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UNIOESTE
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CAMPUS DE MARECHAL CÂNDIDO RONDON
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
NÍVEL MESTRADO
ELISIANE INÊS DALL’OGLIO
ESTABELECIMENTO “IN VITRO” DE CITRONELA DE JAVA
(Cymbopogon winterianus Jowitt)
MARECHAL CÂNDIDO RONDON – PARANÁ
SETEMBRO / 2006
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ELISIANE INÊS DALL’OGLIO
ESTABELECIMENTO “IN VITRO” DE CITRONELA DE JAVA
(Cymbopogon winterianus Jowitt)
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual do Oeste do Paraná, como parte
das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia – Nível
Mestrado, para obtenção do título de
Mestre.
ORIENTADOR: Prof. Dr. VANDEIR
FRANCISCO GUIMARÃES
MARECHAL CÂNDIDO RONDON – PARANÁ
SETEMBRO / 2006
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Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca da UNIOESTE – Campus de Marechal Cândido Rondon – PR.,
Brasil)
Dall’Oglio, Elisiane Inês
D147e Estabelecimento “in vitro” de citronela de Java
(Cymbopogon winterianus Jowitt) / Elisiane Inês Dall’Oglio.
– Marechal Cândido Rondon, 2006
65 p.
Orientador: Prof. Dr. Vandeir Francisco Guimarães
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual do Oeste
do Paraná, Campus de Marechal Cândido Rondon, 2006.
1. Citronela de Java. 2. Citronela de Java – Propagação
“in vitro”. I. Universidade Estadual do Oeste do Paraná.
II. Título.
CDD 21.ed. 633.8
633.88
CIP-NBR 12899
Ficha catalográfica elaborada por Marcia Elisa Sbaraini Leitzke CRB-9/539
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Ata da reunião da Comissão Julgadora da Defesa de Dissertação da Bióloga
ELISIANE INÊS DALL’OGLIO. Aos dezenove dias do mês de setembro do ano
de 2006, às 14 horas, sob a presidência do Prof. Dr. Vandeir Francisco
Guimarães, em sessão pública reuniu-se a Comissão Julgadora da defesa da
Dissertação da Bióloga Elisiane Inês Dall’Oglio, aluna do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia – Nível Mestrado com área de concentração em
“PRODUÇÃO VEGETAL”, visando à obtenção do título de “MESTRE EM
AGRONOMIA”, constituída pelos membros: Drª. Márcia de Moraes Echer; Profª.
Drª. Andréa Maria Teixeira Fortes (Unioeste/CCBS) e Prof. Dr. Vandeir Francisco
Guimarães (Orientador – Unioeste).
Iniciados os trabalhos, a candidata submeteu-se à defesa de sua Dissertação,
intitulada: “Estabelecimento “in vitro” de citronela de Java (Cymbopogon
winterianus Jowitt).”
Terminada a defesa, procedeu-se ao julgamento dessa prova, cujo resultado foi
o seguinte, observada a ordem de argüição:
Drª. Márcia de Moraes Echer ...................................................... Aprovada
Profª. Drª. Andréa Maria Teixeira Fortes ........................................ Aprovada
Prof. Dr. Vandeir Francisco Guimarães (Orientador) ....................... Aprovada
Apurados os resultados, verificou-se que a candidata foi habilitada, fazendo jus,
portanto, ao título de “MESTRE EM AGRONOMIA”, área de concentração:
”PRODUÇÃO VEGETAL”. Do que, para constar, lavrou-se a presente ata, que
vai assinada pelos senhores membros da Comissão Julgadora e por mim,
Secretária.
Marechal Cândido Rondon, 19 de setembro de 2006.
_______________________________________
Drª. Márcia de Moraes Echer
_______________________________________
Profª. Drª. Andréa Maria Teixeira Fortes
____________________________________________
Prof. Dr. Vandeir Francisco Guimarães (Orientador)
_______________________________________
Noili Batschke – Secretária
unioeste
Universidade Estadual do Oeste do Paraná
Campus de Marechal Cândido Rondon – CNPJ 78680337/0003-46
Rua Pernambuco, 1777 – Centro – Cx. P. 1008 – http://www.unioeste.br
Fone/Fax (45) 3254-3216 – CEP 85960-000 – Marechal Cândido Rondon – PR
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AGRADECIMENTOS
Eis que chegou o momento de expressar sinceros agradecimentos a muitos
adorados familiares e amigos que fizeram parte dessa longa caminhada que parecia
sem fim, principalmente pelas dificuldades pessoais de toda ordem, que me
atropelaram, porém essas, longe de obscurecerem o trajeto, aumentaram-lhe o
brilho. E, ao invés de me deterem, impulsionaram-me com mais força.
Se o desafio era enorme, as motivações eram grandiosas, somadas às
espontâneas generosidades que fizeram possível a transformação de instantâneos
momentos de angústia e sofrimento em uma larga estrada, margeada de flores,
frutos e belas árvores.
Dessa forma, dedico algumas palavras àqueles que fizeram parte deste
trabalho direta ou indiretamente ou, ainda, pelo fato de simplesmente existirem.
À Deus, pelo dom da vida, pela oportunidade concedida, pela força renovada
todos os dias, que me ajudaram em mais esta fase da minha vida.
Aos meus país, Alice e Luiz Antônio Dall’Oglio pela sólida formação dada até
minha juventude, que me proporcionou a continuidade nos estudos até a chegada a
este mestrado, apoiando e incentivando-me em todos os momentos.
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Principalmente a você mãe que sempre agiu com paciência, compreensão e
amor para comigo, não me deixando cair nem desistir dos meus objetivos, o meu
eterno agradecimento.
Ao meu amado marido Uriel Ruela Chaves pelo companheirismo ao longo
dessa jornada, o qual sempre esteve ao meu lado, me ajudando e acreditando em
mim, por sua compreensão e encorajamento a prosseguir mesmo quando parecia
impossível.
Ao meu irmão Eder Dall’Oglio que mesmo de longe, sempre acompanhou
esta caminha e acreditou que ela fosse concretizada.
À minha avó de saudosa memória, Ignez Tonin Citadin, os mais profundos
agradecimentos por suas sábias lições de vida.
A minha tia avó Mercedes Ângela Gehlen pela hospitalidade, pela disposição
de servir e principalmente pela oportunidade de convivência, a qual me proporcionou
um aprendizado que levarei para vida toda.
Ao meu querido orientador, professor Dr. Vandeir Francisco Guimarães,
minha eterna gratidão pela confiança em mim depositada, pela colaboração com o
meu trabalho e, sobretudo por possibilitar reflexões que contribuíram
significativamente para o meu crescimento como pesquisadora.
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À Profª. Drª. Márcia de Moraes Echer pela amizade e exemplo de
perseverança que me ajudaram a não desistir.
À Profª. Suzana Stefanello pela amizade, apoio e encorajamento durante a
realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. José Renato Stangarlin como coordenador da pós-graduação e
professor sempre ajudando de forma positiva e segura.
A Prof. Vanda Pietrowski pela colaboração no empréstimo da câmara
fotográfica durante a realização do trabalho.
Ao amigo Darci da Fontoura pela amizade, pelas idas e vindas de Toledo /
Rondon e principalmente pela agradável convivência durante esses dois anos, além
da colaboração na tradução do resumo.
A amiga Luciani Márcia Scherer pela ajuda e colaboração na realização do
meu experimento, cuja convivência interativa me permitiu ensinar e aprender.
A amiga Daniela Cristiane Zigiotto por ter possibilitado a continuação deste
trabalho.
Aos colegas do curso, pelo agradável convívio, que oportunizou trocas de
experiência, tanto de vida quanto de profissão.
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O meu muito obrigada a fantástica equipe de professores pela paciência,
disponibilidade e eficiência em estimular o processo de aprendizagem. Da mesma
forma, agradeço o empenho dos funcionários da instituição, em destaque à
secretária Noili Batschke e ao laboratorista e colega Gilmar Franzener que sempre
providenciaram excelente suporte em todos os momentos.
À Universidade Estadual do Oeste do Paraná pela oportunidade única
concedida.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
- que me concedeu uma bolsa durante o segundo ano do mestrado, fato este que
muito contribuiu para a conclusão do mestrado.
Há muito mais a quem agradecer... A todos aqueles que, embora não
nomeados, me brindaram com seus inestimáveis apoios em distintos momentos, o
meu reconhecido e carinhoso muito obrigada.
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SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................9
LISTA DE TABELAS................................................................................................10
RESUMO ..................................................................................................................11
ABSTRACT ..............................................................................................................12
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................13
2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................15
2.1 IMPORTÂNCIA DAS PLANTAS MEDICINAIS....................................................15
2.2 CITRONELA DE JAVA (Cymbopogon winterianus Jowitt)..................................17
2.2.1 Caracterização Botânica e Centro de Origem..................................................17
2.2.2 Cultivo da Citronela de Java ............................................................................19
2.2.3 Importância Econômica da Citronela de Java..................................................20
2.3 CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS..................................................................23
3 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................28
3.1 EXPERIMENTO 1: ASSEPSIA DE EXPLANTES DE C. winterianus..................28
3.2 EXPERIMENTO 2: AVALIAÇÃO DE TIPOS DE EXPLANTE DE C. winterianus
PARA O CULTIVO “IN VITRO”.................................................................................31
3.3 EXPERIMENTO 3: EFEITO DE REGULADORES VEGETAIS NO
DESENVOLVIMENTO “IN VITRO” DE C. winterianus E A ACLIMATAÇÃO DAS
PLÂNTULAS.............................................................................................................32
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................36
4.1 EXPERIMENTO 1: ASSEPSIA DE EXPLANTES DE C. winterianus..................36
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4.2 EXPERIMENTO 2: AVALIAÇÃO DE TIPOS DE EXPLANTE DE C. winterianus
PARA O CULTIVO “IN VITRO”.................................................................................39
4.3 EXPERIMENTO 3: EFEITO DE REGULADORES VEGETAIS NO
DESENVOLVIMENTO “IN VITRO” DE C. winterianus E A ACLIMATAÇÃO DAS
PLÂNTULAS.............................................................................................................47
5 CONCLUSÕES......................................................................................................53
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................54
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LISTA DE FIGURAS
1 Assepsia de explantes de Cymbopogon winterianus .................................... 30
2 Tipos de explantes de Cymbopogon winterianus para o cultivo “in
vitro”............................................................................................................... 32
3 Plântulas de Cymbopogon winterianus cultivadas “in vitro” prontas para a
fase de aclimatação....................................................................................... 34
4 Aclimatação de plântulas de Cymbopogon winterianus cultivadas “in vitro”.. 35
5 Percentagem de contaminação e percentagem de oxidação de explantes
apicais de citronela de Java (Cymbopogon winterianus Jowitt) em função
do tempo de exposição à solução de hipoclorito de sódio a 0,5% ............... 36
6 Número de brotações por explantes de citronela de Java (Cymbopogon
winterianus Jowitt) em função da concentração de BAP na solução
nutritiva e do tipo de explante utilizado, independente da concentração de
IBA no meio de cultura .................................................................................. 39
7 Multiplicação dos explantes de Cymbopogon winterianus cultivados “in
vitro”, ápos subcultivos. Plântulas de C. winterianus comprometidas pela
permanência em meio de cultura .................................................................. 49
8 Plântulas de Cymbopogon winterianus durante a fase de aclimatação ........ 51
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LISTA DE TABELAS
1 Número de brotações por explantes de citronela de Java (Cymbopogon
winterianus Jowitt) em função do tipo de explante e da concentração de
ácido indolbutírico (IBA) no meio de cultura, com 1,0 mg L
-1
de 6-
benzilaminopurina (BAP) .............................................................................. 40
2 Percentagem de explantes de citronela de Java (Cymbopogon winterianus
Jowitt) que formaram calo, em função do tipo de explante e da
concentração de ácido indolbutírico (IBA) no meio de cultura, com 1,0 mg
L
-1
de 6-benzilaminopurina (BAP) ................................................................. 42
3 Número de brotações por explantes de citronela de Java (Cymbopogon
winterianus Jowitt) em função do tipo de explante e da concentração de
ácido indolbutírico (IBA) no meio de cultura, com 2,0 mg L
-1
de 6-
benzilaminopurina (BAP) .............................................................................. 43
4 Percentagem de explantes de citronela de Java (Cymbopogon winterianus
Jowitt) que formaram calo, em função do tipo de explante e da
concentração de ácido indolbutírico (IBA) no meio de cultura, com 2,0 mg
L
-1
de 6-benzilaminopurina (BAP) ................................................................. 45
5 Número de brotações por explantes e altura do explante de citronela de
Java (Cymbopogon winterianus Jowitt) em função da concentração de
ácido indolbutírico (IBA) no meio de cultura, com 2,0 mg L
-1
de 6-
benzilaminopurina (BAP) e do tempo após a inoculação ............................. 47
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RESUMO
A citronela de Java (Cymbopogon winterianus Jowitt) é uma planta aromática muito
utilizada na fabricação de repelentes contra mosquitos por conter óleo essencial rico
em citronelal. A utilização da cultura de tecidos, como forma de propagação de
plantas medicinais tem aumentado significativamente, pois os métodos
convencionais de propagação limitam o potencial de uso de algumas plantas. Sendo
assim, um protocolo regenerativo para a citronela de Java foi estabelecido com o
objetivo de se obter uma técnica alternativa para a propagação dessa cultura. Para
isso foram realizados quatro experimentos envolvendo a avaliação do tempo de
assepsia, do tipo de explante, do efeito de reguladores vegetais na propagação “in
vitro” da citronela de Java, bem como a aclimatação das plântulas micropropagadas.
Os resultados obtidos revelaram que a utilização do hipoclorito de sódio (0,5%) por
30 minutos promoveu índice satisfatório de assepsia. Os explantes com maior
potencial ao desenvolvimento “in vitro” foram os ápices caulinares. Verificou-se que
o emprego da citocinina benzilaminopurina (BAP) é indispensável para o sucesso do
estabelecimento “in vitro” da citronela de Java, podendo ser utilizado na
concentração de 2,0 mg L
-1
. No entanto, a utilização do ácido indolbutírico (IBA) nas
diferentes concentrações testadas não apresentou resultados que justifique seu
emprego, tanto na multiplicação quanto no enraizamento das plântulas de citronela
de Java. O enraizamento foi evidenciado quando as plântulas micropropagadas
foram inoculadas somente em meio de cultura MS. Foi constatado que na
testemunha (sem regulador vegetal) houve uma organogênese direta, não sendo
verificada nos demais tratamentos. Na aclimatação das plântulas micropropagadas
verificou-se que a utilização do método “floating”, foi fundamental para a
sobrevivência das plântulas, tendo sido observado alto índice de sobrevivência.
Palavras-chave: propagação “in vitro”, ápices caulinares, benzilaminopurina, ácido
indolbutírico.
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ABSTRACT
Establishment “in vitro” of citronella of Java (Cymbopogon winterianus Jowitt)
Citronella of Java (Cymbopogon winterianus Jowitt) is an aromatical plant with large
usage in the manufacture of mosquito repellents because it contains essential oil rich
in citronelal. The application of tissue culture on a large scale in medicinal plants
production has increased significantly, since the conventional methods of
propagation limit the potential use of some plants. Due that, one citronella of Java
protocol was established with the objective of getting an alternative technique for the
propagation of that culture. Four experiments ware conducted to evaluate the
asepsis time, the explant type, the effect of vegetal regulators on the “in vitro”
propagation of citronella of Java, as well as the micro-propagated seedling
acclimatization. The gotten results had disclosed that the use of sodium hypochlorite
(0.5%) during 30 minutes promoted a satisfactory asepsis index. The shoot tips
explants type showed greater potential for the “in vitro” development. It was verified
that the use of benzilaminapurine (BAP) cytokynin is indispensable to succeed in the
citronella of Java “in vitro” establishment, being able to be used in the concentration
of 2.0 mg L
-1
. However, the use of indolbutyric acid (IBA) in the different tested
concentrations did not present any results that justify its use, neither in the citronella
of Java multiplication nor in the root establishment. The root establishment was
evidenced when micro-propagated seedlings had been inoculated only in MS culture
medium. It was verified that the check (without vegetal regulator) had a direct
organogenesis, while such event was not verified in the other treatments. In the
micro-propagated seedling acclimatization it was verified that the use of the floating
method, it was essential for the seedlings survival, resulting in high survival index.
Key words: “in vitro” propagation, shoot tips, benzylamino purine, indol butyric acid.
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1 INTRODUÇÃO
A citronela de Java (Cymbopogon winterianus Jowitt) é uma planta
aromática muito utilizada na fabricação de repelentes contra mosquitos por conter
óleo essencial rico em citronelal e geraniol (SIMON, 1990). As sementes dessa
planta medicinal não cumprem sua função reprodutora, não sendo viável esse meio
de propagação, mas sim por meio da divisão de touceiras, sendo isso um agravante
devido ao alto índice de contaminação das plantas por diferentes patógenos
(CASTRO & CHEMALE, 1995).
Nos últimos anos, técnicas biotecnológicas têm sido empregadas como
alternativa para auxiliar na obtenção de plantas livres de patógenos. Uma das
técnicas utilizadas é a da cultura de tecidos que permite a obtenção de plantas em
curto espaço de tempo, sob adequadas condições de assepsia, nutrição e fatores
ambientais controlados. Esta técnica se baseia, principalmente no aproveitamento
da totipotência das células vegetais, ou seja, na capacidade de produzir órgãos
(organogênese) ou embriões somáticos (embriogênese somática) que regeneram
numa planta completa (TORRES et al., 2000 e CID, 2001).
A micropropagação é a propagação vegetativa “in vitro” de maior aplicação
prática dentro da cultura de tecidos, por ser utilizada principalmente na limpeza
clonal e em plantas de difícil multiplicação pelos métodos convencionais. Esta
técnica permite a obtenção de grande número de plantas sadias e geneticamente
uniformes, em curto período de tempo (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
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14
Porém, para maximizar o desenvolvimento “in vitro” de uma determinada espécie
são necessários ajustes no balanço de nutrientes e reguladores vegetais, bem como
nas condições de cultivo (CALDAS et al., 1998).
O desenvolvimento de protocolo regenerativo, destacando a cultura da
citronela de Java é relevante, por sua importância econômica e problemas
relacionados à incidência e aumento de contaminação por patógenos diagnosticado
por pequenos produtores, na região oeste do Paraná, destacando-se os fungos de
solo.
Neste contexto, o presente trabalho objetivou desenvolver um protocolo
regenerativo para citronela de Java por meio da técnica de propagação “in vitro”,
avaliando o tempo de assepsia, o tipo de explante, o efeito de reguladores vegetais
na propagação “in vitro” da citronela de Java, bem como a aclimatação das plântulas
micropropagadas.
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2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 IMPORTÂNCIA DAS PLANTAS MEDICINAIS
O uso das plantas medicinais é tão antigo quanto à história da humanidade,
sendo encontrado em todas as populações e grupos étnicos conhecidos. Recorrer
ás virtudes curativas de alguns vegetais foi uma das primeiras manifestações do
homem, marcando um antigo desejo de compreender e utilizar a natureza como um
recurso terapêutico (RIBEIRO, 1995).
Em todas as fases de desenvolvimento das civilizações, houve sempre uma
estreita relação entre o homem e as plantas consideradas curativas, por isso a
história da utilização das plantas medicinais e aromáticas pelo homem, pode ser
dividida em quatro períodos distintos: o da Antigüidade; o das civilizações clássicas
dos gregos e romanos; outro da Idade Média que inclui as grandes explorações e o
colonialismo; e a dos tempos modernos (GIACOMETTI, 1989 e SIMÕES et al.,
1989).
Com base na evolução histórica do uso de plantas medicinais e aromáticas,
a Organização Mundial de Saúde (OMS), em 1978, passa a reconhecer a fitoterapia
como terapia alternativa de eficácia comprovada (OLIVEIRA & AKISUE, 2000).
Desta forma, a fitoterapia representou por muito tempo a principal forma
terapêutica realizada de maneira empírica pela população. Contudo, a partir dela
foram descobertos os princípios ativos, ou seja, os componentes químicos existentes
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16
na planta que conferem sua ação terapêutica peculiar usados na medicina
tradicional (CORRÊA et al., 1998).
Na busca por novas substâncias terapêuticas a pesquisa científica vem se
utilizando de vários processos como, a síntese de novas moléculas, a modificação
molecular de substâncias naturais e/ou sintéticas com propriedades farmacológicas
definidas, a extração, isolamento e purificação de novos compostos (principalmente
de origem vegetal). Entretanto, as plantas medicinais e aromáticas não devem servir
apenas como matéria-prima para ponto de partida na descoberta de novas
moléculas, mas sim um recurso natural potencialmente ativo como fitaterápico
padronizado e eficaz (CORRÊA JUNIOR et al., 1991 e OLIVEIRA & AKISUE, 2000).
As plantas aromáticas, além de fornecedoras de óleos voláteis ou
essenciais, são também medicinais e estão presentes no cotidiano das pessoas.
Elas têm sido continuamente usadas na indústria alimentícia, cosmética e
farmacêutica, por delas serem extraídas substâncias voláteis que conferem ou
modificam sabor em alguns alimentos, compõem perfumes e outros cosméticos, e
também como medicamentos analgésicos, antissépticos, sedativos, expectorantes,
estimulantes, estomáquicos, entre outros (CRAVEIRO et al., 1981 e SILVA, 2004).
Essas substâncias voláteis que são conhecidas como óleos essenciais, são
sintetizadas em um grande número de plantas como subproduto do metabolismo
secundário em resposta às necessidades ecológicas e de desenvolvimento da
planta (VOLÁK & STODOLA, 1990).
Os vegetais são mais ricos em essência quando o tempo é estável, quente e
ensolarado, estes óleos são extraídos de plantas frescas ou secas, normalmente
através da destilação por arraste com vapor d’água de flores, folhas, cascas, frutos e
sementes de plantas aromáticas, sendo que os mais conhecidos e utilizados são
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17
constituídos basicamente por duas classes de compostos, os terpenos (mais
abundantes) e os fenilpropenos (VOLÁK & STODOLA, 1990 e SILVA, 2004).
O Brasil mantém um comércio externo de plantas medicinais e aromáticas
bastante expressivo e muitas destas espécies têm sido exportadas com base na
exploração puramente extrativista. Dias (1993) ressalta que as espécies nativas e
exóticas de valor econômico e de grande demanda interna e externa, devem ser
alvo de estudos visando seu cultivo.
Devido a isso, mais recentemente o estudo das plantas medicinais e
aromáticas está sendo abordado também sob o enfoque agrícola, servindo como
alternativa de produção para pequenos, médios e grandes produtores. Já existem no
Brasil, na Região Sul, cooperativas de pequenos produtores de plantas medicinais,
que estão colocando seu produto no mercado interno e em alguns países do
Mercosul, dentro dos melhores padrões de qualidade (MING, 1999).
2.2 CITRONELA DE JAVA (Cymbopogon winterianus Jowitt)
2.2.1 Caracterização Botânica e Centro de Origem
A citronela, como é conhecida popularmente no Brasil, é uma espécie da
família Poaceae, pertencente ao gênero Cymbopogon, a qual apresenta duas
espécies distintas, Cymbopogon nardus, conhecida como citronela do Ceilão, e
Cymbopogon winterianus, conhecida como citronela de Java. A citronela do Ceilão
provavelmente se originou como uma forma distinta de outra espécie selvagem,
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18
chamada Cymbopogon confertiflorus, e a citronela de Java por sua vez é outra
variação da mesma citronela do Ceilão (CRONQUIST, 1988 e CASTRO & RAMOS,
2002).
A planta é perene, herbácea, cespitosa, medindo em torno de 0,80 a 1,20
metros de altura, sendo seu caule rizomatoso, curto, semi-subterrâneo e nodoso,
possui raízes fortes, fibrosas e longas. Deste rizoma emergem brotações achatadas
firmadas pelas bainhas compridas de inúmeras folhas planas, inteiras, lanceoladas,
estreitas, longas (0,50 - 1,00m), invaginantes, de bordos ásperos e cortantes, com
nervuras paralelas e ápice acuminado. Possui aroma intenso que lembra a planta
Eucalyptus citriodora (CASTRO & CHEMALE, 1995 e CASTRO & RAMOS, 2002).
Suas flores são complexas, com brácteas protetoras, reunidas numa grande
inflorescência em panícula formada por racemos curtos, germinados e protegidas
pelas glumas. Possuem dois tipos de flores: uma andrógina e uma masculina ou
neutra. As andróginas estão em espiguetas sésseis e protegidas por uma bráctea.
Ao contrario do que ocorre com o capim-limão, a citronela floresce no Rio Grande do
Sul, no início do verão, porém suas sementes são inviáveis. Em geral as sementes
não cumprem sua função reprodutora, não sendo viável esta forma de propagação
para esta espécie. No entanto, seus frutos são constituídos de cariopses oblongas
envolvidas pelas glumas, com hilo puntiforme segundo descrição de Castro &
Chemale (1995).
O Cymbopogon winterianus Jowitt é originário da Índia e foi introduzido no
Brasil em meados do século XVIII, sendo que até o início do século XIX, a citronela
do Ceilão era a mais utilizada na produção de óleo, mas gradativamente o tipo Java
veio a dominar o mercado devido a sua maior concentração de óleo essencial
(BARSOTTI, 2005).
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19
2.2.2 Cultivo da Citronela de Java
Segundo Castro & Chemale (1995) a citronela de Java é cultivada no Leste
Asiático para a produção de óleo essencial usado em perfumaria. No Brasil é mais
cultivada na fronteira com o Paraguai e Argentina e em zonas tropicais brasileiras,
pois se adapta melhor em clima tropical ou subtropical, não suportando frios ou
geadas. No seu período de crescimento é exigente em chuvas, no entanto, o
excesso de chuvas na colheita pode baixar o teor de óleo essencial, sendo também
exigente em luz (intensidade e horas) e calor. É cultivado a pleno sol, vegetando em
solo areno-argiloso a francos, permeáveis e férteis, preferindo solos altos, secos,
sem umidade excessiva.
A propagação desta espécie se dá por meio da divisão de touceiras, ou seja,
simplesmente a separação das touceiras da planta para serem transplantadas no
local definitivo, onde as mudas devem trazer algumas raízes aderidas, sendo que
não se deve deixar secar as raízes. Recomenda-se plantar no mesmo dia em que
foram arrancadas do solo, aproveitando os dias encobertos para o plantio, também
se faz necessário uma poda da parte aérea em qualquer época do ano, para
estimular o seu desenvolvimento (BLANCO, 2000). De acordo com Choudhury &
Ghosh (1995), a colheita deve ser feita a altura de corte de 30 c.m, por produzir o
mais alto valor de matéria seca e rendimento em óleo essencial de citronela.
As espécies medicinais e aromáticas normalmente apresentam alta
resistência ao ataque de pragas e doenças, mas, por algum desequilíbrio, este pode
ocorrer em níveis prejudiciais, sendo que num ambiente equilibrado, com plantas
bem nutridas, a possibilidade de ataque diminui. O uso de produtos químicos
(agrotóxicos) é condenado para o cultivo de espécies medicinais, isto se justifica
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20
pela ausência de produtos registrados para estas espécies, conforme exigência
legal, e pelas alterações que tais produtos podem ocasionar nos princípios ativos,
por isso nunca devem ser usados defensivos agrícolas que não sejam naturais
(MARTINS et al., 2000).
O mais indicado a ser feito é o processo de rotação de culturas e a
associação de plantas que repelem alguns insetos (CORRÊA et al., 1998). Na
cultura da citronela não se conhece a ocorrência de pragas e doenças segundo
Castro & Chemale (1995). Porém em alguns países, principalmente da Ásia tem-se
verificado a presença de algumas doenças e pragas (ALAM et al., 1992; ALAM et al.,
1994; ALAM & SATTAR, 2000; RAO et al., 2004; SINGH et al., 1997 e SONTAKKE
et al., 1991).
Na espécie de Cymbopogon citratus (DC) Stapf., verificou-se contaminação
por Fusarium spp (CZEPAK et al., 2003), além do aparecimento de fungos de
ferrugem das folhas, e pulgões ou cochonilhas na base das folhas ou nos rizomas
(CASTRO & RAMOS, 2002).
2.2.3 Importância Econômica da Citronela de Java
Nas últimas décadas, a procura por produtos naturais tem envolvido não só
os naturalistas, mas também pesquisadores e todos aqueles que procuram
investigar e divulgar os benefícios desses produtos. Por isso, tem havido um grande
incremento no número e na quantidade empregada destas substâncias nas
indústrias. Dentre os fatores que provocaram este incremento, é importante destacar
a exigência do mercado por produtos livres de poluentes e contaminantes, ou seja,
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21
considerados naturais. Desta forma, a demanda por óleos essenciais, provindo de
plantas aromáticas, está em expansão no cenário mundial (VERLET, 1993).
A citronela por ser uma planta aromática, ficou bem conhecida por fornecer a
matéria-prima, ou seja, óleo essencial, para a fabricação de repelentes contra
insetos. Porém, bem antes do advento dos sprays inseticidas químicos a citronela do
Ceilão, já era utilizada contra os insetos, no entanto os mosquitos não fazem
distinção entre as espécies de citronela, pois sua aversão na verdade é ao citronelal,
constituinte que está em maiores níveis na citronela de Java, sendo este o princípio
ativo responsável pelo potencial repelente da planta (BARSOTTI, 2005).
Além do citronelal, a citronela é constituída pelo geraniol, juntos eles
produzem um aroma rosa-floral cítrico. Além destes, contribuem na constituição da
planta grupos menores como camphene (tipo cânfora), borneol, (tipo camomila) e
methyleugenol, todos combinando num aroma muito peculiar, lembrando uma
vegetação campestre úmida (SIMON, 1990).
De acordo com o artigo Curiosidades do mundo natural (2002), a citronela
de Java tem um aroma agradável, que lembra um pouco o do eucalipto. Devido a
isso, tem sido usada na aromaterapia, pois os terapeutas passaram a pesquisar
mais a fundo suas qualidades a nível físico e mental e constataram que ela funciona
como antidepressivo, anti-séptico, desodorante, tônico e estimulante; e também em
produtos de perfumaria.
No entanto, o mesmo cheiro que agrada tanto aos homens é insuportável
aos insetos, característica que faz dela um repelente natural, pois afasta os insetos
sem matá-los, não poluindo o ambiente, desta maneira não afeta o equilíbrio
ecológico (BARSOTTI, 2005).
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22
Devido suas propriedades repelentes, esta planta que se parece com o
capim, quando plantada em local ensolarado e com passagem de vento, o cheiro se
espalha e espanta os insetos. A citronela pode ser utilizada para tratar a febre, assim
como doenças da pele, por ter ação bactericida, fungicida e esterilizante, sendo
indicada também para tratar cólicas de animais. Além de benéfica, a planta é de
aparência atraente, capaz de compor um visual estético interessante e combater a
erosão do solo (CITRONELA DE JAVA, 2004).
O óleo da citronela de Java é um dos mais usados em perfumaria, devido ao
seu elevado conteúdo de citronelal (até 50% do volume total) e geraniol (até 45%),
que são utilizados como ponto de partida para perfumes que são isolados e
fracionados do óleo (SIMON, 1990).
O método industrial de extração do óleo essencial da citronela é conhecido
como "arraste de vapor d’água", onde as folhas são colocadas num recipiente e
passam a receber vapor d’água constantemente. A água é aquecida em uma
caldeira, que ao passar pelas folhas da planta, o vapor leva junto o óleo essencial,
separado da água, em seguida, por condensação (SILVA, 2004). Este óleo tem sido
empregado também em inflamações articulares, reumatismo e até contra Lesão por
Esforço Repetitivo (LER) tem mostrado resultado (LÁSZLÓ, 2000).
Além destas propriedades, a citronela é utilizada na culinária chinesa e seu
bagaço é aproveitado como ração animal, sendo provado que animais que se
alimentam deste bagaço desenvolvem uma maior resistência a doenças
(BARSOTTI, 2005).
Segundo Tawatsin et al. (2001), o óleo de citronela associado a 5% de
vanilina numa pesquisa laboratorial repeliu três espécies de mosquitos: o Aedes
aegypti, o Culex quin-quefasciatus e os Anopheles, por mais de 8 horas. Foram
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23
eficazes contra o A. aegypti, mosquito causador da dengue, velas com 3% de óleo
essencial de citronela e incensos a 5%. Coleiras com citronela também têm sido
eficazes para afastar pulgas, carrapatos e mosquitos de cachorros.
Ainda que outros países antes não-produtores tenham entrado no mercado
mundial e seu preço oscilado, com freqüentes baixas, a demanda na produção da
citronela ainda tem sido elevada, onde os preços conseguidos permitem ainda o
cultivo desta cultura em escala econômica (CASTRO & RAMOS, 2002).
2.3 CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS
A biotecnologia vem sendo utilizada pelo homem há mais de 10.000 anos
atrás, quando ao domesticarmos plantas e animais, já se introduzia mesmo sem o
conhecimento das técnicas biológicas, o conceito de biotecnologia. Pois define-se
como biotecnologia o conjunto de técnicas que utiliza organismos vivos ou parte
desses, para solucionar problemas, produzir ou modificar produtos, aumentar a
produtividade de plantas ou animais de maneira eficiente ou, ainda produzir
microrganismos para usos específicos (TORRES et al., 2000).
No início do século XX desenvolveram-se as técnicas de cultura de
tecidos e a partir de meados do século surgem novos horizontes com a biologia
molecular que traz o conceito da “nova biotecnologia”, ou seja, a utilização de
células e moléculas biológicas para solucionar problemas ou produzir novos
produtos (KREUZER & MASSEY, 2002).
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A biotecnologia moderna inclui um conjunto de tecnologias entre elas a da
cultura de células e tecidos, a qual é uma importante ferramenta na
transformação genética de plantas, pois requer o cultivo “in vitro” de células e
tecidos da planta que se deseja transformar, bem como as células e tecidos
transformados e regenerados em plantas que expressem o gene de interesse
(BRASILEIRO & DUSI, 1999).
A cultura de tecidos é uma técnica utilizada para propagar células ou tecidos
vegetais em tubos de ensaio com meio nutritivo adequado, sob condições
assépticas, com fatores ambientais controlados. Nesse ambiente, as células, tecidos
e órgãos se multiplicam e continuam a crescer de modo não organizado ou se
regeneram numa planta inteira (TORRES et al., 2000; CID, 2001).
O princípio da cultura de tecidos está baseado na teoria da
totipotencialidade, proposta por Mathias Schleiden e Theodor Schwann no ano de
1838. Esta teoria afirma que a célula é autônoma, portanto, que contêm o potencial
genético necessário para originar um organismo completo, neste caso uma planta
completa. Imbuído desta teoria Haberlandt, em 1902, foi o primeiro a manipular um
sistema de cultura “in vitro” de plantas, procurando estabelecer e consolidar um
sistema de micropropagação. Infelizmente, por limitações técnicas da época, seus
esforços falharam (TORRES et al., 1998).
No entanto, a técnica se difundiu por diversos países da Europa, Ásia, nos
Estados Unidos e Brasil. O método baseia-se na produção de plantas mais
uniformes, sadias e a uma velocidade muito maior do que os métodos
convencionais, sem considerar a manutenção de quantidades consideráveis de
plantas por metro quadrado dentro de frascos em laboratórios protegidos do ataque
de pragas, doenças e intempéries (LEE et al., 1995 e KERBAUY, 1997).
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25
Essa técnica tem se mostrado de enorme importância prática e potencial nas
áreas agrícola e florestal, bem como no auxílio a programas de melhoramento
genético, na propagação de plantas cultivadas livres de patógenos e na produção
em larga escala de plantas para fins comerciais (CID, 2001). Atualmente, vem sendo
amplamente utilizada como uma ferramenta biotecnológica para o estudo do
metabolismo, fisiologia, desenvolvimento e reprodução de plantas com propriedades
desejáveis, tais como resistência a pragas e acúmulo de substâncias ativas de
interesse comercial (DUVAL et al., 1998).
O grau de sucesso em qualquer tecnologia que emprega cultura de células,
tecidos ou órgãos é dependente de poucos fatores. Um fator significante é a escolha
dos componentes nutricionais e reguladores de crescimento que controlam, em
grande parte, o padrão de desenvolvimento “in vitro” (CALDAS et al., 1998).
As citocininas são reguladores de crescimento que desempenham um papel
fundamental no crescimento e morfogênese em cultura de tecidos, estimulando a
regeneração de calos, bem como, a indução e proliferação de brotações de gemas
axilares ou apicais (CID, 2000). O BAP (6-benzilaminopurina) tem sido a citocinina
mais eficaz na multiplicação “in vitro” em diversas espécies do gênero Cymbopogon
(BARUAH & BORDOLOI, 1989; REIS et al., 1999; CZEPAK et al., 2003 e ZIGIOTTO
et al., 2005).
Para a multiplicação da citronela de Java, o BAP atua na formação e no
desenvolvimento de brotações “in vitro” com condições adequadas para a fase de
enraizamento (ZIGIOTTO, 2004).
Outro fator importante a ser considerado no estabelecimento “in vitro” é o
controle da contaminação por patógenos que infestam explantes usados na cultura
de tecidos, devendo-se pesquisar e determinar protocolos mais eficientes levando
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26
em consideração o agente desinfetante, a espécie que se trabalha e o tipo de
explante. Os microrganismos contaminantes competem com os explantes pelos
nutrientes do meio de cultura e provocam danos diretos e indiretos pela colonização
de seus tecidos, podendo eliminar no meio, metabólitos tóxicos às plantas
(MONTARROYOS, 2000).
Inúmeras são as substâncias com ação germicida utilizadas na
desinfestação dos explantes, sendo os mais comuns o etanol e os compostos a
base de cloro, tais como o hipoclorito de sódio e de cálcio. As combinações dos
princípios ativos desinfetantes podem variar, desta forma faz-se necessário à
adequação de acordo com a espécie e a sensibilidade do tecido a ser desinfetado
(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
O cultivo de meristemas (BIASI et al., 1998 e ERIG & FORTES, 2002),
ápices caulinares (DOMINGUES et al., 1995 e ROCHA et al., 2004) e gemas
axilares (MENDANHA & TORRES, 1998 e CANTAGALLO et al., 2005) são
adequados como fonte de explante, por serem considerados mais rápido, eficiente e
confiável método de micropropagação, pois preserva o germoplasma “in vitro” e
supera a contaminação patogênica (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Algumas espécies, no entanto, se regeneram com sucesso a partir de
segmentos nodais (FLORES et al., 1998; NICOLOSO & ERIG, 2002 e ERIG &
SCHUCH, 2003a). Todas estas fontes de explante podem desenvolver-se
diretamente (organogênese direta) numa planta, ou passar pela fase de calo
(organogênese indireta) em meio de cultura adequado (GRATTAPAGLIA &
MACHADO, 1998).
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A micropropagação é a técnica de maior aplicabilidade da cultura de tecidos
e tem sido utilizada para multiplicar várias espécies medicinais que apresentam
problemas com as sementes ou com partes vegetativas que limitam sua
multiplicação em escala, ou ainda que tenham adquirido caracteres indesejáveis
como baixa produtividade e suscetibilidade à doenças, algumas destas espécies são
Maytenus spp. (PEREIRA, 1998), Achyrocline satureioides (IKUTA, 1998),
Myracrodruon urundeuva (ANDRADE et al., 2000), Echinodorus cf. scaber
(PEREIRA et al., 2000), Curcuma zedoaria (MELO et al., 2000), Pfaffia spp.
(NICOLOSO et al., 2001 e FLORES et al., 2006), Aloe vera (ARAÚJO et al., 2002),
Pilocarpus microphyllus (SABÁ et al., 2002), Cissus sicyoides (ABREU et al., 2003),
Ocimum basilicum (DODE et al., 2003), Psychotria acuminata (LARA et al., 2003),
Tabernaemontana fuchsiaefolia (OLIVEIRA et al., 2003), Zingiber officinalle
(DEBIASI et al., 2004), Calophyllum inophyllum (THENGANE et al., 2006).
Outro problema comum que afeta as plantas medicinais é o declínio no teor
de princípios ativos ou de óleos essenciais quando estas são cultivadas por longos
períodos e submetidas à vários cortes, fazendo-se necessária a renovação e
reintrodução de plantas para manter a alta produtividade desses constituintes ativos
(PEREIRA, 2003).
Por essa razão nos últimos anos têm sido propagadas “in vitro” espécies
como a Mentha (BELTRÃO, 2000; BELTRÃO et al., 2000 e BANDEIRA et al., 2006),
Cymbopogon (BARUAH & BORDOLOI, 1989; NAYAK et al., 1996; PATNAIK et al.,
1997; REIS et al., 1999 e CZEPAK et al., 2003) e citronela (BARTHAKUR &
BORDOLOI, 1989; SREENATH & JAGADISHCHANDRA, 1989; SAHA & GHOSH,
2003 e ZIGIOTTO, 2004), para atender a essa demanda.
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3 MATERIAL E MÉTODOS
Para o desenvolvimento de um protocolo regenerativo da citronela de Java
(Cymbopogon winterianus Jowitt) “in vitro”, através da cultura de tecidos, foram
conduzidos 3 experimentos, no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da
Universidade Estadual do Oeste do Paraná – Campus Marechal Cândido Rondon,
em 2005 e 2006.
Para a realização dos experimentos foram utilizadas plantas matrizes de
citronela de Java obtidas da Fazenda São Roque – Marechal Cândido Rondon/PR,
onde as mesmas eram retiradas do campo com uma enxada, após a retirada eram
enroladas em pano e trazidas ao laboratório, onde retiravam-se suas folhas, para
iniciar os respectivos experimentos.
3.1 EXPERIMENTO 1: ASSEPSIA DE EXPLANTE DE C. winterianus
Este experimento foi conduzido no mês de Julho de 2005, para o mesmo
foram empregados como fonte de explante ápices caulinares retirados de plantas
matrizes de citronela de Java (Figura 1a, b), os quais passaram pelo processo de
desinfestação, que constou na imersão em 100 mL de água com três gotas de tween
80 (Figura 1c).
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29
Posteriormente os explantes, foram levados à câmara de fluxo laminar e
colocados em becker com solução de etanol (70%) por 5 minutos (Figura 1d). Então
foram imersos em hipoclorito de sódio (0,5%) nos tempos 15, 20, 25 e 30 minutos
(Figura 1e). Após este procedimento foi realizada a tríplice lavagem em água
destilada e autoclavada.
Após o processo de desinfestação os explantes foram inoculados em
frascos, com cerca de 15 cm de comprimento, 6 cm de diâmetro e tampados com
tampas plásticas vedadas com papel filme, contendo 30 mL de meio de cultura MS
(MURASHIGE & SKOOG, 1962) acrescido de 30 g L
-1
de sacarose, 7 % de agar e
pH ajustado para 5,8, antes da adição do agar (Figura 1f).
O delineamento experimental utilizado neste experimento foi inteiramente
casualizado com um explante por frasco e cinco frascos por tratamento. Os
tratamentos constaram de uma concentração de hipoclorito de sódio e quatro
tempos de exposição dos explantes à solução, totalizando 4 tratamentos. A análise
estatística empregada foi análise de regressão.
Após a inoculação, os frascos foram mantidos no escuro por 7 dias para
diminuir a incidência de oxidação fenólica e então foram transferidos para a sala de
crescimento, sob fotoperíodo de 16 horas luz / 8 horas escuro e temperatura de 25 ±
2º C. As avaliações foram realizadas em intervalos de 7 dias, durante 30 dias,
quanto à presença de contaminação sobre os explantes e a oxidação dos mesmos.
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30
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
Figura 1 Assepsia de explante de Cymbopogon winterianus. (a, b) - Extração dos
ápices caulinares de citronela de Java empregados como fonte de explante para
teste de assepsia. (c) - Imersão dos ápices caulinares em água com tween 80. (d) -
Ápices caulinares em solução de etanol (70%) por 5 minutos. (e) - Transferência dos
ápices caulinares para a solução de hipoclorito de sódio (0,5%) em diferentes
tempos. (f) - Ápice caulinar inoculado no meio de cultura MS.
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31
3.2 EXPERIMENTO 2: AVALIAÇÃO DE TIPOS DE EXPLANTES DE C. winterianus
PARA O CULTIVO “IN VITRO”
A realização deste experimento foi em Setembro de 2005, para o mesmo
foram utilizados três tipos de explantes: ápice caulinar (medindo cerca de 1,5 cm de
comprimento), gema lateral (com aproximadamente 0,5 cm de comprimento) e
segmento nodal (em torno de 0,5 cm de diâmetro), como mostra a Figura 2a. Os
diferentes explantes passaram pelo processo de assepsia descrito no experimento 1.
Optou-se pelo tempo de 30 minutos em hipoclorito de sódio (0,5%), que resultou em
menor contaminação no 1º experimento.
Após o processo de desinfestação os explantes foram inoculados em frascos
(com as mesmas dimensões e condições descritas no 1º experimento) contendo 30
mL de meio de cultura MS (Figura 2b) acrescido de 30 g L
-1
de sacarose e 7 % de
Agar, com pH ajustado para 5,8 antes da adição do Agar. Testou-se combinações
de 6-benzilaminopurina – BAP (1,0 e 2,0 mg L
-1
), ácido indolbutírico – IBA (0,0; 0,1;
0,2 e 0,4 mg L
-1
) e um tratamento testemunha (0,0 BAP e 0,0 IBA), totalizando 9
tratamentos / explante.
O delineamento experimental utilizado neste experimento foi inteiramente
casualizado, em esquema fatorial (3x2x4), sendo três tipos de explante por frasco,
duas concentrações de BAP e 4 concentrações de IBA adicionadas ao meio de
cultura, como já descrito anteriormente. Utilizou-se cinco repetições por tratamento.
Após a inoculação, os frascos foram mantidos no escuro por 7 dias para diminuir a
incidência de oxidação fenólica e então transferidos para a sala de crescimento, sob
fotoperíodo de 16 horas luz / 8 horas escuro e temperatura de 25 ± 2º C.
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32
(a) (b)
Figura 2 Tipos de explantes de Cymbopogon winterianus para o cultivo “in vitro”. (a)
- Ápice caulinar, gema lateral e segmento nodal de C. winterianus, utilizados como
fonte de explante para o cultivo “in vitro”. (b) - Ápice caulinar, gema lateral e
segmento nodal inoculado no meio de cultura MS.
As avaliações foram realizadas após 60 dias, quanto à presença de calo e
número de brotações por explante. Para a análise estatística os dados foram
transformados em raiz (x + 0,5), e então submetidos à analise de variância e as
médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, através do
programa computacional SAEG 5.0 da Universidade Federal de Viçosa.
3.3 EXPERIMENTO 3: EFEITO DE REGULADORES VEGETAIS NO
DESENVOLVIMENTO “IN VITRO” DE C. winterianus
E A ACLIMATAÇÃO DAS PLÂNTULAS
Na realização desse experimento em Novembro de 2005, para verificar o
efeito de reguladores vegetais na propagação “in vitro” da citronela de Java, foram
empregados como fonte de explante ápices caulinares, que demonstraram através
do experimento 2, ser mais promissores para o cultivo “in vitro” da citronela de Java.
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Os explantes foram submetidos ao processo de desinfestação descrito no
experimento 2, onde após este procedimento os mesmos foram transferidos para
frascos (com as mesmas dimensões e condições descritas no 1º experimento)
contendo 30 mL de meio de cultura MS, com 30 g L
-1
de sacarose, 7% de Agar, pH
ajustado para 5,8, antes da adição do Agar e suplementado com 2,0 mg L
-1
de BAP
e diferentes concentrações de IBA (0,0; 0,1; 0,2; 0,3 e 0,4 mg L
-1
), além da
testemunha, totalizando 6 tratamentos.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com um
explante por frasco, cinco frascos por tratamento e seis tratamentos. Após a
inoculação os frascos foram mantidos no escuro por 7 dias para então serem
transferidos à sala de crescimento, sob fotoperíodo de 16 horas luz / 8 horas escuro
e temperatura de 25 ± 2º C.
As avaliações foram realizadas aos 30 dias após a inoculação (DAI), quanto
ao número de brotações por explante e a altura média das brotações (cm). Após a
avaliação foi realizada a repicagem das brotações e inoculadas em meio de cultura
MS com BAP e IBA, e então feita novas avaliações aos 30 e 60 dias após a
transferência (DAT), sendo avaliados os mesmos parâmetros.
Após o período de 60 dias as brotações multiplicadas foram transferidas
para frascos contendo meio de cultura MS desprovido de regulador vegetal (meio de
enraizamento), onde permaneceram por mais 30 dias. Os dados foram
transformados em raiz (x + 0,5) para serem submetidos à analise de variância e as
médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, através do
programa computacional SAEG 5.0.
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A fase de aclimatação ocorreu após a fase de elongação da parte aérea e
enraizamento das plântulas (Figura 3), sendo escolhidas através de um padrão
visual, buscando a uniformidade das plântulas para a aclimatação. Os frascos foram
destampados permanecendo na sala de crescimento por 24 horas. Posterior a este
procedimento, as plântulas foram removidas e tiveram suas raízes lavadas em água
corrente para eliminar o excesso de Agar. As mesmas foram então transplantadas
para bandejas de poliextireno expandido de 128 células com substrato comercial
Plantimax Hortaliças.
Figura 3 Plântulas de Cymbopogon winterianus cultivadas “in vitro” prontas para a
fase de aclimatação.
Para manter a umidade relativa próxima de 100% e evitar o dessecamento
das plantas, a bandeja de poliextireno ficou imersa em uma bandeja plástica com
água e solução nutritiva MS (sistema “floating”), por 10 dias, dentro de uma câmara
úmida obtida através de uma mini-estufa plástica (Figura 4a).
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Passado este período foi retirada a bandeja com água, sendo que as plantas
permaneceram nas bandejas de poliextireno dentro da mini-estufa, por mais 20 dias
(Figura 4b), para então serem transplantadas para vasos plásticos com capacidade
de 2 litros, contendo terra e substrato comercial na proporção de 1:1, onde passaram
mais 10 dias em mini-estufa, sendo posteriormente transferidas para casa de
vegetação. Após o processo de aclimatação foi determinado o número de plantas
que sobreviveram.
(a) (b)
Figura 4 Aclimatação de plântulas de Cymbopogon winterianus cultivadas “in vitro”. (a) -
Mini-estufa plástica utilizada na aclimatação de plântulas de C. winterianus. (b) - Plantas
de C. winterianus em bandeja de poliextireno dentro da mini-estufa.
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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 EXPERIMENTO 1: ASSEPSIA DE EXPLANTE DE C. winterianus
Em relação aos métodos diferenciais de assepsia empregados, ou seja,
diferentes tempos de imersão do explante apical ao hipoclorito de sódio 0,5%, pode-
se verificar na Figura 5 que houve tanto para percentagem de contaminação quanto
para percentagem de oxidação, um comportamento polinomial quadrático.
Nesse experimento houve uma redução do percentual de explantes
contaminados em resposta ao tempo de exposição ao hipoclorito de sódio (0,5%),
sendo observado também uma correlação significativa de 64% entre a percentagem
de explantes contaminados e a percentagem de explantes oxidados.
Figura 5 (a) - Percentagem de contaminação e (b) - percentagem de oxidação de
explantes apicais de citronela de Java (Cymbopogon winterianus Jowitt) em função
do tempo de exposição à solução de hipoclorito de sódio a 0,5%.
y= -0,2x
2
+ 7x+ 5
R
2
= 0,55
0
20
40
60
80
100
15 20 25 30
Tempo (minutos)
Contaminação (%)
(a)
y= -0,6x2 + 26,6x- 221
R
2
= 0,84
0
20
40
60
80
100
15 20 25 30
Tempo (minutos)
Oxidação (%)
(b)
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De maneira geral, a percentagem de explantes contaminados e oxidados foi
alta, a qual pode ser atribuída à condição fitosanitária das plantas matrizes, pois
segundo Grattapaglia & Machado (1998), o estado fitosanitário da planta é
importante e irá determinar a facilidade em descontaminar o explante durante o
isolamento. No estabelecimento “in vitro” de cultivares de pereira (Pyrus spp.), Erig &
Fortes (2002), obtiveram contaminação por bactérias em 45,7% das gemas
provenientes de plantas mantidas no campo.
Apesar de se realizar uma desinfestação dos explantes, diversos
organismos de natureza endógena não são expostos aos agentes desinfetantes e
devem ser controlados ainda na planta matriz, pois a contaminações endógenas
representam sério problema no estabelecimento das culturas “in vitro”
(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998), fazendo-se necessário o aprimoramento nas
técnicas de assepsia para o cultivo “in vitro”.
Outro fator importante para o estabelecimento de uma cultura asséptica é o
cuidado na manipulação de todos os instrumentos de trabalho, pois a contaminação,
neste caso pode ser exógena, além de favorecer a liberação de compostos
fenólicos, devido ao dano causado nas células durante a excisão (GRATTAPAGLIA
& MACHADO, 1998). A oxidação fenólica é um dos sérios problemas que podem
dificultar o desenvolvimento “in vitro” e até levar os explantes à morte (CALDAS et
al., 1998).
Para reduzir o índice de oxidação, pode-se utilizar de diversas técnicas
durante o preparo do explante, do meio de cultura e da fase de incubação. Segundo
Pasqual et al. (1997), a oxidação é menos severa em meio diluído do que em um
outro com alta concentração de sais, como o meio MS. Resultado observado por
Flores et al. (1998) e Utino et al. (2001), que verificando também que a adição de
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38
substâncias antioxidantes como ácido ascórbico ao meio de cultura, minimizou a
oxidação fenólica em Maytenus ilicifolia e Musa sp., respectivamente. Melo et al.
(2001), também testou diferentes antioxidantes para controle da oxidação no
desenvolvimento de plântulas Syagrus oleracea obtendo resultados satisfatórios.
A diminuição da luminosidade na câmara de fluxo laminar, durante a retirada
dos explantes e a manutenção da cultura no escuro no início do cultivo é benéfica
(DANTAS et al., 2002; BIANCHI et al., 2003; CHAVES et al., 2004 e ROCHA et al.,
2004), pois a luz aumenta a produção de fenóis na planta. Essa alternativa foi
realizada neste experimento, o que demonstra que não foi suficiente para diminuir o
índice de oxidação fazendo-se necessários testes com a adição de substâncias
antioxidantes como, por exemplo, ácido ascórbico, ácido cítrico e carvão ativado.
Quanto ao agente desinfetante utilizado (hipoclorito de sódio), vários são os
trabalhos que demonstram resultados promissores quando comparados com outros
agentes empregados (MELO et al., 2000; NICOLOSO et al., 2001; ARAÚJO et al.,
2002; ABREU et al., 2003; BIANCHI et al., 2003; ERIG & SCHUCH, 2003a; AZAD et
al., 2004 e CHAVES et al., 2004) indicando ser este o mais usado, pois além de sua
eficiência estar ligada à ação sistêmica nos tecidos, a relação custo-benefício é
muito satisfatória.
Apesar dos altos índices de contaminação e oxidação ocorridos, o
estabelecimento “in vitro” utilizando ápices caulinares de citronela, se torna viável
quando o tempo de exposição dos explantes ao agente desinfetante (hipoclorito de
sódio) é maior. Reis et al. (1999) e Czepak et al. (2003), obtiveram resultados
satisfatórios na micropropagação de Cymbopogon citratus, utilizando hipoclorito de
sódio no tempo de 30 minutos, justificando assim a opção pelo maior tempo testado.
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39
y = 1,25x + 0,5 R
2
= 0,89
y = 0,4712e
1,6252x
R
2
= 0,99
0
4
8
12
16
0,0 1,0 2,0
Concentrações de BAP no meio de cultura (mg L
-1
)
Nº de brotações/explante
Ápice Caulinar
Gema
Lateral
4.2 EXPERIMENTO 2: AVALIAÇÃO DE TIPOS DE EXPLANTES DE C. winterianus
PARA O CULTIVO “IN VITRO”
Na Figura 6 é demonstrado que, dos explantes testados, o ápice caulinar foi
o que apresentou maior número de brotações por explante de citronela, nas
diferentes concentrações de BAP utilizadas, independente da concentração de IBA
empregada. A concentração de 2,0 mg L
-1
de BAP resultou em percentagem de 74%
no número de brotações, quando comparado com 1,0 mg L
-1
. Resultados
semelhantes foram obtidos por Zigiotto (2004) quando utilizou ápices caulinares,
obtendo uma elevada taxa de multiplicação de brotações de citronela, empregando a
concentração de 2,0 mg L
-1
de BAP.
Reis et al. (1999), cultivando ápices caulinares de Cympopogon citratus em
meio de cultura contendo duas concentrações de BAP (0,5 e 1,0 mg L
-1
), verificou
que 1,0 mg L
-1
de BAP apresentou uma média de 4,3 brotações por explante.
Figura 6 Número de brotações por explantes de citronela de Java (Cymbopogon
winterianus Jowitt) em função da concentração de BAP na solução nutritiva e do tipo
de explante utilizado, independente da concentração de IBA no meio de cultura.
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40
Na Tabela 1 são apresentados os resultados referentes ao número de
brotações por explante de citronela em função do tipo de explante e da
concentração de IBA no meio de cultura, com a adição de 1,0 mg L
-1
de BAP.
Verificou-se a ausência de interação significativa entre as concentrações de IBA e os
tipos de explantes utilizados. Não houve também diferença significativa entre as
diferentes concentrações de IBA empregadas, porém verificou-se uma discrepância
quando utilizou-se 0,4 mg L
-1
de IBA e os demais tratamentos, no explante ápice
caulinar, este pode estar relacionado com a diferença entre o tamanho dos
explantes, no momento da excisão.
Houve diferença significativa somente, na média do número de brotações
em função dos tipos de explante utilizados, sendo que o ápice caulinar e a gema
lateral diferiram do segmento nodal, onde o mesmo não apresentou regeneração
adventícia.
Tabela 1 Número de brotações por explantes de citronela de Java (Cymbopogon
winterianus Jowitt) em função do tipo de explante e da concentração de ácido
indolbutírico (IBA) no meio de cultura, com 1,0 mg L
-1
de 6-benzilaminopurina (BAP).
Número de brotações por explante
Concentração de
IBA no meio
Ápice caulinar Gema lateral Segmento nodal Média
0,0 mg L
-1
3,8 2,0 0,0 1,9 ab
0,1 mg L
-1
0,8 1,8 0,0 0,9 ab
0,2 mg L
-1
0,0 0,3 0,0 0,1 b
0,4 mg L
-1
8,0 2,0 0,0 3,3 a
Média 3,2 A 1,5 A 0,0 B -----
CV (%) 56,98
*Médias seguidas da mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem
estatisticamente pelo teste de Tukey (P<0,05). Para a análise estatística utilizou-se dados
transformados em raiz (x + 0,5).
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41
A otimização do desenvolvimento de segmentos nodais em meio de cultura
é viável, uma vez que há menor disponibilidade de ápices caulinares. Porém, para a
cultura da citronela de Java esta fonte de explante não apresentou morfogênese,
indicando que a utilização deste foi inviável nas condições deste estudo. Segundo
Grattapaglia & Machado (1998) o sucesso e eficiência na regeneração dos explantes
variam com o genótipo. Alguns autores empregaram segmentos nodais e se
depararam com resultados satisfatórios, como Flores et al. (2006), Nicoloso et al.
(2001) e González et al. (2003) na micropropagação de Pfaffia tuberosa, Pfaffia
glomerata e Artemisia absinthium, respectivamente.
Um fator a ser evidenciado é dos segmentos nodais terem maior capacidade
regenerativa quando os mesmos formam calos com células competentes, ou seja,
com capacidade de responder aos efeitos estimulatórios do meio de cultura para
formação de gemas (KERBAUY, 1999). Porém, neste experimento não foi
evidenciado a formação de calo neste tipo de explante (Tabela 2 e 4), fato este que
pode ter dificultado a proliferação de brotos, uma vez que o balanço hormonal
testado, não mostrou-se adequado, sendo necessários mais testes, para viabilizar a
utilização do mesmo, uma vez que de uma planta, pode-se retirar mais de um
explante para o cultivo “in vitro”.
Em explantes obtidos a partir de ápice caulinar e gema lateral, observou-se
formação de calos em 43,8% e 31,3%, respectivamente (Tabela 2). Entretanto esta
diferença não foi significativa estatisticamente, não havendo também interação entre
as concentrações de IBA e o tipo de explante. Thomé et al. (2004) obteve 62% de
formação de calo em Kalanchoe blossfeldiana utilizando 1,0 mg L
-1
de BAP. Já
Alves et al. (2004), trabalhando com Eucalyptus sp., conseguiu 16% de indução de
calo, nesta concentração de BAP, em explantes caulinares.
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42
Tabela 2 Percentagem de explantes de citronela de Java (Cymbopogon winterianus
Jowitt) que formaram calo, em função do tipo de explante e da concentração de
ácido indolbutírico (IBA) no meio de cultura, com 1,0 mg L
-1
de 6-benzilaminopurina
(BAP).
Explantes que formaram calo (%)
Concentração de
IBA no meio
Ápice caulinar Gema lateral Segmento nodal Média
0,0 mg L
-1
50,0 50,0 0,0 33,0 a
0,1 mg L
-1
75,0 50,0 0,0 42,0 a
0,2 mg L
-1
25,0 0,0 0,0 8,0 a
0,4 mg L
-1
25,0 25,0 0,0 17,0 a
Média 43,8 A 31,3 AB 0,0 B -----
CV (%) 25,3
*Médias seguidas da mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem
estatisticamente pelo teste de Tukey (P<0,05). Para a análise estatística utilizou-se dados
transformados em raiz (x + 0,5).
Em alguns casos a formação de calo não é desejável podendo comprometer
a proliferação de gemas axilares e afetar o enraizamento. Uma forma de minimizar
esse problema é o subcultivo das plantas, após 15 dias, em um meio de cultura
novo, na tentativa de evitar que as brotações percam o vigor (GRATTAPAGLIA &
MACHADO, 1998).
Quando o meio de cultura foi suplementado com 2,0 mg L
-1
de BAP
variando-se o tipo de explante e a concentração de IBA, ficou evidente que o ápice
caulinar possui uma competência maior do que a gema lateral e o segmento nodal
para expressar o seu potencial morfogenético. De acordo com a Tabela 3 não houve
interação entre as concentrações de IBA e os tipos de explantes utilizados. Não
existiu também diferença significativa entre as diferentes concentrações de IBA
empregadas.
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43
Tabela 3 Número de brotações por explantes de citronela de Java (Cymbopogon
winterianus Jowitt) em função do tipo de explante e da concentração de ácido
indolbutírico (IBA) no meio de cultura, com 2,0 mg L
-1
de 6-benzilaminopurina (BAP).
Número de brotações por explante
Concentração de
IBA no meio
Ápice caulinar Gema lateral Segmento nodal Média
0,0 mg L
-1
8,0 3,5 0,0 3,8 a
0,1 mg L
-1
11,8 6,0 0,0 5,9 a
0,2 mg L
-1
12,5 0,5 0,0 4,3 a
0,4 mg L
-1
16,8 3,0 0,0 6,6 a
Média 12,3 A 3,3 B 0,0 B -----
CV (%) 74,94
*Médias seguidas da mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem
estatisticamente pelo teste de Tukey (P<0,05). Para a análise estatística utilizou-se dados
transformados em raiz (x + 0,5).
Ainda na Tabela 3, observa-se que para o ápice caulinar houve uma maior
emissão de brotos (12,3), porém só diferiu significativamente na média dos demais
tipos, gema lateral (3,3) e segmento nodal. No entanto, a gema lateral não diferiu do
segmento nodal, sendo que o mesmo não apresentou brotações, fato que pode ser
explicado pelo alto coeficiente de variação (74,94%). Segundo Peres (2002), quando
um explante falha em desenvolver organogênese “in vitro”, essa falha pode ser
devida à etapa de competência.
A utilização direta de tecidos meristemáticos, especialmente ápices
caulinares, facilita a indução dos processos organogenéticos, os quais ocorrem
grande homogeneidade, onde as células estão sempre num processo ativo de
divisão (HANDRO & FLOH, 1990). Na Tabela 3 verifica-se que para o ápice caulinar,
houve uma tendência de aumento no número de brotações em função do aumento
da concentração de IBA, no entanto não foi significativo, fato este evidenciado no
experimento 3, onde buscou-se testar a influência do IBA na multiplicação e
enraizamento “in vitro” da citronela.
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44
Alguns autores obtiveram sucesso na utilização de ápices caulinares, como
em Achyrocline satureioides (IKUTA, 1998), Baccharis trimera (SILVA et al., 2003),
Curcuma zedoaria (MELO et al., 2000), Eucalyptus sp. (ALVES et al., 2004) e Pyrus
communis (ERIG & SCHUCH, 2003b e ROCHA et al., 2004). Outros alcançaram
bons resultados através de gemas (CANTAGALLO et al., 2005; ERIG & FORTES,
2002; DEBIASI et al., 2002 e SATO et al., 2004)
Fazendo um comparativo entre as Tabelas 1 e 3, verifica-se que na adição
de 1,0 mg L
-1
de BAP, o ápice caulinar não diferiu no número de brotações, quando
comparado com a gema lateral. No entanto, com o suplemento de 2,0 mg L
-1
de BAP
no meio de cultura, os ápices caulinares tiveram um incremento de 74% no número
de brotações, sendo que as gemas laterais, apesar do reduzido número de
brotações, tiveram resultado melhor que o obtido com 1,0 mg L
-1
de BAP, no meio de
cultura. As respostas morfogenéticas são dependentes do genótipo que se esta
trabalhando, do tipo de explante empregado e da concentração ideal de reguladores
vegetais para a cultura em questão, pois o que é ideal para uma determinada
cultura, pode não ser para outra (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Como observado por Moura et al. (2001), que a concentração 2,5 mg L
-1
de
BAP foi a que favoreceu a organogênese “in vitro” em segmentos internodais de
limão-'Cravo', e a concentração 1,0 e 2,0 mg L
-1
de BAP foram as que melhor
favoreceram em segmentos de epicótilo da laranja-'Pêra'. Para Alves et al. (2004), a
concentração de 1,0 mg L
-1
de BAP, foi a que promoveu maior regeneração em
explantes caulinares de Eucalyptus sp. Segundo Carvalho et al. (2004), a
concentração 1,0 mg L
-1
de BAP combinado com 0,1 mg L
-1
de ANA induz maior
proliferação de brotos em Agave lechuguila, enquanto para A. palmieri, recomenda-
se BAP a 2,0 mg L
-1
.
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45
Através dos resultados, pôde-se confirmam que para a indução morfogênica
dos explantes da citronela é necessária a adição de citocinina ao meio de cultura,
sendo que a concentração de 2,0 mg L
-1
foi a que levou aos melhores níveis de
resposta, principalmente para o ápice caulinar. As citocininas constituem o grupo de
fitorreguladores indispensáveis para a quebra da dominância apical e indução de
proliferação de gemas axilares. O tipo e a concentração são os que mais influenciam
no sucesso da multiplicação “in vitro” (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Na Tabela 4 encontram-se os resultados referentes à formação de calo nos
tipos de explantes de citronela em função da concentração de IBA no meio de
cultura, com 2,0 mg L
-1
de BAP. Houve interação significativa entre as concentrações
de IBA empregadas e o explante ápice caulinar, onde com exceção da concentração
de 0,2 mg L
-1
de IBA, os demais obtiveram 100% de formação de calo.
Tabela 4 Percentagem de explantes de citronela de Java (Cymbopogon winterianus
Jowitt) que formaram calo, em função do tipo de explante e da concentração de
ácido indolbutírico (IBA) no meio de cultura, com 2,0 mg L
-1
de 6-benzilaminopurina
(BAP).
Explantes que formaram calo (%)
Concentração de
IBA no meio
Ápice caulinar Gema lateral Segmento nodal Média
0,0 mg L
-1
100 a A 100 a A 0,0 a B 66,7
0,1 mg L
-1
100 a A 50 a A 0,0 a B 50,0
0,2 mg L
-1
25 b AB 50 a A 0,0 a B 25,0
0,4 mg L
-1
100 a A 100 a A 0,0 a B 66,7
Média 81,2 75,0 0,0 -----
CV (%) 14,65
*Médias seguidas da mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem
estatisticamente pelo teste de Tukey (P<0,05). Para a análise estatística utilizou-se dados
transformados em raiz (x + 0,5).
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46
A formação de calo esta diretamente ligada à razão auxina/citocinina, sendo
que concentrações excessivas de auxina podem favorecer a proliferação de calos
(TAIZ & ZEIGER, 2004), no entanto, neste experimento as concentrações de auxina
utilizadas, parecem não influenciar diretamente na indução de calos, uma vez que
no meio desprovido de IBA, houve 100% de formação de calo. Alves et al. (2004),
verificaram a formação de calos em 100% dos explantes caulinares, utilizando dose
de TDZ (0,5 mg L
-1
) e ANA (0,1 mg L
-1
).
É comum a formação de calos nesses explantes e em meios com altas
doses de reguladores de crescimento (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Gürel
& Gülsen (1998), verificaram que altos níveis de IBA (0,5 mg L
-1
) e BAP (2,0 ou 3,0
mg L
-1
), ocasionaram formação de calo em ápices caulinares de Amygdalus
communis.
Em cultura de tecidos, dois parâmetros de regeneração de plantas são
particularmente importantes, a freqüência de indução de calos e eficiência de
regeneração a partir destes calos (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Através
dos resultados, pôde-se perceber que a formação de calos parece ter influenciado
no número de brotações. RUEB et al. (1994) consideraram como melhor meio de
indução de calos aquele que apresentou um maior número de brotações por
explante.
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47
4.3 EXPERIMENTO 3: EFEITO DE REGULADORES VEGETAIS NO
DESENVOLVIMENTO “IN VITRO” DE C. winterianus
E A ACLIMATAÇÃO DAS PLÂNTULAS
Com o intuito de testar a influência do IBA na multiplicação e enraizamento
“in vitro” da citronela, utilizou-se a concentração de 2,0 mg L
-1
de BAP no meio de
cultura e diferentes concentrações de IBA (Tabela 5), sendo a fonte de explante
ápices caulinares, que demonstraram serem mais promissores no estabelecimento
“in vitro” para a cultura da citronela. Os resultados observados mostraram que não
houve diferença significativa entre as concentrações de IBA empregadas, para o
número de brotações.
Tabela 5 Número de brotações por explantes e altura do explante de citronela de
Java (Cymbopogon winterianus Jowitt) em função da concentração de ácido
indolbutírico (IBA) no meio de cultura, com 2,0 mg L
-1
de 6-benzilaminopurina (BAP)
e do tempo após a inoculação.
Número de brotações/
explante
Altura do explante (cm)
Concentração de
IBA no meio
30 DAI 30 DAT 60 DAT 30 DAI 30 DAT 60 DAT
0,0 mg L
-1
1,6 a 16,6 a 53,8 a 2,8 a 3,2 a b 5,0 b
0,1 mg L
-1
1,2 a 16,8 a 57,4 a 2,4 a 3,6 a b 5,3 a b
0,2 mg L
-1
1,2 a 17,4 a 43,6 a 2,8 a 2,4 b 5,2 b
0,3 mg L
-1
1,6 a 20,8 a 48,0 a 3,4 a 3,4 a b 6,5 a
0,4 mg L
-1
2,8 a 21,0 a 42,8 a 3,3 a 3,8 a 5,5 a b
CV parcela (%) 32,1 34,6
Cv subparcela (%) 37,5 18,1
*Médias seguidas da mesma letra, minúscula na coluna, não diferem estatisticamente pelo teste de
Tukey (P<0,05). Para a análise estatística utilizou-se dados transformados em raiz (x+0,5).
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48
Zaniolo & Zanette (2002), verificaram uma tendência de aumento no número
de brotações em Ilex paraguariensis com o aumento das concentrações de IBA.
Para Erig et al. (2002), a multiplicação “in vitro” da amoreira-preta pode ser realizada
sem a presença do IBA no meio de cultura, sendo o BAP essencial para promover a
taxa de multiplicação. Segundo Dodds & Roberts (1982) a interação entre auxina e
citocinina adicionada ao meio de cultura é complexa e fatores nutricionais podem
interferir no resultado final.
Para a variável altura dos explantes, houve diferença significativa, aos 30 e
60 dias após a transferência, verificando-se um aumento da altura com doses mais
altas de IBA, estando possivelmente relacionado ao efeito fisiológico do
alongamento celular das auxinas (TAIZ & ZEIGER, 2004). Oliveira et al. (2001),
verificaram que a concentração de 1,0 mg L
-1
de ANA, proporcionou maior
comprimento das brotações de Averrhoa bilimbi. Já Erig et al. (2002), observaram
que na concentração de 1,0 µM de AIB e no aumento das concentrações de BAP,
houve uma diminuição do comprimento das brotações de Rubus idaeus.
A manutenção das plântulas em sucessivos cultivos proporciona um
conseqüente aumento no número de brotações (Figura 7a), o qual pôde ser
evidenciado na Tabela 5, porém se mantidas por mais de 60 dias num mesmo meio
de cultura, as mesma começam a morrer (Figura 7b), provavelmente por
esgotamento do meio, fato observado nas condições deste estudo. Faz-se então
necessário a mudança periódica do meio de cultura de multiplicação, caso se deseje
aumentar a taxa de brotação. Zaniolo & Zanette (2002), observaram que a
permanência de brotações de Ilex paraguariensis durante três subcultivos no mesmo
meio de cultura proporcionou a maior taxa de multiplicação.
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49
(a) (b)
Figura 7 (a) - Multiplicação dos explantes de Cymbopogon winterianus cultivados “in
vitro”, ápos subcultivos. (b) - Plântulas de C. winterianus comprometidas pela
permanência em meio de cultura.
A utilização de auxinas para promover o enraizamento é uma alternativa
viável em muitas culturas (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Gonzáles et al.
(2003), verificaram altos índices de enraizamento em plântulas de Artemisia
absinthium, na presença de IBA no meio de cultura. O mesmo foi constatado por
Almeida et al. (1995), que obtiveram 59,5% de enraizamento em Bixa orellana, na
concentração de 1,0 mg L
-1
de IBA. Neste experimento, não foi evidenciado a
formação de raízes na presença de IBA no meio de cultura.
Visando o enraizamento das plântulas, observou-se neste estudo, que a
mudança do meio de cultura de multiplicação para o meio de cultura MS, ou seja,
sem reguladores vegetais, proporcionou alongamento e enraizamento ideais para a
fase de aclimatação (Figura 3), independente do meio de cultura anterior. Ficou
demonstrado que para citronela, este tipo de morfogênese é aparentemente
favorecido pela ausência total de reguladores vegetais no meio de cultura.
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50
Resultados semelhantes foram verificados por Catapan et al. (2001), os
quais obtiveram 100% de enraizamento das microestacas de Phyllanthus stipulatus
em meio MS sem regulador vegetal. Thomé et al. (2004), conseguiram induzir raízes
em Kalanchoe blossfeldiana somente no meio de cultura desprovido de regulador
vegetal. Já Zaniolo & Zanette (2002), conseguiram indução de raízes em erva-doce
pela permanência das brotações durante 12 dias num meio suplementado com IBA,
seguida da transferência para o meio isento de regulador vegetal.
No tratamento testemunha, ou seja, sem a adição de reguladores vegetais
foi verificada a indução de organogênese direta, sendo que a formação de gemas
adventícias foi precedida da formação de calo nos demais tratamentos. Gürel &
Gülsen (1998), verificaram que não houve proliferação de brotos com a isenção de
reguladores vegetais no meio de cultura, sendo essencial para a cultura de
Amygdalus communis, um balanço entre BAP e IBA, para a obtenção de brotos.
Através deste experimento, ficou evidente que para a cultura da citronela foi
essencial à adição de 2,0 mg L
-1
da citocinina 6-benzilaminopurina (BAP),
favorecendo a multiplicação dos ápices caulinares, no entanto a adição do ácido
indolbutírico (IBA) no meio de cultura, não influiu significativamente na multiplicação
“in vitro”, nem proporcionou enraizamento das plântulas de citronela.
A fase mais crítica da micropropagação é a aclimatação, ou seja, fase de
transferência das mudas produzidas “in vitro” para o ambiente natural ou um
ambiente de transição, como uma casa de vegetação ou telado. Esta afirmação se
deve à grande diferença existente entre as condições ambientais do laboratório e a
do campo. Desta forma, existe a necessidade de adequar a cultura a um método de
aclimatação que permita a mais alta taxa de sobrevivência, sendo que o sucesso da
micropropagação depende dessa transferência (HOFFMANN, 2002).
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51
Quando as plântulas foram submetidas à aclimatação (Figura 8), observou-
se que o método utilizado proporcionou uma taxa média de sobrevivência de 98%
aos 40 dias após a transferência. Esta alta taxa de sobrevivência, provavelmente
esta relacionada com a boa qualidade da parte aérea e do sistema radicular das
plântulas, pois segundo Grattapaglia & Machado (1998) o sucesso desta etapa
depende da qualidade das plantas provenientes da fase anterior.
Figura 8 Plântulas de Cymbopogon winterianus durante a fase de aclimatação.
Durante a fase de aclimatação foi evidenciado uma boa adaptação das
plantas as novas condições ambientais, iniciando o desenvolvimento de novas
brotações, sendo que não foram evidenciadas alterações morfológicas. Flores et al.
(2006) relataram que à medida que novas brotações foram se desenvolvendo, o
crescimento tornou-se mais vigoroso e as plantas de Pfaffia tuberosa mais
adaptadas.
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52
Maciel et al. (2000) testaram alguns substratos, e verificaram que
independente do substrato utilizado, houve 100% de sobrevivência de plântulas de
Saintpaulia ionantha. Salazar et al. (2005), observaram que ao utilizar como
substrato terra negra, 80% das plantas Aster ericoides regeneradas “in vitro” foram
aclimatadas. Guerra et al. (1999) conseguiram uma taxa de sobrevivência de 95,5%
na aclimatação de plântulas micropropagadas de abacaxi, utilizando substrato em
bandejas de isopor dispostas em túnel de nebulização. Thomé et al. (2004), por sua
vez, relataram uma sobrevivência de 100% quando aclimataram plantas de
Kalanchoe blossfeldiana, usando solo e 14 dias em câmara úmida.
O sistema de “floating” foi essencial para diminuir um dos maiores problemas
observados durante a aclimatização que é a ocorrência de déficit hídrico, o mesmo e
comentado por Hoffmann (2002). Czepak et al. (2003), verificaram que o sistema de
“floating” favoreceu a adaptação das plântulas “ex-vitro” de Cymbopogon citratus, o
mesmo foi observado por Reis et al. (1999).
Futuras pesquisas na área de fitotecnia são necessárias para averiguação
do desenvolvimento no campo destas plantas micropropagadas.
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5 CONCLUSÕES
O estabelecido protocolo regenerativo para a citronela de Java através da
propagação “in vitro” é viável e possível:
I – A manutenção do cultivo asséptico foi mantido com a utilização do
hipoclorito de sódio 0,5% no tempo de 30 minutos;
II – O ápice caulinar é o explante que apresenta maior capacidade
regenerativa para a cultura da citronela;
III – O emprego de benzilaminopurina (BAP) é indispensável para o sucesso
do estabelecimento “in vitro” da citronela, podendo ser utilizado na concentração de
2,0 mg L
-1
. A utilização do ácido indolbutírico na multiplicação e enraizamento da
citronela não apresentam resultados que justifique seu emprego;
O enraizamento foi evidenciado quando as plântulas micropropagadas foram
inoculadas somente em meio de cultura MS, sendo que no tratamento testemunha
houve organogênese direta;
O procedimento utilizado para a aclimatização das plântulas regeneradas “in
vitro” foi fundamental para a sobrevivência destas quando transferidas para a casa
de vegetação.
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