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heila
M
ônica
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amásio
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ias
Ação do estrógeno na expressão de proteínas
relacionadas ao metabolismo ósseo durante
regeneração alveolar em ratas
Araçatuba – 2007
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Sheila Mônica Damásio Dias
Ação do estrógeno na expressão de proteínas
relacionadas ao metabolismo ósseo durante
regeneração alveolar em ratas
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia do Campus de Araçatuba –
UNESP, para a obtenção do grau de “MESTRE
em Odontologia – Área de Implantodontia”.
Orientador
OrientadorOrientador
Orientador: Prof. Ass. Dr. Idelmo Rangel
Garcia Júnior.
Co
CoCo
Co-
--
-orientadora
orientadoraorientadora
orientadora: Profa. Ass. Dra. Rita Cássia
Menegati Dornelles
Araçatuba
Araçatuba Araçatuba
Araçatuba –
––
– SP
SP SP
SP
-
--
- 2007
2007 2007
2007 -
--
-
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Dedicatória
Dedicatória
Ao meu esposo Márcio, que com carinho, amor e dedicação
soube superar mais esta etapa de nossas vidas;
aos meus pais Mário e Natália, que com desprendimento
fundamentado no amor conduziram minha formação moral e
profissional,
dedico este trabalho.
Agradecimentos Especiais
Agradecimentos Especiais
Agradeço
à Deus, pois através deste curso foi possível fazer novos amigos,
vivenciar situações antes desconhecidas e superar temores.
À minha irmã Patrícia e minha avó Benedita, pelos momentos de
alegria, amizade e compreensão;
aos meus sogros e cunhados que me receberam de braços abertos em sua
família;
à família Benez Ricieri que me adotou em Araçatuba;
à Cláudia Letícia por ter me ensinado o significado da palavra dividir;
à Thaís Rodrigues Silveira pelo companheirismo;
aos amigos, Lúcia Lima, Luciana, Cleirice, Vaninha, Maurício e Geraldo
Kasbergen, pela torcida que tornou menor a distância entre Belo
Horizonte e Araçatuba;
Agradecimentos Especiais
à Profa. Dra. Rita Cássia Menegati Dornelles, pela dedicação e esmero
com que conduziu minha formação docente e pelos exemplos de
honestidade, disciplina, segurança, responsabilidade e amizade que
tanto contribuíram para minha formação pessoal.
Agradecimentos
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Idelmo Rangel Garcia Júnior pela amizade e por ter
assumido minha orientação junto ao programa de pós-graduação
tornando possível a concretização de um sonho ;
à Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba – UNESP, nas
pessoas do seu diretor Paulo Roberto Botacim e Vice-diretor Célio
Percinoto pela oportunidade de realização do curso de mestrado em
odontologia, área de Implantodontia;
à Prof. Dra. Roberta Okamoto pelo início de minha orientação e pela
leitura das lâminas, seleção e aquisição das imagens;
à mestranda Eloá Rodrigues Luvizuto pela grande ajuda na execução
dos procedimentos experimentais;
aos Professores, Funcionários, Pós-graduandos e Estagiários dos
Departamentos de Ciências Básicas, de Cirurgia e Clínica Integrada e
de Materiais Dentários e Prótese pela convivência agradável e auxílio
na realização das atividades do curso de pós-graduação;
aos funcionários da Seção de Pós-graduação, do Biotério Central e da
Biblioteca pela atenção e disponibilidade;
Agradecimentos
à Sra. Maria Antônia Piedade de Oliveira pela revisão de português;
ao mestrando Carlos Shimabucoro pelo auxílio durante os processos de
edição e impressão;
à FAPESP pelo apoio financeiro ao projeto, sem o qual, seria impossível
realizar este estudo;
ao CNPq pela concessão de bolsa de estudo;
às ratas...
...muito obrigada!!!
Epígrafe
Epígrafe
“A liberdade não consiste em fazer o que
queremos, mas em ter o direito de fazer o que
devemos”
Karol Wojtyla, 1995
Resumo
Resumo
Dias SMD Ação do estrógeno na expressão de proteínas relacionadas
ao metabolismo ósseo durante regeneração alveolar em ratas
[dissertação] Araçatuba: Faculdade de Odontologia da Universidade
Estadual Paulista; 2007.
Objetivo:Avaliar a atuação do E
2
durante a regeneração alveolar,
utilizando a expressão das proteínas OPG, RANK e RANKL como
indicadores celulares de predisposição à reabsorção ou formação de
tecido ósseo. Material e métodos: Após 8 dias da cirurgia SHAM ou
ovariectomia (OVX), as ratas (200g) OVX receberam implantes
subcutâneos contendo óleo de milho (grupo OVX/óleo) ou E
2
(400µg)
(grupo OVX/E
2
). As exodontias dos incisivos superiores direitos foram
realizadas no decorrer do tratamento e agendadas para que ao
término de 60 dias fosse possível obter as peças referentes a 14, 28
e 42 dias de regeneração óssea alveolar. As peças foram submetidas
a processamento imunoistoquímico. Resultados: Nos animais com
ciclo estral regular (grupo SHAM), foi observada expressão baixa aos
14, média/alta aos 28 e a não expressão de OPG e RANKL aos 42
dias. A expressão de RANK iniciou alta e foi diminuindo até o último
período analisado. No grupo OVX/Óleo a expressão de RANKL foi
crescente até o término da análise aos 42 dias, enquanto que a
Resumo
expressão de RANK diminuiu ao longo do período estudado. Foi
observada expressão de OPG no início e ao final do período analisado.
Os animais OVX/E
2
apresentaram marcação semelhante para OPG,
RANK e RANKL aos 14 dias. A expressão de RANKL foi observada até
o final do experimento, entretanto não foi detectada expressão de
OPG e RANK aos 28 e 42 dias. Conclusão: Estes resultados
evidenciam a participação do E
2
modulando o ciclo de remodelação
óssea alveolar.
PALAVRAS-CHAVE: Estradiol; Regeneração óssea; Alvéolo dental;
Imunoistoquímica; RANK ligante.
Abstract
Abstract
Dias SMD Action of estrogen on expression of proteins related on
bone metabolism during alveolar regeneration in rats [dissertation]
Araçatuba: Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual
Paulista; 2007.
Objective: To evaluate the role of E
2
during alveolar bone
regeneration, using OPG, RANK and RANKL protein expression as
cellular indicators of predisposition to resorption or bone tissue
formation. Methods: Eight days after either SHAM surgery or
ovariectomy (OVX), the OVX rats (200g) received subcutaneous
implants with corn oil (OVX/oil group) or E
2
(400µg) (OVX/E
2
group).
Extraction of the maxillary right incisors were performed during the
course of the treatment and was scheduled in such a way that at the
end of a 60-day period it would possible to retrieve anatomic pieces
referring to 14, 28 and 42 days of alveolar bone healing. The pieces
were submitted to immunohistochemical processing. Results: In the
animals with regular estrous cycle (SHAM group), it was observed low
expression at 14 days, medium/high expression at 28 days and no
OPG and RANKL expression at 42 days. RANK expression started high
and decreased continuously up to the last analyzed period. In the
OVX/oil group, RANKL expression increased up to the completion of
Abstract
the analysis at 42 days, whereas RANK expression decreased within
the studied period. OPG expression was observed in the beginning
and the end of the analyzed period. The animals OVX/E
2
showed
similar labeling for OPG, RANK and RANKL at 14 days. RANKL
expression was observed up to the end of the experiment. However,
no OPG and RANK expression was detected at 28 and 42 days.
Conclusion: These results demonstrate the role of E
2
modulating the
alveolar bone remodeling cycle.
KEY WORDS: Estradiol; Bone regeneration; Dental socket;
Immunohistochemistry; RANKL ligand.
Lista de Figuras
Figura 1
Expressão das proteínas referentes aos animais do
g
rupo SHAM e aos períodos após a exodontia. 14
dias: (A) OPG; (B) RANK; (C) RANKL.
28 dias: (D)
OPG; (E) RANK; (F) RANKL. 42 dias: (G) OPG; (H)
RANK; (I) RANKL. (original, DAB, 160x).
p. 36
Figura 2
Expressão das proteínas referentes aos animais do
grup
o OVX/Óleo e aos períodos após a exodontia.
14 dias: (A) OPG; (B) RANK; (C) RANKL.
28 dias:
(D) OPG; (E) RANK; (F) RANKL. 42 dias: (G) OPG;
(H) RANK; (I) RANKL. (original, DAB, 160x).
p. 37
Figura 3
Expressão das proteínas referentes aos animais do
grupo OVX/E
2
e aos períodos após a exodontia. 14
dias: (A) OPG; (B) RANK; (C) RANKL.
28 dias: (D)
OPG; (E) RANK; (F) RANKL. 42 dias: (G) OPG; (H)
RANK; (I) RANKL. (original, DAB, 160x).
p. 38
Figura 4
Terço médio do alvéolo dental aos 14, 28 e 42 dias
de r
eparo alveolar (vertical). (A, D e G) Grupo
SHAM (B, E e H) Grupo OVX/Óleo (C, F e I) Grupo
OVX/E
2
(original, HE 63x).
p. 39
Setas em 1B e E, 2B e 3B, indicam marcações positivas de células
semelhantes a OBs.
Lista de Abreviaturas
OPG
= Osteoprotegerina
RANK
= Receptor ativador do fator nuclear кappaB
RANKL
= RANK ligante
E
2
= Estrógeno
SHAM
= cirurgia sham
OVX = Ovariectomia
OVX/Óleo
= OVX + tratamento com óleo de milho
OVX/E
2
= OVX + tratamento com 17-β estradiol
OBs = Osteoblastos
OCs = Osteoclastos
TNF = fator de necrose tumoral
NF-кB = fator nuclear кappaB
JNK = Jun N-terminal Kinase
PBS
= tampão sódio fosfato
IgG
= Imunoglobulina G
DAB = Diaminobenzidina
HE
= hematoxilina/eosina
IL-1
= interleucina – 1
IL-6
= interleucina – 6
M-CSF = fator estimulante de colônia de macrófagos
PGE
2
= Prostaglandina E
2
Lista de Abreviaturas
TGF-β
= fator de crescimento transformador – β
PTH
= Paratormônio
IL-1ra = antagonista do receptor para interleucina – 1
PTHrP
= Peptídeo relacionado ao paratormônio
TNFR
= receptor de fator de necrose tumoral
Sumário
1 Introdução 24
2 Proposição 28
3 Material e Método 30
4 Resultados 35
5 Discussão 42
6 Conclusões 50
Referências 52
Anexo A – Certificado de aprovação da Comissão de Ética 59
Anexo B – Normas para publicação 60
Introdução
1 Introdução
*
1 Introdução
O metabolismo ósseo é dependente dos processos de formação
e reabsorção que são regulados por sinalização molecular. A hipótese
de que os osteoblastos (OBs), células especializadas responsáveis
pela formação de tecido ósseo, exercem função importante na
diferenciação e ativação de osteoclastos (OCs), células da linhagem
hematopoiética que reabsorvem osso, foi confirmada pela descoberta
do sistema osteoprotegerina (OPG), receptor ativador do fator
nuclear κB (RANK) e RANK ligante (RANKL), cujos elementos são
proteínas, pertencentes à super família fator de necrose tumoral
(TNF) (Simonet et al., 1997; Riggs, 2000; Ikeda et al., 2001; Katagiri
e Takahashi, 2002; Lerner, 2004).
RANKL, produzida por células da linhagem osteoblástica, liga-se
ao RANK, receptor localizado na membrana de pré-osteoclastos,
desencadeando a ativação dos efetuadores finais da
osteoclastogênese, ou seja, o fator nuclear κB (кappaB) e o Jun N-
terminal kinase (JNK) (Suda et al., 1999). As células da linhagem
osteoblástica produzem também a OPG, receptor solúvel que se liga a
RANKL, tornando-a indisponível para ligar-se ao RANK, inibindo a
*
Normalização segundo a Revista Archives of Oral Research (Anexo B)
Introdução 25
diferenciação e ativação de OCs (Simonet et al., 1997). A importância
fisiológica deste sistema sugere a manutenção do equilíbrio entre
formação e reabsorção ósseas (Hofbauer et al., 2000; Teitelbaum,
2000; Katagiri e Takahashi, 2002; Bell, 2003; Lerner, 2004).
Após a demonstração, em 1988 por Eriksen e colaboradores,
de que os OBs contêm receptores funcionais para estrógeno (E
2
),
estudos têm sido direcionados à explicação dos efeitos deste
hormônio no metabolismo ósseo. A deficiência de E
2
por ovariectomia
(OVX) cirúrgica ou perda de função ovariana provoca aumento na
ativação da remodelação e desequilíbrio entre formação e reabsorção
óssea (Riggs, 2000; Riggs et al., 2002).
A deficiência sistêmica de E
2
altera a remodelação óssea
alveolar, possivelmente por interferir na diferenciação de OBs (Li e
Nishimura, 1994), diminui a densidade óssea mandibular (Jiang et
al., 2003) e induz a expressão de RANKL (Kawamoto et al., 2002) e
a osteoclastogênese no periodonto (Kawamoto et al., 2002). De
acordo com Hsieh e colaboradores (1994), a reabsorção do rebordo
residual é maior em exodontias realizadas em mulheres
menopausadas. Em animais de laboratório com deficiência
estrogênica, foi observada alteração significante na formação e
mineralização óssea durante o processo de regeneração alveolar pós-
exodontia (Hsieh et al., 1995). As alterações na arquitetura óssea
decorrentes da deficiência de E
2
, podem ser antagonizadas pela
reposição farmacológica deste hormônio, restaurando o equilíbrio do
Introdução 26
metabolismo e prevenindo a perda óssea (Aubin e Boneyle, 2000;
Vincent et al., 2003).
Considerando o curto período necessário para cicatrização e a
relevância clínica, o modelo de regeneração tecidual pós-exodontia é
interessante para verificar a expressão das proteínas do sistema OPG,
RANK e RANKL em ratas com ciclo estral regular e ratas OVX
submetidas ou não à reposição hormonal de E
2
.
Proposição
2 Proposição
2 Proposição
Foi objetivo deste trabalho, avaliar a atuação do E
2
no
metabolismo ósseo durante a regeneração alveolar, utilizando a
expressão das proteínas OPG, RANK e RANKL como indicadores
celulares de predisposição à reabsorção.
Material e Métodos
3 Material e Métodos
3 Material e Método
Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de
acordo com os princípios éticos na experimentação animal adotados
pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foram
aprovados pela Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEEA)
da Faculdade de Odontologia de Araçatuba-UNESP sob protocolo de
número 38/05 (Anexo A).
Cirurgias:
Foram utilizadas ratas (Rattus norvegicus albinus - Wistar),
com peso corporal de 200g, nulíparas, avaliadas por citologia vaginal
(Evans e Long, 1922) e apresentando ciclo estral regular, mantidas
em ambiente com controle de temperatura (22±2˚C) e ciclo de luz
(12/12h), alimentadas com ração balanceada (Guabinutrilabor ratos e
camundongos
®
, Guabi,Campinas, Brasil) e água à vontade.
Para a realização das cirurgias, os animais foram anestesiados
com Cloridrato de Cetamina (Vetaset
®
, Fort Dodge saúde animal
Ltda, Campinas, SP, Brasil/i.p.) e Xilasina (Dopaser
®
, Laboratórios
Calier S.A., Barcelona, Espanha/i.p.). O grupo controle (24 ratas) foi
submetido à cirurgia sham (grupo SHAM) e os 48 animais restantes
passaram pelo procedimento de OVX bilateral cirúrgica. Todos os
animais receberam dose única (0,1ml/rata/i.m.) de antibiótico
Material e Métodos 31
veterinário polivalente (Pentabiótico
®
veterinário pequeno porte, Fort
Dodge
®
, Fort Dodge saúde animal Ltda, Campinas, SP, Brasil)
imediatamente após as cirurgias. Decorridos 8 dias, 24 ratas OVXs
receberam implantes subcutâneos de polietileno (Silastic
, Dow
Corning, Degania, Israel) contendo óleo de milho (grupo OVX/óleo) e
outras 24 receberam implantes contendo 17β-estradiol (400 µg,
Sigma
®
, Sigma-Aldrich Corporation, ST. Louis, Missouri, USA) diluído
em óleo de milho (grupo OVX/E
2
). Os pellets foram mantidos por 60
dias com trocas na metade deste período. O esfregaço vaginal foi
monitorado para certificar a efetividade do tratamento.
As exodontias dos incisivos superiores direitos (Okamoto e
Russo, 1973) foram realizadas em períodos pré-determinados para
obtenção das peças referentes a 14, 28 e 42 dias de regeneração
óssea alveolar.
Coleta de sangue, eutanásia e obtenção das peças:
Sob anestesia geral, foi retirado 1ml de sangue venoso através
da canulação da veia jugular (Harms e Ojeda, 1974), para dosagem
hormonal posterior através de radioimunoensaio.
A perfusão transcardíaca (Eichhammer et al., 1987), foi
realizada com 600ml/rata de formaldeído 4%, pH 9,5 (4
0
C),
utilizando bomba peristáltica Masterflex LS
®
(Cole Parmer Instrument
Company, Vernon Hills, IL.)
Material e Métodos 32
As peças foram obtidas procedendo duas incisões: 1) na sutura
intermaxilar e 2) perpendicular à primeira, tangente à distal do último
molar.
Processamento histológico:
As peças foram submetidas à pós-fixação (formaldeído 4%),
lavagem em tampão sódio fosfato (PBS), descalcificação em EDTA
5% (Titriplex
®
, Merck, Damnstadt, Alemanha) e crioproteção em
Sacarose 20% (Merck, Damnstadt, Alemanha). Cortes ao longo eixo
do alvéolo, com 14 µm de espessura, feitos em criostato (Mícron,
Zeiss, Alemanha), foram montados em lâminas gelatinizadas.
Os anticorpos primários (1:100) foram contra a OPG (Rabbit
anti-opg – Santa Cruz Biotechnology – SC11383), RANK (Rabbit anti-
rank – Santa Cruz Biotechnology – SC9072) e RANKL (Goat anti-rankl
– Santa Cruz Biotechnology – SC7627). Os anticorpos secundários
(1:200) foram anti-coelho biotinilado produzido em burro (Biotin-SP-
conjugated AffiniPure donkey anti-rabbit IgG - Jackson
Immunoresearch Laboratories – 711.065.152) e anti-cabra biotinilado
produzido em burro (Biotin-SP-conjugated AffiniPure donkey anti-
Goat IgG - Jackson Immunoresearch Laboratories - 705-065-147).
O sinal da reação foi amplificado com o sistema avidina-biotina
(Kit ABC-Vectastain Elite ABC – Peroxidase Standard, reagent A and B
only – PK6100 – Vector Laboratories) e a reação foi revelada
utilizando a diaminobenzidina (DAB) (Sigma
®
, Sigma-Aldrich
Corporation, ST. Louis, Missouri, USA) como cromógeno.
Material e Métodos 33
A especificidade das marcações foi confirmada através da
exclusão do anticorpo primário em lâminas controle. Todas as
incubações dos anticorpos foram realizadas em câmara úmida à
temperatura de 25˚C. A coloração em hematoxilina/eosina (HE) foi
realizada como referência para a citoarquitetura dos cortes
analisados.
O terço médio dos alvéolos dentais foi examinado com o auxílio
de microscópio de luz.
Resultados
4 Resultados
Resultados
Grupo SHAM:
14 dias – Foi observada marcação alta de RANK (Fig. 1B) em
células com morfologia semelhante a osteoblastos localizadas na
interface do tecido ósseo, próximas ao osteóide. Os poucos osteócitos
e células de revestimento ósseo presentes apresentaram expressão
baixa de OPG e RANKL (Fig. 1A e C).
28 dias – A expressão de OPG e RANKL (1D e F) por osteócitos
e células de revestimento ósseo foi média/alta, enquanto a
disponibilidade do receptor RANK marcado em células semelhantes à
OBs foi média (Fig. 1E).
42 dias – Neste período observou-se expressão baixa de RANK
(Fig. 1H), enquanto a expressão de OPG e RANKL não foi perceptível
(Fig. 1G e I).
No decorrer do processo de regeneração alveolar, houve
variação proporcional entre a expressão de OPG e RANKL. Foi
observada expressão baixa no primeiro período analisado (fig. 1A e
C), expressão média/alta aos 28 dias (Fig. 1D e F) e nenhuma
expressão aos 42 dias de regeneração alveolar (Fig. 1G e I).
Resultados 36
Grupo OVX/Óleo:
14 dias – Células semelhantes à OBs marcaram positivamente
para RANK, RANKL e OPG, sendo considerada média a expressão de
OPG e RANK (Fig. 2A e B) e média/baixa para RANKL (Fig. 2C).
28 dias – Não foi observada marcação de OPG neste período
(Fig. 2D), enquanto células semelhantes à OBs apresentaram
expressão baixa para RANK (Fig. 2E) e células da linhagem
A
B
C
D
E
F
H
I
Fig. 1: Expressão das proteínas referentes aos animais do grupo SHAM e
aos períodos após a exodontia. 14 dias: (A) OPG; (B) RANK; (C) RANKL.
28 dias: (D) OPG; (E) RANK; (F) RANKL. 42 dias: (G) OPG; (H) RANK;
(I) RANKL. As setas indicam marcações positivas em células semelhantes
a OBs. (original, DAB, 160x).
F
G I
Resultados 37
osteoblástica localizadas no interior do tecido ósseo, apresentaram
expressão média/alta para RANKL (Fig. 2F).
42 dias – Foi evidenciada imunomarcação discreta contra OPG
(Fig. 2G) e expressão alta de RANKL em células maduras da linhagem
osteoblástica (Fig. 2I). Não foi detectada expressão de RANK (Fig.
2H).
Grupo OVX/E
2
:
14 dias – Marcações consideradas de expressão média para
OPG, RANK e RANKL, foram identificadas em células que
A
B
C
D
E
F
G
H
I
Fig. 2: Expressão das proteínas referentes aos animais do grupo
OVX/Óleo e aos períodos após a exodontia. 14 dias: (A) OPG; (B)
RANK; (C) RANKL. 28 dias: (D) OPG; (E) RANK; (F) RANKL. 42 dias:
(G) OPG; (H) RANK; (I) RANKL. A seta indica marcação positiva em
células semelhantes a OBs. (original, DAB, 160x).
Resultados 38
apresentavam localização e citoarquitetura semelhante à de células
da linhagem osteoblástica (Fig.
3A, B, C).
28 dias – Foi observada expressão alta de ligante (Fig. 3F) em
células maduras no interior do trabeculado ósseo, enquanto que a
disponibilidade dos dois receptores foi nula (Fig.
3D e E).
42 dias – Os receptores OPG e RANK (Fig. 3G e H) também não
apresentaram marcações neste período. Entretanto, foi constatada
expressão média de RANKL (Fig.
3I) nos osteócitos.
G
H
I
A
B
C
D
E
F
Fig. 3: Expressão das proteínas referentes aos animais do grupo OVX/E
2
e aos períodos após a exodontia. 14 dias: (A) OPG; (B) RANK; (C)
RANKL. 28 dias: (D) OPG; (E) RANK; (F) RANKL. 42 dias: (G) OPG; (H)
RANK; (I) RANKL. A seta indica marcação positiva em células
semelhantes a OBs.
(origina
l, DAB, 160x).
Resultados 39
Os cortes destinados ao controle da especificidade da reação
imunoistoquímica que foram submetidos à seqüência de
procedimentos, com exclusão do anticorpo primário, não
apresentaram marcações.
Controles histológicos, corados pela HE, foram úteis para
comparação da citoarquitetura e avaliação das condições da
regeneração óssea (Fig. 4).
A citologia esfoliativa realizada durante o tratamento mostrou
que os animais do grupo SHAM apresentaram ciclo estral regular,
Fig. 4: Terço médio do alvéolo dental aos 14, 28 e 42 dias de reparo
alveolar (vertical). (A, D e G) Grupo SHAM (B, E e H) Grupo OVX/Óleo (C,
F e I) Grupo OVX/E
2
(original, HE 63x).
A
B
D F
E
C
G
H
I
Resultados 40
enquanto o grupo OVX/Óleo, cuja dosagem hormonal foi 10,71 (±
0,54) pg/ml de E
2
, permaneceu em diestro e o grupo OVX/ E
2
que
apresentou 50,40 (± 2,46) pg/ml de E
2
, oscilou entre proestro e
estro.
Discussão
5 Discussão
5 Discussão
A retirada da secreção cíclica do esteróide gonadal alterou a
expressão das proteínas OPG, RANK e RANKL nos 14, 28 e 42 dias
pós-exodontia.
Estudos evidenciam que E
2
modula a síntese de substâncias
relacionadas diretamente com o metabolismo ósseo, como
interleucina-1 (IL1), interleucina-6 (IL6), fator de necrose tumoral-α
(TNF-α), fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF),
prostaglandina E
2
(PGE
2
), fator de crescimento transformador-β
(TGF-β) e paratormônio (PTH), bem como
atua diretamente nas
respostas celulares a estas substâncias (Manolagas, 2000, Riggs,
2000). Compston (2001) e Riggs 2000 verificaram aumento de
substâncias osteoclastogênicas após a OVX ou menopausa, sendo
estes efeitos revertidos pela terapia de reposição de E
2
(Aubin e
Boneyle, 2000; Vincent et al., 2003).
As expressões de OPG, RANK e RANKL detectadas em células da
linhagem osteoblástica, nas ratas com ciclo estral regular (Fig. 1),
demonstram o equilíbrio dinâmico entre formação e reabsorção
ósseas. Em condições fisiológicas, a formação dos osteoclastos requer
contato com as células estromais e osteoblásticas, as quais
expressam as proteínas RANKL e M-CSF em resposta a vários fatores
de reabsorção óssea (Katagiri e Takahashi, 2002). Os resultados
Discussão 43
obtidos (Fig. 1) corroboram com o que está descrito, ou seja, a
participação do E
2
na homeostasia óssea através da diminuição da
produção de fatores pró-osteoclastogênicos, como IL-1, IL-6, TNF, M-
CSF e PGE
2
e estimulação da produção de fatores
antiosteoclastogênicos, como o antagonista do receptor para
interleucina-1 (IL-1ra) (Pacifici et al., 1993), OPG (Hofbauer et al.,
2000) e TGF-β (Oursler et al., 1991).
Embora o anticorpo anti-RANK seja citado na literatura (Jimi, et
al., 1996; Suda et al., 1999; Khosla, 2001; Ikeda et al., 2001) como
específico para pré-osteoclastos e OCs maduros, no alvéolo em
regeneração, as células com morfologia semelhante a OBs,
localizados na periferia do osteóide, apresentaram marcações contra
RANK. Pettit e colaboradores (2006), utilizando anticorpos contra
RANK em estudo de erosão óssea na artrite reumatóide em humanos,
identificaram marcações em células com morfologia de OBs em 6 do
total de 14 amostras examinadas. Coutinho (2005), que estudou o
processo de regeneração alveolar em ratos, confirmou a localização
topográfica das células semelhantes a OBs imunomarcadas por RANK
no tecido ósseo através de coloração HE associada à
imunoistoquímica. Além disso, realizou experimentos de controle
positivo nos quais, células semelhantes a fibroblastos do ligamento
periodontal e macrófagos da cavidade nasal de ratos, mostraram-se
imunorreativos para RANK, garantindo a especificidade do anticorpo
utilizado. Ao reagir cortes de fetos de ratos com 21 dias (Coutinho,
Discussão 44
2005), observou marcações desta proteína em osso primário. Esses
resultados sugerem, que o trauma cirúrgico desencadeia aumento do
“turnover” ósseo durante a regeneração alveolar e pode causar
alterações no metabolismo celular resultando em osteoblastos com
elevadas propriedades osteoclastogênicas, fato que foi verificado de
maneira intensa aos 14 (Fig. 1B) e decrescente dos 28 aos 42 dias
pós-exodônticos (Fig. 1E e H), pois a evolução do processo de
cicatrização (Fig. 4 A, D, G) resultou na diminuição da freqüência de
ativação das unidades ósseas multicelulares.
Células que expressam RANK (Fig. 1B, E e H) estiveram
presentes durante todo o período analisado e devido a esta
marcação, é possível afirmar que havia receptores disponíveis à
osteoclastogênese, mas a expressão do receptor isca (OPG), que foi
equivalente à do ligante (RANKL) minimizou o contato célula-a-célula,
a formação do complexo RANK-RANKL e ativação de NFкB e JNK (Fig.
1A, C, D, F, G e I).
As expressões de OPG (Fig. 2A, D e G) e RANK (Fig. 2B, E e H)
foram diminuindo ao longo dos períodos analisados, no tecido ósseo
alveolar dos animais castrados sem reposição hormonal. Entretanto,
a expressão de RANKL, nos mesmos períodos, foi inversamente
proporcional (Fig. 2C, F e I). Provavelmente, a expressão baixa de
OPG (Fig. 2D) resulta da não ativação dos receptores de E
2
presentes
nos pré-osteoblastos e inibição conseqüente da sinalização autócrina
para produção de TGF-β (Riggs, 2000; Bell, 2003). A produção de
Discussão 45
TGF-β está diretamente relacionada com a proliferação e
diferenciação de pré-osteoblastos (Spelsberg et al., 1999), com a
síntese de OPG e com a apoptose de OCs (Compston, 2001).
Além disso, a deficiência de E
2
para ativar receptores específicos
existentes nas células T (Cenci et al., 2000) e B do sistema imune e
pelas células da linhagem osteoblástica (Bell, 2003), pode ter
desencadeado aumento na produção de RANKL por esses tipos
celulares (Fig. 2C, F e I). Sabe-se que a concentração plasmática
baixa de E
2
desencadeia aumento da produção de IL-1 (estimulador
potente da reabsorção óssea) e TNF-α pelos monócitos e células T
(Bell, 2003). Estas substâncias atuam também em OBs e células do
estroma aumentando a síntese de M-CSF, que é fator responsável
pela proliferação de pré-osteoclastos, pelo estímulo para expressão
de RANK e pelo retardo da apoptose de OCs (Lee e Lorenzo, 2006), e
de PGE
2
, que inibi a produção de OPG (Suda et al., 1999 e Hofbauer
et al., 2000).
De acordo com Kimble e colaboradores (1996), a OVX
desencadeia aumento na concentração de IL-1 e TNF-α, que atuam
na diferenciação de células do estroma com fenótipo para produção
maior de M-CSF. Associando as informações da literatura com os
resultados obtidos, pode-se sugerir que o atraso na regeneração
alveolar dos animais OVX sem reposição hormonal (Fig. 4 B, E e H)
ocorreu devido: 1) ao aumento no número de OCs; 2) à síntese
insuficiente de OPG para prevenir a formação do complexo RANK-
Discussão 46
RANKL, permitindo a diferenciação e ativação de pré-osteoclastos; 3)
à ocorrência de osteoclastogênese através da ligação de TNF-α ao seu
receptor (TNFR) (Riggs, 2000; Katagiri e Takahashi, 2002); 4) ao
aumento do tempo de vida de OC maduros devido ação da IL-1; 5) à
redução da produção TGF-β. Além disso, o aumento crescente da
expressão de RANKL detectada nos animais OVX (Fig. 2C, F,I) pode
ser resultado de aumento da secreção de PTH, pois autores
verificaram que este hormônio estimula expressão maior de RNAm de
RANKL em OBs e células do estroma (Lee e Lorenzo, 1999; Suzawa
et al., 2000).
No tecido ósseo dos animais OVX com reposição hormonal, as
células com morfologia semelhante à OBs expressaram de maneira
equivalente OPG, RANK e RANKL (Fig. 3A, B e C), aos 14 dias de
regeneração óssea. A diminuição da reabsorção óssea constatada,
quando comparada ao grupo OVX/óleo, pode ser resultado da ação de
OPG que diminuiu a ligação RANK/RANKL e deixou os OCs expostos à
ação do TGF-β. Estes resultados estão de acordo com Oursler e
colaboradores (1991), que afirmam ser o mecanismo de ação de
TGF-β, o primeiro exemplo dos efeitos positivos do estrógeno no
osso, pois resulta na diminuição do “turnover” ósseo.
O conjunto de resultados obtidos neste trabalho evidenciou
marcações pelo anticorpo anti RANKL em todos os períodos
estudados nos grupos OVXs, independente da presença do E
2
(Fig. 2-
3C, F e I). Nas fêmeas OVX tratadas com E
2
, as imunomarcações
Discussão 47
positivas para RANKL durante os períodos de 28 e 42 dias se
apresentaram em osteócitos localizados no interior das trabéculas
ósseas (Fig. 3F e I), fazendo alusão à maturidade tecidual compatível
com os períodos avaliados e o tratamento proposto, apresentando
correspondência com a cicatrização óssea alveolar em fêmeas
naturalmente estrogenizadas (Fig. 4D, F, G e I).
Células de revestimento ósseo (Philbrick et al., 1998), OBs e
células estromais (Suda et al., 1999) possuem receptores para
PTH/peptídeo relacionado ao PTH (PTHrP). Além do E
2
modular a
produção do PTH, a reposição com 17-β estradiol, diminui a afinidade
dos receptores para PTH, interferindo na produção de citocinas
envolvidas no metabolismo ósseo, exercendo a função de
osteoprotetor (Aubin e Boneyle, 2000), o que pode ter sido causa da
ausência da expressão de RANK nos períodos de 28 e 42 dias (Fig. 3E
e H). A ausência de expressão de RANK e conseqüentemente de
sinalização para reabsorção óssea nos períodos de 28 e 42 dias (Fig.
3E e H; 4F e I) pode estar relacionada às mudanças ocorridas nos
OCs em resposta a administração de 17-β estradiol. Gruber e
colaboradores (2001) analisaram a ultra-estrutura de OCs de
camundongos submetidos a tratamento com 17-β estradiol e
perceberam mudanças morfológicas que impossibilitavam a
organização de seu citoesqueleto para originar borda franjada
semelhante às dos OCs do grupo controle. Os OCs também se
Discussão 48
tornaram incapazes de formar a zona de selamento com o tecido
ósseo.
O E
2
leva à geração de células do estroma com bloqueio
funcional para produção de IL-1 e TNF, acarretando produção baixa
de M-CSF (Kimble et al., 1996). Pode-se inferir que os efeitos da
reposição hormonal com E
2
causaram menor proliferação,
diferenciação e ativação de OCs, favorecendo arquitetura trabecular
semelhante aos do grupo SHAM e mais compacta que nos animais
OVX/Óleo (Fig. 4). Apesar da não expressão de OPG (Fig. 3D e G) e
pela acentuada expressão de RANKL (Fig. 3F e I) a reabsorção de
tecido ósseo é contida nestes dois períodos, pois não há
disponibilidade de RANK para a osteoclastogênese (Fig. 3E e H).
Estes resultados demonstram a importância da interação
hipotálamo-hipófise-gônada-osso, sugerindo a correlação da
ritmicidade da secreção esteroidal e a expressão das proteínas
ósseas, pois o balanço (grupo SHAM) na expressão de OPG, RANK e
RANKL foi alterado após a retirada dos ovários (grupos OVXs) e não
foi restabelecido com a administração intermitente de E
2
(grupo
OVX/E
2
), evidenciado a importância do esteróide gonadal no
metabolismo ósseo.
Conclusões
6 Conclusões
6 Conclusão
Os resultados encontrados sugerem participação do E
2
na
modulação da expressão das proteínas relacionadas ao ciclo de
remodelação óssea, por ação direta ou indireta sobre células do
tecido ósseo.
A deficiência de E
2
provoca atraso na regeneração óssea
alveolar por propiciar o estabelecimento de condições que favorecem
a osteoclastogênse e a redução da apoptose de OCs.
A correspondência da citoarquitetura óssea do terço médio do
alvéolo dental de SHAM e OVX/E
2
em todos os períodos analisados
está relacionada à ação do E
2
circulante sobre a produção de
substâncias que interferem no metabolismo ósseo dos animais destes
grupos. A equivalência e o balanço das expressões de OPG e RANKL
no decorrer dos períodos analisados nos animais SHAM, garantiram
manutenção do equilíbrio entre reabsorção e formação. Apesar do
efeito benéfico da administração constante do 17-β estradiol, sobre o
processo de regeneração alveolar, a falta de ritimicidade na liberação
de esteróides, parece ter sido o fator responsável pela ausência de
balanço entre as expressões de RANKL e OPG no grupo OVX/E
2
.
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Anexos
Anexo A – Certificado de aprovação da
Comissão de Ética
Anexo A – Comissão de Ética
Anexo B – Normas Para Publicação
A Multidisciplinary Journal of Oral & Craniofacial Sciences
Guide for Authors
Announcement
Please note that Dr David B Ferguson retired in May 2002 as Editor-in-Chief for
Archives of Oral Biology and is succeeded by Professor Paul M Speight. All future
paper submissions to Professor Speight should be sent to the new Editorial Office
address following.
Submissions
Authors are requested to submit their original manuscript and figures online via
Editorial Manager. Editorial Manager is a web-based submission and review system.
Authors may submit manuscripts and track their progress through the system to
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editor. Editors can manage the whole submission/review/revise/publish process.
Please register at: http://aob.edmgr.com
The Editors will accept paper submissions until 30 June 2004. Authors are
requested to submit their original manuscript and figures with four copies to:
Editors-in-Chief:
Dr G R Holland and Professor P M Speight
c/o Libby Calvert, Administrative Editor, Archives of Oral Biology, Elsevier, The
Boulevard, Langford Lane, Kidlington, Oxford OX5 1GB, UK. Tel: +44 (0)1865
843418; fax: +44 (0)1865 843992; Email:
AOB@elsevier.com.
Anexos 61
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not under consideration for publication elsewhere, and that if accepted it will not be
published elsewhere in the same form, in English or in any other language, without
the written consent of the publisher. Each manuscript must be accompanied by a
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form has been read and approved by all authors. Authors should supply details of
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If the manuscript reports experiments or observations using animals or human
subjects a statement must be included in the letter of submission indicating that
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their submission. Full postal and Email addresses should be included. The editors
may or may not, at their discretion, utilise these suggestions.
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communication. Normally papers are assessed by two referees selected by the
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their consideration. Authors may occasionally consider referees' suggestions to be
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Types of Contributions
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of the journal. English usages that may present difficulties to readers whose first
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their own findings in the past tense and use the present tense where reference is
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Anexos 62
concluded. Original papers should follow the pattern of: Introduction, Materials and
Methods, Results or Findings, Discussion.
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and Format (Sixth Edition). The Council of Biology Editors Manual for Authors,
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General
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numbers.
Title page
As titles frequently stand alone in indexes, bibliographic journals etc., and indexing
of papers is, to an increasing extent, becoming computerized from key words in the
titles, it is important that titles should be as concise and informative as possible.
Thus the animal species to which the observations refer should always be given and
Anexos 63
it is desirable to indicate the type of method on which the observations are based,
e.g. chemical, bacteriological, electron-microscopic or histochemical etc. A "running
title" with not more than 40 letters and spaces must also be supplied. A keyword
index must be supplied for each paper.
Structured abstracts
The paper should be prefaced by an abstract aimed at giving the entire paper in
miniature. Abstracts should be no longer than 250 words and should be structured
as per the guidelines published in the Journal of the American Medical Association
(JAMA 1995;273: 27- 34). In brief, the abstract should be divided into sections
including the following: (1) Objective; (2)Design -if clinical to include setting,
selection of patients, details on the intervention, outcome measures, etc.; if
laboratory research to include details on methods; (3) Results; (4) Conclusions.
Received/Accepted Dates
A received date will be added to all papers when they are received by the Accepting
Editor. An accepted date will also be added when the papers are received at the
publishing office.
Introduction
This should be a succinct statement of the problem investigated within the context
of a brief review of the relevant literature. Literature directly relevant to any
inferences or argument presented in the Discussion should in general be reserved
for that section. The introduction may conclude with the reason for doing the work
but should not state what was done nor the findings.
Materials and Methods
Enough detail must be given here so that another worker can repeat the procedures
exactly. Where the materials and methods were exactly as in a previous paper, it is
not necessary to repeat all the details but sufficient information must be given for
the reader to comprehend what was done without having to consult the earlier
work.
Authors are requested to make plain that the conditions of animal experiments
were humane; for instance, the mode of anaesthesia and of killing should be
specified. In human experimentation, authors should state briefly that the subjects
gave informed consent, and preferably that the work was approved by an
appropriate ethics committee or review board.
Anexos 64
Results or Findings
These should be given clearly and concisely. Care should be taken to avoid drawing
inferences that belong to the Discussion. Data may be presented in various forms
such as histograms or tables but, in view of pressure on space, presentation of the
same data in more than one form is unacceptable.
It is usually necessary to analyze numerical results statistically. A statement of the
number, their mean value and some appropriate measure of their variability is
usually sufficient. The method of analysis followed should be indicated. A statement
that the difference between the mean values of two groups of data is statistically
significant should give the probability level set as significant by the investigator and
indicate the statistical test used. It is not sufficient to quote the use of a statistical
package without naming the tests used.
Discussion
This section presents the inferences drawn from the Results: these should be
recapitulated only sparingly, sufficient to make the argument clear.
Acknowledgments As appropriate.
References:
All manuscripts should use the 'Vancouver' style for references, which
should be numbered consecutively in the order in which they are first cited
in the text and listed at the end of the paper.
For journal references, all authors should be included when there are six or fewer
(first six followed by 'et al.' when seven or more), followed by the title of article,
name of journal abbreviated according to British Standard 4148: 1975 (or left in
full), year, volume, and first and last pages.
For example:
1. Dezan CC, Nicolau J, Souza DN, Walter LRF. Flow rate, amylase activity, and
protein and sialic acid concentrations of saliva from children aged 18, 30 and 42
months attending a baby clinic. Arch Oral Biol 2002; 47: 423-427.
For book references,the author(s)should be followed by the chapter title (if
appropriate), editor(s) (if applicable), book title, place of publication, publisher,
Anexos 65
year and page numbers. For example:
2. Gorlin RJ, Pindborg JJ, Cohen MM Jr. Syndromes of the Head and Neck, 2nd
Edition. New York: McGraw-Hill, 1976.
Papers in the course of publication should only be entered in the references if the
paper has been accepted by a journal, and then given in the standard manner in
the text and list of references but with the words "In press" following the name of
the journal.
Units and Symbols
In general, Archives of Oral Biology will use the recommended SI (Systeme
Internationale) units and symbols. The use of the litre, usually better written in full,
in place of SI dm
3
and ml
3
in place of SI cm, will continue to be accepted. For
details of the SI symbols, authors are referred to: Symbols, Signs and
Abbreviations (1969) by the Royal Society of Metric and Decimal Systems in Council
of Biology Editors Style Manual (1978) 4th edn, published by Council of Biology
Editors Inc. Units of enzyme activity must be clearly defined, preferably using SI
units. Centrifugal force should be stated in multiples of g, rather than as rev/min.
Units and abbreviations
As Archives of Oral Biology is a journal with a multidisciplinary readership,
abbreviations, except those universally understood such as mm, g, min. u.v., w/v
and those listed below should be avoided if possible. Examples of abbreviations
which maybe used without definition:
ADP,
AMP,
ATP
DEAE-cellulose
DNA,
RNA
EDTA
EMG
tris
Other abbreviations used to improve legibility should be listed as a footnote on the
title page.
Anexos 66
Chemical symbols may be used for elements, groups and simple compounds, but
excessive use should be avoided. Abbreviations other than the above should not be
used in titles.
Bacterial nomenclature. Organisms should be referred to by their scientific
names according to the binomial system. When first mentioned the name should be
spelt in full and underlined to denote italics. Afterwards the genus should be
abbreviated to its initial letter, e.g. 'S. aureus' not 'Staph. aureus'. If abbreviation is
likely to cause confusion or render the intended meaning unclear the names of
microbes should be spelt in full. Only those names which were included in the
Approved List of Bacterial Names, Int J Syst Bacteriol 1980; 30: 225?420 and those
which have been validly published in the Int J Syst Bacteriol since 1 January 1980
have standing in nomenclature. If there is good reason to use a name that does not
have standing in nomenclature, the names should be enclosed in quotation marks
and an appropriate statement concerning the nomenclatural status of the name
should be made in the text (for an example see Int J Syst Bacteriol 1980; 30:
547?556). When the genus alone is used as a noun or adjective, use lower case
roman not underlined, e.g.'organisms were staphylococci' and 'streptococcal
infection'. If the genus is specifically referred to underline e.g. 'organisms of the
genus Staphylococcus'. For genus in plural, use lower case roman e.g.
'salmonellae'; plurals may be anglicized e.g.'salmonellas'. For trivial names, use
lower case roman e.g. 'meningococcus'.
Numbers, measurements and statistics. Numbers one to nine are spelled
unless they aremeasurements (e.g.5mL). Numbers greater than nine are spelled
out if they begin in a sentence, or when clarity requires it. Numbers above and
including 10 000 have a space, not a comma. A decimal point is preceded by a
number or cypher e.g. '0.5'.Decimal points in columns should be aligned vertically.
Dates are usually provided in full: 14 April 1949. Measurements may be expressed
in SI or non-metric units. Use 10 ml/h rather than -1 or per.
Abbreviations. Use capitals for: MIC, MBC, WBC, RBC, DNA, RNA, Group A, B etc.
for antigenic or other groups, PHLS, CDSC, CDC, WHO, CSF, MSU, EMU, CSU. Use
cfu, pfu, mm, m, min, h, in, ft, g, kg, mL, L, im, iv, iu, P(probability). Use sp. and
spp. (species, singular and plural). Use Gram's stain and Gram-negative bacillus.
Use in-vitro (adjective) but in vitro (adverb), post-mortem (adjective) but post
mortem (adverb). Spelling. Use British spellings: Haemophilus, haematology,
Anexos 67
paediatrics, leucocyte, leukaemia, bacteraemia, sulphonamides, aetiology; but note
neutropenia, fetal. Please note the journal uses UK 'z' spelling (e.g., colonizes).
Drugs. These should be referred to by their approved and not proprietary names;
for guidance, see the British National Formulary.
Proprietary Names
So far as possible, proper names should be used instead of proprietary names.
Where it is desirable to indicate a particular brand of preparations, the proprietary
name and source should be given in parentheses after the proper name, e.g.
Testicular hyaluronidase (Testovase, Bovine Enterprises Ltd, 327 Farm Road,
London E23).
Illustrations
In the initial online submission and review stage, authors are required to provide
electronic versions of their illustrations. When an article has been accepted, authors
must be prepared to provide all illustrations in electronic and camera-ready format,
(suitable for reproduction, which may include reduction, without retouching).
The Artwork Quality Control Tool is now available to users of the online submission
system. To help authors submit high-quality artwork early in the process, this tool
checks the submitted artwork and other file types against the artwork requirements
outlined in the Artwork Instructions to Authors on
http://authors.elsevier.com/artwork. The Artwork Quality Control Tool
automatically checks all artwork files when they are first uploaded. Each figure/file
is checked only once, so further along in the process only new uploaded files will be
checked.
General: Information relating to the preferred formats for Artwork and Illustrations
may be found at http://authors.elsevier.com. Photographs, charts and diagrams
are all to be referred to as "Figure(s)" and should be numbered consecutively in the
order to which they are referred. They should accompany the manuscript, but
should not be included within the text. All hard copy illustrations should be clearly
marked on the back with the figure number and the author's name. All figures are
to have a caption. Captions should be supplied on a separate sheet.
Line drawings: All lettering, graph lines and points on graphs should be
sufficiently large and bold to permit reproduction when the diagram has been
Anexos 68
reduced to a size suitable for inclusion in the journal. Dye-line prints or photocopies
are not suitable for reproduction. Do not use any type of shading on computer-
generated illustrations.
Photographs: Original photographs must be supplied as they are to be reproduced
(e.g. black and white or colour). If necessary, a scale should be marked on the
photograph. Please note that photocopies of photographs are not acceptable.
Colour:Certain illustrations will be approved for publication in colour but only if, in
the opinion of the Editors, the figures convey information not apparent in
monochrome.
Please note that if figures are supplied in colour, they will automatically be available
online in colour at no extra charge, even if the print version is monochrome.
Tables:Tables should be numbered consecutively and given a suitable caption and
each table typed on a separate sheet. Footnotes to tables should be typed below
the table and should be referred to by superscript lowercase letters. No vertical
rules should be used. Tables should not duplicate results presented elsewhere in
the manuscript, (e.g. in graphs).
Acceptance
After acceptance, authors may be requested to provide Elsevier with hard-copy and
electronic versions of their manuscript and their figures. The electronic copy, on
floppy disk, CD-ROM or ZIP, should match the hardcopy exactly, therefore always
keep a backup copy of the electronic file for reference and safety. Full details of
electronic submission and formats can be obtained from
http://authors.elsevier.com
Always keep a backup copy of the electronic file for reference and safety. Full
details of electronic submission and formats can be obtained from
http://authors.elsevier.com
Hardcopy submissions
Authors should submit an electronic copy of their paper with the final
version of the manuscript. The electronic copy should match the hardcopy
exactly. Always keep a backup copy of the electronic file for reference and safety.
Full details of electronic submission and formats can be obtained from Author
Services at Elsevier.
Anexos 69
Proofs
Proofs will be sent to the author (first-named author if no corresponding author is
identified on multiauthored papers) by PDF wherever possible and should be
returned within 48 hours of receipt, preferably by e-mail. Corrections should be
restricted to typesetting errors; any other amendments made may be charged to
the author. Any queries should be answered in full. Elsevier will do everything
possible to get your article corrected and published as quickly and accurately as
possible. Therefore, it is important to ensure that all of your corrections are
returned to us in one all-inclusive e-mail or fax. Subsequent additional corrections
will not be possible, so please ensure that your first communication is complete.
Should you choose to mail your corrections, please return them to: Log-in
Department, Elsevier, Stover Court, Bampfylde Street, Exeter, Devon EX1 2AH, UK.
Offprints
Twenty-five offprints will be supplied free of charge. Offprints and copies of the
issue can be ordered at a specially reduced rate using the order form sent to the
corresponding author after the manuscript has been accepted. Orders placed late
(after publication) for reprints will incur a 50% surcharge.
Copyright
All authors must sign the "Transfer of Copyright" agreement before the article can
be published. This transfer agreement enables Elsevier Ltd to protect the
copyrighted material for the authors, but does not relinquish the author's
proprietary rights. The copyright transfer covers the exclusive rights to reproduce
and distribute the article, including reprints, photographic reproductions, microfilm
or any other reproductions of similar nature and translations. Includes the right to
adapt the article for use in conjunction with computer systems and programs,
including reproduction or publication in machine-readable form and incorporation in
retrieval systems. Authors are responsible for obtaining from the copyright holder
permission to reproduce any figures for which copyright exists.
Author enquiries
For enquiries relating to the submission of articles (including electronic submission
where available) please visit the Author Gateway from Elsevier at
http://authors.elsevier.com. The Author Gateway also provides the facility to track
accepted articles and set up e-mail alerts to inform you of when an article's status
has changed, as well as detailed artwork guidelines, copyright information,
Anexos 70
frequently asked questions and more.
Contact details for questions arising after acceptance of an article, especially those
relating to proofs, are provided after registration of an article for publication.
Livros Grátis
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