (n=8)
+
+
Sham E- (n= 11)
Sham E-/OUA (n= 11)
B)
#
#
#
KCl (mM)
Contração (%)
+
P< 0,05, Sham E-/OUA vs. Sham E+/OUA.
6.2.1.2 Participação do NO sobre a atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase
sensível à ouabaína
em aorta de ratas Sham
A participação do óxido nítrico na modulação endotelial sobre a atividade
funcional da Na
+
K
+
-ATPase foi avaliada em anéis incubados com um inibidor
“não-seletivo” da sintase de óxido nítrico, L-NAME (100 µM).
Como observado na figura 11, houve relaxamento, induzido pelo KCl, o
qual foi reduzido de forma significativa, após a incubação dos anéis com OUA
(10
-4
M) por 30 minutos.
Quando os grupos Sham E+ e Sham L-NAME foram comparados
(Figura 12 A), os resultados demonstraram que a inibição da NOS, através da
incubação com L-NAME, diminuiu o relaxamento induzido pelo KCl (
#
P< 0,05,
nas concentrações de 1, 2, 5 e 10 mM de KCl). Houve também um aumento
significativo da capacidade da OUA de inibir o relaxamento induzido pelo KCl
(
*
P< 0,001, nas concentrações de 5 e 10 mM de KCl) (Figura 12 A).
Comparando-se o grupo Sham L-NAME com o grupo Sham E- (Figura 12 B),
demonstrou-se que não houve diferença significante no relaxamento induzido
pelo KCl, entre os grupos. Nenhuma diferença estatística foi observada
também em relação à capacidade da ouabaína em inibir o relaxamento
induzido pelo KCl entre os grupos Sham L-NAME e Sham E-.
Figura 11: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica de ratas
Sham L-NAME. Anéis com endotélio intacto (E+), incubados por 30 minutos
com L-NAME (100 µM). Sham L-NAME, antes (linha contínua, círculo cheio,
verde); e Sham L-NAME/OUA, após a incubação com OUA (10
-4
M) durante 30
minutos (linha pontilhada, círculo vazio, verde). Resposta de relaxamento ao
KCl foi expressa como a porcentagem de contração residual à fenilefrina.
Resultados expressos como média ± EPM. ANOVA duas vias, post hoc de
Bonferroni.
*P< 0,05, Sham L-NAME/OUA vs. Sham L-NAME.
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
*
*
*
Sham L-NAME (n= 7)
Sham L-NAME/OUA (n= 7)
KCl (mM)
Contração (%)
Figura 12: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica de ratas
Sham, 30 dias após o infarto. A) Comparação entre os grupos Sham com
endotélio intacto (E+) (antes - linha contínua, quadrado cheio, azul; e após a
incubação com OUA (10
-4
M) durante 30 minutos - linha pontilhada, quadrado
vazio, azul) com o Sham L-NAME (antes - linha contínua, círculo cheio, verde e
após a incubação com OUA - linha pontilhada, círculo vazio, verde); B)
Comparação entre os grupos Sham E- (antes - linha contínua, triângulo cheio,
vermelho; e após a incubação com OUA (10
-4
M) durante 30 minutos - linha
pontilhada, triângulo vazio, vermelho), com o grupo Sham L-NAME. Resposta
de relaxamento ao KCl foi expressa como a porcentagem de contração residual
à fenilefrina. Resultados expressos como média ± EPM. ANOVA duas vias,
post hoc de Bonferroni.
#
P< 0,05, Sham L-NAME vs. Sham E+;
*P< 0,05, Sham L-NAME/OUA vs. Sham E+/OUA.
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Sham L-NAME (n= 7)
Sham L-NAME/OUA (n= 7)
Sham E- (n= 11)
Sham E-/OUA (n= 11)
B)
KCl (mM)
Contração (%)
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Sham E+ (n= 8)
Sham E+/OUA (n=8)
*
*
#
#
#
#
Sham L-NAME/OUA (n= 7)
Sham L-NAME (n= 7)
A)
KCl (mM)
Contração (%)
6.2.2 Estudo da atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína
em aortas de ratas infartadas
Como demonstrado na figura 13, houve relaxamento induzido por
concentrações crescentes de KCl (2, 5, 10 mM), nos anéis de aorta com
endotélio intacto (E+) de ratas 30 dias após o infarto. Porém, quando OUA (10
-4
M) foi adicionada ao banho e incubada por 30 minutos, houve uma redução,
estatisticamente significativa, no relaxamento ocasionado pela adição de KCl
(*P< 0,05, nas concentrações 2, 5 e 10 mM).
Figura 13: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica com
endotélio intacto (E+) provenientes de ratas Infartadas, sem sinais de
insuficiência cardíaca (Inf), 30 dias após o infarto. Inf E+, antes (linha contínua,
quadrado cheio, preto); e, Inf E+/OUA, após a incubação com OUA (10
-4
M)
durante 30 minutos (linha pontilhada, quadrado vazio, preto). Resposta de
relaxamento ao KCl foi expressa como a porcentagem de contração residual à
fenilefrina. Resultados expressos como média ± EPM. ANOVA duas vias, post
hoc de Bonferroni.
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Inf E+ (n= 9)
Inf E+/OUA (n= 9)
*
*
*
KCl (mM)
Contração (%)
*P< 0,05, Inf E+/OUA vs. Inf E+.
6.2.2.1 Modulação do endotélio sobre a atividade funcional da Na
+
K
+
-
ATPase sensível à ouabaína
em aortas de ratas infartadas
Nos anéis de aorta provenientes das ratas infartadas, sem sinais de
insuficiência cardíaca, nos quais foi realizada a remoção mecânica do endotélio
(E-), o relaxamento, induzido pelo KCl, pôde ser observado (Figura 14 A). Além
disso, a adição de OUA ao banho foi capaz de inibir o relaxamento induzido
pelo KCl (*P< 0.05, nas concentrações 2, 5 e 10 mM).
A comparação entre os grupos Inf E+ e Inf E- (Figura 14 B) demonstrou
que o relaxamento induzido pelo KCl, diminuiu com a remoção do endotélio
(
#
P< 0,05, nas concentrações de 5 e 10 mM de KCl). Porém, a capacidade da
ouabaína de inibir o relaxamento induzido pelo KCl não foi alterada pela
remoção do endotélio nestes animais.
Figura 14: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica sem
endotélio (E-) de ratas Infartadas, sem sinais de insuficiência cardíaca (Inf), 30
dias após o infarto e comparação entre Inf E- e Inf endotélio intacto (E+) A)
Curva de relaxamento nos anéis Inf E-, antes (linha contínua, triângulo cheio,
cor roxa); e Inf E-/OUA, após a incubação com OUA (10
-4
M) durante 30
minutos (linha pontilhada, triângulo vazio, cor roxa); B) Comparação entre os
grupos Inf E+ (antes - linha contínua, quadrado cheio, preto; e Inf E+/OUA,
após a incubação com OUA (10
-4
M) durante 30 minutos- linha pontilhada,
quadrado vazio, preto) e o grupo Inf E-. O relaxamento ao KCl foi expresso
como a porcentagem de contração residual à fenilefrina. Resultados expressos
como média ± EPM. ANOVA duas vias, post hoc de Bonferroni.
*P< 0,05, Inf E-/OUA vs. Inf E-;
#
P< 0,05, Inf E- vs. Inf E+.
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Inf E+ (n= 9)
Inf E+/OUA (n= 9)
Inf E- (n=8)
Inf E-/OUA (n=8)
#
#
B)
KCl (mM)
Contração (%)
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Inf E- (n= 8)
Inf E-/OUA (n= 8)
*
*
*
A)
KCl (mM)
Contração (%)
6.2.2.2 Participação do NO na modulação endotelial sobre a atividade
funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína
em aortas de ratas
infartadas
Como demonstrado na Figura 15, os anéis de aorta das ratas infartadas,
que não apresentaram sinais de insuficiência cardíaca, os quais foram
incubados por 30 minutos com L-NAME (100 µM), apresentaram relaxamento,
induzido pelo KCl. Porém, este relaxamento foi reduzido na presença da
ouabaína (*P< 0,05, nas concentrações 1, 2, 5 e 10 mM de KCl).
Ao comparar os grupos Inf E+ e Inf L-NAME (Figura 16 A), os resultados
demonstraram que a adição de L-NAME ao banho, diminuiu o relaxamento
induzido pelo KCl (*P< 0,05, na concentração de 5 e 10 de KCl). Entretanto,
nestes grupos, observou-se que o L-NAME não foi capaz de alterar a
capacidade da OUA de inibir o relaxamento induzido pelo KCl (P> 0,05).
Relacionando o grupo Inf L-NAME com o Inf E-, tanto o relaxamento
induzido pelo KCl, quanto à capacidade da OUA de inibir este relaxamento, não
foram estatisticamente diferentes (Figura 16 B).
Figura 15: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica de ratas
Inf, 30 dias após o infarto. Anéis com endotélio intacto (E+), incubados por 30
minutos com L-NAME (100 µM). Inf L-NAME, antes (linha contínua, círculo
cheio, marron); e Inf L-NAME/OUA, após a incubação com OUA (10
-4
M)
durante 30 minutos (linha pontilhada, círculo vazio, marron). Resposta de
relaxamento ao KCl expressa como a porcentagem de contração residual à
fenilefrina. Resultados expressos como média ± EPM. ANOVA duas vias, post
hoc de Bonferroni.
*P< 0,05, Inf L-NAME/OUA vs. Inf L-NAME.
0 2 4 6 8 10
0
25
50
75
100
125
Inf L-NAME (n= 9)
Inf L-NAME/OUA (n= 9)
*
*
*
*
KCl (mM)
Contração (%)
Figura 16: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica de ratas
Inf, 30 dias após o infarto. A) Comparação entre os grupos Inf com endotélio
intacto (E+) (antes -linha contínua, quadrado cheio, preto; e Inf E+/OUA, após a
incubação com OUA (10
-4
M) durante 30 minutos -linha pontilhada, quadrado
vazio, preto) e Inf L-NAME (antes - linha contínua, círculo cheio, marron; e Inf
L-NAME/OUA após a incubação com OUA (10
-4
M) durante 30 minutos - linha
pontilhada, círculo vazio, marron); B) Comparação entre os grupos Inf com
endotélio removido mecanicamente (E-) (antes - linha contínua, triângulo cheio,
cor roxa; e Inf E-/OUA, após a incubação com OUA (10
-4
M) durante 30
minutos - linha pontilhada, triângulo vazio, cor roxa) e Inf L-NAME. Resposta de
relaxamento ao KCl expressa como a porcentagem de contração residual à
fenilefrina. Resultados expressos como média ± EPM. ANOVA duas vias, post
hoc de Bonferroni.
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Inf E+ (n= 9)
Inf E+/OUA (n= 9)
Inf L-NAME (n= 9)
Inf L-NAME/OUA (n= 9)
KCl (mM)
Contração (%)
A)
*
*
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Inf E- (n= 8)
Inf E-/OUA (n= 8)
Inf L-NAME (n= 9)
Inf L-NAME/OUA (n= 9)
B)
KCl (mM)
Contração (%)
*P< 0,05, Inf L-NAME vs. Inf E+ .
6.2.3 Estudo da atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase
sensível à
ouabaína em aortas de ratas infartadas que apresentaram sinais de
insuficiência cardíaca
Nos anéis de aorta, com endotélio intacto, proveniente das ratas
infartadas que apresentaram sinais de insuficiência cardíaca, 30 dias após o
infarto, observou-se que o relaxamento induzido pelo potássio estava presente
e que a adição da ouabaína ao banho, era capaz de reduzi-lo (Figura 17).
Figura 17: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica com
endotélio intacto (E+), de ratas Infartadas que apresentaram sinais de
insuficiência cardíaca (Icc), 30 dias após o infarto (Icc). Icc E+ , antes (linha
contínua, quadrado cheio, laranja), e Icc E+/OUA, após a incubação com OUA
(10
-4
M) durante 30 minutos (linha pontilhada, quadrado vazio, laranja).
Resposta de relaxamento ao KCl expressa como a porcentagem de contração
residual à fenilefrina. Resultados expressos como média ± EPM. ANOVA duas
vias, post hoc de Bonferroni.
*P< 0,05, Icc E+/OUA vs. Icc E+.
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Icc E+ (n= 5)
Icc E+/OUA (n= 5)
*
*
*
*
KCl (mM)
Contração (%)
6.2.3.1 Modulação do endotélio sobre a atividade funcional da Na
+
K
+
-
ATPase
sensível à ouabaína em aortas de ratas infartadas que
apresentaram sinais de insuficiência cardíaca
Nos anéis das ratas Icc, nos quais, removeu-se o endotélio (Figura 18
A), foi demonstrado relaxamento induzido pelo KCl. Contudo, este relaxamento
apresentou-se diminuído após 30 minutos da adição da OUA ao banho (*P<
0,05, concentrações 2, 5 e 10 mM de KCl).
Quando o endotélio foi removido (Figura 18 B), constatou-se também
que o relaxamento induzido pelo KCl diminuiu em relação aos anéis vasculares
com endotélio íntegro (
&
P< 0,05, nas concentrações de 1, 2, 5 e 10 mM de
KCl). Porém, a capacidade da OUA de inibir a o relaxamento induzido pelo KCl
aumentou nos anéis sem endotélio na concentração de 10 mM de KCl (
#
P<
0,05) (Figura 18 B).
Figura 18: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta de ratas
Infartadas que desenvolveram sinais de insuficiência cardíaca (Icc), 30 dias
após o infarto. A) Anéis com endotélio removido (E-) provenientes de animais
Icc, antes (linha contínua, triângulo cheio, cinza) e após a incubação com OUA
(10
-4
M) durante 30 minutos (linha pontilhada, triângulo vazio, cinza). B)
Comparação entre os grupos Icc com endotélio intacto (E+) (antes - linha
contínua, quadrado cheio, laranja; e após a incubação com OUA (10
-4
M)
durante 30 minutos - linha pontilhada, quadrado vazio, laranja) e Icc E-.
Relaxamento ao KCl expresso como a porcentagem de contração residual à
fenilefrina. Resultados expressos como média ± EPM. ANOVA duas vias, post
hoc de Bonferroni.
*P< 0,05, Icc E-/OUA vs. Icc E-;
&
P< 0,05, Icc E-/OUA vs. Icc E+/OUA.
#
P< 0,05, Icc E+ vs. Icc E-.
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Icc E- (n= 6)
Icc E-/OUA (n= 6)
*
*
*
A)
KCl (mM)
Contração (%)
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Icc E+ (n= 5)
Icc E+/OUA (n= 5)
Icc E-/OUA (n= 6)
Icc E- (n= 6)
#
KCl (mM)
Contração (%)
B)
&
&
&
&
6.2.3.2 Participação do NO na modulação da atividade funcional da Na
+
K
+
-
ATPase
sensível à ouabaína em aortas de ratas infartadas que
apresentaram sinais de insuficiência cardíaca
Os anéis de aorta provenientes das ratas Inf, que apresentaram sinais
de insuficiência cardíaca, que foram incubados por 30 minutos com L-NAME,
apresentaram relaxamento, induzido pelo KCl (Figura 19). Este relaxamento
estava diminuído na presença da OUA (*P< 0,05, nas concentrações 2, 5 e 10
mM de KCl).
Figura 19: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta torácica com
endotélio intacto (E+) de ratas infartadas que apresentaram sinais de
insuficiência cardíaca (Icc), 30 dias após o infarto. Anéis E+, incubados por 30
minutos com L-NAME (100µM). Icc L-NAME, antes (linha contínua, círculo
cheio, rosa); e Icc L-NAME/OUA, após a incubação com OUA (10
-4
M) durante
30 minutos (linha pontilhada, círculo vazio, rosa). Resposta de relaxamento ao
KCl expressa como a porcentagem de contração residual à fenilefrina.
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
120
Icc L-NAME (n= 5)
Icc L-NAME/OUA (n= 5)
*
*
*
KCl (mM)
Contração (%)
Resultados expressos como média ± EPM. ANOVA duas vias, post hoc de
Bonferroni.
*P< 0,05, Icc L-NAME/OUA vs. Icc L-NAME.
Quando os grupos Icc E+ e Icc L-NAME foram relacionados (Figura 20 A),
demonstrou-se que a adição de L-NAME ao banho, diminuiu o relaxamento
induzido pelo KCl (*P< 0,05, concentrações de 1, 2, 5 e 10 mM de KCl). Além
disso, observou-se que o L-NAME foi capaz de aumentar a capacidade da
OUA em inibir o relaxamento induzido pelo KCl (
#
P< 0,05, nas concentrações
de 5 e 10 mM de KCl) (Figura 20 A).
Relacionando o grupo Icc L-NAME com o Icc E- (Figura 20 B), tanto o
relaxamento ao KCl, quanto à capacidade da OUA em inibir este relaxamento,
não foram estatisticamente diferentes (P> 0,05).
Figura 20: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta de ratas
Infartadas, com sinais de insuficiência cardíaca (Icc), 30 dias após o infarto. A)
Comparação entre os grupos Icc com endotélio intacto (E+) (antes -linha
contínua, quadrado cheio, laranja; e Icc E+/OUA, após a incubação com OUA
(10
-4
M) durante 30 minutos - linha pontilhada, quadrado vazio, laranja) e Icc L-
NAME (antes - linha contínua, círculo cheio, rosa; e Icc L-NAME/OUA após a
incubação com OUA (10
-4
M) durante 30 minutos- linha pontilhada, círculo
vazio, rosa); B) Comparação entre os grupos Icc com endotélio removido
mecânicamente (E-) (antes - linha contínua, triângulo cheio, cinza; e Icc E-
/OUA, após a incubação com OUA (10
-4
M) durante 30 minutos - linha
pontilhada, triângulo vazio, cinza) e Icc L-NAME. Resposta de relaxamento ao
KCl expressa como a porcentagem de contração residual à fenilefrina.
Resultados expressos como média ± EPM. ANOVA duas vias, post hoc de
Bonferroni.
*P< 0,05, Icc L-NAME vs. Icc E+;
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Icc E- (n= 6)
Icc E-/OUA (n= 6)
Icc L-NAME (n= 5)
Icc L-NAME/OUA (n= 5)
KCl (mM)
Contração (%)
B)
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Icc L-NAME (n= 5)
Icc L-NAME/OUA (n= 5)
Icc E+ (n= 5)
Icc E+/OUA (n= 5)
#
*
*
*
KCl (mM)
Contração (%)
A)
#
*
#
P< 0,05, Icc L-NAME/OUA vs. Icc E+/OUA.
6.2.4 Comparação da atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à
ouabaína,
em aortas com endotélio intacto, proveniente de ratas Sham, Inf
e Icc
Na figura 21 A, os anéis de aorta torácica dos animais infartados que não
apresentaram sinais de insuficiência cardíaca, 30 dias após o infarto do
miocárdio, demonstraram redução no relaxamento induzido pelo KCl (*P< 0,05,
nas concentrações de 1, 2, 5 e 10 mM de KCl) e aumento da capacidade da
ouabaína de inibir este relaxamento (
#
P< 0,05, concentrações 5 e 10 mM de
KCl).
Comparando o grupo infartado, que apresentou sinais de insuficiência
cardíaca, após o infarto do miocárdio, com o grupo cirurgia fictícia (Figura 21 B)
observou-se que o relaxamento induzido pelo KCl não apresentou diferença
significativa. Porém, a capacidade da ouabaína em inibir este relaxamento
apresentou um aumento significativo no grupo Icc, na concentração de 5 mM
de KCl (
&
P< 0,05) (Figura 21 B).
Como pode ser observado na figura 20 C, o grupo infartado que não
apresentou sinais de insuficiência cardíaca, demonstrou um menor
relaxamento induzido pelo KCl, quando comparado com o grupo Icc com
endotélio íntegro (E+) (
+
P< 0,05, nas concentrações de 2 e 5 mM de KCl).
Contudo, a capacidade da ouabaína de inibir o relaxamento ao KCl estava
aumentada no grupo Inf, na concentração de 10 mM (
a
P< 0,05).
Figura 21: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta de ratas com
endotélio íntegro (E+), 30 dias após o infarto. A) Grupo Sham E+ vs. Inf E+. B)
Grupo Sham E+ vs. Icc E+. C) Grupo Inf E+ vs. Icc E+. Sham E+: antes - linha
contínua, quadrado cheio, azul; e após a OUA (10
-4
M) durante 30 minutos –
linha pontilhada, quadrado vazio, azul; Inf E+: antes - linha contínua, quadrado
cheio, preto; e após a OUA (10
-4
M) durante 30 minutos – linha pontilhada,
quadrado vazio, preto; Icc E+: antes - linha contínua, quadrado cheio, laranja; e
após a OUA (10
-4
M) durante 30 minutos – linha pontilhada, quadrado vazio,
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Sham E+ (n= 8)
Sham E+/OUA (n=8)
&
Icc E+ (n= 5)
Icc E+/OUA (n= 5)
B)
KCl (mM)
Contração (%)
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Sham E+ (n= 8)
Sham E+/OUA (n=8)
*
*
Inf E+ (n= 9)
Inf E+/OUA (n= 9)
+
#
#
A)
KCl (mM)
Contração (%)
*
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Inf E+ (n= 9)
Inf E+/OUA (n= 9)
a
Icc E+/OUA (n= 5)
Icc E+ (n= 5)
+
C)
KCl (mM)
Contração (%)
+
laranja. Resposta de relaxamento ao KCl expressa como porcentagem de
contração à fenilefrina. Resultados expressos em média ± EPM. ANOVA duas
vias, post hoc de Bonferroni.
*P< 0,05 Inf E+ vs. Sham E+;
#
P< 0,05, Inf E+/OUA vs. Sham E+/OUA;
&
P< 0,05 Icc E+/OUA vs. Sham E+/OUA;
+
P< 0,05 Icc E+ vs. Inf E+;
a
P< 0,05 Icc E+/OUA vs. Inf E+/OUA.
6.2.5 Comparação da modulação do endotélio sobre a atividade funcional
da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína nos anéis de aorta provenientes
dos grupos Sham, Inf e Icc
Nos animais infartados que não apresentaram sinais de insuficiência cardíaca,
30 dias após o infarto do miocárdio, houve uma redução no relaxamento,
induzido pelo KCl, nos anés vasculares sem endotélio, (*P< 0,05, concentração
de 5 mM de KCl), bem como, constatou-se um aumento da capacidade da
ouabaína de inibir este relaxamento (
+
P< 0,05, concentração 10 mM de KCl)
(Figura 22 A).
Comparando o grupo Icc E- com o Sham E-, os resultados demonstraram que
tanto o relaxamento induzido pelo KCl, quanto a capacidade da ouabaína de
inibí-lo, não apresentaram diferença estatisticamente significante (P> 0,05)
(Figura 22 B).
Relacionando o grupo Inf E- com o grupo Icc E-, também não houve diferença
estatisticamente significante entre o relaxamento induzido pelo KCl e a
capacidade da ouabaína de inibí-lo (P> 0,05) (Figura 22 C).
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Sham E- (n= 11)
Sham E-/OUA (n= 11)
Inf E- (n= 8)
Inf E-/OUA (n= 8)
*
+
A)
KCl (mM)
Contração (%)
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Sham E- (n= 11)
Sham E-/OUA (n= 11)
Icc E- (n= 6)
Icc E-/OUA (n= 6)
B)
KCl (mM)
Contração (%)
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Inf E- (n= 8)
Inf E-/OUA (n= 8)
Icc E- (n= 6)
Icc E-/OUA (n= 6)
C)
KCl (mM)
Contração (%)
Figura 22: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta de ratas sem
endotélio (E-), 30 dias após o infarto. A) Grupo Sham E- vs. Inf E-. B) Grupo
Sham E- vs. Icc E-. C) Grupo Inf E- vs. Icc E-. Sham E-: antes - linha contínua,
triângulo cheio, vermelho; e após a OUA (10
-4
M) durante 30 minutos– linha
pontilhada, triângulo vazio, vermelho; Inf E-: antes - linha contínua, triângulo
cheio, cor roxa; e após a OUA (10
-4
M) durante 30 minutos – linha pontilhada,
triângulo vazio, cor roxa; Icc E-: antes - linha contínua, triângulo cheio, cinza; e
após a OUA (10
-4
M) durante 30 minutos – linha pontilhada, triângulo vazio,
cinza. Resposta de relaxamento ao KCl expressa como a porcentagem de
contração residual à fenilefrina. Resultados expressos como média ± EPM.
ANOVA duas vias, post hoc de Bonferroni.
*P< 0,05 Inf E- vs. Sham E-;
+
P< 0,05 Inf E-/OUA vs. Sham E-/OUA.
6.2.6 Diferença na participação do NO na modulação endotelial sobre a
atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína nos anéis de
aorta provenientes dos grupos Sham, Inf e Icc
Nos anéis de artéria aorta dos animais infartados que foram incubados com um
inibidor da NOS, L-NAME, não foram verificadas diferenças no relaxamento
induzido pelo KCl, quando os mesmos foram comparados com anéis de aorta
do grupo Sham L-NAME. Também não houve diferença na capacidade da
ouabaína de inibir o relaxamento induzido pelo KCl entre estes grupos (P>
0,05) (Figura 23 A).
Comparando o grupo Icc L-NAME com o Sham L-NAME, os resultados
demonstraram que o relaxamento induzido pelo KCl não estava alterado nas
ratas que desenvolveram sinais de insuficiência cardíaca após o infarto.
Contudo, a capacidade da ouabaína de inibir o relaxamento promovido pela
adição de KCl aumentou significantemente no grupo Icc L-NAME, quando
comparado com Sham L-NAME (*P< 0,05, concentração de 10 mM de KCl)
(Figura 23 B).
Relacionando o grupo Inf L-NAME com o grupo Icc L-NAME, não foram
verificadas diferenças significantes (P> 0,05) (Figura 23 C).
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Sham L-NAME/OUA (n= 7)
Sham L-NAME (n= 7)
Inf L-NAME (n= 9)
Inf L-NAME/OUA (n= 9)
A)
KCl (mM)
Contração (%)
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Sham L-NAME/OUA (n= 7)
Sham L-NAME (n= 7)
Icc L-NAME (n= 5)
Icc L-NAME/OUA (n= 5)
*
B)
KCl (mM)
Contração (%)
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
Icc L-NAME (n= 5)
Icc L-NAME/OUA (n= 5)
Inf L-NAME (n= 9)
Inf L-NAME/OUA (n= 9)
C)
KCl (mM)
Contração (%)
Figura 23: Curva de relaxamento induzido pelo KCl, em aorta com endotélio
intacto (E+), incubados com L-NAME, proveniente de ratas, 30 dias após o
infarto. A) Grupo Sham L-NAME vs. Inf L-NAME. B) Grupo Sham L-NAME vs.
Icc L-NAME. C) Grupo Inf L-NAME vs. Icc L-NAME. Sham L-NAME: antes -
linha contínua, círculo cheio, verde; e após a OUA (10
-4
M) durante 30 minutos
– linha pontilhada, círculo vazio, verde; Inf L-NAME: antes - linha contínua,
círculo cheio, marron; e após a OUA (10
-4
M) durante 30 minutos – linha
pontilhada, círculo vazio, marron; Icc L-NAME: antes - linha contínua, círculo
cheio, rosa; e após a OUA (10
-4
M) durante 30 minutos – linha pontilhada,
círculo vazio, rosa. Resposta de relaxamento ao KCl expressa como a
porcentagem de contração residual à fenilefrina. Resultados expressos como
média ± EPM. ANOVA duas vias, post hoc de Bonferroni.
*P< 0,05, Icc L-NAME/OUA vs. Sham L-NAME/OUA.
7. DISCUSSÃO
O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade funcional da Na
+
K
+
-
ATPase sensível à ouabaína, em anéis de aorta de ratas após o infarto do
miocárdio, com mesma área de cicatriz, com e sem sinais de insuficiência
cardíaca. Assim, uma condição essencial para a realização deste trabalho foi a
de que os corações dos animais infartados apresentassem a mesma área de
infarto, como pode ser observado na tabela 1 e figura 8 E. Porém, mesmo com
áreas de cicatriz semelhantes, alguns animais apresentaram sinais de
insuficiência cardíaca, enquanto outros não.
Após o infarto, a perda do miocárdio na área em que se forma a cicatriz,
resulta em um aumento abrupto da sobrecarga cardíaca que leva ao
remodelamento da AI e do miocárdio remanescente. O miocárdio consiste em 3
componentes integrados: miócitos, matriz extracelular e a microcirculação
capilar, que em conjunto, mantém a unidade contrátil. A necrose dos miócitos
promove uma cascata de processos de sinalização bioquímica intracelular que
inicia e modula as alterações reparativas, que incluem a dilatação, a hipertrofia
e a formação de uma cicatriz de colágeno. O remodelamento ventricular pode
durar de semanas e há meses, até que a força de distensão seja
contrabalançada pela tensão da cicatriz. Então, o remodelamento depende do
tamanho, posição, e da transmuralidade do infarto, além da patência da artéria
coronária relacionada, dos fatores locais e do estresse de parede ventricular
(Pfeffer & Braunwald, 1990; Sutton & Sharpe, 2000). A maioria dos trabalhos
tem correlacionado a insuficiência cardíaca a episódios de infarto com grande
área de cicatriz (Anversa et al., 1985; Pfeffer et al., 1991, Olivetti et al., 1991).
Porém, de acordo com o trabalho de Pfeffer et al. (1979), as áreas de infarto
encontradas em nosso estudo classificam-se como moderadas (AI: 32,3 ±
1,5%), o que possibilitou a avaliação de um grupo mais homogêneo de animais
infartados, desconsiderando aqueles com cicatriz muito pequena (menor que
30 %), ou muito grande (maior que 46 %). Através da observação
macroscópica dos corações, pela técnica descrita por Mill et al. (1990) foi
possível constatar AI semelhantes (Tabela 1, Figura 8E). Os animais
infartados, com mesma área de cicatriz foram separados em dois subgrupos:
os que apresentavam sinais de insuficiência cardíaca e os que não
apresentavam. Para isso, foram utilizados dois critérios de classificação. O
primeiro, foi a razão entre o peso dos pulmões e o peso corporal dos animais
Icc apresentar-se maior que a mesma razão dos animais Sham, mais duas
vezes o desvio padrão (Icc= PP/PC
Icc
> PP/PC
Sham
+ 2DP) (Francis et al., 2001;
Davidoff et al., 2004). E o segundo, foi à razão entre o ventrículo direito e o
peso corporal apresentar-se maior que a mesma razão nos animais Sham,
mais duas vezes o desvio padrão (ICC= VD/PC
ICC
> VD/PC
Sham
+ 2DP)
(Davidoff et al; 2004).
Portanto, decorridos 30 dias do INF, além da área da cicatriz, foram avaliados:
peso corporal e as razões VE/PC, VD/PC e PP/PC (Tabela 1, Figura 8). Após o
INF, a hipertrofia é quantitativa e qualitativamente diferente no VD e no VE. A
hipertrofia do VD está associada com o aumento no diâmetro dos miócitos
(hipertrofia concêntrica) e no VE há um aumento no diâmetro, e no
comprimento dos miócitos, culminando em hipertrofia concêntrica e excêntrica,
respectivamente (Anversa et al., 1985). A característica da hipertrofia a ser
desenvolvida dependerá do tipo de estresse inicial na parede do ventrículo
(Grossman et al., 1975).
Contudo, quando a razão entre o peso do VE e o peso corporal foi avaliada,
não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos estudados,
semelhante aos resultados encontrados nos trabalhos de Vargas et al. (2004),
Pereira et al. (2005), Bianchi et al. (2006), Fernandes (2006) e Gilbert et al.
2007. O aumento da razão do VE/PC é um indicativo indireto de hipertrofia,
porém, a técnica de avaliação utilizada neste trabalho, pode não detectar a
existência de hipertrofia no tecido remanescente, visto que o cálculo da razão
VE/PC é realizado utilizando o peso total VE. O aumento do peso do VE
remanescente é compensado pela redução do peso da cicatriz, justificando a
inalteração desta razão, apesar de existir hipertrofia do VE remanescente ao
INF (Mill et al., 1990).
Ao avaliar a razão VD/PC, constatou-se que no grupo Icc houve um aumento
da mesma, em relação aos demais grupos estudados. Este resultado também
foi encontrado no trabalho de Pereira et al. (2005). Após o INF, à sobrecarga
pressórica imposta a câmara cardíaca direita e a hipertrofia concêntrica do VD
são amplamente descritas e estão correlacionadas com os resultados do
presente estudo. A hipertrofia do VD pode ser desencadeada pelas alterações
hemodinâmicas iniciadas no VE (Anversa et al., 1986; Pfeffer et al., 1995), por
fatores de ativação humoral (Nahrendorf et al., 2003) e pela congestão
pulmonar que se instala na ICC (Jasmim et al., 2004).
A observação dos dados do peso pulmonar corrigido pelo peso corporal
demonstrou que no grupo Icc esta razão foi maior que a mesma razão dos
animais Sham, mais duas vezes o desvio padrão. Além disso, houve uma
diferença estatisticamente significante entre o grupo Icc e o grupo Inf. Estes
resultados foram semelhantes aos encontrados nos trabalhos de Francis et al.
(2001), Pereira et al. (2005), Bianchi et al. (2006), Fernandes (2006) e Giubert
et al. (2007). Estes pesquisadores demonstraram que a razão entre o peso
pulmonar e o peso corporal dos animais Icc era maior que a mesma razão nos
animais Sham, e também utilizaram este resultado como um critério para
classificar os animais com insuficiência cardíaca. A razão PP/PC pode
evidenciar hipertensão pulmonar, que é considerada como uma complicação
secundária a ICC (Butler et al., 1999; Francis et al., 2001). Ela provavelmente
esta aumentada devido à congestão pulmonar e ao edema decorrente da ICC.
A pressão aumentada nas veias pulmonares é transmitida de modo retrógrado
aos capilares e artérias o que resulta no remodelamento do parênquima
pulmonar. O remodelamento pulmonar, causando aumento de peso dos
pulmões, deve-se à deposição de colágeno e reticulina, o que promove o
enrijecimento do septo alveolar (Jasmin et al., 2004).
Em relação ao peso corporal, não houve, diferença estatisticamente
significante entre os grupos estudados. Fundamentando este resultado, vários
estudos apresentam peso corporal entre grupos Sham, Inf e Icc semelhantes
até 16 semanas após o INF (Francis et al., 2001; Nahrendorf et al., 2003).
No presente estudo, 18 ratas, sofreram a oclusão cirúrgica da artéria
coronária esquerda, das quais 7 (39%) desenvolveram sinais de ICC, 30 dias
após o INF. Em trabalho realizado por Pereira et al. (2005), semelhante
porcentagem de desenvolvimento de sinais de ICC, em animais infartados, foi
observada. Segundo Francis et al. (2001), este modelo de INF, através da
ligação da artéria coronária descendente anterior esquerda, simula a causa
mais comum de ICC em humanos e permite avaliar o momento preciso do
início das mudanças no sistema neuro-humoral e da função do VE, durante a
progressão da ICC.
Fernandes (2006) demonstrou como resultados do seu trabalho que os animais
infartados com sinais de ICC apresentaram redução da resposta inotrópica no
VD e VE. Porém, os animais que não apresentaram ICC só tinham prejuízo
contrátil do VE, e preservavam a contratilidade do VD. Giuberti et al. (2007)
também verificaram diferenças entre os animais Inf e Icc, quando avaliaram
músculo papilar de ratas. Segundo este estudo, na presença de isoproterenol e
cálcio, a força isométrica dos papilares estava reduzida nos grupos Icc. Estes
dados contribuem para explicar que existem diferenças na contratilidade
cardíaca entre animais com mesma área de infarto que apresentaram ou não
sinais de ICC.
Quando as diferenças na resposta vascular em ratos que desenvolveram ou
não sinais de ICC foram avaliadas por Pereira et al. (2005), esses autores
encontraram uma hiporreatividade a fenilefrina em artéria caudal de animais Icc
quando comparada ao Sham. Esta foi atribuída a um aumento da
biodisponibilidade de NO, pois era acompanhada de um aumento do
relaxamento dependente do endotélio. Nos animais Inf sem sinais de ICC
demonstrou-se aumento da contração induzida pela fenilefrina, paralelo a
diminuição do relaxamento dependente do endotélio. Quando o endotélio dos
animais Inf foi removido, as diferenças entre os grupos eram atenuadas,
sugerindo uma disfunção endotelial após o INF e a participação de algum fator
originado do MLV nesta resposta. Em outro estudo realizado por Bianchi et al.
(2006), também houve um aumento da reatividade a fenilefrina em anéis de
aorta de ratas com Inf. Segundo os autores, este aumento da contração
induzida pela fenilefrina, provavelmente devia-se a diminuição da
biodisponibilidade de NO, mas não podia ser relacionado ao aumento dos
prostanóides vasoconstritores.
Em humanos com INF e ICC, estudos realizados com diferentes vasos
demonstram redução do relaxamento dependente do endotélio (Belardinelli,
2001; Annuk et al., 2003; Linke et al., 2003). Outros trabalhos com diferentes
vasos de ratos mostraram redução e até mesmo preservação do relaxamento
dependente do endotélio em diferentes estágios do INF (Teerlink et al., 1993;
Baggia et al., 1997; Bauersachs et al., 1999; Indik et al., 2001). Teerlink et al.
(1993) verificaram, em anéis de aorta de ratos 1, 4 e 16 semanas após o INF,
um relaxamento induzido pelo NP semelhante. Porém, o relaxamento induzido
pela ACh apresentou-se prejudicado após a 4º e 16º semanas. Enquanto,
Takahashi et al. (2005) encontraram uma redução no relaxamento induzido
pela ACh quando avaliaram diferentes vasos de resistência com o mesmo
diâmetro, no estágio inicial da ICC. No trabalho de Baggia et al. (1997) o
relaxamento induzido pela ACh estava alterado nos anéis de aorta abdominal e
mesentérica, porém mostrou-se diminuído em artéria pulmonar de ratos com
ICC.
Assim, para avaliar os mecanismos de relaxamento dependentes do endotélio,
deve-se considerar: espécie utilizada para estudo; leito vascular (Hirooka et al.,
1994; Baggia et al., 1997; Takahashi et al., 2005); diâmetro do vaso (Mohri et
al., 1997); estágio de desenvolvimento da ICC (Takahashi et al., 2005);
apresentação, ou não, de sinais de ICC após o INF (Pereira et al., 2005).
Em relação ao relaxamento independente do endotélio, induzido pelo NP, a
maior parte dos estudos indicam que não há alteração entre os grupos Sham,
Inf e Icc (Teerlink et al., 1993; Nasa et al., 1996; Pereira et al., 2005; Takahashi
et al., 2005). Isto sugere que esta função vasodilatadora muscular dependente
da ativação do GMPc permanece preservada, mesmo nos estágios mais
avançados da ICC (Takahashi et al., 2005). Porém, outros trabalhos
contradizem estes resultados e demonstram uma diminuição da sensibilidade
do MLV ao GMPc e redução da sensibilidade da guanilato ciclase ao NO (Katz
et al., 1992).
Vários mecanismos podem estar envolvidos na anormalidade do relaxamento
dependente do endotélio no modelo de ICC: 1) Redução da liberação ou
aumento da degradação de NO (Drexler et al., 1994; Bauersachs et al., 1999;
Indik et al., 2001); 2) Redução da expressão da eNOS (Comini et al., 1996;
Schafer et al., 2004); 3) Aumento da liberação de substâncias vasoconstritoras
(Kubo et al., 1991; Katz et al., 1993); 4) Dessensibilização da guanilato ciclase
ao NO (Katz et al., 1992); e, 5) Diminuição da sensibilidade do MLV ao GMPc
(Katz et al., 1992).
O NO é um fator endotelial que estimula a Na
+
K
+
-ATPase (Gupta et al., 1996;
Vrbjar et al., 1999; Rossoni et al., 2003; Dos Santos et al., 2003). Vários
estudos sobre doenças que cursam com disfunção endotelial e modificação da
biodisponibilidade de NO têm correlacionado a alteração do relaxamento
vascular, com a atividade da Na
+
K
+
-ATPase.
O diabetes, por exemplo, é uma doença caracterizada por hiperglicemia
(Ozturk et al., 1996) e que pode estar associado a HAS (Davel et al., 2000). A
insulina é capaz de modular a reatividade vascular, induzindo vasodilatação
(Zemel et al., 1992; Ozturk et al., 1996), sendo que este efeito parece estar
parcialmente relacionado à ativação da Na
+
K
+
-ATPase (Ewart & Klip, 1995;
Gupta et al., 1996; Tack et al., 1996). Chen et al. 1993 relataram que a
diminuição da insulina no diabetes poderia levar a um aumento da
concentração plasmática de OUA. Como a OUA é um inibidor da Na
+
K
+
-
ATPase, alterações na concentração iônica do meio intracelular e
conseqüentemente do tônus vascular poderiam ocorrer (Hamlyn et al., 1982). A
redução da insulina também é descrita sendo capaz de induzir a uma
diminuição da expressão protéica da Na
+
K
+
-ATPase (Ver et al., 1997).
Portanto, a diminuição da insulina pode estar associada com o aumento da
OUA e a redução da atividade da Na
+
K
+
-ATPase no MLV (Gupta et al., 1996;
Tack et al., 1996), bem como pode estar envolvida em mecanismos que
modulam a reatividade vascular e a pressão arterial. Segundo estudo de Davel
et al. (2000) ratos com diabetes, induzido por streptozotocina, apresentaram
uma redução no relaxamento induzido pela ACh em artéria caudal e uma
diminuição da atividade da Na
+
K
+
-ATPase. Os pesquisadores sugeriram que
estes resultados seriam provenientes da redução da insulina e da diminuição
da biodisponibilidade de NO nos animais diabéticos.
Uma alteração no relaxamento vascular dependente do endotélio também tem
sido descrita em diferentes ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e em
humanos com hipertensão arterial (Marín & Rodríguez-Martínez, 1995). Em
artéria mesentérica e cerebral de SHR há um aumento do EDHF e do NO via
iNOS, eNOS, nNOS, que pode participar dos mecanismos compensatórios na
HA nestes animais (Nava et al., 1995; Boulanger et al., 1998 Briones et al.,
1999; Briones et al., 2000). Além disso, os elevados níveis da pressão arterial
podem estar associados a alterações na modulação do endotélio a respostas
de vasoconstritores, incluindo a resposta α-adrenérgica (Dohi et al., 1996).
Outra importante consideração é que vários trabalhos demonstram uma
concentração plasmática de ouabaína aumentada em modelos de hipertensão
em ratos e também, na hipertensão primária em humanos (Overbeck et al.,
1976; Hamlyn et al., 1982; Hamlyn et al., 1996; Schoner & Scheiner-Bobis,
2007). A ouabaína parece contribuir para a regulação da pressão arterial e está
associada ao desenvolvimento e manutenção da mesma, através de
mecanismos de ação central e periférica (Blaustein, 1993). Em 2001, Rossoni
et al. verificaram aumento da resposta pressora em animais hipertensos
DOCA-sal quando doses extremamente baixas de OUA foram administradas
(0,18 µg/Kg). Em 2002, Rossoni et al. demonstraram que o tratamento crônico
com OUA induzia a hipertensão, e este modelo estava associado: 1) a
diminuição da contração induzida pela fenilefrina em aorta de ratos; 2) aumento
da modulação endotelial negativa sobre a ação da fenilefrina; 3) aumento da
expressão da eNOS e nNOS. Estes pesquisadores supõem que a diminuição
da contração induzida pela fenilefrina pode estar relacionada ao aumento da
produção e liberação de NO e EDHF. O aumento do NO, pode então, estimular
a atividade da Na
+
K
+
-ATPase e a hiperpolarização via canais para potássio
dependentes de Ca
+2
, contrapondo-se aos efeitos contráteis da fenilefrina em
aortas de animais tratados cronicamente com OUA. Nesse mesmo estudo,
Rossoni et al. (2002) avaliaram se o tratamento crônico com OUA em Wistar
induzia hipertensão; se ele estava associado a mudanças na reatividade
vascular à fenilefrina e a ACh e se a atividade e a expressão da bomba de
Na
+
K
+
-ATPase estava alterada em artéria aorta, mesentérica e caudal. Os
resultados encontrados demonstraram a presença de hipertensão induzida pelo
tratamento com OUA, um inalterado relaxamento induzido pela ACh em todos
os vasos, uma diminuição da resposta contrátil a fenilefrina na aorta, um
aumento da expressão das isoformas α-1 e α-2, bem como da atividade
funcional da Na
+
K
+
-ATPase na aorta.
Portanto, fica clara a existência da relação entre reatividade vascular e
atividade da Na
+
K
+
-ATPase. Porém, nenhum estudo, até o presente momento,
avaliou a participação desta proteína nas alterações da reatividade vascular
que ocorrem pós-infarto do miocárdio e na progressão da ICC. Mesmo sendo
amplamente conhecido que estas doenças apresentam-se com alterações
capazes de influenciar a atividade da Na
+
K
+
-ATPase, como modificação da
homeostase de sal e água (Rose & Valdes, 1994), aumento na concentração
plasmática de ouabaína (Gottlieb et al., 1992), angiotensina II (Xavier et al.,
2004b; Isenovic et al., 2004), aldosterona (Alzamora et al., 2003), endotelina
(Gupta et al., 1991), AVP (Mujais et al., 1992) e espécies reativas de oxigênio
(Kourie, 1998), além de diminuição da produção de NO, e da resposta do MLV
aos fatores vasodilatadores (Drexler, 1998; Teerlink et al., 1993; Bauersachs et
al., 1999; Behrendt & Ganz, 2002 Indik et al., 2001).
Assim, o objetivo pioneiro deste trabalho foi estudar a atividade funcional
da Na
+
K
+
-ATPase sensível à ouabaína em anéis de aorta de ratas após o
infarto do miocárdio, com mesma área de cicatriz, com e sem sinais de
insuficiência cardíaca.
Para isso, foi utilizada a técnica descrita por Webb & Bohr (1978) que
avalia a atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível a OUA. Estes
pesquisadores propuseram que o relaxamento do MLV, devido à estimulação
da atividade da Na
+
K
+
-ATPase, era resultante do aumento do transporte
eletrogênico de Na
+
e K
+
, em um meio livre de potássio, que gerava
hiperpolarização das células musculares lisas. Portanto, a adição de KCl (1, 2,
5 e 10 mM) ao banho induz ao relaxamento e é capaz de reverter, quase
completamente, a contração induzida pela fenilefrina em um banho com
solução livre de K
+
. Sabendo que a ouabaína é um potente inibidor da Na
+
K
+
-
ATPase (Blaustein, 1993), uma outra curva de relaxamento induzido pelo KCl
era realizada, após a incubação com OUA (10
-4
M) por 30 minutos.
Assim, quando anéis de aorta dos animais Sham, 30 dias após a cirurgia
fictícia de indução ao INF, foram avaliados, verificou-se que a remoção do
endotélio diminuiu o relaxamento vascular induzido pelo KCl. Além disso,
houve um aumento significante da capacidade da OUA de inibir o relaxamento
induzido pelo KCl (Figura 10).
Resultados semelhantes aos encontrados no presente trabalho foram descritos
por Marin & Rodríguez-Martínez (1995) e Marin & Redondo (1999). Rossoni et
al. (2002) também verificaram em anéis de artéria caudal, mesentérica e aorta,
que a remoção do endotélio foi capaz de diminuir o relaxamento induzido pelo
KCl em todos os vasos. Além disso, a capacidade OUA de inibir o relaxamento
induzido pelo KCl também estava aumentada.
Já no fim da década de 80, Feletou & Vanhoutte (2002) propuseram que o
EDHF poderia participar do processo de ativação da Na
+
K
+
-ATPase em anéis
de coronária. Além disso, em 1992, Lee et al. afirmavam que a Na
+
K
+
-ATPase
participava do relaxamento vascular dependente do endotélio, induzido pela
ACh. Em 2004, Palacios et al. estudaram o efeito da ACh sobre a atividade
funcional da Na
+
K
+
-ATPase em anéis de aorta de ratas e verificaram que a
incubação dos anéis vasculares com solução contendo ACh, aumentava
significantemente a atividade da Na
+
K
+
-ATPase. Porém, quando o endotélio
era removido, a resposta de relaxamento do MLV apresentava-se diminuída,
sugerindo a direta influência de um fator endotelial sobre a atividade da Na
+
K
+
-
ATPase.
Vários trabalhos demonstram a existência de fatores endoteliais capazes de
modular a atividade da Na
+
K
+
-ATPase e parcialmente, reduzir os efeitos da
ouabaína sobre a mesma (Lee et al., 1992; Marin & Redondo, 1999; Vavilova et
al., 2000). Os fatores derivados do endotélio, como por exemplo, NO (Rapoport
et al., 1985), endotelina-1 (Gupta et al., 1991), angiotensina II (Isenovic et al.,
2004) e prostaglandinas (Lockette et al., 1980) são amplamente descritos na
literatura por influenciar a atividade da Na
+
K
+
-ATPase.
O NO liberado pelo endotélio ou gerado pelo metabolismo dos
nitrovasodilatadores, como o NP e a nitroglicerina, causa relaxamento,
crescimento e hiperpolarização do MLV (Furchgott & Zawadzki, 1980). Ele é
descrito como um fator estimulador da atividade da Na
+
K
+
-ATPase (Rapoport et
al., 1985; Ando et al., 1991; Gupta et al., 1996). Suas funções são atribuídas a
sua capacidade de ativar a guanilato ciclase solúvel e de aumentar o GMPc,
embora efeitos independentes do GMPc têm sido descritos (Ando et al., 1991;
Gupta et al., 1996; Chen et al., 2005).
Então, após a constatação da modulação positiva do endotélio sobre a
atividade da Na
+
K
+
-ATPase na aorta das ratas Sham, e sabendo da
capacidade do NO em modular a atividade desta enzima, os anéis vasculares
foram estudados após incubação, por 30 minutos, com um inibidor da NOS, o
L-NAME (100 µM). Este procedimento foi realizado a fim de verificar a
participação do NO na estimulação da Na
+
K
+
-ATPase.
Quando o grupo Sham E
+
foi comparado com o Sham L-NAME, houve uma
redução no relaxamento induzido pelo KCl e um aumento na capacidade da
OUA de inibir o relaxamento vascular. Entretanto, não houve diferenças
significativas entre os grupos Sham E- e Sham L-NAME, confirmando a
hipótese de que a ativação da Na
+
K
+
-ATPase nos animais Sham ocorre por
uma via nitrérgica (Figura 12).
O mesmo resultado demonstrado no presente trabalho foi encontrado por Dos
Santos et al. (2003) e Rossoni et al. (2003). Chen et al. (2005) que avaliaram
anéis de aorta torácica, também verificaram inibição do relaxamento induzido
pelo KCl após a incubação dos anéis vasculares com L-NAME.
Os resultados encontrados no presente trabalho confirmam a existência de
uma modulação endotelial positiva da Na
+
K
+
-ATPase, via NO, em aorta, como
previamente descrito na literatura.
No grupo Sham, parte do relaxamento induzido pelo acréscimo de KCl ao
banho foi abolido na presença de OUA. Tal resposta sugere a participação da
Na
+
K
+
-ATPase neste processo. Como esperado, no grupo Inf, também ocorreu
perda parcial da capacidade de relaxamento ao KCl após a adição de OUA
(Figura 13). Muito embora, o relaxamento ao KCl do grupo Inf tenha sido de
menor magnitude do que no grupo Sham, a adição de OUA promoveu uma
inibição muito mais pronunciada no grupo Inf comparado ao que foi observado
no grupo Sham (Figura 21A). Este resultado poderia ser um indicativo de uma
maior participação da Na
+
K
+
-ATPase nos animais infartados sem sinais de
insuficiência cardíaca quando comparado com a resposta obtida no grupo
Sham (Figura 21A).
Além disso, quando o endotélio foi removido, também houve redução do
relaxamento induzido pelo KCl. Estes resultados demonstram a existência de
uma modulação positiva do endotélio sobre o relaxamento induzido pelo KCl.
Porém, não quer dizer que exista modulação endotelial sobre a Na
+
K
+
-ATPase
já que a capacidade da OUA inibir esta enzima, no grupo Inf E
-
, foi semelhante
ao grupo Inf E+. Assim, a remoção do endotélio não foi capaz de aumentar a
capacidade da OUA de inibir a Na
+
K
+
-ATPase (Figura 14B).
Estes resultados nos induzem a concluir que a modulação endotelial
sobre a atividade da Na
+
K
+
-ATPase deve estar prejudicada nos animais
infartados sem sinais de ICC. Entretanto, não se pode dizer que a modulação
endotelial sobre o relaxamento induzido pelo KCl esteja prejudicada nos
animais Inf, já que a remoção do endotélio diminuiu o relaxamento induzido
pelo KCl. Diante desses resultados poder-se-ia especular que o menor
relaxamento induzido pelo KCl em aorta de ratas infartadas sem sinais de ICC
não se deva exclusivamente a uma alteração funcional da Na
+
K
+
-ATPase, mas
tenha participação de outros mecanismos que influenciam a via de
acoplamento excitação–contração do MLV que ainda precisam ser estudados.
Considerando o fato de que, no grupo Inf, a retirada do endotélio não
modificou o relaxamento induzido pelo KCl na presença de OUA, é possível
especular que no grupo Inf a OUA tenha perdido sua influencia sobre o
endotélio, mas preservado sua ação sobre o MLV. Esse comportamento é
diferente do que acontece com o grupo Sham em que a resposta de
relaxamento induzido pelo KCl, com OUA, é modulada pelo endotélio. De fato,
Xie et al. (1993) demonstraram que a OUA é capaz de estimular uma
isoenzima da NOS endotelial aumentando a liberação de NO. Assim, se por um
lado a OUA é capaz de inibir a Na
+
K
+
-ATPase (Blaustein, 1993), tanto
endotelial quanto a do MLV, por outro, ela também estimula a produção de NO
através de sua ação sobre o endotélio (Xie et al., 1993). Eva et al. (2006)
demonstraram também que a OUA estimula a eNOS e a produção de NO em
células endoteliais do cordão umbilical humano. O NO então, promove o
relaxamento do MLV tanto diretamente, quanto devido a uma ativação da
própria Na
+
K
+
-ATPase (Gupta et al., 1996). Se o endotélio contrabalança a
inibição da bomba pela OUA por que estimula a Na
+
K
+
-ATPase, a remoção do
endotélio deveria aumentar a capacidade da OUA de inibir esta proteína. No
entanto, nos animais com Inf sem sinais de ICC a produção endotelial de NO,
estimulada pela OUA, parece ter sido perdida (Figura 24). É interessante
ressaltar que a perda da produção de NO parece ter sido especifica desta via
mediada pela OUA, visto que a produção basal de NO, independente de OUA,
permaneceu preservada, como demonstrado pela redução do relaxamento ao
KCl na presença de L-NAME (Figura 16A e B).
No grupo de animais infartados com sinais de insuficiência, o relaxamento
induzido pela adição de KCl ao banho foi reduzido na presença de OUA (Figura
17). A remoção do endotélio foi capaz de diminuir o relaxamento induzido pelo
KCl e também, aumentar a capacidade da OUA de inibir este relaxamento.
Portanto, pode-se inferir que o relaxamento induzido pelo KCl, na presença e
na ausência de OUA, é regulado pelo endotélio, assim como foi observado no
grupo Sham (Figura 18B).
Quando os animais Sham foram comparados com os Icc, na presença
do endotélio, o relaxamento vascular gerado pela adição de KCl ao banho foi
idêntico. Contudo, a capacidade da OUA de inibir a Na
+
K
+
-ATPase foi um
pouco maior no grupo Icc, na concentração de 5 mM de KCl (Figura 21B).
Portanto, a capacidade de relaxamento induzido pelo KCl possivelmente está
preservada na insuficiência cardíaca. Porém, a OUA parece inibir um pouco
mais a Na
+
K
+
-ATPase nos animais Icc comparados com os animais Sham.
Na ausência de endotélio vascular não há diferença na resposta de
relaxamento ao KCl entre os animais Sham e os infartados com sinais de ICC
(Figura 22B). Este resultado é sugestivo de que nos animais infartados com
sinais de Icc não houve prejuízo do endotélio capaz de reduzir o relaxamento
induzido pelo KCl, ou então, mecanismos compensatórios estariam ativados a
fim de mantê-lo normal. Da mesma forma que ocorreu nos animais Sham, a
capacidade do endotélio de produzir NO, via estimulação pela OUA, estava
preservada nos animais infartados com sinais de ICC. Assim, quando o
endotélio é removido, ou mesmo quando o L-NAME é adicionado ao banho
(Figura 20 A), o relaxamento a OUA é menor, o que sugere uma menor
atividade funcional da Na
+
K
+
-ATPase sensível à OUA. Logo, deduz-se que o
relaxamento induzido pelo KCl e a capacidade inibidora da OUA são
influenciadas pelo endotélio, através da liberação de NO.
Não há diferenças significativas quando são comparadas as curvas dos
animais Icc E- com Icc L-NAME como pode ser observado na Figura 20B. Este
resultado reafirma a participação do endotélio no relaxamento apresentado nos
grupos Icc.
De maneira geral, os resultados apresentados aqui indicam que a
reatividade do anel de aorta de ratos infartados sem sinais de ICC, mas não os
infartados com sinais de ICC está alterada. Ocorreu um menor relaxamento
destes anéis ao KCl na presença e ausência de OUA. Resultados semelhantes
foram descritos por Bianchi et al. (2006), os quais verificaram um aumento na
reatividade a fenilefrina em aortas de ratas, após o INF, que era dependente do
endotélio e estava relacionado à diminuição da biodisponibilidade de NO, mas
não observaram redução do relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh). De
fato, esta não é a primeira vez que se descreve diferenças funcionais
significantes sobre a reatividade vascular de ratos infartados em função da
presença ou não de sinais de ICC. Recentemente, um trabalho publicado por
Pereira et al. (2005) demonstrou que a reatividade do leito arterial caudal de
ratos 30 dias após infarto, sem sinais de ICC, é bem distinta daquela dos
animais infartados com sinais de ICC. Os autores demonstraram que a
reatividade vascular em resposta a fenilefrina estava aumentada em animais
que apresentaram infarto sem sinais de ICC, enquanto o relaxamento em
resposta à ACh estava diminuida. Já nos animais infartados com sinais de ICC
a reatividade a fenilefrina foi menor do que a observada no grupo Sham, com
manutenção do relaxamento a ACh.
Considerando que tem sido descrito na literatura a participação da Na
+
K
+
-
ATPase do MLV nas alterações da reatividade vascular durante o
desenvolvimento de doenças do sistema cardiovascular, como a hipertensão
arterial e o diabetes (Rose & Valdes, 1994; Davel et al., 2000; Rossoni et al.,
2002; Xavier et al., Callera et al., 2004), seria possível que as alterações na
reatividade vascular após infarto descritas por Pereira et al. (2005) também
envolvessem a Na
+
K
+
-ATPase.
OCL
USÃO DA CORONÁRIA ESQUERDA
INFARTO DO MIOCÁRDIO
4 SEMANAS APÓS O INFARTO
MESMA ÁREA DE CICATRIZ
Figura 24: Diagrama com principais resultados e hipótese da pesquisa.
Razão peso do ventrículo direito e peso corporal (VD/PC), peso do pulmão e
peso corporal (PP/PC), infarto sem sinais de insuficiência (Inf), infarto com
sinais de insuficiência (Icc), desvio padrão (DP), ouabaína (OUA), óxido
nítrico (NO).
8. CONCLUSÃO
O principal resultado deste trabalho foi que nos animais infartados sem
sinais de insuficiência o relaxamento induzido pelo KCl apresentou-se
diminuído e a modulação endotelial desse relaxamento, por uma via nitrérgica,
estava presente. Porém, a capacidade da ouabaína de inibir a Na
+
K
+
-ATPase
estava aumentada nestes animais e não apresentou modulação endotelial
como visto nos grupos Sham e Icc. Estes resultados nos induzem a concluir
que a capacidade da OUA de estimular a liberação de NO ou de deixá-lo
biodisponível através do endotélio deve estar prejudicada nos animais
infartados sem sinais de ICC, mas preservada nos animais infartados com
sinais de ICC. É interessante ressaltar que a perda da produção de NO parece
ter sido especifica desta via mediada pela OUA, visto que a produção basal de
NO, independente de OUA, permaneceu preservada.
Nos animais infartados com sinais de ICC não houve prejuízo do
endotélio capaz de reduzir o relaxamento induzido pelo KCl, ou então,
mecanismos compensatórios estariam ativados a fim de mantê-lo normal.
Assim, deduz-se que o relaxamento induzido pelo KCl e a capacidade inibidora
da OUA são influenciadas pelo endotélio, através da liberação de NO.
Portanto, os resultados apresentados neste trabalho demonstram a
participação da Na
+
K
+
-ATPase nas mudanças de reatividade vascular após o
infarto do miocárdio. Além disso, propõem que há diferenças nos mecanismos
envolvidos na reatividade vascular ocasionada após o INF, em animais com
mesma área de cicatriz, com e sem sinais de ICC.
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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