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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
TOXICOLÓGICA
EFEITO DOS CAROTENÓIDES LICOPENO E
ASTAXANTINA SOBRE DANOS RENAIS INDUZIDOS
POR CLORETO DE MERCÚRIO.
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Paula Rossini Augusti
Santa Maria, RS, Brasil
2007
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EFEITO DOS CAROTENÓIDES LICOPENO E ASTAXANTINA
SOBRE DANOS RENAIS INDUZIDOS POR CLORETO DE
MERCÚRIO.
por
Paula Rossini Augusti
Dissertação apresentada ao programa de pós-graduação em
bioquímica toxicológica, área de concentração em bioquímica
toxicológica, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS),
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Bioquímica Toxicológica.
Orientador: Profa. Dra. Tatiana Emanuelli
Santa Maria, RS, Brasil
2007
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Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Naturais e Exatas
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Dissertação de Mestrado
EFEITO DOS CAROTENÓIDES LICOPENO E ASTAXANTINA
SOBRE DANOS RENAIS INDUZIDOS POR CLORETO DE
MERCÚRIO.
elaborada por
Paula Rossini Augusti
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Bioquímica Toxicológica
COMISSÃO EXAMINADORA:
_________________________
Tatiana Emanuelli, Dra.
(Presidente/Orientador)
___________________________________
Vanderlei Folmer, Dr. (UNIPAMPA)
____________________________________
Ijoni Hilda Costabeber, Dra. (UFSM)
Santa Maria, 28 de fevereiro de 2007.
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AGRADECIMENTOS
Aos meus pais e irmãos, pelos valores, ensinamentos e apoio sempre
incondicional a todas as minhas decisões!
Ao meu namorado Paulo, por me amar, apoiar, compreender, compartilhar e
tornar sempre tudo mais fácil! Obrigada por sempre ter uma palavra carinhosa
quando precisei!
À minha orientadora Tatiana Emanuelli, pelos teus ensinamentos nestes
quase 6 anos de convivência... pelo carinho, amizade, compreensão e
paciência...por acreditar que eu era capaz, mesmo quando nem eu acreditava! Não
teria palavras para descrever quanto me influenciastes como profissional e como
pessoa...Muito obrigada!!!
À minha colega de faculdade que virou amiga, que virou colega de mestrado
e continuou amiga, minha co-orientadora e irmã Greicy... Obrigada por tratar minha
dissertação como se fosse tua, por revisar meus artigos, discutir resultados, e o mais
importante: por ser essa pessoa especial e amiga maravilhosa que és!! Essa
conquista também é tua!! Obrigada de coração!!
Aos meus amigos Valéria e Alexandre, que mesmo sem o contato do dia-a dia
estiveram presentes sempre que precisei, sendo por e-mail ou um simples
telefonema... Amigos como vocês fazem a diferença na minha vida!
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Aos amigos do NIDAL, inclusive os que já seguiram seus caminhos, por terem
contribuído de alguma maneira para minha formação profissional. Obrigada pela
convivência e amizade...
Aos professores do curso pelos ensinamentos que me foram passados e a
Angélica, secretária do curso, pelo atendimento e auxílio sempre prestados com boa
vontade e simpatia.
Às estagiárias, Lídia, Sabrina, Rocheli, Patrícia e Juliana, que tornaram
possível a realização desse trabalho. Não teria conseguido sem vocês!! Muito
obrigada!
Aos professores Vanderlei Folmer, Maria Rosa Schetinger e Ijoni Costabeber,
por aceitarem o convite para compor a banca examinadora desta dissertação.
Às professoras Marta Rocha e Dominguita Graça pelo auxílio nas análises
histopatológicas.
À professora Maribel Antonello Rubin, pela orientação durante a docência
orientada.
Aos funcionários do Biotério central, pelo fornecimento dos animais e auxílios
prestados.
A CAPES, pela bolsa concedida e a UFSM, por tornar possível o sonho da
graduação e pós-graduação em uma universidade pública e de qualidade.
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RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil
Efeito dos carotenóides licopeno e astaxantina sobre danos renais
induzidos por cloreto de mercúrio.
Autora: Paula Rossini Augusti
Orientadora: Tatiana Emanuelli
Data e Local de Defesa: Santa Maria, 28 de fevereiro de 2007
O mercúrio é um metal pesado com toxicidade comprovada, capaz de causar danos
em qualquer tecido com o qual tenha contato, sendo o rim o principal alvo para sua forma
inorgânica. O estresse oxidativo tem sido apontado como um importante mecanismo
molecular para a injúria renal induzida por mercúrio inorgânico e a interação desse metal
com moléculas contendo grupos sulfidrílicos, tais como a enzima δ-aminolevulinato
desidratase (δ-ALA-D), parece contribuir para esse processo. Licopeno e astaxantina são
carotenóides abundantes em tomates e em algas e frutos do mar, respectivamente. Ambos
têm sido amplamente estudados por suas propriedades antioxidantes. No presente estudo
foi avaliado o efeito do licopeno e da astaxantina sobre a toxicidade do HgCl
2
em rins de
ratos, utilizando-se como parâmetros a atividade das enzimas δ-ALA-D e glutationa S-
transferase (GST), quantidade de grupos sulfidrílicos não protéicos (NPSH), produção de
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), atividade das enzimas antioxidantes
superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH-Px) e catalase (CAT), além dos
níveis plasmáticos de creatinina e ácido úrico e análise histopatológica. Ratos Wistar adultos
receberam, por gavage, licopeno ou astaxantina nas doses de 0, 10, 25 ou 50 mg/kg, seis
horas antes de receberem uma injeção subcutânea de HgCl
2
(0 ou 5 mg/kg), resultando
assim, em 8 grupos experimentais. Após doze horas da exposição ao HgCl
2
, os animais
foram sacrificados. O HgCl
2
inibiu a δ-ALA-D renal, aumentou a produção de TBARS e
níveis plasmáticos de creatinina, além de causar necrose tubular. O licopeno preveniu a
inibição da δ-ALA-D e a peroxidação lipídica, mas não preveniu o aumento de creatinina no
plasma nem a ocorrência de necrose tubular induzidos pelo HgCl
2
. Embora a astaxantina
não tenha prevenido a inibição da δ-ALA-D e o aumento nos níveis plasmáticos de
creatinina, este carotenóide preveniu a ocorrência da peroxidação lipídica e atenuou a
necrose tubular causada pelo HgCl
2
.
As atividades das enzimas GSH-Px e CAT
aumentaram, enquanto a atividade da SOD diminuiu nos animais tratados com HgCl
2
e
esses efeitos foram prevenidos por algumas doses de licopeno e por todas as doses de
astaxantina avaliadas. Algumas doses de licopeno tiveram efeito negativo sobre as enzimas
antioxidantes per se e o mecanismo envolvido nessa resposta ainda não foi elucidado. O
tratamento com HgCl
2
ou carotenóides não alterou o conteúdo de NPSH ou a atividade da
GST no tecido renal, nem os níveis plasmáticos de ácido úrico. Os resultados indicam que
embora licopeno e astaxantina não tenham prevenido o aumento nos níveis plasmáticos de
creatinina induzido por HgCl
2,
as alterações nas enzimas antioxidantes podem ser limitadas
pelo uso destes carotenóides.
Palavras-chave: δ-aminolevulinato desidratase; enzimas antioxidantes; necrose
tubular; ratos; substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico.
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ABSTRACT
Master Dissertation
Post Graduate Course on Toxicological Biochemistry
Federal University of Santa Maria, RS, Brazil
Effect of lycopene and astaxanthin carotenoids on renal damage induced
by mercuric chloride.
Author: Paula Rossini Augusti
Adviser: Tatiana Emanuelli
Date and Place of the Defense: Santa Maria, February 28, 2007
Mercury is a heavy metal toxic for any living tissue, being kidneys the first target for the
inorganic form. Oxidative stress has been pointed as an important molecular mechanism for
kidney injury in inorganic mercury poisoning and the interaction of the metal with
endogenous thiol-containing molecules, such as δ-aminolevulinate desidratase (δ-ALA-D),
seems to contribute to this process. Lycopene and astaxanthin are plentiful carotenoids in
tomatoes and algaes and seafoods, respectively. They have been widely studied because of
their large antioxidant properties. This work evaluated the ability of lycopene and astaxanthin
to prevent HgCl
2
toxicity, assessing parameters like δ-ALA-D and glutathione S-transferase
(GST) activities, non-protein sulfhydrylic groups content (NPSH), production of thiobarbituric
acid reactive substances (TBARS) and activities of antioxidant enzymes like superoxide
dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), and catalase (CAT), besides creatinine
and uric acid plasma levels and histopathological analyses. Adult Wistar rats received
lycopene or astaxanthin, by gavage, on doses of 0, 10, 25, or 50 mg/kg, six hours prior to the
administration of 0 or 5 mg/kg HgCl
2
, yielding 8 experimental groups. After twelve hours of
exposure to HgCl
2
animals were killed. HgCl
2
inhibited renal δ-ALA-D activity and increased
TBARS levels in kidney and creatinine levels in plasma along with renal tubular necrosis.
Lycopene prevented HgCl
2
-induced inhibition of δ-ALA-D activity and increase of lipid
peroxidation in kidney, but not the increase in plasma creatinine levels or renal tubular
necrosis caused by HgCl
2
. Although astaxanthin have not prevented HgCl
2
-induced inhibition
of δ-ALA-D and increase in plasma creatinine levels, this carotenoid prevented lipid
peroxidation and attenuated renal tubular necrosis caused by HgCl
2
. GPx and CAT activities
were enhanced, while SOD activity was depressed, in mercury-treated rats when compared
to control and these effects were prevented by some lycopene doses and by all astaxanthin
doses evaluated. Some doses of lycopene negativelly affected antioxidant enzymes activities
per se and the mechanism involved in this response has not been elucidated yet. Neither
HgCl
2
nor carotenoids treatment changed the content of NPSH groups or GST activity in
kidney or uric acid levels in plasma. Our results indicate that although lycopene and
astaxanthin did not prevent HgCl
2
-induced creatinine increase in plasma, changes in the
activity of antioxidant enzymes might be limited by the use of these carotenoids.
Keywords: δ-aminolevulinate dehydratase; antioxidant enzymes; tubular necrosis; rats;
thiobarbituric acid reactive substances.
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Formação das espécies reativas de oxigênio, a partir do oxigênio
molecular, com sucessivas transferências de elétrons (Nordberg & Arnér, 2001).....21
FIGURA 2 - Esquema simplificado não estequiométrico dos sistemas oxidante e
antioxidante nas células (Nordberg & Arnér, 2001)..................................................22
FIGURA 3 - Estrutura química do licopeno (Agarwal & Rao, 2000).........................25
FIGURA 4 - Estrutura química da astaxantina (Goto et al., 2006)............................28
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LISTA DE ANEXOS
ANEXO A – Comprovante de aceite do manuscrito “Effect of lycopene on
nephrotoxicity induced by mercuric chloride” pela revista Basic & Clinical
Pharmacology & Toxicology......................................................................................95
ANEXO B – Comprovante de submissão do manuscrito “Effect of astaxanthin on
kidney function changes and oxidative stress induced by mercuric chloride in
rats” à Revista Food and Chemical Toxicology.................................................... ....97
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LISTA DE ABREVIATURAS
ALA − Ácido δ-aminolevulínico
δ-ALA-D − δ-Aminolevulinato desidratase
ANOVA − Análise de Variância
ASX − Astaxantina
CAT – Catalase
DNA – Ácido desoxirribonucléico
DTNB − Ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzóico
EDTA − Sal dissódico do ácido etilenodiamonotetraacético
EROs – Espécies reativas de oxigênio
GR − Glutationa redutase
GSH − Glutationa
GSH-Px – Glutationa peroxidase
GST- Glutationa S-transferase
Hg – Mercúrio
HgCl
2
– Cloreto de mercúrio
LD
50
– Dose letal 50
MDA − Malondialdeído
MeHg − Metilmercúrio
NADPH − Nicotinamida adenina dinucleotídeo
PBG − Porfobilinogênio
s. c. − Subcutânea; subcutaneamente
SEM − Erro padrão da média
SH − Grupo sulfidrila
SHNP – Grupos tiólicos não-protéicos
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SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS.................................................................................................3
RESUMO..................................................................................................................14
ABSTRACT..............................................................................................................15
LISTA DE ILUSTRAÇÕES.......................................................................................16
LISTA DE ANEXOS...................................................................................................8
LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................................9
APRESENTAÇÃO....................................................................................................13
1 INTRODUÇÃO......................................................................................................14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...............................................................................177
2.1 Mercúrio.......................................................................................................177
2.1.1 Aspecto e forma........................................................................................17
2.1.2 Ocorrência, uso e fontes de exposição.....................................................17
2.1.3 Absorção e distribuição.............................................................................19
2.1.4 Alterações bioquímicas.............................................................................19
2.1.5 Nefrotoxicidade.........................................................................................20
2.2 Estresse oxidativo e mercúrio.....................................................................21
2.3 Carotenóides.................................................................................................23
2.3.1 Licopeno.................................................................................................24
2.3.1.1 Ocorrência, estrutura química e metabolismo.................................24
2.3.1.2 Mecanismo de ação........................................................................25
2.3.1.3 Efeitos protetores............................................................................27
2.3.2 Astaxantina..............................................................................................28
2.3.2.1 Ocorrência e usos...........................................................................29
2.3.2.2 Estrutura química e metabolismo....................................................28
2.3.2.3 Propriedades...................................................................................29
2.3.2.4 Efeitos protetores............................................................................30
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3 RESULTADOS......................................................................................................31
3.1 Manuscrito 1....................................................................................................32
3.1 Manuscrito 2....................................................................................................54
4 DISCUSSÃO.........................................................................................................79
5 CONCLUSÕES......................................................................................................85
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................86
7 ANEXOS................................................................................................................95
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APRESENTAÇÃO
Os resultados que fazem parte desta dissertação são apresentados sob a
forma de manuscritos, os quais se encontram no item RESULTADOS. As seções
Materiais e Métodos, Resultados, Discussão dos Resultados e Referências
Bibliográficas, encontram-se nos próprios manuscritos e representam na íntegra este
estudo.
Os itens DISCUSSÃO E CONCLUSÃO, dispostos após os manuscritos,
contêm interpretações e comentários gerais referentes ao presente estudo e
relacionados aos manuscritos deste trabalho.
As REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS são relacionadas às citações que
aparecem nos itens INTRODUÇÃO, REVISÃO BIBLIOGRÁFICA e DISCUSSÃO
desta dissertação.
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14
1 INTRODUÇÃO
O mercúrio (Hg) é um metal pesado que tem sido reconhecido como um
perigoso poluente ambiental. A principal origem natural do mercúrio é o desgaste da
crosta terrestre, emissão por vulcões e evaporação oriunda do metabolismo de
organismos aquáticos (WHO, 1991). O mercúrio inorgânico é amplamente utilizado
em certos tipos de baterias e em termômetros, e continua sendo um componente
essencial de lâmpadas fluorescentes (Clarkson, 1997). A população em geral pode
ser exposta a esta forma de mercúrio através da água e alimentos contaminados,
bem como por amálgamas dentárias. Ainda, a presença dessa forma do metal em
conjunto com as demais, tem sido associada com a intoxicação humana em áreas
de mineração (Drasch et al., 2001). A forma mercúrica, cujo principal representante é
o cloreto de mercúrio (HgCl
2
), é alvo de inúmeras investigações porque, além de sua
toxicidade intrínseca, é atribuída a ela a toxicidade do mercúrio elementar e,
parcialmente, a do metilmercúrio, uma vez que, por oxidação e desmetilação,
respectivamente, ambas as formas são convertidas em Hg
+2
(Patrick et al., 2002).
Todas as formas de mercúrio são tóxicas, sendo que o mercúrio inorgânico
afeta primeiramente os rins, devido à alta afinidade entre mercúrio e enxofre, o que
leva a ligação desse metal a grupos tiólicos de proteínas, peptídeos e aminoácidos,
sendo observada necrose do epitélio renal, acompanhada de proteinúria e
glomerulonefrite (Goyer, 1996). Esta interação com grupos sulfidrílicos está
diretamente envolvida na captação, acúmulo, transporte e, consequentemente,
toxicidade do mercúrio (Zalups, 2000), o que resulta em alteração de atividades
enzimáticas como, por exemplo, da enzima delta-aminolevulinato desidratase (δ-
ALA-D), envolvida na via de formação do grupo heme da hemoglobina (Emanuelli et
al., 1996).
Além da inativação de enzimas sulfidrílicas, o mercúrio exerce efeitos tóxicos
nos rins por desencadear reações auto-imunes (Nielsen & Hultman, 2002), afetar a
comunicação celular mediada por junções do tipo GAP (Aleo et al., 2002) além de
causar danos oxidativos (Stohs & Bagchi, 1995; Zalups, 2000). Ao se ligar aos
grupos sulfidrílicos de proteínas, o Hg diminui os níveis de glutationa, o que pode
contribuir para o aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, como ânion
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15
superóxido, peróxido de hidrogênio e radical hidroxil. Esses, por sua vez, podem
aumentar a lipoperoxidação (Stohs & Bagchi, 1995).
O tratamento utilizado em intoxicações com mercúrio consiste na remoção da
fonte de exposição e utilização de agentes quelantes, tais como dimercaprol, ácido
etilenodiaminotetra acético, D-penicilamina, ácido meso 2,3-dimercaptosuccínico e
2,3-dimercapto-1-propanosulfonato de sódio (Risher & Amler, 2005). No entanto,
existem relatos de alguns desses agentes podem promover redistribuição do metal
no organismo aumentando a sua concentração no sistema nervoso (Emanuelli et al.,
1996). Também tem sido relatado que o tratamento com quelantes pode eliminar
minerais essenciais e provocar outros efeitos adversos (Risher & Amler, 2005).
Considerando que muitos dos efeitos tóxicos induzidos pelo mercúrio estão
relacionados a danos oxidativos e complexação com tióis endógenos, tem sido
sugerido que antioxidantes poderiam auxiliar no tratamento de intoxicações com
mercúrio (Patrick, 2002).
Os carotenóides são pigmentos naturais, sintetizados por plantas e
microrganismos, conhecidos por suas propriedades antioxidantes. Muitos estudos
têm demonstrado o papel dos carotenóides na prevenção de doenças
cardiovasculares e câncer (Davison et al., 1993; Agarwal & Rao, 2000), mas poucos
estudos revelam o papel protetor destes frente a injúrias causadas por metais. El-
Missiry & Shalaby (2000) relataram efeito protetor do β-caroteno sobre danos
oxidativos induzidos por cádmio no cérebro e testículos, enquanto que os resultados
de Andersen & Andersen (1993) sugerem que esse mesmo carotenóide não foi
capaz de proteger danos causados por metilmercúrio em vários órgãos.
O licopeno, um carotenóide abundante no tomate e em produtos derivados,
tem sido apontado como importante na prevenção do câncer de próstata e outros
cânceres, doenças coronárias como aterosclerose, degeneração da mácula
associada à idade e esclerose múltipla. Tais ações preventivas são relacionadas à
proteção contra danos oxidativos (Mortensen et al., 2001) e ao estímulo da
comunicação celular mediada por junções do tipo GAP (Zhang et al., 1991). Entre as
várias estratégias de defesa, o licopeno está envolvido na detoxificação de duas das
principais espécies reativas de oxigênio: o oxigênio singlete (
1
O
2
) e o radical peroxil
(Stahl & Sies, 2003). Foi relatado o efeito protetor desse carotenóide contra danos
oxidativos induzidos por cisplatina em rim e em testículos, além de proteger contra
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16
alterações nas características do esperma de ratos (Atessahin et al., 2005;
Atessahin et al., 2006a, b), e ainda contra danos oxidativos induzidos por ferro em
intestino de ratos (Reifen et al., 2004).
A astaxantina é um carotenóide de ocorrência natural em várias plantas, algas
e frutos do mar e, assim como o licopeno, apresenta atividade antioxidante. Devido
a sua estrutura lipofílica, a astaxantina exerce suas propriedades antioxidantes em
membranas celulares ricas em lipídios (Kurashige et al., 1990). De acordo com Miki
(1991), ratos privados de vitamina E na dieta, apresentaram redução da resistência
à oxidação lipídica, a qual foi restaurada por uma dieta rica em astaxantina. Além
disso, a astaxantina apresentou efeito protetor contra danos induzidos por íons
cálcio (Wu et al., 2006), além de atividade antidiabetes, antihipertensiva,
neuroprotetora e antiapoptótica (Naito et al., 2004; Hussein et al., 2005; Gross et al.,
2006). De acordo com Barros et al. (2001), a astaxantina foi eficiente em inibir
peroxidação de lipossomas induzida por H
2
O
2
e ferro, apresentando poder
antioxidante superior ao β-caroteno, porém inferior ao licopeno. Naguib et al. (2000)
relataram que esse carotenóide possui atividade antioxidante 100-500 vezes maior
que o α-tocoferol.
O presente estudo teve como objetivo investigar o efeito do pré-tratamento
com os carotenóides licopeno e astaxantina sobre danos renais induzidos pela
administração de cloreto de mercúrio em ratos. Os danos renais foram avaliados
através da determinação da atividade das enzimas δ-ALA-D e GST, níveis de grupos
sulfidrílicos não-protéicos e análise histológica, além dos níveis plasmáticos de
creatinina e ácido úrico. Também foram avaliados, como indicadores de estresse
oxidativo no tecido renal, níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS) e atividade das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase, superóxido
dismutase e catalase
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17
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Mercúrio
O mercúrio é um elemento químico que não possui função biológica no
organismo e causa efeitos deletérios sendo, por essa razão, classificado como metal
tóxico (Klaassen, 1996). Por tratar-se de um agente potencialmente tóxico, é preciso
minimizar ao máximo seu emprego em qualquer tipo de atividade.
3.1.1 Aspecto e forma
O mercúrio (Hg) é um metal pesado de aspecto inodoro, argênteo,
pertencente à família química dos metais do grupo IIb da tabela periódica,
juntamente com cádmio e zinco. Normalmente é encontrado nas seguintes formas:
mercúrio metálico (Hg°), mercúrio (I) e mercúrio (II), nas quais os átomos perdem um
ou dois elétrons, respectivamente, formando o mercúrio mercuroso (Hg
2
++
) e o
mercúrio mercúrico (Hg
++
). Estes dois últimos formam diversos compostos orgânicos
e inorgânicos (Nascimento & Chasin, 2001). Os compostos mais importantes
formados são os sais cloreto de mercúrio HgCl
2,
um sublimado corrosivo muito
tóxico, cloreto mercuroso Hg
2
Cl
2
, ocasionalmente ainda usado na medicina e sulfeto
de mercúrio HgS utilizado como pigmento em tintas (HSDB, 2000). Os compostos
orgânicos de mercúrio são muito considerados sob o ponto de vista toxicológico. Os
que causam maior preocupação são os ligados aos radicais alquila de cadeia curta,
onde o mercúrio se liga aos grupos metila, etila e propila (WHO, 1989). Esses
compostos têm aparências e odores distintos, que variam de acordo com os radicais
alquilas aos quais estão ligados (Nascimento & Chasin, 2001).
2.1.2 Ocorrência, uso e fontes de exposição
O Hg raramente é encontrado como elemento livre na natureza. Encontra-se
amplamente distribuído por toda a crosta terrestre, porém em baixas concentrações
(Nascimento & Chasin, 2001). As fontes naturais mais significativas de mercúrio são
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18
a desgaste da crosta terrestre, as emissões de vulcões e a evaporação oriunda do
metabolismo de organismos aquáticos (WHO, 1991). Estas emissões são
responsáveis por 25.000 a 125.000 toneladas por ano, enquanto que a mineração
extrai cerca de 10.000 toneladas por ano. Indústrias de equipamentos elétricos, de
pinturas a base de mercuriais, além da queima de combustíveis fósseis, extração e
refino de ouro e fundição de minérios respondem por mais de 50% da emissão de
mercúrio na atmosfera (WHO, 1989; WHO, 1991). No Brasil, uma portaria da
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2001) proibiu a adição de
substâncias mercuriais a formulações farmacêuticas conhecidas, como o Merthiolate
e Mercúrio Cromo, utilizadas como desinfetantes tópicos.
O mercúrio é usado principalmente como catalisador na produção do cloro e
da soda cáustica. Este metal também é usado em baterias domésticas, lâmpadas
elétricas, incluindo lâmpadas fluorescentes, interruptores, explosivos, no tratamento
de minérios de ouro e prata e para refino de metais (Clarkson, 1997). Cerca de 200
formulações farmacêuticas contendo Hg estão aprovadas nos EUA, tendo como
usos principais, conservantes em soluções nasais, oftálmicas, vacinas e produtos
injetáveis. Entretanto, esse uso tende a diminuir com a substituição por outros
conservantes (FDA, 1997).
Devido aos inúmeros usos do mercúrio, as maiores fontes de exposição da
população em geral, a este metal são a dieta (Klaassen, 1996) e as amálgamas
dentárias (Lorscheider et al., 1995). A contaminação da água é de fundamental
importância, uma vez que o mercúrio inorgânico pode ser metilado por
microorganismos, originando o metilmercúrio. Essa forma orgânica de mercúrio é
absorvida rapidamente e é lentamente excretada pelos organismos, sendo
encontrada em altos níveis em organismos de origem aquática (WHO, 1991). Uma
vez dentro do organismo, o metilmercúrio é desmetilado até mercúrio inorgânico
(Patrick et al., 2002). Estes mesmos autores apontam o mercúrio inorgânico não
apenas como produto do metabolismo do metimercúrio, mas também do mercúrio
elementar, sendo apontado como a forma de mercúrio que causa toxicidade em
organismos expostos ao metilmercúrio e ao mercúrio elementar.
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19
2.1.3 Absorção e distribuição
O mercúrio metálico, devido a sua volatilidade e lipossolubilidade, é
preferencialmente absorvido pelos pulmões. A absorção do cloreto mercuroso e
mercúrico é baixa (Klaassen, 1996), porém o metilmercúrio é quase completamente
absorvido pelo trato gastrintestinal ou pela via pulmonar (WHO, 1991)
O transporte de mercúrio iônico é realizado pelo plasma, enquanto o mercúrio
elementar é transportado pelas hemáceas (Haeys, 1982). Nos eritrócitos e tecidos, o
mercúrio metálico é rapidamente oxidado ao íon Hg
+2
por ação da enzima catalase e
se fixa às proteínas (Magos et al., 1978). O mercúrio inorgânico, menos lipossolúvel,
concentra-se mais no plasma do que nos eritrócitos. O metilmercúrio também é
transportado pelas células vermelhas (95%) e, o restante, ligado às proteínas
plasmáticas (Nascimento & Chasin, 2001).
A distribuição do mercúrio nos tecidos depende da forma do metal a qual o
organismo foi exposto, além da espécie e idade do animal (Jugo, 1976). O mercúrio
inorgânico se acumula principalmente nos rins e fígado (Emanuelli et al., 1996;
Zalups, 2000), enquanto compostos organomercuriais atingem inicialmente o
cérebro, devido a sua lipossolubilidade e capacidade de cruzar a barreira
hematoencefálica (WHO, 1990).
2.1.4 Alterações bioquímicas
Todas as formas de mercúrio são tóxicas, devido à alta afinidade entre
mercúrio e enxofre, ocorrendo ligação entre o mercúrio e grupos tiólicos de
proteínas, peptídeos e aminoácidos. Essa interação com grupos sulfidrílicos de
proteínas, metalotioneínas, glutationa e cisteína está diretamente envolvida na
captação, acúmulo, transporte e conseqüentemente, toxicidade do mercúrio (Zalups,
2000). A indução de metalotioneína é o principal efeito intracelular do mercúrio
inorgânico divalente (Zalups, 2000). A interação com os grupos sulfidrílicos resulta
em alteração de atividades enzimáticas como, por exemplo, da enzima δ-ALA-D,
envolvida na via de formação do grupo heme da hemoglobina (Emanuelli, 1996),
além das enzimas sulfidrílicas aspartato aminotransferase e lactato desidrogenase
(Hill & Soares, 1984). As formas orgânicas e inorgânicas de mercúrio também
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20
exercem grande influência no metabolismo intracelular da glutationa (Zalups, 2000).
Muitos estudos in vivo e in vitro demonstram aumento intracelular nos níveis de
glutationa nas células tubulares renais após administração de doses baixas ou não
tóxicas de metilmercúrio (Woods et al., 1992) ou mercúrio inorgânico (Zalups, 1993).
Por outro lado, doses altas de mercúrio inorgânico diminuem o conteúdo de
glutationa nos rins (Zalups, 1993).
Além da inativação de enzimas sulfidrílicas, o mercúrio exerce efeitos tóxicos
nos rins por desencadear reações auto-imunes (Nielsen & Hultman, 2002), afetar a
comunicação celular mediada por junções do tipo GAP (Aleo et al., 2002) além de
causar danos oxidativos (Lund et al., 1993). Também tem sido observada necrose
do epitélio renal acompanhada de proteinúria e glomerulonefrite (WHO, 1991). A
exposição ao mercúrio pode afetar a reprodução, além de provocar efeitos
teratogênicos (Leonard et al., 1983) e embriotóxicos (Gale et al., 1984).
2.1.5 Nefrotoxicidade
Todas as formas de mercúrio são nefrotóxicas. Entretanto, o mercúrio
inorgânico é preferencialmente acumulado nos rins, causando falência renal
(Tanaka-Kagawa et al., 1998). Essa forma de mercúrio causa toxicidade aos rins
mais pronunciadamente em uma exposição aguda, enquanto compostos orgânicos
de mercúrio requeren múltiplas exposições e doses relativamente altas para causar
toxicidade aos rins (Zalups et al., 2000). A injúria renal induzida pelo mercúrio
inorgânico é completamente expressada durante as primeiras 24h de exposição ao
composto e pode ser induzida em ratos por uma única dose de 1,5 µmol/kg (Zalups
et al., 2000). A DL
50
para exposições humanas ao HgCl
2
foi estimada em 29 - 50
mg/kg (Clarkson, 1997).
Morfologicamente, o túbulo proximal é o segmento do néfron mais vulnerável
aos efeitos tóxicos das formas inorgânica e orgânica de mercúrio. Danos às células
epiteliais do túbulo próximas culminam com o cessamento da reabsorção de água e
solutos (Clarkson, 1997). Danos a essa porção do néfron podem ser observados 1
hora após exposição de ratos a uma dose muito alta de HgCl
2
. Exposição a doses
menores (1-5 mg/kg) de HgCl
2
, causa necrose celular ao longo do túbulo proximal,
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21
visível ao microscópio ótico após, no mínimo, 12 horas de exposição (Zalups et al.,
2000).
2.2 Estresse oxidativo e mercúrio
O estresse oxidativo é definido como o desequilíbrio entre fatores oxidantes e
antioxidantes, a favor dos oxidantes, prejudicando a integridade celular (Sies, 2000).
A utilização do oxigênio pelos organismos aeróbios gera metabólitos reativos,
mesmo em condições fisiológicas normais. Espécies reativas de oxigênio (EROs)
são formadas e degradadas por organismos aeróbicos, sendo sua formação
conduzida a concentrações fisiológicas, requeridas para a função celular normal, ou
quantidades excessivas que levam ao aumento do estresse oxidativo (Nordberg &
Arnér, 2001). As EROs incluem um grande número de moléculas quimicamente
reativas e derivadas do oxigênio, como exemplo o ânion radical superóxido (O
2
.-
),
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e o radical hidroxil (
.
OH). As moléculas anteriormente
citadas e seu mecanismo de formação estão ilustrados na Figura 1
Figura 1 - Formação das espécies reativas de oxigênio, a partir do oxigênio molecular, com
sucessivas transferências de elétrons (Nordberg & Arnér, 2001).
A produção das estruturas químicas intermediárias no metabolismo do
oxigênio ameaça a integridade de várias biomoléculas como proteínas (Stadtman &
Levine, 2000), lipídios e lipoproteínas (Ames et al., 1993), e ácido
desoxirribonucléico (DNA) (Ames et al., 1993).
As enzimas antioxidantes protegem as células aeróbicas e demais estruturas
corporais de injúrias oxidativas causadas por EROs, geradas durante o metabolismo
normal (Fridovich, 1978). Dentre elas estão superóxido dismutase (SOD), catalase
(CAT) e glutationa peroxidase (GPx). A SOD exerce efeito protetor por detoxificar o
ânion radical superóxido (O
2
.-
), num processo de dismutação, produzindo peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
), que pode ser reduzido por ação das enzimas CAT e GPx,
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22
formando água e liberando oxigênio (Ames et al., 1993; Nordberg & Arner, 2001)
(Figura 2).
Figura 2 - Esquema simplificado não estequiométrico dos sistemas oxidante e antioxidante nas
células (Nordberg & Arnér, 2001).
A produção de radicais livres e o estresse oxidativo têm sido apontados como
causa da injúria renal causada por mercúrio (Stohs & Bagchi, 1995; Zalups, 2000).
Ao se ligar aos grupos sulfidrílicos, o Hg diminui os níveis de glutationa, o que pode
contribuir para o aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, como ânion
superóxido, peróxido de hidrogênio e radical hidroxil (Stohs & Bagchi, 1995).
Conseqüentemente, há um aumento na peroxidação lipídica, danos ao DNA e
alteração da homeostase de cálcio e de grupos sulfidrílicos. (Elia et al., 2003).
De acordo com El Demerdash (2001), a exposição ao mercúrio induziu
peroxidação lipídica renal e hepática, enquanto Girardi & Elias (1995) observaram
alteração na atividade das enzimas glutationa peroxidase (GSH-Px) e catalase em
animais com conteúdo reduzido de NPSH uma hora após a exposição dos animais a
5mg/kg de cloreto de mercúrio (HgCl
2
). Gutierrez et al. (2006) relataram que, após
duas semanas de exposição diária ao HgCl
2
(0,16 mg/kg), a atividade da CuZn-SOD
foi diminuída. Entretanto, após 4 semanas, houve uma resposta adaptativa da
enzima, ocorrendo um aumento de 43% da atividade em relação ao controle.
Shimojo et al. (2002) demonstraram que HgCl
2
foi capaz de diminuir a atividade da
Mn-SOD do cérebro de uma maneira dose-dependente. De acordo com Perottoni et
al. (2004), o HgCl
2
inibiu a atividade da δ-ALA-D, elevou os níveis de TBARS e
reduziu o conteúdo de ácido ascórbico no rim dos animais expostos.
De maneira semelhante, o metilmercúrio foi capaz de diminuir a atividade
das enzimas glutationa peroxidase e glutationa redutase, bem como aumentar os
Peroxidação lipídica
D
anos ao DNA ou proteínas
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23
níveis de TBARS no cerebelo de animais expostos (Stringari et al., 2006). Cheng et
al. (2005) demonstraram níveis elevados de MDA e menor conteúdo de glutationa e
das enzimas superóxido dismutase e glutationa peroxidase em cérebro, rins, fígado
e no soro de animais expostos ao metilmercúrio durante 7 dias. Farina et al. (2004)
demonstraram elevação nos níveis de TBARS, bem como redução dos níveis de
grupos tióis não protéicos e da atividade da glutationa peroxidase em fígado de
animais recém-nascidos expostos ao cloreto de metilmercúrio durante 21 dias.
2.3 Carotenóides
Os carotenóides são pigmentos naturais sintetizados por plantas e
microrganismos, sendo componentes essenciais dos alimentos (Sthal & Sies, 2003).
Essas substâncias têm como função primária absorver luz durante a fotosíntese em
plantas ou fotoproteção de microrganismos. Sua estrutura química é composta por
ligações duplas conjugadas, que são responsáveis por sua cor e por algumas de
suas funções biológicas (Moreira & Shami, 2004). Juntamente com as vitaminas,
são as substâncias mais investigadas como agentes quimiopreventivos, funcionando
como antioxidantes em sistemas biológicos (Moreira & Shami, 2004). Algumas das
principais fontes de carotenóides são cenouras e abóboras (α e β-caroteno), tomates
e produtos derivados, como extrato, polpa e molhos (licopeno), espinafre (luteína),
laranja (β-criptoxantina) (Silva & Naves, 2001) e algumas espécies de salmão e
crustáceos, que bioacumulam astaxantina produzida por algas.
Muitas atividades têm sido atribuídas aos diferentes componentes dessa
classe como prevenção de doenças cardiovasculares e câncer, sendo o papel
preventivo contra câncer associado às propriedades antioxidantes e antimutagênicas
(Davison et al., 1993). Testes in vitro e in vivo sugerem que os carotenóides são
excelentes antioxidantes, seqüestrando e inativando os radicais livres (Erdman,
1999). Eles seqüestram o oxigênio singlete, removem radicais peroxil, modulam o
metabolismo carcinogênico, inibem a proliferação celular estimulando a
comunicação celular, além de elevar a resposta imune (Olson, 1999). O mecanismo
pelo qual os carotenóides protegem os sistemas biológicos dos radicais depende da
transferência de energia do radical para a molécula do carotenóide, em que a
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24
energia é dissipada por meio de rotações e vibrações do carotenóide no meio
solvente (Packer et al, 1999).
2.3.1. Licopeno
2.3.1.1. Ocorrência, estrutura química e metabolismo
O licopeno é um carotenóide que contém 40 átomos de carbono, lipossolúvel,
altamente insaturado, composto por ligações duplas conjugadas e não conjugadas
(Figura 3). É encontrado em alguns alimentos de cor vermelha como tomates e seus
produtos derivados, goiaba, melancia, mamão e pitanga (Moreira & Shami, 2004).
De acordo com Giovannucci (1999), o tomate vermelho maduro contém maior
quantidade de licopeno que de β-caroteno, por isso a cor vermelha predomina. A
razão licopeno/β-caroteno é responsável pela diferença de coloração, que também
está associada à enzima β-ciclase, enzima que participa da transformação do
licopeno em β-caroteno.
O licopeno ingerido na forma natural (trans-licopeno), é pouco absorvido, mas
estudos demonstram que o processamento térmico melhora a biodisponibilidade por
ajudar no rompimento da parede celular e extração (Willcox et al., 2003). O aumento
de gordura na dieta facilita a absorção e biodisponibilidade do licopeno (Moreira &
Shami, 2004). O licopeno ingerido é incorporado em micelas, e absorvido na mucosa
intestinal por difusão passiva, sendo incorporado aos quilomícrons e transportado
pelo sistema linfático até o fígado, principal órgão de reserva (Agarwal & Rao, 2000).
De acordo com Boileau et al (1999) o cis-licopeno é mais biodisponível que a forma
trans, por ser mais solúvel nas micelas, sendo mais facilmente incorporado aos
quilomicrons. Isso pode ser explicado pelo fato de que, após absorção e digestão, o
licopeno é separado de lipídios proteínas e fibras do fruto, responsáveis por manter
estável a configuração trans, sendo incorporado a micelas. É possível que o
licopeno sofra isomerização nessa separação (Wilcox et al., 2003). De acordo com
Clinton et al. (1996) mais de 50% do licopeno no soro e tecidos encontra-se na
forma de cis-licopeno.
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25
Figura 3 - Estrutura química do licopeno (Omoni & Aluko, 2005)
De acordo com Khachik et al (2002), oxidação do licopeno é um processo
complexo. O processo oxidativo ocorre naturalmente no fruto cru ou durante o
processamento térmico, além de ocorrer in vivo como parte do metabolismo normal
do carotenóide. Inicialmente, o licopeno é oxidado nas posições 1 e 5, originando
licopeno 1,2-epóxido e licopeno 5,6-epóxido, respectivamente. Embora o primeiro
composto seja bastante estável, o licopeno 5,6-epóxido é instável e ambos sofrem
ciclização, originando uma mistura de 2,6-ciclolicopeno-1,5-epóxido A e B. Embora
os epóxidos de licopeno e produtos de rearranjo não sejam encontrados no soro
humano, os correspondentes dióis cíclicos 2,6-ciclolicopeno 1,5-dióis A e B estão
presentes. Produtos metabólicos do licopeno como o 2,6-ciclolicopeno diol (A e B)
têm sido identificados em leite, soro e próstata de humanos (Kucuk et al., 2001). De
acordo com Zheripheh et al. (2003) o potencial benéfico do licopeno pode ser
mediado por seus metabólitos, como já demonstrado para metabólitos do ácido
retinóico.
2.3.1.2 Mecanismos de ação
O licopeno aparece atualmente como um dos mais potentes antioxidantes,
sendo sugerido na prevenção de carcinogênese e aterogênese por proteger
moléculas como lipídios, lipoproteínas de baixa densidade (LDL), proteínas e DNA
(Agarwal & Rao, 2000).
A ação antioxidante do licopeno está associada à presença das ligações
duplas conjugadas, sendo mais efetivo na remoção do oxigênio singlete e radicais
peroxil. Essa capacidade de remover o oxigênio singlete (
1
O
2
) é 2 vezes maior que a
do β-caroteno e 10 vezes maior que a do α-tocoferol (Agarwal & Rao, 2000). O
licopeno proveniente da dieta aumenta as concentrações séricas e teciduais do
carotenóide, que age como antioxidante, removendo radicais livres e evitando dano
a lipídios (lipoproteínas e lipídios de membrana), proteínas (incluindo importantes
enzimas) e DNA, evitando assim o estresse oxidativo (Omoni & Aluko, 2005). O
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26
reduzido estresse oxidativo diminui o risco de ocorrência de doenças como câncer e
aterosclerose (Agarwal & Rao, 2000). O licopeno é capaz de remover dióxido de
nitrogênio (NO
2
.
), redicais tiil (RS
.
) e sulfonil (RSO
2
.
) e peróxido de hidrogênio, bem
como proteger do dano celular induzido por peroxinitrito (Mortensen et al. 1997;
Musandu et al.; 2006). Durante a remoção do oxigênio singlete, a energia é
transferida do
1
O
2
para a molécula de licopeno, deixando essa espécie reativa em
um estágio triplete de energia. A remoção de outras espécies reativas, como
.
OH,
NO
2
.
ou peroxinitrito, leva a uma ruptura da molécula de licopeno (Stahl & Sies,
2003). Assim, o licopeno impede o dano oxidativo causado por essas espécies aos
constituintes celulares.
Alternativamente, alguns mecanismos não-antioxidantes podem ser
responsáveis pelos efeitos benéficos do licopeno. O aumento da concentração de
licopeno no corpo pode regular funções de genes, melhorar a comunicação celular,
modular resposta hormonal e imune ou regular o metabolismo, diminuindo assim o
risco para doenças crônicas (Agarwal & Rao, 2000). Um possível mecanismo para o
efeito protetor do licopeno contra doenças cardíacas é a inibição da enzima
HMGCoA redutase, enzima importante na síntese do colesterol (Fuhrman et al.,
1997).
2.3.1.3 Efeitos protetores
Poucos estudos foram realizados avaliando o efeito protetor dos carotenóides
contra injúrias causadas por metais pesados. De acordo com El-Missiry & Shalaby
(2000) e El-Demerdash et al. (2004), o β-caroteno foi capaz reverter alterações
bioquímicas, danos ao cérebro e testículos de ratos induzidos por cádmio.
Entretanto, esse mesmo carotenóide não foi capaz de proteger tecidos contra a
peroxidação lipídica induzida por metilmercúrio (Andersen & Andersen, 1993). O
licopeno foi capaz de proteger contra danos oxidativos induzidos por cisplatina, em
rim e em testículos, além de proteger alterações nas características do esperma de
ratos (Atessahin et al., 2005; Atessahin et al., 2006b),
Muitos estudos têm sido conduzidos a fim de utilizar o potencial benéfico do
licopeno e a maioria relaciona o efeito protetor do carotenóide à sua atividade
antioxidante. O licopeno protegeu contra danos oxidativos induzidos por ferro no
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27
intestino e próstata de ratos (Reifen et al., 2004; Matos et al., 2006). O licopeno foi
capaz de proteger contra nefrotoxicidade, cardiotoxicidade e danos testiculares
induzidos por adriamicina (Yilmaz et al., 2006; Atessahin et al., 2006a). Em
combinação com S-alilcisteína, esse carotenóide foi capaz de proteger a
genotoxicidade causada por n-metil-n-nitro-n-nitrosoguanidina (Velmurugan et al.,
2004).
Estudos epidemiológicos relatam uma correlação positiva entre a ingestão de
derivados de tomate e a diminuição da incidência de câncer de próstata e
aterosclerose (Omoni & Aluko, 2005). Estudos in vitro e em modelos experimentais
também relatam o efeito desse carotenóide em suprimir o crescimento de células
tumorais e reduzir a oxidação do colesterol LDL (Fuhrman et al.,1997; Kim et al.,
2002).
2.3.2. Astaxantina
2.3.2.1. Ocorrência e usos
A astaxantina (ASX) é um pigmento produzido por plantas, algas e fungos,
pertencente à família das xantofilas. Está presente em pássaros e animais marinhos.
É o principal pigmento presente em peixes e frutos-do-mar, que acumulam este
carotenóide após o consumo de algas sintetizadoras de astaxantina. Assim, esse
carotenóide é amplamente utilizado nas criações de salmão e crustáceos, a fim de
conferir a coloração laranja desejável. Em animais aquáticos, possui muitas funções,
tais como proteção de ácidos graxos poliinsaturados contra oxidação, proteção
contra radiação UV-A, entre outros (Higuera-Ciapara et al., 2006).
2.3.2.2. Estrutura química e metabolismo
A ASX é um cetocarotenóide que contém 40 átomos de carbono. Sua
estrutura química é caracterizada por uma longa cadeia hidrocarbonada, com duplas
ligaçãoes conjugadas (cadeia poliênica) com um anel aromático em cada
extremidade da cadeia. A presença de hidroxila (-OH) e oxigênio nos anéis terminais
da estrutura química da ASX confere uma maior polaridade a este carotenóide
quando comparado aos demais. Assim, sua estrutura se orienta de maneira que os
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28
dois anéis se localizem na superfície e a cadeia carbonada no interior da membrana
(Goto et al., 2001).
Figura 4 - Estrutura química da astaxantina (Goto et al., 2001).
Assim como os demais carotenóides, a ASX possui diferentes
estereoisômeros, que diferem entre si na configuração dos dois grupos hidroxila
presente em cada anel terminal da estrutura da ASX (Guerin et al., 2003).
Dependendo da origem, a ASX pode ser encontrada esterificada com diferentes
ácidos graxos, o que confere estabilidade à molécula, uma vez que a ASX livre é
muito sensível à oxidação. Além disso, a ASX pode formar complexos com proteínas
e lipoproteínas (Higuera-Ciapara et al., 2006).
Após ingestão, devido a sua liposolubilidade, a ASX é incorporada em micelas
no intestino delgado, se difundindo passivamente na luz intestinal junto com os
ácidos graxos. A ASX é incorporada em quilomícrons e estes, após perder sua
fração lipídica, tornam-se suficientemente pequenos para passar através dos
capilares sanguíneos, chegando ao fígado, principal órgão para metabolismo e
excreção de carotenóides. Neste órgão, a ASX é catabolizada até seus metabólitos.
O mecanismo exato pelo qual a ASX é metabolizada no fígado é desconhecido, mas
sabe-se que a porção deste carotenóide não metabolizada é incorporada as VLDL
antes de chegar a corrente sanguínea novamente (Rajasingh et al., 2006).
2.3.2.3. Propriedades
Apesar da ausência da atividade pró-vitamina A, a ASX possui inúmeras
proprieades farmacológicas incluindo atividades antioxidante, antiinflamatória
(Kurashige et al., 1990), imunomoduladora, anticâncer (Chew et al., 1999) e
antidiabetes (Uchiyama et al., 2002). Entre tais propriedades, sua atividade
antioxidante parece ser responsável pelas demais. A ASX apresentou potencial
antioxidante superior a outros carotenóides como zeaxantina, luteína, cantaxantina,
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29
e β-caroteno e 100 vezes maior que o α-tocoferol (Naguib, 2000). Essa
superioridade estaria relacionada à estrutura química, onde os anéis polares da ASX
removeriam espécies reativas de oxigênio na superfície, enquanto a cadeia
carbonada agiria no interior da membrana (Goto et al., 2001). No anel polar da ASX,
o grupo hidroxila no átomo de carbono 3 é apontado como principal sítio de remoção
de radicais livres.
Alguns autores têm descrito o efeito protetor da ASX contra danos oxidativos
induzidos por radicais hidroxil e oxigênio singlete (Wu et al., 2006). Além disso, tem
sido demonstrado que peróxido de hidrogênio, oxigênio singlete e radical superóxido
estimulam a biossíntese da ASX em fungos, provavelmente como uma resposta de
defesa antioxidante (Schroeder & Johnson, 1993; Schroeder & Johnson, 1995; Liu
& Wu, 2006).
2.3.2.4. Efeitos protetores
De acordo com Barros et al. (2001), a ASX foi o único carotenóide capaz de
inibir a propagação da peroxidação lipídica causada por H
2
O
2
em lipossomas
contendo Fe
+2
, provavelmente devido a duas propriedades combinadas: o efeito
impermeabilizador da membrana, responsável por limitar a entrada de agentes que
promovam a lipoperoxidação no interior da membrana, além da ação antioxidante
deste carotenóide. De acordo com Goto et al. (2001), a ASX protegeu tanto o interior
quanto a superfície de membranas fosfolipídicas contra peroxidação de lipídios in
vitro.
Efeitos neuroprotetores desse carotenóide também têm sido descritos
(Hussein et al, 2005a), relacionados à propriedade antioxidante da ASX contra
radicais livres induzidos pelo processo isquêmico. Recentemente, Li et al. (2004)
mostraram que ASX também apresenta atividade antiapoptótica. Em um estudo de
Hussein et al. (2006), a ASX reduziu os níveis plasmáticos de NO
2
-
/NO
3
-
em ratos
hipertensivos, o que evitaria a formação de espécies reativas de nitrogênio. Hussein
et al. (2005a, 2005b, 2006) descreveram o efeito antihipertensivo da ASX, ligado a
sua atividade antioxidante, principalmente contra o radical superóxido, prevenindo a
degradação do óxido nítrico mediada por essa espécie, resultando em
vasorelaxamento. Este carotenóide apresentou melhor potencial protetor que a
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30
glutationa contra degradação protéica induzida por cálcio em cristalino suíno e o
possível mecanismo para esse efeito antiproteolítico parece ser a capacidade da
ASX de formar complexos com cálcio, diminuindo a disponibilidade deste mineral
para as reações de proteólise (Wu et al., 2006).
Estudos anteriores têm mostrado que a ASX restaurou a atividade da SOD,
GSH-Px e CAT alteradas por etanol e naproxeno em estômago e por CCl
4
em fígado
de ratos, impedindo a peroxidação lipídica e danos a esses tecidos (Kang et al.,
2001; Kim et al., 2005a; Kim et al., 2005b). A ASX tem sido apontada como sendo
mais efetiva que luteína e β-caroteno em restaurar as atividades de SOD e CAT
alteradas por radiação UVA e peroxidação lipídica em fibroblastos de ratos
(O’Connor & O’Brien, 1998). Ainda, a ASX restaurou as atividades da SOD, CAT e
GSH-Px alteradas pela exposição de fibroblastos de frangos ao Paraquat (Lawlor &
O’Brien, 1995), além de prevenir peroxidação lipídica em microssomas hepáticos de
ratos (Palozza & Krinsky, 1992).
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31
3 RESULTADOS
Os resultados que fazem parte desta dissertação estão apresentados sob a
forma de dois manuscritos, apresentados a seguir. Os itens Materiais e Métodos,
Resultados, Discussão dos Resultados e Referências Bibliográficas, encontram-se
nos próprios manuscritos. O manuscrito 1 está disposto na versão aceita pela revista
Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. O manuscrito 2 está disposto na versão
a ser submetida à revista Food and Chemical Toxicology.
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33
Effect of lycopene on nephrotoxicity induced by mercuric chloride in rats
Paula R. Augusti
1
, Greicy M. M. Conterato
1
, Sabrina Somacal
2
, Lídia Einsfeld
2
,
Adriano T. Ramos
3
, Fernando Y. M. Hosomi
3
, Dominguita L. Graça
3
and Tatiana
Emanuelli
2
1
Post-graduate Program on Biochemical Toxicology, Center of Natural and Exact
Sciences, Federal University of Santa Maria, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil;
2
Integrated Center for Laboratory Analysis Development (NIDAL), Department of
Alimentary Technology and Science, Center of Rural Sciences, Federal University of
Santa Maria, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil.
3
Veterinary Pathology Laboratory, Department of Human Pathology, Center of Health
Sciences, Federal University of Santa Maria, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil.
Author for correspondence:
Tatiana Emanuelli
Integrated Center for Laboratory Analysis Development (NIDAL)
Department of Alimentary Technology and Science
Center of Rural Sciences
Federal University of Santa Maria
Campus – Camobi, 97105-900
Santa Maria, RS - Brazil
Telephone: +55 55 3220 8547
Fax: +55 55 3220 8353
E-mail: tatiemanuelli@smail.ufsm.br
Running title: Lycopene and HgCl
2
in adult rats
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34
Abstract: Oxidative stress has been pointed as an important molecular mechanism
for kidney injury in mercury poisoning. Lycopene, a plentiful carotenoid in tomatoes,
has been studied because of its large antioxidant properties. This paper evaluated
the ability of lycopene to prevent HgCl
2
nephrotoxicity. Rats were injected with HgCl
2
(0 or 5 mg/kg body weight, subcutaneously) 6 h after lycopene had been
administered (0, 10, 25, or 50 mg/kg, by gavage) and were killed twelve hours after
HgCl
2
exposure. HgCl
2
-induced inhibition of δ-aminolevulinate dehydratase activity
(~35%) and increase of lipid peroxidation in kidney (~37%) were prevented by
lycopene. However, lycopene did not prevent the increase of plasma creatinine levels
(~123%) and renal tubular necrosis induced by HgCl
2
. Glutathione peroxidase and
catalase activities were enhanced (~71% and ~41%), while superoxide dismutase
activity was depressed (~44%) in HgCl
2
-treated rats when compared to control and
these effects were prevented by lycopene. Our results indicate that although
lycopene did not prevent HgCl
2
-induced renal failure, it could have a beneficial role
against HgCl
2
toxicity by preventing lipid peroxidation and changes in the activity of δ-
aminolevulinate dehydratase and antioxidant enzymes.
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35
Although it has been recognized as a hazardous environmental pollutant, inorganic
mercury is widely used in certain types of batteries and continues to be an essential
component of fluorescent lightbulbs [1]. Most cases of human exposure to inorganic
mercury have been related to working activities like spillage of mercury compounds
on work clothes or in the working environment and handling of mercury salts in the
chemical industry and laboratories [2, 3]. Besides, a mixed burden of mercury
species, including inorganic mercury, has been associated with human poisoning in
gold mining areas [4]. There are also some reports of accidental and intentional
cases of human exposure to inorganic mercury [5, 6].
Inorganic mercury accumulates preferentially in kidneys and causes acute
renal failure [7]. Uptake, accumulation, and toxicity of inorganic mercury in the kidney
have been related to its binding to endogenous thiol-containing molecules [8]. The
thiol-containing enzyme δ-aminolevulinate dehydratase has been pointed to be a
target for inorganic mercury [9, 10]. Additionally, binding of mercuric ions to sulfhydryl
groups may result in decreased glutathione levels, leading to an increase of reactive
oxygen species, like superoxide anion radical, hydrogen peroxide, and hydroxyl
radical [11]. Free radical formation and subsequent lipid peroxidation was reported as
a cause of cell death in mercuric chloride-induced nephrotoxicity [12].
Taking into account that oxidative stress and endogenous thiols depletion are
involved in inorganic mercury toxicity, it has been suggested that antioxidants could
help in the treatment of mercury poisoning [13]. In fact, superoxide dismutase
treatment protected from renal failure and morphological changes induced by
mercuric chloride [12]. Besides, recent studies demonstrated that the non-enzymatic
antioxidant melatonin could prevent mercuric chloride-induced changes [14], whereas
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36
another non-enzymatic antioxidant, trolox, was able to prevent changes induced by
methylmercury [15].
Lycopene is one of the most potent carotenoid antioxidants [16]. It is naturally
found in many plant foods, being especially abundant in tomatoes [16]. It is not
synthesized by humans, but is obtained through dietary consumption. According to
recent reports, lycopene is associated with decreased incidence of many important
diseases including cancer, atherosclerosis, age-related macular degeneration, and
multiple sclerosis, probably via prevention of lipid peroxidation [17]. Lycopene is most
likely involved in the scavenging of two reactive oxygen species, singlet molecular
oxygen (
1
O
2
) and peroxyl radicals, contributing to the defence against lipid
peroxidation [18]. Recent data have shown that this carotenoid is able to protect
against cisplatine-induced oxidative damage in kidney of rats [19], and iron-induced
oxidative damage in bowel and prostate of rats [20, 21].
In the present study we characterized renal changes induced by acute
exposure to mercuric chloride (thiol containing biomolecules, antioxidant enzymes,
plasma creatinine levels, and histological changes) and evaluated the possible
protective effect of lycopene pre-treatment in rats.
Materials and Methods
Animals. This study was approved by the Ethics and Animal Welfare Committee of
Universidade Federal de Santa Maria (23081.008726/2006-37). 8 Weeks-old male
Wistar rats from our breeding colony (191.8 ± 22.3 g) were maintained in an air-
conditioned room (22-25°C) under natural lighting conditions, with free acess to water
and food.
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37
Exposure and sample collection. Animals received vehicle (Milli-Q water) or lycopene
(10, 25, or 50 mg/kg) by oral gavage (1mL/kg body weight). After 6h, they were
subcutaneously injected (1 mL/kg body weight) with vehicle (120 mM NaCl, 10 mM
phosphate buffer, pH 7.4) or HgCl
2
(5 mg/kg). The mercury dose was based on the
study of Perottoni et al. [22], where acute exposure to a similar dose of mercuric
chloride increased lipid peroxidation and decreased δ-aminolevulinate dehydratase
activity in renal tissue in vivo.
According to Lund et al. [23] the dose of 5 mg/kg is
sufficient to elicit mild or moderate oxidative stress in kidney cells.
The doses of
lycopene were based on the study of Matos et al. [21] where similar doses were
effective in protecting against iron-induced oxidative damage. HgCl
2
solution was
prepared in
120 mM NaCl, 10 mM phosphate buffer, pH 7.4. Lycopene (10% powder,
Deg Chemical Products Importation Ltda, São Paulo, Brazil) was suspended in Milli-
Q purified water (35-40°C).
Twelve hours after HgCl
2
injection, rats were anaesthetized with ether for
cardiac punction. Blood samples were collected into heparinized tubes and
centrifuged at 3000 x g for 10 minutes. Plasma was removed immediately and stored
at -20°C until analyzes. Animals were killed by decapitation and left kidney was
removed and homogenized in 3 volumes of 150 mM NaCl. The homogenate was
centrifuged at 3000 x g at 4°C for 10 minutes to yield a low-speed supernatant that
was used to determine delta-aminolevulinate dehydratase activity (ALA-D),
thiobarbituric acid reactive substances, non-protein thiol groups, and antioxidant
enzymes activity. Right kidney was removed and used for histopathological
examinations.
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38
δ-Aminolevulinate dehydratase activity. Activity was assayed as described by Sassa
[24]. The reaction was started after the addition of sample to the incubation medium
and carried out for 180 minutes at 39°C. The reaction product was determined using
Ehrlich’s reagent at 555 nm with a molar absorption coefficient of 6.1 x 10
4
for the
Ehrlich-porphobilinogen salt. Results were expressed as nmol porphobilinogen/h/mg
protein.
Lipid peroxidation. After addition of 7.2 mM of butylated hydroxytoluene to prevent
further oxidation, the supernatant was used for determination of thiobarbituric acid
reactive substances as described by Ohkawa et al. [25]. Following incubation
samples were extracted with n-butanol and the reaction product was determined at
535 nm using a standard curve of 1,1,3,3-tetraethoxypropane.
Non-protein thiol groups. One volume of the low-speed supernatant fraction was
mixed with 1 volume of 10% trichloroacetic acid, followed by centrifugation and
neutralization of the supernatant (to pH 7.5) with 1 M Tris as described by Jacques-
Silva et al. [26]. Non-protein thiol groups were immediately determined as described
by Ellman [27] at 412 nm after reaction with 5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid). A
standard curve using cysteine was used to calculate the content of non-protein thiol
groups in tissue samples.
Plasma creatinine levels. Plasma creatinine concentration was determined at 520
nm, after reaction with picric acid in alkaline medium (final point method), using a
commercial Kit (Doles reagents, Goiânia, GO, Brazil).
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39
Antioxidant enzymes. Superoxide dismutase activity was determined
spectrophotometrically, using 50 mM glycine buffer, pH 10.2, and 1 mM epinephrine
as substrate, at 30°C [28]. Superoxide dismutase activity was expressed as the
amount of enzyme that inhibits the auto-oxidation of epinephrine to adrenochrome by
50% which is equal to 1 unit.
Catalase activity was measured spectrophotometrically, as described by Aebi
[29] using 50 mM phosphate buffer, pH 7.0 and 17 mM hydrogen peroxide as
substrate. The pseudo-first order reaction constant (k) of the decrease in H
2
O
2
absorption/s at 25
o
C was determined and enzyme specific activity was expressed as
k/g protein.
Glutathione peroxidase activity was determined in a medium containing 25
mM potassium phosphate buffer, pH 7.0, 2.5 mM ethylenediaminetetraacetic acid,
0.24 U/mL glutathione reductase, 1 mM reduced glutathione, 1 mM sodium azide,
0.15 mM NADPH, and 0.4 mM hydrogen peroxide. The method is based on the
oxidation of NADPH at 25°C, which is indicated by the decrease in absorbance at
340 nm, according by Paglia and Valentine [30].
Protein quantification. Protein was measured according to Lowry [31] using bovine
serum albumin as the standard.
Histopathological examinations. Renal tissue was fixed in 10% formalin, dehydrated
in an ascending graded series of ethanol, cleared in xylene and embedded in
paraffin. Sections of 5 µm were obtained with a standard microtome and were
mounted on glass slides. The sections were later stained with hematoxylin and eosin
for histological analyses. Slides were examined by observers blinded to the
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40
treatment, using light microscopy. Five fields covering the deep cortex and upper
medulla were examined for each kidney slide. At least one hundred tubules were
counted and the severity of tubular necrosis was expressed as percent of necrotic
tubules.
Statistical analysis. The data were analyzed using two-way analysis of variance (2 Hg
doses x 4 lycopene doses) followed by post hoc Duncan’s multiple range test when
necessary. Results were expressed as the mean ± standard error of means and
differences were considered statistically significant when P < 0.05.
Results
Two-way analysis of variance (2 HgCl
2
doses x 4 lycopene doses) revealed a
significant main effect of HgCl
2
on renal δ-aminolevulinate dehydratase activity and
thiobarbituric acid reactive substances levels, indicating that mercury inhibited the
activity of this sulfhydryl-containing enzyme (~ 35%; P < 0.05, fig. 1A) and increased
lipid peroxidation (~ 37%; P < 0.05; fig. 1B). Although analysis of variance did not
reveal a significant main effect of lycopene or HgCl
2
x
lycopene interaction, post-hoc
analysis revealed that δ-aminolevulinate dehydratase activity of animals treated with
10 or 50 mg/kg lycopene + HgCl
2
were not significantly different from that of control
animals. Similarly, thiobarbituric acid reactive substances levels of all animals treated
with lycopene + HgCl
2
were not significantly different from those of control animals.
These results suggest that pretreatment with lycopene could ameliorate δ-
aminolevulinate dehydratase inhibition and lipid peroxidation induced by mercury (fig.
1A and B). HgCl
2
increased plasma creatinine levels (~ 123%; P < 0.05; fig. 1C).
However, pre-treatment with lycopene did not prevent this effect (fig. 1C). Neither
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41
HgCl
2
nor lycopene treatment changed the content of non-protein thiol groups in
kidney (data not shown).
Analysis of variance revealed a significant HgCl
2
x lycopene interaction on the
activity of antioxidant enzymes (fig. 2). Post-hoc comparisons demonstrated that
superoxide dismutase activity decreased (~ 44%) in kidney tissue of the animals
treated with HgCl
2
when compared to no-lycopene control group (P < 0.05; fig. 2A).
Besides, treatment with lycopene alone at 10 mg/kg reduced superoxide dismutase
activity, but this effect was not observed at higher lycopene doses. The decrease of
superoxide dismutase activity induced by HgCl
2
was prevented by 10 and 25 mg/kg
lycopene (P < 0.05), but not by 50 mg/kg lycopene. Post-hoc comparisons also
demonstrated that catalase activity increased (~ 41%; P < 0.05) in renal tissue of the
animals treated with HgCl
2
, when compared to control group (fig. 2B) and that
lycopene alone did not change catalase activity. While 25 and 50 mg/kg of lycopene
prevented HgCl
2
-induced changes in catalase activity, 10 mg/kg lycopene decreased
catalase activity under control values (P < 0.05). Glutathione peroxidase activity is
presented in Fig. 2C. HgCl
2
alone increased renal glutathione peroxidase activity (~
71%; P < 0.05) and lycopene, which did not affect this enzyme per se, prevented
HgCl
2
effect at doses of 10 and 50 mg/kg, but not at 25mg/kg (P < 0.05), as it could
be demonstrated by post-hoc test.
Histological changes in kidneys are presented in Fig. 3. Analysis of variance
revealed a significant main effect of HgCl
2
, indicating that significant renal tubular
necrosis was observed 12 hours after HgCl
2
exposure (61%, P < 0.05). Treatment
with lycopene was not able to prevent such damage. Lycopene alone did not cause
histological changes in kidney (data not shown).
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42
Discussion
Some previous reports showed protective effect of carotenoids against oxidative
damage induced by metals [19, 21, 32, 33]. Lycopene prevented cisplatin-induced
oxidative damage and nephrotoxicity [19] and iron-induced oxidative damage in rat
prostate [21], while β-carotene prevented oxidative damage and toxicity induced by
cadmium [32, 33]. However, dietary levels of β-carotene did not prevent the increase
of glutathione peroxidase activity or lipid peroxidation induced by methylmercuric
chloride in kidney, while an excess β-carotene further enhanced lipid peroxidation
[34]. Hence, there is still some controversy about the protective potential of
carotenoids against mercury toxicity, and lycopene had not been previously
evaluated to protect against mercuric chloride toxicity.
In the present study we evaluated the effects of pretreatment with lycopene
against mercuric chloride nephrotoxicity. Lycopene is readily absorbed in rats and
serum levels are maintained high between 3 and 24 hours [35]. Although kidney is
not the preferential organ for lycopene deposition, lycopene levels readily increase in
kidney, being decreased between 3 and 24 hours after exposure [35].
Our results revealed that pretreatment with lycopene (6 hours before) prevented
HgCl
2
-induced lipid peroxidation, suggesting that HgCl
2
-generated reactive species
are scavenged by lycopene. There is a number of evidence linking HgCl
2
-induced
renal failure to oxidative stress [8, 11]. However, lycopene treatment did not prevent
renal damage induced by HgCl
2
(creatinine levels and tubular necrosis). This is the
first study evaluating the protective effect of lycopene against δ-aminolevulinate
dehydratase inhibition by metals. Lycopene was previously demonstrated to prevent
reduction of glutathione levels induced by cisplatin [19]. Hence, it could be expected
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43
to protect other endogenous thiols. Accordingly, we observed that lycopene (10 and
50 mg/kg) prevented δ-aminolevulinate dehydratase inhibition by HgCl
2
.
HgCl
2
exposure increased the activities of catalase and glutathione peroxidase in
kidney probably as a defense response against free radicals. This proposal is
supported by the HgCl
2
-induced increase of thiobarbituric acid reactive substances,
which additionally indicates that free radicals generated by HgCl
2
exceeded
endogenous antioxidant activity and induced renal oxidative damage. Interestingly,
we found depressed superoxide dismutase activity in animals treated with HgCl
2
,
which could contribute to the enhanced lipid peroxidation in these animals.
Superoxide dismutase catalyzes superoxide anion radical dismutation to hydrogen
peroxide, and lipid peroxidation induced by HgCl
2
seems to be related to increase in
superoxide anion radical production [12].
Some lycopene doses did prevent mercury-induced changes in antioxidant
enzymes. This contrasts with the absence of β-carotene effect against methylmercury
toxicity [34] and suggests that different carotenoids may have different mechanisms
of action and effects. Lycopene has been demonstrated to protect in vivo against
oxidation of lipids, proteins, and DNA [18, 36]. It is the most efficient biological
carotenoid as singlet oxygen quencher [37, 38]. This higher antioxidant activity when
compared to β-carotene may have contributed to the lycopene protective efficiency.
After
1
O
2
quenching lycopene molecule is regenerated and may participate in further
quenching events. However, OH·, NO
2
·,
and peroxinitrite trapping by lycopene leads
to oxidative breakdown of the antioxidant molecule [18, 36].
The three doses of lycopene evaluated ameliorated the HgCl
2
–induced increase
in catalase activity. Lycopene protection against HgCl
2
–induced decrease of
glutathione peroxidase activity was observed at 10 and 50 mg/kg. Although lycopene
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44
also prevented HgCl
2
–induced decrease of superoxide dismutase activity, this effect
was only observed at the lower doses (10-25 mg/kg). This result may be related to
the u-shaped dose-response curve for the effect of lycopene alone on antioxidant
enzymes described by Breinholt et al. [39]. They observed a general trend: at lower
doses lycopene increased the activities of antioxidant enzymes, whereas at the
higher doses, activities decreased to control levels.
Lycopene protection against HgCl
2
induced-changes in antioxidant enzymes
activities could be linked to changes in the antioxidant/prooxidant homeostasis due to
the antioxidant effect of lycopene. Accordingly, lycopene treatment has been
previously demonstrated to modulate the activity of antioxidant enzymes in vivo
(decrease catalase activity and increase superoxide dismutase activity) even in the
absence of a prooxidant treatment [40].
In conclusion, we demonstrated that although lycopene did not prevent HgCl
2
-
induced renal failure, protection against oxidative damage, δ-aminolevulinate
dehydratase inhibition and changes in the activity of antioxidant enzymes might be
achieved by the use of lycopene. These results suggest that lycopene could have a
beneficial role against HgCl
2
toxicity. However, there is a need for further studies
before a conclusive statement may be made on the potential usefulness of lycopene
as an adjunct to therapy in HgCl
2
poisoning.
Acknowledgements
Work supported by CNPq (grant 470582/2004-9 to T. Emanuelli) and FAPERGS
(grant 0410265 to T. Emanuelli). T. Emanuelli is the recipient of CNPq research
Fellowship (proc. 304257/2004-4). S. Somacal is the recipient of a PIBIC/CNPq-
UFSM fellowship. P.R. Augusti and G.M.M. Conterato are the recipients of CAPES
Master degree fellowships.
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Legends
Fig. 1. δ-Aminolevulinate dehydratase activity (ALA-D; A), thiobarbituric acid
reactive substances levels (B), and creatinine levels (C) in kidneys of rats
treated with lycopene (oral) followed by mercuric chloride (subcutaneous).
Data are expressed as means ± standard error of means (n = 5-8). *Different from
the respective control group (P < 0.05). PBG = porphobilinogen. MDA =
malondialdehyde.
Fig. 2. Antioxidant enzymes activity in kidneys of rats treated with lycopene
(oral) followed by mercuric chloride (subcutaneous). (A) Superoxide dismutase
(SOD), (B) catalase (CAT) and (C) glutathione peroxidase (GSH-Px). Data are
expressed as means ± standard error of means (n = 5-7). *Different from no-
lycopene control group (P < 0.05).
#
Different from no-lycopene mercury group (P <
0.05). **Different from no-lycopene control and from 50 mg/kg lycopene-control
groups (P < 0.05).
&
Different from all groups (P < 0.05).
Fig. 3. Representative histology (200x) of kidney tissue of rats treated with
lycopene (oral) followed by mercuric chloride (subcutaneous) (n=6 per group).
(A) control; (B) HgCl
2
; (C) HgCl
2
+ 50 mg/kg lycopene. Observe that necrotic tubular
cells form bright red casts within the tubular lumen in rats treated with HgCl
2
(B). In
rats treated with HgCl
2
+ lycopene (C) tubules have red casts as much as in B.
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51
0 10 20 30 40 50
Lycopene (mg/kg)
0.00
0.40
0.80
1.20
1.60
2.00
ALA-D (nmol PBG/h/mg protein)
*
*
A
0 10 20 30 40 50
Lycopene (mg/kg)
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
MDA (nmol/mg protein)
*
B
0 10 20 30 40 50
Lycopene (mg/kg)
0.00
0.40
0.80
1.20
1.60
2.00
Creatinine (mg/dL)
Control
Hg
*
*
*
*
C
Fig. 1
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55
Effect of astaxanthin on changes in kidney function and oxidative stress
induced by mercuric chloride in rats
P.R. Augusti
1
; G.M.M. Conterato
1
; S. Somacal
2
; R. Sobieski
2
; P.R. Spohr
2
; J.V.
Torres
2
; M.P. Rocha
3
; T. Emanuelli
2,*
1
Post-graduate Program on Toxicological Biochemistry, Center of Natural and Exact
Sciences, Federal University of Santa Maria, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil;
2
Integrated Center for Laboratory Analysis Development (NIDAL), Department of
Alimentary Technology and Science, Center of Rural Sciences, Federal University of
Santa Maria, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil.
3
Department of Pathology, Center of Health Sciences, Federal University of Santa
Maria, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil.
*Corresponding author. Tel.: +55 55 3220 8547; fax: +55 55 3220 8353.
E-mail address: tatiemanuelli@smail.ufsm.br (Tatiana Emanuelli).
Running title: Astaxanthin and inorganic mercury in rats
Keywords: Antioxidant enzymes; δ-Aminolevulinate dehydratase; Creatinine; Kidney
tubular necrosis; Thiobarbituric acid reactive substances.
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56
Abstract
Reactive oxygen species are implicated as mediators of tissue damage in
acute renal failure induced by inorganic mercury. Astaxanthin (ASX), a carotenoid
with potent antioxidant properties, exists naturally in various plants, algae, and
seafoods. This paper evaluated the ability of ASX to prevent HgCl
2
nephrotoxicity.
Rats were injected with HgCl
2
(0 or 5 mg/kg b.w., sc) 6 h after ASX had been
administered (0, 10, 25, or 50 mg/kg, by gavage) and were killed twelve hours after
HgCl
2
exposure. Although ASX prevented the increase of lipid peroxidation and
attenuated histopathological changes caused by HgCl
2
in kidney, it did not prevent
creatinine increase in plasma and δ-aminolevulinic acid dehydratase inhibition
induced by HgCl
2
. Glutathione peroxidase and catalase activities were enhanced,
while superoxide dismutase activity was depressed in HgCl
2
-treated rats when
compared to control and these effects were prevented by ASX. Our results indicate
that ASX could have a beneficial role against HgCl
2
toxicity by preventing lipid
peroxidation, changes in the activity of antioxidant enzymes and histopathological
changes.
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57
1. Introduction
Although inorganic mercury has been recognized as a hazardous
environmental pollutant, it is widely used in certain types of batteries and continues to
be an essential component of fluorescent light bulbs (Clarkson, 1997). People can be
exposed to mercury through contaminated water and food (Magos and Clarkson,
2006). Also, a mixed burden of mercury species (vapour, inorganic mercury, and
methyl mercury) has been associated with human poisoning in gold mining areas
(Drasch et al., 2001).
Inorganic mercury has a non-uniform distribution after absorption, being
accumulated mainly in kidneys (Emanuelli et al., 1996), causing acute renal failure
(Tanaka-Kagawa et al., 1998). This mercury form has great affinity for SH groups of
endogenous biomolecules, such as the enzyme δ-aminolevulinic acid dehydratase
(ALA-D), which may contribute to its toxicity (Clarkson, 1997). Thus, it is invariably
found in cells and tissues bound to endogenous thiol-containing molecules such as
glutathione, cysteine, homocysteine, metallothionein, and albumin (Zalups, 2000).
Mercury bound to SH groups may result in decreased glutathione levels,
leading to an increase of reactive oxygen species, like superoxide anion radical,
hydrogen peroxide, and hydroxyl radical (Stohs and Bagchi, 1995), which induce
lipid, protein, and DNA oxidation (Clarkson, 1997). Besides, it has been shown that in
vitro Hg
+2
both hinders the antioxidant potential of glutathione and yields reactive
species via thiol complexation (Woods et al., 1990). In fact, free radical formation and
subsequent lipid peroxidation was reported as a cause of cell death in mercury-
induced nephrotoxicity (Girardi and Elías, 1995). Accordingly, mercury exposure has
been demonstrated to induce lipid peroxidation detected by increased thiobarbituric
acid-reactive substances (TBARS) in kidney and other tissues (Huang et al., 1996).
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58
Thus, it is believed that antioxidants should be one of the important components of
effective treatment for mercury poisoning. Indeed, HgCl
2
-induced injury can be
ameliorated by superoxide dismutase (Girardi and Elías, 1995) and non-enzymatic
antioxidants like dimethylthiourea, melatonin, and dimethylsulfoxide (Paller, 1985;
Senner et al., 2003; Jo et al., 2004). Also, another antioxidant, trolox, was able to
prevent changes induced by methyl mercury (Usuki et al., 2001).
Astaxanthin (ASX), a red carotenoid pigment, with no pro-vitamin A activity, is
a biological antioxidant that occurs naturally in a wide variety of plants, algae, and
seafoods. ASX has some pharmacological activities, including antioxidant, anti-
inflammatory (Kurashige et al., 1990), immunomodulatory, anti-cancer (Chew et al.,
1999), and anti-diabetic activities (Uchiyama et al., 2002). Within the cell, astaxanthin
can effectively scavenge lipid radicals and destroy peroxides, thereby protecting fatty
acids and biological membranes from oxidative damage (Kurashige et al., 1990). It
was reported to be more effective than β-carotene in preventing lipid peroxidation in
solution and in various biomembrane systems (Goto et al., 2001). Recent studies
suggest that ASX exhibits about 100-500 times higher antioxidant activity than α-
tocopherol (Naguib, 2000). Studies from our laboratory showed that lycopene
prevented lipid peroxidation and changes in antioxidant enzymes, but not tubular
necrosis induced by mercuric chloride (Augusti et al., 2007). However, Andersen and
Andersen (1993) demonstrated that β-carotene was not able to prevent oxidative
damage caused by methylmercury in kidneys of rats. Hence, there is still some
controversy about the protective potential of carotenoids against mercury toxicity,
and ASX has not been previously evaluated to protect against inorganic mercury
toxicity.
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59
In the present study we investigated the possible protective effect of ASX
against nephrotoxicity induced by mercuric chloride. Kidney function changes
(creatinine and uric acid plasma levels and histolopathogical changes), oxidative
stress (thiol containing biomolecules, lipid peroxidation, and antioxidant enzymes)
and glutathione S-transferase activity were evaluated as indicators of mercury
exposure.
2. Materials and methods
2.1. Animals
This study was approved by the Ethics and Animal Welfare Committee of
Universidade Federal de Santa Maria (23081.008726/2006-37). 8 Weeks-old male
Wistar rats from our breeding colony (183.2 ± 24.7 g) were maintained in an air-
conditioned room (22-25°C) under natural lighting conditions, with free access to
water and food.
2.2 Exposure and sample collection
Animals received vehicle (Milli-Q water) or ASX (10, 25, or 50 mg/kg) by oral
gavage (1mL/kg body weight). After 6h, they were subcutaneously injected (1 mL/kg
body weight) with vehicle (120 mM NaCl, 10 mM phosphate buffer, pH 7.4) or HgCl
2
(5 mg/kg). The mercury dose was based on the study of Perottoni et al. (2004),
where an acute exposure to a similar dose of mercuric chloride increased lipid
peroxidation and decreased ALA-D activity in renal tissue in vivo.
According to Lund
et al. (1993) the dose of 5 mg/kg is sufficient to elicit mild or moderate oxidative
stress in kidney cells.
ASX doses were based on the study of Hussein et al. (2005)
and Icheuchi et al. (2006), where similar doses were effective in protecting against
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60
oxidative damage in several animal models. HgCl
2
solution was prepared in
120 mM
NaCl, 10 mM phosphate buffer, pH 7.4. ASX (2% powder, Fuji Chemical Industry Co.
Ltd, Toyama, Japan) was suspended in Milli-Q purified water (25°C).
Twelve hours after HgCl
2
injection, rats were anaesthetized with ether for
cardiac punction. Blood samples were collected into heparinized tubes and
centrifuged at 3000 x g for 10 minutes. Plasma was removed immediately and stored
at -20°C until analyzes. Animals were killed by decapitation and left kidney was
removed and homogenized in 3 volumes of 150 mM NaCl. The homogenate was
centrifuged at 3000 x g at 4°C for 10 minutes to yield a low-speed supernatant that
was used to determine delta-aminolevulinic acid dehydratase activity (δ-ALA-D),
thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), non-protein thiol groups, and
antioxidant enzymes activity. Right kidney was removed and used for
histopathological examinations.
2.3. ALA-D activity
ALA-D was assayed as described by Sassa (1962). The reaction was started
after the addition of sample to the incubation medium and carried out for 180 minutes
at 39°C. The reaction product was determined using Ehrlich’s reagent at 555 nm with
a molar absorption coefficient of 6.1 x 10
4
for the Ehrlich-porphobilinogen salt.
Results were expressed as nmol porphobilinogen/h/mg protein.
2.4. Lipid peroxidation
After addition of 7.2 mM of butylated hydroxytoluene to prevent further
oxidation, the supernatant was used for TBARS determination as described by
Ohkawa et al. (1979). Following incubation, samples were extracted with n-butanol
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61
and the reaction product was determined at 535 nm using a standard curve of
1,1,3,3-tetraethoxypropane.
2.5. Non-protein thiol groups
One volume of the low-speed supernatant fraction was mixed with 1 volume
of 10% trichloroacetic acid, followed by centrifugation and neutralization of the
supernatant (to pH 7.5) with 1 M Tris as described by Jacques-Silva et al. (2001).
Non-protein thiol groups were immediately determined as described by Ellman
(1959) at 412 nm after reaction with 5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid). A standard
curve using cysteine was used to calculate the content of non-protein thiol groups in
tissue samples.
2.6. Glutathione S-transferase
Glutathione S-transferase activity was determined by measuring the increase
in absorbance at 340 nm using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene as the substrate,
according Habig and Jakoby (1981).
2.7. Plasma creatinine and uric acid levels
Plasma creatinine and uric acid levels were determined using routine
laboratory kits (Doles reagents, Goiânia, GO, Brazil).
2.8. Antioxidant enzymes
Superoxide dismutase (SOD) activity was determined spectrophotometrically
based on its ability to inhibit the autooxidation of adrenalin to adrenochrome at
alkaline pH, according by Misra and Fridovich (1972). SOD activity was expressed as
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62
the amount of enzyme that inhibits the oxidation of epinephrine by 50%, which is
equal to 1 unit.
Catalase (CAT) activity was measured spectrophotometrically, as described
by Aebi (1984) using hydrogen peroxide as substrate. The pseudo-first order reaction
constant (k) of the decrease in H
2
O
2
absorption/s at 25
o
C was determined and
enzyme specific activity was expressed as k/g protein.
Gluthatione peroxidase (GSH-Px) activity was determined using glutathione
reductase and NADPH. The method is based on the oxidation of NADPH at 25°C,
which is indicated by the decrease in absorbance at 340 nm, according to Paglia and
Valentine (1967).
2.9. Protein quantification
Protein was measured according to Lowry (1951) using bovine serum albumin
as the standard.
2.10. Histopathological examinations.
For histopathology, 10% formalin-fixed kidney was dehydrated in an
ascending graded series of ethanol, cleared in xylene and embedded in paraffin.
Sections of 5 µm were obtained with a standard microtome and were stained with
hematoxylin and eosin. The sections were examined and graded by a pathologist
without knowledge of the experimental groups, according to a predetermined scoring
system (Rumbeiha et al., 2000). Normal kidneys were given a score of 0. Kidneys
with mild tubular necrosis were given a score of +1. Those with moderate tubular
necrosis were given a score of +2. Kidneys with severe tubular necrosis were given a
score of +3. Results were expressed as a tubular necrosis score.
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63
2.11. Statistical analysis
Data were analyzed using two-way analysis of variance (ANOVA) (2 HgCl
2
doses x 4 ASX doses) followed by post hoc Duncan’s multiple range test when
necessary. Results were expressed as the mean ± SEM and differences were
considered statistically significant when p < 0.05.
2. Results
Two-way analysis of variance (2 HgCl
2
doses x 4 ASX doses) revealed a
significant main effect of HgCl
2
on renal δ-ALA-D and TBARS levels, indicating that
mercury inhibited the activity of this sulfhydryl-containing enzyme (p < 0.05, Fig. 1A)
and increased lipid peroxidation ( p < 0.05; Fig. 1B). Although inhibition of δ-ALA-D
activity has not been prevented by ASX, it prevented the increase of TBARS levels
caused by HgCl
2
at all evaluated doses. HgCl
2
increased plasma creatinine levels (p
< 0.05; Fig. 1C). However, pre-treatment with ASX did not prevent this effect (Fig.
1C). Neither HgCl
2
nor ASX treatment changed the content of non-protein thiol
groups, glutathione S-transferase activity in kidney or uric acid levels in plasma (data
not shown).
<Insert figure 1 here>
ANOVA revealed significant HgCl
2
x ASX interaction on antioxidant enzymes
activity. Post-hoc comparisons demonstrated that SOD activity decreased in kidney
tissue of the animals treated with HgCl
2
when compared to no-ASX control group (p <
0.05; Fig. 2A) and this effect was prevented by all ASX doses. Post-hoc comparisons
also demonstrated that GSH-Px and CAT activities increased (p < 0.05) in renal
tissue of the animals treated with HgCl
2
, when compared to control group (Fig. 2B
and C). ASX prevented HgCl
2
effect on these antioxidant enzymes at all evaluated
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64
doses (p < 0.05). Besides, ASX had no effect per se on any of the evaluated
parameters
<Insert figure 2 here>
Histological changes in kidney are presented in Fig. 3. ANOVA revealed a
significant main effect of HgCl
2
treatment on renal tubular damage, indicating that
tubular necrosis was observed 12 hours after HgCl
2
exposure (p < 0.05). Treatment
with 50 mg/kg ASX partially prevented such damage. ASX alone did not cause
histological changes in kidney (data not shown).
<Insert figure 3 here>
4. Discussion
Here, we evaluated the effects of pretreatment with ASX against HgCl
2
nephrotoxicity. Our results revealed that pretreatment with ASX (6 hours before)
prevented HgCl
2
-induced lipid peroxidation, suggesting that HgCl
2
-generated reactive
species are scavenged by astaxanthin. Moreover, 50 mg/kg of ASX partially
prevented renal tubular necrosis caused by HgCl
2
. However, ASX treatment did not
prevent the increase in creatinine levels induced by this metal. We previously
demonstrated that lycopene (10 and 50 mg/kg) prevented δ-ALA-D inhibition by
HgCl
2
(Augusti et al., 2007). In contrast, in the present study we observed that ASX
did not prevent δ-ALA-D inhibition by HgCl
2
.
HgCl
2
exposure increased the activities of CAT and GSH-Px in kidney
probably as a defense response against free radicals. This proposal is supported by
the HgCl
2
-induced increase of TBARS, which additionally indicates that free radicals
generated by HgCl
2
exceeded endogenous antioxidant activity and induced renal
oxidative damage. Interestingly, we found depressed SOD activity in animals treated
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65
with HgCl
2
, which could contribute to the enhanced lipid peroxidation in these
animals. SOD catalyzes superoxide anion radical dismutation to hydrogen peroxide,
and lipid peroxidation induced by HgCl
2
seems to be related to increase in
superoxide anion radical production (Girardi and Elías, 1995). All ASX doses
prevented HgCl
2
-induced changes in antioxidant enzymes. This contrasts with the
absence of β-carotene protective effect against methylmercury toxicity (Andersen
and Andersen, 1993). Also, we recently observed that just some doses of the
carotenoid lycopene protected against HgCl
2
-induced changes in antioxidant
enzymes activity (Augusti et al., 2007). Moreover, a low lycopene dose (10 mg/kg)
had an inhibitory effect per se on SOD activity (Augusti et al., 2007), which was not
observed with ASX. These findings indicate that different carotenoids may have
different mechanisms of action and effects. In fact, this is the first report about ASX
effects against metal toxicity.
Some reports have described the protective effect of ASX against hydroxyl
radicals and singlet oxygen-induced oxidative damage (Berstein et al., 2001; Wu et
al., 2006). Additionally, it has been demonstrated that ASX biosynthesis is stimulated
by H
2
O
2
, singlet oxygen and superoxide radical in yeast, probably as an antioxidant
response (Schroeder and Johnson, 1993; Schroeder and Johnson, 1995; Liu and
Wu, 2006). Previous reports demonstrated that ASX protects against ethanol and
naproxen-induced gastric lesions by its ability to restore the activities of SOD, GSH-
Px and CAT (Kim et al., 2005a; Kim et al., 2005b). Accordingly, here we
demonstrated that ASX was effective in restoring SOD activity inhibited by HgCl
2
.
Additionally, ASX reduced the oxidative stress in kidneys and prevented renal cell
damage caused by diabetes in mice (Naito et al., 2004). Accordingly, 50 mg/kg of
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66
ASX partially prevented histopathological changes caused by HgCl
2
, besides the
protective effect against HgCl
2
-induced changes in antioxidant enzymes activities.
ASX has been demonstrated to protect in vitro against oxidation of lipids at the
surface and inside phospholipid membrane (Goto et al., 2001). Accordingly, here we
observed that this carotenoid prevented lipid peroxidation caused by HgCl
2.
This
effectiveness can be explained by location of ASX inside in membranes, where polar
ring of astaxanthin would scavenge reactive oxygen species near the membrane
surface, while the polyene chain would inhibit the radical chain reaction into the
membrane (Goto et al., 2001).
Although ASX is mainly recognized by its reactive oxygen scavenging effect,
there is some evidence that its cyclohexene ring may be a site for binding of divalent
ions (Wu et al., 2006). Besides, it has been suggested that the four oxygen atoms in
each ASX ring can coordinate with metal ions such as Cu (II) and Fe (III) (Zhao et al.,
2005). Therefore, we can not rule out that Hg
2+
binding could underlie some of the
protective effects of ASX against HgCl
2
.
In conclusion, we demonstrated that, although ASX did not prevent HgCl
2
-
induced creatinine increase in plasma and δ-ALA-D inhibition, protection against
oxidative damage, changes in the activity of antioxidant enzymes and
histopathological damage caused by HgCl
2
might be achieved by the use of ASX. We
suggest that use of ASX may offer a beneficial strategy against HgCl
2
toxicity.
Acknowledgements
We would like to thank Fuji Chemical Industry Co., Ltd., Toyama for kindly
donation of the astaxanthin product. This work was supported by CNPq (grant
470582/2004-9 to T. Emanuelli). T. Emanuelli is the recipient of CNPq research
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67
Fellowship (proc. 304257/2004-4). S. Somacal and R. Sobieski are the recipients of
PIBIC/CNPq-UFSM fellowship. P. Spohr is the recipient of CNPq Scientific Initiation
fellowship. P.R. Augusti and G.M.M. Conterato are the recipients of CAPES Master
degree fellowships.
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73
Footnote to page 1
Abbreviations: δ-ALA-D, δ-aminolevulinic acid dehydratase; ANOVA, analysis of
variance; ASX, astaxanthin; b.w., body weight; CAT, catalase; GSH, glutathione;
GSH-Px, glutathione peroxidase; Hg
+2
, inorganic mercury; HgCl
2
, mercuric chloride;
sc, subcutaneous; SEM, standard error of mean; SH, sulfhydryl; SOD, superoxide
dismutase; TBARS, thiobarbituric acid-reactive substances.
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74
Legends
Fig. 1. δ-Aminolevulinate dehydratase activity (ALA-D; A), thiobarbituric acid reactive
substances levels (B), and creatinine levels (C) of rats treated with ASX (oral)
followed by HgCl
2
(sc). Data are expressed as means ± SEM (n = 5-8). *Different
from control group (p < 0.05).
#
Different from all groups (p < 0.05). PBG =
porphobilinogen. MDA = malondialdehyde.
Fig. 2. Antioxidant enzymes activity of rats treated with ASX (oral) followed by HgCl
2
(sc). (A) SOD, (B) GSH-Px, (C) CAT. Data are expressed as means ± SEM (n = 5-7).
&
Different from all other groups (p < 0.05). *Different from no-astaxanthin control
group.
#
Different from no-astaxanthin mercury group (p < 0.05).
Fig. 3. Representative histology and tubular damage score of kidney tissue of rats
treated with ASX (oral) followed by HgCl
2
(s.c.) (n=5 per group). (A) control; (B)
HgCl
2
; (C) HgCl
2
+ 50 mg/kg ASX; (D) Tubular damage score. Tissues were fixed in
10% formalin, embedded in paraffin, sectioned at 5 µm and stained with hematoxylin
and eosin. Magnification was 400x. Score 0 indicate no tubular necrosis and score
+3 indicate severe tubular necrosis. *Different from control groups (p < 0.05).
#
Different from no-astaxanthin mercury group (p < 0.05). Observe tubules with
preserved architecture and regular epithelial cells (A). In rats treated with HgCl
2
,
there is loss of architecture, necrotic tubules with picnotic nucleus and dense and
eosinophilic cytoplasm (B). In rats treated with HgCl
2
+ ASX (C) there are identical
features, although just in focal areas.
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75
Fig. 1
0 10 20 30 40 50
Astaxanthin (mg/kg)
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
ALA-D(nmol PBG/h/mg protein)
*
*
*
*
A
0 10 20 30 40 50
Astaxanthin (mg/kg)
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
MDA (nmol/mg protein)
*
#
B
0 10 20 30 40 50
Astaxanthin (mg/kg)
0.00
0.40
0.80
1.20
1.60
2.00
Creatinine (mg/dL)
Control
Hg
*
*
*
*
C
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79
4 DISCUSSÃO
Mercúrio (Hg) é conhecido como um perigoso poluente ambiental e a
toxicidade dos compostos de mercúrio se deve, principalmente, à afinidade por
grupos tiólicos de biomoléculas endógenas (Clarkson, 1997). Dessa maneira, o Hg é
encontrado nas células e tecidos ligado a proteínas contendo grupos tióis ou a tióis
de baixo peso molecular como cisteína e glutationa (GSH) (Zalups, 2000).
Adicionalmente, o mercúrio pode aumentar a produção de radicais livres, induzindo
oxidação de lipídios, proteínas e DNA (Lund et al., 1993).
Todas as formas de mercúrio são tóxicas, porém o mercúrio inorgânico afeta
primeiramente os rins, devido à alta afinidade entre mercúrio e enxofre, o que leva a
ligação desse metal a grupos tiólicos de proteínas, peptídeos e aminoácidos, sendo
observado necrose do epitélio renal, acompanhada de proteinúria e glomerulonefrite
(Goyer, 1996). Além disso, muitos estudos sugerem que a produção de radicais
livres e o estresse oxidativo também estão envolvidos na injúria celular renal
induzida pelo mercúrio (Stohs & Bagchi, 1995; Zalups, 2000).
Os resultados do presente estudo mostraram que, 12 horas após uma
exposição aguda ao HgCl
2,
a enzima δ-ALA-D foi inibida, o que está de acordo com
trabalhos anteriores (Emanuelli et al. 1996; Farina et al. 2003; Perottoni et al. 2004).
Esse efeito é provavelmente devido à alta afinidade entre o Hg e moléculas
endógenas contendo tióis, como a δ-ALA-D (Clarkson 1997; Nogueira et al. 2003).
Essa enzima catalisa a condensação de duas moléculas de ácido 5-aminolevulínico
(ALA), formando o porfobilinogênio, um precursor do grupo heme (Gibson et al.,
1955). Conseqüentemente, a inibição da δ-ALA-D pode prejudicar a biossíntese do
heme e provocar o acúmulo de ALA, que por sua vez possui efeitos prooxidantes
(Bechara et al., 1993) Em contraste com outros autores (Stohs & Bagchi, 1995), o
conteúdo de NPSH não foi alterado após exposição ao HgCl
2
, como já relatado por
Perottoni
et al. (2004). Essa discrepância pode estar relacionada à dose de mercúrio
administrada, uma vez que tem sido demonstrado que doses baixas ou não tóxicas
aumentam o conteúdo renal do tiol não-protéico GSH. Doses altas, no entanto,
diminuem o conteúdo de GSH nos rins (Zalups, 2000). De acordo com Perottoni et
B
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80
al. (2004), após 12 horas de uma exposição a 5 mg/kg de HgCl
2
, observou-se
diminuição de NPSH no fígado, mas não nos rins.
A GST é uma enzima envolvida na detoxificação de agentes tóxicos, incluindo
metais pesados, via complexação com a glutationa. Um aumento na atividade e
expressão desta enzima no tecido renal tem sido observado após exposição ao
chumbo (Daggett et al., 1998). Estes autores sugeriram que o comportamento desta
enzima é independente do estresse oxidativo, uma vez que eles observaram
aumento na atividade e expressão da enzima mesmo na ausência de depleção de
GSH e de peroxidação lipídica. Embora McGuire et al. (1997) tenham relatado um
aumento na expressão da enzima GST no tecido renal após exposição ao HgCl
2
,
no
presente trabalho a atividade da enzima não foi alterada após 12 horas da exposição
ao HgCl
2
.
Os resultados deste trabalho também revelaram um aumento nos níveis de
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e na atividade da enzima
glutationa peroxidase (GSH-Px) 12 horas após exposição ao HgCl
2
. Essa enzima é
responsável pela detoxificação de peróxidos e pela conversão de hidroperóxidos
lipídicos até álcoois não tóxicos. Entretanto, os resultados revelaram que, o aumento
na atividade da enzima GSH-Px não foi capaz de prevenir a peroxidação lipídica
induzida pelo HgCl
2
.
O HgCl
2
também causou um aumento na atividade da enzima catalase (CAT),
como já observado por Addya et al. (1984) após exposição
crônica ao HgCl
2.
Entretanto, uma diminuição na atividade da CAT foi observada em células epiteliais
renais após exposição ao HgCl
2
in vitro. Essa discrepância pode ser devido às
diferenças entre um sistema de células isoladas in vitro e o órgão inteiro in vivo. Por
outro lado, Girard & Elias (1995) não encontraram nenhuma alteração na atividade
da CAT renal 1 hora após a exposição a 5 mg/kg de HgCl
2
, embora aumento na
peroxidação lipídica e dano renal tenham sido encontrados. Esses autores sugerem
que alterações nas atividades das enzimas antioxidantes CAT e GSH-Px não são
responsáveis pela peroxidação lipídica e pelo dano renal induzido por HgCl
2
. Os
resultados deste trabalho confirmam essa hipótese, uma vez que peroxidação
lipídica e dano renal foram observados mesmo com um aumento nas atividades da
GSH-Px e CAT.
O aumento nas atividades das enzimas antioxidantes ocorreu provavelmente
como um mecanismo de defesa contra os radicais livres produzidos pelo HgCl
2
.
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81
Essa hipótese é sustentada pelo aumento nos níveis de TBARS, que indica que os
radicais livres produzidos pelo Hg excederam a capacidade antioxidante endógena e
induziram dano oxidativo nos rins. Mitocôndrias isoladas do córtex renal de ratos
tratados in vivo com HgCl
2
apresentaram aumento na produção de peróxido de
hidrogênio, depleção de glutationa e aumento na peroxidação lipídica (Lund et al.,
1993). Além disso, a administração de superóxido dismutase (SOD) preveniu a
peroxidação lipídica e o dano renal induzido pelo HgCl
2
in vivo (Girardi & Elías
1995). Esses resultados sustentam a hipótese de que o estresse oxidativo,
especialmente na mitocôndria, é um importante mecanismo envolvido na injúria
tubular renal induzida pelo HgCl
2
(Zalups, 2000). De acordo com esses resultados, o
aumento na peroxidação lipídica encontrado neste trabalho foi acompanhado pelo
aumento nos níveis plasmáticos de creatinina, indicando um decréscimo na filtração
glomerular. O dano aos rins foi confirmado pela análise histopatológica, que revelou
necrose tubular severa. Esses resultados estão de acordo com outros trabalhos
(Girardi & Elías 1995; Tanaka-Kagawa et al. 1998). Embora metais pesados
nefrotóxicos, como o chumbo, promovam o aumento dos níveis plasmáticos de ácido
úrico como resultado do dano tubular (ATSDR, 2000), no presente trabalho a
exposição aguda ao HgCl
2
não alterou os níveis de ácido úrico no plasma. Isso pode
ser explicado pelas variações fisiológicas no conteúdo de ácido úrico, dependente
do metabolismo de proteínas (Choi et al., 2005).
Os resultados deste trabalho demonstraram que a atividade da enzima
superóxido dismutase (SOD) diminuiu nos animais tratados com HgCl
2
, o que
contribuiria para o aumento da peroxidação lipídica nesses animais. A SOD catalisa
a dismutação do radical superóxido (O
2
.-
) até peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e a
peroxidação lipídica induzida pelo HgCl
2
parece estar relacionada ao aumento na
produção do radical superóxido (Girardi & Elías 1995). Shimojo et al. (2002)
demonstraram que o HgCl
2
diminuiu a atividade da Mn-SOD em camundongos. Essa
inibição foi atribuída à ligação covalente do mercúrio ao resíduo de cisteína 196
reativo da enzima. Estudos sugerem que a diminuição na atividade da Cu,Zn-SOD
em ratos expostos ao cádmio estaria ligada com o decréscimo da disponibilidade de
Cu e Zn como resultado da imobilização destes minerais na forma ligada a
metalotioneína, uma proteína envolvida na detoxificação do cádmio (Brzoska et al.,
2002). De maneira semelhante ao cádmio, a exposição ao HgCl
2
também induz a
síntese de metalotioneínas nos rins (Tanaka-Kagawa et al., 1998). Assim, a ligação
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82
do Cu e Zn as metalotioneínas poderia ser responsável pela diminuição da atividade
da SOD induzida por Hg. De forma alternativa, a inibição da atividade da SOD pode
ser conseqüência de um excesso de espécies reativas de oxigênio, que afetaria a
estrutura da enzima (Salo et al., 1988).
Alguns antioxidantes, como melatonina e trolox, são capazes de prevenir
dano oxidativo e toxicidade induzida por mercúrio (Usuki et al., 2001; Sener et al.,
2003). Além disso, Sharma et al. (2005) sugerem que o pré e pós-tratamento com
extrato de Ocimum sanctum, uma planta com poder antioxidante, podem proteger
contra os danos renais induzidos pelo HgCl
2
. Adicionalmente, trabalhos anteriores
mostraram o efeito protetor de carotenóides contra danos oxidativos induzidos por
metais (El-Missiry & Shalaby 2000; El-Demerdash et al., 2004; Atessahin et al.,
2005; Matos et al., 2006). De acordo com Sarafian & Verity (1991), o α-tocoferol
protegeu células cerebelares da peroxidação lipídica induzida por metil mercúrio
(MeHg), mas não protegeu contra a perda da viabilidade celular induzida por esse
composto. Andersen & Andersen (1993) também relataram o efeito protetor de
níveis elevados de vitamina E na dieta contra peroxidação lipídica induzida pelo
MeHg no fígado. Além disso, decréscimo dessa vitamina na dieta aumentou a
peroxidação lipídica causada pelo MeHg nesse tecido. Entretanto, concentrações de
β-caroteno compatíveis com as encontradas na dieta não preveniram o aumento da
atividade da GSH-Px e peroxidação lipídica induzida MeHg nos rins, enquanto um
excesso de β-caroteno aumentou a peroxidação lipídica (Andersen & Andersen,
1993).
No presente estudo, avaliou-se os efeitos do pré-tratamento com licopeno e
astaxantina contra a nefrotoxicidade causada pelo HgCl
2
. Embora o rim não seja o
órgão preferencial para o acúmulo de licopeno e astaxantina, esse órgão parece
desempenhar importante papel no metabolismo destes carotenóides (Zharipheh et
al., 2003; Page & Davies, 2006).
Os resultados deste trabalho revelaram que o pré-tratamento com licopeno e
astaxantina preveniu a peroxidação lipídica induzida por mercúrio, mas não o
aumento nos níveis plasmáticos de creatinina causado por este metal. Muitos
autores sugerem que a prevenção da peroxidação lipídica é responsável pelo efeito
protetor conferido por licopeno e astaxantina contra danos teciduais induzidos por
muitos compostos (Kang et al., 2001; Kim et al., 2005a; Kim et al., 2005b;
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83
Atessahin et al. 2005; Karahan et al. 2005; Ylmaz et al. 2006). Embora o licopeno
não tenha prevenido a necrose tubular, a astaxantina protegeu parcialmente o tecido
renal dos danos causados pelo HgCl
2
.
Este é o primeiro estudo avaliando o efeito protetor do licopeno e astaxantina
sobre a inibição da enzima sulfidrílica δ-ALA-D por metais. Já foi demonstrado que o
licopeno previne a redução dos níveis de GSH causada por cisplatina (Atessahin et
al., 2005). Dessa forma, um efeito protetor seria esperado também sobre outros tióis
endógenos. Neste sentido, observou-se no presente estudo que o licopeno protegeu
a δ-ALA-D da inibição causada por HgCl
2
. No entanto, a ASX não apresentou efeitos
protetores sobre a δ-ALA-D, sugerindo que diferentes carotenóides possuem
diferentes mecanismos de ação.
O licopeno e a astaxantina preveniram as alterações nas enzimas
antioxidantes induzidas por HgCl
2
,
em contraste com a ausência de proteção do β-
caroteno contra alteração na atividade da GSH-Px causada por MeHg (Andersen &
Andersen, 1993). As três doses de licopeno avaliadas preveniram o efeito do HgCl
2
sobre a enzima antioxidante CAT. Entretanto, os animais pré-tratados com 10 mg/kg
de licopeno e expostos ao HgCl
2
apresentaram atividade da CAT menor que os
animais do grupo controle sem pré-tratamento com licopeno. Embora o licopeno
também tenha prevenido a redução da atividade da SOD e GSH-Px, esse efeito foi
observado apenas nas doses de 10 e 25 mg/Kg e 10 e 50 mg/Kg, respectivamente.
Esses resultados podem estar relacionados ao efeito do licopeno sozinho sobre as
enzimas antioxidantes descrito por Breinholt et al. (2000), que observou que o
licopeno, em doses baixas, aumentou a atividade das enzimas antioxidantes,
enquanto em doses mais altas, as atividades foram reduzidas aos níveis controle. A
ação antioxidante do licopeno poderia alterar a homeostase entre
oxidantes/antioxidantes no organismo, uma vez que a atividade da CAT foi
aumentada e a atividade da SOD foi diminuída pelo licopeno, mesmo na ausência
de um tratamento prooxidante (Moreira et al., 2005). Além de não apresentar efeito
per se sobre nenhum dos parâmetros avaliados neste trabalho, a ASX protegeu as
enzimas antioxidantes das alterações causadas pelo HgCl
2
em todas as doses
estudadas.
Os efeitos protetores do licopeno têm sido associados a sua atividade
antioxidante frente a espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (Mortensen et al.
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84
1997; Musandu et al.; 2006). Por outro lado, Wu et al. (2006) sugerem que além da
atividade antioxidante, ASX pode ligar íons divalentes, como cálcio e outros. Em
acordo com essa hipótese, Zhao et al. (2005) sugerem que os átomos de oxigênio
em cada anel da ASX podem coordenar íons metálicos como Cu (II) e Fe (III). Estes
mecanismos, em conjunto, explicariam o efeito protetor desses carotenóides frente
aos danos causados por Hg
+2
observado nesse estudo.
Os resultados deste trabalho indicam que, embora o licopeno tenha prevenido
a inibição da enzima δ-ALA-D, esse carotenóide não foi capaz de prevenir as
alterações histopatológicas causadas pelo HgCl
2
. Além disso, ele apresentou efeito
per se sobre a atividade das enzimas antioxidantes. Por outro lado, todas as doses
estudadas de ASX restauraram as enzimas antioxidantes e impediram a peroxidação
lipídica causada por HgCl
2
, sem causar nenhum efeito per se sobre a atividade das
enzimas antioxidantes. Além disso, a ASX preveniu parcialmente as alterações
histopatológicas causadas pelo HgCl
2
. Entretanto, esse carotenóide não protegeu a
enzima δ-ALA-D da inibição causada pelo HgCl
2
. Esse resultado contrasta com
trabalhos que apontam o licopeno como o principal antioxidante da classe dos
carotenóides (Stahl & Sies 2003). Essa discrepância está relacionada,
provavelmente, a ausência de anéis polares na estrutura do licopeno, o que limitaria
sua atividade antioxidante ao interior da membrana, uma vez que a estrutura é
totalmente hidrofóbica. Adicionalmente, carotenóides apolares, tais como o licopeno
e o β-caroteno, têm sido apontados como sendo capazes de aumentar a
permeabilidade da bicamada lipídica da membrana, permitindo a entrada de
oxidantes polares. Desse modo, esses carotenóides poderiam agir como
prooxidantes, mascarando sua atividade antioxidante (Britton, 1995).
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85
5 CONCLUSÕES
Os resultados do presente trabalho indicam que:
→
→
→
A exposição aguda ao HgCl
2
provocou inibição da atividade da enzima
δ-ALA-D renal e esse efeito foi parcialmente prevenido por licopeno (10 e 50 mg/Kg),
mas não por astaxantina;
→
→
→
A exposição aguda ao HgCl
2
não afetou os níveis de SHNP e atividade
da enzima GST nos rins, bem como os níveis plasmáticos de ácido úrico; licopeno e
astaxantina também não causaram nenhum efeito per se sobre tais parâmetros;
→
→
→
A exposição aguda ao HgCl
2
provocou danos à função renal,
evidenciado pelo aumento nos níveis plasmáticos de creatinina e pela presença de
necrose tecidual. Embora o aumento nos níveis plasmáticos de creatinina não tenha
sido prevenido por nenhum dos carotenóides estudados, a ocorrência de necrose
tecidual foi parcialmente prevenida por astaxantina, mas não por licopeno;
→
→
→
A exposição aguda ao HgCl
2
causou peroxidação lipídica e alteração
na atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT e GSH-Px. Tais efeitos foram
parcialmente prevenidos por licopeno e totalmente prevenidos por astaxantina;
Apesar do licopeno e da astaxantina não terem evitado a falência renal
causada pelo HgCl
2
, os resultados deste trabalho sugerem que tais carotenóides
podem oferecer proteção contra a peroxidação lipídica e as alterações das enzimas
antioxidantes causadas pelo HgCl
2
. Além disso, o licopeno protegeu a enzima δ-
ALA-D contra inibição causada por HgCl
2
, enquanto a astaxantina preveniu
parcialmente as alterações histopatológicas causadas pelo metal.
Assim, licopeno e
astaxantina podem desempenhar um papel benéfico contra a nefrotoxicidade
causada por HgCl
2
. Entretanto, mais estudos são necessários antes de uma
conclusão definitiva sobre o potencial destes carotenóides como adjuntos na
prevenção e tratamento de intoxicações causadas por mercúrio.
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7 ANEXOS
7.1 ANEXO A – Comprovante de aceite do manuscrito “Effect of lycopene on
nephrotoxicity induced by mercuric chloride” pela Revista Basic & Clinical
Pharmacology & Toxicology
Decision
Manuscript title:
Effect of lycopene on
nephrotoxicity induced by mercuric chloride
in rats
Manuscript type:
Original Article
All Authors:
Augusti, Paula R.; Conterato, Greicy M.M.; Somacal,
Sabrina;Einsfeld, Lídia; Ramos, Adriano T.; Hosomi, Fernando
Y.M.; Graça, Dominguita L.; Emanuelli, Tatiana.
Decision:
Accept
Submission number:
2
Decision date:
2007-01-15
Decision letter:
It is a pleasure to inform you that the above manuscript is
acceptable for publication.
It should be noted that the authors will be charged GBP
150 for each page by which the article exceeds 6 pages in
the printed issue (or 2 pages for Short Communications) incl.
tables and figures and for coloured illustrations (see
"Notice to Contributors", Basic & Clinical Pharmacology &
Toxicology 2007, 100, 71-72, and homepage www.bcpt.org or
www.blackwellpublishing.com/pto (in "Notice to Contributors"
see "For authors" and "View a sample issue").
Please CONFIRM that you accept to pay page charge for each
page over and above 6 printed pages and for coloured
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Please confirm by e-mail to fighm@farmakol.ku.dk
Please also send fig. 3 which is missing in the available Word
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the coloured figure.
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with ORIGINAL signature to the address indicated at the very
bottom of the form. The form can be downloaded from the
abovementioned homepages.
When received the manuscript will be subjected to editorial
revision, and proofs will appear in 2-3 months.
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For further correspondence regarding the publication of the
manuscript, please contact Grete Hoppe Mouret at
fighm@farmakol.ku.dk
I thank you very much for submitting this valuable report and
hope that you will continue to consider Basic & Clinical
Pharmacology & Toxicology the primary journal of publication for
your most interesting and important studies.
Yours sincerely
Kim Brøsen
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7.2 ANEXO B – Comprovante de submissão do manuscrito “Effect of
astaxanthin on kidney function changes and oxidative stress induced by
mercuric chloride in rats” à Revista Food and Chemical Toxicology
De:
josephfborzelleca@comcast.net
Para: etaty@terra.com.br, tatiemanuelli@smail.ufsm.br
Cópia:
Data: Sun, 11 Feb 2007 20:05:41 -0000
Assunto:
Editor handles FCT-D-07-00085
Ms. Ref. No.: FCT-D-07-00085
Title: Effect of astaxanthin on changes in kidney function and oxidative stress
induced by mercuric chloride in rats.
Food and Chemical Toxicology
Dear Tatiana,
Your submission entitled "Effect of astaxanthin on changes in kidney function and
oxidative stress induced by mercuric chloride in rats." will be handled by
Receiving Editor Joseph Borzelleca, PhD.
The review process for this journal takes 8-10 weeks on average so please be
patient. You may check on the progress of your paper by logging on to the
Elsevier Editorial System as an author. The URL is http://ees.elsevier.com/fct/.
Thank you for submitting your work to this journal.
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