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Thallita Pereira Queiroz
Araçatuba, SP
2006
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia do campus de Araçatuba – UNESP,
para obtenção do Título de “Mestre em
Odontologia” – Área de concentração em Cirurgia
e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial.
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Hochuli Vieira
Co-orientadora: Profa. Dra. Roberta Okamoto
Avaliação do copolímero de ácido polilático
e poliglicólico ao redor de implantes
osseointegráveis sem estabilidade primária.
Análise biomecânica, histométrica e
imunoistoquímica em coelhos
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A Deus
Desde o primeiro instante que comecei o Senhor se fez presente em todos os
momentos, firmes ou trêmulos. E, passo a passo, posso sentir a tua mão
transmitindo-me por meio de sua luz a segurança necessária para enfrentar meu
caminho e seguir. Grandes foram as lutas, maiores as vitórias. Sempre estiveste
comigo! Muitas vezes pensei que este momento não chegaria, tive vontade de
recuar. No entanto, Tu sempre estiveste presente, fazendo da derrota uma vitória e
da fraqueza uma força. Com Tua ajuda e por Tua misericórdia me encorajei nos
momentos de dificuldade. Sei que não cheguei ao fim, mas ao início de uma longa
caminhada. Senhor, agradeço por ter me dado condições, apoio e força para que
percorresse essa jornada. A Sua grandiosidade me fez substituir as incertezas pela
segurança e o medo pela vitória.
Aos meus pais, Tadeu e Sirlane,
meus amigos verdadeiros, pelo amor, carinho, paciência, dedicação e por todas as
vezes em que abdicaram de seus sonhos para a realização dos meus. Admiro muito
vocês e agradeço a Deus diariamente por ter me dado pais tão maravilhosos, que
souberam me educar com amor, fé, compreensão, apoio e com grandes atitudes.
Vocês são exemplos de vida para mim e espero que eu possa retribuir pelo menos
parte de todo o amor que dedicaram e que continuam dedicando a mim e ao meu
irmão. Tenho muito orgulho de ser filha de vocês! Amo muito vocês!
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Ao meu irmão, Thales,
pelo carinho, amizade, compreensão e apoio durante toda a vida. Apesar de ser
mais novo e de estarmos distantes, aprendo muito com você, principalmente com
sua alegria constante, perseverança, dedicação a tudo que faz, esforço e
competência. Você me surpreende a cada dia! Amo muito você!
Ao Rogério,
pela paciência, carinho, companheirismo e incansável ajuda na realização deste
trabalho. Por sua compreensão diante da minha ausência em diversos momentos
importantes e por seu incentivo, que me impulsionou e me motivou a lutar por meus
objetivos. Você é muito especial!
4
Ao meu orientador, Professor Dr. Eduardo Hochuli Vieira, grande exemplo
de competência e dedicação. Obrigada pela oportunidade oferecida desde a
graduação, pelos preciosos ensinamentos, pela paciência, carinho, pelo incentivo
constante, por ter acreditado em mim e ter me proporcionado a realização de um
grande sonho. Você foi o responsável pelo interesse e amor que sinto pela cirurgia.
Obrigada por tudo!
À minha co-orientadora, Professora Dra. Roberta Okamoto, pela amizade,
carinho, compreensão e ajuda incansável. Exemplo de determinação, competência,
dedicação e amor à pesquisa. Muito obrigada pelo conhecimento transmitido e por
me aceitar como aprendiz. Prossiga sempre abrindo as portas para aqueles que a
procuram. Você foi além de grande mestre, minha amiga e conselheira em todos os
momentos. Obrigada pela paciência e incentivo constantes! Você é muito especial!
Obrigada por tudo!
Ao Professor Dr. Idelmo Rangel Garcia Júnior, não só pelo profissional
dedicado, seguro e competente que é, mas, principalmente pelo ser humano que me
compreendeu, ensinou e incentivou em todos os momentos. Que Deus continue
abençoando-o e iluminando-o para que outras pessoas possam passar pela
experiência pela qual passei, de tê-lo como mestre e amigo. Você é e será sempre
um grande exemplo de competência, amor e dedicação à profissão. Obrigada pela
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paciência que sempre demonstrou diante de minhas indagações, questionamentos e
“teimosia”. Admiro muito você!
Ao Professor Osvaldo Magro Filho, pela competência e pelos preciosos
conhecimentos transmitidos. Obrigada pela amizade, confiança, carinho, incentivo e
por considerar os alunos da pós-graduação seus verdadeiros amigos, sempre se
preocupando conosco e dividindo inúmeros momentos de alegria. Obrigada!
Ao Professor Dr. Michel Saad Neto pelos valiosos ensinamentos, pelo carinho
e pelo exemplo de dedicação e competência. O senhor é um exemplo concreto e
marcante do que é “ser professor”.
À Professora Dra. Cristiane Mara Ruiz de Sousa Fattah e à Professora
Dra. Alessandra Marcondes Aranega, pelo carinho, dedicação,
companheirismo, paciência, confiabilidade e disponibilidade em ajudar sempre.
Obrigada pelos ensinamentos, incentivo e por torcerem sempre pelo sucesso dos
alunos da pós-graduação.
Ao Professor Dr. Tetuo Okamoto, pelo exemplo de caráter, humildade e
dedicação. O curso de pós-graduação e respectivos alunos devem muito ao senhor.
Obrigada pelo carinho, incentivo e disponibilidade em ajudar sempre.
Ao Professor Dr. Wilson Roberto Poi, pelo carinho com que recebe os alunos
da pós-graduação e pelo exemplo de competência, caráter e extrema dedicação.
6
Obrigada pelas inúmeras palavras de carinho e incentivo, pela preocupação
constante, pela amizade, pelo afeto e por sempre atenuar os problemas com
simplicidade e tornar os obstáculos transponíveis. Você possui uma capacidade
incrível de identificar os conflitos, preocupações e aflições de seus alunos e ajudá-
los de maneira carinhosa e intensa. Obrigada por ser PROFESSOR!
À secretária da cirurgia e grande amiga Cleide Lemes da Silva, pelo carinho,
doação, amizade, respeito, ajuda e preocupação constante. Agradeço a Deus pela
oportunidade de conhecer uma pessoa tão especial como você. Obrigada pelos
momentos compartilhados, pela ajuda incansável, pela torcida, pensamentos
positivos e estímulo constante. Você é exemplo de que o amor e a dedicação à
profissão tornam a vida mais alegre, atenuam os problemas e conduzem ao
sucesso. Obrigada por me considerar como uma filha e saiba que você será
eternamente minha “mãe” de Araçatuba. Você é muito especial!
À minha grande amiga e companheira de todos os momentos da pós-graduação
Érica Alves Gomes, pelo carinho, por ouvir com paciência meus incansáveis
desabafos, pela compreensão, pelo incentivo constante, pela torcida por minha
vitória, pela preocupação comigo e por compartilhar inúmeros momentos de alegria
e tristeza, sempre ao meu lado e disposta a me ajudar no que fosse necessário.
Admiro muito sua dedicação e competência!
Ao meu colega de mestrado e grande amigo Francisley Ávila Souza pela
paciência, dedicação, competência, prestatividade e caráter. Apesar dos inúmeros
momentos de dificuldades por nós enfrentados, você sempre se manteve otimista e
7
paciente, não me deixando perder o entusiasmo e a motivação. Obrigada pelos
preciosos conhecimentos transmitidos e pela incansável ajuda em todas as etapas
da pós-graduação.
À minha colega de pós-graduação e grande amiga Jéssica Lemos Gulinelli, pela
cumplicidade tanto na vida profissional quanto na vida pessoal. Sempre disposta a
ajudar! Sua alegria e energia contagiam a todos, sua dedicação e vontade de
trabalhar me incentivaram e sua tranqüilidade me ajudou em muitos momentos de
“estresse”. Obrigada por tudo!
À minha colega de mestrado e amiga Camila Benez Ricieri, pelo carinho,
compreensão, incentivo e estímulo constante. Obrigada pelos momentos agradáveis
compartilhados!
Aos amigos da graduação: Ellen Cristina Gaetti Jardim e Leonardo Perez
Faverani pelo auxílio nas pesquisas, nas clínicas de graduação e pós-graduação,
pela amizade, pelo carinho e incentivo. Parabéns pela dedicação, vontade de
vencer, garra e determinação. Torço muito por vocês!
À minha família, em especial às minhas avós Ana e Luzia e à minha madrinha
Jussara pelas incansáveis orações, pelo amor, carinho, pela preocupação e torcida.
À família do Rogério, pelo carinho, compreensão e incentivo.
8
À Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, sob direção do
Professor Dr. Paulo Botacin e vice-direção do Professor Dr. Célio Percinoto pela
oportunidade de realização do curso de Mestrado.
Aos amigos do curso de Doutorado em Cirurgia: André Dotto Sottovia,
Carolina Chianteli Cláudio Coutinho, Eleonor Álvaro Garbin, Leandro de Carvalho
Cardoso, Paulo Almeida Júnior, Paulo Domingos Ribeiro Júnior, Liliane Sheidegger
da Silva Zanetti, Natasha Magro Érnica, Thais da Silveira Rodrigues e Walter Betoni
Júnior pelos ensinamentos e inesquecíveis momentos de convivência.
Aos amigos do curso de Mestrado em Cirurgia: Albanir Gabriel Borrasca,
Camila Benez Ricieri, Francisley Ávila Souza, Flávia Priscila Pereira, Jéssica Lemos
Gulinelli e Marcos Heidy Guskuma. Aprendi muito com cada um de vocês. Obrigada
pelos momentos compartilhados, pela ajuda, carinho e amizade.
Aos amigos da pós-graduação em Odontologia: Cláudia Letícia, Daniel,
Edmar, Ellen, Eloá, Érica, Fernanda, Francisco (Quico), João, Lilian, Luciana,
Marceli, Márcia, Patrícia, Ronan, Sheila, Thaís Mara e Túlio, pela agradável
convivência e momentos compartilhados.
Aos amigos e estagiários da Disciplina de Cirurgia, Heloísa, Pedro e Renan, pelo
carinho, respeito e agradável convivência.
9
À mestranda em Clínica Integrada Eloá Rodrigues Luvizutto, pela ajuda na
parte experimental da dissertação, pela amizade, paciência e carinho.
À aluna do curso de Graduação Thalyta Ribeiro Neves da Cruz (Thalytinha)
pela valiosa ajuda na realização do processamento imunoistoquímico e pelo carinho
de sempre.
Ao doutorando da área de Prótese, Lucas Fernando Tabata, pela amizade,
incentivo, torcida e principalmente pela alegria contagiante.
Aos alunos do Curso de Graduação da Faculdade de Odontologia de
Araçatuba – UNESP, pelo respeito, credibilidade e confiança depositados aos
alunos da pós-graduação, permitindo-nos realizar nosso grande sonho de atividade
acadêmica. Aprendemos muito com vocês!
Ao aluno de Doutorado em Periodontia da UNESP – Araraquara, Rafael Silveira
Faeda, pela amizade, paciência, disponibilidade e grande ajuda na utilização do
Exakt para o corte das peças deste experimento.
Ao Fabrício Xavier de Oliveira e à Lelaine de Oliveira Nicolette, por
toda a colaboração e prestatividade no cuidado aos animais utilizados neste
experimento, bem como pela valiosa e eficiente ajuda durante a parte experimental
deste trabalho.
10
Aos Docentes da Disciplina de Cirurgia da Faculdade de Odontologia
de Araraquara – UNESP: Professores Doutores Eduardo Hochuli Vieira, Mário
Francisco Real Gabrielli, Roberto Henrique Barbeiro e Valfrido Antônio Pereira Filho
e Professora Doutora Marisa Aparecida Cabrini Gabrielli, pelo exemplo de
competência e dedicação. Obrigada por minha formação, pela credibilidade e pelo
carinho.
Aos Docentes da Disciplina de Clínica Integrada: Professores (as) Doutores
(as) Celso, Daniela, Denise, José Carlos, Poi e Sônia Regina pelo carinho e atenção
constantes.
Aos Docentes da Disciplina de Histologia: Professores (a) Doutores (a)
Edílson Ervolino, Roelf Justino Cruz Rizzolo e Alaíde, pela disponibilidade e auxílio
na utilização do microscópio de captura de imagens.
Ao Professor Dr. Mário Jefferson Quirino Louzada, pela gentileza de ceder
o Biotério do Curso de Medicina Veterinária da UNESP para que pudéssemos
manter os animais utilizados em nosso experimento, pela torcida e incentivo
constantes e principalmente pelo carinho e atenção com que sempre nos recebeu.
Ao Professor Dr. Élcio Marcantonio pelo exemplo de competência, humildade
e dedicação à cirurgia. Obrigada pela ajuda, carinho, incentivo e preciosa
contribuição ao crescimento da Disciplina de Cirurgia.
11
Ao Professor Dr. Élcio Marcantonio Júnior pela confiança, credibilidade,
pelo incentivo e pela gentileza em permitir a utilização do Laboratório do Exakt da
Disciplina de Periodontia da Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP.
Ao Professor Dr. José Sílvio Govone, do Departamento de Estatística,
Matemática Aplicada e Computacional, IGCE e Centro de Estudos Ambientais da
UNESP – Rio Claro, pela valiosa ajuda na compreensão estatística de parte deste
trabalho.
Ao Professor Dr. Romeu Magnani, pela realização dos testes estatísticos
deste trabalho e auxílio precioso em sua compreensão.
Ao Professor Dr. Anselmo Colombo de Alencar pela ajuda no
desenvolvimento do biomaterial e na realização da microscopia eletrônica de
varredura, além do incentivo constante ao nosso desenvolvimento.
Aos funcionários do Laboratório de Cirurgia e amigos: Bernadete Maria
Nunes Kimura, Maria Dirce Colli Boatto e Gilmar Martins de Oliveira pela ajuda em
diversas etapas da dissertação, pelo carinho, paciência, compreensão e agradáveis
momentos compartilhados.
Aos funcionários da Biblioteca: Cláudio, Fernando, Ivone, Izamar, Júnior,
Luzia, Maria Cláudia pela disponibilidade e carinho.
12
À funcionária da Biblioteca Ana Cláudia Martins Grieger Manzatti, pela
valiosa ajuda na correção da Dissertação e pela atenção e carinho sempre
dispensados.
Aos funcionários da Pós-graduação: Diogo, Marina e Valéria, pela paciência,
disponibilidade, alegria e admirável interesse em nos ajudar sempre.
À Conexão – Sistema de Próteses, em nome do Dr. Rodolfo Cândida Alba Júnior
pela gentileza e disponibilidade em ceder os implantes e chaves utilizadas no
experimento deste trabalho, bem como pela confiança em nós depositada.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),
pela concessão da Bolsa de Mestrado e pelo apoio financeiro, indispensáveis para a
realização deste trabalho.
13
"É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida passar;
é melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo nada até o
final.
Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias tristes em casa me
esconder.
Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver..."
Martin Luther King
14
À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo) pelo auxílio financeiro que
viabilizou a realização deste trabalho de
pesquisa.
Processo 05/53706-1
15
16
Queiroz TP. Avaliação do copolímero de ácido polilático e poliglicólico (PLA/PGA)
ao redor de implantes osseointegráveis sem estabilidade primária. Análise
biomecânica, histométrica e imunoistoquímica em coelhos (dissertação). Araçatuba:
Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Paulista; 2006.
A proposta deste estudo foi avaliar a associação do PLA/PGA ao redor de implantes
osseointegráveis instalados sem estabilidade primária, por meio da análise
biomecânica, histométrica e da expressão das proteínas OPG, RANKL, OC e COL-I.
Vinte e cinco coelhos receberam 2 implantes de 2,6/ 6,0mm na tíbia direita em leitos
receptores preparados com 3,0mm. Um defeito foi preenchido com coágulo
sanguíneo e o outro com o PLA/PGA previamente à instalação dos implantes. A
eutanásia dos animais foi realizada nos períodos de 5, 15, 40 e 60 dias pós-
operatórios e o teste biomecânico foi realizado nos períodos de 40 e 60 dias. As
peças foram submetidas ao processamento imunoistoquímico e coradas por HE. As
peças de 5 animais do período de 60 dias foram desgastadas e coradas com
vermelho de alizarina e azul de Stevenel. Não houve diferenças nos valores de
torque-reverso na comparação entre os grupos e os períodos avaliados. A análise
das imunomarcações não evidenciou diferença estatística entre os grupos para cada
período. Houve evidência estatística de maior expressão de RANKL no período de
15 dias no grupo tratado em relação à expressão de colágeno I. A proteína RANKL
apresentou mais percentuais de marcações celulares acima de 50% quando
comparada às outras proteínas. Não houve diferença estatística entre os grupos
quanto à extensão linear de contato entre tecido ósseo e implante. Conclui-se que o
17
copolímero apresentou biocompatibilidade e permitiu neoformação óssea em contato
com o implante. Além disso, ocorreu o processo de osseointegração em ambos os
grupos, mesmo na ausência de estabilidade primária dos implantes.
Palavras-chave: Implante dentário. Substitutos ósseos. Imunohistoquímica.
Biomecânica.
18
19
Queiroz TP. Evaluation of the polylactic and polyglycolic acid copolymer (PLA/PGA)
around of osseointegrated implants without primary stability. Biomechanics,
histometric and immunoistochemistry analysis in rabbits [dissertation]. Araçatuba:
São Paulo State University; 2006.
The purpose of this study was to evaluate the association of the PLA/PGA around of
osseointegrated implants installed without primary stability, through the
biomechanics, histometric analysis and of the OPG, RANKL, OC and COL-I proteins
expression. Twenty-five rabbits received 2 implants of 2.6 / 6.0mm in the right tibia in
receptor beds prepared with 3,0mm. A defect was fulfiled with blood clot and the
other with the PLA/PGA, previously to the implants installation. The euthanasia of 25
animals was performed at 5, 15, 40 and 60 days and the biomechanical test was
performed at 40 and 60 days. The samples followed immunoistochemistry processing
and were stained with HE. The pieces of 5 animals of 60 days were trimmed and
stained with alizarin red and Stevenel′s blue. There were not differences in the
torque-reverse between the groups and periods. The analysis of the immunolabelings
did not evidence statistic difference between the groups for each period. There was
statistics evidence of increase in the RANKL expression in the 15 days period, in the
treated group, when compared to the COL-I. The RANKL protein presented more
percentiles of immunolabelings above 50% when compared to the other proteins.
There was no statistics difference between the groups regarding contact linear
extension between bone tissue and implant. It can be concluded that the copolymer
20
presented biocompatibility and it allowed bone neoformation in contact with the
implant. Besides, the osseointegration process happened in both groups, even in the
absence of primary stability of the implants.
Keywords: Dental implants. Bone substitutes. Immunohistochemistry. Biomechanics.
21
Figura 1- Grupo controle. Instalação do implante de 2,6mm/3,0mm, sem
estabilidade primária no leito receptor, preenchido com o coágulo
sanguíneo.
78
Figura 2- Grupo tratado. Instalação do implante de 2,6mm/3,0mm, sem
estabilidade primária no leito receptor, preenchido com o PLA/PGA.
78
Figura 3- Tíbia direita. Período de 60 dias. Tecido ósseo neoformado
recobrindo o módulo de rebordo dos implantes durante a reabertura.
78
Figura 4- Período de 40 dias após a reabertura da tíbia direita. Verifica-se
menor inclinação do implante do grupo tratado (seta) quando
comparado ao controle.
78
Figura 5- Representação gráfica de médias de torque reverso (colunas), em
N.cm, e de intervalos de 95% de confiança para as médias
populacionais (barras verticais).
79
Figura 6- Representação gráfica de % de ocorrências de médias percentuais
de marcações celulares para as proteínas analisadas,
independentemente do período de avaliação, para ambos os grupos.
79
Figura 7- OPG – Grupo controle. Período de 5 dias. Imunomarcações
positivas para osteócitos presentes na cortical superior (setas)
(DAB, original de 160X).
80
Figura 8: OPG – Grupo controle. Período de 40 dias. Imunomarcação desta
proteína na cortical superior (setas). Nota-se discreta redução na
expressão proteica (DAB, original de 63X).
80
22
Figura 9- RANKL – Grupo controle. Período de 40 dias.
Imunomarcações positivas para osteócitos (setas) na cortical
superior, em maior quantidade quando comparada à OPG.
(DAB, original de 160X).
80
Figura 10- RANKL – Grupo tratado. Período de 5 dias. Imunomarcações
positivas para linfócitos (setas) na área medular (DAB,
original de 160X).
80
Figura 11- RANKL - Grupo controle. Período de 40 dias. Redução na
imunomarcação desta proteína na área medular (setas)
(DAB, original de 63X).
81
Figura 12- OC – Grupo controle. Período de 60 dias. Imunomarcação
desta proteína em osteócitos da cortical superior (setas).
Nota-se a marcação de fundo (*) (DAB, original de 200X).
81
Figura 13 – COL-I – Grupo controle. Período de 15 dias. Imunomarcação
significativa desta proteína na área medular (DAB, original
160X).
81
Figura 14 - COL-I – Grupo controle. Período 60 dias. Redução na
imunomarcação (setas) desta proteína na área medular
(DAB, original de 200X).
81
Figura 15- Corte evidenciando a ausência de marcações inespecíficas
na cortical superior (controle negativo) (DAB, original de
200X).
81
Figura 16 - RANKL – Grupo controle. Período de 5 dias.
Imunomarcações positivas para osteócitos na cortical inferior
(controle positivo) (DAB, original de 200X).
81
Figura 17- Grupo controle. Período de 5 dias. Presença de osteócitos 82
23
(setas) bem marcados na cortical superior (HE, original de
200X).
Figura 18- Grupo tratado. Período de 15 dias. Presença de osteócitos
(setas) bem marcados na cortical inferior (HE, original de
200X).
82
Figura 19- Grupo tratado. Período de 60 dias. Neoformação óssea
acompanhando o formato das espiras (setas) do implante.
Nota-se a presença de inúmeros osteócitos nas corticais (HE,
original de 100X).
82
Figura 20 – MEV. Grupo tratado. Período de 60 dias. Implantes
recobertos por tecido ósseo neoformado (original de 1000X).
83
Figura 21 - Grupo controle. Período de 60 dias. Implantes recobertos por
tecido ósseo neoformado. (original de 1000X).
Figura 22 - Grupo controle. Período de 60 dias. Tecido ósseo
neoformado celularizado (setas) em contato com a superfície
do implante na área do módulo de rebordo (vermelho de
alizarina e azul de Stevenel, original de 400X).
84
Figura 23 - Grupo tratado. Período de 60 dias. Neoformação óssea no
pico e vale da rosca do implante (setas). Destaca-se a
presença de tecido conjuntivo, corado pelo azul de Stevenel,
em contato com a superfície do implante (vermelho de
alizarina e azul de Stevenel, original de 400X).
84
Figura 24 - Grupo tratado. Período de 60 dias. Neoformação óssea em
contato com a superfície do implante no módulo de rebordo e
presença de osteócitos (setas). Nota-se presença de tecido
85
24
conjuntivo nessa interface (vermelho de alizarina e azul de
Stevenel, original de 400X).
Figura 25 - Grupo tratado. Período de 60 dias. Presença de tecido
conjuntivo com inúmeros osteoblastos (setas) na área
medular, envolto pelo remanescente do PLA/PGA (*)
(vermelho de alizarina e azul de Stevenel, original de 400X).
85
Figura 26 – Medidas de torque-reverso para os grupos controle e tratado,
nos períodos de 40 e 60 dias. Não houve correlação entre os
grupos analisados.
104
Figura 27 - Representação gráfica da % de ocorrência de médias
percentuais de imunomarcações celulares de acordo com os
períodos de avaliação (5, 15, 40 e 60 dias) e com os grupos
experimentais: Controle (Cr) e Tratado (Tr), relativas à
proteína OPG.
104
Figura 28 - Representação gráfica da % de ocorrência de médias
percentuais de imunomarcações celulares de acordo com os
períodos de avaliação (5, 15, 40 e 60 dias) e com os grupos
experimentais: Controle (Cr) e Tratado (Tr), relativas à
proteína RANKL.
105
Figura 29 - Representação gráfica da % de ocorrência de médias
percentuais de imunomarcações celulares de acordo com os
períodos de avaliação (5, 15, 40 e 60 dias) e com os grupos
experimentais: Controle (Cr) e Tratado (Tr), relativas à
proteína OC.
105
Figura 30 - Representação gráfica da % de ocorrência de médias
percentuais de imunomarcações celulares de acordo com os
106
25
períodos de avaliação (5, 15, 40 e 60 dias) e com os grupos
experimentais: Controle (Cr) e Tratado (Tr), relativas à
proteína COL-I.
Figura 31 - Incisão nos planos dérmico e muscular de aproximadamente
3 cm de comprimento, na porção medial da tíbia direita.
111
Figura 32 - Incisão periostal na porção medial da tíbia direita. 111
Figura 33 – Leito receptor dos implantes, após descolamento em
espessura total.
111
Figura 34 – Fresas utilizadas na confecção dos defeitos ósseos
(Conexão, SP, Brasil).
111
Figura 35 – Início do preparo do leito receptor do implante com a fresa
lança. Primeiro defeito.
111
Figura 36 –. Preparo seqüencial do leito receptor com a fresa helicoidal de
2,0mm. Primeiro defeito
111
Figura 37 – Preparo seqüencial do leito receptor com a fresa piloto de
2,0mm/3,0mm. Primeiro defeito.
112
Figura 38 - Finalização do preparo do leito receptor com a fresa helicoidal
de 3,0mm. Primeiro defeito.
112
Figura 39 - Início do preparo do leito receptor do implante com a fresa
lança. Segundo defeito.
112
Figura 40 - Preparo seqüencial do leito receptor com a fresa helicoidal de
2,0mm. Segundo defeito.
112
Figura 41 - Preparo seqüencial do leito receptor com a fresa piloto de
2,0mm/3,0mm. Segundo defeito.
112
Figura 42 - Finalização do preparo do leito receptor com a fresa helicoidal
de 3,0mm. Segundo defeito.
112
26
Figura 43 – Leito receptor dos implantes após a confecção dos dois
defeitos ósseos.
113
Figura 44 – Instalação do implante sem estabilidade primária. Defeito
preenchido com o coágulo sanguíneo.
113
Figura 45 – Leito receptor após a instalação do implante do grupo
controle.
113
Figura 46 – Preenchimento do segundo defeito com PLA/PGA,
previamente à instalação do implante.
113
Figura 47 - Instalação do implante envolto com PLA/PGA, sem
estabilidade primária.
113
Figura 48 – Leito receptor após a instalação dos implantes. 113
Figura 49 - Período de 15 dias. Leito receptor dos implantes, após
reabertura. O módulo de rebordo dos implantes encontra-se
parcialmente coberto por tecido ósseo.
114
Figura 50 - Período de 60 dias. Leito receptor dos implantes, após
reabertura. O módulo de rebordo encontra-se parcial ou
totalmente coberto por tecido ósseo neformado.
114
Figura 51 - Ostectomia realizada para exposição do módulo de rebordo
do implante, durante a análise biomecânica.
114
Figura 52 - Adaptação da chave intermediária ao módulo de rebordo do
implante, para a realização do teste biomecânico.
114
Figura 53 - Torquímetro analógico utilizado para os testes biomecânicos. 114
Figura 54 - Cortes longitudinais obtidos em criostato e montados em
lâminas gelatinizadas para o processamento
imunoistoquímico.
115
Figura 55 - Incubação do anticorpo primário, pipetando-o sobre os cortes. 115
27
Figura 56 - Colocação do Paraffilm sobre os cortes para garantir um
adequado contato do anticorpo com os tecidos, durante a
incubação.
115
Figura 57 - Revelação da reação imunoistoquímica utilizando-se a DAB
como cromógeno. Detalhe do controle macroscópico
realizado.
115
Figura 58 - Extensão longitudinal do defeito ósseo, dividido em 3 partes.
Exemplo da expressão de RANKL no grupo tratado, aos 5
dias (DAB, original de 4X).
116
Figura 59 - Microscópio óptico acoplado à câmera de captação de
imagens e conectado ao computador.
116
Figura 60 - Software analisador de imagens IM50 exemplificando captura
no aumento de 40X.
116
Figura 61 - Grupo controle. Período de 5 dias. Observa-se a presença de
células inflamatórias (setas) e a formação de tecido
mesenquimal (*) (HE, original de 20X).
117
Figura 62 - Grupo tratado. Período de 15 dias. Medular celularizada, com
áreas sugestivas da presença do copolímero (*) e de
formação de tecido mesenquimal (HE, original de 160x).
117
Figura 63 - Grupo controle. Período de 15 dias. Nota-se início de
formação de tecido ósseo, caminhando da cortical em direção
à medular (HE, original de 63X).
117
Figura 64 - Grupo controle. Período de 60 dias. Tecido ósseo
neoformado acompanhando o negativo da rosca do implante.
Nota-se a presença de inúmeros osteócitos (setas) (HE,
117
28
original de 400X).
Figuras
65 – 67 –
MEV – Grupo tratado. Período de 40 dias. Observa-se osso
neoformado em contato com a superfície do implante
(originais de 60X, 200X e 1000X, respectivamente).
118
Figuras
68 – 71 –
MEV – Grupo tratado. Período de 60 dias. Observa-se osso
neoformado em contato com a superfície do implante em
maior quantidade quando comparado ao período de 40 dias
(originais de 60X, 200X e 500X, respectivamente).
118
Figuras
72 – 73 -
Grupo tratado. Período de 60 dias. Mensuração do perímetro
total do vale do implante por meio do Programa Imagelab
2000 e cálculo do perímetro utilizando a ferramenta “cálculo
de regiões”.
119
Figuras
74 – 75 -
Grupo tratado. Período de 60 dias. Mensuração do perímetro
de tecido ósseo neoformado (corado pelo vermelho de
alizarina) em contato com a superfície do implante, na área
do vale, por meio do Programa Imagelab 2000 e cálculo do
perímetro utilizando a ferramenta “cálculo de regiões”.
119
29
Tabela 1 – Valores, médias e desvios-padrão de torque-reverso, em N.cm,
para os grupos em estudo de acordo com o período de
avaliação.
87
Tabela 2 – Valores p do teste de Wilcoxon para a comparação entre os
grupos controle e tratado nos períodos de avaliação para cada
proteína.
87
Tabela 3 - Freqüências de médias percentuais de expressão das
proteínas, de acordo com o período de avaliação para os
grupos: controle e tratado.
88
Tabela 4 – Valores dos postos médios do teste de Kruskall-Wallis para as
proteínas analisadas no período de 15 dias, para o grupo
tratado.
88
Tabela 5 - Valores dos postos médios do teste de Kruskal-Wallis para as
proteínas analisadas no período de 15 dias, para o grupo
controle.
89
Tabela 6 – Valores percentuais das médias de extensão linear de contato
entre tecido ósseo/implante e entre tecido conjuntivo/implante
para os grupos controle e tratado.
89
Tabela 7 - Análise de Variância dos valores de torque-reverso aplicada
para a comparação das médias, com a estatística de Welch.
103
Tabela 8 - Freqüências absolutas e freqüências porcentuais (entre 106
30
parênteses) de médias (%) de imunomarcações celulares para
cada proteína, independentemente do período de avaliação,
para os grupos: controle e tratado.
Tabela 9 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas
entre as proteínas analisadas, para o período de 5 dias, no
grupo controle.
107
Tabela 10 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas
entre as proteínas analisadas, para o período de 15 dias, no
grupo controle.
107
Tabela 11 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas
entre as proteínas analisadas, para o período de 40 dias, no
grupo controle.
108
Tabela 12 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas
entre as proteínas analisadas, para o período de 60 dias, no
grupo controle.
108
Tabela 13 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas
entre as proteínas analisadas, para o período de 5 dias, no
grupo tratado.
109
Tabela 14 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas
entre as proteínas analisadas, para o período de 15 dias, no
grupo tratado. Note a diferença estatisticamente significante
entre as proteínas RANKL e COL-I, no teste de comparações
múltiplas.
109
Tabela 15 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas
entre as proteínas analisadas, para o período de 40 dias, no
grupo tratado.
110
31
Tabela 16 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas
entre as proteínas analisadas, para o período de 60 dias, no
grupo tratado.
110
32
COL-I - Colágeno tipo I, Collagen type I
DAB - diaminobenzidina
EDTA - Ácido etileno-diamino-tetracético
HE - Hematoxilina e eosina, hematoxilin and eosin
MEV - Microscopia eletrônica de varredura
OC - Osteocalcina, osteocalcin
OPG - Osteoprotegerina, osteoprotegerin
PBS - Tampão fosfato salina
PGA - Ácido Poliglicólico
PLA - Ácido Polilático
PLA/PGA - Copolímero de ácido polilático e poliglicólico, polylactic and
polyglycolic acid copolymer
PMMAL - Polimetil metacrilato lento
PVPI - Polivinil Pirrolidona Iodo
RANKL - Receptor Ativador Nuclear Kappa-B Ligante, Receptor Activator
Nuclear Kappa-B Ligand
TNF - Fator de Necrose Tumoral
33
1 Introdução 36
2 Material e Método 42
3 Resultados 51
4 Discussão 58
Referências 66
Figuras 78
Tabelas 87
Anexos 90
Anexo A - Certificado do Comitê de Ética na Experimentação Animal
(CEEA)
91
Anexo B - Normas da Revista Clinical Oral Implants Research,
selecionada para a publicação do artigo
92
Anexo C - Protocolo de reação imunoistoquímica em tecido ósseo 101
Anexo D – Complementação das tabelas e gráficos das análises 103
estatísticas
Análise Biomecânica 103
Análise Imunoistoquímica 104
Anexo E – Ilustração do procedimento cirúrgico 111
Anexo F – Ilustração da Análise Biomecânica 114
Anexo G – Ilustração do Processamento Imunoistoquímico 115
Anexo H – Ilustração da Análise imunoistoquímica 116
34
Anexo I – Ilustração da Análise Histológica 117
Anexo J – Ilustração da MEV 118
Anexo L – Ilustração da Análise Histométrica 119
35
36
*
Os implantes dentários osseointegráveis representam uma excelente
alternativa na reabilitação bucal e nas reconstruções maxilofaciais, entretanto, o
sucesso a longo prazo depende de um íntimo contato do tecido ósseo com o
implante, pela osseointegração (Olsen et al. 2005).
A presença de alterações ósseas como fenestrações, defeitos residuais,
alvéolos pós-exodônticos, diástases entre osso/implante por sobrefresagem e de
tecido ósseo de baixa qualidade podem afetar o prognóstico desta modalidade de
tratamento (Gotfredsen et al. 1991; Piattelli et al. 1997).
Os enxertos autógenos são considerados os mais indicados para o
preenchimento de defeitos ósseos (Lekholm et al. 1999), no entanto, sua utilização
nem sempre é viável devido à necessidade de segunda cirurgia para sua remoção, à
morbidade do sítio doador e à limitada disponibilidade em casos de grandes
reconstruções (Becker et al. 1994, 1998; Trejo et al. 2000; Raghoebar et al. 2001).
Buscando evitar ou minimizar os inconvenientes dos enxertos autógenos,
perspectivas favoráveis têm sido descritas quanto à associação dos enxertos
autógenos com os biomateriais (Mellonig & Bowers 1990) ou somente com o uso de
substitutos ósseos (Rutherford et al. 1992).
O desenvolvimento de substitutos ósseos sintéticos como os biomateriais são
de considerável importância, pois evitam complicações potencialmente
imunogênicas relacionadas aos derivados de fontes biológicas (Quattlebaum et al.
1988). Dentre esses materiais destacamos os poliméricos bioabsorvíveis, compostos
por macromoléculas de alto peso molecular, que têm recebido atenção especial por
*
Normas da revista Clinical Oral Implants Research. (Anexo B).
37
sua biocompatibilidade, boas propriedades biomecânicas e fácil manuseio (Pietrzak
et al. 1997).
Os polímeros degradáveis mais comuns são os poli α hidroxi-ésteres, dentre
os quais destacam-se os ácidos polilático, poliglicólico e seus copolímeros
(PLA/PGA), amplamente utilizados em engenharia tecidual (Lo et al. 1996; Ishaug-
Riley et al. 1998; Hasegawa et al. 2002; Lu et al. 2003; Luciano et al. 2003) e que
têm como uma das principais vantagens a não necessidade de remoção dos
materiais implantados, evitando a segunda cirurgia (Matsumoto et al. 2005).
Esse material é produzido de diferentes maneiras para cirurgias ósseas, tais
como dispositivos de fixação (Ferretti & Reyneke 2002; Peltoniemi et al. 2002),
membranas (Crump et al. 1996; Hämmerle & Lang 2001), substitutos ósseos,
carregadores para alterar fatores de crescimento, proteínas morfogenéticas ósseas
ou proteínas de adesão (El-amin et al. 2003; Saito et al. 2003). Vários estudos têm
mostrado efeitos benéficos desses copolímeros em animais e humanos (Holy et al.
2003; Serino et al. 2003; Nair & Schug 2004), destacando sua biocompatibilidade,
biodegradação e suas propriedades osteocondutoras, pois funcionam como
arcabouço para a substituição da matriz extracelular (Imbronito et al. 2005;
Rimondini et al. 2005).
Dentro desse contexto é que a utilização de biomateriais em implantodontia,
principalmente em casos em que o leito receptor do implante apresenta quantidade
e qualidade óssea inadequadas, se torna importante.
Vários fatores interferem na formação tecidual peri-implantar e subseqüente
mineralização, destacando-se o envolvimento mecânico local na interface entre o
osso e o implante (Szmukler-Moncler et al. 1998; Olsen et al. 2005). Portanto, a
estabilidade primária do implante tem sido destacada como pré-requisito para
obtenção da osseointegração (Bischof et al. 2004).
38
A densidade óssea, a proporção de osso cortical e medular, a qualidade do
tecido ósseo, a presença de alvéolos pós-exodônticos e de preparos inadequados
do leito receptor (sobrefresagem) devem ser avaliados devido à influência dos
mesmos sobre a estabilidade primária do implante (Nkenke et al. 2003).
A estabilidade resulta do contato direto entre o osso ao redor do implante e a
sua superfície, podendo ser dividida em primária e secundária, sendo a primeira
determinada pelo modelo do implante, técnica cirúrgica, qualidade óssea e por
defeitos anatômicos do leito receptor. Já a estabilidade secundária é dependente da
resposta tecidual ao implante e à cirurgia e do reparo ósseo. Experimentalmente tem
sido mostrado que o crescimento ósseo pode ocorrer na presença de uma
micromovimentação relativa entre o implante e o osso hospedeiro, entretanto em
casos onde ela é excessiva, pode ocorrer a formação de uma camada fibrosa ao
redor do implante (Pilliar et al. 1986; Soballe et al. 1992).
A interface implante/enxerto ósseo constitui uma situação de reparo
complexa, pois envolve a revascularização, a incorporação do enxerto e a integração
dos implantes (Sjöström et al. 2005).
O osso é um tecido complexo composto de células, matriz colagenosa e
elementos inorgânicos. Seu crescimento, desenvolvimento e manutenção são
processos altamente regulados (Nijweide et al. 1986). Proteínas, hormônios, fatores
de crescimento e citocinas, estão ativamente envolvidos nestes processos e
exercem atividade direta sobre células com atividade osteoblástica e osteoclástica,
atuando em sua diferenciação e ativação metabólica (Ducy et al. 2000).
A adsorção de proteínas, incluindo componentes da matriz extracelular na
superfície do metal é o primeiro passo da interação tecido ósseo/implante. Essas
proteínas formam a matriz óssea e são conhecidas por exercerem um importante
papel no processo de ossificação, contribuindo com o aumento da atividade celular
39
ao redor de implantes e conseqüente osseointegração (Ohsawa et al. 2000; Nagai et
al. 2002; Rammelt et al. 2004).
Dentre essas proteínas destaca-se a OPG, também conhecida como fator
inibitório de osteoclastogênese. A OPG é considerada um receptor solúvel secretado
e é produzida por diferentes tecidos e tipos celulares, incluindo osteoblastos, células
do estroma medular ósseo, fibroblastos e linfócitos T. Ela atua como um receptor
decodificador por ligação e neutralização da RANKL, inibindo a maturação e a
reabsorção óssea osteoclástica e, portanto, regulando a densidade óssea (Simonet
et al. 1997; Kong et al. 1999; Woo et al. 2002; Crotti et al. 2004; Rogers & Eastell
2005).
A proteína RANKL foi descoberta durante pesquisas para o ligante da OPG,
sendo constituinte da família do receptor do fator de necrose tumoral (TNF). Alguns
tipos celulares expressam esta proteína, incluindo osteoblastos, células do estroma
ósseo, células endoteliais e linfócitos T ativados (Khosla 2001; Rogers & Eastell
2005). A expressão relativa de OPG e RANKL é crítica na regulação da atividade
osteoclástica e na perpetuação do ciclo de remodelação óssea (Suda et al. 1999).
Outra importante proteína no processo de ossificação é a OC, a mais
abundante proteína não-colagenosa no osso, que indica o processo de
mineralização na formação óssea, implementada pela calcificação dos osteócitos na
camada de colágeno. Sua concentração sérica é um marcador sensitivo da
formação óssea, correlacionada com índices histomorfométricos (Lieberman et al.
2002; Thorwarth et al. 2005).
O COL-I é a principal proteína estrutural componente do tecido conjuntivo e
constitui a proteína inicial básica no processo de formação óssea. Ela forma um
arcabouço para migração e inserção de células nos tecidos, modulando a
diferenciação celular e a morfogênese (Bhatnagar et al. 1999; Gungormus 2004).
40
Tendo em vista a importância da estabilidade primária do implante na
biomecânica e conseqüente osseointegração, bem como da expressão de proteínas
da matriz óssea durante esse processo, e considerando as alterações anatômicas
naturais ou induzidas no tecido ósseo, a associação de biomateriais reabsorvíveis ao
sítio de instalação dos implantes se torna importante. Dentre os quais destacamos o
PLA/PGA, que poderia contribuir com a estabilidade temporária dos implantes pela
modificação biomecânica da interface osso/implante, além de favorecer a
osteocondução.
Portanto, a proposta deste estudo foi avaliar a associação do PLA/PGA ao
redor de implantes osseointegráveis instalados sem estabilidade primária, por meio
da análise biomecânica, histométrica e da expressão das proteínas OPG, RANKL,
OC e COL-I no processo de ossificação.
41
42
Foram utilizados 25 coelhos machos brancos (Nova Zelândia), variação
albinus, com idade de aproximadamente 5 meses e peso corporal de 3 a 4 Kg. Os
animais foram mantidos em gaiolas individuais com dieta padrão, ração sólida
(Procoelho, Primor) e água “ad libitum”, em condições climatizadas e água
canalizada, no Biotério da Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba -
UNESP. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da
Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, sob o protocolo número 70/05
(anexo A).
Cirurgia Experimental
Os animais foram mantidos em jejum durante oito horas prévias ao
procedimento cirúrgico e foram sedados pela combinação de 50mg/kg de Ketamina
intramuscular (Vetaset – Fort Dodge Saúde Animal Ltda, Campinas, São Paulo,
Brasil) e 5mg/Kg de cloridrato de xilazina (Dopaser – Laboratório Calier do Brasil
Ltda – Osasco, São Paulo, Brasil) e receberam cloridrato de mepivacaína (0.3 ml/Kg,
Scandicaine 2% com adrenalina 1:100.000, Septodont, França) como anestesia local
e para hemostasia do campo operatório.
Após a sedação dos animais foi realizada tricotomia na porção medial da tíbia
direita e anti-sepsia da região a ser incisada com Polivinil Pirrolidona Iodo
Degermante (PVPI 10%, Riodeine Degermante, Rioquímica, São José do Rio Preto),
associado à PVPI tópico.
Com uma lâmina número 15 (Feather Industries Ltda, Tokyo, Japão) foi
realizada uma incisão de aproximadamente 3 cm de comprimento na porção medial
43
da tíbia direita e a seguir, o tecido mole foi divulsionado em espessura total e
afastado com o auxílio de descoladores de periósteo, expondo o osso para receber
os implantes.
Foi utilizado um motor elétrico com velocidade final de 1600 r.p.m. para
confecção dos defeitos ósseos e um contra-ângulo redutor de 16:1 (Kavo, Santa
Catarina, Brasil), O preparo dos leitos receptores foi iniciado com uma fresa lança
para delimitar a localização dos implantes e romper a cortical óssea. Em seguida foi
utilizada a fresa helicoidal de 2,0mm, a piloto de 2,0mm/3,0mm e finalmente a fresa
helicoidal de 3,0mm (Conexão, São Paulo, Brasil), seqüencialmente, com irrigação
por meio de solução de cloreto de sódio a 0,9% (Darrow, Rio de Janeiro, Brasil)
durante toda a preparação. Os defeitos confeccionados envolveram somente a
cortical óssea superior (monocorticais).
Foram instalados 50 implantes de titânio comercialmente puro, de superfície
usinada (Conexão, São Paulo, Brasil), com diâmetro de 2,6 mm e altura de 6,0 mm,
esterilizados por raios gama. Estes implantes apresentam o módulo de rebordo
quadrado para encaixe da chave de adaptação do torquímetro (Conexão, São Paulo,
Brasil).
Cada animal recebeu dois implantes na face lateral da porção medial da tíbia
direita, respeitando-se uma distância de aproximadamente 5 mm entre os mesmos,
constituindo dois grupos experimentais:
Grupo Controle – Foi instalado um implante de titânio comercialmente puro, de
superfície usinada (Conexão, São Paulo, Brasil) na porção medial da tíbia direita
após osteotomia de 3,0 mm de diâmetro e 6,0 mm de profundidade. O implante foi
inserido no local da osteotomia preenchido apenas com coágulo sanguíneo, sem
estabilidade primária (figura 1).
44
Grupo Tratado – Foi instalado um implante na porção medial da tíbia direita,
associado ao copolímero de PLA (70%) PGA (30%) na proporção de 1:1 (VETEC
Química Fina Ltda, Duque de Caxias, RJ, Brasil) aquecido entre 100 e 150°C, na
consistência de gel, após osteotomia de 3,0 mm de diâmetro e 6,0mm de
profundidade (figura 2).
Os tecidos foram suturados em planos empregando-se fio absorvível
(Poligalactina 910 – Vycril 4.0, Ethicon, Johnson Prod., São José dos Campos,
Brasil) com pontos contínuos no plano profundo e com fio monofilamentar (Nylon
5.0, Ethicon, Johnson, São José dos Campos, Brasil) com pontos interrompidos no
plano mais externo.
No pós-operatório os animais receberam administração intramuscular de
Pentabiótico (0,1mL/Kg, Fort Dodge Saúde Animal Ltda, Campinas, São Paulo,
Brasil) com uma dose no pós-operatório imediato e outra dose após 5 dias e de
Dipirona Sódica (1mg/kg/dia, Ariston Indústrias Químicas e Farmacêuticas Ltda, São
Paulo, Brasil) totalizando 3 doses. A eutanásia dos animais foi realizada nos
períodos de 5, 15, 40 e 60 dias pós-operatórios, com 5 animais em cada período de
5, 15 e 40 dias e 10 animais no período correspondente a 60 dias.
Análise Biomecânica
Nos períodos correspondentes à eutanásia dos animais dos grupos de 40 e
60 dias foram realizadas as análises de torque reverso dos implantes instalados na
tíbia dos coelhos.
Os animais foram sedados seguindo protocolo descrito anteriormente e foi
realizada uma nova incisão na porção medial da tíbia direita para exposição dos
implantes instalados. Nos períodos de 40 e 60 dias, os implantes apresentaram-se
parcial ou totalmente cobertos por tecido ósseo, portanto foi realizada a ostectomia
com o auxílio de uma fresa esférica número 2, sob irrigação abundante com soro
45
fisiológico, para permitir a exposição do módulo de rebordo quadrado do implante e
conseqüente adaptação da chave intermediária e do torquímetro.
Em seguida, o torquímetro analógico (ATG24CN, Tohnichi, Tokyo, Japan/
www.tohnichi.co.jp) com escala graduada de 3N.cm à 24N.cm foi acoplado à chave
adaptadora intermediária, e foi aplicada a força de torque reverso para remoção dos
implantes. O teste foi realizado aumentando-se o torque reverso até a rotação do
implante no interior do tecido ósseo, rompendo completamente a interface
osso/implante, momento em que o torquímetro registrou a força necessária para
esse rompimento. Os valores obtidos foram agrupados e submetidos à análise de
variância com a correção de Welch. Nos testes estatísticos empregou-se o nível
usual de significância de 5%.
Análise Imunoistoquímica
Após a remoção dos implantes foi realizada a eutanásia dos animais por meio
da perfusão no ventrículo esquerdo com 150 ml de solução salina fisiológica
tamponada (Darrow, Rio de Janeiro, Brasil) por 10 minutos e em seguida com 1800
ml de formaldeído a 4% (Paraformaldeído, Acros Organics) durante 40 minutos,
utilizando bomba perfusora peristáltica Masterflex® Ls (Cole-Parmer Instrument
Company), na velocidade de 45ml/min.
Após a perfusão, a tíbia direita de 20 animais foi removida e o tecido mole
excedente eliminado. As peças foram reduzidas respeitando-se uma distância de
aproximadamente 10 mm das bordas das cavidades e receberam pós-fixação em
solução de formaldeido 4%, a 4°C, durante um período de 6 horas.
Em seguida, as peças foram lavadas em PBS (pH 7,4) por 60 minutos com
trocas a cada 10 minutos e imersas em solução descalcificadora (EDTA 5%- Merck -
Ácido Etileno Diamino Tetracético), dissolvido em água MiliQ, por um período de 3
meses, à temperatura ambiente. Após a descalcificação as peças foram lavadas por
46
24 horas em solução tampão (PBS) e crioprotegidas utilizando sacarose 30%
(Merck) por 48 horas à temperatura de 4° C, para impedir a formação de bolhas de
ar no interior dos tecidos.
Para realização dos cortes congelados, as peças foram fixadas em um
suporte metálico utilizando Tissue Tek® O.C.T. Compound (Sakura), possibilitando a
obtenção de cortes longitudinais com 14µm de espessura em criostato (Micron,
Zeiss), e posteriormente foram montadas em lâminas gelatinizadas, com dois cortes
de cada grupo por lâmina.
Para o processamento imunoistoquímico, foram utilizados como anticorpos
primários OPG (OPG, Goat (cabra) anti-opg - Santa Cruz Biotechnology, SC21038),
RANKL (Goat anti-rankl - Santa Cruz Biotechnology, SC7627), OC (OC, Goat anti-oc
– Santa Cruz Biotecnology, SC18319) e COL-I (Goat anti-COL-I – Santa Cruz
Biotecnology, SC8788). O anticorpo secundário biotinilado foi anti-cabra (goat)
produzido em burro (donkey) (Biotin-SP-AffiniPure, donkey anti-goat IgG - Jackson
Immunoresearch Laboratories, 705065147). O método de detecção foi por
imunoperoxidase e a 3,3 diaminobenzidina (DAB, Sigma, St. Louis, MO, USA) foi
utilizada como cromógeno.
Foram realizados procedimentos de controle por meio da omissão dos
anticorpos primários (controle negativo), utilizando-se a incubação com soro normal
de burro a 5%, para avaliar a especificidade e efetividade das reações. A cortical
inferior da tíbia dos coelhos foi avaliada como sendo o controle positivo.
Foi realizada uma análise qualitativa ordinal da expressão proteica, dividindo-
se a extensão longitudinal do negativo do implante em três partes: cortical superior
adjacente à área osteotomizada, espaço medular na área do defeito ósseo e cortical
inferior, linearmente abaixo do espaço medular. Para a realização da análise foi
utilizado um microscópio óptico com objetiva de aumento 20X Leica Aristoplan
47
Microsystems (Leitz, Benshein, Alemanha) acoplado a uma câmera de captura de
imagem (Leica
®
DFC 300FX, Leica microsystems, Heerbrugg, Switzerland) e
conectado a um microcomputador Pentium III com um software analisador de
imagens digitalizadas (Leica Câmera Software Box, Leica Imaging Manager -IM50
Demo Software). A análise foi realizada considerando-se os seguintes escores:
marcações negativas (-), positivas (+), super-positivas (++) e hiperpositivas (+++)
das células marcadas em áreas determinadas, que sabidamente estão envolvidas na
dinâmica do tecido ósseo. Para facilitar a comparação entre os diferentes grupos e
períodos, os escores da análise imunoistoquímica foram convertidos em freqüências
de médias percentuais de 0%, 20% (10% à 30%), 60% (50 à 70%) e 90% (80% à
100%), de acordo com o período de avaliação, para ambos os grupos. O avaliador
desconhecia o grupo pertencente a cada defeito ósseo, para evitar tendenciosidade
durante a análise. Os resultados foram tabulados e submetidos ao teste não-
paramétrico de Wilcoxon para duas amostras de dados pareados e de Kruskal-Wallis
para mais de duas amostras de dados independentes, com o cruzamento das
variáveis proteínas e períodos. Empregou-se nestes testes o nível de significância
de 5%.
Parte das amostras teciduais seccionadas foi corada com Hematoxilina e
Eosina (HE Merck & Co., Inc.), servindo como referência para a citoarquitetura dos
cortes processados pela imunoistoquímica.
Análise por MEV
Dez implantes removidos por torque-reverso nos períodos de 40 e 60 dias (5
de cada período) foram submetidos à avaliação em microscópio eletrônico de
varredura (Jeol JSM – T220A, Peabody, USA). Fotomicrografias foram obtidas do
corpo dos implantes nos aumentos de 60X, 100X, 200X, 500X e 1000X.
Análise Histológica/Histométrica
48
Os outros 5 animais utilizados no experimento foram eutanasiados no período
de 60 dias por meio de sobredose anestésica. As peças obtidas da tíbia direita
desses animais foram reduzidas e fixadas em solução de formalina tamponada a
10% (Reagentes Analíticos
®
, Dinâmica Odonto-Hospitalar Ltda, Catanduva, SP,
Brasil) durante 48 horas e banhadas em água corrente por 24 horas. Após a fixação,
as peças passaram pela etapa de desidratação a partir da seqüência crescente de
álcoois 70, 90, 95 e 100, gradativamente, com troca de solução a cada 3 dias, em
agitador orbital (KLine CT – 150
®
, Cientec – Equipamentos para Laboratório,
Piracicaba, SP, Brasil) todos os dias durante 4 horas.
Ao término da desidratação, as peças foram imersas em acetona (Labsynth
Produtos para Laboratórios Ltda, Diadema, SP, Brasil) por 24 horas, a seguir em
solução de acetona e polimetil metacrilato lento (PMMAL) (Classico
®
, Artigos
Odontológicos Clássico, São Paulo, SP, Brasil) na proporção de 1:1. Na seqüência,
recebeu 3 banhos de PMMAL, sendo que no último banho, foi acrescentado o
catalisador peróxido de benzoíla a 1% (Riedel
®
– De Haën AG, Seelze – Hannover,
Germany).
O último banho (PMMAL e catalizador) foi realizado com as peças colocadas
em frascos de vidro com tampa, mantidos à temperatura ambiente por
aproximadamente 1 semana, para que a resina polimerizasse. O corte e o desgaste
das peças foram realizados no plano mésio-distal utilizando um sistema de corte
(Exakt Cutting System, Apparatebau, Gmbh, Hamburgo, Alemanha) até a obtenção
de secção de aproximadamente 70 µm de espessura.
Como corantes foram utilizados o vermelho de alizarina e o azul de Stevenel. As
imagens obtidas foram capturadas pelo mesmo sistema destacado anteriormente e
submetidas à análise histométrica. Com o auxílio do programa ImageLab 2000,
versão 2.4, foi calculada a extensão linear de contato entre tecido conjuntivo (corado
49
com azul de Stevenel) e implante e entre tecido ósseo (corado com vermelho de
alizarina) e implante, de 12 regiões pré-selecionadas, correspondentes às regiões
das roscas, ao módulo de rebordo e ao ápice dos implantes, para ambos os grupos.
Os valores de extensão linear obtidos para tecido conjuntivo e tecido ósseo nos
grupos controle e tratado foram convertidos em valores percentuais e comparados
por meio do teste pareado “t” de Student (p=0.05).
50
51
Análise Clínica
Após a reabertura das tíbias para a realização do torque-reverso, observou-se
aos 40 e 60 dias que os implantes apresentaram-se estáveis, com osso neoformado
cobrindo o módulo de rebordo dos mesmos (figura 3). Os implantes em todos os
períodos do grupo tratado apresentaram-se numa posição tridimensional mais
próxima da posição de instalação, já os implantes do grupo controle apresentaram-
se numa posição mais inclinada (figura 4), quando comparada à posição inicial de
instalação.
Análise Biomecânica
Foram considerados os valores de torque-reverso obtidos para os grupos
controle e tratado, nos períodos de 40 e 60 dias. Na tabela 1 são dados os valores
de torque-reverso, em N.cm, para ambos os grupos, de acordo com o período de
avaliação, destacando-se as médias e desvios-padrão de torque-reverso. Nota-se
que a dispersão dos valores na avaliação de torque-reverso aos 40 dias é menor do
que a dispersão na avaliação de 60 dias (desvio-padrão no período de 60 dias é 3
vezes maior do que no período de 40 dias), indicando resultados mais homogêneos
no período mais curto. Embora as medidas tenham sido obtidas aos pares em cada
período, não se observa correlação significativa entre elas, principalmente para o
período de 60 dias.
A análise de variância foi aplicada para a comparação das médias, com a
estatística de Welch. Obteve-se p= 0,153 e, portanto, não houve evidência de
diferenças significativas entre médias para ambos os grupos (figura 5).
Análise Imunoistoquímica
52
Foram realizadas reações imunoistoquímicas utilizando-se anticorpos
primários contra as proteínas OPG, RANKL, OC e COL-I, analisadas durante o
processo de reparo na interação tecido ósseo/implante.
Inicialmente, considerando-se cada proteína isoladamente, os grupos controle
e tratado foram comparados pelo teste de Wilcoxon em cada período de avaliação,
já que os resultados foram obtidos aos pares em cada animal. Não se observou
qualquer diferença significativa nesta avaliação (tabela 2).
Em seguida, aplicou-se o teste de Kruskal-Wallis para a comparação de
médias percentuais de marcações celulares entre os grupos controle e tratado,
cruzando-se as variáveis proteínas e períodos de avaliação. Na tabela 3 são
mostradas as freqüências de médias percentuais (0, 20, 60 e 90) das
imunomarcações celulares para as proteínas OPG, RANKL, OC e COL-I, de acordo
com os períodos de avaliação, separadamente para ambos os grupos.
Tendo em vista os resultados obtidos pelo teste de Kruskall-Wallis, foi
realizada a união dos valores de expressão protéica dos 4 períodos de avaliação,
verificando-se diferença estatística entre as proteínas RANKL e COL-I para o grupo
tratado (p= 0,001). Para o grupo controle o resultado foi marginal (p=0,085).
Entretanto, os postos médios utilizados pelo teste de Kruskall-Wallis foram muito
semelhantes, revelando valores mais baixos para a proteína COL-I e valores mais
altos para a RANKL, em ambos os grupos (tabelas 4 e 5).
As porcentagens das médias de imunomarcações dos 4 períodos de
avaliação para cada proteína sugerem que a proteína RANKL apresenta mais
percentuais de marcações celulares acima de 50% do que as outras proteínas, em
que predominam percentuais abaixo de 30%, principalmente para o COL-I (figura 6).
Os seguintes resultados qualitativos foram observados:
53
OPG: notou-se imunomarcações positivas para osteócitos, presentes nas corticais
superior e inferior, nos grupos controle e tratado (figura 7). Entretanto, na porção
medular, foram observados poucas marcações imunopositivas para esta proteína em
ambos os grupos aos 5 dias, enquanto aos 15 dias no grupo controle nota-se maior
presença de células positivas para a OPG. Aos 40 dias observa-se redução na
imunomarcação desta proteína em ambos os grupos (figura 8), como destacado na
tabela 3 pela significância do teste de Kruskal-Wallis (p=0,05).
RANKL: imunomarcações positivas foram observadas em osteócitos nas corticais
superior e inferior, em ambos os grupos e períodos analisados. Foi observado um
aumento de células imunopositivas para a RANKL (figura 9) quando comparada à
OPG. A medular apresentou grande quantidade de células imunopositivas no
período de 5 dias, caracterizadas como células do tipo linfócitos (figura 10). Aos 15
dias foi observado aumento na quantidade de células imunopositivas para a RANKL
na mesma área. Os postos médios do teste de Kruskall-Wallis também sugerem
esse resultado. Aos 40 e 60 dias, observa-se menor imunomarcação desta proteína,
principalmente na região medular, entretanto nota-se maior equilíbrio na expressão
de RANKL e OPG em ambos os grupos, com discreta predominância de RANKL
(figura 11).
OC: em ambos os grupos foram observados osteócitos marcados positivamente
para a OC nas corticais analisadas, de maneira equilibrada em todos os períodos.
Vale destacar a presença de marcação de fundo nas corticais superior e inferior, fato
não observado nas demais proteínas. A medular apresentou-se com marcação
discreta, caracterizando poucas células da linhagem osteoblástica imunopositivas.
Aos 60 dias observou-se aumento na expressão de OC, principalmente na cortical
superior, em ambos os grupos (figura 12).
54
COL-I: imunomarcações positivas foram observadas nas corticais superiores e
inferiores em ambos os grupos e períodos analisados. A medular apresentou poucas
células imunopositivas ao COL-I aos 5 dias, entretanto aos 15 dias, em ambos os
grupos foi observado aumento nas imunomarcações positivas (figura 13) em células
com aspecto de fibroblastos Nos períodos de 40 e 60 dias observa-se pouca
expressão de COL-I (figura 14). em ambos os grupos, principalmente na região
medular.
Reações de controle no processamento imunoistoquímico foram realizadas
rotineiramente. Nos controles negativos foram observados cortes isentos de
marcações, comprovando a especificidade das reações (figura 15). Nos controles
positivos, realizados na cortical inferior intacta, foram observadas marcações
celulares para cada proteína avaliada, comprovando a efetividade dos anticorpos
estudados (figura 16).
A comparação da citoarquitetura das células ósseas, como um auxílio na
análise da morfologia celular na expressão protéica, mostrou aos 5 e 15 dias poucos
sinais de formação óssea e as corticais apresentaram um aspecto de normalidade. É
possível observar a presença de osteócitos, bem corados pela hematoxilina, ao
longo das corticais superiores e inferiores (figuras 17 e 18). A medular apresenta-se
celularizada e contém algumas áreas sugestivas da presença do polímero no grupo
tratado. Aos 5 dias no grupo controle observa-se a presença de células inflamatórias
na área medular. Em alguns espécimes, aos 15 dias, é possível observar o início de
formação de tecido ósseo da cortical superior em direção à medular. Neste período,
no grupo tratado, observa-se a formação de tecido mesenquimal na área medular
com remanescentes do polímero.
No período de 40 dias observam-se áreas de neoformação óssea adjacentes
à cortical e na região medular, bastante celularizadas, com aspecto de tecido ósseo
55
imaturo. Já aos 60 dias foi observada maior neoformação óssea em toda a extensão
do defeito, com tecido ósseo imaturo acompanhando o formato das espiras do
implante e presença de inúmeros osteócitos nas corticais superiores e inferiores
(figura 19). Observam-se neste período poucas áreas com remanescentes do
polímero no grupo tratado.
Análise por MEV
Nos implantes removidos no período de 40 dias observam-se áreas de tecido
ósseo aderidas à superfície do metal, em ambos os grupos. Já aos 60 dias pós-
operatórios os implantes encontram-se quase totalmente cobertos por tecido ósseo
neoformado, em toda a extensão, tanto no grupo tratado quanto no grupo controle
(figuras 20 e 21).
Análise Histológica e Histométrica da interface osso/implante
Foram analisadas as porcentagens de extensão linear de contato entre tecido
ósseo/implante e entre pré-osso/implante. O teste pareado “t” de Student não
revelou evidência de diferença estatística entre os grupos controle e tratado
(p=1,55). A tabela 6 destaca as médias percentuais da extensão linear de contato
tecido ósseo/implante para ambos os grupos e interfaces analisadas.
A análise qualitativa do grupo controle, aos 60 dias, revelou a presença de
tecido ósseo neoformado celularizado (corado pelo vermelho de alizarina) em
contato com a superfície do implante, principalmente na área do módulo de rebordo,
tendo em vista sua localização em osso cortical (figura 22). Na área medular, é
possível notar neoformação óssea na região dos picos e vales das roscas dos
implantes, bem como a presença tecido conjuntivo (corado pelo azul de Stevenel)
em contato com a superfície dos implantes e preenchendo a região dos vales das
roscas (figura 23).
56
No grupo tratado, aos 60 dias, também observa-se a presença de áreas de
neoformação óssea em contato com a superfície do implante, na área do módulo de
rebordo e algumas áreas de tecido conjuntivo nessa interface (figura 24). Na área
medular é possível notar a presença de tecido conjuntivo bastante celularizado com
presença de inúmeros osteoblastos envoltos pelo remanescente do polímero que
está sendo degradado e substituído pela matriz colagenosa adjacente (figura 25).
Esta por sua vez, está sendo substituída por tecido ósseo neoformado, que caminha
em direção à superfície do implante. Áreas de interface entre tecido ósseo e
implante também podem ser observadas na região dos vales de algumas roscas
presentes na área medular. Em algumas áreas adjacentes ao implante observou-se
tecido conjuntivo celularizado em contato direto com o osso neoformado.
57
58
A literatura tem utilizado como modelo ósseo a tíbia de coelhos para avaliar a
osseointegração de diferentes tipos de implantes, com variações quanto à área
receptora, incluindo instalação na articulação do joelho e metáfise tibial (Sennerby et
al. 1992), na porção medial-proximal da tíbia (Kong et al. 2002), na metáfise tibial
(Cordioli et al. 2000; Margonar et al. 2003), dentre outros trabalhos, que avaliaram a
osseointegração de diferentes tipos de implantes. Foi definida a utilização da porção
medial da tíbia direita do coelho como área receptora, considerando-se o fato dessa
área estar distante do centro de crescimento ósseo (localizado na metáfise tibial,
próximo à articulação tíbio-femural), região de maior atividade osteogênica, para
evitar qualquer influência sobre o processo de reparo ósseo e conseqüente
expressão proteica.
A estabilidade primária em implantodontia é um dos principais fatores que
influenciam as taxas de sobrevivência do implante. É considerada um pré-requisito
para estabelecer suporte mecânico, sendo este essencial para o processo de
osseointegração (Ivanoff et al. 1996; Nkenke et al. 2003), já que implantes instáveis
resultaram em encapsulação fibrosa (Lioubavina-Hack et al. 2006). Em nosso estudo
verificamos a presença de neoformação óssea ao redor de implantes instalados sem
estabilidade primária, confirmado pela análise biomecânica, histométrica e pela
MEV. Entretanto os diferentes resultados encontrados podem estar relacionados às
inúmeras variáveis, destacando-se como fator fundamental a ausência de leito
receptor intra-ósseo para os implantes instalados sem estabilidade primária em que
ocorreu formação fibrosa ao redor dos mesmos, no trabalho citado anteriormente.
59
Embora altas taxas de sucesso tenham sido relatadas com a utilização de
implantes osseointegráveis (Doring et al. 2004), falhas podem ser observadas em
ossos de baixa qualidade e/ou em situações de volume ósseo reduzido (Jaffin &
Berman 1991). Além disso, após a extração dentária, o alvéolo frequentemente
apresenta dimensões maiores que o diâmetro de um implante convencional,
formando um “gap” que compromete o aceitável contato osso/implante. Além disso,
a largura do defeito ósseo influencia diretamente a porcentagem desse contato
(Akimoto et al. 1999). Portanto, neste contexto destaca-se a importância da
utilização dos biomateriais para o preenchimento desses defeitos.
No protocolo experimental utilizado neste estudo os defeitos confeccionados
apresentaram dimensão de aproximadamente 0,4 mm além do diâmetro do implante.
Foi observada a presença de neoformação óssea em ambos os grupos, mesmo na
ausência de estabilidade primária. Botticelli et al. (2003, 2004, 2005, 2006)
demonstraram que amplos defeitos periimplantares confeccionados em cães, de 1,0
mm até 2,25 mm, associados ou não à remoção intencional da parede vestibular
podem ser preenchidos com tecido ósseo neoformado, fornecendo alto grau de
osseointegração. Além disso, estes autores concluíram que este reparo é
influenciado pelas características de superfície do implante. Contudo, em todos os
estudos realizados por estes autores os implantes apresentavam-se travados na
porção apical, e, portanto com estabilidade primária.
Já as condições desenvolvidas neste trabalho propuseram situações
experimentais diferentes, destacando-se o modelo animal utilizado, o comprimento e
diâmetro dos implantes, as diferentes superfícies dos mesmos, o(s) período(s) de
sacrifício, as distintas formas de análises empregadas, a associação do PLA/PGA,
bem como a ausência de estabilidade primária. Portanto, houve neoformação óssea
em ambos os grupos, justificada, dentre outros fatores, pela formação de uma
60
interface entre tecido ósseo e implante, mesmo na ausência de estabilidade
primária.
O PLA/PGA tem sido utilizado como mini-parafusos, membranas, mini-
placas e substitutos ósseos (Leenslag et al. 1987, Holy et al. 2003), demonstrando
bons resultados, relacionados à sua biocompatibilidade, fácil degradação e
propriedades osteocondutoras (Imbronito et al. 2005). Ele é utilizado em diferentes
consistências para cirurgia, sendo que na forma gelificada, como empregada neste
estudo, apresenta inúmeros poros pequenos, em torno de 3µm (Luciano et a. 2003)
que contribuem com a neoformação óssea por osteocondução. Em nosso estudo foi
possível observar que o PLA/PGA se mostrou biocompatível, já que não alterou as
respostas celulares durante a expressão das proteínas da matriz óssea, não impediu
a neoformação óssea e apresentou resultados biomecânicos e imunoistoquímicos
bastante semelhantes ao grupo controle.
Análise Biomecânica
As forças de torque reverso são comumente utilizadas como medidas
biomecânicas da ancoragem ou osseointegração, sendo que o aumento da força
requerida para a remoção dos implantes possui correlação positiva com o grau de
contato entre tecido ósseo e implante (Klokkevold et al. 2001; Moriya et al. 2006).
Nos períodos de 40 e 60 dias foi possível obter valores da força de ruptura da
interface osso-implante. Isto se deve ao fato de que nesse período ocorre uma
compactação lamelar no processo de reparo, com maturação do calo ósseo e
resistência suficiente para suportar cargas (Roberts et al. 1996, Davies 2003),
comprovando, portanto, o processo de osseointegração ocorrido em ambos os
grupos e períodos analisados, considerando a metodologia empregada.
A análise dos valores de torque-reverso demonstrou que não houve
diferenças nos resultados entre ambos os grupos. Vários trabalhos têm sido
61
realizados para avaliar a osseointegração por meio de análises biomecânicas
(Cordioli et al. 2000; Klokkevold et al. 2001; Kong et al. 2002; Margonar et al. 2003).
Contudo, as médias de valores de torque-reverso obtidas nesses estudos,
considerando tempos de reparo semelhantes e o mesmo modelo animal (coelhos),
diferem entre os mesmos. Variáveis como padrão, tamanho e distribuição de picos e
vales das diferentes superfícies de implantes analisadas, bem como as diferentes
condições experimentais podem contribuir com a variação dos resultados,
impedindo, portanto, comparações diretas entre esses tipos de estudo.
Neste trabalho os valores obtidos apresentam uma aparente proximidade
com os valores de torque-reverso encontrados na literatura para implantes de
superfície usinada (Klokkevold et al. 2001). É necessário considerar que em nosso
estudo os implantes não apresentaram estabilidade primária e, portanto, as
condições experimentais foram distintas. Entretanto pode-se observar que o torque
partiu de um valor zero e alcançou valores semelhantes em ambos os grupos e
períodos, demonstrando que houve neoformação óssea e, portanto,
osseointegração dos implantes. Porém durante a análise clínica na fase de
eutanásia dos animais foi observado que os implantes do grupo tratado
permaneceram em uma posição tridimensional mais adequada, semelhante à
posição inicial de instalação. Este fato pode ser explicado pela manutenção do
posicionamento do implante proporcionada pelo copolímero no ato de instalação dos
mesmos devido à consistência de gel.
Análise Imunoistoquímica
A análise imunoistoquímica fornece importantes informações a respeito do
comportamento celular, de acordo com a expressão de proteínas envolvidas no
metabolismo ósseo durante o processo de osseointegração. As proteínas analisadas
neste estudo foram OPG, RANKL, OC e COL-I.
62
O PLA/PGA demonstrou ser um material biocompatível, tendo em vista a
ausência de alterações na funcionalidade e resposta celulares, comprovada pela
dinâmica da expressão protéica observada em todos os períodos, de maneira
semelhante ao grupo controle. Bostman & Pihlajamaki (2000), observaram
alterações desfavoráveis resultantes da degradação do polímero em aplicações
ortopédicas, com formação de áreas osteolíticas próximas ao material, sem
conseqüências relevantes. Entretanto, outros trabalhos não destacaram a ocorrência
deste tipo de reação tecidual (Matsumoto et al. 2005). Essas variações podem estar
relacionadas às diferentes técnicas cirúrgicas, à anatomia óssea, às diferentes
formas de utilização do polímero, suas formulações, bem como às finalidades de seu
emprego. Em nosso trabalho foram utilizados implantes sem estabilidade primária,
associados ao PLA/PGA na consistência de gel. Portanto a expressão proteica foi
analisada em condições especiais, não relatadas na literatura até o presente
momento.
A OPG sinaliza o preparo tecidual para a formação óssea (Suda et al. 1999).
O anticorpo contra a OPG utilizado marca osteoblastos, osteócitos, fibroblastos,
além de outros tecidos de origem mesenquimal (Stejskal et al. 2001 a). Nossos
resultados estão de acordo com a literatura, já que mostram a imunomarcação da
OPG em células da linhagem osteoblástica (Simonet et al. 1997; Woo et al. 2002;
Rogers & Eastell 2005).
Considerando a expressão da proteína RANKL, foram observadas marcações
em osteócitos na cortical e linfócitos na medular, como observados em outros
trabalhos (Khosla et al. 2001; Stejskal et al. 2001 b; Hasegawa et al. 2002).
A expressão de RANKL e OPG foi examinada durante o reparo de fraturas de
tíbia de ratos (Kon et al. 2001). Picos de expressão de OPG foram vistos 24 horas e
7 dias após a fratura, coincidindo com o pico de formação de cartilagem. A
63
expressão da RANKL apresentou pico aos 3 e 14 dias, quando houve um
decréscimo na expressão da OPG. Nossos resultados demonstraram que essas
duas proteínas se expressaram nos períodos de 5 e 15 dias, com um predomínio de
RANKL tanto na cortical quanto na medular, sendo a marcação desta última
relacionada a células de natureza linfóide. A predominância de RANKL, quando
comparada à OPG, pode significar uma tendência de preparação tecidual para a
reabsorção óssea. Este resultado pode estar relacionado a uma resposta tecidual ao
trauma cirúrgico induzido aos tecidos periimplantares em ambos os grupos. No
grupo tratado essa resposta inicial pode também estar associada à presença do
PLA/PGA, e foi evidenciada pela análise estatística. Além disso, foi observado maior
equilíbrio na imunomarcação destas proteínas, nos períodos de 40 e 60 dias,
sugerindo uma dinâmica óssea mais equilibrada (Ducy et al. 2000).
Outra proteína analisada no estudo foi a OC, expressa em osteoblastos e
também em osteócitos (Thorwarth et al. 2005). As imunomarcações observadas para
esta proteína nas corticais foram semelhantes em ambos os grupos, com a presença
de marcação de fundo característica. A expressão equilibrada de OC confirma a
viabilidade celular e, portanto sua capacidade funcional. A OC está relacionada ao
estágio de mineralização óssea e é capaz de acelerar tanto a ativação de
osteoblastos quanto a de osteoclastos nesse processo (Rammelt et al. 2005).
O COL-I é a proteína inicial da matriz no processo de formação óssea,
modulando a diferenciação celular e a morfogênese por mediação do fluxo de
estimuladores químicos e mecânicos (Bhatnagar et al. 1999). Portanto, o COL-I
representa um índice para avaliação da matriz de colágeno, predominante na parte
orgânica do tecido ósseo. Aos 15 dias foram observadas marcações para o COL-I na
área medular em células semelhantes a fibroblastos sugerindo a possibilidade de
haver formação de matriz orgânica colagenosa e conseqüente formação óssea. Este
64
fato foi comprovado pela neoformação óssea observada nos períodos finais,
principalmente aos 60 dias, na análise histológica e histométrica da interface
osso/implante, com conseqüente redução nas médias percentuais de marcação
desta proteína, evidenciada pelo teste estatístico de Kruskall-Wallis (valores abaixo
de 50%). A expressão de COL-I é considerada como o primeiro indicador de
neoformação óssea, entretanto essa relação é inespecífica (Thorwarth et al. 2005).
Além disso, a MEV dos implantes removidos no período de 60 dias confirmou a
presença de tecido ósseo neoformado em contato com toda a superfície dos
mesmos.
Entretanto, novos estudos são necessários para avaliar o processo de reparo
ósseo na interface osso/implante para verificar a possível influência do PLA/PGA na
aceleração ou retardo do processo de neoformação óssea. Além disso, sugere-se a
análise de períodos de reparo mais longos e de defeitos ósseos maiores, bem como
a avaliação da viabilidade tecidual em receber cargas funcionais após o reparo,
considerando-se a ausência de estabilidade inicial ou a presença de uma
estabilidade mínima dos implantes, pela associação ao biomaterial.
Portanto, considerando a dinâmica da expressão das proteínas OPG, RANKL,
OC e COL-I em ambos os grupos, a neoformação óssea observada principalmente
no período de 60 dias, bem como a semelhança da análise biomecânica nos grupos
e períodos analisados, é possível inferir que o PLA/PGA apresentou
biocompatibilidade e permitiu neoformação óssea em contato com o implante em
defeitos ósseos de aproximadamente 0,4mm além do seu diâmetro. Além disso,
ocorreu o processo de osseointegração em ambos os grupos, mesmo na ausência
de estabilidade primária dos implantes.
65
66
**
• Akimoto, K., Becker, W., Persson, R., Baker, D.A., Rohrer, M.D. & O′Neal,
R.B. (1999) Evaluation of titanium implants placed into simulated extraction
sockets: a study in dogs. The International Journal of Oral and Maxillofacial
Implants 14: 351-360.
• Becker, W., Becker, B.E. & Caffesse, R. (1994) A comparison of
demineralized freeze-dried bone and autologous bone to induce bone
formation in human extraction sockets. Journal of Periodontology 65: 1128-
1133.
• Becker, W., Clokie, C., Sennerby, L., Urist, M.R. & Becker, B.E. (1998)
Histologic findings after implantation and evaluation of different grafting
materials and titanium micro screws into extraction sockets:case reports.
Journal of Periodontology 69: 414-421.
• Bhatnagar, R., Qian, J., Wedrychowska, A., Sadeghi, M., Wu, Y.M. & Smith,
N. (1999) Design of biomimetic habitats for tissue engineering with P-15, a
synthetic peptide analogue of collagen. Tissue Engineering 5: 53-65.
• Bischof, M., Nedir, R., Szmukler-Moncler, S., Bernard, J.P. & Samson, J.
(2004) Implant stability measurement of delayed and immediately loaded
implants during healing. Clinical Oral Implants Research 15: 529-539.
• Böstman, O.M. & Pihlajamaki, H.K. (2000) Adverse tissue reactions to
bioabsorbable fixation devices. Clinical Orthopaedics and Related Research
371: 216-227.
**
Normas da revista Clinical Oral Implants Research. (Anexo B).
67
• Botticelli, D., Berglundh, T. & Lindhe, J. (2004) Resolution of bone defevts of
varying dimension and configuration in the marginal portion of the peri-implant
bone. An experimental study in the dog. Journal of Clinical Periodontology 31:
309-317.
• Botticelli, D., Berglundh, T., Buser, D. & Lindhe, J. (2003) The jumping
distance revisted: an experimental study in the dog. Clinical Oral Implants
Research 14: 35-42.
• Botticelli, D., Berglundh, T., Persson, L.G. & Lindhe, J. (2005) Bone
regeneration at implants with turned or rough surfaces in self-contained
defects. An experimental study in dog. Journal of Clinical Periodontology
32:448-455.
• Botticelli, D., Persson, L.G., Lindhe, J. & Berglundh, T. (2006) Bone tissue
formation adjacent to implants placed in fresh extraction sockets: an
experimental study in dogs. Clinical Oral Implants Research 17: 351-358.
• Cordioli, G., Majzoub, Z., Piatelli, A. & Scarano, A. (2000) Removal torque and
histomorphometric investigation of 4 different titanium surfaces: an
experimental study in the rabbit tibia. The International Journal of Oral and
Maxillofacial Implants 15: 668-674.
• Crotti, T.N., Smith, M.D., Findlay, D.M., Zreiqat, H., Ahern, M.J., Weedon, H.,
Hatzinikolous, G., Capone, M., Holding, C. & Haynes, D.R. (2004) Factors
regulating osteoclast formation in human tissues adjacent to peri-implant bone
loss: expression of receptor activator NFкB, RANK ligand and osteoprotegerin.
Biomaterials 25: 565-573.
• Crump, T.B., Rivera-Hidalgo, F., Harrison, J.W., Willians, F.E. & Guo, I.Y.
(1996) Influence of three membranes types on healing of bone defects. Oral
68
Surgery, Oral Medicine, Oral Patholology, Oral Radiology, and Endodontics
82: 365-374.
• Davies, J.E. (2003) Understanding peri-implant endosseous healing. Journal
of Dental Education 67: 932-949.
• Doring, K., Eisenmann E. & Stiller, M. (2004) Functional and esthetic
considerations for single-tooth Ankylos implant-crowns: 8 years of clinical
performance. The Journal of Oral Implantology 30: 198-209.
• Ducy, P., Schinke T. & Karsenty, G. (2000) The osteoblast: a sophisticated
fibroblast under central surveillance. Science 289: 1501-1504.
• El-Amin, S.F., Lu, H.H., Khan, Y., Burems, S.J., Mitchell, J., Tuan, R.S. &
Laurencin, C.T. (2003) Extracellular matrix production by human osteoblasts
cultured on biodegradable polymers applicable for tissue engeneering.
Biomaterials 24: 1213-1221.
• Eppley, B.L. & Reilly, M. (1997) Degradation characteristics of PLLA-PGA
bone fixation devices. The Journal of Craniofacial Surgery 8: 116-120.
• Ferretti, C. & Reyneke, J.P. (2002) Mandibular sagittal split osteotomies fixed
with biodegradable or titanium screws: a prospective, comparative study of
postoperative stability. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Patholology, Oral
Radiology, and Endodontics 93: 534-537.
• Gotfredsen, K., Warrer, K., Hjorting-Hansen & Karring, T. (1991) Effect of
membranes and hydroxyapatite on healing in bone defects around titanium
implants: an experimental study in monkeys. Clinical Oral Implants Research
2: 172-178.
• Gungormus, M. (2004) The effect on osteogenisis of type I collagen applied to
experimental bone defects. Dental Traumatology 20: 334-337.
69
• Hämmerle, C.H. & Lang, N.P. (2001) Single stage surgery combining
transmucosal implant placement with guided bone regeneration and
bioresorbable materials. Clinical Oral Implants Research 12: 9-18.
• Hasegawa, Y., Sakano, S., Iwase, T. & Warashina, H. (2002) The long-term
behavior of poly-L-lactice screws in a minipig fracture model: preliminary
report. Journal of Biomedical Materials Research 63: 679-685.
• Holy, C.E., Fialkov, J.A., Davies, J.E. & Shoichet, M.S. (2003) Use of a
biomimetic strategy to engineer bone. Journal of Biomedical Materials
Research 65: 447-453.
• Imbronito, A.V., Scarano, A., Orsini, G., Piatelli, A.. & Arana-Chavez, V.E.
(2005) Ultrastructure of bone healing in defects grafted with a copolymer of
polylatic/polyglycolic acids. Journal of Biomedical Materials Research 74A:
215-221.
• Ishaug-Riley, S.L., Crane-Kruger, G.M., Yaszemski, M.J. & Mikos, A.G. (1998)
Three-dimensional culture of rat calvarial osteoblasts in porous biodegradable
polymers. Biomaterials 19: 1405-1412.
• Ivanoff,C.J., Sennerby, L. & Lekholm, U. (1996) Influence of mono-and
bicortical anchorage on the integration of titanium implants. A study in the
rabbit tibia. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 24: 229-
235.
• Jaffin, R.A. & Berman, C.L. (1991) The excessive loss of Branemark fixtures in
type IV bone: a 5-year analysis. Journal of Periodontology 62: 2-4.
• Khosla, S. (2001) Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology
142: 5050-5055.
• Klokkevold, P.R., Johnson, P., Dadgostari, S., Caputo, A., Davies, J.E. &
Nishimura, R.D. (2001) Early endosseous integration enhanced by dual acid
70
etching of titanium: a torque removal study in the rabbit. Clinical Oral Implants
Research 12: 350-357.
• Kon, T., Cho, T.J., Aizawa, T., Yamazaki, M., Nooh, N., Graves, D.,
Gerstenfeld, L.C. & Einhorn, T.A. (2001) Expression of osteoprotegerin,
receptor activator of NF-kB ligand (osteoprotegerin ligand) and related
proinflammatory cytokines during fracture healing. Journal of Bone and
Mineral Research 16: 1004-1014.
• Kong, Y.M., Kim, D.H., Kim, H.E., Heo, S.J. & Koak, J.Y. (2002)
Hydroxyapatite-based composite for dental implants: an in vivo removal torque
experiment. Journal of Biomedical Materials Research 63: 714-721.
• Kong, Y.Y., Yoshida, H., Sarosi, I., Tan, H.L., Timms, E., Capparelli, C.,
Morony, S., Oliveira-dos-Santos, A.J., Van, G., Itie, A., Khoo, W., Wakeham,
A., Dunstan, C.R., Lacey, D.L., Mak, T.W., Boyle, W.J. & Penninger, J.M.
(1999) OPG is a key regulator of osteoclastogenesis, lymphocyte development
and lymph-node organogenesis. Nature 397: 315-323.
• Leenslag, J.W., Pennings, A.J., Bos, R.R., Rozema, F.R. & Boering, G. (1987)
Resorbable materials of poly (L-lactide) VII. In vivo and in vitro degradation.
Biomaterials 8: 311-314.
• Lekholm, U., Wannfors, K., Isaksson, S. & Adielsson, B. (1999) Oral implants
in combination with bone grafts. A 3-year retrospective multicenter study using
the Branemark implant system. International Journal of Oral and Maxillofacial
Surgery 28: 181-187.
• Lieberman, J.R., Daluiski, A. & Einhorn, T.A. (2002) The role of growth factors
in the repair of bone. Biology and clinical aplications. The Journal of Bone and
Joint Surgery American Volume 84-A: 1032-1044.
71
• Lioubavina-Hack, n., Lang, N.P., Karring, T. (2006) Significance of primary
stability for osseointegration of dental implants. Clinical Oral Implants
Research 17: 244-250.
• Lo, H., Kadiyala, S., Guggino, S.E.& Leong, K.W. (1996) Poly (L-lactic acid)
foams with cell seeding and controlled-release capacity. Journal of Biomedical
Materials Research 30: 475-484.
• Lu, H.H., El-Amin, S.F., Scott, K.D. & Laurencin, C.T. (2003) Three
dimensional, bioactive, biodegradable, polymer-bioactive glass composite
scaffolds with improved mechanical properties support collagen synthesis and
mineralization of human osteoblast-like cells in vitro. Journal of Biomedical
Materials Research 64: 465-474.
• Luciano, R.M., Zavaglia, C.A.C., Duek, E.A.R. & Alberto-Rincon, M.C. (2003)
Synthesis and caracterization of poly (L-lactic acid) membranes: studies in
vivo and in vitro. Journal of Materials Science. Materials in Medicine 14: 87-94.
• Margonar, R., Sakakura, C.E., Holzhaussen, M., Pepato, M.T., Alba-Júnior,
R.C. & Marcantonio-Júnior, E. (2003) The influence of diabetes mellitus and
insulin therapy on biomechanical retention around dental implants: a study in
rabbits. Implant Dentistry 12: 333-339.
• Matsumoto, M.A., Nary-Filho, H., Padovan, L.E., Kawakami, R.Y. & Taveira,
L.A. (2005) Tissue response to poly-l-lactide acid-polyglycolic acid absorbable
screws in autogenous bone grafts: a histologic morphological analysis. Clinical
Oral Implants Research 16: 112-118.
• Mellonig, J. T.,& Bowers, G. (1990) Regeneration bone in clinical periodontics.
Journal of the American Dental Association 121:497-502.
72
• Moriya, K., Maruo, Y. & Minagi, S. (2006) Does rotational strain at screw
tightening affect the attainment or maintenance of osseointegration? Clinical
Oral Implants Research 17: 451-458.
• Nagai, M., Hayakawa, T., Fukatsu, A., Yamamoto, M., Fukumoto, M.,
Nagahama, F., Mishima, H., Yoshinari, M., Nemoto, K. & Kato, T. (2002) In
vitro study of collagen coating of titanium implants for initial cell attachment.
Dental Materials Journal 21: 250-260.
• Nair, P.N.R. & Schug, J. (2004) Observations on healing of human tooth
extraction sockets implanted with bioabsorbable polylactic-polyglycolic acids
(PLGA) copolymer root replicas: a clinical, radiographic, and histologic follow-
up report of 8 cases. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral
Radiology, and Endodontics 97: 559-569.
• Nijweide, P.J., Burger, E.H. & Feyen, J.H.M. (1986) Cells of the bone:
proliferation, differentiation and hormonal regulation. Physiological Reviews.
66: 855-886.
• Nkenke, E., Hahn, M., Weinzierl, K.., Radespiel-Troger, M., Neukam, F.W.,
Engelke, K. (2003) Implant stability and histomorphometry: a correlation study
in human cadavers using stepped cylinder implants. Clinical Oral Implants
Research 14: 601-609.
• Ohsawa, K., Neo, M., Natsuoka, H., Akiyama, H., Ito, H., Kohno, H. &
Nakamura, T. (2000) The expression of bone matrix protein mRNAs around
beta-TCP particles implanted into bone. Journal of Biomedical Materials
Research 52: 460-466.
• Olsen, S., Fergusson, S.J., Sigrist, C., Fritz, W.R., Notte, L.P., Hallermann, W.
& Caversaccio, M. (2005) A novel computational method for real-time
73
preoperative assessment of primary dental implant stability. Clinical Oral
Implants Research 16: .53-59.
• Peltoniemi, H., Ashammakhi, N., Kontio, R., Waris, T., Salo, A., Lindqvist, C.,
Gratz, K. & Suuronen, R. (2002) The use of bioabsorbable fixation devices in
craniomaxillofacial surgery. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Patholog,y Oral
Radiololy, and Endodontics 94: 5-14.
• Piattelli, A., Podda, G. & Scarano, A. (1997) Clinical and histological results in
alveolar ridge enlargement using coralline calcium carbonate. Biomaterials 18:
623-627.
• Pietrzak, W.S., Sarver, D.R. & Verstynen, M.L. (1997) Bioabsorbable polymer
science for the practicing surgeon. Journal of Craniofacial Surgery 8: 87-91.
• Pilliar, R.M., Lee, J.M. & Maniatopoulos, C. (1986) Observations on the effect
of movement on bone ingrowth into porous-surfaced implants. Clinical
Orthopaedics and Related Research 208: 108-113.
• Quattlebaum, J., Mellonig, J.T. & Hansel, N. (1988) Antigenicity of freeze-dried
cortical bone allograft in human periodontal osseous defects. Journal of
Periodontology 59: 394-397.
• Raghoebar, G.M., Timmenga, N.M., Reintsema, H., Stegenga, B. & Vissink, A.
(2001) Maxillary bone grafting for insertion of endosseous implants: results
after 12-124 months. Clinical Oral Implants Research 12: 279-286.
• Rammelt, S., Neumann, M., Hanisch, U., Reinstorf, A., Pompe, W., Zwipp, H.
& Biewener, A. (2005) Osteocalcin enhances bone remodeling around
hydroxyapatite/collagen composites. Journal Biomedical Material Research
73A: 284-294.
74
• Rammelt, S., Schulze, E., Bernhardt, R., Hanisch, U., Scharnweber, D.,
Worch, H., Zwipp, H. & Biewener, A. (2004) Coating of titanium implants with
type I collagen. Journal of Orthopaedic Research 22: 1025-1034.
• Rimondini, L., Nicoli-Aldini, N., Fini, M., Guzzardella, G., Tschon, M. &
Giardino, R. (2005) In vivo experimental study on bone regeneration in critical
bone defects using a injetable biodegradable PLA/PGA copolymer. Oral
Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiololy, and Endodontics 99:
148-154.
• Roberts, W.E., Garetto, L.P. & Brezniak, N. (1996) Fisiologia e metabolismo
ósseos. In: Misch, C.E. Implante odontológico contemporâneo, p.329-355.
São Paulo: Pancast.
• Rogers, A. & Eastell, R. (2005) Circulating osteoprotegerin and receptor
activator for nuclear factor kB ligant: clinical utility in metabolic bone disease
assessment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 90: 6323-
6331.
• Rutheford, R.B., Samphat, T.K., Rueger, D.C. & Taylor, T.D. (1992) Use of
bovine osteogenic protein to promote rapid osseointegration of endosseous
dental implants. The International Journal of Oral and Maxillofacial Implants 7:
297-301.
• Saito, N., Okada, T., Horiuchi, H., Ota, H., Takahashi, J., Murakami, N.,
Nawata, M., Kojima, S., Nozaki, K. & Takaoka, K. (2003) Local bone formation
by injection of recombinat human bone morphogenetic protein-2 contained in
polymer carriers. Bone 32: 381-386.
• Sennerby, L., Thomsen, P. & Ericson, L.E. (1992) A morphometric and
biomechanic comparision of titanium implants inserted in rabbit cortical and
75
cancellous bone.The International Journal of Oral and Maxillofacial Implants 7:
62-71.
• Serino, G., Biancu, S., Tezzi, G. & Piatelli, A. (2003) Ridge preservation
following tooth extraction using a polylactide and polyglycolide sponge as
space filler: a clinical and histological study in humans. Clinical Oral Implants
Research 14: 651-658.
• Simonet, W.S., Lacey, D.L., Dunstan, C.R., Kelley, M., Chang, M.S., Luthy, R.,
Nguyen, H.Q., Wooden, S., Bennett, L., Boone, T., Shimamoto, G., DeRose,
M., Elliott, R., Colombero, A., Tan, H.L., Trail, G., Sullivan, J., Davy, E., Bucay,
N., Renshaw-Gegg, L., Hughes, T.M., Hill, D., Pattison, W., Campbell, P.,
Sander, S., Van, G., Tarpley, J., Derby, P., Lee, R. & Boyle, W.J. (1997)
Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone
density. Cell 89: 309-319.
• Sjöström, M., Lundgren, S., Nilson, H. & Sennerby, L. (2005) Monitoring of
implant stability in grafted bone using resonance frequency analysis. A clinical
study from implant placement to 6 months of loading. The International Journal
of Oral Maxillofacial Surgery 34: 45-51.
• Soballe, K., Hansen, E.S., B-Rasmussen, H., Jorgensen, P.H. & Bunger, C.
(1992) Tissue ingrowth into titanium and hydroxyapatite-coated implants
during stable and unstable mechanical conditions. Journal of Orthopaedic
Research 10: 285-299.
• Stejskal, D., Bartek, J., Pastorkova, R., Ruzicka, V., Oral, I. & Horalik, D.
(2001a) Osteoprotegerin, RANK, RANKL. Biomedical Papers of the Medical
Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czechoslovakia 145: 61-64.
76
• Stejskal, D., Zurek, M., Bartek, J., Jedelsky, L. & Ruzicka, V. (2001b)
Osteoprotegerin and bone density. Biomedical Papers of the Medical Faculty
of the University Palacky, Olomouc, Czechoslovakia 145: 75-76.
• Suda, T., Takahashi, N., Udagawa, N., Jimi, E., Gillespie, M.T. & Martin, T.J.
(1999) Modulation of osteoclast differentiation and function by the new
members of the tumor necrosis factor receptor and ligand families. Endocrine
Reviews 20: 345-357
• Szmukler-Moncler, S., Salama, H., Reingewirtz, Y. & Dubruille, J.H. (1998)
Timing of loading and effect of micro-motion on bone dental implant interface.
Journal of Biomedica Materials Research 43: 192-203.
• Thorwarth, M., Rupprecht, S., Falk, S., Felszeghy, E., Wiltfang, J. & Schlegel,
K.A. (2005) Expression of bone matrix proteins during de novo bone formation
using a bovine collagen and platelet-rich plasma (prp) - an
immunohistochemical analysis. Biomaterials 26: 2575-2584.
• Trejo, P.M., Weltman, R. & Cafesse, R. (2000) Treatment of intraosseous
defects with bioabsorbable barriers alone or in combination with decalcified
freeze-dried bone allograft: a randomized clinical trial. Journal of
Periodontology 71: 1852-1861.
• Woo, K.M., Choi, Y., Ko, S.-H., Oh, K.O. & Kim, K.K. (2002) Osteoprotegerin
is present on the membrane of osteoclasts isolated from mouse long bones.
Experimental and Molecular Medicine 34: 347-352.
77
78
Figura 1 - Grupo controle. Instalação
do implante de 2,6mm/3,0mm, sem
estabilidade primária no leito
receptor, preenchido com o coágulo
sanguíneo.
Figura 2 - Grupo tratado. Instalação
do implante de 2,6mm/3,0mm, sem
estabilidade primária no leito
receptor, preenchido com o
PLA/PGA.
Figura 3 - Tíbia direita. Período de
60 dias. Tecido ósseo neoformado
recobrindo o módulo de rebordo dos
implantes durante a reabertura.
Figura 4 - Período de 40 dias após a
reabertura da tíbia direita. Verifica-se
menor inclinação do implante do
grupo tratado (seta) quando
comparado ao controle.
79
0
5
10
15
20
25
40 60
Período (dias)
Média de torque (N.cm)
Controle
Tratado
Figura 5 – Representação gráfica de médias de torque reverso (colunas), em N.cm,
e de intervalos de 95% de confiança para as médias populacionais (barras verticais).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Cr Tr Cr Tr Cr Tr Cr Tr
OPG RANKL OC Colágeno
% de ocorrência
90
60
20
0
Figura 6 - Representação gráfica de % de ocorrências de médias percentuais de
marcações celulares para as proteínas analisadas, independentemente do período
de avaliação, para ambos os grupos.
80
Figura 7 - OPG – Grupo controle.
Período de 5 dias. Imunomarcações
positivas para osteócitos presentes na
cortical superior (setas) (DAB, original
de 160X).
Figura 8 - OPG – Grupo controle.
Período de 40 dias. Imunomarcação
desta proteína na cortical superior
(setas). Nota-se discreta redução na
expressão proteica (DAB, original de
63X).
Figura 10 - RANKL – Grupo tratado.
Período de 5 dias. Imunomarcações
positivas para linfócitos (setas) na
área medular (DAB, original de
160X).
Figura 9 – RANKL – Grupo controle.
Período de 40 dias.
Imunomarcações positivas para
osteócitos (setas) na cortical
superior, em maior quantidade
quando comparada à OPG (DAB,
original de 160X).
81
*
Figura 11 - RANKL – Grupo controle.
Período de 40 dias. Redução na
imunomarcação desta proteína na área
medular (setas) (DAB, original de 63X).
Figura 12 – OC - Grupo controle.
Período de 60 dias. Imunomarcação
desta proteína em osteócitos da cortical
superior (setas). Nota-se a marcação de
fundo (*) (DAB, original de 200X).
Figura 13 - COL-I – Grupo controle.
Período de 15 dias. Imunomarcação
significativa desta proteína na área
medular (original 160X).
Figura 14 - COL-I – Grupo controle.
Período 60 dias. Redução na
imunomarcação (setas) desta
proteína na área medular (DAB,
original de 200X).
Figura 15 – Corte evidenciando a
ausência de marcações inespecíficas na
cortical superior (controle negativo) (DAB,
original de 200X)
Figura 16 – RANKL – Grupo Controle. Período
de 5 dias. Imunomarcações positivas para
osteócitos na cortical inferior (controle positivo).
82
Figura 17 - Grupo controle. Período
de 5 dias. Presença de osteócitos
(setas) bem marcados na cortical
superior (HE, original de 200X).
Figura 18 - Grupo tratado. Período
de 15 dias. Presença de osteócitos
(setas) bem marcados na cortical
inferior (HE, original de 200X).
Figura 19 - Grupo tratado. Período de 60
dias. Neoformação óssea acompanhando
o formato das espiras (setas) do implante.
Notas-se a presença de inúmeros
osteócitos nas corticais (HE, original de
100X).
83
Figura 20 - Grupo tratado. Período de 60 dias. Implantes recobertos por tecido
ósseo neoformado (original de 1000X).
Figura 21 – Grupo controle. Período de 60 dias. Implantes recobertos por tecido
ósseo neoformado (original de 1000X).
84
Figura 23 - Grupo tratado. Período de 60 dias. Neoformação óssea no pico e
vale da rosca do implante (setas). Destaca-se a presença de tecido
conjuntivo, corado pelo azul de Stevenel, em contato com a superfície do
implante (Vermelho de alizarina e azul de Stevenel , original de 400X).
Figura 22 – Grupo controle. Período de 60 dias. Tecido ósseo neoformado
celularizado (setas), corado pelo vermelho de alizarina, em contato com a
superfície do implante na área do módulo de rebordo (Vermelho de alizarina e
azul de Stevenel
,
ori
g
inal de 400X
)
.
85
*
*
*
*
*
Figura 24 - Grupo tratado. Período de 60 dias. Neoformação óssea em contato
com a superfície do implante no módulo de rebordo e presença de osteócitos
(setas). Nota-se presença de tecido conjuntivo nessa interface (Vermelho de
alizarina e azul de Stevenel
,
ori
g
inal de 400X
)
.
Figura 25 - Grupo tratado. Período de 60 dias. Presença de tecido conjuntivo
com inúmeros osteoblastos (setas) na área medular, envolto pelo
remanescente do PLA/PGA (*) (Vermelho de alizarina e azul de Stevenel,
original de 400X).
86
87
Estatística Período (dias)
40 60
Controle Tratado Controle Tratado
1 11 10 22 16
2 10 11 11 11
3 8 12 10 22
4 10 12 16 12
5 12 11 8 18
Média 10,2 11,2 13,4 15,8
Desvio padrão 1,5 0,8 5,6 4,5
Período Proteína
5 15 40 60
OPG 0,787 0,138 0,068 0,109
RANKL 0,208 0,201 0,593 0,173
OC 0,593 0,138 0,109 1,000
COL-I 0,109 0,178 0,593 0,116
Tabela 1 – Valores, médias e desvios-padrão de torque-reverso, em N.cm, para os
grupos em estudo de acordo com o período de avaliação.
Tabela 2 - Valores-p do teste de Wilcoxon para a comparação entre os grupos
controle e tratado nos períodos de avaliação para cada proteína.
88
Tabela 3 - Freqüências de médias percentuais de expressão das proteínas, de
acordo com o período de avaliação para os grupos: controle e tratado.
Proteína M(%) Controle Tratado
Período (dias) K-W
*
Período (dias) K-W
*
5 15 40 60 5 15 40 60
OPG 0 4 0 4 2 5 1 7 5
20 6 5 4 12 5 7 2 9
60 2 3 1 1 2 1 0 1
90 0 1 0 0 0 0 0 0
Total 12 9 9 15 0,05
**
12 9 9 15 0,05
**
RANKL 0 4 2 3 3 3 1 3 6
20 4 4 3 6 3 3 2 5
60 4 3 3 6 5 5 4 4
90 0 0 0 0 1 0 0 0
Total 12 9 9 15 0,91 12 9 9 15 0,38
OC 0 1 1 5 5 1 3 3 5
20 9 4 4 7 8 5 5 7
60 2 4 0 3 3 1 1 3
90 0 0 0 0 0 0 0 0
Total 12 9 9 15 0,04
**
12 9 9 15 0,46
COL-I 0 3 3 7 2 6 6 6 5
20 9 5 2 12 6 3 3 10
60 0 1 0 1 0 0 0 0
90 0 0 0 0 0 0 0 0
Total 12 9 9 15 0,02
**
12 9 9 15 0,31
0,59 0,18 0,15 0,48 0,42 0,02
**
0,06 0,89
* valores p do teste de Kruskal-Wallis
** significativo ao nível de 5%
Teste de Kruskal-Wallis: H ( 3, N= 36) =11,37403 p =,0199
K-W= 0.020
Código N válido
Soma dos
Postos
Média dos Postos
OPG 2 9 182.5 20.3
RANKL 6 9 232.5
25.8
OC 10 9 153.5 17.1
COL-I 14 9 97.5
10.8
Tabela 4 – Valores dos postos médios do teste de Kruskal-Wallis para as proteínas
analisadas no período de 15 dias, para o grupo tratado.
89
Teste de Kruskal-Wallis: H ( 3, N= 36) =4,917252 p =,1780
K-W= 0.178
Código N Válido Soma dos Média dos
Postos Postos
OPG 2 9 203.5 22.6
RANKL 6 9 159.0
17.7
OC 10 9 185.5 20.6
COL-I 14 9 118.0
13.1
Médias
Grupos
Tecido ósseo Pré-osso
Controle 35,14% 64,86%
Tratado 20,66% 79.34%
Tabela 5 - Valores dos postos médios do teste de Kruskall-Wallis para as proteínas
analisadas no período de 15 dias, para o grupo controle.
Tabela 6 – Valores percentuais das médias de extensão linear de contato entre
tecido ósseo/implante e entre pré-osso/implante para os grupos controle e
tratado.
90
91
Certificado do Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA)
92
Normas da Revista Clinical Oral Implants Research, selecionada para a
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st
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online submission site: http://mc.manuscriptcentral.com/coir
complete instructions for preparing and submitting manuscripts online are provided at
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Authors are notified promptly by e-mail that their manuscripts have been received. If
this acknowledgement is not received within a week or so then authors should
enquire at the editorial office: Editorial Assistant Ms. Brigitte Baur:
Manuscripts - The author is responsible for all statements made in the work,
including changes made by the copy editor, which must be reviewed in proof.
Manuscripts must be written in English. Articles should not normally exceed 10
printed pages, including illustrations and references. One printed page is the
equivalent of 3.8 typed double-spaced pages using a 12-pitch font (12 characters per
inch). Additional pages will be charged to the author(s) at the rate of DKK 800 per
page. The author must list 5 appropriate key words for indexing purposes. The Online
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can be manually added.
The article should be clearly divided as follows:
95
Abstract - An abstract should not to exceed 250 words. This should be structured
into: objectives - material and methods - results - conclusions, and no other
information.
Introduction - Summarise the rationale and purpose of the study, giving only strictly
pertinent references. Do not review existing literature extensively. State clearly the
working hypothesis.
Material and methods - Material and methods should be presented in sufficient
detail to allow confirmation of the observations. Published methods should be
referenced and discussed only briefly, unless modifications have been made.
Indicate the statistical methods used, if applicable.
Results - Present your results in a logical sequence in the text, tables, and
illustrations. Do not repeat in the text all data in the tables and illustrations. The
important observations should be emphasised.
Discussion - Summarise the findings without repeating in detail the data given in the
Results section. Relate your observations to other relevant studies and point out the
implications of the findings and their limitations. Cite other relevant studies.
Acknowledgements - Acknowledge persons who have made substantive
contributions to the study. Authors are responsible for obtaining written permission
from everyone acknowledged by name because readers may infer their endorsement
of the data and conclusions. Sources of financial support may be acknowledged.
Short communications -Short communications, limited to two printed pages
including illustrations and references, will be considered for rapid publication. Such
papers must be based on work that is of special importance or has the potential for
96
great impact. Short communications need not follow the usual division into Material
and methods, etc., but should have an abstract.
References - in the text should quote the last name(s) of the author(s) and the year
of publication (Black & Miller 1988). Three or more authors should always be referred
to as, for example, (Fox et al. 1977).
A list of references should be given at the end of the paper and should follow the
recommendations in Units, symbols and abbreviations: a guide for biological and
medical editors and authors (1988), p. 52, London: The Royal Society of Medicine.
a) The arrangement of the references should be alphabetical by author's surname.
b) The order of the items in each reference should be:
(i) for journal references:
name(s) of author(s), year, title of paper, title of journal, volume number, first and last
page numbers.
(ii) for book references:
name(s) of author(s), year, title of book, edition, volume, chapter and/ or page
number, town of publication, publisher.
c) Author's names should be arranged thus:
Daniels, J.A., Kelly, R.A. & Til, T.C.
Note the use of the ampersand and omission of comma before it. Author's names
when repeated in the next reference are always spelled out in full.
d) The year of publication should be surrounded by parentheses: (1966).
c) The title of the paper should be included, without quotation marks.
97
f) The journal title should be written in full, italicised (single underlining on typescript),
and followed by volume number in bold type (double underlining on typescript), and
page numbers.
Examples - Tonetti, M. S., Schmid, J., Hämmerle,C. H. & Lang, N. P. (1993)
Intraepithelial antigen-presenting cells in the keratinized mucosa around teeth and
osseointegrated implants. Clinical Oral Implants Research 4: 177-186.
Poole, B., Ohkuma, S. & Warburton, M. (1978)Some aspects of the intracellular
breakdown of erogenous and endogenous proteins. In: Segal, H.S. & Doyle, D.J.,
eds. Protein turnover and lysosome function, 1st edition, p. 43. New York:
AcademicPress.
Illustrations - All figures should clarify the text and their number should be kept to a
minimum. Details must be large enough to retain their clarity after reduction in size.
Illustrations should preferably fill a single-column width (81 mm) after reduction,
although in exceptional cases 120mm (double-column) and 168 mm (full page)
widths will be accepted. Micrographs should be designed to be reproduced without
reduction, and they should be dressed directly on the micrograph with a linear size
scale, arrows, and other designators as needed.
Line drawings should be professionally drawn; halftones should exhibit high contrast.
Colour illustrations in small numbers may be accepted free of charge to the authors
at the discretion of the Editor. Otherwise the author must pay for the illustrations at a
rate to be quoted by the publisher. To download a Colour Work agreement form, go
to: http://www.blackwellpublishing.com/pdf/SN_Sub2000_X_CoW.pdf
Please find the Electronic Artwork Guidelines on the Blackwell Publishing Author
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98
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Tables - Tables should be numbered consecutively with Arabic numerals. Type each
table on a separate sheet, with titles making them self-explanatory. Due regard
should be given to the proportions of the printed page.
Scientific names - Proper names of bacteria should be binomial and should be
singly underlined on the typescript. The full proper name (e.g., Streptococcus
sanguis) must be given upon first mention. The generic name may be abbreviated
thereafter with the first letter of the genus (e.g., S. sanguis). If abbreviation of the
generic name could cause confusion, the full name should be used. If the vernacular
form of a genus name (e.g., streptococci) is used, the first letter of the vernacular
name is not capitalised and the name is not underlined. Use of two letters of the
genus (e.g., Ps. for Peptostreptococcus) is incorrect, even though it might avoid
ambiguity. With regard to drugs, generic names should be used instead of proprietary
names. If a proprietary name is used, it must be attached when the term is first used.
Abbreviations and symbols - The symbol % is to be used for percent, h for hour,
min for minute, and s for second. In vitro, in vivo, in situ and other Latin expressions
are to be italicised. Use only standard abbreviations. All units will be metric. Use no
roman numerals in the text. In decimals, a decimal point and not a comma will be
used. Avoid abbreviations in the title. The full term for which an abbreviation stands
should precede its first use in the text unless it is a standard unit of measurement. In
cases of doubt, the spelling orthodoxy of Webster's third new international dictionary
will be adhered to.
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101
Protocolo de reação imunoistoquímica em tecido ósseo
Após descalcificação das peças em EDTA à 5% (pH 7,0 por um período de 3
meses) e crioproteção em solução de sacarose 30% (Merck), por 3 dias, mantido em
geladeira. Este processo possibilita a penetração homogênea da solução de
sacarose nos tecidos, impedindo a formação de bolhas de ar no interior da peça,
que causaria danos aos tecidos durante a microtomia.
A microtomia foi realizada em criostato (Mícron, Zeiss). As peça foram fixadas
em suporte metálico e incluídas em TissueTek®. Foram obtidos cortes longitudinais
com 16µm de espessura.
O protocolo padronizado incluiu as seguintes etapas:
1. Lavagem das lâminas com PBS em 3 séries de 10 minutos cada;
2. Inibição da peroxidase endógena utilizando 500µl de água oxigenada (H
2
O
2,
Merck) a 30% em 50 ml de PBS, por 30 minutos, sob agitação, à temperatura
ambiente;
3. Lavagem das lâminas com PBS em 3 séries de 10 minutos cada;
4. Bloqueio das reações inespecíficas utilizando soro normal de burro a 5%
(017000121) diluído em loaded 0,3% (PBS + Tritton X-100 0,3%), por 60
minutos, em repouso, a temperatura ambiente;
5. Lavagem das lâminas com PBS por 5 minutos;
6. Incubação do anticorpo primário na concentração de 1:100 para OPG, OC,
colágeno I e RANKL, por 14 horas, em câmara úmida, à temperatura
ambiente (figuras 16 e 17)
7. Lavagem das lâminas com PBS em 3 séries de 10 minutos cada;
102
8. Incubação do anticorpo secundário Donkey α-goat na concentração de 1:200,
por 60 minutos, em repouso e em meio úmido, à temperatura ambiente ;
9. Lavagem das lâminas com PBS em 3 séries de 10 minutos cada;
10. Incubação do complexo avidina-biotina (Kit ABC- Vectastain Elite ABC –
Peroxidase Standard, reagent A and B only – PK6100 – Vector Laboratories)
utilizando 10µl da solução A e 10µl da solução B, diluídos em 980 µl de PBS,
por 60 minutos, em repouso e em meio úmido, à temperatura ambiente, para
amplificação do sinal da reação;
11. Lavagem das lâminas com PBS em 3 séries de 10 minutos cada;
12. Revelação da reação utilizando 5mg de Diaminobenzidina (DAB- Sigma, St.
Louis, MO, EUA) como cromógeno, diluída em 30 mL de PBS e ativados com
5 µl de H
2
O
2.
A revelação é controlada macro (figura 18) e
microscopicamente.
Após o término da reação, as lâminas permaneceram à temperatura ambiente
e, após secagem completa por aproximadamente 24 horas, os cortes foram imersos
em xilol e as lâminas montadas com lamínulas utilizando permount como meio de
montagem.
103
Complementação das tabelas e gráficos das Análises Estatísticas.
Análise Biomecânica
Tabela 7 do teste estatístico Análise de Variância (ANOVA) com a correção
de Welch, indicada quando a suposição de homogeneidade de variâncias não se
verifica. A normalidade dos resíduos, outra condição da análise, não foi avaliada
devido à quantidade pequena de medidas. Entretanto, acompanhou-se a literatura
que tem comumente empregado este tipo de análise.
Tabela 7 - Análise de Variância dos valores de torque-reverso aplicada para a
comparação das médias, com a estatística de Welch.
Soma de
Quadrados df
Média de
Quadrados F p
Entre os
Grupos 92.950 3 30.983 2.257 0.121
Dentro de
Grupos 219.600 16 13.725
Total 312.550 19
Estatística df1 df2 p
Welch
2.334 3 7.7
0.153
Brown-Forsythe 2.257 3 8.5 0.155
104
0
5
10
15
20
25
Controle Tratado Controle Tratado
40 dias 60 dias
Torque (N.cm)
Figura 26 - Medidas de torque-reverso para os grupos controle e tratado, nos
períodos de 40 e 60 dias. Não houve correlação entre os grupos analisados.
Análise Imunoistoquímica
Nas figuras 25 a 28 estão representadas graficamente as % de ocorrências
de médias percentuais de imunomarcações celulares para cada proteína, de acordo
com o período de avaliação, para os grupos: controle e tratado.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Cr Tr Cr Tr Cr Tr Cr Tr
5 15 40 60
Período (dias)
% de ocorrência
90
60
20
0
Figura 27 - Representação gráfica da % de ocorrência de médias percentuais de
imunomarcações celulares de acordo com os períodos de avaliação (5, 15, 40 e 60
dias) e com os grupos experimentais: Controle (Cr) e Tratado (Tr), relativas à
proteína OPG.
105
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Cr Tr Cr Tr Cr Tr Cr Tr
5 15 40 60
Período (dias)
% de ocorrência
90
60
20
0
Figura 28 - Representação gráfica da % de ocorrência de médias percentuais de
imunomarcações celulares de acordo com os períodos de avaliação (5, 15, 40 e 60
dias) e com os grupos experimentais: Controle (Cr) e Tratado (Tr), relativas à
proteína RANKL.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Cr Tr Cr Tr Cr Tr Cr Tr
5 15 40 60
Período (dias)
% de ocorrência
90
60
20
0
Figura 29 - Representação gráfica da % de ocorrência de médias percentuais de
imunomarcações celulares de acordo com os períodos de avaliação (5, 15, 40 e 60
dias) e com os grupos experimentais: Controle (Cr) e Tratado (Tr), relativas à
proteína OC.
106
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Cr Tr Cr Tr Cr Tr Cr Tr
5 15 40 60
Período (dias)
% de ocorrência
90
60
20
0
Figura 30 - Representação gráfica da % de ocorrência de médias percentuais de
imunomarcações celulares de acordo com os períodos de avaliação (5, 15, 40 e 60
dias) e com os grupos experimentais: Controle (Cr) e Tratado (Tr), relativas à
proteína COL-I.
Proteína Média (%) Controle Tratado
OPG 0 10 (22) 18 (40)
20 27 (60) 23 (51)
60 7 (16) 4 (9)
90 1 (2) 0 (0)
RANKL 0 12 (27) 13 (29)
20 17 (38) 13 (29)
60 16 (36) 18 (40)
90 0 (0) 1 (2)
OC 0 12 (27) 12 (27)
20 24 (53) 25 (56)
60 9 (20) 8 (18)
90 0 (0) 0 (0)
Colágeno 0 15 (33) 23 (51)
20 28 (62) 22 (49)
60 2 (4) 0 (0)
90 0 (0) 0 (0)
Tabela 8 - Freqüências absolutas e freqüências porcentuais (entre parênteses) de
médias (%) de imunomarcações celulares para cada proteína, independentemente do
período de avaliação, para os grupos: controle e tratado.
107
Entre proteínas no período de 5 dias
Teste de Kruskal-Wallis H ( 3, N= 48) =1,932222 p =,5866
K-W= 0.587
Código N Válido Soma dos Postos Média dos Postos
OPG 1 12 274.0 22.8
RANKL 5 12 310.0 25.8
OC 9 12 334.0 27.8
COL-I 13 12 258.0 21.5
Comparações múltiplas
OPG RANKL OC COL-I
OPG 1.000 1.000 1.000
RANKL 1.000 1.000 1.000
OC 1.000 1.000 1.000
COL-I 1.000 1.000 1.000
Entre proteínas no período de 15 dias
Teste de Kruskal-Wallis: H ( 3, N= 36) =4,917252 p =,1780
K-W= 0.178
Código N Válido Soma dos Postos Média dos Postos
OPG 2 9 203.5 22.6
RANKL 6 9 159.0 17.7
OC 10 9 185.5 20.6
COL-I 14 9 118.0 13.1
Comparações múltiplas
OPG RANKL OC COL-I
OPG 1.000 1.000 0.335
RANKL 1.000 1.000 1.000
OC 1.000 1.000 0.786
COL-I 0.335 1.000 0.786
Tabela 10 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas entre as
proteínas analisadas, para o período de 15 dias no grupo controle.
Tabela 9 – Teste estatístico de Kruskal-Wallis e compar ações múltiplas entre as
proteínas analisadas, para o período de 5 dias no grupo controle.
108
Entre proteínas no período de 40 dias
Teste de Kruskal-Wallis: H ( 3, N= 36) =5,352817 p =,1477
K-W= 0.148
Código N Válido Soma de Postos Média dos Postos
OPG 3 9 178.5 19.8
RANKL 7 9 211.5 23.5
OC 11 9 154.0 17.1
COL-I 15 9 122.0 13.6
Comparações múltiplas
OPG RANKL OC COL-I
OPG 1.000 1.000 1.000
RANKL 1.000 1.000 0.272
OC 1.000 1.000 1.000
COL-I 1.000 0.272 1.000
Entre proteínas no período de 60 dias
Teste de Kruskal-Wallis: H ( 3, N= 60) =2,485382 p =,4779
K-W= 0.478
Código N Válido Soma dos Postos Média dos Postos
OPG 4 15 440.0 29.3
RANKL 8 15 535.5 35.7
OC 12 15 414.5 27.6
COL-I 16 15 440.0 29.3
Comparações múltiplas
OPG RANKL OC COL-I
OPG 1.000 1.000 1.000
RANKL 1.000 1.000 1.000
OC 1.000 1.000 1.000
COL-I 1.000 1.000 1.000
Tabela 11 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas entre as
proteínas analisadas, para o período de 40 dias no grupo controle.
Tabela 12 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas entre as
proteínas analisadas, para o período de 60 dias no grupo controle.
109
Entre proteínas no período de 5 dias
Teste de Kruskal-Wallis: H ( 3, N= 48) =8,195050 p =,0421
K-W= 0.421
Código N Válido Soma dos Postos Média dos Postos
OPG 1 12 257.5 21.5
RANKL 5 12 364.0 30.3
OC 9 12 347.5 29.0
COL-I 13 12 207.0 17.3
Comparações múltiplas
OPG RANKL OC COL-I
OPG 0.723 1.000 1.000
RANKL 0.723 1.000 0.132
OC 1.000 1.000 0.243
COL-I 1.000 0.132 0.243
Entre proteínas no período de 15 dias
Teste de Kruskal-Wallis: H ( 3, N= 36) =11,37403 p =,0199
K-W= 0.020
Código N Válido Soma dos Postos Média dos Postos
OPG 2 9 182.5 20.3
RANKL 6 9 232.5 25.8
OC 10 9 153.5 17.1
COL-I 14 9 97.5 10.8
Comparações múltiplas
OPG RANKL OC COL-I
OPG 1.000 1.000 0.343
RANKL 1.000 0.463 0.015
OC 1.000 0.463 1.000
COL-I 0.343 0.015 1.000
Tabela 13 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas entre as
proteínas analisadas, para o período de 5 dias no grupo tratado.
Tabela 14 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas entre as
proteínas analisadas, para o período de 15 dias no grupo tratado. Note a diferença
estatisticamente significante entre as proteínas RANKL e COL-I, no teste de
comparações múltiplas.
110
Entre proteínas no período de 40 dias
Teste de Kruskal-Wallis: H ( 3, N= 36) =7,558244 p =,0561
K-W= 0.056
Código
N
Válido
Soma dos Postos Média dos Postos
OPG 3 9 121.0 13.4
RANKL 7 9 217.0 24.1
OC 11 9 191.5 21.3
COL-I 15 9 136.5 15.2
Comparações múltiplas
OPG RANKL OC COL-I
OPG 0.190 0.688 1.000
RANKL 0.190 1.000 0.430
OC 0.688 1.000 1.000
COL-I 1.000 0.430 1.000
Entre proteínas no período de 60 dias
Teste de Kruskal-Wallis: H ( 3, N= 60) =,6103448 p =,8941
K-W= 0.894
Código
N
Válido
Soma dos Postos Média dos Postos
OPG 4 15 444.5 29.6
RANKL 8 15 477.0 31.8
OC 12 15 483.5 32.2
COL-I 16 15 425.0 28.3
Comparações múltiplas
OPG RANKL OC COL-I
OPG 1.000 1.000 1.000
RANKL 1.000 1.000 1.000
OC 1.000 1.000 1.000
COL-I 1.000 1.000 1.000
Tabela 15 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas entre as
proteínas analisadas, para o período de 40 dias no grupo tratado.
Tabela 16 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis e comparações múltiplas entre as
p
roteínas analisadas
,
p
ara o
p
eríodo de 60 dias no
g
ru
p
o tratado.
111
Ilustração do Procedimento cirúrgico
Figura 31 – Incisão nos planos dérmico
e muscular de aproximadamente 3 cm
de comprimento, na porção medial da
tíbia direita.
Figura 32 - Incisão periostal na
porção medial da tíbia direita.
Figura 33 – Leito receptor dos
implantes, após descolamento em
espessura total.
Figura 34 – Fresas utilizadas na
confecção dos defeitos ósseos
(Conexão, SP, Brasil).
Figura 35 – Início do preparo do leito
receptor do implante com a fresa
lança. Primeiro defeito.
Figura 36 – Preparo seqüencial do
leito receptor com a fresa helicoidal
de 2,0mm. Primeiro defeito.
112
Figura 37 – Preparo seqüencial do
leito receptor com a fresa piloto de
2,0mm/3,0mm. Primeiro defeito.
Figura 38 - Finalização do preparo
do leito receptor com a fresa
helicoidal de 3,0mm. Primeiro
defeito.
Figura 39 - Início do preparo do
leito receptor do implante com a
fresa lança. Segundo defeito.
Figura 40 - Preparo seqüencial do
leito receptor com a fresa helicoidal
de 2,0mm. Segundo defeito.
Figura 41 - Preparo seqüencial do
leito receptor com a fresa piloto de
2,0mm/3,0mm. Segundo defeito.
Figura 42 - Finalização do preparo
do leito receptor com a fresa
helicoidal de 3,0mm. Segundo
defeito.
113
Figura 43 – Leito receptor dos
implantes após a confecção dos
dois defeitos ósseos.
Figura 44 – Instalação do implante
sem estabilidade primária. Defeito
preenchido com o coágulo sanguíneo.
Figura 45 – Leito receptor após a
instalação do implante do grupo
controle.
Figura 46 – Preenchimento do
segundo defeito com PLA/PGA,
previamente à instalação do implante.
Figura 47 - Instalação do implante
envolto com PLA/PGA, sem
estabilidade primária.
Figura 48 – Leito receptor após a
instalação dos implantes.
114
Ilustração da Análise Biomecânica
Figura 49 - Período de 15 dias. Leito receptor
dos implantes, após reabertura. O módulo de
rebordo dos implantes encontra-se
p
arcialmente coberto
p
or tecido ósseo.
Figura 52- Adaptação da chave intermediária
ao módulo de rebordo do implante, para a
realização do teste biomecânico.
Figura 51 - Ostectomia realizada para
exposição do módulo de rebordo do
implante, durante a análise biomecânica.
Figura 50 - Período de 60 dias. Leito receptor
dos implantes, após reabertura, O módulo de
rebordo encontra-se parcial ou totalmente
coberto por tecido ósseo neoformado.
Figura 53 - Torquímetro
analógico utilizado para os
testes biomecânicos.
115
Ilustração do Processamento Imunoistoquímico
Figura 54 - Cortes longitudinais obtidos
em criostato e montados em lâmina
gelatinizada para o processamento
imunoistoquímico.
Figura 55 - Incubação do anticorpo
primário, pipetando-o sobre os cortes.
Figura 56 - Colocação do Paraffilm
sobre os cortes para garantir um
adequado contato do anticorpo com os
tecidos durante a incubação.
Figura 57 - Revelação da reação
imunoistoquímica utilizando-se a DAB
como cromógeno. Detalhe do controle
macroscópico realizado.
116
Ilustração da Análise Imunoistoquímica
Cortical superior
Área medular
Cortical Inferior
Figura 58 - Extensão longitudinal do defeito ósseo, dividido em 3
partes. Exemplo da expressão de RANKL no grupo tratado, aos 5
dias. (DAB, original de 4X).
Figura 59 - Microscópio óptico
acoplado à câmera de captação de
imagens e conectado ao computador.
Figura 60 - Software analisador
de imagens IM50 exemplificando
captura no aumento de 40X.
117
Ilustração da Análise Histológica
Figura 62 - Grupo tratado. Período de
15 dias. Medular celularizada, com
áreas sugestivas da presença do
copolímero (*) e de formação de tecido
mesenquimal (HE, original de 160x).
Figura 61 - Grupo controle. Período
de 5 dias. Observa-se a presença
de células inflamatórias (setas) e a
formação de tecido mesenquimal
(*) (HE, original de 20X).
Figura 63 - Grupo controle. Período
de 15 dias. Nota-se início de
formação de tecido ósseo,
caminhando da cortical em direção à
medular (HE, original de 63X).
Figura 64 - Grupo controle. Período
de 60 dias. Tecido ósseo neoformado
acompanhando o negativo da rosca
do implante. Nota-se a presença de
inúmeros osteócitos (setas) (HE,
original de 400X).
*
*
*
*
118
Ilustração da MEV
Figuras 65 – 67 – MEV – Grupo tratado. Período de 40 dias. Observa-se osso
neoformado em contato com a superfície do implante (originais de 60X, 200X e
1000X, respectivamente).
Figuras 68 – 71 – MEV – Grupo tratado. Período de 60 dias. Observa-se osso
neoformado em contato com a superfície do implante em maior quantidade
quando comparado ao período de 40 dias (originais de 60X, 200X e 500X,
respectivamente).
119
Ilustração da Análise Histométrica
Figuras 72 – 73 - Grupo tratado. Período de 60 dias. Mensuração do perímetro
total do vale do implante por meio do Programa Imagelab 2000 e cálculo do
perímetro utilizando a ferramenta “cálculo de regiões”.
Figuras 74 – 75 - Grupo tratado. Período de 60 dias. Mensuração do perímetro de
tecido ósseo neoformado (corado pelo vermelho de alizarina) em contato com a
superfície do implante, na área do vale, por meio do Programa Imagelab 2000 e
cálculo do perímetro utilizando a ferramenta “cálculo de regiões”.
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