Download PDF
ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
CAROLINA FIORIN ANHOQUE
ANTAGONISTAS NMDA, MK-801 E MEMANTINA, NO
CÓRTEX PRÉ-FRONTAL MEDIAL BLOQUEIAM OS
PREJUÍZOS DO ÁLCOOL SOBRE A MEMÓRIA
OPERACIONAL ESPACIAL DE RATOS
Vitória
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
CAROLINA FIORIN ANHOQUE
ANTAGONISTAS NMDA, MK-801 E MEMANTINA, NO
CÓRTEX PRÉ-FRONTAL MEDIAL BLOQUEIAM OS
PREJUÍZOS DO ÁLCOOL SOBRE A MEMÓRIA
OPERACIONAL ESPACIAL DE RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Fisiológicas do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do
Espírito Santo, como requisito parcial para
obtenção do Grau de Mestre em Ciências
Fisiológicas na área de concentração em
Fisiologia.
Orientadora: Profa. Dra Ester Miyuki Nakamura-
Palacios.
Vitória
2007
ads:
Anhoque, Carolina Fiorin.
Antagonistas NMDA, MK-801 e memantina, no córtex pré-frontal
medial bloqueiam os prejuízos do álcool sobre a memória operacional
espacial de ratos / Carolina Fiorin Anhoque – 2007.
xiv; 122f
NMDA antagonists, MK-801 and Memantine, administered into
the medial prefrontal cortex blocked the impairment of spatial working
memory produced by ethanol in rats.
Orientadora: Profa Dra Ester Miyuki Nakamura-Palacios
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Espírito Santo,
Centro de Ciências da Saúde – PPGCF – UFES.
1. Córtex Pré-frontal Medial 2. Receptores NMDA 3. Memória
Operacional Espacial 4. Labirinto Radial 5. Memantina 6. MK-801
CAROLINA FIORIN ANHOQUE
ANTAGONISTAS NMDA, MK-801 E MEMANTINA, NO CÓRTEX PRÉ-
FRONTAL MEDIAL BLOQUEIAM OS PREJUÍZOS DO ÁLCOOL SOBRE
A MEMÓRIA OPERACIONAL ESPACIAL DE RATOS
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas da
Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do
grau de Mestre em Ciências Fisiológicas na área de concentração em Fisiologia.
Aprovada por:
_____________________________________________________
Profa. Dra. Ester Miyuki Nakamura-Palacios – Orientadora, UFES – ES
_____________________________________________________
Profa. Dra. Rosana Camarini – USP – SP
_____________________________________________________
Prof. Dr. Roney W. Dias de Oliveira – EMESCAM – ES
_____________________________________________________
Prof. Dr. José Geraldo Mill – Coordenador do PPGCF, UFES – ES
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
Vitória, 15 de Junho de 2007.
Ao Rafael pela compreensão e paciência nos
meus momentos de ausência e dedicação à
pesquisa e ciência.
Aos meus pais e irmãos que sempre
estiveram comigo nas jornadas de
estudos.
O que você Vê....você Lembra
O que você Ouve....você Esquece
O que você FAZ...você APRENDE!
Confúcio
(Mestre e Filósofo Chinês)
AGRADECIMENTOS
À professora Ester, que incansavelmente, dividiu seus conhecimentos comigo
e acreditou no meu potencial. Ensinou-me que, organização, dedicação e
persistência fazem parte da construção do conhecimento. Muito obrigada por
permitir que eu aprendesse com você e, cada vez mais, me apaixonar pela pesquisa
e pela ciência.
Aos meus queridos colegas do Laboratório de Neuropsicofarmacologia, pelos
momentos de risos, “stress”, aulas, explicações, correria e muito debate sobre a
temática desenvolvida no nosso laboratório.
Aos funcionários Maria e Jozué, que com grande entusiasmo, dedicação e
alegria me auxiliaram nos trabalhos do laboratório.
Não poderia esquecer de Fonseca e Cláudia, que sempre estiveram
disponíveis para me ajudar nas atividades no Centro Biomédico.
Aos Mestres e Doutores do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Fisiológicas que proporcionaram grandes dias de imersão e desenvolvimento do
conhecimento científico.
Aos meus alunos que sempre me apoiaram nesta intensa jornada de estudos.
Aos meus pais e irmãos, que acreditaram e incentivaram todos os meus
momentos de estudos estando juntos na torcida pela concretização desta nova
etapa.
Ao grande companheiro Rafael pelo seu amor, apoio e confiança
incondicional em todos os momentos deste trabalho.
RESUMO
O córtex pré-frontal (CPF) é o substrato neuroanatômico das funções executivas centrais
que controlam os processos cognitivos e comportamentais. Sua porção medial (CPFm),
em roedores, tem sido considerada uma parte importante no processamento da memória
operacional espacial e no circuito de gratificação cerebral, envolvido no abuso e
dependência de drogas. Os receptores glutamatérgicos do tipo NMDA são encontrados
abundantemente nesta região. Este estudo pretendeu investigar o envolvimento dos
receptores NMDA do CPFm nos efeitos de prejuízo do etanol sobre a memória
operacional espacial. Ratos Wistar machos (n=24; 250-300 g; ≅ 3 meses de idade),
previamente treinados no labirinto radial de 8 braços, com cânulas bilaterais implantadas
no CPFm (B: + 2,5 mm A; +/- 1 mm L; 2,7mm V), receberam administrações
intracorticais (IC) de salina (SAL), MK-801 (0,32, 1,0 ou 3,2 µg) ou memantina (1,0, 3,2 e
10,0 µg) 10 minutos antes da administração de salina ou etanol (100 µg). Cinco minutos
após a última administração, os animais foram submetidos ao teste de desempenho no
labirinto radial de 8 braços com retardos de 1 hora. O etanol na dose de 100 µg produziu
efeitos de prejuízo na memória operacional espacial em ratos, aumentando
significativamente (p < 0,05 ou 0,01) o número de erros quando comparado aos
tratamentos controles salina e salina. A menor dose de MK-801 (0,32 µg) combinada ao
etanol, diminuiu significativamente (p < 0,05) o número de erros em relação à
combinação de salina e etanol e à combinação de MK-801 (1,0 µg) e etanol no pós-
retardo de 1 hora. Os animais que receberam tratamento com memantina, previamente
ao etanol, na maior dose (10,0 µg), também apresentaram significativamente (p < 0,01)
menor número de erros comparado ao tratamento combinado de salina e etanol no pós-
retardo de 1 hora. Estes resultados demonstram que as administrações IC aguda da
menor dose do MK-801 e da maior dose da memantina bloquearam os prejuízos da
memória operacional espacial de longa duração no labirinto radial de 8 braços,
corroborando a participação do sistema glutamatérgico, mais precisamente dos
receptores NMDA, do CPFm no processamento da memória operacional espacial em
ratos, e sugerem o envolvimento deste sistema nos efeitos de prejuízo do etanol sobre
esta função cognitiva.
ABSTRACT
The prefrontal cortex (PFC) is the anatomic site of central executive functions that control
behavioral and cognitive processes. Its medial portion (mPFC), in rodents, has been
considered of importance in the process of working memory and also in the brain reward
circuit, involved in drug abuse and dependence. NMDA glutamatergic receptors are
ubiquitous in this structure. The present study examined the involvement of prefrontal
NMDA receptors in the disruptive effects of ethanol on spatial working memory. 24 male
Wistar rats (250-300 g, ≅ 3 months), were previously trained in the 8-arm radial maze,
and had bilateral cannulae implanted into the mPFC (B: + 2.5 mm A, +/- 1 mm L, 2.7mm
V). They received intracortical (IC) administrations of saline (SAL), MK-801 (0.32, 1.0 or
3.2 µg) or memantine (1.0, 3.2 or 10.0 µg) 10 minutes before the administration of saline
or ethanol (100 µg). Five minutes after the last administration, the animals were
submitted to 1-h delayed tasks in the 8-arm radial maze. The ethanol at dose of 100 µg
impaired the spatial working memory in rats, increasing significantly (p < 0.05 or 0.01) the
number of errors as compared to the control treatments saline and saline. The lowest
dose of MK-801 (0.32 µg) combined to ethanol (100 µg), reduced significantly (p < 0.05)
the number of errors as compared to the combination of saline and ethanol and to the
combination of MK-801 (1.0 µg) and ethanol in the 1-h post-delay performance. The
animals that received memantine treatment at the highest dose (10.0 µg), previously to
ethanol, also presented significantly (p < 0.01) smaller number of errors as compared to
the combined treatment of saline and ethanol in the 1-h post-delay performance. These
results showed that the lowest dose of MK-801 or the highest dose of memantine
administered IC blocked the disruptive effects of ethanol on long-term spatial working
memory, corroborating the participation of glutamatergic system, more precisely the
NMDA receptors in the mPFC, in the processing of spatial working memory in rats, and
suggests the involvement of this system in the disruptive effects of ethanol on this
cognitive function.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Áreas do CPF lateral, medial e orbital da espécie humana, numeradas segundo o
mapa citoarquitetônico de Brodmann ..........................................................................................
17
Figura 2 - Visão superior e medial global do cérebro de rato Áreas Cg1, Cg2 e Cg3 do
cingulado anterior e Fr2 do córtex frontal motor do córtex pré-frontal medial em roedores ........
18
Figura 3 - Estruturas químicas do ácido L-glutâmico (L-Glu), ácido L-aspártico (L-Asp) e o
ácido N-metil-D-aspártico (NMDA) ..............................................................................................
27
Figura 4 - Representação esquemática do receptor NMDA heteromérico composto pelas
subunidades NR1 e NR2 .............................................................................................................
28
Figura 5 - Modelo mostrando o receptor N-Metil-D-Aspartato (NMDA), bloqueio pelo
magnésio (Mg
2+
) e sítios de ligação ............................................................................................
29
Figura 6 - Modelo simplificado da ativação e bloqueio do receptor NMDA ................................
31
Figura 7 - Representação esquemática mostrando o sítio para o MK-801, ketamina e
fenciclidina (bloqueadores não-competitivos de canal aberto) ...................................................
32
Figura 8 - Estrutura química da Memantina e MK-801 ...............................................................
33
Figura 9 - Esquema da cinética de bloqueio e desbloqueio do Mg
2+
, Memantina e MK-801 e
voltagem-dependência nas situações fisiológica e patológica ....................................................
35
Figura 10 - Estrutura química do etanol ......................................................................................
41
Figura 11 - Esquema sobre alterações neurofarmacológicas do uso crônico do álcool e da
síndrome de abstinência alcoólica ...............................................................................................
42
Figura 12 - Fotografia do labirinto radial de 8 braços .................................................................
52
Figura 13 - Ilustração da fase V do treinamento, com a interposição de retardo (5 s) entre o
4º e o 5º braços ...........................................................................................................................
54
Figura 14 - Cirurgia estereotáxica para o implante de cânulas bilaterais no CPFm ...................
56
Figura 15 - Fotos demonstrativas do procedimento de administração de drogas IC antes da
testagem da memória operacional espacial no labirinto radial de 8-braços ................................
59
Figura 16 - Média de erros ± e.p.m. nas 10 últimas sessões de treinamento na fase IV
(aprendizagem) no labirinto radial de 8-braços (n = 24) .....................................................................
65
Figura 18 - Média de erros ± e.p.m. dos animais antes (pré-retardo) e após (pós-retardo) o
retardo de 5 segundos nas sessões de treinamento da fase V para aquisição das tarefas no
labirinto radial de 8-braços (n = 24) .......................................................................................................
67
Figura 21 - Cortes coronais do cérebro de rato e localização de implante das cânulas. Fatias
com vermelho neutro e coloração azul de metileno ....................................................................
70
Figura 22 - Efeitos da combinação do antagonista NMDA (MK-801, 0,32; 1,0 e 3,2 µg) e
salina (SAL) ou etanol (ETOH 100 µg) ........................................................................................
72
Figura 24 - Efeitos da administração aguda do antagonista NMDA (Memantina 1,0; 3,2 e 10,0
µg) no córtex pré-frontal medial comparada ao controle salina (SAL) ........................................
74
Figura 26 - Efeitos da combinação do antagonista NMDA (Memantina, 1,0 e 10,0 µg) e salina
(SAL) ou etanol (ETOH 100 µg) ..................................................................................................
77
Figura 28 - Condição fisiológica do receptor NMDA relacionada aos processos de
aprendizagem. A aprendizagem é baseada na detecção de um sinal relevante (acima do
ruído basal) ..................................................................................................................................
94
Figura 29 - Condição patológica com superativação do receptor NMDA ................................... 95
Figura 30 - Esquema de ação do antagonista memantina na hipótese sinal-ruído ................... 96
LISTA DE TABELAS
Tabela 17 - Média do tempo gasto (segundos) ± e.p.m em cada braço visitado nas 10 últimas
sessões de treinamento na fase IV (aprendizagem) no labirinto radial de 8 braços (n = 24)......
66
Tabela 19 - Média do tempo gasto (segundos) ± e.p.m. pelos animais (n = 24) em cada braço
visitado no pré e pós-retardo de 5 segundos nas últimas 6 sessões de treinamento na fase V..
68
Tabela 20 - Média dos pesos corporais (gramas) ± e.p.m. dos animais (n = 24) durante as
fases de treinamento no labirinto radial de 8-braços e o seu percentual em relação à média do
peso inicial (262,9 ± 6,7) ..............................................................................................................
69
Tabela 23 - Média do tempo gasto (segundos) ± e.p.m. em cada braço visitado antes (pré-
retardo) e após (pós-retardo) os retardos de 1 hora no labirinto radial de 8-braços sob o
tratamento combinado do antagonista NMDA (MK-801) ou salina (SAL) e etanol (ETOH),
ambos administrados no córtex pré-frontal medial (n = 12) ........................................................
73
Tabela 25 - Média do tempo gasto (segundos) ± e.p.m. em cada braço visitado antes (pré-
retardo) e após (pós-retardo) os retardos de 1 hora no labirinto radial de 8-braços sob o
tratamento combinado do antagonista NMDA (Memantina = MEM) e salina (SAL), ambos
administrados no córtex pré-frontal medial (n = 12) ....................................................................
75
Tabela 27 - Média do tempo gasto (segundos) ± e.p.m. em cada braço visitado antes (pré-
retardo) e após (pós-retardo) os retardos de 1 hora no labirinto radial de 8-braços sob o
tratamento combinado do antagonista NMDA (Memantina = MEM) e etanol (ETOH) ou salina
(SAL), ambos administrados no córtex pré-frontal medial (n = 12) .............................................
78
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPA Ácido α-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propiônico
AMPc Monofosfato de Adenosina cíclico
ANOVA Análise de Variância
ATV Área tegmentar ventral
AB Área de Brodmann
Ca
+2
Cálcio
CaMKII Cálcio calmodulina quinase II
CEBRID Centro Brasileiro de Informações sobre Drogas Psicotrópicas
Cg Cingulado anterior
CPF Córtex pré-frontal
CPFm Córtex pré-frontal medial
DA Dopamina
ETOH Álcool etílico ou etanol
e.p.m. Erro padrão da média
Fr2 Córtex frontal anterior
GABA Ácido gama-aminobutírico
IC Intracortical
IP Intraperitoneal
MO Memória operacional
Mg
+2
Magnésio
MK-801 Maleato de dizocilpina
Na
+
Sódio
NAcc Núcleo accumbens
NMDA N-metil-D-aspartato
NMDAR Receptores tipo NMDA
SNC Sistema nervoso central
SAL Salina (Cloreto de sódio a 0,9%)
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 15
1.1 O Córtex Pré-Frontal ................................................................................................... 16
1.1.1 Neurotransmissão e Conexões do Córtex Pré-Frontal .................................. 18
1.1.2 Funções do Córtex Pré-frontal ....................................................................... 20
1.2 A Memória Operacional .............................................................................................. 22
1.2.1 O Córtex Pré-frontal e a Memória Operacional ............................................. 24
1.3 O Glutamato ............................................................................................................... 26
1.3.1 Os Receptores NMDA – Complexo ionóforo ............................................... 28
1.3.2 Os Antagonistas do Receptor NMDA ........................................................... 30
1.3.2.1 MK-801 e Memantina .............................................................. 33
1.4 Ação Fisiológica e Patológica do Receptor NMDA ..................................................... 36
1.4.1 Aprendizagem e memória ............................................................................ 37
1.4.2 Neurotoxicidade ........................................................................................... 38
1.5 NMDA Como Alvo de Drogas ..................................................................................... 40
1.6 O Etanol e Seus Efeitos no SNC ................................................................................ 41
1.6.1 Ação do Etanol no Receptor NMDA ............................................................ 43
1.6.2 Etanol, Memória Operacional e CPFm ........................................................ 44
2 OBJETIVOS .................................................................................................................. 47
2.1 Objetivo Geral ............................................................................................................. 48
2.2 Objetivos Específicos .................................................................................................. 48
3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................. 49
3.1 Animais ....................................................................................................................... 50
3.2 Drogas ........................................................................................................................ 50
3.3 Labirinto Radial de 8-Braços ....................................................................................... 51
3.4 Aquisição da Tarefa .................................................................................................... 52
3.5 Cirurgia Estereotáxica ................................................................................................. 55
3.6 Administração Intracortical da Droga .......................................................................... 58
3.7 Avaliação da Memória Operacional Espacial ............................................................. 59
3.8 Experimentos .............................................................................................................. 60
3.8.1 Experimento I - Efeitos da Combinação do Antagonista NMDA (MK-801) e
ETOH no CPFm sobre a Memória Operacional de Ratos ....................................
60
3.8.2 Experimento II - Ação do antagonista NMDA (Memantina) no CPFm sobre
a Memória Operacional de Ratos .........................................................................
60
3.8.3 Experimento III - Efeitos da Combinação do Antagonista NMDA
(Memantina) e ETOH no CPFm sobre a Memória Operacional de Ratos.............
61
3.9 Histologia .................................................................................................................... 61
3.10 Análise dos Resultados ............................................................................................ 62
4 RESULTADOS .............................................................................................................. 64
4.1 Aquisição da Tarefa no Labirinto Radial de 8-Braços ................................................. 65
4.1.1 Sem interposição de retardo de 5 segundos (Fase IV) ................................ 65
4.1.2 Com interposição de retardo de 5 segundos (Fase V) ................................ 67
4.2 Pesos Corporais Durante as Fases de Treinamento .................................................. 69
4.3 Localização das Cânulas ............................................................................................ 70
4.4 Experimentos .............................................................................................................. 71
4.4.1 Experimento I - Efeitos da Combinação do Antagonista NMDA (MK-801) e
ETOH no CPFm sobre a Memória Operacional de Ratos .................................
71
4.4.2 Experimento II - Ação do antagonista NMDA (Memantina) no CPFm sobre
a Memória Operacional de Ratos .........................................................................
74
4.4.3 Experimento III - Efeitos da Combinação do Antagonista NMDA
(Memantina) e ETOH no CPFm sobre a Memória Operacional de Ratos.............
75
5 DISCUSSÃO .................................................................................................................. 79
5.1 Modelo Experimental: Paradigma do Labirinto Radial de 8-braços ............................ 80
5.2 Sítio Neuroanatômico de Implantação das Cânulas ................................................... 82
5.3 Desenho Experimental: Drogas e Doses .................................................................... 84
5.4 Ação do Etanol e Envolvimento da Transmissão Glutamatérgica .............................. 85
5.4.1 Efeitos da Combinação do Antagonista MK-801 e Etanol ........................... 85
5.4.2 Efeitos do Antagonista Memantina sobre a Memória Operacional de Ratos 89
5.4.3 Efeitos da Combinação do Antagonista Memantina e Etanol ...................... 91
5.4.4 Envolvimento dos receptores NMDA nos efeitos de prejuízo do etanol
sobre a memória operacional no CPFm ...............................................................
97
5.5 Considerações Clínicas …………………………………………………………………… 100
5.5.1 Alcoolismo ................................................................................................... 100
5.5.2 Efeitos cognitivos do álcool ......................................................................... 101
6 CONCLUSÕES .............................................................................................................. 103
7 REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 105
15
1 INTRODUÇÃO
16
1.1 O Córtex Pré-Frontal
Os hemisférios cerebrais direito e esquerdo são divididos em quatro lobos
principais: frontal, temporal, parietal e occipital. Os lobos frontais correspondem à
região anterior ao sulco central e superior à fissura de Sylvio e caracterizam-se por
ser um dos sítios neuroanatômicos para as funções cognitivas, comportamentais e
da linguagem (Nolte, 1993, Adams et al., 1997, Machado, 1998).
Ao longo da evolução da espécie, os lobos frontais foram as últimas
estruturas dos hemisférios a serem formadas e, atualmente, estão presentes em
todos os mamíferos, sendo pouco desenvolvido em animais inferiores, e
apreciavelmente grande, em primatas. No homem, os lobos frontais ocupam até um
quarto da massa total dos hemisférios cerebrais (Luria, 1981; Nolte, 1993; Adams et
al., 1997).
Os lobos frontais podem ser divididos em córtex motor e pré-motor, localizado
mais posteriormente e responsável pela função motora (movimento) e em córtex pré-
frontal (CPF), situado mais rostralmente, anterior ao sulco pré-central. O CPF,
quando estimulado eletricamente, não produz movimento ou sensações sensoriais
(Kolb, 1984; Adams et al., 1997). Essas duas regiões são formadas por isocórtex
(camadas corticais bem definidas) e podem ser diferenciadas quanto à
citoarquitetura cortical. O CPF apresenta uma camada IV granular, o que não é
evidenciado na região mais posterior dos lobos frontais (Kolb, 1984).
Seguindo um gradiente ontogenético do córtex sensorial primário para áreas
de associação multimodais, as áreas posteriores do córtex são responsáveis pela
percepção das informações do meio e as áreas frontais pelas funções executivas do
comportamento. O CPF integra as mais elaboradas informações da percepção e da
execução do comportamento (Fuster, 2000a; Fuster 2001).
Pode-se definir CPF como sendo a região dos lobos frontais que recebem
maciças projeções do núcleo dorso medial do tálamo (Rose e Woolsey, 1948). Essa
definição aplica-se a grande maioria dos mamíferos.
O CPF é caracterizado como uma área de associação terciária, multimodal,
cuja função é primariamente integrativa, não sendo exclusivamente sensorial ou
motora (Luria, 1981; Machado, 1998; Fuster, 2001), podendo ser dividido
17
anatomicamente em três regiões bem definidas (lateral, medial e ventral/orbital) em
primatas humanos e não-humanos.
Brodmann subdivide as áreas de acordo com sua citoarquitetura, definindo
quatro regiões principais: oculomotora (área 8 de Brodmann); dorsolateral (áreas 9 e
10 de Brodmann); orbitofrontal lateral (área 10 de Brodmann) e cingulado anterior ou
córtex pré-frontal medial (CPFm) (área 24 de Brodmann) (Fuster, 2002) (Fig. 1).
Figura 1 - Áreas do CPF lateral e medial (à esquerda) e lateral, medial e orbital (à direita) da
espécie humana, numeradas segundo o mapa citoarquitetônico de Brodmann. (Extraído de
Nature, 405: 347-351, 2000a).
18
A área 24 de Brodmann (cingulado anterior) recebe a maior parte das
projeções do núcleo dorso medial do tálamo.
Em roedores, as áreas correspondentes ao CPFm seriam Cg1 e Cg2 do
córtex cingulado anterior, Cg3 do córtex pré-límbico e Fr2 do córtex frontal (Zilles e
Wree, 1985) (Fig. 2).
Figura 2 - Visão superior global do cérebro de rato (à direita) Visão medial do cérebro de
rato. À esquerda, observa-se em destaque em vermelho as áreas Cg1, Cg2 e Cg3 do
cingulado anterior e Fr2 do córtex frontal motor, que compõem o córtex pré-frontal medial
em roedores. (Extraído e Adaptado de Zilles e Wree, 1985).
1.1.1 Neurotransmissão e Conexões do Córtex Pré-Frontal
A função integrativa e multimodal do CPF está diretamente relacionada com
suas conexões aferentes e eferentes. O CPF não recebe as aferências sensoriais
diretamente da periferia, mas processa as informações através de suas conexões
com outras regiões corticais e subcorticais (Barbas, 2000).
Como já citado no estudo de Rose e Woolsey em 1948 e, de acordo com
Uylings e Van Eden (1990), uma área só pode ser incluída como parte do CPF se
19
suas conexões forem mais proeminentes com o núcleo dorso medial do tálamo,
quando comparadas a outros núcleos talâmicos.
O CPF é constituído de uma variedade de células como neurônios piramidais
glutamatérgicos, eferências e interneurônios colinérgicos e interneurônios
gabaérgicos
As aferências glutamatérgicas do CPF chegam de inúmeras áreas
subcorticais como núcleo accumbens, corpo amigdalóide, hipocampo, hipotálamo,
núcleo dorso medial do tálamo e outros núcleos talâmicos. As aferências
dopaminérgicas provem da área tegmentar ventral; aferências serotoninérgicas dos
núcleos medial e dorsal da rafe; aferências noradrenérgicas do locus coeruleus e por
fim, aferências colinérgicas do núcleo basalis magnocellularis e núcleo dorsolateral
mesopontino. As principais eferências do CPF dirigem-se, virtualmente, para todas
as regiões que para ele se projetam e são todas glutamatérgicas (Steketee, 2003).
Os neurônios dopaminérgicos, serotoninérgicos e noradrenérgicos,
provenientes, respectivamente, da área tegumentar ventral (ATV), dos núcleos
medial e dorsal da rafe e do locus coeruleus, modulam a eferência glutamatérgica do
CPF, controlando a atividade destes neurônios sobre as estruturas subcorticais
como o núcleo accumbens (NAcc) e o striatum (Thierry et al., 1990). Enquanto que
as aferências glutamatérgicas oriundas principalmente do núcleo dorso medial do
tálamo, do hipocampo e da amígdala estabelecem sinapses excitatórias sobre os
dendritos dos neurônios piramidais eferentes (glutamatérgicos) e dos interneurônios
inibitórios (gabaérgicos) do CPF (Steketee, 2003).
Dos lobos frontais direito e esquerdo, originam-se circuitos frontais-
subcorticais paralelos que interligam estruturas do córtex frontal ao núcleo caudado,
putâmen, globo pálido e tálamo (Tekin e Cummings, 2002). São identificados cinco
circuitos frontais-subcorticais que expressam essa organização topográfica entre os
núcleos da base, o tálamo e o córtex frontal: circuito dorsolateral, orbitofrontal,
cingulado anterior, motor e oculomotor (Cummings, 1993). Destes circuitos, apenas
os três primeiros citados originam-se no CPF. Os outros dois são essencialmente
motores e, portanto, possuem sua origem em áreas motoras (área motora
suplementar e campos ópticos frontais, respectivamente).
20
1.1.2 Funções do Córtex Pré-frontal
Grandes avanços na compreensão das funções do CPF se devem a estudos
realizados com pacientes lesionados nessa região cerebral. O papel da área pré-
frontal tem sido desvendado a partir de experiências feitas em macacos e da
observação de casos clínicos nos quais houve lesão dessa área (Machado, 1998;
Kandel et al., 2003).
Por muito tempo, atribuiu-se ao CPF o controle comportamental abstrato, a
síntese intelectual, o comportamento ético, o afeto e a auto-consciência (Kolb,
1984). Entretanto, Hebb em 1939 (apud Kolb, 1984), observou em seus estudos que
pacientes submetidos à cirurgias para remoção dos lobos frontais não apresentavam
dificuldades nos testes padronizados de inteligência, permanecendo esta função
preservada. A partir de então, notou-se que as funções dos lobos frontais eram mais
específicas, não sendo responsável por todos os aspectos da intelectualidade (Kolb,
1984).
O CPF possui um papel central no controle cognitivo. Esta região recebe
projeções de áreas dos lobos occipital, parietal, e temporal, e também, do giro
cingulado. Com isso, parece receber informações sobre todas as modalidades
sensoriais e também do estado motivacional e emocional do individuo. Além disso,
está envolvido na organização temporal do comportamento, mediando as
contingências sensório-motoras através da integração da ação motora com as
informações sensoriais recentes (Kolb, 1984; Fuster, 1991).
Por ser uma área de grande variedade e heterogeneidade de conexões,
sugere-se que CPF esteja relacionado ao controle do estado geral do córtex cerebral
e atividades complexas, como planejamento e controle comportamental e emocional
do indivíduo (Luria, 1981). Por possuir circuitos córtico-subcorticais, exerce influencia
nos estados de alerta, estresse e humor, bem como em funções específicas como a
gratificação do comportamento, atenção seletiva e memória (Robbins, 2000). Em
primatas, as áreas pré-frontais medial, lateral e orbitofrontal estão fortemente
interconectadas, sugerindo que elas participam do planejamento e controle das
funções executivas centrais (Fuster, 2002).
De acordo com Kolb (1984) e Fuster (1991), o CPF seria atuante na
organização temporal do comportamento, e ligaria as informações sensoriais a uma
21
ação comportamental adequada e em tempo adequado. Desta forma, estaria no
topo das estruturas relacionadas com integração sensório-motora.
Para a execução de uma ação, mediante uma percepção, o CPF utiliza-se de
pelo menos três funções cognitivas importantes nessa organização temporal do
comportamento: uma função retrospectiva para manutenção da informação sensorial
recente (memória operacional), uma função prospectiva de preparação para a
resposta motora (planejamento) (Olton, 1979; Baddeley, 1997) e uma função
responsável pelo controle inibitório de interferência (Fuster, 1999).
A capacidade para processar as informações recebidas e planejar ações
apropriadas num tempo futuro antes de responder ao estimulo sensorial de uma
maneira reflexiva é altamente desenvolvida em primatas e depende similarmente de
um CPF altamente desenvolvido (Constantinidis et al., 2002).
Dada a importância do CPF, não surpreende observar que lesões em suas
áreas levam a um profundo distúrbio de personalidade, do afeto, do controle motor,
da linguagem, da memória, da atenção e da resolução de problemas. Estudos
realizados em animais e humanos sugerem que diferentes regiões do CPF
respondem por diferentes funções mentais. Por exemplo, os distúrbios de
personalidade e afetivos estão associados a lesões pré-frontal orbital, enquanto que
os distúrbios de linguagem à área de Broca e os distúrbios de memória a lesões pré-
frontal dorsolateral (Shimamura, 1997).
Desde a definição de CPF por Rose e Woolsey (1948), a região medial do
CPF (CPFm) é amplamente estudada, por ser um dos componentes do circuito de
gratificação cerebral, e ser uma estrutura mediadora dos efeitos reforçadores de
algumas drogas de abuso, além de também participar de uma variedade de funções
cognitivas (Tzschentke, 2000; Dalley et al., 2004).
Evidências que o CPFm estivesse envolvido em funções de memória e
aprendizado foram marcadas por experimentos com animais utilizando-se tarefas de
resposta com retardo (delayed-response). Disfunções cognitivas e de memória
associadas à lesões no CPFm, são particularmente aquelas que envolvem a
interposição de um intervalo de tempo (segundos, minutos ou horas) geralmente no
meio da realização de uma tarefa cognitiva (Delatour e Gisquet-Verrier, 1999).
As funções do CPFm de ratos são equivalentes às encontradas nas regiões
dorsolateral e, possivelmente, cingulado anterior de primatas. Assim, o CPFm está
relacionado ao controle das funções executivas centrais (Kesner, 2000; Uylings et
22
al., 2003). Dentre essas funções, incluem a capacidade de detectar novos estímulos
(Dias e Honey, 2002), a organização temporal do comportamento (Fuster, 2000b),
os processos atencionais (Birrel e Brown, 2000) e mnemônicos (Kesner, 2000). A
memória operacional é uma das funções mnemônicas muito estudada, tanto em
roedores quanto em primatas (Goldman-Rakic, 1992; Baddeley, 2003).
1.2 A Memória Operacional
O termo memória operacional parece ter sido inicialmente proposto por Miller,
Galanter e Pribram na década de 60, e adotado posteriormente por Baddeley e Hitch
em 1974 (apud Baddeley, 2001), e a partir de então, foi modificado e
complementado ao longo do tempo, por outros pesquisadores.
A memória operacional (ou de trabalho) processa e armazena
temporariamente uma determinada informação sensorial (recente e relevante) que
será manipulada durante a execução de tarefas cognitivas que envolvem
aprendizado, compreensão e raciocínio (Baddeley, 2003). Uma ampla variedade de
habilidades cognitivas em humanos como leitura, aprendizagem, compreensão e
raciocínio dependem desse sistema (Baddeley, 1983; Goldman-Rakic, 1992;
Baddeley, 1997). Além disso, participa dos processos da mente fornecendo uma
interface entre a percepção, a memória de longo prazo e a ação (Miyake e Shah,
1999).
Outros estudos definem a memória operacional como um conjunto de
processos cognitivos distintos que inclui o armazenamento temporário de
informações e a sua recuperação (evocação) que são convertidas em uma ação
efetiva e apropriada após intervalos curtos (segundos) ou longos (minutos a horas)
(Fuster, 1997; Floresco e Phillips, 2001; Phillips et al., 2004). A informação somente
estaria acessível enquanto possuísse relevância para a tarefa em execução, sendo,
a seguir, descartada e substituída por outras informações necessárias para uma
nova atividade (Olton, 1979; Goldman-Rakic, 1992; Baddeley, 1997).
23
Um exemplo comum do funcionamento da memória operacional é o
armazenamento temporário de um número de telefone até que o mesmo seja
discado e, então, imediatamente esquecido. Este critério distingue a memória
operacional das memórias semântica, procedural e de referência (Goldman-Rakic,
1992).
Em 1974, Baddeley e Hitch (apud Baddeley, 2001) propuseram um modelo de
múltiplos componentes para a memória operacional. De acordo com os referidos
autores, a memória operacional compreende múltiplos e especializados
componentes da cognição que permitem aos seres humanos compreender o meio
em que vivem, reter as informações da experiência, sustentar a aquisição de novas
informações, resolver os problemas e formular novas estratégias diante dos alvos
presentes (Baddeley e Logie, 1999).
Este modelo, inicialmente foi dividido em três componentes: (1) o executivo
central, um sistema de controle atencional de capacidade limitada, responsável por
tomada de decisões, planejamento de estratégias, raciocínio e controle do
comportamento, que é auxiliado por dois sub-sistemas de armazenamento, (2) a
alça fonológica e (3) a alça visuoespacial, responsáveis pela manutenção temporária
da informação codificada verbalmente e da informação visuoespacial,
respectivamente (Baddeley, 2001).
Um quarto componente da memória operacional ─ o buffer episódico (ou
interface) ─ foi proposto como sendo a base na qual se daria a interação das
informações processadas pelas alças fonológica e visuoespacial com o conteúdo da
consciência e da memória de longo prazo. Este seria um sistema de estoque
temporário, capaz de integrar informações de uma variedade de episódios e
sistemas permitindo que múltiplas fontes de informação sejam consideradas
simultaneamente através da consciência e sob o controle atencional do executivo
central (Baddeley, 2000; Baddeley, 2001).
Portanto, assume-se que o executivo central seja um sistema puramente
atencional cujo papel vai além das funções de memória, enquanto o buffer episódico
assume então, um caráter puramente mnemônico (Baddeley, 2001).
Vários modelos de testes foram desenvolvidos com o objetivo de avaliar a
memória operacional em seus diversos aspectos. Nos modelos experimentais, a
neurociência comportamental em animais, utiliza-se do labirinto radial de 8-braços
como paradigma para testagem da memória operacional. Olton e Samuelson (1976)
24
propuseram o labirinto radial de 8-braços para avaliar a memória operacional no seu
aspecto visuoespacial. Neste contexto, denomina-se como memória operacional
espacial aquela que capacita o animal a localizar-se no espaço, através de pistas
visuais e espaciais do ambiente (Olton, 1979; Gagliardo, Mazzotto e Divac, 1997).
Vale ressaltar que o labirinto radial pode ser utilizado em diferentes protocolos
experimentais em diferentes versões, que estariam avaliando funções cognitivas
distintas.
1.2.1 O Córtex Pré-frontal e a Memória Operacional
O CPF desempenha papel gerenciador de vários processos cognitivos,
inclusive da memória operacional (Goldman-Rakic, 1992). Inicialmente, a correlação
entre o CPF e a memória operacional foi descoberta pela observação de pacientes
que apresentavam lesões nessa área cerebral e na avaliação da atividade de
neurônios pré-frontais do córtex de macacos durante tarefas com retardo. As células
do CPF permaneciam ativadas, mantendo a informação ativa (on-line), na ausência
do estímulo e durante o tempo variável do retardo até o término da tarefa. Os
neurônios ativados durante o período de retardo foram considerados o sítio
anatômico da memória operacional (Goldman-Rakic, 1992).
Fuster (2002), relatando sobre as funções cognitivas do lobo frontal,
evidenciou a associação do CPF com outras regiões cerebrais, de forma a manter
um circuito de reverberação durante a execução da memória operacional, um
processo crucial para sustentação da informação enquanto durar a função.
Recentes estudos em macacos que desempenhavam testes com retardo
também sugerem um papel crucial para o CPF no processamento da memória
operacional. Lesões da região dorsolateral do CPF produziriam prejuízos
dependentes de retardo, ou seja, o prejuízo aumenta com o aumento do tempo de
intervalo na tarefa desempenhada pelo animal. Além disso, registros
eletrofisiológicos da atividade de neurônios do CPF dorsolateral demonstraram um
nível de disparo neuronal persistente e mantido durante o intervalo de retenção nas
tarefas com retardo (Curtis e D’Esposito, 2003).
25
Lesões no CPFm de ratos produzem vários déficits na aquisição e retenção
em testes de memória operacional, tais como resposta com retardo, alternação com
retardo, e outras tarefas relacionadas (Uylings et al., 2003).
Esses neurônios são, em sua maioria, piramidais e se projetam para inúmeras
áreas corticais e subcorticais, nas quais secretam glutamato como neurotransmissor.
A manutenção da informação on line para utilização em processos cognitivos,
poderia ser explicada pela ativação, através desses neurônios, das áreas
relacionadas à percepção sensorial e, ainda, áreas relacionadas à memória de longa
duração, por exemplo, hipocampo e corpo amigdalóide (Goldman-Rakic et al., 2000;
Steketee, 2003).
Numerosos sistemas de neurotransmissores, incluindo noradrenérgico,
serotoninérgico, glutamatérgico, gabaérgico, colinérgico e dopaminérgico modulam
os neurônios piramidais do CPF e, mudanças nas interações entre estes sistemas
de neurotransmissores no CPF podem levar a alterações de respostas
comportamentais (Steketee, 2003).
A memória operacional, em primatas e roedores, tem sido objeto de estudo
para investigação dos principais sistemas de neurotransmissão envolvidos em
funções executivas pré-frontais. Os primatas não-humanos têm uma capacidade de
memória operacional tão boa quanto o homem. Em todas as espécies, o CPF
processa a memória operacional interagindo com o córtex entorrinal, parietal
superior e cingulado anterior e com o hipocampo (Izquierdo et al., 1998; Artiges et
al., 2000).
Em humanos, estudos de neuroimagem funcional têm ajudado a mapear as
áreas cerebrais envolvidas no processamento de funções cognitivas e mnemônicas
complexas (Courtney et al., 1998). Estudos realizados em indivíduos normais
sugerem que o funcionamento das alças fonológica e visuo-espacial se dá em
regiões cerebrais diferentes, onde o hemisfério direito estaria ativado durante a
memória operacional visuo-espacial e o hemisfério esquerdo durante a memória
operacional verbal (Smith et al., 1996).
A memória operacional não pode ser definida pelo seu conteúdo ou sua
duração, mas sim pelo contexto em que opera, sendo melhor entendida como
memória em e para a ação (Fuster, 1991; Fuster, 1997). Isto reforça a existência de
envolvimento do CPF, pois possui funções de interface entre a percepção sensorial
e a ação motora (Goldman-Rackic, 1992).
26
Sabe-se que o CPF está envolvido na mediação de respostas
comportamentais complexas. Consideráveis esforços são dirigidos para refinar o
conhecimento sobre esta área cerebral e o seu papel no desempenho cognitivo e
comportamental como na gratificação e recompensa no abuso de drogas
(Tzschentke, 2001).
1.3 O Glutamato
Pela possibilidade de ser sintetizado nos neurônios, o glutamato é um
aminoácido não-essencial (Kandel et al., 2003) que apresenta um importante papel
na transmissão de sinais excitatórios via neurônios de projeção no sistema nervoso
central (SNC). De fato, de bilhões de neurônios com axônio longo no SNC, a maioria
utiliza o glutamato como seu principal neurotransmissor, e também neurônios locais
excitatórios (Dickenson, 2001).
O progresso nas pesquisas com aminoácidos excitatórios nos últimos
quarenta anos está bem documentado. Estes estudos originaram-se na descoberta
por Hayashi em 1954 (apud Watkins, 1994) dos efeitos convulsivos do L-glutamato e
L-aspartato em cérebro de mamífero, e a demonstração mais tarde da
despolarização e ação excitatória destes aminoácidos sobre neurônios centrais
(Curtis et al., 1959, 1960 apud Watkins, 1994). Hoje o L-glutamato é largamente
aceito como transmissor excitatório predominante no sistema nervoso central,
agindo sobre diferentes tipos de receptores (Watkins, 1994).
O ácido N-Metil-D-aspártico, a forma ácida do NMDA, é um potente
aminoácido que foi sintetizado especificamente para o estudo da relação estrutura
atividade dos ácidos L-glutâmico e L-aspártico por Watkins em 1962 (apud Watkins,
1994) (Fig. 3).
27
Figura 3 - Estruturas químicas do ácido L-glutâmico (L-Glu), ácido L-aspártico (L-Asp) e o
ácido N-metil-D-aspártico (NMDA) (Extraído de Watkins, 1994 pp. 1-21).
Até meados da década de 80, neurofarmacologistas classificaram os
receptores glutamatérgicos em NMDA e não-NMDA, sendo o último subdividido em
quisqualato e kainato. Atualmente, a classificação aceita é ácido α-amino-3-hidróxi-
5-metil-4-isoxazol propiônico (AMPA), kainato, NMDA, que possuem ação excitatória
frente à agonistas sintéticos e bloqueio dos efeitos com antagonistas, e
metabotrópicos. Este último tipo de receptor é dividido em três grupos (I, II, III)
contendo pelo menos 2 subtipos em cada grupo (Dickenson, 2001).
Podemos caracterizar os receptores NMDA, kainato e AMPA como
“ionotrópicos”. A principal função destes receptores é mediar o fluxo iônico sob
mudanças de potencial e condutância envolvidos na transmissão sináptica (Watkins,
1994).
Outro grupo de receptores de aminoácidos excitatórios, são chamados de
“metabotrópicos”, e considerados importantes em mudanças de longa duração
devido sua ligação com sistemas metabólicos (notavelmente hidrólise de
fosfoinositideos e produção de AMPc) envolvendo segundo mensageiros (Watkins,
1994).
Como descrito acima, o receptor NMDA, é um subtipo específico de receptor
do aminoácido excitatório que tem alcançado maior foco de atenção, isto porque
evidências sugerem que este receptor está envolvido em uma larga variedade de
processos neurofisiológicos e patológicos, como aquisição de memória, plasticidade
28
no desenvolvimento, epilepsia, e efeitos neurotóxicos da isquemia cerebral (Cooper
et al., 2003).
1.3.1 Os Receptores NMDA – Complexo ionóforo
O receptor NMDA é um tetrâmero com uma estrutura heteromérica composta
de 2 subunidades diferentes de proteínas: NMDAR1 (ou NR1) e NMDAR2 (ou NR2).
Cooper et al. (2003), referem que estudos atuais ainda não esclarecem quantas
subunidades estão presentes nos receptores. Entretanto, Dickenson (2001) afirma
que para se ter as formas funcionais dos receptores NMDA estes devem ser
compostos por uma combinação da subunidade NR1 e uma ou mais subunidades
NR2 (Fig. 4).
A topologia dos receptores glutamatérgicos é descrita com a presença de 3
domínios transmembranas (M1, M3, e M4) mais uma reentrada na membrana na
face citoplasmática (M2) (Dingledine et al., 1999).
Figura 4 - Representação esquemática do receptor NMDA heteromérico composto pelas
subunidades NR1 e NR2. Cada subunidade é composta por três domínios transmembranas
(M1, M3, e M4) mais uma reentrada na membrana na face citoplasmática (M2). Os sítios de
ligação da glicina e glutamato também estão representados (Extraído de Woodward, 2000).
29
O modelo do complexo receptor-ionóforo do NMDA é composto, de forma
simplificada, de um sítio para reconhecimento do agonista e um sítio modulatório
para a glicina, que interage com seus respectivos ligantes de uma maneira
cooperativa para a abertura do canal iônico através do qual acontece o influxo de
cálcio (Ca
2+
) e sódio (Na
+
), e efluxo de potássio (K
+
) (Watkins, 1994) (Fig. 5). É um
receptor caracterizado por alta permeabilidade ao cálcio e com cinética lenta de
ativação/desativação (Maler et al., 2005).
Dentro do canal iônico está o sítio de ligação para o Mg
2+
e fenciclidina (PCP).
Quando este sítio está ocupado ocorre bloqueio do canal e assim inibição do fluxo
iônico. A existência de sítios modulatórios para o Zn
2+
e poliaminas também tem sido
proposta em alguns estudos (Watkins, 1994) (Fig. 5).
Figura 5 - Modelo mostrando o receptor N-Metil-D-Aspartato (NMDA), bloqueio pelo magnésio
(
Mg
2+
) e sítios de ligação. PCP = fenciclidina, Zn
2+
= zinco, Na
+
= sódio, Ca
2+
= cálcio, K
+
=
potássio (Extraído e adaptado de
http://www.securitylab.ru/analytics/241606.php).
30
O receptor NMDA é um canal ligante-dependente (Cooper et al., 2003), pois
para ativação do canal é necessária a ocupação de dois sítios de agonista e glicina,
envolvendo duas subunidades do receptor (Benveniste e Mayer, 1991; Williams et
al., 1998 apud Watkins, 1994). Além disso, é um canal voltagem-dependente, pois
necessita da despolarização prévia da membrana, por exemplo, pela ação do
glutamato em receptores não-NMDA do tipo AMPA, para expulsão do Mg
2+
e
subseqüente desbloqueio do canal (Dickenson, 2001).
O complexo receptor-ionóforo NMDA tem sido caracterizado fisiologicamente
e farmacologicamente e é amplamente distribuído no hipocampo, medula espinhal e
córtex cerebral de mamíferos. Em casos de ativação sináptica repetitiva, uma
grande despolarização é evocada resultando no envolvimento dos receptores
NMDA. Isto levaria a um grande influxo de Ca
2+
. Assim, os receptores NMDA são
elementos principais na potenciação e depressão de longa duração (LTP e LTD,
respectivamente), na plasticidade, no controle fino do movimento coordenado,
padrões de comportamento, e aprendizagem e memória (Watkins, 1994).
Entretanto, uma superativação ou estimulação prolongada podem
eventualmente gerar morte neuronal por excitotoxidade e estados patológicos
incluindo o fenômeno epiléptico e neurodegeneração (Cooper et al., 2003).
1.3.2 Os Antagonistas do Receptor NMDA
A farmacologia do receptor NMDA indica três possíveis mecanismos de
antagonismos. A modulação funcional do receptor pode ser realizada através de
ações em (1) alguns sítios de reconhecimento, o qual se inclui o sítio dos
transmissores primários, o sítio onde o glutamato e a glicina se ligam (antagonistas
competitivos), (2) o sítio da fenciclidina, ketamina e MK-801 (bloqueadores ou
antagonistas não-competitivos de canal aberto) situado dentro do canal iônico e
agem sempre com o receptor NMDA ativado, e (3) alguns sítios modulatórios
(antagonistas não-competitivos) (Dingledine et al., 1999; Dickenson, 2001; Kandel et
al., 2003) (Fig. 6).
31
Figura 6 - Modelo simplificado da ativação e bloqueio do receptor NMDA. (A) Glutamato e a
glicina devem se ligar ao receptor para ativá-lo. Existem quatro categorias de antagonistas
do receptor NMDA: antagonistas competitivos (B), que se ligam ao sítio do glutamato,
impedindo seu acoplamento; antagonistas da glicina (C), que se ligam ao sítio da glicina e
impede sua ação; antagonistas não-competitivos (D), que inibem o receptor NMDA por
ligação em sítios alostéricos e, por fim, bloqueadores de canal (E), com ligação em sítios
dentro do receptor bloqueando o canal iônico (Extraído e adaptado de
http://en.wikipedia.org/wiki/NMDA_receptor_antagonist).
32
No presente estudo será dado maior ênfase aos antagonistas ou
bloqueadores não-competitivos de canal aberto por fazerem parte do protocolo
experimental aplicado neste projeto de pesquisa.
Um bloqueador não-competitivo de canal aberto age somente quando o
receptor está ativado, e não quando o receptor está em repouso. Íons Mg
2+
,
poliaminas citoplasmáticas e uma variedade de outros compostos, dentre os quais,
antagonistas não-competitivos, são conhecidos por entrarem e bloquearem o canal
quando este se encontra aberto. Assim, a freqüência do bloqueio é uso-dependente
e é acelerado pelo aumento da probabilidade de abertura do canal. Uma vez ligado,
entretanto, o bloqueador pode ficar retido quando o canal se fechar, determinando
uma recuperação de seus efeitos geralmente lenta (Dingledine et al., 1999)
Incluem neste grupo a fenciclidina e a ketamina, agentes primariamente
anestésicos, porém apresentando risco potencial de abuso em função dos seus
efeitos alucinogênicos (MacDonald et al., 1991; Lipton, 1993). O mais potente destes
agentes é o MK-801 (Fig. 7), sendo o seu bloqueio de difícil reversão (Dingledine et
al., 999). Fazem ainda parte deste grupo agentes de uso clínico no tratamento das
demências como a amantadina e a memantina (Parsons et al., 1999).
RECEPTOR NMDA
Figura 7 - Representação esquemática mostrando o sítio para o MK-801, ketamina e
fenciclidina (bloqueadores não-competitivos de canal aberto).
33
1.3.2.1 MK-801 e Memantina
A memantina (1-amino-3,5-dimetiladamantana) foi sintetizada pela primeira
vez em 1968 como um derivado da amantadina (agente antiviral). Possui três anéis
(adamantano) e uma amina que em condições fisiológicas liga-se ao sítio de Mg
2+
do
receptor NMDA. Desde 1980, a memantina (akatinol) é comercializada na Alemanha
para diferentes finalidades. Em 1999 estudos mostraram resultados positivos para o
na Doença de Alzheimer e demências vasculares graves. Entretanto, somente em
2003 foi aprovada pelo Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento da
Doença de Alzheimer em estágios moderado à grave. Este medicamento aumenta a
autonomia do paciente portador da Doença de Alzheimer, na habilidade de levantar-
se, mover-se, orientar-se no espaço, nas atividades de vida diária, entre outros
(Parsons et al., 1999).
O maleato de dizocilpina ((+)-5-metil-10,11-dihidroxi-5h-dibenzociclohepteno-
5,10-imina), MK-801, é uma droga utilizada experimentalmente, considerada um
agente de maior bloqueio do canal NMDA (Misztal et al., 1996; Parsons et al., 1999)
(Fig. 8).
1-amino-3,5-dimethyl-adamantane
(+)-5-methyl-10,11- dihydro-5h-
dibenzocyclohepten-5,10-imine maleate
Figura 8 - Estrutura química da memantina à esquerda (Extraído de Parsons et al., 1999) e
MK-801 à direita (Extraído de http://en.wikipedia.org/wiki/Dizocilpine).
34
Ao final da década de 80, descobriu-se que a memantina é um agente que
exerce seu efeito sobre a atividade do receptor NMDA ligando-se ao sítio do Mg
2+
ou
similar, bloqueando a atividade do receptor quando o canal iônico está aberto
(Parsons et al., 1999).
Suas propriedades farmacodinâmicas foram investigadas em estudos in vitro
com neurônios de roedores. O bloqueio da memantina acontece na subunidade
NR1/NR2 em humanos (Parsons et al., 1999).
O bloqueio do receptor NMDA pela molécula de Mg
2+
é efêmero e, a célula é
despolarizada continuamente até que o Mg
2+
seja totalmente liberado. Por isso, na
maioria dos casos, o Mg
2+
não é suficiente para bloquear o influxo excessivo do
Ca
2+
. A cinética de bloqueio/desbloqueio da memantina no receptor NMDA é
relativamente rápida. O MK-801, por sua vez possui uma alta afinidade, baixa
voltagem-dependência e cinética de desbloqueio lenta. Assim, embora o MK-801
ofereça certa neuroproteção, produz efeitos colaterais e inibe processos plásticos
fisiológicos. Parece então que a memantina, possui uma ação não-competitiva com
tempo de permanência no canal mais prolongado que o Mg
2+
e mais curto do que o
MK-801 (Parsons et al., 1999) (Fig. 9).
35
Figura 9 - Esquema da cinética de bloqueio e desbloqueio do Mg
2+
, Memantina e MK-801 e
voltagem-dependência nas situações fisiológica e patológica (Extraído e adaptado de
Parsons et al., 1999).
A memantina deixa o canal sob forte despolarização sináptica (Fig. 9), por ser
dependente de voltagem e possuir taxa de desbloqueio rápida. Portanto, essa
combinação de cinética rápida e voltagem-dependência podem ressaltar sua
habilidade de bloquear os efeitos neurotóxicos do receptor NMDA sem trazer
prejuízos na mediação de processos fisiológicos como a LTP (Parsons et al., 1993).
36
Esses dois parâmetros estão diretamente relacionados com a afinidade, ou
seja, quanto menor a afinidade maior a rapidez cinética e maior a voltagem
dependência (Parsons et al., 1999), o que provavelmente faz diferir a ação
farmacológica da memantina do MK-801.
A excitotoxidade tem recebido grande atenção de estudiosos, uma vez que
está implicada na fisiopatologia de diversas doenças neurodegenerativas agudas e
crônicas. Contudo, encontrar uma droga que combata a excitotoxidade em excesso
(que leva a morte neuronal), mas que não produzam efeitos colaterais inaceitáveis,
tem sido um grande desafio.
1.4 Ação Fisiológica e Patológica do Receptor NMDA
A transmissão glutamatérgica dita fisiológica apresenta diversas etapas,
iniciando numa situação de repouso com a liberação do glutamato na fenda
sináptica, ativação de receptores do tipo NMDA e AMPA na pós-sinapse, saída do
Mg
2+
seguida do desbloqueio do canal, influxo de Na
+
e Ca
2+
e efluxo de K
+
. Na
situação de repouso, pode ser registrado um “ruído de fundo” que é uma condição
proporcionada pela abertura do canal devido à saída parcial e transitória da
molécula de Mg
2+
. Apenas com a chegada do potencial de ação e interação
glutamatérgica nos receptores, há indução de modificações iônicas despolarizantes
detectadas com sinal eletrofisiológico de amplitude maior que o ruído de fundo
(Parsons et al., 1999).
A transmissão patológica parece estar relacionada à presença constante de
baixas concentrações de glutamato no espaço sináptico que consegue deslocar o
Mg
2+
do canal do receptor NMDA levando à uma despolarização parcial e
sustentada da membrana pós-sináptica com influxo contínuo de Ca
2+
e aumento da
sua concentração no interior do neurônio. Com a chegada do potencial de ação pré-
sináptico gera-se uma despolarização mais marcante na pós-sinapse aumentando
ainda mais a concentração de Ca
2+
. Esta condição eletrofisiológica patológica
produz modificações de longa duração como a neurodegeneração (Danysz et al.,
1995; Parsons et al., 1999).
37
1.4.1 Aprendizagem e memória
Uma das funções mais complexas do SNC é a habilidade de aprender e
lembrar (Cooper et al., 2003). Os receptores NMDA apresentam dois papéis
fisiológicos importantes no SNC de vertebrados: são mediadores da transmissão
sináptica em muitas vias no cérebro e estão criticamente envolvidos na plasticidade
neuronal (Bashir et al.,1994).
Os fenômenos mais estudados que acarretam mudanças na eficácia sináptica
são a potenciação de longa duração (long-term potentiation, LTP) e a depressão de
longa duração (long-term depression, LTD), que resultam de alterações funcionais
na neurotransmissão excitatória mediada por receptores glutamatérgicos pós-
sinápticos.
A LTP é um aumento da eficiência sináptica que pode ser induzida por certos
tipos de estimulação elétrica tetânica por vias aferentes no hipocampo (Bashir et al.,
1994; Dickenson, 2001).
A LTP pode, e talvez deva ser vista como um membro de uma família de
eventos plásticos que algumas regiões do cérebro são capazes de desempenhar
com a maquinaria bioquímica à sua disposição. Acredita-se que os mecanismos
envolvidos na sua indução, expressão, e manutenção são fundamentais para a
aprendizagem e a memória nos vertebrados (Dickenson, 2001).
Eventos do tipo LTD, por outro lado, poderiam estar associados a processos
de esquecimento, habituações ou extinções. Entretanto, a LTD parece contribuir
para o aspecto motor do aprendizado no córtex cerebelar em animais (Dickenson,
2001).
Juntos, a autofosforilação da cálcio calmodulina quinase 2 (CaMKII) e um
grande aumento no Ca
2+
pós-sináptico mediado por receptor NMDA, decorrente de
uma estimulação de alta freqüência, induziria a LTP. Uma conseqüência da forte
ativação do receptor NMDA e o conseqüente aumento de íons Ca
2+
no dendrito pós-
sináptico é a inserção de novos receptores AMPA na membrana sináptica
fortalecendo a transmissão.
Além desta mudança no complemento dos receptores de glutamato, recentes
evidências sugerem que sinapses potenciadas podem, de fato, partir-se pela
metade, constituindo sítios distintos de contato sináptico. A manutenção da LTP está
38
associada a mudanças morfológicas nas espinhas dendríticas, no qual mudanças na
estrutura pré-sináptica parecem ser coordenadas por eventos pós-sinápticos (Bear
et al., 2002).
Surpreendentemente, a LTD, como a LTP, também é disparada pela entrada
de Ca
2+
na região pós-sináptica pelo receptor NMDA. A diferença-chave que
determina o desencadeamento de um ou outro fenômeno está no nível de ativação
do receptor NMDA. Quando o neurônio pós-sináptico está apenas fracamente
despolarizado, o bloqueio parcial do canal no receptor NMDA pelo Mg
2+
previne a
entrada de Ca
2+
no neurônio pós-sináptico, apesar de um leve fluxo do mesmo. Por
outro lado, quando o neurônio pós-sináptico está fortemente despolarizado, o
bloqueio pelo Mg
2+
é inteiramente removido e o Ca
2+
inunda o neurônio pós-
sináptico. Diferentes concentrações de Ca
2+
ativam seletivamente diferentes tipos de
enzimas. As cinases são ativadas por altas concentrações de Ca
2+
, enquanto
aumentos modestos e prolongados de Ca
2+
, ativam proteínas fosfatases, enzimas
que retiram grupamentos fosfato de proteínas. Assim sendo, se para a LTP
grupamentos fosfatos são adicionados, para a LTD, aparentemente, eles são
retirados. De fato, evidências bioquímicas recentes indicam que receptores AMPA
são desfosforilados em resposta à estimulação que induz a LTD. Ademais, a
indução de LTD hipocampal também pode estar associada com a internalização de
receptores AMPA na sinapse. Assim, a LTD e a LTP parecem refletir uma regulação
bidirecional e simétrica dos receptores AMPA pós-sinápticos (Bear et al., 2002).
1.4.2 Neurotoxicidade
Uma das fascinantes ironias sobre a vida e a morte neuronal é que o
glutamato é um dos maiores responsáveis pela toxicidade neuronal. Uma grande
porcentagem das sinapses do encéfalo libera glutamato, que é estocado em grandes
quantidades. Mesmo o citosol de neurônios não-glutamatérgicos possui uma
concentração muito alta de glutamato, acima de 3 mM (Dickenson, 2001).
39
A alta taxa metabólica do encéfalo exige um suprimento contínuo de oxigênio
e glicose. Se o fluxo sanguíneo for interrompido, como em uma parada cardíaca, a
atividade neural cessará em segundos e um dano permanente será provocado em
alguns minutos. Estados patológicos, como parada cardíaca, acidentes vasculares
encefálicos, trauma cerebral, convulsões e deficiência de oxigênio podem iniciar um
ciclo vicioso de liberação excessiva de glutamato (Dickenson, 2001). Sempre que
neurônios não conseguem gerar ATP suficiente para manter as suas bombas iônicas
funcionando ativamente, membranas despolarizam e há entrada de Ca
2+
na célula. A
entrada de Ca
2+
dispara a liberação sináptica de glutamato. O glutamato, por sua
vez, despolariza ainda mais os neurônios, o que aumenta ainda mais o Ca
2+
intracelular e causa maior liberação de glutamato. Neste ponto ainda pode ocorrer
uma reversão do transportador de glutamato, contribuindo ainda mais para o
vazamento de glutamato (Dickenson, 2001).
Quando o glutamato atinge altas concentrações, ele mata os neurônios por
superexcitação, um processo denominado excitotoxicidade. O glutamato ativa seus
diversos tipos de receptores permitindo que quantidades excessivas de Na
+
, K
+
e
Ca
2+
fluam através da membrana. O receptor NMDA ativado por glutamato é um
agente crítico na excitotoxicidade, pois esse canal é uma via de entrada de Ca
2+
(Dickenson, 2001).
A excitotoxicidade tem sido implicada recentemente em diversas doenças
neurodegenerativas progressivas em humanos, tais como a esclerose lateral
amiotrófica (ELA) e a Doença de Alzheimer (DA), nas quais neurônios da medula e
do encéfalo, respectivamente, morrem lentamente. Os efeitos de várias toxinas do
meio ambiente mimetizam alguns aspectos dessas doenças (Bear et al., 2002).
À medida que os pesquisadores desvendarem a intrincada rede das
excitotoxinas, receptores e enzimas, novas estratégias de tratamento emergirão.
Antagonistas de receptores glutamatérgicos que podem obstruir estas cascatas
excitotóxicas e minimizar a lesão neuronal já se mostram como promessas clínicas.
A memantina é uma droga utilizada clinicamente no tratamento de algumas
patologias como doença de Parkinson, doença de Alzheimer, espasticidade e
desordens cerebrovascular (Parsons et al., 1999). Manipulações genéticas poderão,
eventualmente, impedir essas condições neurodegenerativas em indivíduos
suscetíveis (Bear et al., 2002).
40
1.5 NMDA Como Alvo de Drogas
Desde a década de 80 percebe-se muito entusiasmo dentro da academia e da
indústria para o potencial terapêutico de drogas que tem como alvo o receptor
NMDA (Kemp e Mckernan, 2002).
O receptor NMDA também apresenta um papel crucial em outras condições,
tais como abuso e dependência de drogas, dor crônica, e desenvolvimento do SNC,
como também na transmissão sináptica normal ou alterada em algumas áreas do
SNC (Danysz e Parsons, 1998).
Há evidências de que tanto a redução quanto o excesso de função
glutamatérgica são indesejáveis. Por exemplo, a função diminuída do NMDA por
bloqueadores do canal NMDA, tal como fenciclidina, mimetiza os sintomas positivos
e negativos da esquizofrenia em humanos, tendo-se sugerido que uma hipofunção
do sistema glutamatérgico deva ocorrer nesta doença. De fato, há algumas
indicações da hipofunção glutamatérgica em pacientes esquizofrênicos, tal como
diminuição da liberação de glutamato por estimulação de receptores NMDA. Tem-se
sugerido que o aumento da transmissão glutamatérgica poderia ter efeitos benéficos
nesta patologia (Danysz e Parsons, 1998).
O papel do receptor NMDA na excitotoxicidade tem inspirado as pesquisas
para um antagonista como um agente neuroprotetor e, por outro lado, seu papel na
plasticidade sináptica, inspira pesquisas na descoberta de potenciadores do receptor
NMDA para tratar disfunções cognitivas (Kemp e Mckernan, 2002).
Estudos em animais indicam um papel fisiológico importante do receptor
NMDA na indução e manutenção da dor neuropática. Também, em modelos
animais, sugere-se que os antagonistas NMDA apresentem efeitos benéficos na
doença de Parkinson. De fato, a amantadina, um bloqueador de baixa afinidade do
receptor NMDA, tem sido usado no tratamento desta patologia. Este medicamento,
que é usado em alguns países, também tem mostrado melhorar as discinesias
induzidas pela levodopa em humanos (Kemp e Mckernan, 2002).
A memantina, um bloqueador do canal de moderada afinidade tem recebido
aprovação para o tratamento da doença de Alzheimer após experimentos clínicos
(Kemp e Mckernan, 2002). Em ratos, também é uma droga largamente usada, nos
41
modelos de alcoolismo e outras desordens agudas ou crônicas (Spanagel et al.,
1994; Misztal et al., 1996; Zajaczkowaki et al., 1996; Piasecki et al.,1998; Parsons et
al., 1999; Lukoyanov e Paula-Barbosa, 2001; Peeters et al., 2003).
Hoje existem alguns dilemas, pois o receptor NMDA apresenta diferentes
funções dependendo da estrutura cerebral envolvida, portanto um sutil bloqueio dos
receptores NMDA poderia aliviar a dor, mas poderia prejudicar a aprendizagem.
Entretanto, é certo que o complexo receptor-ionóforo oferece grandes possibilidades
de intervenção terapêutica nas desordens do sistema nervoso central (Watkins,
1994).
1.6 O Etanol e Seus Efeitos no SNC
O etanol ou álcool etílico (Fig. 10) é uma substância química utilizada em
diversas atividades do mundo moderno como nos combustíveis de automóveis,
materiais de higienização e biossegurança. Entretanto, faz parte também da
composição de algumas bebidas que são ingeridas pelo ser humano desde
civilizações mais antigas. É considerada a droga de abuso mais consumida no
mundo e alguns fatores podem determinar as características do seu consumo como
aspectos culturais, religiosos, ambientais, psicológicos e biológicos (Edwards et al.,
1999; Focchi et al., 2001).
Figura 10 - Estrutura química do etanol.
42
A ingestão de forma crônica e/ou aguda de álcool tem sido grande alvo de
estudos, uma vez que possui efeitos diferenciados no sistema nervoso central, em
que pode alterar uma variedade de neurotransmissores em cérebro de mamíferos,
além de possuir efeitos diversos quando administrado de forma aguda ou crônica e
após a sua retirada (Fig. 11). Além disso, seu consumo está envolvido em processos
como dependência, tolerância e síndrome de abstinência tanto em humanos como
em animais de laboratório (Piasecki et al., 1998; Lukoyanov e Paula-Barbosa, 2001).
Figura 11 - Esquema sobre alterações neurofarmacológicas do uso crônico do álcool e da
síndrome de abstinência alcoólica. DA = Dopamina; NA = Noradrenalina; GLU = glutamato;
Ca
++
= Cálcio; GABA = ácido gama-amino butírico (Extraído e adaptado de Zaleski et al.,
2004).
O ácido γ-aminobutírico (GABA) é o principal neurotransmissor inibitório do
SNC (Cooper et al., 2003). O receptor GABA do tipo GABA
A
é considerado o
principal alvo do etanol numa ingesta aguda. Assim, há uma potencialização da
neurotransmissão inibitória no cérebro (Edwards et al., 1999). Caracteriza-se desta
forma, como uma droga de abuso com efeito depressor do SNC.
43
Cronicamente, sua ação parece estar relacionada a uma redução da ativação
de receptores do tipo NMDA de glutamato, induzindo sobre-regulação (up-
regulation) destes receptores (Fig. 11). Dados bioquímicos e comportamentais
mostram que os receptores NMDA podem contribuir para intoxicação alcoólica,
tolerância e síndrome de abstinência (Piasecki et al., 1998).
O álcool age sobre outros sistemas de neurotransmissão como
dopaminérgico, ativando o disparo neuronal na área tegmentar ventral (Diana et al.,
1992), e serotoninérgicos com aumento funcional do receptor 5-hidroxitriptamina (5-
HT) do tipo 5-HT3 (Lovinger, 1999). É possível também efeitos de inibição de canais
de cálcio voltagem dependente do tipo L (Edwards et al., 1999; Focchi et al., 2001).
1.6.1 Ação do Etanol no Receptor NMDA
Varias evidências indicam que o receptor NMDA é um alvo de ação do etanol,
e mudanças na sua atividade têm sido relacionadas às respostas neuroadaptativas
vistas no consumo excessivo, bem como em uma variedade de efeitos do etanol no
alcoolista crônico, incluindo a síndrome de dependência, amnésia, convulsões na
abstinência e neurotoxicidade (Maldve et al., 2002).
O etanol reduz a freqüência e amplitude da corrente pós-sináptica excitatória,
enquanto aumenta a corrente pós-sináptica inibitória mediada por receptores GABA
A
(Woodward, 2000). Os efeitos inibitórios do etanol sobre a atividade da corrente pós-
sináptica excitatória são devidos principalmente à redução nas respostas do
componente NMDA, com pouco ou nenhum efeito sobre a corrente excitatória
mediada por receptores não-NMDA (Woodward, 2000).
Em concentrações intoxicantes, o etanol age como antagonista não-
competitivo do receptor NMDA. O bloqueio pelo etanol parece ser mais potente em
receptores constituídos pelas subunidades NR2A ou NR2B do que os constituídos
pelas NR2C ou NR2D (Dingledine et al., 1999).
O etanol, portanto inibe o receptor NMDA, atuando provavelmente em um
sítio alostérico e alterando o acoplamento do agonista ou os eventos decorrentes
entre a ativação do receptor pelo agonista e a abertura do canal iônico (Woodward,
2000; Nagy et al., 2003).
44
Tem-se demonstrado que em ratos dependentes do etanol, ocorre um
aumento da liberação do glutamato no estriado durante a manifestação de sinais de
abstinência, tais como hiperatividade, tremores e contrações musculares (Danysz e
Parsons, 1998). Adicionalmente, o antagonista do receptor NMDA, MK-801,
normaliza as alterações bioquímicas e comportamentais produzidas pelo etanol,
enquanto o diazepam (um benzodiazepínico – agonista do receptor GABA
A
), muito
empregado terapeuticamente como agente substitutivo na retirada do etanol, afeta
apenas o comportamento induzido pelo etanol (Danysz e Parsons, 1998).
Lukoyanov e Paula-Barbosa (2001) num estudo experimental em ratos
adultos com preferência ao álcool e uso de bloqueador NMDA (memantina e MK-
801), durante a síndrome de abstinência, obtiveram efeitos de total reversão dos
déficits produzidos pelo álcool com uso de memantina. O mesmo não aconteceu
com o MK-801.
Em outro estudo com animais num modelo de alcoolismo, observou-se que
animais tratados com memantina reduziram a ingesta alcoólica pela auto-
admistração oral (Piasecki et al., 1998).
Hölter et al. (1996), afirmam que antagonista NMDA reduz os sintomas de
privação do etanol em ratos sem qualquer associação de efeitos como sedação ou
excitação.
Existe, portanto, uma relação entre receptores glutamatérgicos do tipo NMDA
e os efeitos do etanol, principalmente sobre o desenvolvimento de dependência
(Kotlinska, 2001).
1.6.2 Etanol, Memória Operacional e CPFm
Como vimos anteriormente, a aprendizagem e memória são processos
cerebrais complexos que envolvem fenômenos de LTP e LTD, ambos mediados
essencialmente por aminoácidos excitatórios em receptores NMDA. Uma vez que o
etanol altera a atividade destes receptores, este agente produz profundas alterações
nos processos de aprendizagem e memória (Woodward, 2000).
45
Os efeitos prejudiciais do álcool sobre a memória operacional são
demonstrados em muitos estudos tanto em roedores como em seres humanos
(Oliveira e Nakamura-Palacios, 2003).
Estudos prévios de nosso laboratório demonstraram que o etanol
administrado bilateralmente no CPFm prejudica, de forma dose-dependente, a
memória operacional espacial de curta e de longa-duração, avaliados,
respectivamente, em testes com retardos de 5 segundos e 1 hora no labirinto radial
de 8-braços, sugerindo que o etanol administrado no CPFm prejudica a memória
operacional espacial (Oliveira e Nakamura-Palacios, 2003; Galvão, 2005).
Constatou-se ainda que o efeito de prejuízo do etanol sobre a memória operacional
de duração prolongada (retardos de 1 h) foi agravado pela administração prévia do
haloperidol, sistêmica ou intracorticalmente (Oliveira e Nakamura-Palacios, 2003),
porém foi bloqueado pela administração intracortical de um antagonista seletivo de
receptores dopaminérgicos do tipo D
1
(Galvão, 2005).
É preciso considerar que as eferências do CPF são, essencialmente,
glutamatérgicas (Steketee, 2003; Ray et al., 1992). Além disso, projetam-se para
diversas áreas do sistema nervoso central (núcleos do tálamo, núcleo accumbens,
área tegmentar ventral, estriado, outras áreas corticais, etc.). A intensidade de
disparo desses neurônios efetores (neurônios piramidais) influenciam muitas das
funções do CPF, como por exemplo, a memória operacional. Uma diminuição ou
um aumento exacerbado nesse padrão de disparo pode causar prejuízo dessas
funções (Pirot et al., 1995).
De fato, em estudos também realizados em nosso laboratório observou-se
que a administração bilateral do NMDA no CPFm prejudicou, de forma dose-
dependente, a memória operacional de curta e de longa-duração, também avaliada
por meio de tarefas com retardos de 5 segundos e 1 hora no labirinto radial de 8-
braços, sugerindo o envolvimento dos receptores NMDA do CPFm na modulação
da memória operacional espacial (Bazzarella, 2004). Ressalte-se que também foi
observado que a administração prévia do NMDA no CPFm reduziu parcialmente o
efeito de prejuízo do etanol, administrado também no CPFm, sobre a memória
operacional espacial. Entretanto, a administração posterior do NMDA não reverteu
os efeitos do etanol. Estes resultados levaram a sugestão de que os prejuízos do
álcool sobre a memória operacional envolvem, pelo menos em parte, a modulação
glutamatérgica no CFPm (Bazzarella, 2004).
46
Entretanto, há que se considerar que apesar das aferências que atingem o
CPF, sejam em sua maioria, glutamatérgicas (Pirot et al., 1995), há também
importantes aferências dopaminérgicas provenientes da área tegmentar ventral
caracterizando o sistema mesocorticolímbico (Steketee, 2003) e outras aferências
como serotoninérgicas; noradrenérgicas e colinérgicas. Essas projeções originam-se
em regiões corticais e subcorticais.
Portanto, considerando-se que alguns bloqueadores de canal aberto de
receptores NMDA empregados no tratamento das demências (memantina), tem se
mostrado experimentalmente eficazes na redução da ingesta de etanol, e no
bloqueio e/ou reversão de manifestações comportamentais observadas na retirada
(abstinência) do álcool (MK-801 e memantina), e de que os prejuízos da memória
operacional espacial produzido pelo etanol administrado no CPFm parecem envolver
a modulação glutamatérgica pelos receptores NMDA, o presente estudo pretendeu
confirmar o envolvimento dos receptores NMDA do CPFm nos efeitos do etanol
sobre a memória operacional espacial, mediante o emprego de dois bloqueadores
de canal aberto, MK-801 e memantina, administrados no CPFm. Adicionalmente,
também procurou averiguar a potencialidade do emprego da memantina no
tratamento do prejuízo da memória operacional produzido pelo etanol, sendo este
uma das disfunções cognitivas de grande relevância clínica, visto que compromete
as atividades diárias dos indivíduos.
47
2 OBJETIVOS
48
2.1 Objetivo Geral
Investigar a modulação glutamatérgica, nos efeitos de prejuízo produzido pelo
álcool no córtex pré-frontal medial (CPFm) sobre a memória operacional espacial em
roedores.
2.2 Objetivos Específicos
• Analisar os efeitos do etanol na dose de 100 µg, administrado diretamente no
CPFm de ratos sobre o desempenho nas tarefas do labirinto radial de 8 braços,
envolvendo retardos de 1 hora.
• Investigar a influência dos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA através da
administração intracortical do bloqueador de canal aberto MK-801 (0,32; 1,0 e 3,2
µg) nos efeitos do etanol na dose de 100 µg no CPFm de ratos sobre o
desempenho nas tarefas do labirinto radial de 8 braços, envolvendo retardos de 1
hora.
• Investigar os efeitos per se da administração prévia do bloqueador de canal
aberto de receptor NMDA (memantina) no CPFm sobre a memória operacional
de ratos sobre o desempenho nas tarefas do labirinto radial de 8 braços,
envolvendo retardos de 1 hora.
• Investigar a influência dos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA através da
administração intracortical do bloqueador de canal aberto Memantina (1,0; 3,2 e
10,0 µg) nos efeitos do etanol na dose de 100 µg no CPFm de ratos sobre o
desempenho nas tarefas do labirinto radial de 8 braços, envolvendo retardos de 1
hora.
49
3 MATERIAIS E MÉTODOS
50
3.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos provenientes da colônia do Programa
de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas - UFES, com pesos corporais variando
entre 250 g e 300 g. Os mesmos foram mantidos em gaiolas individuais de
polipropileno ou de acrílico transparente, numa temperatura ambiente em ciclo claro-
escuro natural de aproximadamente 12 horas. Os animais foram submetidos à
privação alimentar parcial, mantendo 80 a 85% de seu peso inicial ajustado ao
crescimento e água ad libitum.
3.2 Drogas
Álcool etílico (ETOH), absoluto pró-análise (Jand Química IND. COM. LTDA.,
São Paulo, SP, Brasil) diluído em água destilada, v/v, na concentração de 200 mg/ml
para as administrações intracorticais (IC) na dose de 100 µg.
Maleato de Dizocilpina (MK-801), que se apresenta como um pó branco
cristalino e puro procedente do laboratório Sigma-Aldrich, Inc., SL, EUA, foi
dissolvido em água destilada, nas seguintes concentrações 0,64; 2,0 e 6,4 mg/ml
para as administrações IC nas doses de 0,32; 1,0 e 3,2 µg.
Memantina, que também se apresenta como pó branco cristalino e puro do
laboratório Sigma-Aldrich, Inc., SL, EUA, dissolvida em água destilada nas
concentrações de 2,0; 6,4 e 20 mg/ml para as administrações IC nas doses de 1,0;
3,2 e 10 µg.
Salina (SAL), solução de cloreto de sódio a 0,9% estéril para as
administrações IC que foi empregada como solução controle para todas as drogas
usadas neste estudo.
Todas as soluções foram mantidas sob refrigeração a 4ºC após as diluições.
51
3.3 Labirinto Radial de 8-Braços
O labirinto radial de 8 braços (LR-8) foi originalmente proposto por Olton e
Samuelson em 1976 com a finalidade de avaliar a memória operacional espacial de
animais. Desde então tem se constituído numa valiosa ferramenta para a
investigação sistemática da memória operacional espacial em animais (Olton, 1979)
e dos efeitos de drogas sobre este tipo de memória (Oliveira et al., 1990; Nakamura
et al., 1996; Nakamura-Palacios e Roelke, 1997; Oliveira e Nakamura-Palacios,
2003; Melo et al., 2005).
O LR-8 é construído em acrílico transparente, possuindo uma área central de
base octogonal com 33 cm de diâmetro, de onde partem 8 braços simétricos e
removíveis com 70 cm de comprimento, 10 cm de largura e paredes laterais de 4 cm
de altura. No final de cada braço estão fixados receptáculos de acrílico preto com 11
cm de comprimento, 5 cm de largura e 3 cm de profundidade para colocação do
reforço (pedaços de amendoim).
A plataforma central é constituída, em suas margens, de paredes de acrílico
transparente de 30 cm de altura, nas quais encontram-se portas deslizantes em
forma de guilhotina ligadas a fios de nylon que ficam sob o controle do examinador,
o qual encontra-se à distância do labirinto para abertura e fechamento das mesmas.
Placas de acrílico transparente com 20 cm de altura estão fixadas na entrada das
portas para evitar que o animal atravesse de um braço a outro.
O aparato é montado sobre uma armação de madeira compensada revestida
de fórmica branca e sustentado por um suporte de metal a 100 cm do assoalho,
como ilustrado na Figura 12.
52
Figura 12 - Fotografia do labirinto radial de 8 braços. No canto superior esquerdo, animal na
plataforma central do labirinto, e no canto superior direito, durante a localização do reforço
(amendoim) ao final do braço
.
3.4 Aquisição da Tarefa
A memória operacional espacial foi o principal parâmetro comportamental
almejado em todo o estudo. Todos os 8 braços do labirinto radial eram similares
entre si, diferindo apenas por sua localização espacial em relação aos outros braços,
o que era sinalizada por estímulos visuais distais fixos (quadro, mesa, porta, etc.) de
fácil discriminação e visualização a partir do labirinto.
53
Os animais foram submetidos a sessões de treinamento no LR-8 sob privação
parcial de alimento, de modo a mantê-los em aproximadamente 80 a 85% do peso
corporal inicial, para possibilitar a aquisição das tarefas no decorrer dos treinos. Os
pesos foram ajustados de acordo com o desempenho do animal nas seguintes fases
para aquisição da tarefa:
Fase I – Os animais foram colocados no centro do labirinto com todas as portas
abertas para exploração e adaptação no ambiente durante 10 minutos por dois dias
consecutivos.
Fase II – Pedaços de amendoim (reforço) foram colocados nos receptáculos nos
finais dos braços. Essa fase perdura até que o animal encontre o reforço nos
receptáculos (Fig. 13).
Fase III – Uma vez que o animal localizou o reforço, o mesmo foi colocado na
plataforma central do labirinto com todas as portas abertas. Após entrar em um dos
braços, a porta que permitia o acesso àquele braço foi fechada e o animal colocado
novamente no centro do labirinto com livre acesso aos outros braços. Esta fase
termina quando o animal percorre todos os braços em até 10 minutos.
Fase IV – É a fase de aquisição da tarefa propriamente dita, onde o animal
aprende a entrar em cada braço apenas uma vez. Todas as portas foram abertas a
cada recolocação do animal no centro do labirinto. O mesmo deveria aprender a
visitar cada um dos braços apenas uma única vez em cada sessão. Considerou-se
erro de desempenho a repetição de um braço já visitado pelo animal. Os animais
foram treinados até atingirem o critério de 0 a 1 erro por sessão, nas últimas 3
sessões de treinamento. Foram requeridas 10 sessões, no mínimo, para possibilitar
a análise da aprendizagem de cada animal.
Fase V – Nesta fase, ainda para aquisição da tarefa no labirinto radial, foi
interposto um intervalo de 5 segundos (período de retardo) entre o 4º e o 5º braços
visitados (Fig. 13). Para este procedimento, 4 portas eram abertas selecionadas
aleatoriamente, permitindo a entrada do animal e o alcance do reforço ao final de
cada braço. Denomina-se este período de primeira corrida ou pré-retardo. Após o
54
intervalo de 5 segundos (retardo), durante o qual o animal permanecia em sua
gaiola-casa, retornava-se com o mesmo novamente para o centro do labirinto onde
lhe era permitido o acesso a todos os braços. O reforço encontrava-se apenas nos
braços que ainda não tinham sido visitados pelo animal. Este período é denominado
de segunda corrida ou pós-retardo. Os animais foram treinados até atingirem o
critério de 0 a 1 erro por sessão no pré-e/ou no pós-retardo, por 3 sessões
consecutivas, durante, no mínimo, 6 sessões de treinamento.
Figura 13 - Ilustração da fase V do treinamento, com a interposição de retardo (5 s) entre o
4º e o 5º braços. Durante os testes com administração de drogas, o retardo foi de 1 hora. R=
reforço (pedaço de amendoim) (Extraído e modificado de J Neurosci, 17(5):1880-1890,
1997).
55
3.5 Cirurgia Estereotáxica
Após os animais terem atingido o critério de aprendizado na fase V do
treinamento, foram submetidos à cirurgia estereotáxica para o implante de cânulas
bilaterais de 2 mm (Plastics One Inc., 26 GA, VA, EUA) no córtex pré-frontal medial
(CPFm).
Os animais foram inicialmente anestesiados com hidrato de cloral a 10%, por
via intraperitoneal (IP), na dose de 400 mg/kg. A seguir, foi feita a tricotomia na parte
superior da cabeça e os mesmos foram fixados no estereotáxico (modelo 51600,
Stoeling, IL, EUA).
Uma vez o animal fixado no estereotáxico, seguiu-se o protocolo de rotina
cirúrgica para implantação da cânula que será descrito a seguir (Fig. 14):
1. Colocação da cânula bilateral em uma cânula-guia fixado ao estereotáxico;
2. Assepsia com álcool iodado no campo cirúrgico;
3. Injeção de um botão anestésico com 0,2 ml de solução de lidocaína a 1 %
com epinefrina no tecido subcutâneo;
4. Corte da região do botão anestésico, com retirada de pele e tecido
subcutâneo para exposição da calota craniana na região do Bregma;
5. Perfuração de quatro orifícios na calota craniana (2 frontais e 2 parietais
posteriores) para o posicionamento de 4 parafusos de aço inoxidável com o
auxílio de uma mini-furadeira (Dremel Multipro + Kit, Stoeling, IL, USA) e uma
mini chave de fenda, como preparação para a ancoragem da prótese
cirúrgica;
6. Realização das primeiras medidas estereotáxicas, com a fixação da cânula
esquerda no centro do Bregma;
7. Posicionamento da cânula bilateral à + 2,5 mm AP (ântero-posterior), + 1 mm
L (lateral) em relação ao Bregma para o alcance do córtex pré-frontal medial;
8. Verificação do posicionamento da cânula bilateral e perfuração do crânio nos
orifícios correspondentes;
56
a) b)
c)
d)
Figura 14 - Cirurgia estereotáxica para o implante de cânulas bilaterais no CPFm. a) Animal
fixo no estereotáxico; b) região do Bregma, com marcação dos pontos (B: + 2,5 mm A e +/-
1 mm L); c) da esquerda para a direita: protetor externo, protetor interno e cânula bilateral;
d) cânula bilateral implantada com trepanação de 4 pontos
.
57
9. Abaixamento da cânula bilateral à -2,7 mm V (ventral) ao Bregma.
10. Limpeza e secagem do campo cirúrgico com fixação da cânula bilateral com
resina acrílica auto-polimerizável de secagem rápida (polímero de metacrilato,
JET, São Paulo, SP, Brasil);
11. Retirada da cânula-guia e colocação do protetor interno na cânula bilateral;
12. Fixação, também com a resina, de proteção externa constituída por uma
pequena peça de tubo de plástico transparente e flexível com 1,0 cm de
diâmetro e 1,0 cm de altura em torno da cânula já previamente fixada;
13. Aplicação de aproximadamente 0,2 ml de Penicilina G benzatina 24.000 UI
por via intramuscular;
14. Retirada do animal do estereotáxico e colocação num local aquecido para
recuperação pós-cirúrgica;
15. Retorno do animal para sua gaiola-casa.
Uma vez recuperados da anestesia, os animais foram submetidos a sessões
de treinamento da fase V no labirinto radial para reaquisição e/ou manutenção do
desempenho pré-cirúrgico (linha de base comportamental), ou seja, 0 a 1 erro por
sessão no pré- e/ou no pós-retardo por 3 sessões consecutivas.
Após atingirem o critério de desempenho no labirinto radial, os animais foram
alocados de forma aleatória nas combinações de drogas das curvas dose-efeitos.
O delineamento deste estudo foi o de amostras dependentes, ou seja, os
animais receberam todas as administrações do controle ou das diferentes doses de
drogas por via IC. Portanto, para que não houvesse um único seqüenciamento de
combinações na administração das drogas, foi empregado o método de quadrado
latino, possibilitando, desta forma, que cada animal fosse submetido a uma ordem
individual de combinações no decorrer do experimento. Este procedimento também
foi empregado para compensar as possíveis interferências entre as combinações e
minimizar o efeito de aprendizagem dos animais no decorrer do procedimento com
retardos de 1 h.
58
3.6 Administração Intracortical da Droga
Todas as administrações de drogas foram feitas pela via intracortical (IC)
realizada através da cânula implantada por meio de um injetor bilateral de 1,0 cm de
comprimento acoplado a um sistema de infusão composto por 1 conector constituído
de 2 cânulas de polietileno (PE 50), 2 seringas Hamilton de 10 µl (Stoeling 53431,
CO, IL, EUA) e 1 bomba de infusão contínua (Stoeling CO., IL, EUA), na qual as
seringas estavam fixadas (Fig. 15).
O volume da droga foi de 0,5 µl em cada lado do CPFm, infundidos durante
90 segundos, permanecendo o animal conectado ao sistema de infusão por mais 90
segundos para melhor difusão da droga. Este procedimento foi realizado durante a
primeira administração seguida, da segunda administração, correspondentes às
combinações previamente estabelecidas. Entre a primeira e a segunda
administração deu-se intervalo de 10 minutos. Cinco minutos após a segunda
administração, os animais foram avaliados em testes com retardos de 1 h no LR-8.
Foi realizada apenas uma combinação de drogas por dia em cada animal,
com um intervalo de 7 dias entre as administrações. Neste período, denominado
interdroga, foi realizado uma sessão de treinamento com retardo de 5 s sem a
aplicação prévia de drogas, para a verificação do desempenho do animal na linha de
base comportamental e da existência de efeitos residuais das drogas.
Se o desempenho do animal não correspondesse ao critério de 0 a 1 erro por
sessão, o animal não era submetido à administração de drogas e então, o teste
interdroga era repetido até 3 vezes. Caso o animal não atingisse o critério durante
essas 3 sessões de treinamento, o mesmo era excluído do experimento.
59
Animal conectado ao sistema
infusor da droga
Sistema Infusor
Animal gentilmente segurado pelo
examinador. Observe-se a
inserção do injetor na cânula
bilateral
Injetor bilateral
Figura 15 - Fotos demonstrativas do procedimento de administração de drogas IC antes da
testagem da memória operacional espacial no labirinto radial de 8-braços.
3.7 Avaliação da Memória Operacional Espacial
Após a segunda administração da droga, o animal era devolvido para sua
gaiola-casa, onde permanecia por 5 minutos. Em seguida, era submetido à primeira
corrida ou pré-retardo com a abertura aleatória de 4 portas. Ao terminar esta fase, o
animal era recolocado em sua gaiola-casa, onde permanecia durante 1 hora. Após
este retardo, era devolvido ao centro do LR-8 com as 8 portas abertas para a
avaliação da memória operacional espacial. Os braços visitados, os erros e o tempo
gasto no pré- e pós-retardo de 1 h foram anotados para posterior análise.
60
3.8 Experimentos
3.8.1 Experimento I - Efeitos da Combinação do Antagonista NMDA (MK-801) e
ETOH no CPFm sobre a Memória Operacional de Ratos
Os animais previamente treinados no LR-8 (n = 12), com cânulas bilaterais
implantadas no CPFm, receberam administrações agudas de MK-801 0,32; 1,0 e 3,2
µg, ou SAL IC seguidas, 10 minutos depois, de ETOH na dose de 100 µg IC. Cinco
minutos após a última administração, os animais foram submetidos aos testes com
retardos de 1 h no labirinto radial.
A dose escolhida do etanol foi a dose intermediária de uma curva de
administrações intracorticais desta substância sobre o desempenho no labirinto
radial realizada em nosso laboratório (Oliveira e Nakamura-Palacios, 2003). Neste
estudo, a dose de 100 µg, demonstrou prejuízos no desempenho da memória
operacional espacial em testes com retardos de 1 h quando comparada ao controle.
As doses do MK-801 foram as mesmas empregadas anteriormente em nosso
laboratório na verificação dos efeitos deste antagonista sobre a memória operacional
espacial em ratos em Dissertação de Mestrado desenvolvida por Bazzarella em
2004.
3.8.2 Experimento II - Ação do antagonista NMDA (Memantina) no CPFm sobre
a Memória Operacional de Ratos
Os animais previamente treinados no LR-8 (n = 12), com cânulas bilaterais
implantadas no CPFm, receberam administrações agudas de Memantina 1,0; 3,2 e
10,0 µg ou SAL IC, seguidas, 10 minutos depois, de SAL. Cinco minutos após a
última administração, os animais foram submetidos a testes com retardos de 1 h no
labirinto radial.
61
A escolha das doses da memantina foi obtida em um estudo preliminar (dados
não publicados) considerando-se a máxima concentração do composto que se
mantinha estável em solução.
3.8.3 Experimento III - Efeitos da Combinação do Antagonista NMDA
(Memantina) e ETOH no CPFm sobre a Memória Operacional de Ratos
Os mesmos animais previamente treinados no LR-8 (n = 12), com cânulas
bilaterais implantadas no CPFm, receberam administrações agudas de Memantina
1,0 e 10,0 µg ou SAL IC seguida de ETOH na dose 100 µg IC. Cinco minutos após a
última administração, os animais foram submetidos a testes com retardos de 1 h no
labirinto radial.
A dose de memantina 3,2 µg não está presente neste experimento, pois
apresentou efeito per se.
3.9 Histologia
Após completarem o protocolo de drogas, os animais foram anestesiados com
hidrato de cloral a 10% IP e submetidos à administração IC de azul de metileno a 1%
(Biotec, PR, Brasil) no CPFm, semelhante à administração das drogas. Em seguida,
receberam uma dose mais elevada do anestésico para a perfusão intracardíaca com
solução salina e, posteriormente, solução de formaldeído a 8%.
Os encéfalos foram retirados e conservados em solução de formaldeído a 8%,
por, no mínimo, 48 horas. Os mesmos foram seccionados em cortes de
aproximadamente 80-100 µm de espessura em um vibrátomo (Série 1000 Plus –
sistema de secção tecidual – St. Louis, MO, EUA). As lâminas obtidas foram coradas
com vermelho neutro e a localização das cânulas foi feita através da visualização em
62
um microscópio óptico assinalada em diagramas do Atlas de Paxinos e Watson
(1986).
3.10 Análise dos Resultados
Uma vez o animal inserido no protocolo, os pesos corporais, o número de
erros cometidos e o tempo gasto em cada braço foram registrados durante todo o
treinamento e nas administrações das drogas intracorticalmente.
O desempenho dos animais na fase de aquisição da tarefa no labirinto radial
(fase IV e V), foi analisado pelo número de erros cometidos através da entrada do
animal em braços já visitados numa mesma sessão de treinamento, e a análise de
tempo gasto em cada braço foi avaliada pela relação entre o tempo total de
permanência no labirinto (em segundos) e o número de braços visitados naquela
sessão.
Os pesos (gramas), os dados de desempenho (erros) e os de tempo de
permanência nos braços (em segundos) foram representados pela média ± erro
padrão da média (e.p.m.).
Na fase de aquisição das tarefas no labirinto radial, todos os animais foram
submetidos à sessões consecutivas de treinamento tanto na fase IV (10 sessões)
quanto na fase V (6 sessões). Desta forma, para as análises da aprendizagem e do
tempo gasto nestas fases foram empregadas análises de variância (ANOVA) de uma
via para medidas repetidas seguidas de teste de Fisher para localização das
diferenças estatisticamente significantes.
Foi utilizada regressão linear para análise complementar, considerando todas
as fases de aprendizagem.
Nos experimentos I, II e III também foram considerados o número de erros
cometidos e o tempo gasto em cada braço após administração da droga ou do
veículo, tanto no pré- quanto no pós-retardo de 1 hora.
Para os dados coletados foi empregado tratamento estatístico de análise de
variância (ANOVA) de uma ou de duas vias para medidas repetidas seguidas do
teste de Fisher para comparações múltiplas e determinação das diferenças
63
estatisticamente significantes. Todos os animais (amostra dependente) foram
submetidos às diferentes combinações, ainda que fosse dado um intervalo de 7 dias
(wash out) entre as administrações. Utilizou-se quadrado latino para uma distribuição
randômica das administrações intracorticais das drogas procurando evitar o
seqüênciamento das doses entre os animais, como citado anteriormente.
Para as análises estatísticas foi empregado um nível mínimo de significância
com o valor de p < 0,05.
Utilizou-se os softwares GraphPad Prism versão 4.0 e o GB Stat versão 6.5
para análise estatística e representação gráfica. Os resultados e suas respectivas
análises estão descritos a seguir.
64
4 RESULTADOS
65
4.1 Aquisição da Tarefa no Labirinto Radial de 8-Braços
4.1.1 Sem interposição de retardo de 5 segundos (Fase IV)
Todos os animais (n = 24) apresentaram melhora gradativa do desempenho
na fase de aquisição da tarefa (fase IV) no decorrer das últimas 10 sessões de
treinamento. A análise de regressão linear demonstrou uma diminuição progressiva
do número de erros até a última sessão, atingindo o critério pré-estabelecido para
aprendizagem [F(1,178) = 18,04; Y = 1,922 – 0,16X; r = 0,09; p < 0,0001]
(Fig. 16).
Aquisição da tarefa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
1
2
3
+++
**
**
**
Sessões
Média de erros
±
e.p.m.
Figura 16 - Média de erros ± e.p.m. nas 10 últimas sessões de treinamento na fase IV
(aprendizagem) no labirinto radial de 8-braços (n = 24). +++ p < 0,0001 (Análise de
regressão linear). ** p < 0,01 comparada às sessões 1 e 3 (ANOVA de 1 via para medidas
repetidas, seguida do Teste de Fisher).
66
Há diferenças estatisticamente significantes na comparação do número de
erros entre as sessões de treinamento pela ANOVA de 1 via para medidas repetidas
[F(9,153) = 2,524; p < 0,01]. O Teste de Fisher detectou diferenças estatisticamente
significantes (p < 0,05) nas últimas 3 sessões quando comparadas às sessões 1 e 3.
Na análise do tempo gasto em cada braço nas 10 sessões de treinamento da
fase IV (aprendizagem), a ANOVA de 1 via para medidas repetidas detectou
diferenças estatisticamente significantes [F(9,162) = 2,60816; p = 0,0077] entre as
sessões de treinamento (Tab. 17). O Teste de Fisher para múltiplas comparações
demonstrou que o tempo gasto em cada braço foi significativamente menor nas
sessões 9 e 10 quando comparadas às sessões 1, 3 e 4 (p < 0,05) e às sessões 2 e
5 (p < 0,01), demonstrando que há uma redução no tempo de desempenho no
decorrer da aquisição da tarefa.
Tabela 17 - Média do tempo gasto (segundos) ± e.p.m em cada braço visitado nas 10
últimas sessões de treinamento na fase IV (aprendizagem) no labirinto radial de 8 braços (n
= 24).
Tempo gasto em cada braço (média em segundos ± e.p.m.)
Sessões Média ± e.p.m. Sessões Média ± e.p.m.
1
18,3 ± 2,2
6
16,1 ± 1,9
2
19,8 ± 3,4
7
16,4 ± 2,4
3
18,9 ± 2,5
8
15,6 ± 1,7
4
18,2 ± 2,4
9
13,0 ± 1,0 *
/
**
5
22,0 ± 4,9
10
13,0 ± 0,7 *
/
**
* p < 0,05 comparado às sessões 1, 3 e 4
** p < 0,01 comparado às sessões 2 e 5
67
4.1.2 Com interposição de retardo de 5 segundos (Fase V)
Na fase V, ainda para a aquisição da tarefa no labirinto radial de 8 braços com
a introdução dos retardos de 5 segundos, os animais apresentaram, no pré e no
pós-retardo, bom desempenho (0 a 1 erro) nas últimas 3 sessões de treinamento,
que é pré-requisito para o aprendizado nesta fase. A análise de regressão linear
demonstrou que houve diminuição progressiva do número de erros somente no pós-
retardo [F(1,112) = 16,74; Y = 0,9579 – 0,16X; r = 0,13; p < 0,0001] no decorrer das
6 sessões de treinamento nesta fase (Fig. 18).
Pré-retardo
123456
0
1
2
3
Sessões
Média de erros
±
e.p.m.
Pós-retardo
123456
+++
**
**
**
Sessões
Retardo de 5 segundos
Figura 18 - Média de erros ± e.p.m. dos animais (n = 24) antes (pré-retardo) e após (pós-
retardo) o retardo de 5 segundos nas sessões de treinamento da fase V para aquisição das
tarefas no labirinto radial de 8-braços (n = 24). +++ p < 0,0001 (Análise de regressão linear)
** p < 0,01 comparada à primeira sessão (ANOVA de 1 via para medidas repetidas, seguida
do Teste de Fisher).
68
A ANOVA de 1 via para medidas repetidas, detectou a existência de
diferenças estatisticamente significantes entre as sessões de treinamento [F(5,90) =
4,09; p = 0,0021]. A média de erros cometidos nas sessões 4, 5 e 6 foi
significativamente menor (p < 0,01) quando comparadas à primeira sessão (Teste de
Fisher) (Fig. 18).
Com relação ao tempo gasto em cada braço, não foram encontradas
diferenças estatisticamente significantes neste parâmetro tanto para o desempenho
do pré- quanto do pós-retardo de 5 segundos no decorrer das 6 sessões de
treinamento que antecederam a cirurgia estereotáxica (Tab. 19).
Tabela 19 - Média do tempo gasto (segundos) ± e.p.m. pelos animais (n = 24) em cada
braço visitado no pré e pós-retardo de 5 segundos nas últimas 6 sessões de treinamento na
fase V.
Tempo gasto em cada braço (média em segundos ± e.p.m.)
Sessões Pré-retardo Pós-retardo
1
13,0 ± 1,2 14,0 ± 1,5
2
13,1 ± 1,4 16,1 ± 3,5
3
13,4 ± 2,0 12,8 ± 0,9
4
14,3 ± 2,6 13,0 ± 1,8
5
14,1 ± 3,3 14,9 ± 4,3
6
10,7 ± 0,7 11,8 ± 1,4
69
4.2 Pesos Corporais Durante as Fases de Treinamento
Assim que os animais foram incluídos no protocolo de treinamento, obteve-se
o peso inicial de cada rato e iniciou-se a medida dos pesos corporais durante as
fases de aprendizagem. A Tabela 20 mostra a média dos pesos (± e.p.m.) no
decorrer das fases de treinamento e seu percentual em relação ao peso inicial.
Tabela 20 - Média dos pesos corporais (gramas) ± e.p.m. dos animais (n = 24) durante as
fases de treinamento no labirinto radial de 8-braços e o seu percentual em relação à média
do peso inicial (262,9 ± 6,7).
Pesos Corporais (gramas)
Fases
Média ± e.p.m.
% do peso inicial
I
250,4 ± 6,8 95,2
II
233,9 ± 7,4 88,9
III
222,5 ± 6,5 84,6
IV
231,4 ± 6,0 88,0
V
244,9 ± 4,4 93,1
O peso dos animais foi mantido abaixo do peso inicial nas fases de I a IV, em
que havia privação de alimento para garantir motivação nas sessões de treinamento.
Nota-se que o percentual da média de perda de peso do grupo nessas fases se
manteve abaixo (4,8 a 15,4%) do máximo preconizado (15 a 20%) para este
protocolo.
Assim que os animais adquiriram o desempenho de uma única entrada em
cada braço em cada sessão (fase III), a privação foi diminuída e os animais voltaram
a ganhar peso de acordo com a idade.
70
4.3 Localização das Cânulas
Uma vez atingido o critério de aprendizagem exposto acima, os ratos foram
submetidos à cirurgia estereotáxica para o implante de cânulas bilaterais no CPFm.
Na Figura 21, estão ilustrados os sítios cerebrais de implantação das cânulas no
CPFm, marcados com azul de metileno 1%, extraídos do Atlas de Paxinos e Watson
(1986). Observa-se que a maioria das cânulas bilaterais localizaram-se
predominantemente na área Cg1 do cingulado anterior, Fr2 do córtex frontal e Cg3
do córtex pré-límbico que constituem o CPFm.
a) b) c)
Cg1
Cg1
Fr2
Figura 21 - a) Cortes coronais do cérebro de rato. Nota-se que as cânulas localizaram-se
predominantemente nas áreas Cg1, Cg3 e Fr2 que constituem o CPFm em roedores. b)
Fotografia das fatias cerebrais coradas em vermelho neutro ilustrando as localizações
bilaterais das cânulas destacadas pelo azul de metileno. c) Imagem com inversão de cores
para destaque (fluorescente) da coloração azul de metileno.
71
4.4 Experimentos
4.4.1 Experimento I - Efeitos da Combinação do Antagonista NMDA (MK-801) e
ETOH no CPFm sobre a Memória Operacional de Ratos
Para análise conjunta dos dados obtidos com as combinações de MK-801 e
salina ou ETOH foi empregada uma ANOVA de 2 vias para medidas repetidas (2 x
4) considerando-se como um dos fatores o tratamento com SAL ou ETOH e o outro
fator refere-se às diferentes doses do antagonista NMDA (Fig. 22).
Nesta análise não foram detectadas diferenças estatisticamente significantes
na análise intra-grupos na administração IC aguda do antagonista NMDA (MK-801)
combinado à SAL, tanto no pré- quanto no pós-retardo de 1 hora, quando
comparada ao tratamento controle (SAL e SAL) (Fig. 22A).
Estes resultados demonstram que na administração aguda do MK-801 IC não
foi observado efeito per se no pós-retardo de 1 hora em nenhuma das doses
preconizadas neste estudo.
A ANOVA de 2 vias para medidas repetidas, no entanto, detectou diferenças
estatisticamente significantes entre os tratamentos [F(1,22) = 4,2524; p = 0,05] (Fig.
22B), e o teste de comparação múltipla de Fisher demonstrou que houve aumento
significativo (p < 0,05) do número de erros nos tratamentos combinados de SAL e
ETOH (100 µg), e de MK-801 (1,0 µg) e ETOH (100 µg) comparado ao tratamento
controle SAL e SAL.
Além disso, na administração da combinação de MK-801 na dose de 0,32 µg
e ETOH (100 µg) os animais apresentaram uma diminuição estatisticamente
significante (p < 0,05) do número de erros em relação à combinação de SAL e
ETOH, e também de MK-801 (1,0 µg) e ETOH (Fig. 22B).
72
Retardo de 1 hora
Pré-retardo
SAL 0,32 1,0 3,2
0
1
2
SAL IC
MK-801 IC (µg)
Média de erros
±
e.p.m.
Pós-retardo
SAL 0,32 1,0 3,2
SAL IC
MK-801 IC (µg)
A
Pré-retardo
SAL SAL 0,32 1,0 3,2
0
1
2
ETOH IC (100µg)
MK-801 IC (µg)
SAL
Média de erros
±
e.p.m.
Pós-retardo
SAL SAL 0,32 1,0 3,2
*
*
+
ETOH IC (100µg)
MK-801 IC (µg)
SAL
B
Figura 22 - Efeitos da combinação do antagonista NMDA (MK-801, 0,32; 1,0 e 3,2 µg) e
salina (SAL) (A) ou etanol (ETOH 100 µg) (B) administrados de forma aguda no córtex pré-
frontal medial (intracortical = IC) sobre o desempenho antes (pré-retardo) e após (pós-
retardo) o retardo de 1 hora no labirinto radial de 8-braços (n = 12). * p < 0,05 comparado à
SAL e SAL e + p < 0,05 comparado à SAL e ETOH ou a MK-801 (1,0 µg) e ETOH.
73
Os resultados da análise expostos acima demonstram que o ETOH produz
um efeito de prejuízo sobre a memória operacional espacial em ratos que é refletido
pelo aumento de número de erros na execução da tarefa. O mesmo ocorreu na
combinação de MK-801 na dose de 1,0 µg e o ETOH.
Porém a menor dose de MK-801 IC (0,32 µg) bloqueou o efeito de prejuízo do
ETOH sobre a memória operacional desses animais, após o intervalo de 1 h,
sugerindo a participação do sistema glutamatérgico na ação do etanol no CPFm.
A tabela 23 refere-se ao tempo gasto em cada braço no pré e pós-retardo de
1 hora. A ANOVA de 2 vias para medidas repetidas não identificou diferenças
estatisticamente significantes entre os tempos em cada tratamento tanto antes como
após os retardos de 1 hora.
Tabela 23 - Média do tempo gasto (segundos) ± e.p.m. em cada braço visitado antes (pré-
retardo) e após (pós-retardo) os retardos de 1 hora no labirinto radial de 8-braços sob o
tratamento combinado do antagonista NMDA (MK-801) ou salina (SAL) e etanol (ETOH),
ambos administrados no córtex pré-frontal medial (n = 12).
Tempo gasto em cada braço (média em segundos ± e.p.m.)
Combinações Pré-retardo Pós-retardo
SAL e SAL 11,1 ± 0,8 10,9 ± 0,9
MK-801 0,32 µg e SAL 11,4 ± 1,8 11,0 ± 1,3
MK-801 1,0 µg e SAL 16,9 ± 5,9 10,5 ± 0,8
MK-801 3,2 µg e SAL 12,6 ± 1,4 12,1 ± 0,9
SAL e ETOH 100 µg 12,0 ± 0,7 11,4 ± 0,9
MK-801 0,32 µg e ETOH 100 µg 9,8 ± 0,9 10,8 ± 1,4
MK-801 1,0 µg e ETOH 100 µg 10,7 ± 0,8 10,5 ± 1,1
MK-801 3,2 µg e ETOH 100 µg 13,3 ± 1,3 11,4 ± 0,5
74
4.4.2 Experimento II - Ação do antagonista NMDA (Memantina) no CPFm sobre
a Memória Operacional de Ratos
A ANOVA de 1 via para medidas repetidas detectou a ocorrência de
diferenças estatisticamente significantes nas combinações de Memantina e SAL
[F(3,33) = 5,60377; p < 0,032]. O teste de comparações múltiplas de Fisher
demonstrou que houve um aumento significativo do número de erros cometidos
pelos animais tratados com a combinação de Memantina na dose de 3,2 µg e SAL
comparado ao grupo controle SAL e SAL no pós retardo de 1 hora. Desta forma,
nota-se que esta dose da memantina apresentou efeito per se sobre o desempenho
dos testes com retardos de 1 hora (Fig. 24).
Pré-retardo
SAL 1,0 3,2 10,0
0
1
2
SAL IC
Memantina IC (µg)
Média de erros
±
e.p.m.
Pós-retardo
SAL 1,0 3,2 10,0
*
SAL IC
Memantina IC ( µg)
Retardo de 1 hora
Figura 24 - Efeitos da administração aguda do antagonista NMDA (Memantina 1,0; 3,2 e
10,0 µg) no córtex pré-frontal medial (intracortical = IC) comparados ao tratamento controle
salina (SAL) e SAL sobre o desempenho antes (pré-retardo) e após (pós-retardo) o retardo
de 1 hora no labirinto radial de 8-braços (n = 12).
75
As demais doses de Memantina IC (1,0 e 10 µg) não modificaram,
significativamente, o desempenho dos animais no labirinto radial de 8 braços quando
comparados ao tratamento controle SAL e SAL.
A tabela a seguir refere-se ao tempo gasto em cada braço no pré- e pós-
retardo de 1 hora. A ANOVA de 1 via para medidas repetidas não identificou
diferenças estatisticamente significantes entre os tempos em cada tratamento tanto
antes como após os retardos de 1 hora.
Tabela 25 - Média do tempo gasto (segundos) ± e.p.m. em cada braço visitado antes (pré-
retardo) e após (pós-retardo) os retardos de 1 hora no labirinto radial de 8-braços sob o
tratamento combinado do antagonista NMDA (Memantina = MEM) e salina (SAL), ambos
administrados no córtex pré-frontal medial (n = 12).
Tempo gasto em cada braço (média em segundos ± e.p.m.)
Combinações Pré-retardo Pós-retardo
SAL e SAL 11,2 ± 0,9 12,0 ± 0,6
MEM 1,0 µg e SAL 9,5 ± 0,6 10,2 ± 1,0
MEM 3,2 µg e SAL 11,6 ± 1,2 9,4 ± 1,0
MEM 10,0 µg e SAL 12,1 ± 1,5 14,6 ± 3,1
4.4.3 Experimento III - Efeitos da Combinação do Antagonista NMDA
(Memantina) e ETOH no CPFm sobre a Memória Operacional de Ratos
Nas análises que se seguem, não foi considerada a dose da memantina que
apresentou efeito de prejuízo do desempenho dos testes com retardos de 1 hora, ou
seja, a dose de 3,2 µg, pois pretendia-se avaliar os efeitos da memantina em doses
que não apresentariam efeitos per se, que no caso foram as doses de 1,0 e 10,0 µg,
sobre os efeitos do ETOH em uma dose que sabidamente (por resultados diversas
76
vezes obtidos anteriormente em nosso laboratório) prejudica o desempenho de
tarefas com retardos de 1 hora no labirinto radial (Fig. 26).
Observe-se, portanto, que os dados obtidos com as combinações das duas
doses mencionadas da memantina foram reapresentadas na figura 26A (memantina
1,0 e 10,0 µg e salina), uma vez que os mesmos foram empregados na análise
conjunta com as combinações de memantina e ETOH mostradas abaixo (Fig. 26B).
Desta forma foi empregada uma ANOVA de 2 vias para medidas repetidas (2
x 3) considerando-se como um dos fatores o tratamento com SAL ou ETOH e o
outro fator refere-se às diferentes doses do antagonista NMDA.
Nesta análise detectou-se diferenças estatisticamente significantes entre as
combinações de memantina associada à SAL ou ao ETOH [F(1,22) = 6,98681; p =
0,0148] (Figs. 26A e 26B). O teste de múltipla comparação de Fisher mostrou que
quando submetidos à combinação de SAL e ETOH os animais apresentaram
significativamente maior número de erros (p < 0,01) comparado à combinação
controle SAL e SAL e também às combinações de memantina (1,0 e 10,0 µg) e SAL.
Foi também observado que os animais tratados com a maior dose de
memantina (10,0 µg) combinada ao ETOH apresentaram significativamente menor
número de erros (p < 0,01) comparado ao tratamento combinado de SAL e ETOH
(100 µg), sugerindo que a memantina, na maior dose empregada, administrada no
CPFm bloqueou o efeito de prejuízo do álcool sobre a memória operacional espacial
de duração prolongada (Fig. 26B).
77
Pré-retardo
SAL 1,0 10,0
0
1
2
SAL IC
Memantina IC (µg)
Média de erros
±
e.p.m.
Pós-retardo
SAL 1,0 10,0
SAL IC
Memantina IC (µg)
Retardo de 1 hora
A
Pré-retardo
SAL SAL 1,0 10,0
0
1
2
ETOH IC (100µ g)
Memantina IC (µg)
SAL
Média de erros
±
e.p.m.
Pós-retardo
SAL SAL 1,0 10,0
+ +
ETOH IC (100µg)
Memantina IC (µg)
**
SAL
B
Figura 26 - Efeitos da combinação do antagonista NMDA (Memantina, 1,0 e 10,0 µg) e
salina (SAL) (A) ou etanol (ETOH 100 µg) (B) administrados de forma aguda no córtex pré-
frontal medial (intracortical = IC) sobre o desempenho antes (pré-retardo) e após (pós-
retardo) o retardo de 1 hora no labirinto radial de 8-braços (n = 12). **p < 0,01 comparado à
combinação controle de SAL e SAL e também às combinações de memantina (1,0 e 10,0
µg) e SAL (Fig. 27A), e, ++ p < 0,01 comparado à combinação de SAL e ETOH.
78
Nas combinações de memantina e ETOH não foram observadas pela ANOVA
de 2 vias para medidas repetidas a ocorrência de diferenças estatisticamente
significantes em relação ao tempo gasto em cada braço, tanto no pré quanto no pós-
retardo de 1 hora (Tab. 27).
Tabela 27 - Média do tempo gasto (segundos) ± e.p.m. em cada braço visitado antes (pré-
retardo) e após (pós-retardo) os retardos de 1 hora no labirinto radial de 8-braços sob o
tratamento combinado do antagonista NMDA (Memantina = MEM) e etanol (ETOH) ou salina
(SAL), ambos administrados no córtex pré-frontal medial (n = 12).
Tempo gasto em cada braço (média em segundos ± e.p.m.)
Combinações Pré-retardo Pós-retardo
SAL e SAL 11,2 ± 0,9 12,0 ± 0,6
SAL e ETOH 100 µg 11,2 ± 1,0 11,0 ± 1,5
MEM 1,0 µg e SAL 9,5 ± 0,6 10,2 ± 1,0
MEM 10,0 µg e SAL 12,1 ± 1,5 14,6 ± 3,1
MEM 1,0 µg e ETOH 100 µg 10,9 ± 1,3 9,9 ± 0,8
MEM 10,0 µg e ETOH 100 µg 10,9 ± 1,2 11,4 ± 0,9
Estes resultados demonstram que a memantina, embora tenha apresentado
um efeito per se, dependendo da dose IC, as doses que não apresentavam efeitos
por si só bloqueou o efeito de prejuízo do ETOH IC sobre a memória operacional
espacial, sobretudo na dose de 10,0 µg, corroborando a participação do sistema
glutamatérgico na ação do etanol no CPFm como foi observado no experimento
anterior com o MK-801.
79
5 DISCUSSÃO
80
5.1 Modelo Experimental: Paradigma do Labirinto Radial de 8-
braços
Desde a década de 70 é crescente o número de estudos relacionados aos
processos cognitivos em ratos que receberam uma atenção particular em memória,
mapas de desenvolvimento cognitivo e uso de estratégias dos predadores com suas
vítimas (Olton, 1979). Dentro deste contexto, o labirinto radial de 8-braços,
inicialmente proposto por Olton e Samuelson (1976) continua sendo uma das
ferramentas mais sensíveis e confiáveis para avaliar a memória operacional espacial
em ratos.
O modelo experimental deste estudo utilizou o labirinto radial de 8-braços
como paradigma para avaliar a memória operacional espacial em roedores. Com
este paradigma foi possível avaliar a habilidade do animal de se guiar pelas
orientações espaciais do ambiente para obter alimento.
Alguns cuidados adicionais foram realizados no aparato, como paredes de
acrílico transparentes nos braços e na plataforma central para que o animal não
utilize estratégias internas (interoceptivas) de localização do alimento em cada
braço; recipientes fundos para acondicionar o alimento, em que o animal fica
impossibilitado de visualizar o reforço antes de escolher o braço que deverá entrar;
pistas visuais do ambiente sempre alocadas na mesma posição; limpeza do labirinto
a cada treino e sala iluminada na mesma intensidade nas sessões de treinamento
e/ou sessões de administração de drogas.
Para o desempenho de tarefas neste modelo, os animais não escolhem
braços adjacentes, nem utilizam marcações internas, mas fazem uso
primordialmente de suas capacidades mnemônicas. Além disso, utilizam pistas
visuais (quadros, fotografias, móveis, etc.) localizadas externamente ao labirinto
para mapear o ambiente e diferenciar os braços a serem visitados (Olton e
Samuelson, 1976). Segundo Olton e Samuelson (1976), neste modelo os roedores
não utilizam variáveis como odores, dicas de comida e/ou respostas em cadeia para
resolver a tarefa.
O treinamento dos animais no labirinto radial seguiu critérios pré-estabecidos
(Nakamura-Palacios e Roelke, 1997, Oliveira e Nakamura-Palacios, 2003; Melo et
81
al., 2005). O protocolo possui cinco fases onde os animais aprenderam a localizar
um reforço (1/4 de amendoim) ao final de cada braço somente uma vez por sessão.
Na figura 16 pode-se observar que, após várias sessões de treinamento, todos (n =
24) os animais inseridos no protocolo de administração de drogas atingiram o critério
de aprendizagem (fase IV) alcançando melhora gradativa do desempenho tanto nas
tarefas sem o retardo quanto nas tarefas com o retardo de 5 segundos, utilizadas
para avaliar o desempenho dos animais para inserção no protocolo de administração
de drogas (Fig. 18).
No paradigma do labirinto radial, podem ser diferenciados dois tipos de
memória: a memória de referência e a memória operacional. Os mecanismos
cerebrais da memória de referência e memória operacional são distintos, porém se
associam durante o desempenho no labirinto para produzir o resultado final do teste
(Olton et al., 1977).
A memória de referência ou de procedimento diz respeito às regras de
aprendizagem da tarefa, como, por exemplo, entrar somente uma vez em cada
braço em uma dada sessão para obter o reforço (alimento).
O segundo tipo (memória operacional) está relacionado ao processamento de
diversas funções cognitivas, dentre as quais o armazenamento temporário da
informação, por exemplo, dos braços já visitados em uma mesma sessão de
treinamento, e a finalização da tarefa com presença ou não do retardo (segundos,
minutos ou horas) para a realização da resposta (desempenho) apropriada e efetiva.
Neste caso, a informação seria relevante para aquela sessão especificamente, não
sendo necessária, portanto, para o desempenho das sessões seguintes (Fuster,
1997; Floresco e Phillips, 2001; Phillips et al., 2004; Melo et al., 2005). Neste
contexto, o labirinto radial constitui-se em um modelo animal clássico para avaliar a
memória operacional espacial (Miyake e Shah, 1999; Seamans et al., 1998).
A introdução de um período de retardo durante o desempenho dos animais,
torna a sessão pós-retardo mais sensível à memória operacional. Esta memória
pode ser verificada em curto prazo, através de retardos mais curtos (segundos) ou
ainda, pode ser avaliada como memória operacional de longa duração, através de
retardos mais prolongados (horas). Em nossos experimentos, utilizamos retardos de
5 segundos para aquisição da tarefa e de 1 hora para as sessões de administração
de drogas.
82
Alguns autores questionam o uso do termo “memória operacional de longa
duração” para os resultados obtidos com retardos acima de alguns segundos.
Porém, não consideramos a memória operacional quanto ao aspecto temporal, mas
sim como um processo, para manipular uma informação a fim de atingir um objetivo
final de execução da tarefa (Fuster, 1991). Assim, o animal retém a informação dos
braços já visitados na sessão pré-retardo no labirinto radial e esta permanece on line
por horas, até que a sessão pós-retardo ocorra. Após esse evento, a informação é
descartada, não influenciando uma outra sessão realizada no dia seguinte. Isso
demonstra que não houve uma consolidação da informação e que ela não é mais
sustentada após o período necessário. Sob esse ponto de vista, o desempenho da
memória operacional do animal estaria relacionado à habilidade de integrar a
informação adquirida no pré-retardo, e sustentada durante o intervalo, à realidade do
teste no pós-retardo, onde a resposta comportamental seria o resultado do
processamento dessas informações.
Portanto, considerando esses aspectos, os testes com retardos com uma
hora de duração podem ser considerados avaliações da memória operacional
espacial de longa duração (Melo et al., 2005).
5.2 Sítio Neuroanatômico de Implantação das Cânulas
Rose e Woolsey (1948) definem o CPF de roedores como a região que
recebe maciças projeções do núcleo dorso medial do tálamo. Neste estudo, após
medidas específicas a partir do bregma realizadas na cirurgia estereotáxica e,
análise histológicas de fatias dos cérebros dos animais extraídos do Atlas de
Paxinos e Watson (1986), observou-se que a maior parte das cânulas foram
implantadas na região do cingulado anterior dorsal (ou Cg1) situadas dorsalmente à
região pré-límbica (PrL ou Cg3) e rostralmente à área motora primária (Fig. 21).
Alguns autores consideram apenas a área pré-límbica (PrL ou Cg3) como o
verdadeiro CPF de ratos (Condé et al., 1995; Preuss, 1995), por entenderem que
essa área seria aquela que recebe o maior contingente de aferências do núcleo
83
dorso medial do tálamo. Entretanto, diversos estudos demonstraram que outras
regiões, como a região dorsal do cingulado anterior (Cg1) e a região do córtex frontal
(Fr2) são de fato parte integrante da porção medial do CPF (CPFm), pois também
recebiam maciças projeções do núcleo dorso medial do tálamo (Groenewegen,
1988; Uylings e Van Eden, 1990; Vertes, 2002; Uylings et al., 2003). Dessa forma,
essas regiões tornam-se apropriadas para investigação de funções executivas pré-
frontais, como a memória operacional espacial.
Em primatas, o córtex pré-frontal dorsolateral é o sítio neuroanatômico de
várias funções cognitivas complexas, incluindo a memória operacional (Goldman-
Rakic, 1996). Diferentes grupos de pesquisadores se questionavam se haveria uma
correspondência funcional entre a parte dorsolateral do CPF de primatas não
humanos e o CPF de ratos. Brown e Bowman (2002), correlacionando os achados
de diversas pesquisas envolvendo o CPF de primatas e roedores, sugerem que a
parede medial do CPF do rato (CPFm) é uma área não-diferenciada que possuiria
as funções cognitivas encontradas no córtex pré-frontal dorsolateral de primatas e,
portanto, seria útil na investigação dos processos cognitivos pré-frontais.
Estudos de conexão também parecem mostrar similaridades
neuroanatômicas-estruturais entre o córtex pré-frontal dorsolateral de primatas e o
CPFm de roedores. Há conexões do corpo amigdalóide tanto com o córtex cingulado
anterior dorsal (Cg1) e a região Fr2 em roedores, quanto com o córtex pré-frontal
dorsolateral em primatas (Groenewegen et al., 1997).
Entretanto, outros estudos demonstram que, não somente a memória
operacional, como outras funções pré-frontais, por exemplo, os processos
atencionais, seriam similares entre o CPFm de roedores e o córtex pré-frontal
dorsolateral em primatas (Brown e Bowman, 2002).
Desta forma, é possível sugerir uma semelhança funcional entre o CPFm de
ratos e o córtex pré-frontal dorsolateral de primatas no que se refere aos
mecanismos existentes em comum nessas espécies. Estas informações nos permite
correlacionar com dados obtidos experimentalmente em espécies mais evoluídas
como primatas. Porém, cautela e bom senso devem ser valorizados nas extensões
clínicas dos resultados experimentais.
84
5.3 Desenho Experimental: Drogas e Doses
Como exposto no capítulo “metodologia” deste estudo, as drogas utilizadas
foram álcool etílico (ETOH) e dois antagonistas NMDA de canal aberto: maleato de
dizocilpina (MK-801) e memantina. A combinação de etanol com antagonistas de
canal aberto (MK-801 e memantina) em estudos experimentais é muito freqüente,
principalmente em modelos animais de alcoolismo, preferência ao álcool, e nos
processos de dependência, tolerância e abstinência. (Spanagel et al., 1994; Hölter et
al., 1996; Piasecki et al., 1998; Kotlinska, 2001, Lukoyanov e Paula-Barbosa, 2001)
A escolha da dose do etanol (100 µg) foi determinada de acordo com estudo
prévio realizado em nosso laboratório que demonstrou prejuízos no desempenho da
memória operacional espacial com retardo de 1 hora, seguindo um padrão em “U”
invertido, quando comparada ao controle (Oliveira e Nakamura-Palacios, 2003).
Sendo assim, selecionamos a dose intermediária que se mostrou significativamente
prejudicial para a memória operacional espacial de longa duração de uma curva de
administrações intracorticais para ser empregada no presente estudo.
O mesmo critério foi realizado para selecionar as doses de MK-801, tomando-
se como referência as doses empregadas anteriormente em nosso laboratório
(Bazzarella, 2004).
Os efeitos da memantina, no entanto, não haviam sido previamente
investigados em nosso laboratório. Desta forma, o critério para escolha de suas
doses considerou o limite de solubilidade da substância em veículo de forma que
houvesse o máximo de homogeneização da droga. Por esta razão, foi realizada uma
curva dose-efeito prévia investigando os efeitos deste antagonista NMDA sobre a
memória operacional espacial para que então se pudesse selecionar as doses que
não apresentassem efeitos per se para serem combinadas ao etanol (Fig. 24).
Tanto para o MK-801, como para a memantina as doses utilizadas foram
determinadas através do emprego de uma escala logarítmica, garantindo-se assim,
uma extensão de doses considerável para investigação da ação dessas drogas.
85
5.4 Ação do Etanol e Envolvimento da Transmissão Glutamatérgica
5.4.1 Efeitos da Combinação do Antagonista MK-801 e Etanol
Uma variedade de estudos tem mostrado o envolvimento do sistema
glutamatérgico nos mecanismos de ação do etanol no SNC por meio da
administração de antagonistas NMDA (Hölter et al.,1996; Lukoyanov e Paula-
Barbosa, 2001; Kotlinska, 2001).
Experimentos prévios em nosso laboratório (Bazzarella, 2004) com infusão do
antagonista MK-801, não produziu prejuízo no desempenho dos animais no labirinto
radial em nenhuma das doses estabelecidas, apesar de ter evidenciado certa
tendência, não significante estatisticamente, ao aumento do número de erros no pós
retardo na dose intermediária de 3,2 µg.
No presente estudo também não houve constatação de efeito per se, em
nenhuma das doses, tanto no pré quanto no pós-retardo de 1 hora na administração
aguda do MK-801 IC (Fig. 22A).
A infusão aguda intracortical de etanol na dose de 100 µg produziu efeito de
prejuízo da memória operacional espacial dos animais inseridos no protocolo deste
estudo quando comparado ao grupo controle (Fig. 22B). Esses dados eram
esperados e se corroboram com outros estudos realizados em nosso laboratório que
também constaram aumento do número de erros no desempenho dos animais no
labirinto radial quando administrada a dose de 100 µg (Oliveira e Nakamura-
Palacios, 2003; Galvão, 2005).
Estudos em cultura de células hipocampais e cerebelares mostram que o
receptor NMDA é mais sensível ao etanol do que os receptores não-NMDA (AMPA e
Kainato) (Hoffman et al, 1989; Lovinger et al, 1999). Porém, estudos subseqüentes
realizados em células locus coeruleus demostraram que há inibição das respostas
tanto de receptores NMDA como de AMPA (Fröhlich et al., 1994; Nieber et al., 1998)
Em estudo conduzido por Li et al. (1997) utilizando antagonista NMDA, dentre
eles MK-801, e antagonistas de receptores AMPA no paradigma do labirinto radial
de 8-braços para avaliação da memória operacional espacial, obtiveram prejuízos
86
nas provas com retardo associadas aos antagonistas NMDA, porém o mesmo não
aconteceu com antagonistas AMPA, sugerindo que receptores NMDA e AMPA não
contribuem de forma equalitária nos processos cognitivos de memória operacional
espacial.
No presente estudo foi observado nas curvas de combinação da
administração intracortical do MK-801 e etanol que o desempenho dos animais sob
a combinação das doses maiores do MK-801 (1,0 e 3,2 µg) combinado ao etanol
(100 µg) foi comparável ao produzido pela administração intracortical do etanol (100
µg) precedida de salina, sugerindo que o MK-801 nestas doses administradas no
CPFm não modificaram os efeitos de prejuízo do ETOH sobre a memória
operacional de duração prolongada.
Entretanto, a infusão intracortical da menor dose (0,32 µg) do MK-801
produziu uma diminuição significativa do número de erros produzidas pelo etanol
100 µg, sugerindo que a menor dose do antagonista NMDA bloqueou o efeito de
prejuízo do etanol quando administrado agudamente no CPFm (Fig. 22B).
De acordo com Jackson et al. (2004) o CPF é a estrutura cerebral mais
comprometida quando um antagonista NMDA é administrado sistemicamente.
Ao contrário do que se poderia esperar de um bloqueio (antagonismo) de
receptores NMDA, ou seja, uma redução da atividade sináptica excitatória, Jackson
et al. (2004) demonstraram que a hipofunção de receptores NMDA induzida por um
antagonista (MK-801), em doses que prejudicam o desempenho da memória
operacional, produz uma potenciação sustentada da taxa de disparo (firing rate),
resultante de um aumento do número de potenciais (pulsos) isolados (single spikes)
distribuídos aleatoriamente, e uma concomitante redução da salva de potenciais
(burst) na maioria dos neurônios do CPF de ratos acordados, por redução dose-
dependente do número total de salvas de potenciais, da média do número de salvas
de potenciais por minuto, e da média de potenciais em cada salva de potenciais.
Segundo estes autores as salvas de potenciais são mais efetivas que os
potenciais isolados no desencadeamento da liberação de neurotransmissores e no
processamento de informações (Jackson et al., 2004). E ainda, os potenciais
isolados podem não somente produzir um sinal fraco, mas parecem produzir um
“ruído” que prejudica a filtragem de informações irrelevantes e favorece a
transmissão de informações distorcidas. Assim, o concomitante aumento na
87
atividade de potenciais isolados aleatórios e redução das salvas de potenciais
prejudicam profundamente a função do CPF. Assim, a redução das salvas de
potenciais atenua a eficiência da transmissão sináptica dos neurônios do CPF e
diminui a mediação cortical do comportamento normal, enquanto que, ao mesmo
tempo, o aumento dos potenciais isolados aleatórios pode prejudicar a filtragem de
informações irrelevantes levando à expressão de comportamentos anormais
(Jackson et al., 2004).
Um resultado interessante do estudo de Jackson et al. (2004) foi a de que
uma dose muito pequena do MK-801 melhorou o desempenho da memória
operacional. Ao contrário do que foi observado para as doses maiores do MK-801
como mencionado acima, a pequena dose do MK-801 aumentou a média do número
de salvas de potenciais por minuto e a freqüência de potenciais dentro das salvas de
potenciais dos neurônios do CPF, sugerindo um aumento da eficiência do sinal em
relação à taxa de ruído dos neurônios corticais melhorando a memória operacional
(Jackson et al., 2004).
Curiosamente, no presente estudo a menor dose do MK-801 administrada no
CPFm foi a que bloqueou o prejuízo da memória operacional espacial produzido
pelo etanol intracortical, ainda que esta dose sozinha não tenha apresentado o
mesmo efeito. Considerando o resultado de Jackson et al. (2004), a melhora da
atividade sináptica no CPFm com a conseqüente melhora na função da memória
operacional promovida pela dose pequena do MK-801 pode ter contrabalançado o
prejuízo da memória operacional produzido pelo etanol.
Em protocolo experimental com labirinto aquático de Morris para avaliação de
desempenho cognitivo em ratos em abstinência ao álcool, Lukoyanov e Paula-
Barbosa (2001), mostraram que o MK-801, injetado intraperitonealmente, não
reverteu os prejuízos causados pela abstinência. Em outro estudo, utilizando
paradigma de labirinto em T, o MK-801 (0,31 mg/kg por dia) infundido por via
subcutânea, paralelamente à administração intracerebroventricular de agonista
NMDA (ácido quinolínico), preveniu o aparecimento de prejuízos no desempenho da
tarefa induzidos pelo ácido quinolínico. O mesmo efeito foi evidenciado com a
infusão de memantina (20 mg/kg por dia). Os autores afirmam que tanto MK-801,
como memantina, nas doses administradas, possuem efeito neuroprotetor verificado
pelo melhor desempenho dos ratos em tarefas de aprendizagem e memória (Misztal
et al., 1996).
88
Há que se ressaltar que, por um lado, alguns estudos reportam prejuízos na
memória operacional espacial após o bloqueio do receptor NMDA em ratos (Mandillo
et al., 2003; Ward et al., 1990), enquanto outros não encontram nenhum prejuízo
(Lissek e Güntürkün, 2004). Essas diferenças de resultados podem ser justificados
pela forma de administração sistêmica dos antagonistas de receptor NMDA, não
sendo possível concluir qual área cerebral gerou o déficit (Lissek e Güntürkün,
2004). Cabe referir que no presente estudo nós utilizamos a administração direta de
MK-801 no CPFm combinada com a infusão de etanol, também intracortical. A
administração sistêmica de MK-801 alcançaria outras estruturas, além do CPFm,
envolvidas em tipos diferentes de memórias, como por exemplo o hipocampo.
O etanol inibe, de forma mais direta, a função do receptor NMDA constituído
pelo complexo NR1/NR2A e/ou NR1/NR2B do que receptores com NR1/NR2C e
NR1/NR2D (Kuner et al., 1993; Massod et al., 1994; Mirshahi e Woodward, 1995;
Dingledine et al., 1999).
O efeito do etanol no receptor NMDA não é feito por meio do antagonismo
competitivo do sítio de ligação da glicina ou glutamato, e nem necessita de abertura
do canal para que seus mecanismos ocorram. A inibição da função do receptor
NMDA ocorre por mecanismo não-competitivo sem envolvimento de sítios
modulatórios como fenciclidina, MK-801, poliaminas e zinco (Woodward, 2000).
Do ponto de vista farmacológico, o MK-801 atua no mesmo sítio da
fenciclidina, ou seja, bloqueando, de forma não-competitiva, o canal iônico acoplado
ao receptor NMDA após a sua abertura (Watkins, 1994). Sítios específicos de
ligação, bem como o perfil diferenciado do receptor glutamatérgico NMDA terão
papel importante para determinar se a droga antagonista será bem tolerada
clinicamente ou não (Carter, 1995).
A composição do complexo NR1/NR2 participa efetivamente das
características farmacológicas e fisiológicas do receptor NMDA. Além disso, as
variações das combinações das subunidades dos receptores NMDA são
diferentemente distribuídas no SNC e, o padrão de expressão se modifica ao longo
do desenvolvimento (Allgaier, 2002). O sítio de ligação do receptor NMDA com maior
afinidade para o MK-801 ocorre nas combinações de subunidades NR1/NR2A e
NR1/NR2B e com menor ligação para NR1/NR2C ou NR1/NR2D (Liu e Zhang,
2000). Curiosamente, nestas mesmas combinações de subunidades há também
maior presença de ação do etanol, como citado anteriormente.
89
Antagonistas do receptor NMDA, como o MK-801, podem prorrogar ou
prevenir o desenvolvimento de tolerância ou dependência à morfina, bloquear o
efeito de sensitização da cocaína e anfetamina, bem como inibir processos de
tolerância ao etanol e convulsões induzidas na síndrome de abstinência ao álcool
(Liu e Zhang, 2000). Acrescentamos ainda que, com nossos resultados, é possível
haver bloqueio dos efeitos agudos de prejuízos produzidos pelo etanol sobre a
memória operacional espacial em ratos.
5.4.2 Efeitos do Antagonista Memantina sobre a Memória Operacional de Ratos
A memantina, por ser um antagonista com boa tolerância clínica no
tratamento de algumas doenças neurodegenerativas e no alcoolismo, tem sido
largamente utilizada tanto em protocolos experimentais quanto em clínicos
(Spanagel et al., 1994; Misztal et al., 1996; Zajaczkowaki et al., 1996; Piasecki et
al.,1998; Parsons et al., 1999; Lukoyanov e Paula-Barbosa, 2001; Peeters et al.,
2003).
No presente estudo, observamos que a administração no CPFm da dose de
3,2 µg combinada com salina aumentou significativamente o número de erros
cometidos pelos animais no pós retardo de 1 hora quando comparado ao tratamento
controle. Desta forma, esta dose da memantina apresentou efeito per se sobre o
desempenho dos testes com retardos de 1 hora (Fig. 24), o que não aconteceu com
a menor (1,0 µg) e a maior (10,0 µg) dose empregada.
Estes resultados dos efeitos da memantina sobre a memória operacional
espacial sugerem um padrão de curva em “U” invertido. Curiosamente este perfil de
efeitos segue o mesmo padrão de efeitos de agonistas e antagonistas
dopaminérgicos (Valentim Jr., 2003), e de várias drogas de abuso, como o etanol
(Oliveira e Nakamura-Palacios, 2003; Galvão, 2005) e o ∆
9
-THC, princípio ativo da
cannabis (Melo et al., 2005), observado em estudos realizados anteriormente em
nosso laboratório.
Têm-se estabelecido que o processamento da memória operacional depende
da atividade dopaminérgica, envolvendo, particularmente, os receptores
dopaminérgicos do tipo D
1
(Zhart et al., 1997). De fato tem se demonstrado que a
90
integridade da função da memória operacional no CPF segue um padrão em “U”
invertido (ou bifásico, ou ainda em forma de sino) de ativação de receptores do tipo
D
1
(Goldman-Rakic, 1996; Zahrt et al., 1997; Arnsten, 1998; Seamans e Yang, 2004;
Castner e Williams, 2007), de tal forma que uma ativação insuficiente ou excessiva
destes receptores são prejudiciais para esta função cognitiva (Zhart et al, 1997;
Castner e Williams, 2007).
Desta forma, o padrão de curva dose-efeito produzido pela memantina
administrada no CPFm sobre a memória operacional poderia envolver a mediação
dopaminérgica.
De fato, Spanagel et al. (1994) num estudo de microdiálise in vivo do SNC de
ratos afirmam que a memantina administrada intraperitonealmente resulta num
aumento da liberação de dopamina no CPFm e no striatum de forma dose-
dependente. Estes dados demonstram haver interação entre antagonistas não-
competitivos NMDA e o sistema dopaminérgico.
Em outro estudo também com microdiálise, Nishijima et al. (1994), afirmam
que a infusão local de antagonistas competitivo NMDA no CPFm aumenta a
concentração extracelular de dopamina, sugerindo maior liberação deste
neurotransmissor.
O CPFm recebe grande parte das projeções dopaminérgicas mesocorticais
(Berger et al., 1976; Carr et al., 1999). Ao atingir o CPF, essas projeções realizam
sinapses, tanto em interneurônios gabaérgicos, quanto em neurônios piramidais,
sendo esse último o sítio preferencial dessas terminações (Carr e Sesack, 1996;
Goldman-Rackic et al., 2000).
Pirot et al. (1995) afirmam que o CPF é especialmente rico em receptores
NMDA e AMPA. Assim, há uma importante interação no CPF, entre as vias aferentes
glutamatérgicas e dopaminérgicas. Ambas projetam-se para os mesmos tipos
celulares e realizam sinapses muito próximas uma das outras, constituindo uma co-
localização desses terminais (Carr e Sesack, 1996; Goldman-Rackic et al., 2000).
Segundo Goldman-Rackic et al. (1992) há um impressionante arranjo
sináptico envolvendo a transmissão dopaminérgica no córtex de primata, o qual uma
espinha dendrítica poderia ser o alvo pós-sináptico dopaminérgico de uma suposta
entrada excitatória. Esta tríade sináptica permite uma modulação dopaminérgica
direta da excitabilidade total de neurônios corticais pela alteração de respostas
locais glutamatérgicas, principalmente por alterações nas concentrações
91
intracelulares de AMPc desencadeadas pelos receptores dopaminérgicos (Goldman-
Rakic, 2000; Gu, 2002). Um aumento na concentração desse mediador, por
exemplo, pela atividade do receptor D
1
, ativaria uma cascata enzimática, cujo
resultado é a facilitação dos canais NMDA e AMPA. O receptor D
2
, quando ativado,
inibe toda essa cascata enzimática, pois diminui as concentrações intracelulares de
AMPc (Greengard, 2001).
O CPFm é inervado por aferências dopaminérgicas, provenientes da área
tegmentar ventral e glutamatérgicas vindas do núcleo dorso medial do tálamo.
Kalivas, Romannides e Duffy (1999) demonstram em seu estudo que o aumento
do tônus de disparo de dopamina ou a redução do glutamato no CPF prejudica a
memória operacional espacial com retardo dando suporte para hipótese de
interação dopaminérgica-glutamatérgica no CPF.
Sendo assim, poderíamos sugerir que um bom desempenho da memória
operacional dependeria de um nível ótimo de ativação de receptores tanto
glutamatérgicos como dopaminérgicos, reforçando a possibilidade de interação entre
estes dois sistemas de neurotransmissão. Observe-se que os efeitos da interação
dopaminérgica-glutamatérgica no CPFm sobre a memória operacional espacial
estão sendo atualmente investigados em nosso laboratório e os resultados até o
momento obtidos confirmam a existência de atuação conjunta destes sistemas nesta
função cortical.
5.4.3 Efeitos da Combinação do Antagonista Memantina e Etanol
Como um dos nossos objetivos neste estudo também foi verificar o emprego
da memantina no tratamento dos prejuízos da memória operacional espacial
produzidos pelo etanol, realizamos o experimento III apresentado no capítulo
“resultados” com os efeitos da combinação da memantina e etanol no CPFm. Para
tanto, excluiu-se a dose intermediária 3,2 µg por apresentar efeito per se. Assim, na
figura 26A foram (re)expostos os resultados da memantina combinada ao controle.
Foi observado em nosso estudo que a administração prévia da memantina no
CPFm reduziu, de forma dose-dependente, os efeitos de prejuízo do etanol
intracortical sendo o número de erros cometidos pelos animais sob a combinação de
92
memantina na dose 10,0 µg e etanol significativamente menor comparado ao
desempenho dos animais sob o tratamento com etanol precedido de salina. Estes
resultados sugerem que a memantina bloqueia os prejuízos produzidos pelo etanol
sobre a memória operacional espacial.
Vários estudos in vitro mostram que o efeito protetor da memantina acontece
em cultura de células hipocampais sobre a ação tóxica induzida pelo glutamato
(Parsons et al., 1999b) e na ação de agonistas do receptor NMDA em células
corticais e da retina (Erdõ e Scäfer, 1991; Osborne e Quack, 1992; Weller et al.,
1993).
Acrescenta-se ainda que, 10 µM de memantina fornece proteção completa em
cultura de neurônios similar à 1 µM de MK-801 (Parsons et al., 1999). Os resultados
do presente estudo também obedeceram aproximadamente esta proporção visto
que a menor dose do MK-801 (0,32 µg) e a maior dose da memantina (10 µg) foram
as que bloquearam os efeitos de prejuízo do álcool.
Em vários estudos com modelos de isquemia/hipóxia, memantina e
antagonista da glicina
B
produzem efeito terapêuticos melhores do que MK-801 e
antagonistas competitivos do NMDA.
No labirinto aquático de Morris, a administração intraperitonial (i.p.) de
memantina não produz prejuízos na aprendizagem e memória, enquanto que o MK-
801 produz déficits importantes (Chen et al., 1998).
Zajaczkowski et al. (1996) realizou experimento em ratos com lesão no córtex
entorrinal produzida pela infusão sistêmica de ácido quinolínico, treinados no
labirinto radial de 8-braços e tratados com MK-801, memantina e grupo controle.
Neste estudo, observou que o MK-801 prejudicou a memória procedural, mas não a
memória operacional, enquanto que a memantina reverteu o número de erros
induzidos pela lesão por ácido quinolínico. Esse efeito divergente entre MK-801 e
memantina pode ser explicado pelas diferenças cinéticas de bloqueio do receptor
NMDA exercidas por estas drogas. Deve-se ressaltar também que a administração
das drogas foi realizada sistemicamente.
O ácido quinolínico infundido isoladamente produz déficits importantes de
aprendizagem no labirinto em T, porém quando há infusão de memantina, por via
subcutânea, os animais não apresentam prejuízos no desempenho da tarefa (Misztal
et al., 1996). Além disso, observa-se também, uma diminuição da recaptação da
colina, um indicador da densidade de terminais de acetilcolina, no córtex de animais
93
tratados apenas com ácido quinolínico. Mas, o mesmo não acontece com os animais
tratados simultaneamente com memantina.
Dimpfel (1995) referiu um efeito facilitatório agudo per se da memantina nas
transmissões sinápticas hipocampais. Embora seja fácil compreender o uso de
antagonistas NMDA nas atividades de neuroproteção, a mesma relação torna-se
difícil quando se discute sobre os efeitos sintomatológicos cognitivos, uma vez que,
parece ser necessária a ativação de receptores NMDA na plasticidade e
aprendizagem (Collingridge e Singer, 1990; Danysz et al., 1995).
Entretanto, diversos estudos demonstram benefícios e efetividade de certas
doses de antagonistas de receptor NMDA nos processos de aprendizagem. De fato,
Mondadori et al. (1989) demonstraram efeitos benéficos de antagonistas de
receptores NMDA sobre a aprendizagem e memória já que observaram uma
facilitação da aprendizagem em animais com prejuízos no desempenho de tarefas.
Em outro estudo realizado por Barnes et al. (1996), a administração de memantina
prolongou a duração da LTP e mostrou melhora da retenção da memória no labirinto
aquático de Morris em ratos adultos idosos.
O funcionamento do receptor NMDA tem sido alvo de diversos estudos que
abordam tanto processos fisiológicos como patológicos deste receptor, bem como a
sua relação com diversas doenças agudas ou crônicas. A hipótese sinal-ruído dos
receptores NMDA parece esclarecer alguns aspectos importantes do envolvimento
destes receptores nos processos de aprendizagem e memória.
Na condição
fisiológica (Fig. 28), os receptores NMDA são ativados na pós-sinapse, em sítios de
ligação específicos, pelo agonista glutamato e co-agonista glicina, permitindo o
influxo de Na
e Ca . Nesta situação, o canal NMDA é bloqueado por Mg ,
prevenindo o influxo excessivo desses íons. O desbloqueio do canal e a
despolarização do neurônio pós-sináptico são elementos essenciais nos processos
de aprendizagem e memória.
+ +2 +2
94
Figura 28 - Condição fisiológica relacionada aos processos de aprendizagem. À esquerda
observa-se uma situação de bloqueio do receptor NMDA pelo Mg
+2
e um padrão de ruído
basal. À direita, é mostrada a ação do glutamato na pós-sinapse, a saída do Mg
+2
e a
ativação do neurônio pós-sinaptico. A aprendizagem é baseada na detecção de um sinal
relevante (acima do ruído basal) (Extraído de
www.memantine.com/en/studies/preclinical_data/signal-to-noise_hypothesis; Danysz et al.,
2000).
Entretanto, em uma condição patológica os receptores NMDA seriam
continuamente ativados por baixas concentrações de glutamato, resultando no
aumento do influxo da Ca
+2
e em um aumento do ruído, prejudicando a detecção de
um sinal relevante, e, conseqüentemente interferindo na aprendizagem (Fig. 29).
Esta superativação produz déficits progressivos em funções cognitivas e pode ser
responsável também pela morte neuronal como ocorre nas doenças
neurodegenerativas.
95
Figura 29 - Condição patológica com superativação do receptor NMDA, influxo excessivo de
Ca
+2
, aumento do ruído basal e morte neuronal por neurotoxicidade. O ruído aumentado
dificulta a detecção do sinal relevante prejudicando a aprendizagem (Extraído de
www.memantine.com/en/studies/preclinical_data/signal-to-noise_hypothesis; Danysz et al.,
2000).
De fato, pode-se observar que o Mg
2+
não consegue ter ação efetiva nestes
processos, e, por isso, antagonistas de receptores NMDA são estudados e
preconizados para o tratamento de algumas doenças, desde que sejam bem
tolerados clinicamente. Como já expostos, o MK-801 e memantina possuem
diferenças cinéticas e de afinidade importantes que refletem no uso clínico ou não
da droga. A memantina é um antagonista mais tolerável clinicamente do que MK-801
que produz efeitos adversos.
Como resultado de baixa voltagem-dependência, a memantina é mais efetiva
do que Mg
+2
, bloqueando a ativação patológica dos receptores NMDA. Entretanto,
numa ativação sináptica mais forte, a memantina é deslocada do canal com cinética
rápida, desbloqueando-o. Sua ação suprime o ruído excessivo, mas mantém o ruído
em nível basal, como na condição fisiológica, permitindo assim, que o sinal relevante
envolvido na aprendizagem seja detectado (Fig. 30).
96
Figura 30 - Esquema de ação do antagonista memantina na hipótese sinal-ruído.
Memantina é capaz de funcionar como filtro bloqueador do ruído sináptico permitindo que
um sinal relevante seja detectado (Extraído de
www.memantine.com/en/studies/
preclinical_data/signal-to-noise_hypothesis
; Danysz et al., 2000).
Com os avanços na compreensão da farmacodinâmica da memantina,
diversas possibilidades de aplicações terapêuticas surgiram, como em alterações
neurológicas pelo vírus HIV, glaucoma, encefalopatia hepática, esclerose múltipla,
zumbidos auditivos, doença de Parkinson, discinesias tardias, epilepsia,
espasticidade, dor crônica e tolerância, sensitização e adição de drogas são
descritas por Parsons et al. numa detalhada revisão publicada em 1999.
A memantina infundida por via subcutânea, parece apresentar propriedades
de controle da compulsão (anti-craving) em ratos dependentes ao etanol (Hölter et
al., 1996; Spanagel e Zieglgänsberger, 1997).
Cabe ressaltar que, em nosso estudo, o uso de antagonistas de receptor
NMDA e do etanol foram infundidos de forma aguda no CPFm e, podemos
acrescentar que também foi observado efeitos neuroprotetores dos prejuízos do
álcool sobre a memória operacional espacial avaliada pelo labirinto radial de 8-
braços.
97
De fato, parece haver envolvimento dos receptores NMDA do CPFm nos
efeitos do etanol sobre a memória operacional espacial, sob modulação
glutamatérgica. Entretanto, sabendo que o CPFm é uma estrutura extremamente
rica em conexões, torna-se necessário estudos que possam elucidar os mecanismos
que envolvem a interação dos diversos sistemas de neurotransmissão nas funções
cognitivas dessa região cortical.
5.4.4 Envolvimento dos receptores NMDA nos efeitos de prejuízo do etanol
sobre a memória operacional no CPFm
Tu et al. (2007), realizando um estudo eletrofisiológico in vivo e in vitro
mostraram que o etanol inibe a atividade de neurônios corticais pré-frontais. O
estudo destes autores forneceu a primeira evidência direta de que o etanol prejudica
os padrões complexos da atividade persistente em neurônios piramidais das
camadas profundas do CPF. Segundo estes autores estes efeitos estariam
relacionados aos prejuízos na cognição, na memória operacional, e nas funções
executivas observadas após a ingestão de álcool. Ainda acrescentam que os
prejuízos pré-frontais produzidos pelo etanol estariam relacionados aos prejuízos no
desempenho de tarefas complexas e na inibição de comportamentos de risco,
incluindo o controle sobre a ingestão alcoólica, estando, desta forma, relacionados
ao processo de abuso, adição e dependência a esta droga.
Ainda neste estudo, Tu et al. (2007) sugerem que estes efeitos do álcool
estariam mais relacionados à inibição dos processos relacionados à ativação de
receptores NMDA, do que de receptores AMPA ou GABA. Adicionalmente,
observaram que a inibição dos receptores NMDA pelo etanol é incompleta mesmo
em concentrações associadas a prejuízos comportamentais severos. A inibição das
correntes por uma concentração muito elevada (100 mM) variam entre 18 a 55%,
dependendo das subunidades dos receptores NMDA expressas (Tu et al., 2007).
Nos neurônios corticais, a maioria dos receptores NMDA é formada pelas
subunidades NR1 (contendo o sítio de ligação para a glicina) e NR2 (contendo o
sítio de ligação para o glutamato) A e/ou B. Estes receptores estão localizados, em
grande parte na pós-sinapse, sobre dendritos ou espículas dendríticas, mais
98
abundantemente nas camadas II e III, predominantemente constituído de células
piramidais, mas também são encontrados em terminais axônicos excitatórios e
inibitórios (sugestivamente gabaérgicos) e em astrócitos, sugerindo que a ativação
cortical glutamatérgica não depende exclusivamente da abertura dos canais NMDA
da pós-sinapse (Conti et al., 1999).
As subunidades NR2 dos receptores NMDA parecem contribuir de forma
distinta para as diferentes formas de plasticidade sináptica de longo-prazo, sendo
que a ativação da subunidade NR2B estaria relacionada à depressão a longo-prazo
(LTD) e a subunidade NR2A à potenciação a longo-prazo (LTP) (Erreger et al.,
2005), particularmente no hipocampo (Zhao et al, 2005), mas no cingulado anterior
(CPF) a ativação destas duas subunidades (NR2A e B) parece ser necessária na
indução da LTP (Zhao et al., 2005).
Há uma diferença na expressão das subunidades NR2A e NR2B entre
hipocampo e CPF, mais precisamente no cingulado anterior (Zhao et al., 2005).
Zhao et al. (2005) observaram que a expressão da subunidade NR2A foi
consistentemente maior no hipocampo que no cingulado anterior, enquanto que a
expressão da subunidade NR2B foi equivalente. Desta forma, a proporção da
subunidade NR2B para NR2A foi maior no cingulado anterior comparada ao
hipocampo tanto no homogenato total como nas membranas sinaptosomais,
sugerindo que a subunidade NR2B apresenta uma maior contribuição nas sinapses
do cingulado anterior podendo explicar o seu papel na indução da LTP nesta
estrutura cerebral. Várias evidências demonstram que a subunidade NR2B não
participa na indução da LTP no hipocampo (Zhao et al., 2005).
Erreger et al. (2005), demonstraram, em estudo empregando uma técnica in
vitro (“patch-clamp”) para registro de atividade de um único canal iônico ativo, que a
estimulação de alta freqüência ativa a subunidade NR2A para a abertura dos canais
que ocorre de forma muito mais rápida que a abertura dos canais por ativação da
subunidade NR2B, que ocorre por estimulação de baixa freqüência. No entanto, a
duração da ativação é maior para a subunidade NR2B, e desta forma a transferência
de íons é maior e subseqüentemente é maior o influxo de cálcio. De acordo com
estes autores, as diferenças cinéticas intrínsecas destas duas subunidades
poderiam explicar a diferença de participação das mesmas na plasticidade sináptica
(Erreger et al., 2005).
99
De acordo com Allgaier (2002), a sensibilidade dos receptores NMDA ao
etanol corresponde à sua sensibilidade ao ifenprodil, um antagonista não competitivo
de receptores NMDA que inibe os receptores por ação preferencial na subunidade
NR2B. De fato, Engblom et al. (1997) já haviam demonstrado que os efeitos
inibitórios do álcool sobre os receptores NMDA são parciais e por isso
provavelmente se deveria a uma ação seletiva do álcool em um subtipo de receptor
NMDA, provavelmente contendo um componente do receptor no qual o ifenprodil
atua com elevada potência com propriedades funcionais e farmacológicas da
subunidade NR2B.
Corroborando esta evidência, Boyce-Rustay e Holmes (2005) demonstraram
que os receptores NMDA têm participação fundamental nos efeitos de intoxicação
aguda do álcool em camundongos e sugerem que a subunidade NR2B tem papel
preponderante nestes efeitos, sendo que a subunidade NR2A parece não ter
participação nestes efeitos agudos do álcool.
Adicionalmente, Zhao et al. (2005) demonstraram que a subunidade NR2B
está envolvida na aquisição da memória contextual, desde que o seu bloqueio
prejudicou a aquisição do medo condicionado em camundongos e ratos.
Desta forma, os prejuízos da memória operacional produzidos pela
administração do etanol no CPFm poderia se dever a uma ação inibitória da ativação
dos canais iônicos dos receptores NMDA, particularmente daqueles que apresentam
a subunidade NR2B, cuja ativação é mais lenta, porém permite o maior influxo de
íons, principalmente nos dendritos e espinhas dendríticas das células piramidais das
camadas profundas corticais.
Por outro lado, como a inibição dos receptores NMDA pelo etanol é parcial, ou
incompleta, pois dependeria da presença da subunidade NR2B, os receptores
NMDA contendo a subunidade NR2A, os que apresentam ativação mais rápida,
permitindo um influxo rápido de íons, não seriam comprometidos pelo etanol. Desta
forma, como no CPF, a indução da LTP parece depender da ativação destas duas
subunidades, a inibição de NR2B e a manutenção da função de NR2A produziria um
desequilíbrio na função cortical, com conseqüente disfunção cognitiva, por exemplo,
da memória operacional.
Um antagonista de canal aberto, MK-801, porém em pequenas doses, que
produz uma melhora da atividade neuronal por si só, ou Memantina, teria ação em
todos os tipos de receptores NMDA, possivelmente re-equilibrando a ativação
100
glutamatérgica alterada pela ação do etanol, de forma a melhorar o desempenho da
memória operacional. Por outro lado, doses mais elevadas do antagonista de canal
aberto, especialmente do MK-801, as que se tem mostrado produzir prejuízos por si
só na função cognitiva, incluindo da memória operacional, não bloqueariam e
poderiam inclusive agravar os efeitos do etanol no CPFm.
A melhor compreensão do envolvimento das subunidades NR2A, e
principalmente NR2B, nos efeitos centrais do etanol dependerá dos avanços no
conhecimento das funções e mecanismos envolvidos na ativação destas
subunidades dos receptores NMDA.
Considere-se ainda que não é possível descartar o envolvimento de outros
mecanismos não NMDA e não glutamatérgicos na mediação dos efeitos do etanol
no CPFm, visto que a ação do etanol nos receptores NMDA, apesar de
comprovadamente relevante, é ainda, segundo alguns autores, parcial ou
incompleta.
5.5 Considerações Clínicas
5.5.1 Alcoolismo
O uso do álcool é considerado um problema de saúde pública em várias
partes do mundo. Estudos epidemiológicos realizados pelo Centro Brasileiro de
Informações sobre Drogas Psicotrópicas (CEBRID) sobre uso de drogas
psicotrópicas retratam a realidade brasileira sobre o consumo de álcool no Brasil,
apresentando dados preocupantes quanto ao início mais precoce de uso freqüente
e/ou uso pesado desta substância, bem como estima que já existam
aproximadamente 11,2% de brasileiros com síndrome de dependência do álcool
numa proporção de três homens para cada mulher (Carlini et al., 2001; Galduróz et
al., 2004).
O entendimento dos processos que envolvem o sistema de reforço e
gratificação do uso do álcool, bem como sinais e sintomas da síndrome de
101
abstinência, torna-se necessário para o desenvolvimento da farmacoterapia mais
adequada no tratamento desses indivíduos. Tanto os efeitos reforçadores, mediados
pelos mecanismos de sobreregulação dos receptores, quanto os sinais/sintomas
clínicos e experimentais presentes na crise de abstinência, devem ser melhor
compreendido, uma vez que reforçam o uso contínuo do álcool ou o aumento dos
índices de recaídas.
Sabe-se que o uso agudo ou crônico do álcool reflete em modificações
comportamentais e cognitivas. O uso prolongado pode levar à modificações
irreversíveis do sistema nervoso central, como por exemplo, numa parcela de
“bebedores pesados” que podem apresentar a síndrome de Wernicke-Korsakov em
que o dano cerebral é irreversível e o indivíduo apresenta alterações como
oftalmoplegia, ataxia, confusão mental, amnésia anterógrada, desorientação
temporo-espacial (Edwards et al., 1999)
Portanto, o presente estudo torna-se relevante e pode contribuir para os
estudos experimentais ou clínicos em terapia medicamentosa e/ou reabilitativa,
ampliando o conhecimento dos processos envolvidos nos prejuízos centrais
produzidos pelo álcool.
5.5.2 Efeitos cognitivos do álcool
O manual de diagnóstico e estatístico de transtornos mentais (DSM IV, 2002)
expõe que a presença de alterações cognitivas no paciente com síndrome de
dependência ao álcool, ou seja, no paciente alcoolista, é um importante critério de
avaliação de sua dependência.
Alterações nos processos atencionais, mnemônicos e de funções executivas
podem ser sintomas em pacientes que ingerem álcool. A integridade destas funções
cognitivas são essenciais para a manutenção da qualidade de vida do sujeito, bem
como sua interação nos contextos sociais/culturais, profissionais e familiares. Além
disso, mantém o indivíduo ativo, produtivo e inserido na sociedade.
Os experimentos realizados no presente estudo demonstraram que a menor
dose de MK-801 e a maior dose da memantina, no CPFm, numa área de associação
multimodal, bloquearam os efeitos de prejuízo do álcool no desempenho da memória
102
operacional no modelo do labirinto radial de oito braços. Este resultado confirma
então a participação dos receptores NMDA do CPFm na memória operacional,
fornecendo um suporte adicional na investigação do sistema glutamatérgico nas
funções cognitivas.
O efeito de bloqueio do prejuízo sobre a memória operacional espacial
evitando o processo de estabelecimento da dependência ao álcool estão
intimamente relacionadas, principalmente considerando o envolvimento do CPFm
em ambas condições. Desta forma, seria possível sugerir que o antagonismo de
receptores do tipo NMDA poderia ser de grande utilidade no tratamento da
dependência ao álcool. De fato, o consumo de álcool é responsável por disfunções
cognitivas de relevância clínica, uma vez que compromete as atividades diárias dos
indivíduos. Em nosso estudo, verificou-se que há potencialidade no emprego da
memantina no tratamento dos prejuízos da memória operacional produzido pelo
etanol.
Entretanto, é necessário que esta possível relação seja mais investigada em
estudos experimentais em animais, bem como em ensaios clínicos no homem.
103
6 CONCLUSÕES
104
• A dose de 100 µg de etanol (ETOH), administrada diretamente e bilateralmente
no córtex pré-frontal medial (intracortical) no presente estudo, produziu efeito de
prejuízo sobre a memória operacional espacial de longa duração em ratos que é
refletido pelo aumento de número de erros na execução da tarefa com retardo de
1 h no labirinto radial de 8 braços.
• Estes resultados demonstram o envolvimento do córtex pré-frontal medial nos
efeitos de prejuízo cognitivos produzidos pelo etanol.
• A menor dose de MK-801 IC (0,32 µg) bloqueou o efeito de prejuízo do ETOH
sobre a memória operacional espacial em ratos, desempenhando testes com
retardos de 1 h no labirinto radial de 8 braços.
•
A dose de 3,2 µg da memantina prejudicou significativamente a memória
operacional espacial de longa duração em ratos desempenhando tarefas com
retardos de 1 h no labirinto radial de 8 braços.
• No entanto, a administração prévia da dose de 10,0 µg da memantina, uma dose
que não havia apresentado efeito per se sobre o desempenho de tarefas com
retardos de 1 h no labirinto radial de 8 braços, bloqueou substancialmente o
efeito de prejuízo na memória operacional espacial produzido pelo etanol em
ratos.
• Os efeitos do MK-801 e Memantina, em doses específicas, administradas
bilateralmente no CPFm, corroboram a participação do sistema glutamatérgico,
mais precisamente dos receptores NMDA, do CPFm no processamento da
memória operacional espacial em ratos, e sugerem o envolvimento deste sistema
nos efeitos de prejuízo do etanol sobre esta função cognitiva.
• Adicionalmente, estes resultados sugerem que a memantina, sendo um
antagonista de receptores NMDA que apresentam algumas vantagens sobre o
MK-801, e, especialmente já sendo empregado clinicamente em várias
patologias, como sendo de potencial utilidade clínica no tratamento das
disfunções cognitivas produzidas pelo uso do etanol.
105
7 REFERÊNCIAS
106
Adams, R.D.; Victor, M.; Ropper, A.H. Principles of neurology. 6th ed. McGrawHill,
Inc: New York, USA, 1997.
Allgaier, C. Ethanol sensitivity of NMDA receptors. Neurochemistry Int, 41: 377-382,
2002.
Arnsten, A.F.T. Catecholamine modulation of prefrontal cortical cognitive function.
Trends Cognit Sci., 2: 436-447, 1998.
Artiges, E.; Salamé, P.; Recasens, C.; Poline, J-B.; Attar-Levy, D.; De la Raillère, A.;
Paillère-Martinot, M.L.; Danion, J-M.; Martinot, J-L. Working memory control in
patients with schizophrenia: a PET study during a random number generation task.
American Journal of Psychiatry, 157: 1517-1519, 2000.
Baddeley, A.D. Is working memory still working? American Psychologist, 56(11): 851-
864, 2001.
Baddeley, A.D. The episodic buffer: a new component of working memory? Trends in
Cognitive Science, 4: 417-423, 2000.
Baddeley, A.D. Working Memory. In: Gazzaniga, M.S. (ed): The Cognitive
Neurosciences, New York: Bradford, 1997, p 755-764.
Baddeley, A.D. Working Memory. Phil. Trans. R. Soc. Lond, 302: 311-324, 1983.
Baddeley, A.D. Working memory: looking back and looking forward. Nature Reviews
Neuroscience, 4: 829-839, 2003
Baddeley, A.D.; Logie, R. Working memory: the multiple-component model. In:
Miyake, A.; Shah, P. Models of working memory: mechanisms of active maintenance
and executive control. Cambridge University Press: Cambridge, 1999.
Barbas, H. Proceedings of the human cerebral cortex: from gene to structure and
function. Brain Research Bulletin, 52: 319-330, 2000.
107
Barnes, C.A., Danysz, W., Parsons, C.G. Effects of the uncompetitive NMDA
receptor antagonist memantine on hippocampal long-term potentiation, short-term
exploratory modulation and spatial memory in awake, freely moving rats. Eur. J.
Neurosci, 8: 565-571, 1996.
Bashir, Z.I.; Berreta, N.; Bortolotto, Z.A.; Clark, K.; Davies, C.H.; Frenguelli, B.G.;
Harvey, J.; Potier, B.; Collingridge, G.L. NMDA receptors and long-term potentiation
in the hippocampus. In: Collingridge, G.L.; Watkins, J.C. The NMDA receptor. 2nd
ed. Oxford University Press, 1994.
Bazzarella, S.M. Participação dos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA na
memória operacional espacial e nos efeitos agudos do álcool no córtex pré-frontal
medial. 2004. Dissertação (Mestrado em Ciências Fisiológicas) – Programa de Pós
Graduação em Ciências Fisiológicas, Universidade Federal do Espírito Santo,
Vitória, 2004.
Bear, M.F.; Connors, B.W.; Paradiso, M.A. Neurociências: desvendando o sistema
nervoso. 2. ed. Porto Alegre: Artmed, 2002.
Berger, B.; Thierry, A.M.; Tassin, J.P.; Moyne, M.A. Dopaminergic innervation of the
rat prefrontal cortex: a flurescence histochemical study. Brain Research, 106: 133-
145, 1976.
Birrel, J.M.; Brown, V.J. Medial frontal cortex mediates perceptual attentional set
shifting in the rat. Journal of Neuroscience, 20: 4320-4324, 2000.
Boyce-Rustay, J.M.; Holmes, A. Functional roles of NMDA receptor NR2A and NR2B
subunits in the acute intoxicating effects of ethanol in mice. Synapse, 56: 222-225,
2005.
Brown, V.; Bowman, E.M. Rodents model of prefrontal cortical functions. Trends in
Neurosciences, 25: 340-343, 2002.
108
Carlini EA; Galduróz JCF; Noto AR; Nappo SA. I Levantamento Domiciliar sobre o
Uso de Drogas no Brasil – 2001. Centro Brasileiro de Informações sobre Drogas
Psicotrópicas – Departamento de Psicobiologia da Escola Paulista de Medicina e
SENAD – Secretaria Nacional Antidrogas, Presidência da República, Gabinete de
Segurança Nacional, 2001.
Carr, D.B.; O’Donnell, P.; Card, J.P.; Sesach, S.R. Dopamine terminal in the
prefrontal cortex synapse on pyramidal cells that project nucleus accumbens. J.
Neuroscience, 19: 11049-11069, 1999.
Carr, D.B.; Sesack. S.R. Hippocampal afferents to the rat prefrontal cortex: synaptic
target and relation to dopamine terminals. Journal of neurology, 369: 1-15, 1996.
Carter, A.J. Antagonists of the NMDA receptor-channel complex and motor
coordination. Life Sci, 57: 917-929, 1995.
Castner, S.A.; Williams, G.V. Tuning the engine of cognition: A focus on NMDA/D1
receptor interactions in prefrontal córtex. Brain and Cognition, 63: 94-122, 2007.
Chen, H.S.V., Wang, Y.F., Rayudu, P.V. Neuroprotective concentrations of the N-
methyl-D-aspartate open-channel blocker memantine are effective without
cytoplasmic vacuolation following post-ischemic administration and do not block
maze learning or long-term potentiation. Neuroscience, 86: 1121-1132, 1998.
Collingridge, G.L., Singer, W. Excitatory amino acid receptors and synaptic plasticity.
Trends Pharmacol. Sci, 11: 290-296, 1990.
Condé, F.; Maire-Leproive, E.; Audinat, E.; Crépel, F. Afferent connections of the
medial frontal córtex of the rat: Cortical and subcortical afferent. The Journal of
Comparative Neurololgy, 352: 567-593, 1995.
Condé, F.; Maire-Leproive, E.; Audinat, E.; Crépel, F. Afferent connections of the
medial frontal córtex of the rat: Cortical and subcortical afferent. The Journal of
Comparative Neurololgy, 352: 567-593, 1995.
109
Constantinidis, C.; Williams, G.V.; Goldman-Rakic, P.S. A role for inhibition in
shaping the temporal flow of information in prefrontal cortex. Nat Neuroscienc, 5:
175-180, 2002.
Conti, F.; Barbaresi, P.; Melone, M.; Ducate A. Neuronal and glial localization if NR1
and NR2A/B subunits of NMDA receptors in the human cerebral cortex. Cerebral
Cortex, 9: 110-120, 1999.
Cooper, J.R.; Bloom, F.E.; Roth, R,H. The biochemical basis of neuropharmacology.
8th ed. Oxford Inc.: New York, 2003.
Courtney, S.M.; Petit, L.; Haxby, J.V.; Ungerleider, L.G. The role of prefrontal cortex
in working memory: examining the contents of consciousness. Philosophical
Transactions of the Royal Society of London, 353: 1819-1828, 1998.
Cummings, J.L. Frontal subcortical circuits and human behaviour. Archives of
Neurology, 50: 873-80, 1993.
Curtis, C.E.; D’Esposito, M. Persistent activity in the prefrontal cortex during working
memory. Trends in Cognitive Sciences, 7(9): 415-423, 2003.
Dalley, J.W.; Cardinal, R.N.; Robbins, T. Prefrontal executive and cognitive functions
in rodents: neural and neurochemical substrates. Neuroscience and Biobehavioral
Reviews, 28: 771-784, 2004.
Danysz, W.; Parsons, C.G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors:
physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological
Review, 50: 597-664, 1998.
Danysz, W.; Parsons, C.G.; Möbius, H.J.; Stöffler, A., Quack, G. Neuroprotective and
symptomatological action of memantine relevant for Alzheimer’s disease – an unified
glutamatergic hypothesis on the mechanism of action. Neurotox. Res, 2: 85-97,
2000.
110
Danysz, W.; Zajaczkowaki, W.; Parsons, C.G. Modulation of learning processes by
ionotropic glutamate receptor ligands. Behav Pharmacol, 6: 455-474, 1995.
Delatour, B.; Gisquet-Verrier, P. Lesions of the prelimbic-infralimbic cortices in rats
do not disrupt response selection processes but induce delay-dependent deficits:
evidence for a role in working memory? Behavioral Neuroscience, 113: 941-995,
1999.
Diana, M.; Gessa, G.L.; Rossetti, Z.L.; Lack of tolerance to thanol-induced
stimulation of dopamine mesolimbic system. Alcohol Alcohol 4(2): 329-333, 1992.
Dias, R.; Honey, R.C. Involvement of the rat medial prefrontal cortex in novelty
detection. Behavioral Neuroscience, 116: 498-503, 2002.
Dickenson, A.H. Amino acids: Excitatory. In: Webster, R.A. Neurotransmitter, drugs
and brain function. John Willey & Sons Ltd: Londres, Inglaterra, 2001.
Dimpfel, W. Effects of memantine on synaptic transmission in the hippocampus in
vitro. Arzneim. Forsch. Drug Res, 45: 1-5, 1995.
Dingledine, R.; Borges, K.; Bowie, D.; Traynelis, S.F. The glutamate receptor ion
channels. Pharmacological Review, 51: 1-61, 1999.
DSM IV TR Manual diagnóstico e estatístico de transtornos mentais. Trad. Cláudia
Dornelles. 4. ed. rev. Porto Alegre: Artmed, 2002.
Edwards G; Marshall E.J.; Cook C.C.H. O Tratamento do Alcoolismo. Porto Alegre:
Artmed, 1999.
Engblom C.; Courtney, M.J.; Kukkonen,J.P; Akerman, K.E.O. Ethanol Specifically
Inhibits NMDA Receptors with Affinity for Ifenprodil in the Low Micromolar Range in
Cultured Cerebellar Granule Cells. J. Neurochem, 69: 2162-2168, 1997.
111
Erdõ, S.L., Schäfer, M. Memantine is highly potent in protecting cortical cultures
against excitotoxic cell death evoked by glutamate and N-methyl-D-aspartate. Eur. J.
Pharmacol, 198: 215-217, 1991.
Erreger, K.; Dravid, S.M.; Banke, T.G.; Wyllie, D.J.A.; Traynelis, S.F. Subunit-specific
gating controls rat NR1/NR2A and NR1/NR2B NMDA channel kinetics and synaptic
signaling profiles. J. Physiol, 563(2): 345-358, 2005.
Floresco, S.B.; Phillips, A.G. Delay-dependent modulation of memory retrieval by
infusion of a dopamine D
1
agonist into the rat medial prefrontal cortex. Behavioral
Neuroscience, 115: 934-939, 2001.
Focchi G.R.A.; Leite M.C.; Laranjeira R.; Andrade A.G. Dependência Química: Novos
Modelos de Tratamento. São Paulo: Roca, 2001.
Fröhlich, R., Patzelt, C., Illes, P. Inhibition by ethanol of excitatory amino acid
receptors and nicotinic acetylcholine receptors at rat locus coeruleus neurons. Arch.
Pharmacol, 350: 626-631, 1994.
Fuster JM. Network Memory. Trends Neurosci, 20(10): 451-9, 1997.
Fuster, J.M. Cross - modal and cross-temporal association in neurons of frontal
cortex. Nature, 405: 347-351, 2000a.
Fuster, J.M. Executive frontal functions. Experimental Brain Research, 133: 66-70,
2000b.
Fuster, J.M. Frontal lobe and cognitive development. Journal of Neurocytology, 31:
373-385, 2002.
Fuster, J.M. Synopsis of function and dysfunction of the frontal lobe (Schizophrenia:
clinical signs and cognitive dysfunction). Acta Psychiatrica Scandinavica, 99: 51-57,
1999.
112
Fuster, J.M. The prefrontal cortex – an update: time is of the essence. Neuron, 30:
319-333, 2001.
Fuster, J.M. The prefrontal cortex and its relation to behavior. Progress in Brain
Research, 87: 201-211, 1991.
Gagliardo, A.; Mazzotto, M.; Divac, I. Memory of radial maze behavior in pigeons
after ablations of the presumed equivalent of mammalian prefrontal córtex.
Behavioral Neuroscience, 111: 955-962, 1997.
Galduróz, J.C.F.; Noto, A.R.; Fonseca, A.M.; Carlini E.A. V Levantamento nacional
sobre o consumo de drogas psicotrópicas entre estudantes do ensino fundamental e
médio da rede pública de ensino nas 27 capitais brasileiras. Centro Brasileiro de
Informações sobre Drogas Psicotrópicas – Departamento de Psicobiologia da Escola
Paulista de Medicina e SENAD – Secretaria Nacional Antidrogas, Presidência da
República, Gabinete de Segurança Nacional; 2004.
Galvão, Márcio. Envolvimento do sistema dopaminérgico pré-frontal nos efeitos do
álcool sobre a memória operacional espacial. 2005. Dissertação (Mestrado em
Ciências Fisiológicas) – Programa de Pós Graduação em Ciências Fisiológicas,
Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, 2005.
Goldman-Rakic, P.S. Regional and cellular fractioning of working memory. Proc Natl
Acad Sci USA, 93: 13473-13480, 1996.
Goldman-Rakic, P.S. Working Memory and the Mind. Scientific American, 276(3):
110-117, 1992.
Goldman-Rakic, P.S.; Muly, E.C.; Williams, G.V. D
1
receptors in prefrontal cells and
circuits. Brain Research Reviews, 31: 295-301, 2000.
Greengard, P. The neurobiology of slow synaptic transmission. Neuroscience, 294:
1024-1030, 2001.
113
Groenewegen, H.J. Organization of the afferent connections of the mediodorsal
thalamic nucleus in the rat, related to mediodorsal-prefrontal topography.
Neuroscience, 24: 379-431, 1988.
Groenewegen, H.J.; Wright, C.L.; Uylings, H.B.M. The anatomical relationships of the
prefrontal cortex with limbic structures and the basal ganglia. Journal of
Psychopharmacology, 11: 99-106, 1997.
Gu, Q. Neuromodulatory transmitter systems in the cortex and their role in cortical
plasticity. Neuroscience, 111: 815-835, 2002.
Hoffman, P.L.; Rabe, C.S.; Moses, F.; Tabakoff, B. N-Methyld-aspartate receptors
and ethanol: inhibition of calcium flux and cyclic GMP production. J. Neurochem, 52:
1937-1940, 1989.
Hölter, S.M.; Danysz W.; Spanagel, R. Evidence for alcohol anti-craving propreties of
memantine. European Journal Pharmacoloy, 1996.
Izquierdo I.; Izquierdo L.A.; Barros, D.M.; Melo e Souza, T.; Souza, M.M.; Quevedo,
J.; Rodrigues, C.; Sant’Anna, M.K.; Madruga, M.; Medina, J.H. Differential
involvement of cortical receptor mechanisms in working, shot-term and long-term
memory. Behav Pharmacol, 9(5-6): 421-427, 1998.
Jackson, M.E.; Homayoun, H.; Moghaddam, B. NMDA receptor hypofunction
produces concomitant firing rate potentiation and burst activity reduction in the
prefrontal cortex. Proceedings of the national academy of Sciences of USA, 101(22):
8467-8472, 2004.
Kalivas, P.W.; Romanides, A.J.; Duffy P. Glutamatergic and dopaminergic afferents
to the prefrontal cortex regulate spatial working memory in rats. Neuroscience, 92:
97-106, 1999.
Kandel, E.R.; Schwartz, J.H.; Jessel, T.M. Princípios da neurociência. 4. ed. São
Paulo: Manole, 2003.
114
Kemp, J.A.; Mckernan, R.M. NMDA receptor pathways as drugs targets. Nature, 5:
1039-1042, 2002.
Kesner, R.P. Subregional analysis of mnemonic functions of the prefrontal cortex in
the rat. Psychobiology, 28: 219-228, 2000.
Kolb, B. Functions of the frontal cortex of the rat: A comparative review. Brain
Research Reviews, 8: 65-98, 1984.
Kotlinska, J. NMDA antagonists inhibit the development of ethanol dependence in
rats. J. Pharmacol, 53: 47-50, 2001.
Kuner, T., Schoepfer, R., Korpi, E.R. Ethanol inhibits glutamateinduced currents in
heteromeric NMDA receptor subtypes. Neuroreport, 5: 297-300, 1993.
Li H.; Matsumoto, K.; Yamamoto, M.; Watanabe, H. NMDA but not AMPA receptor
antagonists impair the deley-interposed radial maze performance of rats.
Pharmacology Biochemistry Behavior, 58: 1, 249-253, 1997.
Lipton, S.A. Prospects for clinically tolerated NMDA antagonists: open channel
blockers and alternative redox states of nitric oxide. Trends Neurosci, 16: 527-532,
1993.
Lissek, S.; Güntürkün, O. Maintenance in working memory or response selection?
Functions of NMDA receptors in the pigeon prefrontal cortex. Behavioural Brain
Research, 1-10, 2004.
Liu Y., Zhang, J. Recent development in NMDA receptors. Chinese Medical Journal,
113: 948-956, 2000.
Lovinger, D.M. 5-HT3 receptors and the neural actions of alcohols: an increasingly
exciting topic. Neurochem Int, 35(2): 125-30, 1999.
115
Lukoyanov, N.V.; Paula-Barbosa, M.M. Memantine, but not dizocilpine, amiliorates
cognitive deficts in adult rat whithdraw from chronic ingestion of alcohol.
Neuroscience Letters, 309: 45-48, 2001.
Luria, A. R. Fundamentos da neuropsicologia. São Paulo: Editora da USP, 1981.
MacDonald, J.F., Bartlett, M.C., Mody, I., Pahapill, P., Reynolds, J.N,, Salter, M.W.,
Schneiderman, J.H.; Pennefather, P.S. Actions of ketamine, phencyclidine and MK-
801 on NMDA receptor currents in cultured mouse hippocampal neurons. J Physiol,
432: 483-508, 1991.
Machado, A. Neuroanatomia Funcional. 2. ed. São Paulo: Editora Atheneu, 1998.
Maldve, R.E.; Zhang, T.A.; Ferrani-Kile, K.; Schreiber, S.S.; Lippman, M.J.; Snyder,
G.L.; Fienberg, A.A.; Leslie, S.W.; Gonzales, R.A.; Morrisett, R.A. DARPP-32 and
regulation of the ethanol sensivity of NMDA receptors in the nucleus accumbens.
Nature Neuroscience, 5: 641-648, 2002.
Maler, J.M; Esselmann, H.; Wiltfang, J.; Kuns, N.; Lewczuk, P.; Reulbach, U.; Cleich,
S.; Rüther, E.; Kornhuber, J. Memantine inhibitis ethanol-induced NMDA receptor up-
rgulation in rat hippocampal neurons. Brain Research, 1052: 156-162, 2005.
Mandillo, S.; Rinaldi, A.; Oliverio, A.; Mele, A. Repeated administration of
phencyclidine, amphetamine and MK-801 selectively impairs spatial learning in mice:
a possible model of psychotomometic drug-induced cognitive deficits. Behavioural
Pharmacology, 14: 533-544, 2003.
Masood, K., Wu, C., Brauneis, U., Weight, F.F. Differential ethanol sensitivity of
recombinant N-methyl-d-aspartate receptor subunits. Mol. Pharmacol, 45: 324-329,
1994.
Melo, L.C.S.; Cruz, A.P.; Valentim Jr, S.J.R; Marinho, A.R.; Mendonça, J.B.;
Nakamura-Palacios, E.M. ∆
9
-THC administered into the medial prefrontal cortex
disrupts the spatial working memory. Psychopharmacology, 183(1): 54-64, 2005.
116
Mirshahi, T., Woodward, J.J. Ethanol sensitivtiy of heteromeric NMDA receptors:
effects of subunit assembly, glycine and NMDAR1 Mg
2+
insensitive mutants.
Neuropharmacology, 34: 347-355, 1995.
Misztal, M.; Frankiewicz, T.; Parsons, C.G.; Danysz, W. Learning deficits induced by
chronic intraventricular infusion of quinolinic acid – protection by MK-801 and
memantine. Eur. J. Pharmacol, 296: 1-8, 1996.
Miyake, A.; Shah, P. Models of working memory: mechanisms of active maintenance
and executive control. Cambridge: Cambridge University Press, 1999.
Mondadori, C., Weiskrantz, L., Buerki, H., Petschke, F., Fagg, G.E. NMDA receptor
antagonists can enhance or impair learning performance in animals. Exp. Brain Res,
75: 449-456, 1989.
Nagy, J.; Kolok, S.; Dezso, P.; Boros, A.; Szombathelyi, Z. Differential alterations in
the expression of NMDA receptor subunits following chronic ethanol treatment in
primary cultures of rat cortical and hippocampal neurons. Neurochemistry Int, 42: 35-
43, 2003.
Nakamura-Palacios, E.M.; Caldas, C.K.; Fiorini, A.; Chagas, K.D.; Chagas, K.N.;
Vasquez, E.C. Deficit of spatial learning and working memory in spontaneously
hypertensive rat. Behavioral Brain Reasearch, 74: 217-221, 1996.
Nakamura-Palacios, E.M.; Roelke, C.E. Effects of acute or daily administration of
diazepan on spatial learning and working memory. Drug Alcohol Depend, 46: 181-
190, 1997.
Nieber, K., Poelchen, W., Sieler, D., Illes, P. Inhibition by ethanol of excitatory amino
acid receptors in rat locus coeruleus neurons in vitro. Arch. Pharmacol, 357: 299-
308, 1998.
117
Nishijima, K., Kashima, A. Nishikama, T. Preferential stimulation of extracellular
release of dopamine in rat frontal córtex to striatum following competitive inhibition of
the N-methyl-D-Aspartate receptor. J. Neurochemistry, 63: 375-378, 1994.
Nolte, J. Human Brain and introduction to its functional anatomic. St Lois, Missori:
Mosby Year Book, 1993.
Oliveira, M.G.M.; Kireeff, W.; Hashizume, L.K.; Bueno, O. F. A.; Masur, J. Ethanol
decreases choice accurancy in a radial maze delayed test. Brazilian Journal of Medical
and Biological Research, 23:547-553, 1990.
Oliveira, R.W.D; Nakamura-Palacios, E.M. Haloperidol increases the disruptive effect
of alcohol on spatial working memory in rats: a dopaminergic modulation in the
medial prefrontal cortex. Psychopharmacology, 170: 51-61, 2003.
Olton, D.S. Mazes, maps and memory. American Psychologist, 34(7): 583-596, 1979.
Olton, D.S.; Collinson, C.; Werz, M.A. Spatial memory and radial arm maze
performance of rats. Learning and Motivation, 8: 289-314, 1977.
Olton, D.S.; Samuelson, R.J. Relembrance of places passed: special memory in rats.
Journal of Experimental Physiology: Animal Behavior Process, 2: 97-116, 1976.
Osborne, N.N., Quack, G. Memantine stimulates inositol phosphates production in
neurones and nullifies N-methyl-D-aspartate-induced destruction of retinal neurones.
Neurochem. Int, 21: 329-336, 1992.
Parsons, C.G., Danysz, W., Bartmann, A. Amino-alkylcyclohexanes are novel
uncompetitive NMDA receptor antagonists with strong voltage-dependency and fast
blocking kinetics: in vitro and in vivo characterization. Neuropharmacology, 38: 85-
108, 1999b.
118
Parsons, C.G.; Danysz, W.; Quack G. Memantine is a clinically well tolerated N-
methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist – a review of preclinical data.
Neuropharmacology, 38: 735-767, 1999.
Parsons, C.G.; Gruner R.; Rozental, J.; Millarm, J.; Lodge, D. Patch clamp studies on
the kinetics and selectivity of N-methyl-D-aspartate receptor antagonism by
memantine (1-amino-3,5-dimethyladamantan). Neuropharmacology, 32: 1337-1350,
1993.
Paxinos, G.; Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordenates. New York: Academic
Press, 1986, p. 194.
Peeters, M.; Maloteaux, J-M.; Hermans, E. Distinct effects os amantadine and
memantine on dopaminergic transmission in the rat striatum. Neuroscience Letters,
343: 205-209, 2003.
Phillips, A.G.; Ahn, S.; Floresco, S.B. Magnitude of dopamine release in medial
prefrontal cortex predicts accuracy of memory on a delayed response task. J
Neurosci., 24(2): 547-53, 2004.
Piasecki, J.; Koros, E.; Dyr, W.; Kostowski, W.; Danysz, W.; Bienkowski, P. Ethanol-
reinforced behaviour in the rat: effects of uncompetitive NMDA receptor antagonist,
memantine. Eur J. Pharmacol, 354: 135-143, 1998.
Pirot, S; Glowinski, J.; Thierry, A-M. Excitatory responses evoked in prefrontal by
mediodorsal thalamic nucleus stimulation: influence of anaesthesia. Eur J.
Pharmacol, 285: 45-54, 1995.
Preuss, T.M. Do rats a prefrontal cortex? The Rose-Woolsey-Akert program
reconsidered. Journal of Cognitive Neuroscience, 7: 1-24, 1995.
Ray, J.P.; Fuller, F.T.; Price, J.L. Sources of presumptive glutamatergic / aspartategic
afferents to the mediodorsal nucleus of the thalamus in the rat. J. Comp. Neurol.,
320: 435-456, 1992.
119
Robbins, T.W. Chemical neuromodulation of frontal-executive functions in humans
and other animals. Experimental Brain Research, 133: 130-138, 2000.
Rose, J.E.; Woolsey, C.N. The orbitofrontal cortex and its connections with the
mediodorsal nucleus in rabbits, sheep and cat. Research Public Associaton for
Research in Nervous and Mental Disorders, 27: 210-232, 1948.
Seamans, J.K.; Florezco, S.B.; Phillips, A.G. D
1
receptor modulation of hippocampal-
prefrontal cortical circuits integrating spatial memory with executive functions in the
rat. The Journal of Neuroscience, 18(4): 1613-1621, 1998.
Seamans, J.K.; Yang, C.R. The principal features and mechanisms of dopamine
modulation in the prefrontal cortex. Prog Neurobiol, 74:1–58, 2004.
Shimamura, A.P. Memory and frontal lobe function. In: Gazzaniga, M.S. The
Cognitive neurosciences, New York: Bradford, 803-813, 1997.
Smith, E.; Jonides, J.; Koeppe, R.A. Dissociating verbal and spatial working memory
using PET. Cerebral Cortex, 6: 11-20, 1996.
Spanagel, R., Zieglgänsberger, W. Anti-craving compounds for ethanol: new
pharmacological tools to study addictive processes. Trends Pharmacol, 18: 54-59,
1997.
Spanagel, R.; Eilbacher, B.; Wilke, R. Memantine-induced dopamine release in the
prefrontal cortex and striatum of the rat – a pharmacokinetic microdialysis study. Eur
J. Pharmacol, 262: 21-26, 1994.
Steketee, J.D. Neurotransmitter systems of the medial prefrontal cortex: potential role
in sensitization to psychostimulants. Brain Research Reviews, 41: 203-228, 2003.
Tekin, S.; Cummings, J.L. Frontal-subcortical neuronal circuits and clinical
neuropsychiatry. An update. Journal of Psychosomatic Research, 53: 647-654, 2002.
120
Thierry, A.M., Godbout, R.; Mantz, J.; Glowiski, J. Influence of the ascending
monoaminergic systems on the activity of the rat prefrontal cortex. In: Uylings,
H.B.M., Van Eden, C.G., De Bruin, J.P.C., Corner, M.A., Frenta, M.P.G. The
prefrontal cortex: its structure, function and pathology. Progress in brain research,
v.85. Amsterdam: Elsevier, 1990, p. 357-365.
Tu, Y.; Kroener, S.; Abernathy, K.; Lapish, C.; Seamans, J.; Chandler, J.L.;
Woodward, J.J. Ethanol Inhibits Persistent Activity in Prefrontal Cortical Neurons The
Journal of Neuroscience, 27(17): 4765-4775, 2007.
Tzschentke, T.M. Pharmacology and behavioral pharmacology of the mesocortical
dopamine system. Progress in Neurobiology, 63: 241-320, 2001.
Tzschentke, T.M. The medial prefrontal cortex as a part of the brain reward system.
Amino Acids, 19: 211-219, 2000.
UFES, Biblioteca Central. Normalização e apresentação de trabalhos científicos e
acadêmicos: guia para alunos, professores e pesquisadores da UFES. 6. ed. Vitória:
A Biblioteca, 2002.
Uylings, H.B.M., Groenewegen, H.J. Kolb, B. Do rats have a prefrontal cortex?
Behavioral Brain Research, 146: 3-7, 2003.
Uylings, H.B.M., Van Eden, C.G. Qualitative and quantitative comparison of the
prefrontal cortex in rats and in primates, including humans. In: Uylings, H.B.M., Van
Eden, C.G., De Bruin, J.P.C., Corner, M.A., Frenta, M.P.G. The prefrontal cortex: its
structure, function and pathology. Progress in brain research, vol. 85. Amsterdam:
Elsevier, p. 31-62, 1990.
Valentim Jr, Saavedra José Rios. Modulação dopaminérgica da memória
operacional espacial no córtex pré-frontal medial em ratos: envolvimento de
receptores dos tipos D
1
e D
4
. 2003. Dissertação (Mestrado em Ciências Fisiológicas)
– Programa de Pós Graduação em Ciências Fisiológicas, Universidade Federal do
Espírito Santo, Vitória, 2003.
121
Vertes, R.P. Analysis of projections from the medial prefrontal cortex to the thalamus
in the rat, with emphasis on nucleus reunions. The Journal of Comparative
Neurology, 442:163-187, 2002.
Ward, l. Mason, S.E.; Abraham, W.C. Effects of the NMDA antagonists CPP and MK-
801 on radial arm maze performance in rats. Pharmacology Biochemistry and
Behavior, 35: 785-790, 1990.
Watkins, J.C. The NMDA receptor concept: origins and development. In: Collingridge,
G.L.; Watkins, J.C. The NMDA receptor. 2nd ed. Oxford University Press, 1994.
Weller, M.; Finielsmarlier, F.; Paul, S.M. NMDA receptormediated glutamate toxicity
of cultured cerebellar, cortical and mesencephalic neurons: neuroprotective
properties of amantadine and memantine. Brain Res, 613: 143-148, 1993.
Woodward, J.J. Ethanol and NMDA receptor signaling. Critical Reviews in
Neurobioloy, 14(1): 69-89, 2000.
Zahrt, J.; Taylor, J.R.; Mathew, R.G.; Arnsten, A.F.T. Supranormal stimulation of D1
dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory
performance. J Neurosci., 17:8528-8535, 1997.
Zajaczkowaki, W.; Quack G.; Danysz, W. Infusion of (+)MK-801 and memantine –
contrasting effects on radial maze learning in rats with entorhinal cortex lesion. Eur J.
Pharmacol, 296: 239-246, 1996.
Zaleski, M, Morato, G., S.; Silva, V.A.; Lemos, T. Aspectos neurofarmacológicos do
uso crônico e da Síndrome de Abstinência do Álcool. Rev Bras Psiquiatr, 26: 40-42,
2004.
Zhao, M.G.; Toyoda, H. Lee,Y.S.; Wu,L.J.; Ko, S.W.; Zhang, X.H.; Jia, Y.; Shum, F.;
Xu, H.; Li, B.M.; Kaang, B.K.; Zhuo, M. Roles of NMDA NR2B subtype receptor in
prefrontal long-term potentiation and contextual fear memory. Neuron, 47: 859-872,
2005.
122
Zilles, K.; Wree, A. Cortex: Area and laminar structure. In: Paxinos: The rat nervous
system. Forebrain and midbrain. San Diego, California: Academic Press, Inc., 374-
415, 1985.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo