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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CÊNCIAS
BIOLÓGICAS: BIOQUÍMICA TOXICOLÓGICA
CRESCIMENTO E PARÂMETROS
TOXICOLÓGICOS EM JUNDIÁS (Rhamdia
quelen) EXPOSTOS A UMA FORMULAÇÃO
COMERCIAL DO HERBICIDA 2,4-D
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Milene Braga da Fonseca
Santa Maria, RS, Brasil
2007
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2
CRESCIMENTO E PARÂMETROS TOXICOLÓGICOS EM
JUNDIÁS (Rhamdia quelen) EXPOSTOS A UMA
FORMULAÇÃO COMERCIAL DO HERBICIDA 2,4-D
Por
Milene Braga da Fonseca
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica, da Universidade
Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial
para a obtenção do grau de
Mestre em Bioquímica Toxicológica
Vania Lucia Loro
(Orientadora)
Santa Maria, RS, Brasil
2007
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Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Naturais e Exatas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas:
Bioquímica Toxicológica
A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação
de Mestrado
CRESCIMENTO E PARÂMETROS TOXICOLÓGICOS EM JUNDIÁS
(Rhamdia quelen) EXPOSTOS A UMA FORMULAÇÃO COMERCIAL DO
HERBICIDA 2,4-D
Elaborada por
Milene Braga da Fonseca
Como requisito parcial para a obtenção do grau de
Mestre em Bioquímica Toxicológica
COMISSÃO EXAMINADORA:
Vania Lucia Loro
(Presidente/Orientador)
Bernardo Baldisserotto, Dr (UFSM)
Luis Antônio de Avila, Dr (UFSM)
Santa Maria, 27 de setembro de 2007.
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DEDICATÓRIA
À minha mãe, SOLAGEM, por ter me dado a vida e ter
lutado com toda a garra por ela, pelas noites em claro, pelo entusiasmo e
amor.
Ao mau pai, LAURINDO, meus avós, GLICÉRIO,
ARNO e IRENA, pois onde estiverem essa vitória também é de vocês (in
memorian).
À minha avó GENOÁ e demais familiares pela
compreensão às minhas faltas.
Ao meu amor, ADEJALTO, pois desde que chegaste à
minha vida trouxe uma maré de tranqüilidade e alegrias.
À minha “segunda mãe”, VANIA LUCIA LORO, pois
me fez crescer e enfrentar os obstáculos de frente.
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AGRADECIMENTOS
À DEUS por ter me dado a oportunidade de viver e chegar até aqui,
conhecendo todas essas pessoas maravilhosas que cruzaram o meu caminho.
A toda minha família pelo incentivo, carinho e compreensão, muito
obrigada.
À minha orientadora, Profª Drª Vania Lucia Loro, pela oportunidade,
pelo conhecimento, pelo tempo dedicado, principalmente pela lição de vida,
sempre mostrando a profissional competente e amiga nas horas mais difíceis,
obrigada chefinha.
À minha grande amiga Charlene, mais do que colega, uma companheira
fiel e incansável, muito obrigada por tudo.
À inesquecível Alexandra, parceira para todas as horas, sempre
disposta ao que der e vier, muito obrigada de todo o meu coração.
À amiga Bibiana, demorei um pouco pra te conhecer, mas quando
conheci de verdade roubaste um pedacinho do meu coração, obrigada pelo
companheirismo.
À querida Alice, sempre dedicada e disposta, muito obrigada pela ajuda
e pela amizade.
À amiga Lissandra, no começo foi meio difícil, tivemos alguns
contratempos, mas posso dizer que hoje tu fazes parte do meu coração, muito
obrigada pelas colaborações sempre valiosas.
Às muito queridas Bárbara e Roberta, cada uma de um jeito especial
consegue alegrar a todos, obrigada pela ajuda.
Às colegas Denise, Aracéli e Rita, muito obrigada pela colaboração e
amizade e carinho.
À UFSM, ao PPGBTOX, aos demais professores, ao CNPq, à todos que
contribuíram de alguma maneira para a realização deste trabalho, muito
obrigada.
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6
SUMÁRIO
SUMÁRIO.........................................................................................................06
LISTA DE FIGURAS.........................................................................................08
LISTA DE TABELAS.........................................................................................09
RESUMO..........................................................................................................10
ABSTRACT.......................................................................................................12
1.INTRODUÇÃO...............................................................................................14
2.OBJETIVOS...................................................................................................15
2.1. OBJETIVO GERAL....................................................................................15
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................15
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.........................................................................16
3.1. CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL.................................................................16
3.2. HERBICIDA 2,4-D......................................................................................17
3.2.1. TOXICIDADE DO 2,4-D EM PEIXES......................................................18
3.3. Rhamdia quelen (JUNDIÁ).........................................................................19
3.4. PARÂMETROS DE CRESCIMENTO.........................................................20
3.5. INTERMEDIÁRIOS METABÓLICOS.........................................................20
3.6. ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (EROS)........................................21
4.RESULTADOS...............................................................................................23
4.1. MANUSCRITO 1: Long time 2,4-D exposure on teleostean fish silver
catfish (Rhamdia quelen): evaluate of growth, some metabolic and enzymatic
parameters. Milene Braga da Fonseca, Alexandra Pretto, Charlene Cavalheiro
de Menezes, Bibiana Silveira Moraes, Bárbara Clasen, Vânia Lucia
Loro...................................................................................................................23
4.2. MANUSCRITO 2: 2,4-D herbicide affect toxicological and metabolic
parameters of fish Rhamdia quelen. Milene Braga da Fonseca, *Vânia Lúcia
Loro, Bárbara Clasen, Alexandra Pretto, Alice Raabe and Bernardo
Baldisserotto .....................................................................................................41
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7
5.DISCUSSÃO..................................................................................................58
6.CONCLUSÕES..............................................................................................61
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................62
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8
LISTA DE FIGURAS
MANUSCRITO 1:
FIGURA 01: Catalase activity in the liver of silver catfish (Rhamdia quelen)
exposed to 2,4-D (90 days). Values are means ± SD (n=8). Data are expressed
as µmol mg
-1
protein
min
-1
* Indicates difference between groups and control
values (P≤0.05).
FIGURA 02: Protein and glucose levels of the mucus layer of Rhamdia quelen
after chronic
exposure (90 days) to 2,4-D herbicide. Data represent the mean ±
SD (n=8).
*
indicates significant difference from control (P≤ 0.05).
FIGURA 03: TBARS levels (nmol MDAmg
-1
of protein) in brain, liver and white
muscle of Rhamdia quelen exposed to 0.2 and 0.4 mg L
-1
2,4-D for 90 days.
Data represent the mean ± SD (n=8).
*
Indicates difference between groups and
control values (P≤0.05).
MANUSCRITO 2:
FIGURA 01: Catalase activity in the liver of silver catfish (Rhamdia quelen)
exposed to 2,4-D (96 hours). Values are means ± SD (n=8). Data are
expressed as µmol mg
-1
protein
min
-1
* Indicates difference between groups
and control values (P≤0.05).
FIGURA 02: TBARS levels (nmol MDA mg
-1
of protein) in brain, liver and white
muscle of Rhamdia quelen exposed to 0.2 and 0.4 mgL
-1
2,4-D for 96 hours.
Data represent the mean ± SD (n=8).
*
Indicates difference between groups and
control values (P≤0.05).
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10
LISTA DE TABELAS
MANUSCRITO 1:
TABELA 01: Growth parameters of silver catfish (Rhamdia quelen) after
exposure (90 days) to 2,4-D herbicide at 0.0 (Control), 0.5 or 2.0 mg L
-1
.
*
Indicates (In line) significant difference from control (P≤ 0.05).
TABELA 02: Hepatic, white muscle, kidney and blood metabolites of Rhamdia
quelen exposed to different concentrations (mgL
-1
) of 2,4-D
for 90 days.
Glucose and lactate were expressed in µmol g
-1
tissue. Glycogen was
expressed in µmol glycosyl-glucose g
-1
tissue. Protein was expressed as mg g
-1
tissue. Data represent the mean ± SD (n=8).
*
Indicates difference between
groups and control values (P≤0.05).
MANUSCRITO 2:
TABELA 01: Metabolic parameters (μmol g
-1
tissue or ml plasma) in liver, white
muscle, kidney and blood of Rhamdia quelen exposed to 0.0, 0.5 or 2.0 mg L
-1
2,4-D for 96 hours.
*
Indicates difference between groups and control values
(P≤0.05).
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RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica
Universidade Federal de Santa Maria
CRESCIMENTO E PARÂMETROS TOXICOLÓGICOS EM JUNDIÁS
(Rhamdia quelen) EXPOSTOS A UMA FORMULAÇÃO COMERCIAL DO
HERBICIDA 2,4-D
Autora: Milene Braga da Fonseca
Orientadora: Vania Lucia Loro
Data e local de defesa: Santa Maria, 27 de setembro de 2007.
Neste estudo, jundiás (Rhamdia quelen) foram expostos a uma formulação
comercial do herbicida 2,4-D: 0,0 (controle), 0,5 ou 2,0 mg L
-1
por 90 dias ou 96
horas. Após os períodos experimentais foram avaliados o crescimento (90
dias), composição do muco, parâmetros metabólicos, formação de TBARS em
diferentes tecidos e atividade da catalase. R. quelen apresentou redução em
alguns parâmetros do crescimento como média da massa final que reduziu
37% e 45% respectivamente para 0,5 ou 2,0 mg L
-1
, comprimento total do
corpo de 15% para a concentração 2,0 mg L
-1
. O ganho de massa diário
reduziu 55% e 58% para ambas as concentrações testadas. O crescimento
específico diminuiu de 1,20 (controle) para 0,72 e 0,60 respectivamente para
ambas as concentrações testadas. O fator de condição reduziu 22% e 12%
para as concentrações de 0,5 ou 2,0 mg L
-1
de 2,4-D. Os jundiás apresentaram
alterações no muco como o decréscimo do açúcar solúvel para ambas as
concentrações testadas e aumento nos níveis de proteína em 2,0 mg L
-1
do
herbicida após 90 dias e 96 horas de exposição. Os peixes expostos ao
herbicida 2,4-D a 0,5 ou 2,0 mg L
-1
apresentaram redução nos níveis de
glicogênio e proteína no tecido do fígado após 90 dias de exposição. Mas este
tecido apresentou aumento nos níveis de glicose e lactato para ambas as
concentrações testadas. O fígado de R. quelen após 96 horas de exposição
apresentou aumento nos níveis de glicogênio e redução nos níveis de lactato e
proteína em ambas as concentrações testadas, mas não teve diferença
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12
significativa nos valores de glicose. O tecido muscular após 90 dias de
exposição ao 2,4-D mostrou redução nos valores de glicogênio e proteína na
concentração mais alta testada e decréscimo na glicose para ambas as
concentrações de 2,4-D, porém os níveis de lactato aumentaram em ambas as
concentrações testadas. Após 96 h de exposição o músculo apresentou
redução nos níveis de glicogênio e lactato quando comparado com os valores
do controle. O tecido do rim mostrou redução nos valores de glicogênio e
glicose, mas um aumento no lactato para ambas as concentrações de 2,4-D e
os níveis de proteína não estiveram alterados quando comparados com os
valores de controle. Este tecido após 96 h de exposição a 0,5 ou 2,0 mg L
-1
do
herbicida mostraram decréscimo nos níveis de lactato, mas os valores de
glicogênio, glicose e proteína não estiveram alterados. Os metabólitos do
plasma apresentaram redução nos níveis de lactato e proteína para ambas as
concentrações testadas. A glicose não esteve alterada após 90 dias de
exposição. Depois de 96 h o plasma mostrou redução nos níveis de lactato,
mas glicose e proteína não tiveram alteração significante quando comparadas
com os valores do controle. A atividade da catalase hepática mostrou aumento
para ambos os experimentos em ambas as concentrações testadas. A
formação de TBARS após 90 dias de exposição ao 2,4-D mostrou decréscimo
no tecido do fígado, mas aumento no músculo branco. TBARS no cérebro não
esteve alterado neste experimento. Após 96 h de exposição, os níveis de
TBARS aumentaram no tecido do fígado e não tiveram alteração nos tecidos
do cérebro e músculo branco quando comparado com os valores do controle.
Os dados demonstram que o herbicida 2,4-D altera alguns parâmetros do
crescimento após longo tempo de exposição. Em adição, este herbicida causa
alterações nos parâmetros metabólicos e estresse oxidativo após 90 dias e 96
horas de exposição.
Palavras-chave: Rhamdia quelen, crescimento, metabolismo, catalase, TBARS,
2,4-D, herbicida.
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13
ABSTRACT
Master Dissertation
Biological Sciences: Toxicological Biochemistry Post-Graduation
Universidade Federal de Santa Maria
GROWTH AND TOXICOLOGICAL PARAMETERS OF SILVER CATFISH
(Rhamdia quelen) EXPOSED TO COMMERCIAL FORMULATION TO 2,4-D
HERBICIDE
Author: Milene Braga da Fonseca
Adviser: Vania Lucia Loro
Place and date: Santa Maria, September 27, 2007
In this study, silver catfish (Rhamdia quelen) were exposed to commercial
formulation to 2,4-D herbicide at 0.0 (control) 0.5 or 2.0 mg L
-1
for 90 days or 96
hours. After the exposure were evaluated the growth, mucous layer
composition, metabolic parameters, TBARS formation in different tissues and
liver catalase activity. R. quelen showed reduction on some growth parameter
as final mean mass that decrease on 37% and 46% respectively to 0.5 or 2.0
mg L
-1
, total body length to 15 % to high concentration tested. Daily mass gain
reduced to 55% and 58% to both concentrations tested. The specific growth
decrease of 1.20 (control) to 0.72 and 0.60 respectively to both concentrations
tested. The factor of condition reduced 22% and 12% for 0.5 or 2.0 mg L
-1
2,4-D
concentration. The silver catfish showed alterations on mucous layer contents
as decrease of soluble sugar at both concentrations tested and increase of
protein levels at 2.0 mg L
-1
to herbicide concentration after 90 days and 96
hours of exposure. Fish exposed to 2,4-D herbicide at 0.5 or 2.0 mg L
-1
presented glycogen reduction and protein level in the liver tissue after 90 days
of exposure. But this tissue showed increase in lactate and glucose levels at
both concentrations tested. The liver tissue of R. quelen after 96 h of exposure
showed increased to glycogen level and reduced to lactate and protein levels to
both concentrations tested, but were not significantly difference to glucose
values. The muscle tissue after 90 days of exposure to 2,4-D showed reduced
to glycogen and protein values at high concentration tested and decreases to
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14
glucose at both 2,4-D concentrations. Lactate levels were increased to 0.5 or
2.0 mg L
-1
to 2,4-D herbicide. After 96 h of exposure this tissue presented
reduced to glycogen and lactate levels, but the glucose and protein values was
not altered as compared to control values. The kidney tissue showed decrease
to glycogen and glucose values, but lactate was increased at both
concentrations of 2,4-D and protein levels were not altered as compared to
control values. This tissue after 96 h of exposure to 0.5 or 2.0 mg L
-1
of
herbicide showed decrease to lactate levels, but glycogen, glucose and protein
values was not altered. The plasm metabolites presented reduction of lactate
and protein levels at both concentrations tested. Glucose was not altered after
90 days of exposure. After 96 h the plasm showed reduction in lactate level, but
glucose and protein was not significantly alteration as compared to control
values. Catalase activity showed enhanced to both experimentation and both
concentrations, values as compared to control. TBARS formation after 90 days
to 2,4-D exposure showed decrease to liver tissue, but enhanced in white
muscle. TBARS in brain tissue was not altered in this experimentation. After 96
h of 2,4-D exposure TBARS levels enhanced to liver tissue and was not
alteration in the brain and white muscle tissue as compared to control values.
Data demonstrated that 2,4-D herbicide alter the some growth parameters after
long time exposure. Besides, this herbicide causes alterations on metabolic
parameter and oxidative stress after 90 days and 96 hours of exposure.
Keywords: Rhamdia quelen, growth, metabolism, catalase, TBARS, 2,4-D,
herbicide.
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15
1 - INTRODUÇÃO
A manipulação descuidada de pesticidas pode levar a uma
contaminação acidental de sistemas aquáticos causando efeitos prejudiciais a
diferentes organismos que habitam esses meios, dentre eles as populações de
peixes (Jiraungkoorskul et al., 2002). A presença de herbicidas, classe de
pesticidas que controlam pragas vegetais, no ambiente aquático é
conseqüência do seu uso no controle das plantas daninhas e vegetação
rasteira, porém pouco se conhece sobre a toxicidade destes produtos em
organismos aquáticos não alvo como os peixes (Jyothi & Narayan, 1999). Os
efeitos tóxicos dos diferentes pesticidas empregados no meio agrícola em
peixes variam amplamente, e ocorrem devido à absorção passiva destas
substâncias tóxicas através das brânquias e pela superfície do corpo (Szarek,
2000).
Entre os herbicidas utilizados nas culturas agrícolas do RS, o 2,4-diamin
(2,4-D) é utilizado devido ao seu baixo custo e boa seletividade. De acordo com
Gallagher & Di Giulio (1991), o herbicida 2,4-D em baixas concentrações pode
ser considerado pouco tóxico para peixes. Porém, estudos recentes com a
espécie nativa do RS Leporinus obtusidens mostram que o peixe pode reter até
30% deste composto (Fonseca et al., 2007).
Considerando a importância de elucidar os mecanismos de toxicidade de
pesticidas utilizados em agricultura sobre peixes nativos de nossa região,
escolhemos como modelo experimental o jundiá. O jundiá (Rhamdia quelen) é
uma espécie endêmica da região Sul da América do Sul, podendo sobreviver
ao frio do inverno da região e obter um ótimo crescimento no verão. Além
disso, possui boa aceitação comercial, sendo assim, um peixe com um bom
potencial para o cultivo (Barcellos et al., 2003).
Quando o organismo é afetado por uma substância tóxica, ocorrem
respostas fisiológicas e bioquímicas na tentativa de se obter uma adaptação ou
desenvolvimento de toxicidade. As respostas bioquímicas normalmente são
mais sensíveis, portanto as primeiras passíveis de determinação (Begum,
2004). A presença de herbicidas na água pode causar alterações fisiológicas
em peixes, as quais podem ser avaliadas através dos parâmetros metabólicos,
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16
tais como níveis de lactato, glicose, proteína e glicogênio em diferentes tecidos
(Sancho et al., 1998; Jyoti & Naraian, 1999, Crestani et al.; 2006). Alterações
metabólicas no tecido hepático são freqüentemente encontradas em peixes
expostos a diferentes componentes tóxicos encontrados na água, já que o
fígado é o órgão central responsável pela detoxificação do organismo (Oruç &
Üner, 1999).
A contaminação das águas pode acarretar estresse oxidativo em peixes,
com a formação de espécies reativas que são conhecidas devido aos danos
que causam aos tecidos, dentre elas podemos citar o ânion radical superóxido
(O
2
-
), o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e o radical hidroxila (
-
OH) (Oruç & Üner,
2000, Üner et al., 2005). Em resposta à formação dessas espécies reativas, os
organismos apresentam uma série de mecanismos de defesa a fim de
neutralizá-las, dentre eles estão os sistemas de defesa antioxidante (Monteiro
et al., 2006).
Tendo em vista que a contaminação dos ambientes aquáticos é um fato,
e que os peixes são alvos indiretos desta contaminação, tornam-se
necessárias avaliações toxicológicas de pesticidas utilizados na agricultura
nestes organismos, uma vez que muitos são consumidos diretamente após
despesca.
2 - OBJETIVOS
2.1 – OBJETIVO GERAL
- Avaliar os efeitos do herbicida 2,4-D sobre o crescimento (90 dias) e
parâmetros toxicológicos em jundiás (Rhamdia quelen) expostos a
concentrações subletais em exposição aguda (96 horas) e prolongada (90
dias).
2.2 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS
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17
- Verificar se a exposição prolongada ao herbicida altera parâmetros de
crescimento em juvenis de jundiás expostos às concentrações subletais;
- Verificar se a composição básica do muco de peixes expostos ao herbicida
2,4-D por 96 horas ou 90 dias mostra alterações.
- Avaliar os intermediários metabólicos (glicogênio, glicose, lactato e proteína)
em diferentes tecidos de Rhamdia quelen após exposição aguda e prolongada
ao herbicida 2,4-D;
- Analisar a atividade da enzima catalase e a formação de TBARS (espécies
reativas ao ácido tiobarbitúrico) em jundiás após as exposições ao herbicida.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 - CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL
As práticas agrícolas estão diretamente relacionadas com o uso de
pesticidas, a fim de controlar as pestes que atacam os produtos cultivados na
agricultura, aumentando a produtividade. Entretanto o uso contínuo destes
produtos pode ser tóxico, podendo até mesmo ser mutagênico e cancerígeno
(Primel et al., 2005). O uso indiscriminado de pesticidas na agricultura é uma
grande causa de envenenamento no mundo, pois cerca de três milhões de
casos de envenenamento severo são registrados e destes, duzentos e vinte mil
culminam com a morte. De acordo com as estatísticas, 99% dos casos
registrados ocorrem em países de terceiro mundo, onde os cuidados com a
aplicação e dosagem costumam ser menores (Banerjee et al. 1999).
A contaminação dos ambientes aquáticos por estes pesticidas oriundos
das práticas agrícolas se tornou um problema de grande importância mundial.
Atualmente, existem duas maneiras principais através das quais os pesticidas
podem se concentrar no ambiente aquático: uma delas é devido a sua
persistência no solo, que ao ser lixiviado libera-os para os cursos de água. A
outra forma de contaminação ocorre através de sua evaporação para a
atmosfera, chegando até o meio aquático por precipitação (Pan & Dutta, 1998).
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18
Além da possibilidade de contaminação dos cursos de água naturais, temos os
sistemas de criação de peixes, prática muito empregada na região Sul da
América do Sul. Grande parte dos criadouros localiza-se próximo ou dentro de
áreas de plantações agrícolas, mantendo assim, um contato direto dos animais
com os produtos químicos utilizados nas lavouras (Soso et al., 2007).
Esses tóxicos causam alterações na composição química dos ambientes
aquáticos, o que pode causar sérios prejuízos à fauna natural (Oruç et al.,
2004; Adhikari et al., 2004). Assim, a presença contínua de componentes
tóxicos nas águas pode causar alterações diversas em peixes, inclusive no
comportamento reprodutivo, podendo chegar até mesmo à mortalidade destes
indivíduos. Um efeito a longo tempo pode culminar, inclusive, com a extinção
de espécies mais susceptíveis a esse tipo de variação ambiental (Soso et al.,
2007).
3.2 – HERBICIDA 2,4-D
O herbicida 2,4-D, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, por ser um herbicida
de baixo custo e que possui uma boa seletividade, é amplamente utilizado na
região Sul do Brasil no controle de algumas plantas daninhas que infestam as
plantações agrícolas. Este herbicida possui uma baixa biodegradabilidade,
tendo seus resíduos encontrados em boa parte dos cursos de água da região
(Primel et al., 2005). A concentração indicada para o uso do herbicida 2,4-D
nas plantações da região Sul está entre 0,5 e 1,1 mg L
-1
Rodrigues & Almeida
(2005). De acordo com Primel et al. (2005) este herbicida possui um baixo
potencial de contaminação de águas da superfície e um potencial intermediário
na contaminação de águas subterrâneas na região Sul do Brasil. Os herbicidas
clorofenoxiacéticos, como o 2,4-D, são utilizados para matar plantas daninhas
por suas propriedades químicas que os tornam semelhantes à auxina, o
hormônio do crescimento das plantas, realizando uma superestimulação do
crescimento que irá culminar com a sua morte (Orüç et al., 2004; Benli et al.,
2007). A toxicidade do herbicida 2,4-D em peixes depende da formulação
utilizada, sendo que algumas fórmulas são extremamente tóxicas enquanto
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19
outras causam um prejuízo menor aos organismos expostos (Sarikaya & Selvi,
2005). A formulação comercial do 2,4-D (sal dimetilamina do ácido 2,4-
diclorofenoxiacético) é composta por 72% (720 g L
-1
) do equivalente em ácido e
86,8% do sal dimetilamina, (BASF, São Bernardo do Campo, SP, Brasil),
registrado sob o número 04118189, Chemical Abstract Service 94-75-7.
3.2.1 – TOXICIDADE DO 2,4-D EM PEIXES
A toxicidade aguda do herbicida 2,4-D é relatada por diversos autores,
dentre eles Sarikaya & Selvi (2005), que obtiveram valores de concentração
letal média (CL
50
) entre 28,23 e 86,90 mg L
-1
respectivamente para larvas e
adultos de tilápia em 48 horas de experimento. Astacus leptodactylus mostrou
ser uma espécie muito sensível a este herbicida já que o valor de CL
50
-96
horas foi de 32,6 mg L
-1
(Benli et al., 2007). O Laboratório de Bioquímica
Adaptativa e Toxicológica encontrou um valor para CL
50
de jundiás em 96
horas de 745 mg L
-1
(dados não publicados). O jundiá pode ser considerado
uma espécie mais resistente ao 2,4-D, quando se avalia somente a toxicidade
aguda 96h. O herbicida 2,4-D é conhecido por causar alterações no sistema
nervoso central, inibindo a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE),
(Benli et al., 2007). Um estudo realizado em nosso laboratório de pesquisa
demonstrou que o herbicida 2,4-D altera alguns parâmetros bioquímicos, como
intermediários metabólicos nos tecidos, e inibe a atividade da enzima
acetilcolinesterase em cérebro e músculo de piavas Leporinus obtusidens. Os
peixes foram expostos por 96 horas às concentrações subletais (1,0 ou 10,0
mg L
-1
) da formulação comercial do herbicida (Fonseca et al., 2007). Neste
estudo também se observou que em 96 horas o peixe pode absorver até 30%
do composto. Em eritrócitos humanos, um decréscimo na atividade da
actilcolinesterase (in vitro) esteve relacionado ao aumento da formação de
espécies reativas de oxigênio (Bukowska et al., 2006). Oruç et al. (2004)
relataram que a exposição aguda (96 horas) ao herbicida 2,4-D leva a uma
situação de estresse oxidativo em carpas (Cyprinus carpio), com aumento na
atividade de enzimas antioxidantes, como a superóxido dismutase (SOD) e a
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20
catalase. O efeito do 2,4-D em carpas pode ser potencializado quando a
exposição ao herbicida é combinada com o inseticida azinphosmethyl (Oruç et
al., 2004). Em tilápias (Oreochromis niloticus) o 2,4-D e azinphosmethyl e
também o efeito individual destes pesticidas se mostrou bastante tóxico,
alterando a atividade do sistema antioxidante dos peixes expostos durante 24,
48, 72 e 96 horas (Oruç & Üner, 2000). Outro efeito conhecido do herbicida 2,4-
D é a alteração em parâmetros do metabolismo de carboidratos e proteínas em
peixes (Cyprinus carpio) expostos ao herbicida por 1, 2, 3, 4,15 e 30 dias às
concentrações subletais de 50 e 80 mg L
-1
. As alterações observadas incluem
redução no glicogênio e aumento das proteínas no fígado, e inibição das
aminotransferases (GOT) e (GPT) no plasma (Oruç & Üner 1999).
3.3 – JUNDIÁ (RHAMDIA QUELEN):
O jundiá (Rhamdia quelen) é uma espécie de teleósteo nativa da região
Sul da América do Sul (Barcellos et al., 2003). Esta espécie do gênero
Rhamdia, pertencente à família Heptapteridae, tem preferência de viver em
águas calmas, se escondendo em baixo de troncos e pedras, possui hábitos
noturnos. O hábito alimentar é preferencialmente onívoro, porém possuem uma
clara tendência à carnívoro (Gomes et al., 2000, Baldisserotto & Radünz Neto,
2004). Esta espécie é considerada rústica, pois tem a capacidade de
sobreviver ao intenso frio da região Sul do Brasil durante o inverno, bem como
potencializar o seu crescimento durante o verão (Barcellos et al., 2003; Soso et
al., 2007). Alevinos de Rhamdia quelen também são capazes de sobreviver a
diversas alterações na qualidade da água, como temperatura, salinidade, pH,
dureza, conforme relatado por Gomes et al. (2000). Devido às características
de sobrevivência desta espécie, ela se torna bastante favorável para as
práticas de aqüicultura que são bem freqüentes na região Sul do Brasil,
principalmente no Rio Grande do Sul (Barcellos et al., 2003; Lazzari et al.,
2006). Além disso, esses peixes possuem uma carne de sabor agradável que é
bem aceita pelos consumidores (Lazzari et al., 2006). Sendo assim, esta
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21
espécie apresenta grande importância comercial e possui boas características
para o cultivo em nossa região.
3.4 – PARÂMETROS DE CRESCIMENTO
Alterações na qualidade da água podem causar mortalidade e reduzir a
produtividade dos peixes. Assim, os testes de toxicidade são baseados na
sobrevivência, no crescimento e na reprodução desses organismos não alvo
(Soso et al., 2007). Existem poucos estudos que relacionam a toxicidade de
pesticidas com o crescimento de organismos aquáticos como os peixes. Alguns
xenobióticos que são encontrados no ambiente podem levar as populações
expostas a distúrbios no sistema endócrino podendo afetar, assim, o
crescimento de muitos organismos (Keen et al., 2005). Um estudo do nosso
grupo mostra que piavas (Leporinus sp) após exposição prolongada ao
herbicida Roundoup
®
apresentaram redução nos parâmetros de crescimento e
várias alterações metabólicas após 90 dias de exposição (Salbego, 2005).
3.5 – INTERMEDIÁRIOS METABÓLICOS
Produtos tóxicos podem causar alterações biológicas em peixes, as
quais podem ser reconhecidas através da medida de alguns componentes do
metabolismo (Jyothi & Narayan, 1999). Parâmetros metabólicos são bastante
utilizados como indicadores gerais de estresse fisiológico em peixes (Lermen et
al., 2004). Dentro desses parâmetros, podemos citar aqueles integrantes do
metabolismo de carboidratos, como glicogênio, glicose e lactato, que com
freqüência se alteram nos tecidos e no sangue dos peixes (Begum &
Vijayaraghavan, 1999). Também é bastante utilizada a relação entre
carboidratos, proteínas e os caminhos metabólicos destes compostos (Aguiar
et al., 2004). As atividades teciduais são muito dependentes do metabolismo de
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22
proteínas por suas funções estruturais, catalíticas e regulatórias (Goto et al.,
2004).
Muitos autores descrevem os efeitos tóxicos de pesticidas sobre
parâmetros metabólicos em peixes. É conhecido que carpas comuns (Cyprinus
carpio) expostas ao herbicida 2,4-D (50 ou 80 mg L
-1
) sofrem alterações em
alguns parâmetros do metabolismo de carboidratos, como a redução do
glicogênio hepático e de proteínas em diferentes tecidos, como o aumento das
proteínas hepáticas, e a redução das aminotransferases neste tecido (Oruç &
Üner, 1999). Jundiás expostos a concentrações subletais do herbicida
clomazone apresentaram aumento nos níveis de glicogênio e proteína
hepáticos, uma redução significante do glicogênio do músculo, bem como um
aumento na glicose plasmática, além de outras alterações nos diferentes
tecidos (Crestani et al., 2006). Parâmetros metabólicos apresentaram
mudanças em relação ao grupo controle em piavas (Leporinus obtusidens)
expostas ao herbicida glifosato por 96 horas, tais como o aumento nos valores
de glicose e glicogênio do fígado, com uma significante redução destes no
músculo branco e também ocorreu redução nos níveis de lactato e proteína
hepática (Glusczak et al., 2006). Fonseca et al. (2007) demonstraram que
Leporinus obtusidens expostos ao herbicida 2,4-D por 96 horas às
concentrações de 1,0 ou 10 mg L
-1
apresentaram modificações no padrão de
alguns parâmetros metabólicos, como redução do glicogênio e lactato do
músculo branco, além do aumento dos níveis de proteína. No fígado observou-
se uma redução nos valores de lactato e proteína, sem alterações nos níveis
de glicose e glicogênio. No plasma foi encontrada redução nos valores de
glicose, bem como aumento nos níveis de proteína e lactato. O possível
estresse causado pela intoxicação com 2,4-D pode levar a estes efeitos tóxicos
citados.
3.6 – ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (EROS)
Organismos intoxicados por poluentes ambientais, ao metabolizá-los,
produzem constantemente espécies reativas de oxigênio (EROS) (Üner et al.,
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23
2005). Dentre elas temos o ânion radical superóxido (O
2
-
), o peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) e o radical hidroxila (
-
OH) (Oruç & Üner, 2000). Essas
moléculas, por sua vez, são altamente reativas, podendo causar diversos
danos aos tecidos produzindo peroxidação lipídica, danos ao DNA e oxidação
de proteínas, levando o organismo a uma situação de estresse oxidativo
(Livingstone, 2001; Monteiro et al., 2006). Em resposta ao perigo que
representa a formação dessas espécies reativas o organismo apresenta uma
variedade de mecanismos de defesa na tentativa de neutralizar o efeito
causado por elas, que consiste no sistema de defesa antioxidante (Monteiro et
al., 2006). A formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
pode ser diagnosticada como um biomarcador da peroxidação lipídica em
peixes (Almroth et al., 2005). O malonildialdeído (MDA) é um produto bem
característico da oxidação de ácidos graxos polinsaturados nas lipoproteínas.
Esses ácidos graxos são bastante sensíveis aos radicais hidroxilas (Almroth et
al., 2005).
A enzima catalase participa do mecanismo de defesa antioxidante e
pode ser utilizada como indicador de estresse oxidativo em peixes (Lionetto et
al., 2003, Ahmad et al., 2006; Monteiro et al., 2006). Esta enzima é uma
importante integrante do sistema de defesa antioxidante, e está localizada
principalmente nos peroxissomos. Ela é responsável pela redução do peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
) originado do metabolismo de longas cadeias de ácidos
graxos nos peroxissomos (Üner et al., 2005). Vários autores relatam alterações
nos sistemas de defesa antioxidante em peixes na presença de pesticidas.
Jundiás expostos às concentrações subletais de 0,5 ou 1,0 mg L
-1
do herbicida
clomazone mostram redução na atividade da catalase e um aumento nos níveis
de TBARS do fígado (Crestani et al., 2007). Jundiás expostos a concentrações
subletais de glifosato não apresentaram alteração na atividade da enzima
catalase, porém ocorreu aumento no TBARS, evidenciando peroxidação
lipídica no tecido muscular (Glusczak et al. 2007a). Piavas expostas por 96
horas ao herbicida glifosato apresentaram aumento na atividade da catalase
hepática de maneira dose-dependente, também apresentando aumento nos
níveis de TBARS neste tecido (Glusczak et al., 2007b). Tilápias (Oreochromis
niloticus) e carpas comuns expostas ao herbicida 2,4-D e ao inseticida
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25
4. RESULTADOS:
4.1. MANUSCRITO 1:
LONG TERM OF SILVER CATFISH (Rhamdia quelen) EXPOSURE TO
COMMERCIAL FORMULATION: GROWTH AND SOME METABOLIC AND
ENZYMATIC PARAMETERS
Milene Braga da Fonseca, Alexandra Pretto, Charlene Cavalheiro de Menezes,
Bibiana Silveira Moraes, Bárbara Clasen, Vania Lucia Loro*
Laboratório de Bioquímica Adaptativa, Departamento de Química, Universidade
Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil.
Corresponding Author:
(*) Dr Vania Lucia Loro
Departamento de Química
Universidade Federal de Santa Maria
97105.900 - Santa Maria, RS, Brazil
Phone: + 55 3220-9456
Fax: + 55 3220-8240
e-mail: vanial@smail.ufsm.br
vaniluc@yahoo.com.br
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26
Abstract
This study aimed to analyze 2,4-D effect on silver catfish (Rhamdia
quelen) after 90 days exposure to commercial formulation of 2,4-D herbicide at
0 (control), 0.5 or 2.0mgL
-1
. Growth and metabolic parameters as lactate,
glycogen, glucose and protein in liver, white muscle and kidney tissues were
determined. Catalase activity and TBARS in these tissues were studied.
Chronic exposure to 2,4-D herbicide affected the growth and some metabolic
and enzymatic parameters. Fish exposed to 2,4-D showed decrease in tissues
glycogen at both concentrations tested. Glucose showed increased liver levels
and decreased in muscle and kidney at both herbicide concentrations. This
parameter was not altered in the plasma. Lactate increased in all tissues as
compared to the control, but decrease in the plasm. In contrast, protein levels
reduced in the liver, white muscle, kidney and plasma at both 2,4-D
concentrations. 2,4-D induced liver catalase in R. quelen. Fish exposed to 2,4-D
showed increased TBARS levels in muscle tissue and reduced liver TBARS at
both concentrations tested. Brain TBARS was not altered after 2,4-D exposure.
Soluble sugar was reduced at both 2,4-D concentrations and an increase in
protein levels at the highest concentration tested was observed in mucous
layer. The present study showed that after long term exposure to 2,4-D reduced
growth and alter metabolic parameters. The parameters measured can be used
as herbicide toxicity indicators considering environmental relevant
concentration.
KeyWords: 2,4-D, growth, metabolic parameters, silver catfish, catalase,
TBARS.
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27
1. Introduction
Human activities, such as agriculture, can affect aquatic organisms like
fish, due to residual pesticides that can reach in the environment. Fish showed
changes in metabolic and enzymatic parameters as a consequence of pesticide
induced toxicity (Fatima et al., 2007). The fish responses to environment
contamination are initially reversible, but at longer exposure can be permanent.
The alterations frequently occur at cellular and biochemical levels, leading to
changes in the structure and function of the cells, tissues, physiology and
behavior of the organism, as survival skills, inhibited growth and reproductive
function (Oruç and Uner, 1999; Parvez and Raisuddin, 2005). Pesticides are
environmental contaminants introduced to ensure field in modern agriculture
(Senger et al., 2005). 2,4-D or 2,4 dichlorophenoxyacetic acid is a systemic
herbicide widely used in the world for broadleaf weeds control. This herbicide
showed physiological properties similar to auxin (natural plant hormone)
resulting in overstimulation of plant growth and culminating with death (Oruç
and Uner, 2004; Ateeq et al., 2005; Benli et al., 2007). The recommended 2,4-D
concentration for use in agriculture of Southern Brazil ranges from 0.5 to
1.1mgL
-1
, calculed according to Rodrigues and Almeida (2005). 2,4-D can be
considered as having low contamination potential for surface waters and as a
transitional contaminant of groundwater in Southern Brazil. This herbicide has
low biodegradability and has been frequently detected in watercourses of this
region (Primel et al., 2005).
Teleost fish may be good indicators of contamination by pollutants
such as pesticides because their biochemical responses are similar to those
found in mammals, and also due to high exposure (Sancho et al., 2000;
Begum, 2004). Many xenobiotics induces oxidative stress in fish, resulting
from the production of reactive species. These substances are highly
reactive, causing damage to lipid, proteins, carbohydrates and nucleic acids
(Sevgiler et al., 2004; Üner et al., 2005). Cells present the antioxidant
defense system to neutralize the effects of free radicals, such as superoxide
anion radical (O
2
-
), hydrogen peroxide (H
2
O
2
) and hydroxyl radical (HO)
(Monteiro et al., 2006, Sevgiler et al., 2007). The measurement of the
enzymes and metabolic parameters in fish tissues are important to verify fish
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28
response to the stress caused by xenobiotics present in the environment
(Jyoti and Narayan, 1999).
Mucous composition can also be altered due to pesticide exposure
(Tromeur et al., 1992). A mucous layer that is to act as mechanical protection
and hydrodynamic lubrificant covers fish. Mucous secretion also acts as an
active anti-parasitic and anti-bacterial agent (Tromeur et al., 1992; Sabóia-
Moraes et al., 1996). Fish skin mucous is composed by epithelial mucins
which are widely distributed in animal tissues. Basic mucous composition is
macromolecular glycoproteins, containing sulphate residues.
The silver catfish (Rhamdia quelen) is an endemic species of South
America and widely spread in natural and artificial aquatic environments of this
region. This species is relatively resistant to cold environment and grown in
summer making it ideal for any region with subtropical climate (Barcellos et al.,
2003; Soso et al., 2007). Thus, the aim of this study was to investigate the
effects of a chronic exposure of commercial formulation of 2,4-D herbicide on
growth, metabolic parameters and some antioxidants defenses of silver catfish
as possible indicators of toxicity.
2. Materials and Methods
2.1 Chemicals
The herbicide used in this experiment was the commercial formulation
2,4-D (2,4-D acid equivalent 720g L
-1
and dichlorophenoxyacetic dimethylamin
salt of 2,4-D 868 g L
-1
), Chemical Abstract Service (CAS 94-75-7), register
number 04118189, BASF S.A., São Bernardo do Campo, SP, Brazil. 2,4-D has
soil and water half-life around 7 and 7,5 days respectively. The water solubility
for this herbicide is 311mgL
-1
(Primel et al., 2005). All chemicals and reagents
were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).
2.2 Fish
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29
Juvenile silver catfish of both sexes (9.0 g and 10.0 cm), supplied by the
Universidade Federal de Santa Maria’s fish farm were used in the experiments.
The fish were acclimated for 10 days to laboratory conditions, in 250L tanks,
with aerated water. Water conditions were: temperature 24 ± 2.0
o
C, pH 7.0 ±
0.2 units, dissolved oxygen 6.8 ± 0.3mg L
-1
, non-ionized ammonia 0.005 ±
0.002mg L
-1
, nitrite 0.05 ± 0.02mg L
-1
, alkalinity 65 ± 4.9mg L
-1
CaCO
3
and
hardness 19 ± 1.3mg L
-1
CaCO
3
. All water parameters were determined
according to Boyd and Tucker (1992). During acclimation and experimental
period (90 days), fish were fed twice a day with commercial fish pellets (42%
crude protein, Supra, Brazil). Feces and pellet residues were removed daily by
vacuum.
2.3 Experimental design
The LC
50
(medium lethal concentration) obtained for Rhamdia quelen
was 745 mgL
-1
(unpublished data). Experimental 2,4-D concentrations were
chosen according to Rodrigues and Almeida (2005), considering the minimum
herbicide concentration indicated for use in agriculture in Southern Brazil
(0.5mgL
-1
), and the high environmental relevant concentration for cultivation use
(2.0mg L
-1
). After acclimation, groups of fish (n=8) were redistributed in
continuously aerated 250L boxes and exposed for 90 days to: 0 (control), 0.5 or
2.0mg L
-1
of 2,4-D (72 g a e L
-1
). All tests were carried out in triplicate and fish
were fed to satiation twice a day. Stock solutions were prepared by dissolving
2,4-D in water and added to the experimental tanks. The water in the boxes was
renewed every to 48h to remove the residues and replace herbicide. The
experimental period (90 days) was chosen considering previous studies in our
laboratory using long-term fish exposure to herbicide.
2.4 Growth and metabolic parameters
At the end of the exposure period, all fish were sampled, weighed and
measured for growth parameters estimation (final weight, final length, G
(specific growth rate), daily mass gain (DMG)). The mucus was carefully
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30
scraped from dorsal body surface (total area 6cm
2
) using a cotton swab. After
scraping, the cotton was immersed in 2ml of distilled water, and the sample was
used to determine soluble sugar (Duboie et al., 1956) and protein (Lowry et al.,
1951). The fish blood was quickly colleted for determining plasma parameters.
Punching the spinal cord behind the opercula killed the fish. Brain, liver, kidney,
and white muscle were removed and placed on ice, frozen in liquid nitrogen and
then stored at -20°C. Liver, kidney and muscle glycogen were determined
according to Bidinotto et al. (1997). Tissue protein was estimated according to
Lowry et al. (1951). Tissue samples were homogenized with 10% trichloroacetic
acid using a motor-driven teflon pestle and centrifuged at 1000 x G for 10min.
Deproteinated supernatant was used for the determination of lactate (Harrower
and Brown, 1972) and soluble sugar (Park and Johnson, 1949).
2.5 Catalase activity assay
Catalase (EC 1.11.1.6) activity was assayed by ultraviolet
spectrophotometry (Nelson and Kiesov, 1972). Samples of liver were
homogenized in a Potter-Elvejhem glass/Teflon homogenizer with 20mM
potassium phosphate buffer, pH 7.4 (with 0.1% Triton X100 and 150mM NaCl)
(1:20 dilution), centrifuged at 10 000 x G for 10min at 4°C. Briefly, the assay
mixture consisted of 2.0 mL potassium phosphate buffer (50mM, pH 7.0),
0.05mL H
2
O
2
(0.3M) and 0.05mL homogenate. Change of H
2
O
2
absorbance in
60 seconds was measured at 240nm. The enzyme activity was expressed as
micromoles of H
2
O
2
reduced per milligram of protein per minute (µmol g
-1
protein
min
-1
).
2.6 TBARS determination
Peroxides produced from oxidative stress can be quantified by a TBARS
assay. This is performed by a malondialdehyde (MDA) reaction with 2-
thiobarbituric acid (TBA), which is optically measured. Brain, white muscle and
liver samples were prepared as reported for the catalase assay. Homogenates
(100-400µL) were added to 8.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 2.5 molar
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31
acetic acid (pH 3.4), 0.8% thiobarbituric acid was added to adjust to a final
volume of 2.0mL. The reaction mixture was placed in a microcentrifuge tube
and incubated for 90min at 95 C. After cooling, it was centrifuged at 5.000 x G
for 10min and the optical density at 532nm was determined. TBARS levels are
expressed as nmols MDA per mg of protein according to Ohkawa et al. (1979).
Protein levels were estimated spectrophotometrically by the method of Bradford
(1976), using bovine serum albumin as standard.
2.7 Statistical procedures
One-way analysis of variance (ANOVA) following by Tukey test. Data
(n=24) were expressed as mean ± standard deviation (SD) and mean
differences were considered significant at P< 0.05.
3. Results
Silver catfish exposed to 2,4-D for 90 days at 0.5 or 2.0mgL
-1
showed
reduction on daily mass gain (55 and 58%, respectively) when compared to
control. Specific growth rate was reduced 40 and 50%, respectively. The
condition factor decreased 22 and 12% compared to the control (Table 1). The
protein of the mucous layer increased at high concentration tested and soluble
sugar reduced at both 2,4-D concentrations tested (Figure 2). In this study,
silver catfish exposed to 2,4-D showed liver glycogen and protein reduction, but
glucose and lactate increased in liver at both concentrations when compared to
control (Table 2). White muscle showec glycogen and glucose reduction levels
at both herbicide concentrations tested, however protein reduction was
observed only at the high concentration tested. White muscle lactate increased
at both 2,4-D concentrations as compared to the control (Table 2). The kidney
presented a significant reduction in glycogen and glucose levels at both
concentrations, but increased lactate levels as compared to control. In this
tissue, the protein content was not significant altered after 2,4-D exposure. The
plasma metabolic parameters changes were the following: reduction of protein
and lactate levels for both concentrations tested and glucose levels was not
altered as compared to control (Table 1). The catalase activity was increased at
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32
both concentrations tested as compared to the control (Figure 1). TBARS levels
were not altered in brain tissue of fish exposed to 2,4-D. In contrast, muscle
tissue showed an increase of 63 and 84%, respectively, in TBARS levels when
compared to the control values. Liver TBARS levels decreased significantly
ranging from 18% (0.5mgL
-1
) and 30% (2.0mgL
-1
) in comparison to the control
group (Figure 3).
4. Discussion
Exposure to 2,4-D for 90 days reduced fish growth, probably due to the
commercial formulation of 2,4-D effect. Considering that 2,4-D is a potent water
contaminant, and R. quelen can absorb up to 30% within 96 h (Fonseca et al.,
2007), is probably that a long term exposure to this herbicide affects growth by
altering fish metabolism. Another important parameter evaluated in this study
was mucous layer composition, which after 2,4-D exposure presented a
decrease of soluble sugar and increase in protein. The mucous layer is
important to protect and reduce water impact in fish, but water herbicide
contained seems to influence mucous layer composition as in this study.
Similarly Leporinus obtusidens exposed to glyphosate based herbicide increase
protein of the mucous layer (Glusczak et al., 2007b).
The measurement of lipid peroxidation through the quantification of
TBARS has been used as an indicator of oxidative stress in fish. Herbicides or
their metabolites can change oxidative state, enhanced the intracellular
formation of lipid peroxides resulting in oxidative stress. However, in this study
Rhamdia quelen exposed to 2,4-D showed an increase of TBARS levels only in
the muscle tissue, that is a compatible response to lipid peroxidation. Liver
TBARS decrease levels at both herbicide concentrations and no alteration was
observed in brain tissue. TBARS formation can change according to the tissue
considered. Liver catalase induction was observed at both 2,4-D concentrations
tested, and this response could be related to TBARS response observed in R.
quelen tissues. The sum of results of TBARS levels and catalase may indicate a
compensatory response of fish in order to survive after muscle lipid damage
caused the herbicide. On contrast of TBARS results of this study, the same fish
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33
Rhamdia quelen exposed to clomazone (0.5 or 1.0 mg L
-1
) showed an increase
in TBARS levels, particularly in the liver, after 12, 24, 48, 96 or 192 h of
exposure (Crestani et al., 2007). R. quelen exposed to clomazone herbicide
(12, 24 or 96h) showed different catalase response where enzyme activity
reduction was observed in the liver of silver catfish exposed to clomazone (0.5
or 1.0 mg/L) (Crestani et al., 2007). Tissue differences concerning TBARS
formation are frequently attributed to the variation in antioxidant mechanisms of
fish species and also in the tissue considered (Ahmad et al., 2000; Moraes et
al., 2007).
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34
Table 1. Growth parameters of silver catfish (Rhamdia quelen) after exposure (90 days) to 2,4-
D at 0.0 (Control), 0.5 or 2.0 mgL
-1
.
Parameters Control 0.5 mg L
-1
2.0 mg L
-1
Final weight (g) 27.8 17.5* 15.2*
Total body length (cm) 15.2 14.2 13.0*
Daily weight gain (g) 0.2 0.1* 0.1*
Specific growth rate (% day
-1
) 1.2 0.7* 0.6*
Condition factor 0.8 0.6* 0.7*
* Indicates difference between treatments and the control by Tukey test at P≤0.05).
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35
Table 2. Hepatic, white muscle, kidney and plasma metabolites of Rhamdia quelen exposed to
different concentrations of 2,4-D
for 90 days. Data represent the mean ± SD, (n=24).
* Indicates difference between treatments and the control by Tukey test at P≤0.05).
Tissue 2,4-D (mgL
-
1
) Metabolic Parameter
Glycogen
(glycosyl-glucose
g
-1
)
Glucose
(µmol g
-1
)
Lactate
(µmol g
-1
)
Protein
(mg g
-1
)
Liver Control
94.0 ± 9.9 29.7 ± 2.3 4.2 ± 0.4
171.0
± 12.3
0.5
72.0 ± 10.7*
35.0
± 1.8* 4.7 ± 0.4* 152.0 ± 4.5*
2.0
70.0 ± 5.3* 38.6 ± 1.7* 5.0 ± 0.2*
159.0
± 2.3*
Muscle Control
2.1 ± 0.2 4.4 ± 0.1 8.6 ± 0.4
151.0
± 12.0
0.5
2.1 ± 0.1 3.6 ± 0.1* 16.5 ± 2.2*
121.0
± 12.0
2.0
1.7 ± 0.2* 3.4 ± 0.6* 16.9 ± 1.8*
84.0
± 8.2*
Kidney Control
87.0 ± 10 17.4 ± 1.5 4.34 ± 0.5 113.0 ± 7.8
0.5
40.0 ± 5.3* 15.7 ± 1.3* 6.08 ± 1.1* 111.0 ± 6.0
2.0
36.0 ± 4.6* 12.5 ± 1.7* 6.09 ± 0.5* 120.0 ± 6.0
Glucose Lactate Protein
Plasm Control
37.5 ± 1.9 1.7 ± 0.2 48.1 ± 4.0
0.5
39.5 ± 4.1 1.3 ± 0.1* 28.4 ± 3.6*
2.0
37.2 ± 4.0 1.2 ± 0.1* 28.5 ± 3.9*
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36
Fig. 1. Catalase activity in the liver of silver catfish (Rhamdia quelen) exposed 90 days to two
concentrations a commercial formulation of 2,4-D. Values are means ± SD (n=24). Data are
expressed as µmol mg
-1
protein
min
-1
Control 0.5 mgL
-1
2.0mgL
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Control
0.5 mgL
-1
2.0mgL
-1
*
*
2,4-D (90 days)
µmol min
-1
g
-1
protein
* Indicates difference between treatments and the control by Tukey test at P≤0.05).
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37
Fig. 2. Protein and glucose levels of the mucus layer of Rhamdia quelen after chronic
exposure
(90 days) to 2,4-D. Data represent the mean ± SD, (n=24).
Glucose Protein
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
Control
0.5 mgL
-1
2.0 mgL
-1
*
*
*
2,4-D (90days)
µg (cm
2
)
-1
* Indicates difference between treatments and the control by Tukey test at P≤0.05).
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38
Fig. 3. TBARS levels in brain, liver and white muscle of Rhamdia quelen exposed to 0.5 and 2.0
mgL
-1
2,4-D for 90 days. Data represent the mean ± SD, (n=24).
Liver Muscle Brain
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
Control
0.5 mgL-1
2.0 mgL-1
*
*
*
*
2,4-D (90 days)
nmol MDA mg
-1
protein
* Indicates difference between treatments and the control by Tukey test at P≤0.05).
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43
3.2. MANUSCRITO 2:
A COMMERCIAL FORMULATION OF 2,4-D AFFECTS TOXICOLOGICAL
AND METABOLIC PARAMETERS OF THE TELEOST Rhamdia quelen
Milene Braga da Fonseca, *Vania Lucia Loro, Bárbara Clasen, Alexandra
Pretto, Alice Raabe and Bernardo Baldisserotto
Laboratório de Bioquímica Adaptativa, Departamento de Química, Universidade
Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil.
Corresponding Author:
(*) Dr. Vânia Lucia Loro.
Departamento de Química
Universidade Federal de Santa Maria
97105.900 - Santa Maria, RS, Brazil.
Phone: + 55 –220-9456
Fax: + 55 (55) 220-8240
E-mail: vanial@smail.ufsm.br
vaniluc@yahoo.com.br
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44
Abstract
The effects of 2,4-D (0.5 or 2.0 mgL
-1
) on TBARS formation, catalase
activity and metabolic parameters were evaluated in silver catfish (Rhamdia
quelen) tissues after 96 h exposure. Catalase activity was increased in the liver
at both concentrations tested. TBARS increased in liver tissue, but there was no
significant change in white muscle and brain tissues. White muscle glycogen
was reduced for both 2,4-D concentrations. Liver tissue showed glycogen
increase and no significant change was observed in kidney at both 2,4-D
concentrations tested. Liver protein was reduced after exposure at 0.5 or 2.0
mg L
-1
of 2,4-D, but no significant changes were observed in white muscle and
kidney tissues for this parameter. Lactate levels showed reduction in white
muscle, liver and kidney tissues after 2,4-D exposure. 2,4-D also produced a
decrease in blood lactate at both concentrations tested, but no changes were
observed in plasma protein and glucose levels. In conclusion, the results
obtained indicate that 2,4-D produces liver oxidative stress, affecting catalase
activity and TBARS formation. Some tissue metabolic parameters of silver
catfish were also altered indicating metabolic disorders. The stress generated
by 2,4-D exposure is the probable cause of alterations observed. Measured
parameters can be use as 2,4-D fish toxicity indicators.
Keywords: 2,4-Diamin, herbicide, Catalase, TBARS, glycogen, glucose,
protein, fish.
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45
1. Introduction
Environmental contamination by pesticides may cause physiologic and
behavioral changes in fish and also affect functions such as reproduction and
metabolism (Oruç and Uner 1999; Bretaud et al., 2000). 2,4-D is a widely used
herbicide in the world and also in Southern Brazil due to its low cost and good
selectivity. This herbicide has been frequently detected in water courses (Primel
at al., 2005, Chingombe et al., 2006). The 2,4-D concentration recommended
for use in agriculture of Southern Brazil ranges from 0.5 to 1.1 mg L
-1
calculed
according to Rodrigues and Almeida (2005). 2,4-D can be considered as having
low contamination potential for surface waters and as a transitional contaminant
of groundwater in Southern Brazil (Primel et al., 2005). According to Oruç et al.
(2004), 2,4-D showed properties similar to auxin, a natural plant hormone,
which promotes overstimulation of growth and death. This herbicide is
considered to be non-toxic for fish at low doses for some authors (Gallagher
and Di Giulio, 1991) however, other studies demonstrate that fish tissues can
absorb up to 30% of waterborn 2,4-D (Fonseca et al., 2007). Generally,
biochemical parameters are very sensitive to sublethal concentration of many
stressful agents (Sancho et al., 1997). Organisms exhibit a characteristic
response to a stressor that may be measured through a variety of enzyme
activities and metabolic parameters in blood, liver and muscle. These
responses frequently include depletion of glycogen stores form fish tissues like
liver and muscle (Begum & Vijayaraghavan, 1999). For evaluate a possible 2,4-
D toxicity we chose general parameters (glucose, glycogen, lactate, protein),
basic mucous layer composition and stress oxidative parameters.
Environmental pollutants such a pesticides frequently induce formation of
reactive species (Sevgiler et al., 2004). These reactive species may impaired
oxidative metabolism and cause damage to lipids, proteins, carbohydrates or
nucleic acids (Parvez and Raisuddin, 2005). Pesticides induced lipid
peroxidation (LPO) has been observed in fish tissues. Variations in the
response of antioxidant system have been proposed as indicators of pollutant
mediated oxidative stress (Oruç et al., 2004; Crestani et al., 2006). The effect of
2,4- D has been little studied in fish species of Southern Brazil.
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46
Silver catfish (Rhamdia quelen) is a native freshwater fish from Southern
Brazil and shows good potential for cultivation and commercial market
(Barcellos et al., 2003). Some studies demonstrated that exposure to different
herbicides changed metabolic parameters in jundiás (Crestani et al., 2006;
Glusczak et al., 2007a). The objective of this study was to verify if 2,4-D
concentrations used in agriculture affect catalase activity, TBARS formation and
metabolic parameters of silver catfish.
2. Materials and methods
2.1. Experimental design and metabolic determinations
Silver catfish of both sexes were obtained from the Santa Maria Federal
University (UFSM) fish farm (RS- Brazil). Fish (weight, 15 ± 0.5 g; length, 6 ±
1.0 cm) were acclimated to laboratory conditions for 10 days. They were kept in
continuously aerated tanks (250L) with a static system. Water quality
characteristics were tested at the beginning, middle and end of exposure. Mean
values of water parameters were: temperature 21 ± 2
o
C, pH 7.4 ± 0.2 and
dissolved oxygen 7.8 ± 0.2 mg L
-1
. Fish were fed twice a day with commercial
fish pellets (42% crude protein, Supra, Brazil). Feces and pellet residues were
removed daily by vacuum. The commercial 2,4-D (2,4-D acid equivalent 720 g
L
-1
and diclorofenoxiacético dimetilamina salt of 2,4-D 868 g L
-1
), Chemical
Abstract Service (CAS 94-75-7), register number 04118189, BASF S.A., São
Bernardo do Campo, SP, Brazil was used in experimentation. The 2,4-D
concentrations used in the experiments were chosen considering the
recommended concentration used in agriculture in Southern Brazil, ranging
from 0.5 to 1.1 mg L
-1
(Rodrigues and Almeida, 2005). Following acclimation
period (10 days), the fish were transferred to glass tanks (50 L) with controlled
aeration and temperature. Groups of 8 fish per tank were exposed for 96 hours
to: 0 (control), 0.5 or 2.0 mg L
-1
of 2,4-D. All tests were carried out in triplicate.
The 2,4-D was monitored in water of experimental tanks every day following the
method proposed by Primel et al., (2005) (Data not shown). At the end of the
exposure period (96 h), all fish were sampled and the mucus was carefully
scraped from dorsal body surface (total area 6 cm
2
) using a cotton swab. After
scraping, the cotton was immersed in 2 mL of distilled water, and the sample
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47
was used to determine soluble sugar (Duboie et al., 1956) and protein (Lowry et
al., 1951). After this, blood was collected from the caudal vein with a 1 ml
heparinized syringe, centrifuged (10 min, 3000 x G, 4º C) and used for
metabolite determination. Plasma total protein was estimated in accordance
with Lowry et al. (1951) using bovine serum albumin as standard. Plasma
glucose was measured by the glucose oxidase (LABTEST test kit). Plasma
was dissolved in 10% trichloroacetic acid (1:20 dilution) and lactate was
estimated in accordance with Harrower and Brown (1972). Tissues (brain, liver
and white muscle) were removed and placed on ice, frozen in liquid nitrogen
and then stored at -20º C. Liver and white muscle glycogen was determined in
accordance with Bidinotto et al. (1997). Tissue protein was estimated in
accordance with Lowry et al. (1951). Tissue samples were homogenized with
10 % trichloroacetic acid (TCA) using a motor-driven teflon pestle and
centrifuged at 1000 x G for 10 min. Supernatant (protein free) was used for the
determination of lactate (Harrower and Brown, 1972) and soluble sugar (Park
and Johnson, 1949).
2.2. Catalase activity
Catalase (EC 1.11.1.6) activity was assayed by ultraviolet
spectrophotometry (Nelson and Kiesov, 1972). Samples of liver were
homogenized in a Potter-Elvejhem glass/teflon homogenizer with 20 mM
potassium phosphate buffer, pH 7.4 (with 0.1% Triton X100 and 150 mM NaCl)
(1:20 dilution), centrifuged at 10 000 x G for 10 min at 4°C. Briefly, the assay
mixture consisted of 2.0 mL potassium phosphate buffer (50mM, pH 7.0), 0.05
mL H
2
O
2
(0.3 M) and 0.05 mL homogenate. Change of H
2
O
2
absorbance in 60
s was measured at 240 nm. The enzyme activity was expressed as micromoles
of H
2
O
2
reduced per milligram of protein per minute (µmol mg
-1
protein
min
-1
).
2.3. TBARS determination
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48
Tissues samples (brain, muscle and liver) were prepared as reported for
the catalase assay. Brain, white muscle and liver homogenates (100-400 µL)
were added to 8.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 2.5 molar acetic acid (pH
3.4), 0.8% thiobarbituric acid was added to adjust to a final volume of 2.0 mL.
The reaction mixture was placed in a microcentrifuge tube and incubated for 90
min at 95°C. After cooling, it was centrifuged at 5.000 x G for 10 min and the
optical density at 532 nm was determined. TBARS levels are expressed as
nmols MDA per mg of protein according to Ohkawa et al. (1979). Protein levels
were spectrophotometrically estimated by the method of Bradford (1976), using
bovine serum albumin as standard.
2.4. Statistical analysis
Toxicology and metabolic parameters were analyzed using one-way
analysis of variance (ANOVA) followed by tukey test. Results obtained (n=24)
were expressed as mean + standard deviation (SD) and mean differences were
considered significant at P≤0.05.
3. Results and Discussion
The study showed that 2,4-D increased significantly catalase activity and
TBARS levels in the liver of silver catfish (P≤0.05) at both concentrations tested
(Figure 1). Liver seems to be affect by 2,4-D forming reactive species as
TBARS, and antioxidant defense represented by catalase is activated in this
case. On the contrary, no alteration was observed in the brain and the white
muscle concerning TBARS formation (Figure 2). Elevated TBARS levels on
different tissues induced by aquatic contaminants such as pesticides have been
observed by some authors (Li et al., 2003; Üner et al., 2005). The results of this
study are in agreement with Crestani et al. (2007), who demonstrated an
increase of liver TBARS formation in Rhamdia quelen after clomazone (12-192
h) exposure. However, in the some species TBARS levels in the liver were not
altered and white muscle increase 56% compared to control after 96 h
exposure to a glyphosate-based herbicide (Glusczak et al., 2007a).
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49
Different classes of environmental pollutants or their metabolites can
change the metabolic state of the liver because of its importance for the
detoxification process. In this study after exposure to 2,4-D silver catfish
exhibited a significant decrease of protein and lactate levels in the liver, as
compared to control values. However, liver glycogen showed increased and
glucose remained unaltered. The white muscle tissue showed a significant
decrease of glycogen and lactate at both 2,4-D concentrations tested, but
protein and glucose were not altered. After exposure to 2,4-D silver catfish
showed lower kidney lactate level, but no significant alteration was detected in
glucose, glycogen and protein levels (Table 1). The protein reduction observed
in the liver of silver catfish exposed to 2,4-D may indicate a response to stress
generated by herbicide. A similar response of protein reduction was obtained by
Fernández-Vega et al. (2002) in eels exposed to thiobencarb and by Oruç and
Üner (1999) in Cyprinus carpio exposed to 2,4-D.
The decrease observed in white muscle glycogen and lactate in this
study may indicate that stress caused by the herbicide is accompanied by a
higher dependence on the oxidative degradation of glycogen. In contrast with
this work, Oruç and Üner et al. (1999) observed liver protein increase after
exposure to 2,4-D for 30 days. Gill et al. (1991) found an increase in liver
protein following endosulfan intoxication. The decrease of liver and white
muscle lactate may indicate higher gluconeogenesis adaptation. In summary,
these results suggest that after 2,4-D exposure gluconeogenesis was preferred
and could be a response against energy depletion favoring carbohydrate
oxidation. Glycogen reductions in white muscle after pesticide exposure have
been reported in several studies. Fish frequently use glycogen store when in
hypoxia situation generated by pesticide exposure (Sancho et al., 1998; Oruç
and Üner, 1999; Aguiar et al., 2004). Muscular glycogen decreased in Clarias
batrachus exposed to organophosphate rogor, (Begum and Vijayaraghavan,
1999), but no changes were observed in liver glycogen of Anguilla anguilla
exposed to fenitrothion (Sancho et al., 1997). These findings corroborate with
the results from our study, where glycogen levels after 2,4-D exposure were
reduced in the white muscle tissue. In agreement with our study, glycogen
stores were reduced only in white muscle tissue and enhanced in the liver after
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50
clomazone exposure (Crestani et al., 2006). The liver lactate reduction
observed in this study may be related to a glycogen synthesis.
The protein content of mucous layer composition in silver catfish
increased and glucose reduced after exposure to both 2,4-D concentrations
tested (Figure 3). Similar results were obtained from glyphosate exposure to
Leporinus obtusidens at the concentrations differs were increased low sugar
and protein contents (Glusczak et al., 2007b). The mucous layer has an
important protective role on protecting fish against general stressor agents. 2,4-
D exposure altered the basic mucous layer composition and consequently
enhanced susceptibility of silver catfish to diseases (Tromeur et al., 1992).
This results indicate that sub-lethal doses of 2,4-D may have deleterious
effects on silver catfish. In conclusion, the results obtained indicate that 2,4-D
affects tissue metabolic parameters, and cause liver oxidative stress in silver
catfish, probably due to stress generated by its toxicity. In addition, the present
data can be used to monitor 2,4-D presence in water. Studies for complete
elucidation of 2,4-D induced fish toxicity will be the purpose of future research.
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51
Table 1. Hepatic, white muscle, kidney and plasma metabolites of Rhamdia quelen exposed to
different concentrations of 2,4-D
for 96 hours.
Tissue 2,4-D
(mgL
-1
)
Metabolic parameter
Glycogen
(glycosyl-glucose g
-1
)
Glucose
(µmol g
-1
)
Lactate
(µmol g
-1
)
Protein
(mg g
-1
)
Liver Control
106.0 ± 3.0 25.5 ± 1.4 7.2 ± 1.8 263.0 ± 28.0
0.5
129.0 ± 6.2* 25.7 ± 1.0 5.5 ± 0.7* 200.0 ± 40.0*
2.0
133.0 ± 8.7* 23.9 ± 0.9 5.4 ± 1.3* 200.0 ± 31.0*
Muscle Control
2.4 ± 0.2 6.3 ± 1.4 10.2 ± 2.2 249.0 ± 34.0
0.5
2.0 ± 0.1* 5.7 ± 1.1 7.7 ± 1.6* 262.0 ± 20.0
2.0
1.9 ± 0.2* 5.3 ± 1.7 8.0 ± 1.7* 237.0 ± 11.0
Kidney Control
11.2 ± 1.6 13.5 ± 1.2 4.3 ± 0.8 155.0 ± 24.0
0.5
10.9 ± 1.6 13.9 ± 3.1 2.6 ± 0.6* 177.0 ± 19.0
2.0
11.8 ± 1.2 15.1 ± 2.4 2.7 ± 0.3* 159.0 ± 33.0
Glucose Lactate Protein
Plasm Control
37.6 ± 6.4 4.6 ± 0.6 56.1 ± 8.4
0.5
35.3 ± 10.0 2.6 ± 1.1* 55.8 ± 9.0
2.0
32.8 ± 9.3 3.2 ± 1.2* 57.6 ± 12.0
Values were expressed as mean ± standard deviation (SD). * Indicate significant differences
from control values (p≤0.05) (n=24).
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52
Fig. 1. Catalase activity in the liver of silver catfish (Rhamdia quelen) exposed 96 hours to two
concentrations a commercial formulation of 2,4-D. Values are means ± SD (n=24). Data are
expressed as µmol mg
-1
protein
min
-1
Control 0.5 mgL
-1
2.0 mgL
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Control
0.5 mgL
-1
2.0 mgL
-1
*
*
96 hours
µmol min
-1
g
-1
protein
* Indicates difference between treatments and the control by Tukey test at P≤0.05).
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53
Fig. 2. TBARS levels in brain, liver and white muscle of silver catfish exposed to 0.5 and 2.0
mgL
-1
2,4-D for 96 hours. Data represent the mean ± SD, (n=24).
Muscle Brain Liver
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
Control
0.5 mgL
-1
2.0 mgL
-1
* *
nmol MDA mg
-1
protein
* Indicates difference between treatments and the control by Tukey test at P≤0.05).
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54
Fig. 3. Protein and glucose levels of the mucus layer of silver catfish after acute
exposure (96
hours) to 2,4-D. Data represent the mean ± SD, (n=24).
Glucose Protein
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
0.10
0.11
Control
0.5 mgL
-1
2.0 mgL
-1
*
*
*
*
96 hours
µg (cm
2
)
-1
* Indicates difference between treatments and the control by Tukey test at P≤0.05).
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59
4. DISCUSSÃO:
O presente estudo mostra que a exposição prolongada ao 2,4-D causa
redução em alguns parâmetros do crescimento, indicando que nas condições
de laboratório este herbicida afeta o desempenho produtivo dos jundiás.
Resultados semelhantes foram obtidos em exposição prolongada (90 dias) ao
herbicida glifosato, onde piavas mostraram redução em até 50% nos
parâmetros de crescimento (Salbego, 2005). Existem poucos estudos
avaliando os efeitos de pesticidas sobre o crescimento de peixes, os dados
obtidos neste estudo podem ser comparados somente com as condições de
laboratório, uma vez que em condições naturais outros fatores podem interferir
na biodisponibilidade do herbicida, bem como aumentar sua diluição. A
exposição subletal ao herbicida 2,4-D reduz os valores de açúcares redutores
do muco, e aumenta a produção de proteína após os períodos de 90 dias de
exposição e 96 horas. O muco representa uma importante barreira contra
agentes estressores, diminui o atrito com a água, tendo um papel fundamental
nos mecanismos de proteção de peixes (Tromeur et al., 1992). A exposição ao
herbicida 2,4-D parece interferir na composição básica do muco, deixando o
peixe mais susceptível a doenças.
Diferentes classes de poluentes ambientais podem alterar o estado
metabólico do tecido hepático devido a este órgão ser muito importante para o
metabolismo e também o responsável pelo processo de detoxificação. Neste
estudo após a exposição de 90 dias ao 2,4-D os peixes exibiram alterações no
conteúdo de glicogênio, proteína, lactato e glicose Na exposição aguda (96
horas) as respostas foram um pouco diferentes, mas ocorreram também
alterações nos parâmetros metabólicos. Os resultados mostram que a redução
de proteína nos tecidos provavelmente está relacionada ao consumo de
proteína dos tecidos a fim obter energia para os processos metabólicos e de
detoxificação do organismo. A redução dos níveis de lactato nos tecidos pode
indicar uma estratégia gliconeogênica e poderia ser uma resposta à depleção
de energia. A redução de glicogênio nos tecidos após exposição a pesticidas é
relatada em muitos estudos. Geralmente, os peixes utilizam o estoque de
glicogênio quando ocorre uma situação de hipóxia tecidual gerada pela
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60
exposição a pesticidas (Sancho et al., 1998; Oruç & Üner, 1999; Aguiar et al.,
2004). O aumento nos níveis de lactato dos tecidos pode indicar que o peixe
está usando uma estratégia fermentativa, consumindo glicogênio e glicose a
fim de obter energia de maneira mais rápida. Por outro lado, quando este se
encontra reduzido, pode-se dizer que isto está relacionado com a síntese de
glicose e glicogênio, favorecendo o processo de gliconeogênese. O tecido renal
é de muita importância por auxiliar na excreção desses tóxicos ou seus
metabólitos. Após a exposição prolongada ao 2,4-D o tecido renal apresentou
redução nos níveis de glicose e glicogênio, bem como aumento nos valores de
lactato. Neste tecido, não ocorreu alteração nos níveis de proteína. Jundiás
expostos por 96 horas ao herbicida citado tiveram redução nos valores de
lactato no tecido renal, porém não sofreram alterações nos demais parâmetros
analisados. Os resultados referentes ao rim na literatura são escassos, porém
podemos inferir que o 2,4-D muda parâmetros metabólicos neste tecido. O
decréscimo observado no glicogênio do músculo, fígado e rim neste estudo
podem indicar que o estresse causado pelo herbicida está acompanhado por
uma dependência na degradação oxidativa do glicogênio. Em peixes, o sangue
é bastante sensível quando estes são expostos a poluentes ambientais. Neste
estudo escolhemos parâmetros gerais e indicativos secundários de estresse
como glicose e lactato. Os resultados obtidos parecem indicar uma drenagem
do lactato do sangue para contribuir com a gliconeogênese hepática. A redução
de proteína no plasma pode indicar uma resposta compensatória à toxicidade
do herbicida. Resultado semelhante referente à redução de proteína plasmática
já foi relatado em vários estudos em peixes intoxicados com diferentes
pesticidas. Uma alta demanda de energia pode levar à estimulação do
catabolismo de proteínas (Sancho et al., 1998, 2000, Glusczak et al., 2006).
Os resultados descritos para os níveis de TBARS indicam que ocorre
estresse oxidativo no tecido hepático em 96 h de exposição e no tecido
muscular em 90 dias. De maneira semelhante a este estudo, ocorre aumento
nos níveis de TBARS em jundiás expostos ao herbicida clomazone durante 12-
192h (Crestani et al., 2007). A atividade da enzima do sistema antioxidante
catalase aumentou em ambos tempos experimentais, indicando uma resposta
do peixe ao estado de estresse oxidativo gerado pela exposição ao herbicida. A
reposta do TBARS parece ser tecido-específica, e varia também com a classe
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61
do herbicida e tempo de exposição (Moraes et al., 2007, Glusczak et al.,
2007a). Diversos autores relatam as determinações dos níveis de TBARS e da
enzima catalase como indicadores de estresse oxidativo em organismos
aquáticos após exposição a poluentes ambientais (Oruç et al., 2004; Glusczak
et al., 2007a; Moraes et al., 2007). Oruç & Üner (2000) demonstraram que
tilápias Oreochromis niloticus após exposição subletal ao 2,4-D ou ao inseticida
azinphosmithyl, bem como o efeito combinado de ambos não teve alterações
nos níveis de TBARS e na atividade da catalase após 24, 48, 72 e 96 horas de
exposição. Este mesmo grupo de estudos relatou aumento na atividade da
catalase em carpas (Cyprinus carpio) no tecido do rim, não detectando
alterações para tilápias (Oreochromis niloticus), os níveis de TBARS não
estiveram alterados em nenhum tecido de ambas as espécies neste
experimento, onde foram expostas por 96 horas aos pesticidas 2,4-D e
azimphosmethyl, bem como a sua combinação. Estes resultados podem estar
indicando que outros componentes enzimáticos ou não enzimáticos do sistema
de defesa antioxidante podem estar atuando na detoxificação do organismo.
Outros experimentos do nosso laboratório indicam que a atividade da catalase
aumentou após exposição prolongada (30 dias) aos herbicidas clomazone e
propanil (Moraes et al., 2007). O somatório destes resultados parece indicar
que o 2,4-D interfere no metabolismo dos tecidos de jundiás, e em alguns
tecidos promove estresse oxidativo, representado pelo aumento do TBARS. Os
parâmetros analisados podem ser utilizados como indicadores primários de
toxicidade ao 2,4-D. Outros estudos são necessários para elucidar os
mecanismos de toxicidade deste herbicida em peixes.
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62
5. CONCLUSÕES:
- A exposição prolongada ao herbicida 2,4-D, em condições de laboratório,
reduz o crescimento de jundiás (Rhamdia quelen).
- Exposição crônica (90 dias) e aguda (96 h) ao herbicida 2,4-D causam
alterações na composição básica do muco, representada pelos conteúdos de
glicose e proteína, em jundiás expostos as concentrações sub-letais. Este
resultado sugere que o herbicida pode deixar o peixe mais susceptível a
doenças.
- Intermediários metabólicos, como glicose, lactato, glicogênio e proteína de
diferentes tecidos de jundiás são alterados quando estes organismos são
expostos ao herbicida 2,4-D indicando que o peixe usa mecanismos
compensatórios na tentativa de metabolizar o pesticida.
- Jundiás após exposição crônica ou aguda ao herbicida 2,4-D desenvolvem
uma situação de estresse oxidativo no fígado. Esta situação é indicada pelo
aumento da catalase, bem como a peroxidação lipídica que ocorre em alguns
tecidos. O herbicida leva a um desbalanço entre a atividade antioxidante e a
formação de espécies reativas de oxigênio.
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