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DANIEL MANZONI DE ALMEIDA
ESTUDO DO POTENCIAL NEUTRALIZANTE DO SORO ANTI-
ESFINGOMIELINASES D RECOMBINANTES, SOBRE AS AÇÕES
TÓXICAS DOS VENENOS DAS ARANHAS LOXOSCELES
São Paulo
2007
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Imunologia do
Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade de São Paulo, para
obtenção do Título de Mestre em
Ciências Biológicas (ênfase em
Imunologia).
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5
DANIEL MANZONI DE ALMEIDA
ESTUDO DO POTENCIAL NEUTRALIZANTE DO SORO ANTI-
ESFINGOMIELINASES D RECOMBINANTES, SOBRE AS AÇÕES
TÓXICAS DOS VENENOS DAS ARANHAS LOXOSCELES
São Paulo
2007
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
-
Graduação em Imunologia do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade de São
Paulo, para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Biológicas.
Área de Concentração:
Imunologia
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6
ESTE TRABALHO FOI REALIZADO NO
LABORATÓRIO DE IMUNOQUÍMICA
DO INSTITUTO BUTANTAN
APOIO FINANCEIRO
FAPESP E CNPq
7
Aos meus pais, Iraídes e Marli e meu irmão, Vinícius, por todo amor e apoio
incondicional.
8
Ao Fabrício Freire de Mello, pelo apoio, dedicação e carinho.
À Gabriela Rosa pelo incentivo e amizade.
9
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Dra. Denise Vilarinho Tambourgi, pela oportunidade
de aprender ao seu lado, pela dedicação, pela formação profissional, pelos
ensinamentos sérios, éticos e encantadores da ciência que permanecerão comigo
por toda a minha carreira e pela amizade que levarei por toda a minha vida.
Aos meus pais, Iraídes e Marli e meu irmão, Vinícius, pelo amor, dedicação e
incentivo em todos os momentos; à Gabriela Rosa pelo carinho e amizade; ao
Fabrício Freire Melo pelo carinho, amizade, cumplicidade e companheirismo nesse
nosso ano de teses e estradas.
À Dra. Rute Maria Gonçalves de Andrade pelos ensinamentos, respeito e
dedicação e pela coleta, manutenção e extração dos venenos das aranhas
Loxosceles.
Aos pesquisadores do Laboratório de Imunoquímica: Aparecida Santo Pietro,
Fábio Carlos Magnoli, Jorge Mário da Costa Ferreira Jr., Mônica Spadafora
Ferreira, Rute Maria Gonçalves de Andrade, Osvaldo Augusto Esteves Brazil
Sant’Anna e Fernanda Calheta Vieira Portaro.
À equipe técnica do Laboratório de Imunoquímica pelo carinho que tiveram em todos
os momentos: Helena Maria Machado, Elaine Rodrigues, Maura Coração, Sílvia
Aparecida Camargo, Severino Ramos da Silva, João Batista Coelho, José
Cassiano Borba, Gisélia Belmira Pereira e Márcia Franco.
10
Aos atuais e ex-estudantes do Laboratório de Imunoquímica: Marta Ferreira
Bastos, Giselle Pidde Queiroz, Alessandra Veloso de Melo, Cássia Regina
Pichitelli, Gabriela Dicieri Tanaka, Isadora Maria Villas-Boas, Estevam José
Baldom, Mara Adriana Corrêa, Karina Scaramuzzi, Eliana Blini Marengo,
Luciana Vieira de Carvalho, Cinthya Kimori Okamoto, Lucas Ricardo Alves
Pessoa, Guilherme de Santi-Ferrara Ibañez, Rosana de Fátima Shoji, Patrícia de
Souza Santos, Matheus Fernandes-Pedrosa, Dra Danielle Paixão Cavalcante,
Dra Kátia Cristina de Oliveira Lima, Mara Sílvia Carvalhaes, Joacir de Oliveira,
Sônia Aparecida Andrade Chudzinski, Fernando Pretel, Matheus Ferracine e
Carlos Felgueiras. Muito obrigado!
À Dra. Hisako Gondo Higashi e Dr. José Roberto Marcelino da Divisão
Bioindustrial do Instituto Butantan pela importante colaboração ao desenvolvimento
desse trabalho.
À Profa. Dra. Sonia Jancar Negro e Profa. Dra. Ises de Almeida Abrahamson pela
supervisão e orientação junto ao Programa de Aperfeiçoamento de Ensino Superior.
E, também, à turma animada e dedicada do curso de Farmácia e Bioquímica (BMI-
165:2006) pela oportunidade de aprendermos juntos.
À Dra. Celidéia Copi Vaz, Dra. Mônica Valdercy Lopes-Ferreira e Dra. Sandra
Helena Poliselli Farsky pela participação na banca do exame de qualificação e
contribuição ao presente estudo.
Às secretárias da Pós-Graduação do Departamento de Imunologia do ICB/USP,
Jotelma Leite e Valéria, pelo apoio.
11
À equipe do Biotério Central do Instituto Butantan e a Regina de Luca do Biotério do
ICB/USP pelo suporte com os animais.
Aos amigos e amigas que fiz durante o período que estive no Instituto Butantan e ao
longo da pós-graduação. Levarei nossa amizade para todo o sempre: Danielle
Paixão Cavalcante, pela amizade singular que nem mesmo o Atlântico consegue
separar diariamente; Elaine Rodrigues, pela amizade carinhosa e fraterna que levo
comigo no coração; Ana Cláudia Rocha-Campos, pela amizade alegre e que
também o Atlântico não consegue separar; Eliana Blini Marengo, pela amizade
maravilhosa; Sônia Aparecida Andrade Chudzinski pelo apoio incondicional e por
acreditar nos meus sonhos; Andréa Monteiro, pela amizade sincera; Ana Paula
Azevedo, pela amizade determinada; Rogério Valois, pela amizade corajosa;
Alessandra Veloso, pela amizade alegre e dedicada; Estevam Baldon, pela
amizade sincera conquistada em pouco tempo; Lívia Melo, pela amizade leal e
carinhosa; Carlos Lescovar, pela amizade conselheira; Alessandra Commodoro,
pela amizade inspiradora; Ana Maria Rodrigues, pela amizade sensível.
Aos meus alunos Rosangela Madeiro, Fernanda Lima, Wesley de Almeida,
Francisco de Lima Filho, Luís Nunes da Silva, Alda Ximenez, Regiane Madeiro
e Michele Saboleski, pela confiança, parceria, amizade e contribuição à minha
formação profissional.
À FAPESP e ao CNPq pelo incentivo e apoio financeiro.
12
“Todo o nosso saber começa nos sentimentos”
(Leonardo da Vinci)
13
RESUMO
MANZONI-DE-ALMEIDA D. - Estudo do potencial neutralizante do soro anti-
Esfingomielinases D recombinantes, sobre os efeitos tóxicos dos venenos das
aranhas Loxosceles.
Os envenenamentos por aranhas do gênero Loxosceles (aranha-marrom), presente em
regiões temperadas e tropicais das Américas, África e Europa, podem causar não somente
dermonecrose, mas também sérios efeitos sistêmicos. Três diferentes espécies de Loxosceles são
consideradas de importância médica no Brasil (L. laeta, L. intermedia, L. gaucho) e mais de 3.000
casos de envenenamento são reportados todos os anos. A terapia usada para o loxocelismo, no
Brasil, é a administração do soro anti-Aracnídico, produzido pelo Instituto Butantan, pela imunização
de cavalos com os venenos de Tityus serrulatus, Phoneutria nigriventer e Loxosceles gaucho. O
principal componente tóxico apresenta atividade de esfingomielinase D (SMase D) e várias isoformas
dessa toxina estão presentes nos venenos de Loxosceles. Recentemente, foi produzido um novo soro
anti-loxoscélico, pelo Laboratório de Imunoquímica juntamente com a Divisão Bioindustrial do Instituto
Butantan, pela imunização de cavalos com as formas recombinantes das SMases D, i.e., duas
isoformas de L. intermedia (SMases P1 e P2) e uma de L. laeta (SMase I). O objetivo do presente
estudo foi comparar o potencial neutralizante do novo soro anti-SMases D e do soro anti-Aracnídico
contra os efeitos tóxicos dos venenos das aranhas do gênero Loxosceles, com importância médica
no Brasil. A análise comparativa dos dois soros, por “Western blot”, revelou que o anti-Aracnidico é
capaz de reconhecer a maioria dos componentes presentes nos venenos de L. intermedia, L. laeta e
L. gaucho. O anti-SMases D, em contraste, reconheceu somente os componentes de 30-35 kDa,
massa molecular correspondente à das isoformas nativas de SMases D existentes nos venenos de
Loxosceles. Por ELISA, foi mostrado que o soro anti-SMases D contém títulos superiores de IgGT,
IgGa, b e c do que o anti-Aracnídico. Os testes de soroneutralização (in vivo and in vitro) mostraram
que o soro anti-SMases D tem melhor atividade inibitória do que o anti-Aracnídico, sobre as
atividades tóxicas dos venenos de L. intermedia e L. laeta, como a dermonecrotica, hemolítica e
esfingomielinásica. Para o veneno de L. gaucho, os resultados foram similares ou, em alguns casos,
melhores usando o soro anti-Aracnídico. Em conjunto, os dados sugerem que, embora, o novo soro
anti-SMases D apresente um significante potencial neutralizante, é ainda necessária a inclusão, na
formulação de imunização, de uma isoforma de SMase D do veneno de L. gaucho, para a obtenção
de um antissoro capaz de neutralizar efetivamente os venenos das três principais espécies de
aranhas Loxosceles que causam acidentes no Brasil.
14
ABSTRACT
MANZONI-DE-ALMEIDA, D. Study of the neutralization potential of the anti-
recombinant Sphingomyelinases D serum, on the toxic effects of Loxosceles spider
venoms.
Envenomation by arachnids of the genus Loxosceles (brown spider), present in temperate and
tropical regions of the Americas, Africa and Europe, can lead not only to local dermonecrosis but also
to serious systemic effects. At least 3 different Loxosceles species of medical importance are known in
Brazil, L. laeta, L. intermedia and L. gaucho, and more than 3000 cases of envenomation are reported
each year. The used therapy for loxoscelism, in Brazil, is the administration of the anti-arachnidic
serum, produced by Butantan Institute, by the immunization of horses with the venoms from Tityus
serrulatus, Phoneutria nigriventer and Loxosceles gaucho. The main toxic component is endowed with
sphingomyelinase D (SMase D) activity and various isoforms of this toxin are present in Loxosceles
venoms. Recently, a new anti-loxoscelic serum was produced, by Immunochemistry Laboratory and
the Production Division of Butantan Institute, by horse immunization with the recombinant form of the
SMases D, i.e., two isoforms from L. intermedia (SMases P1 and P2) and one from L. laeta (SMase I).
The aim of this study was to compare the neutralization potentials of the new anti-SMases D and the
anti-arachnidic sera, against the toxic effects of venoms from spiders of the Loxosceles genus of
medical importance in Brazil. The comparative analysis of the two antisera, by Western blot, has
revealed that the anti-arachnidic serum is able to recognize the majority of the components present on
the venoms of L. intermedia, L. laeta e L. gaucho. The anti-SMases D, in contrast, has recognized
only components of 30-35 kDa, which corresponds to the Mr of the natives SMases D isoforms
present in the Loxosceles venoms. By ELISA, it has been determined that the anti-SMases D serum
contains higher titres of IgGT, IgGa, b and c than the anti-arachnidic serum. Serum neutralization tests
(in vivo and in vitro) have showed that the anti-SMases D serum has better inhibitory activity on the
toxic activities of the venoms from L. intermedia and L. laeta, such as shingomyelinasic, dermonecrotic
and haemolytic activites than the anti-arachnidic serum. For L. gaucho venom, the results have been
similar or, in some cases, better by using the anti-arachnidic serum. These data suggest that, although
the new anti-SMases D serum shows a significant neutralization potential, it is still necessary the
inclusion, in the immunization formulation, of a SMase D isoform from L. gaucho venom, in order to
obtain a fully neutralizing antiserum against the three main important Loxosceles spiders that cause
accidents in Brazil.
15
LISTA DE ABREVIATURAS
BCIP 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato.
BSA albumina bovina sérica
cm centrímetros
cm
2
centrímetros quadrados
CD59 “MIRL-mebrane inhibitor of reative lysis”
CR1 “Complement Receptor 1”
DAB “3,3 Diaminobenzidine tetrahydrochloride”
DAF “Decay accelerating factor”
ELISA “Enzyme-Liked Immunosorbent Assay”
FITC isotiocianato de fluoresceína
FPLC “Fast Perfomance Liquid Chromatography”
g grama
GPC glicoforina C
kDa quilodaltons
Kg quilograma
mA miliamper
MCP “Membrane Cofactor Protein”
µg micrograma
µl microlitro
mg miligrama
mM milimolar
µM micromolar
NBT azul de nitrotetrazólio
nm nanômetro
16
OPD ortofenil-diaminobenzidina
PBS solução salina tamponada
rpm rotações por minutos
SDS dodecilsulfato de sódio
SDS-PAGE gel de poliacrilamida – dodecilsulfato de sódio
SHN soro humano normal
SMase D Esfingomielinase D
TEMED N, N, N”, N” – Tetrametilenodiamina
VBS
2+
Tampão veronal com íons
17
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 4
1.1 A ARANHA MARROM: BIOLOGIA E OS PRINCIPAIS ASPECTOS
CLÍNICOS DO ENVENENAMENTO............................................................. 4
1.2 ESTUDOS BIOQUÍMICOS E IMUNOQUÍMICOS........................................... 9
1.3 OS EFEITOS LOCAIS DO ENVENENAMENTO.......................................... 12
1.4 OS EFEITOS SISTÊMICOS OU VISCERAIS DO ENVENENAMENTO....... 15
1.5 TRATAMENTO (I)......................................................................................... 19
1.6 TRATAMENTO (II) – SOROTERAPIA.......................................................... 21
2 OBJETIVO................................................................................................... 25
3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................ 26
3.1 ANIMAIS..................................................................................................... 26
3.1.1 ARANHAS .................................................................................................. 26
3.1.2 COELHOS.................................................................................................. 26
3.2 VENENOS .................................................................................................. 26
3.3 SOROS EQÜINOS HIPERIMUNES ........................................................... 27
3.3.1 SORO ANTI-ARACNÍDICO ........................................................................ 27
3.3.2 SORO ANTI-SMASES D ............................................................................ 27
3.3.3 SORO ANTI-BOTRÓPICO ......................................................................... 27
3.4 ANÁLISE DO RECONHECIMENTO DOS VENENOS PELOS SOROS
ANTI-ARACNÍDICO E ANTI-SMASES D DE LOXOSCELES..................... 28
3.4.1 DOSAGENS DE ANTICORPOS................................................................. 28
3.4.2 DETERMINAÇÃO DAS SUBCLASSES DE IgG PRESENTES NOS
SOROS ANTI-ARACNÍDICO E ANTI-SMASES D...................................... 29
3.4.3 ANÁLISES QUALITATIVAS DOS SOROS................................................. 29
3.5 ENSAIOS DE SORONEUTRALIZAÇÃO ................................................... 31
3.5.1 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DERMONECRÓTICA EM COELHOS 31
3.5.1.1 SORONEUTRALIZAÇÃO “IN-VIVO” ......................................................... 31
18
3.5.1.2 SORONEUTRALIZAÇÃO “IN VTRO - IN VIVO”........................................ 32
3.5.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE HEMOLÍTICA, DEPENDENTE DE
COMPLEMENTO, INDUZIDA PELOS VENENOS DE LOXOSCELES...... 32
3.5.2.1 SORO NORMAL HUMANO........................................................................ 32
3.5.2.2 ERITRÓCITOS HUMANOS........................................................................ 33
3.5.2.3 TRATAMENTOS DOS ERITRÓCITOS HUMANOS COM OS VENENOS DE
LOXOSCELES ........................................................................................... 33
3.5.2.4 ENSAIO HEMOLÍTICO .............................................................................. 33
3.5.2.5 SORONEUTRALIZAÇÃO DA CAPACIDADE DE INDUÇÃO DA REMOÇÃO
DE GLICOFORINA C DAS MEMBRANAS DE ERITRÓCITOS E DA
LIGAÇÃO DAS TOXINAS À SUPERFÍCIE DAS CÉLULAS....................... 34
3.5.3 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ESFINGOMIELINÁSICA DOS
VENENOS DE LOXOSCELES .............................................................. 35
3.5.3.1 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ESFINGOMIELINÁSICA
RESIDUAL DAS AMOSTRAS DOS VENENOS DE LOXOSCELES ......... 35
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................. 36
4 RESULTADOS........................................................................................... 37
4.1 ANÁLISE DO RECONHECIMENTO DOS VENENOS PELOS SOROS
ANTI-ARACNÍDICO E ANTI-SMASES D DE LOXOSCELES..................... 37
4.1.1 por Western Blot......................................................................................... 37
4.1.2 por ELISA – TÍTULOS DE ANTICORPOS ................................................. 39
4.2 DETERMINAÇÃO DOS TÍTULOS DAS SUBCLASSES DE IgG DOS
SOROS....................................................................................................... 41
4.3.1 DA ATIVIDADE DERMONECRÓTICA ....................................................... 42
4.3.3 DA ATIVIDADE HEMOLÍTICA.......................................................................45
4.3.4 DA ATIVIDADE ESFINGOMIELINÁSICA D ................................................. 49
5 DISCUSSÃO ................................................................................................ 52
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 63
4
4
1 INTRODUÇÃO
1.1 A ARANHA MARROM: BIOLOGIA E OS PRINCIPAIS ASPECTOS
CLÍNICOS DO ENVENENAMENTO
As aranhas estão classificadas no filo Arthropoda ordem Araneae, composta
por aproximadamente 38.800 espécies catalogadas. A maioria das aranhas é
peçonhenta (ANDERSON, 1982; RUSSEL, 1961) sendo característica nessas a
presença de glândulas de veneno associadas às quelíceras. No entanto, segundo a
Organização Mundial da Saúde, quatro gêneros são causadores de envenenamento
em humanos (Araneísmo): Latrodectus, Phoneutria, Loxosceles e Atrax e, no Brasil,
os três primeiros são de importância médica.
As aranhas do gênero Loxosceles, família Sicariidae, são conhecidas
popularmente como aranhas marrons. São pequenas, de coloração geralmente
marrom-avermelhada, possuem seis olhos dispostos em três díadas, pernas longas
e finas. São de hábito noturno, preferem locais secos e constroem teia
característica, de fios grosseiros e pegajosos (BUCHERL, 1969), podendo viver
entre três a sete anos (GONÇALVES-DE-ANDRADE et al., 1999). O acidente
humano, geralmente, ocorre por compressão da aranha contra o corpo.
As cem espécies descritas de Loxosceles apresentam ampla distribuição
sendo encontradas em regiões temperadas e tropicais da América do Norte, Central
e Sul e, também, na Europa e África (PLATNICK, 2005). Entre as espécies de
Loxosceles existentes, destacam-se as que têm importância médica devido à
incidência de acidentes a elas atribuídos, como é o caso, de Loxosceles spinuolosa
e Loxosceles parrami, espécies encontradas na África (NEWLANDS et al., 1982) e
Loxosceles reclusa, nos Estados Unidos (FUTRELL, 1992). No Brasil há dez dessas
5
5
espécies, sendo três de importância médica: Loxosceles gaucho, Loxosceles
intermedia, Loxosceles laeta, que são encontradas nas regiões Sudeste e Sul
(WASSERMAN et al., 1983; MINISTÉRIO DA SAÚDE, FUNDAÇÃO NACIONAL DA
SAÚDE, 1998); Loxosceles intermedia é responsável por mais de 2000 casos de
envenenamento na região Sudeste (FUNDAÇÃO NACIONAL DA SAÚDE, 1996).
As três espécies de Loxosceles de importância médica no Brasil diferem entre
si, principalmente, pela coloração, características das pernas, e o lado dorsal do
cefalotórax (FISCHER, 1994).
Na espécie Loxosceles intermedia (Figura 1), os machos possuem
cefalotórax com linhas cefálicas não nítidas, pedipalpos longos, apresentando o
último artículo ou tarso, saliente além da inserção do bulbo copulátório e estilete
sinuoso. As fêmeas possuem cefalotórax com linhas cefálicas não tão nítidas,
pedipalpo curto e simples, abdômen elíptico, na maioria das vezes superando o
tamanho do cefalotórax e com pêlos abundantes e coloração esverdeada
(FISCHER, 1994).
Em Loxosceles laeta (Figura 1), os machos apresentam cefalotórax pardo-
claro, com a região cefálica de tonalidade mais escura, formando uma figura
triangular e com margem posterior pontiaguda, devido às linhas cefálicas limitantes,
estrias na região cefálica bastante nítidas, pedipalpo longo e estilete pontiagudo. As
fêmeas diferem no cefalotórax com região cefálica de tonalidade parda-
avermelhada, formando uma figura pentagonal devido às linhas cefálicas limitantes,
com estrias longitudinais nítidas, pedipalpo fino e curto com as extremidades de
tonalidades mais escuras; o abdômen, visto ventralmente, tem aspecto liso e uma
região mais clara em forma de triângulo que vai desde a base até as fiandeiras
(FISCHER, 1994).
6
6
Na espécie Loxosceles gaucho (Figura 1), os machos possuem a região
torácica com uma impressão mais clara, formada por bandas, porção anterior do
cefalotórax formando na direção traseira um desenho em forma de “v”, apresentando
pedipalpo com os últimos artículos proporcionalmente curtos e estilete curvado. As
fêmeas apresentam região torácica com uma impressão mais clara formada por
bandas, porção anterior do cefalotórax formando para trás um desenho em forma de
“U” e pedipalpo com os últimos artículos proporcionalmente curtos e estilete curvado
(FISCHER, 1994).
7
7
♀ ♂
Figura 1: Aranhas Loxosceles de importância médica no Brasil. Fotos gentilmente cedidas
por Rogério Bertani e Giuseppe Puorto – Instituto Butantan.
L. intermedia
L. laeta
L. gaucho
8
8
Os acidentes causados por aranhas do gênero Loxosceles podem resultar em
manifestações severas, especialmente necrose na pele, evoluindo para distúrbios
hematológicos e renais, nas situações mais graves de envenenamento (FUTREL,
1992). A esse conjunto de sinais, associado a outros sintomas como febre, vômitos
e náuseas, dá-se o nome de Loxoscelismo.
O loxoscelismo foi primeiramente descrito nos Estados Unidos, em 1872
(CAVENESS, 1872), seguido de muitos outros casos identificados em países como
Chile, Peru, Argentina e Brasil. No Brasil, o primeiro caso reportado de acidente
necrótico cutâneo, causado por veneno de aranha, foi em 1891, mas somente em
1954 tais acidentes foram relacionados com a aranha Loxosceles.
A maior parte dos casos de loxoscelismo (entre 84
a 97%) caracteriza-se por
um quadro de necrose no local da picada, sendo este denominado forma cutânea;
entretanto, alguns casos (de 3 a 16%) podem evoluir para a forma sistêmica ou
visceral, na qual hemólise e coagulação intravascular podem ocorrer (Figura 2)
(FUTREL, 1992; BEY, 1997).
Na maioria dos estudos clínicos, foi registrado que os sintomas se iniciam
algumas horas após a picada e aumentam com 24-72 horas, momento em que os
pacientes procuram o atendimento médico. Os acidentados apresentam,
principalmente, dor no local da picada, edema com endurecimento, eritema,
equimose e isquemia, podendo ou não evoluir para necrose tecidual e úlcera. Nos
casos que evoluem para a forma sistêmica, os pacientes podem apresentar
hemólise, coagulação intravascular, trombocitopenia, hematúria, hemaglobinúria,
rabdomiólise, choque e falência renal aguda (FUTREL, 1992; PAULI et al., 2006).
Outros sintomas como náuseas, vômitos, diarréia, sudorese, prurido, astenia,
visão turva, febre, irritabilidade e distúrbios de consciência, foram observados em
9
9
aproximadamente 50% dos pacientes com loxoscelismo cutâneo e em grande parte
dos com loxoscelismo sistêmico (FUTREL, 1992; PAULI et al., 2006).
A B
Figura 2: (A) Loxoscelismo cutâneo: Lesão dermonecrótica caracterizada por edema,
inflamação e necrose. (B) Loxoscelismo sistêmico: detalhe da urina de paciente
com hemoglubinúria.
1.2 ESTUDOS BIOQUÍMICOS E IMUNOQUÍMICOS
A severidade dos acidentes por aranhas Loxosceles parece estar associada à
espécie, sexo, estágio de desenvolvimento da aranha, quantidade de veneno
inoculada e das características genéticas e nutricionais do indivíduo acidentado
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, FUNDAÇÃO NACIONAL DA SAÚDE, 1998; DE
OLIVEIRA et al., 1999; GONÇALVES-DE-ANDRADE et al., 1999; SEZERINO et al.,
1998; TAMBOURGI et al., 1998; PRETEL et al., 2005). DE OLIVEIRA et al. (2005)
analisando comparativamente, por eletroforese, as peçonhas de ambos os sexos de
L. intermedia e L. laeta, verificaram a ocorrência de variações intra- e
interespecíficas na composição de proteínas desses venenos. Este estudo
10
10
demonstrou, também, que os venenos das fêmeas são mais tóxicos do que os dos
machos e que os das fêmeas de L. laeta são os mais nocivos.
Os venenos das aranhas Loxosceles possuem uma composição complexa de
toxinas e essas estão associadas aos seus efeitos deletérios (NORMENT et al.,
1979).
Nas diferentes espécies de Loxosceles a presença da esfingomielinase D
(32–35 kDa) tem sido responsabilizada pela necrose, hemólise e trombocitopenia
(FORRESTER et al., 1978; KURPIEWSKI, 1981; TAMBOURGI et al., 1998). Outras
enzimas, como a hialuronidase (FUTRELL, 1992; WRIGHT, 1973), algumas
proteases (VEIGA, 2000; VEIGA et al., 2001a; VEIGA et al., 2001b), dentre as quais
as metaloproteinases (YONG et al., 2001), parecem contribuir, tanto para o
estabelecimento da lesão, como também para os efeitos sistêmicos nocivos do
veneno (JONG et al., 1979; VEIGA, 2000).
TAMBOURGI et al. (1995, 1998) identificaram e caracterizaram as toxinas de
L. intermedia responsáveis pelos efeitos locais e sistêmicos induzidos pelo veneno.
Esses componentes, com massa molecular (Mr) de 35 kDa, foram purificados por gel
filtração e denominados de Fração 35 (F35) (TAMBOURGI et al., 1998a;
TAMBOURGI et al., 1995). Essa fração é responsável pelas ações dermonecrótica e
hemolítica, sendo a última dependente, principalmente, da ativação da via alternativa
do complemento (TAMBOURGI et al., 1995); quando injetada em camundongos
induziu a produção de mediadores inflamatórios, tais como: Fator de Necrose
Tumoral (TNF), as interleucinas IL-6 e IL-10 e óxido nítrico (TAMBOURGI et al.,
1998b). Ao submeter a F35 à cromatografia de fase reversa foram obtidos três picos
contíguos, denominados P1, P2 e P3. A análise em SDS-PAGE revelou que P1 e P2
continham uma única banda, e P3 duas bandas, com massa molecular
aproximadamente de 35 kDa. A caracterização funcional de P1 e P2 revelou a
11
11
presença de atividade esfingomielinásica e que cada proteína induzia, in vivo, os
mesmos efeitos locais e sistêmicos do veneno bruto de Loxosceles. Em todos os
ensaios P2 foi mais ativa que P1 e P3 caracterizada como uma isoforma inativa
(TAMBOURGI et al., 1998a).
Fernandes Pedrosa et al. (2002) clonaram e expressaram, funcionalmente,
uma toxina de aproximadamente 32 kDa do veneno de L. laeta, que foi denominada
esfingomielinase I (SMase I). Essa proteína é dotada de todas as atividades tóxicas
descritas para o veneno total de Loxosceles. Recentemente, as SMases P1 e P2 de
L. intermedia também foram clonadas e as proteínas recombinantes foram capazes
de reproduzir todos os efeitos biológicos do veneno total e das toxinas P1 e P2
nativas (TAMBOURGI et al., 2004).
Estudos sobre a estrutura secundária das SMases P1, P2 e SMase I
mostraram que essas são ricas em α-hélices, importantes para sua atividade (DE
ANDRADE et al., 2005). Outros estudos estruturais demonstraram que o sítio
catalítico das SMases D, envolvido na hidrólise de esfingomielina, possui uma região
de ligação para o íon Mg
2+
e dois resíduos de histidina, formando um sistema
catalítico via ácido–base, uma característica geral de SMases neutras (MURAKAMI
et al., 2005).
12
12
1.3 OS EFEITOS LOCAIS DO ENVENENAMENTO
A lesão dermonecrótica foi descrita pela primeira vez, em 1872, por Caveness
e Schmaus, em 1929, sugeriu que a lesão poderia estar ligada à picada da aranha L.
reclusa. Em 1947, Machiavello fez associação entre o envenenamento por L. laeta
com a ferida gangrenosa do Chile, mas foi em 1957 e depois em 1958 que ATKINS
e colaboradores descreveram que as aranhas L. reclusa eram as responsáveis pelo
araneísmo necrótico.
A principal manifestação do envenenamento por Loxosceles é a
dermonecrose, ou seja, pelo desenvolvimento de necrose do tecido local atingido
pelo veneno. A patogênese desta reação ainda não é totalmente conhecida, embora
possa ser induzida em coelhos e cobaios (ATKINS et al., 1958; MORGAN, 1969;
FUTRELL, 1992).
O desenvolvimento da lesão se inicia com o aparecimento de edema, nas
primeiras 3 horas após o envenenamento, progride para níveis máximos em 24
horas com hemorragia cutânea e a seguir para uma lesão necrosada.
Análises histopatológicas da pele de coelhos, inoculados com veneno de
Loxosceles, mostraram alterações que incluíam edema, espessamento do endotélio
e degeneração das paredes dos vasos sanguíneos, compilação de células
inflamatórias, vasodilatação, coagulação intravascular, hemorragia subcutânea e
intradérmica. O acúmulo de leucócitos polimorfonucleares (PMN) é bem pronunciado
e a formação de abscesso e necrose podem ocorrer em 3 a 5 dias. O acúmulo de
leucócitos e eritrócitos ao redor das vênulas pode ser observado 3 horas após o
envenenamento, sugerindo perda de integridade vascular (FUTREL, 1992).
A reação dermonecrótica, induzida pelo veneno de Loxosceles, assemelha-se
àquela observada nas reações de Arthus e Shwartzman, nas quais está bem
13
13
documentada a participação do sistema do complemento e de leucócitos (SMITH e
MICKS, 1970; BUTZ et al., 1971). Smith e Micks (1970) mostraram que o sistema
complemento e o acúmulo de PMN no local são necessários para a formação da
lesão, uma vez que esta não foi observada nos animais em que leucopenia ou
depleção de sistema complemento foi induzida, sugerindo a participação de
mediadores inflamatórios no desenvolvimento da dermonecrose nos
envenenamentos por Loxosceles.
Alguns estudos têm sido realizados para determinar quais mediadores
inflamatórios poderiam estar envolvidos no recrutamento de PMN para o local da
lesão. Patel et al. (1994) verificaram que o veneno de Loxosceles reclusa é um
ativador potente de células endoteliais, promovendo a indução da expressão de
E-selectina e aumentando a expressão de IL–8 e GM–CSF, estimulando assim a
migração de neutrófilos e a maturação de granulócitos/macrófagos,
respectivamente; entretanto, esse veneno não promoveu a expressão da molécula
de adesão ICAM–1 ou de IL–6. Outro estudo mostrou que a incubação do veneno de
L. deserta com células endoteliais ou epiteliais causa aumento dos níveis de IL–8 e
GRO–α (growth–regulated oncogene α) e MCP-1 (DESAI, 2000). Além disso, esse
veneno é um potente indutor da expressão do fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF), em queratinócitos humanos, o qual pode estar envolvido na
angiogênese e no aumento da permeabilidade vascular, com conseqüente
vasodilatação, formação de edema e eritema. Málaque et al. (1999) detectaram em
culturas primárias de queratinócitos humanos, após incubação com veneno de L.
gaucho, altos níveis de TNF-α, outro ativador de células endoteliais, potencializando
o quadro inflamatório.
Alguns trabalhos foram realizados na tentativa de identificar os principais
componentes do veneno das aranhas Loxosceles que estariam envolvidos na
14
14
indução de dermonecrose. Componentes, com massas moleculares relativas (Mr)
entre 30 e 37 kDa, foram associados às ações dermonecrótica e letal. Proteínas com
Mr de 34 kDa presentes nos venenos de L. reclusa (MORGAN, 1969), de 33 – 35
kDa de L. gaucho (BÁRBARO et al., 1992) e de 35 kDA de L. intermedia
(TAMBOURGI et al., 1995) foram associadas às ações locais e sistêmicas em
modelos experimentais.
Avaliando os mecanismos moleculares envolvidos na gênese do loxoscelismo
cutâneo, Tambourgi et al. (2005) mostraram que as SMases D dos venenos de
Loxosceles são capazes de induzir dermonecrose dependente da ativação de
complemento em animais inoculados com veneno ou suas SMases D nativas ou
recombinantes e, em conseqüência, uma infiltração maciça de neutrófilos no local da
injúria. O infiltrado de neutrófilos diminuiu em animais descomplementados, pelo
tratamento com cobra venom factor (CoVF), ou em C6–deficientes, sugerindo que
fatores derivados da ativação da cascata do sistema do complemento,
particularmente C5a e MAC (Complexo de Ataque à Membrana), estão envolvidos
no desenvolvimento da dermonecrose. Entretanto, outras injúrias como hemorragia
e dissociação de fibras colágenas não foram prevenidas nesses modelos.
Posteriormente, em análises por zimografia de extratos de peles, foi mostrada a
expressão de gelatinases endógenas, como a MMP-9, em grandes concentrações,
nos animais inoculados com venenos ou suas SMases D. A expressão de MMP-9 e
de outra gelatinase endógena, a MMP-2, foi também observada em culturas de
fibroblastos incubadas com veneno e SMases de Loxosceles, sugerindo, assim, a
participação dessas proteases no quadro dermonecrótico.
Em continuação a esse estudo, Paixão-Cavalcante et al. (2006) mostraram
que, em culturas de queratinócitos humanos, o veneno de Loxosceles intermedia e
as SMases D têm a capacidade de induzir apoptose, e que este fenômeno estava
15
15
associado ao aumento das gelatinases MMP-2 e MMP-9 (PAIXÃO-CAVALCANTE et
al., 2006). Paixão-Cavalcante et al. (2007) mostraram, ainda, em culturas de
fibroblastos humanos e de coelhos, que a viabilidade era também comprometida, de
forma dose dependente da concentração do veneno de L. intermedia, e que a
mortalidade era inibida pela adição do inibidor de metaloproteases, a tetraciclina. O
mesmo foi observado in vivo quando a tetraciclina foi usada no tratamento de lesões
de coelhos inoculados com veneno de L. intermedia, sugerindo o potencial
terapêutico da tetracilina no tratamento do loxoscelismo cutâneo.
1.4 OS EFEITOS SISTÊMICOS OU VISCERAIS DO ENVENENAMENTO
No quadro sistêmico do envenenamento por Loxosceles as principais
manisfestações observadas são: distúrbios hematológicos, como anemia hemolítica
e coagulação intravascular disseminada, e comprometimento renal, observado em
16% dos casos de acidente por Loxosceles, sendo tais alterações implicadas, direta
ou indiretamente, na maioria das mortes (FUTREL, 1992).
Para os estudos dos efeitos sistêmicos do veneno de Loxosceles, Morgan et
al., (1979) desenvolveram um método in vitro para o estudo da hemólise associada
ao veneno de L. reclusa. Por meio deste, observaram que os eritrócitos humanos,
incubados com veneno de L. reclusa, eram lisados quando incubados com soro
humano fresco (grupo sanguíneo compatível), mas não pelo mesmo soro inativado
por aquecimento. Os eritrócitos não tratados com veneno não eram lisados. Esses
resultados sugeriam a participação do sistema do complemento no fenômeno da lise
de hemácias humanas no envenenamento por Loxosceles.
Em continuação a esses estudos, TambourgiI et al. (1995) mostraram que
hemácias humanas pré-tratadas com os venenos das aranhas do gênero Loxosceles
16
16
de importância médica no Brasil, L. gaucho, L. intermedia ou L. laeta, ou com a
fração F35, purificada do veneno de Loxosceles intermedia, tornavam-se
susceptíveis a ação lítica do sistema do complemento. Em análises por citometria de
fluxo revelaram que a lise dos eritrócitos era predominantemente ocasionada pela
ativação e deposição de componentes da via alternativa do sistema do
complemento. Entretanto, observou-se que componentes atuantes na via clássica,
como C1, C2 e C4, também, encontravam-se depositados na superfície dessas
células tratadas com os venenos e incubadas com soro humano normal autólogo.
Investigando a participação da via clássica do sistema do complemento, Tambourgi
et al. (2002, 2007) mostraram que a ativação da via clássica era causada pela
ligação direta de C1q à membrana dos eritrócitos tratados com as SMases D de
Loxosceles
As células nucleadas e eritrócitos são resistentes à morte mediada por
complemento autólogo através de vários mecanismos conhecidos, incluindo a
presença de fatores reguladores da vias alternativa e clássica, presentes na
membrana, como MCP, DAF, CR1 e CD59. A remoção, bloqueio, alterações
funcionais ou estruturais destes reguladores pode privar as células de seus
mecanismos naturais de proteção contra os efeitos da ativação espontânea do
complemento. Ensaios por citometria de fluxo não revelaram nenhuma alteração
significativa na expressão desses reguladores de superfície de hemácias tratadas
com veneno e/ou toxina purificada de Loxosceles. No entanto, tais estudos
permitiram demonstrar que as SMases são capazes de se ligar à superfície dessas
células (TAMBOURGI et al., 1995, 2000).
A falha de controle da ativação do sistema do complemento autólogo,
induzida pelo veneno de Loxosceles, não é devida à remoção ou bloqueio funcional
das moléculas regulatórias do sistema do complemento, mas sim a uma outra
17
17
modificação nos eritrócitos que promove a falha da regulação. A superfície de
hemácias humanas abriga resíduos de ácido siálico que estão, principalmente,
associados às moléculas de glicoforinas, cuja ação inibitória do sistema do
complemento foi reportada (TANNER, 1993; OKADA et al. 1982; BRAUCH et al.,
1983).
Tambourgi et al. (2000) mostraram, através de ensaios de citometria de fluxo
que o veneno de L. intermedia e suas SMases D purificadas, quando incubados com
eritrócitos humanos, têm a capacidade de induzir clivagem das glicoforinas A, B e C
da membrana dessas células. Por ensaios de “Western Blotting” foi verificado que
tanto o veneno quanto as SMases D não apresentavam qualquer atividade
proteolítica direta sobre a glicoforina purificada. Esses dados sugeriram que a
clivagem das glicoforinas da membrana dos eritrócitos humanos tratados com
veneno ou SMases D de Loxosceles ocorre de forma indireta, pela indução da
ativação de uma metaloproteinase endógena, uma vez que o uso de quelantes de
íons bivalentes, como o EDTA, e do inibidor de metaloproteinase, a 1,10-
fenantrolina, inibiu a remoção dessas moléculas da superfície dos eritrócitos.
Outros efeitos sistêmicos podem ser observados nos quadros de
envenenamento por Loxosceles. Análises laboratoriais e clínicas, realizadas em
alguns pacientes acidentados com aranhas do gênero Loxosceles, revelaram um
quadro de hemoglobinúria, hematúria e proteinúria devido aos distúrbios
hematológicos induzidos pelo veneno e, como conseqüência, danos renais agudos
(FUTREL, 1992). Tambourgi et al. (1998) mostraram, após o envenenamento por L.
intermedia, em análises histológicas de rins de camundongos, alterações como
necrose tubular aguda, alterações nos néfrons, acompanhadas de deposição de
material eosinófilico nos túbulos distal e proximal, sugerindo que os danos renais
são ocasionados de forma indireta pela deposição de produtos dos efeitos
18
18
sistêmicos. Luciano et al. (2004) observaram a ligação direta de componentes do
veneno de L. intermedia a estruturas renais, sugerindo que esses componentes
induzem a nefrotoxicidade observada no envenenamento.
Nos envenenamentos por Loxosceles pode também ocorrer alterações no
sistema da coagulação sanguínea, como prolongamento do tempo de coagulação,
coagulação intravascular e trombocitopenia. Essas alterações foram reportadas,
pela primeira vez, em relação a ação do veneno de L. reclusa e da fração contendo
esfingomielinase D, tendo sido sugerido o envolvimento da agregação plaquetária no
mecanismo de dermonecrose (KURPIEWSKI, 1981).
Uma das conseqüências patológicas da agregação plaquetária é a oclusão
das veias. A agregação plaquetária foi observada tanto em humanos quanto em
coelhos envenenados por Loxosceles (FUTRELL, 1992). DA SILVA et al. (2003)
correlacionando os dados de estudos hematológicos com os histopatológicos, de
coelhos inoculados com o veneno de L. intermedia, detectaram um quadro de
trombocitopenia e neutropenia e consideraram que este seria um efeito transitório do
envenenamento e decorrente de uma intensa migração de plaquetas e neutrófilos
para o local da lesão. TAVARES et al.
(2004) mostraram a ação do veneno de
L. gaucho sobre o sistema hemostático de coelhos. Os dados obtidos revelaram
elevação dos fatores da coagulação V, VII, VIII, IX, XI e fibrinogênio, leucopenia e
trombocitopenia, alterações que podem contribuir para o desenvolvimento da lesão
local.
van den Berg et al. (2007) investigaram a ação do veneno de L. intermedia e
suas SMases D sobre receptores de membrana das células endoteliais, envolvidos
na interação com a trombina e Proteína C, a Trombomodulina e o Receptor
Endotelial de Proteína C (EPCR), respectivamente. Nesse estudo, os autores
mostraram que o veneno de L. intermedia e as SMases D induzem ativação de
19
19
metaloproteases endógenas que clivam esses receptores de membrana, tendo
como conseqüência a redução na capacidade de geração de Proteína C ativada,
importante mecanismo fisiológico de anticoagulação. Tal evento pode participar na
gênese da coagulação intravascular presente nas formas graves de loxoscelismo
sistêmico.
1.5 TRATAMENTO (I)
Diferentes intervenções e medicamentos têm sido propostos para o
tratamento dos casos de envenenamentos por Loxosceles, tais como: remoção
cirúrgica do tecido afetado, analgésicos, vasodilatadores, anti-histamínicos,
antibióticos, corticóides, dapsona e antivenenos. Apesar do uso desses tratamentos,
estudos sobre a eficiência dos mesmos não foram ainda muito conclusivos (PAULI
et al., 2006).
A intervenção cirúrgica é utilizada para remoção da lesão no local da picada e
é realizada em vários países, de acordo com a experiência regional e característica
do envenenamento. Essa forma de tratamento é recomendada apenas para a
reconstrução plástica em casos de permanência da lesão tecidual necrosada
(WENDEL, 2003; BARBARO e CARDOSO, 2003; HOGAN et al., 2004; DA SILVA et
al., 2003). No entanto, tal procedimento pode aumentar a inflamação local,
exacerbar os efeitos do veneno, prolongar a injúria tecidual, aumentar a extensão da
lesão e, conseqüentemente, contribuir para a rejeição de implantes de tecidos
futuros e formação de ulceração crônica (KING, 1985; REES et al., 1985; FUTREL,
1992; SHIP, 1998; WENDEL, 2003; DA SILVA et al., 2004).
O uso de antibióticos no tratamento do envenenamento por Loxosceles é
comum nos Estados Unidos. Tal forma de tratamento é utilizada na tentativa de
20
20
prevenir infecções secundárias no local da picada (HOGAN et al., 2004), mas em
outros países, o uso destes é considerado inadequado, uma vez que foi
demonstrado que infecções secundárias não são muito comuns nesses acidentes
(SEZERINO et al., 1998; SCHENONE, 2003; BÁRBARO e CARDOSO, 2003).
Corticóides são utilizados no tratamento do loxoscelismo em muitos países,
inclusive no Brasil. Esses compostos são administrados em casos graves,
especialmente em crianças, pois se acredita que possam ajudar a prevenir a
hemólise e a falência renal, quando aplicados logo nas primeiras horas do
envenenamento (REES et al., 1981; SMITH e BALDWIN, 1998; FUTREL, 1992;
GOMEZ et al., 1999). Entretanto, foi constatado que o uso de corticóide não inativa o
veneno ou inibe os seus efeitos primários, não prevenindo, assim, o aparecimento
da necrose (PAULI et al., 2006).
A Dapsona é um medicamento usado no tratamento da lepra e nos últimos
tempos tem sido recomendada para os casos de envenenamento por Loxosceles.
Os resultados do uso da Dapsona no tratamento de loxoscelismo mostraram que o
seu efeito se dá pela inibição da migração e infiltração de neutrófilos no foco
inflamatório da lesão, retardando assim a injúria tecidual mediada pela ação dessas
células. Entretanto, o uso da Dapsona não é indicado em casos de loxoscelismo
sistêmico e alguns autores questionam sua eficiência, pois há falta de estudos mais
aprofundados sobre sua ação após muitas horas do acidente (PAULI et al., 2006).
A soroterapia é o tratamento mais utilizado para os casos de envenenamento
por Loxosceles, principalmente no Brasil. Esse tratamento é proposto para a
neutralização das toxinas circulantes dos venenos, por moléculas heterólogas e
específicas, os anticorpos. Acredita-se que essa terapia reduza os riscos de
desenvolvimento do quadro sistêmico, como hemólise, coagulação intravascular
disseminada, falência renal e possíveis complicações fatais (PAULI et al., 2006).
21
21
1.6 TRATAMENTO (II) – SOROTERAPIA
Um dos principais objetivos no estudo de toxinas animais é a busca de uma
terapia adequada para os envenenamentos causados por animais peçonhentos.
Assim, desde o final do século XIX foi iniciado, por vários grupos de pesquisa, o
estudo e o desenvolvimento da soroterapia para acidentes, principalmente os
ofídicos. Desses estudos, destaca-se o de Calmette, em 1894, que mostrou pela
primeira vez as propriedades terapêuticas da utilização de soros de cavalos
imunizados, sobre os efeitos deletérios da ação dos venenos. No Brasil, tais estudos
foram iniciados por VITAL BRAZIL, que mostrou que o soro anti-Naja produzido por
CALMETTE era ineficiente em neutralizar os efeitos tóxicos dos venenos das
serpentes brasileiras. Posteriormente, foram produzidos soros através da
imunização de cavalos com venenos de serpentes brasileiras e foi Vital Brazil o
primeiro a defender a idéia da especificidade de ação dos soros para utilização na
terapia.
A técnica utilizada para a produção de soros consiste na utilização de animais
de grande porte, como cavalos, que são imunizados com venenos de uma ou mais
espécies de animais peçonhentos de importância médica; após uma série de ciclos
de imunização esses animais são sangrados e os soros obtidos. Os soros contendo
anticorpos com capacidade neutralizante para as toxinas dos venenos são
classificados como mono- ou poliespecíficos, mas também referidos como mono ou
polivalentes, ou seja, se são produzidos apenas contra um veneno ou toxina de uma
espécie de animal ou contra uma mistura de venenos ou toxinas animais,
respectivamente (BRAZIL, 1905). Atualmente, a soroterapia é considerada o
22
22
tratamento mais eficiente para reverter os efeitos tóxicos causados pelos venenos
animais.
Os principais grupos de animais peçonhentos com importância médica, cujos
acidentes são passiveis de tratamento por soroterapia, incluem serpentes,
escorpiões, aranhas, lagartas e animais marinhos. No Brasil, o Ministério da Saúde
compra a produção dos soros de diversas instituições públicas como: o Instituto
Butantan, em São Paulo, Instituto Vital Brazil, no Rio de Janeiro, Fundação Ezequiel
Dias, em Belo Horizonte e o Centro de Produção e Pesquisa em Imunobiológicos,
em Curitiba, e os distribuí para hospitais de todo o país por meio da Fundação
Nacional de Saúde do Ministério da Saúde. Eventualmente, os soros antivenenos
produzidos no Brasil são utilizados para suprir a carência de outros países da
América Latina.
No Brasil o tratamento soroterápico, para os acidentes causados por aranhas
do gênero Loxosceles, é realizado pela administração do soro anti-Aracnídico,
produzido pela imunização de cavalos com os venenos de L. gaucho, Tityus
serrulatus e Phoneutria nigriventer ou pelo soro anti-Loxosceles, produzido pela
imunização de cavalos com os venenos de L. gaucho, L. intermedia e L. laeta.
Diversos estudos sobre o potencial neutralizante de soros anti-Loxosceles
foram conduzidos ao longo dos anos, na tentativa de se obter um soro mais eficiente
para o tratamento humano. Nos Estados Unidos, Ress et al. (1981) mostraram que a
atividade dermonecrótica, induzida pelo veneno de Loxosceles reclusa, foi
neutralizada com o uso do soro específico, inoculado diretamente no local da lesão.
No Brasil, BÁRBARO et al. (1994) verificaram a reatividade cruzada do soro anti-
Aracnídico e de um soro experimental anti-Loxosceles (produzidos em coelhos) com
os venenos das espécies de importância médica. Bárbaro et al. (1996)
demonstraram que os anticorpos encontrados no soro de coelhos e cavalos, contra
23
23
toxinas das peçonhas de L. gaucho, L. laeta e L. intermedia, eram capazes de
reconhecer com diferentes intensidades os três venenos, sugerindo uma
conservação de determinantes antigênicos comuns.
Braz et al. (1999) e Bárbaro et al. (2005) analisando comparativamente, o
potencial neutralizante de soros eqüinos anti-L. intermedia, produzido no Centro de
Pesquisa Produção de Imunobiológico do Paraná, e anti-Aracnídico, produzido no
Instituto Butantan, mostraram que o primeiro era o mais eficiente na neutralização da
ação letal do veneno em modelo murino. Bárbaro et al. (2005), ainda, mostraram
que esses dois soros apresentam a mesma eficiência na neutralização das demais
atividades tóxicas dos venenos de importância médica no Brasil e a reatividade
cruzada para o veneno de L. reclusa. Analisando a reatividade e neutralização dos
venenos das espécies de importância médica na América, De Roodt et al., (2007)
mostraram que os soros experimentais anti-Loxosceles boneti e anti-Loxosceles
reclusa apresentam reatividade cruzada entre si e com os venenos de L. gaucho e
L. laeta e que ainda foram capazes de neutralizar a dermonecrose a letalidade em
camundongos.
Guilherme et al. (2001) demonstraram in vivo que o anticorpo monoclonal
MoALg1, produzido contra o componente de 35 kDa indutor da dermonecrose de
L. gaucho, foi capaz de reduzir a lesão dermonecrótica em 90-97% após seis horas
do envenenamento. Entretanto, esse anticorpo não neutralizou com eficiência a
dermonecrose induzida pelos venenos de L. laeta e L. intermedia. Esses resultados
sugerem a existência de epítopos diferentes nos componentes dermonecróticos dos
venenos das três espécies. Um soro policlonal experimental anti-L. gaucho produziu
uma redução significante da atividade dermonecrótica em venenos homólogos 12
horas após o envenenamento. Esses tratamentos não reduziram edema, eritema,
hemorragia e isquemia nas áreas afetadas pelo veneno de L. gaucho.
24
24
Na tentativa de otimizar a utilização de antígenos para imunização de animais
e produzir um soro específico, Fernandes Pedrosa et al. (2002) imunizaram coelhos
com a proteína recombinante esfingomielinase I (SMase I) e mostraram que o soro
obtido era capaz de neutralizar totalmente a reação dermonecrótica induzida pelo
veneno de L. laeta.
Tambourgi et al. (2004) analisaram a reatividade cruzada dos anticorpos
produzidos contra as SMases D recombinantes P1 e P2 de L. intermedia e SMase I
de L. laeta, contra os venenos de L. intermedia, L. laeta e L. gaucho. Os resultados
obtidos foram indicativos de que é necessária a associação de SMases dessas
espécies para obtenção de um soro capaz de neutralizar eficientemente os efeitos
tóxicos induzidos pelos venenos.
Seguindo essa proposta, Olvera et al., (2006) clonaram e expressaram
SMases D dos venenos de L. laeta, L. reclusa e L. boneti e produziram um soro anti-
SMases D. Esse soro mostrou capacidade neutralizante para a atividade
esfingomielinásica e dermonecrótica induzida por esses venenos.
25
25
2 OBJETIVO
O presente estudo tem como objetivo avaliar o potencial neutralizante do soro
eqüino hiperimune, produzido contra esfingomileinases D recombinantes de
Loxosceles, i.e., SMase I de L. laeta, SMases P1 e P2 de L. intermedia, e compará-
lo ao do anti-Aracnídico, produzido pelo Instituto Butantan e utilizado na soroterapia
humana, sobre a ação tóxica dos venenos de aranhas do mesmo gênero com
importância médica no Brasil e América Latina.
26
26
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
3.1.1 ARANHAS
As aranhas Loxosceles gaucho, L. intermedia e L. laeta foram mantidas e
criadas no Biotério de Loxosceles do Laboratório de Imunoquímica do Instituto
Butantan, a partir de espécimes coletados em São Paulo (SP), Curitiba (PR), Campo
Alegre e Lauro Muller (SC).
3.1.2 COELHOS
Coelhos machos da raça Nova Zelândia, provenientes do Biotério Central do
Instituto Butantan, pesando entre 2,5 e 3 kg, foram utilizados para a realização dos
ensaios de dermonecrose e soro neutralização in vivo.
3.2 VENENOS
Misturas de venenos de machos e fêmeas das espécies L. intermedia, L. laeta
e L. gaucho foram obtidas por eletroestimulação, segundo o método de BÜCHERL
(1969), com modificações. Este método consiste na aplicação de pulsos de baixa
voltagem na região ventral do externo das aranhas, o que faz com que os animais
ejetem o veneno pelos ferrões; esse foi aspirado com micropipeta e diluído em
solução salina estéril. Para quantificação de proteínas foi utilizado o ensaio de BCA
(“Protein Assay Kit”, Pierce Biotechnology, Inc, EUA) e a concentração dos venenos
27
27
ajustada para 1 µg/µL, com solução salina estéril, sendo as amostras aliquotadas e
estocadas a -20ºC.
3.3 SOROS EQÜINOS HIPERIMUNES
3.3.1 SORO ANTI-ARACNÍDICO
O soro comercial anti-Aracnídico (lote: 0506118) é produzido pela Divisão
Bioindustrial do Instituto Butantan pela imunização de cavalos com uma mistura de
venenos do escorpião Tityus serrulatus (57%) e aranhas Phoneutria nigriventer
(21,5%) e Loxosceles gaucho (21,5%); a fração IgG do soro é purificada, tratada
com pepsina para obtenção da fração F(ab’)
2
, sendo as amostras aliquotadas em
frascos.
3.3.2 SORO ANTI-SMASES D
O soro anti-SMases D de Loxosceles foi produzido pela Seção de
Processamento de Plasmas Hiperimunes da Divisão Bioindustrial, do Instituto
Butantan, e corresponde à fração IgG, tratada com pepsina, purificada a partir de
uma mistura de soros de cavalos, que foram hiperimunizados com as SMases D
recombinantes P1 e P2 de L. intermedia e SMase I de L. laeta. O processo de
produção deste soro está protegido por patente, processo nº 0404765-6 de
03.11.2004, depositada no Instituto Nacional da Propriedade Industrial.
3.3.3 SORO ANTI-BOTRÓPICO
28
28
O soro comercial anti-Botrópico (lote: 0506118) é produzido pela Divisão
Bioindustrial do Instituto Butantan pela imunização de cavalos com uma mistura de
venenos das serpentes B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni, B. newiedii, B.
alternatus, sendo a fração IgG do soro purificada, tratada com pepsina para
obtenção da fração F(ab’)
2
, e as amostras aliquotadas em frascos.
3.4 ANÁLISE DO RECONHECIMENTO DOS VENENOS PELOS SOROS ANTI-
ARACNÍDICO E ANTI-SMASES D DE LOXOSCELES
3.4.1 DOSAGENS DE ANTICORPOS
Os títulos de anticorpos dos soros anti-Aracnídico e anti-SMases D frente aos
diferentes venenos de Loxosceles foram determinados por ELISA. Neste,
microplacas (Costar
®
, Corning Inc., EUA) foram sensibilizadas pela adição de 10
µg/mL dos venenos de L. intermedia, L. gaucho e L. laeta (100 µL/orifício) em
tampão PBS (NaCl 137 mM, Na
2
HPO
4
8,1 mM, KCL 2,7 mM e KH
2
PO
4
1,5 mM - pH
7,2). Após incubação por 18 h a 4ºC em câmara úmida, as placas foram lavadas 3
vezes com PBS e bloqueadas pela incubação com 200 µL/orifício de tampão
PBS/BSA 5% por 2 h a 37ºC. Em seguida, as placas foram lavadas 3 vezes com
tampão PBS/Tween-20 0,1%. Para determinação dos títulos, foram adicionados 100
µL/orifício dos soros normal (controle) e hiperimunes de eqüinos, diluídos de
maneira seriada em tampão PBS/BSA 1%. Após incubação, por 1 h a temperatura
ambiente, as placas foram submetidas a novo ciclo de três lavagens com tampão
PBS/Tween-20 0,1% e adicionados 100 µL/orifício de anti-IgG total de cavalo
conjugado com peroxidase (Sigma-Aldrich, MO, EUA), diluído 1:3.000 em tampão
PBS-BSA 0,1%, seguido da incubação por 1 h a 37ºC. Após ciclo de três lavagens
29
29
com tampão PBS/Tween-20 0,1%, as reações foram reveladas pela adição do
substrato OPD (ortofenil-diaminobenzidina) e H
2
O
2
(peróxido de hidrogênio)
,
de
acordo com as recomendações do fabricante (Sigma-Aldrich). As placas foram
incubadas à temperatura ambiente por 20 min e a reação interrompida pela adição
de 50 µL/orifício de H
2
SO
4
4N. A absorbância foi determinada a λ 492 nm em leitor
de placas de ELISA (Multiskan EX, Labsystems, Finlândia).
3.4.2 DETERMINAÇÃO DAS SUBCLASSES DE IgG PRESENTES NOS SOROS
ANTI-ARACNÍDICO E ANTI-SMASES D
Os títulos das subclasses de IgG (IgGa, IgGb, IgGc, IgGT) presentes nos
soros anti-Aracnídico e anti-SMases D foram determinados por meio de ELISA de
captura. Resumidamente, microplacas (Costar
®
, Corning Inc.) foram sensibilizadas
pela adição dos anticorpos monoclonais (1 : 250) (Bentil, EUA) específicos para as
diferentes subclasses (100 µL/poço) em tampão PBS. Após incubação por uma noite
a 4ºC em câmara úmida, as placas foram lavadas três vezes com PBS e bloqueadas
pela incubação com 200 µL/orifício de tampão PBS/BSA 5% por 2 h a 37ºC. Em
seguida, as placas foram lavadas três vezes com tampão PBS e adicionados 100
µL/orifício dos soros normal, anti-Aracnídico e anti-SMases D, diluídos de maneira
seriada. A seguir a reação foi desenvolvida com o conjugado específico, como
descrito anteriormente.
3.4.3 ANÁLISES QUALITATIVAS DOS SOROS
Amostras dos venenos de L. intermedia, L. gaucho ou L. laeta (10 µg) foram
submetidas à eletroforese vertical em mini-géis de poliacrilamida, em presença de
30
30
dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), segundo o método descrito por Laemmli
(1970). A separação eletroforética foi feita pela aplicação de 100 V e, após a
migração, as bandas foram visualizadas pela impregnação com prata, conforme
descrito por MORRISSEY (1980). As massas moleculares relativas das proteínas
presentes nas amostras foram determinadas por comparação de migração com uma
mistura de proteínas de calibração, com massas conhecidas (BenchMark, “Pre-
Stained Protein Ladder”, GIBCO, EUA).
As amostras dos venenos separadas em géis de SDS-PAGE foram
eletrotransferidas para matrizes de nitrocelulose (Mini-protean TM II, Bio-Rad, Lab.,
Richmond, CA, EUA), segundo o método descrito por TOWBIN et al. (1979). A
transferência foi realizada durante uma noite a 4ºC, sob amperagem constante de
180 mA, em tampão Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8,3, metanol 20%. As
membranas de nitrocelulose, contendo os componentes separados dos venenos de
L. intermedia, L. gaucho e L. laeta foram bloqueadas com PBS contendo BSA 5%,
por duas horas a 37°C e, em seguida, incubadas com os soros anti-Aracnídico ou
anti-SMases D (1:2000) diluídos em PBS/BSA 0.1%, por 1 h a temperatura
ambiente. Decorrido esse período, as membranas foram lavadas três vezes com
PBS/Tween-20 0,1% por 10 minutos e incubadas com conjugado específico
marcado com fosfatase alcalina, diluído 1: 5.000 em PBS/BSA 0.1%, por 1 h a
temperatura ambiente. A seguir, as membranas foram novamente lavadas três
vezes com PBS/Tween-20 0,1% por 10 minutos e a reação foi revelada pela adição
do substrato NBT/BCIP (Nitro-Blue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3’-
indolyphosphate p-toluidine salt), de acordo com as recomendações do fabricante
(Promega, Madison, WI, EUA).
31
31
3.5 ENSAIOS DE SORONEUTRALIZAÇÃO
3.5.1 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DERMONECRÓTICA EM COELHOS
A determinação da atividade dermonecrótica induzida pelos venenos de
Loxosceles foi realizada em coelhos. Amostras de 3 µg dos venenos de L. gaucho,
L. intermedia ou L. laeta foram inoculadas, pela via intradérmica, no dorso de
coelhos adultos. Amostras de PBS foram inoculadas como controle negativo. Os
animais foram examinados ao longo de 72 horas e o tamanho das lesões
mensuradas.
3.5.1.1 SORONEUTRALIZAÇÃO “IN-VIVO”
A capacidade neutralizante dos soros anti-Aracnídico e anti-SMases D de
Loxosceles foi avaliada segundo a metodologia utilizada pelo Setor de Controle de
Qualidade do Instituto Butantan. Para este ensaio, os venenos de L. gaucho
,
L. intermedia ou L. laeta foram inoculados no dorso de coelhos pela via intradérmica
(dois animais por grupo), concomitantemente à injeção endovenosa de 1 mL dos
antissoros teste, diluídos 1:15. Os animais foram examinados durante os tempos de
24, 48 e 72 horas após o envenenamento, sendo o tamanho das lesões
mensuradas. Após 72 horas, os animais foram sacrificados pela injeção de tiopental
sódico, 1 mL/Kg pela via endovenosa. Os resultados obtidos foram expressos como
as médias das porcentagens de soroneutralização obtidas em três ensaios
independentes.
32
32
3.5.1.2 SORONEUTRALIZAÇÃO “IN VTRO - IN VIVO”
A capacidade neutralizante dos soros anti-Aracnídico e anti-SMases D de
Loxosceles foi também avaliada incubando-se, por 30 min a 4°C, amostras contendo
5 µg dos venenos de L. intermedia, L. gaucho ou L. laeta com os soros eqüinos
diluídos de maneira seriada (diluições de 1:15; 1:30; 1:45; 1:60; 1:90 e 1:120). As
misturas foram centrifugadas a 14.000 rpm, por 10 min a 4ºC, os sobrenadantes
coletados e injetados no dorso de coelhos (dois animais por grupo), pela via
intradérmica. Como controles da reação, amostras dos venenos foram incubadas
com soro normal de cavalo ou com salina estéril e processadas como descrito
acima. Os animais foram examinados durante os tempos de 24, 48 e 72 horas após
o envenenamento, sendo o tamanho das lesões mensuradas. Após 72 horas, os
animais foram sacrificados pela injeção de tiopental sódico, 1 mL/Kg pela via
endovenosa. Os resultados obtidos foram expressos como as médias das
porcentagens de soroneutralização obtidas em três ensaios independentes.
3.5.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE HEMOLÍTICA, DEPENDENTE DE
COMPLEMENTO, INDUZIDA PELOS VENENOS DE LOXOSCELES
3.5.2.1 SORO NORMAL HUMANO
Soro de indivíduos adultos saudáveis foi obtido do sangue com o fenótipo O
Rh
+
. O sangue foi incubado a 37ºC e mantido sob refrigeração a 4ºC para retração
do coágulo. Seguiu–se a centrifugação a 1500 rpm por 10 min a 4ºC e o soro foi
armazenado a –80ºC.
33
33
3.5.2.2 ERITRÓCITOS HUMANOS
Amostras de sangue ORh
+
foram coletadas em Alsever pH 6,1 (114 mM
citrato, 27 mM glucose, 72 mM NaCl) e os eritrócitos utilizados como alvo nos
ensaios para complemento.
3.5.2.3 TRATAMENTOS DOS ERITRÓCITOS HUMANOS COM OS
VENENOS DE LOXOSCELES
Um volume de eritrócitos humanos a 1,5% foi incubado com igual volume de
tampão VBS
2+
contendo concentrações crescentes da mistura de venenos de
machos e fêmeas de L. intermedia, L. laeta ou L. gaucho, durante 30 minutos a
37ºC. Eritrócitos incubados com tampão VBS
2+
(2,8 mm ácido barbitúrico, 145,5 mM
NaCl, 0,8 mM MgCl
2
, 0,3 mM CaCl
2,
0,9 mM Na-barbital, pH 7.2) foram utilizados
como controle. As amostras foram lavadas por três vezes e novamente suspensas
em VBS
2+
para o volume final de 1 mL.
3.5.2.4 ENSAIO HEMOLÍTICO
Amostras de 100 µL de eritrócitos humanos tratados ou não com os venenos
das três espécies de Loxosceles, em duplicatas, foram adicionados a 50 µL de soro
humano normal (SHN) e o volume ajustado para 200 µL com tampão VBS
2+
. A lise
espontânea ou total dos eritrócitos humanos foi avaliada em amostras de eritrócitos
incubadas com VBS
2+
ou H
2
O, respectivamente. Após a incubação durante 1 h a
37ºC, as amostras foram centrifugadas a 1.500 rpm durante 3 min e a 4ºC, os
34
34
sobrenadantes coletados e a hemólise mensurada a λ414nm e expressa em
porcentagem.
3.5.2.5 SORONEUTRALIZAÇÃO DA CAPACIDADE DE INDUÇÃO DA
REMOÇÃO DE GLICOFORINA C DAS MEMBRANAS DE ERITRÓCITOS E DA
LIGAÇÃO DAS TOXINAS À SUPERFÍCIE DAS CÉLULAS
Amostras contendo 3 µg dos venenos de L. intermedia, L. laeta ou L. gaucho,
em 25 µL de PBS, foram incubadas por 1 h a 37
o
C sob agitação com diluições
crescentes (1:15; 1:150; 1:750; 1:1500) dos soros-teste (soros eqüinos: anti-
Botrópico, anti-Aracnídico ou anti-SMases D) e adicionadas a amostras de 1 mL de
suspensão de hemácias humanas a 1,5% em VBS
++
; as misturas foram incubadas
em banho-maria a 37
o
C por 30 min sob agitação. Como controles, hemácias foram
incubadas, pelo mesmo período, com tampão na ausência de toxinas e/ou soros. As
amostras foram lavadas três vezes com VBS
++
, ressuspensas em tampão de FACS
(PBS/BSA 0,1% + azida sódica 0,01%) e transferidas para microplacas com fundo
em U (25 µL/poço). Estas foram incubadas com o anticorpo monoclonal anti-GPC
(Bric 4 – BGRL, Reino Unido), na concentração de 1 µg/ml em tampão de FACS.
Após incubação por 30 min a 4
o
C, as hemácias foram lavadas três vezes, com
tampão de FACS, e ressuspensas no mesmo tampão. A seguir, amostras dos
anticorpos secundários, anti-cavalo ou anti-camundongo conjugados com FITC
(isotiocianato de fluoresceína) (Pierce, IL, EUA, diluídas 1:50, foram adicionadas às
células e as placas incubadas por 30 min a 4
o
C. As células foram lavadas por três
vezes, ressuspensas em 200 µL de tampão FACS e a intensidade de fluorescência
determinada em citômetro de fluxo (FACScalbur, Becton Dickinson, CA, EUA).
35
35
3.5.3 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ESFINGOMIELINÁSICA DOS VENENOS
DE LOXOSCELES
A determinação da atividade esfingomielinásica dos venenos de Loxosceles
foi realizada segundo o método descrito por TOKUMURA et al. (2002); esse método
baseia–se na liberação de colina, um dos produtos da hidrólise de esfingomielina
(SM) por SMases. O substrato SM (50 mM - Sigma-Aldrich, MO, EUA) foi diluído em
tampão HEPES-Salina (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl
2
1 mM, MgCl
2
1 mM, HEPES
10 mM - pH 7,4). Amostras dos venenos, preparados em diluições crescentes, e do
substrato foram coincubadas em placas durante 20 min a 37ºC. Posteriormente, 10
µL da mistura composta por colina oxidase (1 unidade/mL), peroxidase (0,06
unidade/mL) e 50 µM de ácido 3-(4-hidroxil-fenil) propiônico em HEPES foram
adicionados e a reação prosseguiu por mais 10 min; ao final, a colina liberada é
oxidada a betaína e peróxido de hidrogênio. A liberação da colina, com a
conseqüente oxidação à betaína, foi acompanhada pela leitura a λ320nm (excitação)
e λ405nm (emissão) em espectrofluorímetro de placa VICTOR.
3.5.3.1 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ESFINGOMIELINÁSICA
RESIDUAL DAS AMOSTRAS DOS VENENOS DE LOXOSCELES
A atividade esfingomielinásica remanescente nas amostras de venenos, após
incubação com os soros eqüinos anti-Botrópico, anti-Aracnídico ou anti-SMases D
de Loxosceles, foi determinada pelo do método TOKUMURA et al. (2002), como
acima descrito. Resumidamente, amostras de 1 µg dos venenos de L. intermedia,
L. laeta ou L. gaucho, diluídos em 10 µL de tampão HEPES, foram incubadas por 30
min a 37
o
C sob agitação com 20 µL dos soros-teste, diluídos de maneira seriada, e
36
36
centrifugadas a 14.000 rpm por 15 min. Os sobrenadantes (10 µL), livres de
imunocomplexos, foram incubados, por 25 min a 37ºC, com amostras do substrato
SM (50 mM). Posteriormente, 10 µL da mistura composta por colina oxidase (1
unidade/mL); peroxidase (0,06 unidade/mL) e 50 µM de ácido 3-(4-hidroxil-fenil)
propiônico em HEPES foram adicionados e a reação prosseguiu por mais 10 min.
Após esse período foi realizada a leitura da placa, a λ320nm (excitação) e λ405nm
(emissão), em espectrofluorímetro de placa VICTOR e a porcentagem de
soroneutralização calculada.
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente pelo teste t’Students,
sendo consideradas significativas as diferenças com p<0.05*.
4 RESULTADOS
4.1 ANÁLISE DO RECONHECIMENTO DOS VENENOS PELOS SOROS ANTI-
ARACNÍDICO E ANTI-SMASES D DE LOXOSCELES
4.1.1 por Western Blot
A análise eletroforética dos venenos de L. intermedia, L. laeta e L. gaucho
revelou a presença de um grande número de bandas com massa molecular entre 18
e 120,0 kDa. A avaliação comparativa dos perfis eletroforéticos dos venenos
mostrou diferenças não só no número como também na intensidade das bandas,
embora, todos apresentem componentes na região de 30-35 kDa, massas
correspondentes às das SMases D (Figura 3 A).
37
37
A análise do reconhecimento das proteínas dos venenos de Loxosceles pelos
soros eqüinos anti-Aracnídico e anti-SMases D foi realizada pela técnica de Western
blot. Os resultados obtidos mostraram que o soro anti-Aracnídico foi capaz de
reconhecer, embora com intensidades distintas, a maioria dos componentes
presentes nos venenos de L. intermedia, L. laeta e L. gaucho. O soro anti-SMases
D, como esperado, reconheceu bandas na região de 30-35 kDa, correspondentes as
SMases D presentes nestes venenos. O soro anti-SMases D teve ainda a
capacidade de reconhecer componentes dos venenos de L. laeta e L. intermedia na
faixa de 65 kDa (Figura 3 B).
38
38
111,4–
79,7 -
61,3 -
49,0 -
36,4 -
24,7 -
Mr [kDa]
A
1 2 3
111,4–
79,7 -
61,3 -
49,0 -
36,4 -
24,7 -
Mr [kDa]
Soro Anti-Aracnídico Soro Anti-SMases D
B
1 2 3 1 2 3
FIGURA 3: RECONHECIMENTO DOS VENENOS DE Loxosceles PELOS SOROS ANTI-
ARACNÍDICO E ANTI-SMASES D. [A] Amostras contendo 10 µg dos venenos
de L. gaucho (1), L. intermedia (2) e L. laeta (3) foram submetidas a
eletroforese em SDS-PAGE a 12% em condições não redutoras. As bandas
foram reveladas por impregnação pela prata. [B] As amostras submetidas à
eletroforese foram, subseqüentemente, eletrotransferidas para membranas de
nitrocelulose, as quais foram incubadas com os soros anti-Aracnídico ou anti-
SMases D. As reações foram reveladas pela adição do conjugado específico
marcado com fosfatase alcalina e reveladas com o substrato NBT/BCIP.
39
39
4.1.2 por ELISA – TÍTULOS DE ANTICORPOS
Os títulos dos soros anti-Aracnídico e anti-SMases D foram determinados
frente aos venenos das três espécies de Loxosceles e às SMases D por ELISA.
Como controle das reações, soro normal de cavalo foi testado frente aos mesmos
antígenos.
As Tabelas 1 e 2 mostram que ambos os soros apresentaram títulos
significativos de anticorpos contra todos os antígenos testados. Entretanto, quando
comparados, o soro anti-Aracnidico apresentou títulos superiores, para o veneno de
L. gauch, do que o soro anti-SMases D. Já o soro anti-SMases D apresentou títulos
mais altos para o veneno de L. intermedia e toxinas recombinantes P1 e P2 de
L. intermedia e SMase I de L. laeta. Os dois soros apresentaram títulos similares
frente ao veneno de L. laeta.
40
40
TABELAS 1 e 2 : Títulos de Anticorpos dos Soros anti-Aracnídico e anti-SMases D.
Placas de ELISA foram sensibilizadas com 100 µl (10 µg/ml) das
amostras de venenos de L. gaucho, L. intermedia e L. laeta [TABELA 1]
ou toxinas recombinantes [TABELA 2] e, posteriormente, incubadas
com diluições crescentes dos soros anti-Aracnídico, anti-SMases D ou
normal de cavalo. As reações foram reveladas pela adição do
conjugado anti-IgG de cavalo marcado com peroxidase e, a seguir, do
substrato específico. Os títulos foram determinados como a maior
diluição dos soros experimentais, cujas D.O.s, medidas a 492 nm, eram
três vezes superiores às obtidas para o soro normal na mesma diluição.
Os dados apresentados são representativos de três experimentos.
TABELA 1 – Títulos dos soros frente os venenos de Loxosceles
Venenos
Soro anti-Aracnídico
Soro anti-SMases D
Loxosceles gaucho
1 : 512.000
1 : 128.000
Loxosceles intermedia
1 : 128.000
1 : 256.000
Loxosceles laeta
1 : 128.000
1 :128.000
TABELA 2 – Títulos dos soros frente às toxinas recombinantes
SMases D
Soro anti-Aracnídico
Soro anti-SMases D
P1
1 : 256.000
1 : 512.000
P2
1 : 256.000
1 : 512.000
SMase I
1 : 512.000
1 : 1.024.000
41
41
4.2 DETERMINAÇÃO DOS TÍTULOS DAS SUBCLASSES DE IgG DOS SOROS
Os títulos das subclasses de IgG (IgGT, IgGa, IgGb e IgGc) nos soros anti-
Aracnídico e anti-SMases D foram determinados por ELISA de captura. Como
controle das reações, soro normal de cavalo foi também testado para as subclasses
de IgG de eqüinos. Os títulos foram determinados com a maior diluição dos soros
experimentais, cujas D.Os fossem uma vez superior àquelas obtidas para o soro
normal.
A Tabela 3 mostra que o soro anti-SMases D apresentou títulos
significativamente maiores de todas as subclasses de IgG do que o anti-Aracnídico.
TABELA 3: Placas de ELISA foram sensibilizadas com 100 µl das amostras dos soros anti-
isotipos de IgG de cavalo (IgGT, IgGa, IgGb e IgGc) diluídos 1:250 e,
posteriormente, incubadas com diluições crescentes dos soros anti-Aracnídico,
anti-SMases D ou normal de cavalo. As reações foram reveladas pela adição
do conjugado anti-IgG de cavalo marcado com peroxidase e, a seguir, do
substrato específico. Os títulos foram determinados como a maior diluição dos
soros experimentais, cujas DOs, medidas a 492 nm, fossem uma vez superior
às obtidas para o soro normal na mesma diluição. Os dados apresentados são
representativos de três experimentos.
Tabela 3 – Títulos das subclasses de IgG dos soros
Isotipos
Anti-Aracnídico
Anti-SMases D
IgGT 1:5.000 1:80.000
IgGa
< 1:5.000 1:160.000
IgGb 1:10.000 > 1:640.000
IgGc < 1:5.000 1:40.000
42
42
4.3 ENSAIOS DE SORONEUTRALIZAÇÃO
4.3.1 DA ATIVIDADE DERMONECRÓTICA
A capacidade de induzir dermonecrose foi avaliada pela inoculação
intradérmica de 3 mg dos venenos de L. gaucho, L. intermedia ou L. laeta em
coelhos, sendo as áreas das lesões mensuradas ao longo de 72 horas. Os animais
receberam PBS como controle negativo da reação. A Figura 4 mostra que o veneno
de L. intermedia induziu uma menor lesão dermonecrótica, durante as 72 horas, do
que as peçonhas de L. gaucho e L.laeta.
O potencial neutralizante dos soros anti-Aracnídico e anti-SMases D foi
avaliado pela metodologia utilizada no Setor de Controle de Qualidade do Instituto
Butantan, SP. Para este ensaio, 3 mg dos venenos de L. intermedia, L. gaucho ou
L. laeta foram inoculados no dorso de coelhos pela via intradérmica,
concomitantemente, a injeção endovenosa de 1 mL dos soros teste na diluição de
1:15. A eficiência neutralizante dos soros foi determinada pela inibição do
desenvolvimento da lesão dermonecrótica durante as 72 horas.
A Figura 5 A mostra que os soros Anti-Aracnídico e Anti-SMases D foram
igualmente eficientes em neutralizar a atividade dermonecrótica do veneno de
L. gaucho ao longo das 72 horas. No entanto, para os venenos de L. intermedia e
L. laeta, o soro anti-SMases D se mostrou mais eficiente na neutralização (Figuras 5
B e C, respectivamente).
A atividade neutralizante dos soros sobre a atividade dermonecrótica foi
também testada em ensaios in vitro - in vivo, nos quais a atividade remanescente
das amostras de venenos pré-incubadas com os soros normal (diluição 1:15), anti-
43
43
Aracnídico ou anti-SMases D, nas diluições de 1:15, 1:30, 1:45, 1:60, 1:75, 1:90 e
1:120 foi determinada em coelhos, após 72 horas da inoculação intradérmica das
misturas.
Os resultados obtidos mostram que o soro anti-SMases D apresentou
potencial neutralizante significantemente maior que o anti-Aracnídico para o veneno
de L. laeta e similar para os venenos de L. gaucho e L. intermedia (Figuras 5 D, E,
F, respectivamente).
FIGURA 4: ATIVIDADE DERMONECRÓTICA INDUZIDA PELOS VENENOS DE
LOXOSCELES. Coelhos foram inoculados, pela via intradérmica, com 3 mg
dos venenos de Loxosceles. As áreas das lesões foram determinadas
durante o período de 72 horas após inoculação. Os resultados foram
expressos com as médias das áreas das lesões, determinadas em três
ensaios independentes.
0 24 48 72
0
25
50
75
100
125
150
L.gaucho
L.intermedia
L.laeta
Tempo [h]
Área [cm
2
]
44
44
FIGURA 5: SORONEUTRALIZAÇÃO DA ATIVIDADE DERMONECRÓTICA INDUZIDA PELOS
VENENOS DE Loxosceles. Ensaio “in vivo”: Grupos de coelhos foram inoculados com
3 mg dos venenos de L. gaucho [A], L. intermedia [B], L. laeta [C] e,
concomitantemente, injetados com 1 mL dos soros anti-Aracnídico (О) ou anti-SMases
D (●), diluídos 1:15 pela via endovenosa diluídos. As áreas das lesões foram
determinadas durante o período de 72 horas após inoculação. Ensaio “in vitro in vivo”:
Amostras contendo 5 mg dos venenos de [D] L. gaucho, [E] L. intermedia e [F) L. laeta
incubadas por 1 h a 37ºC com diluições crescentes dos soros anti-Aracnídico (□) e anti-
SMases D (■) e, a seguir, centrifugadas a 14.000 rpm, por 15 min. Os sobrenadantes
foram inoculados, pela via intradérmica no dorso dos coelhos. As áreas das lesões
dermonecróticas foram mensuradas, às 72 horas após a inoculação. Os resultados
foram expressos com as médias das áreas das lesões e as porcentagens de
soroneutralização, determinadas em três ensaios independentes (*p<0,05).
1:15 1:30 1:45 1:60 1:75 1:90 1:120
0
25
50
75
100
*
*
D
Diluições dos soros
Soroneutralização [%]
1:15 1:30 1:45 1:60 1:75 1:90 1:120
0
25
50
75
100
*
*
E
Diluições dos soros
Soroneutralização [%]
1:15 1:30 1:45 1:60 1:75 1:90 1:120
0
25
50
75
100
* * * *
*
*
Diluições dos soros
Soroneutralização [%]
F
0 24 48 72
0
25
50
75
100
A
Tempo [h]
Soroneutralização [%]
0 24 48 72
0
25
50
75
100
B
*
Tempo [h]
Soroneutralização [%]
0 24 48 72
0
25
50
75
100
C
*
*
Tempo [h]
Soroneutralização [%]
45
45
4.3.3 DA ATIVIDADE HEMOLÍTICA
Amostras de eritrócitos humanos foram incubadas com concentrações
crescentes dos venenos de L. intermedia, L. laeta e L. gaucho por 30 minutos a
37ºC. Após várias lavagens das células, foram adicionados tampão ou soro humano
normal, como fonte de complemento, e as placas incubadas por 60 minutos a 37ºC.
A extensão da lise celular foi determinada e a porcentagem de hemólise calculada. A
Figura 6 mostra que os venenos das três espécies de Loxosceles foram capazes de
tornar os eritrócitos humanos susceptíveis à lise mediada por complemento
autólogo, de forma dose dependente. Na concentração de 3 µg/mL, todos os
venenos induziram hemólises com valores entre 70 e 100% e, com base nesses
dados, esta concentração foi selecionada para ser utilizada nos ensaios de
soroneutralização da atividade hemolítica.
A clivagem de glicoforina C é um evento fundamental para a ocorrência da
hemólise dependente de complemento, induzida por ação indireta das SMases D do
veneno de Loxosceles sobre as superfícies dos eritrócitos (TAMBOURGI et al.,
2000). Tal evento foi utilizado para se avaliar o potencial neutralizante dos soros
com relação ao fenômeno de hemólise dependente de complemento. Para tanto, 3
µg dos venenos de Loxosceles e diluições (1:15; 1:150; 1:750 e 1:1500) dos soros-
teste (anti-Aracnídico, anti-SMases D ou anti-Botrópico) foram incubados com os
eritrócitos humanos a 37ºC por 1 hora. Como controle positivo e negativo das
reações, amostras de eritrócitos foram incubadas somente com veneno ou tampão,
respectivamente. Após esse período, as células foram lavadas e incubadas com
anticorpo monoclonal anti-GPC e, subseqüentemente, com conjugado marcado com
fluoresceína.
46
46
A Figura 7 A mostra que o soro anti-Aracnídico somente foi mais eficaz, do
que o anti-SMases D, em inibir a indução da remoção de GPC dos eritrócitos
tratados com o veneno de L. gaucho; para as peçonhas de L. intermedia e L. laeta, o
soro anti-SMases D apresentou maior potencial neutralizante desta atividade. Nas
mesmas condições experimentais o soro anti-botrópico não foi capaz de neutralizar
tal ação (dados não mostrados).
O potencial neutralizante dos soros frente à capacidade de ligação das
SMases D dos venenos de Loxosceles às membranas dos eritrócitos humanos, foi
avaliado através de ensaios de citometria de fluxo. Assim, amostras contendo os
venenos de L. intermedia, L. laeta ou L. gaucho, e as diluições de 1:15; 1:150; 1:750;
1:1500 dos soros-teste (anti-Botrópico, anti-Aracnídico ou anti-SMases D) foram
adicionadas a amostras da suspensão de hemácias humanas. Posteriormente,
essas misturas foram incubadas a 37
o
C por 30 minutos sob agitação. Como
controles, hemácias foram incubadas, pelo mesmo período, com tampão ou
venenos, na ausência de anticorpos. Após várias lavagens, as células foram
incubadas com anticorpos anti-SMases D e a seguir com antissoro conjugado
marcado com fluoresceína.
Os resultados mostram que o soro anti-SMases D foi mais eficiente em inibir a
ligação das toxinas dos três venenos de Loxosceles à membrana dos eritrócitos
humanos, em todas as diluições testadas, quando comparado ao soro anti-
Aracnídico (*p<0.05) (Figura 7 B). Nas mesmas condições experimentais o soro
anti-botrópico não foi capaz de neutralizar tal atividade (dados não mostrados).
47
47
FIGURA 6: HEMÓLISE DEPENDENTE DE COMPLEMENTO INDUZIDA PELOS
VENENOS DE Loxosceles. Amostras de eritrócitos humanos pré-tratadas
com concentrações crescentes dos venenos de L. gaucho, L. intermedia e L.
laeta foram incubadas com soro humano normal e a hemólise determinada.
Resultados representativos de dois ensaios independentes.
0 1 2 3
0
25
50
75
100
L. gaucho L. intermedia L. laeta
Venenos [mg/mL]
Hemólise [%]
48
48
A B
1:15 1:150 1:750 1:1500
0
25
50
75
100
*
*
*
L. gaucho
Diluições dos Soros
Soroneutralização [%]
1:15 1:150 1:750 1:1500
0
25
50
75
100
L. gaucho
Diluições dos soros
Soroneutralização [%]
1:15 1:150 1:750 1:1500
0
25
50
75
100
*
L. intermedia
Diluições dos soros
Soroneutralização [%]
1:15 1:150 1:750 1:1500
0
25
50
75
100
L. intermedia
Dluições dos soros
Sororneutralização [%]
1:15 1:150 1:750 1:1500
0
25
50
75
100
*
*
L. laeta
Diluições dos soros
Soroneutralização [%]
1:15 1:150 1:750 1:1500
0
25
50
75
100
L. laeta
Diluições dos soros
Soroneutralização [%]
FIGURA 7: SORONEUTRALIZAÇÃO DA ATIVIDADE HEMOLÍTICA INDUZIDA PELOS
VENENOS DE Loxosceles. [A] Inibição da remoção de GPC dos eritrócitos,
induzidas pelos venenos de L. gaucho, L. intermedia e L. laeta pelos soros anti-
Aracnídico (□) ou anti-SMases D (■); [B] Inibição da ligação das SMases D dos
venenos de L. gaucho, L. intermedia e L. laeta, às membranas de eritrócitos
humanos pelos soros anti-Aracnídico (□) e anti-SMases D (■). Resultados
representativos de dois ensaios independentes. *p<0,05
49
49
4.3.4 DA ATIVIDADE ESFINGOMIELINÁSICA D
A determinação da atividade esfingomielinásica dos venenos de Loxosceles
foi realizada pelo método descrito por TOKUMURA et al. (2002). A Figura 8 revela
que os venenos das três espécies foram capazes de hidrolisar esfingomielina de
forma dose-dependente. No entanto, tal atividade parece ser maior em L. gaucho,
uma vez que concentrações inferiores a 250 ng deste veneno foram capazes de
hidrolisar o substrato, com uma intensidade duas vezes maior do que a dos venenos
de L. intermedia e L. laeta. Para os ensaios de soroneutralização da atividade
esfingomielinásica foi utilizada a dose de 1 mg, uma vez que com essa foram obtidos
valores semelhantes de hidrólise do substrato para os três venenos de Loxosceles.
A neutralização da atividade esfingomielinásica dos venenos de Loxosceles
pelos soros-teste, anti-Aracnídico e anti-SMases D e pelo controle negativo, o soro
anti-Botrópico, foi realizada incubando-se amostras de 1 µg dos venenos de L. laeta,
L. intermedia ou L. gaucho com os soros puros ou diluídos. Após o período de
incubação, as amostras foram centrifugadas e os sobrenadantes incubados com
esfingomielina e a hidrólise determinada.
A Figura 9 mostra que o soro anti-SMases D tem maior potencial
neutralizante para a atividade esfingomielinásica presente no veneno de L. laeta, do
que o anti-Aracnídico, e uma melhor ação inibitória para o de L. intermedia nas
maiores diluições. Para o veneno de L. gaucho, o soro anti-Aracnídico foi mais eficaz
na neutralização dessa ação do que o soro anti-SMases D. Nas mesmas condições
experimentais o soro anti-botrópico não foi capaz de neutralizar significativamente tal
atividade (0-10% de neutralização – dados não mostrados).
50
50
0 250 500 750 1000
0
250
500
750
L.gaucho L.intermedia L.laeta
Veneno [ng]
Unidades Arbitrárias
de Fluorescência
FIGURA 8: ATIVIDADE ESFINGOMIELINÁSICA DOS VENENOS DE LOXOSCELES.
Amostras contendo concentrações crescentes dos venenos de Loxosceles
foram incubadas com esfingomielina. Após 30 minutos a 37ºC, foi adicionada a
solução contendo colina-oxidase e as reações de hidrólise foram quantificadas
em fluorímetro de placa. Resultados representativos de dois ensaios
independentes.
51
51
Puro 1:5 1:15 1:30 1:45 1:60 1:75 1:90 1:120
0
25
50
75
100
* *
*
*
*
A
Diluições dos soros
Soroneutralizaçã [%]
Puro 1:5 1:15 1:30 1:45 1:60 1:75 1:90 1:120
0
25
50
75
100
*
*
B
Soroneutralização [%]
Diluições dos soros
Puro 1:5 1:15 1:30 1:45 1:60 1:75 1:90 1:120
0
25
50
75
100
*
*
*
*
*
*
*
C
Soroneutralização [%]
Diluições dos soros
FIGURA 9: DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ESFINGOMIELINÁSICA RESIDUAL DAS
AMOSTRAS DOS VENENOS DE Loxosceles. Amostras dos venenos L.
gaucho [A], L. intermedia [B] e L. laeta [C] foram incubados por 1 hora com os
soros anti-Aracnídico (□) e anti-SMases D (■) e centrifugadas a 14.000 rpm por
15 minutos. Posteriormente, os sobrenadantes foram incubados com o
substrato, as reações de hidrólise mensuradas e a porcentagem de
neutralização calculada. Resultados representativos de dois ensaios
independentes. *p<0,05
52
52
5 DISCUSSÃO
O envenenamento por aranhas do gênero Loxosceles é a forma mais grave
de araneísmo no Brasil, principalmente nas regiões Sudeste e Sul do país
(FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, 1998). O veneno destas aranhas causa lesão
dermonecrótica e/ou desencadeia reação sistêmica, cujas características mais
graves são a hemólise, coagulação intravascular além da possível evolução para
insuficiência renal aguda. Entre as espécies de Loxosceles existentes no Brasil, três
são consideradas de importância médica devido à alta incidência de acidentes a elas
atribuída: L. gaucho, a principal responsável por acidentes no estado de São Paulo,
L. intermedia e L. laeta espécies que estão presentes nos estados do Paraná e
Santa Catarina, respectivamente (CARDOSO et al., 1998; CADERNO DE SAÚDE
DE CURITIBA, 1993).
Os venenos das aranhas Loxosceles são uma mistura de vários componentes
protéicos. Esses venenos possuem uma composição complexa, contendo diferentes
toxinas. Nas diferentes espécies de Loxosceles a presença da esfingomielinase D
(32-35 KDa) foi associada aos principais efeitos cutâneos e sistêmicos do
envenenamento, como dermonecrose e hemólise intravascular. TAMBOURGI et al.,
(2002 e 2004) clonaram e expressaram as SMases D dos venenos L. intermedia (P1
e P2) e de L. laeta (SMase I) e verificaram que o soro experimental produzido frente
essas toxinas tinha a capacidade de reconhecer os venenos brutos das três
espécies de Loxosceles de importância médica no Brasil. OLVERA, et al., 2007
utilizando esfingomielinases D recombinantes de importância médica nas Américas
(L. laeta, L. boneti e L. reclusa), produziu um soro equino e observou o potencial e a
reatividade cruzada e potencial neutralizante da atividade enzimática para os
53
53
venenos dessas três espécies, ressaltando a proposta do soro específico anti-
SMases D recombinantes.
Baseado nesses dados e com o propósito de tentar melhorar a qualidade do
soro produzido para a terapia humana nos casos de loxoscelismo, o Laboratório de
Imunoquímica em conjunto com a Divisão Bioindustrial do Instituto Butantan utilizou
as SMases D recombinantes de Loxosceles intermedia e Loxosceles laeta na
imunização de cavalos para a produção de um novo soro, denominado de anti-
Esfingomielinases D. De forma geral, este soro foi produzido baseado em métodos
estabelecidos pelo setor de Divisão Bioindustrial do Instituto Butantan.
Resumidamente, para tanto, para cada toxina foram imunizados dois cavalos, que
ao longo de sete imunizações tiveram os títulos de anticorpos determinados. Após o
sétimo ciclo de imunização, foram selecionados para a composição do soro anti-
SMases D os soros dos cavalos com os melhores títulos frente às toxinas
recombinantes. Os soros escolhidos foram tratados com ácido caprílico para
isolamento da fração IgG e a seguir com pepsina para remoção da fração Fc das
imunoglobulinas. O produto final preparado pela Divisão Bioindustrial do Instituto
Butantan, correspondente à mistura dos soros individuais purificados, foi esterilizado
por filtração e aliquotado em frascos de 2 mL. Como já mencionado em Material e
Métodos o processo de produção do soro anti-SMases D está protegido por patente.
A partir da produção deste antissoro foi definido o objetivo do presente estudo
que consistiu na avaliação do potencial neutralizante do soro eqüino anti-SMases D
sobre as ações tóxicas dos venenos das aranhas Loxosceles, comparando-o ao do
anti-Aracnídico, utilizado na terapia para loxoscelismo no Brasil.
Como avaliado por ELISA, os soros foram capazes, embora com títulos
variáveis, de reconhecer as peçonhas de L. gaucho, L. laeta e L. intermedia. Essa
observação está de acordo com os dados obtidos por BÁRBARO et al. (1994) que
54
54
mostraram que o soro anti-Aracnídico e um outro soro experimental anti-Loxosceles
(produzido frente os venenos das três espécies acima mencionadas) eram capazes
de reagir com os três venenos.
Analisando individualmente os títulos de anticorpos presentes nos soros para
os venenos de Loxosceles, os dados mostram que o soro anti-SMases D apresentou
títulos mais altos para o veneno de L. intermedia, menor para o veneno de L. gaucho
e igual título para o veneno de L. laeta, quando comparado ao anti-Aracnídico. Para
as toxinas recombinantes o soro anti-SMases D apresentou títulos significativamente
superiores frente às toxinas P2 de L. intermedia e SMase I de L. laeta. O fato dos
dados mostrarem títulos elevados para as toxinas, quando comparado aos venenos,
já era esperado (TAMBOURGI et al., 2004), visto que os animais são imunizados
com essas toxinas. Entretanto é importante ressaltar que o soro anti-SMases D,
apesar de ser produzido frente a toxinas purificadas, apresentou títulos similares ou
iguais quando comparado ao anti-Aracnídico produzido contra o veneno total,
ressaltando a importância do reconhecimento desse componente tóxico nos
venenos de Loxosceles.
A análise eletroforética dos venenos mostrou que eles possuem perfis
distintos de proteínas em sua composição. Entretanto, as proteínas na faixa de
massa molecular em torno de 32-35 kDa, correspondente as SMases D, estão
presentes nos três venenos. Variações inter e intra-espécies foram também
descritas por DE OLIVEIRA et al. (1999, 2005) composição das peçonhas de
machos e fêmeas de L. intermedia e L. laeta
e por PRETEL et al. (2005) de
L. gaucho e L. adelaida.
A análise do perfil de reconhecimento dos venenos pelos soros testes foi
realizada por Western blot. Como resultado, foi observado que o soro anti-
Aracnídico teve maior capacidade de reconhecer os componentes dos venenos de
55
55
Loxosceles. O soro anti-SMases D, por outro lado, reagiu com componentes na faixa
de massa molecular entre 30-35 kDa. Essas observações já eram esperadas, uma
vez que o soro anti-Aracnídico foi produzido frente ao veneno total de L. gaucho e o
anti-SMases D contra as isoformas recombinantes de L. intermedia e L. laeta. Ainda,
para o veneno de L. laeta, o soro anti-SMases D teve a capacidade de reconhecer
componentes na faixa 65 kDa, que podem corresponder a dímeros de SMases D ou
outras moléculas com epítopos comuns.
Dados da literatura mostram que as classes de imunoglobulinas encontradas
no soro de cavalo são comuns à maioria dos mamíferos, i.e., IgA, IgE, IgM e IgG
(HELMS et al., 1970; ROCKEY et al., 1970) e, em eqüinos, a classe IgG possui
várias subclasses denominadas de IgGa, IgGb, IgGc e IgG(T). Segundo MC
DOUGALL et al. (1975), as subclasses IgGa e IgG(T) são as predominantes e
representam mais de 80% das subclasses de IgG no soro eqüino e que essas são
as responsáveis pela neutralização de toxinas circulantes.
A partir dessas informações, analisamos a presença dessas subclasses de
IgG nos soros eqüinos testes por ELISA de captura. Os resultados obtidos
mostraram a presença das subclasses de IgGa, IgGb, IgGc e IgG(T) nos soros
testes e títulos mais elevados dessas subclasses no soro anti-SMases D, quando
comparados ao anti-Aracnídico. Títulos elevados, principalmente de IgGa e IgG(T),
têm sido associados à melhor capacidade neutralizante de soros produzidos contra
venenos de serpentes (Bothrops sp e Crotalus sp) (FERNANDES et al., 1991 e
1997), escorpião (Tityus serrulatus) e aranhas (Loxosceles gaucho e Phoneutria
nigriventri) (TORO et al., 2006).
Após a caracterização dos soros, foram realizados ensaios de neutralização
das atividades tóxicas induzidas pelos venenos de Loxosceles em modelos in vivo e
in vitro.
56
56
Uma das atividades tóxicas dos Loxosceles é a dermonecrose que pode ser
induzida em modelos experimentais como coelhos e cobaios (ATKINS et al., 1958;
MORGAN et al., 1969). Tal atividade foi determinada para as partidas de venenos
utilizadas, pela inoculação de 3 mg das peçonhas de Loxosceles (Dose Mínima
Necrosante para a de L. gaucho – DMN – estabelecida pelo Setor de Controle de
Qualidade do Instituto Butantan), no dorso de coelhos adultos e as lesões
acompanhadas durante 72 horas. Nessa análise foi mostrado que as partidas dos
venenos de L. gaucho, L. intermedia e L. laeta coletadas foram capazes de induzir
dermonecrose, sendo que o de L. intermedia apresentou menor capacidade de
induzir lesão do que os venenos de L. laeta e L. gaucho. Essas observações estão
de acordo com os dados de Oliveira et al. (2005) que mostraram diferenças na
toxicidade local e sistêmica induzidas pelos venenos de L. intermedia e L. laeta.
Com base na técnica desenvolvida por Furlanetto et al. (1961) e usada pelo
Setor de Controle de Qualidade do Instituto Butantan, para determinação da
capacidade neutralizante do soro anti-Aracnídico, realizamos o ensaio de
neutralização “in vivo” da atividade dermonecrótica, com pequenas modificações. O
método original consiste na inoculação de 3 µg do veneno de Loxosceles gaucho,
pela via intradérmica, em uma das orelhas de coelhos adultos e da injeção
concomitante, pela via endovenosa, de 1 mL do soro teste diluído 1:15, na outra
orelha; a leitura da reação e, conseqüente, determinação da atividade neutralizante
do soro, é realizada somente 24 horas pós-inoculação. Em nosso laboratório, o
método foi modificado para inoculação dos venenos pela mesma via de
administração, mas no dorso depilado dos coelhos, a fim de permitir uma mais
precisa mensuração das lesões que foram realizadas ao longo de 72 horas para o
melhor acompanhamento do processo de soroneutralização. Assim, foi observado
que o soro anti-SMases D foi mais eficiente na neutralização da ação
57
57
dermonecrótica do veneno de L. laeta do que o anti-Aracnídico. Para o veneno de
L. intermedia, o soro anti-SMases D foi capaz de conter mais eficientemente o
desenvolvimento da reação dermonecrótica nas primeiras 48 horas, sendo que, às
72 horas, percentuais semelhantes de neutralização foram determinados para os
dois soros.
Apesar de ter sido possível perceber diferenças no potencial neutralizante dos
antissoros por meio desta metodologia, para sua realização com sucesso é
necessário profissional experiente na administração endoveneosa e implica em
maior desconforto para o animal que recebe duas inoculações quase que
concomitantemente.
Outra metodologia disponível para análise do potencial neutralizante de soros
consiste na pré-incubação do veneno com diluições seriadas do soro teste e,
posteriormente, após centrifugação para remoção dos imunocomplexos, na
inoculação das misturas em animais. Tal metodologia foi utilizada por Bárbaro et al.
(2005) para analisar o potencial neutralizante de soros anti-Loxoscélicos produzidos
no Brasil. Os soros utilizados foram: o anti-Loxosceles produzido pelo Centro de
Produção e Pesquisa de Imunobiológicos do Paraná (produzido contra os venenos
de L. gaucho, L. intermedia e L. laeta) e o soro anti-Aracnídico (produzido pela
imunização com o veneno de L. gaucho, Phoneutria nigriventri e Titys serrulatus),
fabricado pela Divisão de Produção Bioindustrial do Instituto Butantan. Como
resultados de soroneutralização esse trabalho mostrou que tais antivenenos eram
capazes de neutralizar a atividade dermonecrótica em 100% dos venenos de L.
gaucho, L. intermedia, L. laeta e L. reclusa.
Usando tal metodologia e analisando os resultados 72 horas após a
inoculação, para uma melhor determinação da atividade residual do veneno,
verificamos que o soro anti-SMases D teve maior capacidade de neutralização do
58
58
que o anti-Aracnídico para os venenos de L. intermedia e L. laeta, sendo que para
esse último o soro anti-SMases D foi capaz de inibir em 100%, em todas as diluições
testadas. Entretanto, para o veneno de L. gaucho os dois soros apresentaram
potencial neutralizante similar até a diluição de 1:75, sendo na de 1:90 e 1:120, o
soro anti-Aracnídico se mostrou mais eficiente. Esses dados complementam os
dados obtidos nos ensaios in vivo de soroneutralização da atividade dermonecrótica,
mostrando a o melhor reconhecimento do soro anti-SMases D para os venenos de
L. intermedia e L. laeta.
A hemólise e as alterações na superfície celular foram utilizadas como
parâmetro para medir o potencial neutralizante dos soros frente ao efeito sistêmico
dos venenos de Loxosceles. Eritrócitos humanos foram incubados com
concentrações crescentes dos venenos e em seguida incubados com soro humano
autólogo, como fonte de proteínas da cascata do sistema do complemento. Os
resultados obtidos mostram que os três venenos de Loxosceles foram capazes de
induzir hemólise dependente de complemento e a dose de 3 µg eleita para os
ensaios de soroneutralização, pois esta induziu percentuais de lise entre 70 e 100.
Tambourgi et al. (2000 e 2002) mostraram que os venenos de Loxosceles
transformam as hemácias humanas em células ativadoras das vias alternativa e
clássica do sistema do complemento autólogo após a ligação das SMases D às suas
superfícies celulares. A falha da regulação deste sistema deve-se à remoção das
porções ricas em ácido siálico das glicoforinas e perda de assimetria de membrana
(TAMBOURGI et al., 2000; 2002; 2007). Assim, o mecanismo proposto pelos autores
para explicação da hemólise intravascular que ocorre nos casos de envenenamento
sistêmico, envolve a clivagem de esfingomielina, presente na superfície dos
eritrócitos, por ação esfingomielinásica das isoformas ativas dos venenos, seguida
da ativação de uma protease de membrana que teria a capacidade de clivar as
59
59
porções extracelulares das glicoforinas, o que permite a ativação da via alternativa
do complemento com conseqüente hemólise. Os dados obtidos por estes autores
ainda ressaltam a importância das glicoforinas, principalmente GPC, na manutenção
da regulação da ativação de complemento autólogo. Por outro lado, a ligação das
SMases à superfície das hemácias e clivagem do substrato induz perda de
assimetria da membrana, com exposição de fosfatidilserina na face externa, o que
permite a ativação da via clássica do Complemento.
Com base nesses achados e impossibilitados tecnicamente de medir o
potencial neutralizante dos soros em ensaios hemolíticos, uma vez que a presença
de anticorpos e ou imunocomplexos na reação poderia levar: 1) ativação do
Complemento em fase fluida e, conseqüente, consumo ou lise reativa, 2) a ativação
do Complemento na superfície dos eritrócitos e, conseqüente hemólise, por
interação de C1 aos anticorpos dos soros teste que interagiram com as SMases D
ligadas membranas. Qualquer um desses eventos geraria falsos resultados, e por
isso foram utilizados como parâmetros para avaliar o potencial neutralizante dos
soros sobre a atividade indutora de hemólise dos venenos, as análises de remoção
de GPC e a ligação das SMases às membranas dos eritrócitos.
Nestes ensaios amostras de venenos foram incubadas junto com as diluições
crescentes dos soros-teste foram adicionadas aos eritrócitos humanos. Como
controle, foram testadas também amostras de veneno incubadas com soro eqüino
não relacionado aos venenos de Loxosceles, ou seja, o anti-Botrópico. Após esse
período, as células foram extensivamente lavadas e marcadas com anticorpo
monoclonal dirigido contra a porção extracelular da GPC (BRIC 4) e a fluorescência
determinada por citometria de fluxo.
Os resultados obtidos revelaram que o soro anti-Botrópico não teve a
capacidade de inibir a remoção de GPC da membrana dos eritrócitos tratados com
60
60
os venenos de Loxosceles, o que já era esperado, tendo em vista que este não é um
soro específico para estas peçonhas. Para os soros testes os resultados mostraram
que o soro anti-SMases D teve maior capacidade de inibir a remoção de GPC da
membrana de eritrócitos tratados com o veneno de L. laeta e L. intermedia, quando
comparado ao soro anti-Aracnídico. No entanto, para o veneno de L. gaucho, o soro
anti-SMases D não inibiu com eficiência a remoção de GPC.
Essas observações podem ser em parte correlacionadas com os resultados
da inibição da ligação das SMases D à membrana dos eritrócitos, pelos quais foi
verificado que o soro anti-SMases D teve maior capacidade de inibir a ligação
dessas enzimas do que o anti-Aracnídico. Esse fato é importante, uma vez que a
ligação de SMases D à membrana de células é um dos eventos principais para o
desenvolvimento do loxoscelismo. Entretanto, apesar do soro anti-SMases D ter a
capacidade de inibir esse evento para os três venenos estudados, quantidades
residuais de SMase D ligadas às membranas, mas não detectáveis pelos métodos
aqui utilizados, podem ser as responsáveis pela remoção de GPC detectada nas
células tratadas com amostras do veneno de L. gaucho pré-incubadas como soro
anti-SMases D.
Alternativamente, pode-se supor que as SMases D de L. intermedia e L. laeta
possam eficazmente induzir anticorpos contra as porções responsáveis pela ligação
destas toxinas, das três espécies de Loxosceles, mas menos eficientemente contra
o sítio ativo. Tal fato resultaria no impedimento da ligação das SMases D presentes
no veneno de L. gaucho às membranas, mas parte delas, não totalmente
neutralizadas e em fase solúvel, seriam ainda capazes de hidrolisar esfingomielina
de membrana, ativar as proteases endógenas e causar a remoção de GPC
observada nas células tratadas com veneno de L. gaucho pré-incubado com soro
anti-SMases D nas diluições de 1:150, 1:750 e 1:1500.
61
61
A atividade esfingomielinásica é responsável pelo efeito dermonecrótico e
hemolítico dependente de sistema do complemento dos venenos de Loxosceles
(FORRESTER et al., 1998; KURPIEWSKI et al., 1981; TAMBOURGI et al., 1998,
TAMBOURGI et al., 2000; FERNANDES-PEDROSA et al., 2002; TAMBOURGI et al,
2004; TAMBOURGI et al, 2005, 2007).
A análise de atividade esfingomielinásica, presente nos venenos das três
espécies de Loxosceles, revelou que todos são capazes de hidrolisar esfingomielina
de forma dose-dependente, sendo que o de L. gaucho foi o mais ativo, uma vez que
concentrações de 150 ng desse produziram hidrólise significativa do substrato, fato
não observado para outros venenos. Por outro lado, amostras de 1 mg das três
peçonhas produziram valores semelhantes de hidrólise da esfingomielina, o que nos
levou a definir esta dose como aquela a ser utilizada nos ensaios de
soroneutralização desta atividade.
Assim, amostras de 1 µg dos venenos foram incubadas com os soros-teste,
nas mesmas diluições utilizadas no ensaio de neutralização da atividade
dermonecrótica in vitro-in vivo. As amostras dos sobrenadantes das reações foram
incubadas com o substrato esfingomielina, para determinação da atividade residual
das SMases D presentes nos venenos. Os resultados obtidos revelaram que,
embora o soro anti-Aracnídico tenha sido mais eficiente do que o anti-SMases D em
neutralizar a atividade esfingomielinásica do veneno de L. gaucho até a diluição de
1:60 e de L. intermedia e L. laeta até 1:15, nas demais diluições, a atividade
neutralizante foi similar ou superior para o soro anti-SMases D.
Olvera et al., 2006 mostraram que o soro produzido contra SMases D
recombinantes de L. laeta, L. reclusa e L. boneti, quando utilizado na diluição de 1:2,
foi capaz de neutralisar a atividade esfingomielinásica presente nos venenos de L.
laeta, L. reclusa e L. boneti.
62
62
Analisando-se comparativamente os resultados obtidos nos ensaios de
soroneutralização das atividades dermonecrótica (in vitro-in vivo) e
esfingomielinásica, que utilizaram as mesmas diluições dos soros, observa-se que
apesar de haver neutralização total e/ou parcial da dermonecrose pelos soros, foi
ainda detectada uma significante atividade esfingomielinásica residual nos venenos,
ressaltando a importância de métodos com maior sensibilidade para determinação
da capacidade neutralizante dos soros. Assim, o método fluorimétrico aqui
padronizado, para medição do potencial neutralizante de soros antivenenos de
Loxosceles, é uma alternativa rápida, reprodutível, de alta sensibilidade, que abole o
uso de animais de experimentação e que poderá ser usada para o controle de
qualidade em substituição ao, atualmente, utilizado que é o da soroneutralização da
atividade dermonecrótica em ensaios in vivo.
Com base nos resultados obtidos podemos concluir que o soro anti-SMases D
foi mais eficiente na neutralização das atividades dermonecrótica,
esfingomielinásica, de indução da remoção de GPC e da ligação das SMases D à
membrana de eritrócitos humanos, dos venenos de L. intermedia e L. laeta, do que o
anti-Aracnídico. Entretanto, para o veneno de L. gaucho o soro anti-SMases D
apresentou neutralização similar ou menor para as atividades tóxicas do que o anti-
Aracnídico. Tais dados, portanto, sugerem que para melhorar o potencial
neutralizante do soro anti-SMases D frente a todos os venenos de Loxosceles com
importância médica no Brasil para ser utilizado na terapia humana, toxinas do
veneno de L. gaucho devem ser incluídas na mistura de imunização dos cavalos.
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