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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM ENGENHARIA MECÂNICA
“ANÁLISE COMPARATIVA DA EMISSÃO DE LUZ POR LED E LASERS
EMITINDO NO VERMELHO DO ESPECTRO ELETROMAGNÉTICO NA
REDUÇÃO DE BACTÉRIAS PERIODONTOPATOGÊNICAS”.
ESTUDO “IN VITRO”
GERDAL ROBERTO DE SOUSA
Orientador: Prof. Dr. Marcos Pinotti Barbosa
Belo Horizonte
2007
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM ENGENHARIA MECÂNICA
“ANÁLISE COMPARATIVA DA EMISSÃO DE LUZ POR LED E LASERS
EMITINDO NO VERMELHO DO ESPECTRO ELETROMAGNÉTICO NA
REDUÇÃO DE BACTÉRIAS PERIODONTOPATOGÊNICAS”.
ESTUDO “IN VITRO”
GERDAL ROBERTO DE SOUSA
Orientador: Prof. Dr. Marcos Pinotti Barbosa
Tese apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Mecânica da Universidade Federal de Minas Gerais,
como requisito para a obtenção do título de
Doutor em Engenharia Mecânica.
Belo Horizonte
2007
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Dedicatória,
Aos meus pais, cuja dedicação
e retidão construíram o exemplo
que procuro seguir em todos os dias
da minha vida;
A Marcia, por ser a luz que ilumina
meus passos, pelo apoio constante, incentivo
e pelas meninas Isabella, Bárbara e Camila
razão do meu esforço.
“O s hom ens não percebem que tudo pertence a todos.
A vida é um a benção que D eus concede, distribuindo
todos os bens igualm ente, sem fazer seleção. O hom em
é que criou os lim ites e as prerrogativas”.
P .E . Paulo
Agradecimentos,
Ao meu orientador e amigo, Prof. Dr. Marcos Pinotti Barbosa por
acreditar em mim e pela valiosa ajuda no desenvolvimento e realização desta
tese.
Ao Prof. Dr. Roberto Márcio de Andrade, pelo estímulo e
confiança em mim depositados.
Aos Professores da Engenharia Mecânica, pela atenção e amparo.
Aos Professores Maria Auxiliadora Roque de Carvalho e Dr. Luiz
Macedo de Farias por abrir as portas do Laboratório de Microbiologia Oral e
Anaeróbios do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, para que este trabalho se
concretizasse.
Ao Prof. Dr. Maurício Veloso Brant Pinheiro e ao Gustavo Catão
Alves pela imensa ajuda nos experimentos executados no Laboratório de
Ressonância Paramagnética do Departamento de Física do Instituto de
Ciências Exatas da UFMG.
A prima e amiga Betânia Maria Soares pela enorme cooperação e
apoio.
A amiga Patrícia Ranger Queiroz
Santos pelo carinho no auxílio
nos experimentos no laboratório.
Aos amigos e companheiros Profs. José Cláudio Faria Amorim,
Lívio de Barros Silveira, Marcos Vinicius Lucas Ferreira e Renato Araújo
Prates pela ajuda de todas as horas.
A Walquiria Lopes Borges pela presteza que nos ajudou no
Departamento de Micologia do ICB/UFMG.
Às empresas mmoptics e Ecco Fibras pelo empréstimo dos
equipamentos utilizados neste experimento.
A todos que de alguma maneira ajudaram-me na realização deste
trabalho.
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar a sensibilização letal in vitro das
bactérias periodontopatogênicas (Fusobacterium nucleatum, Actinobacillus
Actinomycetemcomitans e Prevotella intermedia), através da utilização de
lasers e LED (Light Emitting Diode) no processo de redução bacteriana,
utilizando como fotossensibilizador azul de toluidina (TBO) a 0,01%. Os
resultados estatísticos obtidos pelo Teste t-student demonstraram que os
grupos de terapia fotodinâmica (PDT) (grupos 6, 7, 8) são diferentes do grupo
controle para p=0,05 e os valores percentuais de redução bacteriana dos
grupos PDT foram de 99,8% no grupo 6, 81,9% no grupo 7 e 99,8% no grupo 8
para o Actinobacillus actinomycetemcomitans, de 93,7% no grupo 6, 84% para
o grupo 7 e 99,8% no grupo 8 para o Fusobacterium nucleatum e 26,3% no
grupo 6, 38,6% no grupo 7 e 49,5% no grupo 8 para a Prevotella intermédia,
demonstrando assim, que o corante azul de toluidina 0,01% associado aos
lasers e ao LED apresenta um excelente potencial para a utilização em PDT,
na sensibilização letal dessas bactérias nos parâmetros utilizados no
experimento (∆t=3minutos).
Palavras chaves – Bactérias periodontopatogênicas, terapia fotodinâmica,
senssibilização letal.
SUMÁRIO
Página
Lista de Tabelas vi
Lista de Figuras viii
Lista de Siglas ou Abreviaturas xiv
1 – Introdução 01
2 – Objetivo 07
3 - Revisão de Literatura 08
3.1 – Bactérias periodontopatogênicas submetidas à
fotossensibilização
08
3.1.1 – Actinobacillus actinomycetemcomitans
08
3.1.2 – Fusobacterium nucleatum
09
3.1.3 - Prevotella intermedia
09
3.2 – Mecanismo de ação da terapia fotodinâmica 10
3.2.1 - Tipos de destruição bacteriana 13
3.3 – Corantes (fotossensibilizadores) 14
3.3.1 – O Azul de Toluidina 15
3.3.2 – Concentração do fotossensibilizador 16
3.3.3 – Tempo de pré-irradiação 17
3.4 - Aplicação da Terapia Fotodinâmica na Periodontia 17
4 – Materiais e Métodos 27
5 – Resultados e Discussão 44
6 – Conclusão 67
7 – Sugestões para trabalhos futuros 68
Referências Bibliográficas 70
Anexo 1 – Fontes de Luz 79
Anexo 2 – Espectroscopia 89
Anexo 3 - Medidas descritivas da transmissividade do Laser 1,
Laser 2 e LED para a água (baseline) e os corantes azul de
toluidina (TBO), verde de malaquita (VM) e azul de metileno
(MB) utilizados no experimento 1.
91
Anexo 4 - Medidas descritivas pelo Método Visual e Digital
utilizadas no experimento
95
LISTA DE TABELAS
Tabela 4.1 – Tabela dos grupos utilizados no experimento e sua
descrição e simbologia utilizada
39
Tabela 5.1 – Potência transmitida (τ) da linha de base e do
corante obtida pelo experimento 1 com o corante TBO a 0,01%
avaliado para os equipamentos (Laser 1 – Grupo 6, Laser 2 –
Grupo 7e LED – Grupo 8).
47
Tabela 5.2 - Medidas descritivas visuais das UFCs para todas
as bactérias em triplicata (Aa1, Aa2 e Aa3 - Actinobacillus
Actinomycetemcomitans), (Fn1, Fn2 e Fn3 - Fusobacterium
nucleatum) (Pi1, Pi2 e Pi3 - Prevotella intermedia); dos grupos
de G1-10
2
a G8.
49
Tabela 5.3 – Medidas descritivas da contagem visual para os
grupos em triplicata mostrando percentualmente as colônias
viáveis e sua redução para o Actinobacillus
actinomycetemcomitans.
51
Tabela 5.4 - Medidas descritivas da média, desvio padrão e erro
padrão para Actinobacillus actinomycetemcomitans.
51
Tabela 5.5 – Medidas descritivas da contagem visual para os
grupos em triplicata mostrando percentualmente as colônias
viáveis e sua redução para o Fusobacterium nucleatum
53
Tabela 5.6 - Medidas descritivas da média, desvio padrão e erro
padrão para o Fusobacterium nucleatum.
53
Tabela 5.7 – Medidas descritivas da contagem visual para os
55
grupos em triplicata mostrando percentualmente as colônias
viáveis e sua redução para a Prevotella intermedia
Tabela 5.8 - Medidas descritivas da média, desvio padrão e erro
padrão para Prevotella intermedia
55
Tabela 5.9 – Medidas descritivas para a probabilidade de
significância (p<0,05) para as bactérias Actinobacillus
actinomycetemcomitans (Aa), Fusobacterium nucleatum (Fn) e
Prevotella intermédia (Pi) dos grupos 6, 7 e 8 em relação ao
grupo 1 (controle) utilizando-se o Teste t student entre as
amostras avaliadas presumindo variâncias semelhantes.
(Utilizou-se um nível de significância de 0,05 (p=0,05), onde os
valores de p < 0,05 são considerados diferentes).
59
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 – Figura mostrando do lado esquerdo uma sonda
periodontal dentro do sulco gengival penetrando até no
máximo 3mm evidenciando a saúde do periodonto e do lado
direito a sonda periodontal penetrando mais que 3mm
configurando a presença de bolsa periodontal que é um sinal
clínico da doença periodontal (nota-se a destruição óssea que
é uma característica da periodontite)
02
Figura 1.2 – O agente fotossensibilizador é depositado dentro
da bolsa periodontal com auxílio de uma seringa (imagem
esquerda) e com auxílio de uma fibra ótica a luz do laser em
baixa intensidade é irradiado dentro da bolsa periodontal
(imagem direita).
06
Figura 3.1 - Diagrama de Jablonski - Esquema da transferência
de elétrons pelos mecanismos Tipo I e Tipo II com produção
de oxigênio singleto, ânions superóxidos e hidroxilas por
fluorescência e fosforescência.
.
11
Figura 3.2 - Valores de comprimento de onda máximo de
absorção (λ
abs
) e emissão (λ
em
) em nanômetros, bem como o
deslocamento de Stokes (∆ ) para o corante azul de toluidina
(TBO), T=298K.
16
Figura 3.3 - Representação da estrutura química da molécula do
azul de toluidina (TBO).
16
Figura 4.1 – Câmera digital fixa à estativa dentro do Fluxo
Laminar onde foram feitas as fotos das placas com bactérias
para a contagem eletrônica
27
Figura 4.2 - Laser em baixa inten. Quantum -Ecco (Laser nº1)
28
Figura 4.3 - Laser em baixa intensidade Twinlaser - mmoptics
(Laser n.2)
28
Figura 4.4 - Equipamento de LEDs – FISIOLED – mmoptics –
São Paulo
29
Figura 4.5 - Espectrofotômetro JEN WAY Spectrophotometer
640, EUA
29
Figura 4.6 –– Power Meter - NOVA – Ophir Optronics,
Jerusalém – Israel
30
Figura 4.7 - Bactérias utilizadas no experimento (Actinobacillus
actinomycetemcomitans - ATCC 29525, Fusobacterium
nucleatum - ATCC 25586 e Prevotella intermedia – ATCC
25611).
31
Figura 4.8 – Azul de Toluidina a 0,1% (TBO) - Sigma, St. Louis,
MO., EUA.
31
Figura 4.9 – Cubas de acrílico com água e com os corantes
avaliados.
33
Figura 4.10 - Colocação da ponteira em acrílico do equipamento
de LED em posição e do outro lado da cuba o Power Meter para
mensurar a potência transmitida.
33
Figura 4.11 - Imagem do experimento mostrando além do
sensor o equipamento de medição (Power Meter)
34
Figura 4.12 - Imagem do laser 2 (grupo 7) com a ponta
encostada na cuba de acrílico com TBO a 0,01% mostrando o
feixe sendo absorvido.
35
Figura 4.13 - Imagem do display digital do Power Meter
medindo a potência transmitida pela cuba com o corante.
Figura 4.14 - Análise Visual para Mc Farland 0,5 onde a
densidade óptica do meio no Falcon tem que coincidir
visualmente com o tubo padrão da Escala de Mc Farland
35
36
Figura 4.15 - Gráfico com as curvas de absorbância
1
(densidade
óptica) das bactérias envolvidas no experimento em relação aos
comprimentos de onda entre 380 e 900nm.
37
Figura 4.16 - Foto mostrando os 08 grupos, onde os grupos 1,
3, 4, 5 contém 2ml de suspensão sem TBO (tubos com líquido
incolor) e os grupos 2,6,7,8 onde foram adicionados o corante
TBO (proporção 1:10).
38
Figura 4.17 - Tubos de ensaio sendo irradiados com laser 2 e
LED apoiados em um suporte de laboratório.
40
Figura 4.18a - Procedimento mostrando o momento das
diluições de 10
8
UFC/ml para 10
3
UFC/ml dentro do fluxo
laminar para manter o meio sem contaminação.
41
Figura 4.18b - Diluição até 10
3
UFC/ml sendo mostrado em um
tubo do Tipo Eppendorf (com tampa), antes de ser levado à
placa de Petri.
41
Figura 4.19 - Procedimento de semeadura do meio com as
bactérias na placa de Petri, procedimento este também feito na
câmara do fluxo laminar. Após a semeadura o meio é espalhado
em toda a placa com auxílio de um Drigausk (bastão de vidro).
41
Figura 4.20 - Câmara de anaerobiose onde as placas de Petri
ficam incubadas por 48 horas a 35ºC e após este período é
então feita a contagem visual dos pontos com UFCs.
42
Figura 4.21a – Marcação com caneta hidrográfica azul para
contagem visual das UFCs
43
Figura 4.21b - Contagem eletrônica – Prog. IMAGEPRO-PLUS
6.0.
43
Figura 5.1 – Potência aplicada e potência transmitida para o
Laser 1, com seus respectivos desvios padrões.
44
Figura 5.2 – Potência aplicada e potência transmitida para o
Laser 2, com seus respectivos desvios padrões.
45
Figura 5.3 – Potência aplicada e potência transmitida para o
LED, com seus respectivos desvios padrões.
46
Figura 5.4 - Contagem das UFC/ml dos grupos avaliados, para
as bactérias onde Aa1, Aa2, Aa3 são as medidas para o
Actinobacillus actinomycetemcomitans em triplicata, Fn1, Fn2 e
Fn3 para o Fusobacterium nucleatum em triplicata e Pi1, Pi2 e
Pi3 para a Prevotella intermedia em triplicata.
50
Figura 5.5 - Redução bacteriana do Actinobacillus
actinomycetemcomitans em escala logarítmica e os desvios
padrões para os grupos analisados.
52
Figura 5.6 - Redução bacteriana do Fusobacterim nucleatum em
escala logarítmica e os desvios padrões para os grupos
analisados.
54
Figura 5.7 - Redução bacteriana da Prevotella intermedia em
escala logarítmica e os desvios padrões para os grupos
analisados.
56
Figura 5.8 - Número de células viáveis nos grupos de bactérias
(Fusobacterium nucleatum em vermelho, Actinobacillus
actinomycetemcomitans em verde e Prevotella intermedia em
azul) para os grupos investigados.
57
Figura 5.9 - Percentual de redução bacteriana atingida no
experimento para as três bactérias Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Fusbacterium nucleatum e Prevotella
intermedia nos Grupos 6 (PDT L1), Grupo 7 (PDT L2) e Grupo 8
(PDT LED).
58
Figura 5.10 - Amostras para contagem de Fusobacterium
nucleatum na placa de Petri onde se observa que nos grupos 1,
2, 3, 4 e 5 o número de pontos correspondentes às colônias
bacterianas é muito maior que nos grupos PDT (grupos 6,7,8)
60
Figura 5.11 - Amostras para contagem de Actinobacillus
actinomycentencomitans na placa de Petri onde se observa que
nos grupos 1, 2, 3, 4 e 5 o número de pontos correspondentes
às colônias bacterianas é muito maior que nos grupos PDT
(grupos 6,7,8) ressaltando que no grupos 6 praticamente não
foi constatado nenhuma colônia e no grupo 8 somente uma.
61
Figura 5.12 – Amostras para contagem de Prevotella intermedia
na placa de Petri onde se observa que nos grupos 1, 2, 3, 4 e 5
o número de pontos correspondentes às colônias bacterianas é
maior que nos grupos PDT (grupos 6,7,8) e o grupo 8 o número
de colônias é bem menor do que os outros dois grupos PDT
(grupos 6 e 7)
62
Figura 5.13 - Imagens de microscopia ótica das lâminas coradas
pelo método de Gram das amostras de Fusobacterium
nucleatum (Fn), Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) e
Prevotella intermédia (Pi) dos grupos 1 (inóculo) e dos grupos
PDT (grupos 6,7 e 8) onde pode-se avaliar pela imagem que os
grupos 6,7 e 8 quando comparados com o grupo 1 (inóculo) vê-
se um número muito menor de pontos corados demonstrando
menos bactérias viáveis.
63
Figura 5.14 – As imagens mostram a transmissão da luz no
grupo sem corante (5.14a) e a absorção da luz pelo corante
TBO a 0,01% (5.14b) para o Laser 1.
64
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
a: coeficiente de absorção óptica
Aa: Actinobacillus actinomycetemcomitans
AlPcS
2
: ftalociacina dissulfonada de alumínio
AsGa: arseneto de gálio
AsGaAl: arseneto de gálio alumínio
ATP: adenosina-trifosfato
BHI: Brain Heart Infusion
ºC: graus Celsius
cm: centímetro
cm² : centímetro quadrado
CO
2
: dióxido de carbono
CW: continous wave
DNA: ácido desoxirribonucleico
et al..: et al.li, e colaboradores
ex: exemplo
Fn: Fusobacterium nucleatum
H
2
O
2
: água oxigenada
HeNe: hélio-neon
Hz: hertz
I: intensidade
J: joules
J/cm
2
: joules por centímetro quadrado
LED(s) (Light Emitting Diode – Diodos Emissores de Luz)
LLLT: low level laser therapy
LILT: low intensity laser therapy
m: metro
MB: Metilene Blue
mg: miligramas
min: minutos
mm: milímetro
mm²: milímetro quadrado
ml:mililitro
mW: miliwatts
mW/cm²: miliwatts por centímetro quadrado
mJ: milijoules
MEV: microscopia eletrônica de varredura
µg/ml: microgramas por mililitro
µm: micrômetro
µW: microwatts
nm: nanômetro
¹O
2
- oxigênio no estado singleto
3
T – oxigênio no estado tripleto
PDT –Photodynamic Therapy (Terapia fotodinâmica)
Pi: Prevotella intermedia
PIT: Pré irradiation time – Tempo de pré-irradiação
pH: potencial hidrogeniônico
p/v: por volume
s: segundos
t: tempo
TBO – Toluidine Blue (azul de toluidina)
TAB: tabela
UFC(s): Unidades formadoras de colônia(s)
UFC/ml: Unidades formadoras de colônia por mililitro
EUA: Estados Unidos da América
V: volts
VM: verde de malaquita
W: watts
W/cm²: watts por centímetro quadrado
λ : comprimento de onda
τ: transmissividade
1 – Introdução
A doença periodontal é considerada o segundo problema da odontologia
em saúde pública, e hoje representam uma importante complicação na saúde
geral do indivíduo sendo relacionada a uma série de doenças sistêmicas com
infarto agudo do miocárdio, bacteremias transitórias, endocardites bacterianas,
nascimento de bebês de baixo peso, partos prematuros e pneumonia por
aspiração de partículas contaminadas, além de dificultar o controle metabólico
em pacientes portadores de diabete melito (GROSSI et al., 1994).
A doença periodontal é uma doença inflamatória que afeta os tecidos de
suporte dos dentes, levando à perda óssea e do ligamento periodontal.
Resulta da interação de fatores determinantes locais, como o biofilme dental ou
placa bacteriana, com a presença de bactérias periodontopatogênicas, do
hospedeiro e de fatores ambientais responsáveis pela sua progressão e esta
infecção representa também forte risco sistêmico, pois a liberação de
mediadores inflamatórios na corrente sanguínea pode desencadear uma série
de respostas pelo organismo. Alterações, como infartos agudos do miocárdio e
rompimento de trombos vasculares, vêm sendo pesquisados e fortemente
relacionados a infecções periodontais (FIG. 1.1) (BECK et al. 1994).
Figura 1.1 – Figura mostrando do lado esquerdo uma sonda periodontal dentro do sulco
gengival penetrando até no máximo 3mm evidenciando a saúde do periodonto e do lado direito
a sonda periodontal penetrando mais que 3mm configurando a presença de bolsa periodontal
que é um sinal clínico da doença periodontal (nota-se a destruição óssea que é uma
característica da periodontite) Fonte:http://www.perioufmg.com.br/comunidade_artigo001.htm.
Acesso em 14/07/2006.
A placa bacteriana envelhece através do crescimento das espécies
aderidas e pela colonização e o crescimento de espécies adicionais. Nesta
sucessão ecológica do biofilme, existe uma transição do meio ambiente
aeróbico inicial, caracterizado por espécies gram-positivas facultativas para um
meio ambiente privado de oxigênio, no qual os microrganismos gram-negativos
anaeróbicos predominam. (KOLENBRANDER e LONDON, 1993).
A microbiota geralmente encontrada na placa bacteriana na doença
periodontal difere da encontrada no tecido saudável, sendo a maioria delas
gram-negativas e anaeróbicas estritas. Certas espécies são encontradas
comumente em regiões abaixo do tecido gengival lesado pela doença
periodontal, entre elas o Actinobacillus actinomycetemcomitans, a Prevotella
intermedia e o Fusobacterium nucleatum. Estas bactérias são proteolíticas e
podem degradar os tecidos gengivais e/ou componentes de defesa do
hospedeiro incluindo proteínas regulatórias que são a chave da resposta
inflamatória (MARSH e MARTIN, 2005).
Apesar das dificuldades inerentes na caracterização da microbiota das
doenças periodontais, um pequeno grupo de patógenos é reconhecido devido à
sua associação com a doença periodontal. Avanços tecnológicos na
microbiologia molecular melhoraram a habilidade de detectar bactérias
específicas e seus produtos, os quais podem servir de marcadores da doença
em atividade ou para previsão de futura doença (HAAKE, 1997).
Exames microbiológicos da periodontite crônica foram realizados tanto
em estudos seccionais cruzados como longitudinais; estes últimos foram
conduzidos tanto com como sem tratamento. Estes estudos apóiam o conceito
de que a periodontite do adulto está associada com agentes bacterianos
específicos. O exame microscópico da placa de sítios com periodontite tem,
consistentemente, revelando proporções elevadas de espiroquetas. O cultivo
de microrganismos da placa de sítios com periodontite de adulto revela
porcentagens de espécies anaeróbicas (90%) e gram-negativas (75%)
(SLOTS, 1977, SLOTS, 1979).
Na periodontite crônica, os microrganismos mais frequentemente
cultivados em altos níveis incluem P.gingivalis, B. forsythus, P. intermedia, C.
rectus, E. corrodens, F. nucleatum, A. Actinomycetemcomitans, P. micros e
espécies de Treponema e Eubacterium (LAI et al., 1987, LOESCHE, 1985).
Quando sítios ativos periodontalmente (isto é, com perda de inserção recente)
foram examinados em comparação com sítios inativos (ou seja, sem perda de
inserção), C. rectus, P. gingivalis, P. intermedia, B. forsythus e F. nucleatum
foram encontrados em níveis elevados nos sítios ativos (DZINK et al., 1988).
Além do mais, níveis detectáveis de P. gingivalis, P. intermedia, B. forsythus, C.
rectus e A. actinomycetemcomitans estão associados com a progressão da
doença (DZINK et al., 1988), e a eliminação de patógenos bacterianos
específicos com a terapia está associada à resposta clínica melhorada
(CHRISTERSSON et al., 1991). Demonstrou-se que tanto P. gingivalis quanto
A. actinomycetemcomitans invadem tecidos celulares do hospedeiro, o que
pode ser significativo nas formas agressivas da periodontite do adulto
(CARRANZA et al., 1983).
A microbiota associada com a periodontite agressiva é composta,
predominantemente, de bacilos gram-negativos capnofílicos e anaeróbicos
(NEWMAN e SOCRANSKY, 1976, NEWMAN e SOCRANSKY, 1977). Estudos
microbiológicos indicam que quase todos os sítios de Periodontite Agressiva
abrigam A. actinomycetemcomitans, o qual pode constituir quase 90% da
microbiota total cultivável (KORNMAM e ROBERTSON, 1985, MOORE, 1987).
Outros organismos encontrados em níveis significativos são P. gingivalis, E.
corrodens, C. rectus, B. capillus, Eubacterium brachy, espécies de
Capnocytophaga e espiroquetas (KORNMAM e ROBERTSON, 1985,
MICHALOWICZ et al., 2000).
O tratamento e a prevenção da doença periodontal envolvem boa
higiene oral, que pode ser melhorada pelo uso de agentes antimicrobianos
(MARSH e MARTIN, 2005).
Jolkovsky e Ciancio (1997) relataram que o uso de antibióticos no
tratamento das doenças periodontais é baseado em sua natureza infecciosa.
Entretanto, há dificuldade na identificação dos microrganismos associados com
as várias desordens periodontais, dificultando, assim, a escolha do antibiótico.
Além disso, os autores acima mencionados citaram que Gibson
2
(1982) afirma
que um antibiótico para o uso no tratamento periodontal tem de ser específico
para os patógenos periodontais, alogênico e atóxico, possuir substantividade,
não ser usado com freqüência em outros tratamentos nem ser caro.
Atualmente não existe antibiótico ideal na escolha em questão. Apesar de
muitas bactérias orais serem susceptíveis a alguns, eles não inibem todos os
patógenos periodontais nas concentrações alcançadas nos líquidos do fluido
gengival. Portanto, torna-se necessária uma combinação de antibióticos para
eliminar tais patógenos de uma bolsa periodontal. Quanto ao uso local de
antibióticos, apesar da vantagem de serem direcionados para sítios
específicos.
Nas últimas décadas antimicrobianos locais têm sido utilizados na
tentativa de tratar as infecções associadas à periodontite. Irrigação local e
dispositivos de liberação controlada, com antibióticos e anti-sépticos, foram
desenvolvidos e avaliados como tratamento único, ou adjunto ao tratamento
mecânico (raspagem a alisamento das raízes dos dentes). A utilização de
antimicrobianos locais seria uma opção de tratamento, já que traria os
seguintes benefícios: maior concentração da droga no local, redução de efeitos
2
Gibson W. Antibiotics and periodontal disease: a selective review of the literature. J Am Dent
Assoc 1982 104:213.
sistêmicos, diminuição do risco de resistência em outros locais do organismo,
além de ser opção de tratamento antimicrobiano para pacientes não
cooperadores para a antibioticoterapia sistêmica. Por outro lado, a eficácia do
antimicrobiano local estará na dependência do tempo de contato entre a droga
e o microrganismo alvo e da concentração adequada desta dentro da bolsa
periodontal (LOTUFO et al., 2005).
A terapia fotodinâmica para a redução de bactérias periodontais pode
ser um novo caminho, pois é baseada no princípio de que uma substância
fotoativável, um fotossensibilizador (corante), liga-se à célula alvo e é ativada
por uma luz com comprimento de onda específico (ressonante com o corante).
Neste processo se formam radicais livres ou oxigênio singleto que produzem
efeito tóxico para a célula (FIG. 1.2) (PFITZNER et al., 2004).
As primeiras fontes de luz utilizadas em terapia fotodinâmica foram às
lâmpadas convencionais, com luz não coerente e policromática, com forte
componente térmico associada. Com o desenvolvimento dos lasers, esta fonte
de luz se mostrou mais eficiente que as lâmpadas por serem monocromáticos e
coerentes no tempo e espaço. Os lasers em baixa intensidade podem ser
associados à fotossensibilizadores conhecidos, com bandas de absorção
ressonantes ao comprimento de onda do laser usado, sendo assim capazes de
absorver a maior parte da radiação emitida pela fonte de luz (ACKROYD et al.,
2001).
O laser apresenta características particulares que o diferem das demais
fontes luminosas, como monocromaticidade, caracterizada pala emissão de
fótons com o mesmo comprimento de onda e, portanto, se estiverem no
espectro visível apenas uma cor; coerência, além da direcionalidade, definida
pela capacidade da luz de se propagar em uma única direção (ANEXO 1)
(SOUSA, 2001).
Uma fonte de luz alternativa para a terapia fotodinâmica são os LEDs
(Light Emitting Diode – Diodos Emissores de Luz), que também são
monocromáticos e se diferem dos lasers por terem seu feixe de luz divergente
e que surgem como uma nova opção (ANEXO 1).
Na Periodontite, como em outras infecções localizadas, de pouca
profundidade e de microbiota conhecida, o uso da terapia fotodinâmica pode
ser uma alternativa de tratamento através da redução das bactérias
periodontopatogênicas da bolsa periodontal e diversos estudos, in vitro e in
vivo, documentam a validade da terapia (RIBEIRO, et al. 2005).
Figura 1.2 – O agente fotossensibilizador é depositado dentro da bolsa periodontal com auxílio
de uma seringa (imagem esquerda) e com auxílio de uma fibra ótica a luz do laser em baixa
intensidade é irradiado dentro da bolsa periodontal (imagem direita).
Fonte: Modificado de www.periowave.com Acesso em 14/07/2006.
2- Objetivo
2.1 – Objetivo Geral
Comparar a sensibilização letal das bactérias periodontopatogênicas
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia e Fusobacterium
nucleatum com a utilização de Lasers e LED no processo de redução
bacteriana in vitro, tendo como fotossensibilizador o corante azul de toluidina
(TBO) a 0,01%.
2.2 – Objetivos Específicos
- Avaliação quantitativa visual e através de um sistema de
aquisição de imagens digital, das unidades formadoras de colônias por mililitro
(UFC/ml), em triplicata nas placas de Petri;
- Análise dos resultados obtidos e avaliação comparativa entre os
grupos irradiados ou não pela técnica de terapia fotodinâmica para os três
equipamentos usados.
3 – Revisão de Literatura
3.1 – Bactérias periodontopatogênicas submetidas a
fotossensibilização
3.1.1 - Actinobacillus actinomycetemcomitans
O Actinobacillus actinomycetemcomitans foi isolado pela primeira vez
pelo microbiologista alemão Klinger, em 1912, de lesões de actimicose
cervicofacial. Apresentam aspectos morfológicos internos em forma de estrela
e as células são cocobacilos não móveis, gram-negativas e que fermenta
açucares, tendo como nicho ecológico à placa bacteriana. Está intimamente
ligado à patogênese da doença periodontal, sendo sempre encontrado em
grandes quantidades nas Periodontites Agressivas, que é uma forma grave da
doença periodontal. O tratamento que resulta na eliminação do Actinobacillus
actinomycetemcomitans dos locais subgengivais pode ser correlacionado com
a melhora clínica. (GENCO et al. 1996).
A terapia efetiva para a infecção subgengival causada por esta bactéria
e, assim, para a doença periodontal devida a esse microrganismo,
necessariamente implica no uso de antibioticoterapia em combinação com
cirurgias periodontais. (ZAMBON et al. 1981).
O Actinobacillus actinomycetemcomitans foi implicado na etiologia de
formas particularmente agressivas de doença periodontal em adolescentes.
Tem sido descrito como sendo microaerofílico, capnofílico ou anaeróbico
facultativo, apesar de parecer que cresce melhor em atmosfera aeróbica
enriquecida com 5-10% de CO
2.
O Actinobacillus actinomycetemcomitans é
também um patógeno oportunista, sendo isolado de casos de endocardite
infecciosa, abscessos do cérebro e subcutâneos, osteomielite e doença
periodontal. (MARSH e MARTIN, 2005).
3.1.2 - Fusobacterium nucleatum
Outro grande grupo de bactérias Gram-negativas anaeróbicas
obrigatórias pertence ao gênero Fusobacterium ssp. As células possuem
caracteristicamente a forma de filamentos longos (5-25µm de comprimento) e
incluem as seguintes espécies orais: F. alocis e F. sulci, do sulco gengival
normal e F. periodonticum, de áreas com doença periodontal. A espécie isolada
mais comum, contudo, é o Fusobacterium nucleatum. As fusobactérias
requerem meios ricos para crescimento e são muitas vezes descritas como
sendo assacarolíticas, embora possam utilizar carboidratos para síntese de
compostos intracelulares de armazenamento compostos de poliglicose. As
fusobactérias catabolizam aminoácidos como o aspartato, glutamato, histidina
e lisina para obter energia; esta pode ser obtida do metabolismo de peptídeos,
caso aminoácidos livres não estejam disponíveis. O principal produto do
metabolismo é o butirato, juntamente com baixas concentrações de outros
ácidos (por exemplo, succinato, acetato, lactato, entre outros). O
Fusobacterium nucleatum é capaz de remover enxofre da cisteína e metionina
para produzir amônia, butirato, sulfito de hidrogênio e metilmercaptana. Os dois
últimos compostos são altamente fétidos e estão implicados no odor associado
com a halitose. As fusobactérias são capazes de co-agregar com a maioria das
outras bactérias orais e, consequentemente, acredita-se que sejam importantes
organismos de ponte entre os colonizadores iniciais e tardios durante a
formação da placa bacteriana (MARSH e MARTIN, 2005).
3.1.3 – Prevotella intermedia
A maioria dos bacilos gram-negativos anaeróbicos orais foi colocada
originalmente no gênero Bacteróides. Contudo, estudos taxonômicos
mostraram que este gênero deveria ter uma definição mais restrita, com seus
membros restritos àqueles do grupo B. fragilis, que são encontrados
predominantemente no intestino. Os organismos orais assacarolíticos e
sacarolíticos foram colocados nos gêneros Porphyromonas e Prevotella,
respectivamente. A nova classificação dos Bacteróides implicou que várias
cepas fossem colocadas no gênero Prevotella. As espécies dentro deste grupo
são moderadamente sacarolíticas, produzindo ácido acético, succínico e outros
ácidos da glicose. Este novo gênero inclui as espécies pigmentadas P.
intermedia, P. nigrescens, P. melaninogenica e outras cepas. As cepas de P.
intermedia geralmente têm maior atividade peptidase e estão associadas mais
com a doença periodontal (MARSH e MARTIN, 2005).
3.2 - Mecanismo de ação da terapia fotodinâmica
De acordo com Garcez Segundo et al. (2003), a terapia fotodinâmica
ou PDT (Photodynamic Therapy) consiste na associação de um agente
fotossensibilizante, normalmente exógeno, a uma fonte de luz com o objetivo
de provocar necrose celular, utilizada para tratamento de tumores e para morte
microbiana. O mecanismo de ação faz com que o agente fotossensibilizante
absorva os fótons da fonte de luz. Sendo assim, seus elétrons passam a um
estado excitado (camada mais externa) (FIG. 3.1). Na presença de um
substrato, como é o caso do oxigênio, o agente fotossensibilizante, ao retornar
ao estado natural, transfere energia, formando espécies altamente reativas e
de vida curta, como é o caso do oxigênio singleto (
1
0
2
). Este pode provocar
danos a microrganismos, pela oxidação irreversível de componentes celulares,
como membrana celular, mitocôndrias e núcleo celular.
FIGURA 3.1 - Diagrama de Jablonski - Esquema da transferência de elétrons pelos
mecanismos Tipo I e Tipo II com produção de oxigênio singleto, ânions superóxidos e
hidroxilas por fluorescência e fosforescência. Fonte: Gutknecht; Eduardo, 2004
p.232.
Segundo Malik et al., (1990) o dano celular induzido pelas reações
fotoativadas é o resultado da formação de espécies reativas de oxigênio.
Inicialmente se forma o oxigênio singleto (
1
O
2
). A absorção de um fóton de luz
vai levar as moléculas do corante a um estado singleto excitado. Essas
moléculas passam por um sistema intermediário e chegam a um estado tripleto
excitado, em que as moléculas mais estáveis vão interagir, na água, com o
oxigênio, gerando o oxigênio singleto (
1
O
2
). Além dessas reações, o corante do
estado tripleto excitado pode sofrer outras reações formando radicais livres,
hidroxilas e superóxidos.
Como foi demonstrado por Zanin e Gonçalves (2003), a maioria das
bactérias orais não absorve a luz visível de alguns tipos de laser que operam
em baixa potência. Portanto, utiliza-se um agente de absorção óptica não-
tóxico que se fixe à parede bacteriana, atraindo para si a luz laser no momento
da irradiação. Isso é essencial para que o laser terapêutico tenha ação
antimicrobiana sobre as bactérias orais. Durante a terapia fotodinâmica, as
bactérias expostas ao fotossensibilizador são irradiadas por uma luz de
comprimento de onda compatível, o que promove a absorção de fótons pelo
So
SoSo
So
h
hh
h
SIC
SICSIC
SIC
T
TT
T
1
11
1
P
PP
P
S1
S1S1
S1
Cl
ClCl
Cl F
FF
F
Mecanismo tipo 1:
Reação redox com biomoléculas, produção de
superóxido, etc.
Mecanismo tipo 2:
Mediada por oxigênio singleto, por exemplo,
peroxidação de lípídios, hidroxilação de
guanosina
Onde:So=estado fundamental singleto;S1=primeiro estado singleto excitado;SIC=inter-sistemas cruzados;
T1=primeriro estado tripleto excitado;F=fluorescência;P=fosforecência;CI=conversão interna:
So
SoSo
So
h
hh
h
SIC
SICSIC
SIC
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P
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S1S1
S1
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ClCl
Cl F
FF
F
Mecanismo tipo 1:
Reação redox com biomoléculas, produção de
superóxido, etc.
Mecanismo tipo 2:
Mediada por oxigênio singleto, por exemplo,
peroxidação de lípídios, hidroxilação de
guanosina
Onde:So=estado fundamental singleto;S1=primeiro estado singleto excitado;SIC=inter-sistemas cruzados;
T1=primeriro estado tripleto excitado;F=fluorescência;P=fosforecência;CI=conversão interna:
corante, em virtude do estado de excitação. A seguir, a energia é transmitida
para as moléculas vizinhas, determinando a formação de moléculas reativas,
como o oxigênio singleto, íons superóxidos, hidroxilas e outros radicais livres,
que danificam e até matam as células bacterianas. O fotossensibilizador
funciona como um agente de absorção óptica, sendo essencial usar um
corante adequado ao comprimento de onda do laser utilizado, para assegurar
que ele não apresente danos aos tecidos.
Bhatti et al. (1998) relatam que o mecanismo de ação pelo qual o
corante associado ao laser de baixa intensidade causa morte celular ainda não
está totalmente compreendido. Existem duas hipóteses:
1) Transferência direta de elétrons entre corante e moléculas
biológicas;
2) Transferência de energia, pela excitação do corante, para as
moléculas de oxigênio, resultando na formação de oxigênio singleto.
Segundo Wilson (1993), um requisito importante, na
fotossensibilização letal, é que o tempo de vida útil do substrato excitado seja
suficiente para permitir a interação com as moléculas vizinhas para, assim,
produzir espécies citotóxicas. O autor lembra que, para a terapia fotodinâmica
ser apta a combater doenças periodontais, deve ser capaz de eliminar as
bactérias presentes no biofilme.
Mais especificamente, o mecanismo Tipo I acontece quando o composto
fotoativo no estado singleto (S
1
) ou tripleto (T
1
) pode, por reações de oxidação
e redução com diferentes biomoléculas, ser foto-reduzido a ânion radical, que
por transferência de um elétron à molécula de oxigênio, gera espécies reativas
como peróxidos (ROO
-
), ânion superóxido (O
2
-
), ânion radical hidroxila (OH
-
),
provocando a destruição da membrana ou de macromoléculas. Finalmente o
fotossensibilizador volta para seu estado fundamental. No mecanismo Tipo II, a
molécula no estado T
1
transfere sua energia para a molécula de oxigênio cujo
estado fundamental é tripleto (
3
O
2
), formando finalmente seu estado excitado
singleto (
1
O
2
). O oxigênio singleto é o fator intermediário no processo
fotodinâmico, sendo o principal responsável pela inativação da célula. O
1
O
2
pode induzir várias reações em cadeia com componentes moleculares da
célula, tais como: DNA, proteínas, fosfolipídios da membrana celular,
mitocôndrias e lisossomos, tendo como resultado a morte da célula, e de um
modo geral a destruição do tecido (BORISSEVITCH e SCHABERLE, 2006).
O fator que determina se vai ocorrer reações do Tipo I ou Tipo II, é a
competição entre o substrato e o oxigênio molecular pelo estado excitado do
sensibilizador. Em sistemas atualmente usados na clínica, a porcentagem de
ocorrência do mecanismo tipo I é de aproximadamente 10% enquanto a
ocorrência do mecanismo tipo II é de até 90 %. Este parâmetro pode variar,
dependendo, entretanto, das características do sensibilizador usado como da
natureza do alvo da sua ação (BORISSEVITCH e SCHABERLE, 2006).
A eficácia da terapia fotodinâmica é atribuída a reações bimoleculares
entre os estados excitados S
1
e T
1
do sensibilizador e as moléculas alvo ou de
oxigênio formando seu estado excitado. Por isso ela é maior quando os
rendimentos quânticos dos estados excitados são maiores e seus tempos de
vida são mais longos, pois neste caso a probabilidade de encontro entre a
molécula excitada do fotossensibilizador e de outro reagente é maior
(BORISSEVITCH e SCHABERLE, 2006).
3.2.1 - Tipos de destruição bacteriana (Necrose e apoptose)
A terapia fotodinâmica pode produzir apoptose ou necrose celular, ou
a combinação dos dois mecanismos, sendo que a maioria dos casos induz o
primeiro. A apoptose é também conhecida como “morte celular programada”.
Esse processo fisiológico de eliminação celular ocorre também na
embriogênese, na atrofia tecidual e na regressão tumoral, sendo a cromatina
condensada uma das características morfológicas. Limita a perda de material
intracelular e, desse modo, previne o processo inflamatório. Em contraste, a
necrose resulta de elevados danos celulares, com perda da integridade da
membrana plasmática, causando lises e dando início ao processo inflamatório
(PAZOS et al. 2003).
Além disso, a “morte celular programada” proporciona um mecanismo
de defesa por meio dos quais as células lesadas ou potencialmente perigosas
possam ser eliminadas para o bem do organismo para um todo. Células
infectadas por vírus sofrem frequentemente “morte celular programada”,
impedindo desta forma a produção de novas partículas virais e limitando a
disseminação do vírus através do organismo do hospedeiro (COOPER, 2001).
Segundo Ten Cate (2001), a apoptose é um tipo de morte celular que
resulta numa eliminação seletiva. Tal processo fisiológico caracteriza-se pela
condensação do DNA da célula e sua subseqüente fragmentação em
partículas ligadas à membrana, que são fagocitadas pelos macrófagos.
De acordo com Junqueira e Carneiro (1999), a morte celular por
apoptose é rápida e não deixa vestígios. Os fragmentos apoptóticos não
induzem os macrófagos a produzir moléculas sinalizadoras que
desencadeiam a resposta inflamatória nos tecidos vizinhos. Já na necrose, as
células incham, suas organelas também aumentam de volume e se rompem,
lançando o conteúdo no espaço extracelular. Na apoptose, ao contrário, os
fragmentos celulares estão sempre envoltos por membrana plasmática. Outro
ponto a considerar é que o conteúdo das células que morrem por necrose
também é fagocitado pelos macrófagos, mas estes secretam moléculas que
vão ativar outras células de defesa, que promovem a inflamação.
3.3 – Corantes (fotossensibilizadores)
De acordo com Garcez Segundo (2002), as pesquisas, no campo dos
corantes, se concentraram nas porfirinas, que têm estrutura química
heterocíclica, similar à da clorofila e da hemoglobina. Os fotossensibilizadores
ou corantes absorvem a luz na forma de fótons e transferem energia ao
oxigênio e a outras moléculas, resultando na liberação de substâncias
altamente reativas e de vida curta, que interagem com os sistemas biológicos,
provocando danos aos tecidos. No entanto a toxicidade dos
fotossensibilizadores mais utilizados em PDT ainda é elevada, tornando o uso
viável apenas em concentrações pequenas, o que diminui a absorção de luz e,
conseqüentemente, a eficácia. A procura por agentes fotossensibilizantes
menos tóxicos, de maior absorção, mais ressonantes com os comprimentos de
onda utilizados e mais eficientes tem sido uma constante no campo da terapia
fotodinâmica, tanto no tratamento de tumores, como na eliminação de
microrganismos. Assim, quanto mais próximos do ideal os novos agentes
fotossensibilizantes se mostrarem, melhor será a utilização do potencial da
terapia fotodinâmica na redução microbiana.
Bhatti et al. (1998) afirmaram que, como o corante de azul de toluidina
pode ser aplicado na bolsa periodontal com seringa de ponta romba e o laser,
com fibra óptica, a terapia fotodinâmica não é dolorosa, ao contrário de outros
procedimentos periodontais.
A possibilidade de um composto funcionar como fotossensibilizador é
determinada, em parte, pela sua capacidade de absorver luz do comprimento
de onda emitido pela fonte. Não é surpresa, pois, que o azul de toluidina seja
um eficiente fotossensibilizador associado ao laser de baixa intensidade de
HeNe, pois a sua absorção máxima está no comprimento de onda de 632,2nm,
ressonante ao da fonte de laser HeNe (Hélio-Neon), que é de 632,8nm. O
corante de azul de metileno, que tem sua absorção máxima sob o comprimento
de onda de 664nm, tem ainda uma apreciável absorção a 633nm. Contudo a
absorção deste é 10 vezes menor que a do azul de toluidina no comprimento
de onda do laser HeNe. Já os corantes derivados da hematoporfirina e a
ftalociacina dissulfonada de alumínio, a 632,8nm, não apresentam boa
absorção (WILSON, et al. 1993).
3.3.1 – O Azul de Toluidina
O azul de toluidina (FIG. 3.4) é um corante usado rotineiramente na
clínica médica e odontológica e apresenta a característica de interagir com
várias substâncias orgânicas, principalmente com o biofilme aderido aos
dentes.
A molécula deste corante é derivada da fenotiazina e os valores de
rendimento quântico de fluorescência do corante obtidos experimentalmente
em metanol (MeOH), etanol (EtOH), propanol-1 (PrOH) e butanol-1 (BuOH),
são respectivamente: 0,09, 0,10, 0,11 e 0,12; e os valores dos comprimentos
de onda máximo de absorção (λ
abs
) e emissão (λ
em
), e o deslocamento
espectral ou de Stokes (∆ ) dos corantes dependem da polaridade do solvente,
como pode ser visto nos dados apresentados na tabela a seguir (USACHEVA
et al., 2003) (OLIVEIRA et al., 2003).
Solventes MeOH EtOH PrOH BuOH
TBO (λ
λλ
λ
abs
) em
nm
627 629 630 631
TBO (λ
λλ
λ
em
) em
nm
650 646 647 650
∆ em cm
-1
564 418 417 463
Figura 3.2 - Valores de comprimento de onda máximo de absorção (λ
abs
) e emissão (λ
em
) em
nanômetros, bem como o deslocamento de Stokes (∆ ) para o corante azul de toluidina (TBO),
T=298K (USACHEVA et al. 2003).
Figura 3.3 – Representação da estrutura química da molécula do azul de toluidina
(TBO). Modificado de Oliveira et al., 2003 p.5.
N
S
N
CH
CH
H
3
C
N
H
H
3.3.2 - Concentração do fotossensibilizador
A concentração do corante é outro fator de relevância para o sucesso
da terapia. Devem ser utilizadas concentrações não tóxicas, ou seja, a
concentração escolhida não deve produzir danos ao alvo sem a ativação pela
fonte de luz (toxicidade no escuro). As concentrações utilizadas variam de um
fotossensibilizador para outro de acordo com as características químicas de
cada composto e de sua toxicidade. As concentrações típicas usadas em PDT
antimicrobiana são da ordem de µg/ml (Ribeiro et al., 2005).
3.3.3 - Tempo de pré-irradiação
A interação do agente fotossensibilizador com o substrato, muitas
vezes é um ponto crítico para o sucesso da terapia, uma vez que, se o
fotossensibilizador não estiver próximo ao alvo, sua ativação pela fonte de
energia resultará na formação das espécies tóxicas em local não desejado. O
tempo de pré-irradiação, que é o tempo entre a colocação do
fotossensibilizador no alvo e sua ativação pela fonte de luz, varia de acordo
com a interação desejada. Para a PDT anti-neoplásica, o fotossensibilizador é
aplicado via endovenosa e o tempo de pré-irradiação pode chegar a 48 horas.
Nas aplicações tópicas da PDT, principalmente antimicrobiana, espera-se que
o corante una-se ao microrganismo, ou mesmo chegue a ultrapassar a barreira
da membrana celular, localizando-se no citoplasma da célula ou mesmo
intercalando-se com o DNA do núcleo. Os tempos de pré-irradiação típicos
utilizados em PDT antimicrobiana vão de um a dez minutos (Ribeiro et al.,
2005).
3.4 - Aplicação da Terapia Fotodinâmica na Periodontia e outros
campos.
Wilson, Dobson e Harvey (1992) testaram in vitro vinte e sete
compostos fotossensibilizadores associados a um laser de HeNe com 7,5mW
de potência, avaliando a capacidade de sensibilizar e eliminar as bactérias
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Streptococos sanguis, Fusobacterium
nucleatum e Porphyromonas gingivalis. Dentre esses compostos estudados, os
corantes azul de toluidina, azul de metileno e cloridrato azure B nas
concentrações de 0,005% foram efetivos contra as quatro espécies de
bactérias, com tempo de exposição ao laser de apenas 30 segundos. Como
esses microrganismos estão envolvidos em um grande número de infecções
orais, incluindo gengivite e periodontite, os resultados implicaram que a terapia
fotodinâmica pode ser efetiva no tratamento dessas infecções.
Wilson (1993) mostrou que os corantes azul de toluidina, azul de
metileno e cloridrato de azure B (todos na concentração de 50 µg/ml) foram
fotossensibilizadores efetivos para Actinobacillus actinomycetemcomitans,
P.gingivalis, F.nucleatum e S.sanguis, quando expostos in vitro ao laser HeNe
de 7,3mW, por 30 segundos. Mas não houve evidência de morte bacteriana
somente com os corantes na ausência da luz laser. Os derivados da
hematoporfirina mostraram-se fracos para sensibilizar A.a, F.nucleatum e
S.sanguis, sendo efetivos somente contra o P.gingivalis. Isso pode ser
atribuído à inabilidade do corante de absorver luz com o comprimento de onda
utilizado, que foi de 632,8nm. Mas, usando-se 500-560nm, os derivados de
hematoporfirina podem ser excelentes fotossensibilizadores.
Wilson, Dobson e Sarkar (1993) verificaram in vitro a
fotossensibilização letal de bactérias orais anaeróbias (P.gingivalis,
F.nucleatum e A.a), utilizando laser de HeNe, 7,5mW, por 80 segundos, com
quatro corantes (azul de metileno, azul de toluidina, ftalociacina dissulfonada
de alumínio e diematoporfirina éster, todos com concentração de 25 µg/ml). Os
autores chegaram a resultados importantes. O corante azul de toluidina e azul
de metileno tiveram efeito letal, quando associados ao laser de baixa
intensidade, para essas três bactérias. No caso do P.gingivalis, 20% das
mortes obtidas na fotossensibilização letal podem ser atribuídas apenas ao
efeito tóxico do corante azul de toluidina. Já para A.a, e F.nucleatum, a
toxicidade do corante foi responsável por 8,1% e 16,2%, respectivamente, das
mortes atribuídas à combinação laser/corante. Azul de toluidina causou
redução estatisticamente significativa, na ausência do laser, somente no A.a,
mas azul de metileno, na ausência do laser, não causou redução das colônias
de P.gingivalis, A.a, F.nucleatum. Na ausência do fotossensibilizador, a
exposição ao laser não teve efeito significativo na viabilidade das colônias. Já
os corantes ftalociacina dissulfonada de alumínio e dihematoporfirina éster,
associados ao laser de baixa intensidade, tiveram efeito letal somente para o
P.gingivalis. Entretanto o corante ftalociacina dissulfonada de alumínio foi
tóxico para esta bactéria e para o A.a, na ausência do laser, mas não para o
F.nucleatum.
É importante destacar que, de acordo com o estudo de Wilson,
Dobson e Sarkar (1993), azul de toluidina e azul de metileno foram os
fotossensibilizadores mais efetivos, permitindo reduções apreciáveis nas
colônias de P.gingivalis, A.actinomycetemcomitans e F.nucleatum. Entretanto,
outros aspectos da técnica precisam de mais estudos, como os relacionados
com concentração do corante, doses do laser e freqüência do tratamento.
Wilson e Dobson (1993) investigaram in vitro o potencial de três tipos
de compostos, azul de toluidina, derivados de hematoporfirina e ftalociacina
dissulfonada de alumínio, todos com concentração de 25µg/ml, agindo na
fotossensibilização letal do P.gingivalis e do F.nucleatum, ambos relacionados
com a patogênese da periodontite. Foi usado um laser de HeNe com uma
potência de 7,3mW e uma densidade de 22J/cm
2
(292mJ). O comprimento de
onda emitido foi de 632,8nm. Os autores chegaram aos seguintes resultados:
exposições dos microrganismos somente ao laser, mesmo durante mais de 80
segundos, não tiveram efeito significativo; azul de toluidina ou os derivados de
hematoporfirina, isolados, não apresentaram resultados; ftalociacina
disulfonada de alumínio, sem o laser, causou decréscimo no P.gingivalis, o que
não ocorreu com o F.nucleatum; grandes quantidades de ambos os
microrganismos foram eliminados (49,8 x 10
6
cfu/ml e 54,72 x 10
6
cfu/ml,
respectivamente para P.gingivalis e F.nucleatum), com o uso de pequenas
concentrações do corante azul de toluidina e pequenas doses de laser.
Entretanto, nas associações de derivados de hematoporfirina ou ftalociacina
dissulfonada de alumínio com laser, os resultados não foram significativos.
Esses autores também confirmaram, no referido estudo, que o corante
azul de toluidina associado ao laser HeNe apresentou os melhores resultados,
sendo, pois, um corante efetivo na fotossensibilização letal dos microrganismos
P.gingivalis e F.nucleatum.
Sarkar e Wilson (1993) estudaram a fotossensibilização de bactérias
da placa subgengival de pacientes com periodontite crônica. Amostras da placa
foram expostas a um laser de HeNe de 7,3mW de potência, por 30 segundos,
usando-se 16,5J/cm
2
(219mJ), na presença e na ausência do corante azul de
toluidina na concentração de 50µg/ml. Os autores concluíram que a
combinação laser/corante alcançou significativa redução bacteriana, sendo que
a média de redução foi de 91,1% nas bactérias aeróbias, 96,9% nas
anaeróbias, 100% nas pigmentadas anaeróbias e 94,4% para os
Streptococcus. Entretanto, a redução não foi significativa na presença apenas
do corante. Isso sugere que o laser de baixa intensidade associado a um
corante apropriado pode ser eficaz como tratamento coadjuvante ao
debridamento mecânico, no tratamento periodontal.
Wilson e Pratten (1994) mostraram in vitro a eficácia da terapia
fotodinâmica, usando-se o laser GaAs (arseneto de gálio) associado ao corante
ftalociacina dissulfonada de alumínio, na fotossensibilização letal da bactéria
S.aureus, presente em extensa gama de infecções, inclusive periodontais. Os
autores concluíram que o S.aureus, mesmo cepas resistentes a alguns
antibióticos, pode ser eliminado em cerca de 99% dos sítios infectados, quando
for previamente tratado com o corante ftalociacina dissulfonada de alumínio,
em concentração de 12,5µg/ml, e exposto à irradiação com laser AsGa, com
comprimento de onda de 660nm, por tempo de exposição de 60 ou 120
segundos. Não houve, porém, atividade antimicrobiana significativa, quando a
bactéria foi exposta ao mesmo tipo de laser ou ao mesmo corante,
separadamente, mostrando a efetividade da associação laser/corante exógena,
já que no tipo de bactéria estudado não foi encontrado presença de
fotossensibilizador endógeno.
Os autores acima mencionados mostraram ainda a eliminação do
S.aureus pela associação de fonte de luz branca com o corante exógeno
hematoporfirina. Entretanto para obter efeito similar ao do laser, usaram o
referido corante em alta concentração e exposição à luz branca em período
longo. Já com o laser, devido à grande densidade energética, verificam-se
várias vantagens, permitindo menor tempo de exposição, mas mantendo o
efeito bactericida da associação com o corante ftalociacina dissulfonada de
alumínio, este em concentração menor que a da hematoporfirina.
Wilson e Pratten (1995) confirmaram, in vitro, que o S.aureus pode ser
eliminado com a terapia fotodinâmica, utilizando-se, como corante, o azul de
toluidina (12,5µg/ml) e o laser HeNe (0,88J e comprimento de onda de
632,8nm), sendo que foi encontrada uma redução de 95% na contagem viável
do microrganismo. Entretanto não houve redução significativa nessa contagem,
quando foi exposto à mesma dosagem de laser HeNe, na ausência do corante.
Utilizando-se, porém, dosagem maior do laser (3,5J), houve eliminação do
S.aureus estatisticamente significativa, mesmo na ausência do azul de
toluidina, o que revelou a presença do fotossensibilizador endógeno nesse
organismo. A concentração do azul de toluidina utilizada foi de 12,5µg/ml,
havendo aumento da redução do microrganismo com o aumento da
concentração do corante. Mesmo assim a associação laser GaAs/ftalociacina
dissulfonada de alumínio mostrou-se mais efetiva para eliminar o S.aureus que
a associação laser HeNe/azul de toluidina.
Wilson e Yianni (1995) estudaram se é possível eliminar cepas de
S.aureus MRSA (resistentes ao antibiótico meticilina) pela associação de laser
HeNe (35 mW,15s) e corante azul de toluidina (12,5µg/ml). Os resultados
mostraram que a associação tem efeito sobre as bactérias em questão. Isso é
um fator de grande importância clínica, devido à dificuldade de eliminá-las. É
importante destacar que esses autores mostraram que, se a dose de energia e
a concentração de corante requerida para eliminar células bacterianas forem
menores que as exigidas para eliminar células humanas, a terapia fotodinâmica
pode ser usada para eliminação seletiva, sem danos às células adjacentes do
hospedeiro, in vivo. Além disso, para maior segurança, anticorpos podem ser
ligados ao corante contra a bactéria-alvo.
Wilson et al. (1995) avaliaram se bactérias da placa supragengival
poderiam ser eliminadas pela associação laser/corante. Para isso utilizaram
placas bacterianas obtidas de dez voluntários, que foram tratadas com azul de
toluidina (TBO)/HeNe ou ftalociacina dissulfonada de alumínio (AlPcS
2
)/GaAs.
Para ambos os casos foi encontrada redução significativa das bactérias
anaeróbias e do gênero Streptococcus e Actinobacillus. Entretanto, a
associação HeNe/TBO foi mais efetiva que a outra. Isso pode ser explicado
pelo fato de ser o comprimento de onda do HeNe (632,8nm) ressonante com o
pico de absorção do azul de toluidina (632nm). Já o AsGa apresentou um
comprimento de onda de 660nm e o pico de absorção do AlPcS
2
é de 675nm.
Neste estudo, nem o laser isoladamente nem os fotossensibilizadores
apresentaram efeito significativo na eliminação das bactérias em questão.
Os mesmos autores destacaram as vantagens da terapia fotodinâmica
comparadas às do uso de antimicrobianos, como o não-desenvolvimento da
resistência bacteriana e ausência de necessidade de se manterem altas
concentrações do fotossensibilizador por longos períodos.
Henry et al. (1996) estudaram a ação do laser de argônio em baixa
intensidade com comprimento de onda entre 488-514nm, in vitro, sobre
biofilmes onde havia P.intermedia e P.gingivalis, entre outras espécies
bacterianas. Essas bactérias, do gênero Porphyromonas e Prevotella, são
classificadas como bacteróides ou bactérias de pigmento negro. A descrição é
determinada pela aparência das colônias ou biofilmes cultivados no ágar
sangue, em que o pigmento predominante é uma porfirina.
Esses autores chegaram ao seguinte resultado: o laser de argônio foi
eficiente para eliminar espécies do gênero Porphyromonas e Prevotella. Então,
como não foi adicionado nenhum fotossensibilizador exógeno, conclui-se que
essas espécies bacterianas possuem fotossensibilizadores endógenos, que,
como já dito, são porfirinas. Assim o comprimento de onda utilizado foi
ressonante com o pico de absorção da porfirina. É importante destacar também
a relação inversa entre a maturação do biofilme e a fototoxicidade dos
bacteróides.
Wilson, Burns e Pratten (1996) estudaram, in vitro, a susceptibilidade
do S.sanguis, no biofilme, à terapia fotodinâmica, com a associação do laser
GaAlAs com os seguintes parâmetros 660nm, 11mW, 12,2J mais o corante
AlPcS
2
(675nm). Para isso, fizeram o microrganismo crescer em condições
similares às existentes na cavidade oral, utilizando hidroxiapatita como
substrato e saliva artificial como fonte de nutriente. Os autores lembraram que
as bactérias nos biofilmes são consideravelmente menos susceptíveis a
agentes antimicrobianos e que o uso difundido destes está gerando bactérias
resistentes. Mesmo assim, a terapia fotodinâmica mostra-se como uma
alternativa, já que houve substancial redução do S.sanguis, bactéria presente
em grande número na placa bacteriana, após uso laser/corante. No entanto,
nenhum dos dois, isolados tiveram efeito significativo sobre S.sanguis.
Soukos et al. (1996) avaliaram os efeitos fotodinâmicos, in vitro, da
associação do laser HeNe 7,3mW e do corante azul de toluidina sobre os
queratinócitos e fibroblastos gengivais humanos e sobre o S. sanguis. O
objetivo do trabalho foi avaliar se a terapia fotodinâmica poderia ser usada no
tratamento da doença periodontal, sem provocar danos aos tecidos adjacentes.
Os resultados mostraram que o azul de toluidina é citotóxico para
queratinócitos e fibroblastos gengivais in vitro e esses efeitos tóxicos são dose-
dependentes. Assim, os autores concluíram que o uso de baixas
concentrações do corante (2µg/ml ou 5µg/ml TBO) associadas à exposição ao
laser HeNe por dois minutos provocou a eliminação do S.sanguis, mas não
reduziu a viabilidade celular dos queratinócitos e dos fibroblastos.
Bhatti et al. (1997) estudaram a influência de alguns fatores, como o
pH, concentração do corante, presença do soro sangüíneo, fases de
crescimento do microrganismo, tempo de pré-irradiação e dose de luz usada na
fotossensibilização letal do P.gingivalis. Para isso, usaram azul de toluidina e
laser HeNe. Os resultados obtidos foram os seguintes: Em presença do azul de
toluidina, foi obtido efeito do laser dose-dependente. Não houve efeito
significativo no número de P.gingivalis quando a concentração do azul de
toluidina foi aumentada de 12,5 para 50,0µg/ml. Aumento no tempo da pré-
irradiação gerou discreto aumento de mortes dos microrganismos. Alto número
de mortes foi encontrado nos três pHs estudados (6,8 a 8,0). O estudo mostrou
também que células das três fases de crescimento do microrganismo foram
susceptíveis à fotossensibilização letal, apesar de as da fase estacionária ser
discretamente menos susceptíveis e as da fase log ser ligeiramente mais
susceptíveis. A apreensão máxima do azul de toluidina ocorreu por volta de 60
segundos, sendo a absorção menor no soro que em solução salina.
Bhatti et al. (1998) estudaram a distribuição do corante nas células do
P.gingivalis e os possíveis mecanismos envolvidos na fotossensibilização letal
deste, utilizando azul de toluidina (25µg/ml) e laser de HeNe (0,88J/cm
2
). Os
efeitos da fotossensibilização foram avaliados pela mensuração da
fluorescência do triptofano e eletroforese de proteínas. O envolvimento das
espécies citotóxicas na fotossensibilização letal foi investigado com uso do
óxido deutério, que prolonga a vida ativa do oxigênio singleto e dos radicais
livres, sendo estes possíveis mediadores do dano celular ocorrido na
fotossensibilização letal.
Neste estudo, os autores chegaram aos seguintes resultados: 86,7%
do azul de toluidina aglutinaram-se na membrana externa do P.gingivalis; foram
encontrados 5,4% na membrana plasmática, alterando a geração de energia
(ATP) e o metabolismo anabólico e catabólico celular; foi encontrado 1,9% nas
proteínas citoplasmáticas, 5,7% em outros constituintes citoplasmáticos e
somente 0,25% no DNA. Além disso, foi encontrada pequena porção do azul
de toluidina livre, que também pode ser responsável por certo dano celular.
Nem o laser HeNe, nem o azul de toluidina aplicados isoladamente tiveram
efeito nas massas moleculares das proteínas; somente houve efeito, quando as
células foram previamente tratadas com azul de toluidina e expostas ao laser
HeNe. Foi verificado o envolvimento do oxigênio singleto no processo de morte
celular por fotossensibilização letal, mas a ação específica dos radicais livres
não pôde ser comprovada pelo estudo em questão. Isso se deve,
provavelmente, ao baixo pH dos radicais livres, sendo que o P.gingivalis não
sobrevive em um pH inferior a 6,0. Mesmo assim, o envolvimento dos radicais
livres na morte celular por fotossensibilização não fica excluído. Os autores em
questão fazem referência a outro estudo, com a associação do S.mutans, azul
de toluidina e laser HeNe, que confirma o envolvimento do oxigênio singleto e
dos radicais livres na morte celular, durante a terapia fotodinâmica.
Bhatti et al. (1998) verificaram ainda que, durante a fotossensibilização
letal, o oxigênio singleto pode interagir com aminoácidos foto-oxidáveis de uma
proteína e produzir espécies reativas que podem interagir com radicais e
aminoácidos de outra proteína, formando um cross-link. Assim, a ocorrência do
dano enzimático permite que se estabeleçam três hipóteses: destruição de
aminoácidos das cadeias peptídicas (principalmente timina e guanina, que são
os principais aminoácidos-alvo da fotossensibilização letal); ruptura da cadeia
peptídica e separação das pontes de oxigênio. Após análises da membrana
externa e da membrana plasmática do P.gingivalis, identificando proteínas
fotossensibilizáveis, os autores concluíram que danos a essas proteínas e ao
DNA são a principal causa da morte celular na presença de azul de toluidina,
após irradiação com laser de HeNe.
Jackson et al. (1999) investigaram, in vitro, a morte microbiana da
Candida albicans pela terapia fotodinâmica, nas formas de levedura e hifa. O
tratamento convencional da candidíase (infecção oportunista causada pela
C.albicans) feito com agentes antifúngicos, como o fluconazol, não tem
mostrado sempre sucesso, já que pode haver resistência da C. albicans a
esses agentes. Assim, neste estudo, os autores mostraram uma alternativa de
eliminação do fungo, com o laser de HeNe com comprimento de onda de
632,8nm, potência de 35mW associado ao corante azul de toluidina (12,5µg/ml
ou 25µg/ml). Concluíram que a associação do laser ao corante determinou
morte microbiana expressiva tanto na forma de hifa, quanto na de levedura,
sendo que a primeira foi mais susceptível que a segunda, o que pode ser
atribuído à diferença de morfologia.
Kawamoto et al. (2000) estudaram o efeito antibacteriano do laser
HeNe amarelo (594nm, 4.3mW) associado ao corante cristal de violeta em
abscessos subcutâneos de ratos, provocados pela bactéria P.gingivalis. Para
isso, cones de papel foram contaminados pela bactéria. A seguir, foi adicionado
0,8ml do corante e feita irradiação laser por sessenta segundos. Depois os
cones foram inoculados subcutaneamente nas costas dos ratos. Neste estudo
foi ainda usado um grupo corante sem laser, um grupo P.gingivalis sem laser
nem corante e um grupo controle. Após sete dias, amostras dos locais em que
foram inoculados os cones de papel, dos quatro grupos, foram retiradas para
análise histopatológica. Os resultados mostraram que o grupo controle
apresentou o menor grau de inflamação, seguido pelo grupo em que foi
aplicado o laser. Já nos dois outros grupos o número de células inflamatórias
foi grande, com áreas necrosadas. Os autores concluíram que a associação
laser HeNe amarelo/cristal de violeta exerce efeito antibacteriano in vivo,
levando à formação de menor número de abscessos. É importante lembrar que
a eliminação ou decréscimo do P.gingivalis está associada à redução da
progressão da periodontite, além da redução de abscessos periodontais.
König et al. (2000) analisaram a terapia fotodinâmica, in vitro, sem o
uso de corantes exógenos, contra P.gingivalis, P.intermedia, P.acnes (presente
na microflora normal da pele e um dos responsáveis pela acne),
A.odontolyticus (presente no processo de cárie de dentina) e S.mutans. Nessas
bactérias, com exceção do S.mutans, foi constatada, pela fluorescência,
durante a aplicação do laser HeNe (60mW, 632,8nm), a presença de
endoporfirinas, corantes endógenos. Em vista disso, pode-se utilizar a terapia
fotodinâmica sem corantes exógenos para eliminar as bactérias citadas, desde
que o comprimento de onda do laser seja compatível com o corante endógeno,
como ocorreu no estudo citado. Como era esperado, não houve efeito sobre o
S.mutans, já que este não produz porfirinas endógenas. Os autores lembraram
ainda que o aumento da resistência bacteriana aos antibióticos torna a busca
por novas formas de tratamento uma necessidade, sendo a terapia
fotodinâmica importante alternativa viável.
Dörtbudak et al. (2001) apresentaram o uso da terapia fotodinâmica na
periimplantite. Vários métodos de limpeza das superfícies dos implantes foram
descritas na literatura com objetivo de evitar o fracasso dos implantes. Entre
esses métodos estão o ácido cítrico, o tratamento mecânico com curetas e o
uso do ultra-som com pontas revestidas de plástico. Entretanto alguns tiveram
por conseqüência mudar ou danificar as propriedades da superfície dos
implantes. Uma técnica nova de limpeza, in vivo, é o tratamento com laser.
Vários estudos têm demonstrado que a fotossensibilização letal pode ser
executada in vivo sem alteração nas superfícies tratadas dos implantes.
Dörtbudak et al. (2001) examinaram a efetividade da
fotossensibilização letal no tratamento de superfícies de implantes in vivo,
avaliando a eliminação do A.a, P.gingivalis e P.intermedia. No estudo, utilizou-
se laser de diodo com comprimento de onda de 690nm por 60 segundos e,
como corante, o azul de toluidina (100µg/ml). Houve redução significativa das
três bactérias com a terapia fotodinâmica.
Prates et al., (2006) avaliaram a ação bactericida do verde de
malaquita a 0,01% e laser vermelho (comprimento de onda 660nm) na bactéria
Actinobacillus actinomycetemcomitans in vitro e de acordo com os autores
notou-se que o laser combinado com o corante com tempos de três e cinco
minutos levou a redução de 97,2% e 99,9% deste periodontopatógeno.
Ferreira e Ferreira em 2006 desenvolveram e patentearam um agente
fotossensibilizador para a utilização no processo antimicrobiano ativado por luz
e destinado à sensibilização letal de bactérias e fungos. São utilizados para
este processo os corantes azul de metileno, azul de toluidina, azul de trypan,
azul de Evans e verde de Malaquita associados a uma fonte de luz composta
por LEDs.
O Teste t student que foi utilizado para a análise estatística do
experimento é aplicado quando se querem comparar duas colunas de dados
entre si, mesmo quando é aplicado a uma única amostra, uma coluna de
dados, onde se compara a média da mesma com uma média hipotética teórica,
extraída da literatura ou de outro experimento da população (DORIA FILHO,
2001).
4 - MATERIAL E MÉTODOS
4.1 - MATERIAL
1 – Câmera fotográfica digital Canon G3 - PC1032 – Power Shot – 4.0
Mega Pixels – Fabricante: Canon Inc. – Japão .
2 – Estativa - (FIG. 4.1)
FIGURA 4.1 – Câmera digital fixa à estativa dentro do Fluxo Laminar onde foram feitas as fotos
das placas com bactérias para a contagem eletrônica
3 – Equipamento de laser em baixa intensidade, com comprimento de
onda de 660nm, com potência média de saída do feixe de 103,1mW, área do
feixe 1,5cm², modelo Quantum, Fabricante: Ecco Fibras Brasil (FIG.4.2).
FIGURA 4.2 – Laser em baixa intensidade Quantum -Ecco (Laser nº1)
4 – Equipamento de Laser em baixa intensidade, com comprimento de
onda 660nm, semicondutor com potência média de 40mW, marca TWIN
LASER, Fabricante: mmoptics, São Paulo. (FIG. 4.3 ) (Laser nº2).
FIGURA 4.3 – Laser em baixa intensidade Twinlaser - mmoptics (Laser n.2)
5 – Equipamento de LEDs, com comprimento de onda de 630nm (±
10nm), semicondutor de InGaAlP, potência média de saída de 100mW sem a
ponteira de acrílico, sistema de entrega do feixe por manopla com 1cm², marca
FISIOLED, Fabricante: mmoptics São Paulo (FIG.4.4)
FIGURA 4.4 – Equipamento de LEDs – FISIOLED – mmoptics – São Paulo
6 – Espectrofotômetro - JEN WAY Spectrophotometer 640, EUA. (FIG.
4.5)
FIGURA 4.5 – Espectrofotômetro - JEN WAY Spectrophotometer 640, EUA
7 – Medidor de Potência (Power Meter) NOVA – Analogic Performance
Report, Laser Power/Energy Monitor. Fabricante: Ophir Optronics – Science
Based Industry Park, Jerusalém – Israel. (FIG 4.6)
FIGURA 4.6 – Power Meter - NOVA – Ophir Optronics, Jerusalém – Israel
8 – MICROORGANISMOS: Foi utilizada uma amostra de referência
Actinobacillus actinomycetemcomitans (ATCC 29525), uma amostra de
Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586 ) e uma amostra de Prevotella
intermedia (ATCC 25611) isolados e pertencentes ao Laboratório de
Microbiologia Oral e Anaeróbios do Departamento de Microbiologia do Instituto
de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais.
Actinobacillus
actinomycetemcomitans
Fusobacterium nucleatum Prevotella intermedia
Figura 4.7 – Bactérias utilizadas no experimento (Actinobacillus actinomycetemcomitans -
ATCC 29525, Fusobacterium nucleatum - ATCC 25586 e Prevotella intermedia - ATCC 25611).
9 – Fotossensibilizante: O fotossensibilizador utilizado foi o azul de orto-
toluidina (TBO) (Sigma, St. Louis, MO, USA), na concentração final de 0,01%
p/v. A absorção óptica foi analisada por espectroscopia, apresentou-se
ressonante com o comprimento de onda emitido pelo equipamento testado.
(FIG. 4.8)
FIGURA 4.8 – Azul de Toluidina a 0,1% (TBO) - Sigma, St. Louis, MO, EUA.
4.2 – MÉTODOS
A metodologia foi dividida em duas partes. A primeira parte do
experimento foi a avaliação da linearidade de absorção dos corantes pelos
equipamentos a serem utilizados, verificando principalmente se o corante a ser
usado (TBO a 0,01%) é bem absorvido pelos equipamentos usados e se a
potência desses equipamentos é importante nessa absorção. A segunda fase
executada é o procedimento laboratorial desde o crescimento bacteriano
passando pelas etapas de irradiação com posterior contagem e análise
estatística dos dados obtidos.
4.2.1 – EXPERIMENTO Nº 1 – Avaliação da linearidade de absorção
dos corantes pelos equipamentos de luz (Lasers e LED)
O objetivo é determinar a absorção dos comprimentos de onda
dos lasers 1 e 2 e do LED (grupos 6, 7 e 8) pelos corantes verde de malaquita
(VM), azul de metileno (MB) e azul de toluidina (TBO), todos na concentração
de 0,01% e o coeficiente de absorção ótica dos corantes utilizando-se a Lei de
Beer.
(
)
aLII
−
=
exp.
0
(1)
onde:
I é a intensidade transmitida em [w/cm²]
I
0
é a intensidade inicial em [w/cm²]
a é o coeficiente de absorção ótica [cm
-1
]
L é a espessura de cubeta plástica em [cm] – caminho óptico a ser
percorrido pelo feixe de luz.
Os corantes foram depositados em uma cubeta de acrílico com
também a água (FIG. 4.9). A seguir a cubeta foi apoiada em uma placa de
isopor, onde de um lado ficou localizada a ponteira dos equipamentos e do
outro lado o sensor do Power Meter (FIG. 4.10 e 4.11).
Figura 4.9 – Cubas de acrílico com água e com os corantes avaliados.
Figura 4.10 - Colocação da ponteira em acrílico do equipamento de LED
em posição e do outro lado da cuba o Power Meter para mensurar a potência
transmitida.
Figura 4.11 - Imagem do experimento mostrando além do sensor o equipamento
de medição (Power Meter)
Colocando-se o corante na cuba de acrílico, avaliou-se a penetração do
feixe de luz no recipiente achando-se assim a quantidade de luz absorvida
3
pelo corante e o resíduo de luz transmitida ao Power Meter. (FIG. 4.12).
Lembrando que foi feita uma Linha de Base utilizando a água como veículo na
cuba de acrílico.
Para o Laser 2 (potência de 40mw) variou-se a potência de 10 em
10mW até atingir a potência máxima do equipamento (FIG 4.12).
Para o experimento com o Laser 1(potência de 100mW) e o LED
(potência de 100mW), por terem a potência fixa, foi utilizado um filtro de
transmissão de 20 a 100% para as medições.
Os resultados foram obtidos no display digital do Power Meter (FIG.
4.13) e estão disponíveis no ANEXO 3.
3
Quantidade de radiação absorvida pelo caminho óptico percorrido pela luz dentro da cubeta
com o corante.
Figura 4.12 – Imagem do laser 2 (grupo 7) com a ponta encostada na cuba de acrílico com
TBO a 0,01% mostrando o feixe sendo absorvido.
Figura 4.13 – Imagem do display digital do Power Meter medindo a potência transmitida pela
cuba com o corante.
4.2.2 – EXPERIMENTO Nº 2 - Procedimento para avaliação da
fotossensibilização letal das bactérias pelos lasers e LED:
1° PASSO
PREPARO DO INÓCULO: A amostra das bactérias foi cultivada
(Actinobacillus actinomycetemcomitans em ágar BHI + extrato de levedura),
(Prevotella intermédia em ágar Brucella + hemina, menadiona e extrato de
levedura) e (Fusoacterium nucleatum em BHI + L-cistina + extrato de
leveduras) e incubada em anaerobiose a 35ºC por 48 horas, para obter
colônias bacterianas em fase de crescimento exponencial. Foram utilizados
18ml de salina peptonada esterilizada para preparar uma suspensão de
células. Após homogeneização em vórtex, a concentração final do inóculo foi
ajustada para 1-5 x 10
8
UFC/ml, de acordo com o tubo 0,5 da escala de Mac
Farland. (FIG.4.14)
Bactérias inseridas no meio
dentro do Falcon
Análise visual em contraste
mostrando que o meio com a
bactéria ainda está mais
denso que o controle (tubo
de ensaio)
Análise visual – ideal, onde
o meio está na mesma
densidade do controle
visualmente
FIGURA 4.14 – Análise Visual para Mc Farland 0,5, onde a densidade óptica do meio no
Falcon tem que coincidir visualmente com o tubo padrão da Escala de Mc Farland
2 º PASSO
Espectroscopia (ANEXO 2) do meio e do inóculo com e sem corante
(TBO, 0,1%) (FIG.4.15)
400 600 800
0
1
2
3
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
Densidade óptica (unid. arb.)
Comprimento de onda (nm)
Figura 4.15 – Gráfico com as curvas de absorbância
4
(densidade óptica) das bactérias
envolvidas no experimento em relação aos comprimentos de onda entre 380 e 900nm, onde: a
– Meio com salina peptonada e Actinobacillus actinomicetecomitans 1-5 x 10
8
UFC/ml, b- Meio
com salina peptonada, Actinobacillus actinomicetecomitans 1-5 x 10
8
UFC/ml e TBO, c – Meio
com salina peptonada, Actinobacillus actinomicetecomitans 1-5 x 10
8
UFC/ml, TBO pós PDT
com ∆=3min, d - Meio com salina peptonada e Prevotella intermedia 1-5 x 10
8
UFC/ml , e-
Meio com salina peptonada, Prevotella intermedia 1-5 x 10
8
UFC/ml e TBO, f – Meio com salina
peptonada, Prevotella intermedia 1-5 x 10
8
UFC/ml, TBO pós PDT com ∆=3min, g - Meio com
salina peptonada e Fusobacterium nucleatum 1-5 x 10
8
UFC/ml , b - Meio com salina
peptonada, Fusobacterium nucleatum 1-5 x 10
8
UFC/ml e TBO, c – Meio com salina
peptonada, Fusobacterium nucleatum 1-5 x 10
8
UFC/ml, TBO pós PDT com ∆=3min
4
Quantidade de radiação que é absorvida por uma superfície
3° PASSO
Foram utilizados 08 tubos de ensaio de 10 x 10mm contendo um volume
final de suspensão de 2ml, que foram separados em oito grupos (FIG.4.16 e
TAB. 4.1).
Figura 4.16 – Foto mostrando os 08 grupos, onde os grupos 1,3,4,5 contém 2ml de suspensão
sem TBO (tubos com líquido incolor) e os grupos 2,6,7,8 onde foram adicionados o corante
TBO (proporção 1:10).
Tabela 4.1 – Tabela dos grupos utilizados no experimento e sua descrição e simbologia
utilizada
Grupos -
Simbologia
Descrição do procedimento
Grupo 1
Controle
Inóculo – sem nenhum tratamento
(controle)
Grupo 2
TBO
Meio com bactérias e corante TBO a
0,01%
Grupo 3
Laser 1
Meio com bactérias sem corante TBO a
0,01% e irradiados com laser 1 por 3
minutos
Grupo 4
Laser 2
Meio com bactérias sem corante TBO a
0,01% e irradiados com laser 2 por 3
minutos
Grupo 5
LED
Meio com bactérias sem corante TBO a
0,01% irradiados com LED por 3 minutos
Grupo 6
PDTL1
Meio com bactérias e corante TBO a
0,01% irradiados com laser 1 por 3
minutos
Grupo 7
PDTL2
Meio com bactérias e corante TBO a
0,01% irradiados com laser 2 por 3
minutos
Grupo 8
PDTLED
Meio com bactérias e corante TBO a
0,01% irradiados com LED por 3 minutos
4° PASSO
No grupo 1, correspondente ao controle de crescimento bacteriano, o
inóculo não sofreu nenhum tratamento. No grupo 2, 0,2ml de TBO foram
adicionados a 1,8ml do inóculo, sem a exposição às fontes de luz. Nos grupos
3, 4 e 5, 2ml do inóculo em cada grupo foram irradiados por 3 minutos,
respectivamente, pelo Laser nº1, Laser nº2 e pelo LED. Nos grupos 6, 7 e 8,
0,2ml de TBO foram adicionados a 1,8ml do inóculo e irradiados por 3 minutos,
pelo Laser nº1, Laser nº2 e pelo LED sucessivamente. Para os grupos 2, 6, 7 e
8, foi estabelecido um período de pré-irradiação (PIT) de 5 minutos para
absorção do fotossensibilizante (TBO). (FIG.4.17)
Figura 4.17 – Tubos de ensaio sendo irradiados com laser 2 e LED apoiados em um suporte de
laboratório.
5° PASSO
Posteriormente, o inóculo de cada grupo foi diluído para 10
3
UFC/ml,
exceto o grupo 1 cujo inóculo foi diluído para 10
2
e 10
3
UFC/ml, e semeado, em
triplicata, em placas de Petri contendo agar Brucella suplementado com extrato
de leveduras (FIG.4.18a, FIG.4.18b e FIG.4.19).
Figura 4.18a – Procedimento mostrando o
momento das diluições de 10
8
UFC/ml para
10
3
UFC/ml dentro da câmara do fluxo
laminar para manter o meio sem
contaminação
Figura 4.18b – Diluição até 10
3
UFC/ml sendo
mostrado em um tubo do Tipo Eppendorf
(com tampa), antes de ser levado à placa de
Petri
Figura 4.19 – Procedimento de semeadura do meio com as bactérias na placa de Petri,
procedimento este também feito na câmara do fluxo laminar. Após a semeadura o meio é
espalhado em toda a placa com auxílio de um Drigausk (bastão de vidro).
6° PASSO
As placas foram incubadas em anaerobiose a 35ºC por 48 horas e após
este período realizadas a contagem das colônias bacterianas (FIG.4.20).
Figura 4.20 - Câmara de anaerobiose onde as placas de Petri ficam incubadas por 48 horas a
35ºC e após este período é então feita a contagem visual dos pontos com UFCs
.
7° PASSO
Contagem das colônias (UFC) visual e digital (ANEXO 4) (FIG.4.21a e
FIG.4.21b)
A contagem visual foi feita utilizando-se uma caneta hidrográfica com as
marcações feitas diretamente sobre a placa e para a contagem digital a
aquisição e tratamento das imagens foram obtidas através das imagens
fotográficas, utilizando-se uma câmera Canon G3, com auxílio da estativa,
dentro da câmara de fluxo laminar, com o objetivo de padronização das
imagens.
Figura 4.21a – Marcação com caneta
hidrográfica azul para contagem visual das
UFCs
Figura 4.21b – Contagem eletrônica –
Programa Image Pro-plus 6.0
8° PASSO
ANÁLISE ESTATÍSTICA: Foi utilizado o programa estatístico Microsoft
Office Excel – Teste t student entre duas amostras presumindo variâncias
semelhantes, com uma probabilidade de significância (p < 0,05), tendo,
portanto 95% de confiança nas conclusões apresentadas. (Utilizou-se um nível
de significância de 0,05 (p=0,05), onde os valores de p < 0,05 foram
considerados diferentes. Comparou-se os grupos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 com o grupo
1 (controle).
5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 - EXPERIMENTO 1
No Anexo 3 está apresentada a relação de calibração entre a potência
declarada no equipamento e a potência efetivamente irradiada nas soluções
dentro da cubeta de acrílico nas condições de teste.
As Figuras 5.1, 5.2, 5.3, mostram os resultados obtidos no experimento
para determinar a absorção dos comprimentos de onda dos lasers 1 e 2 e do
LED pelos corantes verde de malaquita (VM), azul de metileno (MB) e azul de
toluidina (TBO).
5 10 15 20 25 30 35 40 45
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
Potência irradiada (mW)
Potência transmitida com corante (mW)
Potência transmitida para o Laser 1
Azul de Toluidina
Verde de Malaquita
Azul de Metileno
Forma Linear - Azul de Toluidina
Forma Linear - Azul de Metileno
Forma Polinomial - Verde de Malaquita
Figura 5.1 – Potência aplicada e potência transmitida para o Laser 1, com seus respectivos desvios
padrões.
0 10 20 30 40 50
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
Potência transmitida para o Laser 2
P irradiada (mW)
P transmitida com corante (mW)
Azul de Toluidina
Verde de Malaquita
Azul de Metileno
Forma Linear - Azul de Toluidina
Forma Linear - Verde de Malaquita
Forma Linear - Azul de Metileno
Figura 5.2 – Potência aplicada e potência transmitida para o Laser 2, com seus respectivos desvios
padrões.
5 10 15 20 25
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
P transmitida com corante (mW)
P irradiada (mW)
Azul de Toluidina
Verde de Malaquita
Azul de Metileno
Forma Linear - Azul de Toluidina
Forma Linear - Verde de Malaquita
Forma Linear - Azul de Metileno
Potência transmitida para LED
Figura 5.3 – Potência aplicada e potência transmitida para o LED, com seus respectivos desvios
padrões.
Nas potências de irradiação aportadas observa-se nas Figuras (5.1, 5.2,
5.3) uma dependência clara entre a potência aplicada e a potência absorvida
para todos os equipamentos e corantes, com exceção de uma medida para o
verde de malaquita (FIG 5.1 em verde), na qual o ajuste dos gráficos não foi
uma reta e sim uma curva do tipo quadrática. Como se tem a luz absorvida no
eixo x, isso indica que para este corante já se está fora dos regimes lineares e
próximos da saturação.
Com os resultados obtidos pode-se concluir que o comportamento dos
três corantes analisados em relação aos equipamentos mostra-se com um
adequado potencial de absorção e somente o verde de malaquita vai se saturar
à medida que se aumente a potência do laser 1.
5.1.1 - Cálculo para coeficiente de absorção ótica
Foi utilizado para o cálculo do coeficiente a de absorção ótica da
amostra de TBO a 0,01% utilizando-se a Equação (1).
Na Tabela 5.1 estão os resultados médios das medidas de
transmissividade (quantidade de luz que ultrapassou a cubeta plástica e incidiu
sobre o power meter) tendo a água com Linha de Base e as médias obtidas
usando o corante Azul de Toluidina a 0,01% quando irradiados como os
equipamentos (Laser 1, Laser 2 e LED). Todos os valores encontrados estão
no Anexo 3, juntamente com os resultados obtidos pelos outros corantes
(Verde de Malaquita e Azul de Metileno).
Tabela 5.1 – Potência transmitida
(τ)
da linha de base e do corante obtida pelo experimento 1 com
o corante TBO a 0,01% avaliado para os equipamentos (Laser 1 – Grupo 6, Laser 2 – Grupo 7e LED
– Grupo 8).
(a) Baseline
(água) em
mW
(b) TBO a
0,01%
em mW
(média)
τ
ττ
τ [
[[
[%]
]]
]
(b)/(a)X100
Laser 1 (Grupo
6)
49,3 0,10 0,2
Laser 2 (Grupo
7)
40,8 0,05 0,1
LED (Grupo 8) 55,4 0,29 0,5
Sabendo-se que para a água (Linha de Base) o I
0
é 55,4W/cm² e o I é
0,29W/cm² para o equipamento de LED e a espessura da cubeta de 1cm e
utilizando-se a equação (1) têm-se que o α é igual a 5,25cm
-1
Para o Laser 1 o coeficiente óptico de absorção é de:
1
20,6
−
= cm
α
Para o Laser 2 o coeficiente óptico de absorção é de:
1
70,6
−
= cm
α
O coeficiente de absorção óptica dos lasers é maior do que o do LED
pelo fato destes equipamentos terem um feixe de irradiação com coerência
espacial e temporal e o LED o feixe de irradiação ser divergente e mais
estudos são necessários para corrobar com os resultados encontrados.
Pode-se dizer também que para os comprimentos de onda de 640 a
660nm (comprimentos dos equipamentos usados no experimento) têm-se uma
transmissão máxima em 55,4 (Linha de Base da água) que equivale a 100% e
0,29 para o TBO a 0,01%, que equivale a 0,52% de transmissividade tendo
com parâmetro a água. Nota-se que para esses comprimentos de onda o TBO
a 0,01% tem um alto índice de absorção (99,48%).
A escolha pelo corante TBO a 0,01% em relação aos outros corantes
fotossensibilizadores avaliados foi devido ao bom comportamento do TBO a
0,01% no experimento, mostrando uma boa regularidade com alto índice de
absorção da luz (laser e LED utilizados no experimento) sendo também o mais
utilizado pelos autores de acordo com a literatura utilizada (Bhatti et al. 1998;
Wilson, 1993; Wilson, Dobson e Sarkar,1993; Wilson e Dobson,1993; Soukos
et al., 1996, Bhatti et al., 1997 e Dortbudak et al., 2001 ).
Pode-se deduzir também que a potência dos equipamentos (mW) tem
uma importância muito grande nesta absorção e que valores baixos de
potência resultariam em um tempo maior de exposição da luz, explicando
assim porque o laser n.2 de 40mW (grupo 7) com o mesmo tempo de
exposição (∆t=3min) do que o laser n.1 (100mW, grupo 6) e o LED de 100mW
(grupo 8), entregaria ao agente fotossensibilizador uma quantidade de energia
menor, tendo assim uma menor sensibilização letal.
Isso significa que a intensidade medida em W/cm² é um fator a ser
considerado relevante para a técnica de sensibilização letal para as bactérias
avaliadas nos tempos de irradiação utilizados.
5.2 - EXPERIMENTO 2
Contagem das UFC/ml nas placas de Petri (visual e digital) ANEXO 4
Foi utilizado nos resultados a contagem visual de acordo com os dados
avaliados no ANEXO 4, através de uma caneta marcadora e marcação dos
pontos na placa de Petri de todos os grupos avaliados (Grupo 1-10
2
, Grupo 1-
10
3
, Grupo 2, Grupo 3, Grupo 4, Grupo 5, Grupo 6, Grupo 7 e Grupo 8) para as
três bactérias (TAB. 5.2).
Tabela 5.2 - Medidas descritivas visuais das UFCs para todas as bactérias em triplicata (Aa1, Aa2 e
Aa3 - Actinobacillus Actinomycetemcomitans), (Fn1, Fn2 e Fn3 - Fusobacterium nucleatum) (Pi1,
Pi2 e Pi3 - Prevotella intermedia); dos grupos de G1-10
2
a G8
.
Grupos/Bactérias
Aa1 Aa2 Aa3 Fn1 Fn2 Fn3 Pi1 Pi2 Pi3
G1- 10
2
57 89 83 70 58 100 100 100 100
G1- 10
3
1000 1000 1000 1000 1000 572 1000 1000 1000
G2 1000 1000 1000 73 197 97 1000 1000 1000
G3 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
G4 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
G5 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
G6 0 0 4 23 60 61 736 726 749
G7 129 141 143 107 141 116 608 636 597
G8 1 3 0 2 0 3 512 487 516
Na figura abaixo (FIG 5.4) estão demonstrados na figura os resultados
obtidos na contagem visual estabelecida na tabela acima (TAB 5.2).
Figura 5.4 - Contagem das UFC/ml dos grupos avaliados, para as bactérias onde Aa1, Aa2, Aa3 são
as medidas para o Actinobacillus actinomycetemcomitans em triplicata, Fn1, Fn2 e Fn3 para o
Fusobacterium nucleatum em triplicata e Pi1, Pi2 e Pi3 para a Prevotella intermedia em triplicata.
5.2.1 - Resultados obtidos para o Actinobacillus
actinomycetemcomitans
A (TAB 5.3) apresenta os resultados das medidas da contagem visual da
quantidade de colônias viáveis e o percentual de redução para o Actinobacillus
actinomycetemcomitans e na Tabela 5.4 a estatística da redução em UFC/ml.
0
200
400
600
800
1000
1200
Aa1 Aa2 Aa3 Fn1 Fn2 Fn3 Pi1 Pi2 Pi3
Bactérias
UFC/ml
G1- 102
G1- 103
G2
G3
G4
G5
G6
G7
G8
Tabela 5.3 – Medidas descritivas da contagem visual para os grupos em triplicata mostrando
percentualmente as colônias viáveis e sua redução para o Actinobacillus actinomycetemcomitans.
1,00E+03 UFC/ml 1,00E+02 UFC/ml
Quota Viáveis %
Redução
%
1 2 3 1 2 3
1000
1000
1000
57
89
83
1
100
0
1000
1000
1000
57
89
83
1
100
0
1000
1000
1000
57
89
83
1
100
0
1000
1000
1000
57
89
83
1
100
0
1000
1000
1000
57
89
83
1
100
0
0
0
4
0
0
0,4
0,0017
0,2
99,8
129
141
143
12,9
14,1
14,3
0,18
18,01
81,9
1
3
0
0,1
0,3
0
0,0017
0,27
99,8
Tabela 5.4 - Medidas descritivas da média, desvio padrão e erro padrão para Actinobacillus
actinomycetemcomitans.
Aa Estatística Redução UFC/ml
Grupos
Media
Desvio Padrão Erro padrão
Controle
76,3 17,00 9,82
TBO
76,3 17,00 9,82
LASER 1
76,3 17,00 9,82
LASER 2
76,3 17,00 9,82
LED
76,3 17,00 9,82
PDT L1
0,13 0,23 0,13
PDT L2
13,76 0,75 0,43
PDT LED
0,13 0,15 0,08
Figura 5.5 - Redução bacteriana do Actinobacillus actinomycetemcomitans em escala logaritmica e
os desvios padrões para os grupos analisados.
De acordo com os resultados alcançados no gráfico acima (FIG 5.5)
pode-se notar uma redução bastante relevante para os grupos PDT (grupos 6,
7 e 8) quando comparados ao controle (grupo 1) e grupos 2, 3, 4, 5. Nos
grupos 6 e 8 os resultados foram melhores tendo uma diminuição logarítmica
de mais de dois logs e no grupo 7 houve também uma redução menor (um log).
5.2.2 - Resultados obtidos para o Fusobacterium nucleatum
A (TAB 5.5) apresenta as medidas descritivas da contagem visual da
quantidade de colônias viáveis e o percentual de redução para o
Fusobacterium nucleatum e na Tabela 5.6 a estatística da redução em UFC/ml.
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
Cont role TBO LASER 1 LASER 2 LED PDT L1 PDT L2 PDT LED
Tabela 5.5 – Medidas descritivas da contagem visual para os grupos em triplicata mostrando
percentualmente as colônias viáveis e sua redução para o Fusobacterium nucleatum
1,00E+03 UFC/ml 1,00E+02 UFC/ml
Quota Viáveis %
Redução
%
1 2 3 1 2 3
1000 1000 572 70 58 100 1
100 0
73 197 97 7,3 19,7 7,3 1 100 0
1000 1000 1000 70 58 100 1 100 0
1000 1000 1000 70 58 100 1 100 0
1000 1000 1000 70 58 100 1 100 0
23 60 61 2,3 6 6,1 0,063 6,3 93,7
107 141 116 10,7 14,1 11,6 0,15 16 84
2 0 3 0,2 0 0,3 0,002 0,2 99,8
Tabela 5.6 - Medidas descritivas da média, desvio padrão e erro padrão para o Fusobacterium
nucleatum.
Fn Estatística Redução
Grupos
Media Desvio Padrão Erro Padrão
Controle
76 21,63 12,48
TBO
11,43
7,15
4,133
LASER 1
76 21,6 12,48
LASER 2
76 21,6 12,48
LED
76 21,63 12,48
PDT L1
4,8 2,16 1,25
PDT L2
12,13 1,76 1,01
PDT LED
0,16 0,15 0,087
Fn
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
Controle TBO LASER 1 LASER 2 LED PDT L1 PDT L2 PDT LED
Grupos
UFC/ml
Figura 5.6 - Redução bacteriana do Fusobacterim nucleatum em escala logarítmica e os desvios
padrões para os grupos analisados.
De acordo com os resultados alcançados no gráfico acima (FIG 5.6)
pode-se notar uma redução bastante evidente para os grupos PDT (grupos 6, 7
e 8) quando comparados ao controle (grupo 1) e grupos 3, 4, 5. No grupos 6
obteve-se uma redução de mais de um log, no 8 uma diminuição logarítmica de
mais de dois logs e no grupo 7 houve também uma redução menor (um log).
No grupo 2 pode-se observar que somente o TBO é bactericida para esta
amostra de Fusobacterim nucleatum tendo uma redução de aproximadamente
um log.
5.2.3 - Resultados obtidos para a Prevotella intermedia
A (TAB 5.7) apresenta as medidas descritivas da contagem visual da
quantidade de colônias viáveis e o percentual de redução para a Prevotella
intermédia e na Tabela 5.8 a estatística de redução em UFC/ml.
Tabela 5.7 – Medidas descritivas da contagem visual para os grupos em triplicata mostrando
percentualmente as colônias viáveis e sua redução para a Prevotella intermedia
1,00E+03 1,00E+02
Quota Viáveis %
Redução
%
1 2 3 1 2 3
1000 1000 1000 100 100 100 1 100 0
1000 1000 1000 100 100 100 1 100 0
1000 1000 1000 100 100 100 1 100 0
1000 1000 1000 100 100 100 1 100 0
1000 1000 1000 100 100 100 1 100 0
736 726 749 73,6 72,6 74,9 0,73 73,7 26,3
608 636 597 60,8 63,6 59,7 0,61 61,4 38,6
512 487 516 51,2 48,7 51,6 0,50 50,5 49,5
Tabela 5.8 - Medidas descritivas da média, desvio padrão e erro padrão para Prevotella intermedia
Estatística Redução
Media Desvio Padrao Erro padrao
Controle
100 0 0
TBO
100 0 0
LASER 1
100 0 0
LASER 2
100 0 0
LED
100 0 0
PDT L1
73,7 1,15 0,66
PDT L2
61,36 2,01 1,16
PDT LED
50,5 1,57 0,90
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
Controle TBO LASER 1 LASER 2 LED PDT L1 PDT L2 PDT LED
Grupos
UFC/ml
Figura 5.7 – Redução bacteriana da Prevotella intermedia em escala logarítmica e os desvios
padrões para os grupos analisados.
De acordo com os resultados alcançados no gráfico acima (FIG 5.7)
pode-se notar uma redução para os grupos PDT (grupos 6, 7 e 8) quando
comparados ao controle (grupo 1) e grupos 2, 3, 4, 5. Em relação às bactérias
anteriores analisadas, o Actinobacillus actinomycetemcomitans e
Fusobacterium nucleatum os resultados foram em termos logaritmos mais
pobres, mas mesmo assim houve redução bacteriana nos grupos PDT (grupos
6,7,8).
No gráfico que se segue podem-se observar as três bactérias envolvidas
no experimento e o grau de sensibilização letal dos grupos avaliados onde
houve uma significativa redução no número de unidades formadoras de
colônias (UFCs) nos grupos testados com PDT (FIGURA 5.8).
Controle ITBO IECCO IMM ILED PDTECCOPDTMM PDTLED
0,00E+000
2,00E+007
4,00E+007
6,00E+007
8,00E+007
1,00E+008
logUFC
Grupos
Fn
Aa
Pi
Figura 5.8: Número de células viáveis nos grupos de bactérias (Fusobacterium nucleatum em
vermelho, Actinobacillus actinomycetemcomitans em verde e Prevotella intermedia em azul) para os
grupos investigados.
O grupo 1 (controle – inóculo), sem qualquer tratamento, apresentou
ótimo crescimento bacteriano (1,5x10
3
UFC/ml). Nos grupos 2, 3, 4, 5, não
houve redução bacteriana, mostrando que somente o corante (grupo 2) e
apenas a irradiação sem o corante (grupos 3,4,5) não alteraram a viabilidade
das espécimes testadas. No entanto, os grupos que foram irradiados
associados ao corante (grupos 6,7,8) pela técnica de PDT com o tempo de 3
minutos (∆t= 3min), mostraram-se sensíveis à terapia proposta, apresentando
um número muito menos expressivo de crescimento bacteriano. Houve uma
redução significante (p<0,05) das bactérias em relação ao número inicial de
unidades formadoras de colônias (UFCs) (FIG. 5.8).
Nas amostras ficou evidente que nos grupos que se submeteram à
técnica de sensibilização letal (grupos 6,7,8) o número de colônias é
visualmente menor que os grupos controle/inóculo (grupo 1) e nos grupos 2,3,4
e 5.
Figura 5.9 - Percentual de redução bacteriana atingida no experimento para as três bactérias
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Fusbacterium nucleatum e Prevotella intermedia nos Grupos
6 (PDT L1), Grupo 7 (PDT L2) e Grupo 8 (PDT LED).
De acordo com a Figura 5.9 se obteve uma redução bacteriana de
99,8% no grupo 6, 81,9% no grupo 7 e 99,8% no grupo 8 para o Actinobacillus
actinomycetemcomitans, de 93,7% no grupo 6, 84% para o grupo 7 e 99,8% no
grupo 8 para o Fusobacterium nucleatum e 26,3% no grupo 6, 38,6% no grupo
7 e 49,5% no grupo 8 para a Prevotella intermedia.
Há de se ressaltar que no grupo 2 do Fusobacterium nucleatum houve
uma significativa redução da viabilidade das colônias mostrando que o corante
TBO a 0,01% é efetivo para a morte dessa bactéria mesmo na ausência de luz
(laser ou LED emitindo entre 640 e 660nm) (FIG 5.8 – Grupo 2 - ITBO).
Os resultados estatísticos entre os grupos 1 (controle) e os grupos 6, 7 e
8 estão descritos na (TAB.5.9), utilizando o Teste t student entre duas
amostras presumindo variâncias semelhantes, com uma probabilidade de
Percentual de redução das unidades formadoras de
colônias por mililitro para as bactérias
0
20
40
60
80
100
120
Aa Fn Pi
Bactérias
Percentual de
redução
PDT L1
PDT L2
PDT LED
significância (p<0,05), tendo portanto 95% de confiança nas conclusões
apresentadas.
Tabela 5.9 – Medidas descritivas para a probabilidade de significância (p<0,05) para as bactérias
Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa), Fusobacterium nucleatum (Fn) e Prevotella intermédia
(Pi) dos grupos 6, 7 e 8 em relação ao grupo 1 (controle) utilizando-se o Teste t student entre as
amostras avaliadas presumindo variâncias semelhantes. (Utilizou-se um nível de significância de
0,05 (p=0,05), onde os valores de p < 0,05 são considerados diferentes).
Grupos/ p<0,05 Aa Fn Pi
Grupo 6
2,00801x10
-6
0,038 0,0009
Grupo 7
6,79195x10
-7
0,045 0,001
Grupo 8
1,12838x10
-6
0,033 0,0004
De acordo com os valores encontrados, pode-se afirmar que existe
diferença significativa entre as amostras dos grupos 6, 7 e 8 das bactérias
Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa), Fusobacterium nucleatum (Fn) e
Prevotella intermédia (Pi) em relação ao grupo controle, lembrando também
que em relação aos grupos 2, 3, 4 e 5 todos os resultados para (p<0,05)
comparados com o grupo controle, os resultados foram superiores a p=0,05
não existindo diferença significativa entre os grupos a exceção para o grupo 2
(TBO) do Fusobacterium nucleatum (Fn), que apresentou um p=0,05
demonstrando uma equivalência com a probabilidade de significância para
p=0,05.
Com os resultados alcançados é lícito afirmar que existe diferença
significativa entre os grupos PDT (grupos 6, 7 e 8) em relação aos outros
grupos (1, 2, 3, 4, 5) e que a redução microbiana nos grupos 6, 7, 8 são
relevantes quando comparadas com o grupo 1 (controle) para p=0,05.
Abaixo nas figuras 5.10, 5.11 e 5.12 está demonstrado através de
imagens feitas no fluxo laminar com a câmera Canon G3 e estativa para
padronização das fotos, uma imagem de cada grupo nas placas de Petri para
que seja feita a contagem digital (ANEXO 4).
Grupo 1 - 10
2
Fn Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4
Grupo 5 Fn Grupo 6 Grupo 7 Grupo 8
Figura 5.10 – Amostras para contagem de Fusobacterium nucleatum na placa de Petri onde se
observa que nos grupos 1, 2, 3, 4 e 5 o número de pontos correspondentes às colônias bacterianas
é muito maior que nos grupos PDT (grupos 6,7,8)
Figura 5.11 – Amostras para contagem de Actinobacillus actinomycetemcomitans na placa de Petri
onde se observa que nos grupos 1, 2, 3, 4 e 5 o número de pontos correspondentes às colônias
bacterianas é muito maior que nos grupos PDT (grupos 6,7,8) ressaltando que no grupos 6
praticamente não foi constatado nenhuma colônia e no grupo 8 somente uma.
Grupo 1 - 10
2
Aa Grupo 2 Aa Grupo 3 Aa Grupo 4 Aa
Grupo 5
Aa Grupo 6 Aa Grupo 7 Aa Grupo 8 Aa
Grupo 1 - 10
2
Pi Grupo 2 Pi Grupo 3 Pi Grupo 4 Pi
Grupo 5 Pi Grupo 6 Pi Grupo 7 Pi Grupo 8 Pi
Figura 5.12 – Amostras para contagem de Prevotella intermedia na placa de Petri onde se observa
que nos grupos 1, 2, 3, 4 e 5 o número de pontos correspondentes às colônias bacterianas é maior
que nos grupos PDT (grupos 6,7,8) e o grupo 8 o número de colônias é bem menor do que os outros
dois grupos PDT (grupos 6 e 7)
Mesmo através do método visual nas imagens ilustrativas abaixo nota-se
uma redução significativa de bactérias viáveis nos grupos 6, 7 e 8 (após a PDT)
em relação ao grupo 1 (inóculo). Pode-se observar também diminuição da
concentração celular nos campos observados, sugerindo uma alteração do
volume dessas células nos grupos 6,7,8 em relação ao grupo 1 (inóculo). (FIG.
5.13)
Grupo 1 Grupo 6 Grupo 7 Grupo 8
Grupo 1 Grupo 6 Grupo 7 Grupo 8
Grupo 1 Grupo 6 Grupo 7 Grupo 8
Figura 5.13 – Imagens de microscopia ótica das lâminas coradas pelo método de gram das
amostras de Fusobacterium nucleatum (Fn), Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) e
Prevotella intermédia (Pi) dos grupos 1 (inóculo) e dos grupos PDT (grupos 6,7 e 8) onde pode-se
avaliar pela imagem que os grupos 6,7 e 8 quando comparados com o grupo 1 (inóculo) vê-se um
número muito menor de pontos corados demonstrando menos bactérias viáveis.
Na Figura 5.14 (a e b) pode-se ver que a presença do corante
ressonante com o comprimento de onda da luz é importante para a absorção
seletiva da luz e isto pode ser demonstrado pela gaussiana da figura 5.14b,
sendo que na Figura 5.14a o feixe de luz do laser é transmitido pelo meio com
bactérias sem aparentar absorção.
G
G
1
1
F
F
n
n
G7
Aa
G8
Aa
G
G
6
6
P
P
i
i
G
G
7
7
P
P
i
i
G
G
8
8
P
P
i
i
G1
Aa
G6
Aa
G
G
6
6
F
F
n
n
G
G
1
1
F
F
n
n
G
G
7
7
F
F
n
n
G
G
8
8
F
F
n
n
G
G
1
1
P
P
i
i
Grupo 3 – Irradiação com Laser 1
mostrando a transmissão da luz
no meio (5.14a)
Grupo 7 – Irradiação com Laser 1
mostrando a absorção da luz no
meio (gaussiana) (5.14b)
Figura 5.14 – As imagens mostram a transmissão da luz no grupo sem corante (5.14a) e a absorção
da luz pelo corante TBO a 0,01% (5.14b) para o Laser 1.
Os resultados mostram percentualmente que o Laser nº1 e o LED foram
mais eficientes na redução bacteriana que o Laser nº2, principalmente para o
Actinobacillus actinomycetemcomitans, onde no grupo 7 sobraram muitos mais
colônias do que no grupo 6 e 8, e isto pode ser explicado pelo fato desses
equipamentos (Laser 1 e LED) possuírem uma potência de saída do feixe em
torno de 100mW +-2nm e o Laser nº2 apenas 40mW. Em termos de densidade
de energia irradiada (fluência – J/cm
2
) aplicada nos tubos de ensaio com as
amostras, verificou-se que com o Laser nº1 foram utilizados 18,54J/cm², o
Laser nº2 foi de 7,2J/cm² e o LED 36J/cm².
Apesar da fluência do LED ter sido muito maior do que os lasers é
importante ressaltar que o LED possui uma dispersão maior do feixe de luz
devido às suas características de divergência em relação aos lasers, onde a luz
tem características de coerência espacial e temporal, como também
paralelismo, mas segundo Karu (2003), a coerência da luz não é importante
nos resultados clínicos esperados pela fototerapia. Portanto, a radiação emitida
por LEDs pode ser caracterizada como monocromática, não coerente e
espontânea e de acordo com os resultados obtidos e analisados pode-se
corrobar com essa consideração.
Uma vantagem deste tratamento é sua ação local e restrita,
assegurando uma manutenção na ecologia entérica que, normalmente é muito
afetada pelos antibióticos, e mesmo a microflora de vários sítios na própria que
também não é afetada pelo tratamento local (Wilson, Burns, Pratten, 1996).
Se pequenas doses de laser associadas a um corante ressonante são
eficientes para eliminar as bactérias periodontopatogênicas in vitro, a terapia
fotodinâmica é um meio útil para eliminação destas bactérias nas bolsas
periodontais (Wilson e Yanni, 1993 e Wilson, Dobson e Sarkar, 1993). E, como
as periodontites crônicas e agressivas são infecções localizadas, esta terapia
apresenta-se como uma opção de tratamento em que não há necessidade de
administração sistêmica de agentes de sensibilização, porque estes podem ser
aplicados diretamente, pela irrigação subgengival.
Diversas fontes de luz (lasers, luz policromática e outras) foram
utilizadas ao longo dos anos, usando-se principalmente comprimentos de onda
no espectro visível e mais especificamente no vermelho associados a vários
corantes, devido à boa penetração deste comprimento de onda nos tecidos
biológicos (Karu, 2003). Além disso, alguns trabalhos mostram que o
tratamento com luz vermelha, ou azul, pode ser empregado como método
terapêutico, para inativar determinadas bactérias periodontopatogênicas, que
sintetizam porfirinas, cromóforos endógenos naturais, sem o uso de um
fotossensibilizador externo (Henry et al., 2000 e Konig et al., 2000). Portanto,
ambas as técnicas (luz ou luz + fotossensibilizador) podem ser propostas como
potenciais terapias, de baixo custo, para o tratamento e prevenção de doenças.
O importante na terapia fotodinâmica é a capacidade de excitar o
fotossensibilizador em seu alvo com um mínimo efeito circunvizinho (Ribeiro et
al., 2005).
Frente ao exposto acima, se constata que as características de
coerência e paralelismo dos lasers não são relevantes para a PDT, tendo em
vista que os resultados obtidos com o LED não tiveram diferença estatística
significante em relação aos lasers.
A terapia fotodinâmica é um eficiente método de redução bacteriana,
sendo o seu uso na Odontologia bem indicado, visto que a terapia fotodinâmica
se mostra muito eficiente em infecções localizadas, de pouca profundidade e
de microflora conhecida. Os trabalhos encontrados na literatura mostram a
viabilidade de uso desta terapia, como auxiliar no tratamento de infecções na
cavidade oral, por ser a PDT uma terapia de baixo custo e, principalmente, com
mínimos efeitos colaterais sem efeitos sistêmicos, além de não haver o risco de
provocar resistência bacteriana.
Os LEDs também são uma nova e boa opção para a sensibilização letal
das bactérias avaliadas.
6 – CONCLUSÃO
Os corantes azul de toluidina e azul de metileno tiveram melhor
comportamento em relação à avaliação de linearidade de absorção pelos
equipamentos de luz (lasers e LED) do que o verde de malaquita.
Em relação aos corantes testados, o corante azul de toluidina (TBO) a
0,01% associado aos lasers e ao LED apresenta adequado potencial para a
utilização em PDT na sensibilização letal das bactérias Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum e Prevotella intermedia nos
parâmetros utilizados no experimento (∆t=3minutos).
Os resultados estatísticos obtidos pelo Teste t-student demonstraram
que os grupos PDT (grupos 6, 7, 8) são diferentes do grupo controle para
p=0,05 e os valores percentuais de redução bacteriana dos grupos PDT foram
de 99,8% no grupo 6, 81,9% no grupo 7 e 99,8% no grupo 8 para o
Actinobacillus actinomycetemcomitans, de 93,7% no grupo 6, 84% para o
grupo 7 e 99,8% no grupo 8 para o Fusobacterium nucleatum e 26,3% no
grupo 6, 38,6% no grupo 7 e 49,5% no grupo 8 para a Prevotella intermédia.
7 – SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
- Avaliação da redução bacteriana para as bactérias periodontopatogênicas
utilizadas no experimento em relação a vários tempos de irradiação.
- Analisar o índice de efetividade de sensibilização letal das bactérias testadas em
relação à dosimetria
- Estudar qual o mecanismo de destruição bacteriana que acontece nas bactérias
avaliadas em termos estruturais e moleculares e se esta morte é por necrose ou
apoptose e quais as estruturas lesadas.
- Conhecer os mecanismos físicos dos corantes utilizados no experimento e
determinar uma concentração ideal que fotossensibilize os microorganismos e que
não interfira nos sistemas biológicos.
- Aprimorar a leitura digital das UFCs na placa de Petri.
ABSTRACT
The aim of the present study is to evaluate in vitro lethal sensibilization of
periodontopathogenic bacteria: Fusobacterium nucleatum (Fn), Actinobacillus
actinomycetemcomitans (Aa) and Prevotella intermedia (Pi) by using toluidine
blue (0.01% w/v) as photo sensitizer and comparing the irradiation of identical
solutions of bacteria with photo sensitizer by three light sources: two lasers
systems of different companies (660 nm) and one LED equipment (light emitting
diode, 630 nm). For each species, they were established a control group and
different test groups, among them: Group 6 (Fn, Aa and Pi) – bacteria solution
irradiated by laser 1; Group 7 (Fn, Aa and Pi) – bacteria solution irradiated by
laser 2 and Group 8 (Fn, Aa and Pi) – bacteria solution irradiated by LED.
Irradiation protocol followed the literature recommendations: 5 minutes of pre-
irradiation time and 3 minutes of irradiation. Results reveal that the bacteria
reduction for the irradiated groups (6, 7 and 8) in comparison with control group
is statistically significant (p<0.05). Actinobacillus actinomycetemcomitans
presented important level of reduction (99.8% for Group 6Aa, 81.9% for Group
7Aa and 99.8% for Group 8Aa) as well as Fusobacterium nucleatum (93.7% for
Group 6Fn, 84% for Group 7Fn and 99.8% for Group 8Fn). Prevotella
intermedia presented low level of reduction (26.3% for Group 6Pi, 38.6% for
Group 7Pi and 49.5% for Group 8Pi). Toluidine blue at concentration of 0.01%
w/v is an effective photosensitizer for Actinobacillus actinomycetemcomitans
and Fusobacterium nucleatum when irradiated with the light wavelength in the
range of 630 to 660 nm using laser or LED light sources.
Keys words
- periodontopathogenic bacteria, Photodynamic Therapy, lethal
sensibilization
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ANEXO 1
Fontes de luz
Nos 20 anos de história das comunicações ópticas, viu-se uma
notável evolução na tecnologia das fibras, dos Lasers, dos LEDs (Light Emitting
Diodes) e fotodetectores que permitem aos sistemas ópticos não apenas
substituir os elétricos com vantagens operacionais, mas também realizar
funções que eram antes impossíveis. Existem várias fontes ópticas que podem
ser utilizadas em odontologia como os Lasers e os LEDs.
De acordo com Ackroyd et al.. (2001), as primeiras fontes de luz
utilizadas eram lâmpadas convencionais, com luz não-coerente, policromática e
forte componente térmico associado. Com o desenvolvimento do laser, este se
mostrou mais eficiente que lâmpadas comuns, para uso em terapia
fotodinâmica. O laser produz luz monocromática com comprimento de onda
bem conhecido, o que o torna altamente seletivo aos corantes. A dose de
radiação é facilmente calculada e a área da radiação pode ser bem controlada.
Além disso, a radiação pode ser transmitida por fibra óptica e esta pode
receber adaptações para melhor acesso à lesão, como microlentes e difusores.
O laser apresenta características particulares que o diferem das
demais fontes luminosas, como monocromaticidade, caracterizada pala
emissão de fótons com o mesmo comprimento de onda e, portanto, apenas
uma cor; coerência, resultante de mesmo comprimento de onda e mesma fase,
além da direcionalidade, definida pela capacidade da luz de se propagar em
uma única direção (SOUSA, 2001).
Laser
“A palavra LASER é o acrônimo de “Light Amplification by Stimulated
Emission of Radiation”, isto é: “Amplificação da Luz por Emissão Estimulada de
Radiação”.
A emissão estimulada foi descrita pela primeira vez em 1917, por
Einstein, de forma teórica. A primeira possibilidade de aplicação desse
fenômeno à amplificação de ondas ultracurtas (maser - microwave amplification
stimulated emission of radiation) foi definida por C. H. Townes em 1951 e
recebeu a confirmação experimental em 1954 (MAILLET, 1987).
A primeira publicação em matéria de Lasers foi o artigo de A. L.
Schawlow e C.H. Townes, em dezembro de 1958, tendo repercussão mundial
nos meios científicos (MAILLET, 1987).
O primeiro laser construído foi um laser de rubi (λ = 694,3nm), por
Theodore Maiman, na Califórnia-USA, em 1960 (MAILLET, 1987)”.
Em 1963, equipes médicas americanas comandadas por Zweng e
Vassiliadis em São Francisco e Campbell em Nova York, divulgaram os
primeiros resultados clínicos obtidos com Lasers, despertando interesse entre
outros profissionais como Goldman em dermatologia, Stern em odontologia,
Klein, Fine e Mac Guff em oncologia.
Contudo, os primeiros aparelhos ao alcance dos médicos não eram
suficientemente dignos de confiança, levando a alguns acidentes, que vieram
deter o avanço do laser em medicina, de forma que à euforia inicial, sucedeu-
se o desinteresse por essa nova técnica.
A partir de 1968, Esperance, nos USA, substituiu o laser de rubi por um
laser contínuo de argônio, aparentemente menos perigoso, crescendo de novo
o interesse da comunidade médico-científica nos Lasers (GUILLET e
MIRO,1987)”.
Propriedades do Laser
A luz laser apresenta características particulares que a difere das
demais fontes luminosas, como:
Monocromaticidade
É caracterizada por emissão de fótons, todos com o mesmo
comprimento de onda, e, portanto, com uma única cor (FIG. 2), diferindo-se da
luz proveniente de filamentos incandescentes ou lâmpadas, que por sua vez,
são constituídas de vários comprimentos de onda (FIG. 1) (CECCHINI, 1995)
FIGURA 1 – Representação artística da dissociação da luz policromática quando emitida sobre
um prisma
FIGURA 2 - Representação artística da luz monocromática (por ex. um laser) sobre um prisma,
mostrando que não ocorre a sua dissociação, mantendo as características.
Coerência
A coerência ocorre quando se tem ondas de mesmo comprimento e em
fase, isto é, as ondas caminham de forma similar no espaço e no tempo, como
um exército marchando com movimentos sincronizados. Tal característica não
ocorre com a luz comum, onde diversas ondas são emitidas, cada qual com
sua freqüência e seu comprimento de onda característicos, de forma a viajar no
espaço e no tempo incoerentemente, como um grupo de indivíduos andando
de forma aleatória (CECCHINI, 1995).
As oscilações são uniformes, quando caminham no espaço de modo
ordenado sem perda de energia, possuindo ondas justapostas, cuja amplitude
tem valores iguais, e sua trajetória apresenta-se ordenada em relação ao
tempo, onde deve haver coincidência de cristas e vales das ondas, bem como,
mesma freqüência (FIG.3) (BRUGNERA et al., 1991)
FIGURA 3 - Representação artística de ondas ilustrando coerência espacial e tempora
l
Direcionalidade
Coerência
espacial
Coerência
temporal
É definida pela capacidade que a luz laser possui de se propagar em
uma única direção (FIG. 4 e.5) (TAYLOR e FRENCH, 1987).
FIGURA 4 – Representação artística de ondas gerada por uma luz incandescente e emitida em
todas as direções
FIGURA 5 – Representação artística de ondas geradas por um laser, mostrando paralelismo
Classificação dos Lasers
Os Lasers são classificados em Lasers em baixa intensidade, que são
Lasers que têm efeitos teciduais não térmicos e Lasers em alta intensidade
com efeitos térmicos sobre os tecidos biológicos.
A utilização dos Lasers em baixa intensidade tem sido estudada desde
os anos 60, principalmente pelo grupo do Prof. Endre Mester que foi um dos
pioneiros no uso do laser nos tecidos biológicos, objetivando um aumento da
velocidade de reparação tecidual (TURNER e HODE, 1999).
Nas pesquisas feitas até o momento atual, constatou-se que os Lasers
em baixa intensidade promovem vários efeitos terapêuticos como: efeitos
analgésicos, antiinflamatórios e trófico-regenerativos.
Laser
Os efeitos demonstrados levam ao aumento da microcirculação local,
aumento da drenagem linfática, proliferação celular e dos fibroblastos, levando
a um aumento na síntese de colágeno (CRUAÑES 1984, TRELLES &
MAYAYO 1992; ABERGEL et al.. 1996) entre outros.
LEDs (Light Emitting Diode)
Os LEDs, são estruturas compostas por dois materiais semicondutores
nos quais, em sua junção, por diferença de cargas, ocorre a emissão de luz,
sem aumento de temperatura (TALES et. al, 1998), e emissão é espontânea
diferindo-se dos Lasers, que produzem emissão estimulada de radiação
(ZANIN & BRUGNERA, 2002).
Um LED ou diodo emissor de luz é um componente eletrônico
formado por material semicondutor que emite luz quando uma corrente elétrica
passa através desse. Os LEDs emitem luz por meio da movimentação de
elétrons através de diferentes materiais semicondutores, produzindo uma
emissão espontânea de fótons não coerentes.
Figura 6 - LED que emite luz azul
LEDs (Light Emitting Diode) (FIG 6) são diodos especiais que emitem luz
quando conectados em um circuito. Eles são freqüentemente usados como luz
“piloto” em equipamentos eletroeletrônicos indicando quando o circuito está
fechado ou não. Os dois filamentos que existem debaixo do LED indicam como
eles deveriam ser conectados num circuito. O lado negativo de um LED é
indicado de duas maneiras: 1) pelo lado plano do bulbo 2) pelo mais curto dos
dois fios que estendem dos LEDs. A parte anterior negativa do LED deveria ser
conectada na parte negativa da bateria. LEDs operam em tensões
relativamente baixas, entre aproximadamente de um a quatro volts e com
correntes de aproximadamente 10 a 40 milliamperes. Tensões e correntes
acima desses valores podem derreter o chip de um LED. A parte mais
importante de um LED é o chip de um semicondutor localizado no centro do
bulbo. O chip tem duas regiões separadas por uma junção. A região p é
dominada por cargas elétricas positivas e a região n é dominada por cargas
elétricas negativas. A junção age como uma barreira ao fluxo de elétrons entre
a região p e a região n. Somente quando suficiente tensão é aplicada no chip
do semicondutor, pode a corrente fluir com os elétrons transitando para a
região p (FIG.7).
Figura 7 - Microchip do LED
Entre os dispositivos usados como fonte de luz, os LEDs são os mais
simples e baratos, e sua principal desvantagem em relação aos Lasers reside
no espectro mais largo de luz gerada. Mas são extremamente mais eficazes do
que a luz halógena, por possuírem um espectro de emissão bem mais estreito
que estas, (STAHL et al., 2000).
A diferença básica entre LEDs e Lasers é que nos primeiros predomina
o mecanismo da emissão espontânea de radiação e nos Lasers a emissão da
luz é estimulada. Desta distinção básica decorrem as diferenças estruturais
entre os dois dispositivos, nem sempre acentuados, gerando diferenças
funcionais, que dão aos Lasers um desempenho geralmente superior, porém,
mais cara e complicada (KARU, 2003).
Os Lasers precisam de grande quantidade de energia para sua
geração, enquanto os LEDs necessitam de pouca energia para a geração de
luz. Entre os dispositivos utilizados como fonte de luz em odontologia, os LEDs
são os mais simples e baratos. Apresentam um largo espectro de luz sendo
mais utilizados em sistemas de transmissão de menor capacidade. Embora
sejam umas fontes de luz divergente e não coerente semelhante à luz
halógena, apresentam um espectro de emissão bem mais estreito, tendo um
aproveitamento bem melhor que a luz halógena (STHAL et al., 2000).
Os Lasers precisam de grande quantidade de energia para sua geração
enquanto os LEDs necessitam de pouca energia para a geração de luz.
(STHAL et al., 2000).
Quando é aplicada tensão suficiente ao chip no plano anterior do LED,
elétrons podem mover em uma única direção através da junção entre a região
p e n. Na região p existem muito mais cargas positivas do que negativas. Na
região n os elétrons negativos são mais numerosos do que os com carga
positiva. Quando uma tensão é aplicada e uma corrente começa a fluir,
elétrons da região n apresentam energia suficiente para moverem-se através
da junção até a região p. Uma vez na região p os elétrons são imediatamente
atraídos pela carga positiva (atração mútua das forças de Coulomb) devido a
atração entre cargas elétricas opostas. Quando um elétron move
suficientemente próximo a uma carga positiva na região p, as duas cargas se
recombinam. A cada momento um elétron recombina com uma carga positiva
sendo que uma energia potencial elétrica é convertida em energia
eletromagnética. Para cada recombinação de carga positiva e negativa, um
quantum de energia eletromagnética é emitido na forma de fóton de luz com
uma freqüência característica de um material semicondutor (usualmente uma
combinação de elementos químicos como gallium, arseneto e fósforo).
Somente fótons com freqüências muito baixas podem ser emitidos por qualquer
material. LEDs que emitem cores diferentes são feitos de materiais
semicondutores diferentes requerendo diferentes energias para iluminarem.
A energia elétrica é proporcional à tensão necessária para fazer fluir
elétrons através da junção p-n. Os diferentes LEDs coloridos emitem
predominantemente luz de uma única cor. A energia da luz emitida por um LED
esta relacionada a carga elétrica de um elétron e a tensão exigida para iluminar
um LED que é dada pela expressão; E-qV joules. Esta expressão
simplesmente diz que a tensão é proporcional à energia elétrica e é uma
declaração geral que aplica a qualquer circuito, como também para LEDs. A
constante q é uma carga elétrica de um único elétron, -1,6 x 10
-19
coulomb.
Suponha que você mediu a tensão através do plano anterior de um LED e você
deseja achar a energia requerida para iluminar o LED. Se tivermos um LED
vermelho, por exemplo, e a tensão medida entre os planos anteriores é 1,71
volts, então a energia requerida para iluminar o LED é dada pela expressão E=
qV ou E= -1,6 x 10-19 (1,71) joule, desde que um coulomb volt é um joule.
Multiplicando esses números temos então 2,74 x 10
-19
joule. A freqüência da
luz é relacionada ao comprimento de onda de um modo muito simples. O
espectrômetro pode ser usado para examinar a luz dos LEDs e calcular o pico
máximo de luz emitido pelo comprimento de onda do equipamento. O
comprimento de onda é relacionado à freqüência de luz por: f=c/
λ
onde c é a
velocidade da luz (3x10
8
m/s) e λ é o comprimento de onda de luz de leitura do
espectrômetro (em unidade de nanômetros). Observando um LED vermelho
através de um espectrômetro, e achando a gama de cores que os LEDs
emitem com intensidade máxima correspondendo ao comprimento de onda de
leitura no espectrômetro de λ= 660nm, a freqüência com qual o vermelho emite
a maioria da sua luz é 4,55 x 10
14
hertz.
ANEXO 2
Espectroscopia
Espectroscopia, em física e físico-química, significa o estudo dos
espectros. Baseia-se no fato de que cada elemento químico tem seu espectro
característico. Esse fato foi observado em 1859 pelos cientistas alemães
Gustav Robert Kirchhoff e Robert Wilhelm Bunsen. Kirchhoff e Bunsen
desenvolveram o espectroscópio de prisma em sua forma moderna e o
aplicaram às análises químicas. Esse instrumento é formado por uma fenda,
pela qual entra a luz procedente de uma fonte externa, um conjunto de lentes,
um prisma e uma ocular. No espectrógrafo, a ocular é substituída por uma
câmera. O espectrofotômetro é usado para medir a intensidade da luz em
comparação com a de uma luz procedente de uma fonte padrão. Essa
comparação permite determinar a concentração da substância que produz esse
espectro. A luz é emitida e absorvida em unidades minúsculas ou corpúsculos
chamados fótons ou quanta. O átomo emite ou absorve um quanta de luz de
uma cor determinada quando um dos seus elétrons salta de uma órbita para
outra. Os componentes de uma molécula são os núcleos dos diferentes átomos
que a formam e os elétrons que rodeiam cada núcleo. A emissão e a absorção
de luz por parte de uma molécula correspondem a seus diferentes modos de
rotação, aos modos de oscilação de seus núcleos atômicos e aos movimentos
periódicos de seus elétrons nas distintas órbitas. Só é possível medir o
comprimento da onda dos fótons emitidos por uma molécula ou átomo, é
possível deduzir uma considerável quantidade de informações sobre sua
estrutura e sobre os distintos modos de movimento periódico de seus
componentes. A maioria das informações que os físicos têm sobre a estrutura
do átomo foi obtida mediante espectroscopia. Os dois principais usos da
análise espectral estão na química e na astrofísica. O espectro de um
determinado elemento é absolutamente característico desse elemento. Quando
se estimula uma substância desconhecida mediante uma chama, um arco
voltaico, uma fagulha ou outro método apropriado, uma análise rápida com um
espectrógrafo costuma ser suficiente para determinar a presença ou a ausência
de um determinado elemento. Os espectros de absorção são, muitas vezes,
úteis para identificar compostos químicos. Os métodos magnéticos de
espectroscopia na região do espectro das radiofreqüências são muito úteis
para proporcionar informação química sobre as moléculas e mostrar sua
estrutura detalhada. (BUNGE, 1977, HANNA, 1969, LI-CHAN, 1996).
ANEXO 3
Medidas descritivas da transmissividade do Laser 1, Laser 2 e LED para
a água (baseline) e os corantes azul de toluidina (TBO), verde de malaquita
(VM) e azul de metileno (MB) utilizados no experimento 1, simulando as
condições de teste e eliminando as possíveis conseqüências da atenuação da
irradiação na cubeta.
Nas tabelas a seguir estão os valores obtidos pelo Power Meter para os
Laser 1, Laser 2 e LED, onde foi encontrada a Linha de Base (água) que serviu
como parâmetro para os corantes e a relação da calibração entre a potência
declarada pelo fabricante nos equipamentos e a potência efetivamente
irradiada na solução na cubeta de acrílico. O Laser 1 e o LED têm a potência
fixa e para tal avaliação foi necessário um filtro de transmissão para variação
da potência e para o Laser 2 não houve necessidade do filtro porque este
equipamento tem uma regulagem da potência.
Laser 1 (Ecco)
100mW
Água (a1)
100% 49,3
80% 40
60% 28,8
40% 17,95
20% 8,1
s/filtro 76,7
Laser 2
(mmoptics) 40mW
Água (a2)
40mW 40,8
35 35,7
30 30,5
25 25
15 15
10 9,4
s/filtro 40,8
LED Água (a3)
100% 25,04
80% 22,11
60% 15,92
40% 9,87
20% 4,87
s/filtro 55,4
E nas tabelas a seguir do lado direito estão os valores percentuais
encontrados para todos os corantes TBO (b), VM (c) e MB (d), tendo como
parâmetro a linha de base da água (a) e no centro os valores das medidas
descritivas da transmissividade dos corantes no experimento.
Laser 1 (Ecco)
100mW
TBO (b) (b/a1) x 100%
100% 0,04 0,08
80% 0,04 0,10
60% 0,03 0,10
40% 0,01 0,05
20% 0,01 0,12
s/filtro 0,10 0,12
Laser 1 (Ecco)
100mW
VM (c) (c/a1) x 100%
100% 0,12 0,24
80% 0,09 0,22
60% 0,07 0,24
40% 0,05 0,27
20% 0,02 0,24
s/filtro 0,2 0,26
Laser 1 (Ecco)
100mW
MB (d) (d/a1) x 100%
100% 0,04 0,08
80% 0,03 0,07
60% 0,02 0,06
40% 0,01 0,05
20% 0,01 0,12
s/filtro 0,1 0,13
Laser 2
(mmoptics) 40mW
TBO (b) (b/a2) x 100%
40mW 0,05 0,12
35 0,04 0,11
30 0,03 0,09
25 0,02 0,08
15 0,02 0,13
10 0,02 0,21
s/filtro 0,01 0,02
Laser 2
(mmoptics) 40mW
VM (c) (c/a2) x 100%
40mW 0,15 0,42
35 0,12 0,33
30 0,09 0,29
25 0,06 0,24
15 0,04 0,26
10 0,02 0,20
s/filtro 0,01 0,02
Laser 2
(mmoptics) 40mW
MB (d) (d/a2) x 100%
40mW 0,04 0,09
35 0,04 0,11
30 0,03 0,09
25 0,03 0,12
15 0,02 0,13
10 0,02 0,21
s/filtro 0,01 0,02
LED TBO (b) (b/a3) x 100%
100% 0,11 0,43
80% 0,12 0,54
60% 0,09 0,56
40% 0,06 0,60
20% 0 0
s/filtro 0,29 0,52
LED VM (c) (c/a3) x 100%
100% 0,15 0,59
80% 0,13 0,58
60% 0,09 0,56
40% 0,06 0,60
20% 0,03 0,61
s/filtro 0,31 0,55
LED MB (d) (d/a3) x 100%
100% 0,12 0,47
80% 0,11 0,49
60% 0,08 0,50
40% 0,05 0,50
20% 0,02 0,41
s/filtro 0,27 0,48
ANEXO 4
Medidas descritivas pelo Método Visual e Digital utilizadas no
experimento
Na contagem visual em determinadas situações onde se tem uma
saturação das UFCs na placa de Petri é utilizado como critério de avaliação
considerar o número de colônias semeadas, que neste experimento foi
considerado como 10
2
para o grupo 1 e 10
3
para os demais grupos.
Tabela 1 - Contagem de UFC/ml das três bactérias utilizando-se o método visual.
VISUAL
Aa1
Aa2
Aa3
Fn1 Fn2 Fn3 Pi1 Pi2 Pi3
G1- 10
2
57 89 83 70 58 100 100 100 100
G1- 10
3
1000
1000
1000
1000
1000
572 1000
1000
1000
G2 1000
1000
1000
73 197 97 1000
1000
1000
G3 1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
G4 1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
G5 1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
G6 0 0 4 23 60 61 736 726 749
G7 129 141 143 107 141 116 608 636 597
G8 1 3 0 2 0 3 512 487 516
Tabela 2 - Contagem de UFC/ml das três bactérias utilizando-se o método digital. Programa
IMAGEPROPLUS versão 6.0 (Nos campos pontilhados não foi possível a contagem digital).
DIGITAL
Aa1
Aa2
Aa3
Fn1 Fn2 Fn3 Pi1 Pi2 Pi3
G1- 10
2
44 73 71 41 52 557 - - - - - -
- - -
G1- 10
3
499 548 528 1198
- - -
- - -
4059
- - -
- - -
G2 595 739 571 64 44 80 2628
- - -
- - -
G3 559 581 602 1048
1056
803 - - - - - -
- - -
G4 634 532 538 1040
1280
1624
4366
- - -
- - -
G5 1347
738 816 28 750 808 458 1597
- - -
G6 0 0 4 17 38 2 91 1701
475
G7 238 141 128 128 32 128 516 - - -
- - -
G8 1 3 1 2 0 3 80 604 7
Tabela 3 - Contagem de UFC/ml das três bactérias utilizando-se o método META-VISUAL,
(> ou = a 749 considera-se 1000)
META-VISUAL
Aa1
Aa2
Aa3
Fn1 Fn2 Fn3 Pi1 Pi2 Pi3
G1- 10
2
44 73 71 41 52 557 100 100 100
G1- 10
3
499 548 528 1000
1000
1000
1000
1000
1000
G2 595 739 571 64 44 80 1000
1000
1000
G3 559 581 602 1000
1000
1000
1000
1000
1000
G4 634 532 538 1000
1000
1000
1000
1000
1000
G5 1000
738 816 28 1000
1000
458 1000
1000
G6 0 0 4 17 38 2 91 1000
475
G7 238 141 128 128 32 128 516 1000
1000
G8 1 3 1 2 0 3 80 604 7
As tabelas acima (TAB. 1, 2 e 3) foram elaboradas a partir dos
resultados colhidos na contagem das UFC/ml das placas de Petri dos grupos
avaliados, onde na tabela 1 têm-se os resultados obtidos na contagem visual,
na tabela 2 os resultados obtidos pela contagem digital, utilizando-se o
programa IMAGEPROPLUS versão 6.0 e a tabela 3 uma tabela meta-visual
onde todos os números acima de 749, que foi o número máximo de UFCs na
contagem visual foram considerados como 1000.
A contagem visual (TAB 1) é feita utilizando-se uma caneta marcadora e
só se consegue fazer esta contagem quando existe um número pequeno de
pontos na placa de Petri.
Em relação à contagem digital (TAB 2) utilizando-se o programa
IMAGEMPROPLUS versão 6.0 é uma tarefa em relação ao programa feita
facilmente, só que existem algumas considerações que limitam a confiabilidade
(FRANCISCO et al.. 2004).
Entre estas limitações pode-se considerar: A seleção do(s) filtro(s)
adequado(s) depende apenas das características de cada grupo de fotos, ou
mesmo das fotos individualmente, e seu erro teve de ser identificado
visualmente durante a contagem e corrigido, aplicando-se outros filtros ou
alterando a superfície limite.
A representatividade da área dos objetos a serem contados com relação
à área da superfície limite afeta a interpretação do programa. Por exemplo, se
houver poucos objetos de áreas relativamente pequenas em relação à
superfície, o programa “refina” sua contagem, pegando pequenas variações de
cor e considera também como objetos, gerando “erro grosseiro”, sendo assim,
se tiver quatro objetos numa placa estes podem acabar sendo contados como
mais de 8500. A correção neste caso pode ser feita por: análise segundo a
área média, considerando apenas o número de objetos que se enquadravam
numa dada classe de áreas; redução da superfície limite até o mínimo possível
que englobasse toda a amostra; aplicação de filtros mais “suaves” ou mais
“contrastantes”; ou, por fim, se nada disso der a devida confiabilidade, a
contagem visual será a única saída.
Os erros considerados mais comuns do programa, excluindo os
grosseiros citados acima, foram à superposição de objetos, quando dois
objetos justapostos foram contados como apenas um, e a consideração de
pequenas alterações de cor do fundo (geradas na aplicação de filtros) também
como objetos (FIG. 8).
Figura 8 – Placa de Petri com alterações no fundo.
O uso de macros, ou automações, não foi possível. Essa facilidade
funciona bem somente quando as fotos das amostras são tiradas em condições
rigidamente iguais e homogêneas (luz bem distribuída, posição placa/câmera
sempre igual) e também há similaridade entre as fotos em ordem de grandeza
do número de objetos (como exemplos podem usar mesmas configurações
para placas com 10 objetos e outras com 1000 certamente mostrarão grande
erro, que pode ser minimizado separando-as em grupos por ordem de
grandeza).
No caso das placas de Petri com demarcações no fundo, houve
necessidade de definição da superfície que não as englobasse. Foi feita a
análise de 1/8 do recipiente, o equivalente a uma divisão, com multiplicação
pelo fator oito para estimativa do total (FIG.9).
Figura 9 – Modelo de Placa de Petri com 8 divisões.
Algumas fotos da “Prevotella intermedia" possuíam resolução baixa dos
objetos, dificultando a definição de seu contorno, o que não foi
satisfatoriamente sanado com filtro algum e, portanto, a contagem não pôde
ser efetuada (FIG. 10).
Figura 10 – Placa de Petri do Grupo1 com uma quantidade incontável de UFCs/ml
Leitura Visual e Metavisual para Aa
0
200
400
600
800
1000
1200
G1-
102
G
1
-
10
3
G
2
G3
G
4
G5
G6
G7
G8
Aa1V
Aa2V
Aa3V
Aa1MV
Aa2MV
Aa3MV
Gráfico comparativo entre a leitura visual e meta-visual para o Actinobacillus
actinomycetencomitans, onde Aa1V, Aa2V, Aa3V são medidas visuais em triplicata para todos
os grupos e Aa1MV, Aa2MV e Aa3MV são as medidas meta-visuais em triplicata para todos os
grupos.
O gráfico acima mostra uma análise comparativa entre os grupos
avaliados por contagem visual e meta-visual onde os resultados para os grupos
com poucas colônias (Grupos 5, 6, 7, 8) são similares e os grupos com maior
número de colônias (Grupos 1, 2,3, 4) os resultados não são tão parecidos.
Leitura Visual e Meta-visual para Fn
0
200
400
600
800
1000
1200
G1-
1
02
G1-
1
03
G2
G
3
G4
G
5
G6
G
7
G8
Fn1V
Fn2V
Fn3V
Fn1MV
Fn2MV
Fn3MV
Gráfico comparativo entre a leitura visual e digital para o Fusbacterium nucleatum, onde Fn1V,
Fn2V, Fn3V são medidas visuais em triplicata para todos os grupos e Fn1MV, Fn2MV e Fn3Mv
são as medidas meta-visuais em triplicata para todos os grupos.
O gráfico acima mostra uma análise comparativa entre os grupos
avaliados por contagem visual e meta-visual onde os resultados obtidos são
similares a não ser para o grupo 5 (Fn1MV) e grupo 1 (10
3
–Fn3MV ).
Leitura Visual e Meta-visual para Pi
0
200
400
600
800
1000
1200
G1
-
102
G
1-
103
G2
G3
G4
G5
G6
G7
G8
Pi1V
Pi2V
Pi3V
Pi1MV
Pi2MV
Pi3MV
Gráfico comparativo entre a leitura visual e digital para a Prevotella intermedia, onde Pi1V,
Pi2V, Pi3V são medidas visuais em triplicata para todos os grupos e Pi1MV, Pi2MV e Pi3MV
são as medidas meta-visuais em triplicata para todos os grupos.
O gráfico acima mostra uma análise comparativa entre os grupos
avaliados por contagem visual e meta-visual onde os resultados para os grupos
1, 2 3, e 4 os resultados são iguais, porque na contagem digital foi impossível
a contagem do número de colônias e então foi considerado máximo na
contagem meta-visual para (10³). Para os grupos 5, 6, 7 e 8 os resultados
avaliados são diferentes.
De acordo com a avaliação comparativa entre as contagens visual e
digital pode-se concluir que os resultados obtidos na contagem digital ficaram
aquém das expectativas e para que se tenha um melhor aproveitamento das
imagens nesta contagem, as fotos devem estar mais bem padronizadas e
mesmo assim as limitações são relevantes. Diante dos resultados encontrados
e após criteriosa análise foi feito a opção para a utilização dos dados obtidos
na contagem visual.
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